MXPA06001393A

MXPA06001393A - Proteasa especifica de ubiquitina.

Info

Publication number: MXPA06001393A
Application number: MXPA06001393A
Authority: MX
Inventors: Nanguneri R Nirmala
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2003-08-06
Filing date: 2004-08-05
Publication date: 2006-08-25
Also published as: JP2007501008A; BRPI0413364A; WO2005014804A2; CN1845994A; CA2534481A1; WO2005014804A3; AU2004262684A1; EP1651764A2

Abstract

La presente invencion proporciona miembros novedosos de la familia de enzimas desubiquitinizantes (DUBs), asi como sus fragmentos, derivados, y homologos biologicamente, diagnosticamente, o terapeuticamente utiles, los cuales son utiles para propositos de investigacion, biologicos, clinicos, terapeuticos, asi como de pronostico y diagnostico. Ademas, los polinucleotidos y polipeptidos proporcionados por la presente invencion son utiles para el tratamiento y diagnostico de cancer de mama, leucemia, o trastornos del cerebro.

Description

PROTEASA ESPECIFICA DE UBIQUITINA Campo de la Invención La presente ¡nvención se refiere a proteasas específicas de ubiquitina (USPs), y de una manera específica, a miembros novedosos de la familia de las enzimas desubiquitinizantes (DUBs).

Antecedentes de la Invención La ubiquitina es una proteína de setenta y seis residuos de aminoácidos, que se encuentra en todas las células eucarióticas, y cuya secuencia está extremadamente bien conservada desde los protozoarios hasta los vertebrados. Tiene un papel clave en una variedad de procesos celulares, tales como la degradación selectiva dependiente de ATP de las proteínas celulares, el mantenimiento de la estructura de cromatina, la regulación de la expresión genética, la respuesta a la tensión, y la biogénesis de ribosomas. La conjugación con la pequeña proteína eucariótica ubiquitina puede modificar funcionalmente, o dirigirse a, las proteínas, para su degradación por medio del proteasoma. Como la fosforilación de proteínas, la ubiquitinación de proteínas es dinámica, involucrando a las enzimas que agregan ubiquitina (enzimas que se conjugan con ubiquitina), y a las enzimas que remueven la ubiquitina. La remoción de la modificación de ubiquitina, o la desubiquitinación , es llevada a cabo por las enzimas denominadas como proteasas específicas de ubiquitina (USPs) o como hidrolasas C-terminales de ubiquitina (UCHs), y es un mecanismo importante que regula esta senda. Estas enzimas pueden disociar cualesquiera enlaces peptídicos que se enlacen con la ubiquitina como parte de una proteína de fusión precursora, liberando fracciones de ubiquitina libres, o pueden disociar los enlaces que conjugan la ubiquitina (después de la traducción) con las proteínas . Las enzimas desubiquitinizantes son proteasas de cisteína que reconocen e hidrolizan el enlace peptídico en la glicina C-terminal de la ubiquitina. Existen dos familias distintas de enzimas desubiquitinizantes (DUBs). La primera clase consiste en enzimas de aproximadamente 25 Kd, y actualmente está representada en el ser humano por UCHL1, UCHL3, Bap1, y UCH37. Estas proteínas pertenecen a la familia C12 en la clasificación de la peptidasa. La segunda familia consiste en proteínas grandes (de 800 a 2,000 residuos) que comparten dos regiones de similitud, una región que contiene una cisteína conservada que probablemente está implicada en el mecanismo catalítico (cuadro de cisteína), y una región que contiene dos residuos de histidina conservados, uno de los cuales también está probablemente implicado en el mecanismo catalítico (cuadro de histidina). Estas proteínas se caracterizaron primeramente en levadura, y pertenecen a la familia C19 en MEROPS, y están representadas por las proteasas específicas de ubiquitina. Las enzimas desubiquitinizantes tienen múltiples papeles dentro de la célula, incluyendo la estabilización de algunos sustratos conjugados con ubiquitina (Ub), la degradación de otros sustratos conjugados con ubiquitina, y el reciclo de la reserva de ubiquitina monomérica libre de la célula. Algunas enzimas desubiquitinizantes remueven la ubiquitina de las proteínas de dirección celular, y de esta manera previenen la degradación mediada por el proteasoma (UBP2). Otras enzimas desubiquitinizantes remueven la ubiquitina de los productos de degradación de péptidos-ubiquitina producidos por los proteasomas, y de esta manera aceleran la degradación mediada por el proteasoma (Doa-4). Los recientes esfuerzos que exploran la secuenciación de diferentes genomas han aumentado el número de secuencias que exhiben características conservadas de la familia. En S. cerevisiae, por ejemplo, se puede identificar una familia de 17 enzimas desubiquitinizantes en su genoma completamente secuenciado. También se han identificado otras diferentes proteínas a partir de eucariotes superiores que contienen los motivos de secuencia conservados (cuadros de cisteína e histidina). Sin embargo, la mayoría de estas nuevas secuencias representan miembros truncados y, como consecuencia, es difícil asignarlas realmente como un miembro de la familia desubiquitinizante.

Compendio de la Invención En un primer aspecto, la ¡nvención proporciona un ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteasa específica de ubiquitina seleccionada a partir del grupo de: (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10; (b) un fragmento de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10; (c) un derivado de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10; (d) una secuencia sustancialmente homologa a las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10. En un aspecto de la invención, el ADN se selecciona a partir del grupo de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10. En otro aspecto de la invención, el fragmento es un fragmento de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10, y retiene la actividad funcional específica de ubiquitina. El fragmento puede ser de cuando menos 50, opcionalmente de cuando menos 75, o de cuando menos 100 nucleótidos consecutivos. En todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un derivado de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10, en donde las supresiones, adiciones, o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos, producen una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente, la cual retiene la actividad funcional específica de ubiquitina. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos que es sustancial-m.ente homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10, y retiene la actividad funcional específica de ubiquitina. El porcentaje de homología entre la secuencia sustancialmente homologa y la secuencia de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10, es deseablemente de cuando menos el 80 por ciento, más deseablemente de cuando menos el 85 por ciento, de preferencia de cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente de cuando menos el 95 por ciento, y todavía de una manera muy preferible de cuando menos el 99 por ciento. En todavía otro aspecto de la invención, se proporciona una secuencia de ácido nucleico complementaria que se híbrida bajo condiciones de alta restringencia a un ADN aislado de cualquiera de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, o un fragmento, derivado, o secuencia sustancialmente homologa de las mismas. En un segundo aspecto de la ¡nvención, se proporciona un polipéptido aislado de una proteasa específica de ubiquitina, el cual comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de: (a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9; (b) un fragmento de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9; (c) un derivado de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9; (d) una secuencia sustancialmente homologa a las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9. Un aspecto preferido de la invención proporciona un polipéptido aislado con una secuencia de aminoácidos como se estipula en la SEQ ID NO: 1. Este polipéptido, o fragmentos del mismo, se encuentra en el tejido de mama de las personas que sufren de cáncer de mama hasta un grado mucho mayor que en el tejido de mama de las personas sin cáncer de mama. De conformidad con este aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos novedosos de origen humano, así como fragmentos, derivados, y homólogos de los mismos que son biológicamente, diagnósticamente, o terapéuticamente útiles.

Otro aspecto preferido de la invención proporciona un polipéptido aislado con una secuencia de aminoácidos como se estipula en la SEQ ID NO: 5. Este polipéptido, o fragmentos del mismo, se encuentra en las células de sangre periférica, en especial en las células linfoides de las personas que sufren de leucemia hasta un grado mucho mayor que en la sangre periférica de las personas sin leucemia. De conformidad con este aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos novedosos de origen humano, así como fragmentos, derivados, y homólogos de los mismos que son biológicamente, diagnósticamente, o terapéuticamente útiles. Todavía otro aspecto preferido de la invención proporciona un polipéptido aislado con una secuencia de aminoácidos como se estipula en la SEQ ID NO: 9. Este polipéptido, o fragmentos del mismo, se encuentra en el tejido cerebral, en especial en el tejido de amígdala, médula espinal, y bulbo olfatorio de las personas que sufren de trastornos del cerebro hasta un grado mucho mayor que en el tejido cerebral de las personas sin trastornos del cerebro. De conformidad con este aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos novedosos de origen humano, así como fragmentos, derivados, y homólogos de los mismos que son biológicamente, diagnósticamente, o terapéuticamente útiles.

Un tercer aspecto de la presente ¡nvención abarca un método para el diagnóstico de un ser humano que requiera la medición de la cantidad de un polipéptido seleccionado a partir del grupo de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, un fragmento, derivado, o secuencia sustancialmente homologa de las mismas, de un ser humano, en donde la presencia de una cantidad elevada del polipéptido o fragmentos del mismo, en relación con la cantidad del polipéptido o fragmentos del mismo en el tejido normal, sea un diagnóstico de que el ser humano está sufriendo de una enfermedad. En un aspecto preferido, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de mama en un ser humano, el cual comprende medir la cantidad de un polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, un fragmento, derivado, o secuencia sustancialmente homologa de la misma, a partir de un ser humano, en el tejido de mama, en donde la presencia de una cantidad elevada de este polipéptido en relación con la cantidad del polipéptido en el tejido de mama normal es un diagnóstico de que este ser humano está sufriendo de cáncer de mama. En otro aspecto preferido, se proporciona un método para el diagnóstico de leucemia en un ser humano, el cual comprende medir la cantidad de un polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, un fragmento, derivado, o secuencia sustancialmente homologa de la misma, a partir de un ser humano, en las células de sangre periférica, en especial las células linfoides, en donde la presencia de una cantidad elevada de este polipéptido en relación con la cantidad del polipéptido en las células de sangre periférica normal, en especial las células linfoides, es un diagnóstico de que este ser humano está sufriendo de leucemia. En todavía un aspecto preferido adicional, se proporciona un método para el diagnóstico de trastornos del cerebro en un ser humano, el cual comprende medir la cantidad de un polipéptido de acuerdo con la SEQ ID NO: 9, un fragmento, derivado, o secuencia sustancialmente homologa de la misma, a partir de un ser humano, en los tejidos de amígdala, médula espinal, o bulbo olfatorio, en donde la presencia de una cantidad elevada de este polipéptido en relación con la cantidad del polipéptido en los tejidos de amígdala, médula espinal, y bulbo olfatorio normales, es un diagnóstico de que este ser humano está sufriendo de un trastorno del cerebro. Otro aspecto de la invención proporciona un proceso para la producción de los polipéptidos anteriormente mencionados, fragmentos de polipéptidos, derivados, homólogos, fragmentos de las variantes y los derivados, y homólogos de los anteriores. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, se proporcionan métodos para la producción de los polipéptidos humanos anteriormente mencionados, los cuales comprenden cultivar células huéspedes que tengan incorporado en las mismas un vector de expresión que contenga polinucleótidos específicos de ubiquitina exógenamente derivados, bajo condiciones suficientes para la expresión de los polipéptidos específicos de ubiquitina en el huésped, y luego recuperar el polipéptido expresado. De conformidad con otro aspecto de la invención, se proporcionan productos, composiciones, procesos, y métodos que utilizan los polipéptidos y polinucleótidos anteriormente mencionados, para, entre otros, propósitos de investigación, biológicos, clínicos, y terapéuticos. En ciertas modalidades preferidas adicionales de este aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se enlaza específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos estipulada en las SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9. En ciertas modalidades particularmente preferidas en este aspecto, los anticuerpos son altamente selectivos para los polipéptidos específicos de la ubiquitina humana o porciones de los polipéptidos específicos de la ubiquitina humana. En un aspecto adicional, se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se enlaza a un fragmento de la secuencia de aminoácidos estipulada en las SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9. En un aspecto relacionado, se proporciona una composición farmacéutica que comprende este anticuerpo. En otro aspecto, se proporcionan métodos para el tratamiento de una enfermedad en un sujeto, en donde la enfermedad es mediada por, o está asociada con, un aumento en la presencia del polipéptido de las SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9 en tejido de mama, células de sangre periférica, o tejido cerebral, respectivamente, mediante ia administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo que se enlaza a un polipéptido con la secuencia de aminoácidos estipulada en las SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, o un fragmento o porción de las mismas, al sujeto. También se proporcionan métodos para el diagnóstico de una enfermedad o condición asociada con un aumento en la presencia del polipéptido en un sujeto, los cuales comprenden utilizar un anticuerpo que se enlace a un polipéptido con la secuencia de aminoácidos estipulada en las SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, o un fragmento o porción de las mismas, en un inmunoensayo. En todavía otro aspecto, la invención proporciona células que se pueden propagar in vitro, de preferencia células de mamífero, más preferiblemente de vertebrado, las cuales son capaces, al crecer en cultivo, de producir un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos estipulada en las SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, o fragmentos, derivados, o secuencias sustancialmente homologas de las mismas, en donde las células opcionalmente contienen secuencias de ADN de control de transcripción, otras secuencias de control de transcripción humanas, en donde las secuencias de control de transcripción controlan la transcripción del ADN que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácidos. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir polipéptidos, el cual comprende cultivar una célula huésped que tenga incorporado en la misma un vector de expresión que contenga un polinucleótido específico de ubiquitina exógenamente derivado de la ¡nvención, bajo condiciones suficientes para la expresión de estos polipéptidos en la célula huésped, provocando de esta manera la producción de un polipéptido expresado, y recuperar el polipéptido expresado. En todavía otro aspecto de la presente ¡nvención, se proporcionan métodos de ensayo y estuches de diagnóstico que comprenden los componentes necesarios para detectar la expresión arriba de lo normal de los polinucleótidos específicos de ubiquitina de la invención, o polipéptidos o fragmentos de los mismos, en muestras de tejido corporal derivadas de un paciente, comprendiendo estos estuches de diagnóstico, por ejemplo, anticuerpos o sondas de oligonucleótidos que se hibridan con los polinucleótidos de la invención. En una modalidad preferida, estos estuches de diagnóstico también comprenden instrucciones que detallan los procedimientos mediante los cuales se van a utilizar los componentes del estuche de diagnóstico. Otro aspecto se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, o un fragmento, derivado, u homólogo de las mismas. En otro aspecto, la invención se refiere a métodos para la identificación de moléculas que se puedan enlazar a las proteasas específicas de ubiquitina de la invención y/o que modulen la actividad de la ubiquitina, o moléculas que se puedan enlazar a secuencias de ácidos nucleicos que modulen la transcripción o traducción de la ubiquitina. Estos métodos se dan a conocer, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,541,070 5,567,317; 5,593,853; 5,670,326; 5,679,582; 5,856,083 5,858,657; 5,866,341; 5,876,946; 5,989,814; 6,010,861 6,020,141; 6,030,779; y 6,043,024, todas las cuales se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Las moléculas identificadas mediante tales métodos también caen dentro del alcance de la presente invención. En todavía otro aspecto, la invención se refiere a métodos para la introducción de los ácidos nucleicos de la ¡nvención en uno o más tejidos de un sujeto que necesite tratamiento, con el resultado de que una o más proteínas codificadas por los ácidos nucleicos son expresadas y/o secretadas por las células de adentro del tejido. Otros aspectos, características, y ventajas de la presente invención llegarán a quedar aparentes para los expertos a partir de la siguiente descripción. Se debe entender, sin embargo, que la siguiente descripción y los ejemplos específicos, aunque indican las modalidades preferidas de la invención, se dan solamente a manera de ilustración. Diferentes cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención divulgada llegarán a ser aparentes para los expertos en este campo a partir de la lectura de la siguiente descripción, y de la lectura de las otras partes de la presente divulgación.

Descripción de las Tablas Tabla 1(a): USP_N01: Variante de empalme novedosa -secuencia de aminoácidos. La Tabla 1(a) ilustra la SEQ ID NO: 1, que es una forma de empalme novedosa de una proteasa específica de ubiquitina. Esta forma de empalme novedosa se caracteriza por 4 inserciones en las siguientes localizaciones: Pos1- Pos11, Pos267-Pos300, P os361 -Pos384, y P os 1243-Pos 1437. Tabla 1(b): USP_N01: Variante de empalme novedosa -secuencia de nucleótidos. La Tabla 1(b) ilustra la SEQ ID NO: 2, que es la secuencia de nucleótidos correspondiente a la Tabla 1(a). Tabla 1(c): Secuencia de aminoácidos de referencia DERWENT AAU82706. La Tabla 1(c) ¡lustra la SEQ ID NO: 3, que es la secuencia de aminoácidos de referencia con la que se ha comparado la forma de empalme novedosa de la Tabla 1(a). Tabla 1 ( ) : Secuencia de nucleótidos de referencia. La Tabla 1(d) ¡lustra la SEQ ID NO: 4, que es la secuencia de nucleótidos de referencia correspondiente a la Tabla 1 (c). Tabla 2(a): USP_N07: Variante de empalme novedosa -secuencia de aminoácidos. La Tabla 2(a) ilustra la SEQ ID NO: 5, que es una forma de empalme novedosa de una proteasa específica de ubiquitina. Esta forma de empalme novedosa se caracteriza por 1 inserción en la siguiente localización: Pos14-Pos81. Tabla 2(b): USP_N07: Variante de empalme novedosa -secuencia de nucleótidos. La Tabla 2(b) ilustra la SEQ ID NO: 6, que es la secuencia de nucleótidos correspondiente a la Tabla 2(a). Tabla 2(c): Secuencia de aminoácidos de referencia DERWENT AAU82714. La Tabla 2(c) ilustra la SEQ ID NO: 7, que es la secuencia de aminoácidos de referencia con la que se ha comparado la forma de empalme novedosa de la Tabla 2(a). Tabla 2(d): Secuencia de nucleótidos de referencia. La Tabla 2(d) ¡lustra la SEQ ID NO: 8, que es la secuencia de nucleótidos de referencia correspondiente a la Tabla 2(c). Tabla 3(a): U S P _ N 11 : Variante de empalme novedosa -secuencia de aminoácidos. La Tabla 3(a) ilustra la SEQ ID NO: 9, que es una forma de empalme novedosa de una proteasa específica de ubiquitina. Esta forma de empalme novedosa se caracteriza por 1 inserción en la siguiente localización: Pos12-Pos48. Tabla 3(b): USP_N11: Variante de empalme novedosa -secuencia de nucleótidos. La Tabla 3(b) ilustra la SEQ ID NO: 10, que es la secuencia de nucleótidos correspondiente a la Tabla 3(a). Tabla 3(c): Secuencia de aminoácidos de referencia DERWENT AAU82713. La Tabla 3(c) ilustra la SEQ ID NO: 11, que es la secuencia de aminoácidos de referencia con la que se ha comparado la forma de empalme novedosa de la Tabla 3(a). Tabla 3(d): Secuencia de nucleótidos de referencia. La Tabla 3(d) ilustra la SEQ ID NO: 12, que es la secuencia de nucleótidos de referencia correspondiente a la Tabla 3(c).

Descripción Detallada de la Invención Todas las solicitudes de patente, patentes, y referencias a la literatura citadas en la presente, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. En la práctica de la presente invención, se emplean muchas técnicas con encionales en biología molecular, microbiología, y ADN recombinante. Estas técnicas son bien conocidas y se explican, por ejemplo, en Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes I, II y lll, 1997 (F. M. Ausubel, Editor); Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; DNA Cloning : A Practical Approach , Volúmenes I y II, 1985 (D. N. Glover, Editor); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M.L. Gait, Editor); Nucleic Acid Hybridization , 1985 (Hames y Higgins); Transcription and Translation , 1984 (Hames y Higgins, Editores); Animal Cell Culture, 1986 (R.l. Freshney, Editor); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbai, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; la serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J.H. Miller y M.P. Calos, Editores, Cold Spring Harbor Laboratory); y Methods in Enzymology, Volumen 154 y Volumen 155 (Wu y Grossman, y Wu, Editores, respectivamente). La invención se refiere a la identificación de variantes de empalme novedosas de proteasas específicas de ubiquitina humana conocidas como DUBs o enzimas desubiquitinizantes. Las variantes de empalme novedosas de la invención se proporcionan en las Tablas 1(a), 2(a), y 3(a), las cuales corresponden a las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEC ID NO: 5, y SEQ ID NO: 9, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos correspondientes se proporcionan en las Tablas 1(b), 2(b), y 3(b), las cuales son las SEQ ID NO: 2, SEC ID NO: 6, y SEQ ID NO: 10, respectivamente. Estas secuencias son variantes de empalme de las secuencias de referencia DERWENT AAU82706, AAU82714, y AAU82713, respectivamente. La invención abarca secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos que son sustancialmente homologas a las secuencias proporcionadas en las Tablas 1, 2 y 3. Sin embargo, se entiende que se excluyen cualesquiera secuencias de aminoácidos dadas a conocer antes de esta invención. El término "sustancialmente homologas", cuando se utiliza en la presente con respecto a una secuencia, significa que una secuencia, al compararse con su secuencia de referencia correspondiente, tiene sustancialmente la misma estructura y función. Cuando una posición en la secuencia de referencia está ocupada por el mismo aminoácido o nucleótido, las moléculas son homologas en esa posición (es decir, hay identidad en esa posición). En el caso de una comparación de secuencias de ácidos nucleicos, también hay homología en cierta posición en donde el triplete de codones que incluye al nucleótido codifica el mismo aminoácido en ambas moléculas comparadas, debido a la degeneración del código genético. El porcentaje de homología entre la secuencia sustancialmente homologa y la secuencia de referencia deseablemente es de cuando menos el 80 por ciento, más deseablemente de cuando menos el 85 por ciento, de preferencia de cuando menos el 90 por ciento, más preferiblemente de cuando menos el 95 por ciento, y todavía de una manera muy preferible de cuando menos el 99 por ciento. Las comparaciones de secuencias se llevan a cabo utilizando un algoritmo de alineación de secuencias de Smith-Waterman (ver, por ejemplo, Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall, Londres: 1995. ISBN 0-412-99391-0, o en http://wvvw-to.usc.edu/software/seqaln/index.html). Dentro de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, también están comprendidas las secuencias que se hibridan a las secuencias de ácidos nucleicos de la presente ¡nvención bajo condiciones de hibridación restringentes. Las condiciones de hibridación restringentes se definen como una señal de hibridación positiva observada después de lavar en dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 7 por ciento, NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 2X, SDS al 0.1 por ciento a 50°C, más deseablemente en dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 7 por ciento, NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 1X, SDS al 0.1 por ciento a 50°C, todavía más deseablemente en dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 7 por ciento, NaP04 0.5M, EDTA 1 M a 50°C con lavado en SSC 0.5X, SDS al 0.1 por ciento a 50°C, de preferencia en dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 7 por ciento, NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0.1X, SDS al 0.1 por ciento a 50°C, más preferiblemente en dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 7 por ciento, NaP04 0.5M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en SSC 0.1X, SDS al 0.1 por ciento a 65°C. Las secuencias de ácidos nucleicos de la invención pueden incorporar al Marco de Lectura Abierta (ORF), y también pueden incorporar la Región No Traducida 5' (UTR) o una porción de la misma. La invención también puede incluir a cualesquiera elementos promotores, potenciadores, reguladores, terminadores, y de localización, y al uso de estos elementos en conjunto con los genes heterólogos.

La definición de las secuencias homologas proporcionada anteriormente abarca a los fragmentos de las variantes de empalme novedosas de las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos de la presente invención. Un "fragmento" significa cualquier molécula de péptido que tiene cuando menos 5, 10, 15, u opcionalmente cuando menos 25, 35, ó 45 aminoácidos contiguos de la variante de empalme novedosa. Un fragmento de una secuencia de ácido nucleico comprende cuando menos 50, opcionalmente cuando menos 75, o cuando menos 100 nucleótidos consecutivos. Sin embargo, no se debe interpretar que los fragmentos a los que pertenece la invención abarquen fragmentos que puedan haberse dado a conocer antes de la presente invención. Los fragmentos pueden retener una o más de las actividades biológicas de la proteína, por ejemplo la capacidad para enlazarse con ubiquitina o para hidrolizar los enlaces peptídicos, así como los fragmentos que se pueden utilizar como un inmunógeno para generar anticuerpos de proteasa de ubiquitina. Los fragmentos biológicamente activos pueden comprender un dominio o motivo, por ejemplo un sitio catalítico, firma UBP ó UCH, regiones asociadas con membrana y sitios para glicosilación, fosforilación de quinasa de proteína dependiente de cAMP y cGMP, fosforilación de quinasa C de proteína, fosforilación de quinasa II de caseína, fosforilación de quinasa de tirosina, N-miristoilación, y amidación. Otros posibles fragmentos incluyen al sitio catalítico o al dominio que incluye los sitios de reconocimiento de ubiquitina de cisteína o histidina, los sitios de enlace de ubiquitina, sitios importantes para la interacción subunitaria, y sitios importantes para llevar a cabo las demás funciones de la proteasa. Estos dominios o motivos se pueden identificar por medio de procedimientos computarizados de búsqueda de homologías de rutina. Por ejemplo, los fragmentos pueden extenderse en una o ambas direcciones desde el sitio funcional para abarcar 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, o hasta 100 aminoácidos. Además, los fragmentos pueden incluir subfragmentos de los dominios específicos mencionados anteriormente, cuyos sub-fragmentos retengan la función del dominio a partir del cual se deriven. Estas regiones se pueden identificar mediante métodos bien conocidos que involucran análisis computarizado de homologías. La invención también proporciona fragmentos con propiedades inmunogénicas. Éstos contienen una porción que lleva epítopo de la proteasa de ubiquitina y sus variantes. Estos péptidos que llevan epítopo son útiles para reproducir anticuerpos que se enlacen de una manera específica al polipéptido o región o fragmento de la proteasa de ubiquitina.

Estos péptidos pueden contener cuando menos 10, 12, cuando menos 14, o entre cuando menos aproximadamente 15 y aproximadamente 30 aminoácidos. Los ejemplos no limitantes de los polipéptidos antigénicos que se pueden utilizar para generar anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, péptidos derivados a partir de un sitio extracelular con regiones que tengan un alto índice de antigenicidad (ver la Figura 3 de la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US 6,451,994). Sin embargo, también se abarcan los anticuerpos intracelularmente hechos ("intracuerpos"), los cuales reconocerían las regiones peptídicas intracelulares. Los polipéptidos de proteasa de ubiquitina que llevan epítopo se pueden producir por cualquier medio convencional (Houghten, R.A. (1985), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 5131-4135). En la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,631,211 se describe la síntesis simultánea de múltiples péptidos. Los fragmentos pueden estar separados (o fusionados con otros aminoácidos o polipéptidos), o pueden estar dentro de un polipéptido más grande. Además, puede haber varios fragmentos comprendidos dentro de un solo polipéptido más grande. En una modalidad, un fragmento diseñado para su expresión en un huésped, puede tener regiones heterólogas de pre- y pro-polipéptido fusionadas al término amino del fragmento de proteasa de ubiquitina, y una región adicional fusionada al término carboxilo de! fragmento. Los fragmentos se pueden utilizar como una sonda de hibridación para una biblioteca de ADNc, con el fin de aislar al gen de longitud completa, y con el fin de aislar otros genes que tengan una alta similitud de secuencia o una actividad biológica similar. Las sondas de este tipo de preferencia tienen cuando menos aproximadamente 30 bases, y pueden contener, por ejemplo, de aproximadamente 30 a aproximadamente 50 bases, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 bases, de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 bases, o más de 200 bases. La sonda también se puede utilizar con el objeto de identificar un clon de ADNc correspondiente a una transcripción de longitud completa y un clon o clones genómicos que contengan al gen de longitud completa, incluyendo regiones reguladoras y promotoras, exones, e intrones. Un ejemplo de un rastreo comprende aislar la región codificante del gen mediante la utilización de la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótido. Se utilizan oligonucleótidos marcados que tengan una secuencia complementaria a aquélla del gen de la presente invención, con el fin de rastrear una biblioteca de ADNc humano, ADN genómico, o ARNm, con el objeto de determinar con cuáles miembros de la biblioteca se híbrida la sonda.

La presente invención también abarca "derivados" de las secuencias de aminoácidos. Un "derivado" es una secuencia relacionada con la secuencia de aminoácidos, ya sea al nivel de los aminoácidos (por ejemplo, una secuencia homologa en donde ciertos aminoácidos que se presentan naturalmente son reemplazados con sustitutos de aminoácidos sintéticos), o al nivel tridimensional (por ejemplo, en donde las moléculas tienen aproximadamente la misma forma y conformación que la secuencia de aminoácidos). Por consiguiente, los derivados incluyen mutantes, miméticos, mimótopos, análogos, formas monoméricas, y equivalentes funcionales. Las supresiones, adiciones o sustituciones de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos, que den como resultado un cambio silencioso, producen un producto genético diferencialmente expresado, funcionalmente equivalente. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos con base en la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o en la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano, y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina; los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina, e histidina; y los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Los derivados pueden incluir aquéllos en los que un residuo de aminoácido sustituido no es uno codificado por el código genético, en donde se incluye un grupo sustituyente, en donde el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o en donde los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora, o una secuencia para la purificación del polipéptido maduro, o una secuencia de pro-proteína. Las modificaciones conocidas incluyen, pero no se limitan a, acetilación, acilación, ribosilación-ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de una fracción heme, unión covalente de un nucleótido o un derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o un derivado de lípido, unión covalente de fosfatidil- inositol, reticulación, c i elación, formación de enlace de disulfuro, desmetilación, formación de reticulaciones covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación-gamma, glicosilación, formación de ancla de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, pren ilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación, y ubiquitinación. Estas modificaciones son bien conocidas por los expertos en la materia, y se han descrito con gran detalle en la literatura científica. Por ejemplo, se describen varias modificaciones particularmente comunes, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, carboxilación-gamma de residuos de ácido glutámico, hidroxilación, y ribosilación-ADP, en la mayoría de los textos básicos, tales como Proteins-Structure and Molecular Properties, 2a Edición, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993). Están disponibles muchas revisiones detalladas sobre esta materia, tales como por Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Editor, Academic Press, Nueva York 1-12 (1983); Seifter y- colaboradores (1990), Meth. Enzymol., 182: 626-646), y Rattan y colaboradores (1992), Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62). Como es también bien conocido, los polipéptidos no son siempre enteramente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden estar ramificados como un resultado de la ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificación, en general como un resultado de eventos posteriores a la traducción, incluyendo eventos de procesamiento naturales y eventos provocados por la manipulación humana que no se presenten naturalmente. Los polipéptidos circulares, ramificados, y circulares ramificados se pueden sintetizar mediante procesos naturales sin traducción y mediante métodos sintéticos. Se pueden presentar modificaciones en cualquier parte de un polipéptido, incluyendo la estructura base del péptido, las cadenas laterales de aminoácidos, y los términos amino o carboxilo. El bloqueo del grupo amino o carboxilo en un polipéptido, o ambos, mediante una modificación covalente, es común en los polipéptidos que se presentan naturalmente y sintéticos. Por ejemplo, el residuo amino-terminal de los polipéptidos hechos en E. coli, antes del procesamiento proteolítico, casi invariablemente será de N-form i l-metionina. Las modificaciones pueden ser una función de la manera en que se hace la proteína. Para los polipéptidos recombinantes, por ejemplo, las modificaciones serán determinadas por la capacidad de modificación posterior a la traducción de la célula huésped, y por las señales de modificación en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. De conformidad con lo anterior, cuando se desea la glicosilación, un polipéptido debe expresarse en un huésped glicosilante, en general una célula eucariótica. Las células de insecto con frecuencia llevan a cabo las mismas glicosilaciones posteriores a la traducción que las células de mamífero y, por esta razón, se han desarrollado sistemas de expresión de células de insectos para expresar de una manera eficiente las proteínas de mamífero que tengan patrones de glicosilación nativos. Se aplican consideraciones similares a otras modificaciones. Puede estar presente el mismo tipo de modificación en el mismo grado o en un grado variable en varios sitios de un polipéptido dado. También, un polipéptido dado puede contener más de un tipo de modificación. "Funcionalmente equivalente", como se utiliza en la presente, puede referirse a una proteína o a un polipéptido capaz de exhibir una actividad in vivo o in vitro sustancialmente similar a la de los productos genéticos endógenos diferencialmente expresados codificados por las secuencias genéticas diferencialmente expresadas descritas anteriormente. "Funcionalmente equivalente" también puede referirse a las proteínas o a los polipéptidos capaces de interactuar con otras moléculas celulares o extracelulares de una manera sustancialmente similar a la manera en la cual lo haría la porción correspondiente del producto genético endógeno diferencialmente expresado. Por ejemplo, un péptido "funcionalmente equivalente" sería capaz, en un inmunoensayo, de disminuir el enlace de un anticuerpo con el péptido correspondiente (es decir, el péptido cuya secuencia de aminoácidos fue modificada para lograr el péptido "funcionalmente equivalente") de la proteína endógena, o con la proteína endógena misma, en donde el anticuerpo se reprodujo contra el péptido correspondiente de la proteína endógena. Una concentración equimolar del péptido funcionalmente equivalente disminuirá el enlace anteriormente mencionado del péptido correspondiente por cuando menos aproximadamente el 5 por ciento, de preferencia entre aproximadamente el 5 por ciento y el 10 por ciento, de una manera más preferible entre aproximadamente el 10 por ciento y el 25 por ciento, todavía más preferiblemente entre aproximadamente el 25 por ciento y el 50 por ciento, y de una forma muy preferible entre aproximadamente el 40 por ciento y el 50 por ciento. Por ejemplo, los péptidos funcionalmente equivalentes pueden ser completamente funcionales, o pueden carecer de función en una o más actividades. Por consiguiente, en la presente invención, las variaciones pueden afectar a la función, por ejemplo, del enlace de ubíquitina, del reconocimiento de ubiquitina, de la interacción con la proteína de sustrato ubiquitinada, tal como enlace o proteólisis, de la interacción subunitaria, en particular dentro del proteasoma, de la activación o el enlace por ATP, de la expresión por el desarrollo, de la expresión temporal, de la expresión específica del tejido, interactuando con los componentes celulares, tales como los factores reguladores de transcripción, y en particular los factores reguladores de transcripción de acción-fraps, de la disociación proteolítica de los enlaces peptídicos en la poli-u i q u i t i n a y de los enlaces peptídicos entre la ubiquitina o poli-ubiquitina y la proteína de sustrato, y de la disociación proteolítica de los enlaces peptí icos entre la ubiquitina o poli-ubiquitina y un péptido o aminoácido. Las variantes completamente funcionales normalmente contienen sólo una variación conservadora o una variación en los residuos no críticos o en las regiones no críticas. Las variantes funcionales también pueden contener sustitución de aminoácidos similares, lo cual da como resultado ningún cambio o un cambio insignificante en la función. De una manera alternativa, estas sustituciones pueden afectar positiva o negativamente la función hasta algún grado. Las variantes no funcionales típicamente contienen una o más sustituciones, supresiones, inserciones, inversiones no conservadoras de aminoácidos, o un truncamiento o una sustitución, inserción, inversión, o supresión en un residuo crítico o en una región crítica. Como se indicó, las variantes se pueden presentar naturalmente, o se pueden hacer por medios recombinantes o mediante síntesis química, para proporcionar características útiles y novedosas para el polipéptido de proteasa de ubiquitina. Esto incluye prevenir la inmunogenicidad de las formulaciones farmacéuticas mediante la prevención de la acumulación de proteína. Las variaciones útiles incluyen además la alteración de la actividad catalítica. Por ejemplo, una modalidad involucra una variación en el sitio de enlace que da como resultado el enlace pero no la hidrólisis, o una hidrólisis más lenta, del enlace peptídico. Una variación útil adicional da como resultado un mayor índice de hidrólisis del enlace peptídico. Una variación útil adicional en el mismo sitio puede dar como resultado una afinidad más alta o más baja por el sustrato. Las variaciones útiles también incluyen cambios que proporcionan afinidad por una proteína de sustrato ubiquitinada diferente de aquélla que se reconoce normalmente. Otras variaciones útiles que involucran un reconocimiento alterado afectan al reconocimiento del tipo de sustrato normalmente reconocido. Por ejemplo, una variación podría dar como resultado el reconocimiento del sustrato intacto ubiquitinado pero no de los restos del sustrato, tales como el aminoácido o péptido ubiquitinado que son productos de la proteólisis que resultan de la hidrólisis del sustrato ubiquitinado intacto. De una manera alternativa, la proteasa se podría variar de tal manera que uno o más de los productos restantes sean reconocidos, pero no el sustrato de proteína intacto. Otra variación afectaría a la capacidad de la proteasa para rescatar a una proteína ubiquitinada. Por consiguiente, los sustratos de proteína que son normalmente rescatados de la proteólisis estarían sujetos a degradación. Otras variaciones útiles afectan a la capacidad de la proteasa para ser inducida por activadores, tales como citoquinas, incluyendo, pero no limitándose a, aquéllas que se dan a conocer en la presente. Otra variación útil afectaría al reconocimiento del sustrato de ubiquitina, de tal manera que la enzima no podría reconocer una o más de una poli-ubiquitina lineal, poli-ubiquitina de cadena ramificada, sustrato poli-ubiquitinado lineal, o sustrato de poli-ubiquitina de cadena ramificada. Las variaciones específicas incluyen truncamiento en donde, por ejemplo, se suprime un dominio HIS, dando la variación como resultado una reducción o pérdida de la actividad de desubiquitinación. Otra variación útil incluye una que impide la activación por el ATP. Otra variación útil proporciona una proteína de fusión en donde uno o más dominios o sub- regiones se fusionan operativamente con uno o más dominios o sub-regiones de otro UBP o de un UCH. De una manera específica, se puede introducir un dominio o una sub-región que proporcione una función de rescate a una enzima que normalmente no tenga esta función, o para el reconocimiento de un sustrato específico en donde no esté disponible el reconocimiento para la enzima original. Otras variaciones incluyen aquéllas que afectan al reconocimiento de ubiquitina, o al reconocimiento de una proteína de sustrato ubiquitinada. Otras variaciones podrían afectar a la interacción subunitaria específica, en particular en el proteasoma. Otras variaciones afectarían a la expresión por el desarrollo, temporal, o específica del tejido. Otras variaciones afectarían a la interacción con los componentes celulares, tales como los factores reguladores de transcripción. Los aminoácidos que sean esenciales para la función se pueden identificar mediante métodos conocidos en este campo, tales como mutagénesis dirigida al sitio, o mutagénesis de exploración de alanina (Cunningham y colaboradores (1985), Science 244: 1081-1085). El último procedimiento introduce mutaciones de alanina individuales en cada residuo de la molécula. Luego las moléculas mutantes resultantes se prueban para determinar su actividad biológica, tal como hidrólisis de péptidos in vitro, o actividad in vitro dependiente de ubiquitina, tal como la actividad proliferativa, la transducción de señal mediada por el receptor, y otros procesos celulares, incluyendo, pero no limitándose a, aquéllos dados a conocer en la presente, que son una función del sistema de ubiquitina. Los sitios que son críticos para el enlace o el reconocimiento también se pueden determinar mediante análisis estructural, tal como cristalización, resonancia magnética nuclear, o marcado por fotoafinidad (Smith y colaboradores (1992), J. Mol. Biol., 224: 899-904; de Vos y colaboradores (1992), Science, 255: 306-312). Los ensayos para desubiquitinizar la actividad enzimática son bien conocidos en la técnica, y se pueden encontrar, por ejemplo, en Zhu y colaboradores (1997), Journal of Biological Chemistry, 272: 51-57, Mitch y colaboradores (1999), American Journal of Physiology, 276: C1132-C1138, Liu y colaboradores (1999), Molecular and Cell Biology, 19: 3029-3038, y tales como los citados en diferentes revisiones, por ejemplo Ciechanover y colaboradores (1994), The FASEB Journal, 8: 182-192, Ciechanover (1994), Biol. Chem., Hoppe-Seyler 375: 565-581, Hershko y colaboradores (1998), Annual Review of Biochemistry 67: 425-479, Swartz (1999), Annual Review of Medicine, 50: 57-74, Ciechanover (1998), EMBO Journal, 17: 7151-7160, y D'Andrea y colaboradores (1998), Critica! Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 33: 337-352. Estos ensayos incluyen, pero no se limitan a, la desaparición del sustrato, incluyendo la reducción en la cantidad de poli-ubiquitina o de proteína de sustrato ubiquitinada o de restos de proteína, la aparición de productos intermediarios y finales, tal como la aparición de monómeros de ubiquitina libres, cambio general de proteína, cambio específico de proteína, enlace de ubiquitina, enlace con proteína de sustrato ubiquitinada, interacción subunitaria, interacción con ATP, interacción con los componentes celulares, tales como los factores reguladores de acción-rrans, estabilización de proteínas específicas, y similares. Una "célula huésped", como se utiliza en la presente, se refiere a una célula procariótica o eucariótica que contiene ADN heterólogo que se ha introducido en la célula por cualquier medio, por ejemplo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección, transformación, infección viral, y similares. "Heterólogo", como se utiliza en la presente, significa "de diferente origen natural", o representa un estado no natural. Por ejemplo, si una célula huésped se transforma con un ADN o un gen derivado de otro organismo, en particular de otra especie, ese gen es heterólogo con respecto a esa célula huésped, y también con respecto a los descendientes de la célula huésped que puedan llevar ese gen. De una manera similar, heteróloga se refiere a una secuencia de nucleótidos derivada a partir de, e insertada en, el mismo tipo de célula natural original, pero que está presente en un estado no natural, por ejemplo un número de copias diferente, o bajo el control de diferentes elementos reguladores. Un "vector" es una molécula de ácido nucleico en la que se puede insertar el ácido nucleico heterólogo, el cual luego se puede introducir en una célula huésped apropiada. Los vectores de preferencia tienen uno o más orígenes de réplica, y uno o más sitios en los cuales se puede insertar el ADN recombinante. Los vectores con frecuencia tienen elementos convenientes mediante los cuales se pueden seleccionar células con vectores a partir de aquéllas sin vectores, por ejemplo, las que codifican genes de resistencia a fármacos. Los vectores comunes incluyen plásmidos, genomas virales, y (primordialmente en levadura y bacterias) "cromosomas artificiales". Los "plásmidos" se designan en general en la presente mediante una p minúscula precedida y/ o seguida por letras mayúsculas y/o números, de acuerdo con las convenciones de nombramiento estándares que son familiares para los expertos en la materia. Los plásmidos de partida dados a conocer en la presente están comerciaimente disponibles, están públicamente disponibles sobre una base sin restricciones, o bien se pueden construir a partir de los plásmidos disponibles mediante la aplicación rutinaria de los procedimientos publicados bien conocidos. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y expresión que se pueden utilizar de conformidad con la presente invención son bien conocidos y están fácilmente disponibles para los expertos en este campo. Más aún, los expertos pueden construir fácilmente cualquier número de otros plásmidos adecuados para utilizarse en la invención. Las propiedades, construcción, y uso de estos plásmidos, así como de otros vectores, en la presente invención, serán fácilmente aparentes para los expertos, a partir de la presente divulgación. El término "aislado" significa que el material se remueve de su medio ambiente original (por ejemplo, ei medio ambiente natural si se presenta naturalmente). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que se presente naturalmente presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado, inclusive si subsecuentemente se vuelve a introducir en el sistema natural. Estos polinucleótidos podrían ser parte de un vector, y/o estos polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y todavía estar aislados, en que tal vector o composición no sea parte de su medio ambiente natural. Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de control de transcripción" se refiere a secuencias de ADN, tales como secuencias iniciadoras, secuencias potenciadoras, y secuencias promotoras, las cuales inducen, reprimen, o controlan de otra manera la transcripción de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteína con las que se enlazan operativamente.

Las "secuencias de control de transcripción humanas" son cualquiera de las secuencias de control de transcripción que se presentan naturalmente en el genoma humano, mientras que las "secuencias de control de transcripción no humanas" son cualesquiera secuencias de control de transcripción que no se encuentren en el genoma humano. Se puede utilizar una variedad de sistemas de vectores de expresión del huésped para expresar las secuencias de codificación genética de la invención. Estos sistemas de expresión del huésped representan vehículos mediante los cuales se pueden producir las secuencias de codificación de interés, y subsecuentemente se pueden purificar, pero también representan a las células que, cuando se transforman o se transfectan con las secuencias de codificación de nucleótidos apropiadas, pueden exhibir la proteína genética diferencialmente expresada de la invención in situ. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganis os tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, de ADN de plásmido, o de ADN de cósmido, que contengan secuencias de codificación de la proteína genética diferencialmente expresada; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinante que contengan las secuencias de codificación de la proteína genética diferencialmente expresada; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, baculovirus) que contengan las secuencias de codificación de la proteína genética diferencialmente expresada; sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión de virus recombinante (por ejemplo, virus de mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformados con vectores de transformación de plásmido recombinante (por ejemplo, plásmido Ti) que contengan las secuencias de codificación de la proteína genética diferencialmente expresada; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que alojen construcciones de expresión recombinante que contengan promotores derivados a partir del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína), o a partir de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de virus de vacuna de 7.5K). En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar de manera conveniente un número de vectores de expresión, dependiendo del uso pretendido para la proteína genética diferencialmente expresada que se esté expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una gran cantidad de esta proteína, para la generación de anticuerpos o para rastrear bibliotecas de péptidos, por ejemplo, pueden ser deseables vectores que dirijan la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifiquen fácilmente. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión Pur278 de E. coli (Ruther y colaboradores, 1983, EMBO J., 2: 1791), en donde la secuencia de codificación de la proteína genética diferencialmente expresada se puede ligar individualmente en el vector dentro del marco con la región codificante de lac Z, de tal manera que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem., 264: 5503-5509); y similares. También se pueden utilizar los vectores PGEX para expresar los polipéptidos extraños como proteínas de fusión con S-transferasa de glutationa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de las células usadas mediante adsorción a perlas de glutationa-agarosa, seguido por elución en la presencia de glutationa libre. Los vectores PGEX se diseñan para incluir sitios de disociación de proteasa de trombina o de factor Xa, de tal manera que se pueda liberar la proteína genética objetiva clonada desde la fracción GST. Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado utilizando vectores que contengan una unidad de transcripción de reportero que carezca de una región promotora, tal como una unidad de transcripción de acetil-transferasa de cloranfenicol ("cat"), corriente abajo del sitio o sitios de restricción, para introducir un fragmento promotor candidato; es decir, un fragmento que pueda contener un promotor. Como es bien conocido, la introducción en el vector de un fragmento que contenga promotor en el sitio de restricción corriente arriba del gen cat engendra la producción de actividad de CAT, la cual se puede detectar mediante ensayos de CAT convencionales. Los vectores adecuados para este fin son bien conocidos y están fácilmente disponibles. Dos de estos vectores son pKK232-8 y pCM7. Por consiguiente, los promotores para la expresión de los polinucleótidos de la presente invención incluyen no solamente a los promotores bien conocidos y fácilmente disponibles, sino también a los promotores que se pueden obtener fácilmente mediante la técnica anterior, utilizando un gen reportero. Entre los promotores bacterianos conocidos para la expresión de polinucleótidos y polipéptidos de conformidad con la presente invención, están los promotores lacl y lacZ de E. coli, los promotores T3 y T7, el promotor tac T5, los promotores lambda PR, PL, y el promotor trp. Entre los promotores eucarióticos conocidos adecuados en este aspecto están el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de quinasa de timidina de HSV, los promotores SV40 temprano y tardío, los promotores de LTRs retrovirales, tales como aquéllos del virus de sarcoma de Rous ("RSV"), y los promotores de metalotioneína, tales como el promotor de metalotioneína-l de ratón. En un sistema de insecto, el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) es uno de los diferentes sistemas de insectos que se pueden utilizar como un vector con el fin de expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia de codificación del gen diferencialmente expresado se puede clonar individualmente en las regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus, y se puede poner bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina). La inserción de éxito de la secuencia de codificación del gen diferencialmente expresado dará como resultado la inactivación del gen de polihedrina y la producción del virus recombinante no obstruido (es decir, el virus que carece del recubrimiento proteináceo codificado por el gen de polihedrina). Entonces se utilizan estos virus recombinantes para infectar las células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado. (Por ejemplo, ver Smith y colaboradores, 1983, J. Virol., 46: 584; Smith, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,215,051). En las células huéspedes de mamífero, se pueden utilizar un número de sistemas de expresión basados en virus. En los casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, la secuencia de codificación del gen diferencialmente expresado de interés se puede ligar a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Luego se puede insertar este gen quimérico en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región E1 ó E3) dará como resultado un virus recombinante que sea viable y capaz de expresar la proteína genética diferencialmente expresada en los huéspedes infectados. (Por ejemplo, ver Logan y Shenk, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci., EUA 81: 3655-3659). También se pueden requerir señales de inicio específicas para la traducción eficiente de las secuencias de codificación del gen diferencialmente expresado insertadas. Estas señales incluyen al codón de inicio ATG y a las secuencias adyacentes. En los casos en los que se inserta un gen diferencialmente expresado entero, incluyendo su propio codón de inicio y las secuencias adyacentes, en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que solamente se inserta una porción de la secuencia de codificación del gen diferencialmente expresado, se deben proporcionar señales de control de traducción exógenas, incluyendo, tal vez, al codón de inicio ATG. Adicionalmente, el codón de inicio debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación deseada con el fin de asegurar la traducción del inserto entero. Estas señales de control de traducción exógenas y codones de inicio pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos potenciadores de transcripción apropiados, terminadores de transcripción, etc. (ver Bittner y colaboradores, 1987, Methods in Enzymol. , 153: 516-544). La selección de los vectores y promotores apropiados para la expresión en una célula huésped es un procedimiento bien conocido, y las técnicas requeridas para la construcción de vectores de expresión, la introducción del vector en el huésped, y la expresión en el huésped por sí mismo, son habilidades de rutina en la técnica. En términos generales, los vectores de expresión recombinante incluirán los orígenes de réplica, un promotor derivado a partir de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo, y un marcador seleccionable para permitir el aislamiento de las células que contengan al vector después de exponerse al vector. En adición, se puede seleccionar una célula huésped que module la expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto genético en la forma específica deseada. Estas modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, disociación) de productos de proteína, pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células huéspedes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento posterior a la traducción y la modificación de proteínas. Se pueden seleccionar líneas celulares o sistemas huéspedes apropiados con el fin de asegurar la modificación y procesamiento correctos de la proteína extraña expresada. Para este fin, se pueden utilizar células huéspedes eucarióticas que posean la maquinaria celular para el procesamiento apropiado de la transcripción primaria, la glicosilación, y la fosforilación del producto genético. Estas células huéspedes de mamífero incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, etc. Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden diseñar líneas celulares que expresen establemente la proteína genética diferencialmente expresada. En lugar de utilizar vectores de expresión que contengan orígenes de réplica virales, las células huéspedes se pueden transformar con ADN controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras, mejoradores, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. En seguida de la introducción del ADN extraño, se puede permitir que las células diseñadas crezcan durante 1 a 2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección, y permite que las células integren establemente el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos, los cuales a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares. Este método se puede emplear convenientemente para diseñar líneas celulares que expresen la proteína genética diferencialmente expresada. Estas líneas celulares diseñadas pueden ser particularmente útiles en el rastreo y la evaluación de los compuestos que afecten a la actividad endógena de la proteína genética diferencialmente expresada. Se pueden utilizar un número de sistemas de selección, incluyendo, pero no limitándose a, los genes de quinasa de timidina del virus de herpes símplex (Wigler y colaboradores, 1977, Cell, 11: 223), fosf o-ribosil-transferasa de hipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 48: 2026), y fosfo-ribosil-transferasa de adenina (Lowy y colaboradores, 1980, Cell, 22: 817), que se pueden emplear en células tk", hgprt", ó aprt", respectivamente. También, se puede utilizar la resistencia a anti-rñetabolitos como la base de selección para los genes dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y colaboradores, 1980, Nati. Acad. Sci. EUA 77: 3567; O'Hare y colaboradores, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78: 1527); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan y Berg, 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 78: 2072); neo, que confiere resistencia al amino-glicósido G-418 (Colberre-Garapin y colaboradores, 1981, J. Mol. Biol. 150: 1); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y colaboradores, 1984, Gene 30: 147). Un sistema de proteína de fusión alternativo permite tener una fácil purificación de las proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en las líneas celulares humanas (Janknecht y colaboradores, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88: 8972-8976). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de vacuna, de tal manera que el marco de lectura abierta del gen se fusione en la traducción con una marca amino-terminal consistente en seis residuos de histidina. Se cargan extractos de células infectadas con el virus de vacuna recombinante sobre columnas de ácido nitrilo-acético Ni2 + -agarosa, y las proteínas marcadas con histidina se eluyen selectivamente con reguladores que contengan imidazol. Cuando se utiliza como un componente en los sistemas de ensayo tales como los descritos más adelante, la proteína genética diferencialmente expresada se puede marcar, ya sea directa o indirectamente, con el objeto de facilitar la detección de un complejo formado entre la proteína genética diferencialmente expresada y una sustancia de prueba. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de sistemas de marcado adecuados, incluyendo, pero no limitándose a, radioisótopos tales como 1251; sistemas marcadores de enzimas que generen una señal calorimétrica o luz detectable cuando se expongan al sustrato; y marcas fluorescentes. Cuando se utiliza la tecnología de ADN recombinante con el fin de producir la proteína genética diferencialmente expresada para estos sistemas de ensayo, puede ser conveniente diseñar proteínas de fusión que puedan facilitar el marcado, la inmovilización, y/o la detección. El marcado indirecto involucra el uso de una proteína, tal como un anticuerpo marcado, que se enlaza específicamente a un producto genético diferencialmente expresado. Estos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, de una sola cadena, fragmentos Fab, y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab. En otro aspecto, los polipéptidos de proteasa específica de ubiquitina de la invención son útiles en los ensayos biológicos relacionados con la función de la proteasa de ubiquitina. Estos ensayos involucran a cualquiera de las funciones o actividades o propiedades conocidas útiles para el diagnóstico y el tratamiento de condiciones relacionadas con ubiquitina o con proteasa de ubiquitina. En la presente se han dado a conocer los ensayos potenciales, e incluyen genéricamente la desaparición del sustrato, la aparición del producto final, y el cambio de proteína general o específico. Los polipéptidos de proteasa específica de ubiquitina también son útiles en los ensayos de rastreo de fármacos, en los sistemas basados en células o sin células. Los sistemas basados en células pueden ser nativos, es decir, células que expresen normalmente la proteasa de ubiquitina, como una biopsia o expandidos en el cultivo celular. Sin embargo, en una modalidad, los ensayos basados en células involucran a las células huéspedes recombinantes que expresan la proteasa de ubiquitina. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para ¡nteractuar con la proteasa de ubiquitina también puede comprender la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para enlazarse preferencialmente con el polipéptido, comparándose con la capacidad de una molécula de enlace conocida (por ejemplo, ubiquitina) para enlazarse con el polipéptido. Los polipéptidos se pueden utilizar para identificar compuestos que modulen la actividad de la proteasa de ubiquitina. Estos compuestos, por ejemplo, pueden aumentar o reducir la afinidad para la poli-ubiquitina, ya sea de cadena lineal o ramificada, para el sustrato de proteína ubiquitinado, o para los restos de sustrato de proteína ubiquitinados. Estos compuestos, por ejemplo, también podrían aumentar o reducir el índice de enlace a estos componentes. Estos compuestos también podrían competir con estos componentes por el enlace con la proteasa de ubiquitina, o podrían desplazar estos componentes enlazados con la proteasa de ubiquitina. Estos compuestos también podrían afectar a la interacción con otros componentes, tales como ATP, otras subunidades, por ejemplo en el complejo 19S, y factores reguladores de transcripción. Por consiguiente, se entiende que estos compuestos se pueden identificar no solamente por medio de la ubiquitina, sino también por medio de cualquiera de los componentes que interactúen funcionalmente con la proteasa dada a conocer. Esto incluye, pero no se limita a, cualquiera de los componentes dados a conocer en la presente. Las proteasas específicas de ubiquitina, sus derivados y fragmentos, se pueden utilizar en rastreos de alta producción para ensayar compuestos candidatos con el fin de determinar su capacidad para enlazarse con la proteasa de ubiquitina. Estos compuestos se pueden rastrear adicionalmente contra una proteasa de ubiquitina funcional con el objeto de determinar el efecto del compuesto sobre la actividad de la proteasa de ubiquitina. Se pueden identificar compuestos que activen (agonistas) o inactiven (antagonistas) a la proteasa de ubiquitina hasta un grado deseado. Se pueden llevar a cabo métodos moduladores in vitro (por ejemplo, mediante el cultivo de la célula con el agente), o, de una manera alternativa, in vivo (por ejemplo, mediante la administración del agente a un sujeto). Los polipéptidos de proteasa específica de ubiquitina de la presente invención se pueden utilizar para rastrear un compuesto con el fin de determinar su capacidad para estimular o inhibir la interacción entre la proteína de proteasa de ubiquitina y una molécula objetiva que interactúe normalmente con la proteína de proteasa de ubiquitina. El objetivo puede ser ubiquitina, sustrato ubiquitinado, o poii-ubiquitina, u otro componente de la senda con la que normalmente interactúa la proteína de proteasa de ubiquitina (por ejemplo, ATP). El ensayo incluye los pasos de combinar la proteína de proteasa de ubiquitina con un compuesto candidato bajo condiciones que permitan que la proteína de proteasa de ubiquitina o el fragmento interactúe con la molécula objetiva, y para detectar la formación de un complejo entre la proteína de proteasa de ubiquitina y el objetivo, o para detectar la consecuencia bioquímica de la interacción con la proteasa de ubiquitina y el objetivo. Se puede ensayar cualquiera de los efectos asociados de la función de proteasa. Esto incluye la producción de productos de hidrólisis, tales como el sustrato de péptido terminal libre, el aminoácido terminal libre a partir del sustrato hidrolizado, la ubiquitina libre, la especie de poli-ubiquitina hidrolizada de más bajo peso molecular, la proteína de sustrato intacta liberada resultante del rescate de la proteólisis, la poli-ubiquitina libre formada a partir de la hidrólisis de la poli-ubiquitina del sustrato intacto, y los restos de sustrato, tales como los aminoácidos y péptidos producidos a partir de la proteólisis de la proteína de sustrato, y los puntos finales biológicos de la senda. La determinación de la capacidad de la proteasa de ubiquitina para enlazarse a una molécula objetiva también se puede llevar a cabo empleando una tecnología, tal como Análisis de Interacción Bimolecular (BIA) en tiempo real. Sjolander y colaboradores (1991), Anal. Chem., 63: 2338-2345, y Szabo y colaboradores (1995), Curr. Opin. Struct. Biol., 5: 699-705. Como se utiliza en la presente, "BIA" es una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore®). Los cambios la resonancia del plasmón superficial (SPR) del fenómeno óptico se pueden utilizar como una indicación de las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas. Los compuestos de prueba de la presente invención se pueden obtener empleando cualquiera de los numerosos planteamientos en los métodos de bibliotecas de combinación conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase sólida o en fase de solución paralelas espacialmente dirigibles; métodos de biblioteca sintéticos que requieren desconvolución; el método de biblioteca de "una perla-un compuesto"; y los métodos de biblioteca sintéticos que utilizan selección de cromatografía por afinidad. El planteamiento de la biblioteca biológica está limitado a las bibliotecas de polipéptidos, mientras que los otros cuatro planteamientos son aplicables a bibliotecas de compuestos de polipéptidos, de oligómeros que no son péptidos, o de moléculas pequeñas (Lam, K.S. (1997), Anticancer Drug Des., 12:145). Los ejemplos de los métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo en DeWitt y colaboradores (1993), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 6909; Erb y colaboradores (1994), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91: 11422; Zuckermann y colaboradores (1994), J. Med. Chem. 37: 2678; Cho y colaboradores (1993), Science 261: 1303; Carell y colaboradores (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell y colaboradores (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; y en Gallop y colaboradores (1994), J. Med. Chem. 37: 1233. Las bibliotecas de compuestos se pueden presentar en solución (por ejemplo, Houghten (1992), Biotechniques 13: 412-421), o sobre perlas (Lam (1991), Nature 354: 82-84), chips (Fodor (1993), Nature 364: 555-556), bacterias (Ladner, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,223,409), esporas (Ladner, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número '409), plásmidos (Culi y colaboradores (1992), Proc. Nati. Acad, Sci. EUA 89: 1865-1869), o sobre fagos (Scott y Smith (1990), Science 249: 386-390); (Devlin (1990), Science 249: 404-406); (Cwirla y colaboradores (1990), Proc. Nati. Acad. Sci. 97: 6378-6382); (Felici (1991), J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner, supra). Los compuestos candidatos incluyen, por ejemplo, 1) péptidos tales como péptidos solubles, incluyendo péptidos de fusión con cola de Ig y miembros de bibliotecas de péptidos aleatorios (ver, por ejemplo, Lam y colaboradores (1991), Nature 354: 82-84; Houghten y colaboradores (1991), Nature 354: 84-86), y bibliotecas moleculares derivadas de química de combinación hechas de aminoácidos en configuración D y L; 2) fosfopéptidos (por ejemplo, miembros de bibliotecas de fosfopéptidos dirigidos aleatorios y parcialmente degenerados, ver, por ejemplo, Songyang y colaboradores (1993), Cell 72: 767-778); 3) anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, antiidiotípicos, quiméricos, y de una sola cadena, así como Fab, F(ab')2, fragmentos de bibliotecas de expresión de Fab, y fragmentos de anticuerpos de enlace de epítopo); y 4) moléculas pequeñas orgánicas e inorgánicas (por ejemplo, moléculas obtenidas a partir de bibliotecas de productos de combinación y naturales). Un compuesto candidato es una proteasa específica de ubiquitina de longitud completa soluble o un fragmento que compita por el enlace del sustrato. Otros compuestos candidatos incluyen las proteasas de ubiquitina mutantes o los fragmentos apropiados que contengan mutaciones que afecten a la función de proteasa de ubiquitina y compitan por el sustrato. De conformidad con lo anterior, un fragmento que compite por el sustrato, por ejemplo con una afinidad más alta, o un fragmento que se enlaza con el sustrato, pero que no hidroliza el enlace peptídico, está abarcado por la invención. Otros compuestos candidatos incluyen la proteína ubiquitinada o el análogo de proteína que se enlaza a la proteasa pero que no se libera o se libera lentamente. Otros compuestos candidatos incluyen a los análogos de los otros sustratos naturales, tales como los restos de sustrato que se enlazan, pero que no se liberan, o se liberan más lentamente. Otros compuestos candidatos incluyen a los activadores de las proteasas, tales como citoquinas, incluyendo, pero no limitándose a, las que se dan a conocer en la presente. La invención proporciona otros puntos finales para identificar compuestos que modulen (estimulen o inhiban) la actividad de proteasa de ubiquitina. Los ensayos involucran típicamente un ensayo de eventos en la senda que indiquen la actividad de proteasa de ubiquitina. Esto puede incluir a los eventos celulares que resultan de la desubiquitinación, tales como el progreso del ciclo celular, la muerte celular programada, la transducción de señal mediada por el factor de crecimiento, o cualquiera de los procesos celulares, incluyendo, pero no limitándose a, los que se dan a conocer en la presente como resultantes de la desubiquitinación. Los fenotipos específicos incluyen cambios en la respuesta a la tensión, réplica del ADN, internalización del receptor, transformación celular o inversión de transformación, y silenciamiento de transcripción. Los ensayos se basan en las múltiples funciones celulares de las enzimas desubiquitinizantes. Estas enzimas actúan en varios niveles diferentes en la regulación de la ubiquitinación de proteína. Una enzima desubiquitinizante puede degradar una cadena de poli-ubiquitina lineal en moléculas de ubiquitina monomérica. Las enzimas desubiquitinizantes, tales como la isopeptidasa-T, pueden degradar una cadena de multi-ubiquitina ramificada en moléculas de ubiquitina monoméricas. Las enzimas desubiquitinizantes pueden remover la ubiquitina de una proteína objetiva conjugada con ubiquitina. La enzima desub i quitin izante, tal como i s o -peptidasa FAF ó PA700, puede remover la poli-ubiquitina de una proteína objetiva ubiquitinada, y de esta manera puede rescatar al objetivo de la degradación por medio del proteasoma 26S. Las enzimas desubiquitinizantes, tales como Doa-4, pueden remover la poli-ubiquitina de los productos de degradación del proteasoma. El resultado de todo esto es regular la reserva celular de la ubiquitina monomérica libre. De conformidad con lo anterior, los ensayos se pueden basar en la detección de cualquiera de los productos producidos por la hidrólisis/desubiquitinación. Adicionalmente, se puede ensayar la expresión de genes que aumenten o disminuyan por la acción de la proteasa de ubiquitina. En una modalidad, la región reguladora de estos genes se puede enlazar operativamente a un marcador que sea fácilmente detectable, tal como luciferasa. De acuerdo con lo anterior, se puede utilizar cualquiera de las funciones biológicas o bioquímicas mediadas por la proteasa de ubiquitina como un ensayo de punto final. Éstas incluyen a todos los eventos bioquímicos o bioquímicos/biológicos descritos en la presente, en las referencias citadas en la presente, incorporadas como referencia para estos objetivos de ensayo de punto final, y otras funciones conocidas por los expertos ordinarios en este campo.

También se pueden rastrear compuestos de enlace y/o activadores mediante la utilización de proteínas de proteasa de ubiquitina quiméricas en donde uno o más dominios, sitios, y similares, como se dan a conocer en la presente, o partes de los mismos, puedan ser reemplazados por sus contra-partes heterólogas derivadas a partir de otras proteasas de ubiquitina. Por ejemplo, se puede utilizar una región de reconocimiento o de enlace que interactúe con diferente especificidad de sustrato y/o afinidad que la proteasa de ubiquitina nativa. De conformidad con lo anterior, está disponible un conjunto diferente de componentes de senda como un ensayo de punto final para la activación. Adicionalmente, los sitios que sean responsables de la especificidad de desarrollo, temporal, o del tejido, pueden ser reemplazados por sitios heterólogos, de tal manera que se pueda detectar la proteasa bajo condiciones de expresión específica del desarrollo, temporal, o específica del tejido. Los polipéptidos de proteasa de ubiquitina también son útiles en los ensayos de enlace de competencia en los métodos diseñados para descubrir compuestos que interactúen con la proteasa de ubiquitina. Por consiguiente, un compuesto se expone a un polipéptido de proteasa de ubiquitina bajo condiciones que permitan que el compuesto se enlace a, o interactúe de otra manera con, el polipéptido.

También se agrega a la mezcla el polipéptido de proteasa de ubiquitina soluble. Si el compuesto de prueba interactúa con el polipéptido de proteasa de ubiquitina soluble, disminuye la cantidad de complejo formado o la actividad desde el objetivo de la proteasa de ubiquitina. Este tipo de ensayo es particularmente útil en los casos en los que se busquen compuestos que interactúen con regiones específicas de la proteasa de ubiquitina. Por consiguiente, el polipéptido soluble que compita con la región de proteasa de ubiquitina objetiva se diseña para contener secuencias de péptidos correspondientes a la región de interés. Se puede emplear otro tipo de ensayo de enlace de competencia para descubrir compuestos que interactúen con sitios funcionales específicos. Como un ejemplo, se pueden agregar ubiquitina y un compuesto candidato a una muestra de la proteasa de ubiquitina. Los compuestos que interactúen con la proteasa de ubiquitina en el mismo sitio que la ubiquitina, reducirán la cantidad de complejo formado entre la proteasa de ubiquitina y la ubiquitina. De conformidad con lo anterior, es posible descubrir un compuesto que impida específicamente la interacción entre la proteasa de ubiquitina y la ubiquitina. Otro ejemplo involucra la adición de un compuesto candidato a una muestra de proteasa de ubiquitina y poli-ubiquitina. Un compuesto que compita con la poli-ubiquitina reducirá la cantidad de hidrólisis o enlace de la poli-ubiquitina con la proteasa de ubiquitina. De conformidad con lo anterior, se pueden descubrir compuestos que ¡nteractúen directamente con la proteasa de ubiquitina y que compitan con la poli-ubiquitina. Estos ensayos pueden involucrar a cualquier otro componente que interactúe con la proteasa de ubiquitina, tal como la proteína de sustrato ubiquitinada, los restos de sustrato ubiquitinados, y los componentes celulares con los que interactúe la proteasa, tales como factores reguladores de transcripción. Con el fin de llevar a cabo ensayos de rastreo de fármacos sin células, es deseable inmovilizar ya sea a la proteasa de ubiquitina, o al fragmento, o a su molécula objetiva, para facilitar la separación de los complejos de las formas no complejadas de una o ambas de las proteínas, así como para acomodar la automatización del ensayo. Las técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices se pueden emplear en los ensayos de rastreo de fármacos. En una modalidad, se puede proporcionar una proteína de fusión que agregue un dominio que per ita que se enlace la proteína a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión de S-transferasa de glutationa/proteasa de ubiquitina, se pueden adsorber sobre perlas de glutationa-sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.), o placas de microtitulación derivadas de glutationa, las cuales entonces se combinan con los usados celulares (por ejemplo, marcados con 35S) y el compuesto candidato, y la mezcla se incuba bajo condiciones que conduzcan a la formación del complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH). En seguida de la incubación, las perlas se lavan para remover cualquier marca no enlazada, y la matriz se inmoviliza y se determina directamente la radiomarca, o en el sobrenadante después de que se disocian los complejos. De una manera alternativa, los complejos se pueden disociar de la matriz, se pueden separar mediante SDS-PAGE, y se puede cuantificar el nivel de proteína de enlace de proteasa de ubiquitina encontrada en la fracción de perlas a partir del gel, empleando técnicas electroforéticas convencionales. Por ejemplo, se puede inmovilizar el polipéptido o su molécula objetiva utilizando conjugación de biotina y estreptavidina, empleando técnica bien conocidas en este campo. De una manera alternativa, se pueden derivar anticuerpos que reaccionen con la proteína pero que no interfieran con el enlace de la proteína a su molécula objetiva, hacia los pozos de la placa, y la proteína se atrapa en los pozos mediante conjugación del anticuerpo. Las preparaciones de un componente objetivo de enlace de proteasa de ubiquitina, tal como ubiquitina, poli-ubiquitina, proteína de sustrato ubiquitinada, resto de proteína de sustrato ubiquitinado, o aminoácido restante ubiquitinado, y un compuesto candidato, se incuban en los pozos presentadores de proteasa de ubiquitina, y se puede cuantificar la cantidad de complejo atrapado en el pozo. Los métodos para detectar estos complejos, en adición a los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados en GST, incluyen la inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos que reaccionen con la molécula objetiva de proteasa de ubiquitina, o que reaccionen con la proteasa de ubiquitina y compitan con la molécula objetiva;, así como ensayos enlazados con enzima que se apoyen en la detección de una actividad enzimática asociada con la molécula objetiva. Los moduladores de la actividad de proteasa de ubiquitina identificados de acuerdo con estos ensayos de rastreo de fármacos se pueden utilizar para tratar a un sujeto con un trastorno mediado por la senda de proteasa de ubiquitina, mediante el tratamiento de las células que expresen la proteasa de ubiquitina. En un aspecto, la invención se refiere a moduladores de la expresión de un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10. De preferencia, estos moduladores son ácidos nucleicos inhibidores, tales como oligonucleótidos anti-sentido, ADN de triple hélice, ARNsi, ribozimas, aptámeros de ARN, o ARN de doble cadena o de una sola cadena. Está bien dentro del conocimiento de la persona experta diseñar ácidos nucleicos que inhiban la expresión de un gen que comprenda una secuencia de ácido nucleico como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10. En una modalidad particularmente preferida, el ácido nucleico inhibidor es un ARNsi. Las moléculas de ARNsi preferidas son típicamente de entre 18 y 30 nucleótidos de longitud, aunque también son adecuadas longitudes mayores para inhibir la expresión del gen objetivo. En una modalidad preferida, las moléculas de ARNsi son de entre 19 y 25 nucleótidos de largo. De conformidad con la presente ¡nvención, se ha encontrado que, en el tejido de cáncer de mama, está presente una cantidad elevada de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9. Por lo tanto, en un aspecto, la presente ¡nvención proporciona un método para el tratamiento de cáncer de mama, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico inhibidor adecuado para inhibir la expresión de un gen que comprenda una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, a un paciente de cáncer de mama. En una modalidad preferida, el ácido nucleico inhibidor es un ARNsi. En otra modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la presente invención proporciona el uso de un ácido nucleico inhibidor, de preferencia un ARNsi, adecuado para inhibir la expresión de un gen, el cual comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, de preferencia la SEQ ID NO: 2, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer de mama. De acuerdo con la presente ¡nvención, se ha encontrado que, en las células de sangre periférica, en particular en las células linfoides, está presente una cantidad elevada de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9. Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de leucemia, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico inhibidor adecuado para inhibir la expresión de un gen que comprenda una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, a un paciente de leucemia. En una modalidad preferida, el ácido nucleico inhibidor es un ARNsi. En otra modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico es la SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, la presente invención proporciona el uso de un ácido nucleico inhibidor, de preferencia un ARNsi, adecuado para inhibir la expresión de un gen, el cual comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, de preferencia la SEQ ID NO: 6, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de leucemia. De conformidad con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico inhibidor, en particular un ARNsi, adecuado para inhibir la expresión de un gen, el cual comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto de la invención, se proporciona un método para el diagnóstico de enfermedades que involucran una proteasa específica de ubiquitina, el cual comprende medir la cantidad de un polinucleótido o polipéptido de la ¡nvención en el tejido de un ser humano, en donde la presencia de una cantidad elevada de este polinucleótido o polipéptido en relación con la cantidad del polinucleótido o polipéptido en el tejido de control normal, es diagnóstico de que este ser humano está sufriendo de una enfermedad relacionada con una proteasa específica de ubiquitina. El término "normal", en el contexto del tejido utilizado para los métodos de diagnóstico de acuerdo con la presente invención, significa el tejido de un ser humano que no esté sufriendo de la enfermedad que se va a diagnosticar. En una modalidad preferida de este aspecto, estos métodos de diagnóstico se llevan a cabo in vitro o ex vivo. En un aspecto preferido de la invención, un método para el diagnóstico de enfermedades que involucran una proteasa específica de ubiquitina, comprende un paso de detección que involucra poner en contacto un tejido con un anticuerpo que se enlace específicamente con un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, y detectar el enlace específico a este anticuerpo con un polipéptido en dicho tejido, en donde la detección del enlace específico a un polipéptido indica la presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9. En una modalidad de la invención, las células que se diagnostican son células de mama, y la enfermedad involucrada incluye, pero no se limita a, trastornos del desarrollo de la mama, inflamaciones, incluyendo, pero no limitándose a, mastitis aguda, mastitis periductal (absceso subareolar recurrente, metaplasia escamosa de los conductos lactíferos), ectasia del conducto mamario, necrosis grasa, mastitis granulomatosa, y las patologías asociadas con implantes de mama de silicona; cambios fibroquísticos; enfermedad de mama proliferativa, incluyendo, pero no limitándose a, hiperplasia epitelial, adenosis esclerosante, y papilomas de conductos pequeños; tumores, incluyendo, pero no limitándose a, tumores estromales tales como fibroadenoma, tumor Phyllodes, y sarcomas; y tumores epiteliales, tales como papiloma de conducto grande; carcinoma de mama, incluyendo carcinoma in situ (no invasivo), que incluye carcinoma ductal in situ (incluyendo enfermedad de Paget), y carcinoma lobular in situ; y carcinoma invasivo (de infiltración), incluyendo, pero no limitándose a, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo no de tipo especial, carcinoma medular, carcinoma coloide (mucinoso), carcinoma tubular, y carcinoma papilar invasivo, y neoplasmas malignos arios. Los trastornos en la mama masculina incluyen, pero no se limitan a, ginecomastia y carcinoma. En otra modalidad de la invención, las células que se diagnostican son células de sangre periférica, en particular células linfoides. Los trastornos incluyen, pero no se limitan a, leucemias. En todavía otra modalidad de la invención, las células que se diagnostican están en el cerebro, e involucran trastornos del cerebro, los cuales incluyen, pero no se limitan a, trastornos que involucran a las neuronas, y trastornos que involucran a la glía, tales como astrocitos, oligodendrocitos, células ependimales, y microglía; edema cerebral, presión intracraneal elevada y herniación, e hidrocéfalo; malformaciones y enfermedades del desarrollo, tales como defectos del tubo neural, anomalías del cerebro anterior, anomalías de la fosa posterior, y siringomielia e hidromielia; lesión cerebral perinatal; enfermedades cerebro-vasculares, tales como aquéllas relacionadas con hipoxia, isquemia, e infarto, incluyendo hipotensión, hipoperf usión, y estados de flujo bajo - isquemia cerebral global e isquemia cerebral focal - infarto por obstrucción del suministro sanguínea local, hemorragia intracraneal, incluyendo hemorragia intracerebral (intraparenquimal), hemorragia subaracnoide y rupturas de aneurismas cerebrales saculados, y malformaciones vasculares, enfermedad cerebrovascular hipertensiva, incluyendo infartos lacunares, hemorragias de hendiduras, y encefalopatía hipertensiva; infecciones, tales como meningitis aguda, incluyendo meningitis piogénica aguda (bacteriana) y meningitis aséptica aguda (viral), infecciones supurantes focales agudas, incluyendo absceso del cerebro, enfisema subdural, y absceso extradural, meningoencefalitis bacteriana crónica, incluyendo tuberculosis y micobacteriosis, neurosífilis, y neuroborrel iosis (enfermedad de Lyme), meningoencefalitis viral, incluyendo encefalitis viral por artrópodos (Arbo), virus de Herpes símplex Tipo 1, virus de Herpes símplex Tipo 2, virus de Varicela-Zóster (herpes zóster), citomegalovirus, poliomielitis, rabia, y virus de inmunodeficiencia humana 1 , incluyendo meningoencefalitis por VIH-1 (encefalitis sub-aguda), mielopatía vacuolar, miopatía asociada con SIDA, neuropatía periférica, y SIDA en niños, leucoencefalopatía multifocal progresiva, panencefalitis esclerosante sub-aguda, menlngoencefalitis fúngica, otras enfermedades infecciosas del sistema nervioso; encefalopatías espongiformes transmisibles (enfermedades de priones); enfermedades desmielinizantes, incluyendo esclerosis múltiple, variantes de esclerosis múltiple, encefalomielitis diseminada aguda y encefalomielitis hemorrágica necrotizante aguda, y otras enfermedades con desmielinación; enfermedades degenerativas, tales como enfermedades que afectan a la corteza cerebral, incluyendo enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Pick, enfermedades degenerativas de los ganglios básales y del tallo cerebral, incluyendo Parkinsonismo, enfermedad de Parkinson ¡diopática (parálisis agitans), parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal , atrofia de sistemas múltiples, incluyendo degeneración estriatonigral, síndrome de Shy-Drager, y atrofia olivopontocerebelar, y enfermedad de Huntington; degeneraciones espinocerebelares, incluyendo ataxias espinocerebelares, incluyendo ataxia de Friedreich, y ataxia-telanglectasia, enfermedades degenerativas que afectan a las m otoneuronas, incluyendo esclerosis lateral amiotrófica (enfermedad de m otoneuronas) , atrofia bulboespinal (síndrome de Kennedy), y atrofia muscular espinal; errores del metabolismo de nacimiento, tales como leucodistrofias, incluyendo enfermedad de Krabbe, leucodistrofia metacromática, adrenoleucodistrofia, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, y enfermedad de Canavan, encefalo-miopatías mitocondriales, incluyendo enfermedad de Leigh y otras encef alomiopatías mitocondriales; enfermedades metabólicas tóxicas y adquiridas, incluyendo deficiencias de vitaminas tales como deficiencia de tiamina (vitamina B1) y deficiencia de vitamina B12, secuelas neurológicas de alteraciones metabólicas, incluyendo hipoglicemia, hiperglicemia, y encefalopatía hepática, trastornos tóxicos, incluyendo lesión inducida por monóxido de carbono, metanol, etanol, y radiación, incluyendo lesión inducida por metotrexato y radiación; tumores, tales como gliomas, incluyendo astrocitoma, incluyendo astrocitoma fibrilar (difuso) y glioblastoma multiforme, astrocitoma pilocítico, xantoastrocitom a pleomórfico, y glioma del tallo cerebral, oligodendroglioma, y ependimoma y lesiones de la masa paraventricular relacionadas, tumores neuronales, neoplasmas pobremente diferenciados, incluyendo meduloblastoma, otros tumores parenquimales, incluyendo linfoma cerebral primario, tumores de células germinales, y tumores parenquimales pineales, meningiomas, tumores metastásicos, síndromes paraneoplásticos, tumores de vaina nerviosa periférica, incluyendo schwannoma, neurofibroma, y tumor de vaina nerviosa periférica maligno (schwannoma maligno), y síndromes neurocutáneos (facomatosis), incluyendo neurofibrom atosis, incluyendo neurofibromatosis Tipo 1 (NF1) y neurofibromatosis Tipo 2 (NF2), esclerosis tuberosa, y enfermedad de Von Hippel-Lindau. Esta invención también se refiere al uso de los polipéptidos de la ¡nvención para proporcionar un objetivo para diagnosticar una enfermedad o la predisposición a una enfermedad mediada por las proteasas específicas de ubiquitina, incluyendo, pero no limitándose a, las enfermedades que involucran a los tejidos en donde se expresan las proteasas de ubiquitina, como se dan a conocer en la presente, tal como en el cáncer de mama. De conformidad con lo anterior, se proporcionan métodos para detectar la presencia, o niveles de, la proteasa de ubiquitina en una célula, tejido, u organismo. El método involucra poner en contacto una muestra biológica con un compuesto capaz de interactuar con la proteasa de ubiquitina, de tal manera que se pueda detectar la interacción. Los polipéptidos también son útiles para el tratamiento de un trastorno caracterizado por cantidades reducidas de estos componentes. Por consiguiente, el aumento o la reducción de la actividad de la proteasa son benéficos para el tratamiento. Los polipéptidos también son útiles para proporcionar un objetivo para el diagnóstico de una enfermedad caracterizada por niveles de sustrato excesivos o reducidos. De acuerdo con lo anterior, cuando el sustrato es excesivo, el uso de los polipéptidos de proteasa puede proporcionar un ensayo de diagnóstico. Adicionalmente, por ejemplo, se pueden utilizar proteasas que tengan una actividad reducida con el fin de diagnosticar las condiciones en las que el sustrato reducido sea el responsable del trastorno. Un agente para detectar la proteasa de ubiquitina es un anticuerpo capaz de enlazarse de una manera selectiva con la proteasa de ubiquitina. Una muestra biológica incluye tejidos, células, y fluidos biológicos aislados a partir de un sujeto, así como tejidos, células, y fluidos presentes adentro de un sujeto. La proteasa de ubiquitina también proporciona un objetivo para diagnosticar la enfermedad activa, o la predisposición a la enfermedad, en un paciente que tenga una proteasa de ubiquitina variante. Por consiguiente, la proteasa de ubiquitina se puede aislar a partir de una muestra biológica, y se puede ensayar para detectar la presencia de una mutación genética que dé como resultado una proteína aberrante. Esto incluye sustitución, supresión, inserción, y reconfiguración de aminoácidos (como el resultado de eventos de empalme aberrantes), y la modificación inapropiada posterior a la traducción. Los métodos analíticos incluyen una movilidad electroforética alterada, digestión de péptidos trípticos alterada, actividad de proteasa de ubiquitina alterada en un ensayo basado en células o sin células, alteración en el enlace a, o en la hidrólisis de, la poli-ubiquitina, enlace a la proteína de sustrato ubiquitinada o hidrólisis de la ubiquitina de la proteína, enlace a los restos de proteína ubiquitinados, incluyendo péptidos o aminoácidos, e hidrólisis de la ubiquitina de los restos, cambio general de proteína, cambio específico de proteína, patrón de enlace de anticuerpos, punto isoeléctrico alterado, secuenciación directa de aminoácidos, y cualquier otra de las técnicas de ensayo conocidas útiles para la detección de mutaciones en una proteína en general o en una proteasa de ubiquitina específicamente, incluyendo los ensayos descritos en la presente. Las técnicas in vivo para la detección de proteasa de ubiquitina incluyen ensayos inmunosorbentes enlazados con enzima (ELISAs), Western blots, inmuno-precipitaciones, e inmuno-fluorescencia. De una manera alternativa, la proteína se puede detectar in vivo en un sujeto mediante la introducción en el sujeto de un anticuerpo anti-proteasa de ubiquitina marcado. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radioactivo cuya presencia y localización en un sujeto se pueda detectar mediante técnicas de formación de imágenes convencionales. Son particularmente útiles los métodos que detectan la variante alélica de la proteasa de ubiquitina expresada en un sujeto, y los métodos que detectan los fragmentos de la proteasa de ubiquitina en una muestra. Los polipéptidos de proteasa de ubiquitina también son útiles en el análisis farmacogenómico. La farmacogenómica trata con las variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta a fármacos debido a una disposición alterada a los fármacos y a una acción anormal en las personas afectadas. Ver, por ejemplo, Eichelbaum, M. (1996), Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23 (10-100): 983-985, y Linder, M.W. (1997), Clin. Chem., 43 (2): 254-266. Las consecuencias clínicas de estas variantes dan como resultado una severa toxicidad de los fármacos en ciertos individuos, o un fracaso terapéutico de los fármacos en ciertos individuos, como un resultado de la variación individual en el metabolismo. Por consiguiente, el genotipo del individuo puede determinar la manera en que actúe un compuesto terapéutico sobre el cuerpo, o la manera en que el cuerpo metabolice el compuesto. Además, la actividad de las enzimas que metabolizan el fármaco afecta tanto a la intensidad como a la duración de la acción del fármaco. Por consiguiente, la farmacogenómica del individuo permite hacer la selección de compuestos efectivos y de dosificaciones efectivas de estos compuestos para el tratamiento profiláctico o terapéutico, basándose en el genotipo del individuo. El descubrimiento de los polimorfismos genéticos en algunas enzimas que metabolizan los fármacos han explicado la razón por la cual algunos pacientes no obtienen los efectos esperados del fármaco, muestran un efecto exagerado del fármaco, o experimentan una seria toxicidad por dosificaciones estándares del fármaco. Los polimorfismos se pueden expresar en el fenotipo del metabolizador extenso y el fenotipo del metabolizador pobre. De conformidad con lo anterior, el polimorfismo genético puede conducir a variantes de proteínas alélicas de la proteasa de ubiquitina, en donde una o más de las funciones de proteasa de ubiquitina en una población son diferentes de aquéllas de otra población. Por consiguiente, los polipéptidos permiten que un objetivo asevere cierta predisposición genética que puede afectar a la modalidad de tratamiento. Por lo tanto, en el tratamiento basado en ubiquitina, el polimorfismo puede dar lugar a regiones catalíticas que sean más o menos activas. De conformidad con lo anterior, necesariamente se modificaría la dosificación para maximizar el efecto terapéutico dentro de una población dada que contenga el polimorfismo. Como una alternativa a la genotipificacíón, se podrían identificar polipéptidos polimórficos específicos. Los polipéptidos de proteasa de ubiquitina también son útiles para monitorear los efectos terapéuticos durante los estudios clínicos y otro trata iento. Por lo tanto, se puede monitorear la efectividad terapéutica de un agente que esté diseñado para aumentar o reducir la expresión genética, los niveles de proteína, o la actividad de la proteasa de ubiquitina, durante el transcurso del tratamiento, utilizando los polipéptidos de proteasa de ubiquitina como un objetivo de punto final. El monitoreo puede ser, por ejemplo, como sigue: (i) obtener una muestra previa a la administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de expresión o la actividad de la proteína en la muestra previa a la administración; (iii) obtener una o más muestras del sujeto posteriores a la administración; (iv) detectar el nivel de expresión o la actividad de la proteína en las muestras posteriores a la administración; (v) comparar el nivel de expresión o de actividad de la proteína en la muestra previa a la administración, con la proteína en la muestra o muestras posteriores a la administración; y (vi) aumentar o reducir la administración del agente al sujeto de conformidad con lo mismo. En otro aspecto de la invención, los métodos para el tratamiento incluyen, pero no se limitan a, el uso de proteasas específicas de ubiquítina solubles o fragmentos de la proteína de proteasa específica de ubiquitina que compitan por los sustratos, incluyendo los que se dan a conocer en la presente. Estas proteasas de ubiquitina o fragmentos pueden tener una afinidad más alta para el objetivo, con el fin de proporcionar una competencia efectiva. El estímulo de actividad es deseable en las situaciones en las que la proteína es anormalmente disminuida, y/o en las que sea probable que la actividad incrementada tenga un efecto benéfico. De la misma manera, es deseable la inhibición de la actividad en las situaciones en donde la proteína sea anormalmente aumentada y/o en donde sea probable que la actividad reducida tenga un efecto benéfico. En un ejemplo de esta situación, un sujeto tiene un trastorno caracterizado por un desarrollo o diferenciación celular aberrante. En otro ejemplo, el sujeto tiene una enfermedad proliferativa (por ejemplo, cáncer), o un trastorno caracterizado por una respuesta hematopoiética aberrante. En otro ejemplo, es deseable lograr la regeneración del tejido en un sujeto (por ejemplo, en donde un sujeto haya sufrido lesión cerebral o de la médula espinal, y sea deseable regenerar el tejido neuronal de una manera regulada). En otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para la producción de anticuerpos capaces de reconocer específicamente uno o más epítopos genéticos diferencialmente expresados. Estos anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos de una sola cadena, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld), y fragmentos de enlace de epítopo de cualquiera de los anteriores. Estos anticuerpos se pueden utilizar, por ejemplo, en la detección de una huella, objetivo, o gen en una muestra biológica, o de una manera alternativa, como un método para la inhibición de la actividad anormal del gen objetivo. Para la producción de anticuerpos para un gen diferencialmente expresado, se pueden inmunizar diferentes animales huéspedes mediante inyección con una proteína genética diferencialmente expresada, o con una porción de la misma. Estos animales huéspedes pueden incluir, pero no se limitan a, conejos, ratones, y ratas, por nombrar solamente unos cuantos. Se pueden utilizar distintos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie del huésped, incluyendo, pero no limitándose a, medio de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de actividad superficial tales como lisolecitina, polioles Pluronic, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianina de limpete de orificio, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin), y Corynebacterium parvum. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas a partir de los sueros de los animales inmunizados con un antígeno, tal como el producto genético objetivo, o un derivado antigénico funcional del mismo. Para la producción de anticuerpos policlonales, los animales huéspedes, tales como los descritos en lo anterior, se pueden inmunizar mediante inyección con el producto genético diferencialmente expresado complementado con adyuvantes, como también se describe anteriormente. Los anticuerpos monoclonales, los cuales son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno particular, se pueden obtener mediante cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por medio de líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein (1975, Nature, 256: 495-497; y Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,376,110), la técnica de hibridoma de células-B humanas (Kosbor y colaboradores, 1983, I munology Today, 4:72; Colé y colaboradores, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 80: 2026-2030), y la técnica de hibridoma-EBV (Colé y colaboradores, 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R.

Liss, Inc., páginas 77-96). Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, I g A , IgD, y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de esta invención se puede cultivar in vitro o in vivo. La producción de altas titulaciones de anticuerpos monoclonales in vivo, hace que éste sea el método de producción actualmente preferido. En adición, se pueden emplear las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison y colaboradores, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger y colaboradores, 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda y colaboradores, 1985, Nature, 314: 452-454), mediante el empalme de los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de una especificidad de antígeno apropiada, junto con los genes de una molécula de anticuerpo humano de una actividad biológica apropiada. Un anticuerpo quimérico es una molécula en donde se derivan diferentes porciones de diferentes especies animales, tales como aquéllas que tienen una región variable o hipervariable derivada a partir de un anticuerpo monoclonal de murino y una región constante de inmunoglobulina humana. De una manera alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,946,778; Bird, 1988, Science, 242: 423-426; Huston y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883; y Ward y colaboradores, 1989, Nature, 334: 544-456), se pueden adaptar para producir los anticuerpos de una sola cadena del gen diferencialmente expresado. Los anticuerpos de una sola cadena se forman mediante el enlace de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido de una sola cadena. De una manera más preferible, las técnicas útiles para la producción de "anticuerpos humanizados" se pueden adaptar para producir anticuerpos para los polipéptidos, fragmentos, derivados, y equivalentes funcionales dados a conocer en la presente. Estas técnicas se dan a conocer en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,932,448; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 5,530,101; 5,910,771; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,545,580; 5,661,016; y 5,770,429, cuyas divulgaciones se incorporan a la presente como referencia en su totalidad. Se pueden generar fragmentos de anticuerpos que reconozcan epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen, pero no se limitan a: los fragmentos F(ab')2, los cuales se pueden producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo, y los fragmentos Fab que se pueden generar mediante la reducción de los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. De una manera alternativa, se pueden construir bibliotecas de expresión de Fab (Huse y colaboradores, 1989, Science, 246: 1275-1281), para permitir una identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. Para una mayor facilidad de detección, se prefiere en particular el ensayo de emparedado, del cual existen un número de variaciones, todas las cuales pretenden ser abarcadas por la presente invención. Por ejemplo, en un ensayo típico hacia adelante, se inmoviliza el anticuerpo no marcado sobre un sustrato sólido, y la muestra que se vaya a probar se pone en contacto con la molécula enlazada. Después de un período de incubación adecuado, durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo binario de anticuerpo-antígeno; en este punto, se agrega entonces y se incuba un segundo anticuerpo, marcado con una molécula reportera capaz de inducir una señal detectable, dando tiempo suficiente para la formación de un complejo ternario de anticuerpo-antígeno-anticuerpo marcado. Se lava cualquier material sin reaccionar, y se determina la presencia del antígeno mediante la observación de una señal, o se puede cuantificar mediante una comparación con una muestra de control que contenga cantidades conocidas de antígeno. Las variaciones sobre el ensayo hacia adelante incluyen el ensayo simultáneo, en donde se agregan tanto la muestra como el anticuerpo de una manera simultánea al anticuerpo enlazado, o el ensayo inverso, en donde el anticuerpo marcado y la muestra que se vaya a probar primero se combinan, se incuban, y se agregan al anticuerpo enlazado a la superficie no marcada. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en este campo, y será fácilmente aparente la posibilidad de variaciones menores. Como se utiliza en la presente, "ensayo de emparedado" pretende abarcar todas las variaciones sobre la técnica básica de dos sitios. Las moléculas reporteras más comúnmente utilizadas en este tipo de ensayo son enzimas, o moléculas que contengan fluoróforo o radionúclido. En el caso de un inmunoensayo enzimático, se conjuga una enzima con el segundo anticuerpo, usualmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Sin embargo, como será fácilmente reconocido, existe una amplia variedad de diferentes técnicas de ligamiento, las cuales son bien conocidas por el experto. Las enzimas comúnmente utilizadas incluyen peroxidasa de rábano, oxidasa de glucosa, beta-galactosidasa, y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que se vayan a utilizar con las enzimas específicas se seleccionan en general para la producción, sobre la hidrólisis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. De una manera alternativa, los compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, se pueden acoplar químicamente con los anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace. Cuando se activa mediante iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorócromo absorbe la energía de la luz, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido por la emisión de la luz a una longitud de onda característica más larga. La emisión aparece como un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Las técnicas de inmunofluorescencia y de ElA están ambas muy bien establecidas en la materia, y se prefieren en particular para el presente método. Sin embargo, también se pueden emplear otras moléculas reporteras, tales como radioisótopos, o moléculas quimiluminiscentes o bioluminiscentes. Será fácilmente aparente para el experto la manera de variar el procedimiento para adaptarse al uso requerido. Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un estuche de diagnóstico, el cual comprende cuando menos uno de los siguientes componentes: (a) un oligonucleótido adecuado para detectar un ácido nucleico que comprenda una secuencia de nucleótidos o parte de una secuencia de nucleótidos como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10, (b) un anticuerpo adecuado para detectar un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos o parte de una secuencia de aminoácidos como se estipula en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, (c) instrucciones para utilizar el estuche de diagnóstico. Las secuencias de nucleótidos de la presente ¡nvención también son valiosas para la localización de cromosomas. La secuencia se dirige específicamente hacia, y se puede hibridar con, una localización particular sobre un cromosoma humano individual. El mapeo de las secuencias relevantes para los cromosomas de acuerdo con la presente invención es un primer paso importante en la correlación de estas secuencias con la enfermedad asociada con el gen. Una vez que se ha mapeado una secuencia para una localización cromosómica precisa, se puede correlacionar la posición física de la secuencia sobre el cromosoma con los datos del mapa genético. Estos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian I nheritance in Man (disponible en línea a través de la Johns Hopkins University Welch Medical Library). Entonces se identifica la relación entre los genes y las enfermedades que se hayan mapeado para la misma región cromosómica, a través de análisis de enlaces (coherencia de genes físicamente adyacentes). También se pueden determinar las diferencias en el ADNc o en la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o en todos los individuos afectados, pero no en individuos normales, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad. Un aspecto adicional de la invención se refiere a la administración de una composición farmacéutica, en conjunto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de los efectos terapéuticos descritos en lo anterior. Estas composiciones farmacéuticas pueden consistir en anticuerpos, miméticos, agonistas, antagonistas, o inhibidores de las proteasas específicas de ubiquitina de la presente invención. Las composiciones se pueden administrar solas o en combinación con cuando menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, las cuales se pueden administrar en cualquier vehículo farmacéutico biocompatible estéril, incluyendo, pero no limitándose a, suero, suero con el pH regulado, dextrosa, y agua. Las composiciones se pueden administrar a un paciente solas, o en combinación con otros agentes, fármacos, u hormonas. Las composiciones farmacéuticas abarcadas por la invención se pueden administrar mediante cualquier número de vías, incluyendo, pero no limitándose a, el medio oral, intra-venoso, intra-muscular, intra-articular, intra-aterial, intra-medular, intra-tecal, intra-ventricular, transdérmico, subcutáneo, intra-peritoneal, intra-nasal, enteral, tópico, sublingual, o rectal. En adición a los ingredientes activos, estas composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprendan excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos para obtener preparaciones que se puedan utilizar farmacéuticamente. Se pueden encontrar detalles adicionales sobre las técnicas par ala formulación y administración en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa.). Las composiciones farmacéuticas para la administración oral se pueden formular utilizando vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en este campo, en dosificaciones adecuadas para administración oral. Estos vehículos hacen posible que se formulen las composiciones farmacéuticas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas acuosas, suspensiones, y similares, para ser ingeridos por el paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener mediante una combinación de los compuestos activos con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo una mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos, después de agregar auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son carbohidratos o rellenos de proteína, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; almidón de maíz, de trigo, de arroz, de papa, o de otras plantas; celulosa, tal como metil-celulosa, hidroxi-propil-metil-celulosa, o carboxi-metil-celulosa de sodio; gomas, incluyendo goma arábiga y tragacanto; y proteínas, tales como gelatina y colágeno. Si se desea, se pueden agregar agentes desintegrantes o solubilizantes, tales como la polivinil-pirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Los núcleos de grageas se pueden utilizar en conjunto con recubrimientos adecuados, tales como soluciones de azúcar concentradas, las cuales también pueden contener goma arábiga, talco, polivinil-pirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes o mezclas de solventes orgánicos adecuados. Se pueden agregar materiales de tinte o pigmentos a las tabletas o a los recubrimientos de grageas para la identificación del producto, o para caracterizar la cantidad del compuesto activo, es decir, la dosificación. Las preparaciones farmacéuticas que se pueden utilizar oralmente incluyen cápsulas de presión hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un recubrimiento, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de presión pueden contener ingredientes activos mezclados con un relleno o con aglutinantes, tales como lactosa o almidones, lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio, y opcionalmente estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, líquido, o polietilenglicol líquido con o sin estabilizantes. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración parenteral se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en reguladores del pH fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer, o suero fisiológicamente regulado. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboxi-metil-celulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas para inyección apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de ajonjolí, o esteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. También se pueden utilizar polímeros de amino policatiónicos que no sean de lípido para el suministro. De una manera opcional, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Para la administración tópica o nasal, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera particular que se vaya a permear. Estos penetrantes son conocidos generalmente en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar de una manera que es conocida en este campo, por ejemplo por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrape, o liofilización. La composición farmacéutica se puede proporcionar como una sal, y se puede formar con muchos ácidos, incluyendo, pero no limitándose a, ácido clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en solventes acuosos o en otros solventes protónicos que las formas de base libre correspondientes. En otros casos, la preparación preferida puede ser un polvo liofilizado que puede contener cualquiera o todos los siguientes: histidina 1-50 mM, sacarosa del 0.1 por ciento al 2 por ciento, y manitol del 2 al 7 por ciento, en un intervalo de pH de 4.5 a 5.5, que se combina con un regulador antes de usarse. Después de que se hayan preparado las composiciones farmacéuticas, se pueden colocar en un recipiente adecuado, y se puede etiquetar para el tratamiento de una condición indicada. Para la administración, la etiqueta incluiría cantidad, frecuencia, y método de administración. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para utilizarse en la invención incluyen las composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito pretendido. La determinación de una dosis efectiva está bien dentro de la capacidad de los expertos en la materia. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular, por ejemplo de células neoplásticas, o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal también se puede utilizar para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Entonces se puede utilizar esta información para determinar las dosis útiles y las vías de administración en seres humanos. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de ingrediente activo, fragmentos del mismo, anticuerpos, agonistas, antagonistas, o inhibidores de la proteasa específica de ubiquitina, que aminore los síntomas o la condición. La eficacia terapéutica o la toxicidad se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o en animales experimentales, por ejemplo, la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50 por ciento de la población), y la LD50 (la dosis letal para el 50 por ciento de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la proporción LD50/ED50. Se prefieren las composiciones que exhiban grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y de los estudios animales, se utilizan en la formulación de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyan la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo, dependiendo de la forma de dosificación empleada, de la sensibilidad del paciente, y de la vía de administración. La dosificación exacta será determinada por el profesional, a la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiera tratamiento. La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes de la fracción activa, o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tomar en cuenta incluyen la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso, y género del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción, y la tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de larga acción se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y del índice de tolerancia de la formulación particular. Las cantidades de dosificación normales pueden variar desde 0.1 a 100,000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 gramo, dependiendo de la vía de administración. La guía con respecto a las dosificaciones particulares y métodos de suministro se proporciona en la literatura, y está generalmente disponible para los profesionales en este campo. Los expertos en la materia emplearán diferentes formulaciones para nucleótidos que para proteínas o sus inhibidores. De una manera similar, el suministro de polinucleótidos o polipéptidos será específico para las células particulares, condiciones, localizaciones, etc. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral de proteínas se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,008,114; 5,505,962; 5,641,515; 5,681,811; 5,700,486; 5,766,633; 5,792,451; 5,853,748; 5,972,387; 5,976,569; y 6,051,561.

Los siguientes ejemplos y tablas ilustran la presente invención, sin limitar de ninguna manera su alcance.

Tablas : Tabla 1 (a) -USP NOl:variante de empalme novedosa-secuencia de aminoácidos LOCUS USP_N01 3370 aa PRT Acceso BAA25496 Sec. Gen AAU82706 ORIGEN humano Forma de empalme caracterizada por 4 inserciones: Pos 1 - Pos 11 Pos 267 - Pos 300 Pos 361 - Pos 384 Pos 1243 - Pos 1437 1 MRRKNSYYV QKIFQIQFPL YTAYKHNTHP TIEDISTQES NILGAFCDMN DVEVPLHLLR 61 YVCLFCGKNG LSLMKDCFEY GTPETLPFLI AHAFITWSN IRI LHIPAV MQHIIPFRTY 121 VIRYLCKLSD QELRQSAARN MADLMWSTVK EPLDTTLCFD KESLDLAFKY FMSPTLTMRL 181 AGLSQITNQL HTFNDVCNNE SLVSDTETSI AKELADWLIS NNVVEHIFGP NLHIEIIKQC 241 QVILNFLAAE GRLSTQHIDC IWAAAQRKKS LEEQLHHLGH LQLVLK II AIHIKVEVVT 301 EPSVHTEQTL YLASMLIKAL WNNALAAKAQ LSKQSSFASL LNTNIPIGNK KEEEELRRTA 361 LK MSNLLIE PNMCNNDFQT QKESMQGSSD ETANSGEDGS SGPGSSSGHS DGSSNEVNSS 421 HASQSAGSPG SEVQSEDIAD lEALKEEDED DDHGHNPPKS SCGTDLRNRK LESQAGICLG 481 DSQGTSERNG TSSGTGKDLV FNTESLPSVD NRMRMLDACS HSEDPEHDIS GEMNATHIAQ 541 GSQESCITRT GDFLGETIGN ELFNCRQFIG PQHHHHHHHH HHHHDGHMVD DMLSADDVSC 601 SSSQVSAKSE KNMADFDGEE SGCEEELVQI NSHAELTSHL QQHLPNLASI YHEHLSQGPV 661 VHKHQFNSNA VTDINLDNVC KKGNTLL DI VQDEDAVNLS EGLINEAEKL LCSLVC FTD 721 RQIRMRFIEG CLENLGNNRS VVISLRLLPK LFGTFQQFGS SYDTHWITM AEKELNMMKL 781 FFDNLVYYIQ TVREGRQKHA LYSHSAEVQV RLQFLTCVFS TLGSPDHFRL SLEQVDILWH 841 CLVEDSECYD DALHWFLNQV RSKDQHAMGM ETYKHLFLEK MPQLKPETIS MTGLNLFQHL 901 CNLARLATSA YDGCSNSELC GMDQF GIAL RAQSGDVSRA AIQYINSYYI NGKTGLEKEQ 961 EFISKCMESL MIASSSLEQE SHSSLMVIER GLLMLKTHLE AFRRRFAYHL RQ QIEGTGI 1021 SSHLKALSDK QSLPLRVVCQ PAGLPDKMTI EMYPSDQVAD LRAEVTH YE NLQKEQINQQ 1081 AQLQEFGQSN RKGEFPGGLM GPVRMISSGH ELTTDYDEKA LHELGFKDMQ MVFVSLGAPR 1141 RERKGEGVQL PASCLPPPQK DNIPMLLLLQ EPHLTTLFDL LEMLASFKPP SGKVAVDDSE 1201 SLRCEELHLH AENLSRRVWE LLMLLPTCPN MLMAFQNISD EQSNDGFN K ELLKIKSAHK 1261 LLYALEIIEA LGKPNRRIRR ESTGSYSDLY PDSDDSSEDQ VENSKNSWSC KFVAAGGLQQ 1321 LLEIFNSGIL EPKEQESWTV QLDCLACLL KLICQFAVDP SDLDLAYHDV FA SGIAESH 1381 RKRT PGKSR KAAGDHAKGL HIPRLTEVFL VLVQGTSLIQ RLMSVAYTYD NLAPRVLKAQ 1441 SDHRSRHEVS HYSM LLVSW AHCCSLVKSS LADSDHLQD LKKLTLLIPE TAVRHESCSG 1501 LYKLSLSGLD GGDS1NRSFL LLAASTLLKF LPDAQALKPI RIDDYEEEPI LKPGCKEYF 1561 LLCKLVDNIH IKDASQTTLL DLDALARHLA DCIRSREILD HQDGNVEDDG LTGLLRLATS 1621 VVKHKPPFKF SREGQEFLRD IFNLLFLLPS LKDRQQPKCK SHSSRAAAYD LLVEMVKGSV 1681 ENYRLIHNWV MAQHMQSHAP YKWDY PHED VRAECRFVGL TNLGATCYLA STIQQLYMIP 1741 EARQAVFTAK YSEDMKHKTT LLELQKMFTY LMESECKAYN PRPFCKTYTM DKQPLNTGEQ 1801 KDMTEFFTDL ITKIEEMSPE LKNTVKSLFG GVITNNVVSL DCEHVSQTAE EFYTVRCQVA 1861 DMKNIYESLD EVTIKDTLEG DNMYTCSHCG KKVRAEKRAC FKKLPRILSF NTMRYTFNMV 1921 TMMKEKVNTH FSFPLRLDMT PYTEDFLMGK SERKEGFKEV SDHSKDSESY EYDLIGVTVH 1381 TGTADGGHYY SFIRDIVNPH AYKNNKWYLF NDAEVKPFDS AQLASECFGG EMTTKTYDSV 2041 TDKFMDFSFE KTHSAYMLFY KRMEPEEENG REYKFDVSSE LLEWI HDNM QFLQDKNIFE 2101 HTYFGFMWQL CSCIPSTLPD PKAVSLMTAK LSTSFVLETF IHSKEKPTML QWIELLTKQF 2161 NNSQAACE F LDRMADDDWW PMQILIKCPN QIVRQMFQRL CIHVIQRLRP VHAHLYLQPG 2221 MEDGSDDMDT SVEDIGGRSC VTRFVRTLLL IMEHGVKPHS KHLTEYFAFL YEFAKMGEEE 2281 SQFLLSLQAI STMVHFYMGT KGPENPQVEV LSEEEGEEEE EEEDILSLAE EKYRPAALEK 2341 MIALVALLVE QSRSERHLTL SQTDMAALTG GKGFPFLFQH IRDGINIRQT CNLIFSLCRY 2401 NNRLAEHIVS MLFTSIAKLT PEAANPFFKL LTMLMEFAGG PPGMPPFASY ILQR1 EVIE 2461 YNPSQCLDWL AVQTPRNKLA HSWVLQNMEN WVERFLLAHN YPRVRTSAAY LLVSLIPSNS 2521 FRQMFRSTRS LHIPTRDLPL SPDTTVVLHQ VYNVLLGLLS RAKLYVDAAV HGTTKLVPYF 2581 SFMTYCLISK TEKLMFSTYF MDLWNLFQPK LSEPAIATNH NKQALLSFWY NVCADCPENI 2641 RLIVQNP VT KNIAFNYILA DHDDQD VLF NRGMLPAYYG ILRLCCEQSP AFTRQLASHQ 2701 NIQWAFKNLT PHASQYPGAV EELFNLMQLF IAQRPDMREE ELEDIKQFKK TTISCYLRCL 2761 DGRSCWTTLI SAFRILLESD EDRLL VFNR GLILMTESFN TLHMMYHEAT ACHVTGDLVE 2821 LLSIFLSVLK STRPYLQRKD VKQALIQWQE RIEFAHKLLT LLNSYSPPEL RNACIDVLKE 2881 LVLLSPHDFL HTLVPFLQHN HCTYHHSNIP MSLGPYFPCR ENIKLIGGKS NIRPPRPELN 2941 MCLLPTMVET SKGKDDVYDR MLLDYFFSYH QFIHLLCRVA INCEKFTETL VKLSVLVAYE 3001 GLPLHLALFP KLWTELCQTQ SAMSKNCIKL LCEDPVFAEY IKCILMDERT FLNNNIVYTF 3061 MTHFLLKVQS QVFSEANCAN LISTLITNLI SQYQNLQSDF SNRVEISKAS ASLNGDLRAL 3121 ALLLSVHTPK QLNPALIPTL QELLSKCRTC LQQRNSLQEQ EAKERKTKDD EGATPIKRRR 3181 VSSDEEHTVD SCISDMKTET REVLTPTSTS DNETRDSSII DPGTEQDLPS PENSSVKEYR 3241 MEVPSSFSED MSNIRSQHAE EQSNNGRYDD CKEFKDLHCS KDSTLAEEES EFPSTSISAV 3301 LSDLADLRSC DGQALPSQDP EVALSLSCGH SRGLFSHMQQ HDILDTLCRT IESTIHVVTR 3361 ISGKGNQAAS Tabla 1 (b) : -USP NOl:variante de empalme novedosa-secuencia de nucleótidos 1 atgagaagga aaaactctta ctatgtgtgg caaaaaattt ttcaaattca gtttccctta 61 tatactgctt acaagcataa tactcaccct actattgagg atatatcaac tcaagaaagt 121 aacatattag gggcattctg tgatatgaat gatgtagaag taccattgca tttgcttcgt 181 tatgtatgtt tgttttgtgg gaaaaatggc ctttctctca tgaaggattg ctttgaatat 241 ggaactcctg aaactttgcc atttcttata gcacatgcgt ttattacagt tgtgtctaat 301 attagaatat ggctacatat tcccgctgtc atgcagcaca ttataccttt taggacctat 361 gttattaggt atttatgcaa gctctcggat caggagttac gacagagtgc agctcgtaac 421 atggctgact taatgtggag cacagtcaaa gaaccattgg atacaacatt atgctttgat 481 aaagaaagcc tagatcttgc atttaagtac tttatgtcac ctactttgac tatgaggttg 5 541 gctggattga gtcagataac aaatcaactc cataccttca atgatgtgtg caataatgaa 601 tcattagtat cggacacaga aacgtccatt gcaaaagaac ttgcagactg gcttattagc 661 aacaatgtgg 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ttgatcagca ctcttattac aaacttgata agccagtatc agaacctaca gtctgatttc 9121 tccaaccgag ttgaaatttc caaagcaagt gcttctttaa atggggacct gagggcactc 9181 gctttgctcc tgtcagtaca cactcccaaa cagttaaacc cagctctaat tccaactctg 9241 caagagcttt taagcaaatg caggacttgt ctgcaacaga gaaactcact ccaagagcaa 9301 gaagccaaag aaagaaaaac taaagatgat gaaggagcaa ctcccattaa aaggcggcgt 9361 gttagcagtg atgaggagca cactgtagac agctgcatca gtgacatgaa aacagaaacc 9421 agggaggtcc tgaccccaac gagcacttct gacaatgaga ccagagactc ctcaattatt 94B1 gatccaggaa ctgagcaaga tcttccttcc cctgaaaata gttctgttaa agaataccga 5 9541 atggaagttc catcttcgtt ttcagaagac atgtcaaata tcaggtcaca gcatgcagaa 9601 gaacagtcca acaatggtag atatgacgat tgtaaagaat ttaaagacct ccactgttcc 9661 aaggattcta ccctagctga ggaagaatct gagttccctt ctacttctat ctctgcagtt 9721 ctgtctgact tagctgactt gagaagctgt gatggccaag ctttgccctc ccaggaccct 9781 gaggttgctt tatctctcag ttgtggccat tccagaggac tctttagtca tatgcagcaa i0 9841 catgacattt tagataccct gtgtaggacc attgaatcta caatccatgt cgtcacaagg 9901 atatctggca aaggaaacca agctgcttct tga Tabla 1 (c) -USP NOl: secuencia de referencia (Derwent AAU82706) Secuencia de Aminoácidos: 15 1 mcencadlve vlneisdveg gdglqlr eh tlkiftyins wtgrqclccf keykhleifn 61 gvvcalinlv iaqvqvlrdq Ickhcttini dstwqdesnq aeeplnidre cnegsterqk 121 siekksnstr icnlteeess kssdpfslws tdekeklllc vakifqiqfp lytaykhnth 181 ptiedistqe snilgafcdm ndvevplhll ryvclfcgkn glslmkdcfe ygtpetlpfl 241 iahafit vs niri lhipa vmqhiipfrt yvirylckls dqelrqsaar nmadlm stv 20 301 kepldttlcf dkesldlafk yfmsptltmr laglsqitnq lhtfndvcnn eslvsdtets 361 iakeladwli snnvvehifg pnlhieiikq cqvilnflaa egrlstqhid ciwaaaqlkh 421 csryihdlfp sliknldpvp lrhllnlvsa lepsvhteqt lylasmlika l nnalaaka 481 qlskqssfas llntnipign kkeeeelrrt apspwspaas pqssdnsdth qsggsdiemd 541 eqlinrtkhv qqrlsdtees mqgssdetan sgedgssgpg sssghsdgss nevnsshasq „. 601 sagspgsevq sediadieal keededddhg hnppksscgt dlrnrklesq agiclgdsqg 661 tserngtssg tgkdlvfnte slpsvdnrmr mldacshsed pehdisgemn athiaqgsqe 721 scitrtgdfl getignelfn crqfigpqhh hhhhhhhhhh dghmvddmls addvscsssq 781 vsakseknma dfdgeesgce eelvqinsha eltshlqqhl pnlasiyheh lsqgpvvhkh 841 qfnsnavtdi nldnvckkgn tllwdivqde davnlsegli neaekllcsl vcwftdrqir 901 mrfiegclen Ignnrsvvis Irllpklfgt fqqfgssydt h itm aeke Inmmklffdn 961 lvyyiqtvre grqkhalysh saevqvrlqf ltcvfstlgs pdhfrlsleq vdil hclve 1021 dsecyddalh flnqvrskd qhamg etyk hlflekmpql kpetismtgl nlfqhlcnla 1081 rlatsaydgc snselcgmdq f gialraqs gdvsraaiqy insyyingkt glekeqefis 1141 kcmeslmias ssleqeshss lmviergllm lkthleafrr rfayhlrqwq iegtgisshl 1201 kalsdkqslp Irvvcqpagl pdkmtiemyp sdqvadlrae vthwyenlqk eqinqqaqlq 1261 efgqsnrkge fpgglmgpvr missgheltt dydekalhel gfkdmqmvfv slgaprrerk 1321 gegvqlpasc Ipppqkdnip mllllqephl ttlfdlleml asfkppsgkv avddseslrc 1381 eelhlhaenl srrvwellml Iptcpnmlma fqnisdeqsf kaqsdhrsr evshysm ll 1441 vswahccslv kssladsdhl qd lkkltll ipetavrhes csglyklsls gldggdsinr 1501 sflllaastl Ikflpdaqal kpiriddyee epilkpgcke yf llcklvd nihikdasqt 1561 tlldldalar hladcirsre ildhqdgnve ddgltgllrl atsvvkhkpp fkfsregqef 1621 lrdifnllfl Ipslkdrqqp kckshssraa aydllvemvk gsvenyrlih nwvmaqhmqs 1681 hapyk dy p hedvraecrf vgltnlgatc ylastiqqly mipearqavf takysed kh 1741 kttllelqkm ftylraeseck aynprpfckt ytmdkqplnt geqkdmteff tdlitkieem 1801 spelkntvks Ifggvitnnv vsldcehvsq taeefytvrc qvadmkniye sldevtikdt 1861 legdnmytcs qcgkkvraek racfkklpri xsfntmrytf nmvtmmkekv nthfsfplrl 1921 dmtpytedfl mgkserkegf kevsdhskds esyeydligv tvhtgtadgg hyysfirdiv 1981 nphayknnkw ylfndaevkp fdsaqlasec fggemttkty dsvtdkfmdf sfekthsaym 2041 lfykrmepee engreykfdv ssellewiwh dnmqflqdkn ifehtyfgf wqlcscipst 2101 lpdpkavslm taklstsfvl etfihskekp tmlqwiellt kqfnnsqaac ewfldrmadd 2161 dwwpmqilik cpnqivrqmf qrlcihviqr lrpvhahlyl qpgmedgsdd mdtsvedigg 2221 rscvtrfvrt lllimehgvk phskhlteyf aflyefakmg eeesqfllsl qaistmvhfy 2281 gtkgpenpq vevlseeegg eeeeeedils laeekyrpaa lekmialval Iveqsrserh 2341 ltlsqtdmaa Itggkgfpfl fqhirdgini rqtcnlifsl crynnrlaeh ivsmlftsia 2401 kltpeaanpf fklltmlmef aggppgmppf asyilqriwe vieynpsqcl dwlavqtprn 2461 klahswvlqn menwverfll ahnyprvrts aayllvslip snsfrqmfrs trslhiptrd 2521 Iplspdttvv Ihqvynvllg llsraklyvd aavhgttklv pyfsfmtycl iskteklmfs 2581 tyfmdlwnlf qpklsepaia tnhnkqalls fwynvcadcp enirlivqnp vvtkniafny 2641 iladhddqdv vlfnrgmlpa yygilrlcce qspaftrqla shqniqwafk nltphasqyp 2701 gaveelfnlm qlfiaqrpdm reeeledikq fkkttiscyl rcldgrscwt tlisafrill 2761 esdedrllvv fnrglilmte sfntlhmmyh eatachvtgd lvellsifls vlkstrpylq 2821 rkdvkqaliq wqeriefahk lltllnsysp pelrnacidv lkelvllsph dflhtlvpfl 2B81 qhnhctyhhs nipmslgpyf pcreniklig gksnirpprp elnmcllptra vetskgkddv 2941 ydrmlldyff syhqfihllc rvaincekft etlvklsvlv ayeglplhla lfpklwtelc 3001 qtqsamsknc ikllcedpvf aeyikcilmd ertflnnniv ytfrathfllk vqsqvfsean 3061 canlistlit nlisqyqnlq sdfsnrveis kasaslngdl ralalllsvh tpkqlnpali 3121 ptlqellskc rtclqqrnsl qeqeakerkt kddegatpik rrrvssdeeh tvdscisdmk 3181 tetrevltpt stsdnetrds siidpgteqd Ipspenssvk eyrmevpssf sedmsnirsq 3241 haeeqsnngr yddckefkdl hcskdstlae eesefpstsi savlsdladl rscdgqalps 3301 qdpevalsls cghsrglfsh mqqhdildtl crtiestihv vtrisgkgnq aas Tabla 1 (d) -USP NOl: secuencia de referencia (Der ent AAU82706) Secuencia de Nucleótidos: atgtgcgaga actgcgcaga cctggtggag gtgttaaatg aaatatcaga tgtagaaggt 60 ggtgatggac tgcagctcag aaaggaacat actctcaaaa tatttactta catcaattcc 120 tggacacaga ggcaatgtct atgctgcttc aaggaatata agcatttgga gatttttaat 180 caagtagtgt gtgcacttat taacttagtg attgcccaag ttcaagtgct ccgggaccag 240 ctttgtaaac attgtactac cattaacata gattccacgt ggcaagatga gagtaatcaa 300 gcagaagaac cactgaatat agatagagag tgtaatgaag gaagtacaga aagacaaaaa 360 tcaatagaaa aaaaatcaaa ctctacaaga atttgtaatc tgactgagga ggaatcttca 420 aagagttctg atccttttag tttatggagt acagatgaga aggaaaaact cttactatgt 480 gtggcaaaaa tttttcaaat tcagtttccc ttatatactg cttacaagca taatactcac 540 cctactattg aggatatatc aactcaagaa agtaacatat taggggcatt ctgtgatatg 600 aatgatgtag aagtaccatt gcatttgctt cgttatgtat gtttgttttg tgggaaaaat 660 ggcctttctc tcatgaagga ttgctttgaa tatggaactc ctgaaacttt gccatttctt 720 atagcacatg cgtttattac agttgtgtct aatattagaa tatggctaca tattcccgct 780 gtcatgcagc acattatacc ttttaggacc tatgttatta ggtatttatg caagctctcg 840 gatcaggagt tacgacagag tgcagctcgt aacatggctg acttaatgtg gagcacagtc 900 aaagaaccat tggatacaac attatgcttt gataaagaaa gcctagatct tgcatttaag 960 tactttatgt cacctacttt gactatgagg ttggctggat tgagtcagat aacaaatcaa 1020 ctccatacct tcaatgatgt gtgcaataat gaatcattag tatcggacac agaaacgtcc 1080 attgcaaaag aacttgcaga ctggcttatt agcaacaatg tggtggagca tatatttgga 1140 ccaaatttac atattgagat tatcaaacag tgccaagtga ttttgaattt tttggcagca 1200 gaagggcgac tgagtactca acatattgac tgtatttggg ctgcagcaca gttgaaacat 1260 tgtagtcggt atatacatga cttatttcct tcactcatca agaatttgga tcccgtacca 1320 cttagacatc tacttaatct ggtctcagct cttgagccaa gtgttcatac tgaacagaca 1380 ctgtacttgg catccatgtt aattaaagca ctgtggaata acgcactagc agctaaggct 1440 cagttatcta aacagagttc ttttgcatct ttattaaata ctaatattcc cattggaaat 1500 aagaaagagg aagaagagct tagaagaaca gctccatcac cttggtcacc tgcagctagt 1560 cctcaaagca gtgataatag cgatacacat caaagtggag gtagtgacat tgaaatggat 1620 gagcaactta ttaatagaac caaacatgtg caacaacgac tttcagacac agaggaatcc 1680 atgcagggaa gttctgacga aactgccaac agtggtgaag atggaagcag tggtcctggt 1740 agcagtagtg ggcatagtga tggatctagc aatgaggtta attctagcca cgcaagccag 1800 tcagctggga gccctggcag tgaggtacag tcagaagaca ttgcagatat tgaagccctc 1860 aaagaggaag atgaagacga tgatcatggt cataatcctc ccaaaagcag ttgtggtaca 1920 gatcttcgga atagaaagtt agagagtcaa gcaggcattt gcctggggga ctcccaaggc 1980 acgtcagaaa gaaatgggac aagcagcgga acaggaaagg acctggtttt taacactgaa 2040 tcattgccat cagtagataa tcgaatgcga atgctggatg cttgttcaca ctctgaagac 2100 ccagaacatg atatttcagg ggaaatgaat gctactcata tagcacaagg gtctcaggag 2160 tcttgtatca cacgaactgg ggacttcctt ggggagacta ttgggaatga attatttaat 2220 tgtcgacaat ttattggtcc acagcatcac caccaccacc accaccatca ccaccaccac 2280 gatgggcata tggttgatga tatgctaagt gcagatgatg tcagttgtag tagctcccag 2340 gttagtgcaa aatcagaaaa aaatatggct gattttgatg gtgaagaatc tggatgtgaa 2400 gaggagctag ttcagattaa ttcacatgcg gaactgacat ctcacctcca acaacatctt 2460 cccaatttag cttccattta ccatgaacat cttagtcaag gacctgtagt tcataaacat 2520 caattcaaca gtaatgctgt tacagacatt aatttggata atgtttgcaa gaaaggaaat 2580 actttgttgt gggatatagt ccaagatgaa gatgcagtta atctttctga aggattaata 2640 aatgaagcag agaaacttct ttgttcgtta gtatgttggt ttacagatag acaaattcga 2700 atgagattca ttgaaggttg ccttgaaaac ttgggaaaca acagatcagt agtaatttca 2760 cttcgtcttc ttccaaaact atttggtact tttcagcagt ttgggagcag ttacgataca 2820 cactggataa caatgtgggc agaaaaagaa ctgaacatga tgaagctttt ctttgataat 2880 ttggtatact acattcaaac tgtgagagaa ggaagacaaa aacatgcact gtacagccat 2940 agtgctgaag ttcaagttcg tcttcaattc ttgacttgtg tattttcaac tctgggatca 3000 cctgatcatt tcaggttaag tttagagcaa gttgacatct tatggcattg tttagtagaa 3060 gattctgaat gttatgatga tgcactccat tggtttttaa atcaagttcg aagtaaagat 3120 caacatgcta tgggtatgga aacctacaaa catcttttcc tggagaagat gccccagcta 3180 aaacctgaaa caattagcat gactggctta aacctgtttt cagcatctct 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gtgcatgctc atctctattt 6600 gcagccagga atggaagatg ggtcagatga tatggatacc tcagtagaag atattggtgg 6660 tcgttcatgt gtcactcgct ttgtgagaac cctgttatta attatggaac atggtgtaaa 6720 acctcacagt aaacatctta cagagtattt tgccttcctt tacgaatttg caaaaatggg 6780 tgaagaagag agccaatttt tgctttcatt gcaagctata tctacaatgg tacattttta 6840 catgggaaca aaaggacctg aaaatcctca agttgaagtg ttatcagagg aagaaggggg 6900 agaagaagag gaggaagaag atatcctctc tctggcagaa gaaaaataca ggccagctgc 6960 ccttgaaaag atgatagctt tagttgctct tttggttgaa cagtctcgat cagaaaggca 7020 tttgacatta tcacagactg acatggcagc attaacagga ggaaagggat ttcccttctt 7080 gtttcaacat attcgtgatg gcatcaatat aagacaaact tgtaatctga ttttcagcct 7140 gtgtcgatac aataatcgac ttgcagaaca tattgtatct atgcttttca catcaatagc 7200 aaagttgact cctgaggcag ccaatccttt ctttaagttg ttgactatgc taatggagtt 7260 tgctggtgga cctccaggaa tgcctccctt tgcatcttat attctgcaga ggatatggga 7320 ggtgattgaa tacaatcctt ctcagtgtct agattggttg gcagtgcaga caccccgaaa 7380 taaactggca cacagctggg tcttacagaa tatggaaaac tgggtcgagc ggtttctttt 7440 ggctcacaat tatcctagag tgaggacttc tgcagcttat cttctggtgt cccttatacc 7500 aagcaattca ttccgtcaga tgttccggtc aacaaggtct ttgcacatcc caacccgtga 7560 ccttccactc agtccagaca caacagtagt cctacatcag gtctacaacg tgctccttgg 7620 tttgctctca agagccaaac tttatgttga tgctgctgtt catggcacta caaagctagt 7680 gccctatttt agctttatga cttactgttt aatttccaaa actgagaagc tgatgttttc 7740 cacatatttc atggatttgt ggaacctttt ccagcctaaa ctttctgagc cagcaatagc 7800 tacaaatcac aataaacagg ctttgctttc attttggtac aatgtctgtg ctgactgtcc 7860 5 agagaatatc cgccttattg ttcagaaccc agtggtaacc aagaacattg ccttcaatta 7920 catccttgct gaccatgatg atcaggatgt ggtgcttttt aaccgtggga tgctgccagc 7980 gtactatggc attctgaggc tctgctgtga gcagtctcct gcattcacac gacaactggc 8040 ttctcaccag aacatccagt gggcctttaa gaatcttaca ccacatgcca gccaataccc 8100 tggagcagta gaagaactgt ttaacctgat gcagctgttt atagctcaga ggccagatat 8160 0 gagagaagaa gaattagaag atattaaaca gttcaagaaa acaaccataa gttgttactt 8220 acgttgctta gatggccgct cctgctggac tactttaata agtgccttca gaatactatt 8280 agaatctgat gaagacagac ttcttgttgt atttaatcga ggattgattc taatgacaga 8340 gtctttcaac actttgcaca tgatgtatca cgaagctaca gcttgccatg tgactggaga 8400 tttagtagaa cttctgtcaa tatttctttc ggttttgaag tctacacgcc cttatcttca 8460 15 gagaaaagat gtgaaacaag cattaatcca gtggcaggag cgaattgaat ttgcccataa 8520 actgttaact cttcttaatt cctatagtcc tccagaactt agaaatgcct gtatagatgt 8580 cctcaaggaa cttgtacttt tgagtcccca tgattttctt catactctgg ttccctttct 8640 acaacacaac cattgtactt accatcacag taatatacca atgtctcttg gaccttattt 8700 cccttgtcga gaaaatatca agctaatagg agggaaaagc aatattcggc ctccgcgccc 8760 20 tgaactcaat atgtgcctct tgcccacaat ggtggaaacc agtaagggca aagatgacgt 8820 ttatgatcgt atgctgctag actacttctt ttcttatcat cagttcatcc atctattatg 8880 ccgagttgca atcaactgtg aaaaatttac tgaaacatta gttaagctga gtgtcctagt 8940 tgcctatgaa ggtttgccac ttcatcttgc actgttcccc aaactttgga ctgagctatg 9000 ccagactcag tctgctatgt caaaaaactg catcaagctt ttgtgtgaag atcctgtttt 9060 _<- cgcagaatat attaaatgta tcctaatgga tgaaagaact tttttaaaca a~aacattgt 9120 ctacacgttc atgacacatt tccttctaaa ggttcaaagt caagtgtttt ctgaagcaaa 9180 ctgtgccaat ttgatcagca ctcttattac aaacttgata agccagtatc agaacctaca 9240 gtctgatttc tccaaccgag ttgaaatttc caaagcaagt gcttctttaa atggggacct 9300 gagggcactc gctttgctcc tgtcagtaca cactcccaaa cagttaaacc cagctctaat 9360 tccaactctg caagagcttt taagcaaatg caggacttgt ctgcaacaga gaaactcact 9420 ccaagagcaa gaagccaaag aaagaaaaac taaagatgat gaaggagcaa ctcccattaa 9480 aaggcggcgt gttagcagtg atgaggagca cactgtagac agctgcatca gtgacatgaa 9540 aacagaaacc agggaggtcc tgaccccaac gagcacttct gacaatgaga ccagagactc 9600 ctcaattatt gatccaggaa ctgagcaaga tcttccttcc cctgaaaata gttctgttaa 9660 agaataccga atggaagttc catcttcgtt ttcagaagac atgtcaaata tcaggtcaca 9720 gcatgcagaa gaacagtcca acaatggtag atatgacgat tgtaaagaat ttaaagacct 9780 ccactgttcc aaggattcta ccctagctga ggaagaatct gagttccctt ctacttctat 9840 ctctgcagtt ctgtctgact tagctgactt gagaagctgt gatggccaag ctttgccctc 9900 ccaggaccct gaggttgctt tatctctcag ttgtggccat tccagaggac tctttagtca 9960 tatgcagcaa catgacattt tagataccct gtgtaggacc attgaatcta caatccatgt 10020 cgtcacaagg atatctggca aaggaaacca agctgcttct tga 10063 Tabla 2 (a) -USP N07: variante de empalme novedosa-secuencia de aminoácidos LOCUS USP_N07 1355 aa PRT Acceso NP_060414 Sec. Gen AAU82714 ORIGEN humano Forma de empalme caracterizada por 1 inserción: Pos 14 - Pos 81 1 MVPGEENQLV PKEIENAAEE PRVLCIIQDT TNSKTVNERI TLNLPASTPV RKLFEDVANK 61 VGYINGTFDL VWGNGINTAD MAPLDHTSDK SLLDANFEPG KKNFLHLTDK DGEQPQILLE 121 DSSAGEDSVH DRFIGPLPRE GSVGSTSDYV SQSYSYSSIL NKSETGYVGL VNQAMTCYLN 181 SLLQTLFMTP EFRNALYKWE FEESEEDPVT SIPYQLQRLF VLLQTSKKRA IETTDVTRSF 241 GWDSSEAWQQ HDVQELCRVM FDALEQKWKQ TEQADLINEL YQGKLKDYVR CLECGYEGWR 301 IDTYLDIPLV IRPYGSSQAF ASVEEALHAF IQPEILDGPN QYFCERCKKK CDARKGLRFL 361 HFPYLLTLQL KRFDFDYTTM HRIKLNDRMT FPEELDMSTF IDVEDEKSPQ TESCTDSGAE 421 NEGSCHSDQM SNDFSNDDGV DEGICLETNS GTEKISKSGL EKNSLIYELF SVMVHSGSAA 481 GGHYYACIKS FSDEQWYSFN DQHVSRITQE DIKKTHGGSS GSRGYYSSAF ASSTNAYMLI 541 YRLKDPARNA KFLEVDEYPE HIKNLVQKER ELEEQEKRQR EIERNTCKIK LFCLHPTKQV 601 MMENKLEVHK DKTLKEAVEM AYKMMDLEEV IPLDCCRLVK YDEFHDYLER SYEGEEDTPM 661 GLLLGGVKST YMFDLLLETR KPDQVFQSYK PGEVMVKVHV VDLKAESVAA PITVRAYLNQ 721 TVTEFKQLIS KAIHLPAETM RIVLERCYND LRLLSVSSKT LKAEGFFRSN KVFVESSETL 781 DYQMAFADSH LWKLLDRHAN TIRLFVLLPE QSPVSYSKRT AYQKAGGDSG NVDDDCERVK 841 GPVGSLKSVE AILEESTEKL KSLSLQQQQD GDNGDSSKST ETsDFENrEs PLNERDSSAS 901 VDNRELEQHI QTSDPENFQS EERSDSDVNN DRSTSSVDSD ILSSSHSSDT LCNADNAQIP 961 LANGLDSHSI TSSRRTKANE GKKETWDTAE EDSGTDSEYD ESGKSRGEMQ YMYFKAEPYA 1021 ADEGSGEGHK WLMVHVDKRI TLAAFKQHLE PFVGVLSSHF KVFRVYASNQ EFESVRLNET 1081 LSSFSDDNKI TIRLGRALKK GEYRVKVYQL LVNEQEPCKF LLDAVFAKGM TVRQSKEELI 1141 PQLREQCGLE LSIDRFRLRK KTWKNPGTVF LDYHIYEEDI NISSNWEVFL EVLDGVEKMK 1201 SMSQLAVLSR RWKPSEMKLD PFQEVVLESS SVDELREKLS EISGIPLDDI EFAKGRGTFP 1261 CDISVLDIHQ DLDWNPKVST LNVWPLYICD DGAVIFYRDK TEELMELTDE QRNELMKKES 1321 SRLQKTGHRV TYSPRKEKAL KIYLDGAPNK DLTQD Tabla 2 (b) -USP N07 : variante de empalme novedosa-secuencia de nucleótidos 1 atggtgcccg gcgaggagaa ccaactggtc ccgaaagaga tagaaaatgc tgctgaagaa 61 cctagagtct tatgtattat acaagatact actaattcaa agacagtgaa tgaacggatc 121 actttaaatt taccagcatc tactccagtc agaaagctct ttgaagatgt ggccaacaaa 181 gtaggctaca taaatggaac ctttgacttg gtgtggggaa atggaatcaa tactgctgat 241 atggcaccac tggatcatac cagtgacaag tcacttctcg acgctaattt tgagccagga 301 aagaagaact ttctgcattt gacagataaa gatggtgaac aacctcaaat actgctggag 361 gattccagtg ctggggaaga cagtgttcat gacaggttta taggtccgct tccaagagaa 421 ggttctgtgg gttctaccag tgattatgtc agccaaagct actcctactc atctattttg 481 aataaatcag aaactggata tgtgggacta gtaaaccaag caatgacttg ctatttgaat 541 agccttttgc aaacactttt tatgactcct gaatttagga atgcattata taagtgggaa 601 tttgaagaat ctgaagaaga tccagtgaca agtattccat accaacttca aaggcttttt 661 gttttgttac aaaccagcaa aaagagagca attgaaacca cagatgttac aaggagcttt 721 ggatgggata gtagtgaggc ttggcagcag catgatgtac aagaactatg cagagtcatg 781 tttgatgctt tggaacagaa atggaagcaa acagaacagg ctgatcttat aaatgagcta 841 tatcaaggca agctgaagga ctacgtgaga tgtctggaat gtggttatga gggctggcga 901 atcgacacat atcttgatat tccattggtc atccgacctt atgggtccag ccaagcattt 961 gctagtgtgg aagaagcatt gcatgcattt attcagccag agattctgga tggcccaaat 1021 cagtattttt gtgaacgttg taagaagaag tgtgatgcac ggaagggcct tcggtttttg 1081 cattttcctt atctgctgac cttacagctg aaaagattcg attttgatta tacaaccatg 1141 cataggatta aactgaatga tcgaatgaca tttcccgagg aactagatat gagtactttt 1201 attgatgttg aagatgagaa atctcctcag actgaaagtt gcactgacag tggagcagaa 1261 aatgaaggta gttgtcacag tgatcagatg agcaacgatt tctccaatga tgatggtgtt 1321 gatgaaggaa tctgtcttga aaccaatagt ggaactgaaa agatctcaaa atctggactt 1381 gaaaagaatt ccttgatcta tgaacttttc tctgttatgg ttcattctgg gagcgctgct 1441 ggtggtcatt attatgcatg tataaagtca ttcagtgatg agcagtggta cagcttcaat 1501 gatcaacatg tcagcaggat aacacaagag gacattaaga aaacacatgg tggatcttca 1561 ggaagcagag gatattattc tagtgctttc gcaagttcca caaatgcata tatgctgatc 1621 tatagactga aggatccagc cagaaatgca aaatttctag aagtggatga atacccagaa 1681 catattaaaa acttggtgca gaaagagaga gagttggaag aacaagaaaa gagacaacga 1741 gaaattgagc gcaatacatg caagataaaa ttattctgtt tgcatcctac aaaacaagta 1801 atgatggaaa ataaattgga ggttcataag gataagacat taaaggaagc agtagaaatg 1861 gcttataaga tgatggattt agaagaggta atacccctgg attgctgtcg ccttgttaaa 1921 tatgatgagt ttcatgatta tctagaacgg tcatatgaag gagaagaaga tacaccaatg 1981 gggcttctac taggtggcgt caagtcaaca tatatgtttg atctgctgtt ggagacgaga 2041 aagcctgatc aggttttcca atcttataaa cctggagaag tgatggtgaa agttcatgtt 2101 gttgatctaa aggcagaatc tgtagctgct cctataactg ttcgtgctta cttaaatcag 2161 acagttacag aattcaaaca actgatttca aaggccatcc atttacctgc tgaaacaatg 2221 agaatagtgc tggaacgctg ctacaatgat ttgcgtcttc tcagtgtctc cagtaaaacc 2281 ctgaaagctg aaggattttt tagaagtaac aaggtgtttg ttgaaagctc cgagactttg 2341 gattaccaga tggcctttgc agactctcat ttatggaaac tcctggatcg gcatgcaaat 2401 acaatcagat tatttgtttt gctacctgaa caatccccag tatcttattc caaaaggaca 2461 gcataccaga aagctggagg cgattctggt aatgtggatg atgactgtga aagagtcaaa 2521 ggacctgtag gaagcctaaa gtctgtggaa gctattctag aagaaagcac tgaaaaactc 2581 aaaagcttgt cactgcagca acagcaggat ggagataatg gggacagcag caaaagtact 2641 gagacaagtg actttgaaaa catcgaatca cctctcaatg agagggactc ttcagcatca 2701 gtggataata gagaacttga acagcatatt cagacttctg atccagaaaa ttttcagtct 2761 gaagaacgat cagactcaga tgtgaataat gacaggagta caagttcagt ggacagtgat 2821 attcttagct ccagtcatag cagtgatact ttgtgcaatg cagacaatgc tcagatccct 2881 ttggctaatg gacttgactc tcacagtatc acaagtagta gaagaacgaa agcaaatgaa 2941 gggaaaaaag aaacatggga tacagcagaa gaagactctg gaactgatag tgaatatgat 3001 gagagtggca agagtagggg agaaatgcag tacatgtatt tcaaagctga accttatgct 3061 gcagatgaag gttctgggga aggacataaa tggttgatgg tgcatgttga taaaagaatt 3121 actctggcag ctttcaaaca acatttagag ccctttgttg gagttttgtc ctctcacttc 3181 aaggtctttc gagtgtatgc cagcaatcaa gagtttgaga gcgtccggct gaatgagaca 3241 ctttcatcat tttctgatga caataagatt acaattagac tggggagagc acttaaaaaa 3301 ggagaataca gagttaaagt ataccagctt ttggtcaatg aacaagagcc atgcaagttt 3361 ctgctagatg ctgtgtttgc taaaggaatg actgtacggc aatcaaaaga ggaattaatt 3421 cctcagctca gggagcaatg tggtttagag ctcagtattg acaggtttcg tctaaggaaa 3481 aaaacatgga agaatcctgg cactgtcttt ttggattatc atatttatga agaagatatt 3541 aatatttcca gcaactggga ggttttcctt gaagttcttg atggggtaga gaagatgaag 3601 tccatgtcac agcttgcagt tttgtcaaga cggtggaagc cttcagagat gaagttggat 3661 cccttccagg aggttgtatt ggaaagcagt agtgtggacg aattgcgaga gaagcttagt 3721 gaaatcagtg ggattccttt ggatgatatt gaatttgcta agggtagagg aacatttccc 3781 tgtgatattt ctgtccttga tattcatcaa gatttagact ggaatcctaa agtttctacc 3841 ctgaatgtct ggcctcttta tatctgtgat gatggtgcgg tcatatttta tagggataaa 3901 acagaagaat taatggaatt gacagatgag caaagaaatg aactgatgaa aaaagaaagc 3961 agtcgactcc agaagactgg acatcgtgta acatactcac ctcgtaaaga gaaagcacta 4021 aaaatatatc tggatggagc accaaataaa gatctgactc aagactga Tabla 2 (c) -USP N07 : secuencia de referencia (Der ent AAU82714) Secuencia de Aminoácidos: 1 vpgeenqlv pkeapldhts dkslldanfe pgkknflhlt dkdgeqpqil ledssageds 61 vhdrfigplp regsvgstsd yvsqsysyss ilnksetgyv glvnqamtcy Insllqtlfra 121 tpefrnalyk wefeeseedp vtsipyqlqr lfvllqtskk raiettdvtr sfgwdsseaw 181 qqhdvqelcr vmfdaleqkw kqteqadlin elyqgklkdy vrclecgyeg wridtyldip 241 lvirpygssq afasveealh afiqpeildg pnqyfcerck kkcdarkglr flhfpylltl 301 qlkrfdfdyt tmhriklndr mtfpeeldms tfidvedeks pqtesctdsg aenegschsd 361 qmsndfsndd gvdegiclet nsgtekisks gleknsliye Ifsvmahsgs aagghyyaci 421 ksfsdeqwys fddqhvsrit qedikkthgg ssgsrgyyss afasstnaym liyrlkdpar 481 nakflevgey pehiknlvqk ereleeqekr qreierntck iklfclhptk qvmmenklev 541 hkdktlkeav emaykmmdle evipldccrl vkydefhdyl ersyegeedt pmglllggvk 601 stymfdllle trkpdqvfqs ykpgevmvkv h vdlkaesv aapitvrayl nqtvtefkql 661 iskaihlpae trarivlercy ndlrllsvss ktlkaegffr snkvfvesse tldyqmafad 721 shlwklldrh antirlfvll peqspvsysk rtayqkaggd sgnvdddcer vkgpvgslks 781 veaileeste klkslslqqq qdgdngdssk stetsdfeni esplnerdss asvdnreleq 841 hiqtsdpenf qseersdsdv nndrstssvd sdilssshss dtlcnadnaq iplangldsh 901 sitssrrtka negkketwdt aeedsgtdse ydesgksrge mqymyfkaep yaadegsgeg 961 hkwlmvhvdk ritlaafkqh lepfvgvlss hfkvfrvyas nqefesvrln etlssfsddn 1021 kitirlgral kkgeyrvkvy qllvneqepc kflldavfak gmtvrqskee lipqlreqcg 1081 lelsidrfrl rkktwknpgt vfldyhiyee dinissnwev flevldgvek mksmsqlavl 1141 srrwkpsemk ldpfqevvle sssvdelrek Iseisgipld diefakgrgt fpcdisvldi 1201 hqdldwnpkv stlnvwplyi cddgavifyr dkteelmelt deqrnelmkk essrlqktgh 1261 rvtysprkek alkiyldgap nkdltqd Tabla 2 (d) -USP N07 : secuencia de referencia (Der ent AAU82714) Secuencia de Nucleótidos: atggtgcccg gcgaggagaa ccaactggtc ccgaaagagg caccactgga tcataccagt 60 gaca-agtcac ttctcgacgc taattttgag ccaggaaaga agaactttct gcatttgaca 120 gataaagatg gtgaacaacc tcaaatactg ctggaggatt ccagtgctgg ggaagacagt 180 gttcatgaca. ggtttatagg tccgcttcca agagaaggtt ctgtgggttc taccagtgat 240 tatgtcagcc aaagctactc ctactcatct attttgaata aatcagaaac tggatatgtg 300 ggactagtaa accaagcaat gacttgctat ttgaatagcc ttttgcaaac actttttatg 360 actcctgaat ttaggaatgc attatataag tgggaatttg aagaatctga agaagatcca 420 gtgacaagta ttccatacca acttcaaagg ctttttgttt tgttacaaac cagcaaaaag 480 agagcaattg aaaccacaga tgttacaagg agctttggat gggatagtag tgaggcttgg 540 cagcagcatg atgtacaaga actatgcaga gtcatgtttg atgctttgga acagaaatgg 600 aagcaaacag aacaggctga tcttataaat gagctatatc aaggcaagct gaaggactac 660 gtgagatgtc tggaatgtgg ttatgagggc tggcgaatcg acacatatct tgatatccca 720 ttggtcatcc gaccttatgg gtccagccaa gcatttgcta gtgtggaaga agcattgcat 780 gcatttattc agccagagat tctggatggc ccaaatcagt atttttgtga acgttgtaag 840 aagaagtgtg atgcacggaa gggccttcgg tttttgcatt ttccttatct gctgacctta 900 cagctgaaaa gattcgattt tgattataca accatgcata ggattaaact gaatgatcga 960 atgacatttc ccgaggaact agatatgagt acttttattg atgttgaaga tgagaaatct 1020 cctcagactg aaagttgcac tgacagtgga gcagaaaatg aaggtagttg tcacagtgat 1080 cagatgagca acgatttctc caatgatgat ggtgttgatg aaggaatctg tcttgaaacc 1140 aatagtggaa ctgaaaagat ctcaaaatct ggacttgaaa agaattcctt gatctatgaa 1200 cttttctctg ttatggctca ttctgggagc gctgctggtg gtcattatta tgcatgtata 1260 aagtcattca gtgatgagca gtggtacagc ttcgatgatc aacatgtcag caggataaca 1320 caagaggaca ttaagaaaac acatggtgga tcttcaggaa gcagaggata ttattctagt 1380 gctttcgcaa gttccacaaa tgcatatatg ctgatctata gactgaagga tccagccaga 1440 aatgcaaaat ttctagaagt gggtgaatac ccagaacata ttaaaaactt ggtgcagaaa 1500 gagagagagt tggaagaaca agaaaagaga caacgagaaa ttgagcgcaa tacatgcaag 1560 ataaaattat tctgtttgca tcctacaaaa caagtaatga tggaaaataa attggaggtt 1620 cataaggata agacattaaa ggaagcagta gaaatggctt ataagatgat ggatttagaa 1680 gaggtaatac ccctggattg ctgtcgcctt gttaaatatg atgagtttca tgattatcta 1740 gaacggtcat atgaaggaga agaagataca ccaatggggc ttctactagg tggcgtcaag 1800 tcaacatata tgtttgatct gctgttggag acgagaaagc ctgatcaggt tttccaatct 1860 tataaacctg gagaagtgat ggtgaaagtt catgttgttg atctaaaggc agaatctgta 1920 gctgctccta taactgttcg tgcttactta aatcagacag ttacagaatt caaacaactg 1980 atttcaaagg ccatccattt acctgctgaa acaatgagaa tagtgctgga acgctgctac 2040 aatgatttgc gtcttctcag tgtctccagt aaaaccctga aagctgaagg attttttaga 2100 agtaacaagg tgtttgttga aagctccgag actttggatt accagatggc ctttgcagac 2160 tctcatttat ggaaactsct ggatcggcat gcaaatacaa tcagattatt tgttttgcta 2220 cctgaacaat ccccagtatc ttattccaaa aggacagcat accagaaagc tggaggcgat 2280 tctggtaatg tggatgatga ctgtgaaaga gtcaaaggac ctgtaggaag cctaaagtct 2340 gtggaagcta ttctagaaga aagcactgaa aaactcaaaa gcttgtcact gcagcaacag 2400 caggatggag ataatgggga cagcagcaaa agtactgaga caagtgactt tgaaaacatc 2460 gaatcacctc tcaatgagag ggactcttca gcatcagtgg ataatagaga acttgaacag 2520 catattcaga cttctgatcc agaaaatttt cagtctgaag aacgatcaga ctcagatgtg 2580 aataatgaca ggagtacaag ttcagtggac agtgatattc ttagctccag tcatagcagt 2640 gatactttgt gcaatgcaga caatgctcag atccctttgg ctaatggact tgactctcac 2700 agtatcacaa gtagtagaag aacgaaagca aatgaaggga aaaaagaaac atgggataca 2760 gcagaagaag actctggaac tgatagtgaa tatgatgaga gtggcaagag taggggagaa 2820 atgcagtaca tgtatttcaa agctgaacct tatgctgcag atgaaggttc tggggaagga 2880 cataaatggt tgatggtgca tgttgataaa agaattactc tggcagcttt caaacaacat 2940 ttagagccct ttgttggagt tttgtcctct cacttcaagg tctttcgagt gtatgccagc 3000 aatcaagagt ttgagagcgt ccggctgaat gagacacttt catcattttc tgatgacaat 3060 aagattacaa ttagactggg gagagcactt aaaaaaggag aatacagagt taaagtatac 3120 cagcttttgg tcaatgaaca agagccatgc aagtttctgc tagatgctgt gtttgctaaa 3180 ggaatgactg tacggcaatc aaaagaggaa ttaattcctc agctcaggga gcaatgtggt 3240 ttagagctca gtattgacag gtttcgtcta aggaaaaaaa catggaagaa tcctggcact 3300 gtctttttgg attatcatat ttatgaagaa gatattaata tttccagcaa ctgggaggtt 3360 ttccttgaag ttcttgatgg ggtagagaag atgaagtcca tgtcacagct tgcagttttg 3420 tcaagacggt ggaagccttc agagatgaag ttggatccct tccaggaggt tgtattggaa 3480 agcagtagtg tggacgaatt gcgagagaag cttagtgaaa tcagtgggat tcctttggat 3540 gatattgaat ttgctaaggg tagaggaaca tttccctgtg atatttctgt ccttgatatt 3600 catcaggatt tagactggaa tcctaaagtt tctaccctga atgtctggcc tctttatatc 3660 tgtgatgatg gtgcggtcat attttatagg gataaaacag aagaattaat ggaattgaca 3720 gatgagcaaa gaaatgaact gatgaaaaaa gaaagcagtc gactccagaa gactggacat 3780 cgtgtaacat actcacctcg taaagagaaa gcactaaaaa tatatctgga tggagcacca 3840 aataaagatc tgactcaaga ctga 3864 Tabla 3 (a) -USP Nll:variante de empalme novedosa : secuencia de aminoácidos LOCUS USP_N11 402 aa PRT Acceso AK022614 Sec. Gen AAU82713 ORIGEN humano Forma de empalme caracterizada por 1 inserción: Pos 12 - Pos 48 1 MTVRNIASIC NMEEPPALGS PGWTLLAPPL VRAFGELRLE EGIAVPCRGT NASALEKDIG 61 PEQFPINEHY FGLVNFGNTC YCNSVLQALY FCRPFRENVL AYKAQQKKKE NLLTCLADLF 121 HSIATQKKKV GVIPPKKFIS RLRKENDLFD NYMQQDAHEF LNYLLNTIAD ILQEEKKQEK 181 QNGKLKNGNM NEPAENNKPE LTWVHEIFQG TLTNETRCLN CETVSSKDED FLDLSVDVEQ 241 NTSITHCLRD. FSNTETLCSE QKYYCETCCS KQEAQKRMRV KKLPMILALH LKRFKYMEQL 301 HRYTKLSYRV VFPLELRLFN TSSDAVNLDR MYDLVAV VH CGSGPNRGHY ITIVKSHGFW 361 LLFDDDIVEK 1DAQAIEEFY GLTSDISKNS ESGYILFYQS RE Tabla 3 (b) -USP Nll: ariante de empalme novedosa : secuencia de nucleótidos 1 atgactgtcc gaaacatcgc ctccatctgt aatatgggca ccaatgcctc tgctctggaa 61 aaagacattg gtccagagca gtttccaatc aatgaacact atttcggatt ggtcaatttt 121 ggaaacacat gctactgtaa ctccgtgctt caggcattgt acttctgccg tccattccgg 181 gagaatgtgt tggcatacaa ggcccagcaa aagaagaagg aaaacttgct gacgtgcctg 241 gcggaccttt tccacagcat tgccacacag aagaagaagg ttggcgtcat cccaccaaag 301 aagttcattt caaggctgag aaaagagaat gatctctttg ataactacat gcagcaggat 361 gctcatgaat ttttaaatta tttgctaaac actattgcgg acatccttca ggaggagaag 421 aaacaggaaa aacaaaatgg aaaattaaaa aatggcaaca tgaacgaacc tgcggaaaat 481 aataaaccag aactcacctg ggtccatgag atttttcagg gaacgcttac caatgaaact 541 cgatgcttga actgtgaaac tgttagtagc aaagatgaag attttcttga cctttctgtt 601 gatgtggagc agaatacatc cattacccac tgtctaagag acttcagcaa cacagaaaca 661 ctgtgtagtg aacaaaaata ttattgtgaa acatgctgca gcaaacaaga agcccagaaa 721 aggatgaggg taaaaaagct gcccatgatc ttggccctgc acctaaagcg gttcaagtac 781 atggagcagc tgcacagata caccaagctg tcttaccgtg tggtcttccc tctggaactc 841 cggctcttca acacctccag tgatgcagtg aacctggacc gcatgtatga cttggttgcg 901 gtggtcgttc actgtggcag tggtcctaat cgtgggcatt atatcactat tgtgaaaagt 961 cacggcttct ggcttttgtt tgatgatgac attgtagaga aaatagatgc tcaagctatt 1021 gaagaattct atggcctgac gtcagatata tcaaaaaatt cagaatctgg atatatttta 1081 ttctatcagt caagagagta a Tabla 3 (c) -USP Nll: secuencia de referencia (Der ent AAU82713) Secuencia de Aminoácidos: 1 mtvrniasic nmgtnasale kdigpeqfpi nehyfglvnf gntcycnsvl qalyfcrpfr 61 envlaykaqq kkkenlltcl adlfhsiatq kkkvgvippk kfisrlrken dlfdnymqqd 121 aheflnylln tiadilqeek kqekqngklk ngn nepaen nkpeltwvhe ifqgtltnet 181 rclncetvss kdedfldlsv dveqntsith clrdfsntet lcseqkyyce tccskqeaqk 241 rmrvkklp v lalhlkrfky meqlrrytkl syr vfplel rlfntssdav nldrmydlva 301 vvvhcgsgpn rghyitivks hgfwllfddd ivekidaqai eefygltsdi sknsesgyil 361 fyqsre Tabla 3 (d) -USP Nll: secuencia de referencia (Der ent AAU82713) Secuencia de Nucleótidos: atgactgtcc gaaacatcgc ctccatctgt aatatgggca ccaatgcctc tgctctggaa 60 aaagacattg gtccagagca gtttccaatc aatgaacact atttcggatt ggtcaatttt 120 ggaaacacat gctactgtaa ctccgtgctt caggcattgt acttctgccg tccattccgg 180 gagaatgtgt tggcatacaa ggcccagcaa aagaagaagg aaaacttgct gacgtgcctg 240 gcggaccttt tccacagcat tgccacacag aagaagaagg ttggcgtcat cccaccaaag 300 aagttcattt caaggctgag aaaagagaat gatctctttg ataactacat gcagcaggat 360 gctcatgaat ttttaaatta tttgctaaac actattgcgg acatccttca ggaggagaag 420 aaacaggaaa aacaaaatgg aaaattaaaa aatggcaaca tgaacgaacc tgcggaaaat 480 aataaaccag aactcacctg ggtccatgag atttttcagg gaacgcttac caatgaaact 540 cgatgcttga actgtgaaac tgttagtagc aaagatgaag attttcttga cctttctgtt 600 gatgtggagc agaatacatc cattacccac tgtctaagag acttcagcaa cacagaaaca 660 ctgtgtagtg aacaaaaata ttattgtgaa acatgctgca gcaaacaaga agcccagaaa 720 aggatgaggg taaaaaagct gcccatggtc ttggccctgc acctaaagcg gttcaagtac 780 atggagcagc tgcgcagata caccaagctg tcttaccgtg tggtcttccc tctggaactc 840 cggctcttca acacctccag tgatgcagtg aacctggacc gcatgtatga cttggttgcg 900 gtggtcgttc actgtggcag tggtcctaat cgtgggcatt atatcactat tgtgaaaagt 960 cacggcttct ggcttttgtt tgatgatgac attgtagaga aaatagatgc tcaagctatt 1020 gaagaattct atggcctgac gtcagatata tcaaaaaatt cagaatctgg atatatttta 1080 ttctatcagt caagagagta a 1101 Ejemplos Los miembros de la familia específicamente conocidos del clan CA/familia C12/C19 (enzimas de desubiquitina) , se recuperan de MEROPS (un total de 9 secuencias de péptidos para C12, y 76 secuencias de péptidos para C19), y se someten a las búsquedas PSI-BLAST y de Smith-Waterman. Las bases de datos de búsqueda incluyen las secuencias de Marco de Lectura Abierta traducidas de las secuencias del genoma humano, tanto de Celera como la pública (NCBI), de las proteínas predichas por Celera, de la predicción genscan de Celera basada en el genoma humano de Celera, y de las secuencias predichas de las bases de datos patentadas. En adición, los miembros de las dos familias (C12 y C19) se someten a búsquedas de Interproscan, con el fin de identificar sus motivos Interpro. Todas las proteínas de la familia C12 (hidrolasa carboxilo-terminal de ubiquitina, familia 1) se identifican mediante IPR001578, y los patrones asociados Prints, Prosite, y PFAM (PR00707, PS00140, y PF01088). De una manera similar, la familia C19 es definida por el motivo IPR001394 (tiolesterasa de ubiquitina), y las firmas correspondientes Prints y PFAM (PS00972, PS00973, PS50235, PF00443). Los modelos de las bases de datos Prosite, Prints, y PFAM se descargan y se utilizan en las búsquedas apropiadas. Los resultados de las diferentes búsquedas se fusionaron y se procesaron mediante tres filtros con el objeto de reducir la redundancia. Se rastrean los impactos primarios para determinar la baja complejidad, y se cotejan contra una base de datos de referencia de proteínas que contenga las secuencias de las proteínas humanas de GenBank, SuissProt, y Refseq. Se remueven los impactos que compartan una identidad mayor al 95 por ciento sobre cuando menos 50 aminoácidos con las proteínas en la base de datos de referencia. En adición, las secuencias de ADN correspondientes de los impactos se cotejan contra la base de datos de referencia de ADN que contenga las secuencias de ADNc humanas Refseq. Se remueven los impactos que compartan una identidad mayor al 95 por ciento sobre cuando menos 150 nucleótidos con las secuencias de ADN de la base de datos de referencia. Y finalmente, se purgan los impactos que sobrevivan al proceso de filtración unos contra otros, utilizando un corte de identidad del 95 por ciento, para generar racimos consistentes en impactos altamente homólogos. USP_N01 es una secuencia de impacto representativa de este racimo. Se conduce una segunda ronda de análisis para la perfilación de la expresión genética y el Northern electrónico para todos los miembros humanos de las familias C12/C19.

Se utilizan las secuencias públicas de los miembros de las familias C12/C19 con el fin de identificar el racimo UniGene correspondiente y la distribución de expresión normalizada asociada para los tipos de tejido. Éstos se comparan con los datos de chips genéticos que se puedan obtener mirando los conjuntos de sondas correspondientes sobre un atlas de tejido humano y sobre las muestras de tumor.

Ejem lo 1 : En la Figura 1 se muestran los perfiles de expresión genética para USP_N01 correspondientes a las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

Ejem pío 2: En la Figura 2 se muestra el perfil de expresión genética para USP_N07 correspondiente a las SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

Ejem pío 3: En la Figura 3 se muestra el perfil de expresión genética para USP_N11 correspondiente a las SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ADN aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteasa específica de ubíquitina seleccionada a partir del grupo de: (a) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10; (b) un fragmento de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10; (c) un derivado de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10; (d) una secuencia sustancialmente homologa a las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10.

2. Un ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 1, el cual consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10.

3. Un ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el fragmento mencionado comprende cuando menos 50 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10, y retiene la actividad funcional específica de ubiquitina.

4. Un ADN aislado de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende una secuencia de nucleótidos que es cuando menos el 80 por ciento homologa a una secuencia de nucleótidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10, y retiene la actividad funcional específica de ubiquitina.

5. Un ADN aislado, el cual comprende una secuencia de ácido nucleico de aproximadamente 30 a 50 nucleótidos, la cual se híbrida bajo condiciones de alta restringencia a un ADN aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un polipéptido aislado de una proteasa específica de ubiquitina, el cual comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de: (a) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9; (b) un fragmento de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9; (c) un derivado de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9; (d) una secuencia sustancialmente homologa a las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9.

7. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 6, el cual consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9.

8. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el fragmento mencionado comprende cuando menos 5 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO:

9. 9. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 6, el cual es cuando menos el 80 por ciento homólogo a una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, y retiene la actividad funcional específica de ubiquitina.

10. Un polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el derivado mencionado es funcionalmente equivalente a una proteasa específica de ubiquitina.

11. Una célula huésped, la cual comprende un ADN aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. Un vector, el cual comprende un ADN aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

13. Un vector de acuerdo con la reivindicación 12, el cual comprende secuencias de control de transcripción.

14. Una célula huésped, la cual comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13.

15. Un método para el diagnóstico de cáncer de mama en un ser humano, el cual comprende medir la cantidad de un polipéptido que comprenda un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en tejido de mama de un ser humano, en donde la presencia de una cantidad elevada de este polipéptido en relación con la cantidad del polipéptido en el tejido de mama normal es un diagnóstico de que este ser humano está sufriendo de cáncer de mama.

16. Un método para diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el paso de detectar comprende poner en contacto el tejido de mama con un anticuerpo que se enlace específicamente a un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, y detectar el enlace específico de este anticuerpo con un polipéptido en el tejido de mama, en donde la detección del enlace específico a un polipéptido indica la presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

17. Un método para diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 15 o con la reivindicación 16, en donde la secuencia de aminoácidos comprende la SEQ ID NO: 1, un fragmento, derivado, u homólogo de la misma.

18. Un método para el diagnóstico de leucemia en un ser humano, el cual comprende medir la cantidad de un polipéptido que comprenda un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en las células de sangre periférica, en especial las células linfoides, en donde la presencia de una cantidad elevada de este polipéptido en relación con la cantidad del polipéptido en las células de sangre periférica normal, en especial las células linfoides, es un diagnóstico de que este ser humano está sufriendo de leucemia.

19. El método de la reivindicación 18, en donde el paso de detectar comprende poner en contacto las células de sangre periférica, en especial las células linfoides, con un anticuerpo que se enlace específicamente a un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, y detectar el enlace específico de este anticuerpo con un polipéptido en estas células de sangre periférica, en donde la detección del enlace específico con un polipéptido indica la presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

20. Un método para diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 18 o con la reivindicación 19, en donde la secuencia de aminoácidos comprende la SEQ ID NO: 5, un fragmento, derivado, u homólogo de la misma.

21. Un método para el diagnóstico de trastornos del cerebro en un ser humano, el cual comprende medir la cantidad de un polipéptido que comprenda un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 en los tejidos de amígdala, médula espinal, o bulbo olfatorio, en donde la presencia de una cantidad elevada de este polipéptido en relación con la cantidad del polipéptido en los tejidos de amígdala, médula espinal, y bulbo olfatorio normales, es un diagnóstico de que este ser humano está sufriendo de un trastorno del cerebro.

22. El método de la reivindicación 21, en donde el paso de detectar comprende poner en contacto los tejidos de amígdala, médula espinal, o bulbo olfatorio, con un anticuerpo que se enlace específicamente a un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, y detectar el enlace específico de este anticuerpo con un polipéptido en el tejido cerebral, en donde la detección del enlace específico con un polipéptido indica la presencia de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

23. Un método para diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 21 o con la reivindicación 22, en donde la secuencia de aminoácidos comprende la SEQ ID NO: 9, un fragmento, derivado, u homólogo de la misma.

24. Un anticuerpo que se enlaza específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos estipulada en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

25. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 24, el cual es un fragmento Fab o F(ab')2.

26. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 24, el cual es un anticuerpo policlonal.

27. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 24, el cual es un anticuerpo monoclonal.

28. Una composición farmacéutica, la cual comprende un anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 27.

29. Un método para el tratamiento de cáncer de mama, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico inhibidor adecuado para inhibir la expresión de un gen que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, a un paciente de cáncer de mama.

30. Un método para el tratamiento de leucemia, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de un ácido nucleico inhibidor adecuado para inhibir la expresión de un gen que comprenda una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, a un paciente de leucemia.

31. Una composición farmacéutica, la cual comprende un ácido nucleico inhibidor adecuado para inhibir la expresión de un gen que comprenda una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

32. Un estuche de diagnóstico para una enfermedad que involucre una proteasa específica de ubiquitina, el cual comprende cuando menos uno de los siguientes componentes: (a) un oligonucleótido adecuado para la detección de un ácido nucleico que comprenda una secuencia de nucleótidos, o parte de una secuencia de nucleótidos, como se estipula en las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, ó SEQ ID NO: 10, (b) un anticuerpo adecuado para la detección de un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos, o parte de una secuencia de aminoácidos, como se estipula en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 5, ó SEQ ID NO: 9, (c) instrucciones para utilizar el estuche de diagnóstico.