MXPA06012770A - Un metodo para producir acido succinico a partir de hidrolizados crudos. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un metodo para producir acido succinico a partir del hidrolizado grado industrial, que comprende suministrar un organismo que contiene mutaciones para los genes ptsG, pfiB y IdhA, y permitir que el organismo acumule biomasa, y permitir que el organismo metabolice el hidrolizado. Se proporciona tambien un mutante bacteriano que produce acido succinico a partir de un substrato contenido en un hidrolizado grado industrial en una relacion entre 0.6:1 y 1.3:1 de acido succinico a substrato.

Description

UN MÉTODO PARA PRODUCIR ACIDO SUCCINICO A PARTIR DE HIDROLIZADOS CRUDOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención Esta invención se relaciona con un método de fermentación para producir ácido succínico, y más particularmente, esta invención se relaciona con un método para crear una cepa bacteriana capaz de utilizar una miríada de azúcares para producir ácido succínico como un producto de fermentación mayor.

Antecedentes de la invención Los ácidos carboxílicos resultan promisorios como precursores potenciales de numerosas sustancias químicas. Por ejemplo, el ácido succínico puede servir como materia prima para precursores plásticos tales como 1 ,4-butanodiol (BDO), tetrabidrofurano y ?-butirolactona. Se están desarrollando productos nuevos derivados de ácido succínico, entre los más notables se encuentra el poliéster el cual se elabora al unir ácido succínico y BDO. Generalmente, los esteres de ácido succínico tienen potencial de ser solventes nuevos, "verdes" que pueden sustituir a muchos solventes dañinos. En total, el ácido succínico puede servir como un precursor para millones de libras de sustancias químicas anualmente con un valor en el mercado total de superior a 1000 millones. Junto con el ácido succínico, otros ácidos dicarboxílicos de 4 carbonos tales como el ácido málico y el ácido fumárico también tienen potencial como materias primas. La producción de estos ácidos carboxílicos a partir de materias primas renovables (en este caso a través de procedimientos de fermentación) es una manera de sustituir métodos de mayor intensidad energética de derivación de dichos ácidos a partir de fuentes no renovables. El succinato es un intermediario para fermentaciones anaeróbicas por bacterias productoras de propionato pero dichos procedimientos tienen como resultado rendimientos y concentraciones bajas. Las bacterias anaeróbicas de rumen, tales como Bacteroides ruminicola y Bacteroides amylophilus también producen succinato. No obstante, los organismos del rumen característicamente son inestables en procedimientos de fermentación. Durante mucho tiempo se ha sabido que se produce una mezcla de ácidos a partir de fermentación en E. coli, como lo ha indicado Stokes, J. L. 1949 "Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli" J. Bacteriol. 57: 147-158. No obstante, por cada mol de glucosa fermentada, solo se producen 1.2 moles de ácido fórmico, 0.1 -0.2 moles de ácido láctico y 0.3-0.4 moles de ácido succínico. De esta manera, los esfuerzos por producir ácidos carboxílicos de manera fermentativa han resultado en cantidades relativamente grandes de sustratos de crecimiento, tales como glucosa los cuales no se convierten al producto deseado. Algunas bacterias, tales como A. succiniciproducens, utilizadas en procedimientos de fermentación como se indica en la patente de E. U. A. No. 5, 143,834 para Glassner et al., producen de manera natural ácido succínico en litros moderados hasta únicamente aproximadamente 35-40 gramos por litro (g/1). Se ha demostrado que la cepa hospedadora de A. succiniciproducens no es altamente osmotolerante y de esta manera no tolera concentraciones elevadas de sales y además es inhibida por concentraciones moderadas del producto. Finalmente, A. succiniciproducens presenta un manejo en donde es un anaerobio obligado, lo que produce utilizar al organismo lo cual debe realizarse en ausencia de oxígeno. Además, el medio de preparación para el inoculo requiere la adición de triptofano. Los esfuerzos anteriores de los inventores para producir ácido succínico han resultado en el aislamiento y utilización de una bacteria mutante. El mutante, disponible como ATCC, número de acceso 202021, es el objeto de la solicitud de reexpedición de patente de E. U. A. No. 09/429,693. La solicitud de reexpedición No. 09/429,693, incorporada en la presente como referencia, describe una cepa bacteriana que produce ácido succínico (AFP 1 1 1) la cual mutua espontáneamente de su precursor. El mutante es capaz de crecer fermentativamente en glucosa para producir ácido succínico con rendimientos elevados, mientras que sus precursores son incapaces de hacer esto. No obstante, un inconveniente obvio de utilizar este método de producción de ácido succínico es su limitación a un único mutante. Otros esfuerzos por parte de los inventores (Patente de E. U.

A. No. 6,159,738) ha resultado en un método para construir cepas bacterianas que tienen producción aumentada de ácido succínico. El método describe que la alteración del gen para fosfotransferasa de E. coli hace que las bacterias produzcan más ácido succínico. Un inconveniente a este método es su limitación a una sola alteración. En la técnica existe la necesidad por un método para producir de manera fermentativa ácido succínico, método por el cual no se relegue a un mutante o gen únicos. El método debe permitir que cualquier organismo que tenga un genotipo particular y determinado con facilidad. El método debe ser capaz de ser realizado en condiciones relativamente inertes utilizando organismos robustos (es decir, aquellos que tienen umbrales de inhibición de retroalimentación elevados) y de esta manera que se elimine la necesidad de medidas de control ambientales sofisticadas. El método debe producir resultados superiores utilizando mezclas de azúcares derivadas de hidrólisis de materiales lignocelulosicos en la medida en que estos sustratos ofrezcan una fuente más barata de azúcares y como tales, su uso puede reducir los costos de producción para ácido succínico.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir ácido succínico que resuelva muchas de las desventajas de la técnica anterior. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de fermentación que produzca altos rendimientos de ácido succínico. Una característica de la invención es la utilización de genomas bacterianos que contengan una pluralidad de genes mutantes para habilitar el método. Una ventaja de la invención es que dicha bacteria se puede manipular con facilidad para producir la pluralidad de mutantes. De manera alternativa, se pueden utilizar bacterias que contengan de antemano la pluralidad de mutaciones, sin manipulación adicional. Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un procedimiento para manipular bacterias para producir grandes cantidades de ácido succínico. Una característica de la invención es la ruptura de la regulación normal del metabolismo de azúcar en la bacteria. Una ventaja de la invención es la capacidad para manipular una diversidad de bacterias para facilitar proporciones de producto respecto a sustrato de crecimiento relativamente elevadas (es decir, en o superiores a 1 : 1) en el procedimiento de fermentación para producir ácido succínico. Otra ventaja de la invención es la capacidad de utilizar bacterias las cuales se vuelven metabolizantes de glucosa y no metabolizantes de glucosa. Otro objeto adicional de la presente invención es producir ácido succínico de manera fermentativa. Una característica de la invención es la utilización de bacterias que contienen sistemas alterados de fosfotransferasa (pts), sistemas de piruvato formiato liasa (pfl) y sistemas de lactato deshidrogenasa (ldh). Una ventaja de la invención es que las bacterias se pueden derivar de muchos géneros los cuales utilizan estos sistemas de enzima para fermentación de azúcar. Brevemente, se proporciona un método para producir ácido succínico a partir de hidrolizados de grado industrial, que comprende: suministrar un organismo que contiene mutaciones para los genes ptsG, pflB y IdhA; permitir que dicho organismo acumule biomasa; y permitir que el organismo metabolice el hidrolizado. También se proporciona una bacteria mutante caracterizada porque produce ácido succínico a partir de sustrato contenido en hidrolizado de grado industrial en una proporción de entre 0.6: 1 y 1.3 : 1 de ácido succínico respecto a sustrato (por ejemplo entre 0.6 y 1.3 gramos de ácido succínico por gramo de azúcar total consumido).

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS La presente invención, junto con los objetivos anteriores y otros objetivos y ventajas se pueden comprender mejor a partir de la siguiente descripción detallada de la modalidad de la invención que se ilustra en los dibujos, en los que: la figura 1 es una gráfica que muestra una producción aumentada de ácido succínico después de transformación de una bacteria con un gen mutante, de acuerdo con las características de la presente invención; la figura 2 es una gráfica que muestra la fermentación de hidrolizado industrial vía un organismo mutante triple, de acuerdo con las características de la presente invención; y la figura 3 es una gráfica que muestra la fermentación de azúcar sintética vía un organismo mutante triple, de acuerdo con las características de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores han desarrollado un método para producir de manera fermentativa altos rendimientos de ácido succínico. El método aprovecha los mecanismos alterados de represión de catabolito de los organismos seleccionados de manera que permite que los organismos produzcan ácido succínico utilizando mezclas de materias primas de glucosa y diferentes de glucosa. Antes de establecer la invención con detalle, se proporcionan las siguientes definiciones sí aparecen en la presente: Un "vector" es un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido al cual se puede unir otro segmento de ADN de manera que lleva a cabo la replicación del segmento unido. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de ADN in vivo, es decir, capaz de replicación bajo su propio control. Un "cásete" se refiere a un segmento de ADN que puede ser insertado en un vector en sitio de restricción específicos. El segmento de ADN codifica para un polipéptido de interés, y el cásete y los sitios de restricción están diseñados para asegurar la inserción del cásete en el marco de lectura apropiado para transcripción y traducción. Una célula ha sido "transfectada" por ADN exógeno o heterólogo cuando dicho ADN ha sido introducido dentro de la célula. Una célula ha sido "transformada" por ADN exógeno o heterólogo cuando el ADN transfectado lleva a cabo un cambio fenotípico. El ADN "heterólogo" se refiere a ADN que no se localiza de manera natural en la célula o en un sitio cromosómico de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye un gen extraño a la célula. Una "molécula de ácido nucleico" se refiere a una forma polimérica de éster de fosfato de ribonucleosidos (adenosina, guanosina, uridina o citidina; "moléculas de ARN") o desoxirribonucleosidos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina o desoxicitidina; "moléculas de ADN") o cualquiera de los análogos fosfoéster de los mismos, tales como fosforotioatos y tioésteres ya sea en forma de cadena sencilla o en una hélice de cadena doble. Son posibles hélices de cadena doble ADN-ADN, ADN-ARN y ARN-ARN. El término molécula de ácido nucleico, y en particular molécula de ADN o ARN, se refiere únicamente a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no se limita a alguna de las formas terciarias particulares. De esta manera, este término incluye ADN de cadena doble que se encuentra, por ejemplo, en moléculas de ADN lineales o circulares (por ejemplo, fragmentos de restricción), plásmidos y cromosomas. Al discutir la estructura de las moléculas de ADN de cadena doble particular, se pueden describir secuencias en la presente de acuerdo con la convención normal de proporcionar únicamente la secuencia en la dirección 5 ' a 3' a lo largo de la cadena no transcrita de ADN (es decir, la cadena que tiene una secuencia homologa al ARNm). Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha experimentado manipulación biológica molecular. Una molécula de ácido nucleico es "hibridizable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o ARN cuando una forma de cadena sencilla de una molécula de ácido nucleico se puede reasociar a otra molécula de ácido nucleico bajo condiciones apropiadas de temperatura y fuerza iónica de la solución (véase Sambrook et al., supra). Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Para un cribado preliminar para ácidos nucleicos homólogos, las condiciones de hibridación de baja rigurosidad, que corresponden a una Tm de 55°C son las que se pueden utilizar, por ejemplo 5XSSC, SDS 0.1 %, leche 0.25% y sin formamida; o formamida 30%, 5X SSC, SDS 0.5%). Las condiciones de hibridación de rigurosidad moderada corresponden a una Tm más alta, por ejemplo formamida 40% con 5X o 6X SCC. Las condiciones de hibridación de alta rigurosidad corresponden a la Tm más alta, por ejemplo formamida 50%, 5X o 6X SCC. La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles malos apareamientos entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridación de ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y el grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor sea el grado de similitud u homología entre dos secuencias nucleotídicas, mayor será el valor de Tm para híbridos de ácido nucleicos que tengan dichas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a Tm más alta) de hibridaciones de ácido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN: ARN, ADN: ARN y ADN:ADN. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al., supra, 9.50-0.51). Para hibridación con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de los malos apareamientos se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 1 1.7-1 1.8).

Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridizable es de por lo menos aproximadamente 12 nucleótidos, de manera preferible por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos; y de manera más preferible la longitud es de por lo menos aproximadamente 27 nucleótidos; y de manera mucho más preferible de aproximadamente 36 nucleótidos. El término "recombinación homologa" se refiere a la inserción de una secuencia de ADN extraño de un vector en un cromosoma. Preferiblemente, el vector está dirigido hacia un sitio cromosómico específico para recombinación homologa. Para recombinación homologa específica el vector contendrá regiones suficientemente largas de homología a secuencias del cromosoma para permitir la unión complementaria y la incorporación del vector en el cromosoma. Las regiones más largas de homología y los mayores grados de similitud de secuencia pueden aumentar la eficiencia de la recombinación homologa. Una "secuencia codificante" de ADN es una secuencia de ADN de cadena doble la cual se transcribe y traduce en un polipéptido en una célula in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por el codón de inicio en la parte 5' (amino) terminal, y el codon de detención de traducción en la parte 3 ' (carboxilo) terminal. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a secuencias de procariótas, ADNc de ARNM eucariótico, secuencias de ADN genómico a partir de ADN eucariótico (por ejemplo de mamífero) e incluso secuencias de ADN sintético. Sí la secuencia codificante está diseñada para expresión en una célula eucariótica, una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción habitualmente se localizará en 3 ' respecto a la secuencia codificante. Las secuencias de control transcripcionales y traduccionales son secuencias reguladoras de ADN tales como promotores, mejoradores, terminadores y similares, que proporcionan la expresión de una secuencia codificante en una célula hospedadora. En células eucarióticas, las señales de poliadenilación son secuencia de control. Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unir ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante en la dirección 3 '. Por ejemplo, la secuencia promotora está unida en su parte V terminal por el sitio de inicio de transcripción y se extiende hacia la dirección 5' para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo, dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, mediante el mapeo con la nucleasa S l) así como dominios de unión de proteína (secuencias de consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa. Una secuencia codificante está "bajo el control" de secuencias de control transcripcionales y traduccionales en una célula cuando la ARN polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm, el cual después se empalma en ARN trans y se traduce en la proteína codificada por la secuencia codificante. Como se utiliza en la presente, el término "homología de secuencias" en todas sus formas gramaticales se refiere a la relación entre las proteínas que poseen un "origen evolutivo común" que incluye proteínas de superfamilias (por ejemplo la superfamilia de inmunoglobulina) y proteínas homologas de especies diferentes (por ejemplo cadena ligera de miosina, etc) (Reeck et al., Cell, 50:667 (1987)]. En consecuencia, el término "similitud de secuencia" en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de proteínas entre ácidos nucleicos o aminoácidos que no comparten un origen evolutivo común [véase Reeck et al., 1987, supra]. No obstante, en uso común y en la presente solicitud, el término "homólogo", cuando está modificado con un adverbio tal como "altamente" puede referirse a similitudes de secuencia que no son de origen evolutivo común. Dos secuencias de ADN son "sustancialmente homologas" o sustancialmente similares" cuando por lo menos aproximadamente 50% (de manera preferible por lo menos aproximadamente 75% y de manera mucho más preferible por lo menos aproximadamente 90%, 95% o 99.9%) de los nucleótidos coinciden sobre la longitud definida de las secuencias de ADN. Las secuencias que son sustancialmente homologas se pueden identificar al comparar las secuencias utilizando software estándar disponible en bancos de datos de secuencia o en experimento de hibridación Southern, por ejemplo, bajo condiciones rigurosas como se define para ese sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas están dentro de la habilidad en la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., supra; ADN Cloning, Vols. I & II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. De manera similar, dos secuencias de aminoácidos "sustancialmente homologas" o "sustancialmente similares", cuando más de 30% de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente 60% son similares (funcionalmente idénticos). Preferiblemente, las secuencias similares homologas se identifican por alineación utilizando, por ejemplo, el programa de acumulación GCG (Genetics Computer Group, programa manual para el paquete GCG, versión 7, Madison, is). El término "que corresponde a" se utiliza en la presente para referirse a secuencias similares homologas en donde la posición exacta es idéntica o diferente de la molécula a la cual se le mide la similitud u homología. Por lo tanto, el término "que corresponde a" se refiere a la similitud de la secuencia y no a la numeración de los residuos aminoácidos o bases nucleotídicas. Los mutantes resultantes de los protocolos resultan en una proporción de succinato respecto a materia prima de hasta 1.3 : 1 y típicamente de 0.9: 1. Se obtienen acumulaciones de succionato entre 60 g/1 y 75 g/1. Las duraciones típicas de protocolo son mayores de 70 horas y habitualmente entre 120 y 170 horas. Por ejemplo, se obtienen rendimientos de 70 g/1 después de 160 horas. El proceso es viable desde entre aproximadamente 25°C y 45°C, con un intervalo preferible de aproximadamente 30 a 39°C. Es adecuado un pH de entre aproximadamente 5 y 9, con un intervalo más preferible de aproximadamente 6.1 y 7.2. Los mutantes inventados son componentes especialmente viables del protocolo fermentativo en la medida en que presenten una tolerancia aumentada a productos fermentativos. Por ejemplo se pueden obtener concentraciones de 72 g/1 para succinato, 22 g/1 para acetato, 14 g/1 para etanol y 8 g/1 para lactato, sin inducir inhibición de retroalimentación. Detalle de materia prima Una característica notable del método y mutante de la invención es la utilización directa de materias primas industriales. Se pueden utilizar una amplia variedad de materias primas que incluyen pero que no se limitan a agua de maceración directa, hidrolizado lignocelulosico producido por diversos métodos de hidrólisis, soluciones de azúcar derivada de maíz (tal como licor de macerado de maíz), lactosa de suero y otros azúcares de grado industrial. Por ejemplo, el hidrolizado lignocelulosico producido por hidrólisis acida concentrada o hidrólisis acida diluida, hidrólisis enzimática o hidrolizados producidos por una combinación de estos procedimientos, son todos adecuados. También son adecuadas las soluciones de azúcar derivadas de maíz. Las materias primas industriales generalmente son mezclas de glucosa y otros azúcares, el azúcar diferente de glucosa más común es xilosa. La figura 2 muestra la utilización de glucosa y xilosa por uno de los mutantes de la invención. En base en lo anterior, cualquier materia prima que contenga glucosa y/o azúcares diferentes de glucosa resulta adecuada. Como tales materias primas que contienen glucosa, sorbitol, xilosa, arabinosa, mañosa, lactosa, ácido glucuronico, galactosa, fructosa y combinaciones de las mismas resultan apropiadas. Detalle de los organismos Los métodos de la invención utilizan organismos que contiene alteraciones en el sistema de represión por catabolito de los organismos. Específicamente, los inventores han encontrado que cuando existen alteraciones en el sistema de fosfotransferasa (pts), en el sistema de piruvato formiato liasa (pfl) y en el sistema de lactato deshidrogenasa (ldh) de las bacterias, estas bacterias son adecuadas para uso en los procedimientos de producción de ácido succínico de la invención. Los genes pflAB y IdhA son los que codifican para piruvato: formiato liasa y la lactato deshidrogenasa fermentativa, respectivamente.

De esta manera, la única limitación respecto al tipo de organismo utilizado en el procedimiento fermentativo de la invención es que el organismo originalmente debe tener esto sistemas. Se puede utilizar un organismo que comprenda de manera natural alteraciones en estos sistemas (es decir, mutantes espontáneos) u organismos los cuales estén alterados específicamente. En los casos en donde las bacterias están alteradas, las bacterias fermentativas que tengan rendimientos nulos o bajos de producto de ácido succínico (es decir, menos de 0.5 moles por una mol de sustrato de crecimiento alimentado)se convierte en las bacterias que tengan rendimientos elevados de producto de ácido succínico (es decir, mayores que o iguales a 1 mol de ácido succínico por uno o más de sustrato de crecimiento alimentado). Cualquier bacteria capaz de producir de manera fermentativa cualquier ácido succínico son candidatos de transducción particularmente adecuados, que incluye pero que no se limitan a bacterias fermentativas gram negativas y gram positivas. Preferiblemente, las cepas adecuadas incluyen pero no se limitan a E. coli, Klebsiella, Erwinia y Lactobacillus. Los organismos que se van a alterar para incluir las tres inactivaciones se modifican por transducción en serie utilizando bacteriófago Pl . Se utilizan los protocolos de transducción estándar Pl, un protocolo ejemplar se describe en J. H. Miller, ed. Experiments in Molecular Genetics 1972 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.) y se incorpora en la presente como referencia. Utilizando este método, las cepas de tipo natural o casi de tipo natural de las bacterias (por ejemplo la cepa C600 de E. coli; ATTC acceso número 23724) se puede utilizar para crear subcepas mutantes que carezcan de uno, dos o tres genes funcionales que se seleccionan de pfl, Idh y ptsG. El término "inactivación de gen" se refiere a un procedimiento en donde se suprime la expresión de un gen particular en una célula. El procedimiento de supresión puede incluir, por ejemplo, el direccionamiento para el bloqueo del gen o el bloqueo antisentido. El direccionamiento para bloqueo de gen se refiere a un procedimiento de introducción de un constructo de ácido nucleico en una célula para recombinar específicamente con el gen objetivo. El constructo de ácido nucleico inactiva al gen objetivo. La inactivación puede ser por introducción de codones de terminación en una región codificante o la introducción de un sitio d represión en una secuencia reguladora. El bloqueo antisentido se refiere a la incorporación en una célula de secuencias de expresión las cuales dirigen la síntesis de ARN antisentido para bloquear la expresión de un gen objetivo. El ARN antisentido híbridiza con el ARNm del gen objetivo para inhibir la expresión. Un ejemplo de una cepa de E. coli que comprende tres mutaciones que pueden ser utilizadas en la invención se denomina AFP 184 (ATCC número de acceso PTA 5132, depositado el 9 de abril de 2003) (AFP = programa de materia prima alternativa). AFP 184 tiene la supresión pfl, la inactivación ldh y una forma mutante diferente de ptsG insertada de manera deliberada en una cepa de tipo casi natural de E. coli. También se puede utilizar otra cepa denominada AFP 415. AFP 415 difiere de AFP 184 únicamente en que tiene inactivado ptsG. Funciona de manera similar a AFP 184. De manera sorprendente e inesperada, los inventores encontraron que la velocidad de metabolismo y el título para AFP 184 y AFP 415 son superiores a los derivados W1485 descritos en las patentes de E. U. A. Nos. 5,770,435 (ahora solicitud reexpedida No. 09/429,693) y 6,159,738. La tabla 1 proporciona una comparación de producción de ácido succínico por AFP 184 y un derivado W1485 (AFP 1 11). Es notable que aunque el derivado W1485 utiliza materias primas muy refinadas, AFP 184 aún proporciona valores superiores con hidrolizados de grado industrial. Una mutación que contenga la totalidad de las tres inactivaciones también se puede generar utilizando una bacteria que contenga de antemano una o dos de las anomalías genéticas y después introducir las inactivaciones restantes. En este caso, un organismo de inicio viable es W1485, ATCC número de acceso 12435. AFP 400 (ATCC, número de acceso PTA 5583, depositado el 10 de octubre de 2003) es un organismo con inactivación triple elaborado deliberadamente.

Contiene la supresión de pfl por August Bock, y se insertó en W1485 por David Clark de la University of Illinois para producir FMJ123. FMJ123 se produce de acuerdo con el protocolo encontrado en P. K. Bunch et al. (1997) Microbiology 143, 187-195, y se incorpora en la presente como referencia. AFP 400 también contiene la inactivación ldh y se insertó en FMJ123 para producir DC1327. DC1327 se produce de acuerdo con el protocolo encontrado en Chatterjee et al., Appl. Environ. Microbiol. 61, pp 148-154, y se incorpora en la presente como referencia. AFP 400 contiene la inactivación ptsG, como se describe en la referencia de Chatterjee.

Tabla 1 : Comparación de producción de ácido succínico por diferentes líneas de E. coli Cepa Concentración Productividad máxima Rendimiento máxima (g/g de glucosa) AFP 111 51 g/1 0.87 g/lh 0.70 AFP 184 72 g/1 l.O g/lh 1.00 También se ha construido AFP404 con inactivación triple (ATCC, número de acceso PTA 5133, depositado el 9 de abril de 2003) por introducción de las tres inactivaciones en la cepa C600. AFP404 es similar a AFP 184 pero tiene una inactivación de ptsG en vez de una mutación puntual del gen. También produce ácido succínico con un rendimiento de aproximadamente 1 mol/mol de glucosa. Un protocolo para el desarrollo de la mutación triple a partir de la cepa natural también se encuentra en R. Chatterjee et al. Los marcadores de antibióticos típicos que indican la presencia de cada una de las inactivaciones incluyen, pero no se limitan a Cam, Tet y Kan. Las cepas nuevas de E. coli, AFP 400 y AFP 404 que contiene las inactivaciones y los marcadores de antibióticos se han generado de esta manera. Dicho protocolo sigue: Construcción e introducción de un gen ptsG inactivado insercionalmente Un gen ptsG nativo de E. coli se clona por PCR a partir de ADN genómico preparado a partir de W1485 utilizando cebadores dirigidos a las partes N y C terminales de la proteína sin secuencias genómicas adicionales amplificadas. El gen se clona en el vector pFJ1 18EH para proporcionar pJFptsG. El gen se rompe por inserción del cásete de resistencia a canamicina de pUC-4K (Pharmacia), se corta con EcoRI en el sitio Mfel del gen ptsG en pJFptsG para proporcionar el plásmido pTSGK. Debido a que NZN 1 11 ya incluye un marcador de resistencia a canamicina, se construye una cepa equivalente por transducción del gen ldhA inactivado por TnlO a partir de la cepa SE1752 en FMJ123. La cepa resultante, DC1327, no es distinguible en su fisiología de NZN 1 1 1. El gen ptsG roto se transfiere en DC1327 por transformación de las células con pTSGK, haciendo crecer las células durante aproximadamente 30 generaciones en presencia de canamicina y ausencia de ampicilina, y después sembrando en placa el cultivo sobre placas LB que contienen glucosa y se incuban anaeróbicamente. Las colonias que son capaces de crecer de manera fermentativa se purifican y criban para determinar su sensibilidad a los dos antibióticos, como se describe con detalle en los ejemplos que siguen. Se aisla la cepa AFP400 como una cepa sensible a ampicilina, resistente a canamicina, estable, que fermenta a glucosa a succinato, acetato y etanol. La integración apropiada del gen ptsG roto se confirma por PCR. El gen roto se amplifica a partir de ADN AFP400 utilizando cebadores que hacen coincidir las secuencias flanqueantes aproximadamente 1 10 pares de bases fuera de la región codificante del gen. Estas secuencias no están presentes en un vector de integración. El producto resultante tiene un tamaño de 3.0 kb, como se predice a partir de la secuencia conocida ptsG, sus regiones flanqueantes y el inserto de canamicina. El producto se digiere con Clal (sitio en el cásete de canamicina) y Agel (sitio en ptsG) y genera los fragmentos que se esperan para inserción del cásete en el sitio Mfel de ptsG (1.95 y 1.05 kb para Clal, y 2.3 y 0.7 kb para Agel). Otra cepa adicional que comprende las tres inactivaciones, AFP 404, también se deriva de C600, una cepa de tipo casi natural de E. coli K12 utilizando el mismo protocolo anterior. La ubicación de las inactivaciones como se conocen de antemano de la investigación previa del inventor (patente de E. U. A. No. 6,159,738 y Chatterjee et al.) se discutió supra. Las inactivaciones se introducen utilizando una copia del gen inactivado, que tiene un marcador de resistencia, para transformar células. Se permite que se produzca recombinación homologa, como se facilita por las enzimas hospedadoras. Después se selecciona el cromosoma que contenga el marcador. La inactivación de ptsG se introduce de esta manera. La prueba de su inserción, vía PCR, se destalla en Chatterjee et al., incorporada previamente como referencia. Detalle de Crecimiento Los organismos mutantes triples producidos por los inventores no son anaerobios obligados. Como tales, la acumulación inicial de biomasa puede producirse aeróbicamente, después de lo cual se establecen las condiciones fermentativas. Las ventajas de este procedimiento en dos etapas (es decir, aeróbico y después anaeróbico) de protocolo se ilustran en la figura 2, en donde la velocidad de producción de ácido succínico es mucho mayor en comparación con la curva de crecimiento del protocolo anaeróbico de una sola etapa de la figura 1. De manera general, cuando la biomasa alcanza un punto del equivalente de aproximadamente 108 a 101 1 células por mililitro (o aproximadamente 2 a 5 gramos de peso de célula seca por litro), el fermentador se vuelve anaeróbico. En el laboratorio, este punto de concentración se alcanza después de aproximadamente 6 horas.

En protocolos industriales, un fermentador se carga con agua de maceración ligera más hidrolizado lignocelulosico. Se incluyen antibióticos según se necesiten en las siguientes concentraciones: 100 µg de carbenicilina por ml, 30 µg de canamicina por ml, 10 µg de tetraciclina por ml y 30 µg de cloramfenicol por ml. Un caldo rico contiene (por litro), 10 g de triptona, 5 g de NaCl y 1 g de extracto de levadura. El medio sólido para placas contiene 1.5 por ciento (peso/volumen) de agar Difco Bacto-Agar. El medio mínimo E se prepara como se describe en Vogel, H. J. 1956 Acetylornithinase in E. coli., Biol. Chem. 218: 97-103, la cual se incorpora en la presente como referencia. Las condiciones de laboratorio para la fermentación son las siguientes: Se realiza el crecimiento fermentativo en tubos de sueros sellados que contienen 10 ml de medio LB suplementado con 0.5 g de MgCO3 (agregado con el fin de mantener el pH del medio durante la fermentación), antibióticos y aproximadamente 10 g/1 de glucosa. Se pueden utilizar una mediada de sustratos de crecimiento que incluyen pero que no se limitan a azúcares, alcoholes de azúcar, ácidos de azúcar y combinaciones de los mismos. Los siguientes azúcares se probaron en lugar de glucosa a concentraciones de 5 g/1 en crecimiento anaeróbico: trehalosa, mañosa, fructosa, sorbitol y ácido glucuronico. Se preparan inóculos para el cultivo de líquido anaeróbico al hacer crecer las cepas aeróbicamente durante la noche en medio LB suplementado con antibiótico. Una muestra del cultivo nocturno se diluye a 100 veces en medio fresco y se permite que crezca aeróbicamente a una A600 de aproximadamente 1 ; el medio de crecimiento anaeróbico se inocula con 1 ml de inoculo. Se extraen las muestras anoxicamente de los tubos sellados en momentos apropiados para análisis de las concentraciones de glucosa (o sustratos de azúcar alternativos) remanentes y los productos de fermentación que se forman. Para crecimiento anaeróbico en medio sólido, las placas de agar se incuban a 37°C en una jarra anaeróbica bajo una atmósfera de H2-CO2 generada por el uso de Gas-Pak. Se utiliza un ensayo en placa para determinar la actividad de ß-galactosidasa para determinar la presencia de represión de catabolito normal en cepas. El medio LB o el medio de agar E son dos de los diversos medios los cuales se pueden utilizar. El medio de agar E es un medio nutriente mínimo utilizado comúnmente y se discute en Vogel, H. J., 1956 Acetylornithase in E coli, J. Biol. Chem 218: 97-103, incorporado en la presente como referencia. En protocolos ejemplares, el medio LB o el medio de agar E se suplementan con 4 g/1 de glucosa, 4 g/1 de lactosa, 3 mg/l de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-ß-D-galactosido (X-gal) y antibióticos. Estos medios posteriormente se les denomina como agar X-gal/glucosa. La formación de colonias azules indica la expresión de ß- galactosidasa en presencia de glucosa debido a la ausencia de represión de catabolito normal. Inversamente, la formación de colonias blancas indica que existe represión normal del catabolito y por lo tanto no está presente enzima para separar el disacárido lactosa. Los inventores también han diseñado un método para utilizar el mutante en un procedimiento continuo. En un procedimiento continuo se llevan a cabo experimentos repetitivos, en los cuales, después de que el cultivo ha producido aproximadamente 50 g/1 de ácido succínico, se agrega 1 ml de la mezcla a un recipiente fresco que contiene medio LB, glucosa y MgCO3. Este inoculo nuevo continúa produciendo ácido succínico de manera eficaz. Este procedimiento se repite 3-4 veces, en cada caso resulta en una producción eficaz de ácido succínico.

Ejemplo 1 - Producción de ácido succínico utilizando hidrolizado industrial Se coloca AFP 184 en un fermentador con hidrolizado verdadero de paja de arroz. Un hidrolizado ejemplar se prepara comercialmente y se encuentra disponible de Arkenol Inc., de Mission Viejo, CA, vía su procedimiento de hidrólisis acida concentrada, el medio de paja de arroz contiene aproximadamente 600 g/1 de glucosa y 169 g/1 de xilosa como los dos componentes de azúcar principal, más cantidades menores de otros azúcares. Los datos experimentales se encuentran en la tabla 2 y en la figura 2.

Lo siguiente es un protocolo para el procedimiento de fermentación basado en AFP 184: el medio de fermentación contiene los siguientes componentes: extracto de levadura Difco, 5 g/1, triptona 10 g/1, (NH4)2SO4, 2 g/1, MgSO4-7H2O 0.2 g/1, NaCl 10 g/1, K2HPO4 7 g/1, KH2PO 3 g/1, hidrolizado de Arkenol 16.5 mg/l y canamicina 30 mg/l. El hidrolizado industrial contiene 607 g/1 de glucosa y 169 g/1 de xilosa como los dos componentes de azúcar principales más cantidades menores de otros azúcares. El medio con la totalidad de los componentes excepto el antibiótico se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Después se agrega canamicina, al dejar enfriar. Este medio de fermentación se utiliza tanto para los matraces de inoculo como para el fermentador de un litro. Para el inoculo se colocan 50 mg de medio en un matraz de 205 mg y se inocula con 0.2 mg de cultivo concentrado AFP184 el cual se mantiene en glicerol 30% y a -70°C. El matraz se incuba en un agitador incubador a 37°C y 250 rpm durante la noche (aproximadamente 16 horas). La totalidad del contenido de los matraces después se utiliza para inocular el fermentador el cual se mantiene a 37°C. El medio en el fermentador se airea para permitir el crecimiento rápido del organismo. Después de seis horas, cuando se alcanza la masa de células requerida, se toman las siguientes acciones: 1. Se suspende el suministro de aire para ejercer condiciones anaeróbicas, las cuales pueden iniciar la producción de ácido succínico; 2. se purga dióxido de carbono gaseoso al medio, a una velocidad de 0.03 mg por minuto; y 3. una solución de alimentación la cual contiene el hidrolizado de Arkenol diluido con agua desionizada a una concentración de 500 g/1 de glucosa total más xilosa se agrega al fermentador para obtener una concentración de azúcar total de 50 g/1 en el medio de fermentación. Durante el desarrollo del experimento, cuando la concentración de azúcar en el fermentador es baja, se agrega más alimento para proporcionar sustratos suficientes para la producción de ácido succínico. Conforme las células producen ácido succínico, disminuye el pH. Se mantiene a un pH de 6.5 por la adición de una solución de Na2CO3 1.5 M mediante la acción de un controlador automático de pH. Se toman muestran a intervalos y se analizan para determinar densidad óptica, glucosa, xilosa, ácido succínico, ácido acético, ácido láctico y etanol.

Tabla 2: Producción de ácido succínico, ácido acético y etanol a partir de Arkenol con un mutante que contiene anomalías en ptsG, ldh y pfl Tiempo glucosa xilosa ácido ácido acético etanol succinico 0 7.04 1.94 0 0 1.60 2 6.85 1.53 0 0.41 1.35 1.2 4.41 0 0 0.85 1.13 6 0 0 0 0.55 1.04 6.05 29.27 7.17 0 0 0.68 24 9.56 1.69 26.12 2.24 0.49 24.05 27.25 5.60 26.39 2.82 0.72 28.1 23.7 14.69 28.42 2.98 0.71 29.5 22.8 14.17 27.20 3.04 0.67 29.55 34.77 7.95 26.41 2.63 0.52 48 20.98 4.72 37.98 3.71 0.62 54 19.13 4.30 43.82 4.10 0.71 54.05 46.73 10.85 43.51 3.69 0.59 72 35.14 8.85 48.52 4.01 0.63 80 33.60 8.45 51.44 4.10 0.50 104.25 23.02 7.20 50.99 4.64 0 120 19.73 6.77 54.12 4.83 0 192 13.04 5.87 63.21 4.88 0 Ejemplo 2 - Producción de ácido succínico a partir de una mezcla de azúcar sintética Se desarrolla un protocolo de fermentación utilizando AFP 184 en combinación con una materia prima de azúcar sintética. Como se puede notar en la figura 3, la producción de succinato es rápida hasta 80 horas, forma una meseta un poco antes de alcanzar una altura final de 60 g/1, aproximadamente después de 140 horas.

El medio de fermentación contiene los siguientes componentes: 5 g/1 de extracto de levadura Difco, 10 g/1 de triptona, 2 g/1 de (NH4)2SO4, 0.2 g/1 de MgSO4-7H2O, 10 g/1 de NaCl, 7 g/1 de K2HPO4, 3 g/1 de KH2PO4, 7.6 g/1 de glucosa, 1.85 g/1 de xilosa y 30 mg/l de canamicina. El medio con todos los componentes excepto el antibiótico se esteriliza en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Después se agrega canamicina, al dejar enfriar. Este medio de fermentación se utiliza tanto para los matraces de inoculo como para el fermentador de un litro. Para el inoculo se colocan 50 mg de medio en un matraz de 250 mg y se inocula con 0.2 mg de cultivo concentrado AFP184 el cual se mantiene en glicerol 30% y a — 70°C. El matraz se incuba en un agitador de incubador a 37°C y 250 rpm durante la noche (aproximadamente 16 horas). La totalidad del contenido del matraz después se utiliza para inocular el fermentador el cual se mantiene a 37°C. El medio en el fermentador se airea para permitir el crecimiento rápido del organismo. Después de seis horas, cuando se obtiene la masa de células requerida, se toman las siguientes acciones: 1. Se suspende el suministro de aire para ejercer condiciones anaeróbicas, las cuales pueden iniciar la producción de ácido succínico; 2. se purga dióxido de carbono gaseoso al medio, a una velocidad de 0.03 mg por minuto; y 3. se agrega al fermentador una solución de alimentación la cual contiene 400 g/1 de glucosa y 84 g/1 de xilosa para obtener una concentración de azúcar total de 50 g/1 en el medio de fermentación. Durante el desarrollo del experimento, cuando la concentración de azúcar en el fermentador es baja, se agrega más alimento para proporcionar sustratos suficientes para la producción de ácido succínico. Conforme las células producen ácido succínico, disminuye el pH. Se mantiene a un pH de 6.5 por la adición de una solución de Na2CO3 1.5 M mediante la acción de un controlador automático de pH. Se toman muestras a intervalos y se analizan para determinar densidad óptica, glucosa, xilosa, ácido succínico, ácido acético, ácido láctico y etanol. La tabla 3, abajo, y la figura 3 ilustran la producción de ácido succínico que resulta de la utilización de la mezcla sintética de azúcar. Como se puede notar en una comparación entre el ejemplo 1 y el ejemplo 2, la producción de succinato del mutante es equivalente (véanse los puntos de tiempo 120 y 122 de la tabla 2 y 3, respectivamente) cuando se utiliza el hidrolizado industrial versus a cuando se utiliza materia prima sintética. Este resultado ilustra el carácter robusto del protocolo de la invención y que cualquier material tóxico inherente con los hidrolizados de grado industrial no disminuye el rendimiento.

Tabla 3: Producción de ácido succínico en un protocolo de fermentación utilizando azúcar sintético Tiempo glucosa xilosa succinato acetato 0 7.65 1.85 0 0 2 7.19 1.03 0 0.32 4.2 3.15 0 0 1.1 4.45 6.03 0.84 0 1.1 6 1.04 0 0 2.02 6.25 40.2 7.57 0 2.02 24 7.76 3.92 24.55 3.43 30 9.18 2.63 29.34 4.11 30.25 39.3 8.2 29.34 4.11 Tiempo glucosa xilosa succinato acetato 48 18.6 5.5 39.8 4.6 54 14.8 4.95 42.33 5.26 54.25 27.4 8.1 40.77 4.9 72 19.7 6.04 48.33 5.76 78 17.6 5.42 50.27 78.25 35.5 9.49 48.87 5.75 96.5 30.2 8.25 53.62 5.87 122 24.1 6.48 55.1 5.87 144 22.8 5.67 59.35 5.43 Aunque se ha descrito con referencia a los detalles de la modalidad ilustrada, no se pretende que estos detalles limiten el alcance de la invención como se define en las reivindicaciones anexas.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir ácido succínico a partir de hidrolizados de grado industrial, caracterizado porque comprende: a) suministrar un organismo que contiene mutaciones para los genes ptsG, pflB y IdhA; b) permitir que el organismo acumula biomasa; y c) permitir que el organismo metabolice el hidrolizado.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo es de un género que se selecciona del grupo que consiste de Escherichia coli, Klebsiella, Erwinia y lactobacillus.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la biomasa se acumula entre aproximadamente 10 a 1011 células por mililitro.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el hidrolizado de grado industrial es hidrolizado lignocelulosico o soluciones de azúcar derivadas de maíz.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la temperatura se selecciona de entre aproximadamente 25°C y 45°C.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque la biomasa se acumula en una atmósfera aeróbica.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el pH se selecciona de entre aproximadamente 5 y 9.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el hidrolizado está contenido en una primera cantidad de materia prima y en donde el método se vuelve continuo con la adición de una segunda cantidad de materia prima.

9. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la segunda cantidad de materia prima se agrega cuando la concentración de ácido succínico es de aproximadamente 50 g/1.

10. Un mutante bacteriano, caracterizado porque produce ácido succínico a partir de un sustrato contenido en hidrolizado de grado industrial en una proporción de entre 0.6: 1 y 1.3 : 1 de ácido succínico respecto a sustrato.

1 1. El mutante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado por que el sustrato es un azúcar que se selecciona del grupo que consiste de glucosa, lactosa, sorbitol, xilosa, arabinosa, mañosa, ácido glucuronico, galactosa, fructosa o combinaciones de los mismos.

12. El mutante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el mutante contiene un sistema de fosfotransferasa inoperante, un sistema de piruvato formiato liasa inoperante y un sistema de lactato deshidrogenasa inoperante.

13. El mutante de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el sistema de fosfotransferasa inoperante es el resultado de una mutación puntual.

14. El mutante de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el mutante utiliza más de un sustrato simultáneamente para producir ácido succínico simultáneamente.