MXPA06008404A - Agonistas del receptor (vpac2) de peptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (pacap) y sus metodos de uso farmacologico - Google Patents

Abstract

Esta invención proporciona péptidos nuevos que funcionan in vivo como agonistas del receptor VPAC2. Se ha demostrado que estos polipéptidos secretagogos de insulina disminuyen el nivel de glucosa en sangre in vivo al realizar una prueba de tolerancia a la glucosa. Los polipéptidos de esta invención también son estables en la formulación y tienen vidas medias prolongadas. Los péptidos de la presente invención proporcionan una terapia para los pacientes con una reducción de la secreción de insulina endógena, por ejemplo, diabetes tipo 2. La invención también estáorientada a un método para tratar una enfermedad metabólica en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de los péptidos.

Description

C?, CH, CN. CO, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EC, EE, — as to the applicant 's entitlement to claim. the priorily ofthe EG, ES, Fl, GB. GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL. ¡N, IS, earlier application (Rule 4.17(iii))for all designations JP, KE, KG, KP, KR. KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, — as to ihe applicant's entitlement to claim the priorily ofthe MD, MG, MK, MN, MW, MX. MZ NA, NI, NO, NZ, OM. earlier application (Rule 4?7(iii))for all designations PG, PH, PL, PT, RO, RU, SC, SD, SE, SG, SK, SL, SM, SY, — of inventorship (Rule 4.17(iv))for US only TJ. TM, TN, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VC, VN, YU. ZA, ZM, ZW, ARIPO patent (BW. GH. GM, KE, LS, MW, MZ, Publisñed: NA, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZM, ZW), Eurasian patent (AM, — without intemational search report and to be republished AZ. BY, KG, KZ, MD. RU, TJ. TM), European patent (AT, upon receipt ofthat report BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, Fl, FR, GB, GR, HU, lE, IS, IT, LT, LU, MC, NL, PL, PT, RO, SE, SI, SK, For lwo-letler codes and other abbreviations, refería the "Gtiid-TR). OAPl patent (BF, BJ, CF, CG, Cl, CM, GA, GN, GQ, ance Notes on Codes andAbbreviations" appearing at ihe beginGW, ML, MR, NE, SN, TD, TG) ning ofeach regular issue ofthe PCT Gazelle. _ AGONISTAS DEL RECEPTOR (VPAC2) DEL PÉPTIDO ACTIVADOR DE LA ADENILATO CICLASA HIPOFISARIA (PACAP) Y SUS MÉTODOS DE USO FARMACOLÓGICO La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional N.° de Serie 60/539.550 de los EE. UU., presentada el 27 de enero de 2004 y la Solicitud Provisional N.° de Serie 60/566.499 de los EE. UU., presentada el 29 de abril de 2004, cuyo contenido se incluye en su totalidad en la presente por referencia. ÁMBITO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con polipéptidos recientemente identificados y con el uso de dichos polipéptidos con fines terapéuticos. Más específicamente, los polip/ptidos de la presente invencicm son ?tiles para estimular la liberacisn de insulina de las células ß pancreáticas en una forma dependiente de la glucosa, proporcionando de este modo una opcisn de tratamiento para las personas que tienen trastornos metabólicos, como la diabetes o la intolerancia a la glucosa, un estado pred ¡abético.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diabetes se caracteriza por alteraciones en el metabolismo de la glucosa, que se manifiesta, entre otras cosas, por un elevado nivel de glucosa en sangre en el paciente diabético. Los defectos subyacentes llevan a una clasificación de la diabetes en dos grupos principales: diabetes tipo 1 o diabetes mellitus insulino dependiente (insulin dependent diabetes mellitus, IDDM), que surge cuando los pacientes carecen de células ß productoras de insulina en sus islotes de Langerhans pancreáticos; y diabetes tipo 2 o diabetes mellitus no insulino dependiente (non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM), que se produce en pacientes con problemas en la función de las células ß y alteraciones en la accisn de la insulina.

Actualmente, los pacientes con diabetes tipo 1 reciben tratamiento con insulina, mientras que la mayoría de los pacientes con diabetes tipo 2 reciben tratamiento con agentes que estimulan la función de las c/lulas ß o con agentes que aumentan la sensibilidad de los tejidos de los pacientes hacia la insulina. Con el transcurso del tiempo, casi la mitad de los sujetos con diabetes tipo 2 pierden su respuesta a estos agentes y deben comenzar a recibir terapia con insulina. A continuación, se describen los fármacos que se utilizan actualmente para tratar la diabetes tipo 2.

Los inhibidores de la alfa glucosidasa (p. ej., Precose® (Bayer Pharmaceuticals Corporation), Voglibose™ (Takeda Pharmaceuticals Company Limited) y Miglitol® (Bayer Pharmaceuticals Corporation)) reducen las fluctuaciones de la glucosa postprandial al retardar la absorción de glucosa del intestino. Estos fármacos son seguros y proporcionan tratamiento para los sujetos con diabetes de leve a moderada. Sin embargo, en la bibliografía se han informado efectos secundarios gastrointestinales. Los sensibilizantes a la insulina son fármacos que aumentan la respuesta del organismo a la insulina. Las tiozolidinedionas, como Avandia® (GlaxoSmithKIine, rosiglitazona) y Actos™ (Takeda Pharmaceuticals Company Limited, pioglitazona) activan el receptor activado por proliferadores de peroxisomas (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR) del subtipo gamma y modulan la actividad de un conjunto de genes que no han sido bien descritos. Rezulin™ (Warner-Lambert Company, troglitazona), el primer fármaco de esta clase, fue retirado del mercado debido a que provocaba niveles elevados de enzimas hepáticas y hepatotoxicidad farmacógena. Estos efectos hepáticos no parecen ser un problema significativo en los pacientes que usan Avandia® y Actos™. De todos modos, se recomienda realizar un análisis de enzimas hepáticas cada 2 meses durante el primer año de la terapia y, en lo sucesivo, en forma periódica. Avandia® y Actos™ parecen estar asociados con la retención de líquidos y el edema. Otro posible efecto secundario es el aumento de peso.

Avandia® no está indicado para su uso con insulina debido a que puede producirse insuficiencia cardíaca congestiva. Los secretagogos de insulina (p. ej., sulfonilureas (SFU) y otros agentes que actúan mediante el canal de K+ dependiente del trifosfato de adenosina [adenosine triphosphate, ATP]) son otro tipo de fármaco utilizado actualmente para tratar la diabetes tipo 2. Las SFU constituyen la terapia estándar para los pacientes con diabetes tipo 2 que tienen glucemia en ayunas de leve a moderada. Las SFU tienen limitaciones que incluyen la posibilidad de provocar hipoglucemia, aumento de peso, y tasas altas de fracaso primario y secundario. Entre el 10 y el 20% de los pacientes que reciben tratamiento inicialmente no muestran un efecto significativo del tratamiento (fracaso primario). El fracaso secundario queda demostrado por una pérdida adicional del efecto del tratamiento, de entre el 20 y el 30%, después de seis meses de recibir tratamiento con una SFU. El tratamiento con insulina es necesario en el 50% de los sujetos que respondieron a las SFU después de entre 5 y 7 años de terapia (Scheen, et al., Diabetes Res. Clin. Pract. 6:533-543, 1989). Glucophage® (Lipha Corporation, HCl de metformina) es una biguanida que disminuye el nivel de glucosa en sangre mediante la reducción de la producción de glucosa hepática y el aumento de la captación y utilización de glucosa periférica. El fármaco es efectivo para disminuir el nivel de glucosa en sangre en sujetos de leve a moderadamente afectados por la enfermedad, y no tiene los efectos secundarios de aumento de peso ni la posibilidad de provocar hipoglucemia. Sin embargo, Glucophage® tiene una serie de efectos secundarios que incluyen alteraciones gastrointestinales y acidosis láctica. Glucophage® está contraindicado en sujetos diabéticos mayores de 70 años y en sujetos con disfunción renal o hepática. Por último, las tasas de fracaso primario y secundario de Glucophage® son similares a las de las SFU. El tratamiento con insulina se instituye una vez que no se ha logrado controlar adecuadamente el nivel de glucosa en sangre mediante dieta, ejercicio y medicamentos orales. Este tratamiento tiene como desventajas que es inyectable, puede producir hipoglucemia y provoca aumento de peso. Debido a los problemas que plantean los tratamientos actuales, se necesitan nuevas terapias para tratar la diabetes tipo 2. En particular, se necesitan nuevos tratamientos para mantener la secreción de insulina (glucosa dependiente) normal. Dichos nuevos fármacos deberían tener las siguientes características: dependencia de la glucosa para promover la secreción de insulina (es decir, producir la secreción de insulina sólo en presencia de un nivel elevado de glucosa en sangre); tasas bajas de fracaso primario y secundario; y preservación de la función de las células de los islotes. La estrategia para desarrollar la nueva terapia divulgada en la presente se basa en el mecanismo de señalización del monofosfato de adenosina cíclico (cyclic adenosine monophosphate, cAMP) y sus efectos en la secreción de insulina. El AMP cíclico es un importante regulador del proceso de secreción de insulina. La elevación de esta molécula de señalización promueve el cierre de los canales de K+ tras la activación de la vía de la proteína quinasa A. El cierre de los canales de K+ provoca la despolarización de las células y la subsiguiente apertura de los canales de Ca++, lo que a su vez lleva a la exocitosis de los granulos de insulina. En ausencia de bajas concentraciones de glucosa, los efectos que se producen en la secreción de insulina son escasos o nulos (Weinhaus, et al., Diabetes 47:1426-1435, 1998). Los secretagogos, como el péptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (pituitary adenylate cyclase activating peptide, PACAP), el péptido intestinal vasoactivo (vasoactive intestinal peptide, VIP) y el péptido 1 similar al glucagón (glucagon-like peptide 1 , GLP-1) utilizan el sistema del cAMP para regular la secreción de insulina en una forma dependiente de la glucosa (Komatsu, et al., Diabetes 46:1928-1938, 1997; Filipsson, et al., Diabetes 50:1959-1969, 2001 ; Drucker, Endocrinology 142:521-527, 2001 ). Los secretagogos de insulina que actúan a través de la elevación del cAMP, como el GLP-1 , el VIP y el PACAP también pueden aumentar la síntesis de insulina, además de la liberación de insulina (Skoglund, et al., Diabetes 49:1156-1164, 2000; Borboni, et al., Endocrinology 140:5530-5537, 1999). El GLP-1 es liberado de las células L del intestino después de una comida y funciona como una hormona incretina (es decir, potencia la liberacisn de insulina inducida por la glucosa de la c/lula ß pancreática). Es un p/ptido de 37 aminoácidos que es expresado diferencialmente por el gen del glucagsn, en función del tipo de tejido. Con el GLP-1 , se han recopilado datos clvnicos que respaldan el efecto beneficioso de aumentar los niveles de cAMP en las c/lulas ß. Las infusiones de GLP-1 en sujetos con control deficiente de la diabetes tipo 2 normalizaron sus niveles de glucosa en sangre en ayunas (Gutniak, et al., New Eng. J. Med. 326:1316-1322, 1992) y al administrar infusiones mas prolongadas, se mejors la función de las c/lulas ß hasta alcanzar los niveles de los sujetos normales (Rachman, et al., Diabetes 45:1524-1530, 1996). Un informe reciente ha demostrado que el GLP-1 mejora la capacidad de las c/lulas ß para responder a la glucosa en sujetos con intolerancia a la glucosa (Byrne, et al., Diabetes 47:1259- 1265, 1998). Sin embargo, todos estos efectos tienen poca duración debido a la corta vida media del péptido. Amylin Pharmaceuticals ha llevado a cabo ensayos clínicos con Exendin-4 (AC2993), un péptido de 39 aminoácidos originalmente identificado en el Monstruo de Gila. Amylin ha informado que los estudios clínicos demostraron un mejor control glucémico en los pacientes con diabetes tipo 2 tratados con Exendin-4. Sin embargo, la incidencia de náuseas y vómitos fue significativa. El PACAP es un potente estimulador de la secreción de insulina glucosa dependiente de las c/lulas ß pancreáticas. Se han descrito tres tipos diferentes de receptores del PACAP (PAC1 , VPAC1 y VPAC2) (Harmar, et al., Pharmacol. Reviews 50:265-270, 1998; Vaudry, et al., Pharmacol. Reviews 52:269-324, 2000). El PACAP no presenta selectividad para los receptores, y los tres receptores tienen actividades y potencias comparables. El PAC1 se ubica predominantemente en el sistema nervioso central, mientras que el VPAC1 y el VPAC2 tienen una distribución más amplia. El VPAC1 se ubica en el sistema nervioso central, y en el hígado, los pulmones y el intestino. El VPAC2 se ubica en el sistema nervioso central, el páncreas, el músculo esquelético, el corazón, el riñon, el tejido adiposo, el testículo y el estómago. Un trabajo reciente afirma que el VPAC2 es responsable de la secreción de insulina de las células ß (Inagaki, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :2679-2683, 1994; Tsutsumi, et al., Diabetes 51 :1453-1460, 2002). Esta acción insulinotrópica del PACAP es mediada por las proteínas G de unión del trifosfato de guanosina (guanosine triphosphate, GTP). La acumulación de cAMP intracelular, a su vez, activa los canales de cationes no selectivos en las células ß aumentado el [Ca++] y promueve la exocitosis de los granulos secretores que contienen insulina.

El PACAP es el integrante más nuevo de la superfamilia de hormonas peptídicas metabólicas, neuroendocrinas y neurotransmisoras que ejercen su acción a través de la vía de transducción de señales mediada por el cAMP (Arimura, Regul. Peptides 37:287-303, 1992). Los péptidos biológicamente activos son liberados del precursor biosintético en dos formas moleculares: como un péptido de 38 aminoácidos (PACAP-38) y/o como un péptido de 27 aminoácidos (PACAP-27) con un terminal carboxilo amidado (Arimura, supra). Las concentraciones más altas de las dos formas del péptido se encuentran en el cerebro y el testículo (Arimura, supra). La forma más corta del péptido, el PACAP-27, muestra una homología estructural del 68% con respecto al polipéptido intestinal vasoactivo (vasoactive intestinal polypeptide, VIP). Sin embargo, la distribución del PACAP y el VIP en el sistema nervioso central sugiere que estos péptidos estructuralmente relacionados tienen diferentes funciones neurotransmisoras (Koves, et al., Neuroendocrinology 54:159-169, 1991 ). Estudios recientes han demostrado efectos biológicos distintos del PACAP- 38, que abarcan desde un papel en la reproducción (McArdle, Endocrinology 135:815-817, 1994) hasta la capacidad de estimular la secreción de insulina (Yada, et al., J. Biol. Chem. 269:1290-1293, 1994). Además, el PACAP parece desempeñar una función en la regulación hormonal del metabolismo de los lípidos y carbohidratos (Gray, et al., Mol. Endrocrinol. 15:1739-47, 2001 ); en la función circadiana (Harmar, et al., Cell 109: 497-508, 2002); en la función del sistema inmunitario, el crecimiento, la homeostasis energética y la reproducción masculina (Asnicar, et al., Endrocrinol. 143:3994-4006, 2002); en la regulación del apetito (Tachibana, et al., Neurosci. Lett. 339:203-206, 2003); así como en las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, el choque septicémico y las enfermedades autoinmunes (p. ej., el lupus eritematoso sistémico) (Pozo, Trends Mol. Med. 9:211-217, 2003). El péptido intestinal vasoactivo (VIP) es un péptido de 28 aminoácidos que se aisló por primera vez de la porción superior del intestino delgado del cerdo (Said y Mutt, Science 169:1217-1218, 1970; Patente estadounidense n.° 3.879.371). Este péptido pertenece a una familia de pequeños polipéptidos estructuralmente relacionados que incluye la helodermina, la secretina, las somatostatinas y el glucagón. Los efectos biológicos del VIP son mediados por la activación de las proteínas receptoras fijadas a la membrana que están acopladas al sistema de señalización del cAMP intracelular. Estos receptores se conocían originalmente como VIP-R1 y VIP-R2; sin embargo, posteriormente se descubrió que eran los mismos receptores que el VPAC1 y el VPAC2. El VIP muestra actividades y potencias comparables a ías del VPAC1 y del VPAC2. Para mejorar la estabilidad del VIP en el líquido pulmonar humano, Bolin, et al., (Biopolymers 37:57-66, 1995) elaboraron una serie de variantes del VIP diseñadas para aumentar la propensión a una estructura helicoidal de este péptido y reducir la degradación proteolítica. Las sustituciones se concentraron en las posiciones 8, 12, 17 y 25-28, sobre las cuales se infirió que no eran importantes para la unión a receptores. Además, la secuencia "GGT" se pegó al C-terminal de las muteínas VIP, con la esperanza de agregar la caperuza en la hélice con mayor efectividad. Por último, para estabilizar más la hélice, se sintetizaron diversas variantes cíclicas (Patente estadounidense n.° 5.677.419). Si bien estos esfuerzos no estaban dirigidos hacia la selectividad para los receptores, dieron dos análogos que tienen mayor selectividad para el VPAC2 (Gourlet, et al., Peptides 18:403-408, 1997; Xia, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 281 :629-633, 1997).

Se necesitan mejores péptidos que tengan la actividad de secretagogo de insulina glucosa dependiente del PACAP, el GLP-1 o Exendin-4, pero con menos efectos secundarios y, preferentemente, que sean estables en la formulación y tengan largas vidas medias plasmáticas in vivo. Esa mejor vida media in vivo se obtiene a partir de péptidos con menor depuración y menor susceptibilidad a la proteólisis. Asimismo, un control más estricto de los niveles de glucosa en plasma puede prevenir complicaciones diabéticas a largo plazo. De este modo, los nuevos fármacos para la diabetes deberían brindar una mejor calidad de vida a los pacientes.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona polipéptidos nuevos que funcionan in vivo como agonistas del receptor VPAC2 (en adelante, el VPAC2) y que son efectivos en el tratamiento de enfermedades y condiciones que pueden mejorar gracias a agentes que tienen actividad agonista sobre él VPAC2. Preferentemente, los polipéptidos de esta invención son agonistas selectivos del VPAC2 y tienen mayor potencia en el VPAC2 que en el VPAC1 y el PAC1. Por ejemplo, a mero tvtulo enunciativo, estos polip/ptidos estimulan la síntesis y liberación de insulina de las c/lulas ß pancreáticas en una forma dependiente de la glucosa y la posterior reduccisn de la glucosa en plasma. Se ha demostrado que estos polipéptidos secretagogos disminuyen el nivel de glucosa en sangre in vivo en mayor medida que el control del vehículo al realizar una prueba de tolerancia a la glucosa. Asimismo, los polipéptidos de esta ¡nvención son estables en la formulación y tienen vidas medias plasmáticas largas y una larga duración de la acción in vivo cuando son derivatizados. Los polipéptidos de la presente invención tienen una mejor estabilidad a la proteólisis mediante la dipeptidil-peptidasa IV (DPP4) y en plasma, en comparación con el PACAP o el VIP. Si bien se ha informado que tanto el VIP como el PACAP27 son resistentes al clivaje mediante la DPP4 (Zhu, et al., J. Biol.

Chem 278: 22418-22423, 2003), la Figura 2a demuestra que estos péptidos son olivados en puntos en el tiempo más prolongados, mientras que los péptidos de la presente invención son resistentes al clivaje en los puntos en el tiempo evaluados. Los derivados de la presente ¡nvención demuestran una duración extendida de la acción in vivo, lo que respalda un ¡ntervalo posológico de menos de una vez por día, y una vez por semana o más cuando son derivatizados. Los polipéptidos de la presente invención proporcionan una terapia para pacientes que tienen, por ejemplo, trastornos metabólicos como los que se producen como consecuencia de la reducción de la secreción de insulina endógena, tales como los pacientes con diabetes tipo 2, o para pacientes con intolerancia a la glucosa, un estado prediabético que se caracteriza por una alteración leve de la secreción de insulina. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden ser útiles para prevenir y/o tratar la diabetes gestacional, la diabetes hereditaria juvenil tipo 2 (maturity-onset diabetes of the young, MODY), la diabetes autoinmune latente del adulto (latent autoimmune diabetes adult, LADA) y la dislipidemia asociada a la diabetes, y otras complicaciones diabéticas, como también la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la intolerancia a la glucosa, la alteración de la glucosa en ayunas, la dislipidemia, la hipertrigliceridemia, el síndrome X y la resistencia a la insulina.

Los polipéptidos de la presente invención pueden utilizarse para prevenir y/o tratar la obesidad (p. ej., regulación del apetito y la ingesta de alimentos), la enfermedad ateroesclerótica, la hiperlipidemia, la hipercolesterolemia, los niveles bajos de HDL, la hipertensión, la enfermedad cardiovascular (incluida la ateroesclerosis, la enfermedad cardíaca coronaria, la enfermedad de las arterias coronarias y la hipertensión), la enfermedad cerebrovascular y la enfermedad de los vasos periféricos; y para prevenir y/o tratar el lupus, el síndrome de ovario poliquístico, la carcinogénesis y la hiperplasia, el asma, los problemas reproductivos masculinos, las úlceras, los trastornos del sueño, los trastornos del metabolismo de los lípidos y carbohidratos, la disfunción circadiana, los trastornos del crecimiento, los trastornos de la homeostasis energética, las enfermedades inmunitarias, incluidas las enfermedades autoinmunes (p. ej., el lupus eritematoso sistémico), como también las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, el choque septicémico y otras condiciones identificadas en la presente; o bien pueden desempeñar otras funciones, que se describen más adelante en la presente. Un aspecto de la invención es un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las ID. de SECUENCIA N.° 1 a 148, y los fragmentos, derivados y variantes de éste que demuestran al menos una función biológica que es sustancialmente igual a la de los polipéptidos de los números de ID de SECUENCIA mencionados (en conjunto, los "polipéptidos de esta invención"), incluidos los equivalentes funcionales de estos. Otra aplicación de esta invención es un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1 a 37, y las ID de SECUENCIA N.° 112 a 148, y los fragmentos, derivados y variantes de éste que demuestran al menos una función biológica que es sustancialmente igual a la de los polipéptidos de los números de ID de SECUENCIA mencionados. Otra aplicación de esta invención es un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1 a 5, y las ID de SECUENCIA N.° 112 a 115, y los fragmentos, derivados y variantes de éste que demuestran al menos una función biológica que es sustancialmente igual a la de los polipéptidos de los números de SECUENCIA de ID mencionados. Otra aplicación de esta ¡nvención es un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1 y 112, y los fragmentos, derivados y variantes de éste que demuestran al menos una función biológica que es sustancialmente igual a la de los polipéptidos de los números de ID de SECUENCIA mencionados. También se proporcionan anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen selectivamente a los polipéptidos de esta invención. Dichos anticuerpos son útiles para detectar los polipéptidos de esta invención, y pueden identificarse y fabricarse mediante procedimientos bien conocidos en el campo. Se han generado un anticuerpo IgG N-terminal policlonal y un anticuerpo Fab C-terminal monoclonal que reconocen los polipéptidqs de esta invención.

La ¡nvención también está orientada a un método para tratar la diabetes, los trastornos relacionados con la diabetes, y/u otras enfermedades o condiciones afectadas por los polipéptidos de esta invención, por ejemplo, afectadas por la función de los polipéptidos de esta invención como agonistas del VPAC2, en un mamífero, que implica administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los polipéptidos de la presente invención o cualquier polipéptido activo en el VPAC2, como los de las ID de SECUENCIA N.° 1 a 148. También se divulgan los métodos de fabricación de los polipéptidos de esta ¡nvención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA ILUSTRACIÓN Las Figuras 1 a-1d representan las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de las ID de SECUENCIA N.° 1 a 148. Las ID de SECUENCIA N.° 112-148 se refieren a péptidos que están PEGilados en la cisteína C-terminal mediante un enlace de maleimida. El polietilenglicol (polyethylene glycol, PEG) puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, un PEG lineal de 22 kD o un PEG ramificado de 43 kD o más grande. La Figura 1e se refiere a los estándares de los péptidos relacionados.

Las Figuras 2a y 2b representan la estabilidad de los análogos del VPAC2 ante el clivaje proteolítico mediante la DPP4.

La Figura 3 representa la respuesta al cAMP de las células tratadas con los péptidos del VPAC. Las Figuras 4a y 4b representan un ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (Enzyme Linked-lmmuno-Sorbent Assay, ELISA) para la detección de péptidos. Las Figuras 5a, 5b y 5c demuestran las propiedades farmacocinéticas de los péptidos del VPAC.

Las Figuras 6a, 6b, 6c y 6d ilustran la eficacia in vivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona polipéptidos nuevos, y fragmentos, derivados y variantes de éstos que demuestran al menos una función biológica que es sustancialmente igual a la de los polipéptidos de las Figuras 1a-1d (en conjunto, los polipéptidos de esta ¡nvención). Los polipéptidos de esta ¡nvención funcionan ¡n vivo como agonistas del VPAC2 y pueden usarse para prevenir y/o tratar enfermedades o condiciones como la diabetes, incluida la diabetes tipo 2, la diabetes gestacional, la diabetes hereditaria juvenil tipo 2 (MODY) (Hermán, et al., Diabetes 43:40, 1994); la diabetes autoinmune latente del adulto (LADA) (Zimmet, et al., Diabetes Med. 11 :299, 1994); y la dislipidemia asociada a la diabetes y otras complicaciones diabéticas, como también la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la intolerancia a la glucosa, la alteración de la glucosa en ayunas, la dislipidemia, la hipertrigliceridemia, el síndrome X y la resistencia a la insulina. Además, los polipéptidos de la presente invención también pueden utilizarse para prevenir y/o tratar la obesidad (p. ej., la regulación del apetito y la ingesta de alimentos), la enfermedad ateroesclerótica, la hiperlipidemia, la hipercolesterolemia, los niveles bajos de HDL, la hipertensión, la enfermedad cardiovascular (incluida la ateroesclerosis, la enfermedad cardíaca coronaria, la enfermedad de las arterias coronarias y la hipertensión), la enfermedad cerebrovascular y la enfermedad de los vasos periféricos; y para prevenir y/o tratar el lupus, el síndrome de ovario poliquístico, la carcinogénesis y la hiperplasia, el asma, los problemas reproductivos masculinos, incluida la motilidad del esperma humano, las úlceras, los trastornos del sueño y otras condiciones identificadas en el presente; o bien pueden desempeñar otras funciones, que se describen más adelante en la presente. Asimismo, los polipéptidos de esta invención estimulan la liberación de insulina de las células pancreáticas en una forma dependiente de la glucosa. Los polipéptidos de esta invención también son estables en formulaciones acuosas y no acuosas, y exhiben una vida media plasmática de más de una hora, por ejemplo, de más de 6 horas. Los polipéptidos de esta ¡nvención son agonistas del VPAC2. Son agonistas selectivos del VPAC2 que tienen como mínimo, por ejemplo, una selectividad para el VPAC2 igual a 10 veces la que tienen para el VPAC1 y/o el PAC1. Los polipéptidos de esta invención estimulan la liberación de insulina en el plasma en una forma dependiente de la glucosa sin provocar estasis ni aumento del nivel de glucosa en plasma que es contraproducente para el tratamiento, por ejemplo, de la diabetes tipo 2. Además, los polipéptidos de esta invención son agonistas selectivos del receptor VPAC2; de este modo, por ejemplo, provocan un aumento en la liberación de insulina en el plasma, a la vez que son selectivos respecto de otros receptores que son responsables de efectos secundarios desagradables o peligrosos, como la retención de agua en el tubo gastrointestinal y/ó efectos cardiovasculares no deseados, como aumento de la frecuencia cardíaca o la presión arterial.

Los polipéptidos de esta invención también son estables en formulaciones acuosas y no acuosas. Por ejemplo, los polipéptidos de esta invención exhiben una degradación menor al 10% a 37-40 °C durante un período de una semana, cuando se disuelven en agua (a un pH de entre 7-8) o en un solvente orgánico no acuoso. Asimismo, las composiciones y formulaciones de la presente invención pueden comprender los polipéptidos de la presente invención, y uno o más de los vehículos farmacéuticamente aceptables, los diluyentes farmacéuticamente aceptables y los solventes farmacéuticamente aceptables. Los polipéptidos de esta invención proporcionan una terapia para los pacientes con una reducción de la secreción de insulina endógena o con intolerancia a la glucosa, por ejemplo, diabetes tipo 2. Es decir que los polipéptidos de la presente invención son agonistas del VPAC2 de acción prolongada que pueden usarse para mantener, mejorar y restablecer la secreción de insulina estimulada por la glucosa. Asimismo, un péptido agonista selectivo del receptor VPAC2 aumenta la secreción de insulina dependiente de la glucosa en el páncreas, sin provocar los efectos secundarios asociados con la activación no selectiva de los otros receptores del PACAP. Ciertos términos que se usan a lo largo de esta especificación se definen a continuación y otros se definirán a medida que aparezcan. A continuación se incluye la abreviatura de una sola letra para un aminoácido específico, su aminoácido correspondiente y la abreviatura de tres letras: A, alanina (ala); C, cisteína (cis); D, ácido aspártico (asp); E, ácido glutámico (glu); F, fenilalanina (phe); G, glicina (gly); H, histidina (his); I, isoleucina (ile); K, lisina (lys); L, leucina (leu); M, metionina (met); N, asparragina (asn); P, prolina (pro); Q, glutamina (gln); R, arginina (arg); S, serina (ser); T, treonina (thr); V, valina (val); W, triptofano (trp); e Y, tirosina (tyr). Las expresiones "equivalente funcional" y "sustancialmente la misma función o actividad biológica" significan el grado de actividad biológica que se encuentra comprendido aproximadamente entre el 30% y el 100% o más de la actividad biológica demostrada por el polipéptido con el que se está haciendo la comparación, cuando la actividad biológica de cada polipéptido se determina mediante el mismo procedimiento. Por ejemplo, un polipéptido que es funcionalmente equivalente a un polipéptido de la Figura 1 es aquel que, al ser evaluado con el ensayo de centelleo por proximidad para el AMP cíclico (cAMP) del Ejemplo 9, demuestra la acumulación del cAMP en la línea celular de ovario de hámster chino (Chínese Hámster Ovary, CHO) que expresa el receptor VPAC2 humano. Los términos "fragmento", "derivado" y "variante", referidos a los polipéptidos de la Figura 1 , significan los fragmentos, derivados y variantes de los polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función o actividad biológica que dichos polipéptidos, tal como se describe más detalladamente a continuación.

Un análogo incluye un pro-polipéptido que incluye en su interior la secuencia de aminoácidos del polipéptido de esta invención. El polipéptido activo de esta ¡nvención puede ser olivado a partir de los aminoácidos adicionales que completan la molécula del pro-polipéptido mediante procesos in vivo naturales, o mediante procedimientos bien conocidos en el campo, tales como el clivaje enzimático o químico. Por ejemplo, el péptido VIP nativo de 28 aminoácidos se expresa naturalmente como un polipéptido mucho más grande que luego se procesa in vivo para liberar el péptido maduro activo de 28 aminoácidos. Un fragmento es una porción del polipéptido que conserva una actividad funcional sustancialmente similar, tal como se describe en los modelos in vivo divulgados en la presente. Un derivado incluye todas las modificaciones al polipéptido que preservan sustancialmente las funciones divulgadas en la presente e incluyen una estructura y función relacionada adicionales (p. ej., polipéptidos PEGilados o acetilados que tienen una mayor vida media), polipéptidos de fusión que confieren una mayor vida media, orientados a la especificidad o actividad adicional, como una reducción de la toxicidad para un objetivo propuesto, tal como se describe más detalladamente a continuación. El fragmento, derivado o variante de los polipéptidos de la presente invención puede ser (i) aquel en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos son sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un residuo de aminoácido conservado) y dicho residuo de aminoácido sustituido puede estar o no codificado por el código genético; (ii) aquel en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluyen un grupo sustituyente; (iii) aquel en el cual el grupo acetilo N-terminal es reemplazado por otro sustituyente en uno o más de los tres primeros aminoácidos o aquel en el cual uno o más de los tres primeros aminoácidos es sustituido por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un residuo de aminoácido conservado) y dicho residuo de aminoácido sustituido puede estar o no codificado por el código genético, a fin de conferir resistencia a la proteólisis; (iv) aquel en el cual el polipéptido maduro se fusiona con otro compuesto, como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (p. ej., polietilenglicol o ácido graso); (v) aquel en el cual los aminoácidos adicionales se fusionan con el polipéptido maduro, como una secuencia líder o secretoria, o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia propolipeptídica, o (vi) aquel en el cual la secuencia polipeptídica se fusiona con un polipéptido más grande (p. ej., una albúmina humana, un anticuerpo o Fc para aumentar la duración del efecto). Dichos fragmentos, derivados, y variantes y análogos se consideran incluidos dentro del alcance de los especialistas en la materia de conformidad con lo descrito en la presente. Los derivados de la presente ¡nvención pueden contener sustituciones de aminoácidos conservadoras (definidas más detalladamente a continuación) que se realizan en uno o más residuos de aminoácidos previstos, preferentemente no esenciales. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse a partir de la secuencia natural de una proteína sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" es necesario para la actividad biológica. Una "sustitución de un aminoácido conservadora" es aquella en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en el campo. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (p.ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (p. ej., glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leuoina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta ramificadas (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). No se realizarían sustituciones no conservadoras para los residuos de aminoácidos conservados ni para los residuos de aminoácidos que residen dentro del dominio de una proteína conservada, como los residuos 19 y 27 que son esenciales para la actividad de la proteína, como la actividad del VPAC2 y/o la selectividad para el VPAC2. Los fragmentos o las porciones biológicamente activas incluyen fragmentos de polipéptidos apropiados para su uso como medicamento, para generar anticuerpos, como un reactivo para investigaciones, y para usos similares. Los fragmentos incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente similares a las secuencias de aminoácidos de un polipéptido de esta invención o derivadas de éstas, y que exhiben al menos una actividad de ese polipéptido, pero que incluyen menos aminoácidos que los polipéptidos de longitud completa divulgados en la presente. Por lo general, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo que tenga al menos una actividad del polipéptido. Una porción biológicamente activa de un polipéptido puede, por ejemplo, ser un péptido que tenga una longitud de cinco o más aminoácidos.

- Dichas porciones biológicamente activas pueden prepararse sintéticamente o mediante técnicas recombinantes, y pueden ser evaluadas en relación con una o más de las actividades funcionales de un polipéptido de esta invención por los medios divulgados en la presente y/o bien conocidos en el campo. Las variantes de los polipéptidos de esta invención incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente similar a la secuencia de aminoácidos de los números de ID de SECUENCIA de la Figura 1 (a-d) o un dominio de estos. El término "suficientemente similar" significa una primera secuencia de aminoácidos que contiene una cantidad suficiente o mínima de residuos de aminoácidos idénticos o equivalentes a los de una segunda secuencia de aminoácidos, de forma tal que la primera y segunda secuencia de aminoácidos tienen un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común que es al menos alrededor de un 45% idéntico, alrededor de un 75% a un 98% idéntico, o que es idéntico son definidas en la presente como suficientemente similares. Por ejemplo, las variantes pueden ser suficientemente similares a la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de esta ¡nvención. Las variantes incluyen polipéptidos que difieren en cuanto a la secuencia de aminoácidos debido a la mutagénesis. Las variantes que funcionan como agonistas del VPAC2 pueden identificarse mediante el cribado de bibliotecas combinatorias de. mutantes, por ejemplo, mutantes por truncamiento, de los polipéptidos de esta invención en relación con la actividad agonista sobre el VPAC2. Además, los derivados de la presente invención incluyen polipéptidos maduros que se han fusionado con otro compuesto, por ejemplo un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido y/o reducir la posible inmunogenicidad del polipéptido (p. ej., polietilenglicol ["PEG"] o ácido graso). En el caso de la PEGilación, la fusión del polipéptido con el PEG puede lograrse por cualquier medio conocido por una persona idónea en la materia. Por ejemplo, la PEGilación puede lograrse introduciendo primero una mutación en ia cisteína en el polipéptido para proporcionar un enlace al cual pueda unirse el PEG, seguida de la derivatización específica para el sitio con PEG-maleimida. Como ejemplo, se puede agregar la cisteína al C-terminal de los péptidos (ver, p. ej., Tsutsumi, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97(15):8548-53, 2000; Veronese, Biomaterials 22:405-417, 2001 ; Goodsoon y Katre, Bio/Technology 8:343-346, 1990). Además de la maleimida, hay numerosos grupos reactivos de Cys que son conocidos para los especialistas en la materia del entrecruzamiento de proteínas, como el uso de halogenuros de alquilo y sulfonas vinílicas (ver, p. ej., T. E. Creighton, Proteins, 2 a Ed., 1993). Además, el PEG puede introducirse mediante unión directa al grupo carboxilato C-terminal, a la cadena lateral de un C-terminal, a un aminoácido interno, como Cys, Lys, Asp o Glu, o a aminoácidos no naturales que contengan fracciones de cadenas laterales reactivas similares. El enlace entre el PEG y el grupo de entrecruzamiento de péptidos puede variar. Por ejemplo, el PEG de 40 kDa reactivo para Cys (mPEG2-MAL; Nektar, San Carlos, CA) disponible comercialmente emplea un grupo maleimida para la conjugación con la Cys, y el grupo maleimida se une al PEG mediante un enlace que contiene una Lys. Como segundo ejemplo, el PEG de 43 kDa reactivo para Cys (GL2-400MA; NOF, Tokio, Japón) disponible comercialmente emplea un grupo maleimida para la conjugación con la Cys, y el grupo maleimida se une al PEG mediante un enlace alcano disustituido.

La presente invención ejemplifica, a mero título enunciativo, el uso de Cys como un sitio de entrecruzamiento. Es bien conocido que otras fracciones presentes en los aminoácidos como el grupo amino N-terminal, el carboxilato C- terminal y las cadenas laterales de aminoácidos como Lys, Arg, Asp o Glu, proporcionan grupos reactivos con fracciones adecuadas para la modificación covalente y la unión al PEG. Hay numerosos ejemplos de agentes de entrecruzamiento apropiados que son conocidos para los especialistas en la materia (ver, p. ej., T. E. Creighton, Proteins, 2 a Ed., 1993). Dichos agentes de entrecruzamiento pueden unirse al PEG según se ilustra, a título enunciativo, mediante derivados del PEG disponibles comercialmente que contienen aminas, aldehidos, acétales, maleimida, succinimidas y tioles que están disponibles comercialmente, por ejemplo, Nektar y NOF (p. ej., Harris, et al., Clin. Pharmokinet. 40, 539-551 , 2001). La invención también proporciona polipéptidos quiméricos o de fusión. Los polipéptidos de esta invención pueden estar compuestos por aminoácidos unidos entre sí por uniones peptídicas o uniones peptídicas modificadas (es decir, isósteros peptídicos) y pueden contener aminoácidos que no sean los 20 aminoácidos codificados por los genes. Los polipéptidos pueden ser modificados mediante procesos naturales, como el procesamiento postraduccional, o mediante técnicas de modificación química que son bien conocidas en el campo. Dichas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, como también en la bibliografía de investigación. Pueden producirse modificaciones en cualquier parte de un polipéptido, incluida la cadena principal del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos y el terminal amino o carboxilo. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en igual o distinto grado en diversos sitios de un polipéptido determinado. Además, un polipéptido determinado puede contener muchos tipos de modificaciones. Los polipéptidos pueden estar ramificados, por ejemplo, como resultado de la ubicuitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, los polipéptidos ramificados y los polipéptidos cíclicos ramificados pueden ser el resultado de procesos postraduccionales naturales o fabricarse mediante métodos sintéticos. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ADP- ribosilación, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, unión covalente de fosfatidilinositol, entrecruzamiento, ciclización, formación de unión disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formulación, gamma carboxilación, glicosilación, formación de anclaje de glicosil fosfatidilinositol (Glycosyl Phosphatidylinositol, GPl), hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, premiación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por el ARN de transferencia, como la arginilación y ubicuitinación (ver, p. ej., Proteins, Structure and Molecular Properties. 2.a ed., T. E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins. B. C. Johnson, ed., Academic Press, Nueva York, págs. 1-12 (1983); Seifter, et al., Meth. Enzymol 182:626-646, 1990; Rattan, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62, 1992). Los polipéptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos de la Figura 1a-d (ID de SECUENCIA N.° 1 a 148), como también las secuencias que tengan variaciones insustanciales con respecto a estos. Una "variación insustancial" incluiría cualquier adición, sustitución o eliminación de la secuencia que mantenga sustancialmente, al menos, una función biológica de los polipéptidos de esta invención, por ejemplo, la actividad agonista sobre el VPAC2, la actividad agonista selectiva sobre el VPAC2 o la actividad de secreción de insulina demostrada en la presente. Estos equivalentes funcionales pueden incluir polipéptidos que tengan al menos una identidad de aproximadamente el 90%, el 95% o el 97% con los polipéptidos de la Figura 1a-d, y también incluyen las porciones de dichos polipéptidos que tengan sustancialmente la misma actividad biológica. Sin embargo, cualquier polipéptido que tenga una variación insustancial en la secuencia de aminoácidos con respecto a los polipéptidos de la Figura 1a-d y que demuestre una equivalencia funcional tal como se describe más detalladamente en la presente está incluido en la descripción de la presente ¡nvención. Como se conoce en el campo, la "similitud" entre dos polipéptidos puede determinarse comparando la secuencia de aminoácidos y sus sustitutos de aminoácidos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Dichas sustituciones conservadoras incluyen las descritas anteriormente, y las descritas por Dayhoff (The Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978) y por Argos (EMBO J. 8:779-785, 1989). Por ejemplo, los aminoácidos pertenecientes a uno de los siguientes grupos representan cambios conservadores: - ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; - cys, ser, tyr, thr; - val, ile, leu, met, ala, phe; - lys, arg, his; - phe, tyr, trp, his; y - asp, glu. Los polipéptidos de esta invención pueden ser un producto de procedimientos sintéticos químicos y, como tal, un polipéptido de esta invención aislado o purificado, o una parte biológicamente activa de éste, puede estar sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando esté sintetizado químicamente. Por ejemplo, un polipéptido de esta invención aislado puede tener menos que aproximadamente el 30% (en peso seco) de material no polipeptídico o contaminante. Cuando un péptido de esta invención es producido mediante síntesis química, los preparados pueden contener menos de aproximadamente el 30%, en peso seco, de precursores químicos o sustancias químicas no incluidas en la invención.

Los polipéptidos de esta invención pueden ser aislados de manera conveniente tal como se describe en los ejemplos específicos incluidos a continuación. Un preparado de polipéptido purificado, por ejemplo, tiene una pureza mínima de aproximadamente el 70%; o una pureza de aproximadamente el 85% al 99%. La pureza de los preparados puede evaluarse por cualquier medio conocido en el campo, como electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (sodium dodecyl sulfate, SDS) y espectroscopia de masas/cromatografía líquida. También se proporcionan los péptidos y compuestos relacionados (p. ej., molécula pequeña) que son comprendidos por los especialistas en la materia, como sustancias químicas miméticas, moléculas orgánicas miméticas o péptidos miméticos. Tal como .se usan en la presente, se pretende que los términos "mimético", "péptido mimético", "molécula orgánica mimética" y "sustancia química mimética" comprendan los derivados de péptidos, los análogos de péptidos y los compuestos químicos" que tienen una disposición de los átomos en una orientación tridimensional que es equivalente a la de un péptido de la presente invención. Se entiende que la frase "equivalente a", tal como se usa en la presente, comprende los péptidos o compuestos que tienen una o más sustituciones de determinados átomos o fracciones químicas en dicho péptido, que tienen longitudes de unión, ángulos de unión y disposiciones en el compuesto mimético que producen una disposición u orientación de dichos átomos y fracciones igual o suficientemente similar como para tener la función biológica de los péptidos de la invención. En los péptidos miméticos de la invención, la disposición tridimensional de los constituyentes químicos es estructural y/o funcionalmente equivalente a la disposición tridimensional de la cadena principal del péptido y las cadenas laterales de aminoácidos componentes del péptido; como resultado de ello, dichos péptidos miméticos, moléculas orgánicas miméticas y sustancias químicas miméticas de los péptidos de la invención tienen actividad biológica sustancial. Estos términos se usan conforme a lo que se sabe en la materia, como ilustra, por ejemplo, Fauchere, (Adv. Drug Res. 15:29, 1986); Veber y Freidinger, (TINS p.392, 1985); y Evans, et al., (J. Med. Chem. 30:1229, 1987), que se incluye en la presente por referencia. Se entiende que existe un farmacóforo para la actividad biológica de cada péptido de la invención. En este campo se entiende que un farmacóforo comprende una definición idealizada tridimensional de los requisitos estructurales para la actividad biológica. Los péptidos miméticos, moléculas orgánicas miméticas y sustancias químicas miméticas pueden ser diseñados de modo que se ajusten a cada farmacóforo con el software actual de modelización por computadora (diseño de fármacos asistido por computadora). Dichas sustancias miméticas pueden ser producidas mediante un análisis de estructura-función, sobre la base de la información posicional de los átomos sustituyentes en los péptidos de la invención. Los péptidos tal como son proporcionados por la ¡nvención pueden ser sintetizados ventajosamente mediante cualquiera de las técnicas de síntesis química conocidas en el campo, particularmente las técnicas de síntesis en fase sólida, por ejemplo, usando sintetizadores automáticos de péptidos disponibles comercialmente. Las sustancias miméticas de la presente ¡nvención pueden sintetizarse mediante los métodos en fase sólida o en fase de solución utilizados convencionalmente para la síntesis de péptidos (ver, p. ej., Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54, 1963; Carpino, Acc. Chem. Res. 6:191-98, 1973; Birr, Aspects of the Merrifield Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Heidelberg, 1978; The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 , 2, 3 y 5, (Gross y Meinhofer, eds.), Academic Press: Nueva York, 1979; Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2.a ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, lll., 1984; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957-89, 1988; y Gregg, et al., Int. J. Peptide Protein Res. 55:161-214, 1990, que se incluyen en su totalidad en la presente por referencia). Por ejemplo, puede utilizarse la metodología en fase sólida. Brevemente, un residuo de aminoácido C-terminal N-protegido se une a un soporte insoluble, como poliestireno entrecruzado con divinilbenceno, resina de poliacrilamida, Kieselguhr/poliamida (Pepsyn K), vidrio de poro controlado, celulosa, membranas de polipropileno, varillas de polietileno recubiertas con ácido acrílico u otros similares. Los ciclos de desprotección, neutralización y acoplamiento de derivados de aminoácidos protegidos sucesivos se usan para unir los aminoácidos del C- terminal, de acuerdo con la secuencia de aminoácidos. Para algunos péptidos sintéticos, puede usarse una estrategia FMOC, usando una resina sensible al ácido. En este sentido, los soportes sólidos son resinas de poliestireno entrecruzado con divinilbenceno, que están comercialmente disponibles en diversas formas funcionalizadas, que incluyen la resina de clorometilo, la resina de hidroximetilo, la resina de paraacetamidometilo, la resina de bencidrilamina (BHA), la resina de 4-metilbencidrilamina (MBHA), las resinas de oxima, la resina de alcohol 4-alcoxibencílico (resina Wang), la resina de 4-(2',4,-dimetoxifenil aminometiI)-fenoximetilo, la resina de 2,4-dimetoxibencidril-amina y la resina de 4- (2,,4'-dimetoxifenil-FMOC-amino-met¡l)-fenoxiacetamidonorleucil-MBHA (resina Rink amida MBHA). Además, las resinas sensibles al ácido también proporcionan ácidos C-terminales, si se desea. Un grupo protector de los aminoácidos alfa es el 9-fluorenilmetoxi-carbonilo (FMOC) lábil a bases. Los grupos protectores adecuados de las funcionalidades de las cadenas laterales de aminoácidos químicamente compatibles con los grupos BOC (t-butiloxicarbonilo) y FMOC son bien conocidos en el campo. Al usar la química del FMOC, se prefieren los siguientes derivados de aminoácidos protegidos: FMOC-Cys(Trit), FMOC-Ser(But), FMOC-Asn(Trit), FMOC-Leu, FMOC-Thr(Trit), FMOC-Val, FMOC-Gly, FMOC-Lys(Boc), FMOC-Gln(Trit), FMOC-Glu(OBut), FMOC-His(Trit), FMOC-Tyr(But), FMOC-Arg(PMC (2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo)), FMOC-Arg(BOC)2, FMOC-Pro y FMOC-Trp(BOC). Los residuos de aminoácidos pueden acoplarse utilizando diversos agentes y químicas de acoplamiento conocidos en el campo, como acoplamiento directo con DIC (diisopropil-carbodiimida), DCC (diciclohexilcarbodiimida), BOP (hexafluorofosfato de benzotriazolil-N-oxitrisdimetilaminofosfonio), PyBOP (hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidinofosfonio), PyBrOP (hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfonio); mediante anhídridos simétricos preformados; mediante esteres activos, como esteres de pentafluorofenilo; o mediante esteres activos de HOBt (1 -hidroxibenzotriazol) preformados o utilizando fluoruro y cloruros de aminoácidos con FMOC, o utilizando N-carboxi anhídridos de aminoácidos con FMOC. Se prefiere la activación con HBTU (hexafluorofosfato de 2-(1H- benzotriazol-1-il),1 ,1,3,3-tetramet¡Iuronio) o HATU (hexafluorofosfato de 2-(1H-7- aza-benzotriazol-1-il),1 ,1 ,3,3-tetrametiluronio) en presencia de HOBt o HOAt (7- azahidroxibenzotriazoi). El método en fase sólida puede llevarse a cabo manualmente, si bien puede usarse la síntesis automática mediante un sintetizador de péptidos disponible comercialmente (p. ej., Applied Biosystems 431A u otro similar; Applied Biosystems, Foster City, CA). En una síntesis típica, el primer aminoácido (C- terminal) se carga en la resina de clorotritilo. Se puede usar la desprotección sucesiva (con piperidina al 20%/NMP (N-metilpirrolidona)) y ciclos de acoplamiento de acuerdo con los protocolos ABI FastMoc (Applied Biosystems), a fin de generar la secuencia peptídica. También puede usarse el acoplamiento doble y triple, con adición de caperuza mediante anhídrido acético. El péptido mimético sintético puede olivarse de la resina y desprotegerse mediante tratamiento con ácido trifluoroacético (trifluoroacetic acid, TFA) que contenga los antioxidantes apropiados. También pueden usarse muchos de estos reactivos de clivaje, como el reactivo K (0,75 g de fenol cristalino, 0,25 mL de etanoditiol, 0,5 mL de tioanisol, 0,5 mL de agua desionizada y 10 mL de TFA) y otros reactivos. El péptido puede separarse de la resina mediante filtración y aislarse mediante precipitación con éter. Puede lograrse la purificación ulterior mediante métodos convencionales, como filtración por gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (high performance liquid chromatography, HPLC) en fase invertida. Los péptidos miméticos sintéticos de acuerdo con la presente invención pueden tener la forma de sales farmacéuticamente aceptables, especialmente sales con adición de una base, incluidas las sales de bases orgánicas y bases inorgánicas. Las sales con adición de base de los residuos de aminoácidos ácidos pueden prepararse mediante el tratamiento del péptido con la base o base inorgánica apropiada, de acuerdo con los procedimientos bien conocidos por los especialistas en la materia, o también, la sal deseada puede obtenerse directamente mediante la liofilización de la base apropiada. Por lo general, los especialistas en la materia reconocerán que los péptidos como los descritos en la presente pueden modificarse mediante diversas técnicas químicas, a fin de producir péptidos que tengan esencialmente la misma actividad que el péptido no modificado, y que opcionalmente tengan otras propiedades deseables. Por ejemplo, ios grupos de ácido carboxílico del péptido pueden proporcionarse en ia forma de una sal de un catión farmacéuticamente aceptable. Los grupos amino del péptido pueden tener la forma de una sal con adición de un ácido farmacéuticamente aceptable, como HCl, HBr, y sales de ácido acético, benzoico, tolueno sulfónico, maleico, tartárico, y otras sales orgánicas, o pueden convertirse en una amida. Los tioles pueden protegerse mediante cualquiera de diversos grupos protectores bien reconocidos, como los grupos acetamida. Los especialistas en la materia reconocerán también métodos para introducir estructuras cíclicas en los péptidos de esta invención, a fin de aproximarse más a la configuración de unión nativa. Por ejemplo, se puede agregar al péptido un residuo de cisteína carboxilo terminal o amino terminal, de modo que al ser oxidado el péptido contenga una unión disulfuro, generando de este modo un péptido cíclico. Otros métodos de ciclización de péptidos incluyen la formación de tioéteres y amidas y esteres carboxilo y amino terminales. Específicamente, se dispone de diversas técnicas para construir derivados y análogos de péptidos con una actividad biológica deseable igual o similar a la del péptido correspondiente, pero con una actividad más favorable que la del péptido con respecto a la solubilidad, estabilidad y susceptibilidad a la hidrólisis y proteólisis. Dichos derivados y análogos incluyen péptidos modificados en el grupo amino N-terminal, el grupo carboxilo C-terminal y/o el cambio de uno o más de los enlaces amido en el péptido por un enlace no amido. Se entiende que dos o más de dichas modificaciones pueden acoplarse en la estructura de un péptido mimético (p. ej., la modificación en el grupo carboxilo C-terminal y la inclusión de un enlace carbamato-CH2- entre dos aminoácidos del péptido). Las modificaciones en los amino terminales incluyen la alquilación, la acetilación, la adición de un grupo carbobenzoilo y la formación de un grupo succinimida. Específicamente, se puede hacer reaccionar al grupo amino N- terminal para que forme un grupo amida de la fórmula RC(O)NH~, donde R es un alquilo, por ejemplo, un alquilo inferior, y se agrega mediante la reacción con un halogenuro de ácido, RC(O)CI o anhídrido de ácido. Por lo general, la reacción puede llevarse a cabo mediante el contacto de cantidades aproximadamente equimolares o en exceso (p. ej., aproximadamente 5 equivalentes) de un halogenuro de ácido con el péptido en un diluyente inerte (p. ej., diclorometano), que preferentemente contenga un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, como la diisopropiletilamina, para recoger el ácido generado durante la reacción. Las demás condiciones en que se produce la reacción son las convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). La alquilación del amino terminal para proporcionar una N-sustitución de un alquilo inferior seguida de una reacción con un halogenuro de ácido, tal como se describió anteriormente, proporcionará un grupo amida N-alquilo de la fórmula RC(O)NR- En forma alternativa, el amino terminal puede unirse en forma covalente al grupo succinimida mediante la reacción con anhídrido succínico. Se usa una cantidad aproximadamente equimolar o un exceso de anhídrido succínico (p. ej., aproximadamente 5 equivalentes) y el grupo amino terminal se convierte en la succinimida mediante métodos bien conocidos en el campo, que incluyen el uso de un exceso (p. ej., 10 equivalentes) de una amina terciaria, como ia diisopropiletilamina, en un solvente inerte apropiado (p. ej., diclorometano), tal como se describe en Wolienberg, et al., (Patente estadounidense n.° 4.612.132), que se incorpora en su totalidad en la presente por referencia. También se entiende que el grupo succínico podrá sustituirse, por ejemplo, por un C2- a Ce-alquilo o sustituyentes -SR, que son preparados de manera convencional para proporcionar la succinimida sustituida en el N-terminal del péptido. Dichos sustituyentes alquilo pueden prepararse mediante la reacción de una olefina inferior (C2- a C6- alquilo) con anhídrido maleico de la manera descrita por Wollenberg, et al., supra., y los sustituyentes -SR pueden prepararse mediante la reacción de RSH con anhídrido maleico, donde R es lo que se definió anteriormente. En otra aplicación ventajosa, el amino terminal puede ser derivatizado para formar un grupo benciloxicarbonil-NH- o benciloxicarbonil-NH- sustituido. Este derivado puede producirse mediante la reacción con una cantidad aproximadamente equivalente o un exceso de cloruro de benciloxicarbonilo (CBZ- Cl) o un CBZ-CI sustituido en un diluyente inerte apropiado (p. ej., diclorometano) que contenga, por ejemplo, una amina terciaria para recoger el ácido generado durante la reacción. En aún otro derivado, el N-terminal comprende un grupo sulfonamida mediante la reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-S(O)2CI en un díluyente inerte apropiado (diclorometano) para convertir la amina terminal en una sulfonamida, donde R es un alquilo y preferentemente, un alquilo inferior. Por ejemplo, el diluyente inerte puede contener un exceso de una amina terciaria (p. ej., 10 equivalentes), como la diisopropiletilamina, para recoger el ácido generado durante la reacción. Las demás condiciones en que se produce la reacción son las convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). Los grupos carbamato pueden producirse en el amino terminal mediante la reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R--OC(O)CI o R-OC(O)OC6H4-p- ?2 en un diluyente inerte apropiado (p. ej., diclorometano) para convertir la amina terminal en carbamato, donde R es un alquilo y preferentemente, un alquilo inferior. Por ejemplo, el diluyente inerte puede contener un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, como la diisopropiletilamina, para recoger cualquier ácido generado durante la reacción. Las demás condiciones en que se produce la reacción son las convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante 30 minutos). Pueden formarse grupos urea en el amino terminal mediante la reacción con una cantidad equivalente o un exceso (p. ej., 5 equivalentes) de R-N=C=O en un diluyente inerte apropiado (p. ej., diclorometano) para convertir la amina terminal en un grupo urea (es decir, RNHC(O)NH-), donde R es lo que se definió anteriormente. Por ejemplo, el diluyente inerte puede contener un exceso (p. ej., aproximadamente 10 equivalentes) de una amina terciaria, como la diisopropiletilamina. Las demás condiciones en que se produce la reacción son las convencionales (p. ej., temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos). Al preparar péptidos miméticos donde el grupo carboxilo C-terminal puede ser reemplazado por un éster (p. ej., -C(O)OR, donde R es un alquilo y preferentemente, un alquilo inferior), pueden emplearse las resinas utilizadas para preparar los ácidos peptídicos, y el péptido protegido por la cadena lateral puede olivarse con una base y con el alcohol apropiado (p. ej., metanol). Los grupos protectores de la cadena lateral pueden removerse del modo habitual mediante el tratamiento con fluoruro de hidrógeno, a fin de obtener el éster deseado. Al preparar péptidos miméticos donde el grupo carboxilo C-terminal es reemplazado por la amida -C(O)NR3R . se utiliza una resina de bencidrilamina como soporte sólido para la síntesis peptídica. Al completarse la síntesis, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno para liberar el péptido del soporte da como resultado directo la amida peptídica libre (es decir, el C-terminal es -C(O)NH2). En forma alternativa, el uso de la resina clorometilada durante la síntesis peptídica junto con la reacción con amoníaco para clivar ei péptido protegido por la cadena lateral del soporte da la amida peptídica libre, y la reacción con una alquilamina o dialquilamina da una alquilamida o dialquilamida protegida por la cadena lateral (es decir, el C-terminal es -C(O)NRR?, donde R y Ri son alquilos y preferentemente, alquilos inferiores). Luego se remueve la protección de la cadena lateral del modo habitual, mediante el tratamiento con fluoruro de hidrógeno, a fin de obtener las amidas, alquilamidas o dialquilamidas libres. En otra aplicación alternativa, se puede inducir la ciclización del grupo carboxilo C-terminal o de un éster C-terminal mediante el desplazamiento del -OH o el éster (-OR) del grupo carboxilo o éster, respectivamente, con el grupo amino N-terminal para formar un péptido cíclico. Por ejemplo, después de la síntesis y el clivaje para dar el ácido peptídico, el ácido libre se convierte en solución en un éster activado mediante un grupo carboxilo activador apropiado, como la diciclohexilcarbodiimida (DCC), por ejemplo, en cloruro de metileno (CH2CI2), formamida de dimetiio (DMF) o mezclas de estos. El péptido cíclico se forma luego mediante el desplazamiento del éster activado con la amina N-terminal. La ciclización, más que la polimerización, puede mejorarse mediante el uso de soluciones muy diluidas de acuerdo con los métodos bien conocidos en el campo.

Los péptidos miméticos, según se entiende en el campo y tal como son proporcionados por la invención, son estructuralmente similares al péptido de la invención, pero tienen uno o más enlaces peptídicos que pueden reemplazarse por un enlace seleccionado del grupo compuesto por: -CH2NH-, -CH2S-, - CH2CH2~, ~CH=CH- (confórmeros cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2 - y - CH2SO-, mediante los métodos conocidos en el campo y descritos más detalladamente en las siguientes referencias: Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, (Weinstein, ed.), Marcel Dekker: Nueva York, pág. 267, 1983; Spatola, Peptide Backbone Modifications 1 :3, 1983; Morley, Trends Pharm. Sci. págs. 463-468, 1980; Hudson, et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185, 1979; Spatola, et al., Life Sci. 38:1243-1249, 1986; Hann, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314, 1982; Almquist, et al., J. Med. Chem. 23:1392-1398, 1980; Jennings-White, et al., Tetrahedron Lett. 23:2533, 1982; Szelke, et al., EP045665A; Holladay, et al., Tetrahedron Lett. 24:4401-4404, 1983; y Hruby, Life Sci. 31 :189-199, 1982; cada una de las cuales se incluye en la presente por referencia. Dichos péptidos miméticos tienen ventajas significativas con respecto a las aplicaciones polipeptídicas, que incluyen por ejemplo, costo de producción más económico, mayor estabilidad química o mejores propiedades farmacológicas (tales como vida media, absorción, potencia, eficacia, etc.), antigenicidad reducida, y otras propiedades. Los análogos miméticos de los péptidos de la invención también pueden obtenerse usando los principios del diseño de fármacos convencional o racional (ver, p. ej., Andrews, et al., Proc. Alfred Benzon Symp. 28:145-165, 1990; McPherson, Eur. J. Biochem. 189:1-24, 1990; Hol, et al., en Molecular Recognition: Chemical and Biochemical Problems, (Roberts, ed.); Royal Society of Chemistry; págs. 84-93, 1989a; Hol, Arzneim-Forsch. 39:1016-1018, 1989b; Hol, Agnew Chem. Int. Ed. Engl. 25:767-778, 1986; cuyas divulgaciones se incluyen en la presente por referencia). De acuerdo con los métodos del diseño de fármacos convencional, las moléculas miméticas deseadas pueden obtenerse evaluando en forma aleatoria las moléculas cuyas estructuras tengan un atributo en común con la estructura de un péptido "nativo". La contribución cuantitativa que se obtiene al cambiar un grupo específico de una molécula de unión puede determinarse midiendo la actividad biológica de la sustancia mimética supuesta en comparación con la actividad del péptido. En una aplicación del diseño de fármacos racional, la sustancia mimética es diseñada para que comparta un atributo de la conformación tridimensional más estable del péptido. De este modo, por ejemplo, la sustancia mimética puede estar diseñada para poseer grupos químicos que estén orientados de forma tal que sea suficiente para provocar interacciones iónicas, hidrofóbicas o de van der Waals similares a las que exhiben los péptidos de la invención, tal como se divulga en la presente. Un método para realizar el diseño de sustancias miméticas racional emplea un sistema computarizado capaz de formar una representación de la estructura tridimensional del péptido, como las ilustradas por Hol, 1989a; Hol, 1989b; y Hol, 1986. Las estructuras moleculares de los péptidos miméticos, las moléculas orgánicas miméticas y las sustancias químicas miméticas de los péptidos de la invención pueden producirse usando programas de diseño asistido por computadora disponibles comercialmente en el campo. Algunos ejemplos de dichos programas incluyen SYBYL 6.5®, HQSAR™ y ALCHEMY 2000™ (Tripos); GALAXY™ y AM2000™ (AM Technologies, Inc., San Antonio, TX); CATALYST™ y CERIUS™ (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA); CACHE PRODUCTS™, TSAR™, AMBER™, y CHEM-X™ (Oxford Molecular Products, Oxford, CA) y CHÉMBUILDER3D™ (Interactive Simulations, Inc., San Diego, CA).

Los péptidos miméticos, las moléculas orgánicas miméticas y las sustancias químicas miméticas producidos usando los péptidos divulgados en la presente, que utilizan, por ejemplo, programas de modelización molecular reconocidos en el campo, pueden producirse usando técnicas sintéticas químicas convencionales y diseñarse de forma tal de permitir el cribado ultrarrápido, incluidos métodos de química combinatoria. Los métodos combinatorios útiles para producir los péptidos miméticos, las moléculas orgánicas miméticas y las sustancias químicas miméticas de la invención incluyen síntesis en fase sólida y series de química combinatoria, según, por ejemplo, SIDDCO (Tuscon, Arizona); Tripos, Inc.; Calbiochem/Novabiochem (San Diego, CA); Symyx Technologies, Inc. (Santa Clara, CA); Medichem Research, Inc. (Lemont, IL); Pharm-Eco Laboratories, Inc. (Bethlehem, PA); o N.V. Organon (Oss, Países Bajos). En la producción mediante química combinatoria de los péptidos miméticos, las moléculas orgánicas miméticas y las sustancias químicas miméticas de ia invención pueden utilizarse los métodos conocidos en el campo, que incluyen, a mero título enunciativo, las técnicas divulgadas en Terrett, (Combinatorial Chemistry, Oxford University Press, Londres, 1998); Gallop, et al., J. Med. Chem. 37:1233-51 , 1994; Gordon, et al., J. Med. Chem. 37:1385-1401 , 1994; Look, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:707-12, 1996; Ruhland, et al., J. Amer. Chem. Soc. 118: 253-4, 1996; Gordon, et al., Acc. Chem. Res. 29:144-54, 1996; Thompson y Ellman, Chem. Rev. 96:555-600, 1996; Fruchtel y Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:17-42, 1996; Pavía, "The Chemical Generation of Molecular Diversity", Network Science Center, www.netsci.org, 1995; Adnan, et ai., "Solid Support Combínatorial Chemistry en Lead Discovery and SAR Optimization," Id., 1995; Davies y Briant, "Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity", Id., 1995; Pavia, "Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future", Id., 1996; y las Patentes estadounidenses n.° 5.880.972, 5.463.564, 5.331.573 y 5.573.905. Los polipéptidos recientemente sintetizados pueden purificarse sustancialmente mediante cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa (ver, p. ej., Creighton, Proteins: Structures And Molecular Principies, WH Freeman and Co., Nueva York, N.Y., 1983). La composición de un polipéptido sintético de la presente invención puede confirmarse mediante análisis o secuenciación de aminoácidos, por ejemplo, mediante el procedimiento de degradación de Edman (Creighton, supra). Además, cualquier porción de la secuencia de aminoácidos del polipéptido puede alterarse durante la síntesis directa y/o combinarse usando métodos químicos con las secuencias de otras proteínas, a fin de producir una variante del polipéptido o un polipéptido de fusión. En esta invención también se incluyen los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que unen selectivamente los polipéptidos de esta ¡nvención. Cualquier tipo de anticuerpo conocido en ei campo puede generarse usando métodos bien conocidos en el campo. Por ejemplo, puede generarse un anticuerpo para que se una específicamente a un epítopo de un polipéptido de esta invención. El término "anticuerpo", tal como se u en la presente, incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, como también fragmentos de étas, como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de unirse a un epítopo de un polipéptido de esta invención. Por lo general, se requieren al menos 6, 8, 10 o 12 aminoácidos contiguos para formar un epítopo. Sin embargo, los epítopos que involucran aminoácidos no contiguos pueden requerir más aminoácidos, por ejemplo, al menos 15, 25 o 50 aminoácidos. Un anticuerpo que se una específicamente a un epítopo de un polipéptido de esta invención puede usarse con fines terapéuticos, como también en ensayos inmunoquímicos, por ejemplo, inmunoelectrotransferencias o "Western blot", ensayos ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, immunoprecipitaciones u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en el campo. Pueden usarse varios inmunoensayos para identificar anticuerpos que tengan la especificidad deseada. Numerosos protocolos para ensayos de unión competitiva o inmunorradiométricos son bien conocidos en el campo. Por lo general, dichos inmunoensayos implican la medición de la formación de un complejo entre un inmunógeno y un anticuerpo que se une específicamente al inmunógeno.

Por lo general, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de esta invención proporciona una señal de detección al menos 5, 10 o 20 veces más alta que una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usa en un ensayo inmunoquímico. Preferentemente, los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de esta invención no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar un polipéptido de esta invención de la solución. Los polipéptidos de esta invención, o fragmentos de estos, pueden usarse para inmunizar un mamífero, como un ratón, una rata, un conejo, un cobayo, un mono o un ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, un polipéptido de esta invención o un fragmento de éste puede conjugarse con una proteína portadora, como la albúmina sérica bovina, la tiroglobulina y la hemocianina de lapa californiana. En función de la especie huésped, pueden usarse varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen, a mero título enunciativo, el adyuvante de Freund, geles minerales (p. ej., hidróxido de aluminio) y sustancias tensioactivas (p. ej., lisolecitina, polialcoholes Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol). Entre los adyuvantes utilizados en los seres humanos, el BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y el Corynebacterium parvum son especialmente útiles. Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un polipéptido de esta ¡nvención o a un fragmento de éste pueden prepararse usando cualquier técnica que permita la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, a mero título enunciativo, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma con el virus de Epstein Barr (Epstein-Barr virus, EBV) (Kohier, et al., Nature 256:495-97, 1985; Kozbor, et al., J. Immunol. Methods 81 :3142, 1985; Cote, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 80:2026-30, 1983; Colé, et al., Mol. Cell Biol. 62:109-20, 1984).

Además, pueden usarse las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el corte y empalme de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos a fin de obtener una molécula con la especificidad antigénica y la actividad biológica apropiadas (Morrison, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 81 :6851-55, 1984; Neuberger, et al., Nature 312:604-08, 1984; Takeda, et al., Nature 314:452-54, 1985). Los anticuerpos monoclonales y otros anticuerpos también pueden "humanizarse" para impedir que un paciente desarrolle una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo cuando se use con fines terapéuticos. Dichos anticuerpos pueden ser suficientemente similares a los anticuerpos humanos, en cuanto a la secuencia, como para ser utilizados directamente en terapias o pueden requerir la alteración de algunos residuos clave. Las diferencias con respecto a la secuencia entre los anticuerpos de roedores y humanos pueden minimizarse mediante el reemplazo de los residuos que difieren de aquellos presentes en las secuencias humanas mediante la mutagénesis de residuos individuales dirigida a los sitios o mediante el tamizaje de regiones enteras determinantes de la complementariedad. En forma alternativa, los anticuerpos humanizados pueden producirse usando métodos recombinantes (ver, p. ej., GB2188638B). Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de esta invención pueden contener sitios de unión de antígenos que estén parcial o totalmente humanizados, según lo divulgado en la Patente estadounidense n.° 5.565.332. En forma alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena simple pueden adaptarse usando métodos conocidos en el campo para producir anticuerpos de cadena simple que se unan específicamente a un polipéptido de esta invención. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de diferente composición idiotípica pueden generarse mediante el intercambio de cadenas de bibliotecas combinatorias aleatorias de inmunoglobulina (Burton, Proc. Nati. Acad. Sci. 88:11120-23, 1991). Los anticuerpos de cadena simple también pueden construirse usando un método de amplificación del ADN, como la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR), que usa ADNc del hibridoma como molde (Thirion, et al., Eur. J. Cáncer Prev. 5:507-11 , 1996). Los anticuerpos de cadena simple pueden ser monoespecíficos o biespecíficos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. La elaboración de anticuerpos de cadena simple tetravalentes, biespecíficos se describe, por ejemplo, en Coloma y Morrison (Nat. Biotechnol. 15:159-63, 1997). La elaboración de anticuerpos de cadena simple bivalentes, biespecíficos se describe en Mallender y Voss (J. Biol. Chem. 269:199-206, 1994).

Se puede construir una secuencia de nucleótidos que codifique un anticuerpo de cadena simple usando la síntesis de nucleótidos manual o automática, clonarla en una construcción de expresión utilizando métodos estándar de ADN recombinante e introducirla en una célula para expresar la secuencia de codificación, tal como se describe a continuación. En forma alternativa, los anticuerpos de cadena simple pueden producirse utilizando directamente, por ejemplo, la tecnología de fagos filamentosos (Verhaar, et al., Int. J. Cáncer 61 :497-501 , 1995; Nicholls, et al., J. Immunol. Meth. 165:81-91 , 1993). Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de esta invención también pueden producirse induciendo la producción in vivo en la población linfocítica o cribando bibliotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de unión altamente específicos tal como se divulga en la bibliografía (Orlandi, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 86:38333-37, 1989; Winter, et al., Nature 349:293-99, 1991). Otros tipos de anticuerpos pueden elaborarse y usarse con fines terapéuticos en los métodos de la ¡nvención. Por ejemplo, se pueden elaborar anticuerpos quiméricos, según lo divulgado en WO 93/03151. También pueden prepararse proteínas de unión que son derivadas de las ¡nmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, como los "fragmentos bivalentes" (ver, p. ej., WO 94/13804). Los anticuerpos humanos que tienen la capacidad de unirse a los polipéptidos de esta invención también pueden identificarse a partir de la biblioteca HuCAL® de MorphoSys, tal como se indica a continuación. Un polipéptido de esta invención puede ser recubierto en una placa de pocilios e incubado con la biblioteca de fagos vinculados con Fab HuCAL® de MorphoSys. Esos Fab vinculados con fagos que no se unen al polipéptido de esta invención pueden quitarse de la placa mediante lavado, dejando sólo el fago que se una firmemente al polipéptido de esta invención. El fago unido puede eluirse, por ejemplo, mediante un cambio en el pH o mediante la elución con E. coli, y amplificarse mediante la infección de huéspedes de E. coli. Este proceso de cribado conocido como "panning" puede repetirse una o dos veces para obtener una población más grande de anticuerpos que se unan firmemente al polipéptido de esta invención. Luego, los Fab del conjunto enriquecido son expresados, purificados y cribados en un ensayo ELISA. Los anticuerpos de acuerdo con la ¡nvención se pueden purificar mediante métodos bien conocidos en el campo. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por afinidad haciéndolos pasar por una columna a la que está unido un polipéptido de esta invención. Luego, los anticuerpos unidos pueden eluirse de la columna usando una solución amortiguadora con una alta concentración de sal. A continuación se definen varios términos, tal como se los usa en la presente. Al presentar los elementos de la presente ¡nvención o la(s) aplicación(es) preferida(s) de ésta, se pretende que los artículos "un(a)", "el(la)" y "dicho(a)" signifiquen que hay uno o más de los elementos. Se pretende que los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene" sean incluyentes y signifiquen que puede haber elementos adicionales distintos de los elementos mencionados. El término "sujeto" tal como se usa en la presente incluye los mamíferos (p. ej., seres humanos y animales). El término "tratamiento" incluye cualquier proceso, acción, aplicación, terapia u otro procedimiento similar, en el que un sujeto, incluso un ser humano, recibe asistencia médica con el objeto de mejorar la condición del sujeto, directa o indirectamente, o de hacer más lenta la progresión de una condición o un trastorno en el sujeto. El término "terapia combinada" o "terapia conjunta" significa la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una condición y/o un trastorno. Dicha administración incluye la administración conjunta de dos o más agentes terapéuticos en una manera sustancialmente simultánea, por ejemplo, en una única cápsula que tenga una proporción fija de principios activos o en múltiples cápsulas separadas para cada agente inhibidor. Además, dicha administración incluye el uso de cada tipo de agente terapéutico de manera secuencial. La frase "terapéuticamente efectivo(a)" significa la cantidad de cada agente administrado que logrará el objetivo de mejorar la severidad de una condición o trastorno diabéticos, evitando o minimizando a la vez los efectos secundarios asociados con un tratamiento terapéutico determinado. El término "farmacéuticamente aceptable" significa que el elemento en cuestión es apropiado para su uso en un producto farmacéutico. Dado que los polipéptidos de la presente invención tienen la capacidad de estimular la secreción de insulina de las células de los islotes pancreáticos in vitro y provocan una disminución del nivel de glucosa en sangre in vivo, pueden emplearse en el tratamiento de la diabetes, incluida la diabetes tipo 2 (diabetes mellitus no insulino dependiente). Dicho tratamiento también puede retardar la aparición de la diabetes y las complicaciones diabéticas. Los polipéptidos pueden usarse para prevenir que los sujetos con intolerancia a la glucosa desarrollen diabetes tipo 2. Otras enfermedades y condiciones que pueden tratarse o prevenirse utilizando los péptidos de la invención en métodos de la invención incluyen: la diabetes hereditaria juvenil tipo 2 (MODY) (Hermán, et al., Diabetes 43:40, 1994); la diabetes autoinmune latente del adulto (LADA) (Zimmet, et ai., Diabetes Med. 11:299, 1994); la intolerancia a la glucosa (IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Sup. 1):S5, 1999); la alteración de la glucosa en ayunas (IFG) (Charles, et al., Diabetes 40:796, 1991); la diabetes gestacional (Metzger, Diabetes, 40:197, 1991); y el síndrome metabólico X. Los polipéptidos de la presente invención también pueden ser efectivos en trastornos como la obesidad, y para tratar la enfermedad ateroesclerótica, la hiperlipidemia, la hipercolesterolemia, los niveles bajos de HDL, la hipertensión, la enfermedad cardiovascular (incluida la ateroesclerosis, la enfermedad cardíaca coronaria, la enfermedad de las arterias coronarias y la hipertensión), la enfermedad cerebrovascular y la enfermedad de los vasos periféricos; y para tratar el lupus, el síndrome de ovario poliquístico, la carcinogénesis y la hiperplasia, el asma, los problemas reproductivos masculinos, las úlceras, los trastornos del sueño, los trastornos del metabolismo de los lípidos y carbohidratos, la disfunción circadiana, los trastornos del crecimiento, los trastornos de la homeostasis energética, las enfermedades inmunitarias, incluidas las enfermedades autoinmunes (p. ej., el lupus eritematoso sistémico), como también las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, y el choque septicémico. Los polipéptidos de la presente invención también pueden ser útiles para tratar trastornos fisiológicos relacionados, por ejemplo, con la diferenciación celular para producir células acumuladoras de lípidos, la regulación de la sensibilidad a la insulina y los niveles de glucosa en sangre que están relacionados, por ejemplo, con la función anormal de las células ß pancreáticas, los tumores que segregan insulina y/o hipoglucemia autoinmune debido a los autoanticuerpos contra la insulina, los autoanticuerpos contra el receptor de insulina o los autoanticuerpos que estimulan las células ß pancreáticas, la diferenciación de macrófagos que lleva a la formación de placas ateroescleróticas, respuesta inflamatoria, carcinogénesis, hiperplasia, expresión génica de adipocitos, diferenciación de adipocitos, reducción en la masa de células ß pancreáticas, secreción de insulina, sensibilidad de los tejidos a la insulina, proliferación de células de liposarcoma, enfermedad de ovario poliquístico, anovulación crónica, hiperandrogenismo,- producción de progesterona, esteroidogénesis, potencial de oxidorreducción y agresión oxidativa en las células, producción de óxido nítrico sintasa (nitric oxide synthase, NOS), aumento de la gamma glutamil transpeptidasa, catalasa, niveles de triglicéridos y- colesterol HDL y LDL en plasma, y para usos similares. Los polipéptidos de la invención también pueden usarse en métodos de la invención para tratar las causas secundarias de la diabetes (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care 22 (Sup. 1 ):S5, 1999). Dichas causas secundarias incluyen exceso de glucocorticoides, exceso de la hormona de crecimiento, feocromocitoma y diabetes farmacógena. Los fármacos que pueden provocar la diabetes incluyen, a mero título enunciativo, el piriminil, el ácido nicotínico, los glucocorticoides, la fenitoína, la hormona tiroidea, los agentes ß-adrenérgicos, el interferón a y los fármacos usados para tratar la infección por VIH. Además, los polipéptidos de la invención pueden usarse para el tratamiento del asma (Bolin, et al., Biopolymer 37:57-66, 1995; Patente estadounidense n.° .677.419; que muestra que el polipéptido R3P0 tiene actividad para relajar el músculo liso de la tráquea del cobayo); para la inducción de hipotensión (el VIP provoca hipotensión, taquicardia y rubor facial en los pacientes asmáticos (Morice, et al., Peptides 7:279-280, 1986; Morice, et al., Lancet 2:1225-1227, 1983); para los problemas reproductivos masculinos (Siow, et al., Arch. Androl. 43(1):67-71 , 1999); como agente antiapoptosis/neuroprotector (Brenneman, et al., Ann. N. Y.

Acad. Sci. 865:207-12, 1998); para la cardioprotección durante eventos isquémicos (Kalfin, et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1268(2):952-8, 1994; Das, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:297-308, 1998), para la manipulación del reloj circadiano y los trastornos relacionados (Hamar, et al., Cell 109:497-508, 2002; Shen, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 97:11575-80, 2000) y finalmente, como agente antiulceroso (Tuncel, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:309-22, 1998). Los polipéptidos de la presente invención pueden usarse solos o en combinación con terapias y/o compuestos adicionales que son conocidos para los especialistas en la materia en el tratamiento de la diabetes y los trastornos relacionados. En forma alternativa, los métodos y los polipéptidos descritos en la presente pueden usarse, parcial o completamente, en terapia combinada. Los polipéptidos de la invención también pueden administrarse en combinación con otras terapias conocidas para el tratamiento de la diabetes, que incluyen los agonistas del PPAR, las sulfonilureas, los secretagogos no sulfonilureas, los inhibidores de la a-glucosidasa, los sensibilizantes a la insulina, los secretagogos de insulina, los compuestos que disminuyen la producción de glucosa hepática, la insulina y los fármacos contra la obesidad. Dichas terapias pueden administrarse antes de la administración de los polipéptidos de la invención, junto con estos o con posterioridad a ellos. La insulina incluye las formas de acción corta y prolongada, y las formulaciones de insulina. El agonista del PPAR puede incluir los agonistas de cualquiera de las subunidades del PPAR o las combinaciones de este. Por ejemplo, el agonista del PPAR puede incluir los agonistas del PPAR-a, PPAR-?, PPAR-d, o cualquier combinación de dos o tres de las subunidades del PPAR. Los agonistas del PPAR incluyen, por ejemplo, la rosiglitazona, la troglitazona y la pioglitazona. Las sulfonilureas incluyen, por ejemplo, la gliburida, la glimepirida, la clorpropamida, la tolbutamida y la glipizida. Los inhibidores de la a-glucosidasa que pueden ser útiles para tratar la diabetes al administrarlos con un polipéptido de la invención incluyen Precose®, Miglitol® y Voglibose™. Los sensibilizantes a la insulina que pueden ser útiles para tratar la diabetes incluyen los agonistas del PPAR-?, como las glitazonas (p. ej., troglitazona, pioglitazona, englitazona, MCC-555, rosiglitazona y otras similares); las biguanidas, como la metformina y la fenformina; los inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa-1B (PTP-1 B); los inhibidores de la dipeptidil peptidasa IV (DP-IV); y las tiazolidinedionas y no tiazolidinedionas. Los compuestos que disminuyen la producción de glucosa hepática que pueden ser útiles para tratar la diabetes al administrarlos con un polipéptido de la ¡nvención incluyen ia metformina, como Glucophage® y Glucophage XR®. Los secretagogos de insulina que pueden ser útiles para tratar la diabetes al administrarlos con un polipéptido de la invención incluyen las sulfonilureas y no sulfonilureas: GLP-1 , péptido inhibidor gástrico (gastric inhibitor peptide, GIP), secretina, nateglinida, meglitinida, repaglinida, glibenclamida, glimepirida, clorpropamida y glipizida. El GLP-1 incluye los derivados del GLP-1 que tienen vidas medias más largas que el GLP-1 nativo, como por ejemplo, el GLP-1 derivatizado de ácidos grasos y el exendin. En una aplicación de la invención, los polipéptidos de la invención se usan en combinación con secretagogos de insulina para aumentar la sensibilidad de las células ß pancreáticas al secretagogo de insulina. Los polipéptidos de la invención también pueden usarse en métodos de la invención en combinación con fármacos contra la obesidad. Los fármacos contra la obesidad incluyen los agonistas ß-3; los antagonistas CB-1 ; los inhibidores del neuropéptido Y; los anorexígenos, como por ejemplo, la sibutramina (Meridia®, Abbott Laboratories); y ios inhibidores de la lipasa, como por ejemplo, el orlistat (Xenical®, Roche Pharmaceuticals). Los polipéptidos de la invención también pueden usarse en métodos de la invención en combinación con fármacos comúnmente utilizados para tratar los trastornos lipidíeos en pacientes diabéticos. Dichos fármacos incluyen, a mero título enunciativo, inhibidores de la HMG-CoA reductasa, ácido nicotínico, fármacos que disminuyen los lípidos (p. ej., esteres de estanol, glucósidos de esterol como la tiquesida y azetidinonas como la ezetimiba), inhibidores de la acetil-CoA-C-acetiltransferasa (acetyl-CoA C-acetyItransferase, ACAT) (como la avasimiba), secuestradores de ácidos biliares, inhibidores de la recaptación de ácidos biliares, inhibidores dei transporte de triglicéridos microsomales y derivados de ácido fíbrico. Los inhibidores de la HMG-CoA reductasa incluyen, por ejemplo, la lovastatina, la simvastatina, la pravastatina, la fluvastatina, la atorvastatina, la rivastatina, la itavastatina, la cerivastatina y la ZD-4522. Los derivados de ácido fíbrico incluyen, por ejemplo, el clofibrato, el fenofibrato, el bezafibrato, el ciprofibrato, el beclofibrato, el etofibrato y el gemfibrozil. Los secuestradores incluyen, por ejemplo, la colestiramina, el colestipol y los derivados dialquilaminoalquilo de un dextrano entrecruzado.

Los polipéptidos de la invención también pueden usarse en combinación con fármacos antihipertensivos, como por ejemplo, ß-bloqueadores e inhibidores de la enzima convertidora de la angiotensina (angiotensin converting enzime, ACE). Los ejemplos de agentes antihipertensivos adicionales para uso en combinación con los polipéptidos de la presente invención incluyen bloqueadores de los canales de calcio (tipo L y tipo T; p. ej., diltiazem, verapamilo, nifedipina, amlodipina y mibefradil), diuréticos (p. ej., clorotiazida, hidroclorotiazida, flumetiazida, hidroflumetiazida, bendroflumetiazida, metilclorotiazida, triclorometiazida, politiazida, benztiazida, ticrinafeno de ácido etacrínico, clortalidona, furosemida, musolimina, bumetanida, triamtereno, amilorida, espironolactona), inhibidores de la renina, inhibidores de la ACE (p. ej., captoprilo, zofenoprilo, fosinoprilo, enalaprilo, ceranoprilo, cilazoprilo, delapril, pentopril, quinaprilo, ramiprilo, lisinoprilo), antagonistas del receptor de la angiotensina 1 (AT-1 ) (p. ej., losarían, irbesartán, valsarían), antagonisías del recepíor de la endoíelina (ET) (p. ej., sifaxsenían, aírasenían, inhibidores de la endopepíidasa neutra (neutral endopeptidase, NEP), inhibidores de la vasopepfidasa (inhibidores duales de la NEP-ACE) (p. ej., omapaírilat y gemopafrilat) y niíraíos. Dichas terapias conjuntas pueden administrarse en cualquier combinación de dos o más fármacos (p. ej., un polipéptido de la ¡nvención en combinación con un sensibilizante a la insulina y un fármaco contra la obesidad). Dichas terapias conjuntas pueden adminisírarse en forma de composiciones farmacéuíicas, fai como se describió anteriormente. Sobre la base de ensayos bien conocidos usados para determinar la eficacia para el traíamienío de las condiciones idenfificadas anferiormeníe en mamíferos y por comparación de estos resultados con los resultados de medicamentos conocidos que se usan para trafar esías condiciones, la dosis efecíiva de los polipéptidos de esta invención puede determinarse fácilmente para el trafamienfo de cada indicación deseada. La caníidad de principio acíivo (p. ej., polipépíidos) que se adminisírará en el írafamienío de una de esías condiciones puede' variar en gran medida, en función de consideraciones tales como el polipépíido específico y la unidad posológica empleada, el modo de adminisíración, el período de íraíamienío, la edad y el sexo del pacieníe írafado, y la naíuraleza y la exíensión de la condición íraíada. Por lo general, la caníidad íoíal de principio acíivo que se adminisírará puede oscilar entre aproximadamente 0,00001 mg/kg y 1 mg/kg, y preferentemeníe eníre aproximadameníe 0,0001 mg/kg y 0,1 mg/kg de peso corporal por día. Una unidad posológica puede confener entre aproximadamente 0,01 mg y 20 mg de principio activo, y puede administrarse una o más veces por semana. La dosis semanal para la administración mediante inyección, incluidas las inyecciones intravenosas, intramusculares, subcutáneas y parenterales, y el uso de técnicas de infusión puede oscilar entre aproximadamente 0,0001 y 01 mg/kg. El régimen posológico rectal diario puede oscilar entre 0,001 y 1 mg/kg de peso corporal toíal. La conceníración íransdérmica puede ser la requerida para maníener una dosis diaria de entre 0,001 y 1 mg/kg. Por supuesto, el régimen posológico inicial y continuo específico para cada paciente variará en función de la naturaleza y severidad de la condición, según lo determine el médico traíante que realice el diagnóstico, la actividad del polipéptido específico empleado, la edad del paciente, la dieta del paciente, la hora de administración, la vía de administración, la tasa de excreción del fármaco, las combinaciones de fármacos y otros factores similares. El modo de tratamiento deseado y la cantidad de dosis de un polipéptido de la presente invención pueden ser determinados por los especialistas en la materia usando pruebas de tratamienío convencionales. Los polipéptidos de esta invención pueden utilizarse para lograr el efecto farmacológico deseado mediante la administración a un paciente que los necesite en una composición farmacéuíica formulada adecuadameníe. A los fines de esía invención, se eníiende por paciente un mamífero, incluidos los seres humanos, que necesita trafamiento para una condición o enfermedad específicas. Por lo tanlo, la presente invención incluye las composiciones farmacéuticas que están compuestas por un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad ferapéuficameníe efectiva de un polipéptido. Un vehículo farmacéuticameníe acepíable es cualquier vehículo que sea relaíivamenfe no íóxico e inocuo para un pacienfe a conceníraciones compaíibles con la acíividad efecfiva del principio acíivo, de forma íal que cualquier efecto secundario aíribuible al vehículo no contamine los efectos beneficiosos del principio activo. Una cantidad terapéuíicameníe efectiva de un polipéptido es la cantidad que produce un resultado o ejerce una influencia en la condición específica que se está traíando. Los polipépíidos descriíos en la preseníe pueden adminisírarse con un vehículo farmacéuficamenfe aceptable utilizando cualquier forma de unidad posológica convencional efectiva, que incluye, por ejemplo, preparados de liberación inmediata y prolongada, administración por vía oral, parenteral o tópica, u oíra forma similar. Los polipépíidos de esfa ¡nvención pueden adminisírarse por vía pareníeral, es decir, por vía intravenosa, intramuscular, interperiíoneal o preferentemente, por vía subcutánea, * como dosis inyectables del polipéptido en un diluyente fisiológicamente aceptable con un vehículo farmacéuíico que puede ser un líquido o una mezcla de líquidos estériles, como agua, solución salina, dexírosa acuosa y soluciones de azúcar relacionadas; un alcohol, como etanol, isopropanol o alcohol hexadecílico; glicoles como propilenglicol o polietilenglicol; cetales de glicerol, como 2,2-dimetil-1 ,1-dioxolano-4-mefanol; éferes como poli(eíilenglicol) 400; un aceife; un ácido graso; un ésíer o glicérido de ácido graso; o un glicérido de ácido graso aceíilado con o sin la adición de un surfactante farmacéuticamente aceptable, como un jabón o detergeníe, un agente de suspensión, como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximeíilcelulosa, o un agenle emulsionante y otros adyuvantes farmacéuticos. Algunos ejemplos de aceites que pueden usarse en las formulaciones parenterales de esta invención son aquellos a base de petróleo, de origen animal, vegetal o sintéíico, por ejemplo, el aceife de cacahuete, soja, sésamo, semillas de algodón, maíz u oliva, la vaselina y el aceite mineral. Los ácidos grasos apropiados incluyen el ácido oleico, el ácido esteárico y el ácido isoesteárico.

Algunos ésíeres de ácidos grasos apropiados son, por ejemplo, el eíil oleato y el isopropil miristaío. Los jabones apropiados incluyen aquellos de metal alcalino graso, amonio y sales de trieíanolamina, y los detergentes apropiados incluyen los detergentes catiónicos, por ejemplo, los halogenuros de dimetil dialquil amonio, halogenuros de alquil piridinio y acétalos de alquilamina; los detergentes aniónicos, por ejemplo, los sulfonatos de alquilo, arilo y olefina; los sulfatos de alquilo, olefina, éter y monoglicérido; y los sulfosuccinatos; los detergeníes no iónicos, por ejemplo, los óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxieíilenpolipropileno; y los detergentes anfotéricos, por ejemplo, los alquil-beta-aminopropionaíos y ias sales de 2-alquilimidazolina cuaternaria de amonio, como también mezclas. Por lo general, las composiciones parenterales de esta invención pueden contener aproximadamente entre el 0,5% y el 25% según el peso del principio activo en la solución. Los conservantes y las soluciones amortiguadoras íambién pueden usarse de forma veníajosa. A fin de minimizar o eliminar la irriíación en el lugar de inyección, es posible que dichas composiciones contengan un surfactante no ¡ónico que tenga un equilibrio hidrófiio-lipófilo (hydrophile-lipophile balance, HLB) de entre 12 y 17 aproximadamente. La cantidad de surfactante presente en dicha formulación oscila aproximadamente entre un 5% y un 15% según el peso. El surfactante puede ser un componente único que tenga el HLB aníes mencionado o puede ser una mezcla de dos o más componenfes que íenga el HLB deseado. Algunos ejemplos de los surfacíaníes usados en las formulaciones pareníerales son la clase de ésferes de ácidos grasos de sorbiíán de polietileno, por ejemplo, el monooleato de sorbitán y los aductos de alio peso molecular del óxido de etileno con una base hidrofóbica, formada por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las composiciones farmacéuticas pueden tener la forma de suspensiones acuosas inyectables estériles. Dichas suspensiones pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos utilizando agentes dispersantes o humectaníes y ageníes de suspensión apropiados, como por ejemplo, carboximeíilcelulosa sódica, meíilcelulosa, hidroxipropilmeíil-celulosa, alginaío de sodio, polivinilpirrolidona, goma de íragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectaníes que pueden ser una fosfatida presente naturalmeníe, como la leciíina, un producío de la condensación de un óxido alquileno con un ácido graso, por ejemplo, estearato de polioxietileno, un producto de la condensación de un óxido de etileno con un alcohol alifático de cadena larga, por ejemplo, heptadecaetilenoxiceíanol, un producto de la condensación de un óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un hexitol, como el monooleato de sorbitán de polioxietileno, o un producto de la condensación de un óxido de etileno con un éster parcial derivado de un ácido graso y un anhídrido de hexitol, por ejemplo, monooleato de sorbitán de polioxietileno. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmeníe aceptable no tóxico. Los diluyentes y solventes que pueden emplearse son, por ejemplo, agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles son empleados convencionalmente como solventes o medios de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo suave, incluidos los monoglicéridos o diglicéridos sintéíicos. Además, los ácidos grasos como el ácido oleico pueden usarse en la preparación de formas inyectables. Una composición de la ¡nvención también puede administrarse en forma de supositorios del fármaco para administración rectal. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco (p. ej., polipéptido) con un excipiente no irritante apropiado que sea sólido a temperaturas habituales, pero líquido a la temperatura rectal y que, en consecuencia, se derretirá en el recto para liberar el fármaco. Dichos materiales incluyen, por ejemplo, la mantequilla de cacao y el polietilenglicol. Otra formulación empleada en los métodos de la presente invención emplea disposiíivos de administración transdérmica ("parches"). Dichos parches transdérmicos pueden usarse para proporcionar una infusión continua o discontinua de los polipéptidos de la presente ¡nvención en cantidades controladas. La elaboración y el uso de parches transdérmicos para la administración de agentes farmacéuíicos es bien conocida en el campo (ver, p. ej., la Paíeníe esíadounidense n.° 5.023.252, que se incluye en la preseníe por referencia). Dichos parches pueden elaborarse para la adminisíración de agentes farmacéuticos en forma continua, pulsátil o a demanda. Es posible que sea deseable o necesario introducir la composición farmacéutica en el paciente a través de un dispositivo de administración mecánico. La elaboración y el uso de dispositivos de administración mecánicos para la administración de agentes farmacéuticos es bien conocida en el campo. Por ejemplo, las técnicas directas para administrar un fármaco directamente en el cerebro, por lo general, implican la colocación de un catéter para la administración del fármaco en el sistema ventricular del paciente, a fin de puentear la barrera hematoencefálica. Uno de tales sistemas de administración implantables que se usan para el transporte de agentes a regiones anatómicas específicas del cuerpo se describe en la Patente estadounidense n.° 5.011.472, que se incluye en la presente por referencia. Las composiciones de la invención también pueden contener otros ingredientes para composición farmacéuticamente aceptables convencionales, que generalmente se denominan vehículos o diluyentes, según sea necesario o se requiera. Cualquiera de las composiciones de esta invención puede preservarse mediante la adición de un antioxidante, como el ácido ascórbico, o mediante otros conservantes apropiados. Pueden utilizarse los procedimientos convencionales para preparar dichas composiciones en 'formas galénicas apropiadas. Los ingredientes farmacéuticos uíilizados comúnmeníe cuyo uso puede ser apropiado para formular la composición para su vía de adminisíración pretendida incluyen: agentes acidificantes, por ejemplo, a mero título enunciativo, ácido acélico, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido clorhídrico, ácido nítrico; y agentes alcalinizantes, por ejemplo, a mero título enunciativo, solución de amoníaco, carbonato de amonio, dietanolamina, monoetanolamina, hidróxido de potasio, borato de sodio, carbonato de sodio, hidróxido de sodio, trietanolamina, trolamina.

Otros ingredientes farmacéuticos incluyen, a mero título enunciativo, adsorbentes (p. ej., celulosa en polvo y carbón activado); propulsores en aerosol (p. ej., dióxido de carbono, CCI2F2, F2CIC-CCIF2 y CCIF3); agentes de desplazamiento de aire (p. ej., nitrógeno y argón); conservantes antimicóticos (p. ej., ácido benzoico, butilparabeno, eíilparabeno, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio); conservantes antimicrobianos (p. ej., cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato de fenilmercurio y timerosal); antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galaío de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, metabisulfito de sodio); materiales de unión (p. ej., polímeros de bloque, caucho natural y sintético, poliacrilatos, poliuretanos, siliconas y copolímeros de estireno-buíadieno); agentes amortiguadores (p. ej., meíafosfato de potasio, fosfato de potasio monobásico, acetato de sodio, citraío de sodio anhidro y dihidraío de ciírato de sodio); vehículos (p. ej., jarabe de acacia, jarabe aromático, elixir aromático, jarabe de cereza, jarabe de cacao, jarabe de naranja, jarabe, aceite de maíz, aceite mineral, aceite de cacahuate, aceite de sésamo, inyección bacteriostática de cloruro de sodio y agua bacteriostática para inyección); agentes quelantes (p. ej., edetato disódico y ácido edético); eoloraníes (p. ej., FD&C rojo n.° 3, FD&C rojo n.° 20, FD&C amarillo n.° 6, FD&C azul n.° 2, D&C verde n.° 5, D&C naranja n.° 5, D&C rojo n.° 8, caramelo y rojo óxido férrico); agentes clarificantes (p. ej., bentoniía); ageníes emulsionantes (a mero título enunciativo, acacia, cetomacrogol, alcohol cetílico, monoestearaío de glicerilo, lecitina, monooleato de sorbitán, estearato de polietileno 50); agentes encapsulantes (p. ej., gelatina y ftalato de acetaío de celulosa); saborizantes (p. ej., aceite de anís, aceite de canela, cacao, mentol, aceite de naranja, aceite de menta y vainilla); humectantes (p. ej., glicerina, propilenglicol y sorbitol); agentes para levigar (p. ej., aceite mineral y glicerina); aceites (p. ej., aceite de maní, aceite mineral, aceite de oliva, aceite de cacahuate, aceite de sésamo y aceite vegetal); bases para pomadas (p. ej., lanolina, pomada hidrofílica, pomada de polietilenglicol, vaselina, vaselina hidrofílica, pomada blanca, pomada amarilla y pomada de agua de rosas); elementos que aumentan la penetración (administración transdérmica) (p. ej., monohidroxi o polihidroxi alcoholes, alcoholes grasos saturados o no saturados, esteres grasos saturados o no saturados, ácidos dicarboxílicos saturados o no saturados, aceites esenciales, derivados de fosfatidilo, cefalina, terpenos, amidas, éteres, cetonas y ureas); plastificantes (p. ej., ftalato de dietilo y glicerina); solventes (p. ej., alcohol, aceite de maíz, aceite de semillas de algodón, glicerina, alcohol isopropílico, aceite mineral, ácido oleico, aceite de cacahuate, agua purificada para inyección, agua estéril para inyección y agua estéril para irrigación); agentes endurecedores (p. ej., alcohol cetílico, cera de esteres cetílicos, cera microcrisíalina, parafina, alcohol esíearílico, cera blanca y cera amarilla); bases para supositorios (p. ej., mantequilla de cacao y polietilenglicoles (mezclas)); surfactantes (p. ej., cloruro de benzalconio, nonoxinol 10, oxtoxinol 9, polisorbato 80, sulfato láurico de sodio y monopalmitato de sorbitán); agentes de suspensión (p. ej., agar, bentonita, carbómeros, carboximetilcelulosa sódica, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, caolín, metilcelulosa, tragacanío y Veegum); endulzantes (p. ej., aspartamo, dexírosa, glicerina, maniíol, propilenglicol, sacarina sódica, sorbiíol y sacarosa); antiadherentes para comprimidos (p. ej., estearato de magnesio y talco); aglutinantes para comprimidos (p. ej., acacia, ácido algínico, carboximetilcelulosa sódica, azúcar compresible, etil celulosa, gelatina, glucosa líquida, metilcelulosa, povidona y almidón pregelatinizado); diluyentes para comprimidos y cápsulas (p. ej., fosfato de calcio dibásico, caolín, lactosa, manitol, celulosa microcristalina, celulosa en polvo, carbonato de calcio precipitado, carbonato de sodio, fosfato de sodio, sorbitol y almidón); agentes para recubrimiento de comprimidos (p. ej., glucosa líquida, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, ftalato de acetato de celulosa y goma laca); excipientes para la compresión directa de comprimidos (p. ej., fosfato de calcio dibásico); desintegrantes de comprimidos (p. ej., ácido algínico, carboximetilcelulosa calcica; celulosa microcristalina, polacrilina potásica, alginato de sodio, glicolato de almidón sódico y almidón); deslizantes para comprimidos (p. ej., sílice coloidal, almidón de maíz y talco); lubricantes para comprimidos (p. ej., estearato de calcio, estearaío de magnesio, aceiíe mineral, ácido esteárico y estearaío de zinc); opacantes para comprimidos/cápsulas (p. ej., dióxido de titanio); agentes para el pulido de comprimidos (p. ej., cera de Carnauba y cera blanca); agentes espesantes (p. ej., cera de abejas, alcohol cetílico y parafina); agentes de tonicidad (p. ej., dexírosa y cloruro de sodio); agentes que aumentan la viscosidad (p. ej., ácido algínico, bentonita, carbómeros, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, povidona, alginato de sodio y tragacanto); y agentes humectantes (p. ej., oxicetanol de hepíadecaetileno, lecitinas, monooleato de sorbitol de polietileno, monooleato de sorbitol de polioxietileno y estearaío de polioxieíileno). Los polipépíidos descritos en la preseníe pueden adminisírarse como agentes farmacéuticos únicos o en combinación con uno o más agentes farmacéuticos más, donde la combinación no provoca efectos adversos inaceptables. Por ejemplo, los polipéptidos de esta invención pueden combinarse con agentes contra la obesidad, agentes antidiabéíicos o agentes para otras indicaciones conocidos, y agentes similares, como también con mezclas y combinaciones de estos. Los polipéptidos descritos en la presente también pueden utilizarse, en forma de base libre o en composiciones, con fines de investigación y diagnóstico, o como estándares de referencia analítica, y para otros usos similares. Por lo tanto, la presente ¡nvención incluye las composiciones que comprenden un vehículo inerte y una caníidad efecfiva de un polipéptido identificado por los métodos descritos en la presente, o una sal o éster de éste. Un vehículo inerte es cualquier material que no interactúa con el polipéptido que será transportado y que proporciona un soporte, un medio de transporte, volumen, un material rastreable, eníre oíras cosas, al polipéptido que será transportado. Una cantidad efectiva de polipéptido es la cantidad que produce un resultado o ejerce una influencia en el procedimiento específico que se está realizando. Se sabe que los polipéptidos experimentan hidrólisis, desamidación, oxidación, racemización e isomerización en medios acuosos y no acuosos. La degradación mediante la hidrólisis, desamidación u oxidación, por ejemplo, puede detectarse fácilmente medianíe electroforesis capilar, espectrometría de masas o degradación de Edman. Sin perjuicio de la degradación enzimática, los polipéptidos que tienen una vida media plasmática o un tiempo de residencia biológica prolongados deben, como mínimo, ser estables en solución acuosa. Es esencial que el polipéptido exhiba una degradación menor al 10% durante un período de un día a temperatura corporal. Es aún más preferible que el polipéptido exhiba una degradación menor al 5% durante un período de un día a temperatura corporal. Debido a que el paciente diabético crónico recibe tratamiento durante toda su vida, preferentemente, es aún más conveniente administrar estos agentes terapéuficos con poca - frecuencia, si se adminisíran por vía parenteral. La estabilidad (es decir, un porcentaje pequeño de degradación) durante un período de semanas a temperaíura corporal permiíirá la administración de dosis con menos frecuencia. La estabilidad (es decir, un porcentaje pequeño de degradación) a la degradación a través de la proteólisis, en relación con la DPP4 o en plasma durante períodos de días a semanas respaldará aún más la administración de dosis con menos frecuencia. La estabilidad en años a temperatura de refrigeración permitirá al fabricante presentar una formulación líquida y evitar, de este modo, la incomodidad de la reconstiíución. Además, la esíabilidad en un solveníe orgánico permiíirá formular el polipépfido en formas galénicas nuevas, como implantes. Las formulaciones apropiadas para la administración subcutánea, intravenosa, intramuscular y otras similares; los vehículos farmacéuticos apropiados; y las técnicas para la formulación y administración pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en el campo (ver, p. ej., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 20 a edición, 2000). Debe ser evidente para una persona con conocimientos normales en la materia que pueden realizarse cambios y modificaciones a esta invención, sin apartarse del espíriíu o alcance de la invención, según lo esíabiecido en la presente.

EJEMPLOS A fin de que esta invención pueda comprenderse mejor, se incluyen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se incluyen únicamente con fines ilustrativos, y no debe interpretarse que limitan el alcance de la invención de ninguna manera. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incluyen en su totalidad por referencia. Ejemplo 1. Metodología de síntesis peptíídíca Para sintetizar algunos de los polipéptidos de la invención se siguieron los siguientes procedimientos generales: La síntesis peptídica se realizó mediante la estrategia de FMOC/t-butilo (Penningíon y Dunn, Peptide Synthesis Protocols, Volumen 35, 1994) en condiciones de flujo continuo, usando resinas de polietileriglicol-poliestireno de Rapp-Polymere (Rapp-Polymere, Tubingen, Alemania). Al completarse la síntesis, los péptidos fueron olivados de la resina y desprotegidos usando TFA/DTT/H2O/triisopropil silano (88/5/5/2). Los péptidos fueron precipitados del líquido de clivaje usando dietil éter frío. El precipitado se lavó tres veces con el éter frío y luego se disolvió en ácido acético al 5% antes de la liofilización. Los pépíidos fueron verificados medianíe cromaíografía en fase invertida en una columna YMC-Pack ODS-AQ (YMC, Inc., Wilmingíon, NC) en un sistema ALLIANCE® de Waters (Waters Corporation, Milford, MA) usando agua/acetonitrilo con TFA al 3% como gradiente de 0% a 100% de acetonitrilo, y mediante la espectrometría de masas de desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (matrix-assisíed laser-desorption ionization, MALDI) en un Espectómetro de masas MALDI VOYAGER DE™ (Modelo 5-2386-00, PerSeptive BioSystems, Framingham, MA). La muesíra de pépíidos se agregó a la solución amortiguadora Matrix (50/50 dH2O/acetonitrilo con TFA al 3%) en una proporción 1/1. Los pépfidos que no cumplían con los criterios de pureza de >95% fueron purificados mediante cromatografía en fase invertida en un Sistema de HPLC Delta Prep 4000 de Waters (Waters Corporation, Milford, MA).

Ejemplo 2. Acetilación peptídica Los péptidos fueron sintetizados mediante métodos estándar bien conocidos en el campo. Los péptidos fueron sintelizados con un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 430A utilizando química FMOC con activación con HBTU en resina Rink amida, y el N-terminal fue acetilado con anhídrido acético. El péptido fue clivado con TFA al 84,6%, fenol al 4,4%, agua al 4,4%, tioanisol al 4,4% y etanoditiol al 2,2%. Los péptidos fueron precipitados del líquido de clivaje usando éter tertbutilmetílico. El precipitado se lavó con el éter frío y se secó con argón. Los péptidos fueron purificados con cromatografía C18 en fase invertida con gradientes lineales de agua/acetonitrilo con TFA al 0,1%. La identidad de los péptidos se confirmó con la espectrometría de masas MALDI y por electrospray, y con análisis de aminoácidos.

Ejemplo 3. PEGilación peptídica La vida media de un péptido in vivo puede aumentarse a través de la unión de una fracción de polietilenglicol (PEG) al péptido, con lo cual se reduce la depuración del péptido por parte del riñon y se reduce la degradación del péptido mediante la proteasa. El uso de un péptido agonista del receptor VPAC2 se ve severamente limitado por su muy corta vida media in vivo; la unión de una fracción de PEG al péplido (PEGilación) prolongó lo suficiente la vida media del péptido como para permifir un íraíamiento aplicado entre upa vez por día y una vez por semana. La PEGilación puede realizarse mediante cualquier método conocido para los especialistas en la materia. Sin embargo, en este ejemplo, la PEGilación se realizó mediante la introducción de una mutación en la cisteína única en el péptido, seguida de la PEGilación de la cisteína a través de un enlace tioéíer esíable enlre el sulfhidrilo del péptido y el grupo maleimida del reactivo metoxi- PEG-maleimida (Nekíar (Inhale/Shearwaíer), San Carlos, CA; NOF, Tokio, Japón). La cisteína única puede introducirse en el C-terminal del péptido para minimizar la posible reducción de la actividad mediante la PEGilación. Como ejemplo, se agregó un exceso molar dos veces mayor de un reactivo mPEG-mal (peso molecular 22kD y 43kD) a 1 mg de péptido (p. ej., ID de SECUENCIA N.° 1 con una muíación en la cisteína en el C-terminal del péptido) y se disolvió en una solución amortiguadora de reacción a pH 6 (fosfato sódico 0,1 M / NaCl 0,1 M / ácido etilendiaminoíeíraacéíico [EDTA] 0,1 M). Después de 30 minuíos a temperaíura ambiente, la reacción se terminó con el agregado de un exceso molar dos veces mayor de ditiotreitol (DTT) a mPEG-mal. La mezcla reactiva péptido-PEG-mal se aplicó a una columna de intercambio catiónico para remover los reactivos de PEG residuales, seguido de una columna de filtración por gel para remover el péptido libre residual. La pureza, la masa y el número de sitios PEGilados se determinó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (Sodium dodecyl sulphate-PoIyacrylamide gel elecírophoresis, SDS-PAGE) y especírometría de masas de desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (matrix-assisted laser-desorption ionization, MALD!)-tiempo de vuelo (time of flight, TOF). Cuando se unió un PEG de 22 kD a los péptidos de la presente ¡nvención, se mantuvo la potente activación del receptor VPAC2. Asimismo, también se mantuvo la selectividad de activación de receptores del VPAC2, en comparación con el VPAC1 y el PAC1. Es posible que la PEGilación con un PEG más pequeño (p. ej., un PEG lineal de 22 kD) tenga menos probabilidades de reducir la actividad del péptido, mientras que un PEG de mayor tamaño (p. ej., un PEG ramificado de 43kD) tendrá más probabilidades de reducir la actividad. Sin embargo, el PEG de mayor tamaño aumentará aún más la vida media plasmática, de forma tal que sea posible administrar una inyección por semana (Harris, et al., Clin. Pharmacokinet. 40:539-551, 2001). Ejemplo 4. Composición farmacéutica: formulaciones IV y SC Una formulación inyectable IV estéril se prepara con 4 mg de un polipéptido de ID de SECUENCIA N.° 1 , o un polipéptido derivatizado que tenga un contenido equivalente a 4 mg de polipéptido, y 1 L de solución salina estéril, utilizando cualquier proceso de fabricación bien conocido en el campo. Para la formulación subcutánea (SC), pueden utilizarse concentraciones más altas del polipéptido. En el caso del polipéptido identificado como ID de SECUENCIA N.° 1, o de un polipéptido derivatizado, se disuelven 4 mg en 100 mL de solución salina o dimetiisulfóxido (DMSO), y se rellenan con la composición viales estériles previamente sometidos a filtración aséptica. Ejemplo 5. Análisis de péptidos mediante espectrometría de masas Se diluyeron con agua alícuotas de cuarenta pmol/2 µl d péptidos hasta 10 µl. La solución amortiguadora de ácido N-2-hidroxieíilpiperazin-N'-2-eíanosulfónico (N-2-Hydroxyeíhylpiperazin-N'-2-Efhanesulfonic Acid, HEPES) fue removida medianíe la aplicación del 50% de la muestra (20 pmol/5 µl) a un C18 ZipTip acondicionado de Millipore, según las insírucciones del fabricante. La muestra fue eluida del ZipTip con una matriz (10 mg/ml de ácido alfa-cianohidroxicinámico en acetonitrilo (ACN) al 50%, TFA al 0,1%) directamente en la placa MALDI. Las muestras fueron analizadas en un sistema Voyager DE-PRO MALDI de Applied Biosystems operado en el modo reflector de iones. Los datos se recopilaron en el rango de 500 a 4000 Da, y las masas resultantes se compararon con las teóricas mediante cálculos manuales. Ejemplo 6. Análisis de péptidos de Edman Se suministraron muestras de péptidos para la degradación de Edman a 1 nmol/10 µl en HEPES 10 mM, pH 7,4, TFA al 5%. Antes del análisis de Edman, se removió la sal de la solución amortiguadora de HEPES usando un cartucho de muestra ProSorb de Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante. Brevemente, la muestra se aplicó a una membrana de difluroruro de polivinilideno (Polyvinylidene difluoride, PVDF) y se lavó con TFA al 0,1%; luego se removió la 5 membrana y se insertó en el secuenciador de proteínas para la degradación de Edman. La degradación de Edman se llevó a cabo en un sistema de secuenciación de proteínas Procise 494HT de Applied Biosystems, utilizando el método en fase líquida pulsante, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las determinaciones de secuencias se realizaron manualmente. Ejemplo 7. Estabilidad de los péptidos. Las formulaciones descritas en el Ejemplo 4 se colocaron en una cámara - de estabilidad constante. Los péptidos íambién fueron analizados con respecío a su estabilidad a la degradación en soluciones de DPP4 y en plasma.

Periódicamente, se removieron muestras para análisis mediante electroforesis capilar, espectrometría de masas, degradación de Edman, ELISA y ensayos de actividad peptídica, que son métodos sensibles para detectar la degradación del polipéptido. Se sumó el área de varios picos y el área del pico del polipéptido - precursor se divide por el área pico total. El cociente es la pureza porcentual.

Dado que hay impurezas presentes en el polipéptido nuevo, el cambio en la pureza se normaliza dividiendo la pureza en diferentes puntos en el tiempo por la pureza inicial. Para medir la estabilidad al DPP4 y en plasma, los péptidos a 20 pmol/µl se incubaron a 37°C en presencia de DPP-IV 300 pM en HEPES 100 mM, pH 7,4 (Figura 2a). En diversos puntos en el tiempo, la reacción (alícuota de 2 µl) se terminó mediante la adición del inhibidor de la DPP-IV 1 µM y el congelamiento. Para el análisis de espectromeíría de masas MALDl, se evaluaron los siguieníes punios en el liempo: T = 0 h, 1 h, 5 h y 24 h. Los resulíados se graficaron como porcenfaje de péptidos o derivados de péptidos intacíos, en comparación con los producios de degradación.

Ejemplo 8. Unión de los péptidos a los receptores PACAP1 y VPAC1 y VPAC2 Se cultivaron hasta la confluencia células de CHO con una sobreexpresión de los receptores PAC1 , VPAC1 y VPAC2, luego fueron raspadas de sus matraces y peletizadas por centrifugación suave en tubos de 50 ml. Los pellets fueron resuspendidos n una solución amortiguadora de homogeneización a base de iris y homogeneizados en un iriturador de tejidos Dounce con 30-40 golpes manuales en hielo. La suspensión se centrifugó en una ultracenírifugadora, lo cual produjo la peletización de las membranas. Este pellef se resuspendió en una pequeña cantidad de solución amortiguadora de homogeneización y se determinó una concentración de proteínas a través del uso de un kit BCA de Pierce. Una reaccisn de unión que contiene una protevna de membrana de 10 µg, 125I-PACAP 27 0,1 nM y una curva de dosis del compuesto a ser evaluado se incubó en una placa de 96 pocilios a 37°C durante 20 minutos. La reacción se detuvo al colocar la placa en hielo durante 20 minutos. La reacción se agregó a una placa de filtro preincubada con polietilenimina (polyethylenimine, PEÍ) al 0,1% para evitar la unión no específica, se procesó con un colector de vacío y se lavó varias veces con una solución de lavado a base de albúmina sérica bovina (bovine serum albúmina, BSA). La placa de filtro se secó, se agregó centelleador y se leyó en un contador MicroBeta. Los datos fueron analizados y presentados en gráficos Prism. Ejemplo 9. Elevación del cAMP en respuesta a los péptidos Las células de CHO que expresaban los péptidos VPAC2 se colocaron en placas de 96 pocilios a razón de 8 x 104 células/pocilio y se cultivaron a 37 °C durante 24 horas en aMEM, nucleósidos, glutamina (Gibco/BRL, Rockville, MD), suero bovino fetal (fetal bovine serum, FBS) al 5%, Pen/Strep 100 µg/mL, higromicina 0,4 mg/mL y Geneíicin 1 ,5 mg/mL (Gibco/BRL). Los medios se removieron y las placas se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato (phosphate buffered saline, PBS). Las células se incubaron con un pépíido (en HEPES 10 mM, NaC1 150 mM, KCl 5 mM, CaCI2 2,5 mM, KH2P04 1,2 mM, MgSO4 1 ,2 mM, NaHCO3 25 mM (pH 7,4) con BSA al 1% y 100 µM IBMX) durante 15 minutos a 37 °C. El AMP cíclico de los extractos celulares se cuantificó utilizando el sistema de ensayo con cribado directo del ensayo de proximidad por centelleo (scintillaíion proximity assay, SPA) del cAMP (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, ). La cantidad de cAMP presente en los lisados se determinó siguiendo las instrucciones provistas con este kit. La cantidad de cAMP (en pmol) producida a cada concentración del péptido se gráfico y analizó mediante regresión no lineal utilizando el software Prizm para determinar la mediana de la concentración efectiva (median effective conceníration, EC50) para cada péptido. En forma alternativa, la elevación del cAMP en respuesta a la activación del receptor puede medirse en una línea celular indicadora, como la de CHO, que no sólo expresa el receptor deseado, sino que también expresa un indicador, como la luciferasa, unido a un elemento de respuesta al cAMP (cAMP response element, CRE). Dichas células se colocan en placas de 96 pocilios a razón de 104 células por pocilio y se cultivan a 37 °C durante 48 horas en aMEM, nucleósidos, glutamina (Gibco/BRL, Rockville, MD), FBS al 5%, Pen/Strep 100 µg/mL, higromicina 0,4 mg/mL y Geneticin (Gibco/BRL) 1 ,5 mg/mL. Luego las células se incuban con un péptido durante 6 horas, se remueven los medios y se agrega el reactivo Bright-Glo (Promega). La señal se delecta usando un contador de centelleo. Los polipéptidos de esta invención están diseñados sobre la base del VIP, que se ha demostrado que carece de actividad en el PAC1 (Vaudry, et al., Pharmacol. Rev. 52:269-324, 2000). Por lo tanto, se cree que los polipéptidos de esta invención no poseen actividad considerable en el PAC1. En la Figura 3 se, muestran los resultados de este ensayo con polipéptidos representativos de esta invención. Los péptidos identificados como ID de SECUENCIA N.° 1 y 112 son potentes agonistas del receptor VPAC2, y activan el receptor al 100% del nivel máximo de activación del receptor lograda por el péptido endógeno PACAP-27. Asimismo, los péptidos identificados como ID de SECUENCIA N.° 1 , 112, 152 y 154 son agonistas selectivos del receptor VPAC2 y poseen una actividad agonista muy débil con respecto al VPAC1. El PACAP-27 es un potente agonista del VPAC1. Ejemplo 10. Secreción de insulina de células de los islotes de ratas dispersas La secreción de insulina de islotes de ratas dispersas mediada por una serie de péptidos de la presente invención se midió como se describe a continuación. Se digirieron los islotes de Langerhans, aislados de ratas SD (200- 250 g), utilizando colagenasa. Las células de los islotes dispersas fueron tratadas con tripsina, sembradas en placas de 96 pocilios con fondo en V y peletizadas. Luego las células se cultivaron durante la noche en medios con o sin péptidos de esta invención. Los medios fueron aspirados, y las células fueron preincubadas con solución amortiguadora de Krebs-Ringer-HEPES que contenía glucosa 3 mM durante 30 minutos a 37°C. La solución amortiguadora de preincubación se removió, y las células se incubaron a 37°C con solución amortiguadora de Krebs-Ringer-HEPES que contenía la concentración apropiada de glucosa (p. ej., 8 mM), con o sin péptidos, durante un período apropiado. En algunos estudios, también se incluyó una concentración apropiada de GLP-1. Se removió una porción del sobrenadante y se midió su contenido de insulina mediante SPA. Los resultados se expresaron como "cantidad de veces mayor que el control"(fold over control, FOC). En este ensayo, un aumento en la secreción de insulina de células de los islotes de ratas dispersas se definió como un aumento de al menos 1 ,4 veces. El componente agonista del receptor VPAC2 de los polipéptidos de esta ¡nvención produjo un aumento en la secreción de insulina de las células de los islotes dispersas de, al menos, entre 1 ,4 veces y aproximadamente 1,7 veces. Ejemplo 11. Generación de anticuerpos específicos contra los péptidos y medición de los péptidos mediante ELISA Se generaron anticuerpos policlonales específicos contra los polipéptidos de la presente invención mediante la síntesis de un fragmento específico de un polipéptido de esta invención utilizando un sintetizador de pépfidos ABI 433A. Luego, el péptido fue olivado de la resina y purificado en un sistema de HPLC analítica y preparativa System Gold de Beckman. Se utilizó un sistema de espectrofotómetro de masas MALDl Perspective para identificar el producto correcto. El péptido se secó utilizando un liofilizador. Luego, el péptido (2 mg) fue conjugado con hemocianina de lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin, KLH) a través del grupo sulfhidrilo libre de la Cys. Conejas blancas de Nueva Zelanda fueron inmunizadas el Día 0, 14, 35, 56 y 77. El Día 0, a cada coneja se le administró una inyección subcutánea de 250 Og del péptido y el adyuvante de Freund completo. Las inmunizaciones posteriores utilizaron 125 Dg del péptido por coneja. Las sangrías se iniciaron el Día 21 y continuaron a intervalos de 21 días en lo sucesivo. La purificación de los anticuerpos contra el péptido se realizó pasando el suero crudo por una columna de purificación por afinidad específica peptídica. La tilulación de anticuerpos se determinó mediante ELISA. Una placa Immulon 4HBX de 96 pocilios se cubrió con un anticuerpo F(ab) C-terminal de Morphosys, específico contra los péptidos de la presente invención y se dejó incubar durante la noche a 4 °C. Luego la placa se bloqueó para impedir la unión no específica. Luego, los estándares de péptidos (2500 ng/mL-160 pg/mL) se diluyeron en plasma al 33%, y las muestras se diluyeron en una proporción 1 :3 en solución amortiguadora, seguida de incubación durante 1 ,5 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, se incubó en la placa un anticuerpo N-terminal policlonal específico contra los péptidos de esta invención, durante una hora. A continuación, se agregó el anticuerpo de burro-anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (horseradish peroxidase, HRP), y las muestras y los estándares fueron incubados durante una hora más. La detección se evaluó después de la incubación con solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencid¡na (TMB), y la placa se lee a una densidad óptica de OD45o (Figura 4a).

En forma a.ltemaíiva, la placa Immulon 4HBX de 96 pocilios se cubrió con un anticuerpo N-terminal policlonal, específico contra los péptidos de la presente invención, y se dejó incubar durante la noche a 4 °C. Luego la placa se bloqueó para impedir la unión no específica. Luego, los estándares de péptidos (2500 ng/mL-160 pg/mL) se diluyeron en plasma al 50%, y las muestras se diluyeron en una proporción 1 :2 en solución amortiguadora, seguida de incubación durante 1,5 horas a temperaíura ambiente. Después del lavado, se incubó durante una hora en la placa un anticuerpo anti-PEG monoclonal específico coníra los péptidos de esta invención. A continuación, se agregó el anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), y las muestras y los estándares fueron incubados durante una hora más. La detección se evaluó después de la incubación con solución de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), y la placa se lee a OD450 (Figura 4b).

Ejemplo 12. Farmacocinética de los péptidos después de la administración de dosis IV y subcutáneas Las muestras de plasma se transfieren a un tubo microcentrífugo y se agrega un volumen equivalente de acetonitrilo a la muestra (concentración final del 50%). La muestra se mezcla en vórtex durante aproximadamente 5 minutos y se deja reposar en hielo durante 10 minutos. La muestra se mezcla vigorosamente en vórtex nuevamente durante aproximadameníe 1 minuto, y luego se centrifuga durante 30 minutos en un tubo microcentrífugo (4 °C) a la velocidad máxima (aproximadamente 15.000 x g). Después de la centrifugación, la fase acuosa se transfiere cuidadosamente a un tubo centrífugo limpio, y la muestra se centrifuga durante 5 minutos en un tubo microcentrífugo (4 °C) a la velocidad máxima (aproximadamente 15.000 x g). La muestra extraída se seca al vacío usando un Speed Vac SC110 (Savant) con la temperaíura intermedia hasfa que se seque. La muesíra se resuspende en un volumen apropiado de agua esíéril y se maníiene a 4 °C. Luego, la muestra se homogeniza con ultrasonido en un baño ultrasónico durante 10 minutos a temperatura ambiente antes del análisis. La concentración peptídica se determina utilizando el ensayo indicador según lo descrito en el Ejemplo 9. Usando este método, las propiedades farmacocinéticas de la ID de SECUENCIA N.° 112 se compararon con las de la ID de SECUENCIA N.° 154 (Figura 5a). La acetilación pepíídica preseníe en la ID de SECUENCIA N.° 112 demuesfra mejores propiedades farmacocinéíicas, y se deíecfa a las 24 y 48 horas, mienfras que el pépíido no aceíilado de la ID de SECUENCIA N.° 154 se deíecfa únicameníe a las 6 horas. Esfudios posíeriores que compararon los dos péptidos demostraron que la ID de SECUENCIA N.° 112 tenía una vida media de 10,9 horas en la rata, mientras que la de la ID de SECUENCIA N.° 154 no acetilada era de aproximadamente 6 horas (Figura 5b). Las concentraciones peptídicas plasmáticas también pueden medirse utilizando el ensayo ELISA, según lo descrito en el Ejemplo 11. Utilizando esta metodología, se caracterizó aún más la farmacocinética de la ID de SECUENCIA N.° 112 (Figura 5c). En el perro, la ID de SECUENCIA N.° 112 sigue estando presente a una concentración detecfable durante una semana. Ejemplo 13. Efecto de los péptidos PEGilados en la tolerancia a la glucosa intraperitoneal en ratas Se examinó en raías la acíividad in vivo de los pépíidos PEGilados de esía invención, adminisfrados por vía subcufánea. Raías que habvan ayunado durante la noche recibieron una inyección subcutánea de conírol o p/píido PEGilado (1-100 µg/kg). Tres horas más farde, se midió el nivel de glucosa en sangre basal, y las raías recibieron 2 g/kg de glucosa por vía intraperitoneal. El nivel de glucosa en sangre se midió nuevamente al cabo de 15, 30 y 60 minutos. Un péptido PEGilado de esta invención redujo significativamente los niveles de glucosa en sangre en relación con el vehículo después de la prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (Intraperitoneal Glucose Tolerance Tesí, IPGTT), con una reducción del 17%-28% en el área bajo la curva (área under fhe curve, AUC) de glucosa (Figuras 6a-6d). Esío demuesfra que el pépíido PEGilado fiene una prolongada acíividad de disminución de la glucosa in vivo. Además de la acfividad de disminución de la glucosa de los péptidos PEGilados de la presente invención, también indica que el péptido tiene una vida media in vivo prolongada. El PACAP- 27 íiene una vida media muy corta in vivo (< 10 minutos). La capacidad de los péptidos PEGilados de la invención para disminuir el nivel de glucosa en sangre al cabo de 24. (Figura 6b), 41 (Figura 6c), 65 (Figura 6c) y 72 (Figura 6d) horas después de la administración del péptido es una clara indicación de que el péptido está presente en la circulación en este punto en el tiempo y en consecuencia, tiene una vida media prolongada en relación con el PACAP-27 (Figura 6c). Asimismo, los péptidos de la ID de SECUENCIA N.° 112 demuestran mayor potencia y eficacia en puntos en el liempo más prolongados, en comparación con los pépíidos de la ID de SECUENCIA N.° 154 y 155 (Figuras 6b y 6d). La demosíración de la acíividad de los polipéplidos de la presente invención puede lograrse a través de ensayos in vitro, ex vivo e in vivo que son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, pueden usarse los siguientes ensayos para demostrar la eficacia de un agente farmacéutico para el traíamienío de la diabeíes y de trastornos relacionados, como el síndrome X, la intolerancia a la glucosa, la alteración de la glucosa en ayunas y la hiperinsulinemia; la enfermedad ateroescleróíica y írasíornos relacionados, como la hipertrigliceridemia y la hipercolesferolemia; y la obesidad. Método para medir los niveles de glucosa en sangre Se les exírae sangre (de una vena del ojo o la cola) a raíones db/db (obtenidos de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), y los ratones son agrupados de acuerdo con los niveles de glucosa en sangre medios equivalentes. Se les administra una dosis oral (mediante gavage en un vehículo farmacéuticamenfe aceptable) del polipéptido de prueba una vez por día durante 14 días. En ese momento, se les vuelve a extraer sangre a los animales, de una vena del ojo o la cola, y se determinan los niveles de glucosa en sangre. En cada caso, los niveles de glucosa se miden con un glucómeíro Élite XL (Bayer Corporaíion, Elkhart, IN).

Método para medir un efecto en los parámetros cardiovasculares También se evalúan los parámetros cardiovasculares (p. ej., frecuencia cardíaca y presión arterial. Se administra a ratas SHR una dosis oral del vehículo o del polipéptidp de prueba una vez por día duraníe 2 semanas. La presión arterial y frecuencia cardíaca se determinan utilizando un método que implica colocar un manguito en la cola, según se describe en Grinsell, et al., (Am. J. Hypertens. 13:370-375, 2000). En los monos, se moniíorean la presión arterial y la frecuencia cardíaca, según se describe en Shen, ef al., (J. Pharmacol. Exp. Therap. 278:1435-1443, 1996). Método para medir los niveles de triglicéridos Se les extrae sangre (de una vena del ojo o la cola) a ratones hApoAl (obtenidos de Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), y los ratones son agrupados de acuerdo con los niveles de triglicéridos en suero medios equivalentes. Se les administra una dosis oral (mediante gavage en un vehículo farmacéuficamente aceptable) del polipéptido de prueba una vez por día durante 8 días. Se les vuelve a extraer sangre a los animales, de la vena del ojo o la cola, y se determinan los niveles de triglicéridos en suero. En cada caso, los niveles de triglicéridos se miden ufilizando un Auíoanalizador Technicon Axon (Bayer Corporation, Tarrytown, NY). Método para medir los niveles de colesterol HDL Para determinar los niveles plasmáticos de colesterol HDL, se les extrae sangre a ratones hApoAl y se los agrupa de acuerdo con los niveles plasmáticos de colesterol HDL medios equivalentes. Se administra a los ratones una dosis oral del vehículo o del polipéptido de prueba una vez por día durante 7 días, y luego se les vuelve a extraer sangre el día 8. Se analiza el plasma para determinar el colesterol HDL utilizando el Sistema Clínico Synchron (CX4) (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Método para medir los niveles de colesterol total, colesterol HDL, triglicéridos y glucosa En otro ensayo in vivo, se les extrae sangre a monos obesos, luego se les administra una dosis oral del vehículo o del polipéptido de prueba una vez por día durante 4 semanas, y luego se les vuelve a extraer sangre. El suero se analiza para determinar los niveles de colesterol toíal, colesferol HDL, triglicéridos y glucosa, utilizando el Sistema Clínico Synchron (CX4) (Beckman Coulter, Fullerton, CA). El análisis de subclases de lipoprofeínas se realiza mediante la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (nuclear magnetic resonance, NMR) según se describe en Oliver, et al., (Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 98:5306-5311 , 2001). Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior se incluyen en la presente por referencia. Diversas modificaciones y variaciones de las composiciones y los métodos de la invención descritos resultarán evidentes para los especialistas en la maíeria, sin apartarse del alcance y el espíriíu de la invención. Si bien la invención ha sido descriía en relación con aplicaciones preferidas específicas, debe eníenderse que la invención íal como se la reivindica no debe limifarse indebidamente a dichas aplicaciones específicas. En efecto, se pretende que diversas modificaciones de los modos antes descritos para llevar a cabo la invención, que son obvias para los especialistas en el campo de la bioquímica y otros campos relacionados, se incluyan dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Los especialistas en la materia reconocerán o podrán determinar, con solo realizar experimentos de rutina, muchos equivalentes a las aplicaciones particulares de la invención descriía en la preseníe.

Claims (53)

1. Reivindicamos: 1. Un polipépfido seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1 a 148, y los fragmentos, derivados y varianíes de este funcionalmenfe equivalentes.
2. 2. El polipépíido de la reivindicación 1 , donde dicho polipépíido es seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1 , 2, 3, 4, 5, 112, 113, 114, 115 y 116.
3. 3. Un anficuerpo que se une específicamente al polipépíido de la reivindicación 1.
4. 4. El aníicuerpo de la reivindicación 3, donde dicho anficuerpo es un aníicuerpo policlonal.
5. 5. El anticuerpo de la reivindicación 3, donde dicho anticuerpo es un anficuerpo monoclonal.
6. 6. Un aníicuerpo que se une específicamente al polietilenglicol.
7. 7. El anticuerpo de la reivindicación 6, donde dicho anficuerpo es un aníicuerpo policlonal.
8. 8. El aníicuerpo de la reivindicación 6, donde dicho aníicuerpo es un aníicuerpo monoclonal.
9. 9. Un méíodo para detector un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1 a 148 en una muestra que implica: a. poner la muestra en contacto con un anticuerpo de la reivindicación 3 o la reivindicación 6, b. detecfar dicho aníicuerpo, y o ésíablecer una correlación eníre la detección del anficuerpo y la cantidad de polipéptido presente en la muestra.
10. 10. Un método para detecíar un polipépíido seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1 a 148 en una muesfra que implica: a. poner la muesíra en contacto con un primer anticuerpo de la reivindicación 3 o la reivindicación 6, b. poner la muestra en contacto con un segundo anticuerpo marcado, donde el segundo anticuerpo se une al primer anticuerpo, o detecíar el marcador, y d. esíablecer una correlación enfre la deíección del marcador y la cantidad de polipéptido presente en la muestra.
11. 11. Un kit para detectar un polipéptido seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1 a 148 en una muestra que implica: un primer anficuerpo de la reivindicación 3 o la reivindicación 6, y un segundo anficuerpo, donde el segundo anficuerpo se une al primer anficuerpo.
12. 12. Una composición farmacéufica que comprende una canfidad terapéuticameníe efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 o fragmentos, derivados y variantes de este funcionalmente equivalentes, en combinación con un vehículo farmacéuticameníe acepíable.
13. 13. La composición farmacéuíica de la reivindicación 12, donde dicho polipépfido es seleccionado del grupo que comprende las ID de SECUENCIA N.° 1, 2, 3, 4, 5, 112, 113, 114, 115 y 116.
14. 14. Una composición farmacéuíica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1, o fragmentos, derivados y variantes de este funcionalmente equivalentes, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y uno o más agentes farmacéuticos.
15. 15. La composición farmacéuíica de la reivindicación 14, donde dicho agente farmacéutico es seleccionado del grupo que comprende los ligandos del PPAR, los secretagogos de insulina, las sulfonilureas, los inhibidores de la a- glucosidasa, los sensibilizantes a la insulina, los compuestos que disminuyen la producción de glucosa hepática, la insulina y los derivados de la insulina, las biguanidas, los inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa-1B, la dipeptidil pepíidasa IV y la 11 befa-HSD, los fármacos contra la obesidad, los inhibidores de la HMG-CoA reductasa, el ácido nicotínico, los fármacos que disminuyen los lípidos, los inhibidores de la ACAT, los secuestradores de ácidos biliares, los inhibidores de la recaptación de ácidos biliares, los inhibidores del transporte de triglicéridos microsomales, los derivados del ácido fíbrico, los ß-bloqueadores, los inhibidores de la ACE, los bloqueadores de los canales de calcio, los diuréticos, los inhibidores de la renina, los antagonisías del recepfor de la AT-1 , los aníagonisías del receptor de la ET, los inhibidores de la endopeptidasa neutra, los inhibidores de la vasopeptidasa y los nifraíos.
16. 16. Una composición que comprende una caníidad efecfiva de un polipépíido de la reivindicación 1 , o fragmentos, derivados y variantes de este funcionalmeníe equivaleníes, en combinación con un vehículo inerte.
17. 17. Un méíodo para íraíar la diabetes, que comprende el paso de adminisírar a un sujeío que lo necesite una caníidad íerapéuíicameníe efecíiva de un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12.
18. 18. El método de la reivindicación 17, donde dicha diabetes es seleccionada del grupo que comprende la diabetes tipo 2, la diabetes hereditaria juvenil tipo 2, ia diabetes autoinmune latente del adulto y la diabetes gestacional.
19. 19. Un método para tratar el síndrome X, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12.
20. 20. Un método para traíar los trastornos relacionados con la diabetes, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efecíiva de un polipépíido de la reivindicación 1 o una composición farmacéuíica de la reivindicación 12.
21. 21. El método de la reivindicación 20, donde dicho írastorno relacionado con la diabeíes es seleccionado del grupo que comprende la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la intolerancia a la glucosa, la alíeración de la glucosa en ayunas, la dislipidemia, la hipertrigliceridemia y la resistencia a la insulina.
22. 22. Un método para traíar la diabeíes, que comprende el paso de adminisírar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 , en combinación con uno o más agentes farmacéuticos.
23. 23. El método de la reivindicación 20, donde dicho agente farmacéutico es seleccionado del grupo que comprende los agonistas del PPAR, las sulfonilureas, los secretagogos no sulfonilureas, los inhibidores de la a- glucosidasa, los sensibilizantes a la insulina, los secretagogos de insulina, los compuestos que disminuyen la producción de glucosa hepática, la insulina y los agenfes confra la obesidad.
24. 24. El método de la reivindicación 23, donde dicha diabetes es seleccionada del grupo que comprende la diabetes tipo 2, la diabetes de la madurez de inicio en el joven, la diabetes autoinmune latente del adulto y la diabetes gestacional.
25. 25. Un método para traíar el síndrome X, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 , en combinación con uno o más agentes farmacéuficos.
26. 26. El méíodo de la reivindicación 25, donde dicho agenfe farmacéuíico es seleccionado del grupo que comprende los agonisías del PPAR, las sulfonilureas, los secretagogos no sulfonilureas, los inhibidores de la a- glucosidasa, los sensibilizantes a la insulina, los secretagogos de insulina, los compuestos que disminuyen la producción de glucosa hepática, la insulina y los ageníes confra la obesidad.
27. 27. Un méfodo para íratar los trastornos relacionados con ia diabetes, que comprende el paso de administrar a un sujeío que lo necesite una canfidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1, en combinación con uno o más agentes farmacéuticos.
28. 28. El método de la reivindicación 27, donde dicho trasíorno relacionado con la diabeíes es seleccionado del grupo que comprende la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la intolerancia a la glucosa, la alteración de la glucosa en ayunas, la dislipidemia, la hipertrigliceridemia y la resistencia a la insulina.
29. 29. El método de la reivindicación 28, donde dicho agente farmacéutico es seleccionado del grupo que comprende los agonistas del PPAR, las sulfonilureas, los secretagogos no sulfonilureas, los inhibidores de la a- glucosidasa, los sensibilizantes a la insulina, los secretagogos de insulina, los compuestos que disminuyen la producción de glucosa hepática, la insulina y los agentes contra la obesidad.
30. 30. Un método para traíar la diabeíes, el Síndrome X o los írasíomos relacionados con la diabeíes, que comprende el paso de adminisírar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticameníe efecíiva de un polipépfido de la reivindicación 1 , en combinación con uno o más ageníes seleccionados del grupo que comprende los inhibidores de la HMG-CoA reducíasa, el ácido nicoíínico, los fármacos que disminuyen los lípidos, los inhibidores de la ACAT, los secuesíradores de ácidos biliares, los inhibidores de la recaplación de ácidos biliares, los inhibidores del íransporte de íriglicéridos microsomales, los derivados del ácido fíbrico, los ß-bloqueadores, los inhibidores de la ACE, los bloqueadores de los canales de calcio, los diuréticos, los inhibidores de la renina, los antagonisfas del recepíor de la AT- 1 , los aníagonistas del receptor de la ET, los inhibidores de la endopeptidasa neutra, los inhibidores de la vasopeptidasa y los nitratos.
31. 31. El método de la reivindicación 30, donde dicho trastorno relacionado con la diabetes es seleccionado del grupo que comprende la hiperglucemia, la hiperinsulinemia, la intolerancia a la glucosa, la alteración de la glucosa en ayunas, la dislipidemia, la hipertrigliceridemia y la resisíencia a la insulina.
32. 32. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 31 , donde el polipéptido de la reivindicación 1 y uno o más agentes farmacéuticos se administran como una forma galénica única.
33. 33. Un método para traíar la diabeíes o prevenir las causas secundarias de dicha enfermedad, que comprende el paso de adminisfrar a un sujeío que lo necesite una caníidad íerapéuíicamente efecfiva de un polipépíido de la reivindicación 1 o una composición farmacéuíica de la reivindicación 12.
34. 34. El método de la reivindicación 33, donde dicha causa secundaria es seleccionada del grupo que comprende el exceso de glucocorticoides, el exceso de la hormona de crecimiento, el feocromocitoma y la diabetes farmacógena.
35. 35. Un método para tratar la diabetes o prevenir las causas secundarias de dicha enfermedad, que comprende el paso de administrar a un sujeto, que lo necesite una cantidad terapéuíicamente efecfiva de un polipépíido de la reivindicación 1 , en combinación con uno o más agenfes farmacéuticos.
36. 36. El método de la reivindicación 35, donde dicho ageníe farmacéuíico es seleccionado del grupo que comprende los agonisfas del PPAR, las sulfonilureas, los secreíagogos no sulfonilureas, los inhibidores de la a- glucosidasa, los sensibilizantes a la insulina, los secreíagogos de insulina, los compuestos que disminuyen la produccisn de glucosa hepática, la insulina y los agentes contra la obesidad.
37. 37. Un método para traíar la enfermedad respiratoria, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un poiipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéuíica de la reivindicación 12.
38. 38. Un método para íraíar la obesidad, que comprende el paso de adminisírar a un sujeto que lo necesite una canfidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12.
39. 39. Un método para traíar la enfermedad cardiovascular, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéuíica dé la reivindicación 12.
40. 40. El méíodo de la reivindicación 39, donde dicha enfermedad cardiovascular es seleccionada del grupo que comprende la aíeroesclerosis, la enfermedad cardíaca coronaria, la enfermedad de las arterias coronarias y la hipertensión.
41. 41 . Un método para íratar los trastornos del metabolismo de los lípidos y carbohidratos, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuficameníe efecfiva de un polipépíido de la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12.
42. 42. Un método para traíar los trastornos del sueño, que comprende el paso de adminisírar a un sujeto que lo necesite una canfidad íerapéuficameníe efecíiva de un polipépíido de la reivindicación 1 o una composición farmacéufica de la reivindicación 12.
43. 43. Un método para tratar los trastornos reproducíivos masculinos, que comprende el paso de adminisírar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipépíido de la reivindicación 1 o una composición farmacéuíica de la reivindicación 12.
44. 44. Un méíodo para íraíar los írasíornos del crecimienío o de la homeosíasis energéfica, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuíicamente efecliva de un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12.
45. 45. Un método para traíar las enfermedades inmuniíarías, que comprende el paso de adminisírar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuíicamente efecíiva de un polipépíido de la reivindicación 1 o una composición farmacéufica de la reivindicación 12.
46. 46. Un méíodo para tratar las enfermedades autoinmunes, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una canfidad terapéuíicameníe efecíiva de un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12.
47. 47. Un método para traíar las enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, que comprende el paso de administrar a un sujeto que lo necesite una canfidad íerapéuficamente efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéufica de la reivindicación 12.
48. 48. Un méfodo para íraíar el choque sepficémico, que comprende el paso de adminisírar a un sujeío que lo necesite una caníidad lerapéuíicameníe efectiva de un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéufica de la reivindicación 12.
49. 49. Un método para estimular la liberación de insulina en una forma dependiente de la glucosa en un sujeto que lo necesite, al administrarle a dicho sujeto un polipéptido de la reivindicación 1 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12.
50. 50. Los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1 para ei traíamiento y/o la profilaxis de la diabetes y los trastornos relacionados con la diabetes.
51. 51. Un medicamento que contiene al menos un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 , en combinación con al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable y farmacéuticamente seguro.
52. 52. El uso de los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1 para fabricar un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de la diabetes y los trastornos relacionados con la diabetes.
53. 53. Un medicamento de acuerdo con la reivindicación 51 para el traíamienío y/o la profilaxis de la diabeíes. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona péptidos nuevos que funcionan in vivo como agonistas del receptor VPAC2. Se ha demostrado que estos polipéptidos secretagogos de insulina disminuyen el nivel de glucosa en sangre in vivo al realizar una prueba de tolerancia a la glucosa. Los polipéptidos de esta invención también son estables en la formulación y tienen vidas medias prolongadas. Los péptidos de la presente invención proporcionan una terapia para los pacieníes con una reducción de la secreción de insulina endógena, por ejemplo, diabeíes fipo 2. La invención también está orientada a un método para tratar una enfermedad metabólica en un mamífero que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuíicameníe efecfiva de los péptidos. 1/17 FIG. 1a