MXPA06012431A - Sistema de administracion para agentes bioactivos con base en un portador de farmaco polimerico que comprende un polimero de bloque anfifilico y un derivado de acido polilactico. - Google Patents

Sistema de administracion para agentes bioactivos con base en un portador de farmaco polimerico que comprende un polimero de bloque anfifilico y un derivado de acido polilactico.

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polylactic
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Jeong-Il Yu
Jae-Hong Kim
Yil-Woong Yi
Sa-Won Lee
Dong-Hoon Chang
Hye-Won Kang
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Abstract

Se describe un sistema de suministro para agentes bioactivos sobre la base de un portador de farmaco polimerico formado a partir de las composiciones que comprenden un copolimero de bloque anfifilico de un bloque hidrofilico y un bloque hidrofobico que tiene un grupo terminal hidroxilo substituido con un grupo de tocoferol o colesterol, y un derivado de acido polilactico en donde un extremo del acido polilactico se enlaza covalentemente a al menos un grupo carboxilo. El grupo carboxilo del derivado del acido polilactico se puede fijar con un ion de metal di- o trivalente, el cual se obtiene al agregar el ion de metal di- o trivalente a la composicion polimerica.

Description

objetivo en el tejido. Una concentración elevada de fármaco en el tejido se puede lograr por una formulación que muestre un tiempo de circulación en sangre extendido. Por lo tanto, se ha hecho un gran esfuerzo en desarrollar sistemas de suministro de fármacos por el uso de portadores de nanopartículas que incluyen liposomas y micelos poliméricos que tienen tiempos de circulación largos. Se han sugerido muchas metodologías para mejorar la absorción intracelular de los agentes bioactivos. Los vehículos de suministro tales como liposomas también se han descrito para su uso en el suministro intracelular de agentes bioactivos tales como oligonucléotidos (Felgner, et al., Patente de E.U.A. No. 5,264,618 (1993); Eppstein, et al., Patente de E.U.A. No. 4,897,355 (1990); y Wang, et al., Proc . Nat. Acad. Sci . 84: 7851-7855 (1987); Patente de E.U.A. No. 5,759,519 (1998)) . El uso de liposomas como portadores de fármacos sin embargo se limita debido a problemas tales como una eficiencia baja de entrampamiento, inestabilidad del fármaco, fuga rápida del fármaco y una pobre estabilidad de almacenamiento. Los micelos tensoactivos moleculares pequeños se disocian fácilmente cuando se diluyen con fluidos corporales después de administrarse en el cuerpo, así es difícil que lleven a cabo su papel como portadores de fármaco. En años recientes, se han hecho esfuerzos para la preparación, caracterización y aplicación farmacéutica de micelos poliméricos. Estos fueron bien revisados por V. Torchilin en Journal of Controlled Reléase 73(2001) pp.137-172. Los micelos poliméricos se caracterizan por una estructura de envolvente y núcleo en medios acuosos lo cual resulta de copolímeros de bloque anfifílicos que tienen segmentos de núcleo hidrofóbico y de envolvente hidrofílica. Un fármaco soluble en agua pobremente se atrapa dentro del núcleo hidrofóbico del micelo. Ha existido una investigación considerable en el desarrollo de los copolímeros de bloque A-B, A-B-A-, ó B-A-B que tienen un bloque A hidrofílico y un bloque B hidrofóbico. Para su uso como un portador de fármaco, se prefiere que el hidrofóbico B (bloque de núcleo de micelo interior) comprenda un polímero biodegradable tal como el poli-DL láctido, poli-e-caprolactona ó poli (?-bencil-L-aspartato) y que el hidrofílico A (bloque de envolvente de micelo exterior) sea un polímero que pueda interactuar con las proteínas del plasma y las membranas celulares tales como polietilenglicol (PEG) . Los micelos poliméricos proporcionan características atractivas en que pueden evitar la absorción del fármaco por el sistema retículoendotelial (RES) o el sistema de fagocitos mononucleares (MPS) in vivo y así pueden circular la sangre por un periodo prolongado de tiempo. Esta ventaja resulta de la estructura de un micelo. Las porciones hidrofílicas de un copolímero de bloque anfifílico forman la envolvente exterior y se exponen al fluido corporal y así protegen efectivamente a los micelos de las interacciones con las membranas de células y las proteínas de plasma en la sangre [V. Torchilin et al., Advanced Drug Delivery Reviews 16(1995) pp.141-155]. R. Savic et al. Mostraron una evidencia experimental de que los micelos formados a partir de copolímeros de bloque de poli (caprolactona) -b-poli (óxido etileno) pueden suministrar un agente bioactivo dentro de células vivas al usar micelos con tetrametilhodamina-5-carbonilo azida (TMRCA) unidos de forma covalente al extremo PCL del polímero [R. Savic et al., Science 300(2003) pp.615-618]. Sin embargo, se detectaron los micelos fluorescentes solamente en el compartimiento citoplásmico pero no en el compartimiento nuclear y así los agentes bioactivos tales como los fármacos anti-cáncer que se enlazan al ADN no son adecuados para su uso con los micelos. En vista de lo anterior, se desea en desarrollo de un micelo o nanopartícula polimérica que pueda suministrar agentes bioactivos dentro de las células objetivo. Así, la presente invención proporciona un método para dirigir el suministro intracelular de agentes bioactivos usando un micelo polimérico o un portador de fármaco de nanopartícula. Breve Descripción de la Invención Es un objetivo de la presente invención proporcionar un método para el suministro intracelular de agentes bioactivos al usar portadores de fármacos poliméricos formados a partir de composiciones que comprenden (a) un copolímero de bloque anfifílico que comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en donde el bloque hidrofóbico tiene un grupo terminal hidroxilo que se sustituye con un grupo tocoferol o colesterol y (b) un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo terminal al final del polímero. Opcionalmente, 0.01 a 10 equivalentes de un ión de metal di o trivalente se enlaza a un equivalente del grupo terminal carboxilo del derivado del ácido poliláctico. Es otro objetivo de la presente invención un sistema de suministro para el suministro intracelular de agentes bioactivos que comprenda agentes bioactivos y un portador de fármaco polimérico con los agentes bioactivos atrapados dentro de la solución acuosa, en donde el portador del fármaco polimérico se prepara por una composición polimérica que comprende (a) un compolímero de bloque anfifílico que consiste de un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en el cual el bloque hidrofóbico tiene un grupo hidroxilo terminal que se sustituye con un grupo de tocoferol o colesterol y (b) un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo al final del polímero y en donde los agentes bioactivos atrapados en el portador del fármaco polimérico se permite que se suministren dentro de la célula en una cantidad mayor cuando el portador del fármaco hace contacto con la célula. Es otro objetivo de la presente invención una composición para el suministro intracelular de agentes bioactivos que comprenden agentes bioactivos y un portador fármaco polimérico con los agentes bioactivos atrapados en la solución acuosa, en donde el portador del fármaco polimérico se prepara por una composición polimérica que comprende (a) un copolímero de bloque anfifílico que consiste de un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en el cual el bloque hidrofóbico tiene un grupo hidroxiloterminal que se sustituye con un grupo de tocoferol o de colesterol y (b) un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo al final del polímero y en donde los agentes bioactivos atrapados en el portador del fármaco polimérico se permite que se suministren en una célula en una cantidad mayor cuando el portador de fármaco hace contacto con la célula. La presente invención se refiere a portadores de fármaco polimérico los cuales pueden suministrar un agente bioactivo dentro de una célula objetivo. Breve Descripción de las Figuras La Fig. 1 es un diagrama esquemático de la internalización celular de un agente bioactivo del fluido corporal después de la administración de la composición de la presente invención. La Fig. 2A muestra el número de células en las cuales se internaliza el fármaco después del tratamiento de células sensibles a la doxorubicina (MES-SA) con las composiciones de fármaco . La Fig. 2B muestra el número de células en las cuales se internaliza el fármaco después del tratamiento de células sensibles a la doxorubicina (MES-SA/Dx-5 ) con las composiciones de fármaco. La Fig. 3A muestra la intensidad de fluorescencia detectada por FACS después del tratamiento de células sensibles a la doxorubicina (MES-SA) con las composiciones de fármaco . La Fig. 3B muestra la intensidad de fluorescencia detectada por FACS después del tratamiento de células sensibles a la doxorubicina (MES-SA/Dx-5 ) con las composiciones de fármaco. La Fig. 4A muestra imágenes microscópicas confocales obtenidas 2 horas después del tratamiento de células sensibles a la doxorubicina (MES-SA) con la composición que contiene doxorubicina (composición 1, lado derecho) y una formulación en solución convencional (lado izquierdo) . La Fig. 4B muestra imágenes microscópicas confocales obtenidas 8 horas después del tratamiento de células sensibles a la doxorubicina (MES-SA) con la composición que contiene doxorubicina (composición 1) y una formulación en solución convencional . La Fig. 4C muestra imágenes microscópicas confocales obtenidas 2 horas después del tratamiento de células sensibles a la doxorubicina (MES-SA/Dx-5 ) con la composición que contiene doxorubicina (composición 1) y una formulación en solución convencional . La Fig. 4D muestra imágenes microscópicas confocales obtenidas 8 horas después del tratamiento de células sensibles a la doxorubicina (MES-SA/Dx-5 ) con la composición que contiene doxorubicina (composición 1) y una formulación en solución convencional . La Fig. 4E muestra imágenes microscópicas confocales obtenidas 2 horas después del tratamiento de células sensibles a la epirubicina (MCF-7) con la composición que contiene epirubicina (composición 6) y una formulación en solución convencional . La Fig. 4F muestra imágenes microscópicas confocales obtenidas 8 horas después del tratamiento de células sensibles a la epirubicina (MCF-7) con la composición que contiene epirubicina (composición 6) y una. formulación en solución convencional . La Fig. 4G muestra imágenes microscópicas confocales obtenidas 2 horas después del tratamiento de células resistentes a la epirubicina (MCF-7/ADR) con la composición que contiene epirubicina (composición 6) y una formulación en solución convencional . La Fig. 4H muestra imágenes microscópicas confocales obtenidas 8 horas después del . tratamiento de células resistentes a la epirubicina (MCF-7/ADR) con la composición que contiene epirubicina (composición 6) y una formulación en solución convencional . La Fig. 5A muestra la viabilidad celular después del tratamiento con células sensibles a la doxorubicina (MES-SA) con las composiciones de fármacos (0.1 ug/ml) . La Fig. 5B muestra la viabilidad celular después del tratamiento con células resistentes a la doxorubicina (MES-SA/Dx-5) con las composiciones de fármacos (1.0 ug/ml) La Fig. 6 muestra la concentración del fármaco en plasma en la sangre con tiempo después de la administración intravenosa de las composiciones del fármaco en ratas. Descripción Detallada de la Invención Antes de que se describa y detalle la presente invención, se debe entender que esta invención no se limita a las configuraciones en particular, etapas de proceso y materiales aquí descritos y tales configuraciones etapas de proceso y materiales pueden variar. También se debe entender que la terminología empleada en la presente se usa para el propósito de describir solamente modalidades en particular y no se pretende que limite el alcance de la presente invención el cual se limitará solamente por las reivindicaciones anexas y equivalentes de las mismas. Se debe observar que como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno" y "los" incluyen referentes en plural al menos que el contexto claramente lo indique dé otra manera. Así por ejemplo, la referencia a un polímero que contiene "un grupo terminal" incluyen la referencia a dos o más de tales grupos. Al describir y reivindicar la presente invención, se usará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones establecidas a continuación. Como se usa en la presente, el término "agente bioactivo" significa un compuesto orgánico o fármaco el cual tiene una actividad biológica deseable o función esto es, un efecto biológico o efecto farmacológico in vivo. Por ejemplo, el agente bioactivo que consiste de agentes terapéuticos puede alterar las funciones celulares tales como la función de genes. Alternativamente, los agentes bioactivos que consisten de agentes de diagnóstico tales como agentes para formación de imágenes por resonancia magnética ("MRI") o tomografía computarizada ("CT") tienen la función biológica de potenciar las imágenes en diagnóstico de tejidos y/u órganos. Como se usa en la presente, el término "biodegradable" o "biodegradación" se define como la conversión de materiales en intermediarios menos complejos o productos finales por hidrólisis en solubilización o por la acción de entidades formadas biológicamente las cuales pueden ser enzimas u otros productos del organismo . Como se usa en la presente, el término "biocompatible" significa materiales o los intermediarios o productos finales de los materiales formados por hidrólisis en solubilización o por la acción de entidades formadas biológicamente las cuales pueden ser enzimas u otros productos del organismo y que no provocan efectos adversos sobre los organismos . "Poli (láctido) " o "PLA" significa un polímero derivado de la condensación del ácido láctico o por la polimerización de abertura de anillo de láctido. Los términos "láctido" y "lactato" se usan de forma intercambiable. Se hará referencia ahora a las modalidades ejemplares y se usara en la presente un lenguaje específico para describir las mismas . Sin embargo se entenderá que no se pretende con ello ninguna limitación del alcance de la invención. Las alteraciones y modificaciones adicionales de los aspectos inventivos aquí ilustrados y las aplicaciones adicionales de los principios de la invención como se ilustran en la presente los cuales se presentarían para alguien experto en el arte relevante y que tiene posesión de esta descripción se considerarán dentro del alcance de la invención. La presente invención proporciona un método para el suministro intracelular de agentes bioactivos al usar portadores de fármacos poliméricos formados a partir de composiciones poliméricas que comprenden un copolímero de bloque anfifílico que comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en donde el bloque hidrofóbico tiene un grupo hidróxido terminal que se substituye con un grupo tocoferol o colesterol y un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo terminal al final del polímero . La presente invención también proporciona un método para el suministro intracelular de agentes bioactivos al usar portadores de fármacos formados a partir de composiciones poliméricas que comprenden un copolímero de bloque anfifílico el cual comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en donde el bloque hidrofóbico tiene un grupo hidroxilo terminal que se substituye de un grupo de ácidos succínico de colesterol o ácido succínico de tocoferol, un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo terminal al final del polímero y 0.01 a 10 equivalentes de un ión de metal di o trivalente con respecto a un equivalente del grupo terminal carboxilo del derivado del ácido poliláctico. La presente invención además proporciona un sistema de suministro para el suministro intramolecular de agentes bioactivos que comprende agentes bioactivos y un portador de fármaco polimérico con los agente bioactivos atrapados en la presente en la solución acuosa, en donde el portador de fármaco polimérico se preparó por una composición polimérica que comprende (a) un copolímero de bloqueo anfifílico que consiste de un bloqueo hidrofóbico y un bloqueo hidrofóbico en el cual el bloque hidrofóbico tiene un grupo terminal hidroxilo que es substituido con un grupo de tocoferol o colesterol y (b) un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo en el termino del polímero; y en donde los agentes bioactivos atrapados en el portador de fármaco polimérico se permite que se suministren en una célula en una mayor cantidad cuando el portador de fármaco hace contacto con la célula. En una modalidad de la presente invención, los agentes bioactivos se permite que se suministren en una célula en una mayor cantidad, y preferiblemente, en una forma más eficiente que aquellos en ausencia del portador de fármaco polimérico. La presente invención proporciona además portadores de fármacos poliméricos los cuales pueden suministrar un agente bioactivo en la célula objetivo. Específicamente la presente invención proporciona un método para el suministro intracelular de agentes bioactivos que comprende las etapas de: a) seleccionar al menos un agente bioactivo; b) preparar una composición polimérica que comprende un copolímero de bloque anfifílico que comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en donde el bloque hidrofóbico tiene un grupo terminal hidroxilo que se substituye con un grupo tocoferol o colesterol, un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo al final del polímero; c) mezclar y disolver la composición polimérica y los agentes bioactivos en un solvente y evaporar el solvente; d) agregar una solución acuosa para formar un portador de fármaco polimérico con agentes bioactivos atrapados en ellos en la solución; y e) hacer contacto del portador de fármaco con una célula para facilitar el suministro de agentes bioactivos dentro de la célula. Selección de al menos un agente bioactivo Los agentes bioactivos de la presente invención pueden ser cualquier compuesto orgánico o cualquier fármaco el cual puede emplearse como actividad biológica. Esta incluye, pero no se limita a, proteínas, hormonas tales como testosterona, estradiol, estrógeno, progesterona, triamcinolona acetato, dexametasona, etc., genes, polipéptidos , oligonucleótidos , nucleótidos, anticuerpos, fármacos tales como agentes anticáncer, agente anti-inflamatorios , agentes antifungales , antibióticos, anestésicos, agentes antihipertensivos , y agentes para el tratamiento de diabetes, agentes antihiperlipidémicos , agentes antivirales, agentes para el tratamiento de enfermedad del Parkinson, agentes antidemencia, antieméticos, immunosupresores , agentes antiulcerantes , laxantes, agentes antimaláricos, y agentes de imagen de diagnóstico. Los ejemplos de fármacos anticáncer incluyen paclitaxel, epirubicina, dactinomicina, bleomicina, raitomicina, docetaxel, 5-fluorouracilo, metotrexato, camptotecina, etopósido, doxorubicina, dausorubicina, idarubicina, ara-C, ciclosporina A, etc., y derivados de los mismos . El agente bioactivo de arriba puede agregarse a la composición polimérica en una relación peso por peso de 0.1-20:80.0-99.9 que apropiadamente está contenida en el núcleo de micelos formados de copol meros de bloque , anfifílicos y el derivado de ácido poliláctico. Preparación de una composición polimérica El copolímero de bloque anfifílico de la presente invención es preferiblemente un copolímero de dibloqueo de tipo A-B o copolímero de tribloqueo de tipo B-A-B que comprende un bloqueo A hidrofílico y un bloque B hidrofobico. El copolímero de bloqueo anfifílico, cuando se coloca en una fase acuosa, forma micelos poliméricos de tipo núcleo envolvente en donde el bloque B hidrofobico forma el núcleo y el bloque A hidrofílico forma el envolvente. Preferiblemente, el bloque A hidrofílico es un miembro seleccionado del grupo que consiste de polialquilen glicol, alcohol de polivinilo, polivinil pirrolidona, poliacril amida y derivados de los mismos. Más preferiblemente, el bloque A hidrofobico es un miembro seleccionado del grupo que consiste de monometoxietilen glicol, monoacetoxipolietilen glicol, polietilen glicol, polietilen-co-propilen glicol y polivinil pirrolidona. Preferiblemente, el bloque A hidrof lico tiene un número promedio del peso molecular de 500 hasta 50,000 Daltones. Más preferiblemente, el bloque A hidrofílico tiene un número promedio de peso molecular de 1,000 hasta 20,000 Daltones . El bloque B hidrofóbico del copolímero de bloque anfifílico de la presente invención es un polímero altamente biocompatible y biodegradable seleccionado del grupo que consiste de poliésteres, polianhidridos , ácidos poliamino, poliortoésteres y polifosfazina . Más preferiblemente, el bloque B hidrofóbico es uno o más seleccionado del grupo que consiste de poliláctidos , poliglicólidos , policaprolactona, polidioxan-2-ona, polilactic-co-glicólido, polilactic-co-dioxan-2-ona, polilactic-co-caprolactona y poliglicolic-co-caprolactona . El grupo terminal del bloque hidrofóbico tiene un grupo hidroxilo y el grupo terminal hidroxilo del bloque B hidrofóbico es substituido con un grupo hidrofóbico de tocoferol o colesterol, ambos tienen hidrofobicidad excelente, con el propósito de incrementar la hidrofobicidad del bloque B hidrofóbico mientras se mantiene este peso molecular. El grupo tocoferol o colesterol se enlaza químicamente al grupo de terminal hidroxilo del bloque B hidrofóbico usando un agente ligador, por ejemplo, un ácido dicarboxílico tal como ácido succínico, ácido malonico, ácido glutárico, ácido adípico . El tocoferol y colesterol son biocompatibles y los compuestos hidrofóbicos tienen una estructura de anillo, la cual puede hacer crecer la hidrofobicidad interior de los micelos polimericos por ello aumentar la estabilidad física de los micelos poliméricos. Preferiblemente, el bloque B hidrofóbico del copolímero de bloque anfifílico tiene un número promedio de peso molecular de 5 00 hasta 50 , 000 Daltones. Más preferiblemente, el bloque B hidrofóbico del copolímero de bloque anfifílico tiene un número promedio de peso molécula de 1 , 000 hasta 2 0 , 00 0 Daltones. La relación del bloque A hidrofílico al bloque B hidrofóbico del copolímero de bloqueo anfifílico de la presente invención está preferiblemente dentro del rango de 3 : 7 hasta 8 : 2 en peso, y más preferiblemente dentro del rango de : 6 hasta 7 : 3 . Si el contenido del bloque A hidrofílico es muy bajo, el polímero puede no formar micelos poliméricos en una solución acuosa, y si el contenido es muy alto, las formas de micelos poliméricos no son estables. En una modalidad, el copolímero de bloque anfifílico de la presente invención puede ser representado por la siguiente fórmula : Ri'-0-[R3' ]i'-[R ' ]m'-[R5' ]n'-C(=0)- (CH2)x'-C(=0) -0-R2' (I' ) En donde Ri' es CH3-, H- [R5 ' ] n' - [R4 ' ] m' - , ó R2'-0-C(=0)- (CH2 ) x.-C(=0)-[R5' ] n ' - [ í ] m ' - ; R2' es tocoferol o colesterol; R3' es -CH2CH2-O-, -CH(OH) -CH2-, -CH(C (=0) - H2) -CH2-, O R4' es -C (=0) -CHZ' -0-, en donde Z' es un átomo de hidrógeno o grupo metilo; R5' es -C (=0) -CHY' ' -0- , en donde Y'' es un átomo de hidrógeno o grupo metilo, -C (=0) -CH2CH2CH2CH2CH2-0, o -C(=0)-CH2OCH2CH2-0- ; 1' es un entero desde 4-1150; m' es un entero desde 1-300; n' es un entero desde 0-300; y x' es un entero desde 0-4. El copolímero de bloqueo tiene el bloque hidrofobico cuyo grupo terminal hidroxilo es substituido con tocoferol o colesterol pueden prepararse de conformidad a los siguientes métodos. En una modalidad, un ligador adecuado, por ejemplo, un ácido dicarboxílico tal como ácido succínico, ácido malonico, ácido glutárico o ácido adípico, se introduce en el grupo hidroxilo de tocoferol o colesterol y el tocoferol carboxilado o colesterol se enlaza químicamente al grupo de terminal hidroxilo del bloque B hidrofobico. En una modalidad, de conformidad al método de la patente de E.U.A. No. 6,322,805, el copolímero de bloque anfifílico (mPEG-PLA) que comprende monometoxipolietilen glicol (mPEG; Mn = 2,000) y poliláctido (PLA; Mn = 1,750) se pesó, y se deshidrató usando una bomba a 120°C, y luego se disolvió en acetonitrilo o cloruro de metileno. A esto se agregó tocoferol succinato o colesterol succinato, y diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP) se pesaron y se agregaron al mismo como un iniciador y un catalizador, respectivamente y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente. El reactivo se volvió opaco para formar diciclohexilurea (DCU) en la reacción entre la terminal -OH de mPEG-PLA y -COOH del compuesto hidrofóbico. Después de 24 horas, el DCU se removió por usar un filtro de vidrio, y DMAP se extrajo y se removió con una solución de ácido clorhídrico acuoso. A esta solución de producto purificado se agregó MgS04 para remover cualquier humedad en el residuo, y luego, los precipitados se formaron en un solvente hexano/dietil éter con objeto de obtener el copolímero de bloque anfifílico en el cual el tocoferol de succinilo o colesterol de succinilo se enlazaron, mPEG-PLA-tocoferol o mPEG-PLA-colesterol (en el cual tocoferol o colesterol se enlazaron a PLA por medio de diéster de ácido succínico) . El producto polimérico precipitado se filtró, y luego se secó bajo vacío para obtener el polímero como partículas blancas. En otra modalidad, un compuesto hidrofóbico carboxilado se activo con cloruro de oxalilo sin cualquier catalizador y se enlazó al término de mPEG-PLA. Esto es, tocoferol (o colesterol) succinato se hizo reaccionar con cloruro de oxalilo y luego el exceso de cloruro de oxalilo se removió bajo vacío a temperatura ambiente. El mPEG-PLA se pesó y se agregó al mismo, y la reacción se llevó a cabo a 100°C durante 12 horas para obtener mPEG-PLA-tocoferol (o colesterol) . El polímero sintetizado se disolvió en cloruro de acetonitrilo o metileno, se precipitó en hexano/dietil éter, y se filtró. En los dos procesos de preparación de arriba, tocoferol (o colesterol) malonato, tocoferol (o colesterol) glutarato, o tocoferol (o colesterol) adipato, etc., pueden usarse en lugar de tocoferol (o colesterol) succinato. En otra modalidad, tocoferol o colesterol se enlazó al término de mPEG-PLA usando un compuesto de dicloruro como un agente ligador. Específicamente, tocoferol o colesterol se pesaron y se deshidrataron usando una bomba al vacío a 50°C. Se agregó a ello el agente de ligadura excesivo, y la reacción se efectuó durante 12 horas. Después de que la reacción se completó, el agente ligador agregado excesivamente se removió bajo vacío a 100°C. A esto se agregó mPEG-PLA pesado, y la reacción se llevó a cabo a 100°C durante 12 horas. El polímero sintetizado se disolvió en cloruro de metileno, y se precipitó en hexano/dietil éter en orden para obtener el copolímero de bloque anfifílico en el cual el tocoferol o colesterol se enlazó a PLA por medio de diéster de ácido succínico, esto es, mPEG-PLA-tocoferol o mPEG-PLA-colesterol . El producto polimérico precipitado se filtró y se secó bajo vacío para obtener el polímero como partículas blancas . El agente ligador el cual puede usarse en la reacción puede seleccionarse de tales compuesto de dicloruro tales como cloruro de succinilo, cloruro de oxalilo, cloruro de malonilo, cloruro de glutarilo, cloruro de adipoilo, etc. Uno o más términos del ácido poliláctico derivado de la presente invención se enlazaron covalentemente a al menos un ácido carboxílico o sal de carboxilato. El otro término del derivado de ácido poliláctico de la presente invención pueden enlazarse covalentemente a un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de grupos hidroxilo, acetoxi, benzoiloxi, decanoiloxi y palmitoiloxi . La función de ácido carboxílico o sales de carboxilato como un grupo hidrofílico en una solución acuosa de pH 4 o mayor la cual habilita el derivado de ácido poliláctico para formar las micelos poliméricas en la presente. Cuando los derivados del ácido poliláctico de la presente invención se disolvieron en una solución acuosa, los componentes hidrofilicos y hidrofóbico presentes en el derivado de ácido poliláctico se deben balancear con objeto de formar micelos poliméricos. Por lo tanto, el número promedio de peso molecular del derivado de ácido poliláctico de la presente invención es preferiblemente dentro del rango de 500 hasta 2,500 daltones. El peso molecular del derivado de ácido poliláctico puede ajustarse por controlar la temperatura de reacción, tiempo y similares, durante los procesos de preparación . El derivado de ácido poliláctico se presenta preferiblemente por la siguiente fórmula: RO-CHZ- [A]n- [B]m-COOM (I) En donde A es -COO-CHZ-; B es -COO-CHY, -C00-CH2CH2CH2CH2CH2- ó -COO-CH2CH2OCH2; R es un átomo de hidrógeno, grupo acetilo, benzoilo, decanoilo, palmitoilo, metilo o etilo; Z e Y son cada uno un átomo de hidrógeno, grupo metilo o fenilo; M es H, Na, K, o Li; n es un entero desde 1 hasta 30, y m es un entero desde 0 hasta 20. Un extremo del derivado de ácido poliláctico de la presente invención se enlazó covalentemente a un grupo carboxilo o una sal de metal alcalino del mismo, preferiblemente, una sal de metal alcalino del mismo. El ión de metal en la sal de metal alcalino el cual forma el derivado de ácido poliláctico es monovalente, por ejemplo, sodio, potasio o litio. El derivado de ácido poliláctico en la forma de sal de ión de metal es un sólido a temperatura ambiente, y es muy estable debido a su pH relativamente neutral. Más preferiblemente, el derivado de ácido poliláctico se presenta por la siguiente fórmula: RO-CHZ- [COO-CHX]p- [COO-CHY' ] q-COO-CHZ-COOM (II) En donde X es un grupo metilo; Y' es un átomo de hidrógeno o grupo fenilo; p es un entero desde 0 hasta 25; q es un entero desde 0 hasta 25, con la condición de que p+q es un entero desde 5 hasta 25; R, Z y M son el mismo como se define en la fórmula (I) . Además, los derivados de ácido poliláctico de las siguientes fórmulas (III) , (IV) y (V) también son adecuados para RO-PAD-COO-W- (III) En donde W-M' es el PAD es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido D, L-poliláctico, ácido D-poliláctico, ácido polimandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido glicólico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido mandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y caprolactona y un copolímero de ácido D,L-láctico y 1 , 4-dioxano-2-ona; R y M son la misma como se define en la fórmula (I) .
En donde S es L es -NRi - o -0-; Ri es un átomo de hidrógeno o alquilo C1-10; Q es CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3 , CH2CH2CH2CH3 , o CH2C6H5; a es un entero desde 0 hasta 4; b es un entero desde 1 hasta 10; R y M son el mismo como se define en la fórmula (I) ; y PAD es la misma como se define en la fórmula (III) .
(V) En donde R' es -PAD-O-C (0) -CH2CH2-C (0) -0M y M es el mismo como se define en la fórmula (I) ; PAD es el mismo como se define en la fórmula (III) ; a es un entero desde 1 hasta 4 (cuando a = 1, este es un 3-arm PLA-COONa; si a = 2, este es un 4-arm PLA-COONa; cuando a = 3, este es un 5-arm PLA-COONa, y si a = 4; este es 6-arm PLA-COONa) . El iniciador de la síntesis de los polímeros (fórmula V) incluye glicerol, erititol, treltol, pentaeritritol , xilitol, adonitol, sorbitol y manitol. La composición polimérica de la presente invención puede contener 0.1 hasta 99.9% en peso del copolímero de bloqueo anfifílico y 0.1 hasta 99.9% en peso del derivado de ácido poliláctico basado en el peso total del copolímero de bloqueo anfifílico y el derivado de ácido poliláctico. Preferiblemente, la composición polimérica de la presente invención contiene 20 hasta 95% en peso del copolímero de bloqueo anfifílico y 5 hasta 80% en peso del derivado de ácido poliláctico. Más preferiblemente, la composición polimérica de la presente invención contiene 50 hasta 90% en peso del copolímero de bloque anfifílico y 10 hasta 50% del derivado de ácido poliláctico. Aunque los derivados de ácido poliláctico de la presente invención solo pueden formar micelos en una solución acuosa con un pH 4 o mayor, las composiciones poliméricas comprenden copolímeros de bloque anfifílicos y los derivados de ácido poliláctico pueden formar micelos en una solución acuosa sin considerar el pH de la solución y las composiciones poliméricas de la presente invención pueden usarse en un pH dentro del rango desde 1 hasta 10, preferiblemente a un pH dentro del rango de 4 hasta 8. El tamaño de partícula de los micelos o nanopartículas preparadas a partir de las composiciones poliméricas de la presente invención pueden ajustarse para estar dentro del rango de 1 hasta 400 nm, y preferiblemente desde 5 hasta 200 nm, dependiendo en el peso molecular de los polímeros y la relación del derivado de ácido poliláctico al copolímero de bloque anfifílico. En una modalidad de la presente invención, el grupo de terminal carboxilo del derivado de ácido poliláctico se enlaza o se fija con un ión de metal di o tri-valente. El ión de metal fijado a la composición polimérica puede prepararse por agregar el ión de metal di o tri-valente a la composición polimérica del copolímero de bloque anfifílico y el derivado de ácido poliláctico. Los micelos poliméricos o nanopartículas pueden formarse por cambiar la cantidad del ión de metal di o tri-valente agregado para enlazar o fijar el grupo de terminal carboxilo del derivado de ácido poliláctico. El ión de metal di o tri-valente es preferiblemente un miembro seleccionado del grupo que consiste de Ca2+, Mg2+, Ba2+, Cr3+, Fe3+, Mn2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+ y Al3+. El ión de metal di o tri-valente puede agregarse a la composición polimérica del copo-limero de bloqueo anfifílico y el derivado de ácido poliláctico en la forma de un sulfato, cloruro, carbonato, fosfato o hidroxilato y preferiblemente en la forma de CaCl2, MgCl2, ZnCl2, AlCl3, FeCl3, CaC03, MgC03, Ca3(P04)2, Mg3(P04)2, AIP04, MgS04, Ca(OH)2, Mg(OH)2, Al(OH)3, o Zn(OH)2. Ya sea los micelos poliméricos o nanopartículas pueden prepararse por cambiar el número de equivalentes del ión de metal agregado. Específicamente, si un ión de metal divalente se agregó a 0.5 equivalentes o menos con respecto a los grupos de terminal carboxilo, el ión de metal que puede formar enlaces con el grupo terminal carboxilo del derivado de ácido poliláctico es insuficiente; y así, los micelos poliméricos se forman. Si un ión de metal divalente se agregó a 0.5 equivalente o más, el ión de metal puede formar enlaces con el grupo de terminal carboxilo del derivado, de ácido poliláctico si es suficiente para fijar firmemente los micelos; y así, formar las nanopartículas . Además, la relación de la liberación del fármaco de los micelos poliméricos o nanopartículas puede ajustarse por cambiar el número de equivalentes del ión de metal agregado.
Si el ión de metal se presenta en 1 equivalente o menos con respecto a aquel del grupo carboxilo del derivado de ácido poliláctico, el número disponible para enlazar al grupo de terminal carboxilo del derivado de ácido poliláctico se disminuyo, y la relación de liberación del fármaco se incremento. Si el ión de metal se presenta en 1 equivalente o más, el número disponible para enlazarse al grupo de terminal carboxilo del derivado, ácido poliláctico se incrementa y la relación de liberación del fármaco disminuye. Por lo tanto, para incrementar el rango de liberación del fármaco en la sangre, el ión de metal se usó en una pequeña cantidad de equivalente y disminuye la liberación del fármaco, el ión de metal se usó en una cantidad de equivalente mayor. Las composiciones poliméricas fijadas en el ión de metal de la presente invención pueden contener 5 hasta 95% en peso del copol mero de bloqueo anfifílico, 5 hasta 95% en peso del derivado de ácido poliláctico y 0.01 hasta 10 equivalentes del ión de metal di o tri-valente con respecto al número de equivalentes de los grupos de terminal carboxilo de los derivados de ácido poliláctico. Preferiblemente, estos contienen 20 hasta 80% en peso del copolimero de bloque anfifílico, 20 hasta 80% en peso del derivado de ácido poliláctico y 0.1 hasta 5 equivalentes del ión de metal di o tri-valente y más preferiblemente, 20 hasta 60% en peso del copolimero de bloqueo anfifílico, 40 hasta 80% en peso del derivado de ácido poliláctico y 0.2 hasta 2 equivalente del ión de metal di o tri-valente. Mezcla y disolución de la composición polimérica y los agentes bioactivos en un solvente y evaporación del solvente; y formulación de una solución de un portador de fármaco con un agente bioactivo atrapado en la presente portador del fármaco de la presente invención puede ser un micelo polimérico o una nanopartícula formada de las composiciones poliméricas que comprenden un copolímero de bloque anfifílico el cual comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en donde el bloqueo hidrofóbico tiene un grupo de terminal hidroxilo que se substituye con un grupo tocoferol o colesterol y un derivado de ácido poliláctico que tienen al menos un grupo de terminal carboxilo en el término del polímero. Las nanopartículas o micelos de la presente invención pueden formarse a partir de composiciones poliméricas de un copolímero de bloque anfifílico que comprende de un bloque hidrofílico y un bloqueo hidrofóbico, en donde el bloque hidrofóbico tiene un grupo de terminal hidroxilo el cual es substituido con un grupo tocoferol o colesterol, un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo de terminal carboxilo en el termino en el cual se enlaza o se fija con un ión de metal di o tri-valente. Los agentes bioactivos pueden atraparse en los micelos o nanopartículas o estos pueden incorporarse dentro de los micelos o nanopartículas de la presente invención para la formación un complejo iónico estable con el grupo carboxilo del derivado de ácido poliláctico biodegradable de conformidad a los agente bioactivos . El copolímero de bloqueo anfifílico, el derivado de ácido poliláctico, y el fármaco pobremente soluble en agua en ciertas relaciones puede disolverse en uno o más solventes orgánicos mezclados seleccionados del grupo que consiste de acetona, etanol, metanol, acetato de etilo, acetonitrilo, cloruro de metileno, cloroformo, ácido acético y dioxano. El solvente orgánico puede removerse del mismo para preparar una mezcla homogénea del fármaco pobremente soluble en agua y el polímero. La mezcla homogénea del fármaco pobremente soluble en agua y la composición polimérica de la presente invención pueden agregarse a una solución acuosa con un pH de 4 hasta 8, a 0 hasta 80°C, resultando en una solución acuosa de micelo polimérico mezclado que contiene el fármaco pobremente soluble en agua. La solución acuosa de micelo polimérica que contiene fármaco puede luego liofilizarse para preparar la composición de micelo polimérica en la forma de un sólido. Una solución acuosa que contiene 0.001 hasta 2 M de ión de metal di o tri-valente se agregó a la solución acuosa de micelo polimérica mezclada pobremente soluble en agua. La mezcla se agitó lentamente a temperatura ambiente durante 0.1 hasta 1 hora y luego se liofilizo para preparar la composición de micelo polimérica fijada en ión de metal o nanoparticula en la forma de un sólido. Contacto del Portador de Fármaco con una Célula Para la administración oral o parenteral de un agente bioactivo, el agente bioactivo se atrapa en el portador del fármaco y con ellos se solubiliza. Particularmente, los micelos poliméricos fijados en un ión de metal con nanopartículas se retienen en el torrente sanguíneo por un periodo prolongado de tiempo y se acumulan en las lesiones objetivo. El agente bioactivo se libera del núcleo hidrofóbico de los micelos para ejercer un efecto farmacológico mientras que los micelos se degradan. Para el suministro parenteral la composición polimérica se puede administrar por vía intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , transnasal, intrarectal, intraocular, o intrapulmonar. Para el suministro oral, el agente bioactivo se mezcla con el portador del fármaco de la presente invención y luego se administra en forma de una tableta cápsula o solución acuosa. La composición polimérica de la invención se puede administrar con diversos intervalos de acuerdo con los requerimientos del fármaco en particular. Como es bien conocido en las artes médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores incluyendo el peso del paciente área superficial del cuerpo, edad, el compuesto en particular administrarse, sexo, tiempo y vía de administración salud en general y otros fármacos que se administren en paralelo . Internalización Celular de un Agente bioactivo. La internalización celular de un agente bioactivo se puede estudiar con citometría de flujo y microscopía confocal usando composiciones que contienen fármacos. Como un ejemplo, de la presente invención, las líneas de células de cáncer uterino humano (MES-SA; MES-SA/Dx-5) y las líneas de células de cáncer de mama humano (MCF-7; MCF-7/ADR) se trataron con las composiciones de fármaco de la presente invención. Las líneas celulares MES-SA Y MCF-7 son sensibles a la doxorubicina y las líneas celulares MES-SA/Dx-5; MCF-7 /ADR son resistentes a la doxorubicina. Como se muestra en las Figuras 2A a la 3B y las Tablas 2A a la 3B, el fármaco entra más efectivamente en las células desde la composición de fármaco de la presente invención (Composición 1) que de la formulación convencional en solución (Libre de Dox) . Más notablemente, el número de células las cuales absorben al fármaco fue cinco veces mayor que la composición de fármaco de la presente invención que de la formulación en solución convencional . Particularmente es notable la absorción de la doxorubicina en las células en la línea celular resistente a fármacos. Así, hay una buena posibilidad de que la composición de la presente invención se pueda usar para vencer la resistencia a muíti-fármacos en quimioterapia . Las imágenes confocales en las Figuras 4a a la 4H visualizan los resultados de la citometria de flujo: cantidades mucho mayores del fármaco se absorbieron por las células cuando la composición del fármaco de la presente invención se trató. En las Figuras 4a a la 4H, las imágenes del lado izquierdo son las imágenes confocales después del tratamiento con la formulación en solución convencional y las imágenes en el lado derecho son después del tratamiento con las composiciones de la presente invención. Y como se muestra en las figuras 4B, 4D, 4F y 4H, los micelos o nanopart culas se detectaron en los compartimientos nuclear y citoplásmico . Adicionalmente, los resultados del ensayo MTT mostrados en las figuras 5A a la 5B y la Tabla 3, soportan los resultados de la citometria de flujo y los estudios de microscopía confocal . Para el ensayo MTT, una composición que contiene doxorubicina de la presente invención (Composición 1) y una formulación convencional de doxorubicina (Libre de Dox) se probaron en líneas celulares de cáncer uterino MES-SA (línea celular sensible a doxorubicina) y MES-SA/Dx-5 (línea celular resistente a doxorubicina) . La actividad citotóxica sobre las células sensibles a doxorubicina fueron similares en ambas composiciones como se muestra en la Fig. 5A, pero la composición del fármaco de la presente invención mostró una actividad 6.7 veces superior a los tres días después del tratamiento que la formulación en solución convencional cuando se tratan las células resistentes a la doxorubicina como se muestra en la Fig. 5B. Esta diferencia en actividad se debe a las características de las líneas celulares resistentes a fármacos en las cuales la P-glicoproteínas (P-gp) se sobre-expresan y extruyen continuamente los fármacos citotóxicos de la célula. Ya que el fármaco libre no se puede concentrar dentro.de las células resistentes a fármacos, este resultado implica que el portador del fármaco de la presente invención entra junto con la célula con el fármaco incorporado en el portador del fármaco . A partir de la estabilidad física del portador de fármaco de la presente invención y los resultados del estudio de internalización celular, se puede concluir que la mayoría de las composiciones que contienen el agente bioactivo de la presente invención, entra al citoplasma de la célula en forma de un micelo o nanopartícula por endocitosis sin el colapso de su estructura. Este proceso de internalización celular se muestra esquemáticamente en la Figl : 1 representa un fármaco; 2 representa el núcleo interior del micelo o nanopartícula; 3 representa la envolvente exterior del .micelo o nanopartícula; 4 representa el fluido extracelular; 5 representa la membrana celular; y 6 representa el citoplasma. Se efectuó un experimento farmacocinética en ratas Sprague-Dawley (200-250 g) al usar composiciones que contienen doxorubicina de la presente invención (Composiciones 1 a la 5) y la formulación convencional de doxorubicina (libre de Dox) . Como se muestra en la Fig. 6 y la Tabla 4, las composiciones de la presente invención mostraron un tiempo de circulación sanguínea prolongado en comparación con la formulación convencional de doxorubicina. La biodisponibilidad calculada del área bajo la curva de tiempo concentración en la sangre (AUC) para la composición 1 de la presente invención fue 63 veces mayor que aquella de la formulación convencional de doxorubicina. Los portadores de fármacos de la presente invención pueden suministrar un tiempo en circulación sistémico prolongado debido a su tamaño pequeño (<100nm) , su envolvente hidrofílica la cual minimiza la absorción por el MPS, y su alto peso molecular el cual evita la excreción renal. Los portadores de fármacos de la presente invención se pueden usar como portadores para los fármacos solubles en agua, péptidos y proteínas así como para fármacos solubles pobremente en agua. Como se ilustra por el estudio de internalización celular, las composiciones que contienen el agente bioactivo de la presente invención forman tales micelos o nanopartículas estables en medios acuosos que entran al citoplasma en forma de micelos o nanopartículas por endocitosis sin colapso de su estructura. Adicionalmente, una mayor acumulación de un agente bioactivo en el tejido del tumor se puede lograr con la composición de la presente invención. Mejor Modo para Llevar a Cabo la Invención Los siguientes ejemplos permitirán a aquellos expertos en la técnica a entender más claramente como practicar la presente invención. Se entenderá que aunque la invención se ha descrito en conjunto con las modalidades específicas preferidas de la misma, lo que sigue se pretende que ilustre y no que limite el alcance de la invención. Otros aspectos de la invención serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a los cuales se refiere la invención. Ejemplo de Preparación 1 Copolímero de bloque anfifílico de PEG y PLA (mPEG-PLA) Una mezcla de 20 g de polietilenglicol de monometoxi (mPEG con un peso molecular de 2,000), 20 g de D,L-láctido que se recristalizó a partir de acetato de etilo, y 0.2 g de octoato estañoso que se disolvió en tolueno 5 mi se agregaron a un reactor equipado con un agitador mecánico y un conjunto de destilación. El tolueno residual se evaporó a 120°C. La reacción se llevó a cabo bajo vacío (25 mmHg) . Después de 6 horas de ocurrir la polimerización, el polímero resultante se disolvió en diclorometano y se vació dentro de éter de dietilo frío (4°C) hasta precipitar el polímero. El polímero precipitado se lavó dos veces con éter de dietilo y se secó bajo vacío (0.1 mmHg) durante 24 horas. El peso molecular del co-polímero de bloque determinado por espectroscopia (RM ) de resonancia magnética nuclear fue 2,000-1,800 (2,000 por bloque PEG y 1,800 por bloque PLA) . Ejemplo de Preparación 2 Co-polímero de bloque anfifílico de PEG y PLGA (mPEG-PLGA) Un co-polímero de dibloque (mPEG-PLGA, LA:GA=70:30 por peso) se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 1, usando 14 g de D,L-láctido y 6 g de glicólido en lugar de 20g de D,L-láctido. El peso molecular del co-polímero de bloque determinado por RMN fue 2,000-1,750 (2,000 para el bloque PEG y 1,750 para el bloque PLGA). Ejemplo de Preparación 3 Co-polímero de bloque anfifílico de PEG y PCL (mPEG-PCL) Un co-polímero de dibloque (mPEG-PCL) se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 1, usando 20 g de D, L-caprolactona en lugar de D,L-láctido. El peso molecular del co-polímero de bloque determinado por RMN fue 2,000-1,800 (2,000 para el bloque PEG y 1,800 para el bloque PCL) . Ejemplo de Preparación 4 Co-polímero de bloque anfifílico de PEO y PLA (pLA-PEO-PLA) Un co-polímero de tri-bloque (pLA-PEO-PLA) se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 1, usando 20 g de polietilenglicol (pEG con un peso molecular de 2,000) en lugar de polietilenglicol de monometoxi (mPEG con un peso molecular de 2,000). El peso molecular del co-polímero de bloque determinado por RMN fue 850-2,000-850 (2,000 por el bloque PEO y 900 para cada bloque PLA) . Ejemplo de Preparación 5 Succinato de tocoferol Una mezcla de 8.6 g de tocoferol, 24 g de anhídrido succínico y 2.9 g de 4- (dimetilamino) piridina (DMAP) se disolvieron en 100 mi de 1,4-dioxano en un reactor equipado con un agitador mecánico. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente. Después de 24 horas de agitación, la mezcla de reacción se introdujo en una solución HC1 hasta precipitar el succinato de tocoferol (10.2 g; rendimiento = 96%) . Ejemplo de Preparación 6 Succinato de colesterilo El succinato de colesterilo se preparó (9.1 g; rendimiento = 94%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 5, usando 7.7 g de colesterol en lugar de tocoferol . Ejemplo de Preparación 7 Co-polímero de bloque anfifílico que tiene un grupo tocoferol en el final del bloque hidrofobico (mPEG-PLA-Toco) Una mezcla de 10.0 g (2.6 mmol) de mPEG-PLA se preparó a partir del Ejemplo de Preparación 1 y 1.7 g (3.2 mmol) de succinato de tocoferol se preparó a partir del Ejemplo de Preparación 5 se disolvieron en 50 mi de acetonitrilo en un reactor equipado con un agitador mecánico. 0.78 g (3.8 mmol) de diciclohexilcarbodiimida (DCC) y 0.046 g (0.38 mmol) de 4-(dimetilamino) piridina (DMAP) se usaron como catalizadores. Después de agitar durante 24 horas a temperatura ambiente, la mezcla se filtró usando un filtro de vidrio para remover diciclohexilcarbourea . Los catalizadores restantes se extrajeron con una solución HCl acuosa, y sulfato de magnesio se agregó en la solución de polímero para remover agua. El producto resultante (mPEG-PLA-Toco) se re-cristalizó a partir de un co-solvente de n-hexano/éter de dietilo (6/4, p/p) . El producto de recristalizado se filtró y se secó bajo vacío para dar un producto en polvo blanco (9.9 g; rendimiento = 87%) . Ejemplo de Preparación 8 Co-polímero de bloque anfifílico que tiene un grupo tocoferol en el final del bloque hidrofobico (mPEG-PLGA-Toco) Un co-polímero de bloque anfifílico (mPEG-PLGA-Toco) se preparó (9.5 g; rendimiento = 83%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 7, usando 9.8 g (2.6 mmol) de mPEG-PLGA preparado a partir del Ejemplo de Preparación 2 en lugar de mPEG-PLA preparado a partir del Ejemplo de Preparación 1.
Ejemplo de Preparación 9 Co-polímero de bloque anfifílico que tiene un grupo tocoferol en el final del bloque hidrofóbico (mPEG-PCL-Toco) Un co-polímero de bloque anfifílico (mPEG-PCL-Toco) se preparó (10.1 g; rendimiento = 89%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 7, usando 10.0 g (2.6 mmol) de mPEG-PCL preparado a partir del Ejemplo de Preparación 3 en lugar de mPEG-PLA preparado a partir del Ejemplo de Preparación 1. Ejemplo de Preparación 10 Co-polímero de bloque anfifílico que tiene un grupo tocoferol en el final del bloque hidrofóbico (Toco-PLA-PEO-PLA-Toco) Un co-polímero de bloque anfifílico (Toco-PLA-PEO-PLA-Toco) se preparó (9.2 g; rendimiento = 84%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 7, usando 9.6 g (2.6 mmol) de PLA-PEO-PLA preparado a partir del Ejemplo de Preparación 4 en lugar de mPEG-PLA preparado a partir del Ejemplo de Preparación 1. Ejemplo de Preparación 11 Co-polímero de bloque anfifílico que tiene un grupo colesterol en el final del bloque hidrofóbico (mPEG-PLA-Chol) Un co-polímero de bloque anfifílico (mPEG-PLA-Chol ) se preparó (9.7 g; rendimiento = 86%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 7, usando 1.6 g (3.2 mmol) de succinato de colesterilo) preparado a partir del Ejemplo de Preparación 6 en lugar de succinato de tocoferol preparado a partir del Ejemplo de Preparación 5. Ejemplo de Preparación 12 Poliéster Biodegradable (PLMA-COONa) (1) Preparación de PLMA-COOH Una mezcla de 7.5 g de ácido D,L-láctico (0.083 mol) y 2.5 g de ácido D, L-mandélico (0.016 mol) se agregaron a un reactor equipado con un agitador mecánico y un conjunto de destilación. La humedad se evaporó a 80°C durante 1 hora bajo presión reducida (25 mmHg) con un aspirador. La reacción se llevó a cabo a una temperatura elevada de 180°C durante 5 horas bajo vacío (10 mmHg) . El producto resultante se agregó para destilar agua, el polímero precipitado se lavó además con agua destilada. El producto de polímero se agregó entonces a 0.1 litro de agua destilada, y el pH de la solución acuosa se ajustó entre 6 y 8 por la adición de carbonato ácido de sodio en porciones además disolviendo el polímero. El polímero insoluble en agua se separó y removió por centrifugación o filtración. Una solución de ácido clorhídrico 1 N se agregó gota a gota a ello y el polímero se precipitó en la solución acuosa. El polímero precipitado se lavó dos veces con agua destilada, se aisló y se secó bajo presión reducida para obtener un polímero que tiene un grupo final carboxilo (6.7 g de PLMA-COOH, rendimiento = 67%) . El número promedio de peso molecular del polímero determinado por RMN fue 1,100. (2) Preparación de PLMA-COONa Una solución de 5g de polímero PLMA-COOH se disolvió en acetona en un reactor equipado con un agitador mecánico y un conjunto de destilación. La solución se agitó lentamente a temperatura ambiente, y solución de carbonato ácido de sodio (1 N) se agregó lentamente a ello para alcanzar un pH de 7. El sulfato de magnesio anhidro se agregó a ello para remover cualquier residuo de humedad. La mezcla se filtró, la acetona restante se evaporó con un evaporador rotatorio, y un producto sólido blanco se obtuvo de esto. El producto sólido se disolvió nuevamente en acetona anhidro, la solución se filtró para remover partículas insolubles, la acetona se evaporó completamente para dar el producto final, PLMA-COONa, como un sólido blanco (rendimiento: 95%) . Ejemplo de Preparación 13 Poliéster Biodegradable (3arm-PLA-COOK) (1) Preparación de 3arm-PLA-OH 1. Og (0.011 mol) de glicerol se agregó a un reactor equipado con un agitador mecánico y un conjunto de destilación. La humedad se evaporó a 80°C durante 30 minutos. 0.036 g (0.089 mmol) de octoato estañoso en tolueno se agregó a ello, el tolueno residual se evaporó a 120°C, y 36 g (0.25 mol) de D,L-Láctido que se re-cristalizó a partir de acetato de etilo se introdujo en el reactor. La reacción se llevó a cabo a 130°C bajo vacío (20 mmHg) . Después de 6 horas de polimerización, el polímero resultante se disolvió en acetona y una solución NaHC03 acuosa (0.2 N) se agregó gota a gota a ello hasta precipitar el polímero. El polímero precipitado se lavó tres veces con agua destilada y se secó bajo presión reducida para dar una forma de polvo blanco del polímero (3arm-PLA-OH) . El peso molecular del polímero determinado por espectroscopia RMN fue 3,050. (2) Preparación de 3arm-PLA-COOH 10 g (3.28 mmol) de polímero 3arm-PLA-OH preparado arriba se agregó a un reactor equipado con un agitador mecánico y un conjunto de destilación. La humedad se evaporó a 120°C durante 1 hora. 1.96 g (19.6 mmol) de anhídrido succínico se agregó a esto, y la reacción se llevó a cabo a 125°C durante 6 horas. El polímero resultante se disolvió en acetona y agua destilada se agregó gota a gota a ello para precipitar el polímero. El polímero precipitado se disolvió en una solución NaHC03 acuosa (0.2 N) a 60°C, y solución HCl acuosa (1N) se agregó gota a gota a ello hasta precipitar el polímero. El polímero precipitado se lavó tres veces con agua destilada y se secó bajo vacío para dar una forma de polvo blanco del polímero (3arm-PLA-COOH) . El peso molecular del polímero determinado por espectroscopia RMN fue 3,200. (3) Preparación de 3arm-PLA-COOK Finalmente, un poliéster biodegradable (3 arm-PLA-COOK) se preparó (rendimiento = 90%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 12, usando 5 g del polímero 3arm-PLA-COOH preparado arriba y una solución de carbonato ácido de potasio (1N) en lugar del polímero PLMA-COOH y solución de carbonato ácido de sodio (1 N) . Ejemplo de Preparación 14 Poliéster Biodegradable (4arm-PLA-COONa) (1) Preparación de 4arm-PLA-0H Un polímero 4arm-PLA-OH se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 13, usando 1.5 g (0.011 mol) de pentaeritritol en lugar de glicerol. El peso molecular del polímero (4 arm-PLA-OH) determinado por espectroscopia RM fue 3,100. (2) Preparación de 4arm-PLA-COOH Un polímero 4arm-PLA-COOH se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 13, usando lOg (3.23 mmol) del polímero 4arm-PLA-OH preparado arriba y 2.58 g (25.8 mmol) de anhídrido succínico en lugar de lOg (3.28 mmol) del polímero 3arm-PLA-OH y 1.96 g (19.6 mmol) de anhídrido succínico. El peso molecular del polímero (4arm-PLA-COOH) determinado por espectroscopia RMN fue 3,300. (3) Preparación de 4arm-PLA-COONa Finalmente, un poliéster biodegradable (4arm-PLA-COONa) se preparó (rendimiento = 92%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 12, usando 5 g del polímero 4arm-PLA-C00H preparado arriba en lugar del polímero PLMA-COOH. Ejemplo de Preparación 15 Poliéster Biodegradable (PLA-COONa) (1) Preparación de PLA-COOH Un PLA-COOH se preparó (rendimiento = 78%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 12, usando 109 de ácido D,L-Láctico (0.11 mmol) . El número promedio de peso molecular del polímero determinado por RMN fue 1,100. (2) Preparación de PLA-COONa Un poliéster biodegradable (PLA-COONa) se preparó (rendimiento = 92%) por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo de Preparación 12, usando 5 g del polímero PLA-COOH preparado arriba en lugar del polímero PLMA-COOH. Ejemplo 1 Composición qpie contiene fármaco (Composición 1: Doxorubicina / mPEG-PLA-Toco / PLMA-COONa) 10 mg de clorohidrato de doxorubicina se disolvió en 5ml de etanol-agua (9:1 p/p) en un matraz de fondo redondo. 810 mg del co-polímero de bloque anfifílico preparado a partir del Ejemplo de Preparación 7 (mPEG-PLA-Toco) y 180mg del poliéster biodegradable preparado a partir del Ejemplo de Preparación 12 (PLMA-COONa) se agregan a ello y se disuelven completamente dando una solución clara. El solvente se evaporó a una temperatura elevada (60°C) bajo vacío con un evaporador 2 Los resultados se resumen en la Tabla 1. Ejemplo 2 Composición que contiene fármaco (Composición 2: Doxorubicina / mPEG-PLGA-Toco / PLMA-COONa) Una composición que contiene fármaco (composición 2) se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando mPEG-PLGA-Toco preparado a partir del Ejemplo de Preparación 8 en lugar de mPEG-PLA-Toco . Los resultados se resumen en la Tabla 1. Ejemplo 3 Composición que contiene fármaco (Composición 3: Doxorubicina / mPEG-PCL-Toco / 3arm-PLA-COOK) Una composición que contiene fármaco (composición 3) se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando mPEG-PCL-Toco preparado a partir del Ejemplo de Preparación 9 y 3arm-PLA-C00K preparado a partir del Ejemplo de Preparación 13 en lugar de mPEG-PLA-Toco y PLMA-COONa. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Ejemplo 4 Composición que contiene fármaco (Composición 4: Doxorubicina / Toco-PLA-PEO-PLA- Toco / 4arm- PLA-COONa) Una composición que contiene fármaco (composición 4) se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando Toco-PLA-PEO-PLA-Toco preparado a partir del Ejemplo de Preparación 10 y 4arm-PLA-COONa preparado a partir del Ejemplo de Preparación 14 en lugar de mPEG-PLA-Toco y PLMA-COONa. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Ejemplo 5 Composición que contiene fármaco (Composición 5: Doxorubicina / mPEG-PLA-Chol / PLMA-COONa) Una composición que contiene fármaco (composición 5) se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando mPEG-PLA-Chol preparado a partir del Ejemplo de Preparación 11 en lugar de mPEG-PLA-Toco . E emplo 6 Composición que contiene fármaco (Composición 6: Epirubicina / mPEG-PLA-Toco / PLMA-COONa) Una composición que contiene fármaco (composición 6) se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1, usando epirubicina en lugar de doxorubicina. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Ejemplo 7 Composición que contiene fármaco (Composición 7: Paclitaxel fijado a Ca2+ / mPEG-PLA-Toco / PLA- COONa) (1) Preparación de solución acuosa que contiene paclitaxel Una mezcla de 248.1 mg PLA-COONa se preparó a partir del Ejemplo de Preparación 15, 7.5 mg de paclitaxel, y 744.3 mg de mPEG-PLA-Toco preparada a partir del Ejemplo de Preparación 7 se disolvieron completamente en 5 mi de etanol para obtener una solución clara. El etanol se removió de esto para preparar una composición polimérica que contiene paclitaxel. El agua destilada (6.2 mi) se agregó a ello y la mezcla se agitó durante 30 minutos a 60°C para preparar la solución acuosa que contiene paclitaxel. (2) Fijación con el ion de metal divalente 0.121 mi (0.109 mmol) de una solución acuosa 0.9 de cloruro de calcio anhidro se agregó a la solución acuosa que contiene paclitaxel preparado arriba, y la mezcla se agitó durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se filtró usando filtro de membrana PVDF 0.22 |0m. La solución filtrada se secó por congelado y se almacenó en un refrigerador hasta que se usó. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Ejemplo 8 Composición que contiene fármaco (Composición 8: Paclitaxel fijado a Mg2+ / mPEG-PLGA-Toco / PLMA-COONa) Una composición que contiene paclitaxel fijado a Mg2+ se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 7 excepto que se usó 248.1 mg de PLMA-COONa (Mn: 1,096) del Ejemplo de Preparación 12, 7.5 mg de paclitaxel, 744.3 mg de mPEG-PLGA-Toco del Ejemplo de Preparación 8 y 0.230 mi (0.113 mmol) de una solución acuosa 0.5M de hidrato 6 de cloruro de magnesio (M : 203.31). Los resultados se resumieron en la Tabla 1. Ejemplo 9 Composición que contiene fármaco (Composición 9: Paclitaxel fijado a Ca2+ / mPEG-PLA-Toco / PLMA-COONa) Una composición que contiene paclitaxel fijado a Cg2+ se preparó por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 7 excepto que se usó248.1 mg de PLMA-COONa del Ejemplo de Preparación 12, 7.5 mg de paclitaxel, 744.4 mg de mPEG-PLA-Toco del Ejemplo de Preparación 7 y 0.230 mi (0.113 mmol) de una solución acuosa 0.9 M de cloruro de calcio anhidro. Los resultados se resumieron en la Tabla 1. Ejemplo 10 Composición que contiene fármaco (Composición 10: Paclitaxel fijado a Ca2+/mPEG-PLA-Chol/PLMA-COONa) Se preparó una composición que contiene paclitaxel fijado a Ca2+ por el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 7, excepto que se usaron 248.1 mg de PLMA-COONa del Ejemplo de Preparación 12, 7.5 mg de paclitaxel, 744.4 mg de mPEG-PLA-Chol del Ejemplo de Preparación 11 y 0.230 mi (0.113 mmol) de una solución acuosa 0.9 M de cloruro de calcio anhidro. Los resultados se resumen en la Tabla 1.
Tabla 1. Fármaco Copolímero Poliéster Eficiencia Tamaño de de bloque biodegradable de partícula anfifílico atrapado (nm) (%) Peso 10 mg 810 mg 180 mg inicial Conp. 1 Doxorubicina mPEG-PLA- PLMA-COONa 98 32 Toco Conp. 2 Doxorubicina mPEG-PLGA- PLMA-CCONa 97 28 Toco Conp. 3 Doxorubicina mPEG-PCL- 3arm-PLA-COOK 95 41 Toco Conp. 4 Doxorubicina Toco-PLA- 4arm-PLA- 95 57 PEO-PLA- COONa Toco Conp. 5 Doxorubicina mPEG-PLA- PLMA-COONa 96 35 Chol Conp. 6 Epirubicina mPEG-PLA- PLMA-CCONa 97 38 Toco Conp. 7 Paclitaxel mPEG-PIA- PLA-COONa 99 29 Toco Conp. 8 Paclitaxel mPEG-PLGA- PLMA-COONa 101 30 Toco Conp. 9 Paclitaxel mPEG-PLA- PLMA-COONa 100 34 Toco Conp. 10 Paclitaxel mPEG-PLA- PLMA-COONa 99 34 Chol Ejemplo 11 Evaluación de absorción intracelular de un fármaco: citometría de flujo Para evaluar la absorción intracelular de un agente bioactivo, la composición que contiene doxorubicina de la presente invención (Composición 1 en el ejemplo 1) y la formación de doxorubicina convencional (solución acuosa de clorohidrato de doxorubicina, libre de Dox) se probaron en líneas de células de cáncer uterino humanas, MES-SA (línea de células sensibles a la doxorubicina) y MES-SA/Dx-5 (línea de célula resistente a la doxorubicina) . El estudio de citometría de flujo se realizó con el FACStarplus (Becton Dickinson) de conformidad con el método de Walker et al. (Experimental Cell Research 207: 142(1993)). Brevemente, las células (1.0 x 106) se incubaron en medio mcCoy 5A (Invitrogen Corp.) complementado con suero de bovino fetal al 10% y estreptomicina de penicilina al 1%. Después de un periodo de incubación de 24 horas, las células se trataron con la composición de fármaco a una dosis de 1.0 µg/ml . Las células en tubos Falcon de 12 x 75 se colocaron en el FACStarPlus y la fluorescencia se observó a una longitud de onda de 488 nm (excitación) y 519 nm (emisión) . Los datos se analizaron por el software CellQuest y los resultados se muestran en las Figuras 3A hasta 4B y se resumen en las Tablas 2A y 2B.
Tabla 2A: Número de células (%) que absorben el fármaco *Relación = Composición 1 /Libre de Dox Tabla 2B: Cambio de Intensidad de Fluorescencia *Relación = Composición 1 /Libre de Dox Como se muestra en las Figuras 2A hasta 3B y las Tablas 2A y 2B, el fármaco entre más efectivamente en las células a partir de la composición de fármaco de la presente invención (Composición 1) que a partir de la formulación de solución convencional (Libre de Dox) . Particularmente la absorción de la doxorubicina en las células es notable en la línea de célula resistente al fármaco.
Ejemplo 12A Microscopio confocal: composición que contiene doxorubicina en células MES-SA Para visualizar la absorción intracelular de un agente bioactivo, la composición que contiene doxorubicina de la presente invención (Composición 1 en el Ejemplo 1) y la formulación de doxorubicina convencional (solución acuosa de clorohidrato de doxorubicina, Libre de Dox) se probaron en las líneas de células de cáncer uterino humanas, MES-SA (línea de célula sensible a la doxorubicina) y MES-SA/Dx-5 (línea de célula resistente a la doxorubicina) . Las células se forman en imagen en un sistema de formación de imagen confocal Zeiss LSM 510 (Thornwood, NY) con un microscopio fluorescente invertido y un analizador de imágenes. Brevemente, las células (3 x 105) en 3 mi de medio McCoy 5A (Invitrogen Corp.) complementado con suero de bovino fetal al 10% y estreptomicina de penicilina al 1% se incubaron durante la noche en un portaobjetos de vidrio a 37 °C. Después de la incubación, las células se trataron con la composición de fármaco a una dosis de 1.0 µg/ml, y el portaobjeto se montó en el microscopio. A los intervalos de tiempo dado, la fluorescencia se observó a una longitud de onda de excitación de 484 nm, y los resultados se muestran en las Figuras 4A y 4D. Las imágenes confocales en las Figuras 4A hasta 4D visualizan los resultados de citoraetría de flujo: se absorbieron cantidades mucho mayores de doxorubicina por las células cuando la composición que contiene doxorubicina de la presente invención se trató. En las Figuras 4A hasta 4D, las fotos del lado izquierdo son las imágenes confocales después del tratamiento con la formulación de solución convencional y las imágenes del lado derecho son después del tratamiento con las composiciones de la presente invención. Y como se muestra en las Figuras 4B y 4D, los micelos o nanopartículas se detectaron en los compartimiento citoplásmicos y nucleares. Ejemplo 12B Microscopio confocal: composición que contiene epirubicina en células MCF-7 Para visualizar la absorción intracelular de un fármaco, la composición que contiene epirubicina de la presente invención (Composición 6 en el Ejemplo 6) y la formulación de epirubicina convencional (solución acuosa de clorohidrato de epirubicina) se probaron en las líneas de células de cáncer de mama humanas, MCF-7 (línea de célula sensible a la epirubicina) y MCF-7 /ADR (línea de célula resistente a la epirubicina) . Las imágenes confocales se obtienen por el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 12A, usando medio RPMI (Invitrogen Corp.) en lugar de medio McCoy 5A, y los resultados se muestran en las Figuras 4E hasta 4H.
Las imágenes confocales en las Figuras 4E hasta 4H visualizan los resultados de citometría de flujo: se absorben cantidades mucho mayores de epirubicina por las células cuando la composición que contiene epirubicina de la presente invención se trata. En las Figuras 4E hasta 4H, las fotos del lado izquierdo son las imágenes confocales después del tratamiento con la formulación de solución convencional y las imágenes del lado derechos son después del tratamiento con las composiciones de la presente invención. Y como se muestra en las Figuras 4F y 4H, los micelos o nanopartículas se detectan en los compartimientos citoplásmicos y nucleares. Ejemplo 13 Citotoxicidad in vitro Para la prueba de citotoxicidad in vitro de la composición de la presente invención, la composición que contiene doxorubicina de la presente invención (Composición 1 en el Ejemplo 1, Doxo-PNP) y la formulación de doxorubicina convencional (solución acuosa de clorohidrato de doxorubicina, Libre de Dox) se probaron en líneas celulares de cáncer uterino humanas, MES-SA (línea de célula sensible a la doxorubicina) y MES-SA/Dx-5 (línea de célula resistente a la doxorubicina) . El ensayo MTT es un método bien establecido para la prueba de citotoxicidad. Cuando las células se tratan con MTT (metiltiazoltetrazolio) , el MTT-formazan se produce de la reducción de MTT-tetrazolio por enzimas presentes en células vivas solamente (las células muertas no reducen el MTT-tetrazolio a MTT-formazan) . La fluorescencia del MTT-formazan se detecta por un lector de fluorescencia y la densidad óptica se correlaciona con el número de células . Este procedimiento se automatiza, y la viabilidad celular y los valores IC50 (concentración inhibidora al 50% del crecimiento celular) se calculan por el software instalado en el lector de microplaca . La actividad citotóxica de cada composición se evaluó en ambas líneas de célula de tumor humanas a cinco diluciones de diez veces en el rango desde 0.01 hasta 100 µg/ml . Después de una exposición continua durante 3 días, las células se tratan con TT (metiltiazoltetrazolio) . El MTT-formazan producido por la reducción de MTT-tetrazolio por enzimas presentes en las células vivas, se detectó por un lector de fluorescencia. La densidad óptica se correlaciona con el número de células. Los resultados de dos experimentos independientes se expresan como valores IC50 (concentración inhibidora al 50%) de cada línea de célula. El ensayo MTT se realizó esencialmente de conformidad con el método de Carmichael et al. (Cáncer Research 47:936(1987)). Brevemente, las células se cosecharon de un cultivo de fase exponencial que se hace crecer en medio McCoy 5A (Invitrogen Corp.) complementado con suero de bovino fetal al 10% y estreptomicina de penicilina al 1%, contado y colocado en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pozos (100 suspensión celular, 5 x 104 células/ml para cada línea de célula) . Después de una recuperación de 24 horas para permitir que las células crezcan en resumen exponencial, un medio de cultivo (24 pozos de control por placa) o medio de cultivo que contiene el fármaco se agregan a los pozos. Cada concentración de fármaco se colocó por triplicado. Después de 3 días de exposición del fármaco continua, las células se tratan con 25 µ? de una solución MTT en agua estéril (2mg/ml) . Se midió la fluorescencia usando un lector de microplaca automático (SpectraMax 190, Molecular Devices) a una longitud de onda de 549nm, y el número de células viables se calculó de la densidad óptica. Los resultados del estudio de viabilidad celular se muestran en las Figuras 5A y 5B y valores IC50 (concentración inhibidora al 50%) de cada línea celular se resumen en la Tabla 3. Tabla 3: Ensayo MTT (IC50, µg/ml) *Relación = Composición 1 /Libre de Dox La actividad citotóxica en las células sensibles a la doxorubicina fue similar en ambas composiciones como se muestra en las Figuras 5A, pero la composición del fármaco de la presente invención muestra una actividad 6.7 veces mayor a tres días después del tratamiento que la formulación de solución convencional cuando se trata las células resistentes a la doxorubicina como se muestra en la Figura 5B. Esta diferencia en la actividad se debe a las características de las líneas celulares resistentes al fármaco en las cuales las P-glicoproteínas (P-gp) se sobreexpresan y extruyen continuamente los fármacos citotóxicos de la célula. Ya que el fármaco libre no se concentración dentro de las células resistentes al fármaco, este resultado implica que el portador fármaco de la presente invención entre en conjunto a la célula con el fármaco incorporado en el portador fármaco. Ejemplo 14 Farmacocir-ética en ratas Las concentraciones de fármaco en plasma sanguíneo se miden después de la administración intravenosa de las composiciones que contienen doxorubicina en la presente invención (Composiciones 1 hasta 5 en los ejemplos 1 hasta 5) y la formulación de doxorubicina convencional (solución acuosa de clorohidrato de doxorubicina, Libre de Dox) en ratas Sprague-Dawley de 7 hasta 8 semanas de edad. Las ratas (5 ratas por cada formulación) se inyectaron intravenosamente a través de la vena de la cola a una dosis de 5mg/kg. Las muestras sanguíneas se colectan de la vena de la cola a l, 5, 15, 30 minutos y 1, 2, 4, 8, y 24 horas después de la inyección del fármaco. Las muestras sanguíneas se centrifugan inmediatamente, y el plasma se separó. Las muestras de plasma se almacenaron a -50°C hasta el análisis. La doxorubicina se analizó por el ensayo CLAR descrito en el ejemplo 1. La curva de tiempo de concentración sanguínea (curva C-t) se muestra en la Figura 6, y el área bajo la curva de tiempo de tiempo-concentración sanguínea (AUC) se calculó usando la regla trapezoidal lineal. Los resultados se resumen en la Tabla 4. Tabla 4 : Farmacocinéticos en Ratas Se entenderá que las configuraciones arriba referenciadas son solamente ilustrativas de la aplicación de los principios de la presente invención. Pueden divisarse numerosas modificaciones y configuraciones alternativas sin salirse del espíritu y alcance de la presente invención. Aunque la presente invención se muestra en los dibujos y se describe completamente arriba con particularidad y detalle en conexión con las que actualmente se consideran que son las modalidades preferidas y más prácticas de la invención, serán aparentes a aquellos de habilidad ordinaria en la técnica que pueden hacerse numerosas modificaciones sin salirse de los principios y conceptos de la invención como se estable en la presente. Se hace constar que con esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a cabo la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones 1. Un sistema de suministro para el suministro intracelular de agentes bioactivos que comprende agentes bioactivos y un portador de fármaco polimérico con los agentes bioactivos entrampados dentro de la solución acuosa, caracterizado porque el portador de fármaco polimérico se prepara por una composición polimérica que comprende (a) un copolímero de bloque anfifílico que consiste de un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en el cual el bloque hidrofóbico tiene un grupo terminal hidroxilo que se substituye con un grupo de tocoferol o colesterol y (b) un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo al final del polímero; y en donde los agentes bioactivos entrampados en el portador del fármaco polimérico se permiten suministrar en una célula en una mayor cantidad cuando el portador de fármaco hace contacto con la célula. 2. Un método para el suministro intracelular de agentes bioactivos, caracterizado porque comprende las etapas de: a) seleccionar al menos un agente bioactivo; b) preparar una composición polimérica que comprende un copolímero de bloque anfifílico que comprende un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico en donde el bloque hidrofóbico tiene un grupo terminal hidroxilo que se substituye con un grupo tocoferol o colesterol, un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo al final del polímero; c) mezclar y disolver la composición polimérica y los agentes bioactivos en un solvente y evaporar el solvente; d) agregar una solución acuosa para formar un portador de fármaco polimérico con agentes bioactivos atrapados en ellos en la solución; y e) hacer contacto del portador de fármaco con una célula para facilitar el suministro de agentes bioactivos dentro de la célula. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la siguiente fórmula: RO-CHZ- [A]n- [B]m-COOM (I) En donde A es -COO-CHZ-; B es -COO-CHY, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- ó -COO-CH2CH2OCH2 ; R es un átomo de hidrógeno, grupo acetilo, benzoilo, decanoilo, palmitoilo, metilo o etilo; Z e Y son cada uno un átomo de hidrógeno, grupo metilo o fenilo; M es H, Na, K, o Li; n es un entero desde 1 hasta 30, y m es un entero desde 0 hasta 20. 4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la siguiente fórmula: RO-CHZ- [COO-CHX]p- [COO-CHY' ] q-COO-CHZ-COOM (II) en donde X es un grupo metilo; Y' es un átomo de hidrógeno o grupo fenilo; p es un entero desde 0 hasta 25; q es un entero desde 0 hasta 25, con la condición de que p+q es un entero desde 5 hasta 25; R es un átomo de hidrógeno, grupo acetilo, benzoilo, decanoilo, palmitoilo, metilo o etilo; Z es un átomo de hidrógeno, grupo metilo o fenilo; M es H, Na, K, o Li . 5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la siguiente fórmula: RO-PAD-COO-W-M' (III) o C 1H CHgCOOM - En donde W-M' es ? ; el PAD es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido D, L-poliláctico , ácido D-poliláctico, ácido polimandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido glicólico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido mandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y caprolactona y un copolímero de ácido D,L-láctico y 1, 4-dioxano-2-ona; R es un átomo de hidrógeno, grupo acetilo, benzoilo, decanoilo, palmitoilo, metilo o etilo; y M es H, Na, K, o Li . 6. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la siguiente fórmula: S-0-PAD-COO-Q (IV) en donde S es (C& a-C00M; L es _?¾_ q _q_. ¾ es un átomo de hidrógeno o alquilo Ci-m; Q es CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3 , o CH2C6H5; a es un entero desde 0 hasta 4; b es un entero desde 1 hasta 10; R es un átomo de hidrógeno, acetilo, · benzoilo, decanoilo, palmitoilo, grupo metilo o etilo; M es H, Na, K, o Li y PAD es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido D, L-poliláctico, ácido D-poliláctico, ácido polimandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido glicólico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido mandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y caprolactona y un copolímero de ácido D,L-láctico y 1 , 4-dioxano-2-ona . 7. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la siguiente fórmula: CHHD-FP en donde R' es -PAD-O-C (0) -CH2CH2-C (0) -0M y PAD es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido D,L-poliláctico, ácido D-poliláctico, ácido polimandélico, un copolimero de ácido D,L-láctico y ácido glicólico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido mandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y caprolactona y un copolímero de ácido D,L-láctico y 1 , 4-dioxano-2-ona; M es el mismo como se define en la fórmula (I); a es un entero desde 1 hasta 4. 8. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el bloque hidrofílico es uno seleccionado del grupo que consiste de polialquilen glicoles, polivinil pirrolidona, alcoholes de polivinilo y poliacril amidas, y el bloque hidrofílico es uno seleccionado del grupo que consiste de poliláctidos , poliglicólidos , polidioxan-2-ona, policaprolactona, co-glicólido poliláctico, co-caprolactona poliláctica, co-dioxan-2-ona poliláctica y derivados de los mismos en donde el grupo terminal carboxilo se substituye con un grupo ácido succínico de tocoferol o ácido succínico de colesterol . 9. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los bloques hidrofílico e hidrofóbico tienen un peso molecular promedio en número dentro del intervalo de 500 a 50,000 daltones, respectivamente. 10. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la relación del bloque hidrofílico al bloque hidrofóbico en el copolímero de bloque anfifílico es 3:7 a 8:2. 11. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico tiene un peso molecular promedio en número de 500 a 2,500 daltones. 12. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico está en forma de una sal de sodio o potasio obtenida por la reacción en condensación en ausencia de un catalizador seguida por neutralización con carbonato de sodio, carbonato ácido de sodio, carbonato ácido de potasio o carbonato de potasio. 13. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la composición polimérica comprende 0.1 a 99.9% en peso del copolímero de bloque anfifílico y 0.1 a 99.9% en peso de derivados del ácido poliláctico con base en el peso total del copolímero de bloque anfifílico y el derivado de ácido poliláctico. 14. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la relación del agente bioactivo a la composición polimérica es una relación de 0.1-20.0:80.0-99.9 en peso . 15. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el tamaño de partícula del portador de fármaco está dentro del intervalo de 1 a 400 nm. 16. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los agentes bioactivos se seleccionan del grupo que consiste de fármacos de proteínas y polipéptidos. 17. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque los agentes bioactivos son uno seleccionado del grupo que consiste de agentes anticáncer, agentes anti-inflamatorios , agentes antifungales , agentes antihipertensivos , antieméticos y antibióticos. 18. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente bioactivo es ácido nucleico. 19. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el portador de fármaco es un micelo polimérico . 20. Un método para el suministro intracelular de agentes bioactivos, caracterizado porque comprende las etapas de: a) seleccionar al menos un agente bioactivo; b) preparar una composición polimérica que comprende un copolímero de bloque anfifílico que consiste de un bloque hidrofílico y un bloque hidrofóbico, en donde el grupo terminal carboxilo se substituye con un grupo ácido succínico de tocoferol o ácido succínico de colesterol, un derivado de ácido poliláctico que tiene al menos un grupo carboxilo al final del polímero y de 0.01 a 10 equivalentes del ión de metal di- o trivalente con respecto a 1 equivalente del grupo terminal carboxilo del derivado de ácido poliláctico; c) mezclar y disolver la composición polimérica y los agentes bioactivos en un solvente y evaporar el solvente; d) agregar una solución acuosa para formar un portador de fármaco polimérico con agentes bioactivos atrapados dentro de la solución; y e) hacer contacto del portador de fármaco con una célula para facilitar el suministro de agentes bioactivos dentro de la célula. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el ión de metal di- o tri-valente se selecciona del grupo que consiste de Ca2+, Mg2+, Ba+, Cr3+, Fe3+, Mn2+, Ni2+, Cu+, Zn2+ y Al3+. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la fórmula siguiente: RO-CHZ- [A]n- [B]m-COOM (I) en donde A es -COO-CHZ- ; B es -COO-CHY, -COO-CH2CH2CH2CH2CH2- ó -COO-CH2CH2OCH2 ; R es un átomo de hidrógeno, grupo acetilo, benzoilo, decanoilo, palmitoilo, metilo o etilo; Z e Y son cada uno un átomo de hidrógeno, grupo metilo o fenilo; M es H, Na, K, o Li; n es un entero desde 1 hasta 30, y m es un entero desde 0 hasta 20. 23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la fórmula siguiente: RO-CHZ- [COO-CHX]p- [COO-CHY' ]q-COO-CHZ-COOM (II) en donde X es un grupo metilo; Y' es un átomo de hidrógeno o grupo fenilo; p es un entero desde 0 hasta 25; q es un entero desde 0 hasta 25, con la condición de que p+q es un entero desde 5 hasta 25; R es un átomo de hidrógeno, grupo acetilo, benzoilo, decanoilo, palmitoilo, metilo o etilo; Z es un átomo de hidrógeno, grupo metilo o fenilo; M es H, Na, K, o Li . 24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la fórmula siguiente: RO-PAD-COO-W-M' (III) en donde W-M' es CHjCOOM; PAD es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido D, L-poliláctico, ácido D-poliláctico, ácido polimandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido glicólico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido mandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y caprolactona y un copolímero de ácido D,L-láctico y 1 , 4-dioxano-2-ona; R es un átomo de hidrógeno, grupo acetilo, benzoilo, decanoilo, palmitoilo, metilo o etilo; y M es H, Na, K, o Li . 25. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la fórmula siguiente: S-O-PAD-COO-Q (IV) en donde S es (C¾)a—COOM- L es -NRi- o -0-; Ri es un átomo de hidrógeno o alquilo Ci-io; Q es CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3, CH2CH2CH2CH3 , o CH2C6H5; a es un entero desde 0 hasta 4; b es un entero desde 1 hasta 10; R es un átomo de hidrógeno, acetilo, benzoilo, decanoilo, palmitoilo, grupo metilo o etilo; M es H, Na, K, o Li y PAD es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido D,L-poliláctico, ácido D-poliláctico, ácido polimandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido glicólico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido mandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y caprolactona y un copolímero de ácido D,L-láctico y 1 , 4-dioxano-2-ona . 26. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico es representado por la fórmula siguiente: (V) en donde R' es -PAD-O-C (O) -CH2CH2-C (O) -OM y PAD es un miembro seleccionado del grupo que consiste de ácido D,L-poliláctico, ácido D-poliláctico, ácido polimandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido glicólico, un copolímero de ácido D,L-láctico y ácido mandélico, un copolímero de ácido D,L-láctico y caprolactona y un copolímero de ácido D,L-láctico y 1 , 4-dioxano-2-ona; M es el mismo como se define en la fórmula (I); a es un entero desde 1 hasta 4. 27. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el bloque hidrofílico es uno seleccionado del grupo que consiste de polialquilen glicoles, polivinil pirrolidona, alcoholes de polivinilo y poliacril amidas, y el bloque hidrofílico es uno seleccionado del grupo que consiste de poliláctidos , poliglicólidos , polidioxan-2-ona, policaprolactona, co-glicólido poliláctico, co-caprolactona poliláctica, co-dioxan-2-ona poliláctica y derivados de los mismos en donde el grupo terminal carboxilo se substituye con un grupo ácido succínico de tocoferol o ácido succínico de colesterol . 28. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los bloques hidrofílico e hidrofóbico tienen un peso molecular promedio en número dentro del intervalo de 500 a 50,000 daltones, respectivamente. 29. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la relación del bloque hidrofílico al bloque hidrofóbico en el copolímero de bloque anfifílico es 3:7 a 8:2. 30. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico tiene un peso molecular promedio en número de 500 a 2,500 daltones. 31. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el derivado de ácido poliláctico está en forma de una sal de sodio o potasio obtenida por la reacción en condensación en ausencia de un catalizador seguida por neutralización con carbonato de sodio, carbonato ácido de sodio, carbonato ácido de potasio o carbonato de potasio. 32. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la composición polimérica comprende 0.1 a 99.9% en peso del copolímero de bloque anfifílico y 0.1 a 99.9% en peso de derivados del ácido poliláctico con base en el peso total del copolímero de bloque anfifílico y el derivado de ácido poliláctico. 33. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la relación del agente bioactivo a la composición polimérica es una relación de 0.1-20.0:80.0-99.9 en peso . 34. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el tamaño de partícula del portador de fármaco está dentro del intervalo de 1 a 400 nm. 35. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los agentes bioactivos se seleccionan del grupo que consiste de fármacos de proteínas y polipéptidos . 36. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque los agentes bioactivos son uno seleccionado del grupo que consiste de agentes anticáncer, agentes anti-inflamatorios , agentes antifungales , agentes antihipertensivos , antieméticos y antibióticos. 37. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el agente bioactivo es ácido nucleico. 38. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el portador de fármaco es un micelo polimérico o nanopartícula .
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