MXPA06008843A - Especies oxidables como referencia interna para biosensores y metodo de uso - Google Patents

Abstract

Se proporciona un biosensor (102) para determinar la presencia o cantidad de una sustancia en una muestra y métodos para el uso del biosensor (102). El biosensor (102) que recibe una muestra del usuario a analizarse incluye una mezcla para la reacción electroquímica con un analito. La mezcla incluye una enzima, un mediador y una especie oxidable como una referencia interna. Las figuras más representativas de la invención son las números 1A, 1B, 1C y 1D.

Description

ESPECIES OXIDABLES COMO REFERENCIA INTERNA PARA BIOSENSORES Y MÉTODO DE USO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general a un biosensor y, más particularmente, a un biosensor nuevo y mejorado, que incluye una especie oxidable como una referencia interna y métodos de uso del biosensor, para determinar la presencia o cantidad de una sustancia en una muestra.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR La determinación cuantitativa de analitos en fluidos corporales es de gran importancia en las diagnosis y el mantenimiento de ciertas anormalidades fisiológicas. Por ejemplo, lactato, colesterol y bilirrubina deben ser supervisados en ciertos individuos. En particular, la determinación de la glucosa en fluidos corporales es de gran importancia para individuos diabéticos quienes deben verificar frecuentemente el nivel de glucosa en sus fluidos corporales como un medio para regular el insumo de glucosa en sus dietas . Mientras que el resto de la descripción de este documento será dirigida hacia la determinación de glucosa, se debe entender que el elemento sensor nuevo y mejorado y el método de uso de esta invención pueden utilizarse para la determinación de otros analitos con la selección de la enzima apropiada. Los métodos para determinar la concentración de analitos en fluidos pueden' basarse en la reacción electroquímica entre el analito y una enzima específica para el analito y un mediador que mantiene la enzima en su estado de oxidación inicial. Las enzimas redox adecuadas incluyen oxidasas, deshidrogenasas, catalasa y peroxidasa. Por ejemplo, en el caso donde la glucosa es el analito, la reacción con glucosa oxidasa y oxígeno es representada por la ecuación: Glucosa oxidasa (GO) Glucosa+02 — > gluconolactona+ H202 (A) En el paso inicial de la reacción representada por la ecuación (A) , la glucosa presente en la muestra de prueba convierte la enzima (Eox) , tal como el centro oxidado de flavina-adenina-dinucleótido (FAD) de la enzima en su forma reducida (Ered) , por ejemplo, (FADH2) . Debido a que estos centros redox están aislados eléctricamente en esencia dentro de la molécula de la enzima, la transferencia directa de electrones a la superficie de un electrodo convencional no ocurre a ningún grado mesurable en ausencia de una tensión de celda inaceptablemente alta. Un mejoramiento a este sistema implica el uso de un acoplamiento redox no fisiológico entre el electrodo y la enzima para alternar electrones entre el (FADH2) y el electrodo. Esto es representado por el siguiente esquema en el cual el acoplador redox, referido típicamente como un mediador, es representado por M: Glucosa+GO(FAD) -?- gluconolactona+ GO(FADH2) GO (FADH2) + 2Mox ? GO (FAD) + 2Mre + 2H+ 2Mred - 2Mox + 2e" (en el electrodo) En el esquema, GO (FAD) representa la forma oxidada de glucosa oxidasa y G0(FADH2) indica su forma reducida. La especie mediadora M0?/Mred alterna electrones de la enzima reducida al electrodo oxidando con lo cual la enzima causando su regeneración in situ. Las patentes norteamericanas Nos. 5,620,579 y ,653,863 expedidas a Gensha y colaboradores, y asignadas al presente cesionario, describen aparatos y un método para determinar la concentración de un analito en una muestra de prueba del fluido al aplicar la muestra de prueba del fluido a la superficie de un electrodo de trabajo, el cual está conectado electroquímicamente a un contraelectrodo y cuya superficie lleva una composición que comprende una enzima específica para el analito. Un mediador es reducido en cuanto a su respuesta a una reacción entre el analito y la enzima. Un potencial de oxidación se aplica entre los electrodos para regresar al menos una porción del mediador nuevamente a su forma oxidada antes de determinar la concentración del analito para incrementar con lo cual la precisión de la determinación del analito. Después de este potencial aplicado inicialmente, el circuito es conmutado a un circuito abierto o a un potencial que reduce sustancialmente la corriente para minimizar la proporción del potencial electroquímico en el electrodo de trabajo. Un segundo potencial se aplica entre los electrodos y la corriente generada en la muestra de prueba del fluido es medida para determinar la concentración del analito. Opcionalmente, la precisión de la determinación del analito es mejorada adicionalmente de manera algorítmica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los aspectos importantes de la presente invención son para proporcionar un biosensor nuevo y mejorado para determinar la presencia o cantidad de una sustancia en una muestra que incluye una especie oxidable como referencia interna y un método de uso del biosensor. En resumen, se proporciona un biosensor para determinar la presencia o cantidad de una sustancia en una muestra y los métodos de uso del biosensor. El biosensor para recibir una muestra del usuario a ser analizada incluye una mezcla para una reacción electroquímica con un analito. La mezcla incluye una enzima, un mediador y una especie oxidable como referencia interna. La referencia interna es definida como la especie oxidable la cual en una modalidad puede ser definida adicionalmente como la forma reducida de un acoplamiento redox reversible que tiene un potencial redox igual o más alto que aquel del mediador. La referencia interna actúa para incrementar la corriente de respuesta por adición para los potenciales de operación que oxidan ambas especies y en el caso donde la glucosa es el analito, una corriente de respuesta total es representada por: Itotal= -E±nt-ref + Iglucosa I±nt-ret °c (referencia interna) y Igiucos 8 (glucosa) ; Donde Iint-ref es la porción de la corriente de respuesta total debido a la referencia interna, mientras que Ig?Ucosa es debido a la oxidación del mediador proporcional a la concentración de glucosa. De acuerdo con las características de la invención, la referencia interna puede ser ya sea la misma especie del mediador o una especie oxidable con un potencial redox más alto que el mediador. De esta manera, para los biosensores con un potencial de operación bajo que oxidan solo el mediador, la corriente Iint-ref será cero. Sin embargo, para los biosensores con un potencial de operación más alto que oxida ambas especies, la corriente de respuesta total será la suma de la porción debido a la referencia interna y debido a la glucosa. Puesto que la concentración de la referencia interna es fija, la pendiente de calibración del sensor dependerá únicamente de la respuesta del sensor para la glucosa mientras que la intercepción dependerá de la cantidad agregada de la referencia interna. En otras palabras, la referencia interna desviará únicamente la intercepción y no cambiará la pendiente de calibración. De esta manera, el concepto de referencia interna proporciona formas nuevas y diferentes para hacer biosensores de glucosa.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención junto con los objetivos y ventajas anteriores y aún otros puede ser mejor entendida a partir de la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención ilustradas en los dibujos, en donde: la Figura ÍA es una representación de un diagrama de bloques del medidor de biosensor que incluye un biosensor que tiene una referencia interna de acuerdo con la presente invención; las Figuras IB, 1C y ID son diagramas que ilustran respectivamente los métodos de funcionamiento para el uso con el biosensor de la Figura 1 de la invención; las Figuras 2A, 2B y 2C son diagramas que muestran tres tensomogramas cíclicos de los biosensores de glucosa basados en MLB con ferrocianuro como la referencia interna del biosensor de la Figura 1 de la invención en muestras de sangre entera de 0 mg/dL de glucosa; la Figura 3 es un diagrama que ilustra una respuesta lineal del biosensor de la Figura 1 de la invención a diferentes potenciales operativos de tensión; la Figura 4 es un diagrama que ilustra el efecto de la referencia interna agregada a la corriente tensométrica total utilizando los biosensores de la Figura 1 de la invención con ferricianuro impreso al 10% como el contraelectrodo; las Figuras 5A y 5B son diagramas que ilustran la respuesta lineal y la intercepción incrementada con el incremento de la referencia interna de los biosensores basados en MLB de la Figura 1 de la invención con Ag/AgCl como el contraelectrodo; las Figuras 6A y 6B son diagramas que ilustran la respuesta lineal y la intercepción incrementada con el incremento de la referencia interna de los biosensores basados en MLB de. la Figura 1 de la invención con ferricianuro al 10% como el contraelectrodo; la Figura 7 es un diagrama que ilustra la relación lineal de la intercepción de calibración con el incremento de la referencia interna, creciente de los biosensores DEX de la Figura 1 de la invención con ferricianuro al 10% como el contraelectrodo; y las Figuras 8A y 8B son diagramas que ilustran la relación de la señal con respecto a los resultados de referencia del análisis por inyección en flujo (FIA, por sus siglas en inglés) del ferrocianuro residual de una tinta reactiva de control y la tinta reactiva con ferrocianuro al 0.1% agregado a la mezcla reactiva de ferricianuro al 20% de un biosensor de la Figura 1 de la invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se refiere a un biosensor electroquímico para determinar la presencia o cantidad de una sustancia en una muestra. El biosensor incluye tiras sensoras que contienen un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, cada uno de los cuales está cubierto al menos parcialmente con, por ejemplo, una capa separada de reactivo. La capa de reactivo sobre el electrodo de trabajo incluye, por ejemplo, una enzima que interactúa con un analito a través de una reacción de oxidación-reducción y también incluye un mediador que es la forma oxidada de un acoplamiento redox. El biosensor de la invención incluye una referencia interna o una forma reducida del mediador en la capa de reactivo sobre el electrodo de trabajo. La referencia interna es definida como una especie oxidable la cual en una modalidad puede definirse adicionalmente como una forma reducida de un acoplamiento redox, reversible que tiene un potencial redox igual o más alto que aquel del mediador. Una cantidad cuantitativa, fija de la referencia interna se proporciona en la capa de reactivo. Los biosensores de la invención que incluyen la referencia interna o una cantidad agregada de la forma reducida del mediador proporcionan mejoramientos en cuanto a que la referencia interna actúa para asegurar la intercepción de calibración inherente de la termodinámica mientras que mantiene la pendiente de calibración. Muchos compuestos son útiles como mediadores debido a su capacidad para aceptar electrones de la enzima reducida y transferirlos al electrodo. Un atributo necesario de un mediador es la capacidad para permanecer en el estado oxidado bajo las condiciones presentes en la superficie del electrodo antes del uso del sensor. Entre los mediadores más venerables están la forma oxidada de compuestos organometálicos, moléculas orgánicas, complejos de coordinación de metales de transición. Un ejemplo específico de un mediador es el hexacianoferrato de potasio (III) , también conocido como ferricianuro. Como se utiliza en la siguiente especificación y las reivindicaciones, el término biosensor significa una tira sensora, electroquímica o elemento sensor de un dispositivo analítico o un instrumento que responde selectivamente a los analitos en una muestra apropiada y convierte su concentración en una señal eléctrica. El biosensor genera directamente una señal eléctrica, facilitando un diseño de instrumento simple. También, un biosensor ofrece la ventaja de bajo costo del material puesto que una capa delgada de químicos es depositada sobre los electrodos y se desperdicia poco material . El término "muestra" se define como una composición que contiene una cantidad desconocida del analito de interés. Típicamente, una muestra para el análisis electroquímico está en forma líquida y preferiblemente la muestra es una mezcla acuosa. Una muestra puede ser una muestra biológica, tal como sangre, orina o saliva. Una muestra puede ser un derivado de una muestra biológica, tal como un extracto, una dilución, un producto filtrado o precipitado reconstituido. El término "analito" se define como una sustancia en una muestra, la presencia o la cantidad del cual debe determinarse. Un analito interactúa con la enzima oxidorreductasa que está presente durante el análisis y puede ser un substrato para la oxidorreductasa, una coenzima u otra sustancia que afecta la interacción entre la oxidorreductasa y su substrato. El término "oxidorreductasa" se define como cualquier enzima que facilita la oxidación o reducción de un substrato . El término oxidorreductasa incluye "oxidasas" , que facilitan las reacciones de oxidación en las cuales el oxígeno molecular es el receptor de electrones; "reductasas", que facilitan las reacciones de reducción en las cuales el analito es reducido y el oxígeno molecular no es el analito; y "deshidrogenasas" , que facilitan las reacciones de oxidación en las cuales el oxígeno molecular no es el receptor de electrones. Véase, por ejemplo, Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised Edi tion, A.D. Smith, Ed. , Nueva York: Oxford University Press (1997) páginas 161, 476, 477 y 560. El término reacción de "oxidación-reducción" se define como una reacción química entre dos especies que implica la transferencia de al menos un electrón de una especie a la otra especie. Este tipo de reacción también es referida como una "reacción redox" . La porción de oxidación de la reacción implica la pérdida de al menos un electrón por una de las especies y la porción de reducción implica la adición de al menos un electrón a la otra especie. La carga iónica de una especie que es oxidada se hace más positiva por una cantidad igual al número de electrones transferidos. De igual manera, la carga iónica de una especie que es reducida se hace menos positiva por una cantidad igual al número de electrones transferidos. El término "número de oxidación" es definido como la carga iónica, formal de una especie química, tal como un átomo. Un número de oxidación más alto, tal como (III) , es más positivo y un número de oxidación más bajo, tal como (II) , es menos positivo. Una especie neutra tiene una carga iónica de cero. La oxidación de una especie da por resultado un incremento en el número de oxidación de esa especie y la reducción de una especie da por resultado una disminución en el número de oxidación de esa especie. El término "par redox" se define como dos especies de una sustancia química que tienen diferentes números de oxidación. La reducción de la especie que tiene el número de reducción más alto produce la especie que tiene el número de oxidación más bajo. Alternativamente, la oxidación de la especie que tiene el número de oxidación más bajo produce la especie que tiene el número de oxidación más alto. El término "especie oxidable" se define como la especie de un par redox que tiene el número de oxidación más bajo y la cual es capaz, de esta manera, de ser oxidada para ser la especie que tiene el número de oxidación más alto. De igual manera, el término "especie reducible" se define como la especie de un par redox que tiene el número de oxidación más alto y la cual es capaz, de esta manera, de ser reducida para ser la especie que tiene el número de oxidación más bajo. El término "complejo metálico de organotransición" también conocido como "complejo OTM" se define como un complejo donde un metal de transición es enlazado a al menos un átomo de carbono a través de un enlace sígma (carga formal de -1 en el átomo de carbono sigma enlazado al metal de transición) o un enlace pi (carga formal de 0 en los átomos de carbono pi enlazados al metal de transición) . Por ejemplo, el ferroceno es un complejo OTM con dos anillos de ciclopentadienilo (Cp) , cada uno enlazado a través de sus cinco átomos de carbono a un centro de hierro por dos enlaces pi y un enlace sigma. Otro ejemplo de un complejo OTM es ferricianuro (III) y su contraparte ferrocianuro (II) reducido, donde seis ligandos de ciano (carga formal de -1 en cada uno de los 6 ligandos) son enlazados a través de un enlace sigma a un centro de hierro a través de los átomos de carbono de los grupos ciano . El término "complejo de coordinación" se define como un complejo que tiene una geometría de coordinación bien definida, tal como geometría plana octaédrica o cuadrada. A diferencia de los complejos OTM, los cuales son definidos por su enlace, los complejos de coordinación son definidos por su geometría. De esta manera, los complejos de coordinación pueden ser complejos OTM (tal como el ferricianuro mencionado anteriormente) o complejos donde los átomos diferentes de carbono que no son metálicos, tales como heteroátomos que incluyen nitrógeno, azufre, oxígeno y fósforo, son enlazados dativamente al centro del metal de transición. Por ejemplo, la hexaamina de rutenio, o hexaaminorrutenato (11)/ (III), es un complejo de coordinación que tiene una geometría octaédrica bien definida donde seis ligandos de NH3 (carga formal de 0 en cada uno de los 6 ligandos) son enlazados dativamente al centro de rutenio. El ferricianuro también es un ejemplo del complejo de coordinación que tiene la geometría octaédrica. Una descripción más completa de los complejos de metales de organotransición, complejos de coordinación y enlace de metales de transición se puede encontrar en Coliman y colaboradores, Principies and Applications of Órgano trans i tion Metal Chemistry (1987) y Miessler & Tarr, Inorganic Chemistry (1991) . El término "mediador" es definido como una sustancia que puede ser oxidada o reducida y que puede transferir uno o más electrones entre una primera sustancia y una segunda sustancia. Un mediador es un reactivo en un análisis electroquímico y no es el analito de interés. En un sistema simplista, el mediador se somete a una reacción redox con la oxidorreductasa después de que la oxidorreductasa ha sido reducida u oxidada a través de su contacto con un substrato apropiado. Este mediador oxidado o reducido entonces se somete a la reacción opuesta en el electrodo y es regenerado a su número de oxidación original . El término "molécula orgánica, electroactiva" se define como una molécula orgánica que no contiene un metal y que es capaz de someterse a una reacción de oxidación o reducción. Las moléculas orgánicas, electroactivas pueden comportarse como especies redox y como mediadores . Los ejemplos de moléculas orgánicas, electroactivas incluyen la coenzima pirroloquinolina-quinona (PQQ) , benzoquinonas y naftoquinonas, N-óxidos, compuestos nitrosos, hidroxilaminas, oxinas, flavinas, fenazinas, fenotiazinas, indofenoles e indaminas . El término "electrodo" se define como una sustancia eléctricamente conductiva que permanece estacionaria durante un análisis electroquímico. Los ejemplos de materiales de electrodos incluyen metales sólidos, pastas metálicas, carbono conductivo, pastas de carbono conductivo y polímeros conductivos.

Haciendo referencia ahora a los dibujos, en la Figura 1 se ilustra un medidor de biosensor designado como un conjunto por el carácter de referencia 100 de la modalidad preferida y ordenado de acuerdo con los principios de la presente invención. El medidor de biosensor 100 incluye un biosensor 102 ordenado de acuerdo con los principios de la presente invención. El medidor de biosensor 100 incluye un microprocesador 104 junto con una memoria asociada 106 para almacenar un programa y datos del usuario. Los datos digitales del microprocesador 104 se aplican a un convertidor digital a análogo (D/A) 108. El convertidor D/A 108 convierte los datos digitales a una señal análoga. Un amplificador 110 acoplado al convertidor D/A 108 amplifica la señal análoga. La salida de señal análoga amplificada del amplificador 110 es aplicada al biosensor 102 de la invención. El biosensor 102 está acoplado a un amplificador 112. La señal del sensor amplificada es aplicada a un convertidor de análogo a digital (A/D) 114 que convierte la señal de sensor análoga, amplificada a una señal digital. La señal digital es aplicada al microprocesador 104. La mayoría de los biosensores desechables, comercialmente disponibles que se utilizan para supervisar la glucosa en la sangre requieren la deposición/impresión de una mezcla de una enzima y un mediador con algún agente de enlace. Para la aplicación de la medición de glucosa, el mediador está en la forma oxidada de un acoplamiento redox. Dependiendo del acoplamiento redox, el mediador puede ser un oxidante muy fuerte, tal como ferricianuro, oxidando químicamente con lo cual los grupos funcionales después de la mezcla con la enzima y el agente de enlace. Subsecuentemente, una pequeña cantidad del mediador reducido se forma como impureza en el reactivo en los procesos de mezclado, almacenamiento e impresión. De esta manera, el resultado final del mezclado e impresión de la tinta reactiva es la generación de la forma reducida del acoplamiento redox, dando origen a la corriente de fondo. La formación de esta forma reducida del mediador y de esta manera la corriente de fondo puede variar de lote en lote. Esta forma reducida del mediador generada por el proceso, tal como ferrocianuro de ferricianuro, se puede oxidar en general para minimizar la señal de fondo utilizando el algoritmo resumido en las patentes norteamericanas Nos. 5,620,579 y 5,653,863 expedidas a Genshaw y colaboradores, y asignadas al presente cesionario. Sin embargo, la señal de fondo dependiente del proceso, la cual es traducida en la intercepción de calibración, se puede extender en un intervalo de valores . En los extremos de estos valores divergidos de la intercepción, se experimentará una precisión analítica debido a que no se puede asignar una intercepción de calibración razonable para acomodar la intercepción divergida. De acuerdo con las características de la invención, un grado de mediador que contiene un cierto nivel de la forma reducida del mediador en el reactivo se utiliza para disminuir el efecto del oxidante fuerte. Termodinámicamente, la presencia de una pequeña cantidad de la forma reducida del mediador en la mezcla de tinta de enzima y mediador disminuye la fuerza de impulsión para la conversión de la forma oxidada a la forma reducida. Esto se realiza ventajosamente al agregar una pequeña cantidad fija de la forma reducida del mediador al mediador oxidado. Aunque se generará una señal de fondo, el algoritmo en las patentes norteamericanas Nos. 5,620,579 y 5,653,863 minimizará el efecto del fondo para incrementar la precisión del sensor de glucosa. Las patentes identificadas anteriormente describen un método que reduce la polarización de fondo debido a las impurezas oxidables en un sensor amperométrico utilizado para medir un analito específico, tal como glucosa en sangre. La corriente de fondo de este sensor incrementará si se almacena durante un período de tiempo prolongado o bajo tensión (calor, humedad, etcétera) debido a la presencia incrementada del mediador reducido u otra impureza reducida que está presente en el sensor tal como estabilizadores enzimáticos, por ejemplo glutamato, y surfactantes que tienen equivalentes de reducción. Por ejemplo, en un sensor amperométrico basado en ferricianuro, la polarización de fondo está relacionada con la presencia de ferrocianuro (de la reducción de ferricianuro) cerca de la superficie del electrodo. Este ferrocianuro acumulado, que es opuesto al ferrocianuro producido durante el uso del sensor (ferrocianuro fresco) , es oxidado nuevamente a ferricianuro para reducir la polarización de fondo que causa y extiende con lo cual la vida útil del sensor. Para lograr este objetivo, el método utiliza un planteamiento electroquímico. La polarización de fondo es reducida adicionalmente cuando el planteamiento electroquímico es acrecentado con una corrección algorítmica. El método descrito implica aplicar primero un impulso de potencial positivo (llamado el impulso de "requemado") el cual precede al perfil de potencial normal durante el uso del biosensor. Esto se realiza típicamente al aplicar un potencial positivo de 0.1 a 0 . 9 voltios (preferiblemente de 0.3 a 0.7 voltios) entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia del sensor durante un período de 1 a 15 segundos (preferiblemente de 5 a 10 segundos) . El impulso de requemado oxida el ferrocianuro inicial (u otra impureza oxidable) , de manera que el sensor puede comenzar el ensayo con un fondo limpio. Típicamente, el fondo no está perfectamente limpio puesto que solo una porción de la impureza oxidable es oxidada por el impulso de requemado. Este es el caso debido a que la capa química cubre tanto el electrodo de trabajo como el contraelectrodo. El ferrocianuro inicial existe en la capa química puesto que proviene del ferricianuro. Cuando se aplica el fluido de muestra y se rehidrata la capa química, el ferrocianuro cerca del electrodo de trabajo es re- oxidado. El resto del ferrocianuro se difunde en el fluido de muestra y se mezcla con la glucosa. Esa porción del ferrocianuro inicial no puede ser re-oxidada sin afectar la glucosa. El ferrocianuro inicial está cerca del electrodo durante un tiempo muy corto (algunos segundos) después de que la muestra de prueba del fluido es aplicada. La razón de esto es que los químicos (enzima y ferricianuro, etcétera) son depositados como una capa delgada sobre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo. La técnica de requemado toma ventaja de esto puesto que una cantidad significativa del ferrocianuro inicial puede ser requemada sin una reducción perceptible de la concentración del analito en la muestra de prueba del fluido, la mayor parte de la cual no entra en contacto directo con el electrodo. Los experimentos han demostrado que la polarización de fondo de un sensor sometido a tensión puede reducirse en un 40% con la aplicación apropiada del impulso de requemado.

El método descrito de las patentes norteamericanas Nos. 5,620,579 y 5,653,863 se aplica de manera ventajosa para minimizar el efecto de la señal de fondo para incrementar la precisión del medidor de biosensor de glucosa 100 de la modalidad preferida. La materia objeto de las patentes identificadas anteriormente es incorporada en este documento a manera de referencia. De acuerdo con las características de la invención, la cantidad agregada de la forma reducida del mediador actúa para asegurar la intercepción de calibración inherente de la termodinámica mientras que mantiene la pendiente de calibración. En vista de la función que la forma reducida del mediador, por ejemplo ferrocianuro, juega en el sensor de glucosa, se prefiere como la referencia interna. Los ejemplos de mediadores de moléculas orgánicas electroactivas se describen en la patente norteamericana No. 5,520,786, expedida a Bloczynski y colaboradores el 28 de Mayo de 1996 y asignada al presente cesionario. En particular, un mediador descrito (compuesto 18 en la TABLA 1) que comprende 3-fenilimino-3H-fenotiazina referida en este documento como MLB-92, se ha utilizado para hacer un biosensor de glucosa 102 de acuerdo con las características de la invención. La materia objeto de la patente identificada anteriormente es incorporada en este documento a manera de referencia . Un medidor de biosensor y un biosensor comercialmente disponibles son fabricados y vendidos por Bayer Corporation bajo la marca comercial Ascensia DEX. El biosensor Ascensia DEX incluye generalmente una forma de ferricianuro tan pura como sea posible para el reactivo. El biosensor Ascensia DEX ha sido utilizado para hacer un biosensor de glucosa 102 de acuerdo con las características de la invención al agregar una cantidad adecuada de ferrocianuro al ferricianuro puro. Los beneficios de la adición del ferrocianuro que define la referencia interna del biosensor 102 a la tinta reactiva Ascensia DEX incluyen un beneficio inmediato en el incremento de la intercepción sin cambiar la pendiente, asegurando el intervalo de intercepción e incrementando la estabilidad a largo plazo del biosensor durante el almacenamiento . De acuerdo con las características de la invención, el mediador de MLB-92 que tiene un potencial redox inferior se utilizó para hacer un biosensor de glucosa 102 con propiedades especiales. Con la adición de cantidades adecuadas de la referencia interna, ferrocianuro, el nuevo sistema de biosensor se puede hacer para trabajar con dos potenciales de operación; (1) a 400 mV donde tanto el nuevo mediador como la referencia interna son oxidados y (2) a 100 mV donde solo el nuevo mediador puede ser oxidado. La significación de este planteamiento es doble. Primero, el biosensor de glucosa 102 tal como se formuló (nuevo mediador y referencia interna) se puede operar a un potencial alto (+400 mV) para producir corrientes en un intervalo que se ajusta a las características de calibración de los requerimientos del equipo físico del instrumento existente. En segundo lugar, puesto que es probable que el potencial redox inferior y de esta manera una potencia de oxidación inferior del mediador no tendrán virtualmente una conversión de la forma oxidada a la forma reducida del mediador, se puede aplicar un potencial de operación inferior (0 - 100 mV) al sensor para así evitar la oxidación de la referencia interna. De esta manera, un nuevo conjunto de características de calibración basadas en el nuevo mediador, más probablemente con una intercepción casi cero debido a la potencia de oxidación inferior, conducirá a una mejor precisión analítica para las mediciones de glucosa. También reducirá la interferencia de matriz en la sangre entera al evitar la oxidación de alguna de las especies oxidables, conocidas tales como ácido úrico y acetaminofeno. De acuerdo con las características de la invención, otra aplicación de la referencia interna para los sensores de glucosa 102 es agregar una cantidad adecuadamente grande de la referencia interna al sistema biosensor para producir una respuesta de corriente alta. Utilizando el algoritmo con doble número de pasos con un circuito abierto entre los mismos (patentes de Bayer #5,620,579 y #5,653,863), el primer paso de potencial se establece a 400 V para producir una corriente que es principalmente debido a la señal de referencia interna mientras que el segundo paso se establece a un potencial bajo (0 - 100 mV) para producir una señal de corriente relacionada con la concentración de glucosa únicamente. La relación de la primera señal, la cual debe ser virtualmente independiente del hematocrito de sangre entera, con respecto a la segunda señal a un potencial bajo se puede utilizar para corregir la polarización analítica debido al efecto del hematocrito . De acuerdo con las características de la invención, la referencia interna es definida como la especie oxidable la cual en una modalidad es definida adicionalmente como la forma reducida de un acoplamiento redox, reversible que tiene un potencial redox igual o más alto que - aquel del mediador. El concepto y uso de una referencia interna son muy comunes en el campo de la química analítica. Sin embargo, no se ha sugerido un ejemplo para utilizar una referencia interna para biosensores en las patentes o bibliografía existentes. En los tres escenarios descritos anteriormente, la referencia interna actúa para incrementar la corriente de respuesta por adición para los potenciales de operación que oxidan ambas especies y con glucosa como el analito; una corriente de respuesta total es representada por: Itotal = -tint-ref "1" glucosa int-ref °c (referencia interna) y Ig?UCosa 8 (glucosa) ; Donde I±nt-ref es I porción de la corriente de respuesta total debido a la referencia interna, mientras que Igiucos es debido a la oxidación del mediador proporcional a la concentración de glucosa. De acuerdo con las características de la invención, la referencia interna puede ser ya sea la misma especie del mediador o una especie oxidable con un potencial redox más alto que el mediador. De esta manera, para los biosensores con un potencial de operación bajo que oxida únicamente al mediador, la corriente int-ref será cero. Sin embargo, para los biosensores con un potencial de operación más alto que oxida ambas especies, la corriente de respuesta total será la suma de la porción debido a la referencia interna y aquella debido a la glucosa. Puesto que la concentración de referencia interna es fija, la pendiente de calibración del sensor dependerá únicamente de la respuesta del sensor para la glucosa mientras que la intercepción dependerá de la cantidad agregada de la referencia interna. En otras palabras, la referencia interna solo desviará la intercepción y no cambiará la pendiente de calibración. De esta manera, el concepto de la referencia interna proporciona formas nuevas y diferentes para hacer biosensores de glucosa. Con referencia ahora a las Figuras IB, 1C y ID, existen al menos tres modos de operación basados en el uso de una referencia interna para los biosensores de glucosa 102 de la invención. Potencioestáticamente, los tres modos de operación son representados en las Figuras IB, 1C y ID. Cada uno de los modos ilustrados de operación incluye un primer impulso de requemado, seguido por un segundo período de espera o circuito abierto y un tercer impulso de lectura final, cada impulso o período que tiene una duración seleccionada, por ejemplo 10 segundos. En la operación básica o más intermedia, el ferrocianuro es retenido en el ferricianuro a la concentración de 0.1 a 1% del ferricianuro total proporcionando la referencia interna para los biosensores de glucosa 102 de la invención. Esto es representado en la Figura IB donde ambos potenciales en el primer y tercer período están a la misma tensión, por ejemplo 400 mV. La retención de un pequeño porcentaje de ferrocianuro que define la referencia interna puede realizarse ya sea por medio de un proceso de purificación apropiado de ferricianuro o por la adición de una cantidad adecuada de ferrocianuro al ferricianuro puro . El resultado de estos procesos de retención es mantener deliberadamente una cantidad deseable de ferrocianuro en ferricianuro como un grado especial de ferricianuro. Esto contrasta con la sabiduría popular de tener una forma de ferricianuro tan pura como sea posible, tal como para el reactivo DEX, usualmente ferrocianuro en el orden de 0.05% de ferricianuro o menos como impureza. La cantidad más deseable es 0.1% de ferrocianuro en la formulación final para el sensor de DEX, lo cual conducirá al aseguramiento de la intercepción de calibración a un intervalo más estrecho mientras que se mantiene la pendiente de calibración para el sensor DEX. En la Figura 1C se muestra el segundo modo de operación, donde una cantidad deseable de ferrocianuro (la referencia interna) se agrega al reactivo de la enzima y un mediador con un potencial redox menor que aquel de la referencia interna. Se espera que el biosensor 102 trabaje bajo potenciales altos y bajos (por ejemplo a 400 mV y 100 mV contra Ag/AgCl) para los instrumentos existentes e instrumentos con un nuevo requerimiento del equipo físico. Este biosensor puede ser operado en programas de potenciales representados en la Figura IB para los instrumentos existentes 100 y la Figura 1C para los nuevos instrumentos 100. Los ejemplos de la combinación del mediador y la referencia interna incluyen el sistema de MLB-92 y ferrocianuro así como también hexaamina de rutenio y ferrocianuro. La separación de los dos potenciales redox es suficientemente grande de manera que no habrá generalmente una oxidación de la especie de referencia interna cuando se opere a baja tensión. En la Figura ID se muestra el tercer modo de operación, donde una concentración más alta pero deseable de ferrocianuro se agrega a la mezcla de reactivo de la enzima y un mediador con un potencial redox más bajo que aquel de la referencia interna. La cantidad de la referencia interna producirá preferiblemente una corriente equivalente de aproximadamente 50% a 75% de la escala completa en el intervalo de calibración. En el algoritmo de operación, el primer paso de potencial se establece para oxidar tanto al mediador como la referencia interna (400 mV) mientras que el segundo paso de potencial para el impulso de lectura es para oxidar al mediador únicamente (0 - 100 mV) . La corriente en el primer paso de potencial de la Figura ID será más pertinente para la referencia interna que inmediatamente después para el electrodo y no debe tener virtualmente un efecto del hematocrito. La relación de la corriente del segundo paso con respecto a aquella del primer paso proporcionará una corrección para la polarización analítica debido al efecto del hematocrito. Se han llevado a cabo experimentos para mostrar la factibilidad del método que consiste en agregar una referencia interna a un sistema mediador para superar los problemas existentes o para mejorar el desempeño del sensor de acuerdo con el biosensor 102 -de la invención. Con referencia ahora a las Figuras 2A, 2B y 2C, se muestran tres tensomogramas cíclicos que ilustran la operación del biosensor 102 de la invención. Los tres tensomogramas cíclicos ilustrados son para los biosensores de glucosas basados en MLB 102 con ferrocianuro como la referencia interna en muestras de sangre entera de 0 mg/dL de glucosa. La Figura 2A ilustra el electrodo de trabajo contra el contraelectrodo de ferricianuro, la Figura 2B ilustra el electrodo de trabajo contra el contraelectrodo de plata (Ag) y cloruro de plata (AgCl) o Ag/AgCl y la Figura 2C ilustra el electrodo de trabajo contra el contraelectrodo de MLB-92. Los picos respectivos etiquetados como 1 y 2 representan la oxidación del mediador de MLBred (forma reducida de MLB) y la referencia interna de ferrocianuro respectivamente para los tres esquemas de tensomograma . El pico de oxidación para MLBred se desplaza a lo largo de la escala de potencial a medida que el acoplamiento redox en el contraelectrodo cambia de ferricianuro a Ag/AgCl a MLB-92. Sin embargo, se puede observar que la posición relativa del mediador de MLB-92 con respecto a la referencia interna de ferrocianuro es la misma en los tres esquemas de tensomograma de las Figuras 2A, 2B y 2C. Con referencia a la Figura 3, se muestra en la misma un diagrama que ilustra una respuesta lineal del biosensor 102 de la invención a diferentes potenciales de operación de tensión. El biosensor 102 es operado a (1) un potencial de 400 mV y (2) un potencial de 150 mV. La Figura 3 ilustra la respuesta a la dosis lineal del biosensor basado en el mediador de MLB-92 102 con ferrocianuro 20 mM como la referencia interna. Las líneas respectivas etiquetadas como EJEMPLO 1 y EJEMPLO 2 son de potenciales de operación de 400 mV y 150 mV contra el contraelectrodo de Ag/AgCl . Como se muestra en la Figura 3, el biosensor 102 da virtualmente la misma pendiente pero con diferentes intercepciones para las operaciones a potenciales de 400 mV y 150 mV. Este resultado demuestra que la referencia interna puede ser oxidada o evitada selectivamente por el potencial de operación. De esta manera, un biosensor 102 puede servir para dos diferentes medidores . Los ejemplos del biosensor 102 han sido preparados sistemáticamente mostrando el incremento de la intercepción con el incremento de ferrocianuro como la referencia interna mientras que las pendientes se mantuvieron virtualmente sin cambios. Tres reactivos de electrodos de trabajo se prepararon en las siguientes formulaciones. Estos tres reactivos se depositaron con alfileres sobre dos formatos de sensores: (1) Ag/AgCl como el contraelectrodo, (2) ferricianuro impreso al 10% como el contraelectrodo .

La Figura 4 ilustra el efecto de la referencia interna agregada a la corriente tensométrica, total utilizando los biosensores 102 de la invención con ferricianuro impreso al 10% como el contraelectrodo. La Figura 4 proporciona tensomogramas cíclicos de sensores con ferrocianuro como la referencia interna en muestras de sangre entera de O mg/L de glucosa. Los tensomogramas etiquetados como A, B y C son con las formulaciones 1, 2 y 3 respectivamente en su totalidad con un contraelectrodo de ferricianuro impreso al 10%. El efecto de la referencia interna, agregada hacia la corriente tensométrica, total se muestra en la Figura 4 utilizando sensores con ferricianuro impreso al 10% como el contraelectrodo. Los picos principales de oxidación/reducción en este punto se centran alrededor de -0.38 Voltios contra ferricianuro al 10%, lo cual es debido al mediador de MLB . El pico de oxidación a aproximadamente 0 - 50 mV es debido a la referencia interna del ferrocianuro. Mientras que el pico de oxidación para el ferrocianuro de referencia interna incrementa con los incrementos de la concentración de la referencia interna de 0 a 4 a 8 mM, el pico de oxidación para el mediador está virtualmente sin cambios. En este punto, el concepto de referencia interna es explicado adicionalmente por el hecho que el pico de oxidación principal de MLBred se encuentra sin cambios por la presencia de la referencia interna. Con referencia a las Figuras 5A y 5B, se muestran diagramas que ilustran la respuesta lineal y la intercepción incrementada con el incremento de la referencia interna de los biosensores basados en MLB 102 de la invención con Ag/AgCl como el contraelectrodo. La Figura 5A ilustra la respuesta a la dosis lineal de los biosensores basados en MLB 102 con ferrocianuro 0, 4 y 8 mM, etiquetados respectivamente como EJEMPLO 1, EJEMPLO 2 y EJEMPLO 3. La Figura 5B ilustra la intercepción y la pendiente como una función del ferrocianuro agregado en el reactivo del electrodo de trabajo del biosensor 102 de la invención. Los tres sensores utilizaron Ag/AgCl como el contraelectrodo . También con referencia a las Figuras 6A y 6B, se muestran diagramas que ilustran la respuesta lineal y la intercepción incrementada con el incremento de la referencia interna de los biosensores basados en MLB 102 de la invención con ferricianuro al 10% como el contraelectrodo. La Figura 6A ilustra la respuesta a la dosis lineal de los biosensores basados en MLB 102 con ferrocianuro 0, 4 y 8 mM etiquetados respectivamente como EJEMPLO 1, EJEMPLO 2 y EJEMPLO 3. La Figura 6B ilustra la intercepción y la pendiente como una función del ferrocianuro agregado en el reactivo del electrodo de trabajo del biosensor 102 de la invención. Los tres sensores utilizaron ferricianuro impreso al 10% como el contraelectrodo . En los experimentos de respuesta a la dosis, ambas series de sensores con contraelectrodo de Ag/AgCl de las Figuras 5A y 5B y el contraelectrodo de ferricianuro al 10% de las Figuras 6A y 6B muestran una respuesta' lineal y una intercepción incrementada con el incremento de la referencia interna. Para propósitos prácticos, la pendiente de los tres sensores en las Figuras 5A y 5B se encuentra sin cambios mientras que la intercepción incrementa linealmente con el ferrocianuro agregado. La misma relación lineal de la intercepción con ferrocianuro agregado y la tendencia de pendiente plana se repiten en las series de sensores con el % de ferricianuro impreso como el contraelectrodo, como se muestra en las Figuras 6A y 6B. Se han llevado a cabo experimentos para mostrar la adición de ferrocianuro a la tinta reactiva DEX, la modificación de la intercepción de calibración sin cambiar la pendiente de acuerdo con el biosensor 102 de la invención. La Figura 7 ilustra la relación lineal de la intercepción de calibración con el incremento de la referencia interna de los biosensores de tipo DEX 102 de la invención. Cinco formulaciones diferentes en un formato establecido etiquetado como BC7 en la Figura 7 se hicieron con ferrocianuro al 0, 0.02, 0.04, 0.06 y 0.08% mezclado en el reactivo estándar DEX para el sensor DEX. La pendiente de regresión y las intercepciones para estos cinco sensores del formato BC7 se muestran en la Figura 7. Excepto por el sensor con ferrocianuro al 0.06% debido a problemas experimentales, las intercepciones de los otros cuatro sensores proporcionan una función lineal agradable con respecto a la cantidad agregada de ferrocianuro como la referencia interna. Por otra parte, las pendientes de los cinco sensores se encuentran en una línea plana indicando que la adición de la referencia interna no cambia la pendiente de los biosensores de tipo DEX 102 de la invención. Las Figuras 8A y 8B ilustran la relación de la señal con los resultados de referencia del análisis por inyección en flujo (FIA) del ferrocianuro residual de una tinta reactiva de control y la tinta reactiva con ferrocianuro al 0.1% agregado a la mezcla de reactivos de ferricianuro al 20% de un biosensor 102 de la invención. Uno de los efectos sutiles de la adición de la referencia interna de ferrocianuro a la tinta reactiva DEX es para disminuir la fuerza de impulsión para la conversión del mediador de ferricianuro a ferrocianuro. De esta manera, el ferricianuro se vuelve la fuente de la corriente residual en el sensor DEX. Una forma para mostrar este efecto sutil es supervisar el incremento de la corriente residual (corriente de fondo) de la tinta reactiva con la referencia interna junto con la tinta reactiva de control durante un período de tiempo prolongado. Ambas tintas reactivas se almacenaron en refrigeración (2 - 8°C) durante varias semanas . La Figura 8 muestra los resultados del FIA del ferrocianuro residual de ambas tintas reactivas . A partir de la Figura 8, la relación de la señal con respecto a la referencia (S/R) representa la cantidad relativa de ferrocianuro de la tinta reactiva en comparación con el ferrocianuro agregado como la referencia en el FIA. De esta manera, mientras más alto sea el valor de S/R del análisis FIA, mayor será el ferrocianuro en las tintas reactivas. Se puede observar a partir de la Figura 8A que el valor de S/R se incrementa durante el período de seis semanas tanto para las tintas de control como para la tinta reactiva con ferrocianuro agregado. Sin embargo, la curva de tinta reactiva con ferrocianuro agregado tiene un incremento más lento de corriente residual durante el período de seis semanas en comparación con las curvas de control . En la Figura 8B, las curvas de respuesta de S/R de las tintas de control y la tinta reactiva con ferrocianuro agregado se fusionan por comparación. Para la aproximación de primer orden (puesto que los coeficientes para los términos de segundo orden de ambos polinomios de segundo orden son muy pequeños) , la velocidad de incremento de corriente residual durante seis semanas en refrigeración es aproximadamente 30% ([0.0918 - 0.0638]/0.0918 = 30%) menor para la curva de tinta reactiva con ferrocianuro agregado que para las curvas de control. De esta manera, se puede entender a partir de las Figuras 8A y 8B que la velocidad de la conversión de ferricianuro a ferrocianuro en la tinta reactiva es disminuida sustancialmente por la adición de la referencia interna de ferrocianuro a la tinta reactiva DEX de acuerdo con el biosensor 102 de la invención. Mientras que la presente invención ha sido descrita con referencia a los detalles de las modalidades de la invención mostradas en los dibujos, estos detalles no se proponen para limitar el alcance de la invención reclamada en las reivindicaciones anexas.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. Un biosensor para la determinación de la concentración de un analito en una muestra de prueba, caracterizado porque comprende: una mezcla para la reacción ' electroquímica con un analito; la mezcla incluye una enzima, un mediador y una especie oxidable como una referencia interna.
2. 2. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la referencia interna es definida como la forma reducida de un acoplamiento redox reversible que tiene un potencial redox igual o más alto que aquel del mediador.
3. 3. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mediador comprende 3-fenilimino-3H-fenotiazina .
4. 4. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la referencia interna comprende ferrocianuro .
5. 5. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el ferrocianuro que define la referencia interna y el mediador son oxidados a un primer potencial de tensión y solo el mediador es oxidado a un segundo potencial de tensión; el segundo potencial de tensión es menor que el primer potencial de tensión.
6. 6. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el primer potencial de tensión es de aproximadamente 400 V y el segundo potencial de tensión es de aproximadamente 100 mV.
7. 7. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mediador comprende ferricianuro.
8. 8. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la referencia interna comprende ferrocianuro.
9. 9. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mediador comprende hexaamina de rutenio .
10. 10. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la referencia interna comprende ferrocianuro .
11. 11. Un biosensor de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la enzima comprende glucosa oxidasa.
12. 12. Un método para el uso de un biosensor que incluye una mezcla de una enzima, un mediador y una especie oxidable como una referencia interna, el método está caracterizado porque comprende los pasos que consisten en: aplicar un primer potencial de tensión en un primer período; proporcionar un período de retardo establecido; aplicar un segundo potencial de tensión en un período final después del período de retardo; y en donde el primer potencial de tensión y el segundo potencial de tensión se proporcionan selectivamente para oxidar solo al mediador o tanto al mediador como a la referencia interna.
13. 13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el paso de aplicar un primer potencial de tensión en un primer período incluye el paso de aplicar un primer potencial de tensión alto, seleccionado en el primer período para oxidar al mediador y la referencia interna.
14. 14. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el paso de aplicar un primer potencial de tensión en un primer período incluye el paso de aplicar un primer potencial de tensión bajo, seleccionado en el primer período para oxidar solo al mediador .
15. 15. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el paso de aplicar un segundo potencial de tensión en un período final después del período de retardo incluye el paso de aplicar un segundo potencial de tensión seleccionado para oxidar al mediador y la referencia interna.
16. 16. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el paso de aplicar un segundo potencial de tensión en un período final después del período de retardo incluye el paso de aplicar un segundo potencial de tensión seleccionado para oxidar solo al mediador.
17. 17. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los pasos de aplicar el primer potencial de tensión y aplicar el segundo potencial de tensión incluyen los pasos de aplicar un potencial de tensión seleccionado en un intervalo entre 100 mV y 400 V.
18. 18. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los pasos de aplicar el primer potencial de tensión y aplicar el segundo potencial de tensión incluyen los pasos de aplicar un primer potencial de tensión seleccionado en el primer período para oxidar tanto al mediador como a la referencia interna; y aplicar un segundo potencial de tensión seleccionado para oxidar solo al mediador.
19. 19. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el biosensor incluye un mediador que comprende una 3-fenilimino-3H-fenotiazina y hexaamina de rutenio; y en donde la referencia interna comprende ferrocianuro, y en donde los pasos de aplicar el primer potencial de tensión y aplicar el segundo potencial de tensión incluyen los pasos de aplicar un primer y segundo potencial de tensión seleccionado para oxidar solo al mediador.
20. 20. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque los pasos de aplicar el primer potencial de tensión y aplicar el segundo potencial de tensión incluyen los pasos de aplicar un primer y segundo potencial de tensión seleccionados para oxidar tanto al mediador como a la referencia interna; en donde la referencia interna asegura de manera efectiva una intercepción de calibración dentro de un intervalo estrecho y la referencia interna mantiene de manera efectiva una pendiente de calibración para el biosensor.