MXPA06010445A

MXPA06010445A - Metodos y constructos para expresar multimeros de polipeptido en celulas eucarioticas usando empalme alternativo

Info

Publication number: MXPA06010445A
Application number: MXPA/A/2006/010445A
Authority: MX
Inventors: Prentice Holly
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc
Priority date: 2004-03-15
Filing date: 2006-09-13
Publication date: 2007-04-10

Abstract

La invención proporciona un método de producción de polipéptidos múltiples, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en una célula eucariótica usando un vector sencillo de expresión. El vector de expresión se prepara por ingeniería para comprender dos o más casetes de expresión bajo el control de un promotor sencillo en donde los casetes de expresión tienen sitios de empalme los cuales permiten su empalme alternativo y la expresión como dos o más productos de genes independientes a una relación deseada. Se describe el uso del vector para la expresión eficiente de los anticuerpos recombinantes en células hospederas eucarióticas asícomo el uso de tales anticuerpos en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

Description

MÉTODOS Y CONSTRUCTOS PARA EXPRESAR MULTIMEROS DE POLIPEPTIDO EN CÉLULAS EUCARIOTICAS USANDO EMPALME ALTERNATIVO Campo de la Invención Ciertas modalidades de la invención descritas en la presente se refieren a vectores y métodos para expresar multímeros de polipéptido en células eucarióticas, tanto in vitro como in vivo, usando empalme alternativo. Los métodos para producir células que contienen estos vectores se incluyen, así como el uso de estos vectores y los polipéptidos expresados de estos para el tratamiento de una enfermedad y para la producción eficiente in vivo o in vitro de tales proteínas multiméricas .

Antecedentes de la Invención Los multímeros de polipéptido se ensamblan de dos o más polipéptidos que juntos forman un complejo. Los polipéptidos que hacen el complejo son usualmente diferentes. Los anticuerpos son un multímero de polipéptido típico los cuales están comprendidos de dos polipéptidos de cadena ligera de anticuerpo y dos polipéptidos de cadena pesada de anticuerpo que juntos forman un complejo tetra érico. La expresión de multímeros de polipéptido en las células hospederas es un proceso desafiante en el cual la expresión de cada polipéptido diferente que hace el multímero de REF:i75741 polipéptido deberá coordinarse cuidadosamente. Por ejemplo, para expresar un anticuerpo en células eucarióticas, un primer gen que codifica el anticuerpo de cadena ligera y un segundo gen que codifica un anticuerpo de cadena pesada deberán introducirse en la célula y expresarse dentro de un rango de relaciones aceptable. La expresión de una relación inaceptable de anticuerpo de cadena ligera a pesada dentro de la misma célula o sistema de cultivo puede resultar en una producción altamente ineficiente del complejo multimérico deseado o en toxicidad de la célula u organismo. Los enfoques anteriores para expresar multímeros de polipéptido en células eucarióticas incluye introducir dos o más vectores, cada vector codifica separadamente cada uno de los polipéptidos diferentes que hacen el multímero de polipéptido. Cada vector porta típicamente un promotor que conduce la expresión de un polipéptido del complejo, y al menos un vector típicamente codifica un marcador de selección. Los vectores son entonces, en serie o en conjunto, introducidos en la célula (usualmente por transfección) y las células se co-seleccionan para la expresión de ambos marcadores de selección. En otro enfoque, una secuencia que codifica junto con un promotor para cada polipéptido que hace el complejo de polipéptido, se produce por ingeniería en un vector sencillo. Este enfoque elimina la necesidad para trabajar con vectores múltiples, pero todavía no elimina el potencial para competencia del promotor entre cada secuencia de codificación. También, este enfoque puede no resolver típicamente el problema de expresar los polipéptidos individuales que comprenden el multímero de proteína en una relación aceptable para resultar en una expresión eficiente del multímero de proteína. De esta manera, en cualquiera de los enfoques anteriores, una relación consistente de dos productos puede no siempre obtenerse en la célula hospedera. Esto puede deberse a factores tales como una actividad promotora diferencia, competencia del promotor para factores celulares requeridos para expresión óptima, eficiencia de transcripción y/o traducción de los polipéptidos de componente multímero de proteína, y/o una diferencia en el número de copias para cada uno de los vectores introducidos en la célula. Los- vectores de empalme utilizan un donador de empalme sencillo y un aceptor de empalme también se ha desarrollado. La Patente E.U.A. No. 5,043,270 describe un minigen que expresa un marcador seleccionable, por ejemplo, DHFR, y tiene un intrón que contiene un gen que codifica la proteína de interés. La- Patente E.U.A. No. 5,561,053 describe la situación inversa, en la cual el gen que codifica la proteína de interés contiene un intrón 5' para la secuencia de codificación. Este intrón contiene el gen que codifica el marcador seleccionable enlazado por el donador y aceptor de empalme. Este tipo de vector de expresión intrónica se. describe además en Lukas, B.K., Nucleic Acids Res. 24:1114-1119 (1996) . La solicitud de publicación de Patente E.U.A. ?o. 2005/0019925 Al describe vectores intrónicos similares con un marcador seleccionable de fusión. También se describe el uso de dos pares de donadores de empalme y aceptores de empalme para la expresión de más de una proteína de interés. Todos estos constructos publicados, sin embargo, dependen de pares de donadores de empalme y aceptores de empalme, esto es, tienen una donador de empalme alineados a un aceptor -de empalme sencillo. Cada uno de estos constructos depende de un empalme altamente eficiente en todos los sitios para su efectividad. ?o hay referencia para usar un donador de empalme sencillo para activar el empalme alternativo desde más de un aceptor de empalme para expresar polipéptidos múltiples. Además, no hay sugerencia en desear expresar los polipéptidos a relaciones diferentes, o la substitución de diferentes aceptores de empalme para controlar la expresión relativa de los polipéptidos. En consecuencia, existe una necesidad para un constructo que enlace la expresión de dos o más genes en una relación consistente, de tal manera que los productos de gen resultantes se produzcan y ensamblen eficientemente.

Breve Descripción de la Invención La invención soluciona los problemas anteriores de expresar el multímero de polipéptido en una célula hospedera usando un vector de expresión al ligar la expresión de dos o más genes a través del uso de empalme alternativo. En consecuencia, un vector sencillo que tiene un promotor puede usarse para conducir la expresión de un pre-ARNm que puede empalmarse en dos o más transcriptos de ARNm diferentes de tal manera que los dos o más transcriptos de ARNm codifican polipéptidos diferentes. De esta manera, la expresión relativa de los dos o más productos no está influenciada por la actividad diferencial de promotores independientes, competencia del promotor, o número de copias del vector. En particular, la invención proporciona un método para introducir un vector de expresión sencillo en una célula eucariótica usando un promotor sencillo para conducir la transcripción de un pre-AR?m sencillo que luego se empalma alternativamente en dos o más productos de gen diferentes que pueden entonces traducirse en dos o más polipéptidos diferentes. En una modalidad, los productos de gen codifican las subunidades de polipéptido de una proteína multimérica. En una modalidad adicional, los productos de gen son anticuerpos de cadenas ligera y pesada que comprenden un anticuerpo.

En consecuencia, la invención tiene varias ventajas que incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: - proporcionar un vector para expresión de polipéptidos múltiples, en particular, polipéptidos heteroméricos tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo; - un método eficiente de producción de polipéptidos múltiples, por ejemplo, polipéptidos de cadena pesada y ligera de anticuerpos, en una célula eucariótica tal como una célula animal o una célula de levadura; - un método eficiente de producción de anticuerpos recombinantes para uso en diagnóstico o aplicaciones terapéuticas; y - anticuerpos recombinantes producidos por el método, para tratar un sujeto en necesidad de una terapia de anticuerpos recombinantes . En consecuencia, en una modalidad, la invención proporciona un vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3' o en la dirección 3', un promotor, por ejemplo, el promotor CMV; una región no traducida (UTR) que proporciona, por ejemplo, una señal de cierre; un donador de empalme; un intrón; un primer aceptor de empalme; un primer exón que codifica un primer polipéptido; un segundo aceptor de empalme; y un segundo exón que codifica un segundo polipéptido, en donde el promotor se liga operablemente al primero y segundo exón. Los sitios de empalme (esto es, donadores y aceptores) pueden ser sitios de empalme que ocurren naturalmente, sitios de empalme diseñados, por ejemplo, sitios de empalme sintéticos, sitios de empalme canónicos o de consenso, o sitios de empalme no canónicos, por ejemplo, sitos de empalme crípticos. Cada exón además puede comprender una señal de poliadenilación. Aquí, el término "primero" o "segundo" como se aplica a un elemento genético tal como un exón, intrón, cualquier sitio de empalme, etc., se usa principalmente para identificar y distinguir varios elementos uno del otro y no se refiere a la colocación lineal del momento o numeración de elementos dentro de un gen o al orden en el cual las moléculas pre-ARNm que codifican componentes de polipéptido separados de un multímero de proteína se expresan. En otra modalidad, el vector contiene un donador de empalme y más de un aceptor de empalme, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más aceptores de empalme . Cada aceptor de empalme está asociado con un exón localizado justo en la dirección 3' del aceptor de empalme. Por lo tanto, el vector contiene más de un exón, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho nueve, diez o más exones. En una modalidad, el primer polipéptido es la cadena pesada de un anticuerpo y el segundo polipéptido es la cadena ligera del anticuerpo o, alternativamente, el primer polipéptido es la cadena ligera de un anticuerpo y el segundo polipéptido es la cadena pesada del anticuerpo. En una modalidad relacionada, la cadena ligera y/o pesada es murina, quimérica, humanizada, o humana. Las cadenas ligeras o pesadas pueden contener alteraciones de aminoácido tales como la introducción o ablación de sitios de glicosilación en, por ejemplo, la región Fc. En otra modalidad, el primero y segundo polipéptidos se expresan en una relación de alrededor de 20:1 hasta alrededor de 1:20, alrededor de 15:1 hasta alrededor de 1:15, alrededor de 12:1 hasta alrededor de 1:12, alrededor de 10:1 hasta alrededor de 1:10, alrededor de 9:1 hasta alrededor de 1:9, alrededor de 8:1 hasta alrededor de 1:8, alrededor de 7:1 hasta alrededor de 1:7, alrededor de 6:1 hasta alrededor de 1:6, alrededor de 5:1 hasta alrededor de 1:5, alrededor de 4:1 hasta alrededor de 1:4, alrededor de 3:1 hasta alrededor de 1:3, alrededor de 2:1 hasta alrededor de 1:2, o alrededor de 1:1. En modalidades particulares, el primero y segundo polipéptidos se expresan en una relación de alrededor de 20:1, alrededor de 19:1, alrededor de 18:1, alrededor de 17:1, alrededor de 16:1, alrededor de 15:1, alrededor de 14:1, alrededor de 13:1, alrededor de 12:1, alrededor de 11:1, alrededor de 10:1, alrededor de 9:1, alrededor de 8:1, alrededor de 7:1, alrededor de 6:1, alrededor de 5:1,. alrededor de 4:1, alrededor de 3:1, alrededor de 2:1, alrededor de 1:1, alrededor de 1:2, alrededor de 1:3, alrededor de 1:4, alrededor de 1:5, alrededor de 1:6, alrededor de 1:7, alrededor de 1:8, alrededor de 1:9, alrededor de 1:10, alrededor de 1:11, alrededor de 1:12, alrededor de 1:13, alrededor de 1:14, alrededor de 1:15, alrededor de 1:16, alrededor de 1:17, alrededor de 1:18, alrededor de 1:19 y/o alrededor de 1:20. La determinación de la relación se determina comúnmente usando técnicas reconocidas en el arte tales como reacción de cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR) o Northern blot (para medición de las cantidades relativas de transcritos) o inmunotinción o técnicas de ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) (para medición de cantidades relativas de polipéptidos) . En una modalidad, el vector comprende SEQ ID N0:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ó 28. En una modalidad relacionada, el vector comprende SEQ ID NO: 29. En otra modalidad, la invención proporciona una célula eucariótica que contiene el vector anterior capaz de expresar dos o más productos de gen de empalme alternativamente. En una modalidad, el vector de empalme alternativo de la presente invención se integra dentro del ADN cromosomal de la célula, y en todavía otra modalidad, el vector es episomal.

En modalidades relacionadas, el cásete de empalme alternativo o constructo de la presente invención se integra dentro del ADN cromosomal de la célula. En otra modalidad relacionada, el cásete de empalme alternativo o constructo de la presente invención es episomal . En todavía otras modalidades relacionadas, el vector de empalme alternativo de la presente invención comprende un vector viral . En otra modalidad, la célula eucariótica que contiene el vector de la invención es una célula de mamífero, tal como, por ejemplo, una célula de riñon de hámster recién nacido, un fibroblasto, una célula de mieloma, una célula de NSO, una célula de PER.C6, o célula de CHO, o, alternativamente, una célula de insecto, tal como, por ejemplo, una célula de Spodoptera frugiperda (Sf9) , una célula de Tricoplusía ni (Tn. TnHigh-Five) , o una célula de Bombyx mori (BMN) . Alternativamente, la célula eucariótica que contiene el vector de la invención es una célula de levadura, por ejemplo, ~ una célula de Saccharomyces, célula de Schizosaccharomyces, o una célula de Pichia . En otra modalidad, la invención proporciona un método de producción de polipéptidos, el método comprende el cultivo de la célula anterior que contiene el vector de empalme o cásete de expresión o constructo alternativo de la presente invención seguido por el aislamiento del primer y segundo polipéptidos del cultivo de célula.

En una modalidad del método, el primero y segundo polipéptidos forman un multímero de polipéptido tal como un anticuerpo . En otra modalidad, la invención proporciona el multímero de péptido anterior, producido por el método para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno. En otra modalidad, la invención proporciona para el suministro del vector de empalme alternativo o el cásete de empalme alternativo o constructo para un paciente in vivo. En una modalidad más, la invención proporciona el suministro del vector de empalme alternativo o el cásete de empalme alternativo o constructo a unas células del paciente o tejido ex vivo. En modalidades relacionadas, la presente invención también proporciona el regreso de células o tejidos de pacientes que comprenden el vector de empalme alternativo o el cásete de empalme alternativo o constructo para el cuerpo del paciente. Otras características y ventajas de la invención serán palpables para alguien de experiencia ordinaria en la técnica de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra un esquema de los aspectos estructurales y funcionales de un vector de empalme alternativo de la invención que se designa para permitir que un promotor sencillo conduzca la transcripción de un pre-ARNm sencillo que puede entonces alternativamente empalmarse en dos o más transcritos . Los dos O más transcritos se traducen entonces en dos o más polipéptidos correspondientes. La Figura 2 muestra un esquema de un vector de expresión de la invención cuando se usa para expresar un anticuerpo de cadena ligera y pesada que se ensambla entonces para formar un anticuerpo tetramérico maduro. La Figura 3 es un mapa plásmido de un vector de empalme' alternativo de la invención designado para expresar un anticuerpo de cadena ligera y pesada de un promotor sencillo para la producción de un anticuerpo en células eucarióticas. El mapa plásmido también indica la posición y orientación de sitios de empalme, sitios de clonación, secuencias de poliadenilación, y marcadores para selección en células eucarióticas (DHFR) y propagación en células procarióticas (beta-lactamasa) . Ver también SEQ ID ?O: 29, que proporciona la secuencia de la columna de vector. La Figura 4 muestra la secuencia de los sitios de empalme de los primeros aceptores de empalme probados, regiones de intrón y exón (respectivamente, caso inferior y caso superior) , y las correspondientes designaciones de plásmido e identificadores de secuencia.

Descripción Detallada de la Invención Con objeto de proporcionar un entendimiento claro de la especificación y reivindicaciones, se proporcionan convenientemente a continuación las siguientes definiciones.

Definiciones Los términos "primer polipéptido" o "segundo polipéptido" se refieren a polipéptidos cuya coexpresión se desea. Estos incluyen, por ejemplo, "cadenas" de polipéptido de proteínas multiméricas que comprenden subunidades de polipéptido múltiples. Estas proteínas multiméricas pueden ser aquellas encontradas en la naturaleza, por ejemplo, aquellas descritas en la técnica. Por supuesto, los términos "primer polipéptido" y "segundo polipéptido" también pueden usarse en el futuro para describir proteínas multiméricas que aún no se han descrito en la técnica. Estas proteínas multiméricas también pueden ser artificiales, por ejemplo, que comprenden polipéptidos que normalmente no se encuentran asociados en la naturaleza. Además, los polipéptidos pueden no asociarse en conjunto, pero pueden coexpresarse para algú propósito funcioanl, por ejemplo, la coexpresión de un marcador seleccionable y un polipéptido de interés. Además, los polipéptidos pueden ser secuencias nativas o mutadas, tal como por la adición, eliminación, o substitución de aminoácidos. Una persona de habilidad ordinaria en la técnica rápidamente reconocería la viabilidad de los vectores de la presente invención para un amplio espectro de polipéptidos y sería capaz de adaptar los vectores para usarlos con estos polipéptidos usando técnicas de biología molecular estándar. El término "anticuerpo" o "fragmento de anticuerpo" se refiere un ensamble de polipéptidos o fragmentos de anticuerpo, que tienen actividad de enlace para un polipéptido objetivo o receptor o tienen la función efectora deseada. Típicamente, tales ensambles incluyen al menos la región variable de un anticuerpo de cadena ligera y cadena pesada, por ejemplo un fragmento Fab, o dos anticuerpos de cadenas pesadas y dos anticuerpos de cadenas pesadas, las cuatro cadenas juntas forman un anticuerpo tetramérico (L:H:H:L) las regiones variables del cual pueden enlazar un antígeno. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier forma conocida en la técnica, por ejemplo, murino, quimérico, humanizado, humano, o sintético. Los anticuerpos de la invención también pueden modificarse para tener otras características tales como sitios de glicosilación alterados o regiones Fc. El término "UTR" significa la región no traducida y se refiere a un segmento de una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en una región no traducida del pre-ARNm y ARNm maduro. Un 5' UTR típicamente sirve como el extremo.5' del transcrito que se modifica o "tapa" con una tapa 7-guano, 7-metilguanosina que inicia la traducción del transcrito de ARNm en un polipéptido. El término "expresado en una relación" se refiere a la relación de producción de un producto de gen expresado ya sea como un transcrito o polipéptido. La determinación de la relación se determina típicamente usando técnicas reconocidas en el arte tales como reacción de cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) o técnicas Northern (para medir las cantidades relativas de transcritos) o técnicas de inmunotransferencia o ensayo inmunosorbente ligado a la enzima (ELISA) (para medir cantidades relativas de polipéptidos) . En ciertas modalidades, el primero y segundo polipéptidos se expresan en una relación de alrededor de 20:1 hasta alrededor de 1:20, alrededor de 15:1 hasta alrededor de 1:15, alrededor de 12:1 hasta alrededor de 1:12, alrededor de 10:1 hasta alrededor- de 1:10, alrededor de 9:1 hasta alrededor de 1:9, alrededor de 8:1 hasta alrededor de 1:8, alrededor de 7:1 hasta alrededor de 1:7, alrededor de 6:1 hasta alrededor de 1:6, alrededor de 5:1 hasta alrededor de 1:5, alrededor de 4:1 hasta alrededor de 1:4, alrededor de 3 : 1 hasta alrededor de 1:3, alrededor de 2:1 hasta alrededor de 1:2, o alrededor de 1:1. En modalidades particulares, el primero y segundo -polipéptidos se expresan en una relación de alrededor de 20:1, alrededor de 19:1, alrededor de 18:1, alrededor de 17:1, alrededor de 16:1, alrededor de 15:1, alrededor de 14:1, alrededor de 13:1, alrededor de 12:1, alrededor de 11:1, alrededor de 10:1, alrededor de 9:1, alrededor de 8:1, alrededor de 7:1, alrededor de 6:1, alrededor de 5:1, alrededor de 4:1, alrededor de 3:1, alrededor de 2:1, alrededor de 1:1, alrededor de 1:2, alrededor de 1:3, alrededor de 1:4, alrededor de 1:5, alrededor de 1:6, alrededor de 1:7, alrededor de 1:8, alrededor de 1:9, alrededor de 1:10, alrededor de 1:11, alrededor de 1:12, alrededor de 1:13, alrededor de 1:14, alrededor de 1:15, alrededor de 1:16, alrededor de 1:17, alrededor de 1:18, alrededor de 1:19 y/o alrededor de 1:20. El término "primer exón" se refiere a una secuencia codificada o secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido o una región de polipéptido y el término "segundo exón" se refiere a una segunda secuencia de codificación diferente o secuencia de ácido nucleico que codifica una segunda región de polipéptido. Los primeros y segundos exones de la presente invención también comprenden una secuencia aceptora de empalme 5' . El término "célula hospedera" o "célula hospedera eucariótica" se refiere a cualquier célula eucariótica que produce o expresa los productos de gen del primero y segundo exones, usando el sistema de expresión de la invención. Este incluye, por ejemplo, células de mamífero tales como células de riñon de hámster bebe, fibroblastos, células de mieloma (por ejemplo, células NSO), células PER.C6 humanas, o células de ovarios de hámster chino (CHO) . Las células de insectos útiles para la expresión incluyen, por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda (Sf9) , células de Tricoplusia ni (Tn. TnHigh-cinco) , o células de Bombyx mori (BMN) . Las células de levadura útiles para la expresión incluyen, por ejemplo, células de Saccharomyces, células de Schizoeaccharomyces y células de Pichia . Tales células son rápidamente accesibles de fuentes públicas y comerciales, tales como la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) . El término "intron" se refiere a un segmento de una secuencia de ácido nucleico que se transcribe y está presente en el pre-ARNm pero se extirpa por la maquinaria de empalme con base en las secuencias del donador de empalme y los aceptores de empalme y por lo tanto no se presenta en el transcrito de ARNm maduro. El término "ligado operablemente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes están en una relación que les permite funcionar de su manera pretendida (por ejemplo, ligado funcionalmente) . El término "señal • de poliadenilación" se refiere a una secuencia de ácido nucleico presente en el transcrito de ARN que permite que el transcrito, cuando está en presencia de la enzima poliadenil transferasa, se poliadenile.' Muchas señales de poliadenilación se conocen en la técnica y son útiles para __la presente invención. Los_ ejemplos incluyen la señal de poliadenilación de hormona de crecimiento variable humana, la señal de poliadenilación tardía SV40 y la señal de poliadenilación de hormona de crecimiento de bovino. El término "promotor" se refiere a una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción, preferiblemente en una célula eucariótica. Los promotores para usarse en la invención incluyen, por ejemplo, promotores virales, de mamífero, insecto y levadura que proporcionan altos niveles de expresión, por ejemplo, el citomegalovirus mamífero o promotor CMV, el promotor SV40, o cualquier promotor conocido en la técnica apropiado para la expresión en células eucarióticas . El término "sitio de empalme" se refiere secuencias de ácido nucleico específicas que son capaces de reconocerse por la maquinaria de empalme de una célula eucariótica como sea apropiado para cortarse y/o ligarse al sitio de empalme correspondiente. Los sitios de empalme permiten la extirpación de intrones presentes en un transcrito pre-ARNm. Típicamente la porción 5' del sitio de empalme se refiere como el donador de empalme y el sitio de empalme correspondiente 3' se refiere como el sitio de empalme aceptor. El término sitio de empalme incluye, por ejemplo, sitios de empalme que se presentan naturalmente, sitios de empalme producidos por ingeniería, por ejemplo, sitios de empalme sintéticos, sitios de empalme canónicos o de consenso, y/o sitios de empalme no canónicos, por ejemplo, sitios de empalme crípticos. El término "empalmado con" se refiere al donador de empalme que interactúa con el aceptor de empalme para permitir el empalme del transcrito por la maquinaria de empalme (por ejemplo, el espliceosoma) . Como se describe arriba, el empalme es la extirpación de una porción del transcrito (el intrón) enlazado por el donador de empalme y el aceptor de empalme. Para cada transcrito, el donador de empalme se empalma sólo con un aceptor de empalme. Para empalme alternativo, dentro del grupo de transcritos el donador de empalme se empalma con más de un aceptor de empalme. Por ejemplo, el donador de empalme puede empalmarse con un primer aceptor de empalme para un transcrito, pero en otro transcrito, el donador de empalme puede empalmarse con un segundo aceptor de empalme, lo que genera un grupo heterogéneo de transcritos. El término "transcrito empalmado" se refiere a un ARN transcrito del vector de empalme alternativo de la invención que comprende un primero o segundo exón y que experimenta un empalme entre el donador de empalme y cualquiera del primero o segundo aceptores de empalme.

El término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico (ya sea ADN o ARN) capaz de conferir la expresión de un producto de gen cuando se introduce en célula hospedera o extracto de célula hospedera. Este término es intercambiable con "vector de empalme alternativo" , "vector de expresión" , "cásete de expresión" o "constructo" . Tales vectores o casetes de expresión o constructos pueden comprender los ' elementos de empalme alternativo de la presente invención así como secuencias adicionales para la propagación del vector en células, la entrada del vector en células y posterior expresión, marcadores seleccionables, o cualesquiera otros elementos funcionales. Tales elementos son bien conocidos en la técnica y pueden intercambiarse como sea necesario usando técnicas de biología molecular estándar. El término "vector viral" o variaciones de esta (tal como "vector adenoviral") se refiere a una partícula vitral aligerada o • deficiente en replicación que comprende el vector de empalme alternativo o cásete de expresión o constructo de la invención. Como se describe en más detalle abajo, tales vectores viral son útiles para insertar el vector de empalme alternativo o cásete de expresión o constructo de la invención en células hospedadoras .

Descripción Detallada de la Invención 1. Introducción La invención proporciona, en parte, un método para expresar dos o más productos de gen en una célula eucariótica al proporcionar un vector o cásete de expresión o constructo que comprende un promotor sencillo que conduce la expresión de dos o más exones que se han producido por ingeniería para empalmarse alternativamente en dos o más transcritos expresables. De esta manera, el vector o cásete de expresión o constructo es apropiado para expresar dos o más polipéptidos, y en particular, multímeros de polipéptido, por ejemplo anticuerpos (o fragmentos de anticuerpo) que son típicamente un ensamble de anticuerpos de polipéptido de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. Por otro lado, debido a que el vector o cásete de expresión o constructo de la invención usa un promotor sencillo para conducir la expresión de un pre-ARNm, que se empalma entonces alternativamente en dos o más productos de gen, la invención evita el uso de vectores múltiples, competencia del promotor del uso de promotores múltiple, o actividad diferencial de promotores independientes. Adicionalmente, a través del uso de múltiples aceptores de empalme, la invención tiene la ventaja de proporcionar para la expresión de múltiples productos de gen en una -célula eucariótica a una relación deseada de tal manera que, por ejemplo, el ensamble resultante de polipéptidos, por ejemplo un anticuerpo tetramérico, se produzca eficientemente. Además, la presente invención se proporciona para alterar la relación de la expresión de los polipéptidos codificados al cambiar la secuencia de los . elementos de empalme, particularmente el primer aceptor de empalme. La capacidad para alternar la relación de los polipéptidos expresados, permite una multimerización más eficiente u otro aspecto funcional de los polipéptidos al proporcionar los polipéptidos en cantidades óptimas. De esta manera, el vector o cásete de expresión o constructo de la presente invención permite la expresión de los polipéptidos en cantidades suficientes para producir una o más proteínas deseadas . De esta manera, la invención también proporciona vectores apropiados para la expresión de multímeros de polipéptido, por ejemplo, anticuerpos, usando empalme alternativo así como células que comprenden el vector y anticuerpos producidos de tales células, y su uso en, por ejemplo, prognosis, diagnóstico, prevención, alivio o tratamiento de un trastorno o enfermedad en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano. Además, la invención proporciona vectores apropiados para la expresión de los polipéptidos in vivo, ya sea por administrar el vector al sujeto directamente o a través de técnicas ex vivo. 2. Diseño del Vector o Cásete de expresión o constructo _ para_Expresar Multímeros de Polipéptido Los métodos de la invención emplean el uso de un vector que comprende (en 5' a 3' o dirección descendente) un promotor; una región no traducida 5' (UTR) (que puede o no incluir una secuencia de codificación) ; un donador de empalme sencillo 5' ; un intrón que termina con un aceptor de empalme 3 ' que se usa con preferiblemente con una eficiencia de alrededor de 5 hasta 95% (dependiendo de la relación ' deseada de productos) (ejemplarmente, el aceptor de empalme 3' incluye eficientemente, pero no se limita a, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95%) ; un exón que contiene el primer gen y, opcionalmente, una señal de poliadenilación; una secuencia de intrón que termina con el aceptor de empalme 3' que es mayor al 50% de eficiencia (en modalidades preferidas, el aceptor de empalme 3' es mayor a 75% de eficiencia (por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 95% ó 100%) , mayor a 85% de eficiencia (por ejemplo, 90%, 95% ó 100%) , mayor a 90% de eficiencia (por ejemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%), o, en una modalidad altamente preferida, mayor a 95% de eficiencia (por ejemplo, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%)); y un exón que contiene el segundo gen, y opcionalmente, una señal de poliadenilación (ver Fig. 1) . El vector, cásete de expresión o constructo de la presente invención puede introducirse en una célula hospedera donde produce alternativamente transcritos de ARNm empalmados. Estos dos o más transcritos de .ARNm codifican distintos polipéptidos, que se expresan entonces en cantidades suficientes para producir una o más proteínas multiméricas deseadas . La relación de los dos o más productos puede entonces, si se desea, alterarse a través de la selección de sitios de empalme apropiados, por ejemplo, un aceptor de empalme más débil o más fuerte. En modalidades particulares, la relación de los dos o más productos puede alterarse a través de la selección de sólo el primer aceptor de empalme. Típicamente, el empalme de pre-ARNm involucra la remoción precisa de las secuencias de intrón y en parte se basa en el reconocimiento de secuencias específicas, esto es, sitios de empalme donador y aceptor, en los límites intrón-exón por la maquinaria de empalme, por ejemplo el espliceosoma. Estas secuencias del límite típicamente colocan las secuencias de consenso de MAG/GURAGU (SEQ ID NO : 30) para el extremo 5' del intrón y YIQ?CAG/G (SEQ ID NO : 31) para el extremo 3' del intrón (donde M = A o C, se subrayan los nucleótidos no variantes, Y?0 = 10 nucleótidos C o T consecutivos, y ? = cualquier nucleótido) . Las secuencias dentro de los intrones y exones así como el tamaño del intrón también se ha mostrado que juega un papel en la eficiencia del empalme (ver, por ejemplo, Chabot, B. Trends en Genetics, 12.?472-478 .(1996) ) . En ciertas modalidades de la presente invención, el empalme alternativo puede regular la expresión de cada polipéptido codificado por los exones del vector o cásete de expresión o constructo de la invención. Para cada transcrito empalmado individual, el donador de empalme se empalma sólo con un aceptor de empalme o en ninguno. Sin embargo, el empalme alternativo forma un grupo heterogéneo de transcritos como el donador de empalme puede empalmarse con el primer aceptor de empalme en un transcrito, y empalmar con un segundo aceptor de empalme en otro transcrito. De esta manera, el empalme de un donador de empalme sencillo a múltiples aceptores de empalme regulará los niveles de transcritos empalmados del primero y segundo (o más) exones generados de un vector o cásete de expresión o constructo de la presente invención en una célula. Las cantidades relativas de los niveles de transcrito diferencialmente empalmado dependerán en como frecuentemente el donador de empalme se une con un aceptor de empalme particular, que se refiere como la eficiencia del evento de empalme . Entre más f ecuentemente se presente un evento de empalme particular, entonces el donador de empalme y el aceptor de empalme asociados con tal evento de empalme son los más eficientes o fuertes .

En ciertas modalidades de la presente invención, es preferible que el donador de empalme y el aceptor de empalme 3' terminal (por ejemplo, el segundo aceptor de empalme) son altamente eficientes de manera que el empalme general es altamente eficiente y la fuerza del primer aceptor de empalme controla los niveles relativos de transcritos de exón empalmados . La traducción del transcrito no empalmado es típicamente muy ineficiente, de manera que el empalme máximo, promueve la expresión del polipéptido. Por ejemplo, si el donador de empalme y el segundo aceptor de empalme son altamente eficientes, la mayoría del ARNm incipiente se empalmará. Si el primer aceptor de empalme es fuerte (esto es, eficiente) , entonces se presentarán niveles relativamente altos de transcritos empalmados que comprende el primer exón dentro de la célula, lleva a una alta relación de la expresión del primer polipéptido comparado con el .segundo polipéptido. Si el primer aceptor de empalme es más débil, entonces niveles relativamente bajos de transcritos empalmados que comprende el primer exón estarán presentes dentro de la célula, lo que lleva a una relación baja de la expresión del primer polipéptido en comparación al segundo polipéptido. Debido a que la traducción es altamente dependiente de los niveles de transcrito empalmado que comprende un exón dado, la expresión del polipéptido codificado por el primer o segundo exón depende de los niveles de empalme utilizando el aceptor de empalme inmediatamente en dirección ascendente de tal exón. Por lo tanto, en ciertas modalidades, debido a que el empalme afecta los niveles de transcritos maduros que comprende cada exón codificado por un vector o cásete de expresión o constructo de la invención, el empalme alternativo se usa para regular la expresión de los polipéptidos codificados por los exones.

Los donadores de empalme y aceptores de empalme son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse en la presente invención. Estos elementos pueden encontrarse, inter alia, en la técnica o derivarse de secuencias de consenso, ya sea empíricamente al insertar, eliminar o sustituir nucleótidos, o al usar un software capaz de predecir una secuencia de empalme, tal como Netgene2 versión 2.4. Tales elementos de empalme pueden probarse para ser apropiados en la presente invención, tal como por el uso de los métodos descritos en los ejemplos. En parte, la presente invención incorpora y mejora tales secuencias para realizar, a través de producción por ingeniería genética, el empalme alternativo de dos o más productos de genes recombinantes deseables en células eucarióticas . El vector o cásete de expresión o constructo de la invención es útil para expresar una variedad de proteínas heteromultiméricas . Los ejemplos incluyen, pero no se limita a, heterodímeros tales como las hormonas de glicoproteína (por ejemplo gonadotropina coriónica (CG) , tirotropina (TSH) , lutropina (LH) , y folitropina (FSH) ) o miembros de la familia de integrina. Los heterotetrámeros que consisten de dos pares de subunidades idénticas también podrán usarse. Los ejemplos de heterotetrámeros apropiados incluyen anticuerpos, el receptor de insulina (alfa2 beta2) y el factor de inicio de transcripción TFIIE (alfa2 beta2) . Además, usando un par de aceptores de empalme que generan una relación de expresión 2:1, el vector o cásete de expresión o constructo puede usarse para la expresión de heterotrímeros tales como linfotoxina alfalbeta2. Al alterar la relación de expresión al combinar diferentes aceptores de empalme, se puede generar vectores o casetes de expresión o constructos capaces de expresar multímeros en diferentes relaciones, lo que permite una expresión eficiente de muchas proteína heteromultiméricas diferentes. En ciertas modalidades, las relaciones de expresión se predicen con base en la secuencia del donador de empalme y/o señales del aceptor. En otras modalidades, las relaciones de expresión se determinan empíricamente. Por otro lado, las secuencias genéticas útiles para producir multímeros de polipéptido, -por ejemplo, anticuerpos, usando el sistema de empalme alternativo de la invención, pueden obtenerse de un número de fuentes diferentes. Por ejemplo, una variedad de genes de proteína humana están disponibles están disponibles en forma de secuencias genéticas públicamente accesibles y/o depósitos de plásmidos, clones, células, y los similares. Alternativamente, las líneas de células que producen proteínas pueden seleccionarse y cultivarse usando técnicas reconocidas en el arte. En otras modalidades, las secuencias genéticas se obtienen a través del acceso a bases de datos por suscripción. Alguien de experiencia ordinaria en la técnica conocería muchos métodos apropiados para obtener información de secuencia genética. Por ejemplo, el ARN que codifica el anticuerpo puede aislarse de las células de hibridoma que producen el anticuerpo original o de otras células transformadas por técnicas estándar, tales como extracción de guanidinio isotiocianato y precipitación seguido por centrifugación o cromatografía. Donde sea deseado, el ARNm puede aislarse del AT? total por técnicas estándar tales como cromatografía en oligo dT celulosa. Las técnicas apropiadas para estos propósitos son familiares para alguien de habilidad ordinaria en la técnica. Los AD?c que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo pueden hacerse, ya sea simultáneamente o separadamente, usando transcriptasa inversa y polimerasa de AD? de conformidad con métodos bien conocidos. Puede iniciarse por cebadores de región constante de consenso o por cebadores más específicos con base en, por ejemplo, el AD? de cadena ligera y pesada de anticuerpo publicado y secuencias de aminoácido. Como se discute arriba, el PCR también puede usarse para aislar los clones de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo. En este caso, las colecciones pueden separarse por exclusión por cebadores de consenso o sondas homologas grandes, tales como sondas de región constante de ratón. Alternativamente, los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pueden sintetizarse usando secuencias derivadas de técnicas de modelado por computadora bien conocidas. Tales técnicas de modelado pueden usarse para predecir secuencias de anticuerpo que, en el contexto de una estructura de anticuerpo dada definida por las secuencias de aminoácido conservadoras, enlazarían una estructura de ligando predicha. Al usar esta relación conocida, la persona experta en la técnica puede diseñar la secuencia de aminoácido del anticuerpo deseado o fragmento de anticuerpo, luego sintetizar las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos deseados. Tal anticuerpo designado o fragmentos de anticuerpo se refieren como "sintético" . Las composiciones y métodos inventivos de la presente invención son apropiados para cualquier anticuerpo, o efectivamente cualquier proteina multi-cadenas o multimérica. Las técnicas de síntesis de oligonucleótido compatibles con esta modalidad de la invención son bien conocidas por alguien de experiencia ordinaria en la técnica, y pueden llevarse a cabo usando cualesquiera de varios sintetizadores automatizados comercialmente disponibles. Además, las secuencias de ADN que codifican varios tipos de • cadenas pesadas y ligeras establecidos en la presente, pueden obtenerse a través de los servicios de vendedores de ADN comercial . El material genético obtenido usando cualesquiera de los métodos anteriores puede entonces alterarse o modificarse para proporcionar anticuerpo compatibles con la presente invención y el uso deseado de tales anticuerpos. Una variedad de diferentes tipos anticuerpos pueden expresarse de conformidad con la invención. Por ejemplo, anticuerpo o fragmentos de anticuerpo con una actividad inmunoreactiva específica para un antígeno, por ejemplo, un antígeno asociado con tumor, patógeno, o auto-antígeno involucrado en una enfermedad autoinmune. El anticuerpo (o fragmento del mismo) , puede modificarse de tal manera que una o más regiones constante se eliminan o de otra manera se alterar para proporcionar la actividad funcional deseada tal como vida media del suero, o función efectora. Muchos de tales anticuerpos se describen en Kuby, J. Immunology, 3rd ed., .H. Freeman and Co. (1997). Los anticuerpos apropiados para expresarse en una célula eucariótica usando el método de la invención incluyen las cinco clases distintas de anticuerpo: IgA, IgD, IgG, IgE, e IgM. Aunque todas las cinco clases están dentro del alcance de la presente invención, la siguiente discusión se dirige generalmente a la clase de moléculas IgG. Alguien de habilidad ordinaria en la técnica podrá fácilmente adaptar la siguiente discusión a las otras clases de inmunoglobulinas. Las moléculas IgG típicamente comprenden dos cadenas ligeras de anticuerpo idénticas de un peso molecular de aproximadamente 23 kD cada una, y dos cadenas pesadas de anticuerpo idénticas de un peso molecular de 53-70 kD cada una. Los enlaces disulfuro entre cadenas, en una configuración como se muestra en la Fig. 2, une las cuatro cadenas. Además, las cadenas tanto ligera como pesadas del anticuerpo se dividen en regiones de homología funcional y estructural . Los términos "constante" y "variable" e usan funcionalmente. A este respecto, se apreciará por alguien de habilidad ordinaria en la técnica que los dominios variables de las cadenas tanto ligera (VL) como pesada (VH) del anticuerpo determinar el reconocimiento y especificidad del antígeno. A la inversa, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3)- confieren propiedades biológicas importantes tales como secreción, movilidad transplacental, enlace del receptor Fc, enlace del complemento, y otras funciones efectoras. Las cadenas ligeras se clasifican como cadenas ya sea kappa o lambda. Cada clase de cadena pesada puede enlazarse con cualquier cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligera y pesada se enlazan covalentemente una a la otra, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas se enlazan una a la otra por ligaduras de disulfuro covalentes cuando las inmunoglobulinas se generan ya sea por hibridomas, células B, o células hospederas producidas por ingeniería genética (ver Fig. 2) . En la terminal N es una región variables y en la terminal C es una región constante. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o epsilon, con algunas subclases entre estas. Es la naturaleza de esta cadena la que determina la "clase" del anticuerpo como IgA, IgD, IgE IgG, o IgM. Las subclases de inmunoglobulina (isotipos) por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4, IgAl son bien caracterizadas y se conocen por conferir especialización funcional. Se entiende que el primer exón o el segundo exón de la presente invención pueden usarse para codificar alternativamente la cadena del anticuerpo ya sea ligera o pesada de manera que el vector resultante codifica una cadena ligera y una cadena pesada. El sitio de enlace al antígeno se define por tres regiones complementariamente determinantes (CDRs) en cada una de las cadenas VH y VL. Los seis CDR presentes en cada anticuerpo monoméricos son secuencias no contiguas, cortas, de aminoácidos que se colocan específicamente para formar el sitio de enlace al antígeno como el anticuerpo asume su configuración tridimensional en un ambiente acuoso. El resto de los dominios de variable pesada y ligera muestra menos variabilidad molecular en la secuencia de aminoácido y se llaman las regiones de columna. Las regiones de estructura adoptan ampliamente una conformación de lámina beta y los CDR forman rizos conectados a, y en algunos casos que forman parte de, la estructura de lámina beta. De esta manera, las regiones de estructura actúan para formar una andamio que se proporciona para colocar los seis CDR en la orientación correcta por interacciones no covalentes, entre cadenas. El sitio de enlace del antígeno formado al colocar los CDR define una superficie complementaria al epítopo en el antígeno inmunoreactivo. Esta superficie complementaria promueve el enlace no covalente del anticuerpo al epítopo de antígeno inmunoreactivo. Los fragmentos de anticuerpo son apropiados para la expresión usando los vectores de empalme alternativos o los casetes de expresión o constructos de la invención. Tales fragmentos son cualquier porción o porciones de un anticuerpo deseado, y pueden incluir, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, y fragmentos Fc. Además, los fragmentos de anticuerpo pueden incluir anticuerpos de cadena sencilla u otros polipéptidos derivados de anticuerpo que comprenden menos de la proteína de anticuerpo tetramérica, de longitud completa.

Se apreciará por alguien de experiencia ordinaria en la - .. _técnica,_que„los anticuerpos expresados que usan los vectores de empalme alternativos o casetes de expresión o constructos de la invención pueden comprender cualquier tipo de región 5 variable que proporciona la asociación del anticuerpo con el antígeno seleccionado. En esta consideración, la región variable puede comprender o se deriva de cualquier tipo de mamífero que se puede inducir para soportar una respuesta humoral y generar inmunoglobulinas contra el antígeno 0 deseado. Como tal, la región variable de los anticuerpos modificados puede ser, por ejemplo, de murino, primate no humano o humano. Cuando se deriva de una especie diferente, comúnmente una región variable de murino fusionada a regiones constantes humanas, el anticuerpo es referido como un 5 anticuerpo quimérico. En modalidades preferidas, ambas regiones la variable y la constante de los anticuerpos son humanas. En otras modalidades seleccionadas las regiones variables de anticuerpos compatibles (usualmente derivados de una fuente no humana) puede ser diseñada o adaptada 0 específicamente para aumentar las propiedades de enlazamiento (por ejemplo, maduración de afinidad) o reducir la inmunogenicidad de la molécula. En este respecto, las regiones variables útiles en la presente invención pueden ser humanizadas o de otra manera alteradas a través de la inclusión del ADN importado o secuencias de aminoácido. Tales anticuerpos humanos, que tienen los CDR injertados de otras especies, son referidos como anticuerpos humanizados. Además, las regiones variables pueden ser diseñadas, o sintéticas, como se describió previamente . Cualquiera de los anticuerpos anteriores pueden ser además modificados para tener sitios de glicosilación alterados, sitios apropiados para pegilación, y/o sitios que confieren una función de efector alterada al anticuerpo, por ejemplo, enlazamiento de complemento alterado, enlazamiento de receptor de Fc alterado, y/o actividad de interacción de célula inmune alterada. Para los propósitos de esta invención, se pueden emplear numerosos sistemas de vector de expresión de empalme alternativos. Por ejemplo, el vector de empalme alternativo o cásete de expresión o constructo de la invención puede contener elementos de ADN los cuales se derivan de virus animales tales como un virus de papiloma humano o de bovino, un virus de polioma, un adenovirus, un virus de vaccinia, un baculovirus, un retrovirus (por ejemplo, VIH), un citomegalovirus, o un virus SV40. Adicionalmente, las células que pueden integrar el vector de empalme alternativo o cásete de expresión o constructo dentro de sus cromosomas o mantienen el vector o cásete de expresión o constructo episomalmente se puede seleccionar por introducción de uno o más marcadores que permiten la selección de las células hospedadoras transfectadas. El gen marcador seleccionable puede ser ligado directamente a las secuencias de ADN para ser expresado, o introducido en la misma célula por cotransfección. Las células hospedadora apropiadas para introducción de los vectores o casetes de expresión o constructos de la invención se discute a continuación. 3. Expresión de Multímeros de Polipéptidos en Células Eucarióticas en Cultivo. El vector de empalme alternativo o cásete de expresión o constructo de la invención puede ser introducido dentro de una célula hospedera apropiada usando tecnologías que son bien conocidas por uno de experiencia ordinaria en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, transfección (que incluye electroforesis y electroporación) , fusión de protoplasto, precipitación de fosfato de calcio, fusión de célula con ADN envuelto, microinyección, e infección con virus (ver, por ejemplo, Ridgway, A. A. G. ""Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470- 472 Vectors, Rodríguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988) . Como se mencionó anteriormente, los vectores o casetes de expresión o constructos de la invención pueden ser integrados dentro del cromosoma de la célula hospedera, mantenida episomalmente, o expresada transitoriamente. Las células transformadas crecen bajo condiciones apropiadas para la producción de los polipéptidos codificados que ahí contiene, por ejemplo, el anticuerpo, cadenas ligeras o pesadas_, y_ ensayadas para síntesis de polipéptidos. Las técnicas ensayadas para identificación y cuantificación de síntesis de polipéptidos incluyen, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , transferencia de energía ' de resonancia de fluorescencia (FRET) , radioinmunoensayo (RÍA) , análisis, clasificador de células activada de fluorescencia (FACS) , e inmunohistoquímica. La línea de célula hospedera usada para la expresión de proteína es preferiblemente de origen eucariótico, por ejemplo de origen mamífero o, alternativamente, una levadura o insecto. Ejemplarmente las líneas de célula hospedera incluyen, por ejemplo, líneas de Ovario de Hámster Chinos (CHO) , HeLA (carcinoma cervical humano) , CVl (línea de riñ n de mono) , COS (un derivado de CVl con antígeno SV40 T) , R1610 (fibroblasto de hámster chino) , BALBC/3T3 (fibroblasto de ratón) , HAK (línea de riñon de hámster) , SP2/0 (mieloma de ratón) , NSO (mieloma) , (células endoteliales de bovino) , RAJI (linfocito humano), 293 (riñon humano), PER.C6 (humano), Spodoptera frugiperda (Sf9) (insecto) , Tricoplusia ni (Tn. TnHigh-Five) (insecto) , Bombyx mori (BMN) (insecto) , Saccharomyces (levadura) , Schizosaccharomyces (levadura) , y Pichia (levadura) . Las líneas de célula hospedera comúnmente están disponibles de servicios comerciales, tales como la American Tissue Culture Collection o de literatura publicada.

La producción in vi tro permite el escalamiento para dar cantidades grandes del polipéptido deseado producido usando el sistema de empalme alternativo de la presente invención, preferiblemente un anticuerpo. Las técnicas para cultivo eucariótico, por ejemplo, cultivo de células de mamífero o levadura bajo condiciones de cultivo de tejido son bien conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica e incluyen cultivo de suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor de transporte aéreo o en un reactor de agitador continuo, o cultivo de células inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras de hueco, microcápsulas, en microperlas de agarosa, cartuchos de cerámica o en termentadores. Para aislamiento y recuperación de las proteínas multiméricas producidas de acuerdo con la invención, en particular con respecto a anticuerpos, las proteínas (por ejemplo, inmunoglobulinas) en los sobrenadantes del cultivo primero pueden ser concentradas, por ejemplo, por precipitación con sulfato de amonio, diálisis contra material higroscópico tal como PEG y filtración a través de membranas selectivas. Si es necesario y/o deseado, las soluciones concentradas de las proteínas multiméricas (por ejemplo, anticuerpos multivalentes) se purifican por los métodos de cromatografía tradicionales, por ejemplo, filtración de gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre celulosa DEAE, o cromatografía de inmunoafinidad (por ejemplo, Proteína A o Proteína G) . La invención además contempla la expresión de cualquier secuencia de cadena ligera y pesada de anticuerpo la cual cuando se expresa usando el sistema de empalme alternativo de la invención, se asocia para producir un anticuerpo funcional, por ejemplo, uno que enlaza específicamente a un antígeno objetivo, tal como un antígeno asociado a tumor, patógeno, o el mismo antígeno o tienen una función de efector deseada. Importantemente, el número de copias de los genes de cadena ligera y pesada de anticuerpo en el constructo de empalme alternativamente se puede seleccionar tal que se obtenga la relación preferida de cadena ligera/pesada. En ciertas modalidades, la cadena ligera se expresa en niveles los cuales comúnmente están en el rango de alrededor de 10/1, alrededor de 5/1, alrededor de 3/1 o alrededor de l/l relativo a la cadena pesada. En modalidades relacionadas los polipéptidos ligeros y pesados se expresan en una relación de alrededor de 20:1 hasta alrededor de 1:20, alrededor de 15:1 hasta alrededor de 1:15, alrededor de 12:1 hasta alrededor de 1:12, alrededor de 10:1 hasta alrededor de 1:10, alrededor de 9:1 hasta alrededor de 1:9, alrededor de 8:1 hasta alrededor de 1:8, alrededor de 7:1 hasta alrededor de 1:7, alrededor de 6:1 hasta alrededor de 1:6, alrededor de 5:1 hasta alrededor de 1:5, alrededor de 4:1 hasta alrededor de 1:4, alrededor de 3:1 hasta alrededor de 1:3, alrededor de 2:1 hasta alrededor de 1:2, o alrededor de 1:1. En modalidades particulares, los polipéptidos ligeros y pesados se expresan en una relación de alrededor de 20:1, alrededor de 19:1, alrededor de 18:1, alrededor de 17:1, alrededor de 16:1, alrededor de 15:1, alrededor de 14:1, alrededor de 13:1, alrededor de 12:1, alrededor de 11:1, alrededor de 10:1, alrededor de 9:1, alrededor de 8:1, alrededor de 7:1, alrededor de 6:1, alrededor de 5:1, alrededor de 4:1, alrededor de 3:1, alrededor de 2:1, alrededor de 1:1, alrededor de 1:2, alrededor de 1:3, alrededor de 1:4, alrededor de 1:5, alrededor de 1:6, alrededor de 1:7, alrededor de 1:8, alrededor de 1:9, alrededor de 1:10, alrededor de 1:11, alrededor de 1:12, alrededor de 1:13, alrededor de 1:14, alrededor de 1:15, alrededor de 1:16, alrededor de 1:17, alrededor de 1:18, alrededor de 1:19 y/o alrededor de 1:20. La invención también proporciona un método para selección de cualquier relación deseada por vectores de separación por exclusión que tienen sitios de empalme diferentes tales que, por ejemplo, en una línea de célula dada, la relación deseada se logra (ver, por ejemplo, Ejemplo 2) . Esto es especialmente crítico cuando se expresa eficientemente un anticuerpo debido a que se ha observado que ciertos niveles de expresión de la cadena ligera pueden ser instrumentales en dirección al ensamble apropiado de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos, y la cadena pesada impar excesiva puede inducir toxicidad de la célula. Más aún, la cadena ligera también es crítica en dirección de la multiplicación de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo ensambladas para producir un anticuerpo que enlaza antígeno funcional en el retículo endoplásmico. En consecuencia, en ciertas modalidades, la cadena ligera de anticuerpo comúnmente se expresa desde alrededor de 10/1 hasta l/l relativo a la cadena pesada de anticuerpo (ejemplarmente las relaciones de cadena ligera/pesada incluyen, pero no se limitan a, alrededor de 10/1, 9/1, 8/1, 7/1, 6/1, 5/1, 4/1, 3/1, 2/1 y 1/1) . En ciertas modalidades, un anticuerpo que se expresa de acuerdo con el sistema de expresión sujeto puede ser específico a cualquier antígeno deseado. Preferiblemente, el anticuerpo será un anticuerpo funcional que produzca un efecto terapéutico, tal como un anticuerpo útil para tratar una enfermedad autoinmune, inflamatoria, infecciosa, alérgica o neoplástica. El anticuerpo se puede combinar con otros agentes terapéuticos para efectos sinérgicos. Por ejemplo, el anticuerpo puede estar combinado con, por ejemplo, otros anticuerpos, moléculas pequeñas, o una fuente radioactiva para uso como un agente quimioterapéutico de cáncer.

En ciertas modalidades, los vectores de empalme alterna iYOS o casetes de expresión o constructos de la presente invención se usan en combinación con otros vectores o casetes de expresión o constructos que no dependen intencionalmente del empalme alternativo para expresar polipéptidos múltiples. 4. Composiciones Farmacéuticas . La invención también proporciona, inter alia, composiciones terapéuticas que comprenden proteínas multiméricas expresadas usando métodos y/o vectores o casetes de expresión o constructos de la presente invención para el tratamiento de un sujeto o paciente en necesidad de este. Las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar un sujeto (esto es, un paciente) en necesidad de éste, vía administración de polipéptidos terapéuticos producidos por los métodos de la invención o por terapia de genes que comprende el vector de empalme alternativo o cásete de expresión o constructo de la invención. Un sujeto en necesidad de esto es un sujeto que sufre, o está en riesgo de sufrir, de una enfermedad, trastorno o condición que se puede tratar o prevenir mediante la administración de una composición de esta invención. Ese sujeto puede ser un sujeto mamífero. Un sujeto preferido es un sujeto humano.

En ciertas modalidades, las composiciones terapéuticas -i-no-luyen las —proteínas multiméricas en un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades preferidas, las composiciones terapéuticas incluyen por lo menos un anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo producido de acuerdo con la invención en un portador farmacéuticamente aceptable. Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a por lo menos un componente de una preparación farmacéutica que normalmente se usa para administración de ingredientes activos. Como tal, un portador puede contener cualquier excipiente farmacéutico usado en la técnica y cualquier forma de vehículo para administración. Las composiciones pueden ser, por ejemplo, soluciones inyectables, suspensiones acuosas o soluciones, suspensiones no acuosas o soluciones, formulaciones orales sólidas y líquidas, ungüentos, geles, pomadas, parches intradermales, cremas, lociones, tabletas, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida, y similares. Los excipientes adicionales puede incluir, por ejemplo, colorantes, agentes de modificación de sabor, ayudantes de solubilidad, agentes de suspensión, agentes de compresión, recubrimientos entéricos, ayudantes de liberación sostenida, y similares. Los agentes de la invención a menudo se administran como composiciones farmacéuticas que comprenden un agente terapéutico activo y una variedad de otros componentes farmacéuticamente aceptables. Ver Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Pubíishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)). La forma preferida depende del modo proyectado de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones también pueden incluir, dependiendo de la formulación portadores o diluentes no tóxicos farmacéuticamente aceptable deseados, los cuales se definen como vehículos usados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para administración a animales o humanos. El diluente se selecciona tal que no afecte la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluentes incluyen, pero no se limitan a, agua destilada, solución salina amortiguadora de fosfato fisiológica, soluciones de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank. Además, la composición farmacéutica o formulación también puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos. Comúnmente, las composiciones se administran en cantidades terapéuticamente efectivas, las cuales son una cantidad suficiente para producir un efecto benéfico preferiblemente médicamente detectable en un sujeto o paciente que sufre o está en riesgo de sufrir de una enfermedad, trastorno o condición susceptible para tratamiento con las composiciones de la invención. Las proteínas multiméricas producidas de acuerdo con la presente invención se pueden administrar en la forma de una inyección o preparación de implante, la cual se puede formular _en una manera tal que permita una liberación sostenida del ingrediente activo. En una modalidad preferida, la proteína multimérica es un anticuerpo. Una composición ejemplar comprende anticuerpo monoclonal en 5 mg/mL, formulada en solución amortiguadora acuosa que consiste de 50 mM de L-histidina, 150 mM de NaCl , ajustada a pH de 6.0 con HCl. Comúnmente, las composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas apropiadas para solución, o suspensión en vehículos líquidos antes de inyección. La preparación también puede ser emulsificada o encapsulada en liposomas o partículas micro tales como polilacturo, poliglicólido, o copolímero para efecto adyuvante mejorado, como se discutió anteriormente (ver, Langer, Science 249: 1527 (1990) y Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28:97 (1997)).

. Métodos Profilácticos y Terapéuticos. En ciertas modalidades, la presente invención se dirige a la producción de proteínas apropiadas para la prevención, mejoramiento o tratamiento de cualquier enfermedad, trastorno o condición. Los trastornos - o enfermedades incluyen cáncer, condiciones precancerosas, y enfermedad o condición genética tal como distrofia muscular. Una enfermedad, un trastorno o •condición susceptible de tratar con las proteínas producidas por los métodos de la presente invención incluye condiciones tales como enfermedades genéticas (esto es, condición de enfermedad que es atribuible a uno o más defectos genéticos) , patologías adquiridas (esto es, una condición patológica que no es atribuible a un defecto de nacimiento) y procesos profilácticos (esto es, prevención de una enfermedad o de una condición médica no deseada) . Una patología adquirida puede ser una enfermedad o síndrome manifestado por un' estado biológico anormal, fisiológico, bioquímico, celular, estructural o molecular. Una enfermedad, un trastorno o una condición susceptible de ser tratada con las proteínas producidas por los métodos de la presente invención puede ser una infección, incluyendo infección viral y bacterial, una enfermedad o trastorno hiperproliferativo, que incluyen cáncer o condiciones precancerosas, trastornos inmunes, tales como artritis reumatoide, condiciones de inmunodeficiencia genética, tales como síndrome de hiper-IgM, condiciones de inmunodeficiencia primaria o combinada, que incluyen condiciones caracterizadas por neutropenia, además de trastornos neurológicos, trastornos cardiovasculares, tales como isquemia, y trastornos endocrinos, tales como diabetes, trastornos de tiroides e infertilidad.

Una enfermedad, un trastorno o una condición susceptible de ser tratada con las proteínas producidas por los métodos de la presente invención pueden ser enfermedades o trastornos hiperproliferativos, que incluyen cáncer. Las enfermedades o trastornos pueden involucrar cualquier célula, tejido u órgano, incluyendo cerebro, pulmón, células escamosas, vejiga, estómago, páncreas, pecho, cabeza, cuello, hígado, riñon, ovario, próstata, colon, recto, esófago, nasofaringe, tiroides y piel. El cáncer puede ser melanoma, linfoma, leucemia, mieloma múltiple, sarcoma o carcinoma. El cáncer puede ser tumores sólidos o puede involucrar un fluido corporal tal como sangre. Una enfermedad, un trastorno o una condición susceptible de tratar con las proteínas producidas por los métodos de la presente invención pueden ser enfermedades heredadas genéticamente, tales como enfermedad de Huntington, trastorno bipolar, enfermedad de Parkinson, Síndrome de Túnel del Carpió, fibrosis quística, Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, esclerosis múltiple o Distrofia Muscular de Duchenne . Una enfermedad, un trastorno o una condición susceptible de tratar con las proteínas producidas por los métodos de la presente invención puede ser una enfermedad infecciosa, tal como tuberculosis, malaria, fiebre amarilla, o una enfermedad provocada por infección por virus de hepatitis B, virus de herpes, virus_dg_ humana, etc . En modalidades particulares, la presente invención también se dirige, inter alia, a la producción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos apropiados para la prevención o tratamiento de un trastorno o enfermedad, por ejemplo, un trastorno o enfermedad del sistema inmune. En consecuencia, en ciertas modalidades, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la presente invención son útiles en la prevención o tratamiento de trastornos inmunes que incluyen, por ejemplo, glomerulonefritis, escleroma, cirrosis, esclerosis múltiple, nefritis de lupus, arterosclerosis, enfermedades de intestino inflamado, alergias o artritis reumatoide. En otra modalidad, los anticuerpo o fragmentos que enlazan antígeno de la invención se pueden usar para tratar o prevenir enfermedades inflamatorias, incluyendo, pero no limitadas a Alzheimer, asma severo, dermatitis atópica, caquexia, isquemia CHF, restinosis coronaria, enfermedad de Crohn, neuropatía diabética, linfoma, soriasis, f brosis/radiación inducida, artritis juvenil, apoplejía, inflamación del cerebro o sistema nervioso central debido a trauma, y colitis .ulcerativa. Otros trastornos inflamatorios los cuales se -pueden prevenir o tratar con los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos producidos de acuerdo con la invención incluyen inflamación debida a transplante de córnea, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hepatitis C, mieloma múltiple, y osteoartritis. En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos que enlazan antígenos de la invención se pueden usar para prevenir o tratar neoplasia, que incluye, pero no se limita a cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, sarcoma de Kaposi, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de estómago, leucemia/linfoma, y mieloma múltiple. Las condiciones de neoplasia adicional incluyen, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer endometrial, cáncer de riñon, cáncer de pulmón de célula no escamosa, y cáncer de próstata.

En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden usar para prevenir o tratar trastornos neurodegenerativos, que incluyen, pero no se limitan a Alzheimer, apoplejía, cerebro traumático o lesiones del sistema nervioso central. Los trastornos neurodegenerativos adicionales incluyen enfermedad de ALS/de neuronas motoras, neuropatía periférica diabética, retinopatía diabética, enfermedad de Huntington, degeneración macular, y enfermedad de Parkinson. En aplicaciones clínicas, un sujeto se identifica como que tiene o está en riesgo de desarrollar una de las condiciones antes mencionadas por exhibición de por lo menos un signo o síntoma de la enfermedad o trastorno. Por lo menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de estos de la invención o composiciones que comprenden por lo menos un anticuerpo o fragmento que enlaza antígeno de estos de la invención se administra en una cantidad suficiente para tratar por lo menos un síntoma de una enfermedad o trastorno, por ejemplo, como se mencionó anteriormente. En consecuencia, una proteína de la invención es apropiada para la administración como un reactivo terapéutico para un sujeto bajo condiciones que generan una respuesta terapéutica benéfica en un sujeto, por ejemplo, para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno, como por ejemplo, como lo descrito en la presente. Los agentes terapéuticos de la invención comúnmente son sustancialmente puros de contaminantes indeseados. Esto significa que un agente comúnmente es por lo menos alrededor de 50% p/p (peso/peso) de pureza, además de que está sustancialmente libre de proteínas y contaminantes que interfiere. Algunas veces lo agentes son por lo menos alrededor de 80% p/p de pureza y, más preferiblemente por lo menos 90% o alrededor de 95% p/p de pureza. Sin embargo, usando técnicas de purificación de proteína convencional, por ejemplo, como se describe en la presente, se pueden obtener los péptidos homogéneos de por lo menos 99% p/p.

Los métodos se pueden usar en sujetos asmáticos y en aquellos que comúnmente muestran síntomas de enfermedad. Los anticuerpos usados en tales métodos pueden ser anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o no humanos, o fragmentos de estos (por ejemplo, fragmentos que enlazan antígeno) y pueden ser monoclonales o policlonales. •En otra modalidad, la invención caracteriza la administración de un anticuerpo producido de acuerdo con un método de- la invención, con un portador farmacéutico como una composición farmacéutica. Alternativamente, el anticuerpo se puede administrar a un sujeto por administración de un polinucleótido que codifica por lo menos una cadena de anticuerpo. El polinucleótido se expresa para producir la cadena de anticuerpo en el sujeto. En consecuencia, el polinucleótido codifica las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. El polinucleótido se expresa para producir las cadenas pesadas y ligeras en el sujeto. En modalidades ejemplares, el sujeto se supervisa para el nivel de anticuerpos administrado en la sangre del sujeto. 6. Administración de genes La presente invención también abarca la terapia génica por medio de la cual los ácidos nucleicos que comprenden al vector de empalme alternativo se proporcionan a un paciente ' que requiere de los mismos. Pueden tratarse las. mismas enfermedades, trastornos y condiciones, pueden mejorarse o prevenirse como se describe anteriormente para el tratamiento con polipéptidos producido mediante los métodos de la invención. Se describen varios métodos para transferir o administrar ADN a las células para la expresión del gen producto de la proteína, llamada en otra parte, terapia génica, como se describe en Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang, Crit. Rev. Biotechn. 12(4): 335-356 (1992) que está en la presente incorporada mediante la referencia. La terapia génica incluye la incorporación de secuencias de ADN en células somáticas o células de línea germinal para el uso ya sea ex vivo o en la terapia in vivo. La terapia génica funciona para reemplazar los genes, aumentar la función del gen normal o anormal, y combatir enfermedades infecciosas y otras patologías . Las estrategias para tratar estos problemas médicos con la terapia génica incluyen estrategias terapéuticas tales como la identificación del gen defectuoso y agregar después un gen funcional para reemplazar la función del gen defectuoso o para aumentar ligeramente un gen funcional; o estrategias profilácticas, tales como agregar un gen para la proteína del producto que tratará la condición o que hará al tejido u órgano más susceptible a un régimen del tratamiento. Alternativamente, pueden transferirse genes que confieren inmunidad, al proporcionar anticuerpos contra un antígeno particular en el vector de empalme alternativo de la invención. Los métodos para transferir genes en la terapia génica caen en tres amplias categorías físicas (por ejemplo, electroporación, transferencia de genes directa y bombardeo de partículas) , químico (portadores con base lípida u otros vectores no virales) y biológico (vector derivado a partir de virus y captación del receptor) . Por ejemplo, pueden usarse los vectores no virales que incluyen liposomas que forman complejos con el ADN. Tales complejos de liposomas/ADN pueden inyectarse directamente intravenosamente en el paciente. Se cree que los complejos de liposomas/AD? se concentran en el hígado donde liberan el AD? a los macrófagos y células de Kupffer. Estas células tienen un periodo de vida amplio, proporcionando de esta manera, una expresión a largo plazo del AD? liberado. Adicionalment-e, vectores o el "AD?" descubierto del gen pueden inyectarse directamente, en el órgano deseado, tejido o tumor para la liberación dirigida del AD? terapéutica. Las metodologías de terapia génica tambi n pueden ser descritas mediante el sitio de liberación. El modo fundamental para los genes de liberación incluye la transferencia del gen ex vivo, transferencia del gen in vivo, y transferencia del gen in vi tro. En la transferencia del gen ex vivo, las células se toman a partir del paciente y crecimiento en el cultivo celular. El ADN se transfecta en las células, las células transfectadas se expanden en número y después se reimplantan en el paciente . En la transferencia del gen in vi tro, el método es el mismo, pero las células transfectadas son células que crecen en el cultivo, tales como las células de cultivo de tejido, y no las células del paciente individual . En la transferencia del gen in vivo involucra introducir el ADN en las células del paciente cuando las células se encuentran dentro del paciente. Los métodos incluyen usar transferencia del gen mediado viralmente usando un virus no infeccioso para la liberación del gen en el paciente o inyectando el ADN descubierto en un sitio en el paciente y el AD? se absorbe . mediante un porcentaje de células en las que el gen de la proteína producto se expresa. Adicionalmente, los otros métodos descritos en la presente, tales como los métodos mecánicos o químicos pueden usarse para la inserción in vivo de los ácidos nucleicos de la invención. Los métodos mecánicos de suministro de ADN incluyen la inyección directa de AD?, tales como la microinyección de AD? en las células somáticas o germinales, las partículas revestidas con AD? suministrado neumáticamente, tales como las partículas doradas usadas en una "pistola de genes", y metodologías químicas inorgánicas tales como la transfección de fosfato de calcio. Otro método, la terapia génica mediada por ligandos involucra formar complejos de ADN con los ligandos específicos para formar conjugados de ADN-ligando, para el ADN a una célula específica o tejido. Los métodos químicos de terapia génica pueden involucrar un químico para enlazar a la célula y/o transportar el ADN a través de la membrana celular, tales como las vesículas lípidas fusogénicas tales como los liposomas u otras vesículas para la fusión de la membrana, partículas lípidas de J&DN que incorporan lípidos catiónicos tales como la lipofectina, o transferencia mediada por polilisina de ADN. Las lipofectinas o citofectinas, iones positivos basados en lípidos que se enlazan al AD? cargado negativamente, forman un complejo que puede atravesar la membrana celular y proporcionar el AD? en el interior de la célula. Otro método químico usa endocitosis basada en el receptor, que involucra enlazar a un ligando específico a un receptor de la superficie celular envolviéndolo y transportándolo a- través de la membrana celular. El ligando enlaza al AD? y el complejo completo se transporta en la célula. El complejo de gen de ligando se inyecta en la circulación sanguínea y entonces a las células objetivo que tienen el receptor que enlazará específicamente al ligando y transportarán al complejo de ADN-ligando a la célula. , Muchas metodologías de terapia génica emplean vectores virales para insertar los genes en las células y puedan diseñarse genéticamente para comprender el vector de empalme alternativo de la presente invención. Por ejemplo, los vectores del retrovirus alterados se han usado en los métodos ex vivo para introducir genes en los linfocitos, hepatocitos, células epidérmicas, u otras células somáticas periféricas y que se infiltran en el tumor. Estas células alteradas se introducen entonces en el paciente para proporcionar el producto del gen del ADN insertado. También se han usado vectores virales para insertar genes en células usando protocolos in vivo (ver por ejemplo, Eck, SX. y J.M. ilson, "Gene Based Therapy", Goodman & Gilman 's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9 edición, pp. 77-101, McGraw-Hill, New York (1996)). Para dirigir . la expresión específica de tejidos de * genes extranjeros, pueden usarse promotores o elementos regulatorios que actúan en cis que se conocen por ser un tejido específico. Alternativamente, esto puede lograrse usando la liberación in situ de ADN o vectores virales a los sitios anatómicos específicos in vivo. Por ejemplo, la transferencia del gen a los vasos sanguíneos in vivo se logró implantando células endoteliales transducidas in vi tro en los sitios seleccionados en las paredes arteriales . El virus infecta a las células circundantes, que expresan también al producto del gen. Un vector viral puede ser liberado directamente al sitio in vivo, mediante un catéter, por ejemplo, permitiendo infectar únicamente a ciertas áreas por el virus, y proporcionando la expresión del gen en el sitio específico a largo plazo. La transferencia del gen in vivo usando vectores del retrovirus también se ha demostrado en el tejido mamario y en el tejido hepático mediante la inyección del virus alterado en los vasos sanguíneos que llevan a los órganos . Los vectores virales que se han usado para los protocolos de terapia génica incluyen, pero no se limitan a, retrovirus, otros virus de ARN tales como poliovirus o virus de Sindbis, adenovirus, virus asociados al adeno, virus del herpes, SV 40, vaccinia y otros virus de ADN. Los vectores retrovirales de murino de replicación defectuosa y vectores adenovirales son los vectores de transferencia de gen ampliamente utilizados. Los retrovirus de leucemia de murino están compuestos de una sola hebra de ARN que forma complejos con una proteína del centro nuclear y enzimas de polimerasa (pol) , encajadas por un centro de la proteína (gag) y rodeada por un envolvente (env) de glicoproteína (env) que determina el rango del hospedador. La estructura genómica de los retrovirus incluyen los genes gag, pol y env adjuntados por las repeticiones 5 ' y 3 ' largas terminales (LTR) . Los sistemas del vector retroviral aprovechan el hecho de que un vector mínimo que contiene las LTR en 5' y 3 ' y la señal de empaquetamiento son suficientes para permitir el empaquetamiento del vector, infección e integración en las células, objetivo en. las que proporcionan las proteínas estructurales virales se suministran en trans en la línea celular de empaquetamiento. Las ventajas fundamentales de vectores retrovirales para la transferencia del gen incluyen lá infección eficiente y expresión del gen en la mayoría de los tipos celulares, la integración precisa de la copia simple del vector en el ADN cromosomático de la célula objetivo y la fácil manipulación del genoma retroviral. El adenovirus está compuesto de ADN de hebra doble lineal que forma complejos con las proteínas de núcleo y rodeadas con proteínas de cápsida. Los adelantos en la virología molecular han -encauzado al aprovechamiento de la biología de estos organismos para crear los vectores capaces de transducir secuencias genéticas novedosas en las células objetivo in vivo . Los vectores basados en adenovirus expresarán los el péptidos del producto de gen a niveles altos . Los vectores adenovirales tienen altas eficiencias de infectividad, incluso con concentraciones bajas del virus. Adicionalmente, el virus es totalmente infeccioso como un virión libre celular de tal modo que la producción de líneas celulares no sea necesaria. Otra ventaja potencial de los vectores adenovirales es la capacidad para lograr una expresión a largo plazo de genes heteról-ogos in vivo en algunos tipos celulares.

Los vectores adenovirales se derivan de la replicación incompetente de adenovirus que contienen típicamente una supresión en el gen El . Tales vectores son transfectados en las células, tales como la línea celular de riñon embrionario humano 293, que permite la replicación de los adenovirus eliminados El. Después de la transfección, el vector adenoviral se permite replicar en las células auxiliadoras especializadas y forman partículas infecciosas que son reunidas y purificadas. Estas partículas son capaces de infectar un amplio rango de células hospederas para la expresión del transgen, por ejemplo, el vector de empalme alternativo de la presente invención, pero no es capaz de replicar sin la adición de factores virales adicionales. Para reducir la probabilidad de adenovirus competentes con la replicación que contamina la preparación adenoviral, pueden usarse vectores adenovirales con supresiones o mutaciones adicionales en el genoma viral, tales como los vectores eliminados E1/E3 o "aprensivos" que han tenido todos o la mayoría de los genes virales inactivados. Alternativamente, puede usarse un vector adenoviral que contiene un gen pIX de proteína invertida, tal como se describe en la Solicitud U.S. Nos. 60/621, 782 y 60/631,246. Se ha encontrado que al inyectar el ADN del plásmido en células del músculo produce un alto porcentaje de células que son transfectadas y que han sostenido la expresión de genes marcadores . El ADN del plásmido puede o no puede integrarse en el genoma de las células . La no integración del ADN transfectado permitiría la transfección y expresión del gen de la proteína producto en tejidos no proliferativos terminalmente diferenciados durante un período prolongado de tiempo sin temor a inserciones mutacionales, supresiones o alteraciones en el genoma mitocondrial o celular. A largo plazo, pero no necesariamente permanente, la transferencia de genes terapéuticos en las células específicas puede proporcionar tratamientos para las enfermedades genéticas o para el uso profiláctico. El ADN podría reinyectarse periódicamente para mantener el nivel del producto del gen sin mutaciones que ocurren en los genomas de las células del receptor. La no integración de ADNs exógenos puede permitir la presencia de varios constructos de ADN exógenos diferentes dentro de una célula con todos los constructos que expresan varios o múltiples productos del gen. Los métodos de transferencia de gen mediados por partículas se usaron primero en la transformación del tejido de las plantas. Con un dispositivo de bombardeo de partículas, o "pistola de genes", se genera una fuerza motriz para acelerar las partículas de alta densidad revestidas con ADN (tales como el oro o tungsteno) a una velocidad alta que permita la penetración de los órganos objetivo, tejidos o células. El bombardeo de la partículas puede usarse en los sistemas in vi tro, o con las técnicas ex vivo o in vivo para introducir ADN en las células, tejidos o órganos. La electroporación para la transferencia del gen usa una corriente eléctrica para elaborar células o tejidos susceptibles a la • transferencia del gen mediado por la electroporación. Se usa un impulso eléctrico breve con una fuerza de campo dada para aumentar la permeabilidad de una membrana de tal manera que las moléculas de ADN puedan penetrar en las células . Esta técnica puede usarse en los sistemas in vitro, o con las técnicas ex vivo o in vivo para introducir el ADN en las células, tejidos u órganos. La transferencia del gen mediado por el portador in vivo puede usarse para transfectar el ADN extranjero en las células. El complejo de ADN portador puede introducirse adecuadamente en fluidos del cuerpo o en el torrente sanguíneo y después al sitio dirigido específicamente al tejido u órgano objetivos en el cuerpo. Pueden usarse tanto los liposomas como los policationes tales como la polilisina, lipofectinas o citofectinas . Los liposomas pueden desarrollarse en una célula específica u órgano específico y así el ADN extranjero dirigido por los liposomas absorberán las células objetivo. La inyección de inmunoliposomas que se dirigen a un receptor específico en ciertas células puede usarse como un método adecuado para insertar el ADN- en las células que llevan el receptor. Otro sistema portador que se ha usado es el sistema conjugado de asialoglicoproteína/polilisina para llevar el ADN a los hepatocitos para la transferencia del gen in vivo. El ADN transfectado también puede formarse con complejos junto con otros tipos de portadores para que el ADN se transporte a la célula del receptor y después residir en el citoplasma o en el nucleoplasma. El ADN puede acoplarse para transportar las proteínas nucleares en los complejos de la vesícula específicamente diseñados y transportarse directamente en el núcleo. Por ejemplo, las células de tumor removidas de un paciente pueden ser transfectadas con un vector de la presente invención que expresa a los polipéptidos del antitumor, y reintroducirlos al paciente. Las células de tumor * transfectadas producen los niveles de la proteína en el paciente que inhiben el crecimiento del tumor. Los pacientes pueden ser los animales humanos o no humanos . Las células también pueden ser transfectadas mediante métodos físicos o químicos conocidos en el arte tales como la electroporación, ionoporación, o vía una "arma del gen" . Adicionalmente, los ácidos nucleicos que comprenden el vector de empalme alternativo de la invención pueden inyectarse directamente, sin la ayuda de un portador, en un paciente. En particular, el ADN del vector puede inyectarse en la piel, músculo o sangre .

El protocolo de terapia génica para la transfección del vector de la invención en un paciente puede ser ya sea a través de la integración del ADN del vector en el genoma de las células, en los minicromosomas o como un constructo de ADN de replicación o no replicación individual en el citoplasma o nucleoplasma de la célula. La expresión de la proteína puede continuar durante un período largo de tiempo o puede reinyectarse periódicamente para mantener un nivel deseado de la proteína en la célula, el tejido u órgano o un nivel sanguíneo determinado. 7. Dosificaciones y Regímenes de Tratamiento En las aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran a un sujeto que sufre de un trastorno tratable con una proteína recombinante de la invención, por ejemplo, un trastorno del sistema inmunológico, en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo, disminuir la severidad, o retrasar el comienzo del trastorno, incluyendo el bioquímico, histológico y/o síntomas conductuales del trastorno, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo del trastorno. En las aplicaciones terapéuticas, se administran composiciones o medicamentos a un sujeto que se sospecha o padece de tal trastorno en una cantidad suficiente a la cura, o por lo menos parcialmente suspender, los síntomas del trastorno (bioquímico, histológico y/o —-— eonduG-te-ual-)-, incluyendo . , .sus __ complicaciones y fenotipos patológicos intermedios en el desarrollo del trastorno. Los polipéptidos de la invención son particularmente útiles para 5 modular la actividad biológica de un antígeno de la superficie celular que reside en la sangre, en donde la enfermedad a tratarse o prevenirse se causa por lo menos en parte, debido a la actividad biológica anormalmente alta o baja del antígeno. 10 En algunos métodos, la administración de composiciones de la presente invención reduce o elimina el trastorno inmune, por ejemplo, la inflamación. Una cantidad adecuada para lograr el tratamiento profiláctico o terapéutico se define como una dosis profilácticamente o terapéuticamente efectiva. En ambos regímenes profiláctico y terapéutico, los agentes se administran normalmente en varias dosificaciones hasta que se haya obtenido una respuesta inmune suficiente. Las dosis eficaces de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de las condiciones descritas anteriores varían dependiendo de distintos factores, que incluyen medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del sujeto, si el sujeto es humano o un animal, otras medicaciones administradas, y si el tratamiento es 'profiláctico o terapéutico. Normalmente, el sujeto es un humano pero mamífero no humanos que incluyen a los mamíferos Pue en_ tratarse . Los polipéptidos y proteínas expresadas por el vector de empalme alternativo o cásete de expresión o constructo de la invención descritos arriba pueden proporcionarse como proteínas substancialmente purificadas y aisladas y fragmentos de proteínas en las formulaciones farmacéuticamente aceptables que usan los métodos de la formulación conocidas por aquellos expertos en el arte. Estas formulaciones pueden administrarse mediante vías normales. En general, las combinaciones pueden administrarse mediante una vía tópica, transdermal, intraperitoneal, intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterina, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, hipodérmica o intramuscular) . Además, los polipéptidos pueden incorporarse en polímeros biodegradables que permiten la liberación sostenida del compuesto, los polímeros que son implantados en la vecindad en donde se desea que se libere el fármaco, por ejemplo, en el sitio de un tumor o implantado para que los polipéptidos sean liberados lentamente de manera sistémica. También pueden usarse minibombas osmóticas para proporcionar la liberación controlada de concentraciones altas de los polipéptidos a través de una cánula en el sitio de interés, tal como directamente en un crecimiento metastático o en el suministro vascular para ese tumor. Se describen los polímeros biodegradables y su uso, por ejemplo, en detalle en Brem et al., J. Neurosurg. 747AI-446 (1991). La dosificación de los polipéptidos de la presente invención dependerá del estado de la enfermedad o de la condición a ser tratada y de otros factores clínicos tales como el peso y la condición del humano o animal y la vía de administración del compuesto. Para tratar humanos o animales, puede administrarse entre aproximadamente 0.5 mg/kilogramos a 500 mg/kilogramos de los polipéptidos. Dependiendo de la vida media de los polipéptidos en el animal particular o humano, los polipéptidos pueden administrarse entre varias veces por día a una vez por semana. Será entendido que la presente invención tiene aplicación para uso humano y veterinario. Los métodos de la presente invención contemplan administraciones únicas o múltiples, dado simultáneamente o sobre un período extendido de tiempo. Para la inmunización pasiva con un anticuerpo, los rangos de dosificación van de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, más normalmente de 0.01 a 20 mg/kg, del peso corporal del hospedador. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser 1 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del rango de 1-10 mg/kg, preferentemente por lo menos 1 pg/kg. A los sujetos se les puede administrar tales dosificaciones diariamente, en días alternados, semanalmente o de acuerdo a cualquier otro esquema determinado por el análisis, empírico.__.Un__tratamientp ejemplar trae consigo la administración en dosificaciones múltiples sobre un período prolongado, por ejemplo, de por lo menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ejemplares adicionales traen consigo la administración una vez por cada dos semanas o una vez al mes, o una vez cada 3 a 6 meses. Los esquemas de la dosificación ejemplares incluyen 1-10 mg/kg o 15 mg/kg en los días consecutivos, 30 mg/kg en días alternados o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con especificidades de enlace diferentes se administran simultáneamente, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los rangos indicados . El anticuerpo se administra normalmente en ocasiones múltiples. Los intervalos entre las dosificaciones simples pueden ser semanales, mensuales o anualmente, En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpos de plasma de 1-1000 µg/ml y en algunos métodos de 25-300 µg/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de la liberación sostenida en -cuyo caso, se requiere de una administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el sujeto, En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido por los anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosificación y frecuencia de administración pueden variar, dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En las aplicaciones profilácticas, las composiciones que contienen los anticuerpos presentes o en un cóctel de las mismas se administran a un sujeto que ya no se encuentra en el estado de la enfermedad para mejorar la resistencia del sujeto. Tal cantidad se define por ser una "dosis profiláctica efectiva" . En este uso, las cantidades precisas dependen nuevamente, del estado de salud del sujeto e inmunidad general, pero generalmente se encuentran en el rango de 0.1 a 25 mg por dosis, sobre todo de 0.5 a 2.5 mg por dosis. Una dosificación relativamente baja se administra a intervalos relativamente poco frecuentes durante un período largo de tiempo. Algunos sujetos continúan recibiendo el tratamiento durante el resto de sus vidas . En las aplicaciones terapéuticas, una dosificación relativamente alta (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 200 mg de anticuerpos por dosis, con dosificaciones de de 5 a 25 mg son las que más se usan normalmente) en intervalos relativamente cortos a veces se requiere hasta que el progreso de la enfermedad se reduzca o termine, y preferentemente hasta que el sujeto muestre mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Después de esto, al paciente puede administrarse un régimen profiláctico. Las dosis para los ácidos nucleicos que codifican a los anticuerpos van desde aproximadamente 10 ng a 1 g, 100 ng a 100 mg, 1 µg a 10 mg, o 30-300 µg de ADN por sujeto. Las dosis para los vectores virales infecciosos variarán dependiendo del tipo de vector viral usado, pero estará entre lxlO5 a lxlO20 viriones por dosis in vivo. Para dosis in vitro, se usarán generalmente aproximadamente dosificaciones de 0.5 a 100 viriones por célula. Los agentes terapéuticos pueden ser administrados mediante medios parenteral, tópico, intravenoso, oral, hipodérmico, intraarterial, intracraneal, intraperitoneal, intranasal o medios intramusculares para el tratamiento profiláctico y/o el tratamiento terapéutico. La vía más típica de administración de un fármaco de la proteína es intravascular, hipodérmica o intramuscular, aunque otras vías pueden ser eficaces. En algunos métodos, se inyectan agentes directamente en un tejido particular en donde los depósitos han aumentado, por ejemplo la inyección intracraneal. En algunos métodos, se administran los anticuerpos como u a composición de liberación sostenida o dispositivo, tal como un dispositivo Medipad™. El fármaco de la p-roteína también puede administrarse vía el tracto respiratorio, por ejemplo, usando un dispositivo de inhalación de polvo seco.

Los agentes de la invención pueden administrarse opcionalmente en combinación con otros agentes que son por lo menos en parte eficaces en el tratamiento de trastornos dirigidos por la presente invención. Los siguientes ejemplos son incluidos para los propósitos de ilustración y no deben traducirse como una limitante de la invención. Los contenidos de cualquier patente, solicitudes de patente, publicaciones de patentes (nacional e internacional) , (específicamente, incluso los listados de secuencias) y las referencias citadas a lo largo de esta especificación están en la presente incorporadas mediante la referencia en su totalidad.

Ejemplificación A lo largo de los ejemplos, se usaron los siguientes materiales y métodos a menos que se establezca lo contrario.

Materiales y Métodos En general, la práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de la biología molecular, tecnología de ADN recombinante y oncología, neurología e inmunología, sobre todo, por ejemplo, la tecnología del anticuerpo. Por ejemplo, Ver Sambrook, Fritsch y . aniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) ; j&ntibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996) ; Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed. , M Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999) ; and Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, John Wiley & Sons (1992) .

Introducción de Vectores de Empalme Alternativos en Células Eucarióticas Para la expresión de los polipéptidos en células eucarióticas, los vectores de la invención se introdujeron típicamente en células CHO mediante electroporación en 0.8 ml de HEBS (20 niM Hepes pH 7.05, 137 mm NaCl, 5 mm KCl, 0.7 mm Na2HP04, 6 mM dextrosa) usando una cuba de 0.4 cm (BioRad, Hércules, CA) a 0.28 kV y 950 uF. Aproximadamente 5 x 106 células para cada electroporación. Después de la electroporación, se permitieron a las células incubarse en la cuba durante 5-10 min a la temperatura ambiente y después se transfirieron a un tubo de centrifugado que contenía 10 ml de suero del medio CHO libre en 10 ml de suero libre del medio CHO, se sembraron en frascos T75 y se incubaron a 36°C con 5% de Co2 en un incubador humidificado. Tres de los cinco días después de la transfección, el medio condicionado se cosechó y la titulación del anticuerpo se determinó por ELISA. Se realizaron las transfecciones por duplicado.

Análisis de Expresión del Polipéptido Multímero El_ análisis de expresión se llevó típicamente a cabo usando una selección de DHFR. Las células transfectadas establemente se hicieron crecer en un medio libre de CHO que carecía de nucleósidos durante aproximadamente dos semanas después de la transfección. Las células transfectadas sin ADN (control negativo) se murieron considerando que las células que contienen el marcador seleccionable crecieron. La productividad de multímeros del polipéptido específico de las células se evaluó intercambiando los medios, sembrando las células a 2 x 105 a 3 x 105 células viables/ml, permitiendo que las células crecieran durante dos a tres días después de que la concentración del anticuerpo y las densidades celulares fueron determinadas. Todas las titulaciones se determinaron usando un ensayo FRET o un ELISA específico para la región variable del anticuerpo y/o un ELISA específico para la región Fc del anticuerpo. Brevemente, las placas se cubrieron con 50 µl/pozo del fragmento Fc? IgG anti humano de cabra AffiniPure (cat. No. 109-005-098, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) o antígeno específico a 10 µg/ml en PBS e incubarse toda la noche a 4o C. Antes del uso, las soluciones de cubierta se removieron y se lavaron 3x con PBS, 0.05% Tween 20, entonces se bloquearon durante al menos 1 hr con 200 de PBS µl/pozo, 0.05% Tween 20, 1% BSA {PBST/BSA) . Las soluciones de bloqueo se removieron y las muestras se analizaron contra una curva normal . Ambos estándar y conocidos se diluyeron típicamente en PBST/BSA, se incubaron durante 2 hr. a la temperatura ambiente, y entonces se lavaron como se describió anteriormente. Una alícuota de 50 µl/pozo de peroxidasa conjugada con anti-lgG humano de asno (H+L) (Jackson Immunoresearch. Cat. no. 709-035-149) se usó para detectar la presencia de anticuerpo. El conjugado se diluyó 1:10,000 en PBST/BSA e incubó para 1.5 hr a la temperatura ambiente, entonces se removió y se lavó como arriba. Un alícuota de 100 µl/pozo de substrato (420 mM de tetrametil bencidina y 0.05% de peróxido de hidrógeno en 0.1 M de una solución amortiguadora de acetato de sodio pH 4.9) se añadió después para resolverse el enlace del antígeno mediante la incubación con el substrato durante 2 min, seguido por la fijación con una solución amortiguadora de detención de 100 µl/pozo 2 ácido sulfúrico. La absorbancia resultante se leyó a 450 nm en un lector de placa de un Dispositivo Molecular SpectraMax Plus usando un software Softmax (Dispositivos Moleculares, Sunnyvale, CA) . Para el ensayo FRET, 50 µL de muestras del medio acondicionado se mezclaron con 75 µL de 1.67- µg/mL LanceTM Eu-IDEC-152 (un anticuerpo IgGl monoclonal etiquetado con europio) Perkin Elmer (Boston, MA) diluido en PBS con 1% BSA (solución salina de un amortiguador de fosfato Dulbecco, cat. no. 9280, Irvine Scientific, Santa Ana, CA; BSA, la Sigma, cat . no . CA-7906) . Después _ de__la adición del anticuerpo etiquetado, 75 uL de la mezcla del ensayo se agrega conteniendo 6.67 µg/mL del conjugado (APC) (Fc específico) -Xl Alopicocianina de IgG antihumano PhycolinkR de cabra (cat. no. PJ253, Prozyme San Leandro, CA) diluido en PBS con 1% BSA. La mezcla adicional de las muestras se incubaron en una placa Negra de 96 pozos no tratada con tapas, (cat. no . 237105, NalgeNunc International, Rochester, NY) y se agitaron durante más de 15 minutos usando un agitador de placa de titulación (cat. no. 4625 (VWR #57019-600), Barnstead/Lab-línea, Meirose Park, IL) . Las placas se leyeron usando un contador de etiquetas múltiple 1420 (Wallac, Gaithersburg, MD) durante un tiempo que resuelve el modo de fluorescencia con excitación a 337 ?M y emisión a 665 ?M. Los datos se analizaron usando un software Softmax (Molecular Devices) .

Ejemplos Ejemplo 1 Métodos para diseñar genéticamente un vector que exprese múltiples polipéptidos que usan empalmes alternativos. El siguiente ejemplo describe los métodos para construir un vector adecuado para expresarse en las células eucarióticas, dos o más productos del gen mediante un empalme alternativo.

Los vectores de expresión descritos en la presente son derivados del vector de expresión pV80 descritos en la Solicitud U.S. No. 10/237,067 que contienen un intrón CMV nativo con el donador de empalme CMV nativo y el aceptor de empalme. Brevemente, un constructo de ADN se elaboró al comprender (en una dirección 5' a 3' o ascendente) un promotor 1 temprano inmediato del citomegalovirus (CMV IEl) que incluye la región 5' no traducida que precede al intrón IE1 CMV (cepa AD169 del citomegalovirus humano) y la mitad 5' del intron IEl de CMV, que incluye la secuencia del donador de empalme nativa (SD) . La porción 3' modificada del intrón IEl CMV incluido en una poliligadura de clonación (Swal -BstBI) para los aceptores de empalme alternativos (SAI) que van a ser intercambiados convenientemente. Además, un sitio de clonación (Ascl) para la primera secuencia de codificación en la que un gen de cadena ligera humanizado se clonó, se añadió precisamente en la dirección descendente de SAI junto con una variante humana en la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento (hGH) . Además de la dirección descendente, la porción 3' del intrón IE1 de CMV, que incluye la secuencia aceptor de empalme nativo (SA2) , se incorporó en el vector. Un sitio de clonación (BamHI) para la segunda secuencia de codificación en la cual un gen de cadena pesada IgGl humanizado se clonó y se añadió justo en la dirección descendente de SA2 junto con la variante humana en la región de poliadenilación (hGH) de la hormona de crecimiento. En una ubicación individual en el vector, se introdujo el marcador seleccionable del dihidrofolato reductasa (DHFR) . El marcador seleccionable se deriva de pSI (acceso Genbank #U47121, Promega, Madison, Wl) y se controló transcripcionalmente mediante el promotor/mejorador SV40, un intrón artificial (separado del vector de empalme alternativo) y la- secuencia de poliadenilación tardía SV40. Para clonar y propagar el vector de empalme alternativo en las células procarióticas, se agregaron secuencias derivadas de pUC19 que incluye el gen de beta lactamasa. El vector resultante {es decir, el pHL005) de las etapas diseñadas genéticamente anteriores se muestra en la Fig. 3 (ver también la SEQ ID NO:29 que proporciona la secuencia de la estructura del vector sin las secuencias que codifican al exón insertadas en los sitios Ascl y BamHI) . En este ejemplo, se han clonado las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo humanizado en los sitios Ascl y BamHI, respectivamente. Este vector también permite la inserción de una variedad de aceptores del empalme en los sitios de restricción (Swal-BstBl) justo en la dirección ascendente de la primera secuencia de codificación a, opcionalme?te, el cambio en la proporción de la expresión de la cadena pesada y ligera.

Los vectores de expresión adicionales se hicieron en las porciones .del intrón justo en la 5' del aceptor de empalme, se eliminaron para generar la estructura del vector vHLP005. La secuencia intrón de pHLP005 contiene un sitio PflMI y un sitio BspEI aproximadamente de 310 pares base y 110 pares base 5' de un sitio Svral , respectivamente. Para generar estas supresiones, el plásmido pHLP005 se linealizó mediante una digestión parcial con PfIMI o BspEI y entonces se digirió completamente con BspEI y se purificó con gel. Para generar los vectores de expresión con diferentes primeros aceptores de empalme (SAI) , los oligonucleótidos con sitios compatibles PfIMI y BspEI o BspEI y BspEI (SEQ ID NOs : 1-28) se ligaron en el vector digerido pHLP005 respectivo y dado una nueva designación del vector (Fig. 4). Todos los constructos se confirmaron entonces mediante el análisis de secuencias de ADN. Los vectores resultantes contienen, én una dirección 5' a 3' o en una orientación descendente, un donador de empalme CMV nativo (SD) , un primer aceptor de empalme (SAI) seleccionado de la SEQ ID NOS: 1-28, un primer sitio de restricción (Ascl) para la inserción de los primeros polipéptidos, un segundo aceptor del empalme (SA2) que es un aceptor de empalme CMV nativo y un segundo sitio de restricción (BamHI) para la introducción del segundo polipéptido Las secuencias de cadena pesada y ligera del anticuerpo se prepararon usando una reacción de cadena de polimerasa basad en un cebador (PCR) y los productos resultantes se introdujeron en el vector usando las técnicas de ingeniería genética estándar. Los cebadores usados en los sitios de restricción contenidos adyacentes a las regiones de codificación para la inserción en los sitios Ascl y BamHI. Por ejemplo el cebador 5' podría ser TTTTGGCGCGCCATGN (20) (SEQ ID NO: 32) para la cadena ligera y TTTTGGATCCATGN (20) (SEQ ID NO: 33) para la cadena pesada. El cebador 3' podría ser GCACGGCGCGCCCTAN (20) (SEQ ID NO:34) para la cadena ligera y GCAGGGATCCTCAN (20) (SEQ ID NO: 35) para la cadena pesada. Para estos cebadores, N(20) representa la secuencia del nucleótido específico para el ADN que codifica a la cadena pesada o la cadena ligera deseada.

Ejemplo 2 Métodos para determinar la eficiencia de empalme alternativo. En este ejemplo, se describen métodos y constructos para determinar la eficacia de usar empalmes alternativos para expresar dos productos del gen diferentes codificados mediante exones adyacentes a diferentes aceptores de empalme. A pesar de que el empalme se media mediante las secuencias de consenso en las uniones del exon/intrón, una predicción exacta de empalme eficaz no puede determinarse mediante solo estas secuencias. Por esta razón, una metodología empírica es necesaria para identificar secuencias aceptoras de empalme que generarían la proporción apropiada de productos, que pueden medirse aquí como el importe total de proteína multimérico producido. Por consiguiente, la invención proporciona vectores adecuados para combinaciones de separación por exclusión eficientes en sitios de empalme deseables en cualquier línea celular dada. Para generar una variedad de vectores de expresión con sitios de empalme alternativos, se generaron oligonucleótidos con un extremo con puntas romas y un extremo BstBI compatible para la inserción en los sitios Swal y BstBI en el vector pHLP005. Todos los constructos se confirmaron mediante un análisis de secuencia de ADN. Las secuencias de los sitios de empalme probadas en la Fig. 4 y en el listado e secuencias (es decir, la SEQ ID NOS:l-28) . Los vectores generados con los distintos aceptores de empalme se compararon usando una transfección transitoria o estable mediante electroporación. La célula hospedera usada para las transfecciones fue la línea DG44 celular (CHO) de ovario de hámster chino deficiente en dihidrofolato reductasa (DHFR) (Urlaub et al, Cell 33, 405-412 (198-3)). Todo el ADN se preparó al usar el kit Megaprep (Qiagen, Valencia, CA) . Previo a la transfección, el ADN se precipitó en etanol (EtOH) , se lavó en 70% de EtOH, se secó, se volvió a suspender en HEBS, y se cuantifico previo a la transfección. Los controles negativos no contenían transfección de ADN y se usaron como controles de transfección. Tanto el ELISA específico del mAb y el ELISA específico de IgG miden el anticuerpo total secretado dentro del medio de cultivo celular. Los niveles de expresión de anticuerpos para las células transfectadas de forma transitoria se proporcionan en la Tabla 1. Los resultados demuestran que ciertos sitios de empalme, por ejemplo, pHLP0015 y pHLPOOld, son más eficientes que otros, al generar niveles superiores de anticuerpo total, cuando se prueban, transitoriamente, en células CHO.

Tabla 1. Concentraciones de Anticuerpos de la Transfección Transitoria Ejemplo 3 Expresión de Productos de Genes Empalmados Alternativamente en Células Eucarióticas En este ejemplo, la expresión de productos de genes empalmados alternativamente, en particular, anticuerpos ensamblados de IgG, se describe. Brevemente, se transfretaron células CHO con los vectores de empalme alternativos de la invención por electroporación y se dejaron recuperar en medios selectivos, como se describe supra, por alrededor de dos semanas para generar células transfectadas de manera estable. Después de 3-5 días los medios acondicionados se cosecharon y la concentración de anticuerpos se determinó por ELISA. En un primer experimento, 50 µg de ADN de los vectores separados que codifican la cadena ligera y cadena pesada, 50 µg de vectores alternativamente empalmados que codifican a ambas cadenas ligera y pesada de anticuerpos, o ningún ADN en absoluto se introdujo en las células eucarióticas (CHO) y se determinó la cantidad de multímeros de polipéptidos funcionales producidos por las células como una función de la actividad de enlace de anticuerpos (Tabla 2) .

Tabla 2. Productividad Específica de Acumulados Estables Los resultados del -primer experimento son prueba del principio de que es posible generar un multímero de polipéptido funcional, por ejemplo, un producto de anticuerpo monoclonal, de un vector de empalme alternativo.

En experimentos adicionales, 25 µg de ADN de vectores separados que codifican cadena ligera y pesada de anticuerpos, 50 µg de vectores alternativamente empalmados que codifican ambas cadenas ligera y pesada de anticuerpos, o ningún ADN en absoluto, se introdujeron dentro de células eucarióticas (CHO) y la cantidad de multímeros de polipéptidos funcionales producidos por las células como una función de la actividad de enlace de anticuerpos, se determinó (Tablas 3-6) . Los resultados de los experimentos demuestran que es posible generar un multímero de polipéptido funcional, por ejemplo, un producto de anticuerpo monoclonal, a partir de un vector de empalme alternativo. Los datos sugieren que pHLP015 es un mejor vector de empalme alternativo que otros probados debido a su capacidad de producir altos niveles de anticuerpo funcional.

Tabla 3. Concentraciones de Anticuerpos de la Transfección Transitoria Tabla 4. Productividad Específica de Acumulados Estables Tabla 5. Concentraciones de Anticuerpos de Transfección Transitoria Tabla 6. Productividad Específica de Acumulados Estables De esta manera, se concluyó que un multímero de polipéptido funcional, por ejemplo, un anticuerpo, se puede producir al usar un vector de empalme alternativo tanto transitoria como establemente en células eucarióticas. Por lo tanto, se demostró la facilidad y utilidad de un sistema de un vector que expresa más de un polipéptido a través de empalmado alternativo.

Ejemplo 4 Demostración de que el vector puede producir líneas celulares con buen potencial de expresión El vector de la presente invención se diseñó para optimizar la relación de las cadenas ligera y pesada para la expresión de anticuerpos. Las cadenas pesadas de inmunoglobulina no se secretan a menos que se ensamblen con cadenas ligeras, mientras que la mayoría de las cadenas ligeras se pueden secretar como moléculas libres. Así, las cantidades excesivas de cadena ligera libre serían indicativas de la necesidad de optimizar además el vector para incrementar la relación de la producción de . cadena pesada a ligera. Con objeto de evaluar la producción de cadena ligera libre, se evaluaron líneas celulares que contienen uno de los vectores de la invención se generaron y sus medios acondicionados, que contienen la cadena ligera libre recombinante secretada y/o productos ensamblados de multímeros de anticuerpos (Tabla 7) .

Generación de Vectores Un vector basado en pHLP015 se preparó como se describe en Ejemplos 1 y 2. Este vector se insertó dentro de células CHO y se seleccionó para transfección estable como se describió previamente. Las líneas celulares amplificadas se derivaron con direccionamiento del estándar de la industria de una productividad específica en exceso de 10 picogramos de proteína producida por célula por día como se mide por el análisis FRET como se describió previamente. Los resultados proporcionados a continuación demuestran la utilidad de este vector de expresión en la elaboración de líneas celulares aceptables para producción de anticuerpos. Los resultados de RT-PCR confirman los sitios de empalme predichos . Transcripción reversa de ARN celular seguida por la reacción en cadena de polimerasa del ADNc (RT-PCR) se efectuó para confirmar las uniones de empalme de los ARNm de cadena pesada y ligera contra las uniones predichas del diseño del vector de expresión. Una línea celular tra-nsfectada de forma estable se aisló de una de las transfecciones al usar el plásmido pHLP015 y el ARN total se preparó (R?Awiz, Ambion, Austin, TX) . Al usar un cebador complementario al centro aproximado del ARNm de cadena pesada, se generó un ADNc al usar la transcriptasa reversa (transcriptasa reversa Superscript III, Invitrogen, Carlsbad, CA) . El ADNc luego se usó como una plantilla para PCR (polimerasa Vent de AD?, ?ew England Biolabs, Beverly, MA) al usar un cebador en la región no traducida CMV 5' (5' del donador de empalme) y un cebador en la región de codificación (3 ' del aceptor de empalme en la secuencia de codificación de cadena pesada) . Este producto de PCR se formó en secuencias y se confirmó el producto de empalme predicho entre el donador de empalme en el intrón CMV y el aceptor de empalme justo 5' de la secuencia de codificación de cadena pesada. Al usar oligo (dT) 15 como un cebador, se generó un AD?c del AR? celular al usar transcriptasa reversa (sistema de transcripción reversa, Promega, Madison, Wl) .

Este AD?c luego se usó como una plantilla para PCR (polimerasa Vent de AD?, ?ew England Biolabs, Beverly, MA) al usar un cebador en la región no traducida de CMV ' (51 del donador de empalme) y un cebador en la región de codificación (3 ' del aceptor de empalme en la secuencia de codificación de cadena ligera). Este producto por PCR se formó en secuencias y el producto de empalme predicho entre el donador de empalme en el intrón CMV y el aceptor de empalme justo en 5 ' de la secuencia codificadora de cadena ligera se confirmó, lo que indica que el vector de expresión estaba funcionando por empalmado alternativo como se esperaba.

Análisis SDS-PAGE de medios acondicionados Se aisló una línea celular transfectada de forma estable de una transfección al usar el plásmido pHLP015 (mAb#l-l en Tabla 7) de los Ejemplos 1-3. Además, un número de líneas celulares transfectadas establemente se generaron al usar otro vector basado en pHLP015 (como se genera en este Ejemplo, mAb#2-l a 5 en Tabla 7) . Para purificar tanto el mAb entero y las cadenas ligeras libres, se aplicaron aproximadamente 50 mL de medio acondicionado a una columna de 1.3 mL de proteína de L-agarosa (cat. no. P3351, Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) , la columna se lavó con 15 mL 3X PBS, luego 5 mL de IX PBS y eluyó con 100 mM de NaH2P04, pH 2.8 en alícuotas de 0.3 mL y se neutralizó inmediatamente con 75 µL de Hepes 1M, pH 8. El pico de proteína se localizó por absorbancia de UV a 280 nm y la concentración de proteína se determinó al usar un coeficiente de extinción de 1.5 A280/mg/mL. Un volumen apropiado de la muestra pico se diluyó en solución amortiguadora de muestra, para cargar 1.5 µg de proteína en 15 µL. La solución de reserva 4X de solución amortiguadora de muestra basada en Laemmli (0.25 M Tris-HCl, pH 6 .8 , 8% SDS, 40% glicerol, y 0.01% de azul de bromofenol) se preparó con 100 mM de NEM fresco para los geles no reductores. Las muestras se calentaron durante 5 min a 100 °C y 15 µL se cargaron sobre geles PAGEr Gold Precast con 4-20% de tris-glicina (cat. no. 59517, Cambrex, East Rutherford, NJ) . Los geles se corrieron a 45 mA durante 40 min en solución amortiguadora de Laemmli. Después de la corrida, Jos geles se tiñeron con aproximadamente 100 mL de tinción de azul de Coomassie Cleveland (50% de metanol, 10% de ácido acético, 0.1% de azul de Coomassie) por microondas durante 1 min y agitación por 10 min. Los geles luego se destiñeron en aproximadamente 100 mL de 10% de metanol, ácido acético al 10% por microondas durante 2 min y agitación durante la noche con espuma absorbente. Los geles se escanearon en un densitómetro calibrado Biorad GS-800 y las bandas de anticuerpo completo y cadena ligera libre se cuantificaron con un software Biorad Quantity One. La cantidad de cadena ligera libre como un' porcentaje de la proteína secretada total (anticuerpo completo + cadena ligera libre) se muestra en la Tabla 7.

Tabla 7. Evaluación de las Cantidades relativas de Anticuerpo Entero y Cadena ligera libre en Medios acondicionados de Líneas celulares basadas en pHLP015 Línea Celular % LC libre mAb#l-l no detectado mAb#2-l 14 mAb#2-2 14 mAb#2-3 16 mAb#2-4 no detectado mAb#2-5 no detectado Como se muestra en la Tabla 7, altos niveles de cadena ligera libre no se detectaron lo que indica que el vector está bien balanceado en la expresión de la cadena ligera con relación a la cadena pesada.

Ejemplo 5 Proteínas multiméricas que producen vectores Los vectores y casetes o constructos de expresión de la presente invención se pueden usar para expresar cualquier proteína multimérica, incluyendo, pero no limitada a, las proteínas multiméricas descritas en la Descripción Detallada supra. Muchas de tales proteínas son bien conocidas en la técnica y son adecuadas para su uso en los vectores y casetes o constructos de expresión de la' presente invención. Puede variara el número de polipéptidos a expresarse. Por ejemplo, dos polipéptidos se pueden expresar como se describió previamente. Polipéptidos adicionales se pueden expresar al insertar exones adicionales que codifican los polipéptidos en el vector, preferiblemente entre el primer exón y segundo aceptor de empalme. Cada uno de los exones adicionales tendría un aceptor de empalme 5 ' al exón para regular la transcripción cuando sucede el empalme entre el donador simple de empalme y los aceptores individuales de empalme. Así, más de un polipéptido se puede expresar al usar el mismo donador de empalme y diferentes aceptores de empalme para expresar los polipéptidos en relaciones para optimizar la expresión de la proteína o proteínas deseadas . Un vector o constructo o cásete de expresión se prepara como se describe en los ejemplos anteriores que contienen aceptores de empalme que permiten el empalme y la traducción posterior de las cadenas de polipéptidos en relaciones que optimizan la expresión de la proteína multimérica. Primero, los genes que codifican las cadenas de polipéptidos se clonan o amplifican al usar técnicas estándar, tales como RT-PCR al usar cebadores específicos para las cadenas y una colección apropiada que contiene los genes que expresan los polipéptidos deseados. Los genes luego se insertan dentro de un vector o constructo o cásete de expresión de la invención capaz de expresar los polipéptidos en las relaciones adecuadas suficientes para expresar altos niveles de la proteína multimérica.

Este vector o constructo o cásete de expresión puede tener sitios de restricción convenientes para facilitar la inserción de los sitios de empalme, exones y otros elementos deseados. Por ejemplo, se puede usar pHLP0015. Alternativamente, los genes que codifican los polipéptidos se insertan dentro de más de un vector o constructo o cásete de expresión, cada uno con un primer aceptor de empalme diferente, para seleccionar un aceptor de empalme que permita el nivel de expresión adecuado, como se describe en los Ejemplos 2 y 3. Finalmente, el vector o vectores o casetes o constructos de expresión que codifican los polipéptidos se insertan en una línea celular adecuada, por ejemplo, células de mamíferos, células de insectos o células de levaduras, y se expresan. La proteína multimérica luego se puede recolectar del medio de cultivo celular si se secreta, o de las células lisadas si la proteína es intracelular o enlazada a la membrana. Todas la referencias citadas en la presente se incorporan por ello como referencia en su totalidad.

Equivalentes Para alguien experto ordinario en la técnica, al usar no más que la experimentación de rutina, existen muchos equivalente a las modalidades específicas de la invención aquí descritas . Tales equivalentes se pretende que se abarquen por las siguientes reivindicaciones . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Un vector de expresión que comprende, un promotor; una UTR en 5 ' ; un donador sencillo de empalme; un intrón; un primer aceptor de empalme; un primer exón que codifica un primer polipéptido; un segundo aceptor de empalme; y un segundo exón que codifica un segundo polipéptido, caracterizado porque el promotor se liga operativamente al primero y segundo exones, en donde con la entrada en una célula, el donador sencillo de empalme se empalma con el primer aceptor de empalme, formando un transcrito empalmado el cual permite la transcripción del primer exón, y el segundo aceptor de empalme formando un transcrito empalmado >. el cual permite la transcripción del segundo exón, y en donde el primer polipéptido y el segundo polipéptido se expresan a partir de los transcritos empalmados .

2. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor es un promotor CMV.

3. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además una señal de poliadenilación ligada operativamente al primer exón o el segundo exón.

4. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector comprende además uno o más de un aceptor adicional de empalme y exón adicional que codifica un polipéptido adicional, en donde con la entrada en una célula, el donador sencillo de empalme se empalma con el aceptor adicional de empalme, formando un transcrito empalmado adicional el cual permite la' transcripción del exón adicional, y en donde el polipéptido adicional se expresa del transcrito adicional empalmado.

5. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primero o segundo exones o ambos codifican un marcador seleccionable.

6. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primero y segundo polipéptido forman un multímero.

7. El vector de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la proteína multimérica es un heterodímero, un heterotrimero, o un heterotetrámero.

8. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer polipéptido se expresa a una frecuencia de alrededor de- 10:1 a alrededor de 1:10 con relación al segundo polipéptido.

9. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer polipéptido se expresa a una frecuencia de alrededor de 3:1 a alrededor de 1:3 con relación al segundo polipéptido.

10. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer polipéptido se expresa a una frecuencia de alrededor de 1:1 con relación al segundo polipéptido.

11. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primero o segundo aceptor de empalme comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-28.

12. El vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el donador de empalme y el segundo aceptor de empalme se derivan de CMV y el primer aceptor de empalme comprende cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOS: 1-28.

13. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el vector es un vector viral.

14. El vector de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende SEQ ID NO: 29.

15. Una célula eucariótica caracterizada porque contiene el vector de conformidad con la reivindicación 1.

16. La célula de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el vector se integra dentro del ADN cromosomal de la célula.

17. La célula de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el vector es episomal.

18. La célula de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la célula es una célula de mamífero o una célula de levadura.

19. La célula de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que comprende: una célula de riñon de hámster recién nacido, un fibroblasto, una célula de mieloma, una célula NSO, una célula PER.C6, o una célula CHO.

20. La célula de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la célula es una célula CHO.

21. Un método de producción de polipéptidos, el método caracterizado porque comprende cultivar una célula de la reivindicación 15 en un cultivo y aislar el primer polipéptido y el segundo polipéptido del cultivo.

22. Un primer polipéptido y un segundo polipéptido caracterizado | orque se produce por el método de conformidad con la reivindicación 21.

23. Una composición caracterizada porque comprende el primer polipéptido y segundo polipéptidos de conformidad con la reivindicación 22, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

24. Un método de tratamiento de un paciente que necesita del mismo, caracterizado porque es con la composición de conformidad con la reivindicación 23.

25. Un vector de expresión que comprende, un promotor; una UTR en 5' ; un donador sencillo de empalme; un intrón; un primer aceptor de empalme; un primer exón que codifica un primer polipéptido de anticuerpos o fragmento del mismo; un segundo aceptor de empalme; y un segundo exón que codifica un segundo polipéptido de anticuerpos o fragmento del mismo, caracterizado porgue el promotor se liga operativamente al primero y segundo exón, en donde con la entrada en una célula, el donador sencillo de empalme se empalma con el primer aceptor de empalme, formando un transcrito empalmado el cual permite la transcripción del primer exón, y el segundo aceptor de empalme, formando un transcrito empalmado el cual permite la transcripción del segundo exón, y en donde el primer polipéptido de anticuerpos o fragmento del mismo y el segundo polipéptido de anticuerpos o fragmento del mismo se expresan a partir de los transcritos empalmados y se asocian para formar un anticuerpo o fragmento de anticuerpos .

26. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porgue el primer exón o el segundo exón o ambos, codifican a un fragmento de anticuerpos.

27. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer polipéptido codifica una cadena pesada de anticuerpos o un fragmento del mismo y el segundo polipéptido es una cadena ligera de anticuerpos o un fragmento del mismo.

28. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer polipéptido es una cadena ligera de anticuerpos o un fragmento del mismo y el segundo polipéptido es una cadena pesada de anticuerpos o un fragmento del mismo .

29. El vector de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la cadena ligera o pesada o ambas es de murino, quimérica, humanizada, humana o sintética.

30. El vector de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la cadena ligera o pesada o ambas es de murino, quimérica, humanizada, humana o sintética.

31. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer polipéptido de anticuerpos o fragmento del mismo se expresa a una frecuencia de alrededor de 3:1 a alrededor de 1:3 con relación al segundo polipéptido de anticuerpos o fragmento del mismo.

32. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer polipéptido de anticuerpos o fragmento del mismo está a una frecuencia de alrededor de 1:1 con relación al segundo polipéptido de anticuerpos o fragmento del mismo.

33. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el primer aceptor de empalme o el segundo aceptor de empalme comprende cualesquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOS : 1-28.

34. El vector de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el donador de empalme y el segundo acept-or de empalme se derivan de CMV y el primer aceptor de empalme comprende cualesquiera de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste de SEQ ID NOS : 1-28.

35. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el vector es un vector viral.

36. El vector de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende SEQ ID NO : 29.

37. Una célula eucariótica caracterizada porque contiene el vector de conformidad con la reivindicación 25.

38. La célula de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el vector se integra dentro del ADN cromosomal de la célula.

39. La célula de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque el vector es episomal.

40. La célula de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque la célula es una célula de mamífero o una célula de levadura.

41. La célula de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque la célula se selecciona del grupo que comprende: una células de riñon de hámster recién nacido, un fibroblasto, una _ célula_ _de mieloma,_ una célula NSO, una célula PER.C6, o una célula CHO.

42. La célula de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la célula es una célula CHO.

43. Un método de producción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, el método caracterizado porque comprende cultivar una célula de conformidad con la reivindicación 37 en un cultivo, y aislar el primer polipéptido y el segundo polipéptido del cultivo.

44. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpos caracterizado porque es producido por el método de conformidad con la reivindicación 43.

45. Una composición caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpos de conformidad con la reivindicación 44, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.

46. Un método de tratamiento de un paciente que necesita del mismo caracterizado porque comprende la composición de conformidad con la reivindicación 45.