MXPA97003738A - Metodo de determinacion inmunologica usando receptores oligomerizados - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a que para extender la gama de medición y reducirel efecto de Hook (efecto de gancho) en un método inmunológico de determinación de un antígeno basado en el principio de un ensayo de interposición o intercalado, se prefiere usar un método el cual se caracteriza porque la molécula de detección etiquetada es un oligómero de una molécula de unión o enlace seleccionada a partir del anticuerpo y/o fragmento de anticuerpo.

Description

MÉTODO DE DETERMINACIÓN QUE USA RECEPTORES OLIGOMERIZADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para la determinación inmunológica de un anaiits de acuerdo al principio de ensayo de interposición o intercalado y substancias aglutinantes adecuadas para esto En particular, la invención se refiere a un mejoramiento de tales métodos de intercalado o de interposición para extender la gama de medición y reducir el efecto de Hook (efecto de gancho).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La determinación cuantitativa de substancias antigénicas por medio de inmunoensayos es conocida. Un ensayo de interposición o intercalado así llamado, frecuentemente se usa para esto, en el cual dos anticuerpos dirigidos hacia el mismo o diferentes epítopes del analito se incuban con una muestra que contiene un analito a ser determinado. En este método un primer anticuerpo soluble se acopla directa o indirectamente a un sistema que genera una señal, es decir, una etiqueta o marca REF: 24683 mientras que un segundo anticuerpo (en un ensayo heterogéneo) se presenta acoplado a una fase sólida o se provee con un componente aglutinante tal como por ejemplo, biotina la cual es capaz de aglutinarse o unirse a una fase sólida apropiadamente revestida. La concentración de un número de proteínas importantes en el diagnóstico puede variar dentro de una amplia gama que propone una amplia gama de medición es deseable o aún esencial para la analítica. Ejemplos de tales proteínas son, por ejemplo, parámetros del cáncer tales como Ot fetoproteína (AFP) y antígenos carcinoembriónicos (CEA) y también la gonadotropina cloriónica humana de la proteína del embarazo (HCG). Cuando se determinan tales analitos es importante en el diagnóstico por una parte obtener un valor exacto en gamas de concentración elevadas para ser capaz de realizar un monitoreo exitoso, pero por otra parte también deberá ser posible realizar una determinación exacta en la gama de concentración inferior para un diagnóstico cualitativamente correcto (si/no) el cual a su vez puede conducir a consecuencias terapéuticas fundamentales . Un problema con concentraciones elevadas de analito en una muestra a ser examinada es el así llamado "efecto de Hook (efecto de gancho)" el cual se entiende como una disminución de la señal detectable a concentraciones de analito muy elevadas. La razón para esto es que normalmente en un formato de ensayo de interposición heterogéneo el anticuerpo soluble y el anticuerpo de fase sólida están presentes en un exceso relativo al analito a ser determinado de modo que los complejos de interposición pueden ser formados y también detectados en forma esencialmente completa; sin embargo, en el caso de una concentración de analito elevada un número limitado de anticuerpos se enfrenta con un número muy amplio de moléculas de analito. En el caso extremo existe un déficit de anticuerpo de fase sólida de modo que el analito se une sólo parcialmente y además la fracción de analito unida a la fase sólida no puede ser detectada completamente puesto que el anticuerpo etiquetado es capturado por el exceso de analito con formación de anticuerpos de detección solubles: complejos de analito. Esto resulta en una reducción de la señal medida la cual puede conducir a un resultado de prueba negativo, falso. Una solución al problema es por supuesto diluir adecuadamente la muestra a ser examinada. Sin embargo, puesto que en la práctica no se conoce desde el inicio cuando y a qué extensión una dilución se ha realizado, esto significa que varias mediciones con diferentes concentraciones tienen que ser realizadas lo cual es indeseable por razones de costos y a causa de la cantidad incrementada de trabajo. Una solución adicional a este problema es incrementar la concentración de ambos anticuerpos utilizados en el ensayo de intercalado o de interposición. Esto sin embargo, resulta en un número de desventajas tales como por ejemplo posibilidades adicionales de interferencia, un valor de blanco elevado y una forma desfavorable de la curva de calibración. Además, los costos de cada determinación individual también se incrementan de modo que esta posibilidad también no se puede ver como satisfactoria. Todavía una solución adicional se describe en la patente Norteamericana 4,743,542. Esta patente enseña que la curva de calibración se puede linealizar a concentraciones elevadas de analito por la adición de anticuerpos primero o segundo no etiquetados o de mezclas de los mismos. Esto disminuye la sensibilidad en la gama de medición inferior pero la incrementa a concentraciones de analito más elevadas que resultan en una linealización total o completa de la curva de calibración. Sin embargo, una desventaja del método de conformidad con la patente Norteamericana No. 4,743,542 es la reducción de la sensibilidad en la gama de medición inferior. Esta reducción es particularmente crítica cuando un resultado de prueba preciso es esencial en la gama de medición inferior por ejemplo en la prueba de HCG para determinar si un embarazo está presente o no.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por esto el objeto de la invención fue proporcionar un método para la determinación inmunológica de un analito en el cual las desventajas del estado de la técnica sean al menos parcialmente eliminadas y que en particular permitan una determinación cuantitativamente exacta sobre un amplia gama de medición mientras que al mismo tiempo se obtienen buenos resultados en la gama de concentración inferior. Este objeto se logra de acuerdo con la invención por un método para la determinación inmunológica de un analito en un líquido de muestra de acuerdo con el principio de un ensayo de interposición en el cual el líquido de muestra se incuba en la presencia de una fase sólida con al menos dos receptores capaces de unirse o -enlazarse con el analito a ser determinado en el cual el primer receptor es soluble y el segundo receptor (a) se une a una fase sólida o (b) es capaz de unirse a una fase sólida y el analito se detecta determinando la etiqueta o marca en la fase sólida y/o en la fase líquida que se caracteriza porque el primer receptor es un oligómero de una molécula de enlace o unión seleccionada a partir de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y mezclas de los mismos. Se ha presentado sorprendentemente que el uso de un anticuerpo oligomérico soluble permite que el efecto de Hook (efecto de gancho) sea reducido y por consi-guiente una extensión de la gama de medición. En general la sensibilidad en la gama de medición inferior es retenida o aún mejorada. El límite inferior de detección LLD de conformidad con Kayser (Fresenius "Zeitschrift für analytische Chemie", volumen 209, número 1, página 1-18, 1965) se usa en la presente descripción como una medida de la sensibilidad en la gama de medición inferior. El primer receptor usado de conformidad con la invención es un oligómero de una molécula de enlace o aglutinante seleccionado a partir de anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo y por el motivo de simplicidad se refiere como "anticuerpo oligomérico" en lo siguiente. El prefijo "primero" o "segundo" anticuerpo sólo sirve al propósito de distinción en esta descripción y no para instancias referidas a un orden de adición, etc. El término "anticuerpo" en la presente invención se sobreentiende como un anticuerpo con una especificidad única o sencilla tal como un anticuerpo monoclonal así como una mezcla de anticuerpos que se dirigen hacia diferentes epítopes del mismo antígeno tal como un antisuero policlonal. "Fragmento de anticuerpo" se entiende como cualquier molécula que se derive de un anticuerpo completo mientras que conserve al menos un paratope y el cual por ejemplo puede ser obtenido por tratamiento enzimático o químico de un anticuerpo o por ingeniería genética. En particular un fragmento de F(ab')-, se entiende como un fragmento de anticuerpo. El grado de oligomerización relativo a un anticuerpo completo o a un fragmento de F(ab')2 es al menos dos, es decir, el número mínimo de paratopes de un anticuerpo oligomérico de conformidad con la invención es cuatro. El grado mínimo de oligomerización es preferiblemente dos a tres.

El grado máximo de oligomerización es de hasta 15, preferiblemente hasta 10 y en forma más preferible hasta 8. El grado de oligomerización es en forma más preferible 2 a 8 y especialmente preferible de 4 a 6. El primer receptor oligomérico se usa de manera preferible en una forma etiquetada o marcada en el método de conformidad con la invención. Esto significa que se acopla o une directa o indirectamente a un grupo de marcación o etiquetado. En esta conexión un acoplamiento directo se entiende como una incorporación covalente de una substancia detectable o de una molécula la cual en reacción con un substrato adecuado genera una substancia detectable. Un ejemplo del último podría ser por ejemplo una enzima la cual se une o enlaza covalentemente al receptor opcionalmente vía un intermediario o separador. Un acoplamiento indirecto denota una configuración en la cual el primer receptor de conformidad con la presente invención y una substancia detectable o una molécula que genera tal substancia, son capaces de unirse o enlazarse entre sí vía un par de aglutinación o unión específico tal como biotina/avidina. El grupo de marcación o etiquetado en el método de conformidad con la invención, se puede seleccionar a partir de etiquetas o marcas conocidas en el estado de la técnica. Ejemplos son radioetiquetas y etiquetas o o marcas de enzima o etiquetas o marcas luminiscentes. Ejemplos preferidos de etiquetas o marcas de enzima son por ejemplo fosfatasa alcalina, peroxidasa y galactosidasa. Preferidas como las etiquetas o marcas luminiscentes son las fotoproteínas que pueden ser activadas por calcio tal como acuorin y etiquetas o marcas electroquimiluminiscentes . Las etiquetas o marcas en las que la determinación es por medio de una reacción luminiscente, se prefieren especialmente, y un grupo de etiquetado o marcación de quelato de metal luminiscente es más preferido como el grupo de marcación o etiquetado. Los quelatos metálicos luminiscentes son quelatos metálicos que generan una reacción de luminiscencia detectable. La detección de esta reacción luminiscente puede ser, por ejemplo, por medición de fluorescencia o por electroquimiluminiscencia. El metal de estos quelatos metálicos o de metal es por ejemplo un metal de transición o un metal de tierras raras. El metal es preferiblemente rutenio, osmio, renio, iridio, rodio, platino, indio, paladio, molibdeno, tecnetio, cobre, cromo o tungsteno.

El rutenio, renio, iridio y osmio son particularmente preferidos y el rutenio es más preferido. Los ligandos los cuales forman el quelato metálico junto con el metal son usualmente ligandos polidentados, es decir, ligandos con varias posiciones de coordinación. Los ligandos polidentados por ejemplo, comprenden ligandos aromáticos y alifáticos. Los ligandos polidentados aromáticos adecuados incluyen ligandos heterocíclicos aromáticos Los ligandos heterocíclicos preferidos son poliheterociclos que contienen N tales como, por ejemplo, bipirididilo, bipiracilo, terpiridilo y fenantrolilo. Estos ligandos pueden contener, por ejemplo, substituyentes tales como alquilo, alquilo substituido, arilo, arilo substituido, aralquilo, carboxilato, carboxialdehído, carboxamida, ciano, amino, hidroxi, imino, hidroxicarbonilo, aminocarbonilo, amidina, guanidino, ureida, grupos que contienen azufre, grupos que contienen fósforo y los esteres de carboxilato de N-hidroxisuccinimida. El quelato también puede contener uno o varios ligandos monodentados . Ejemplos de ligandos monodentados incluyen monóxido de carbono, cianuros, isocianuros, halogenuros y aminas, estilbenos, arsinas y fosfinas alifáticas, aromáticas y heterocíclicas.

El quelato de metal luminiscente particularmente se selecciona en forma preferible de quelatos metálicos que contienen ligandos de fenantrolilo o bipiridilo. Ejemplos de quelatos de metales adecuados y la producción de los mismos se describen en las solicitudes de patente EP-A-0 178 450, EP-A-0 255 534, EP-A-0 580 979 y WO 90/05301. La referencia se hace aquí a este descripción. Los quelatos de metales más preferidos son quelatos de rutenío-(bipiridilo)- . Estos quelatos están comercialmente disponibles en la forma de derivados de éster activo por ejemplo, de Igen Inc. (Rockville, MD, USA). El receptor etiquetado o marcado usado en el método de conformidad con la invención, contiene uno o varios grupos de marcación o etiquetado. Si varios grupos de marcación o etiquetado se usan por molécula del primer receptor oligomérico, se prefiere que el número de grupos de marcación o etiquetado sea de 2 a 20 y en forma más preferible de más de 2 a 10. El segundo receptor usado en el método de conformidad con la invención se une o enlaza a la fase sólida o es capaz de unirse al mismo. El término "enlazado o unido a la fase sólida" se entiende en esta descripción como una inmovilización que toma lugar antes que el ensayo por enlace o unión a un portador macromolecular tal como por adsorción, enlace o unión covalente o por medio de un par de enlace o unión específico. De acuerdo al término "capaz de enlazarse" se entiende como una inmovilización durante el ensayo por medio de la interacción específica de un par de enlace específico adecuado tal como biotina/avidina. El segundo receptor se acopla o enlaza preferiblemente a la fase sólida por medio de un par de enlace o unión específico. El segundo receptor particularmente es bíotinilado en forma preferida y la fase sólida se reviste con avidina o/y estreptavidina. El tipo del segundo receptor no es particularmente crítico en el método de la presente invención y por consiguiente el segundo receptor se puede seleccionar de un número de moléculas siempre que las mismas se puedan unir específicamente al analito a ser determinado. Ejemplos de substancias que son adecuadas para su uso como un segundo receptor son, por ejemplo, anticuerpos oligoméricos dentro del sentido de esta invención, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, receptores de células o celulares, enzimas, ácidos nucleicos y otras substancias las cuales debido a una estructura espacial, particular, o afinidad química, son capaces de unirse o enlazarse al analito a ser determinado. Dependiendo del diseño experimental exacto, fases sólidas convencionales se usan como la fase sólida en el método de conformidad con la invención. Esto por ejemplo comprende materiales finamente dispersos tales como perlas de poliestireno o material magnético particulado y en general superficies de recipientes de reacción tales como la pared de una cubeta o una placa de microtitulación y para aplicaciones especiales microplaquetas (chips) r sensores o membranas. En la modalidad presentemente preferida del método de conformidad con la invención la fase sólida es material magnético particulado el cual contiene un revestimiento capaz de unirse o enlazarse al segundo receptor. El procedimiento exacto para el método de conformidad con la invención corresponde a protocolos conocidos de ensayos de interposición o intercalado y es familiar para una persona de experiencia ordinaria en la técnica. En general una muestra que contiene un analito a ser determinado, se incuba bajo condiciones adecuadas y por un periodo de tiempo adecuado con un primer receptor, segundo receptor y fase sólida en un orden arbitrario para asegurar que se forme un complejo de interposición o intercalado inmovilizado.

Posteriormente el complejo de interposición que contiene el analito que se forma se separa del anticuerpo etiquetado libre y se determina cualitativamente o cuantitativamente en forma opcional después de la adición de un substrato de detección adecuado. En una modalidad preferida del método de conformidad con la invención, la muestra a ser examinada primero se mezcla y se incuba con un anticuerpo oligomérico etiquetado o marcado de quelato de rutenio y un anticuerpo biotinilado. En un segundo paso las perlas magnéticas que se revisten con avidina o estreptavidina se agregan y se incuban adicionalmente. Después la mezcla se pasa sobre un magneto, las perlas se separan es decir, el complejo que se forma se separa de la muestra remanente y del anticuerpo etiquetado o marcado no unido o no enlazado y el complejo separado se lava de nuevo con una solución que contiene un agente reductor tal como tripropilamina (TPA) y opcionalmente un agente activo superficial. El proceso de lavado remueve todo el rutenio excepto lo que se une en el complejo de interposición. La concentración de Ru medida es así directamente proporcional a la concentración de analito. •-ruando un voltaje eléctrico se aplica, una reacción luminiscente ocurre en la cual el rutenio y el TPA reaccionan. Opcionalmente cuando se usa un primer receptor etiquetado, un receptor específico-analito no marcado puede estar presente adicionalmente, por ejemplo, un anticuerpo oligomérico y/o anticuerpo monomérico no etiquetado. De conformidad con un aspecto adicional la presente invención se refiere a un anticuerpo oligomérico que comprende un conjugado o conjunto de al menos dos anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y mezclas de los mismos en donde las moléculas de enlace o unión se enlazan directamente en forma covalente entre sí y el cual se caracteriza porque el grado de oligomerización es 2 a 15. Un enlace directo de las moléculas de unión o aglutinación significa que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se enlazan conjuntamente ya sea vía un enlace químico simple o sencillo o vía una molécula de enlace/separadora bifuncional adecuada. Un gran número de métodos para efectuar esto y moléculas espadadoras adecuadas, son conocidos por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, el bis (maleinimido) -metil éster, dimetil suberimidato, disuccínimidil suberato, glutardialdehído, N-succinimidil-3- (2-piridilditio)propionato, N-5-azido-2-nitrobenzoilsuccinimida, N-succinimidil (4-yodacetil)-aminobenzoato, una combinación de maleinimidohexanoil-succinimidato y ácido S-acetil-mercaptosuccínico anhídrido o compuestos análogos entran en consideración como enlaces químicos. En una modalidad preferida, el anticuerpo oligomérico de conformidad con la invención se provee de acuerdo a un primer aspecto de la invención con al menos uno y opcionalmente varios grupos de etiquetado o marcación. Una etiqueta de quelato de metal luminiscente se prefiere como la etiqueta y particularmente en forma preferible el anticuerpo oligomérico es rutenilado/ es decir., el quelato de metal o metálico es un quelato de rutenio. Los ligandos que junto con el metal forman el quelato metálico son ligandos usualmente polidentados es decir, ligandos con varias posiciones de coordinación. Tales ligandos y quelatos metálicos se describen por ejemplo en la solicitud de patente DE-A-44 30 998.8 para la divulgación de la cual la referencia se hace con la presente. Los quelatos metálicos más preferidos son quelatos de rutenio (bipiridilo), . Todavía un aspecto adicional de la presente invención es un proceso para la producción de un anticuerpo oligomérico el cual se caracteriza porque los anticuerpos o/y fragmentos de los mismos se enlazan covalentemente entre sí. Para este propósito el anticuerpo (fragmentos) se funcionaliza(n) de una manera adecuada tal como por reacción con una de las moléculas separadoras bifuncionales mencionadas anteriormente. Las condiciones de reacción adecuadas se conocen generalmente en el estado de la técnica y no se establecen con detalle aquí (cf. también en el ejemplo 1 ) . Aún un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo oligomérico como se definió anteriormente, como un reactivo de detección en un ensayo de interposición. Además el anticuerpo oligomérico se puede usar para reducir o/y evitar el efecto de Hook (efecto de gancho) en un método inmunológico de determinación. Todavía un aspecto adicional de la presente invención se refiere a un conjunto de reactivos para la determinación inmunológica de un analito, el cual es adecuado para realizar el método de conformidad con la invención. Este conjunto comprende en particular un anticuerpo oligomérico etiquetado como se definió anteriormente y el segundo receptor usado en el método de conformidad con la invención, es decir, un receptor unido a la fase sólida o preferiblemente un receptor capaz de unirse o enlazarse a la fase sólida por ejemplo, un anticuerpo o/y fragmento de anticuerpo. El anticuerpo oligomérico y el segundo receptor se pueden presentar separadamente en el conjunto de reactivos de acuerdo con la invención o entre sí en un reactivo simple o sencillo. El conjunto opcionalmente contiene reactivos adicionales tales como una fase sólida adecuada, una solución de substrato etc., los cuales en general luego se separan espacialmente. El método de conformidad con la invención se explica con mayor detalle por los ejemplos siguientes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Producción de anticuerpos biotinilados, oligoméricos y etiquetados 1. Anticuerpo anti-HCG biotinilado, monomérico El IgG anti-HCG-M-1 F7.9 monoclonal (Boehringer Mannheim GmbH) se disuelve en 0.1 M de amortiguador de fosfato de potasio, pH 8.4 a una concentración de 10 mg/ml. Una cantidad molar de 6 partes de biotin-DDS* (disuelta en dimetilsulfóxido; 16.3 mg/ml) se agrega. Después de 90 minutos agitando a 25°C la reacción se detiene por adición de 10 jjl 1M de lisina. La misma se dializa contra 25 mM de fosfato de potasio/50 mM de NaCl, pH 7.0 y el producto se liofiliza. * Biotina (DDS) = ácido biotinil-amino-3 ,6-dioxaoctanil-aminocarbonilheptanoico-éster de N-hidroxisuccínimida (véase DE 4302241 A1 ) . 2. Anticuerpo anti-HCG rutenilado oligomérico a) Grupo de marcación o etiquetado de rutenio El éster activo Ru(bpy)32+-NHS ( ( 2 ,2 ' -bipiridil) 2 (4-[3- (N-hidroxisuccinimidil-carboxi )propil] -4 ' -metil-2, 2 ' -bipiridina) de rutenio) el cual se puede obtener de Igen Inc. Co. Rockville USA, se usa para etiquetar anticuerpos y fragmentos de anticuerpos. b) Producción de fragmentos de anti-HCG-F(ab' )2 300 mg del anticuerpo anti-HCG-M-INN22-IgG monoclonal se disocia o separa con pepsina de acuerdo con Johnstone y Thorpe (Inmunochemistry in Practice, página 61 f, Black ell Scientific, 1987) y los fragmentos de F(ab')-, se purifican por cromatografía S 200. Rendimiento o producción: 128 mg F(ab')2- c) Producción y aislami-anto de fragmentos de anticuerpo oligomérico 100 mg de fragmentos de F(ab')2 anti-HCG-M-INN22 se disuelven en 1.5 mi 0.15 M de amortiguador de K-fosfato, pH 8.3. Poco antes se usar 27.6 mg de disuccinimidilsuberato (DSS) se disuelven en 1 mi de dimetilsulfóxido. A intervalos de 10 min 5 jul de una solución de DSS se agregan a la solución de F(ab')-, mientras que se agita. Después de un periodo de reacción total de 75 min la reticulación del F(ab')2 se detiene con 15 fü. 1M de solución de lisina. El polimerizado crudo de F(ab')2 anti-HCG-M-INN22 se separa por cromatografía de gel sobre Sephacryl S300HR (Pharmacia, Upsala) en fracciones con pesos moleculares de 200,000, 400,000, 500,000-800,000 y >800,000. Los polímeros de = 800,000 son preferidos. d) Producción de fragmentos de anticuerpo oligomérico rutenilado mg del oligómero de F(ab')2 anti-HCG-M-INN22 (peso por mol de 400,00) se disuelven en 1 mi 0.15 M de amortiguador de K-fosfato, 0.15 M de NaCl, pH 7.8. Inmediatamente antes del uso de 5 mg de Ru(bpy), -NHS se disuelven en 0.75 mi de dimetilsulfóxido anhidro. Para obtener una proporción o relación molar de 3.3:1 basado en pesos moleculares de 1057 para Ru(bpy -NHS y 100,000 para el monómero de F(ab')2 0.174 mg de Ru(bpy )32+-NHS (59.4 µl ) se agregan por pipeta a la solución de F(ab')2 mientras que se agita. El recipiente de reacción se incuba por 60 min a 25°C. La reacción se termina agregando 10 juü. de una solución de lisina de 1 M. La mezcla se dializa entonces por 24 horas para 25 mM de amortiguador o solución amortiguadora de K-fosfato/0.1 M de NaCl, pH 7.0 y se liofiliza. Producción o rendimiento: 4.4 mg de oligómero anti-HCG-M-INN22-F(ab' )2~Ru(bpy ) 32+ (400,000) . Medición de la absorbencia a 455 nm (£= 13.7) produce una relación o proporción molar de etiqueta o marca incorporada de 2.2-2.8 = Ru:F(ab')2. Los fragmentos de anticuerpos oligoméricos con pesos moleculares de 200,000 y 500,000 a 800,000 se acoplan o unen de una manera similar a los grupos de etiquetado o marcación de rutenio.

Ejemplo 2 Detección de HCG usando anticuerpos oligoméricos Las dos soluciones siguientes que contienen anticuerpos rutenilados oligoméricos, etiquetados, y anticuerpos biotinilados monoméricos se preparan: Solución 1 : Fragmentos de anticuerpo de F(ab')_ anti-HCG etiquetados de Ru(bpy)3 monoclonal los cuales se pueden obtener de acuerdo con el ejemplo 1 , se usan como el receptor oligomérico (referido como AB-BPRU en lo siguiente) AB-BPRU se usa con un grado de oligomerización de 5-7 y un grado de rutenilación de 3.3. Para preparar la solución 1/ 3.0 /--1/ml de AB-BPRU se disuelven y se mezclan en 40 mmoles/1 de solución amortiguadora o amortiguador de fosfato (pH = 6.5) que contiene 0.1% de inmunoglobulina de bovino (IgG), 3.5% de albúmina de suero de bovino (BSA) y 150 mmoles/l de NaCl.

Solución 2: Anticuerpos anti-HCG biotinilados monoméricos (IgG) se disuelven en una concentración de 5.0 jag/ml, grado de biotinilación = 1:10 en una solución amortiguadora o amortiguador de fosfato de 80 mmoles/1 (pH = 7.0) que contiene 0.1% de IgG de bovino, 2.0% de BSA y 150 mmoles de NaCl. 100 µl de la solución 1 y 100 _A_ L de la solución 2 se mezclan, 25 ul de la muestra a ser analizada (suero de humano) se agregan y la mezcla se incuba por 5 min a 37°C. En seguida, 35 l de una suspensión de perlas revestidas de estreptavidina con un núcleo de hierro, capacidad de aglomeración o unión de biotina de 450 a 650 ng/ml, concentración de la solución 720 ?g/ml se agregan y se incuban por 5 min adicionales. Las perlas posteriormente se separan, se lavan con una solución que contiene tripropilamina y se determina la electroquimi-luminiscencia. En general la estreptavidina Dynabeads M-280 (Dynal A.S., Oslo, Norway) se usa. en los ejemplos como perlas es decir, partículas de poliestireno superparamagnético con un diámetro de 2.8 /-un a las cuales la estreptavidina se une o enlaza covalentemente. El resultado es que una gama de medición de hasta 12,000 mlU/ml de HCG se obtiene y una muestra que contiene 500,000 mlU/ml de HCG se reconoce como que es superior a la gama de medición (efecto de Hook). El límite de detección inferior es «¿l 0.1 mlU/ml de HCG. En esta aplicación la gama de medición se refiere a la gama en la cual los sueros de humano no diluidos se pueden determinar correctamente.

Ejemplo 3: Influencia del grado de oligomerización en la gama de medición El procedimiento experimental fue como se describió en el ejemplo 2, 3.13 >u-g/ml de AB-BPRU que se usan en la solución 1 los cuales difieren en sus grados de oligomerización como sigue: P1 MW 800,000 P2 500,000 - 800,000 P3 400,000 P4 200,000 P5 100,000 (=F(ab')2 Los resultados se muestran en la Tabla 1. Se puede observar que como el grado de reticulación se incrementa (= peso molecular) las señales de los estándares superiores se incrementan mientras que el valor del blanco (señal del estándar cero a) permanece constante. Por consiguiente, la sensibilidad de la prueba se incrementa, es decir, el incremento en el grado de oligomerización conduce a una más amplia gama de medición en tanto que se retarda el límite inferior de detección.

Tabla 1 cr.

Ejemplo 4: Detección de HCG usando un anticuerpo monoclonal monomérico (comparación), adición del anticuerpo no etiquetado o marcado En este ejemplo de conformidad con el método de la patente Norteamericana No. 4,743,542 un anticuerpo monoclonal monomérico MAB < HCG > -BPRU con un grado de rutenilación de 1:8 se usa a una concentración de 2 <-g/ml en la solución 1 y el anticuerpo monoclonal biotinilado en la solución 2 se usa a una concentración de 2/j-g/ml. Además de cantidades diferentes (2, 4, 8 y 16 -Atg/ml) de un anticuerpo anti-HOG monoclonal monoérico no etiquetado se a-gregan a la solución de prueba de modo que este anticuerpo está presente en la mezcla de prueba a concentraciones de 2, 4, 8 y 16 > /ml. 3 sueros de humano con diferentes concentraciones de HCG se prueban, HS1 (2941 mlU/ml), HS2 (50,000 mlU/ml) y HS3 (500,000 mlU/ml, muestra de Hook(de efecto de gancho)) así cerno 2 estándares que contienen 0.0 (estándar a) y 13.0 mlU/ml (estándar b) de HCG. Los resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2 Anticuerpo anti-HCG monomérico sin etiquetar [ *g/ml] 2 4 8 16 incremento de la gama = 1.0 1.84 2.76 4.19 de medición* estándar b/estándar a 1.89 1.77 1.58 1.44 * Cociente de la gama de medición a la concentración respectiva de anticuerpo sin etiquetar o no marcado dividido por la gama de medición con 2 /-v-g/ml de ~ anticuerpo no etiquetado o no marcado.

Se ha encontrado que la gama de medición se incrementa con una cantidad incrementada de anticuerpo no etiquetado. Al mismo tiempo la señal del estándar b disminuye así como aquélla de los otros sueros de humano mientras que aquel del estándar a (suero cero, valor de blanco u objetivo) permanece esencialmente constante. Consecuentemente existe una evolución desfavorable creciente de la diferenciación en la parte inferior de la gama de medición. El cociente del estándar b/a que debe estar al menos en la gama de 1.9 a 2.0 para un diagnóstico confiable está ya bajo este valor cuando se agregan 2 ;ug/ml de anticuerpo no etiquetado o no marcado. Una afirmación acerca de un posible embarazo no se puede hacer.

Ejemplo 5: Detección de HCG con anticuerpo policlonal monomé-rico (comparación), adición del anticuerpo no etiquetado o no marcado El procedimiento es como en el ejemplo 4, excepto que el anticuerpo policlonal PAB ^-£-HCG>S-(PA)-IgG(DE) se usa como el anticuerpo no marcado. Los resultados corresponden esencialmente a aquéllos del ejemplo 4, pero la gama de medición sólo se incrementa por un factor de 1.35. Una diferenciación confiable no es posible en la gama de señal inferior. El estándar b/a cociente fue 1.33 cuando 2 >tg/ml del PAB no etiquetado o no marcado se agregó y disminuyó adicionalmente a concentraciones de PAB mayores (16 -g/ml : b/a = 0.94) Ejemplo 6: Detección de HCG con anticuerpo monoclonal oligomérico adición del anticuerpo no etiquetado o no marcado El procedimiento es de acuerdo con el ejemplo 2 en el cual un anticuerpo oligomérico rutenilado (grado de oligomerización ca. 4-8) de conformidad con la invención, se usó como el anticuerpo de detección a una concentración de 1 , 2 y 4 .-ug/ml. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

Tabla 3 anticuerpo anti-HCG oligomérico rutenilado [ ?-g/p?l] 1 2 4 incremento de la gama de =1.0 1.83 4.19 medición* estándar b/estándar a 3.07 1.98 2.24 * Cociente de la gama de medición a la concentración respectiva de anticuerpo no etiquetado dividido por la gama de medición con 1 -AA-g/ml de anticuerpo no etiquetado o no marcado.

El valor de blanco u objetivo (estándar a) así como el nivel de señal de las otras muestras (sueros de humano y estándares) se incrementa con una concentración de AB-BPRU en aumento. Como se puede observar a partir de la tabla el estándar b/a cociente permanece a o arriba de 2.0 y por consiguiente asegura una buena medición en la gama de concentración inferior. Al mismo tiempo la gama de medición se incrementa considerablemente con una concentración de AB-BPRU creciente ?a cual en el presente ejemplo llega casi proporcional (una duplicación de la concentración de anticuerpo corresponde aproximadamente a una duplicación de la gama de medición). Puesto que la gama de medición se incrementa mientras que se retiene la precisión de la medida o medición en la gama de concentración de HCG inferior, en este caso existe una extensión real de la gama de medición para una estimación completa.

Ejemplo 7: Detección de TSH Comparación del anticuerpo monoclonal monomérico y oligomérico La prueba de TSH se usa para diagnosticar la función del tiroide. Los valores de TSH incrementados así como ampliamente reducidos en el suero son de importancia en el diagnóstico. Por esta razón una precisión elevada de la prueba también es importante en la gama inferior así como una buena diferenciación entre el estándar a inferior y el segundo más inferior b. La relación e/a, el cociente del más elevado dividido por el estándar más inferior, sirve como un parámetro para la gama de medición completa. El cociente deberá ser tan elevado como sea posible. Los reactivos siguientes se usaron en un sistema similar a aquél usado para HCG: R1 : solución amortiguadora o amortiguador de fosfato, 50 mmoles, pH = 7.4; 0.1% de cada uno de MIT y oxiperoina (para preservación), 2% de albúmina de suero de bovino, 1% de IgG de bovino y anticuerpo monoclonal rutenilado MAB - SH > -m-Fab-BP-Ru a una concentración de 2.0 Og/ml para el oligómero y 0.2 - 1.0 tg/ml para el monómero.

R2: Reactivo como en R1 , anticuerpo monomérico biotinilado MAB«CTSH>F(ab' )b-Bi (DDS) se usa en lugar de MAB-BPRU a una concentración de 1.7 yug/ml.

Perlas: Micropartículas con un núcleo de hierro se usan teniendo una capacidad de enlace o unión de biotina de 700 /Ag/ml.

La reacción se realiza pipetando o introduciendo con la pipeta juntamente 70 pl de muestra, 80 ?I de R1 y 80 ul de R2, cuidadosamente se mezcla y se incuba por 10 min. Después 50 AI de perlas se agregan y se incuban por unos 10 min. adicionales. Después la mezcla de reacción se coloca en el electrodo como se describe para HCG, las micropartículas se sujetan con la ayuda de un magneto o imán y se lavan. Esto se continúa por la reacción electroquímica en la cual la señal de luz se mide cuantitativamente. El resultado se muestra en la Tabla 4.

Tabla 4 4-> * medio de 3 mediciones Las concentraciones en incremento de AB-RU monomérico incrementan la señal del estándar a así como aquélla del estándar e. El cociente b/a permanece casi constante, un mejoramiento del poder resolutivo en la gama inferior (b-a) no se logra y las dinámicas de la gama de medición no se mejoran (e/a casi constantes). Esto se logra sólo cuando se agrega AB-RU oligomérico. Resultados similares se obtienen para otros lotes o porciones de micropartículas. La precisión y acuracidad de la medición se mejora por el uso de AB oligomérico el cual también se puede observar en comparaciones del método.

Ejemplo 8 Detección de HCG con un anticuerpo oligomérico con/sin adición del anticuerpo no etiquetado o no marcado (F(ab')g) R1 : 3.0 «ug/ml de MAB< HCG>-rutenio(II)tris-(bipiridil)- NHS-oligo como F(ab')2f grado de polimerización 5-7, grado de rutenilación 3.3, se disuelven y se mezclan en un amortiguador o sustancia amortiguadora de fosfato de 40 mmoles/1, pH=7.5 el cual adicionalmente contiene 0.1% de IgG de bovino y 3% de albúmina de suero de bovino (BSA).

R2: 5.0 -/u-g/ml de MAB < HCG > -IgG-biotinilado con un grado de biotinilación de 1:10 se usan en un reactivo como se describió anteriormente en lugar de MAB-PBRU.

R3: 4 >ug/p?l de PAB<HCG>-IgG policlonal no etiquetado o no marcado, se agregan adicionalmente a un reactivo R1 y se mezclan.

Una serie de estándares de HCG con concentraciones de 0 a 20,000 mlU/ml se analizan en el sistema experimental como se describió en el ejemplo 7 sin (R1 , R2 , perlas) y con la adición (R1 , R2, perlas) del anticuerpo monoclonal no etiquetado o no marcado. Resulta que una curva de calibración del aplanador se obtiene cuando los reactivos R2 y R3 se usan que cuando R1 y R2 se usan. Sin embargo, la gama de medición es mayor en el sistema de R2 , R3 ( adición del anticuerpo no etiquetado o no marcado) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un método para la determinación inmunológica de un analito en un líquido de muestra de conformidad con el principio de un ensayo de interposición o intercalación en el cual el líquido de muestra se incuba en la presencia de una fase sólida con al menos dos receptores capaces de unirse o enlazarse al analito a ser determinado en el cual el primer receptor es soluble y el segundo receptor (a) se une a una fase sólida o (b) es capaz de unirse o enlazarse a una fase sólida y el analito se detecta determinando la etiqueta o marca en la fase sólida y/o en la fase líquida, caracterizado porque el primer receptor es un oligómero de una molécula aglutinante seleccionada de anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y mezclas de los mismos.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el grado de oligomerización del primer receptor es de 2 a 15.

3 . El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 , caracterizado porque el primer receptor incluye o lleva de 1 a 20 grupos de marcación o etiquetado.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el primer receptor incluye o lleva 2 a 10 grupo de marcación o etiquetado.

5. El método de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque el grupo de marcación o etiquetado es un grupo de marcación o etiquetado de quelato de metal luminiscente.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el quelato de metal o metálico luminiscente se selecciona del grupo que comprende quelatos de rutenio, renio, iridio y osmio.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el quelato de metal luminiscente se selecciona de quelatos de rutenio.

8. El método de conformidad con alguna de las reivindicaciones previas, caracterizado porque la fase sólida se compone de un material magnético, particulado y se reviste con el segundo receptor o un material el cual es capaz de unirse o enlazarse al segundo receptor.

9. El método de conformidad con alguna de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el segundo receptor lleva o incluye grupos de biotina y la fase sólida lleva o incluye grupos de avidina o estreptavidina.

10. El método de conformidad con alguna de la reivindicaciones previas, caracterizado porque la determinación se realiza en la presencia de un primer receptor etiquetado o marcado y adicionalmente de un receptor específico del analito no etiquetado-o no marcado.

11. Un anticuerpo oligomérico que comprende un conjugado de al menos dos anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y/o mezclas de los mismos, caracterizado porque el grado de oligomerización es 2-15.

12. El anticuerpo oligomérico de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado porque él mismo lleva o incluye al menos un grupo de marcación o de etiquetado.

13. El anticuerpo oligomérico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los grupos de marcación o etiquetado son grupos de marcación o etiquetado de quelato metálico luminiscente.

14. El anticuerpo oligomérico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el quelato metálico luminiscente se selecciona a partir de quelatos de rutenio.

15. El anticuerpo oligomérico de conformidad con alguna de las reivindicaciones 12-14, caracterizado porque el número de grupos de marcación o etiquetado es de 2 a 20.

16. Un proceso para la producción de un anticuerpo oligomérico de conformidad con una de las reivindicaciones 11-15, caracterizado porque los anticuerpos y/o fragmentos de los mismos se enlazan o unen covalentemente entre sí.

17. El uso de un anticuerpo oligomérico de conformidad con una de las reivindicaciones 11-15 como un reactivo de detección en un ensayo de interposición o intercalado.

18. El uso de un anticuerpo oligomérico de conformidad con una de las reivindicaciones 11-15 para la reducción y/o prevención del efecto de Hook (efecto de gancho) en un método inmunológico.

19. El conjunto de reactivos para la determinación inmunológica de un antígeno, caracterizado porque comprende un anticuerpo oligomérico de conformidad con una de las reivindicaciones 11-15 y un anticuerpo el cual se une a una fase sólida o la cual es capaz de unirse o enlazarse a una fase sólida.