MXPA98009698A - Sistemas de expresion por oncogenes o virus - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una construcción deácidos nucleicos para la expresión de un gen efector, conteniendo la construcción deácidos nucleicos un promotor I (componente a) que controla la expresión de un gel del factor de transcripción (componente b) contenido asimismo en la contrucción deácidos nucleicos, y conteniendo un promotor II (componente c) al que se une específicamente el producto génico del gen del factor de transcripción y que controla la expresión de un gen efector (componente d) contenido asimismo en la construcción deácidos nucleicos, caracterizada porque la actividad del producto génico del gen del factor de transcripción depende de una o varias proteínas reguladoras celulares que se unen específicamente a este producto génico y que afectan a su actividad, a una célula aislada que contiene la citada construcción para la preparación de un agente terapéutico y curativo para el tratamiento de enfermedades, a la utilización de la citada célula para el mismo fin y a un procedimiento para la preparación de la contrucción deácidos nucleicos.

Description

Sistemas de expresión controlados por oncogenes o virus La presente invención se refiere a una construcción de ácidos nucleicos para la expresión de un gen efector, conte-niendo la construcción de ácidos nucleicos un promotor I (componente a) que controla la expresión de un gen del factor de transcripción (componente b) contenido asimismo en la construcción de ácidos nucleicos, y conteniendo un promotor II (componente c) al que se une específicamente el producto génico del gen del factor de transcripción y que controla la expresión de un gen efector (componente d) contenido asimismo en la construcción de ácidos nucleicos, caracterizada porque la actividad del producto génico del gen del factor de trans-cripción depende de una o varias proteínas reguladoras celulares que se unen específicamente a este producto génico y que afectan a su actividad.

I . Introducción Un problema de la terapia génica, todavía insuficientemente resuelto, es el control específico de la célula de la expresión de un gen efector, en particular en células enfermas o modificadas de otra manera. La presente invención incluye un nuevo procedimiento de este control . Se basa en el reconocimiento (Werness et al. Science 248, 76 (1990)) de que en células degeneradas se manifiestan proteínas reguladoras que están modificadas o disminuidas de manera que ya no se unen a sus moléculas participantes correspondientes y pueden interactuar con ellas, o bien adquieren nuevas propiedades de unión con" sus correspondientes moléculas participantes o con otras . El procedimiento de acuerdo con la invención se basa, además, en el reconocimiento de que, por ejemplo, la proteína de retinoblastoma se puede unir a los dominios de activación del factor de transcripción E2F y, con ello, puede inhibir su actividad (Flemington et al., PNAS USA 90, 69 14 (1993)).

Genes para proteínas reguladoras de este tipo ya se utilizaron para sistemas de expresión para la búsqueda de inhibidores o estimuladores de estas proteínas reguladoras (por ejemplo, documentos W095/19367, W095/14777, W097/04092) . Además, ya se divulgaron sistemas de vectores, en donde un primer vector expresa una proteína supresora de tumores, y un segundo vector una proteína que se une a la proteína supresora de tumores y, con ello, la inhibe (documento W095/16771) . Los dos vectores se introducen en una célula. Mediante la combinación de los dos vectores pueden producirse en la célula vectores que codifican una proteína supresora de tumores, sin que la célula sea inhibida en su proliferación por parte de la proteína supresora de tumores . Adicionalmente, en el documento WO97/12970 se dan a conocer sistemas de expresión, en los que la expresión de un primer gen es controlada por un primer promotor, cuya función está suprimida en células no tumorales, y la expresión de un segundo gen, cuyo producto de expresión inhibe la expresión del primer gen en células no tumorales, es controlada por un segundo promotor que es altamente regulado en células no tumorales . Es objeto de la invención, entonces, un nuevo sistema de expresión sencillo que sólo puede ser activado en células en las que las proteínas reguladoras de este tipo aparecen en forma disminuida o modificada. Con ello, se activa la transcripción de un gen efector codificado por el sistema de expresión. El producto de expresión del gen efector tiene, por sí solo o en combinación con otro principio activo farmacéutico, un efecto profiláctico o terapéutico. - •< II . Descripción general de la invención El sistema de expresión correspondiente a la invención representa una construcción de ácidos nucleicos, cuya expresión es controlada por oncogenes o virus a través de la modificación o influencia sobre proteínas reguladoras provocadas por los anteriores y que contiene, en el caso más sencillo, los siguientes componentes: a) al menos una secuencia de activación (unidad de promotor I) b) al menos un gen para un factor de transcripción, siendo controlada su transcripción por parte del componente a) c) al menos otra secuencia de activación (unidad de promotor II) que controla la expresión del componente d) a través de la unión del factor de transcripción, codificado por el componente b) d) al menos un gen efector. La disposición de los distintos componentes está reproducida a título de ejemplo en la figura 1. De manera correspondiente a esta invención, se han de diferenciar dos formas de realización particulares de la construcción de ácidos nucleicos: a) Forma de realización A) Esta forma de realización se caracteriza por las siguientes propiedades de los componentes : Componente a) al menos una secuencia de activación (promotor n° I) Componente b) al menos un gen para un factor de transcripción consis- tente en una proteína de fusión que contiene • Componente i._ ) al menos un dominio de activación de un factor de transcripción • Componente b2) al menos una secuencia de unión de una proteína de unión para una proteína - reguladora • Componente b3) al menos un dominio de unión de ADN de un factor de transcripción Componente c) al menos una secuencia de activación (promotor n° II) que es activada mediante la unión del factor de transcripción, codificada por el comoponente b) Componente d) al menos un gen efector. La disposición de los distintos componentes está reproducida a título de ejemplo en la figura 2. Es premisa para la funcionalidad de acuerdo con la invención del sistema de expresión que el componente b2) esté incluido entre o en los componentes b_) y b3) de manera que la unión de la proteína reguladora el componente b2) inhiba la funcionalidad de los dominios de activación (componente bx) y/o de los dominios de unión de ADN (componente b3) . Esta inhibición conduce en células normales, es decir en una proteína reguladora funcional normal, a una inhibición de la expresión del gen efector. En una célula degenerada o infectada, en la que la proteína reguladora está modificada o complej ada, de manera que ya no puede interactuar con la correspondiente proteína de unión, o bien ya no está presente o sólo lo está escasamente, falta esta inhibición, de manera que el factor de transcripción (componente b) puede activar libremente la secuencia de activación (componente c) y, con ello, puede iniciar la transcripción del gen efector. La transcripción del gen efector se inicia mediante una activación de la secuencia de activación [componente a) ] que tiene como consecuencia una expresión del gen para el factor de transcripción [componente b) ] . El factor de transcripción [componente b) ] se une de nuevo a la secuencia de activación [componente c) ] que induce una expresión del gen efector [componente d) ] . En una forma de realización particular de esta invención, el componente a) es igual al componente c) . En esta forma de realización particular, una ligera activación de la secuencia de activación [promotor I, componente a)] conduce a una expresión del factor de transcripción [componente b) ] que activa tanto la secuencia de activación [promotor I, componente a) ] como también la secuencia de activación [promotor II, componente c) ] y, con ello, induce la expresión tanto dei gen efector [componente d) ] como también refuerza la expresión del factor de transcripción [componente b) ] , con lo que, de nuevo, se refuerza la expresión del gen efector [componente d) J . 2 ) Forma de realización B) Esta forma de realización se caracteriza por las siguientes propiedades de los componentes: Componente a' ) - al menos una secuencia de activador (promotor I) , que contiene • Componente a : al menos una secuencia de unión de ADN para una proteína reguladora y • Componente a2) : al menos un promotor basal, activando al componente a2) la unión de la proteína reguladora al componente a Componente b') * al menos un gen para un factor de transcripción que actúa como represor, siendo inducida su expresión por parte del componente a') Componente c') al menos una secuencia de activación (promotor II) que contiene • Componente c? ) : al menos una secuencia de act?vación para la inducción de la transcripción del componente d) y • Componente c2) : al menos una secuencia de ADN para la unión del represor (componente b' ) , inhibiendo esta unión la activación de " la transcripción del gen efector situado más abajo (componente d) Componente d) un gen efector. La disposición de los componentes de la forma de realización B) está reproducida a título de ejemplo en la figura 3.

Es premisa para el modo de funcionamiento de acuerdo con la invención del sistema de expresión de acuerdo con la forma de realización b) el que en la célula normal la unión de una proteína reguladora celular al componente a' ) de la unidad de promotor I induzca la transcripción del gen represor (componente b') , y el que el represor expresado se una al componente c2) de la unidad de promotor II y, con ello, inhiba la activación de la transcripción del gen estructural (componente d) por parte de la unidad de promotor II. En una célula degenerada o infectada, en la que la proteína reguladora está modificada o complejada, de manera que ya no se puede unir a la secuencia de unión de ADN (componente aJ en la unidad de prmotor I, o bien ya no está presente o sólo lo está escasamente, no se efectúa ninguna expresión del gen para el represor y, con ello, tampoco ninguna inhibición de la expresión de la construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. En estas células degeneradas o infectadas, en la forma de realización B) de la construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención se inicia la transcripción del gen efector (componente d) por la activación de la secuencia de activación (componente c de la unidad de promotor II. Este sistema de expresión se puede ampliar en las formas de realización A) y B) - mediante la yuxtaposición de varias secuencias iguales o diferentes para genes efectores [componentes d) , d' ) , d")] que están unidos en cada caso entre sí mediante secuencias IRES iguales o diferentes o mediante Secuencias de activación [componentes c') y e")]. En la forma de realización A) mediante la yuxtaposición de varios genes iguales o diferentes para factores de transcripción [componente b) ] , que en cada caso están unidos entre sí mediante secuencias IRES iguales o diferentes o secuencias de activación [componente a) ] o [componente c) ] . En el caso de una yuxtaposición de genes para diferentes factores de transcripción, las secuencias de activación han de elegirse de manera que contengan secuencias de nucleótidos a las que se pueda unir el factor de transcripción [componente b) ] . Mediante las construcciones de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, un gen efector [componente d) ] se puede expresar, en función de la elección de la secuencia de activación [componentes a) o c_ ) ] de forma no específica, específica de la célula o específica del virus o bajo determinadas condiciones metabólicas o también de forma específica del ciclo celular. En el caso del gen efector se trata de un gen que, por su parte, codifica una sustancia farmacológicamente activa o bien una enzima que separa un precursor inactivo de un farmacón en un farmacón activo. Por ejemplo, el gen efector se puede elegir de manera que esta sustancia activa o esta enzima sea expresada en forma de proteína de fusión con un ligando, y este ligando se una a la superficie de células, por ejemplo células endoteliales o tumorales, o leucocitos. Las construcciones de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención consisten, preferiblemente, en ADN. Por la expresión "construcciones de ácidos nucleicos" se entienden estructuras artificiales a base de ácidos nucleicos que pueden ser transcritas en las células diana. Preferiblemente, están incorporadas en un vector, siendo particularmente preferidos vectores de plásmidos o vectores virales . La construcción de ácidos nucleicos, eventualmente incorporada en un vector, se administra a un paciente para la profilaxis o terapia de una enfermedad. La administración debe efectuarse por vía oral, local o por inyección o infusión. Son objeto de la presente invención también células de mamíferos que contienen una construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. En una forma de realización particularmente preferida, las construcciones de ácidos nucleicos se incorporan en líneas celulares que, después de la transfección, pueden ser utilizadas como soportes del sistema de expresión de acuerdo con la invención para la expresión del gen efector. Células de este tipo pueden utilizarse para la puesta a disposición de un agente terapéu-tico y curativo para pacientes. Alternativamente, las células o líneas celulares tales como, por ejemplo, células tumorales, del sistema inmune o endoteliales, en las que se( incorporaron las construcciones de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, se pueden administrar localmente a pacientes o por vía parenteral, por ejemplo intravenosa, intrá-arterial en una cavidad del cuerpo, en un órgano o inyectar por vía subcutánea . Una utilización preferida de la construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención consiste, por consi-guíente, en la profilaxis o el tratamiento de una enfermedad, abarcando la invención la introducción in vitro de una construcción de ácidos nucleicos en una célula diana, la expresión inespecífica, específica del virus o de la célula diana, metabólicamente específica y/o específica del ciclo celular del agente terapéutico y curativo en la célula diana y la administración local o parenteral de la célula diana al paciente o bien la administración local o parenteral de la construcción de ácidos nucleicos al paciente para la introducción in vivo de una construcción de ácidos nucleicos en la célula diana. Las construcciones de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención no se presentan en esta forma en la naturaleza, es decir el gen efector para la sustancia activa o para una enzima o para una proteína de fusión ligando- sustancia activa o ligando-enzima no está cfombinada de forma natural con secuencias de ácidos nucleicos tal como las contiene la construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.

Genes efectores preferidos que son incorporados en un sistema de expresión de acuerdo con la invención codifican una sustancia farmacológicamente activa. Estos son proteínas y glicoproteínas, elegidas del grupo que contiene citoquinas, factores de crecimiento, receptores para citoquinas o factores de crecimiento, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, proteínas de acción antiproliferante o citostática, proteínas de acción apoptótica o anti-apoptótica, antígenos de tumores, inhibidores de la angiogénesis, proteínas inductoras de trombosis, inhibidores de la coagulación, proteínas de acción fibrinolítica, proteínas del plasma sanguíneo, proteínas activantes del complemento, sustancias envolventes de virus y bacterias, hormonas, péptidos con actividad sobre la circulación sanguínea, neuropéptidos, enzimas, mediadores, proteínas reguladoras no modificadas que se presentan de forma natural y ribozimas o ribonucleótidos (antisentido) que actúan de forma inhibidora sobre la expresión de genes. Preferiblemente, en el caso del transgen se trata de un gen efector que codifica una ribozima que inactiva el ARNm que codifica una proteína elegida del grupo que contiene proteínas para el control del ciclo celular, en particular ciclina A, ciclina B, ciclina DI, ciclina E, E2F1-5, cdc2, cdc25C o DPI, o proteínas de virus o citoquinas o factores de crecimiento o sus receptores . En otra forma de realización, el gen efector puede codificar una proteína de fusión ligando-sustancia activa, pudiendo ser el ligando un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una citoquina, un factor de crecimiento, una molécula de adhesión o una hormona peptídica y la sustancia activa una sustancia farmacológicamente activa tal como se ha descrito antes, o una enzima. Por ejemplo, el gen efector puede codificar una proteína de fusión ligando-enzima, en donde la" enzima disocia un''precursor de un farmacón en un farmacón y el ligando se une a una superficie de la célula, preferiblemente a células endoteliales o células tumorales.

III. Descripción detallada de las particularidades de la forma de realización A) 1) El componente b) 1.1) Secuencia de unión para una proteína reguladora [componente b2) ] Numerosas proteínas de unión celulares para proteínas reguladoras han sido descritas [Zwicker y Müller, Progress in Cell Cycle Res. 1:91 (1995); Boulikas et al., Int. J. Oncol. 6:271 (1995); Pawson, Nature 373: 573 (1995); Cotter, Leuk . Lymph. 18: 231 (1995); Hesketh, the Oncogene Facts Book Acad. Press, ISBN 0-12-344550-7 (1995) ; Miller y Sarver, Nature Med. 3 : 389 (1997) ] . En el sentido de la invención son particularmente adecuadas proteínas de unión o sus secuencias de unión para proteínas reguladoras de este tipo que sólo son escasamente expresadas en células enfermas, están inhibidas en su unión a la secuencia de unión, debido a un exceso de la secuencia de unión no se presentan en forma libre o sólo lo hacen escasamente o están afectadas o modificadas de otra forma en su función tal como, por ejemplo, por mutación. A proteínas reguladoras de este tipo pertenecen, por ejemplo, las proteínas expresadas de genes supresores de tumores . Una elección no limitante de la invención de proteínas reguladoras de este tipo y de sus proteínas de unión correspondientes y de sus secuencias de unión se recoge en los siguientes ejemplos: Proteína reguladora Componente b2) _ (proteína de unión celular con secuencia dé unión para la proteína regulado- =Ü p53 MDM-2 pRb • factor de transcripción E2F, -1, -2, -3 • ciclina-D?; -D2, -D3 o -C • ciclina-A, -E • factor de transcripción PU.l • factor de transcripción Elf-l pl30 • factor de transcripción E2F-5 • ciclina-A, -E Max Myc MAD • Myc VHL elongina.-C, -B Cdk4 pl4, pl5, pld, pl8, p27, p57, p21 MTS-1 (pl6) cdk4 WT-1 • p53 SMAD2 (MADR2: • DPC4 DPC-4 SMAD2 /3-catenina LEF-1 LEF-1 ß-catenina En una forma de realización particular de esta invención, el componente b2) es una secuencia de unión de una proteína -de unión no propia' de la célula para una proteína reguladora. Una secuencia de unión no propia de la célula de este tipo puede, por ejemplo, ser de origen viral, bacteriano o parasitario. La utilización de una secuencia de unión no propia de la célula de este tipo hace posible el que en células normales esté inhibida la función del componente b) debido a la unión de la respectiva proteína reguladora al componente b2) . Sin embargo, en células infectadas se une ampliamente la correspondiente proteína reguladora debido a la producción intracelular de la proteína de unión que contiene la secuencia de unión por parte del agente infeccioso respectivo. Con ello, en estas células el componente b) está libre y es funcional.

En otra forma de realización particular de esta invención, el componente b2) es un anticuerpo o una parte de un anticuerpo con secuencias de unión (VH y VL) para una proteína reguladora. Una elección no limitante de la invención de secuencias de unión no propias de la célula está recogida en los siguientes ejemplos: Proteína reguladora Componente b2) (proteína de unión viral con secuencia de unión para la proteína regulado- raj p53 • IE 84 de CMV (Speir et al., Science 265, 391 (1994) • E1B (55 Kd) de AV (Sarnow et al., Cell 28., 387 (1982); Liu et al . , Cold Spring Harbor Symp . On Quantitative Biol. LIX, 215 (1995)) • EBNA-5 de EBV (Szekeley et al., PNAS USA £0, 5455 (1993) ) • BHFR1 de EBV (Theodorakis et al., Oncogene 12., 1707 (1996) ) • E6 de HPV-16 ó -18 (Dyson et al., Science 243 , 934 (1989); Howes et al., Genes Dev. 8., 1300 (1994)) • proteína HBX de HBV (Wang et al., PNAS USA £1, 2230 (1994)) • antígeno T de SV40 (Lañe et al., Nature 278, 261 (1979); Linzer et al., Cell 17, 43 (1979)) pRb • E1A de AV (Nevis Science 258, 424 (1992)) • EBNA-2 de EBV • EBNA-1 ó -5 de EBV • E7 de HPV • antígeno T de SV40 pl30 • E1A de AV (Li et al., Genes Dev. 7, 2366 (1993)) CBF-1 (RBP-JK) • EBNA-2 de EBV (Zimber-Strobl et al., EMBO J. 13, 4973 (1994) ) NF-kappa B • Tax de HIV (Suzuki et al., Oncogene 9, 3099 (1994)) Lyn-tirosinquinasa • LMP-1 de EBV • LMP-2A o LMP-2B de EBV bak • E1B (16 Kd) de AV (Farrow et al., Nature 374, 731 (1995)) bax • E1B (19 Kd) de AV (Han et al., Genes Dev. 10, 461 (1996)) Proteína reguladora Anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con secuencia de unión (VH, V para la proteína reguladora p53 • anticuerpos monoclonales específicos para los dominios de unión de ADN no mutados (Legros et al., Oncogene JL 2071 (1994); 1, 3689 (1994); Hupp et al., Cell 71, 875 (1992); Abarzna et al., Cáncer Res. 55, 3490 (1995); Bonsing et al., Cyto- metry 28, 11 (1997); Thomas et al., J. Clin. Path. 50, 143 (1997) ; Jannot et al., BBRC 230, 242 (1997)) pRb • anticuerpos monoclonales específicos para pRb activo (no fosforilado) (Hu et al., Mol. Cell Biol. 11, 5792 (1991) ) En el caso de la elección de un anticuerpo, se han de emplear como componente b2) preferiblemente las partes del anticuerpo que se unen al epítopo FVL FVH, en el caso de origen murínico en forma humanizada. La humanización se efectúa del modo descrito por Winter et al. (Nature 349 , 293 (1991) y Hoogenbooms et al. (Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36 , 19 (1993)) . Los fragmentos de anticuerpo se preparan de mane-ra correspondiente al estado conocido de la técnica, por ejemplo en el modo descrito por Winter et al., (Nature 349 , 293 (1991), Hoogenbooms et al., Rev. Tr. Transfus. Hemobiol. 36., 19 (1993), Girol . Mol. Immunol . 28, 1379 (1991) o Huston et al., Int. Rev. Immunol . 10., 195 (1993). Una descripción detallada de la preparación de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos recombinantes se realizó en la solicitud de patente DE 196 49 645.4. Los fragmentos de anticuerpo recombinantes se preparan directamente a partir de hibridomas existentes o se aislan con ayuda de la tecnología de "exhibición del fago" a partir de genotecas de fragmentos de anticuerpos urínicos o humanos (Winter et al., Annu. Rev. Immunol . 12, 433 (1994)). Estos fragmentos de anticuerpos se emplean luego en el plano genético directamente para el acoplamiento con los componentes b y b3) . Para la preparación de fragmentos de anticuerpos recombinantes a partir de hibridomas, la información genéti-ca, que codifica los dominios que se unen a antígenos (VH, VL) de los anticuerpos, se obtiene por aislamiento del ARNm, la transcripción inversa del ARN en ADNc y la subsiguiente amplificación mediante reacción en cadena con polimerasa y oligonucleótidos complementaria a los extremos 5' ó 3' de los fragmentos variables. Los fragmentos de ADN, así obtenidos, que codifican los fragmentos VH y VL se clonan entonces en vectores de expresión bacterianos y, de esta forma, pueden expresarse, por ejemplo, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o fragmentos Fab. Nuevos fragmentos de a'hticuerpos pueden aislarse, mediante la tecnología de "exhibición de fagos", también directamente a partir de genotecas de anticuerpos (genotecas inmunes, genotecas nativas) de origen murínico o humano. En el caso de la "exhibición del fago" de fragmentos de anti-cuerpos, los genes de dominios que unen antígenos se clonan, en forma de genes de fusión, con el gen de la proteína envolvente g3P de bacteriófagos filamentosos en el genoma del fago o en vectores fagémidos en forma de genes de fragmentos scFv o en forma de genes de fragmentos Fab. Los fagos que se unen a antígenos se seleccionan en recipientes de plástico cargados con antígenos (en inglés panning) , en "perlas" paramagnéticas conjugadas con antígenos o mediante unión a superficies de células. Las genotecas inmunes se preparan mediante amplificación por PCR de los genes de los fragmentos de anticuerpos variables a partir de linfocitos B de animales b pacientes inmunizados. Para ello, se utilizan combinaciones de oligonucleótidos que son específicos de inmunoglobulinas murinas o humanas o de las familias de genes de inmunoglobulinas humanas . Con la utilización de donantes no inmunizados como fuente de los genes de inmunoglobulina se pueden preparar genotecas nativas. Alternativamente, se pueden emplear genes de la banda de gérmenes de inmunoglobulina para la preparación de repertorios semisintéticos de anticuerpos, completán-dose la región 3 determinante de la complementaridad de los fragmentos variables mediante PCR con ayuda de cebadores degenerados. Estas denominadas genotecas "de un solo recipiente" tienen la ventaja, frente a genotecas inmunes, de que los fragmentos de anticuerpos se pueden aislar frente a una pluralidad de antígenos a partir de una única genoteca. La afinidad de fragmentos de anticuerpos se puede continuar aumentando mediante la tecnología de "exhibición del fago", preparándose nuevas genotecas de fragmentos de anticuerpos ya existentes mediante mutagénesis casual, basada en codoi?es o preestablecida' mediante "desorden de la cadena" ("chain shuffling") de dominios individuales con fragmentos de repertorios nativos o con ayuda de cepas mutadoras bacterianas, y se aislan mediante la reselección en condiciones limitantes de fragmentos de anticuerpos con propiedades mejoradas. Adicionalmente, fragmentos de anticuerpos muríni-cos pueden humanizarse mediante intercambio escalonado de uno de los dominios variables por un repertorio humano y subsiguiente selección con el antígeno original ("selección guiada") . Al ernativamente, la humanización de anticuerpos murínicos se efectúa mediante intercambio preestablecido de las regiones hipervariables de anticuerpos humanos por las correspondientes regiones del anticuerpo murínico original . 1.2) Los dominios de activación [componente bx) ] y los dominios de unión de ADN [componente b3) ] En el sentido de la invención puden utilizarse todos los genes disponibles de dominios de activación y dominios de unión de ADN de un factor de transcripción para el componente b) . Ejemplos para ello, pero cuya descripción no debe limitar la invención, son.- - Dominios de activación [componente bx) ] de al menos de una secuencia • del ADNc para el dominio de transactivación (TAD) de carácter ácido de HSV1-VP16 (aminoácidos 406 a 488,- Triezenberg et al., Genes Developm. 2: 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gen. Developm. 5: 190 (1995) o aminoácidos 413 a 490; Regier et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, 883 (1993)) o • el dominio de activación de Oct-2 (aminoácidos 438 a 479; Tanaka et al., Mol. Cell. Biol. 14: 6046 (1994) o aminoácidos 3 a 154; Das et al., Nature 374: 657 (1995)) O • el dominio de activación de SP1 (aminoácidos 340 a " 485; Courey y Tij'an, Cell 55, 887 (1988)) o • el dominio de activación de NFY (aminoácidos 1 a 233; Li et al., J. Biol., Chem. 267, 8984 (1992) van Hujisduijnen et al., EMBO J. 9, 3119 (1990) Sinha et al., J. Biol. Chem. 92., 1624 (1995) Coustry et al., J. Biol. Chem, 270, 468 (1995)) o • el dominio de activación de ITF2 (aminoácidos 2 a 452; Seipel et al., EMBO J. 13, 4961 (1992)) o • el dominio de activación de c-Myc (aminoácidos 1 a 262; Eilers et al. ) o • el dominio de activación de CTF (aminoácidos 399 a 499; Mermod et al., Cell 58/ 741 (1989); Das y Herr, Nature 374, 657 (1995)) - Dominios de unión de ADN [componente b3) ] de al menos una secuencia • del ADNc para el dominio de unión de ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147;' Chasman y Kornberg, Mol. Cell. Biol. 10:2916 (1990)) o • de la proteína LexA (aminoácidos 1 a 81; Kim et al., Science 255: 203 (1992) o de la proteína LexA completa (aminoácidos 1 a 202; Brent et al., Cell 43: 729 (1985)) o • de la proteína del represor lac (lacl) (Brown et al., Cell 49: 603 (1987); Fuerst et al., PNAS USA 86: 2549 (1989)) o , • de la proteína del represor de tetraciclina (tet R) (Gossen et al., PNAS USA 89; 5547 (1992); Dingermann et al., EMBO J. 11: 1487 (1992)) o • de la proteína ZFHD1 (Pomerantz et al., Science 267: 93 (1995) ) . Es ventajoso en el sentido de la invención incorporar en el extremo 3' del dominio de unión de ADN una señal de localización nuclear (NLS) . 2) La secuencia de activación activable por el componente b) de la unidad de promotor II [componente c) ] - La elección de esta secuencia de activación se orienta en función de la elección del dominio de unión de ADN [componente b3) ] en el gen para un factor de transcripción [componente b) ] . Para los ejemplos recogidos en el apartado 1.2 de los dominios de unión de ADN existen, de nuevo, por ejemplo las siguientes posibilidades: 2.1) Posibilidad A) una secuencia de activación con al menos una secuencia de unión [secuencia de nucleótidos: 5'-CGGACAACTGTTGACCG-3'] (SEQ ID N0:1) para la proteína Gal4 (Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) y (en cuyo extremo 3') está incorporado • el promotor basal de SV40 (nucleótidos 48 a 5191; Tooze (comp.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor Nueva York, Nueva York; Cold Spring Harbor Laboratory) o • el promotor de c-fos (Das et al., Nature 374 , 657 (1995)) o • el promotor de ARN U2 sn o • el promotor de HSV TK (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990); Park et al., Molec. Endocrinol,. 7, 319 (1993)). 2.2) Posibilidad B) - una secuencia de activación • con al menos una secuencia de unión [secuencia de nucleótidos: 5 ' -TACTGTATGTACATACAGTA-3 ' ] (SEQ ID NO: 2) para la proteína LexA [operador LexA; Brent et al., Nature 612 , 312 (1984)] y (en cuyo extremo 3') está incorporado • el promotor basal de SV40 (nucleótidos 48 a 5191; Tooze (comp.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor Nueva York, Nueva " York; Cold Spring" Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la posibilidad A) . 2.3) Posibilidad C) - una secuencia de activación • con al menos una secuencia de unión del operador Lac (secuencia de nucleótidos: 5 ' -GAATTGTGAGC- GCTCACAATTC-3' ) (SEQ ID NO : 3 ) para la proteína del represor lac I (Fuerst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624 (1984)) y (en cuyo extremo 3') está incorporado el promotor basal de SV40 (nucleótidos 48 a 5191; Tooze (comp.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor, Nueva York, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la posibilidad A) . 2.4) Posibilidad D) - una secuencia de activación • con al menos una secuencia de unión del operador de tetraciclina (tet 0) (secuencia de nucleótidos: 5 ' -TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3 ' ) (SEQ ID NO: 4) para la proteína del represor de tetraciclina (tet R) y (en cuyo extremo 3') está incorporado • el promotor basal de SV40 (nucleótidos 48 a 5191; Tooze (comp.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor, Nueva York, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promotor (véase la posibilidad A) . 2.5) Posibilidad E) - una secuencia de activación • con al menos una secuencia de unión [secuencia de nucleótidos: 5 ' -TAATGATGGCG-3 ' ) (SEQ IDNO:5) para la proteína ZFHD-l (Pomerantz et al., Science 267 , "" 93 (1995)) y (en-'cuyo extremo 3') está incorporado • el promotor basal de SV40 (nucleótidos 48 a 5191; Tooze (comp.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor Nueva York, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory) u otro promo- tor (véase la posibilidad A) .

IV) Descripción detallada de las particularidades de la forma de realización B) 1) La secuencia de activación de la unidad de promotor I [componente a' ) ] 1.1) La secuencia de unión de ADN para una proteína reguladora [componente a._) ] A ella pertenecen las secuencias de unión de ADN para factores de transcripción que están impedidos mediante mutación en su capacidad de unión de ADN o están incrementados o reducidos cuantitativamente en la célula. Factores de transcripción y sus modificaciones se representaron en forma de compendio, por ejemplo, por Nichols et al., Blood 8.0, 2953 (1992); Crepieux et al., Crit. Rev. Oncogen. 5, 615 (1994); La Thangue, TIBS 1£, 108 (1994) ; Lipton, Nature Med. 3, 20 (1997) ) . Por ejemplo, a ellos pertence al menos una secuencia de unión de ADN para la proteína p53 [ATAATTGGGCAAGTCTAGGAA-3; (SEQ ID NO : 6) Kern et al., Science 252, 1708 (1991), Cho et al., Science 265, 346 (1994) o - (G/A) - (G/A) - (G/A) -C- (A/T) - (T/A) -G; Cho et al . , Science 265, 346 (1994)] para la proteína Wt-1 (Wang et al., Oncogene 10., 415 (1995); Borel et al., Biochem. 35/37, 12070 (1996)) para la proteína NF-kappa B (secuencia de nucleótidos 5' -GGGACTTTCC-3 ' ) (SEQ ID NO:7) ; Urban et al., Genes and Developm. 4, 1975 (1990) ,- Roug et al., Virol. 189; 750 (1992)) o HIV-LTR (Gimble et al., J. Virol. 62., 4104 (1988)) para el complejo E2F/DP-1 (al menos una secuencia de nucleótidos 5' -TTTTCCCGCCAAAA (SEQ ID NO: 8); Ó 5 ' -TTTTCCCGCCTTTTTT (SEQ ID NO : 9); Ó 5' -TTTTCCCGCGCTTTTTT) (SEQ ID NO: 10) (Ouellete et al., Oncogene 7, 1075 (1992)) para la proteína Myc/Max (al menos una secuencia de nucleótidos de 5 ' -CACGTG-3 ' ) (Walhout et al., Nucí. Acids Res. 25., 1493 (1997); Nozaki et al., J. Biochem. 121, 550 (1997)) o de 5 ' - -CATGTG-3' (Físher et al., EMBO J. 12, 5075 (1993)) 1.2) el promotor basal [componente a2) ] A él pertenecen, por ejemplo: el promotor basal de SV40 (nucleótidos 48 a 5191; Tooze (comp.) , DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor Nueva York, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory) o el promotor de c-fos (Das et al., Nature 374 , 657 (1995)) o el promotor de ARN Us sn o el promotor de HSV TK (Papavassiliou et al., J. Biol. Chem. 265, 9402 (1990); Park et al., Mol. ?ndocrin. 7, 319 (1993)) ) El represor [componente b' ) ] A él pertenecen, por ejemplo el represor lac (Brown et al., Cell 49, 603 (1987); Fürst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989) o el represor de tetraciclina (Gossen et al., PNAS USA 89., 5549 (1992); Dingermann et al., EMBO J. 11, 1487 (1992)) ) La secuencia de activación [componente cx) ] influenciada por el componente b') A ella pertenecen, por ejemplo, todas las secuencias de activación recogidas seguidamente en el apartado V) . 4 ) la secuencia de unión de ADN para el represor [componente c2) ] A ella pertenecen, por ejemplo: al menos una secuencia de unión del operador lac ( secuencia de nucleótidos : 5 ' -GAATTGTGAGCGCTCACAATTC-3 ' ) (SEQ ID NO: 3) para la proteína del represor lac I (Fürst et al., PNAS USA 86, 2549 (1989); Simons et al., PNAS USA 81, 1624 (1984) ) o al menos una secuencia de unión del operador de tetraciclina (tet O) (secuencia de nucleótidos: 5 ' -TCGAGTTTAC- CACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3' ) (SEQ ID NO: 4) para la proteína del represor de tetraciclina (tet R) .

V) la secuencia de activación I [componente a) en la forma de realización A) y componente c_) en la forma de realización B) ] En el sentido de la invención se han de utilizar como secuencias de activación secuencias de nucleótidos que, después de la unión de factores de transcripción, activan la transcripción de un gen situado contiguo al extremo 3'. La elección de la secuencia de activación se orienta en función de la enfermedad a tratar y de la célula diana a transducir. Así, la secuencia de activación [componente a)] puede ser activable de forma ilimitada, de forma específica de la célula diana, en determinadas condiciones metabólicas, de forma específica del ciclo ''celular o de forma específica del virus. Una descripción detallada de estas secuencias de promotor se realizó ya en las solicitudes de patente EP 95930524.4, EP95931933.6 , EP95931204.2 , EP95931205.9 , EP97101507.8, EP97102547.3 , DE19639103.2 y DE19651443.6. A las secuencias de promotor a elegir pertenecen, por ejemplo: 1) Promotores y secuencias de activador activables' de forma ilimitada tales como, por ejemplo el promotor de la ARN-polimerasa III el promotor de la ARN-polimerasa II - el promotor y reforzador de CMV el promotor de SV40 2) Secuencias de promotor y activador virales tales como, por ejemplo, - HBV HCV HSV HPV EBV - HTLV HIV En el caso de utilizar el promotor de HIV, se ha de emplear, como promotor específico del virus, toda la secuencia de LTR, incluida la secuencia de TAR [posicio- nes -453 a -80, Rosen et al., Cell 41, 813 (1985)] . 3) Secuencias de promotor y reforzador activables metabólicamente tales como, por ejemplo, el reforzador inducible por hipoxia. 4) Promotores activables de forma específica del ciclo celular Tales promotores son, por ejemplo, el promotor del gen cdc25C, del gen ciclina A, del gen cdc2 , del gen B-myb, del gen DHFR, del gen E2F-1, del gen cdc25B, o bien secuencias de unión para factores de transcripción que se manifiestan o son activados durante la proliferación celular. A estas secuencias de unión pertenecen, por ejemplo, secuencias de unión para proteína c-myc. A estas secuencias de unión se han de incluir monómeros o multímeros de la secuencia de nucleótidos designada caja Myc E [5' -GGAAGCAGACCACGTGGTCTGCTTCC-3 ' ) (SEQ ID NO: 11) ; Blackwood y Eisenmann, Science 251: 1211 (1991)] .

) Promotores activables por tetraciclina tales como, por ejemplo, el operador de tetraciclina en combinación con un correspondiente represor. I 6) Promotores quiméricos Un promotor quimérico representa la combinación de una secuencia de activador situada más arriba, específica de la célula, activable por vía metabólica ó de forma específica del virus con un módulo del promotor situado más abajo que contiene la secuencia de nucleótidos CDE-CHR o E2FBS-CHR a la cual se unen proteínas supresoras, las cuales, con ello, pueden inhibir la activación de la secuencia de activador situada más arriba en las fases G0 y Gx del ciclo celular (documento PCT/GB94/17366 ; Lucibello et al., EMBO J. 14, 12 (1994) ) . 7) Promotores activables de forma específica de la célula A ellos pretenecen preferiblemente promotores o secuencias de activador a base de promotores o reforzadores de genes que, formados preferiblemente para proteínas, codifican células elegidas. Por ejemplo, en el sentido de la invención se han de utilizar preferiblemente en las siguientes células promotores para las siguientes proteínas: 7.1 Secuencias de promotor y activador activadas en células endoteliales - *• transportador de1 glucosa-1 endotelial, específico del cerebro endoglina receptor-1 de VEGF (flt-1) receptor-2 de VEGF (flk-1, KDR) - tie-1 o tie-2 receptor de B61 (receptor de Eck) B61 endotelina, en especial endotelina B o endotelina- -1 receptores de endotelina, en particular receptor de endotelina B receptores de manosa-6-fosfato factor von Willebrand IL-la, IL-10 receptor de IL-1 - molécula de adhesión de células vasculares (VCAM- -1) secuencias de activador sintéticas Como alternativa a promotores específicos de células endoteliales naturales se pueden utilizar también secuencias de activador sintéticas que consisten en sitios de unión oligomerizados para factores de transcripción que son activos de forma preferencial o selectiva en células endoteliales. Un ejemplo de ello es el factor de transcripción GATA-2, cuyo sitio de unión en el gen de endotelina-1 es 5'-TTATCT-3' [Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dormann et al., J.

Biol. Chem. 267, 1279 (1992) y Wilson et al., Mol. Cell Biol. , 4854 (1990) ] . 7.2 Promotores o secuencias de activador, activados en células en vecindad de células endoteliales activadas VEGF Las secuencias reguladores de genes para el gen de VEGF son la región flanqueante 5', la región flanqueante 3', el gen c-Src o el gen v-Src - *- receptores de hormonas esteroides y sus elementos de promotor (Truss y Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), en particular el promotor del virus del tumor de mama de ratón. 7.3 Promotores o secuencias de activador, activados en células musculares, en particular células musculares lisas tropomiosina a-actina c-miosína - receptor para PDGF receptor para FGF MRF-4 fosfofructoquinasa A fosfogliceratomutasa - troponina C miogenina receptores para endotelina A desmina VEGF Las secuencias reguladores de genes para el gen de VEGF ya han sido recogidas en el apartado "Promotores activados en células en vecindad dé células endoteliales activadas" (véase antes) promotores "artificiales" Factores de la famila hélice-bucle-hélice (HLH) (MyoD, Myf-5, miogenina, MRF4) se describen como factores de transcripción específicos de los músculos. Además de ello, a los factores de transcripción específicos de los músculos pertenece la proteína de dedo de cinc GATA-4. Las proteínas HLH así como GATA-4 muestran una transcripción específica de los músculos no sólo con promotores de genes específicos de los músculos, sino también en un contexto heterólogo, así * también con promotores artificiales. Promotores artificiales de este tipo son, por ejemplo, copias múltiples del sitio de unión (ADN) para proteínas HLH específicas de los músculos tal como la caja E (Myo D) (por ejemplo, 4x AGCAGGTGTTGGGAGGC) o copias- múltiples del sitio de unión de ADN para GATA-4 del gen de la cadena pesada de a-miosina (por ejemplo, 5' -GGCCGATGGGCAGATAGAGGGGGCCGATGGGC- AGATAGAGG3') (SEQ ID NO: 12) Promotores y secuencias de activador, activados en células glia A ellos pertenecen, en particular, las secuencias reguladoras de genes o elementos a base de genes que codifican, por ejemplo, las siguientes proteínas: - la proteína periaxina específica de células de Schwann glutaminsintetasa la proteían específica de células glia (proteína acida fibrilar glial = GFAP) - la proteína de células glia SlOOb IL-6 (CNTF) receptores de 5-HT TNFa ' IL-10 - receptores I y II del factor de crecimiento similar a insulina VEGF Las secuencias reguladoras de genes para el gen VEGF ya han sido recogidas anteriormente.

Promotores y secuencias de activador, activados en células hematopoyéticas A secuencias reguladoras de genes de este tipo pertene-ceíl secuencias de proftiotor para genes de una citoquina o de su receptor, las cuales son expresadas en células hematopoyéticas o en células vecinas tales como, por ejemplo, el estroma. A ellas pertenecen secuencias de promotor para, por ejemplo, las siguientes citoquinas y sus receptores: receptor del factor de células primitivas factor de células primitivas IL-Ia receptor de IL-1 IL-3 - receptor de IL-3 (subunidad a) receptor de IL-3 (subunidad ß) IL-6 receptor de IL-6 GM-CSF - receptor de GM-CSF (cadena o;) factor regulador del interferon 1 (IRF-l) El promotor de IRF-1 es activado de igual manera por IL-6 que por IFN? o IFN/3 eritropoyetina - receptor de eritropoyetina Promotores y secuencias de activador, activados en linfocitos y/o macrófagos A ellos pertenecen, por ejemplo, las secuencias de promotor y activador de los genes para citoquinas, receptores de citoquinas y moléculas de adhesión y receptores para el fragmento Fc de anticuerpos . A ellos pertenecen, por ejemplo: - receptor de IL-1 IL-la IL-l/ß IL-2 receptor de IL-2 - " IL-3 receptor de IL-3 (subunidad CÜ) receptor de IL-3 (subunidad ß) IL-4 receptor de IL-4 - IL-5 IL-6 receptor de IL-6 factor regulador del interferon 1 (IRF-1) (El promotor de IRF-1 es activado de igual manera por IL-6 que por IFN? o IFN3) - promotor que responde a IFN? IL-7 IL-8 IL-10 IL-11 - IFN? GM-CSF receptor de GM-CSF (cadena ) IL-13 LIF - receptor del factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF) receptores de barrido de macrófagos tipos I y II MAC-1 (antígeno funcional de leucocitos) LFA-la (antígeno funcional de leucocitos) - pl50,95 (antígeno funcional de leucocitos) Secuencias de promotor y activador, activadas en células sinoviales A ellas pertenecen las secuencias de promotor para metaloproteinasas de la matriz (MMP) , por ejemplo para: MMP-1 (colagenasa intersticial) MMP-3 (estromelisina/transina) A ellas pertenecen, además, secuencias de promotor para inhibidores de tejidos' de metaloproteinasas (TIMP) , por ejemplo TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 Promotores y secuencias de activador, activados en células de leucemia A ellos pertenecen, por ejemplo, promotores para c-myc - HSP-70 bcl-1/ciclina D-1 bcl-2 IL-6 IL-10 - TNFa, TNF0 HOX-11 BCR-Abl E2A-PBX-1 PML-RARA (receptor del ácido retinoico de leucemia promielocítica) - . c-myc proteínas c-myc se unen y activan multímeros de la secuencia de nucleótidos ( 5 ' -GGAAGCCAGAC- CAGCTGGTCTGCTTCC-3' ) (SEQ ID N° : 11) designada caja Myc E Promotores o secuencias de activador activados en células tumorales Como secuencia de promotor o activador está prevista una secuencia de nucleótidos reguladora de genes, con la que interactúan factores de transcripción formados o activos en células tumorales . En el sentido de esta invención pertenecen a los promotores o secuencias de activador preferidos secuencias o elementos reguladores de genes a base de genes que codifican proteínas formadas particularmente en células cancerígenas o células de sarcoma. Así, en el caso de carcinomas bronquiales de células pequeñas se utiliza preferiblemente el promotor de la proteína N--CAM, en el caso de carcinomas de ovario, el promotor del receptor del "factor de crecimiento de la hepatitis" o de la L-plastina, y en el caso de carcinomas de páncreas, el promotor de la L-plastina o de la mucina epitelial polimorfa (PEM) .

VI. El gen efector [componente d) ] En el sentido de la invención, los genes efectores [componente d) ] codifican una sustancia activa para la profilaxis y/o terapia de una enfermedad. Genes 'efectores y secuencias de promotor se han de elegir en relación con el tipo de terapia de la enfermedad y teniendo en cuenta la célula diana a transducir. Por ejemplo, en el caso de las siguientes enfermedades, se han de elegir las siguientes combinaciones de secuencias de promotor y genes efectores (una descripción detallada ya se efectuó en las solicitudes de patente EP95930524.4, EP95931933.6, EP95931204.2 , EP95931205.9 , EP97101507.8 , DE 19617851.7, DE19639103.2 y DE19651443 , 6 , a las que se hace referencia) . 1) Terapia de tumores 1.1) Células diana.- - células endoteliales proliferantes o - células de estroma vecinas a la célula endotelial y células musculares o - células tumorales o células de leucemia 1.2) Promotores: '' - específicos de la célula endotelial y específicos del ciclo celular o - inespecíficos de la célula o específicos de la célula muscular y específicos del ciclo celular o 1 - específicos de la célula tumoral (tumores sóli- dos, leucemia) y específicos del ciclo celular ) Genes efectores para inhibidores de la proliferación celular, por ejemplo para - la proteína del retinoblastoma (pRb=pllO) o las proteínas pl07 y pl30 relacionadas La proteína del retinoblastoma (pRb/pllO) y las proteínas pl07 y pl30 relacionadas son inactiva- das por fosforilación. Preferiblemente, se han de utilizar genes de estos inhibidores del ciclo celular que presenten mutaciones para los sitios de inactivación de las proteínas expresadas sin que con ello perjudiquen su función. Ejemplos de estas mutaciones se describieron para la pllO . De manera análoga, se muta la secuencia de ADN para la proteína pl07 o la proteína pl30. - la proteína p53 La proteína p53 es inactivada en la célula por unión a proteínas especiales tales como, por ejemplo, MDM2 o por oligomerización de la p53 a través de la serina C-terminal desfosforilada . Preferiblemente, se utiliza por consiguiente una secuencia de ADN para una proteína p53 que está acortada en el extremo C en la serina 392. - la p21 (WAF-1) - la proteína pl6 - otros inhibidores de cdk - la proteína GADD45 - la proteína bak "" - una proteína de -Unión para una proteína reguladora (véase II.1.) ) Genes efectores para factores inductores de la coagulación e inhibidores de la angiogénesis, por ejemplo: - inhibidor del activador de plasminógeno- 1 (PAI-l) - PAI-2 - PAI-3 - angiostatina - interferones (IFNa, IFN/3 o IFN?) - factor de plaquetas 4 - TIMP-l - TIMP-2 - TIMP-3 - factor inhibidor de la leucemia (LIF) - factor tisular (TF) y sus fragmentos 'con actividad coagulante Genes efectores para proteínas citostáticas y citotóxicas, por ejempo para - perforina ' - granzima - IL-2 - IL-4 - IL-12 - interferones tales como, por ejemplo, IFN-a, IFN3 o IFN? - TNF tal como TNFa o TNFß - oncostatina M - esfingomielinasa - magainina y derivados de maganinina Genes efectores para anticuerpos citostáticos o citotóxicos y para proteínas de fusión entre fragmentos de anticuerpo que se unen a antígenos con proteínas o enzimas citostáticas, citotóxicas o inflamatorias . A los anticuerpos citostáticos o citotóxicos pertenecen los dirigidos contra estructuras de la membrana de células endoteliales tales como se describieron, por ejemplo, por Bu- rrows et al. (Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)), Hughes et al., (Cáncer Res. 49, 6214 (1989)) y Maruyama et al., (PNAS USA 87, 5744 (1990)) . En particular, a ellos pertenecen anticuerpos contra los receptores de VEGF. - Además, a ellos pertenecen anticuerpos citostáticos o citotóxicos dirigidos contra estructuras de la membrana en células tumorales. Anticuerpos de este tipo se representaron de forma sinóptica, por ejemplo, por Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32., editorial Karger, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 43., editorial Karger, Munich (1992) . Otros ejemplos los representan los anticuerpos contra sialilo Lewis ,- contra péptidos en tumores, que son reconocidos por células T; contra proteínas expresadas por oncogenes,- contra gangliósidos tales como GD3 , GD2 , GM2 , 9-0-acetilo GD3 , fucosilo GM1,- contratantíge- nos de grupos sanguíneos y sus precursores,- contra antígenos en la mucina epitelial polimorfa; contra antígenos en proteínas de choque térmico Además, pertenecen a ellos anticuerpos dirigidos contra estructuras de la membrana de células de leucemia. Un gran número de anticuerpos monoclonales de este tipo ya ha sido descrito para procedimientos diagnósticos y terapéuticos (recopilaciones en Kristensen, Danish Medical Bulletin 41, 52 (1994 Schranz, Thérapia Hungarica ¿8, 3 (1990 Drexler et al., Leuk. Res. 10., 279 (1986 Naeim, Dis. Markers 7., 1 (1989) ; Stickney et al., Curr.. Opin. Oncol. 4, 847 (1992); Drexler et al., Blut 57, 327 (1988) ; Freedman et al., Cáncer Invest. 9., 69 (1991)) . En función del tipo de la leucemia, son adecúa- dos, como ligandos, por ejemplo anticuerpos monoclonales o sus fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos dirigidos contra los siguientes antígenos de la membrana: Células Antígeno de la membrana AML CD13 CD15 CD33 10 sialosilo-Le B-CLL CD5 CDlc CD23 15 idiotipos e isotipos de las inmunoglobulinas de la membrana T-CLL CD33 20 M38 receptores de IL-2 receptores de células T ALL CALLA 25 CD19 linfoma no de Hodgkin La humanización de anticuerpos murínicos, la preparación y optimización de los genes para Fab y fragmentos Fv recombinantes se efectúa de manera correspondiente a la técnica conocida por el experto en la materia. La fusión de los fragmentos Fv recombinantes con genes para proteínas o enzimas citostáticas, cito¬ tóxicas o inflamatorias se efectúa de igual manera, de manera correspondiente al estado de la técnica conocido por el experto en la materia . 7) Genes efectores para proteínas de fusión de ligan- dos que se unen a células diana con proteínas citostáticas y citotóxicas. A los ligandos pertenecen todas las sustancias que se unen a estructuras de la membrana o receptores de la membrana en células endoteliales. Por ejemplo, a ellos perte- necen citoquinas tales como, por ejemplo, IL-1 o factores de crecimiento o sus fragmentos o secuencias parciales que, expresados en receptores, se unen mediante células endote- liales tales como, por ejemplo, PDGF, bFGF, VEGF, TGF. Además, pertenecen a ellos moléculas de adhesión que se unen a células endoteliales activadas y/o proliferantes. A ellos pertene- cen, por ejemplo, SLex, LFA-1, MAC-1, LECAM- 1, VLA-4 o vitronectina. A ellos pertenecen, además, sustancias que se unen a estructuras de la membrana o receptores de la membrana de células tumorales o de _ leucemia. Por ejemplo, a ellas pertenecen, por ejemplo, hormonas o factores de crecimiento o sus fragmentos o secuencias parciales que se unen a receptores expresados por células de leucemia o células tumorales. " Factores de •' crecimiento de este tipo ya se describieron (recopilaciones en Cross et al., Cell 64, 271 (1991), Aulitzky et al., Drugs 48, 667 (1994), Moore, Clin. Cáncer Res . 1, 3 (1995), Van Kooten et al., Leuk. Lymph. 12, 27 (1993) ) . La fusión de los genes de estos ligandos que se unen a la célula diana con proteínas o enzimas citostáticas, citotóxicas o inflamatorias se efectúa de manera correspondiente al estado de la técnica con los métodos conocidos por el experto en la materia.

Genes efectores para inductores de inflamaciones, por ejemplo para IL-1 - IL-2 RANTES (MCP-2) factor quimiotáctico y activante de monocitos (MCAF) IL-8 - proteína inflamatoria de macrófagos -1 (MIP-la, -ß) proteína activante de neutrófilos -2 (NAP-2) IL-3 IL-5 - factor inhibidor de la leucemia humana (LIF) IL-7 IL-11 IL-13 GM-CSF - G-CSF M-CSF factor del veneno de cobra (CVF) o secuencias parciales de CVF que corresponden funcionalmente al factor de complemento C3b humano, es decir que se1 pueden unir al factor de complemento B y que, después de la separación por parte del factor D, representan una converta- sa C3 el factor de complemento humano C3 o su secuencia parcial C3b productos de disociación del factor de com- plemento humano C3 que se asemejan funcional y estructuralmente al CVF proteínas bacterianas que activan el complemento y desencadenan inflamaciones tales como, por ejemplo, proteínas de Salmonella typhi murium, factores "agrupantes" de Sta- phylococcus aureus, modulinas, en particular de bacterias gram-negativas, "proteína de la membrana externa principal" de legionelas o de Haemophilus influenzae tipo B 'o de Kleb- siellas o de moléculas M de estreptococos del grupo G.

Genes efectores para enzimas para la activación de precursores para agentes citostáticos, por ejemplo para enzimas que disocian sustancias previas inactivas (profármacos) en agentes citostáticos activos (fármacos) . Sustancias de este tipo y los profármacos y fárma-cos respectivos correspondientes ya han sido descritos de forma recopilativa por Deonarain et al . (Br. J. Cáncer 70, 786 (1994)), Mullen, Pharmac . Ther. 63., 199 (1994)) y Harris et al. (Gene Ther. 1, 170 (1994)) . Por ejemplo, se ha de utilizar la secuencia de ADN de una de las siguientes enzimas: timidinquinasa del virus Herpes simplex timidinquinasa del virus Varizella zoster nitrorreductasa bacteriana /3-glucuronidasa bacteriana ,ß-glucuronidasa vegetal de Sécale cereale /3-glucuronidasa humana carboxipeptidasa humana (CB) , por ejemplo CB- -A de la célula cebada, CB-B del páncreas o carboxipeptidasa bacterina - /3-lactamasa bacteriana citosina-desaminasas bacterianas catalasa o peroxidasa humana fosfatasa, en particular fosfatasa alcalina humana, fosfatasa acida de la próstata humana o fosfatasa cida del tipo 5 - oxidasa, en particular lisiloxidasa humana o D-aminooxidasa acida humana peroxidasa, en particular glutation-peroxidasa humana, peroxidasa de eosinófilos humana o peroxidasa de los ganglios lifáticos humana - galactosidasa pia de enfermedades autoinmunes e inflamaciones 1) Células diana: - células endoteliales proliferantes o macrófagos y/o linfocitos o células sinoviales 2) Promotores: - específicos de las células del endotelio y específicos del ciclo celular o específicos de macrófagos y/o linfocitos y/o específicos del ciclo celular o específicos de las células sinoviales y/o específicos del ciclo celular 3) Genes efectores para la terapia de alergias, por ejemplo para IFN/3 - IFN? •• IL-10 anticuerpos o fragmentos de anticuerpos contra IL-4 receptores de IL-4 solubles - IL-12 TGF/3 Genes efectores para evitar el rechazo de órganos trasplantados, por ejemplo para IL-10 TGF/3 - receptores de IL-1 solubles receptores de IL-2 solubles antagonistas de receptores de IL-1 receptores de IL-6 solubles anticuerpos inmunosupresores o sus fragmentos que contienen VH y VL o sus fragmentos VH y VL unidos a través de un enlazador. Anticuerpos inmunosupresores son, por ejemplo, anticuerpos específicos para el receptor de células T o su complejo CD3 , contra CD4 o CD8 y, ade- más, contra el receptor de IL-2, el receptor de IL-l o el receptor de IL-4 o contra las moléculas de adhesión CD2 , LFA-1, CD28 o CD40 Genes efectores para la terapia de enfermedades autoinmunes mediadas por anticuerpos", por ejemplo para TGF3 IFNa IFN3 - IFN? IL-12 receptores de IL-4 solubles receptores de IL-6 solubles anticuerpos inmunosupresores o sus fragmentos con contenido en VH y VL Genes efectores para la terapia de enfermedades autoinmunes mediadas por células, por ejemplo para IL-6 - IL-9 IL-10 IL-13 TNFa o TNF/3 un anticuerpo inmunosupresor o sus fragmentos con contenido en VH y VL Genes efectores para inhibidores de la proliferación celular, proteínas y enzimas citostáticas o citotóxicas para la activación de precursores de agentes citostáticos Ejemplos de genes que codifican proteínas de este tipo ya se han señalado en el apartado "genes efectores para la terapia de tumores". De igual manera a la allí ya descrita, en el sentido de la invención pueden utilizarse genes efectores que codifican proteínas de fusión de anticuerpos o fragmentos Fab o Fv recombinantes de estos anticuerpos u otros ligandos específicos para la célula diana y las citoquinas, factores de crecimiento, receptores, proteínas y enzimas citostáticas o citotóxicas antes indicados.

Genes efectores para la terapia de la artritis En el sentido de la invención se eligen genes efectores, cuya proteína expresada inhibe directa o indirectamente la inflamación, por ejemplo en la articulación, y/o fomenta la reconstitución de matriz extracelular (cartílago, tejido conjuntivo) en la articulación. A ellos pertenecen, por ejemplo antagonista del receptor de IL-1 (IL-l-RA) ; IL-l-RA inhibe la unión de IL-la, ß receptor de IL-1 soluble el receptor de IL-1 soluble une e inactiva IL-1 IL-6 IL-6 aumenta la secreción de TIMP y superóxi- dos y reduce la secreción de IL-1 y TNFa por parte de células sinoviales y condrocitos - receptor de TNF soluble el receptor de TNF soluble une e inactiva TNF. IL-4 IL-4 inhibe la formación y secreción de IL-1, TNFa y MMP IL-10 IL-10 inhibe la formación y secreción de IL- 1, TNFa y MMP y aumenta la secreción de TIMP factor del crecimiento similar a insulina (IGF-1) IGF-1 estimula la síntesis de matriz extracelular. TGFß, en especial TGF/31 y TGF32 TGF3 estimula la síntesis de matriz extrace- lular superoxidodismutasa TIMP, en especial TIMP-1, TIMP-2 o TIMP-3 ia de la formación defiente de células de la sangre ) Células diana: células inmaduras proliferantes del sistema hematopoyético células del estroma vecinas a las células - hematopoyéticas ) Promotores: específicos para células hematopoyéticas y/o específicas del ciclo celular - inespecíficos de las células y específicos del ciclo celular 3.3) Genes efectores para la terapia de la anemia, por ejemplo para eritropoyetina 3.4) Genes efectores para la terapia de la leucopenia, por ejemplo para G-CSF GM-CSF M-CSF 3.5) Genes efectores para la terapia de la trombocitopenia, por ejemplo para IL-3 factor inhibidor de leucemia (LIF) - IL-11 trombopoyetina rapia de lesiones del sistema nervioso 4.1) Células diana: células glia o células endoteliales proliferantes 4.2) Promotores: - específicos de células glía y específicos del ciclo celular o específicos de células endoteliales y específicos del ciclo celular o inespecíficos y específicos del ciclo celular 4.3) Genes efectores para factores de crecimiento neuronales, por ejemplo FGF t factor de crecimiento nervioso (NGF) - factor neurotrópico derivado del cerebro (BDNF) neurotrofina-3 (NT-3) neurotrofina-4 (NT-4) factor neurotrófico ciliar (CNTF) 4.4) Genes efectores para enzimas, por ejemplo para tirosinhidroxilasa dopadecarboxilasa 4.5) Genes efectores para citoquinas y sus inhibidores que inhiben o neutralizan el efecto neúrotóxico de TNFa!, por ejemplo para TGF/3 receptores de TNF solubles receptores de TNF que neutralizan TNFa - IL-10 IL-10 inhibe la formación de IFN?, TNFa, IL-2 e IL-4 receptores de IL-l solubles receptor I de IL-1 - receptor II de IL-1 receptores de IL-1 solubles neutralizan la actividad de IL-l antagonista del receptor de IL-1 receptores de IL-6 solubles ) Terapia de trastornos del sistema de la coagulación sanguínea y de la circulación sanguínea .1) Células diana: - _ células endOteliales o células endoteliales proliferantes o células somáticas en vecindad de células endoteliales y células musculares lisas o macrófagos .2) Promotores inespecíficos de la célula y específicos del ciclo celular o específicos de células endoteliales, células musculares lisas o macrófagos y específicos del ciclo celular Genes estructurales para la inhibición de la coagulación o para el fomento de la fibrinolisis, por ejemplo para - activador de plasminógeno de tejidos (tPA) activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) híbridos de tPA y uPA proteína C - hirudina inhibidores de serina-proteinasa (serpina) tales como, por ejemplo, inhibidor de C-1S, antitripsina al o antitrombina III inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) Genes efectores para el fomento de la coagulación, por ejemplo para F VIII F IX - factor von Willebrand F XIII PAI - 1 PAI-2 factor tisular y fragmentos del mismo Genes efectores para factores de la angiogénesis, por ejemplo para VEGF FGF Genes efectores para la disminución de la presión sanguínea, por ejemplo para calicreína "sintasa de óxido nítrico" de células endote- liales .7) Genes efectores para la inhibición de la proliferación de células musculares lisas después de lesiones de la capa endotelial, por ejemplo para una proteína antiproliferante, citostática o citotóxica o una enzima para la separación de precursores de agentes citostáticos en agentes citostáticos tal como se ha indicado ya antes (en el apartado tumor) o - una proteína de fusión de una de estas sustancias activas con un ligando, por1 ejemplo un anticuerpo o fragmentos de anticuerpos específicos para células musculares .8) Genes efectores para otras proteínas del plasma sanguíneo, por ejemplo para albúmina inactivador de Cl colinesterasa de suero - transferrina 1-antitripsina 6) Vacunaciones 6.1) Células diana: •• células musculares o macrófagos y/o linfocitos células endoteliales 6.2) Promotores: inespecíficos y específicos del ciclo celular o específicos de la célula diana y específicos del ciclo celular 6.3) Genes efectores para la profilaxis de enfermedades infecciosas Las posibilidades de preparar vacunas eficaces por vía convencional son limitadas . Por consiguiente, se desarrolló la tecnología de la vacuna de ADN. Estas vacunas de ADN plantean, sin embargo, cuestiones en cuanto al poder de actividad. Conforme a esta invención, se ha de contar con una mayor actividad de las vacunas de ADN. Como sustancia activa se ha de elegir un ADN de una proteína formada por el agente patógeno infec- cioso que, mediante desencadenamiento de una reacción inmune, es decir mediante unión de anti- cuerpos y/o mediante linfocitos T citotóxicos, conduce a la neutralización y/o al exterminio del agente patógeno. Los denominados antígenos de neutralización de este tipo ya se emplean como antígenos de vacunación (véase un compendio en Ellis, Adv. Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)). En el sentido de la invención se prefiere el ADN que codifica antígenos de neutralización de los siguientes agentes patógenos: virus de la influenza A *" HIV virus de la rabia HSV (virus Herpes simplex) RSV (virus sincitial respiratorio) virus de parainfluenza - rotavirus V21V (virus Varicella zoster) CMV (citomegalovirus) virus del sarampión HPV (papilomavirus humano) HBV (virus de la hepatitis B) - HCV (virus de la hepatitis C) HDV (virus de la hepatitis D) HEV (virus de la hepatitis E) HAV (virus de la hepatitis A) antígeno de Vibrio cholerae - Borrelia burgdorferi Helicobacter pylori antígeno de la malaria A sustancias activas de este tipo en el sentido de la invención pertenece, sin embar- go, también el ADN de un anticuerpo anti- -idiotipo o de sus fragmentos que unen antígenos, cuyas estructuras de unión de antígenos (las "regiones determinantes de la com- plementariedad" ) representan copias de la estructura de la proteína o hidrato de carbono del antígeno de neutralización del agente patógeno infeccioso. Anticuerpos anti-idiotipo de este tipo pueden reemplazar en particular antígenos de hidratos de carbono en el caso de agentes patógenos infecciosos bacterianos . Anticuerpos anti-idiotipo de este tipo y sus productos de disociación ya se describieron a modo de compendio por Hawkins et al. (J. Immunother :' 14, 273 (1993)) y Westerink y Apicella (Springer Seminars in Immunopathol . 15, 227 (1993) ) .

Genes efectores para "vacunas contra tumores" - A ellos pertenecen antígenos a base de células tumorales . Antígenos de este tipo se presentaron a modo de compendio, por ejemplo, por Sedlacek et al., Contrib. to Oncol. 32., editorial Karger, Munich (1988) y Contrib. to Oncol. 43., editorial Karger, Munich (1992). Otros ejemplos los representan los genes para los siguientes antígenos de proteínas o para la región variable (VL, VH) de anticuerpos anti-idiotipo correspondientes a los siguientes antígenos no proteínicos : - gangliósidos : sialilo Lewis péptidos sobre tumores que son reconocidos por células T proteínas expresadas por oncogenes - antígenos de grupos sanguíneos y sus precursores antígenos sobre mucina asociada a tumores antígenos sobre proteínas de choque térmico La terapia de enfermedades infecciosas crónicas .1) Célula diana: célula del hígado linfocito y/o macrófago - célula epitelial célula endotelial .2) Promotores: específicos del virus o específicos de la *" célula y específicos del ciclo celular 3) Genes efectores, por ejemplo para una proteína que presenta efectos cistostáti- cos, apoptóticos o citotóxicos - una enzima que disocia en la sustancia activa un precursor de una sustancia antiviral o citotóxica . 7.4) Genes efectores para proteínas antivirales citoquinas y factores de crecimiento con 5 actividad antiviral. A ellos pertenecen, por ejemplo, IFNcü, IFNjg, IFN?, TNF?, TNFa, IL-1 o TGF3 anticuerpos de una especificidad que inacti- van el virus respectivo o sus fragmentos que 10 contienen VH y VL o a sus fragmentos VH y VL unidos a través de un enlazador, preparados como ya se ha descrito. Anticuerpos contra antígeno del virus son, por ejemplo: 15 anti-HBV anti-HCV anti-HSV anti-HPV anti-HIV 20 anti-EBV anti-HTLV anti-virus Coxsackie anti-virus Hantaan una proteína que une Rev. Estas proteínas se 25 unen al ARN de Rev e inhiben las etapas post- -transcripcionales dependientes de Rev de la expresión de genes de retrovirus. Ejemplos de proteínas que unen Rev son: RBP9-27 30 - RBP1-8U -' , RBP1-8D pseudogenes de RBP1-8 ribozimas las cuales digieren el ARNm de genes para proteínas del control del ciclo 35 celular o el ARNm de virus. Ribozimas catalíticas para HIV se describieron a modo de compendio, por ejemplo, por Christoffersen et al., J. Med. Chem. 38, 2033 (1995).

) Genes efectores para proteínas antibacterianas A las proteínas antibacterianas pertenecen, por ejemplo, anticuerpos que neutralizan las toxinas bacterianas u opsonizan bacterias. Por ejemplo, a ellos pertenecen anticuerpos contra meningococos C o B E. coli Borrelia Pseudomonas Helicobacter pylori Staphylococcus aureus VII. Combinación de genes efectores iguales o diferentes Es objeto de la invención, además, un sistema de expresión autorreforzante y eventualmente controlable por vía farmacológica, en el que está presente una combinación de las secuencias de ADN de dos genes efectores iguales o de dos genes efectores diferentes [componentes c) y e')] . Para la expresión de las dos secuencias de ADN está intercalada entre los dos genes efectores otra secuencia de promotor o, preferiblemente, el ADNc de un "sitio de entrada de ribosomas interno" (IRES) en calidad de elemento regulador. Un IRES posibilita la expresión de dos secuencias de ADN unidas entre sí a través de un IRES . IRES's de este tipo se describieron, por ejemplo, por Montford y Smith (TIG 11,, -'179 (1995); Kaufman et al., Nucí. Acids Res. 19, 4485 (1991); Morgan et al., Nucí. Acids Res. 20, 1293 (1992); Dirks et al., Gene 128, 247 (1993); Pelle-tier y Sonenberg, Nature 334, 320 (1988) y Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694 (1994)). Así, por ejemplo, el ADNc de la secuencia IRES del poliovirus (posición =140 a =630 del 5'UTR).

Preferiblemente, en el sentido de la invención se han de enlazar genes efectores a través de otras secuencias de promotor o de una secuencia IRES, que presentan un efecto aditivo . En el sentido de la invención, son combinaciones preferidas de genes efectores, por ejemplo para 1) la terapia de tumores proteínas iguales o diferentes, citostáticas, apoptóticas, citotóxicas o inflamatorias o enzimas iguales o diferentes para la disociación del precursor de un agente citostática 2) la terapia de enfermedades autoinmunes - citoquinas o receptores diferentes con efecto sinérgico para la inhibición de la reacción inmune celular y/o humoral o TIMP's diferentes o iguales 3) la terapia de la formación deficiente de células de la sangre citoquinas diferentes jerárquicamente consecutivas tales como, por ejemplo, IL-1, IL-3, IL-6 o GM-CSF y eritropoyetina, G-CSF o trombopoye ina 4) la terapia de lesiones de las células nerviosas un factor de crecimiento neuronal y una citoquina o el inhibidor de una citoquina ) la terapia de trastornos del sistema de la coagulación sanguínea y de la circulación sanguínea un agente antitrombótico y un agente fibrinolítico (por ejemplo tPA o uPA) o una proteína citostática, apoptótica o citotóxica y un agente antitrombótico o un agente fibrinolí- tico varios factores de coagulación sanguínea diferentes, que actúan sinérgicamente, por ejemplo F VIII y FvW o F VIII y F IX 6) Vacunaciones un antígeno y una citoquina inmunoestimulante tal como, por ejemplo, IL-la, IL-1/3, IL-2, GM-CSF, receptor de IL-3 o IL-4 diferentes antígenos de un agente patógeno infec- cioso o de diferentes agentes patógenos infecciosos o diferentes antígenos de un tipo de tumor o de diferentes tipos de tumores 7) Terapia de enfermedades infecciosas virales una proteína antiviral y una proteína cistostáti- ca, apoptótica o citotóxica anticuerpos contra diferentes antígenos superficiales de un virus o de varios virus 8) Terapia de enfermedades infecciosas bacterianas anticuerpos contra diferentes antígenos superficiales y/o toxinas de un germen VIII. Incorporación de secuencias de señal y dominios de transmembrana 1) Refuerzo de la traducción Para reforzar la traducción se puede introducir la se-cuencia"de nucleótidos GCCACC o GCCGCC en el extremo 3' de la secuencia de promotor y, directamente en el extremo 5' de la señal de iniciación (ATG) , la secuencia de señal o de la transmembrana (Kozak, J. Cell Biol. 108 , 299 (1989)). 2) Facilitamiento de la secreción Para facilitar la secreción del producto de expresión del gen efector, la secuencia de señal homologa contenida eventualmente en la secuencia de ADN del gen efector se puede reemplazar por una secuencia de señal heteróloga que mejora la secreción extracelular. Así, por ejemplo, se pueden incluir las secuencias de señal para la inmunoglobulina (posición de ADN = 63 a = 107; Riechmann et al., Nature 332 , 323 (1988)) o la secuencia de señal para la CEA (posición de ADN = 33 a = 134,- Schrewe et al., Mol. Cell Biol. 10, 2738 (1990); Berling et al., Cáncer Res. 50, 6534 (?990)) o la secuencia de señal de la glicoproteína del virus sincitial respiratorio humano (ADNc de los aminoácidos = 38 a = 50 ó 48 a 65 ; Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996) ) .

Anclaje de la sustancia activa Para el anclaje de la sustancia activa en la membrana celular de la célula transducida que forma la sustancia activa se puede introducir alternativa o adicionalmente a la secuencia de señal una secuencia para un dominio de la transmembrana. Así, por ejemplo, la secuencia de la transmembrana del factor estimulante de colonias de macrófagos humano (posición de ADN = 1485 a = 1554; Cosman et al., Behring Inst. Mitt. 83., 15 (1988)) o la secuencia de ADN para la región de la señal y de la transmembrana de la glicoproteína G del virus sincitial respiratorio (RSV) humano (aminoácidos 1 a 63. o sus secuencias parciales, aminoá-ci&os 38 a 63; Vijayá' et al., Mol. Cell. Biol. 8, 1709 (1988); Lichtenstein et al., J. Gen. Virol. 77, 109 (1996) ) o la secuencia de ADN para la región de señal y de transmembrana de la neuraminidasa del virus de la influenza (aminoácidos 7 a 35 o la secuencia parcial, los aminoácidos 7 a 27; Brown et al . , J. Virol. £2, 3824 (1988)) se pueden introducir entre la secuencia del promotor y la secuencia del gen efector.

Para el anclaje de la sustancia activa en la membrana celular de las células transducidas que forman la sustancia activa puede introducirse sin embargo también la secuencia de nucleótidos para un anclaje de glicofos-folípidos . La introducción de un anclaje de glicofosfolípidos se efectúa en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos para el gen efector y puede efectuarse, adicionalmente, para la introducción de una secuencia de señal . Anclajes de glicofosfolípidos están descritos, por ejemplo, para la CEA, para la N-CAM y para otras proteínas de la membrana tales como, por ejemplo, Thy-1 (véase compendio de Ferguson et al., Ann. Rev. Biochem. 57., 285 (1988) ) .

Otra posibilidad del anclaje de sustancias activas a la membrana celular correspondiente a la presente invención es la utilización de una secuencia de ADN para una proteína de fusión ligando-sustancia activa. La especificidad del ligando de esta proteína de fusión está dirigida contra una estructura de la membrana sobre la membrana celular de la célula diana elegida. A los ligandos que se unen a la superficie de células pertenecen, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos dirigidos contra estructuras sobre la superficie de, por ejemplo, células endoteliales. En particular, a ellos "" pertenecen anticuerpos contra los receptores de VEGF o contra receptores de quinina o de células musculares tales como anticuerpos contra actina o anticuerpos contra receptores de angiotensina II o anticuerpos contra receptores de factores de crecimiento tales como, por ejemplo, contra receptores de EGF o contra receptores de PDGF o contra receptores de FGF o anticuerpos contra receptores de endotelina A A los ligandos pertenecen también anticuerpos o sus fragmentos que están dirigidos contra antíge- nos específicos de tumores o asociados a tumores sobre la membrana de la célula tumoral. Anticuerpos de este tipo ya han sido descritos. Los anticuerpos monoclonales murínicos se han de emplear preferiblemente en forma humanizada. Fragmentos Fab y Fv recombinantes y sus productos de fusión se preparan, como ya se ha descrito, con la tecnología conocida por el experto en la materia. A los ligandos pertenecen, además, todas las sustancias activas tales como, por ejemplo, citoquinas o moléculas de adhesión, factores de crecimiento o sus fragmentos o sus secuencias parciales, mediadores u hormonas peptídicas que se unen a estructuras de la membrana o receptores de la membrana sobre la célula elegida respectiva. Por ejemplo, a ellos pertenecen - ligandos para células endoteliales tales como IL-l, PDGF, bFGF, VEGF, TGG3 o quinina y derivados o análogos de quinina . Además, pertenecen a ellos moléculas de adhesión. Moléculas de adhesión de este tipo tales como, por ejemplo, SLex, LFA-1, MAC-1, LeCAM-1, VLA-4 o vitronectina y derivados o análogos de vitronectina ya se describieron para células endoteliales (compendios en Augustin-Voss et al., J. Cell Biol. 119, 483? (1992); Pauli et al., Cáncer Metast . Rev. 9, 175 (1990); Honn et al""., Cáncer Metast. Rév. 11, 353 (1992); Varner et al., Cell Adh. Commun. 3, 367 (1995)). La invención se describe más detalladamente en los siguientes ejemplos.

IX. Ejemplos para la descripción más detallada del objeto de la invención 1) Preparación de un sistema de expresión controlado por oncogenes El sistema de expresión controlado por oncogenes de acuerdo con la invención consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos diferentes yuxtapuestas situados más abaj o : Componente a) • el promotor del gen cdc25C (ácidos nucleicos -290 a +121; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et al., Nucí. Acids Res. 22 , 3822 (1995)) Componente b) • la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T larga de SV40, aminoácidos 126 a 132; PKKKRKV (SEQ ID NO: 13); Dingwail et al., TIBS 16, 478 (1991)) • el dominio de transactivación (TAD) ácido de VP16 de HSV-1 (aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gene Developm. 5, 190 (1995)) • la secuencia de unión RB de la proteína E2F-1 (aminoácidos 409 a 426 (LDYHFGLEEGEGIRDLFD) (SEQ ID NO: 14); Flemington et al., PNAS USA 90, 6914 (1993); Helin et al., Cell 70, 337 (1992)) • el ADNc para los dominios de unión de ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147; Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) Componente c) • 10 veces la secuencia de unión para la secuencia de unión de ADN de Gal4 con la secuencia de nu- " cleótidos 5' -CGGACAATGTTGACCG-3 ' (SEQ ID N0:1) (Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990) ) • el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Toóse (comp.) DNA Tumor Viruses; Cold Spring Harbor, Nueva York, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory) Componente d) • la secuencia GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108., 229 (1989) ) • el ADNc para el péptido señal de la inmunoglobuli- na (secuencia de nucleótidos 63 a 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) • el ADNc de la 3-glucoronidasa (secuencia de nucleótidos 93 a 1982; Oshima et al, PNAS( USA 84, 685 (1987)) El enlace de los distintos componentes de la construcción se efectúa a través de sitios de restricción adecuados que son conducidos conjuntamente a través de la amplificación por PCR a los extremos de los distintos elementos . El enlace se efectúa con ayuda de enzimas y ADN-ligasas específicas para los sitios de restricción, conocidas por el experto en la materia. Estas enzimas se pueden adquirir en el comercio. La construcción de nucleótidos, así preparada, se incorpora por clonación en el vector del plásmido pXP2 (Nordeen, BioTechniques 454 (1988)) que se utiliza directa-mente o en sistemas de dispersión coloidales para una aplicación in vivo. Con el plásmido descrito, los fibroblastos 3T3 mantenidos en cultivo (RB positivos) y células de osteosarcoma (SAOS-2, RB negativas) son transfectados con el método conocido por el experto en la materia (Lucibello et al., EMBO J. 132 (1995) ) y se mide la cantidad de 3-glucuronidasa producida por los fibroblastos o células de osteosarcoma con ayuda de 4-metilumbeliferil-/3-glucurónido como sustrato. Para examinar la capacidad del ciclo celular, las células"de osteosarcoma se-'sincronizan a lo largo de 48 horas en GQ/G! mediante la extracción de metionina. El contenido en ADN de las células se determina después de la tinción con Hoechst 33258 en un clasificador de células de activación por fluorescencia (Lucibello et al., EMBO J. 132 (1995)). Se consiguen los siguientes resultados: En fibroblastos transfectados (RB positivos) no se puede determinar ningún aumento de la 3-glucuronidasa en comparación con fibroblastos no transfectados . Células de osteosarcoma transfectadas (RB negativas) expresan claramente más /3-glucuronidasa que células de osteosarcoma no transfectadas . Células de osteosarcoma proliferantes (ADN > 2S; S = tanda sencilla de cromosomas) segregan claramente más ß--glucuronidasa que células de osteosarcoma sincronizadas en Go/G, (ADN = 2S) . Por consiguiente, el sistema de expresión descrito conduce a una expresión RB-dependiente del gen estructural ß--glucuronidasa que puede ser regulada en función de la elección de la secuencia de promotor, por ejemplo de forma dependiente del ciclo celular. 2) Preparación de un sistema de expresión controlado por virus El sistema de expresión controlado por virus de acuerdo con la invención consiste en las siguientes secuencias de nucleótidos diferentes yuxtapuestas situadas más abajo: Componente a) • el promotor del gen cdc25C (ácidos nucleicos -290 a +121; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et al., Nucí. Acids Res. 23., 3822 (1995)) Componente b) • la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T larga de SV40, aminoácidos 126 a 132; PKKKRKV (SEQ ID NO: 13); Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) • " el dominio de tr&nsactivación (TAD) ácido de VP16 de HSV-1 (aminoácidos 406 a 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2 , 718 (1988); Triezenberg, Curr. Opin. Gene Developm. 5., 190 (1995) ) • la proteína E6 del virus HPV-18 (secuencia de nucleótidos 100 a 578; Roggenbuck et al., J. Virol. 65, 5068 (1991) ) • el ADNc para los dominios de unión de ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147; Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990)) Componente c) « 10 veces la secuencia de unión para la secuencia de unión de ADN de Gal4 con la secuencia de nucleótidos 5' -CGGACAATGTTGACCG-3' (SEQ ID NO:l) (Chasman y Kornberg, Mol. Cell Biol. 10, 2916 (1990) ) • el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191; Toóse (comp.) DNA Tumor Viruses; Cold Spring Harbor, Nueva York, Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory) Componente d) • la secuencia GCCACC (Kodak, J. Cell Biol. 108, 229 (1989)) • el ADNc para el péptido señal de la inmunoglobulina (secuencia de nucleótidos 63 a 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) • el ADNc de la 3-glucoronidasa (secuencia de nucleótidos 93 a 1982; Oshima et al, PNAS USA 84., 685 (1987)) El enlace de los distintos componentes de la construcción se efectúa a través de sitios de restricción adecuados que son conducidos conjuntamente a través de la amplificación por PCR a los extremos de los distintos elementos. El enlace se efectúa con ayuda de enzimas y ADN-ligasas específicas para los sitios de restricción, conocidas por el experto en la materia. Estas enzimas se pueden adquirir en el comercio. La" construcción de •' nucleótidos, así preparada, se incorpora por clonación en el vector del plásmido pUC18/l9 que se utiliza directamente o en sistemas de dispersión coloidales para una aplicación in vivo. Con el plásmido descrito, se transfectan fibroblastos humanos mantenidos en cultivo (Wi-38, E6/E7 negativos) y células de carcinoma del cuello (HeLa, HPV- 18 E6/E7 positi-vas) con el método conocido por el experto en la materia (Lucibello et al., EMBO J. 132 (1995)) y se mide la cantidad de ß-glucuronidasa producida por estas células con ayuda de 4-metilumbeliferil-/3-glucurónido como sustrato. Para examinar la especificidad del ciclo celular, las células HeLa se sincronizan a lo largo de 48 horas en G0/G1 mediante la extracción de metionina .. El contenido en ADN de las células se determina después de la tinción con Hoechst 33258 en un clasificador de céulas de activación por fluores-cencia (Lucibello et al., EMBO J. 132 (1995)). : Se consiguen los siguientes resultados: En fibroblastos transfectados no se puede determinar ningún aumento de la -glucuronidasa en comparación con fibroblastos no transfectados. Células HeLa transfectadas expresan claramente más ß --glucuronidasa que células HeLa no transfectadas. Células HeLa proliferantes (ADN > 2S; S = tanda sencilla de cromosomas) segregan claramente más /3-glucuronidasa que células HeLa sincronizadas en GQ /G-^ (ADN = 2S) . Por consiguiente, el sistema de expresión descrito conduce a una expresión específica del virus (HPV18) del gen estructural /3-glucuronidasa que puede ser regulada en función de la elección de la secuencia del promotor, por ejemplo de forma dependiente del ciclo celular. Una sustancia activa de acuerdo con los Ejemplos 1 y 2 permite, después de la aplicación local, por ejemplo en el lugar del tumor o después de administración intracraneal o subaracnoidea, o de administración sistémica, preferiblemente intravenosa o intraarterial, el que predominamente, si no de forma "exclusiva, sólo segregan /3-glucuronidasa aquellas células que presentan un oncogen mutado o una infección vírica. Esta /3-glucuronidasa disocia un doxorrubicin-?--glucurónido ahora inyectado y bien compatible (Jacquesy et al., documento EP 0 511 917 Al) en la doxorrubicina de acción citostática. Esta inhibe la proliferación de células endoteliales y actúa de forma citostática sobre las células al igual que sobre células tumorales vecinas . Con ello se produce la inhibición del desarrollo del tumor.

Leyendas de las figuras Figura 1: Tipo y disposición de los componentes generales de una construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención.

Figura 2 : Representación esquemática de la disp sición de los componentes generales de una construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención conforme a la forma de realización A.

Figura 3 : Representación esquemática de la disposición de los componentes generales de una construcción de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención conforme a la forma de realización B.

Claims (32)

REIVINDICACIONES

1.- Construcción de ácidos nucleicos para la expresión de un gen efector, conteniendo la construcción de ácidos nucleicos un promotor I (componente a) que controla la expresión de un gen del factor de transcripción (componente b) contenido asimismo en la construcción de ácidos nucleicos, y conteniendo un promotor II (componente c) al que se une específicamente el producto génico del gen de? factor de transcripción y que controla la expresión de un gen efector (componente d) contenido asimismo en la construcción de ácidos nucleicos, caracterizada porque la actividad del producto génico del gen del factor de transcripción depende de una o varias proteínas reguladoras celulares que se unen específicamente a este producto génico y que afectan a su actividad.

2.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, caracterizada porque - Componente a) : es una secuencia de activación para la transcripción del componente b) ,- Componente b) : es un factor de transcripción que contiene h ) un dominio de activación b2) una secuencia de unión para una proteína reguladora celular b3) un dominio de unión de ADN; Componente c) : es una secuencia de activacióh que es activada mediante la unión del producto " de expresión del componente b) y activa la transcripción del componente d) ; y Componente d) : es un gen efector.

3.- Contrucción de ácidos nucleicos según la reivindicación 1, caracterizada porque los componentes a, b y c están realizados en forma de los componentes a' , b' y e': Componente a' ) : una secuencia de activación para la transcripción del componente b') que contiene a la secuencia de unión de ADN para una proteína reguladora celular a2) un promotor basal Componente b' ) : un factor de transcripción que representa una proteína represora e inhibe el componente c' ) Componente c') : una secuencia de activación que contiene cx) una secuencia de activación para la transcripción del componente d) c2) una secuencia de ADN que une la proteína represora [componente b')] y, con ello, inhibe la activación de la transcripción del componente d) Componente d) un gen efector

4.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 2, caracterizada porque el componente a) es igual al componente c) .

5.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 2 ó 3, caracterizada porque el componente a) o el componente c_ ) representa una secuencia de promotor activable de forma inespecífica, específica de la célula, metabólicamente específica, específica del virus y/o específica del ciclo celular.

6.- Contrucción de ácidos nucleicos según la reivindicación 5, caracterizada porque el componente a) o el componente cx) se elige del grupo que contiene promotores activados en células endoteliales, células peritoneales, células -pleurales, células epiteliales de la piel, del pulmón, del tracto gastrointestinal, de los ríñones y de los uréteres, en células musculares, en células de tejido conjuntivo, en células hematopoyéticas, en macrófagos, en linfocitos, en células de leucemia, en células tumorales o en células glia o secuencias de promotor de virus tales como HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV, CMV o HIV secuencias de promotor o reforzador activadas por hipoxia o secuencias de activación específicas del ciclo celular de los genes para cdc25C, ciclina A, cdc2, E2F-1, B-myb y DHFR secuencias de unión para factores de transcripción que se manifiestan en función de la proliferación celular o activados tales como monómeros o multímeros de la caja Myc E.

7.- Construcción de ácidos nucleicos según una o varias de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizada porque el dominio de activación [(componente bx ) ] del componente b) se elige del grupo que contiene los dominios de activación de los factores de transcripción Oct-2, Spl, NFY, ITF-2, VP-16, c-Myc y CTF.

8. - Construcción de ácidos nucleicos según una o varias de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizada porque la secuencia de unión [ (componente b2) del componente b) ] para una proteína reguladora celular es una proteína de unión celular o una parte de esta proteína de unión.

9. - Construcciones de ácidos nucleicos según la reivindicación 8, caracterizadas porque la proteína de unión celular o una parte de esta proteína de unión se une a una proteína reguladora celular elegida de un grupo que contiene p53, pRb, pl30, Max, MAD, VHL, cdk-4, MTS-1 (pl6) , WT-1, SMAD-2, DPC-4.

10.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 9, caracterizada porque el componente b' ) se elige de un grup"b de proteínas de uftión celulares que contienen E2F-1, -2, -3, -4, -5, ciclina-D1( -D2, -D3 o -C, ciclina-A, -E, Myc, factor de transcripción PU.l o Elf-l, elongina-B, -C, pl4, pl5, pl6, pl8, p21, p27, p53 , Myc, cdk-4, DPC-4 y SMAD-2.

11.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia de unión [compo-nente b2) del componente b) ] para una proteína reguladora celular es una proteína de unión viral o una parte de esta proteína de unión.

12.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindi-cación 11, caracterizada porgue la proteína de unión viral o una parte de esta proteína de unión se une a una proteína reguladora celular elegida de un grupo que contiene p53, pRb (pllO) , NFKB, pl30, CBF-1, Lyn-tirosinquinasa, bak y bax.

13.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindi-cación 12, caracterizada porque el componente b2): se elige de un grupo de proteínas de unión virales que contienen IE 84 de CMV, E1B (55 Kd) de AV, EBNA-5 de EBV, BHFR de EBV, E6 de HPV- 16 ó -18, proteína x de HBV, antígeno T de SV40, E1A de AV, ?BNA-2 de EBV, EBNA-1 de EBV, E7 de HPV, Tax de HIV, LMP-1 de EBV, LMP-2A o LMP-2B de EBV, E1B (16 Kd) de AV, E1B (10 kD) de AV.

14.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia de unión [componente b2) del componente b) ] para una proteína reguladora celular es un anticuerpo o una parte de este anticuerpo.

15. - Construcción de ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el componente c) contiene al menos una secuencia de ADN para la unión del componente b) y, mediante esta unión, activa la expresión del componente d) .

16.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 15, en la que la secuencia de ADN se elige de un grupo que contiene la secuencia de unión (5' -CGGACAACTGTTGACCCG-3 ' , SEQ ID NO.-l) para la" proteína Gal4; la stecuencia de unión (5 ' -TACTGTATGTA-CATACAGTA-3' , SEQ ID NO : 2 ) para la proteína LexA; la secuencia de unión (5' -GAATTGTGAGCGCGCACAATTC-3' , SEQ ID NO : 3 ) para la proteína represora de lac I; la secuencia de unión (5'--TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3' , SEQ ID NO: 4) para la proteína represora de tetraciclina y la secuencia de unión (5' -TAATGATGGGCG-3 ' , SEQ ID NO: 5) para la proteína ZFHD-1.

17. - Construcción de ácidos nucleicos según una o varias de las reivindicaciones 11 a 14, caracterizada porque la secuencia de unión de ADN para una proteína reguladora celular [componente ax) ] es una secuencia de unión de ADN elegida del grupo que contiene proteína p53, W4-1, NF-kappa B, E2F/DP o Myc/Max.

18.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 17, caracterizada porque el promotor basal [componente a2) ] se elige del grupo que contiene los promotores de SV40, c-fos, ARN de U2 sn y HSV-TK.

19.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 18, caracterizada porque el represor [componente b' ) ] se elige del grupo que contiene el gen represor de lac o el gen represor de tetraciclina.

20.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 19, caracterizada porque la secuencia de unión de ADN para el represor [componente c' ) ] contiene al menos una secuencia de unión del operador lac o al menos una secuencia de unión del operador de tetraciclina.

21.- Construcción de ácido nucleico según una o varias de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque en el caso del gen efector (componente d) se trata de un gen que codifica una sustancia activa que se elige del grupo que contiene citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, receptores para citoquinas, quimioquinas o factores de crecimiento, proteínas de acción antiproliferante o citostá-tica o apoptótica, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, inhibidores de la angiogénesis, hormonas peptídicas, factores de coagulación, inhibidores de la coagulación, proteínas fibrinolíticas, péptidos o proteínas que actúan sobre la circulación sanguínea, proteínas del plasma sanguíneo y antígenos de agentes patógenos infecciosos o de células o de tumores, determinando el antígeno elegido una reacción inmune .

22. - Construcción de ácidos nucleicos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque en el caso del gen efector se trata de un gen que codifica una enzima que disocia en un farmacón un precursor de un fár a-cón.

23. - Contrucción de ácidos nucleicos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizada porque en el caso del gen efector se trata de un gen que codifica una proteína de fusión ligando- sustancia activa o una proteína de fusión ligando-enzima, eligiéndose el ligando de un grupo que contiene quitoquinas, factores de crecimiento, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, hormonas peptídicas, mediadores y moléculas de adhesión celular.

24.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 2, caracterizada porque los componentes a), b) , c) y d) se caracterizan como siguen: Componente a) • el promotor del gen cdc25C (ácidos nucleicos -290 a +121) Componente b) • la señal de localización nuclear (NLS) de( SV40 (T larga de SV40, aminoácidos 126 a 132; PKKKRKV (SEQ ID NO: 13) • el dominio de transactivación (TAD) ácido de VP16 de HSV-l (aminoácidos 406 a 488) • la secuencia de unión RB de la proteína E2F-1 (aminoácidos 409 a 426 (LDYHFGLEEGEGIRDLFD) (SEQ ID NO: 14) • el ADNc para dominios de unión de ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147) - Componente c) •' • 10 veces la secuencia de unión para la secuencia de unión de ADN de Gal4 con la secuencia de nucleótidos 5' -CGGACAATGTTGACCG-3' (SEQ ID N0:1) • el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191) Componente d) • la secuencia GCCACC • el ADNc para el péptido señal de la inmunoglobulina (secuencia de nucleótidos 63 a 107) • el ADNc de la /3-glucoronidasa (secuencia de nu- cleótidos 93 a 1982) .

25.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 2, caracterizada porque los componentes a), b) , c) y d) se caracterizan como siguen: Componente a) • el promotor del gen cdc25C (ácidos nucleicos -290 a +121) Componente b) • la señal de localización nuclear (NLS) de SV40 (T larga de SV40, aminoácidos 126 a 132; PKKKRKV (S?Q ID NO: 13) • el dominio de transactivación (TAD) ácido de VP16 de HSV-1 (aminoácidos 406 a 488) • la proteína E6 del virus HPV- 18 (secuencia de nucleótidos 100 a 578) « el ADNc para los dominios de unión de ADN de la proteína Gal4 (aminoácidos 1 a 147) Componente c) • 10 veces la secuencia de unión para la secuencia de unión de ADN de Gal4 con la secuencia de nu- cleótidos 5 ' -CGGACAATGTTGACCG-3 ' (SEQ ID NO:l) • el promotor basal de SV40 (ácidos nucleicos 48 a 5191) Componente d) • la secuencia GCCACC • " el ADNc para el péptido señal de la inmunoglobulina (secuencia de nucleótidos 63 a 107) • el ADNc de la /3-glucoronidasa (secuencia de nucleótidos 93 a 1982)

26.- Contrucción de ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque en el caso del ácido nucleico se trata de ADN.

27.- Contrucción de ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la construcción de ácidos nucleicos está incorporada en un vector.

28.- Construcción de ácidos nucleicos según la reivindicación 27, caracterizada porque se trata de un vector del plásmido.

29.- Contrucción de ácidos nucleicos según la reivindicación 27, caracterizado porque se trata de un vector viral.

30.- Construcción de ácidos nucleicos según runa o varias de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizada porque se administra externamente, por vía peroral, intravesical, nasal, intrabronquial o en el tracto gastrointestinal, o se inyecta en un órgano, en una cavidad del cuerpo, en la musculatura, por vía subcutánea o en la circulación sanguínea, para la profilaxis o terapia de una enfermedad.

31.- Célula aislada, caracterizada porque contiene una construcción de ácidos nucleicos según una de las reivindicaciones 1 - 29.

32.- Empleo de una construcción de ácidos nucleicos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 29 o una célula según la reivindicación 31 para la preparación de un agente terapéutico y curativo para el tratamiento de una enfermedad elegida del grupo contiene infecciones, tumores, leucemias, enfermedades autoinmunes, alergias, artritis, inflamaciones, rechaces de órganos, reacciones de trasplante contra hospedante, enfermedades de la coagulación sanguínea, enfermedades circulatorias, anemia, enfermedades hormonales y lesiones del sistema nervioso central. 33".- Procedimiento pa'ra la preparación de las construcciones de ácidos nucleicos según una o varias de las reivindicaciones 1 a 30, en el que los distintos elementos se ligan conjuntamente de forma escalonada. 34.- Empleo de una célula según la reivindicación 31, para la preparación de un agente terapéutico y curativo para la profilaxis y terapia de enfermedades según la reivindica-ción 32, caracterizado porque al menos una célula se? administra externamente, por vía intravesical, nasal, intrabronquial, oral o en el tracto gastrointestinal o se inyecta en un órgano, en una cavidad el cuerpo, la musculatura, por vía subcutánea o en la circulación sanguínea.