MXPA06001511A

MXPA06001511A - Derivados de polisacaridos con alta actividad antitrombotica en plasma.

Info

Publication number: MXPA06001511A
Application number: MXPA06001511A
Authority: MX
Inventors: Giovanni Cipolletti
Original assignee: Inalco Spa
Priority date: 2003-08-06
Filing date: 2004-07-07
Publication date: 2006-05-15
Also published as: EP1654288A1; JP2007501305A; KR20060063933A; CA2534709A1; EP1654288B9; RU2361881C2; DK1654288T3; BRPI0413346A; WO2005014656A1; ATE458009T1; EP1654288B1; RU2006106790A; CN1832966A; ITMI20031618A1; IL173482A0; US7687249B2; ES2341249T3; AU2004262584A1; DE602004025583D1; US20070042993A1

Abstract

El invento actual esta relacionado a un proceso para la preparacion de glicosaminoglicanos sulfatados derivados de N-acetilheparosano que consta de: a) N-desacetilacion y N-sulfatacion del polisacarido N-acetilheparosano preparado de cepas bacterianas naturales o recombinantes, de preferencia de K5 E. coli, b) epimerizacion enzimatica con enzima de epimerasa C5 glucuronil, c) O-sulfatacion parcial seguido por O-desulfatacion parcial, d) 6-0 sulfatacion parcial, e) N-sulfatacion y un paso intermedio de despolimerizacion controlada caracterizado por el hecho de que ambas O-sulfataciones (O-sulfatacion y 60-sulfatacion) son parciales. Mas aun, el invento esta relacionado a los productos obtenidos segun el proceso que muestra una proporcion entre la actividad anti-Xa y la actividad anti-IIa igual o mayor a 1 y a compuestos que contengan dichos productos en combinacion con excipientes y/o diluyentes y farmaceuticamente aceptables.

Description

DERIVADOS DE POLISACARIDOS CON ALTA ACTIVIDAD ANTITROMBÓTICA EN PLASMA CAMPO DEL INVENTO El campo del invento es la preparación de polisacáridos sulfatados con actividad antitrombótica, anticoagulante iniciando con polisacáridos de origen microbiana.

ESTADO DE LA TÉCNICA La heparina natural es un polímero con una estructura glicosaminoglicánica, con peso molecular variable de entre 3,000 y 30,000 Da, compuesto por la secuencia de unidades de disacáridos repetidos hechos de ácido urónico (L-idurónico o D-glucurónico) y un azúcar amino (glucosamina) enlazados uno al otro con enlaces ß-1-4. El ácido urónico se puede sulfatizar en la posición 2 y la glucosamina puede ser N-acetilado o N-sulfatado y 6-=-sulfatado. Además, la glucosamina también puede contener un grupo de sulfato en la posición 3. Son esenciales estas sustituciones en la creación de la región de enlace con alta afinidad a antitrombina (ATIII) y para explicar la actividad anticoagulante y antitrombótica del polímero. La Heparina es el agente anticoagulante y antitrombótico básico para uso terapéutico y, hasta la fecha, se obtiene por medio de la extracción de órganos animales. En un esfuerzo por sustituir este fuente de suministro, y por lo tanto, por satisfacer los pedidos crecientes de material, y a la vez eliminar cualquier contaminación accidental de agentes infecciosos, principalmente virus o priones, fueron desarrollados en los últimos años varios procesos para la preparación de moléculas con una estructura similar a la heparina así como con características similares, iniciando con polisacáridos acetilheparosanos de origen bacteriano y, por lo tanto, disponibles sin limitantes de cantidad. El polisacárido N-acetilheparosano aislado de unos cuantos Escherichia Coli K5 naturales o recombinantes o de reservas de bacterias de Pasteurella multocida, tiene la misma estructura básica que el precursor de heparina natural compuesto por una secuencia repetida del enlace ácido D-glucorónico y N-acetílglucosamina enlazados el uno al otro con enlaces a 1-4. Por lo contrario, el enlace entre las unidades disacáridos es ß 1-4. Puede ser sulfatado el ácido urónico en dos diferentes posiciones y la glucosamina puede ser N-acetilado o N-sulfatado y 6-O-sulfatado. Además la glucosamina también puede contener un grupo de sulfato en la posición 3. El polisacárido N-acetilheparosano aislado de E. Coli K5 (V ann W.F., Schmidt M.A., Jann B., Jann K. (1981) en Era-. J. Biochem 116, 359-364) fue modificado químicamente como describe Lormeau et al. en la Patente de EE.UU. No. 5,550,116 y por Casé et al (Carb. Res 263-1994-271-284) o químicamente y enzimáticamente en un esfuerzo por obtener productos dotados con actividad biológica comparable con la de la heparina extraída. Además, los productos semi-sintéticos deben sufrir un proceso de despolimerización con el fin de disminuir su peso molecular que hace más adecuado el producto en distintas aplicaciones terapéuticas. En particular mejora la bio-disponibilidad y reduce el riesgo de sangrado asociado con su uso y otros efectos secundarios. Se describen modificaciones químicas y enzimáticas en el polisacárido bacteriano por ejemplo en la patente italiana No. IT 1230785 en el cual el polisacárido K5 es N-desacetilado y N-sulfatado; luego sufre la epimerización enzimática C5 del ácido glucurónico. A estas transferencias se les siguen otras transferencias de sulfatación enzimática tanto en el ácido uránico como en el amino azúcar. La solicitud de patente WO92/17509 describe un método para la preparación de productos semejantes a la heparina iniciando desde el polisacárido K5 por medio de conductos de N-desacetilación, N-sulfatación y epimerización enzimática C5, seguidos por O-sulfatación química y opcionalmente por N-sulfatación. La solicitud de patente WO 96/14425 y la patente de EE.UU. No. 5,958,899 describen un método para la preparación de derivados de K5 polisacáridos con un alto contenido de ácido idurónico obtenido a través de N-desacetilación y N-sulfatación, epimerización enzimática a ácido idurónico de mas de 50% del ácido glucurónico usando tampones modificados para obtener una viscosidad crítica, y en seguida a través de sulfatación de por lo menos algo de los grupos de hidroxilo libre del ácido uránico y de los grupos de glucosamines. La solicitud de patente WO 97/433117 y la patente de EE.UU. 6,162,797 describen la preparación de derivados K5 con actividades anticoagulantes y antitrombóticos altas obtenidas a través de N-desacetilación y N-sulfatación, epimerización enzimática del ácido glucorónico, y a través de O-supersulfatación y N-risulfatación. La solicitud de patente WO 98/42754 y la patente de EE.UU. No. 6,197,943 y Naggi A. et al. Carbohydrate Research 336 (2001) 283-290, describen una metodología para la preparación de glicosaminoglicanes sulfatados incluyendo derivados polisacáridos K5 que tienen una alta actividad antitrombótica in vitro, a través de desulfatación solvolítica de precursores supersulfatadas y 6-0 risulfatación opcional. Las solicitudes de patentes WO 01/72848 y WO 2/50125 describen un método para la preparación del derivado glicosaminoglicanes desde polisacárido K5 que tenga una alta actividad anticoagulante y antitrombótica. El proceso consiste en los siguientes pasos: a) N-desacetilación, b) N-sulfatación, c) epimerización enzimática del ácido glucurónico en ácido idurónico, d) supersulfatación, e) desulfatación química parcial, f) 6-0 risulfatación selectiva opcional. El proceso se caracteriza por el uso de una enzima C5 glucuronil epimerasa en forma truncada, en solución o inmovilizada. Además, la solicitud de patente de EE.UU. No. 09/732,026 y Li et al. J. Biol. Chem, vol 276, 213 (2001) 20069-20077 han llevado al descubrimiento de un nuevo gen de ratón para la expresión de la enzima C5 epimerasa que contenga la secuencia adicional en la terminal reductor-N que permite la producción de formas completas de la enzima que tiene actividad/estabilidad mas alta con respeto al anterior.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El invento actual refiere a un proceso para la preparación de glicosaminoglicanes sulfatados derivados de N-acetilheparosano que consiste de los siguientes pasos: a) N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N- acetilheparosano aislado de fuente natural o recombinante bacteriano, b) Epimerización enzimática a través de la enzima C5-epimerasa glucuronil, c) O-sulfatación parcial combinada con una O-desulfatación parcial, d) 6-0 sulfatación parcial e) N-risulfatación consiste además de un paso de despolimerización intermedia controlada llevada a cabo después de los pasos b), c) o d) y en el cual tal proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en el paso c) se lleva a cabo usando una fracción molar entre el agente de sulfatación y los hidroxilos del N-acetilheparosano menor o igual a 5, de mas preferencia menor a 2.5 o hasta de mas preferencia menor a 1.5 y que la 60-sulfatación parcial en el paso d) se lleva a cabo usando una fracción molar entre el agente de sulfatación y los hidroxilos de N-acetilheparosan igual a o menor a 2. Según una incorporación preferida, la despolimerización intermedia se lleva a cabo después de la epimerización del paso b).

Se llevan a cabo tanto la O-sulfatación parcial y 60-sulfatación parcial con agentes de sulfatación seleccionados entre: trietilamina-S03, trimetilamina-S03, piridina-S03 en un solvente polar aprótico de preferencia no-donadores de grupos formil, tales como tetrametilenosulfona, 2, 4-dimetilsulfona, ?,?,-dimetilacetamida o ?,?,-dietilacetamida. Opcionalmente el proceso comprende un paso de selección de afinidad en la matriz que lleva la antitrombina III o sus fragmentos. El invento también se refiere a glicosaminoglicanes sulfatadas K50S60SNS-epi obtenidos según el proceso descrito para uso farmacéutico. Estos productos se caracterizan por un grado de 60-sulfatación arriba de 40 % y de preferencia entre 50% y 85%, muy cerca a los valores de heparina extraída y por la presencia, en el terminal reductor, de un residuo de anhidromanitol, de preferencia sulfatado, en las posiciones 1, 3 y 6. También se caracterizan por un grado de sulfatación del grupo hidroxilo en las posiciones 1 y 6 del anhidromanitol igual a o mayor a 20% y según un aspecto preferido, por la ausencia total de grupos formil de amino azúcar. Según el invento, los glicosaminoglicanes muestran una actividad biológica anti-factor Xa en plasma mayor a aquella de heparinas biotecno lógicas obtenidas según los métodos del arte anteriores y una proporción entre actividad anti-Xa y anti-IIa igual o mayor de 1, semejante a las heparinas extraídas. Los productos obtenibles según el proceso del invento: a) son capaces de liberar un inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) de las células del endotelio vascular igual a las heparinas extraídas o mayor, b) son especialmente resistentes a la degradación con enzimas hidrolíticas tales como heparinasa I, c) son capaces de inhibir la liberación de trombina y proteasa factor Xa, d) muestran una baja afinidad con el factor PF4 (factor de plaquetas 4). Según otro aspecto, el invento refiere a heparinas biotecnológicas (heparosanos N-acetilo modificados) obtenidas según el proceso del invento para uso terapéutico y a los compuestos farmacéuticos que contienen tales productos como principios activos. Según otro aspecto, el invento está relacionado con el uso de productos obtenidos para la preparación de drogas con actividades antitrombóticas y anticoagulantes semejantes a la heparina, para la preparación de medicamentos profibrinolíticos y antiagregantes y para la preparación de medicamentos para la profilaxis y el tratamiento de afecciones tromboembólicos causadas por una falta congénita o adquirida de antitrombina III. Otro aspecto del invento esta relacionado a la preparación de intermediarios O-sulfatados, K50SN¾-epi y K50S60SNH2-epi que llevan el grupo amínico de amino azúcar libre, de preferencia libre de grupos formil en el cual tales intermediarios se pueden aislarse y ser usados en la preparación de derivados heparosanos N-sulfatados y/o N-acetilados.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un espectro 1 C-NMR de la región anomérica del polisacárido K5 N-sulfatado-epimerizado como se describe en el ejemplo 1. La Figura 2 es un espectro 'H-NlVfR del producto obtenido en el ejemplo 1. La Figura 3 es un espectro ^-NMR del producto obtenido en el ejemplo 2. La Figura 4 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 3. La Figura 5 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 4. La Figura 6 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 5. La Figura 7 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 6. La Figura 8 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 7. La Figura 9 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 8. La Figura 10 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 9. La Figura 11 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 10. La Figura 12 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 11.

La Figura 13 es un espectro C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 12. La Figura 14 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 13. La Figura 15 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 14. La Figura 16 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 15. La Figura 17 es un espectro 13C-NMR del producto obtenido en el ejemplo 16. La Figura 18 es un espectro 'H-NMR del producto obtenido en el ejemplo 18.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO Según un aspecto principal, el invento está relacionado a un proceso para la preparación de glicosaminoglicanes sulfatados derivados de N-acetilheparosanos y llamados para propósitos de este invento, "Heparinas biotecnológicas", que consiste en los siguientes pasos: a) N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N- acetilheparosano aislado de una fuente natural o recombinante bacteriano, b) Epimerización enzimática a través de la enzima C5-epimerasa glucuronil, c) O-sulfatación parcial combinada con una O-desulfatación parcial, d) 6-0 sulfatación selectiva parcial e) N-risulfatación, en el cual este proceso además consiste en un paso intermedio de despolimerización controlada llevada a cabo de manera alterna después del paso b) o c) o d) y en el cual dicho proceso esta caracterizado por el hecho de que las O-sulfataciones son parciales, en el cual en el paso c) eso se logra usando una fracción molar entre el agente de sulfatación y los grupos hidroxilos de substrato (heparosano N-acetilo epimerizado) menor o igual a 5, de mas preferencia menor o igual a 2.5 o, de todavía mayor preferencia, menor o igual a 1.5 y un tiempo de sulfatación menor a 10 horas. Una 60-sulfatación parcial según el paso d) se obtiene usando una fracción molar entre el agente de sulfatación y los grupos hidroxilos del substrato (heparosano N-acetilo eqimerizado) menor o igual a 2, o de mas preferencia menor o igual a 1.5 y un tiempo de sulfatación menor a 2 horas, o hasta de mas preferencia, menor o igual a 90 minutos, o hasta de todavía mas preferencia, menor o igual a 60 minutos a una temperatura que consta de entre 4°C y 30°C, de preferencia entre 10°C y 25°C. Se llevan a cabo la O-sulfatación parcial según el paso c) y la 60-sulfatación parcial del paso d) con agentes de sulfatación conocidos en un solvente polar aprótico de preferencia no-donador de grupos formil, de mas preferencia seleccionado de: N, N, dialquilo acetamida (de mayor preferencia ?,?,-Dimetilacetamida o N,N, Dietilacetamida) y sulfolanos (de preferencia tetrametileno-sulfona o 2,4-Dimetilenosulfolano).

El uso de un solvento orgánico no-donador de los grupos formil combinado a condiciones de sulfatación parcial lleva a productos caracterizados por la falta de los grupos formil y sus derivados en la amino azúcar y a una distribución de los grupos sulfates similares a aquella de heparinas extraídas. Según el proceso del invento, se lleva a cabo despolimerización controlada como paso intermedio, que significa de manera alterna después del paso b), c) o d) y no en la fase final como se describió en el are anterior. De preferencia se lleva a cabo en un polisacárido de heparosano epimerizado N-sulfatado antes o después del paso c) de la O-sulfatación parcial. Se puede llevar a cabo a través de métodos físicos incluyendo un tratamiento con rayos gamma o a través de métodos químicos incluyendo un tratamiento beta-gamma con ácido nitroso o sus sales o un tratamiento con sales periódicas o un tratamiento de radicales libres. Según un aspecto preferido, el agente de despolimerización es ácido nitroso usado en una cantidad que consiste de 1 a 100 mg sal/g de polisacárido. Se lleva a cabo la reacción a una temperatura que consiste de entre 4 y 10°C. De mayor preferencia, se lleva a cabo la polimerización controlada durante menos de 30 minutos en la presencia de nitrito de sodio y se terrnina agregando un exceso molar de hidruro de borosodio. La despolimerización intermedia permite la obtención de un producto de peso molecular bajo, de preferencia con un peso molecular menor o igual a 15000 Da, de mayor preferencia que consta de entre 3000 y 9000 Da, que lleva un residuo anhidromanitol al terminal reductor que muestra, además de la sulfatación hidroxilo en la posición 6, como en heparinas extraídas, la sulfatación hidroxilo en las posiciones 1 y 3. Sin embargo, el proceso es compatible también con una despolimerización más que se lleva a cabo al final del proceso. Se ha observado que, cuando se lleva a cabo la despolimerización en una fase intermedia, los productos finales tienen actividad anticoagulante y antitrombótica y una proporción entre anti Xa y anti Ha, sorpresivamente mas alta que aquellas encontradas en productos con el mismo peso molecular pero que se obtuvieron después de una despolimerización llevada a cabo después de los pasos de sulfatación/desulfatación y 60-sulfatación, como se demuestra en los datos mostrados en la tabla 1. Según una incorporación preferida del proceso, de preferencia el heparosano N-acetilo polisacárido es derivado de de E. coli K5. El proceso además y opcionalmente puede consistir de una fase final de enriquecimiento de los productos que resultan de los pasos a)-e), que consiste en una cromatografía de afinidad en antitrombina III como se describe en OK et al. FEBS Lett 1976, 66:90-93. Se llevan a cabo N-desacetilación y N-sulfatación según los métodos del arte anteriores que consisten en una hidrólisis alcalina llevada a cabo a una temperatura que consiste de entre 30 y 80°C, de preferencia entre 40 y 60°C, durante un período de tiempo que consiste de entre 10 y 30 horas, de preferencia entre 15 y 20 horas, seguido por un tratamiento, por un período de tiempo de hasta 12 horas a 20-65°C con un agente de sulfatación, de preferencia piridina-trióxido de azufre en carbonato de sodio.

Se lleva a cabo la epimerización en el paso b) con una enzima de epimerasa C5 de glucuronil natural o recombinante en forma inmovilizada. La enzima de preferencia es la recombinante descrita en WO98/48006 o hasta de mayor preferencia la descrita en EE.UU. No. 09/732,026 y de preferencia es expresada y purificada de células de insectos o de cepas de levadura tales como por ejemplo Saccharomyces Cerevisiae, Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Saccharomyces pombe, Kluyveromices lactáis, Kluyveromices fragilis. Se lleva a cabo la inmovilización de la enzima de preferencia en resinas CNBr Sefarosa 4B (Pharmacia) o en resinas polimetacrílicas o poliestirénicas, con grupos epoxídicos o diólicos activados con CNBr, en un tampón NaHC03 100-300 mM o en tampón de fosfato 10-50 mM a pH 7.0-8.3, de mayor preferencia a pH 7.2-7.8, a una temperatura de 4-25° durante 12-72 horas. Según un aspecto mas preferido, la reacción de epimerización se lleva a cabo a una temperatura no mayor a 35°C, de preferencia a una temperatura que consta de entre 15 y 30°C, de mayor preferencia que consta de entre 20 y 25°C.

Se lleva a cabo la epimerización según métodos conocidos, tales como aquellos descritos en WO 01/72848, de preferencia a una temperatura no mayor a 35°C, de mas preferencia de entre 15 y 30°C, o hasta de mayor preferencia de entre 20°C y 25°C. El tampón de epimerización es de preferencia una solución HEPES (de preferencia a una concentración de 25 mM) con pH que consta de entre 5.5-8.0, de mayor preferencia de entre pH 6.5-7.0, y que además consta de el polisacárido N-deacetilado y N-sulfatado, ETDA 10-30 mM, de preferencia 15-25 mM, CaCI2 (o de manera alterna sales de otros cationes divalentes tales como Zn2+ , Ba2+, Mg2+, Mn2+) en concentraciones que constan de entre 70 y 150 mM, de mucha mayor preferencia entre 75-100 mM. Se termostatea la solución a una temperatura que consta de entre 15° y 30°C (de preferencia 20-25°C), de preferencia reciclado a un flujo de 30-240 ml/hora, por un período de entre 1 y 24 horas. La columna contiene, de preferencia, entre 1.2 x 107 a 3 x 1011 cpm equivalentes de la enzima inmovilizada en apoyo inerte termostateado. Las arriba definidas condiciones de operación, en particular la temperatura preseleccionada, estabilizan la enzima C5 epimerasa durante miles de horas, permitiendo un ahorro sorprendente de tiempo y de reactivos para la preparación de la columna de epimerización. Se lleva a cabo la O-sulfatación parcial en el proceso (paso c) a través del uso de agentes sulfatizantes tales como trietilamina-S03, trimetilamina-S03, piridina-S03 en un solvente polar aprótico, de preferencia no-donadores de grupos formil. Se lleva a cabo usando una fracción molar entre el agente de sulfatación y los grupos hidroxilos de substratos menor o igual a 5 o de preferencia menor o igual a 2.5 o de mayor preferencia menor a 1.5, por un período de tiempo igual o menor a 10 horas, de mayor preferencia igual o menor a 8 horas, de preferencia que consta de entre 1 y 6 horas a una temperatura de entre 20 y 70°C, de preferencia entre 30 y 60°C. La O-sulfatación parcial es seguida por una desulfatación parcial llevada a cabo por tratamiento con un agente de desulfatación tal como DMSO en metanol, por un período de tiempo que consta de entre 10 y 240 minutos a una temperatura que consta de 45 a 90°C.

Cada paso del proceso también puede constar de precipitaciones y/o desalinizaciones de polisacáridos intermedios según los métodos conocidos. La 60-sulfatación (paso d) se obtiene a través de agregar un agente de sulfatación en fracción molar con los grupos hidroxilos de substrato igual o menor a 2 o de preferencia menor a 1.5 durante un período de tiempo igual o menor a 2 horas, o de preferencia igual o menor a 90 minutos, de mayor preferencia de entre 4°C y 30°C, de preferencia 10°C y 25°C en un solución con un solvente polar aprótico, de preferencia no-donador de grupos formil. Según una incorporación alterna del proceso, la 60-sulfatación parcial (paso d) se lleva a cabo después de la N-risulfatación y pasos d) y e) se llevan a cabo en orden invertida. De preferencia se lleva a cabo la N-risulfatación (paso e) en un tampón carbonato a través de la agregación de un agente sulfatizante conocido, tal como por ejemplo trietilamina-S03, trimetilamina-S03, piridina-S03. En conclusión, el proceso del invento muestra los siguientes elementos innovadores: O-sulfatación parcial (O-sulfatación y 60-sulfatación), despolimerización llevada a cabo en un paso intermedio y no como paso final y, además, una O-sulfatación y 60-sulfatación parcial llevadas a cabo en un solvente orgánico polar aprótico de preferencia no-donadores de grupos formil. Los derivados N-acetilo-heparosanos obtenidos del proceso del invento actual presentan estructura característica y diferencias biológicas con respeto a heparinas biotecnológicas obtenidas según procesos del arte bien conocidos anteriores.

Desde el punto de vista químico, se definen los polisacáridos del invento como una cadena de polisacáridos mixta representada por la siguiente formula (I) general: Formula (I) en la cual n está en un rango de 3 a 150, Rl puede ser un hidrógeno, un grupo S03 o un grupo acetilo. Rl no presenta otros grupos funcionales tales como grupos formil. R2, R3, R4 y R5 pueden ser hidrógeno o un grupo S03 en el cual Rl, R2, R3, R4, R5 se sustituyen de la siguiente manera: • Rl desde 85 hasta 97% con grupos S03- y/o desde 3% hasta 15% de grupos acetilo y/o desde 0 hasta 12% de H+ • R2 desde 15 hasta 60% con S03- • R3 con grupos S03 a por lo menos 40%, de preferencia desde 50% hasta 85% • Por lo menos 20% de las unidades de ácido glucurónico son no- sulfatadas en las posiciones R4 y R5. En particular los polisacáridos despolimerizados según el proceso del invento muestran en su terminal reductor un residuo anhidromanitol con uno o más hidroxi sulfatados.

Esto ocurre cuando se lleva a cabo la despolimerización en la presencia de ácido nitroso o sus derivados, tales como nitrito de sodio, seguido por tratamiento con hidruro de borosodio, con el fin de obtener los compuestos según la siguiente estructura (II): Formula (II) en la cual Rl, R2, R3 pueden ser hidrógeno o un grupo S03- y de preferencia en el cual: • Rl está dentro del rango de 0 a 100% de S03- • R2 desde 0 hasta 100% de S03- • R3 desde 0 hasta 100% de S03- De preferencia Rl y R3 constan de desde 20% hasta 85% de S03- y R2 desde 15 hasta 60% de S03-. Los productos preferidos son aquellos cuyo peso molecular es menor o igual a 15000 Da, o de preferencia que consta de 1500 a 15000 Da, de mayor preferencia todavía, desde 3000 hasta 9000 Da. Los productos obtenidos según el invento son diferentes desde el punto de vista estructural comparados con los productos del arte anterior, por la presencia de señales múltiples en la región del espectro 13C NMR que consta de 79 a 89 ppm, en particular desde 80 a 86 ppm, que son en exceso con respecto a señales características del anhidromanitol (vea figura 10 que muestra el espectro 13C NMR a alta resolución de la muestra preparada en el ejemplo 9) y que indica la presencia de anhidromanitol de forma diversa sulfatado en particular en los hidroxilos en las posiciones 1 y 6, en productos de peso molecular bajo preparados según el proceso del invento con una despolimerización intermedia. Más particularmente los productos obtenidos según el proceso del invento son diferentes por la sulfatación de los hidroxilos en la posición 1 del anhidromanitol como se muestra el incremento de la señal en la región a 67-68 ppm y por el decremento de la desaparición de la señal en una región a 61-63ppm en el espectro 13 C NMR. Se muestra la diferencia comparando el espectro de la figura 11 (que corresponde al polisacárido producido como se describe en el ejemplo 10) y el mostrado en la figura 9 (polisacárido producido como se describe en el ejemplo 8). Son mas evidentes estas diferencia por medio de NMR bidimensional según el método descrito en Guerrini et al. Seminars in Thrombosis and Hermostasis, vol 27, 5, 473-482, 2001. La característica principal de estos regiones se derive de la sulfatación parcial o total de los grupos hidroxilos disponibles de anhidromanitol que se forman en el terminal reductor del polisacárido durante la despolimerización, cuando esto se lleva a cabo antes del paso de sulfatación y en particular por la sulfatación de los hidroxilos en las posiciones 1 y 6. Otra característica de los productos del invento con respecto a los productos y el procedimiento del arte anterior (tales como, por ejemplo, aquellos que se muestran en los ejemplos experimentales comparativos 6 y 7 de la solicitud actual) es la ausencia de las señales a 7-9.5 ppm en el espectro 1H NMR y a 51 hasta 165 ppm en el especto 13C NMR que indica la ausencia de grupos químicos diferentes a un grupo amínico libre o a un grupo acetilo o del grupo sulfato en la glucosamina en todos los productos derivados con peso molecular bajo o alto. Por lo contrario, usualmente están presentes estas señales en productos derivados de los procesos en los cuales se llevan a cabo la sulfatación de N-acetilo heparosano en donadores solventes orgánicos de grupos formil tales como N,N, formamidas de dialquilo. Los glicosaminoglicanes sulfatados obtenidos según este invento muestran una actividad anticoagulante medida como anti-factor Xa en la presencia de plasma, más alta que aquella de las heparinas biotecnológicas obtenidas según métodos conocidos de modiñcación. Además, muestran una proporción entre actividad anti Xa y anti Ha igual o mayor a 1, muy semejante a la de heparinas extraídas. En particular los nuevos productos muestran: a) una actividad inhibidora del factor Xa mayor a 50 IU/mg, de mayor preferencia mayor a 70 IU/mg en pruebas llevadas a cabo en la presencia de plasma humana. Se mide la actividad del factor anti Xa de preferencia como se describe en Ten Cate H et al. Clin. Chem 3,860-864 (1984) o en la Farmacopea Europea 1997 3ra edición. Es sorpresivamente mas alta esta actividad biológica en la presencia de plasma que aquella de heparinas biotecnológicas producidas con procesos del arte anteriores, y es semejante a aquella medida para heparinas extraídas con peso molecular alto o bajo, b) una capacidad de activación del TFPI (inhibidor de la vía del factor tisular, descrito en Bronze GJ Jr et al. Blood 71, 335-343, 1988) igual o mayor a aquella de heparinas extraídas, c) ima proporción de actividades anti Xa/anti Ha igual o mayor a 1 a peso molecular comparable. De mas preferencia la proporción es mayor a 1.5, d) una resistencia a digestión de heparinasa I igual o mayor a aquella de heparinas extraídas, e) la capacidad de inhibir la liberación de proteasa del factor trombina y Xa, f) baja afinidad para el factor PF4 (factor plaquetario 4) La capacidad de activación de TFPI de células vasculares endoteliales aumentan la actividad antitrombótica y antiinflamatoria de estos productos y extiende y mejora las indicaciones terapéuticas para la trombosis venosa profunda en procedimientos quirúrgicas, complicaciones isquémicas de angina inestable y en infarto agudo de miocardio y en eventos isquémicos. La capacidad de inhibir la producción de proteasa, combinada con el incremento en la producción de TFPI, permite mayor extensión de las indicaciones terapéuticas de estos productos en el tratamiento de sepsis y en sus complicaciones tales como la coagulación intravascular diseminada (CID) y en el tratamiento de enfermedades causadas por la falta congénita o adquirida de antitrombina III.

Se lleva a cabo la determinación de la actividad en el factor TFPI después de tratamiento con los productos del invento, por ejemplo In Vitro en células HUVEC según el proceso descrito en Gory AM. Et al. Thromb. Haemostasis:81 :589-593 (1999). Los derivados de N-acetilo heparosanos obtenidos según el invento (heparinas biotecnológicas) son particularmente resistentes a la degradación con enzimas hidrolíticas tales como la heparinasa I. Esta característica, junto con la posibilidad de obtener productos de bajo peso molecular, en si incrementa la biodisponibilidad y disminuye el riesgo hemorrágico asociado con su uso y los efectos colaterales con respecto a heparinas de peso molecular alta, junto con una actividad del anti-factor Xa alta y un bajo grado de sulfatación, permite su uso no solamente para administración parenteral sino también para administración oral. Como se ha mencionado con anterioridad, el producto obtenido con el proceso del invento muestra la capacidad de inhibir la generación de proteasa trombina y el factor Xa. Se lleva a cabo de preferencia la inhibición de generación de proteasas en plasma con ausencia de fibrinógeno. Se monitorea la inhibición tanto de trombina (factor II) como la generación del factor Xa de preferencia usando un método amidolítico para el sistema de coagulación intrínseco así como para el extrínseco. Según ambos métodos, en ambos sistemas que se usaron, los productos derivados del invento muestran una actividad inhibidora fuerte tanto en la trombina como en el factor Xa y esta característica mejora el perfil antitrombótico de estos productos.

Los productos obtenidos según el proceso del invento además están dotados de una baja afinidad para el factor PF4 (factor de plaquetas 4) que se puede medir en plasma como actividad anti-Xa residual después de agregar una cantidad fija del factor PF4 a la solución que contiene las heparinas biotecnológicas. La actividad anti-Xa residual calculada como un porcentaje con respecto a la actividad inicial es mas alta que la obtenida con heparinas extraídas o con heparinas extraídas con peso molecular bajo lo cual indica una baja afinidad con PF4. Esta afinidad de vinculación mas baja mejora el perfil clínico de los productos obtenidos según el invento ya que disminuye el riesgo del inicio de trombocitopenia inducida por heparina (????). Aunque el peso molecular preferido de los productos obtenibles es menor a 15000 Da, o de mayor preferencia es de entre 3000 y 9000 Da, son obtenibles los productos con peso molecular >15000 Da simplemente a través de cambiar las condiciones de despolimerización, mientras se mantiene las propiedades biológicas tales como la actividad anti-Xa alta, la resistencia de heparinasa y el factor de liberación TFPI. En conclusión, las heparinas biotecnológicas producidas según el invento presentan las siguientes características principales: • una región que consta de entre 79 y 89 ppm o mas, precisamente consta de entre 80-86 ppm por 13C NMR caracterizada por la presencia de múltiples señales en exceso con respecto a las señales características del anhidromanitol y un incremento en la señal a 67-68 ppm y/o una disminución de la señal o hasta su desaparición a 61-62 ppm por C NMR. Estas señales indican la presencia de anhidromanitol diversamente sulfatado, en particular sulfatado en las posiciones 1, 3 y 6 y, todavía mas particularmente sulfatado en el hidroxilo en la posición 1 como se enfatizó en la comparación entre los espectros de la figura 11 y la figura 9. • de preferencia la ausencia de señales a 7-9.5 ppm en un espectro [H NMR y la ausencia de la señal a 51 a 165 ppm en el espectro 13C NMR que indica la ausencia de grupos formil. • una actividad anti-Xa (anticoagulante) en plasma mayor a aquella de las heparinas biotecnológicas preparadas según los métodos anteriores del arte. • Una proporción de actividad anti-Xa/factor Ha igual o mayor a la de heparinas biotecnológicas preparadas según los métodos anteriores del arte, de preferencia mayor o igual a 1 o de mayor preferencia mayor o igual a 1.5. • Una resistencia a heparinasa igual o mayor a heparinas extraídas; • La habilidad de inhibir la producción de trombina y factor Xa • Afinidad a PF4 baja Las actividades biológicas de las recién producidas heparinas biotecnológicas son peculiares: en particular una proporción entre la actividad anti-Xa y la actividad anti-IIa igual o mayor a 1, en productos usualmente obtenidos según el arte anterior es menor a 1 indicando una proporción óptima entre actividades antitrombóticas y anticoagulantes que resultan en valores APTT. Tal proporción es similar a aquella para heparinas extraídas. Una característica óptima también con respecto a heparinas extraídas, evaluable por los valores de HCII altos, es una mejor inhibición directa de trombina, que implica la posibilidad del uso de productos del invento en afecciones trombóticas-embolíticas y/o vasculares debido a la trombina y en la falta adquirida o congénita de antitrombina III. Según otro aspecto, el invento tiene que ver con el uso de los productos obtenidos según el proceso descrito, solo o formulado en compuestos con excipientes o diluentes adecuadas, farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento anticoagulante y antitrombótico o el profilaxis en sustitución de heparinas extraídas y en la preparación de farmacéuticos con actividad profibrinolítica o antiagregante. Es particularmente adecuado el uso de los productos del invento o compuestos que contienen tales productos como ingrediente activo en la profilaxis y el tratamiento de angina inestable, infarto de miocardio, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, evento isquémico así como para el tratamiento de septicemia y en la prevención de sus complicaciones tales como coagulación intravascular diseminada (CID). Según otro aspecto, el invento tiene que ver con el uso de los productos del invento en la preparación de farmacéuticos para la profilaxis y tratamiento de angina inestable, trombosis arterial, aterosclerosis y en el tratamiento de enfermedades tromboembólicas debidas a la falta congénita o adquirida de antitrombina III.

Los productos pueden ser transportados por micelas o moléculas portadoras, por ejemplo, y resultan especialmente adecuados para uso oral aparte de para uso parenteral. Por lo tanto, el uso tanto oral como parenteral de los compuestos que contienen como principio activo los derivados polisacáridos de N-acetilo-heparosanos producidos con el proceso del invento, en formulaciones apropiadas, representa otro aspecto del invento. Según otro aspecto, el invento tiene que ver con la preparación de intermediarios O-sulfatados con el grupo amínico libre de la amino azúcar y con carencia total de grupos formil y sin ninguna actividad anticoagulante, útil, por ejemplo, en la preparación de los productos finales del invento. Es particularmente preferido el intermedio K5-OS,NH2,epi obtenido y asilado según el proceso descrito en este invento, que se define como una mezcla de cadenas polisacarídicas representadas por la siguiente formula general (III): Formula (III) en la cual n esta en un rango de entre 3 y 150, Rl puede ser hidrógeno o un grupo acetilo con un grado de acetilación dentro del rango de 3% hasta 15%.

Rl no lleva ningún otro grupo funcional, de preferencia no lleva grupos formil; R2, R3, R4 y R5 pueden ser hidrógeno o un grupo S03- en el cual el rango de sulfatación consta de preferencia de entre 30% y 989%. K50SNH2 -epi, (espectro lü NMR mostrado en la figura 16) tiene un peso molecular de preferencia de entre 1500 y 15000 Da o, de mayor preferencia entre 3000 y 9000 Da y se caracteriza por una actividad anticoagulante menor a 10 IU/mg, medida por la actividad anti-factor Xa con un método cromogénico (Coatest Heparin kit, Chromogenix). K50SNH2-epi es útil, por ejemplo, en la preparación de los productos de este invento. K5-OS60SNH2,epi se obtiene y se puede aislar según este invento y se define como una mezcla de cadenas polisacarídicas representadas por la siguiente formula general (IV): Formula (TV) en la cual n está dentro del rango de 3 a 150, Rl puede ser hidrógeno o un grupo acetilo en el cual el rango de acetilación consta de entre 3% hasta 15%. De preferencia Rl no lleva ningún otro grupo funcional, de preferencia no lleva grupos formil; R2, R3, R4 y R5 pueden ser hidrógeno o un grupo S03- en el cual R2, R3, R4 R5 de preferencia se sustituyen de la siguiente manera: R2 desde 15 hasta 60% de S03- • R3 mayor a 40%, de preferencia entre 50 y 85% de S03- y por lo menos 20% de las unidades de ácido glucurónico no son sulfatadas en las posiciones R4 y R5. K5-OS60SN¾ -epi intermedio, (espectro 13C MR mostrado en la figura 15) tiene un peso molecular de preferencia de entre 1500 y 15000 Da o, de mayor preferencia entre 3000 y 9000 Da. El K5-OS60SNH2-epi intermedio se caracteriza por un grupo anímico en un amino azúcar, no-sulfatado y de preferencia libre de grupos formil. También se caracteriza por una actividad anticoagulante menor a 10 IU/mg, medida por la actividad anti-factor Xa con un método cromogénico (Coatest Heparin kit, Chromogenix). El K5-OS60SNH2 -epi intermedio es útil, por ejemplo, en la preparación de derivados N-sulfatados según el invento y no tiene ninguna actividad anticoagulante. En una incorporación particularmente preferida el proceso para la producción de bioheparinas a partir de pobsacáridos bacterianos, tales como el N-acetilo heparosano (K5 polisacárido de E. coli) consta de los siguientes pasos: Preparación y purificación de N-acetilheparosano polisacáridos El material inicial es de preferencia el N-acetilheparosano polisacárido representado por la cadena de las unidades disacarídicas [-4)-GicA a 1-4 GlcNAc-(l-]n compuesto por un ácido D-glucurónico y monómeros de N-acetiol-glucosamina ligado por medio de enlaces ß 1-4. Se puede obtener el polisacárido por ejemplo de la sepa natural de K5 Escherichia coli (sepa Bi 83337/41 serotipo O10:K5:H4) (en este caso el polisacárido es el K5 polisacárido) o de bacteria Pasteurella multocida tipo D, o de los derivados y mutantes de cepas recombinantes de Escherichia coli obtenido por ejemplo como se describe en Finke A, et al. Journal of Bacteriology, 173 (13): 4088-4094, 1991, o en Drake CR, Roberts IS, Jann B, Jann K y Boulnois GJ. FEMS Microbiol Lett. 54 (1-3): 227-230, 1990. Se puede obtener la sepa de Escherichia coli útil en la producción de K5 polisacárido también de colecciones de microorganismos tales como ATCC (American Type Culture Collection-USA) No. ATCC 23506. La cepa de Multocida Pasteurella tipo D se puede obtener de la colección ATCC (ATCC No. 12948). Se obtiene el N-acetilheparosano polisacárido por medio de fermentación y extracción microbiana del caldo de cultivo. Se lleva a cabo la purificación a través de técnicas conocidas, tales como aquellas descritas por ejemplo en la patente WO 01/02597 en la cual se usa el siguiente caldo de cultivo: harina de soya desgrasada 2g/l, K2HPO4 9.7 gr/1, KH2PO4 2 gr/1, MgCl2 0.11 gr/1, citrato de sodio 0.5 gr/1, sulfato de amonio lgr/1, glucosa (esterilizada aparte) 2gr/l, agua q.b a 1000 mi, pH 7.3. De preferencia se inocula un pre-cultivo con una suspensión celular de E. coli Bi 8337/41 (010:K5:H4) derivado de un inclinado de agar tríptico de soya. Se incuba a 37°C durante 24 horas con movimiento. En un paso subsiguiente, se inocula un fermentor que contiene el medio citado, a 0.1% con el arriba mencionado pre-cultivo y se lleva a cabo una fermentación a 37°C durante 18 horas. Durante la ermentación se monitorea el pH, oxígeno, glucosa residual, polisacárido K5 producido y crecimiento bacteriano. Al final de la fermentación se aumenta la temperatura a 80°C durante 10 minutos. Se separan las células del medio a través de centrifugación a 10,000 rpm y se filtra el sobrenadante a través de membranas de filtración con un corte a 1000-10,000 Da para reducir el volumen a alrededor de 1/5. Luego, se precipita el K5 polisacárido por medio de la adición de 4 volúmenes de acetona y se recupera a través de centrifugación. De preferencia se lleva a cabo desproteinización del granulo usando un proteasa tipo II de Apergillus Orizae en un tampón que consta de NaCl 0, 1 M y EDTA 0,15M a pH 8 que contiene SDS a 0.5% a 37°C durante 90 minutos. Se ultrafiltra la solución con membranas de corte de 10,000 Da y luego se precipita el polisacárido con acetona. Normalmente la pureza del polisacárido es mayor a 80%> y se mide con por lo menos uno de los siguientes métodos analíticos: calculo de protones de ácido urónico (método del carbazol) y 13C- NMR, UV y/o contenido de proteína. a) N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido heparosano N-acetilo de fuente microbiana. Se solubiliza una cantidad, de preferencia entre 5 y 10 g, de polisacárido K5 purificado en 200-2000 mi 2N hidróxido sódico y se le permite reaccionar a 40-80°C hasta que se finaliza la deacetilización (por ejemplo, 15-30 horas). Se lleva la solución a la neutralidad. Se mantiene la solución que contiene el polisacárido K5 deacetilado a 20-65°C y se agregan 10-40 g carbonato sódico en un solo paso junto con 10- 40 g de un agente sulfactante seleccionado de entre los reactivos tales como aducios de piridina-trioxido de azufre, trimetilamina-trioxido de azufre, por ejemplo. Se agrega el agente sulfactante en un tiempo de hasta 12 horas. Al final de la reacción, de ser necesario, se lleva a temperatura ambiente la solución, y a un pH de entre 7.5 y 8. Se purifica el producto de las sales a través de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, a través de diafiltración con membranas espirales 1,000 Da (Prepscale Cartridge-Millipore). Se reduce el producto obtenido a volumen hasta obtener una concentración de polisacárido de 10%. De ser necesario, se puede secar con métodos conocidos. Se mide la proporción N-sulfatado/N-acetilado con carbón 13 NMR. b) Epimerización enzimática por medio de glucuronil C5 epimerasa El paso de epimerización C-5 que involucra la epimerización de una paite del ácido glucurónico en ácido idurónico se lleva a cabo con la enzima glucuronil C5 epimerasa (llamado C-5 epimerasa) natural o recombinante ya sea en solución o de preferencia en forma inmovilizada. Para este paso, se usa la anima epimerasa C5 recombinante como se describió en WO 98/48006. De preferencia, la enzima recombinante modificada como se describe en EE.UU. N° 09/732,026 y en Li et al J. Biol. Chem, vol 276, 23, (2001) 20069-20077) y contiene una secuencia adicional en el terminal reductor- N. De preferencia se expresa y se purifica la enzima recombinante de células de insectos o células de levadura que pertenecen de preferencia a los géneros Saccharomyces Cerevisiae, Pichia Pastoris, Pichia methanolica, Hansenula polymorpha, Saccharomyces pombe, Kluyveromices lactis, Kluyveromices fragilis. b.l) Inmovilización de la C-5 epimerasa en resinas. Se puede inmovilizar la enzima recombinante en distintas matrices inertes tales como resmas, membranas o cuentas de vidrio derivados de grupos funcionales por medio de técnicas conocidas tales como bromuro de cianógeno, glutaraldehido, carbodimida o dejando que la enzima reacciona con la resina de intercambio iónico o dejándolo absorberse en membranas. Según una realización preferida, se inmoviliza la enzima en resinas comerciales tales como CNBr Sefarosa 4B (Pharmacia) o en resinas poliesitirénicas o polimetacrílicas (Resindion Mitsubishi) con grupos activados epoxídicos o diólicos-C Br. Es particularmente preferido según el invento la inmovilización de enzima en resina polimetacrílica con grupos diólicos activados con CNBr en tampón NaHC03 100-300 mM a 7.0-8.3 pH, de preferencia 7.2-7.8 pH a una temperatura de 4-25°C durante 12-72 horas. Según el invento, la reacción de enlace de la enzima en la matriz inerte se lleva a cabo en la presencia de un sustrato K5 N-deacetilado, N-sulfatado para evitar que el ligamiento involucre el sitio activo de la enzima con pérdida de actividad. Se lleva a cabo la medida de la actividad de la enzima inmovilizada por medio de permitir que recircule a través de una columna que contiene la enzima inmovilizada, la cantidad de N-deacetilado, N-sulfatado K5 convertible en teoría por medio de cpm en la enzima inmovilizada, disuelta en tampón HEPES 25mM, KC1 0,1 M, Tritón X100 0,01% y EDTA 0,15 M a 7,4 pH a 37°C durante 24 horas con un flujo de 0.5 ml/minuto. Después de purificación a través del método cromatográfico DEAE y de desalinizar en Sephadex G-10, se liofiliza el producto y se analiza para el contenido de ácido idurónico por medio de la técnica de protón NMR según WO 96/14425. b.2) Epimerización con enzima inmovilizada Se puede llevar a cabo la reacción de C5 epimerización, por ejemplo, como se describe en WO 96/14425, en reacción tampón a pH 7.4 que consiste de preferencia de HEPES 0.04 o Tris 0.05 M, KC1 0.4 M, EDTA 0.06 M y tritón X-100 y uno o mas aditivos tales como, en particular, glicerol o polivinilpirrolidona. Se puede llevar a cabo la reacción como se describe en WO 01/72848 en el cual se usa una solución que contiene HEPES 25 mM, CaC12 50 mM a 7.4 pH, a una temperatura de 30-40 °C. Particularmente preferido son las condiciones de reacción de temperatura y tampón que permiten que la actividad de la epimerasa C5 glucoronil sea duradera y estable aun después de inmovilización en una columna. Se permite circular a un flujo de 30-240 ml/hora por un tiempo que consta de entre 1 y 24 horas, 20-1000 mi de solución acuosa que contiene 0.001-10 g K5 N-deacetilado, N-sulfatado y 10-30 mM EDTA, de preferencia 15-25 mM, 25 mM HEPES, CaC12 a una concentración de entre 70 y 150 mM (de preferencia 75-100 mM) a pH 5.5-8.0 en una columna que contiene entre 1.2 x 107 y 3 x 1011 equivalentes de la enzima inmovilizada en un medio termostático de entre 15°C y 30°C (de preferencia entre 20-23°C) inerte a una temperatura que consta de entre 15°C y 30°C, de preferencia entre 20 y 25°C. Las arriba mencionadas condiciones de temperatura y tampón incrementan la estabilidad de la enzima en columna durante un período de trabajo mayor a 3000 horas y, por lo tanto, hace particularmente ventajoso el proceso. Al final de la reacción, se purifica la muestra pasándola por una resina DEAE o cartucho DEAE Sartobind y precipitándola a través de la adición de 2M NaCl y, finalmente se desaliniza en G10 Resina Sephadex (Pharmacia) o se purifica a través de la precipitación con 2 volúmenes de etanol y se pasar a resina IR 120H+ para obtener la sal sódico. El producto obtenido bajo dichas condiciones preferidas tiene una velocidad de epimerización medida por la técnica MR protón como se describe en WO 96/14425, de por lo menos 50% (velocidad de ácido idurónico en total de ácidos urónico).

Despolimerización controlada. El producto obtenido en el paso b) o c) o d) sufre despolimerización controlada con técnicas conocidas tales como la deaminación con ácido nitroso como se describe en WO 82/03627 o a través de apertura oxidativa con periodato de sodio (EP 287477), o a través de tratamiento con radicales libres (EP 121067) o a través de beta-eliminación (EP 40144), o a través de tratamiento con rayos gamma (EE.UU. 4,987,222) para obtener fracciones de peso molecular que consta de preferencia entre 1500 y 15000 D, o de todavía mayor preferencia entre 3000 y 9000 Da.

Según una incorporación preferida del invento, se lleva a cabo despolimerización controlada antes de los pasos de sulfatación. En particular, su sujeta el producto que resultó de los pasos anteriores a despolimerización controlada con ácido nitroso o con nitrito de sodio. En este caso la cantidad de sal a usar consta de entre 1 y 100 mg por cada gramo de polisacárido, seguido por reducción con hidruro de borosodio en exceso. Según una segunda incorporación preferida, se disuelve la muestra en 50-250 mi de agua a 4°C y se acidifica con 1N ácido cloruro. Luego se agrega una cantidad de nitrito de sodio que consta de entre 5 y 500 mg y se sigue la reacción durante menos de 60', de preferencia, menos de 30'. Después de la destrucción del hidruro de borosodio en exceso, se recupera el producto a través de precipitación con 3 volúmenes etanol y se seca en un horno de vació. Cuando se lleva a cabo la despolimerización al final del proceso, se puede llevar a cabo como se describe, por ejemplo, en WO 01/72848. c) O-suIfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial Se resuspende en agua a una concentración de 10% el producto derivado de los arriba mencionados pasos. Se enfría la solución a 10°C y mientras se mantiene la temperatura a 10°C se pasa a través de una resina de intercambio catiónico IR- 120 IT1". Después de pasar la solución a través de la resina se lave con agua deionizada hasta que el pH eluato es mayor a 6. Se lleva la solución ácido a neutralidad a través de la adición de una amina terciaria o una sal de amonio tal como una solución acuosa a 15% de hidróxido de tetrabutilamonio para obtener la sal de amonio relevante. Se puede concentrar la solución a un volumen mínimo y liofilizarla. Se suspende el producto obtenido en 10-1000 mi de un solvente orgánico que consta de, de preferencia sulfolano o 2,4-dimetilsulfolana. De manera alterna, el solvente orgánico puede ser dimetilformamida (DMF) o dimetilsulfoxida (DMSO) o ?,?,-dimetilacetamida. Se agrega este solvente orgánico con el agente sulfatante, por ejemplo un piridina aducto -S03 en forma sólida o en solución con los mismos solventes que se usaron con anterioridad. La fracción molar entre el agente sulfatante y el substrato polisacarídico (K5 N-sulfatado epimerizado), que debe de ser la proporción entre el agente sulfatante y los moles del dímero de polisacárido, se mantiene igual o menor a 5 o, de mayor preferencia, menor a 2.5 o, de todavía mayor preferencia menor a 1.5. Se mantiene la solución a una temperatura de entre 20 y 70°C, de preferencia de entre 30 y 60°C por un período de tiempo menor o igual a 10 horas, de mayor preferencia igual o menor a 8 horas y de todavía mayor preferencia menor o igual a 6 horas. Al final de la reacción, se enfría la solución eventualmente a temperatura ambiente y se le agrega acetona saturada con cloruro de sodio hasta lograr la precipitación completa del polisacárido. Se separa el precipitado del solvente a través de filtración, se solubiliza con una cantidad mínima de agua deionizada y se le agrega cloruro de sodio hasta obtener una solución de 0.2 M. Se lleva la solución a un pH de 7.5-8 por medio de la adición de hidróxido de sodio 2N. Se agrega acetona luego para completar la precipitación. Se separa el precipitado del solvente por medio de filtración. Se solubiliza el sólido obtenido con 10-100 mi de agua deionizada y se purifica de sales residuales a través de ultrafíltración. Se liofiliza un alícuota para análisis estructural del producto parcialmente O-sulfatado por medio de 13C-NMR y 1H-NMR. Se pasa la solución que contiene el producto parcialmente sulfatado a través de una resina de intercambio catiónico IR-120+ o su equivalente. Se lava la resina con agua deionizada hasta que el pH del eluato es mayor a 6 y luego se le agrega piridina. Se concentra la solución a un volumen mínimo y se liofiliza. Se trata el producto con 20-200 mi de una solución de DMSO/metanol (9/1 V V) y se mantiene la solución a 45-90°C durante 10-420 minutos. Al final se agrega a la solución 10-200 mi de agua deionizada y se trata con acetona saturada con cloruro de sodio para completar la precipitación. Se purifica el sólido obtenido a través de diaíiltración según técnicas conocidas y se liofiliza un alícuota para análisis estructural por medio de 13C-NMR. d) 6-0 sulfatación parcial Posteriormente se 60-sulfata el producto del paso anterior. Se mide el contenido de grupos de sulfates en la posición 60 por medio de técnicas conocidas tales como, por ejemplo NMR según las condiciones descritas en Guerrini et al. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, vol 27, 5, 473-482, 2001. Se resuspende el producto obtenido en agua a una concentración que consiste de entre 5 y 10% y se mantiene a temperatura ambiente. En seguida se pasa la solución a través de una resina que tiene un intercambio catiónico IR-120 o su equivalente. Después del flujo de la solución, se lava la resina con agua deionizada y se lleva a neutralidad con amina terciaria o sal de amonio cuaternario, por ejemplo hidróxido de tetrabutilamonio en solución acuosa que contiene las sales de amonio relevantes. Se concentra la solución a un volumen mínimo y se liofiliza. Se suspende el producto obtenido en 10-1000 mi de un solvente orgánico que contiene dimetilformamida de preferencia, en sulfolano o en 2,4-dimetilsulfolano o en ?,?-dimetilacetamida y se agrega con un agente sulfatante tal como aducto de piridina -S03 en forma sólida o en solución con el mismo solvente. Se lleva la suspensión a una temperatura de entre 4o y 30°C, de preferencia 10 a 25 °C, se trata con una cantidad de un agente sulfatante tal como por ejemplo aducto de piridina- S03 usando menos de 2 equivalentes comparado con los grupos hidroxilos que se van a sulfatar o de mayor preferencia con menos de 1.5 equivalentes durante 10-90 minutos y se trata con acetona saturada con cloruro de sodio en la cantidad necesaria para completar la precipitación. Posteriormente se purifica el sólido así obtenido a través de diafiltración según métodos conocidos en el arte. Se liofiliza un alícuota para análisis estructural por medio de 13C-NMR. e) N-risuIfatación Se lleva a 20-65 °C la solución del paso d) que contiene el polisacárido 60 sulfatado y se agrega 10-100g de carbonato sodio en una única adición y 10-100 g de un agente sulfatante seleccionado de entre reactivos disponibles tales como, de preferencia, el piridina-anhídrido sulfúrico. Se lleva a cabo la adición del agente sulfatante durante un tiempo de hasta 12 horas. Al final de la reacción, de ser necesario, se lleva la solución a temperatura ambiente, y a un pH que consta de entre 7.5 y 8, de preferencia con 2M hidróxido sódico. Se purifica el producto de sales con métodos conocidos tales como, por ejemplo, diafiltración usando una membrana espiral de 1000 Da (por ejemplo Prepscale cartridge-Millipore). Está completo el proceso cuando la conductividad de permeabilidad es menor a 1000 µß, de preferencia menor a 100 µ8. Se reduce el producto obtenido en volumen hasta obtener una concentración polisacarídica de 10% por medio de filtración. Se liofiiiza un alícuota de la solución concentrada para análisis estructural por medio de 13 C-NMR. Se pueden llevar a cabo la sulfatación 6-0 selectiva y N-risulfatación descritos en este paso, en productos derivados del paso e) en orden distinta, por ejemplo primero la N-risulfatación y luego la 6-0 sulfatación) como se describe en WO 98/42754, sin modificar las actividades biológicas del producto final.

Euriquecimiento en secuencias que ligan la antitrombina ?? (opcional). Opcionalmente se puede purificar aun mas el producto obtenido como se describió en los pasos anteriores, por medio de cromatografía por ejemplo en una columna cromatográfica de intercambio aniónico, tales como por ejemplo columnas DEAE como se describe en Lam L.H. et al. Bioch. And Biophysical Research Communication vol 69, 2, pag. 570-577, 1976. De manera alterna a esta purificación y aparte de esta, se puede sujetar el producto a una cromatografía adicional de afinidad en columnas que llevan la secuencia antitrombina humana parcial o entera como se describe, por ejemplo, en, Hook et al FEBS Lett 1976, 66:90-93 o en la patente EE.UU. 4,692,435 o secuencias péptidas que tengan una alta afinidad con heparina como se describe en Liu S et al. Proc. Nati. Acad Sci USA 1980, 77:6551-6555. Este tratamiento permite la separación, por medio de elución subsiguiente con una solución salina de NaCl de por lo menos una fracción capaz de ligarse a la fase sólida. En la práctica, se carga 10-50 mg del producto derivado del paso de N-risulfatación en una columna de afinidad en el cual se ha inmovilizado 50-100 mg de antitrombina III (Kedrion SpA, Lucca, Italia) en lOmM tampón a 7.4 pH y 0-0.15 M NaCl 4°C. Posteriormente se lava la columna con por lo menos 3 volúmenes de tampón de 10 mM Ttris-HCl, 7.4 pH. Las moléculas que ligan con mayor afinidad a la columna se eluyen por medio de 1 OmM Tris-HCl, 7.4 pH. En seguida se diafiltra por medio de membranas espirales de corte de 1000 Da el material eluido para eliminar sales y se concentra a través de liofilización. Se puede analizar un alícuota por medio del método Carbazol, HPLC, NMR y prueba cromogénica para medir la actividad anti Xa. El material obtenido muestra una mayor actividad anti Xa, enriquecida de entre 1.5 y 3 veces la actividad del material de inicio. Se obtiene el mismo incremento en actividad anti-Xa por medio del tratamiento de heparinas extraídas de la misma manera. Este es otra señal de la semejanza entre heparinas biotecnológicas obtenidas según este invento y heparinas extraídas, en el ligamento a antitrombina III.

PARTE EXPERIMENTAL EJEMPLO 1. Producción de heparina biotecnológica según el proceso del invento. Se han seguido los siguientes pasos: a) preparación de polisacárido N-acetilheparosano iniciando desde Escherichia coli 5 b) N-desacetilación/N-sulfatación c) Epimerizáción d) Despolimerización e) O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial f) 6-0 sulfatación parcial g) N-risulfatación a) Preparación del polisacárido Se obtuvo el polisacárido N- acetilheparosano a través de fermentación de E. coli cepa Bi 8337/41 stock, serotipo O10:k5:H4 (ATCC 23506) y la subsiguiente extracción del caldo de cultivo y purificación según la descripción de la patente WO 01/02597 usando el siguiente caldo de cultivo: 2 gr/1 de harina de soya desgrasada, 9.7 gr/1 de K2HP04, 2 gr/1 de K2HP04, 0.11 gr/1 de MgCl2, 0.5 gr/1 de citrato de sodio, 1 gr/1 de sulfato de amonio, 2gr/l de glucosa (esterilizada aparte), agua q.b a 1000 mi, pH 7.3.

Se inoculó el cultivo con una suspensión celular derivado de un inclinado guardado en agar tríptico de soya a 37°C durante 24 horas con movimiento. Se inoculó el inoculo en fermentar, tipo F5 (industrie Meccaniche de Bagnolo SpA) que contiene el mismo medio mencionado arriba, a 0.1% con el arriba mencionado cultivo en matraz y se llevó a cabo la fermentación a una temperatura de 37°C durante 18 horas. Durante la fermentación se midieron el pH, oxígeno, glucosa residual, polisacárido K5 producido y crecimiento bacteriano. Al final de la fermentación se aumenta la temperatura a 80°C durante 10 minutos. Se separaron las células del medio a través de centrifugación de corte a 10,000 rpm y se filtró el sobrenadante a través de membranas de filtración con un corte a 10,000 Da para reducir el volumen a alrededor de 1/5. Luego, se precipitó el K5 polisacárido por medio de la adición de 4 volúmenes de acetona y se recupera a través de centrifugación. Se llevó a cabo desprotemización del granulo usando una proteasa tipo II de Apergillus Orizae en un tampón que consta de NaCl 0,1 M y EDTA 0.15M apH 8 que contiene SDS a 0,5% a 37°C durante 90 minutos. Se ultrafiltró la solución con membranas con un corte nominal de 10,000 Da y luego se precipitó el polisacárido con acetona. Se midió la pureza del polisacárido por medio de calculo de protones de ácido urónico (método del Carbazol) y protones y 13 MR, UV y contenido de proteína. b) N-desacetilación/N-sulfatación Se solubilizaron 10 g del producto obtenido en el paso a) en 200 mi 2N hidróxido sódico y se le permitió reaccionar a 50°C durante 18 horas. Se llevó la solución a un pH neutral con ácido hidroclórico 6N. Se obtuvo un polisacárido N-deacetilado. Se mantuvo la solución del polisacárido N-deacetilado a 40°C y se agregó 10 g carbonato sódico en un solo paso y 10 g de un aducto de piridrna-trióxido de azufre dentro de 10 minutos. Se purificó el producto obtenido compuesto por K5 polisacárido N-deacetilado, N-sulfatado de las sales a través de diafiltración usando una membrana espiral de 1,000 Da (Prepscale Cartridge-Millipore). Se completó el proceso de purificación cuando la conductividad de permeabilidad era menor a 100 µ?. Se llevó el producto a una concentración polisacarídica de 10% usando el mismo método de diafiltración y posteriormente fue liofilizado. La proporción N-sulfatado/N-acetilado del producto obtenido fue de 9.5/0.5, medida con carbón 13 NMR. c) Epimerización c-1) Inmovilización de la Epimerasa C5 en resina Se disolvieron 5 mg de glucuronil C5 epimerasa recombinante obtenido según el EE.UU. No. 09/732,026 y Li et al J. Biol. Chem., vol 276, 23, (2001) 20069-20077 en 200ml de tampón HEPES 0.25 M, pH 7.4, que contenía 0.1 M de KC1, 0.1 % de Tritón X-100 y 15 mN EDTA. Se agregaron a la solución 100 mg de K5 N-deacetilado, N-sulfatado obtenido según la descripción en el paso b). Se diafíltró la solución en una membrana D 30,000 a 4°C hasta que desapareciera el K5 N-deacetilado, N-sulfatado en el diafiltrado. A la solución que se retuvo en la membrana, se cambió el tampón por medio de diafiltración y fue sustituido con NaHC03 200 mM a 7 pH y después de la concentración a 50 mi, se agregaron 50 mi de resina activada CNBr Sefarosa 4B, y se dejó reaccionar toda la noche a 4°C. Al finalizar la reacción, se midió la cantidad de enzima residual en el sobrenadante con el método Quantigold (Diversified Biotec) después de decantación. Fue ausente la enzima en el sobrenadante, así demostrando que, con el método descrito, se inmovilizó la enzima al 100%. Para ocupar los sitios en la resina dejados disponibles, se lavó la resina con un tampón Tris-HCl 100 mM a 8 pH. Para la medición de la actividad de la enzima inmovilizada, se carga una columna con una cantidad de la enzima en teoría inmovilizada a 1.2 x 107 cpm. En la columna así preparada se trató y se disolvió 1 mg de K5 N-deacetilado, N-sulfatado obtenido según el paso b) en un tampón de 25 mM HEPES, 0.1 M de KC1, 0.015 M EDTA, 0.01 % de Tritón X-100 a 7.4 pH, se permitió que recirculara por dicha columna a 37°C durante la noche con un fluj o de 0.5 ml/minuto . Después de la purificación por medio del método de cromatografía DEAE y desalinización en Sephadex G10, se lioñlizó la muestra y se analizó el contenido de ácido idurónico a través de la técnica de protón NMR según la descripción en la patente WO 96/14425. c-2) Epimerización con enzima inmovilizada Se disolvieron 10 g de polisacárido 5 N-deacetüado, N-sulfatado en 600 mi de tampón de 15 mM EDTA, 25 mN HEPES, 7.0 pH, que contenía 75 mM CaCL2. Se pennitió que la solución obtenida recirculara a través de la columna de 50 mi cargada con una resina que contenía la enzima inmovilizada.

Se llevó a cabo la operación a 28°C con un flujo de 200 ml/h durante 24 horas. Se purificó el producto obtenido por medio de ultrafiltración y se precipitó con etanol. Se resolubilizó el precipitado en agua a una concentración de 10%. El producto obtenido muestra un porcentaje de Epimerización, medido con ^-NMR, como porcentaje de ácido idurónico en el total de ácidos uránicos de 55% (como se muestra en el dibujo 1). d) Despolimerización controlada. La muestra obtenida en el paso c-2) sufrió la degradación controlada con ácido nitroso como se describe en la patente WO 82/03627. En particular, se disolvieron 5 g de la muestra en 250 mi de agua y se llevó a 4°C en un baño termostateado. Con 1 N ácido cloruro se llevó el pH a 2.0 y se enfrió a 4°C y posteriormente, se agregaron 200 mg de nitrito de sodio. De ser necesario, se llevó el pH a 2.0 con 1 N cloruro y se mantuvo a agitación lenta durante 15 minutos. Se neutralizó la solución con 1 N de NaOH enfriado a 4°C. Agregamos 250 mg hidruro de borosodio disuelto en 13 mi agua deionizada y se dejó reaccionar durante 4 horas. Se llevó la solución a 5.0 pH con 1 N ácido cloruro y se dejó 10 minutos para destruir el exceso de hidruro de borosodio, y posteriormente, se neutralizó con 1N de NaOH. Se recuperó el producto a través de precipitación con 3 volúmenes de etanol, y luego, se secó en un horno de vació. El producto obtenido muestra un peso molecular de alrededor de 6000 Da. e) O-sulfatación parcial/ O-desuIfatación parcial Se resuspendió en una solución de agua a una concentración de 10% el producto resultado del paso anterior. Se enfrió la solución a 10°C y mientras se mantiene la temperatura a 10°C se pasó a través de una resina de intercambio catiónico IR- 120 H+. Después del flujo de esta solución, se lavó la resina con agua deionizada hasta que el pH eluato fue mayor a 6. Se llevó la solución ácida a neutralidad a través de la adición de una amina terciaria o una sal de amonio tal como una solución acuosa al 5% de hidróxido de tetrabutilamonio para obtener la sal de amonio. Se concentró la solución a un volumen rnínimo y se liofilizó. Se suspendió la solución resultante en 100 mi N,N,-drmetilacetamida (DMA) y se agregó pirridina-S03. Posteriormente se agregó una cantidad de agente sulfatante con una fracción molar entre el agente sulfatante y el sustrato K5 N-sulfatado epimerizado (como moles hidroxílicos) de 1.25 Se mantuvo la solución a 50°C durante 360 minutos. Al final de la reacción, se enfrió la solución a temperatura ambiente y se le agregó acetona saturada con cloruro de sodio hasta lograr la precipitación completa. Se separó el precipitado del solvente a través de filtración, se solubilizó con una cantidad mínima de agua deionizada y se le agregó cloruro de sodio hasta obtener una solución de 0.2 M. Se llevó la solución a un pH de 7.5 por medio de la adición de 2N hidróxido de sodio y se agregó acetona para completar la precipitación. Posteriormente se separó el precipitado del solvente por medio de filtración. Se solubilizó la solución sólida obtenida con la adición de 100 mi de agua deionizada y se purificó de sales residuales a través de ultrafiltración. Se liofilizó una alícuota para análisis estructural del producto parcialmente O-sulfatado por medio de I3C-NMR. Se pasó la solución que contiene el producto parcialmente sulfatado a través de una resina de intercambio catiónico IR-120+ o su equivalente. Después del flujo de esta solución se lavó la resina con agua deionizada hasta que el pH permeado fue mayor a 6. Se llevó la solución a neutralidad a través de la adición de piridina. Se concentró la solución a un volumen mínimo y se liofilizó. Se trató el producto con 100 mi de una solución de DMSO/metanol (9/1 V/V) y se mantuvo la solución a 65°C durante 240 minutos. Al final se agregó a la solución 200 mi de agua deionizada y se trató con acetona saturada con cloruro de sodio en tal cantidad que se completara la precipitación. Se purificó el sólido obtenido a través de diafiltración según técnicas conocidas y se liofilizó un alícuota para análisis estructural por medio de 13C-NMR. f) 6-0 sulfatación parcial Se resuspendió el producto obtenido en el paso e) en una solución de agua a una concentración de 10% y se mantuvo a temperatura ambiente. En seguida se pasó la solución a través de una resina que tiene un intercambio catiónico IR- 120 H*. Posteriormente se lavó la resina con agua deionizada y se llevó a neutralidad a través de hidróxido de tetrabutilamonio en solución acuosa que contenía las sales de amonio. Se concentró la solución a un volumen mínimo y se liofilizó.

Se suspendió el producto obtenido en 100 mi DMA y se agregó el agente sulfatante de piridina -S03 agregado a la solución de DMA. Se llevó la solución a una temperatura de 10°C y se trató con aducto de piridina- S03 como agente sulfatante con 1.25 equivalentes de agente sulfatante en relación al hidroxilo durante 60 minutos. Se trató la solución con acetona saturada con cloruro de sodio en la cantidad necesaria para completar la precipitación. Posteriormente se purificó el sólido así obtenido a través de diafiltración según métodos conocidos. Se liofilizó un alícuota para análisis estructural por medio de I3C-NMR. g) N-risuIfatación Se solubilizó el producto en agua, llevada a una temperatura de 40°C y se agregó 10 gr de carbonato sódico y 10 gr de piridina -trióxido de azufre aun intervalo de 10 minutos. Al final de la reacción, de ser necesario, se llevó la solución a temperatura ambiente, y en seguida, de ser necesario a un pH menor a 8.0 con NaOH. Posteriormente se purificó el producto de sales con métodos conocidos tales como, por ejemplo, diafiltración con una membrana espiral de 1000 Da (Prepscale cartridge-Millipore). Se acabó el proceso cuando la conductividad de permeabilidad era menor a 1000 µ8, de preferencia menor a 100 µ?. Se redujo el producto obtenido en volumen hasta obtener una concentración del polisacárido de 10% por medio del mismo proceso de filtración. Se muestra el espectro 1H-NMR en el dibujo 2.

La actividad anti-Xa medida en plasma humana de los productos humanos fue 140 IU/mg (véase la tabla 2) y la proporción entre la actividad anti-Xa y la actividad anti-II fue de 2.5 EJEMPLO 2. O-suIfatación con DMF Se repitió el ejemplo 1 con la variación de que en los pasos c) y f) se llevó a cabo la O-sulfatación parcial y la 60-sulfatación parcial usando dimetilformamida (DMF) como solvente orgánico. El producto obtenido mostró una actividad anti-Xa en plasma de 85.9 IU/mg (véase tabla 2). Se muestra el espectro NMR en la figura 3.

EJEMPLO 3. Despolimerización controlada en la presencia de 50 mg/gr de sustrato de nitrito de sodio Se repitió el ejemplo 1 con la diferencia de que se llevó a cabo la despolimerización con 50 mg de nitrito de sodio por g de polisacárido con el fin de obtener un peso molecular de alrededor de 4200 Da. El producto obtenido mostró una actividad anti-Xa en plasma de 60.1 1 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro C-NMR en la figura 4.

EJEMPLO 4. La producción de heparinas biotecnológícas que tengan un peso molecular de alrededor de 8000 Da (despolimerización controlada con 20 mg/g sustrato de nitrito de sodio) Se repitió el Ejemplo 1 con la diferencia de que en el paso d) se llevó a cabo la despolimerización controlada con 20 mg nitrito de sodio por g de polisacárido con el fin de obtener un peso molecular de alrededor de 8000 Da.

El producto obtenido mostró una actividad anti-Xa en plasma de 150 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro 13C-NMR en la figura 5.

EJEMPLO 5. La producción de heparinas biotecnológicas que tengan un peso molecular de alrededor de 20,000 Da Se llevó a cabo el ejemplo no. 5 según los siguientes pasos: a) preparación del polisacárido N-acetilo parosano iniciando desde Escherichia coli K5; b) N-deacetilización/N-sulfatación; c) Epimerización; d) O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial; e) 6-0 sulfatación parcial/N-risulfatación. Los pasos a)-c) corresponden a los pasos respectivos del ejemplo 1, y en el cual, por falta de la despolimerización (paso d), el paso d) corresponde al paso e) en el ejemplo 1 y el paso e) corresponde a los pasos f) y g) en el ejemplo 1. El producto final obtenido tenía un peso molecular de alrededor de 20,000 Da, y es susceptible a la despolimerización. La actividad anti-Xa en plasma fue de 135 IU/mg (véase tabla 2). Se muestra el espectro 13C- NMR en la figura 6.

EJEMPLO 6. La producción de heparinas biotecnológicas que tengan un peso molecular de alrededor de 15000 Da (despolimerización controlada con 5 mg/g sustrato de nitrito de sodio) Se repite el ejemplo 1 bajo las mismas condiciones de temperatura y tiempo usadas en el paso d) pero se llevó a cabo la despolimerización controlada con nitrito de sodio con 5 mg de nitrito de sodio por g de polisacárido con el fin de obtener un peso molecular de alrededor de 15,000 Da. El producto obtenido mostró una actividad anti-Xa en plasma de 180 IU/mg (véase tabla 2); se muestra el espectro 13C-NMR en la figura 7.

EJEMPLO 7. Proceso para la preparación de heparina biotecnológica según las técnicas conocidas. En este ejemplo se usaron las condiciones del proceso de Osuper sulfatación y 60-sulfatación descritas en WO 01/72848 y WO 02/50125. De manera breve, se llevó a cabo la supersulfatación en dimetilformamida a 50°C durante 18 horas, la O-desulfatación a 65°C durante 150 rninutos y la 60-sulfatación en dimetilformamida a 0°C por 90 minutos. El producto final mostró un peso molecular de alrededor de 20,000 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 45 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro WO 01/72848 y WO 02/50125 en la figura 8.

EJEMPLO 8. La producción de hepariñas biotecñológicas según técnicas del arte anteriores. Se llevó a cabo el ejemplo usando las mismas condiciones de supersulfatación y 60-desulfatación como en WO 01/72848 y WO 02/50125: de manera breve, se llevó a cabo la supersulfatación en dimetilformamida a 50°C durante 18 horas, la O-desulfatación a 65°C durante 150 minutos y la 60-sulfatación en dimetilformamida a 0°C durante 90 minutos. Además, se llevó a cabo un paso de despolimerización al final del proceso de sulfatación como se describe en WO 01/72848 y WO 02/50125 en la presencia de 40 mg/g de sustrato de nitrito de sodio a 4°C durante 15 minutos. El producto final obtenido tiene un peso molecular de alrededor de 6,000 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 31.5 IU/mg. Se muestra el espectro 13C-NMR en la figura 9.

EJEMPLO 9. La producción de heparinas biotecnológicas: control de las condiciones de despolimerización y sulfatación. Se repitió el ejemplo 1 con las siguientes variaciones: Se llevó a cabo la despolimerización controlada (paso d) en el ejemplo 1) con 40 mg de nitrito de sodio por g de 5NS epimerizada bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura que en el ejemplo 1. El peso molecular obtenido fue de alrededor de 6,500 Da. Se llevó a cabo la sulfatación parcial (paso e) del ejemplo 1 con una fracción molar de 5 entre el agente sulfatante y el sustrato K5N-sulfatado epimerizado durante un período de 180 minutos, mientras que se hizo la O-desulfatación durante 60 minutos. El producto obtenido mostró una actividad anti-Xa en plasma de 89 IIU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro 13C-NMR en la figura 10.

EJEMPLO 10. La producción de heparinas biotecnológicas: control de las condiciones de despolimerización y sulfatación. Se repitió el ejemplo 1 y se llevó a cabo la despolimerización intermedia (paso d) en el polisacárido K5-N bajo las mismas condiciones de tiempo y temperatura descritas en el Ejemplo 9 pero usando 40 mg de nitrito de sodio por mg de K5NS epimerizado para obtener un peso molecular de alrededor de 6,500 Da. Se llevó a cabo la sulfatación parcial que corresponde al (paso e) en ejemplo 1) usando una fracción molar de 0.6 entre el agente sulfatante y el sustrato K5N-sulfatado epimerizado en un tiempo de incubación de 8 horas. Se llevó a cabo O-desulfatación durante 30 minutos. El producto obtenido mostró una actividad anti-Xa en plasma de 101 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro 13C- MR del producto obtenido según este ejemplo en la figura 11.

EJEMPLO 11. La separación de fracciones de polisacáridos que tengan una gran afinidad con antitrombina III por medio de la selección en una columna de afinidad. Se preparó un polisacárido según el Ejemplo 1. Después del paso g) de N-risulfatación, se pasó el producto por una columna de afinidad de la siguiente manera: Se cargó 20 mg del producto derivado del paso g) del ejemplo 1 en una columna de resina CNBr sefarosa 4B (Pharmacia), en el cual previamente se había inmovilizado, según las técnicas conocidas, 100 mg de antitrombina III humana (Kedrion SpA, Lucca, Italia) en tampón de lOmM Tris-HCI a 7.4 pH y 0-0.15 M NaCl a 4°C. Después de un período de 60 minutos de ligamento, se lavó la columna con por los menos 3 volúmenes de tampón de 10 mM Ttris-HC1, 7.4 pH. Las moléculas que ligaron con mayor afinidad a la columna se eluyen por medio de la adición de un gradiente de lOmM Tris-HCl, 7.4 pH que contenía 2M aCl. Se diafiltró por medio de membranas espirales de corte de 1000 Da el material eluido para eliminar sales y se concentró a través de liofilización. El producto final obtenido mostró un peso molecular de 8,500 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 300 lU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el especio 13C-NRM en el dibujo 12.

EJEMPLO 12. La producción de heparinas biotecnológicas que tengan un peso molecular de alrededor de 6000 Da. Se repitió el ejemplo 5 pero después del paso de N-resulfatación, se despolimerizó el producto bajo las mismas condiciones como se describió en el paso d) del ejemplo 1. El producto final obtenido tenía un peso molecular de alrededor de 6,000 Da y una actividad anti-Xa en plasma de 65 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro I3C-NRM en el dibujo 13.

EJEMPLO 13. Producción de heparinas biotecnológicas: control de las condiciones de sulfatación.

Se repitió el ejemplo 1 variando la O-sulfatación (paso e) del ejemplo 1, que se llevó a cabo con una fracción molar de 5 entre el agente sulfatante y el sustrato de K5-sulfatado epimerizado durante 8 horas a 50°C. El producto obtenido mostró una actividad anti-Xa en plasma de 75 IU/mg. Se muestra el espectro 13C-NRM en la figura 14.

EJEMPLO 14. Preparación de K5-OS60SNH2,epi intermedio (intermedio no-re-sulfatado de heparina biotecnológica). Se repitió el ejemplo 1 sin el último paso de resulfatación. El producto final tenía un peso molecular de alrededor de 6,000 Da y una actividad anti-Xa de 5 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro 13C-NRM en el dibujo 15.

EJEMPLO 15. Preparación de K5- OS,NH2,epi intermedio (intermedio de heparina biotecnológica antes de los pasos de desulfatación, 6 O-sulfatación y N-resulfatación). Se repitió el ejemplo 1, variando las condiciones de la O-sulfatación parcial (paso e) del Ejemplo 1, porque se llevó a cabo con una fracción molar de 5 entre el agente sulfatante y los hidroxilos del sustrato de K5N-sulfatado epimerizado durante 8 horas a 50°C y sin los pasos subsiguientes de desulfatación, 60-sulfatación parcial y N-resulfatación. El producto K5-OSNH2-epi obtenido tenía un peso molecular de alrededor de 6,000 Da, una sulfatación de hidroxilos de 95% y una actividad anti-Xa de 8 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro protón?-??? en la figura 16.

EJEMPLO 16. Producción de heparinas biotecnológicas con peso molecular de alrededor de 6,000 Da. Se llevó a cabo el Ejemplo 1 con los siguientes pasos: a) preparación del polisacárido N-acetilheparosano iniciando desde Escherichia coli K5 b) N-desacetilación/N-sulfatación c) Epimerización d) O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial e) Despolimerización controlada f) 6-0 sulfatación parcial/N-resulfatación, en el cual las condiciones de los pasos a)-c) corresponden a aquellas en los pasos respectivas del ejemplo 1 y en el cual están en orden inversa los pasos d) y e) con respecto a los mismos pasos en el ejemplo 1. El producto final obtenido tenía un peso molecular de alrededor de 6,000 Da, y una actividad anti-Xa en plasma de 95 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de carbono NMR en el dibujo 17.

EJEMPLO 17. Determinación de la actividad biológica de los productos obtenidos según el invento. Medición de la actividad anti factor Xa: Se estimó la actividad ánti factor-Xa según un método cromogénico (Coatest Heparin kit, Chromogenix). Se llevó a cabo la medición en plasma humana normal, usando como reactivos el sustrato cromogénico S2222 (Chromogenix), factor bovina Xa (Chromogenix) y Antitrombina III humana (Chromogenix). Se llevó a cabo la reacción a 37°C en un coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory) y se hizo la lectura a 405 nm. Se muestran los resultados en la tabla 2. Se han resumido en la tabla 1 los resultados obtenidos según las técnicas conocidas (en especial productos de los procedimientos hechos como se describe en WO 01/72848 y WO 02/50125), en los cuales se ha reportado datos de la literatura de heparinas extraídas (Fareed J et al. Exp Opin. Invest. Drugs, 1997, 6:705-733). Actividad Anti-factor Ha. Se estimó la actividad anti-factor Ha en plasma humana normal según el siguiente protocolo: Se mezclaron 30 µ? de 0.5 U/m de antitrombina III humana (Chromogenix) con 30 µ? de la solución de la muestra investigada en diferentes concentraciones y a 60 µ? de trombina bovina a 5.3 nKat/ml (Chromogenix). Se incubó la solución durante 70 segundos a 37°C, en seguida se agregaron 60 µ? de sustrato cromogénico S-2238 (Chromogenix). Se grabó la reacción durante 90 segundos con una lectura cada segundo a 405 mn usando un coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory). Se han resumido en la tabla 1 los resultados obtenidos con los productos conocidos (en su mayoría productos del proceso descrito en WO 01/72848 y WO 02/50125). Resistencia a la heparinasa. Se estimó la resistencia a heparinasa I a través de la preparación de muestras de bajo y alto peso molecular, en tampones de 20 mM Tris HCl, 50 mM NaCl, 4mM CaC12 y 0.01% BSA a pH 7.5 en una concentración final de 0.02%. Se agregaron 20 unidades de heparinasa I (Sigma, numero CAS 52227-76-6) a una 100 µ? solución que contenía la muestra y la reacción se incubó a 25°C. En seguida se detuvo la reacción por medio de la adición de 50 mM HCl, a intervalos regulares cada 10 min, 1 hora, 2 horas, 20 horas.

Se analizaron todas las muestras a través de determinación espectrofotométrica a 235 nm y a través de GPC-HPCL para determinar el peso molecular. Se muestran los resultados obtenidos en la tabla 3, en el cual se puede observar que mientras que las heparinas extraídas usadas en el estudio, tanto de peso molecular alta (HMW) como bajo (Fraxiparina, Sanofi), a lo largo se han degradado como es evidente en la disminución del peso molecular, las heparinas biotecnológicas obtenidas según este invento son estables (el peso molecular es estable aun después de un tratamiento de 20 horas con heparinasa I). Actividad TFP1. Se hizo la determinación de la actividad en base al factor TFPI in vitro en células HUVEC según el método descrito en Gori AM. et al. Thromb. Haemostasis 1999:81:589-93 y se hizo la comparación con una heparina comercial no-separada (tabla 4). Inhibición de generación de proteasas. Se realizó la determinación de la inhibición de la generación de proteasas en plasma empobrecida en fíbrinógeno según el método reportado en Fareed et al. Path. Haem. Thromb. 2002; 32 (3): 56-65. Después de agregar varias diluciones de las muestras bajo exanimación, se activó la plasma a través de la adición de PT (tromoboplastina C) para la activación del sistema de coagulación intrínseca o APTT (Dade Actin) para la activación del sistema de coagulación intrínseca. Se monitoreó la inhibición tanto de trombina (factor II) como del factor Xa usando un coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory). Se muestran en la tabla 5 los valores obtenidos con una dilución muestra de 50 µg/m. Afinidad para el factor PF4: Se evaluó en plasma la determinación de la afinidad para el factor PF4 (factor plaquetario 4) a través de la determinación de la actividad residual anti-Xa después de la adición de una cantidad fija de factor PF4 en la solución que contiene las heparinas biotecnológicas obtenidas según el invento. Se agregaron 100 plasma que contenía IU/ml 0.8 anti-Xa para obtener una concentración final de PF4 de 10 µg/ml. Se midió la actividad residual anti-Xa de la muestra usando un kit Coatest para heparina (chromogenix) por medio del coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory). Se midió la actividad residual anti Xa como un porcentaje de la actividad inicial (tabla 6). Medición de tiempo parcial de tromboplastina activada (TTPA). Se realizó la determinación del TTPA a través de la prueba de coagulación usando un coagulómetro ACL 9000 (International Laboratory). Se llevó a cabo la reacción a 37°C agregando una cantidad de cefalina (kit APTT International Laboratory cod 8468710) a la muestra debidamente diluida y después de la formación de coágulos, la adición de cloruro de calcio y la lectura de los resultados a 660 nm. Se reportan los valores TTPA en la tabla 2 como porcentajes de la actividad con respecto al primer estándar internacional de heparina de bajo peso molecular 85/600. Determinación de la actividad del cofactor II de la heparina (HCII): se realizó la determinación del HCII preparando una mezcla de reacción que contenía 20 µ? HCII (Stago) 0.085 PEU/ml, 80 µ? solución de la muestra bajo examinación a diferentes concentraciones, 50 µ? de trombina 0.18 U/ml (Boehringer) en un tampón 0.02 M tris-, pH 7.4, =.15 M NaCl y 0,1% de PEG 6000. Se incubó la solución durante 60 segundos a 37°C, en seguida se agregaron 50 µ? de 1 mM de sustrato cromogénico Spectrozyme (American Diagnostic). Se monitoreó la reacción durante 180 segundos a intervalos de 1 segundo a longitud de onda de 405 nm en un coagulómetro automático ACL 9000 (Instrumentation Laboratory). Se reportaron los valores HCII en la tabla 2 como porcentajes con respecto al primer estándar internacional de heparina de bajo peso molecular 85/600. En las tablas 1 y 2, los datos sobre la actividad biológica de heparinas biotecnológicas producidas según el invento, o según los métodos caracterizado por O-supersulfatación sin importar el uso de solventes donadores o no donadores de grupos formil tales como N,N, dimetilformamida y por el paso final de despolimerización, o de heparinas extraídas. Los datos muestran en particular que la actividad anti-Xa medida en plasma humana es mas alta para los productos obtenidos según este proceso que para los productos de artes anteriores a peso molecular comparable. De hecho, en productos obtenidos según el invento, la proporción entre la actividad biológica expresada como actividad anti factor Xa y el peso molecular es mayor. Tal incremento parece deberse a las peculiaridades combinadas del proceso: • O-sulfataciones (O-sulfatación y 60-sulfatación) llevadas a cabo bajo condiciones ligeras (véase los ejemplos 5 y 7 para una comparación); • Uso de un solvente polar aprótico no donador de grupos formil durante los pasos de O-sulfatación y 60-sulfatación (véase ejemplos 1 y 2 para una comparación); • Paso intermedio de despolimerización que se lleva a cabo antes de los pasos de de O-sulfatación o antes de 60-sulfatación, comparado con la despolimerización llevada a cabo al final del proceso (véase los ejemplos 1 y 12 para una comparación). Se obtiene un incremento mayor de la proporción entre la actividad biológica, tomada como la actividad anti Xa en plasma y el peso molecular del producto obtenido, así como la proporción entre la actividad anti Xa y anti Ha, cuando las O-sulfataciones (O-sulfatación y 60-sulfatación) son parciales juntas con el uso de un solvente polar aprótico no donador de grupos formil para O-sulfatación y 60-sulfatación juntos con la despolimerización llevada a cabo en la fase intermedia como en el ejemplo 1 y en el ejemplo 6. Sin embargo, el proceso es compatible también con una O-sulfatación más fuerte con 60-sulfatación parcial, como se describe en el ejemplo 13. Además, el proceso del invento también es compatible con una despolimerización final como se describe en el ejemplo 12. Otro parámetro mejorado en los productos del invento, comparado con heparinas biotecnológicas obtenidas según métodos conocidos, es la proporción entre la actividad anti-Xa y la actividad anti Ha, indicando una relación entre características antitrombóticas y anticoagulantes, resultando también de los valores TTPA que son similares al valor de heparinas extraídas.

En los productos obtenidos según el invento tal proporción es igual o mayor a 1, mientras que para productos obtenidos según procesos de artes anteriores el valor es menor a 1.

Otra característica mostrada por los valores HCII altas es la mayor capacidad para inhibir la trombina directamente, comparada con heparinas extraídas.

EJEMPLO 18. Producción de heparinas biotecnológicas con peso molecular de alrededor de 6,000 Da. Se llevó a cabo el ejemplo 1 según los siguientes pasos: a) preparación del polisacárido N-acetilheparosano iniciando desde Escherichia coli K5 b) N-desacetilación/N-sulfatación c) Epimerización d) O-sulfatación parcial/O-desulfatación parcial e) N-risulfatación f) Despolimerización controlada g) 6-0 sulfatación parcial en el cual las condiciones de los pasos a)-c) corresponden a aquellas en los pasos respectivas del ejemplo 1 y en el cual están en orden inversa los pasos d) -g) con respecto a los mismos pasos en el ejemplo 1. El producto final obtenido tema un peso molecular de alrededor de 6,000 Da, y una actividad anti-Xa en plasma de 92 IU/mg (véase la tabla 2). Se muestra el espectro de protón NMR en el dibujo 18.

TABLA 1. Tabla comparativa de datos de actividad biológica. (*) valores publicados en: Fareed et al. Exp. Opin. Invest. Drugs (1997) 6:705-733, Eriksson B. et al. Tromb. Haemost. (1995) 73: 398 TABLA 2. Tabla de resumen: ejemplos y actividad biológica de los productos según del invento.

MW Anti Xa EJ. Figura antiXa/ (Da) O-Sulfatación Desulfatación en plasma APTT HCH notas n° n° anti Ha HPLC (ÍU/mg) 1 f.m.=1.25 240 min 1,2 6000 140 « 2.5 93 n.d Véase ejemplo 1 6 hras, 50°C 65°C 2 f.m.=1.25 240 min Como en el ejemplo 1 pero con 3 6000 85,9 1.5 84 364 6 hras, 50°C 65°C DMF 3 f.m.=1.25 240 min Como en el ejemplo 1 con 4 4200 60,1 3.0 58 254 6 hras, 50°C 65°C despolimerización a 4200 Da 4 f.m=1.25 240 min Como en el ejemplo 1 con 5 8000 150 2.0 98 n.d 6 hras, 50°C 65°C despolimerización a 8000 Da 5 20000 f.m=1.25 240 min Como en ejemplo 1 sin 6 135 1.0 n.d 725 6 hras, 50°C 65°C despolimerización f.m=1.25 240 min Como en ejemplo 1 con 6 7 15000 180 1.2 n.a n.a 6 hras, 50°C 65°C despolimerización a 15000 Da Supersulfatación y 60-sulfatación 7 Supersulf 150 min 8 20000 45 0.6 n.d n.d como en WO 01/72848 sin 18 hras, 50°C 65°C despolimerización Supersulfatación y 60-sulfatación 8 Supersulf 150 min 9 6000 31,5 0.8 n.d n.d como en WO 01/72848 con 18 hras, 50°C 65°C despolimerización final 9 f.m=5 60 min Como en ejemplo 1, con diferencias 10 6500 89 2.5 73.9 395 3 hras, 50°C 65°C en el paso e) 10 f.m=0.6 30 min Como en ejemplo 1, con diferencias 11 6500 101 2.5 n.d 423 8 hras, 50°C 65°C en el paso e) f.m=1.25 240 min Como en ejemplo 1, con columna de 11 12 8500 300 1.8 94.2 n.d 6 hras, 50°C 65°C afinidad f.m=1.25 240 min Como en ejemplo 1, con 12 13 6000 65 1.0 n.d n.d 6 hras, 50°C 65°C despolimerización final 13 f.m=5 240 min Como en ejemplo 1, con diferencias 14 6000 75 1,2 n.d n.d 8 hras, 50°C 65°C en el paso e) 15 f.m=1.25 240 min 14 Como en el ejemplo 1, sin N- 6000 5 n.d n.d n.d 6 hras, 50°C 65°C risulfatación 15 f.m=5 Como en el ejemplo 13 sin 240 min 16 6000 8 n.d n.d n.d desulfatación /60sulfatación/N- 8 hras, 50°C 65°C risulfatación 16 f.m=1.25 240 rain Como en el ejemplo 1 con la 17 6000 95 2.5 n.d n.d 6 liras, 50°C 65°C inversión de los pasos d) y e) 18 f.m=1.25 240 min Como en el ejemplo 1 con la 18 6000 92 2.5 n.d n.d 6 hras, 50°C 65°C inversión de los pasos d) - g) n.d.= no determinado f.m.= fracción molar entre el agente sulfatante y el sustrato TABLA 3: Prueba comparativa de hidrólisis de Heparinasa de heparinas biotecnológicas y extraídas Tabla 4: Prueba de liberación de factor TFPI de células HUVEC in vitro Muestra TFPI liberado en el medio (ng/ml) Control (solo medio de cultivo) 0,5-0,8 Heparina extraída no fraccionada (Vister, Pfizer) 2,4-2,6 (lIUaXa/ml) Heparina biotecnológica 6000 Da (ej. n°l) 2,5-3,7 (HUaXa/ml) Heparina biotecnológica 8500 Da (ej. n°10) 3.0-4,7 (HUaXa/ml) Tabla 5: Prueba de inhibición de generación de proteasa (trombma y factor Xa).

Tabla 6: Prueba de añnidad para factor PF4 Muestra % actividad Xa residual en presencia de PF4 Heparina extraída no f accionada (HNF) 45 Heparina extraída de peso molecular bajo (LMWH) 65 Heparina biotecnológica 4200 Da (ej. No.3) 90 Heparina biotecnológica 8500 Da (ej. No. 10) 70

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la preparación de glicosaminoglicanes tipo sulfatas derivados de acetilo N-heparosano que consta de los siguientes pasos: a) N-desacetilación y N-sulfatación del polisacárido de N- acetilheparosan aislado de cepas bacterianas naturales o recombinantes; b) Epimerización enzimática a través de la enzima epimerasa glucuronil C5; c) O-sulfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial; d) 6-0 sulfatación parcial; e) N-resulfatación que además consiste en un paso de despolimerización controlada, de manera alterna llevada a cabo después de los pasos b), c) o d), o en el cual dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en el paso c) se lleva a cabo durante menos de 10 horas y con una fracción molar entre el agente sulfatante y le N-acetilo heparosano menor o igual a 5 y por el hecho de que la 60-sulfatación parcial (paso d) se lleva a cabo durante un tiempo igual o menor a 2 horas usando una fracción molar entre el agente sulfatante y los grupos hidroxilos del N-acetilo heparosano menor o igual a

2. El proceso conforme a la reivindicación 1 en el cual los pasos d) y e) se llevan a cabo en orden inverso.

3. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-2, en el cual se lleva a cabo la despolimerización intermedia después del paso b) de epimerización.

4. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-2, en el cual la 0-sulfatación según el paso c) se lleva a cabo con una fracción molar entre el agente sulfatante y el N-acetilo heparosano menor a 2.5.

5. El proceso conforme a la reivindicación 4 en el cual dicha fracción molar es igual o menor a 1.5.

6. El proceso conforme a las reivindicaciones 4-5 en el cual se lleva a cabo la O-sulfatación parcial (paso d) por un tiempo igual o menor a 6 horas.

7. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-6 en el cual la 0-sulfatación parcial (paso d) se lleva a cabo usando una fracción molar entre el agente sulfatante y los grupos hidroxilos de N-acetilo heparosano menor o igual a 1.5.

8. El proceso conforme a la reivindicación 7 en el cual se lleva a cabo la 60-sulfatación parcial ((paso d) del proceso) por un tiempo igual o menor a 60 minutos. V/

9. El proceso conforme a la reivindicación 8 en el cual se lleva a cabo la sulfatación por un tiempo igual o menor a 30 minutos.

10. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-2 en el cual el 5 polisacárido N-acetilo heparosano en el paso a) se aisla el E.coli K5.

11. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-10 caracterizado por el hecho de que comprende un paso f) mas de selección de afinidad en matrices que fijan antitrombina III o fragmentos de esta. 10

12. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-11 en el cual la sulfatación parcial según el paso c) y la 60-sulfatación parcial según el paso d) se llevan a cabo usando un agente sulfatante seleccionado del grupo que consta de: trietilarnina S03, trimetilamina-SO, piridina-S03 en un solvente aprótico. 15

13. El proceso conforme a la reivindicación 12, en el cual dicho solvente aprótico polar es no donador de grupos formil.

14. El proceso conforme a la reivindicación 12, en el cual dicho 20 solvente aprótico polar se escoge entre: tetrametilenosulfona, 2.4- dimetilsulfolano o ?,?-dimetilacetamida o N,N,-dietilacetamida.

15. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-14 en el cual la 60-sulfatación parcial (paso d) se lleva a cabo a una temperatura que consta de 25 entre 4°C y 30°C.

16. El proceso conforme a la reivindicación 13 en el cual dicha temperatura consta de entre 10°C y 25°C.

17. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-16 en el cual la despolimerización intermedia controlada se lleva a cabo por medio de métodos químicos o físicos.

18. El proceso conforme a la reivindicación 17, en el cual dichos métodos físicos constan de tratamiento con rayos gamma y en el cual dichos métodos químicos constan de: un tratamiento con ácido nitroso o sales de este, o de beta-eliminación o un tratamiento con ácidos periódicos o radicales libres.

19. El proceso conforme a la reivindicación 18, en el cual se lleva a cabo la despolimerización a través de tratamiento con ácido nitroso o sales de este.

20. El proceso conforme a la reivindicación 19 en el cual la proporción entre el ácido nitroso o sales de este y el polisacárido consta de entre 1 y 100 mg sal por gramo polisacárido y la reacción se lleva a cabo a una temperatura que consta de entre 4 y 10°C.

21. El proceso conforme a la reivindicación 20 en el cual se lleva a cabo la despolimerización controlada en un tiempo menor a 30 rninutos y en la presencia de ácidos nitrosos o sales de estos.

22. El proceso conforme a la reivindicación 21 en el cual la sal de ácido nitroso es nitrato de sodio.

23. El proceso conforme a las reivindicaciones 17-22, en el cual se finaliza la despolimerización con la adición de un exceso molar de hidruro de boro.

24. El proceso para la preparación de glicosaminoglicanes sulfatados derivados de acetilo N-heparosano que consta de los siguientes pasos: a) N-desacetilación y N-sulfatación de un polisacárido N- acetilheparosano aislado de una cepa bacteriana natural o recombinante. b) Epimerización enzimática por medio de glucuronil C5 epimerasa, c) O-sulfatación parcial combinada con O-desulfatación parcial, d) 6-0 sulfatación parcial, que además consta del paso intermedio de despolirnerización controlada llevada a cabo de manera alterna en los pasos b), c) o d) en el cual dicho proceso se caracteriza por el hecho de que la O-sulfatación parcial en el paso c) se lleva a cabo por un tiempo igual o menor a 10 horas y usando una molar entre el agente sulfatante y le N-acetilheparosano menor o igual a 5 y se lleva a cabo la 60 sulfatación parcial (paso d) por un tiempo igual o menor a 2 horas y con una fracción molar entre el agente sulfatante y el N-acetilheparosano menor o igual a 2 y en que las O-sulfataciones en los pasos c) y d) se llevan a cabo con un agente sulfatante seleccionado entre: 1xietilamina-S03, trimetilamina-SO, piridina- S03 en un solvente aprótico.

25. El proceso conforme a las reivindicaciones 1-24 caracterizado en que la reacción de epimerización C-5 (paso c) se lleva a cabo a una temperatura menor a 35°C y en el cual la glucuronil C5 epimerasa, ya sea natural o recombinante, se inmoviliza en una fase estacionaria.

26. El proceso conforme a la reivindicación 25 en el cual dicho epimerasa C5 recombinante es una enzima de ratón expresada en células de insecto o levadura.

27. El proceso conforme a la reivindicación 25 en el cual dicha temperatura consta de entre 15°C y 30°C.

28. El proceso conforme a la reivindicación 27 en el cual dicha temperatura consta de entre 20°C y 25°C.

29. El proceso conforme a la reivindicación 25 en el cual la fase estacionaria es una resina poliestérica o polimetacrílica con grupos epoxídicos o diólicos activados con CNBr y que la inmovilización C5 epimerasa se lleva a cabo en un tampón que consta de NaHC03 en una concentración de entre 100 y 300 mM o en un tampón de fosfato en una concentración de entre 10 y 50 mM a un pH de entre 7.0 y 8.3, a una temperatura de entre 4 y 25°C por un tiempo que consiste de entre 12 y 72 horas.

30. El proceso conforme a las reivindicaciones 25-29 en el cual la epimerización en el paso c) se lleva a cabo en un tampón HEPES que consiste en: EDTA de entre 10 y 30 mM, CaCI2 de entre 70 y 150 mM y con un pH de entre 5.5 y 8.0.

31. N-acetilheparosano modificado obtenible conforme al proceso de las reivindicaciones 1-30.

32. N-acetilheparosano modificado conforme a la reivindicación 31 con un peso molecular menor o igual a 15,000 Da.

33. N-acetilheparosano modificado conforme a la reivindicación 32 con un peso molecular que consta de entre 3,000 y 9,000 Da.

34. N-acetilheparosano modificado obtenible conforme al proceso de la reivindicación 13 caracterizado por la ausencia de grupos formil en la molécula.

35. N-acetilheparosano modificado conforme a las reivindicaciones 31-34 caracterizado por el hecho de que carga en su terminal reductor un residuo de 2,5 anhidromanitol sulfatado.

36. N-acetilheparosano conforme a la reivindicación 35 en el cual los grupos hidroxilos en las posiciones 1, 3 y 6 del anhidromanitol son parcialmente sulfatados.

37. N-acetilheparosano conforme a la reivindicación 36 en el cual el anhidromanitol es parcialmente sulfatado en los hidroxilos en las posiciones 1 y 6.

38. N-acetilheparosano K50S60SNS-epi conforme a la reivindicación 37 en el cual el grado de sulfatación de los grupos hidroxilos en la posición 1 consta de entre 20% y 85%.

39. N-acetilheparosano K50S60SNS-epi conforme a la reivindicación 37 en el cual el grado de sulfatación de los grupos hidroxilos en la posición 6 de la glucosamina es mayor a 40%.

40. N-acetilheparosano K50S60SNS-epi conforme a la reivindicación 39 en el cual el grado de sulfatación consta de entre 50 y 85%.

41. N-acetilheparosano K50S60SNS-epi conforme a la reivindicación 36 en el cual el grado de sulfatación de los grupos hidroxilos en la posición 3 de la glucosamina es menor a 60%.

42. 50S60SNH2,epi es obtenible por medio del proceso conforme a la reivindicación 24.

43. K50SN¾-epi es obtenible por medio del proceso conforme a la reivindicación 24, pasos a)-c).

44. N-acetilheparosano modificado conforme a las reivindicaciones 31-41 caracterizado por una actividad anti-factor Xa medida en la presencia de plasma igual o mayor a 50 IU/mg.

45. N-acetilheparosano modificado conforme a la reivindicación 44 caracterizado por una proporción entre las actividades de inhibición del factor Xa y el factor Ha igual o mayor a 1.0.

46. N-acetilheparosano modificado conforme a la reivindicación 44 caracterizado por una actividad de activación de TFPI igual o mayor comparado con heparinas extraídas.

47. N-acetilheparosano modificado conforme a la reivindicación 44 caracterizado en que tenga una resistencia a heparinasa I mayor a heparinas extraídas.

48. N-acetilheparosano modificado conforme a la reivindicación 44 caracterizado porque inhibe la generación de proteasas de trombina y factor Xa.

49. N-acetilheparosano modificado conforme a la reivindicación 44 caracterizado porque tenga una afinidad para el factor PF4 menor comparado con heparinas extraídas.

50. N-acetilheparosano modificado conforme a la reivindicación 44 caracterizado por una actividad HCII mayor a heparinas extraídas.

51. N-acetil eparosano modificado conforme a las reivindicaciones 44-50 caracterizado por la presencia de múltiples señales en el espectro 13C NMR en exceso comparado con las señales de anhidromanitol en la región que consta de 79 a 89 ppm, por la ausencia de señales a 51 a 165 ppm y por la ausencia de señales en la región a ppm 7-9.5 del espectro 1H-NMR.

52. K5 OS 60S N-epi conforme a la reivindicación 51 con un espectro 1H-NMR que corresponde a la figura 2.

53. K5 OS 60S N-epi conforme a la reivindicación 51 con un espectro 1H-NMR que corresponde a la figura 7.

54. N-acetilheparosano modificado conforme a las reivindicaciones 31-41 y 44-53 para uso farmacológico.

55. El uso del producto conforme a la reivindicación 54 en la preparación de un medicamento con actividad anticoagulante antitrombótica similar a la heparina.

56. El uso del producto conforme a la reivindicación 54 en la preparación de un medicamento con actividad profibrinolítico y antiagregante.

57. El uso conforme a la reivindicación 55 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y tratamiento de angina inestable, infarto de miocardio, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar y eventos isquémicos.

58. El uso conforme a las reivindicaciones 55-56 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de septicemia y de sus complicaciones tales como coagulación intravascular diseminada (CID).

59. El uso conforme a la reivindicación 56 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de angina inestable, infarto de miocardio, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, eventos isquémicos, arteriosclerosis.

60. El uso conforme a las reivindicaciones 54-55 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y tratamiento de eventos tromboembolíticos debidos a falta congénita o adquirida de antitrombina III.

61. La composición farmacéutica que contiene como principio activo cualquier de los productos conforme a las reivindicaciones 31-41 y 44-53 en combinación con excipientes y/o diluentes adecuados.

62. La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 61 en compuestos adecuados para la administración oral.