MXPA06009199A - Cementos a base de fosfato de calcio macroporosos, reabsorbibles e inyectables para reparacion, aumento t regeneracion de hueso, y tratamiento de osteoporosis. - Google Patents

Abstract

Una composicion y un metodo para producir cementos interconectivos macroporosos, reabsorbibles e inyectables basados en fosfato de calcio (MICP); la composicion de la invencion se fija a fosfato de calcio apatitico escasamente cristalino despues de mezclarlo con un componente en polvo y una solucion acuosa; los componentes multifasicos de fosfato de calcio en el cemento se reabsorben a diferentes velocidades permitiendo el reemplazo progresivo por hueso nuevo; la macroporosidad interconectada en el cemento permite la vascularizacion, el afianzamiento de los factores de crecimiento, la colonizacion celular y el crecimiento interno del tejido; este MICPC se puede utilizar para aplicaciones dentales y medicas relacionadas con la reparacion, el aumento, la reconstruccion, la regeneracion de huesos y el tratamiento de la osteoporosis, y tambien para el suministro de farmacos, y como andamiaje para la ingenieria de tejidos.

Description

CEMENTOS A BASE DE FOSFATO DE CALCIO MACROPOROSOS, REABSORB1BLES E INYECTABLES PARA REPARACIÓN, AUMENTO Y REGENERACIÓN DE HUESO, Y TRATAMIENTO DE OSTEOPOROSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere generalmente a métodos y composiciones para reparación, aumento y regeneración de hueso, y para tratamiento de osteoporosis. De manera más específica, la invención se refiere a la preparación y usos de un cemento a base de fosfato de calcio macroporoso terconectivo, reabsorbible e inyectable.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El hueso es un matepal mixto de biopolímeros (principalmente colágeno), y un componente inorgánico identificado como hidroxiapatita carbonatada, aproximada como (Ca, Mg, Na, M)?o(PO4, CO3, HPO4)6(OH,CI)2 [Véase LeGeros RZ (1981 ). "Apatites in Biological Systems". Prog Crystal Growth 4: 1-45; y LeGeros R. Z. (1991 ). Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine. Monographs ¡n Oral Sciences. Vol 15. Myers H. M. (ed). Karger, Basel]. Los materiales de fosfato de calcio, principalmente hidroxiapatita (HA), fosfato de beta-tricalcio (ß-TCP), fosfatos de calcio bifásico, BCP (que consiste de una mezcla de HA y ß-TCP en relaciones de HA/ß-TCP variables) están comercialmente disponibles como biomateriales para reparación, aumento o sustitución de hueso. Las principales ventajas de materiales de fosfato de calcio son: similitud en composición al mineral óseo, bioactividad, osteoconductividad y capacidad para formar una ¡nterfaz singularmente fuerte con el hueso. Los materiales de fosfato de calcio están disponibles como granulos, bloques, revestimientos sobre implantes dentales y médicos, y como cementos. Cementos de fosfato de calcio (CPCs). El concepto y ventajas potenciales de un cemento apatítico o de fosfato de calcio (CPC) como un posible material de restauración fue introducido por primera vez por LeGeros et al en 1982. [Véase LeGeros R. Z. , Chohayeb A, Shulman A (1982). "Apatitic Calcium Phosphates: Possible Restorative Materials. "J Dent Res 61 (Spec Iss): 343]. Esta formulación temprana se basó en el mezclado de apatita deficiente en calcio o precipitada (CDA) e hidróxido de calcio con ácido fosfórico. En 1987, Brown y Chow reportaron el primer CPC de endurecimiento que resulta de mezclar tetrafosfato de calcio (TTCP) y fosfato de calcio anhidro (DCPA). Hay actualmente numerosas patentes sobre CPC y varios productos comerciales de CPC. Comparados con los fosfatos de calcio que están disponibles en partículas o formas de bloque, el CPC tiene las siguientes propiedades deseables y ventajas decididas: maleabilidad (que le permite adaptarse al sitio y forma del defecto) y bioreasorbabilidad alta (que le permite ser reemplazado por hueso). La introducción de cementos de fosfato de calcio inyectables mejoraron en gran medida el manejo y suministro de los cementos y áreas abiertas de nuevas aplicaciones para el CPC. [Niwa S., LeGeros R. Z. (2002). Injectable Calcium Phosphate Cements for Repair of Bone Defects, En: Lewandrowski, K. A. , Wise D. L., Taratola D. (eds). Tissue Engineering and Biodegradable Equivalents: Scientific and Clinical Applications. New York, Marcel Dekker, Inc. pp. 385-399.] Los sistemas de cemento de fosfato de calcio (CPC) consisten de un polvo y un componente líquido. El componente en polvo está hecho usualmente de uno o más compuestos de fosfato de calcio con o sin sales de calcio adicionales. Otros aditivos se incluyen en pequeñas cantidades para ajustar los tiempos predetrerminados, incrementar la capacidad de inyección, reducir el tiempo de cohesión o hinchazón, y/o introducir macroporosidad. Los CPCs comerciales actuales incluyen dos o más de los siguientes compuestos de fosfato de calcio: fosfato de calcio amorfo (ACP), Cax (PO4) y H2O; monofosfato de calcio monohidratado (MCPH), CaH4(P04)2.H20; fosfato de calcio dihidratado (DCPD), CaHPO4.2H2O; fosfato de calcio anhidro (DCPA), CaHPO4; apatita precipitada o deficiente en calcio (CDA), (Ca, Na)10(PO4, HPO4)6(OH)2; alfa- o beta-trifosfato de calcio (a-TCP, ß-TCP), Ca3(PO4)2; y tetrafosfato de calcio (TTCP), Ca4P2Og. Otras sales de calcio incluyen: carbonato de calcio (CC), óxido de calcio o hidróxido de calcio (CH), sulfato de calcio hemihidratado (CSH), y silicato de calcio. El componente líquido puede ser una o combinaciones de las siguientes soluciones: solución salina, H2O desionizada, ácido fosfórico diluido, ácidos orgánicos diluidos (acético, cítrico, succínico), fosfato de sodio (alcalino o neutro), carbonato o bicarbonato de sodio, alginato de sodio, bicarbonato de sodio, y/o condroitinsulfato de sodio. El producto(s) de reacción de fraguado obtenido después de que el cemento se ha fraguado es (son) determinado(s) por la composición del componente en polvo y composición y el pH del componente líquido. El tiempo de fraguado (que puede variar de 10 a 60 min) es determinado por la composición de los componentes en polvo y líquido, la relación de polvo-a-líquido (P/L), proporción de los componentes de fosfato de calcio (v.gr., relación de TTCP/DCPA) y los tamaños de partícula de los componentes en polvo. Fosfato de calcio apatítico o apatita que contiene carbonato (hidroxiapatita carbonatada, CHA) con cristalinidad (tamaño del cristal) similar a la de la apatita ósea se puede formar antes de la implantación cuando el cemento se fragua o puede resultar de hidrólisis in vivo del producto fraguable no apatítico (v.gr., DCPD) después de la implantación. Los CPCs comerciales actualmente disponibles se fraguan como una masa densa y por lo tanto adolecen de algunos inconvenientes tales como la ausencia de macro porosidad de interconexión y velocidad de bioreabsorbabilidad lenta. La macroporosidad apropiada (100-300, µ) en el cemento es crítico para permitir que tenga lugar la vascularización y crecimiento interno de tejido y por lo tanto facilita la formación de hueso nuevo. Además, la porosidad apropiada permite la incorporación de fármacos y agentes terapéuticos (v.gr., antibióticos, agentes de anti-resabsorción para osteoporosis; agentes anticancerosos, etc) o factores de crecimiento (v.gr., proteínas morfogenéticas de hueso; BMPs y otras moléculas biocativas). La velocidad apropiada de la bio-reabsorbabilidad es crítica para el reemplazo oportuno del cemento con hueso nuevo. Varios métodos de introducción de macroporosídad en el CPC han sido recomendados. Estos métodos incluyen: introducir fibras reabsorbibles, v.gr., poligalactina; añadir sales solubles (v.gr. cloruro de calcio e hidróxido de sodio o potasio; añadir agentes formadores de poros (v.gr., azúcar, NaHCOs, sales de calcio); usar partículas en solución de fosfato de sodio congelado (Na2HPO4); añadir solución de fosfato de sodio ácido (NaH2PO4) a NaHCO3; y proveer ácido (ácido cítrico) y base (NaHCO3). Estos métodos producen macroporosidad a partir de la liberación de CO2 durante la reacción de ácido y NaHCO3.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El cemento de fosfato de calcio macroporoso, bio-reabsorbible e inyectable (MICPC) de la presente invención provee macroporosidad y reabsorbabilidad no presentada por los CPC actualmente disponibles. Características de la invención incluyen: (1 ) incorporar fosfato de calcio bifásico (BCP) y fosfato de calcio amorfo (ACP) como compuestos principales en el componente de polvo y (2) proveer macroporosidad del cemento. Estas características combinadas no están presentes en los cementos de fosfato de calcio actualmente disponibles.

El fosfato de calcio bifásico, BCP, se usa actualmente en muchas aplicaciones médicas y dentales. Debido a que consiste de una mezcla íntima de HA y ß-TCP y debido a la diferencia en su solubilidad (ß-TCP >»HA), bio-reabsorbabilidad o bioactividad se puede controlar manipulando la relación de HA/ß-TCP del BCP. [LeGeros RZ y Daculsi G (1990). In vivo transformation of biphasic fosfato de calcio ceramics: ultrastructural and physico-chemical characterizations. En: Handbook of Bioacfive Ceramics. Vol II. Calcium Phosphate Ceramics. Yamamuro N, Hench L, Wilson-Hench J (eds), CRC Press, Boca Ratón, pp. 17-28]. La relación de HA/ß-TCP (v.gr., 60/40,20/80, etc.) en el BCP puede ser fácilmente controlado por los parámetros de síntesis. El fosfato de calcio amorfo, ACP, se usa como un componente principal de un CPC comercial. ACP es el más soluble en el grupo de compuestos de fosfato de calcio usados en muchos CPCs. ACP se puede hacer más o menos estable (es decir, más o menos soluble o más o menos susceptible a transformarse a otros fosfatos de calcio) dependiendo de los iones incorporados en él. [LeGeros RZ et al, (1973). Amorphous calcium phosophates: synthetic and biological. Colloque Intemationaux CNRS No. 230, "Physico-chimie et Cristallogrpahie des Apatites d'lnteret Biologique", Paris, pp 105-115]. El cemento de la invención contiene cuatro compuestos de fosfato de calcio con BCP, ACP (composición modificada o no modificada) y a-TCP o TTCP como los componentes principales. Estos fosfatos de calcio difieren en sus solubilidades y por lo tanto en su velocidad de reabsorbabilidad: ACP» a-TCP»BCP y en BCP, ß-TCP»HA [LeGeros RZ (1993) Biodegradation/bio-resorption of calcium phosphate materials. Clin Mat 14: 65-88]. In vivo, la disolución preferencial de ACP y la diferencia en las velocidades de disolución de los otros compuestos de fosfato de calcio provee macroporosidad de interconexión interna en el cemento que permite la vascularización, atrapamiento de factores de crecimiento, colonización de células y crecimiento interno de tejido. La adición de cantidades menores de compuestos ácidos y básicos permite la formación de macroporosidad a medida que los componentes dei cemento se mezclan y a medida que el cemento se fragua. Por lo tanto, esta invención provee cementos de fosfato de calcio macroporosos, inyectables ("MICPCs") con macroporosidad de bio-reabsorbabilidad e interconexión programable. Este MICPC se puede usar para aplicaciones dentales y médicas relacionadas con reparación, aumento, reconstrucción, regeneración de hueso y tratamiento de osteoporosis, y también para suministro de fármaco, y como andamios para ingeniería de tejido. Otras aplicaciones dentales potenciales son: reparación de defectos periodontales, aumento de senos, reconstrucción maxilofacial, materiales de bloqueo de pulpa, reparación de paladar hendido, y como adyuvantes para implantes dentales. Aplicaciones médicas adicionales incluyen reparación de defectos de huesos grandes, reparación de fracturas de huesos causadas por trauma, o asociadas con osteoporosis; para fusión de columna, revisión de cirugía, aumento de hueso, y para reconstrucciones de hueso asociadas con terapia de cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos anexos a la presente: La figura 1a muestra el patrón de difracción de rayos X típico de un fosfato de calcio amorfo caracterizado por un alto fondo y ausencia de cualesquiera picos de difracción; La figura 1 b muetsra un espectro de infrarrojo (FTIR) de la peparación de carbonato-fosfato de calcio amorfo secado por congelamiento (ACCP); La figura 2 muestra un análisis de difracción de polvo en rayos X de la muestra del ejemplo 2, 24 hr después del fraguado; La figura 3A muestra el producto de la reacción después de 3 días del fraguado; La figura 3B muestra el producto de la reacción con 100% de alfa-TCP después de 48 horas del fraguado; La figura 4A es un perfil de difracción de rayos X que ilustra la composición multifásica del cemento 24 horas después del fraguado; La figura 4B muestra la conversión principalmente a hidroxiapatita carbonatada observada 48 horas después del tiempo de fraguado; Las figuras 5A a 5D muestran los resultados del análisis de SEM sobre los discos de diferentes formulaciones de cemento; La figura 6 ilustra la viabilidad de las células después de 15 días de cultivo para diferentes formulaciones de cemento; La figura 7A es una micrografía de SEM del defecto después de 3 semanas de implantación de una preparación de fosfato de calcio típica (CPC) que contiene principalmente a-TCP; y La figura 7B es una micrografía de SEM que ilustra la estructura abierta de un cemento de fosfato de calcio macroporoso estable MICPC de conformidad con la invención (que contenía ACP y BCP), después de 3 semanas de implantación en fémur de rata.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención provee un método de preparación de composiciones de cemento de fosfato de calcio (CPC) inyectables y reabsorbibles, que se auto-endurecen para formar hidroxiapatita deficientemente cristalina a temperatura ambiente y corporal cuando hace contacto con una solución acuosa, combinando uno o más fosfatos de calcio escasamente solubles junto con un ácido y base para producir un cemento autofraguable con porosidad interconectada. De conformidad con la invención, la principal fracción del componente de polvo consiste de los siguientes compuestos de fosfato de calcio principales en porcentajes reducidos: a-TCP o TTCP, BCP, y ACP. Las partículas de a-TCP o TTCP típicamente tienen una mediana de tamaño de partícula de aproximadamente 7 mieras. Los granulos de BCP macoporosos (que consisten de una mezcla íntima de HA y ß-TCP en relaciones de HA/ß-TCP variables) tienen un tamaño de partícula típico entre aproximadamente 40 y 600 mieras, preferiblemente entre aproximadamente 200 y 500 mieras. El ACP puede ser no estabilizado (sólo calcio y fosfato) o estabilizado (s-ACP), o una mezcla de ambos. El ion estabilizador puede ser zinc (Zn-ACP), magnesio (Mg-ACP) pirofosfato (P2-ACP) o carbonato (ACCP) o una combinación de iones [LeGeros RZ (1991) "Calcium Phosphates in Oral Biology and Medicine". Monographs in Oral Sciences. Vol 15, Myers H. M. (ed) Karger, Basel]. La fracción menor y componentes de la mezcla de polvo comprenden monofosfato de calcio monohidratado (MCPM)] o monofosfato de calcio (MCP) o carbonato de calcio (CC) o carbonato-fosato de calcio amorfo (ACCP). Esta fracción menor también puede ser una mezcla de dos, tres o cuatro de esos compuestos. El componente líquido usado con los polvos consiste de una solución acuosa con un pH que varía de aproximadamente 5 a 10. Este componente líquido se prepara disolviendo en una solución acuosa cantidades apropiadas de Na2HPO4 o K2HPO4 o NaH2P04 o KH2PO4 o una mezcla de las mismas. A fin de obtener una apatita deficientemente cristalina con el fraguado antes o después de la implantación, el pH del componente líquido debe ser preferiblemente entre 5 y 7. Otros aditivos también se pueden añadir al componente líquido. El componente de polvo por lo tanto comprende sales de fosfato de calcio con diferentes velocidades de disolución. La combinación de la matriz (que puede incluir a-TCP o TTCP, ACP, MCP, MCP, CC, ACCP) y los granulos de BCP macroporosos, pueden superar la reabsorción no controlada presentada por otros cementos, y permite el reemplazo oportuno del cemento al formar hueso nuevo. El porcentaje (p/p) de la combinación de los compuestos de fosfato de calcio excluyendo BCP es de aproximadamente 10% a 70% basado en el peso seco total de la fase de polvo. El contenido (% p/p) del fosfato de calcio amorfo no estabilizado o estabilizado, es de aproximadamente 5% a 30% basado en el peso seco total de la fase de polvo. El contenido (% p/p) de los grániulos de BCP macroporosos es de aproximadamente 10% a 70% basado en el peso seco total de la fase de polvo. El contenido (% p/p) de la fracción menor es de aproximadamente 1 % a 10 % basado en el peso seco total de la fase de polvo. La presente invención puede controlar además la consistencia e incrementar la capacidad de inyección de la pasta de cemento que resulta de mezclar el polvo y el líquido disolviendo oligómeros y polímeros biodegradables en la fase líquida antes de mezclar los componentes de polvo y líquido. El polímero biodegradable se puede seleccionar del grupo de ácido hialurónico, sales de hialuronato, hidroxipropilmetilcelulosa, dextrano, alginato, quitosán, agarosa, polietilenglicoles (PEG), metacrilatos de polihidroxietileno (HEMA), proteínas sintéticas y naturales, o colágeno. La disolución de los polímeros en la pasta resultante del cemento de fosfato de calcio mejorará la capacidad de inyección de la pasta de cemento de fosfato de calcio. Los principales compuestos de fosfato de calcio se pueden combinar con otros aditivos tales como sulfato de calcio hemihidratado o sulfato de calcio dihidratado o una combinación de ambos que se puede usar para regular el tiempo de fraguado o para actuar como agentes formadores de poros debido a su disolución rápida. Además, el cemento puede incorporar ingredientes farmacéuticamente activos o sustancias biológicamente y fisiológicamente activas que tienen una amplia gama de aplicaciones, preferiblemente seleccionadas del grupo de antibióticos, fármacos antiinflamatorios, fármacos anti-cancerosos, péptidos, y proteínas tales como factores de crecimiento. Los factores de crecimiento pueden ser tales como BMP (proteína morfogenética de hueso), FGF (factor de crecimiento de fibroblastos). El antibiótico es preferiblemente una gentamicina o una sal de gentamicina, típicamente sulfato de gentamicina. Debido a su estructura y propiedad de disolución, los cementos de fosfato de calcio son capaces de liberar lentamente los ingredientes activos en el ambiente dentro de unos cuantos días después de la implantación.

EJEMPLO 1 Preparación de fosfato de calcio amorfo (ACP) y ACP modificado a 25°C (i) Fosfato de calcio amorfo: ACP Reactivos: Na2HPO4.2H2O (0.25 moles/I); CaCI2.2H2O (0.75 moles/I). (Estas concentraciones dieron una concentración de fosfato final de 0.15 moles/l y una relación molar de Ca/P de 1.71). La solución de calcio se añadió rápidamente con agitación a la solución de fosfato. Todas las soluciones se ajustaron a pH 10 con NaOH concentrado antes del mezclado. La fase sólida inicial formada inmediatamente al mezclarse se filtró, se lavó (con agua destilada + NaOH, pH 10), y después se secó por congelamiento. (¡i) Fosfato de calcio amorfo que contiene carbonato: ACCP Reactivos: Na2HPO4. 2H2O (0.25 M), NaHCO3 (0.25 M), CaCI2.2H2O (0.75 M). relación de solución molar de CO3 P = 5/1. Las soluciones de calcio y (fosfato+carbonato) se ajustaron primero a pH 10 usando NH4OH. 100 ml de la solución de calcio se añadió rápidamente a la solución de fosfato y carbonato bajo agitación (100 mi). El precipitado se filtró, se lavó (con agua destilada + NaOH, pH 10), después se secó por congelamiento. (iii) Carbonato-fosfato de calcio amorfo que contiene fluoruro: ACCP-F Reactivos: Na2HPO4. 2H2O + NaHCO3 + NaF (0.25 M); CaCI2. 2H2O (0.75 M) (relación molar de CO3/P = 5/1 ; F/P = 0.1/1 ) (iv) Carbonato-fosfato de calcio amorfo que contiene magnesio: ACCP-Mq Reactivos: Na2HPO4.2H2O + NaHCO3 (0.25 M); CaCI2.2H2O + Mg(CI)2, 6H2O (0.75 M) (relación molar de COs P 5/1 ; Mg/Ca 0.2/1 ) (v) Carbonato-fosfato de calcio amorfo que contiene zinc: ACCP-Zn Reactivos: Na2HPO4.2H2O + NaHCO3 (0.25M); CaCI2.2H2O + Zn(CI)2, 6H2O (0.75 M) (relación molar de CO3/P 5/1 ; Zn/Ca 0.03/1 ) Caracterización de las preparaciones de fosfato de calcio amorfo: La figura 1A muestra el patrón de difracción de rayos X típico de un fosfato de calcio amorfo caracterizado por un fondo alto y ausencia de cualesquiera picos de difracción. La figura 1B muestra un espectro de infrarrojo (FTIR) de la preparación de carbonato-fosato de calcio amorfo (ACCP) secada por congelamiento. Las bandas de absorción de FTIR para grupos de CO3 (a 1420 a 1450 cm"1; 970 a 980 cm"1) y para grupos P04 (a 950 a 1200 cm"1 y 450 a 650 cm"1) están presentes. La falta de resolución de las bandas de absorción de PO4 son características típicas de ACCP.

EJEMPLO 2 Preparación de una formulación de cemento de fosfato de calcio Se prepararon muestras de cemento con relación de líquido a polvo diferente. Para una formulación, el polvo del cemento contenía 45% de a-TCP, 15% de ACCP, 30% de granulos macroporosos de BCP (40-200 µ), 5% de MCPA y 5% de CC. El HA/ß-TCP del BCP fue de 60/40. La relación de líquido/polvo L/P de los cementos varió de 0.30 o 0.32 o 0.35 o 0.40 ml/g. La concentración de líquido fue de 3% de Na2HPO4/NaH2PO4 en agua, y el pH del líquido varió de 5 a 10. Los tiempos de fraguado inicial y final se determinaron con agujas de Gilmore. Se usaron moldes de Teflon para preparar cilindros de cemento con una altura de 12 mm y un diámetro de 6 mm y el remojo se llevó a cabo durante 1 hr, 24 hr, 1 y 3 días en solución de Ringer a 37°C antes de la determinación de la resistencia a la compresión. Se usó microscopía electrónica de barrido (SEM) para análisis microstructural. Finalmente, las muestras se trituraron usando un mortero y pistilo para análisis de difracción de polvo por rayos X. Se usó porosimetría de mercurio para mediciones de porosidad. La presencia de macroporosidad es evidente incluso 24 hr después del fraguado (figura 2). El producto final de la reacción fue apatita poco cristalina de una formulación con la composición anteriormente descrita y con una relación de líquido a polvo UP = 0. 40 ml/g, concentración de líquido, 3% de Na2HPO4/NaH2PO4 en agua y un pH de 6.5. Se observó la conversión significativa de algunos de los compuestos de fosfato de calcio en el componente de polvo a apatita (mostrada por grumos pequeños de cristales) (figura 3A). En comparación, se observaron cristales de apatita mucho más grandes durante la conversión de CPC que consistía principalmente de oc-TCP (figura 3B). La composición multifásica del cemento es aún evidente en el perfil de difracción de rayos X 24 horas después del fraguado (figura 4A). La conversión principalmente a carbonato de hidroxiapatita se observa 48 horas después del tiempo de fraguado (figura 4B).

EJEMPLO 3 Respuesta de células in vitro a preparaciones de cemento Ocho formulaciones con diferente fosfato de calcio amorfo se prepararon para determinar la respuesta de las células. Formulación A, a-TCP, ACCP-Zn, MCPA y CC Formulación B, a-TCP, ACCP-Zn, MCPA y CC + granulos BCP (40-200 mieras) Formulación C, a-TCP, ACCP-Mg, MCPA y CC + granulos BCP (40-200 mieras) Formulación D, a-TCP, ACCP-F, MCPA y CC + granulos BCP (40-200 mieras) (Para todas las formulaciones, los granulos macroporosos BCP consistieron de 60HA/40ß-TCP). Relación líquido a polvo UP = 0.40 ml/g; Líquido pH, 6.5; 1 hora y 24 horas después del fraguado, los cementos se remojaron a 37°C en solución de Ringer. Se prepararon muestras de disco y se esterilizaron usando autoclave durante 30 minutos a 121 °C. Se usaron células MC3T3-E1 , una línea de células no transformadas establecidas de cráneos de ratones recién nacidos. Células MC3T3-E1 se hicieron crecer en medio alfa MEM complementado con 10% de FCS, 1 % de penicilina/estreptomicina y 1% de L-glutamina. Las células se subcultivaron una vez a la semana usando tripcina/EDTA y se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 en aire. El medio se renovó completamente cada dos días. Las células se cultivaron en discos de diferentes muestras de cemento en placas de 24 pozos a una densidad final de 10 000 células/cm2. Las células cultivadas en ausencia de los materiales se usaron como controles. Después de 15 días, los medios se removieron y 100 ml de solución MTS se añadió en cada pozo durante 2-3 hr. La medición colorimétrica de colorante de formazan se realizó en un éspectrofotó metro con una lectura de OD a 490 nm. Los discos se fijaron con 4% de glutaraldehído en PBS (pH 7.2) durante 1 hr 30 a 4°C. Después de la deshidratación en alcoholes graduados, los especímenes se trataron con una mezcla graduada de etanol/triclorotrifluoroetano (75/25,50/50, 25/75 y 0/100). Después se revistieron por espurreado con oro-paladio y finalmente se observaron en microscopio electrónico de barrido. Morfología y proliferación celular. Los resultados de análisis de SEM mostraron que las células en los discos de diferentes formulaciones de cemento exhibieron diseminación mayor e interconexiones celulares (figuras 5A a 5D). La viabilidad de las células se midió como actividad de deshidrogenasa dependiente de NADH/NADPH mitocondrial, dando por resultado la conversión celular de la sal de tetrazolio MTS en un colorante de formazán soluble con la prueba de proliferación celular no reactiva acuosa CelITiter 96. Los resultados se expresaron como actividad de MTS relativa comparada con condiciones de control (células cultivadas en ausencia de los discos de cemento). Los resultados mostraron que la viabilidad de las células en presencia de los discos de cemento no fue estadísticamente diferente a la de los controles (figura 6).

EJEMPLO 4 Experimentos con animales Se prepararon muestras de cemento mezclando polvo y líquido esterilizados. Se probaron dos composiciones. Las composiciones de cemento fueron (a) 45% de a-TCP, 15% de ACCP, 30% de granulos de BCP (40-200 mieras), 5% de MCPA y 5% de CC y (b) 45% de a-TCP, 15% de ACCP-F, 30% de granulos de BCP (40-200 mieras), 5% de MCPA y 5% de CC. Relación líquido a polvo L/P = 0.40 ml/g; El líquido a pH 6.5 se usó para ambas composiciones. Las pastas de cemento se inyectaron en el defecto de hueso quirúrgicamente creado (3 mm de diámetro) en femoral de rata. Se realizaron implantaciones bilateralmente en seis ratas en condiciones asépticas y bajo anestesia general. Las primeras tres ratas fueron sacrificadas después de 2 semanas. Las segundas tres ratas fueron sacrificadas después de 3 semanas. Los resultados no mostraron diferencia entre 2 y 3 semanas y la matriz de cemento se disolvió parcialmente formando una estructura abierta y porosidad interconectiva (figuras 7A-7B). Se observó hueso nuevo directamente en contacto con los granulos de BCP (figuras 7A-7B). Aunque la presente invención se ha descrito en términos de modalidades específicas de la misma, en vista de la presente descripción se entenderá que numerosas variaciones a la invención ahora pueden hacerlas los expertos en la técnica, variaciones que aún están dentro del alcance de la presente enseñanza. Por consiguiente, la invención debe considerarse ampliamente, y está limitada únicamente por el alcance y espíritu de las reivindicaciones ahora anexas a la misma.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición de cemento de fosfato de calcio autofraguable que comprende una mezcla de un polvo y una fase líquida que da como resultado la formación de una apatita poco cristalina similar a la apatita de hueso como el producto final del autofraguado; la fase de polvo comprendiendo compuestos de fosfato de calcio de diferentes regímenes de reabsorbabilidad, la fracción mayor de la fase de polvo comprendiendo a-TCP o TTCP, granulos de fosfato de calcio bifásico macroporoso (BCP) que consisten de una mezcla de HA y ß-TCP en relaciones de HA/ß-TCP seleccionadas, y ACP o ACP estabilizado; y la fracción menor de la fase de polvo comprendiendo uno o más miembros seleccionados del grupo que consiste de fosfato de monocalcio, monofosfato de calcio monohidratado, carbonato de calcio y ACCP.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la fase líquida de la composición de cemento comprende una solución de fosfato de sodio con pH que varía de 5 a 10.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la relación p/p de los granulos de BCP a los compuestos de fosfato de calcio restantes se selecciona de tal manera que el resultado final de su combinación no cambia el pH final de la mezcla de los componentes de polvo y líquidos.

4.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque los granulos de BCP comprenden 80 a 20% en peso de los componentes de polvo totales.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la mayor parte del peso de los compuestos de fosfato de calcio es provista por alfa-trifosfato de calcio.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la mayor parte del peso de los compuestos de fosfato de calcio es provista por tetrafosfato de calcio.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la mayor parte del peso de los compuestos de fosfato de calcio comprende alfa-trifosfato de calcio y/o tetrafosfato de calcio.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el fosfato de calcio amorfo es estabilizado por uno o más iones seleccionados del grupo que consiste de iones de carbonato, magnesio, zinc, fluoruro y pirofosfato.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque los granulos de fosfato de calcio granulos bifásicos macroporosos tienen un tamaño de partícula entre aproximadamente 40 mieras y 600 mieras.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el porcentaje (% p/p) de ia combinación de los compuestos de fosfato de calcio excluyendo BCP es de 10% a 70% basado en el peso seco total de la fase de polvo.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el contenido (% p/p) del fosfato de calcio amorfo no estabilizado o estabilizado, es de 5% a 30% basado en el peso seco total de la fase de polvo.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el contenido (% p/p) de los granulos macroporosos de BCP es de 10% a 70 % basado en el peso seco total de la fase de polvo.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el contenido (% p/p) de la fracción menor es de 1% a 10% basado en el peso seco total de la fase de polvo.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el líquido del cemento comprende ortofosfato de sodio u ortofosfato de potasio.

15.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la fase líquida tiene un pH por abajo de 7.

16.- La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque comprende un polímero biodegradable como un aditivo para controlar la reología del cemento.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la mezcla de cemento incluye además uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste de un ingrediente activo farmacéutico, un fármaco terapéutico, un factor de crecimiento, y una proteína o péptido biológicamente activo.

18.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el factor de crecimiento es una proteína morfogénica de hueso, un factor de crecimiento de fibroblastos, un factor de crecimiento de tejido, o un factor de crecimiento de la superfamilia TGFbeta, o moléculas de proteína bioactivas.

19.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la mezcla comprende además sulfato de calcio hemihidratado, y/o sulfato de calcio deshidratado.

20.- La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el valor de pH medible de la pasta de cemento durante el fraguado es de aproximadamente 7.