MXPA06005875A - Un agente preventivo para la vasculitis - Google Patents

Abstract

Proveer un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis tal como la poliarteritis nudosa, el síndrome de aortitis y una vasculitis asociada con anormalidades inmunológicas, comprendiendo dicho agente un antagonista de interleuquina 6 (IL-6) como componente activo.

Description

UN AGENTE PREVENTIVO PARA LA VASCUL1T1S Campo Técnico La presente invención se refiere a un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis. Antecedentes de la Técnica La vasculitis es una de las condiciones patológicas intratables comúnmente observadas en enfermedades autoinmunes, y muchos casos de la misma son refractarios a los métodos terapéuticos empleados convencionalmente, tal como esferoides e inmunosupresores y, por lo tanto, se han buscado nuevos métodos terapéuticos. En el síndrome de vasculitis, la inflamación se produce en arterias de diferentes tamaños, y se puede desarrollar fiebre, dolor en músculos y articulaciones, obstrucción vascular, úlcera de la piel y mononeuritis múltiple. La vasculitis incluye síndromes de vasculitis intratable tales como la poliarteritis nudosa y el síndrome de aortitis. Las lesiones de la poliarteritis nudosa se caracterizan por inflamaciones necróticas de la media y la adventicia, y la aortitis en general desarrolla inflamaciones de la íntima, la media y la adventicia. La aortitis también se denomina arteritis de Takayasu. Se sugirió que la patología de la vasculitis está asociada con IL-6. Por ejemplo, Noris et al. han informado que los niveles sanguíneos de IL-6 se incrementan en pacientes con arteritis de Takayasu en la etapa activa de la patología en comparación con las personas saludables normales (Circulación 1999, Julio 6;100(1);55-60). Sin embargo, este artículo también informa que la concentración sérica de RANTES, una de las quimiocinas, también aumenta. Noris et. al sugieren la posibilidad de que estas citoquinas sean responsables de las lesiones vasculares en pacientes que padecen arteritis de Takayasu. Descripción de la Invención Sin embargo, el artículo no menciona en ningún momento la posibilidad de que la arteritis de Takayasu se pueda tratar inhibiendo IL-6. Por lo tanto, la presente invención provee agentes preventivos y/o terapéuticos para la vasculitis que comprenden un antagonista de IL-6 como componente activo. Después de una investigación intensiva y extensiva, los inventores de la presente demostraron que IL-6 es indispensable en la patología para la vasculitis y que un antagonista de IL-6 posee un efecto terapéutico para la vasculitis. Más sorpresivamente, en el estudio realizado por los presentes inventores, cuando se inhibió la unión de IL-6 a su receptor por medio de un anticuerpo del receptor de IL-6, IL-6 per se redujo en sangre. Por consiguiente, se demostró que la terapia de inhibición de IL-6 no sólo posee un efecto anti-inflamatorio sobre la vasculitis per se, sino que también trata la vasculitis per se actuando sobre el núcleo de la vasculitis. Por lo tanto, la presente invención provee un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis, comprendiendo dicho agente un antagonista de interleuquina 6 (IL-6) como un componente activo. La presente invención provee un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis que es resistente a los esferoides y /o inmunosupresores, dicho agente comprende un antagonista de interleuquina 6 (IL-6) como componente activo. Dicha vasculitis por ejemplo poliarteritis nudosa, el síndrome de aortitis, o una vasculitis que se asocia con anormalidades inmunológicas. El síndrome de aortitis también se denomina arteritis Takayasu. Como vasculitis asociadas con anormalidades inmunológicas, por ejemplo, se puede mencionar la vasculitis asociada con la reumatoidea y vasculitis asociada con lupus eritematoso sistémico (LES). Dicho antagonista de IL-6 es, por ejemplo, un anticuerpo contra IL-6 o un anticuerpo contra el receptor de IL-6, con preferencia un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6. Dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 con mayor preferencia es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 humano, por ejemplo, anticuerpo de PM-1 , o un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL- 6 de ratón, por ejemplo, anticuerpo de MR16-1. Dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es preferentemente un anticuerpo recombinante. Dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 puede ser un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o anticuerpo humano. Según se emplea en la presente, el anticuerpo de mayor preferencia es un anticuerpo de PM-1 humanizado. La presente invención, también puede comprender los siguientes aspectos: (1 ) El uso del antagonista de interleuquina 6 (IL-6) para la fabricación de un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis. (2) El uso del antagonista de interleuquina 6 (IL-6) para la fabricación de un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis que posee resistencia a los esferoides y/o inmunosupresores. (3) El uso de acuerdo con los anteriores (1) o (2) en los cuales dicha vasculitis es poliarteritis nudosa. (4) El uso de acuerdo con los anteriores (1 ) o (2) en los cuales dicha vasculitis es el síndrome de aortitis. (5) El uso de acuerdo con los anteriores (1 ) o (2) en los cuales dicha vasculitis es vasculitis asociada con anormalidades ¡nmunológicas. (6) El uso de acuerdo con cualquiera de los anteriores (1) a (5) en los cuales dicho antagonista de IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6. (7) El uso de acuerdo con el anterior (6) en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6. (8) El uso de acuerdo con el anterior (6) en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor humano de IL-6. (9) El uso de acuerdo con el anterior (6) en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón . (10) El uso de acuerdo con cualquiera de los anteriores (6) a (9) en los cuales dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo recombinante. (11 ) El uso de acuerdo con ei anterior (8) en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor humano de IL-6 es anticuerpo de PM-1. (12) El uso de acuerdo con el anterior (9) en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón es un anticuerpo de MR16-1. (13) El uso de acuerdo con cualquiera de los anteriores (6) a (12) en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. (14) El uso de acuerdo con el anterior (13) en el cual dicho anticuerpo humanizado contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo humanizado de PM-1. (15) Un método para prevenir y/o tratar la vasculitis que comprende administrar un antagonista de interleuquina 6 (IL-6). (16) Un método para prevenir y/o tratar la vasculitis que posee resistencia a esferoides y/o inmunosupresores que comprenden administrar un antagonista de interleuquina 6 (IL-6). (17) El método de acuerdo con el anterior (15) o (16) en los cuales dicha vasculitis es poliarteritis nudosa. (18) El método de acuerdo con los anteriores (15) o (16) en los cuales dicha vasculitis es el síndrome de aortitis. (19) El método de acuerdo con los anteriores (15) o (16) en los cuales dicha vasculitis es la vasculitis asociada con anormalidades inmunológicas. (20) El método de acuerdo con cualquiera de los anteriores (15) a (19) en los cuales dicho antagonista de IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6. (21) El método de acuerdo con el anterior (20) en ei cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6. (22) El método de acuerdo con el anterior (20) en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 humano. (23) El método de acuerdo con el anterior (20) en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón. (24) El método de acuerdo con cualquiera de los anteriores (20) a (23) en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo recombinante. (25) El método de acuerdo con el anterior (22) en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor humano de IL-6 es anticuerpo de PM-1. (26) El método de acuerdo con el anterior (23) en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón es anticuerpo de MR1. (27) El método de acuerdo con cualquiera de los anteriores (20) a (26) en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano anticuerpo contra el receptor de IL-6. (28) El método de acuerdo con el anterior (27) en el cual dicho anticuerpo humanizado contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo humanizado de PM-1. Breve Explicación de los Dibujos La Fig. 1 es una fotografía que muestra el resultado del CT en el tratamiento del síndrome de la vasculitis con anticuerpo humanizado de 1L-6R, en el cual la flecha superior indica la aorta ascendente y la flecha inferior indica la aorta descendente. La Fig. 2 es una fotografía que muestra el resultado del CT en el tratamiento del síndrome de la vasculitis con anticuerpo humanizado de IL-6R, en el cual la flecha indica el arco aórtico. La Fig. 3 es una fotografía que muestra el resultado del CT en el tratamiento del síndrome de la vasculitis con anticuerpo humanizado de IL-6R, en la cual la flecha superior indica la aorta ascendente y la flecha inferior indica la aorta descendente. La Fig. 4 es una fotografía que muestra el resultado del CT en el tratamiento del síndrome de la vasculitis con anticuerpo humanizado de IL-6R, en ia cual la flecha superior indica la aorta ascendente y la flecha inferior indica la aorta descendente. La Fig. 5 es una fotografía que muestra el resultado del CT en el tratamiento del síndrome de la vasculitis con anticuerpo humanizado de IL-6R, en la cual la flecha indica el arco aórtico. La Fig. 6 es una fotografía que muestra el resultado del CT en el tratamiento del síndrome de la vasculitis con anticuerpo humanizado de IL-6R, en el cual la flecha superior indica la aorta ascendente y la flecha inferior indica la aorta descendente. Mejor modo de llevar a cabo la invención !L-6 es una citoquina que también se denomina factor 2 de estimulación de la célula B (BSF2) o interleuquina R2. IL-6 fue descubierto como un factor de diferenciación involucrado en la activación de las células B linfáticas (Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76). A continuación, se descubrió que una citoquina multifuncional influencia varias funciones de las células (Akira, S. et al., Adv. ¡n Immunology (1993) 54, 1-78). Se informó que IL-6 induce la maduración de las células T linfáticas (Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1259).

IL-6 transmite su actividad biológica a través de dos tipo de proteínas en la célula. Una de ellas es el receptor de IL-6, una proteína de unión al ligando con un peso molecular de alrededor de 80 kD, a la cual se une IL-6 (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981 ; Yamasaki, K. et al., Science (1987) 241 , 825- 828). El receptor de IL-6 se presenta no sólo en la forma unida a la membrana que penetra y se expresa en la membrana de la célula sino que también como un receptor de IL-6 soluble que consiste principalmente en la región extracelular. El otro es una proteína gp130 unida a la membrana que posee un peso molecular de alrededor de 130KD que se involucra en la transducción de señal de unión de no ligandos. IL-6 y el receptor de IL-6 forman el complejo IL-6/ receptor de IL-6, que después de unirse a gp130 transmite su actividad biológica a la célula. (Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581). Un antagonista de IL-6 es una sustancia que inhibe la transducción de la actividad biológica de IL-6. Como el antagonista de IL-6, se conocieron hasta el momento anticuerpo dirigido contra IL-6 (anticuerpo anti-lL-6), anticuerpo dirigido contra el receptor de IL-6 (anticuerpo anti-receptor de IL-6), y anticuerpo dirigido contra gp130 (anticuerpo anti-gp130), IL-6 alterado, péptidos parciales de IL-6 o receptor de IL-6 y similares. El anticuerpo anti-receptor de IL-6 se ha descripto en varios informes (Novick D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146, Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630, Publicación de Patente Internacional WO 95-09873, Solicitud de Patente Francesa FR 2694767, Patente Estadounidense US 521628). Se supo que un anticuerpo humanizado de PM-1 se obtuvo mediante el transplante de la región que determina la complementaridad (CDR) de uno de ellos, un anticuerpo PM-1 de ratón (Hirata, Y. at al., J. Immunology (1989) 143, 2900-2506), a un anticuerpo humano (la solicitud de Patente Internacional WO 92-19759). El antagonista de IL-6 anterior con preferencia es un anticuerpo contra el receptor de IL-6, preferentemente un anticuerpo monoclonal contra el receptor humano de IL-6 o un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón. Como el anticuerpo monoclonal anterior contra el receptor humano de IL-6, se puede ¡lustrar anticuerpo de PM-1 , y como el anticuerpo monoclonal anterior contra el receptor de lL-6 de ratón, se puede ¡lustrar el anticuerpo de MR16-1. El anticuerpo anterior es con preferencia un anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano, por ejemplo un anticuerpo humanizado de PM-1. El antagonista de IL-6 para usar en la presente invención puede ser de cualquier origen, cualquier tipo y cualquier forma, siempre que sean útiles como un componente activo para un efecto preventivo o terapéutico para la vasculitis. El antagonista de IL-6 bloquea la transducción de señal mediante IL-6 e inhibe la actividad biológica de IL-6. Los antagonistas de IL-6 son preferentemente sustancias que poseen una actividad de inhibición de cualquier de IL-6, receptor de IL-6 y gp130. Como antagonistas de IL-6, se puede mencionar por ejemplo el anticuerpo anti-IL-6, anticuerpo del anti-receptor de IL-6, anticuerpo de anti-gp130, IL-6 alterado, receptor soluble alterado de IL-6, un péptido parcial de IL-6 o receptor de IL-6, y las sustancias de bajo peso molecular que poseen la misma actividad que estos. Los anticuerpos anti-IL-6 para usar en la presente invención se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales empleando un método conocido. Como los anticuerpos anti-IL-6 en la presente invención, se prefieren los anticuerpos monoclonales de, en particular, origen mamífero. Los anticuerpos monoclonales de origen mamífero incluyen aquellos que se producen mediante una hibridoma y anticuerpo recombinante producido por un huésped que se transformó con un vector de expresión que contiene genes del anticuerpo modificados mediante ingeniería genética. Estos anticuerpos, mediante la unión con IL-6, bloquean la unión de IL-6 con el receptor de IL-6 y por lo tanto bloquea la transducción de señal de la actividad biológica de IL-6 en la célula. Ejemplos de dichos anticuerpos incluyen MH166 (Matsuda et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951 -956) y anticuerpo SK2 (Sato, K. et al., The 21 st Nihon Menekigakkai Soukai (Asamblea General de la Sociedad Japonesa de Inmunología), Academic Record (1991) 21 , 166) y similares. Un anticuerpo anti-IL-6 que produce hibridoma se puede construir básicamente empleando un procedimiento conocido, según se describe a continuación. Por lo tanto, IL-6 se puede usar como un antígeno sensibilizante y se inmuniza en el método convencional de inmunización. Las células inmunes que se obtuvieron de esa manera se fusionan con células progenitores conocidas en el proceso de fusión celular convencional y las células que producen anticuerpos monoclopales se exploran mediante el método de exploración convencional para preparar el hibridoma deseado. Específicamente, el anticuerpo anti-IL-6 se puede obtener de la siguiente manera. Por ejemplo, un UL-6 humano para usar como el antígeno sensibilizante para obtener el anticuerpo se puede obtener usando la secuencia del gen/aminoácidos de IL-6 divulgada en Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541 , o Argic. Biol. (1990) 54, 2685-2688. Después de que se transforma una célula huésped adecuada mediante la inserción de ¡a secuencia génica de IL-6 en un sistema conocido del vector de expresión, la proteína de IL-6 de interés se purifica a partir de la célula huésped o el sobrenadante del cultivo del mismo, y la proteína de IL-6 purificada se puede usar como el antígeno sensibilizante. De manera alternativa, se puede usar una proteína de fusión de la proteína de IL-6 y otra proteína como el antígeno sensibilizante. Los anticuerpos del anti-receptor de IL-6 para el uso en la presente invención se puede obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando un método conocido. Como los anticuerpos anti-IL-6 para usar en la presente invención, se prefieren los anticuerpos monoclonales de, en especial, origen mamífero. Los anticuerpos monoclonales de un origen mamífero incluyen aquellos producidos por un hibridoma y aquellos producidos por un huésped que se ha transformado con un vector de expresión que contiene genes del anticuerpo modificados mediante ingeniería genética. Los anticuerpos, por medio de la unión con el receptor de IL-6, inhiben la unión de IL-6 al receptor de IL-6, y de esa manera bloquean la transducción de la actividad biológica de IL-6 en la célula. Ejemplos de dichos anticuerpos incluyen anticuerpo de MR16-1 (Tamura, T., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), anticuerpo de PM-1 (Hirata, et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906), o anticuerpo de AUK12-20, anticuerpo de AUK64-7 o anticuerpo de AUK146-15 (Publicación de Patente Internacional WO 92-19759), y similares. Entre ellos, es de mayor preferencia el anticuerpo de PM-1. De manera incidental, la línea celular del hibridoma que produce el anticuerpo de PM-1 se ha depositado intemacionalmente según las disposiciones del Tratado de Budapest como PM-1 el 12 de julio de 1995 con el Patent Microorganism Depository of the National Institute of Industrial Science and Technology (Depósito de Patentes de Microorganismos del Instituto Nacional de Ciencias y Tecnología Industrial), de Chuo 6, 1 -1 , Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, como FERM BP-2998. La línea celular del hibridoma que produce el anticuerpo de MR16-1 se ha depositado intemacionalmente según las disposiciones del Tratado de Budapest como MR16-1 el 13 de marzo de 1997, con el Patent Microorganism Depository of the National institute of Industrial Science and Technology, de Chuo 6, 1-1 , Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, como FERM BP-5875. Los hibridomas que producen el anticuerpo monoclonal del anti-receptor de IL-6 se puede preparar básicamente mediante el uso de un procedimiento conocido según se describe a continuación. Por lo tanto, el receptor de IL-6 se usa como un antígeno sensibilizante y se inmuniza de acuerdo con el método convencional de inmunización. Las células inmunes que se obtuvieron de esa manera se fusionaron con células progenitoras conocidas en el proceso convencional de fusión celular y luego las células que producen anticuerpos monoclonales se pueden explorar mediante el método convencional de exploración para preparar el hibridoma deseado. De manera específica, el anticuerpo del anti-receptor de IL-6 se puede preparar de la siguiente manera. Por ejemplo, el receptor humano de IL-6 que se usa como el antígeno sensibilizante para obtener el anticuerpo se puede obtener mediante el uso de la secuencia del den del receptor de IL-6 /secuencia de aminoácidos divulgado en la Solicitud de Patente Europea EP 325474, y el receptor de IL-6 de ratón se puede obtener mediante el uso del gen del receptor de IL-6 divulgado en la Publicación de Patente Japonesa Sin Examinar (Kokai) 3- 155795. Existen dos tipos de proteínas del receptor de IL-6: receptor de IL-6 expresado en la membrana de la célula, y el receptor de IL-6 separado de la membrana de la célula (receptor soluble de IL-6) (Yasukawa et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). El anticuerpo del receptor soluble de IL-6 está compuesto esencialmente por la región extracelular del receptor de IL.6 unido a la membrana de la célula, y por lo tanto es diferente al receptor de IL-6 unido a la membrana en que el anterior no posee la región de la transmembrana o tanto la región de la transmembrana como la región intracelular. Como la proteína del receptor de IL-6, se puede usar cualquier receptor de IL-6, siempre que se puede usar como un antígeno sensibilizante para la producción del anticuerpo del receptor de IL-6 para usar en la presente invención.

Después de que la secuencia génica del receptor de IL-6 se inserta en un sistema de vectores de expresión conocido para transformar una célula huésped apropiada, la proteína deseada del receptor de IL-6 se puede purificar a partir de la célula huésped o un sobrenadante del cultivo de la misma usando un método conocido, y la proteína purificada del receptor de IL-6 purificado de esa manera se puede usar como el antígeno sensibilizante. De manera alternativa, las células que expresan al receptor de IL-6 o una proteína de fusión de la proteína del receptor de IL-6 y se puede usar otra proteína como antígeno sensibilizante. E. coii posee un plásmido plBIBSF2R que contiene ADNc codificador del receptor humano de IL-6 depositado intemacionalmente según las disposiciones del Tratado de Budapest como HB101-plBIBSF2R el 9 de enero de 1989 con el Patent Microorganism Depository of the National Institute of Industrial Science and Technology, de Chuo 6, 1-1 , Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japón, como FERM BP-2232. Los anticuerpos anti-gp130 para usar en la presente invención se pueden obtener como anticuerpos policlonales o monoclonales usando un método conocido. Al igual que los anticuerpos de anti-gp130 para usar en la presente invención, se prefieren en especial los anticuerpos monoclonales de origen mamífero. Los anticuerpos monoclonales de origen mamífero incluyen aquellos producidos por un hibridoma y aquellos producidos por un huésped que se transformó con un vector de expresión que contiene genes de anticuerpos modificados mediante ingeniería genética. Los anticuerpos, por medio de unirse a gp130, inhiben la unión del complejo IL-6/receptor de IL-6 a gp130, y de esa manera bloquean la transducción de la actividad biológica de IL-6 en la célula. Ejemplos de dichos anticuerpos incluyen anticuerpo AM64 (Publicación de Patente Japonesa sin Examinar (Kokai) 3-219894), anticuerpo 4B11 y anticuerpo 2H4 (US5571513), anticuerpo B-S12 y anticuerpo B-P8 (Publicación de Patente Japonesa Sin Examinar (Kokai) 8-291199). Básicamente, se puede crear un hibridoma que produce anticuerpos monoclonales anti-gp130 usando un procedimiento según se describe a continuación. Por lo tanto, gp130 se puede usar como un antígeno sensibilizante y se inmuniza en el método convencional de inmunización. Las células inmunes que se obtuvieron de esa manera se fusionan con células progenitoras conocidas y luego los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales se exploran mediante el método de exploración convencional para preparar el hibridoma deseado. Específicamente, el anticuerpo monoclonal se puede obtener de la siguiente manera. Por ejemplo, gp130 se usa como el antígeno sensibilizante para la generación de anticuerpos se puede obtener usando la secuencia del gen gp130/secuencia de aminoácidos revelado en la Solicitud de Patente Europea EP 411946. Después de que se transforma una célula huésped mediante la inserción de la secuencia del gen gp130 en un sistema de vector de expresión conocido, la proteína de gp130 de interés se purifica a partir de la célula huésped o a partir del sobrenadante del cultivo del mismo. La proteína del receptor de gp130 purificada se puede usar como el antígeno sensibilizante. De manera alternativa, una proteína de fusión de la proteína de gp130 y de otra proteína se puede usar como el antígeno sensibilizante. Aunque los mamíferos a inmunizar con el antígeno sensibilizante no so limitan específicamente, con preferencia se seleccionan considerando su compatibilidad con la célula progenitora para usar en la fusión de células. En general incluyen roedores tales como ratones, ratas, hámsters y similares. La inmunización de animales con un antígeno sensibilizante se lleva a cabo usando un método conocido. Un método general, por ejemplo, comprende una administración intraperitoneal o subcutánea de un antígeno sensibilizante al mamífero. Específicamente, se mezcla un antígeno sensibilizante que se diluyó y se suspendió en una cantidad adecuada de salina de fosfato de Ph regulado (PBS) o solución salina fisiológica, etc., según se desee, con una cantidad apropiada de un adyuvante común, por ejemplo adyuvante completo de Freund.

Después de la emulsión, preferentemente se administra a un mamífero en varias oportunidades cada 4 a 21 días. De manera alternativa, se puede emplear un vehículo adecuado en el momento de inmunización del antígeno sensibilizante. Después de la inmunización y la confirmación del incremento en los niveles deseados de anticuerpo in el suero, las células inmunes se retiran del mamífero y se someten a fusión celular. Las células inmunes preferidas que se someterán a fusión celular incluyen en especial, las células del bazo. Las células del mamífero del mieloma, al igual que las otras células progenitoras que se fusionan con las células inmunes mencionadas anteriormente, con preferencia, incluyen varias líneas de células conocidas, tales como P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al., J. Immunol. (1979) 123; 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81; 1-7), NS-1 (Kohier, G. and Milstein, C, Eur. J. Immunol. (1976) 6; 511 -519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8; 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276; 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) ; 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148; 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277; 131-133) y similares. La fusión celular entre las células inmunes anteriores y las células del mieloma se puede llevar a cabo esencialmente de acuerdo con un método conocido tal como se describe en Miistein et al. (Kohier, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73; 3-46) y similares. Más específicamente, la fusión de células anterior se lleva a cabo en un caldo nutriente en presencia de, por ejemplo, un acelerador de fusión celular. Al igual que el acelerador de fusión celular, se puede usar polietilenglicol (PEG), virus Sendai (HVJ) y similares y, además, un adyuvante tal como dimetil sulfóxido, etc., se puede agregar según se desee para mejorar la eficiencia de la fusión. La relación preferida de las células inmunes y las células del mieloma a usar es, por ejemplo, de 1 a 10 veces más células inmunes que las células del mieloma. Ejemplos del medio de cultivo a usar para la fusión celular anterior incluye medio RPMI1640 y medio de cultivo MEM adecuados para el crecimiento de las líneas celulares anteriores del mieloma y el medio de cultivo convencional empleado para este tipo de cultivo de células, y además se puede agregar un suplemento sérico tal como suero fetal bovino (FCS). En la fusión celular, se mezclan bien las cantidades predeterminadas de las células inmunes anteriores y las células del mieloma en el cultivo anterior, al cual se agrega solución de PEG calentada anteriormente a alrededor de 37°C, por ejemplo, se agrega una solución de PEG con un peso molecular de la media de alrededor de 1000 a 6000, a una concentración del 30 al 60% (p/v) y se mezcla para obtenerlas células de fusión deseadas (hibridoma). Luego, por medio de repetir el agregado en secuencias de un líquido de cultivo adecuado y de la centrifugación para remover el sobrenadante, se pueden remover los agentes de fusión de células etc. que no son deseables para el crecimiento del hibridoma. Dicho hibridoma se selecciona por medio del cultivo en el medio de selección convencional, por ejemplo, el medio de cultivo de HAT (un líquido de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en dicho medio de cultivo de HAT se continúa, en general, durante un período de tiempo suficiente para matar las células en lugar del hibridoma deseado (células de no fusión), en general, durante varios días a varias semanas. Se lleva a cabo el método limitativo de dilución en el cual los hibridomas que producen el anticuerpo deseado se exploran y se clonan monoclonalmente. Además de obtener el hibridoma anterior por medio de inmunizar un animal en lugar de un ser humano con un antígeno, también es posible sensibilizar linfocitos humanos in vitro con un antígeno deseado o células que expresan antígenos deseadas, y los linfocitos B sensibilizados resultantes se fusionan con células del mieloma humano, por ejemplo, U266, para obtener el anticuerpo humano deseado que posee la actividad de unirse al antígeno deseado o células que expresan el antígeno deseadas (ver Publicación de Patente Japonesa examinada posteriormente (Kokoku) No. 1-59878). Además, un animal transgénico que posee un repertorio de todos los genes de anticuerpos humanos puede ser inmunizado con el antígeno o las células que expresan antígenos para obtener el anticuerpo humano deseado en el método descripto anteriormente (ver Publicación de Patente Internacional WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 y WO 96/33735). El hibridoma monoclonal que produce anticuerpos que se construye de esa manera se puede subcultivar en el líquido convencional de cultivo, o se puede almacenar durante un período de tiempo prolongado en nitrógeno líquido. Para obtener anticuerpos monoclonales de dicho hibridoma, se puede usar un método en el cual dicho hibridoma se cultiva en el método convencional y los anticuerpos se obtienen como el sobrenadante, o un método en el cual se administra el hibridoma y se cultiva en un mamífero compatible con dicho hibridoma y los anticuerpos se obtienen como la ascitis. El método anterior es adecuado para obtener anticuerpos de alta pureza, mientras que el último es adecuado para una producción a gran escala de anticuerpos. Por ejemplo, un hibridoma que produce anticuerpos del anti-receptor de IL-6 se puede preparar usando el método que se divulga en la Publicación de Patente Japonesa Sin Examinar (Kokai) 3-139293. Se puede llevar a cabo mediante un método en el cual el anticuerpo del hibridoma que produce PM-1 que se depositó intemacionalmente según las disposiciones del Tratado de Budapest como FERM BP-2998 el 12 de julio de 1989 con el- Patent Microorganism Depository of the National Institute of Industrial Science and Technology, de Chuo 6, 1-1 , Higashi 1- chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japón, se inyecta intraperitonealmente a ratones BALB/c para obtener la ascitis de la cual se purifica el anticuerpo de PM- 1 , o un método en el cual dicho hibridoma se cultiva en un medio de cultivo adecuado tal como el medio RPMI1640 que contiene 10% de suero fetal bovino y 5% de MB-Condimed Hi (fabricado por Boehringer Mannheim), el medio de SFM del hibridoma (fabricado por GIBCO-BRL), el medio de PFHM-II (fabricado por GIBCO-BRL) y similares, y el anticuerpo de PM-1 se puede purificar del sobrenadante. En ia presente invención se puede usar un anticuerpo recombinante que se produjo mediante la tecnología génica recombinante en la cual se clonó un gen del anticuerpo a partir del hibridoma y se integró en un vector adecuado que se introdujo luego en un huésped (ver, por ejemplo, Borrebaeck C.A.K., y Larrick J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, publicado en el Reino Unido por MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990). Específicamente, el ARNm que codifica la región variable (V) del anticuerpo deseado se aisla de las células que producen anticuerpos tales como un hibridoma. El aislamiento de ARNm se lleva a cabo por medio de preparar ARN total usando, por ejemplo, un método conocido tal como el método de guanidina ultracentrífugo (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), el método de AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal, Biochem. (1987) 162, 156-159), y luego se purifica el ARNm del ARN total usando el equipo de Purificación de ARNm (fabricado por Pharmacia) y similares. De manera alternativa, el ARNm se puede preparar directamente usando el equipo de Purificación de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia). El ADNc de la región V del anticuerpo se puede sintetizar del ARNm que se obtuvo de esa manera usando una transcriptasa en reversa. El ADNc se puede sintetizar usando el equipo AMV de Transcriptasa en Reversa de Síntesis de primera hebra de cADN y similares. De manera alternativa, para la síntesis y amplificación del ADNc, se pueden usar el equipo 5'-Ampli FINDER RACE (fabricado por Clontech) y el método 5'-RACE (Frohman, M.A. et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al, Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) que emplean la reacción en cadena de polimerasa (PCR). El fragmento de ADN deseado se purifica a partir del producto de la PCR obtenido y se puede ligar al ADN del vector. Además, el vector recombinante se prepara de los mismos y luego se introduce en el E. Coli, etc., del cual se seleccionan colonias para preparar el vector recombinante deseado. La secuencia base del ADN deseado se puede confirmar mediante un método conocido tal como el método dideoxi. Una vez que se obtuvo el ADN que codifica la región V del anticuerpo deseado, se puede ligar al ADN que codifica la región constante (región C) del anticuerpo deseado, que luego se integra en un vector de expresión. De manera alternativa el ADN que codifica la región V del anticuerpo se puede integrar en un vector de expresión que contiene ADN que codifica la región C del anticuerpo. Para producir el anticuerpo para usar en la presente invención, el gen del anticuerpo se integra según se describe a continuación en un vector de expresión de manera que se exprese bajo el control de la región reguladora de expresión, por ejemplo, un mejorador y/o un promotor. Posteriormente, el vector de expresión se puede convertir en una célula huésped y entonces el anticuerpo se puede expresar en la misma. De acuerdo con la presente invención, se puede usar el anticuerpo recombinante alterado artificialmente tal como anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado y el anticuerpo humano con el fin de reducir la antigenicidad heteróloga contra los seres humanos. Estos anticuerpos alterados se pueden producir usando métodos conocidos. 5 El anticuerpo quimérico se puede obtener por medio de ligar el ADN obtenido de esa manera que codifica la región V del anticuerpo al ADN que codifica la región C del anticuerpo humano, que luego se integra en un vector de expresión y se introduce en un huésped para la producción del anticuerpo en el _ - mismo (ver Solicitud de Patente Europea EP 125023, y Publicación de Patente ; 10 Internacional WO 92-19759). Usando este método conocido, se puede obtener el — : anticuerpo quimérico útil para la presente invención. - Por ejemplo, un plásmido que contiene ADN que codifica la región V de cadena L o la región V de cadena H del anticuerpo quimérico PM-1 se designó :; como pPM-k3 o pPM-h1 , respectivamente, y E. coli que posee el plásmido se ha depositado intemacionalmente según las disposiciones del Tratado de Budapest como NCIMB 40366 y NCIMB 40362, respectivamente, el 12 de febrero de 1991 con National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (23 St Machar Drive, Aberdeen, Escocia, AB2 1 RY, Reino Unido e Irlanda del Norte). El anticuerpo humanizado que también se denomina anticuerpo humano 20 reformado se preparó por medio de transplantar la región que determina la - complementariedad (CDR) del anticuerpo de un mamífero que no sea humano, ~ por ejemplo el anticuerpo de ratón, en el CDR del anticuerpo humano. La - tecnología recombinante general para la preparación de dichos anticuerpos también es conocida (ver Solicitud de Patente Europea EP 125023 y Publicación - 25 de Patente Internacional WO 92-19759). Específicamente, una secuencia de ADN que se designó para ligar el CDR del anticuerpo de ratón con región de marco (FR) del anticuerpo humano _se sintetiza de diversos oligonucléotidos divididos que poseen secciones superpuestas entre sí en los extremos del mismo. El ADN que se obtuvo de esa manera se liga al ADN que codifica la región C del anticuerpo humano y luego se integra en un vector de expresión, que se introduce en un huésped para la producción de anticuerpos (ver Solicitud de Patente Europea EP 239400 y Publicación de Patente Internacional WO 92-19759). Para el FR del cuerpo humano ligado a través del CDR, se selecciona la región que determinar la complementariedad que forma un sitio favorable de unión de antígenos. Cuando se desea, los aminoácidos en la región de marco de la región variable del anticuerpo se puede sustituir de manera que la región que determina la complementariedad del anticuerpo humano reformado puede forman un sitio apropiado de unión de antígenos (Sato, K. et al., Cáncer Res. (1993) 53, 851-856). Por ejemplo, para un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado, se usa la región C del anticuerpo humano. Como región C del anticuerpo humano, se puede por ejemplo mencionar Cy y C?1 , C?2, C?3 y C?9. La región C del anticuerpo humano se puede modificar para mejorar la estabilidad del anticuerpo o la producción del mismo. El anticuerpo quimérico consiste en la región variable del anticuerpo que deriva de un mamífero que no sea humano, y la región C que deriva del anticuerpo humano, mientras que el anticuerpo humanizado consiste en la región que determina la complementariedad del anticuerpo que deriva de un mamífero que no es un ser humano y la región de marco y la región C del anticuerpo que deriva de un anticuerpo humano. Por consiguiente, la antigenicidad del mismo en el cuerpo humano se redujo de manera que sean útiles como anticuerpos para usar en la presente invención. Como una realización preferida del anticuerpo humanizado para usar en la presente invención, se puede mencionar el anticuerpo humanizado de PM-1 (ver Publicación de Patente Internacional WO 92-19759). Además, como método para obtener anticuerpos humanos, se conoce una tecnología que emplea la toma panorámica con una biblioteca de anticuerpo humano, además de aquellos descriptos anteriormente, por ejemplo, la región variable del anticuerpo humano se expresa sobre la superficie de un fago mediante el método de muestra del fago como un anticuerpo de cadena simple (scFv) para seleccionar un fago que se une al antígeno. Por medio del análisis del gen del fago seleccionado, se puede determinar la secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo humano que se une al antígeno. Una vez que se clarifica la secuencia de ADN de scFv que se une al antígeno, es posible preparar un vector de expresión apropiado que contiene dicha secuencia y luego obtener un anticuerpo humano. Estos métodos ya son conocidos y se pueden encontrar en WO 92/01047, WO 92/20791 , WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388. Los genes de los anticuerpos según se describió anteriormente se pueden expresar y obtener en un método conocido. En el caso de células de mamíferos, la expresión se puede lograr usando un vector que contiene un promotor útil empleado comúnmente, el gen del anticuerpo a expresar, el ADN en el cual la poli señal A se ha unido operativamente en la posición 3 corriente abajo del mismo o un vector que contiene dicho ADN. Ejemplos del promotor/mejorador incluyen promotores/mejoradores tempranos inmediatos del citomegalovirus humano. Adicionalmente, como el promotor/mejorador que se puede usar par aia expresión del anticuerpo para su uso en la presente invención, se puede usar promotores/mejoradores virales tales como retrovirus, virus del polioma, adenovirus y simian virus 40 (SV40), y promotores/mejoradores derivados de células de mamíferos tales como el factor 1 a de extensión humana (HEF1 ).

Por ejemplo, la expresión se puede lograr fácilmente mediante el método de Mulligan et al. (Mulligan, R. O et al., Nature (1979) 277, 108-114) cuando se usa el promotor mejorador SV40, o mediante el método de Mizushima et al.

(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el promotor/mejorador de HEF1a. En el caso del E. Coli, la expresión se puede llevar a cabo por medio de unir operativamente un promotor útil usado comúnmente, una secuencia de señal para la secreción de anticuerpos u el gen del anticuerpo a expresar, seguido por la expresión del mismo. Como el promotor, por ejemplo, se puede mencionar el promotor 1 acZ y el promotor araB. El método de Ward et al. (Ward, E.S. et al., Nature (1098) 341 , 544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) se puede usar cuando se usa el promotor 1 acZ y el método de Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043) se puede usar cuando se usa el promotor araB. Como secuencia de señalización para la secreción del anticuerpo, cuando se produce en el periplasma de E. coli, se puede usar la secuencia de señalización pe1 B (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383). Después de separar el anticuerpo producido en el periplasma, la estructura del anticuerpo se repliega apropiadamente antes del uso (ver, por ejemplo, WO 96/30394). Como origen de replicación, se pueden usar los que derivan de SV40, polioma virus, adenovirus, virus bovino de papiloma (BPV) y similares. Además, para ampliar el número de genes en el sistema de células huésped, los vectores de expresión pueden incluir, como marcadores seleccionables, el gen de la aminoglicósido fosfotransferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la xantina guanina fosforrilbosil transferasa de E. Coli (Ecogpt), el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr) y similares. Para la producción del anticuerpo para usar en la presente invención, se puede usar cualquier sistema de producción. El sistema de producción para la preparación del anticuerpo comprende el sistema de producción in vivo o el sistema de producción in vitro. Como el sistema de producción in vitro, se puede mencionar un sistema de producción que emplea células eucarióticas y el sistema de producción que emplea células procarióticas. Cuando se usan las células eucarióticas, se encuentran los sistemas de producción que emplean células animales, células vegetales o células fúngicas. Las células animales conocidas incluyen (1) células de mamíferos tales como células CHO, células COS, células del mieloma, células de riñon de cría de hámster (BHK), células HeLa y células Vero, (2) células de anfibios tales como los oocitos de Xenopus o (3) células de insectos tales como sf9, sf21, y Tn5. Células vegetales conocidas incluyen, por ejemplo, aquellas derivadas de tabaco de nicotina, que se puede someter al cultivo de callos. Células fúngicas conocidas incluyen levaduras tales como las del género Saccharomyces, más específicamente Saccharomyces cereviceae, u hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, más específicamente Aspergillus niger. Cuando se emplean las células procarióticas, existen sistemas de producción que emplean células de bacterias. Las células bacteriales incluyen Escherichia coli (E. coli) y Bacillus subtilis. Mediante la introducción por medio de la transformación del gen del anticuerpo deseado en estas células y por medio del cultivo de las células transformadas in vitro, se puede obtener el anticuerpo. El cultivo se lleva a cabo según los métodos conocidos. Por ejemplo, se puede usar DMEM, MEM, RPM11640 y IMDM como el líquido de cultivo, y suplementos de suero tales como suero fetal bovino (FCS) se pueden usar en combinación. Además, los anticuerpos se pueden producir in vivo por medio del implante de células en las cuales se introdujo el gen del anticuerpos en la cavidad abdominal de un animal o similar. Como los sistemas de producción in vivo, se pueden mencionar aquellos que emplean animales y aquellos que emplean vegetales. Cuando se emplean animales, se encuentran los sistemas de producción que emplean mamíferos e 5 insectos. Como mamíferos, se pueden usar cabras, cerdos, ovejas, ratones y vacas (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). También como insecto, se pueden usar los gusanos de seda. Cuando se usan vegetales, se puede usar por ejemplo, tabaco. 1° Los genes de los anticuerpos se introducen en estos animales o plantas y se los anticuerpos se producen en dichos animales o plantas y se recuperan. Por ejemplo, se inserta un gen de anticuerpo en el medio de una proteína que codifica genes que se produce inherentemente en la leche tal como caseína de cabras para preparar genes de fusión. Los fragmentos de ADN que contienen el gen de fusión en ei cual se insertó el gen del anticuerpo se inyectan en un embrión de cabra, y el embrión se introduce en una cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene de la leche producida por la cabra transgénica que proviene de la cabra que recibió el embrión o sus crías. Para incrementar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, se le pueden dar hormonas a la cabra transgénica según sea apropiado. (Ebert, K.M. et ai., Bio/Technology (1994) 12, 699-702). Cuando se emplean gusanos de seda, se infecta baculovirus en el cual se insertó el gen del anticuerpo deseado al gusano de seda, y el anticuerpo deseado se puede obtener del fluido corporal del gusano de seda (Maeda, S. et al., Nature I " 25 (1985) 315, 592-594). Además, cuando se emplea tabaco, el gen del anticuerpo deseado se inserta en un vector de expresión para vegetales, por ejemplo, pMON 530, y luego el vector se introduce en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. Luego, la bacteria se infecta al tabaco tal como Nicotiana tabacum para obtener el anticuerpo deseado a partir de las hojas del tabaco (Julián, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138). Cuando se produce el anticuerpo en sistemas de producción ¡n vitro o in vivo, según se describió anteriormente, el ADN que codifica la cadena pesada • (cadena H) o la cadena liviana (L) del anticuerpo, se pueden integrar por separado en un vector de expresión y los huéspedes se transforman simultáneamente, o el ADN que codifica la cadena H y la cadena L se pueden integrar en un vector de expresión único, y el huésped se transforma con el mismo, (ver Publicación de Patente Internacional WO 94-11523). Los anticuerpos para usar en la presente invención pueden ser fragmentos de anticuerpo o versiones modificadas de los mismos, siempre que se usen 1 , preferentemente. Por ejemplo, como fragmentos de anticuerpo, se pueden : mencionar Fab, F(ab')2, Fv o Fv(scFc) de cadena simple en cuya Fv de cadena H — 15 y de cadena L se ligaron mediante un vínculo adecuado. _ -_ De manera específica, los anticuerpos se trataron con un enzima, por ejemplo, papaína o pepsina, para producir fragmentos de anticuerpos o se I . construyen genes que codifican estos fragmentos de anticuerpo y luego se introducen en un vector de expresión que se expresa en una célula huésped (ver, por ejemplo, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H., Methods ¡n Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. and Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121 , 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121 , 663-66; Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991 ) 9, 132-137). 25 scFv se puede obtener por medio de ligar la región V de cadena H y la . región V de cadena L del anticuerpo. En scFv, la región V de cadena H y la región V de cadena L se ligan preferentemente mediante un vínculo, preferentemente un vínculo péptido (Huston, J.S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-- 5883). La región V de cadena H y la región V de cadena L en scFv pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente. Como el vínculo péptido para ligar las regiones V, se puede usar cualquier péptido de cadena simple que comprenda, por ejemplo 12 - 19 residuos de aminoácidos. El ADN que codifica el scFv se puede obtener usando ADN que codifica la cadena H o la región V de cadena H del anticuerpo anterior y el ADN que codifica la cadena L o la región V de cadena L del anticuerpo anterior como el modelo por medio de ampliar la parte de ADN que codifica ia secuencia de aminoácidos deseada entre las secuencias anteriores por medio de la técnica de PCR con el par de encendedores que especifica ambos extremos del mismo, y además por medio de ampliar la combinación del ADN que codifica el la parte del vínculo del péptido y el par de encendedores que define que los dos extremos de dicho ADN se liguen a la cadena H y a la cadena L, respectivamente. Una vez que se construyeron los ADN que codifican scFv, se pueden obtener un vector de expresión que los contiene y un huésped transformado con dicho vector de expresión a través de los métodos convencionales y se puede obtener scFv usando el huésped resultante mediante métodos convencionales. Estos fragmentos de anticuerpos se puede producir por medio de obtener el gen de los mismos de una manera similar a aquella mencionada anteriormente y por medio de permitirle expresarse en un huésped. "Anticuerpo" según se emplea en la presente también comprende estos fragmentos de anticuerpos. Como anticuerpos modificados, se pueden emplear los anticuerpos asociados con varias moléculas tales como polietilenglicoi (PEG). "Anticuerpo", según se emplea en la presente, comprende estos anticuerpos modificados. Estos anticuerpos modificados se pueden obtener por medio de modificar químicamente los anticuerpos que se obtuvieron de esa manera. Estos métodos ya han sido -- establecidos en la técnica. 1 Los anticuerpos producidos y expresados según se describe anteriormente se pueden separar del interior o exterior de la célula huésped y luego se pueden purificar hasta lograr la homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo 5 para usar en la presente invención se puede lograr mediante de cromatografía de afinidad. Como la columna empleada para dicha cromatografía de afinidad, de puede emplear la columna de Proteína A y columna de Proteína G. Ejemplos de los vehículos usados en la columna de la proteína A son Hyper D, POROS, 1. Sefarosa F. F. y similares. De manera alternativa, se pueden usar sin limitación métodos para separación y purificación usados convencionalmente para — proteínas. - La separación y purificación de los anticuerpos para usar en la presente invención se pueden lograr por medio de combinar, según sea apropiado, I cromatografía, que no sea la cromatografía de afinidad mencionada anteriormente, filtración, uítrafiltración, precipitación con sal, diálisis y similares. La cromatografía incluye, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, filtración de gel y similares. Estas cromatografías se pueden aplicar en cromatografía líquida de alta definición (HPLC). De manera alternativa, se puede usar HPLC de fase reversa. 20 La concentración del anticuerpo que se obtuvo en el anterior se puede determinar mediante la medición de la absorbancia o mediante el ensayo ZT ¡nmunoabsorbente vinculado por enzimas (ELISA) y similares. Por lo tanto, -•• cuando se emplea la medición de absorbancia, se diluye una muestra de manera 7 apropiada con PBS(-) y luego se mide la absorbancia a 280 nm, seguido por el i; 25 cálculo usando el coeficiente de absorción de 1 ,35 OD a 1 mg/ml. Cuando se emplea el método ELISA, la medición se lleva a cabo de ¡a siguiente manera. Por lo tanto, se agregan 100 µl de IgG antihumano de cabra (fabricado por TAG) diluido a 14g/ml en buffer de bicarbonato 0,1 M, pH 9,6, a una placa de 96 pocilios (fabricada por Nunc), y se incuba hasta el día siguiente a 4 °C para inmovilizar el anticuerpo. Después del bloqueo, se agrega 100 µl de cada uno de los anticuerpos diluidos de manera apropiada de la presente invención o una muestra que contiene el anticuerpo, o 100 µl de IgG humano (fabricado por CAPPEL) como el estándar, y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, se agregan 100 µl de anticuerpo de IgG anti-humano marcado de fosfatasa alcalina diluido 5000 veces (fabricado por BIO SOURCE) y se incuba a temperatura ambiente durante -1 hora. Después del lavado, se agrega e incuba la solución del sustrato, seguida por la medición de la absorbancia a 905 nm usando el MICROPLATE READER modelo 3550 (fabricado por Bio-Rad) para calcular la concentración del anticuerpo deseado. La IL-6 alterada para usar en la presente invención posee una actividad de unión al receptor de IL-6 y no transmite la actividad biológica de IL-6. Por lo tanto, la IL-6 alterada, aunque compite con IL-6 para la unión con el receptor de IL-6, no transmite la actividad biológica de IL-6 y de esa manera bloquea la transducción de señales por medio de IL-6. La IL-6 alterada se puede preparar a través de la introducción de mutación mediante el reemplazo de residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de IL-6. IL-6, la fuente de la IL-6 alterada, puede ser de cualquier origen, pero cuando se considera la antigenicidad, preferentemente es IL-6 humana. Específicamente, la estructura secundaria de IL-6 se predice usando un programa de modelado molecular de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, WHATIF (Vriend et al., J. Mel. Graphics (1990), 0, 52-56), y se evalúan los efectos totales sobre el residuo de aminoácido a reemplazar. Después de determinar un residuo apropiado, se introduce la mutación para efectuar la sustitución del aminoácido por medio del método de reacción en cadena de polimerasa (PCB) usado comúnmente que usa un vector que contiene la secuencia base que codifica el gen IL-6 humano como un modelo mediante el mismo para obtener un gen que codifica un IL-6 alterado. Luego, este se integra, según se desea, en un 5 vector de expresión apropiado del cual se puede obtener la IL-6 alterada de — acuerdo con laos métodos de expresión, producción y purificación de dicho zz anticuerpo recombinante. " Ejemplos específicos de IL-6 alterada se divulgan en Brakenhoff et al., J.

"' Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, y Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, ~; 10 WO 96-18648, y WO 96-17869. El péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial del receptor de IL-6 para usar en la presente invención posee una actividad de unión al receptor de IL-6 o IL-6, respectivamente y no transmite la actividad biológica de IL-6. Por lo tanto, el péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial del receptor de IL-6 inhibe 15 específicamente la unión de IL-6 al receptor de L-6 mediante la unión al receptor de IL-6 o a IL-6, respectivamente, y de esa manera capturándolo. Como —_ resultado, estos no transmiten la actividad biológica de IL-6, y por lo tanto — bloquean la transducción de señal de IL-6. rz El péptido "parcial de IL-6 o el péptido parcial del receptor de IL-6 es un -• 20 péptido que comprende algunas o todas las secuencias de aminoácidos de la región involucrada en la unión a IL-6 y al receptor de IL-6 en la secuencia de 7 aminoácidos de IL-6 o del receptor de IL-6. Dicho péptido en general comprende - 60, preferentemente 20 - 50, más preferentemente 20 - 40 residuos de aminoácidos. 25 El péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial del receptor de IL-6 se puede preparar por medio de especificar la región involucrada en la unión a IL-6 y al receptor de IL-6 en la secuencia de aminoácidos de IL-6 o del receptor de IL-6 y por medio de producir algunas o todas las secuencias mediante un método convencional tal como tecnología de ingeniería genética o un método de síntesis de péptidos. Para preparar el péptido parcial de IL-6 o el péptido parcial del receptor de IL-6 mediante una tecnología de ingeniería genética , la secuencia de ADN que codifica el péptido deseado se integra en un vector de expresión, del cual se puede obtener el péptido mediante los métodos de expresión, producción y purificación de dicho anticuerpo recombinante. La preparación del péptido parcial de IL-6 o del péptido parcial del receptor de !L-6 mediante el método de síntesis de péptidos se puede llevar a cabo usando un método empleado comúnmente en la síntesis de péptidos tal como la síntesis de fase sólida o la síntesis de fase líquida. Específicamente, se puede usar el método que se describe en Zoku- lyakuhin no Kaihatsu (Sequei to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peputido Gousei (Peptide Synthesis), editado por Haruaki Yajima, Hirokawa Shoten, 1991. El método de síntesis de fase sólida empleado incluye, por ejemplo, una reacción en la cual un aminoácido que corresponde a la terminal C del péptido a sintetizar se acopla a un soporte que es ¡nsoluble en solventes orgánicos y luego eí aminoácido en el cual un grupo a-amino o un grupo funcional de cadena lateral se protegió con un grupo protector apropiado se condensa un aminoácido en un momento desde la dirección C-terminal a la dirección N terminal y una reacción en la cual dicho grupo protector del grupo a-amino del aminoácido o péptido acoplado a la resina se elimina se repiten alternadamente para prolongar la cadena de péptidos. Los métodos de síntesis de péptidos de fase sólida se dividen en el método Boc y en el método Fmoc dependiendo del tipo de grupo protector a emplear. Después de que se completó la síntesis del péptido deseado, se lleva a cabo una reacción de desprotección y una reacción para escindir la cadena del — péptido del soporte. Para la escisión de la cadena del péptido, en general, se ZZ" emplea fluoruro de hidrógeno o ácido trifluorometansulfónico en el método de Boc — y TRFA en el método de Fmoc. En el método de Boc, por ejemplo la resina del — 5 péptido anterior se trata en fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol. z: Posteriormente, el grupo protector se elimina y se recupera el péptido mediante la '-". escisión del soporte. Mediante la liofilización de este, se puede obtener péptido bruto. Por otra parte, en el método de Fmoc, la reacción de desprotección y la reacción de escisión del péptido del soporte de puede realizar en TFA, por 10 ejemplo, en un procedimiento similar al anterior. El péptido bruto que se obtuvo de esa manera se puede aplicar a HPLC para su separación y purificación. Esta elución se puede llevar a cabo en un _ sistema de solvente agua-acetonitrilo que se emplea comúnmente para la ZZ purificación de proteínas bajo una condición óptima. Se recolectó y liofilizó la — 15 fracción correspondiente al pico del perfil de la cromatografía obtenida. La fracción del péptido que se purificó de esta manera se identifica por medio de someterlo al análisis del peso molécula mediante análisis de masa z: espectroscópica, el análisis de la composición de aminoácidos o el análisis de ia secuencia de aminoácidos y similares. 20 Ejemplos específicos del pépíido parcial de 1L-6 o del péptido parcial del receptor de IL-6 se divulgan en la Publicación de Patente Japonesa Sin Examinar (Kokai) 2-188600, Publicación de Patente Japonesa Sin Examinar (Kokai) 7- 324097, Publicación de Patente Japonesa Sin Examinar (Kokai) B-311098, y Publicación de Patente Estadounidense US 5210075. — 25 La actividad del antagonista de IL-6 para usar en la presente invención de Z7 bloquear la transducción de señal de IL-6 se puede evaluar usando un método conocido. Específicamente, la línea celular de mieloma humano dependiente de IL-6 (56545, XPMM2), línea celular humana del linfoma T de Lennert's KT3, o se cultiva la célula dependiente de IL-6 MH60.BSF2, a la cual se agrega IL-6 y la actividad se puede evaluar usando la incorporación de 3H-timidina en la célula dependiente de IL-6 en la coexistencia del antagonista de IL-6. De manera alternativa, puede cultivarse 0266, una célula que expresa el receptor de IL-6 a la cual se agrega IL-6 marcada con 125l y se agrega un antagonista de IL-6 al mismo tiempo, y luego se determina la IL-6 marcada con 125l unida a la célula que expresa el receptor de IL-6. En el sistema de ensayo anterior, un grupo de control negativo que no contiene antagonistas de IL-6, además, se prepara del grupo en el cual se encuentra presente un antagonista del receptor de ¡L-6, y los resultados que se obtienen para ellos se comparan para evaluar la actividad de inhibición de IL-6 del antagonista del receptor de IL-6. Según se describe en el siguiente Ejemplo, el anticuerpo anti-receptor de IL-6 mostró un efecto terapéutico de la vasculitis, sugiriendo que antagonistas de IL-6 tales como anticuerpos del receptor de IL-6 son efectivos como agentes terapéuticos para la vasculitis. El sujeto a tratar en la presente invención es un mamífero. El sujeto mamífero a tratar es, preferentemente, un ser humano. Los agentes preventivos o terapéuticos de la presente invención se pueden administrar, ya sea por vía oral o parenteral, sistémica o localmente. Por ejemplo, se pueden seleccionar la inyección intravenosa tal como infusión por goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, supositorios, lavaje intestinal, comprimidos recubiertos orales entéricos y similares, y se puede elegir el método de administración, según sea apropiado, dependiendo de la edad y las condiciones del paciente. La dosificación efectiva se elige del rango de 0,01 a 100 mg por kg de peso corporal por administración. De manera alternativa, se puede elegir la dosificación en el rango de 1 a 20, preferentemente de 2 a 6 mg por paciente. Las dosificaciones preferidas y los métodos preferidos de administración son tales que, en el caso del anticuerpo del anti-receptor de IL-6, las cantidades en las cuales el anticuerpo libre se encuentra presente en la sangre en dosificaciones efectivas. En ejemplos específicos, se administra 1 mg a 20 mg por kg de peso corporal, preferentemente de 2 mg a 8 mg, por mes (4 semanas) en de una a varias dosis, por ejemplo, dos veces por semana, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada cuatro semanas y similares. Los agentes preventivos o terapéuticos para la vasculitis de la presente invención pueden contener vehículos aceptables para uso farmacéutico o aditivos dependiente de la vía de administración. Ejemplos de dichos vehículos o aditivos incluyen agua, un solvente orgánico aceptable para uso farmacéutico, colágeno, alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano soluble en agua, carboximetil almidón sódico, pectina, metil celulosa, etil celulosa, goma xántica, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina de suero humano (usa), manitol, sorbitoi, lactosa, o tensioactivos aceptables para uso farmacéutico y similares. Los aditivos empleados se eligen, pero sin que se limiten a los mismos, de los anteriores o de combinaciones de los mismos dependiendo de la forma de dosificación. Ejemplos La presente invención se explicará a continuación en mayor detalle con referencia a los ejemplos operativos y a los ejemplos de referencia. Sin embargo, se debe observar que la presente invención no se limita por los mismos de ninguna manera. Ejemplo Operativo 1 Método: Los pacientes que padecen el síndrome de vasculitis incurable (poliarteritis nudosa, el síndrome de aortitis) refractario a la terapia convencional se sometieron a tratamiento con anticuerpo humanizado del anti-receptor de IL-6. Con la autorización del Comité de Tratamiento Médico Avanzado del Hospital de la Universidad de Osaka, dos pacientes recibieron el anticuerpo humanizado de PM-1 (MRA) que es u n anticuerpo humanizado del anti-receptor de IL-6. El punto final fue el perfeccionamiento en la evaluación de imágenes por medio de imágenes por resonancia magnética (IRM) y tomografía computada (TC), perfeccionamiento de las condiciones de ia piel, perfeccionamiento en los marcadores inflamatorios tales como proteína C reactiva (CRP), y perfeccionamiento en QOL (dolor, artralgia, malestar). Asimismo, se evaluaron los conteos de células de sangre periférica, bioquímica general, función homeostática, IL-6, receptor soluble de IL-6, la concentración del anticuerpo humanizado del anti-receptor de IL-6 en la sangre, el factor de necrosis del tumor a (TNFa, ¡nterleuquina-1 b (IL-1 b) y el factor de crecimiento epidérmico vascular (VEGF). Resultado: Caso 1 : Una mujer de 19 años de edad. Diagnosticada como padeciendo el síndrome de aortitis en 1996. Con una complicación de colitis ulcerosa. Se inició prednisolona (PSL) 60 mg/día. Ni siquiera el uso combinado de ciclosporina pudo reducir la PSL a 20 mg/día o a menos. In 1998, en respuesta al agravamiento, se usaron 150 mg/día de ciclofosfamida además de la terapia de pulso de metil prednisolona (mPSL), pero no pudo reducirse a 30 mg/día o menos. Se agregó 1 mg/día de betametasona y luego se llevó a cabo la leucoferesis siete veces, pero sin efecto. En el 2000, y después, se usó la terapia de pulso de mPSL de manera intermitente y se usaron en combinación 100 mg/día de azatioprina, 2 g/día de micofenolato mofetil y 17,5 mg/semana de metotrexato, pero sin efecto. Según se muestra en las Figs. 1 a 6, la TC reveló la hipertrofia prominente de la pared de los vasos sanguíneos en la aorta ascendente, la trifurcación del arco aórtico y la aorta descendente. Se observó estenosis en la arteria subclavia (1t.

SCA). Se observó inflamación severa con CRP 12,6 mg/dl, y debido a un dolor de pecho persistente severo, se presentó una reducción en el peso corporal de 5 kg por mes, y ataques de pérdida del conocimiento, se usó la infusión por goteo de 200 mg/semana de MRA. Alrededor de dos semanas después, CRP se tornó negativa. Un mes después, el dolor de pecho mejoró, y según se vio en las Fig. 1- 6, se observaron mejoras en la hipertrofia de la pared de vasos sanguíneos y en la aorta ascendente, la trifurcación del arco aórtico y la aorta descendente y el alargamiento del lumen de los vasos sanguíneos, y además mejoró el flujo sanguíneo en la arteria carótida. Asimismo, la hemoglobina fecal también se tornó negativa y desaparecieron los síntomas de la colitis ulcerosa. Durante la terapia de MRA, se elevaron los niveles sanguíneos del TNFa , pero sin ninguna agravación en los síntomas. Se mantuvo la mejora en la hipertrofia de la pared de la aorta y el alargamiento del lumen de los vasos sanguíneos aún en dos años después de la terapia de MRA. La arteritis de Takayasu también se denomina como la enfermedad sin pulso, y en este paciente también no se pudo sentir el pulso, pero después del tratamiento, la pulsación de las arterias del radio y del cubito se puso sentir en la muñeca. Debido al uso prolongado de MRA los niveles sanguíneos de ¡L-6 disminuyeron de 1720 mg/ml a 100 pg/ml. Caso 2: Un hombre de 42 años de edad. En 1986, desarrolló arteritis nudosa (del tipo de piel) y a pesar de los tratamientos con PSL, azatiopurina, colchicina y anticoagulantes, remisión y agravamiento repetidos. En 1995 y después, se usó ciclofosfamida en combinación con la terapia de pulso de mPSL, pero sin efecto. A partir de 1997, se comenzó la administración en bolo de azatiopurina, ciclofosfamida y d-globulina, y desde el 2000, se iniciaron la terapia de pulso de ciclofosfamida y la leucoforesis, pero sin efecto. Se realizó el injerto de piel en la úlcera de la piel debido a la vasculitis, pero sin efecto, y debido al agravamiento, se realizó la remoción de la fíbula derecha y la amputación de B-K. La vasculitis necrótica se agravó más y se extendió la úlcera en la extremidad inferior. Después de empezar el tratamiento con 200 mg/semana de un anticuerpo humanizado del anti-receptor de IL-6, la fiebre y el eritema de piel y los dolores musculares que se observaron previamente mejoraron. Aunque no se pudo evitar la remoción del muslo derecho, los conteos de leucocitos se normalizaron con la reducción de IL-6 en la sangre y no se observó posteriormente un agravamiento en la úlcera de la piel. Discusión: Debido a que el MAR fue efectivo para pacientes con vasculitis incurable que no se pudo controlar mediante los tratamientos convencionales, se sugirió que el tratamiento de inhibición de IL-6 podría proveer un método novedoso de tratamiento para la vasculitis. Esto significa que la IL-6 es indispensable para determinar la patología de la vasculitis. Asimismo, como se observó la reducción per se de IL-6 en todos ios casos, esto demostró que el tratamiento de inhibición de IL-6 no solo posee un efecto anti-inflamatorio sino que también actúa sobre la naturaleza esencial de la vasculitis. Ejemplo de referencia 1. Preparación del receptor humano soluble de ÍL-6 El receptor soluble de IL-6 se preparó mediante el método de PCR usando un plásmido pBSF2R.236 que contiene ADNc que codifica al receptor de IL-6 que se obtuvo de acuerdo con el método de Yamasaki et al., (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241 , 825-828). El plásmido pBSF2R.236 se digirió con una enzima de restricción Sph I para obtener el ADNc del receptor de I L-6, que luego se insertó en mp18 (fabricado por Amersham). Usando un oligoencendedor sintético diseñado para introducir un codón de detención en el ADNc del receptor de IL-6, se introdujo una mutación en el ADNc del receptor de IL-6 por medio del método de PGA usando el Sistema de Mutagénesis in vitro (fabricado por Amersham). El procedimiento produjo la introducción de un codón de detención al aminoácido en la posición 345 y dio ADNc que codifica al receptor soluble de IL-6. Para expresar el ADNc del receptor soluble de IL-6 en células de CHO, se ligó al plásmido pSV (fabricado por Pharmacia) para obtener plásmido pSVL344.

El ADNc del receptor soluble de IL-6 que se escindió con Hind ill-Sal I se insertó al plásmido pECEdhfr344 que contiene el ADNc de dhfr para obtener el plásmido pECEdhfr344 que se puede expresar en las células de CHO. Se transfectaron 10 g del plásmido pECEdhfr344 a la línea celular DXB-11 de dhfr-CHO (Orlaub G. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) mediante el método de precipitación de fosfato de calcio (Chen C. et al., Mal. Cell. Biol. (4987) 7, 2745-27511. Las células transfectadas de CHO se cultivaron durante 3 semanas en un medio de selección de a MEM libre de nuecleósidos que contienen 1 mM de glutamina, 10% de FCS dializado, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células de CHO seleccionadas se exploraron mediante el método de dilución limitativo para obtener un clon de célula CHO simple. El clon de célula de CHO se amplió en 20 nM - 200 nM de metotrexato (MTX) para obtener una línea celular de CHO 5E27 que produce receptor de ¡L-6 humano soluble. La línea celular de CHO 5E27 se cultivó en un medio modificado por Iscov de Dulbecco (IMDM, fabricado por Gibco) que contiene 5% de FBS. El sobrenadante del cultivo se recolectó y se determinó la concentración del receptor soluble de IL-6 en ei sobrenadante del cultivo mediante ELISA. El resultado confirmó que el receptor soluble de ¡L-6 se encuentra presente en el sobrenadante del cultivo. Ejemplo de Referencia 2. Preparación del anticuerpo humano de IL-6 Se inmunizaron 10 g del IL-6 recombinante (Hirano et al., Immunol. Lett., (1988) 17, 41) para ratones BALB/c junto con el adyuvante completo de Freund, y esto se repitió cada semana hasta que se pudo detectar el anticuerpo anti-IL-6 en el suero. Las células inmunes se extrajeron del nodo linfático local y luego se fusionaron con una línea celular P301 del mieloma usando polietilenglicol 1500. Los hibridomas se seleccionaron de acuerdo con el método de Oi et al. (Selective Methods ¡n Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Francisco, 351 , 1980) que emplea el medio HAT y se estableció el hibridoma que produce anticuerpo anti-humano de IL-6. El hibridoma que produce el anticuerpo anti-humano de IL-6 se sometió al ensayo de unión de ¡L-6 de la siguiente manera. Por lo tanto, se recubrió una placa de 96 pocilios de microlitros fabricada de polivinilo flexible (fabricada por Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) con 100 µl de Ig de cabra anti-ratón (10 µl/ml, fabricado por Cooper Biomedical, Inc., Malvern, PA) hasta el día siguiente a 4 °C. Posteriormente, la placa se trató con 100 µl de PBS que contiene 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavarlo en PBS, se agregaron 100 µl del sobrenadante del cultivo del hibridoma a cada pocilio y luego se incubó hasta el día siguiente a 4 °C. La placa se lavó, se agregó IL-6 recombinante rotulado 125l a cada pocilio en una concentración de 2000 cpm/0,5 ng/pocillo y luego se determinó la radioactividad de cada pocilio después de cada lavado mediante un contador gamma (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA). De 216 clones del hibridoma, 32 fueron positivos en ei ensayo de unión de IL-6. De estos clones, se obtuvo finalmente MH166.BSF2 estable. El anticuerpo anti-IL-6 MH166 producido por dicho hibridoma posee un subtipo de lgG1 K. Luego, se usó el clon MH60.BSF2 de hibridoma de ratón dependiente de IL-6 para examinar una actividad neutralizadora con respecto al crecimiento del hibridoma mediante el anticuerpo de MH166. Las células MH60.BSF se distribuyeron a 1 x 104/200 µl/pocillo y se agregaron muestras que contienen el anticuerpo MH166 al mismo, se cultivaron durante 48 horas, se agregó 0,5 µCi/pocillo de 3H-timidina (New England Nuclear, Boston, MA) y el cultivo se continuó durante otras 6 horas. Las células se colocaron sobre un papel de filtro de vidrio y se trataron mediante el cosechador automático (Lebo Mash Science Co., Tokyo, Japan). Como el control, se usó el anticuerpo anti-IL-6 de conejo. Como resultado, el anticuerpo de MH166 inhibió, de una manera dependiente de la dosis, la incorporación de 3H-timidina de células MH60.BSF2 inducida por IL-6. Esto reveló que el anticuerpo de MH166 neutraliza la actividad de IL-6. Ejemplo de Referencia 3. Preparación del anticuerpo humano del anti-receptor de IL-6 El anticuerpo del anti-receptor de IL-6 MT18 preparado meduiante el método de Hirata et al. (Hirata, Y. et al. J. Immunol., (1989) 143, 2900-2906) se unió a Sefarosa 4B activada por CNBr (fabricada por Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) de acuerdo con el régimen adjunto y se purificó el receptor de IL-6 (Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241 , 925-828). Una línea celular U266 de mieloma humano se solubilizó con 1 mM de clorhidrato de p-para-aminofenil metan sulfonil fluoruro (fabricado por Wako Chemicals) (buffer de digitonina) que contiene 1 % de digitonina (fabricado por Wake Chemicals), 10 mM de trietanolamina (pH 7,8) y 0,15 M de NaCI, y se mezcló con anticuerpo MT18 unido a perlas de Sefarosa 4B. Luego, las perlas se lavaron seis veces con buffer de digitonina para preparar el receptor purificado parcialmente de IL-6 a usar en la inmunización. Los ratones BALB/c se inmunizaron cuatro veces cada diez días con el receptor de IL-6 purificado parcialmente obtenido de células U266 3 x 103 y luego se preparó un hibridoma usando un método estándar. El sobrenadante del cultivo de hibridoma del pocilio de crecimiento positivo se analizó para determinar su actividad de unión al receptor de IL-6 de acuerdo con el método que se describe a continuación. Las células U266 5 x 107 se rotularon con 35S-metionina (2,5 mCi) y se solubilizaron con el buffer de digitopina anterior. Las células U266 solubilizadas se mezclaron con un volumen de 0,04 mi del anticuerpo MT18 unido a perlas de Sefarosa 4B, y luego se lavaron seis veces con buffer de digitonina. Se eluyó el receptor de IL-6 rotulado de 39S-metionina con 0,25 mi del buffer de digitonina (pH 3,4) y se neutralizó en 0,025 mi de 1 M de Tris (pH 7,4). Se mezcló 0,05 mi del sobrenadante del cultivo del hibridoma con 0,01 mi de Sefarosa de Proteína G (fabricado por Pharmacia). Después del lavado, la Sefarosa se incubó con 0,005 mi de solución del receptor de IL-6 35S-rotulado preparado según lo descripto anteriormente, se analizó el inmunoprecipitado mediante SDS-PAGE para investiga el sobrenadante del cultivo del hibridoma que reacciona con el receptor de IL-6. Como resultado, se estableció el clon PM-1 del hibridoma de reacción positivo (FERM BP-2996). El anticuerpo que se produce a partir del hibridoma PM-1 posee un subtipo de IgGI K. La actividad inhibidora de unión de IL-6 del anticuerpo producida por el hibridoma PM-1 con eí receptor humano de IL-6 se estudió usando la línea celular U266 del mieloma humano. Se preparó un IL-6 recombinante humano a partir de E. Coli (Hirano et al., Immunol. Lett, (1988) 17, 41-45), y se rotuló con 125l usando el reactivo de Bolton-Hunter (New England Nuclear, Boston, MA) (Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981).

ZZ Las células U266 4 x 105 se cultivaron con el sobrenadante del cultivo de 70% (v/v) del hibridoma PM-1 junto con 14,000 cpm de IL-6 rotulado con 125l durante una hora. Setenta µl de la muestra se colocó en capas sobre 300 µl de FCS en un tubo de polietileno micrófugo de 400 µl. Después del centrifugado, se determinó la radioactividad de la célula. El resultado reveló que el anticuerpo producido por el hibridoma PM-1 inhibe la unión de IL-6 con el receptor de IL-6. ZZ Ejemplo de Referencia 4. ZZZ Preparación del anticuerpo de ratón del anti-receptor de IL-6 — 10 Se preparó un anticuerpo monoclonal dirigido contra el receptor de IL-6 de — ratón de acuerdo con el método descripto en Saito, et al., S. Immunol. (1991) 147, ? 168-173. Z Las células de CHO que producen el receptor soluble de IL-6 de ratón se cultivaron en el líquido de cultivo de IMDM que contiene 10% de FCS. A partir del 15 sobrenadante del cultivo, se purificó el receptor soluble de IL-6 de ratón usando una columna de afinidad en la cual el anticuerpo RS12 del receptor de IL-6 antiratón (ver Saito, et al., supra) se fijó a Affigel 10 gel (fabricado por Biorad). El receptor soluble de IL-6 de ratón (50 µg) que se obtuvo de esta manera _ - se mezcló con adyuvante completo de Freund, que luego se inyectó en el abdomen de ratas Wistar. A partir de las 2 semanas después de la administración, ZZ los animales se elevaron con el adyuvante incompleto de Freund. En el día 45, se — cosecharon las células del bazo de rata y alrededor de 2 x 108 células de los ~- mismos se fusionaron con células 1 x 107 de mieloma de ratón P3U1 usando un ZT PEG1500 al 50% (fabricado por Boehringer Mannheim) de acuerdo con el método convencional, y luego se exploraron a través del medio de cultivo de HAT. Después de que se agregó el sobrenadante del cultivo del hibridoma a la placa recubierto con anticuerpo de conejo de IgG anti-rata (fabricado por Cappel), se hizo reaccionar el receptor soluble del receptor de IL-6. Posteriormente, usando anticuerpo de conecto anti-receptor de IL-6 de ratón e IgG alcalino rotulado con fosfatasa de oveja anti-conejo, se exploraron hibridomas que producen anticuerpo dirigido contra el receptor soluble de IL-6 de ratón mediante ELISA. Después de que se confirmó la producción del anticuerpo, los clones del hibridoma se subexploraron dos veces para obtener un clon simple de hibridoma. El clon se denominó MR16-1. La actividad neutralizante del anticuerpo producido por el hibridoma sobre la transducción de señal de lL-6 de ratón se examinó mediante la incorporación de 3H-timidina usando células MH60.BSF2 (Matsuda, T. et al., J. limnunol. (1988) 18, 951-956). Para una placa de 96 pocilios, se prepararon células MH60.BSF2 a 1 x 104 células/200 µl/pocillo. A la placa se agregaron 10 pg/ml de IL-6 de ratón y anticuerpo de MR16-1 o anticuerpo RS12 a 12,3 - 1000 nq/ml, y luego se cultivaron a 37°C y 5% de C02 durante 44 horas, y luego se agregó 1 µCi/pocillo de 3H-timidina. Después de 4 horas, se midió ia incorporación de 3H-timidina.

Como resultado, el anticuerpo de MR16-1 suprimió la incorporación de 3H-timidina mediante las células MH60.BSF2. Por lo tanto, se demostró que el anticuerpo producido por el hibridoma MR16-1 (FERM BP-5875) inhibe la unión de IL-6 al receptor de IL-6.

Claims (42)

1. - REIVINDICACIONES — 5 Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la ZZ presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo. 1. Un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis, comprendiendo dicho agente un antagonista de interleuquina 6 (IL-6) como componente activo. 10 2. Un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis que posee resistencia a esferoides y/o ¡nmunosupresores, comprendiendo dicho agente un antagonista de interleuquina 6 (IL-6) como componente activo. 3. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el cual dicha vasculitis es la poliarteritis nudosa. 15 4. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el cual la vasculitis es el síndrome de aortitis. 5. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 en el cual la vasculitis es la vasculitis asociada con anormalidades inmunológicas. 6. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a 5 en el cual dicho antagonista de IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6. 7. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 6 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de ¡L-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de I L-6. 25 8. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 6 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monocíonal contra el receptor humano de IL-6. 9. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 6 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón. 10. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con cualquiera de las 5 reivindicaciones 6 a 9 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo recombinante. 11. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 6 en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor humano de IL-6 es eí anticuerpo PM-1. " 10 12. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 9 en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón es el anticuerpo MR16-1. 13. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un 15 anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo humano contra el receptor de I L-6. 14. El agente preventivo y/o terapéutico de acuerdo con la reivindicación 13 en el cual dicho anticuerpo humanizado contra el receptor de IL-6 de ratón es el anticuerpo humanizado PM-1. 20 15. El uso de un antagonista de interleuquina 6 (¡L-6) para la fabricación de un agente preventivo y/o terapéutico para la vasculitis. 16. El uso de un antagonista de interleuquina 6 (IL-6) para la fabricación de un agente preventivo y/o terapéutico para la vascuiitis que posee resistencia a esferoides y/o inmunosupresores. 25 17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 o 16 en el cual dicha vasculitis es la poliarteritis nudosa. 18. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 o 16 en el cual dicha vasculitis es el síndrome de aortitis. 19. El uso de acuerdo con la reivindicación 15 o 16 en el cual dicha vasculitis es vasculitis asociada con anormalidades inmunológicas. 20. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19 en el cual dicho antagonista de IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6. 21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6. 22. El uso de acuerdo con la reivindicación 20 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonai contra el receptor humano de IL-6. 23. El uso de acuerdo con la reivindicación 20 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón. 24. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo recombinante. 25. El uso de acuerdo con la reivindicación 22 en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor humano de IL-6 es el anticuerpo PM-1. 26. El uso de acuerdo con la reivindicación 23 en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón es el anticuerpo MR16-1. 27. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 26 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. 28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27 en el cual dicho anticuerpo humanizado contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo humanizado PM-1. 29. Un método para prevenir y/o tratar la vascuíitis que comprende administrar un antagonista de interleuquina 6 (IL-6) a un sujeto que lo necesita. 30. Un método para prevenir y/o tratar la vasculitis que posee resistencia a esferoides y/o inmunosupresores que comprende administrar un antagonista de_ interleuquina 6 (IL-6) a un sujeto que lo necesita. 31. El método de acuerdo con la reivindicación 29 o 30 en el cual dicha vasculitis es la poliarteritis nudosa. 32. El método de acuerdo con la reivindicación 29 o 30 en el cual dicha vasculitis es el síndrome de aortitis. 33. El método de acuerdo con la reivindicación 29 o 30 en el cual dicha vasculitis es vasculitis asociada con anormalidades inmunológicas. 34. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 33 en el cual dicho antagonista de IL-6 es un anticuerpo contra el receptor de IL-6. 35. El método de acuerdo con la reivindicación 34 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6. 36. El método de acuerdo con la reivindicación 34 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor humano de ¡L-6. 37. Ei método de acuerdo con la reivindicación 34 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón. 38. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37 en el cual dicho anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo recombinante. 39. El método de acuerdo con la reivindicación 36 en el cual dicho anticuerpo monocional contra el receptor humano de IL-6 es el anticuerpo PM-1. 40. El método de acuerdo con la reivindicación 37 en el cual dicho anticuerpo monoclonal contra el receptor de IL-6 de ratón es el anticuerpo MR1. 41. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 40 en el cual el anticuerpo contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano contra el receptor de IL-6. 42. El método de acuerdo con la reivindicación 41 en el cual dicho anticuerpo humanizado contra el receptor de IL-6 es un anticuerpo humanizado PM-1. — 10 15 20 25