MXPA05006035A - Polipeptido mitoneet de membranas mitocondriales, moduladores del mismo y procedimientos para usar el mismo. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere generalmente a una familia de polipeptidos de membranas mitocondriales, que se unen a tiazolodindionas antidiabeticas, sensibilizadoras a insulina, y secuencias de acidos nucleicos que codifican la familia de polipeptidos; la invencion se refiere a procedimientos de identificacion de agentes terapeuticos que se unen a los polipeptidos de la presente invencion; la invencion se refiere ademas a procedimientos utiles para tratar o modular trastornos metabolicos en mamiferos con necesidad de tal efecto biologico.

Description

POLIPEPTIDO mitoNEET DE MEMBRANAS MITOCONDRIALES. MODULADORES DEL MISMO Y PROCEDIMIENTOS PARA USAR EL MISMO CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere generalmente a la identificación de una familia de polipéptidos de las membranas mitocondriales, que se unen a tiazolodindionas antidiabéticas que sensibilizan a insulina, y las secuencias de ácido nucleico que codifica la familia de los polipéptidos. La invención se refiere a procedimientos de identificación de agentes terapéuticos que se unen a los polipéptidos de la presente invención. La presente invención también se refiere a moléculas antisentido. La invención adicionalmente se refiere a procedimientos útiles para tratar o modular trastornos metabólicos en mamíferos que necesitan de este efecto biológico. Esto incluye el diagnóstico, tratamiento, y prevención de enfermedades o afecciones disfuncionales metabólicas asociadas con mitoNEET incluyendo, pero no de forma limitante, aquellas enfermedades o afecciones que se cree que están asociadas con PPARy, diabetes, "síndrome metabólico" o síndrome X, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, cánceres, y enfermedades inflamatorias. La invención también se refiere a anticuerpos que tienen especificidad por este polipéptido. Adicionalmente, la presente invención además se refiere al uso de anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención como sondas diagnósticas o como agentes terapéuticos así como el uso de secuencias polinucleotídicas que codifican los polipéptidos de la presente invención como sondas diagnósticas o agentes terapéuticos para el tratamiento o prevención de un amplio rango de estados patológicos incluyendo trastornos metabólicos, oncológicos, inflamatorios, y cardiovasculares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La diabetes mellitus no insulino-dependiente (NIDDM) o la Diabetes de Tipo 2 se caracteriza por la resistencia a insulina de los tejidos periféricos, incluyendo el músculo esquelético, hígado, y tejido adiposo. La hiperglucemia resultante a menudo se acompaña de metabolismo lipídico defectuoso que puede conducir a complicaciones cardiovasculares tales como aterosclerosis e hipertensión. Las tiazolidindionas comprenden un grupo de compuestos antidiabéticos relacionados estructu raímente que aumenta la sensibilidad a la insulina de los tejidos diana (músculo esquelético, hígado, adiposo) en animales resistentes a la insulina. Además de estos efectos en hiperglucemia, las tiazolidindionas también reducen los niveles de lípido e insulina en modelos animales de NIDDM. Las tiazolidindionas troglitazona, rosiglitazona, y pioglitazona han mostrado tener estos mismos efectos beneficiosos en pacientes humanos que sufren de tolerancia alterada a la glucosa, una afección metabólica que precede al desarrollo de NIDDM, así como en pacientes que sufren de NIDDM. (por ejemplo, Nolan y col., N. Eng. J. Med. 331 , 1 188-1193, 1994). Aunque su mecanismo de acción permanece sin aclarar, se conoce que las tiazolidindionas no causan aumento en la secreción de insulina o en el número o afinidad de sitios de unión al receptor de insulina, lo que sugiere que las tiazolidindionas amplifican los sucesos post-receptor en la cascada de señalización de la insulina (Coica y Morton, New Antidiabetic Drugs (C.J. Bailey y P.R. Flatt, eds.). Smith-Gordon, Nueva York, 255-261 , 1990, Chang y col., Diabetes 32:839-845, 1983). Se ha encontrado que las tiazolidindionas son inductores eficaces de la diferenciación en líneas celulares de preadipocitos cultivadas (Hiragun et at, J. Cell Physiol.134:124-130, 1988; Sparks y col., J. Cell. Physiol. 146:101-109, 1991 ; Kletzien y col., Mol. Pharmacol. 41 :393-398, 1992). El tratamiento de líneas celulares de preadipocitos con la tiazolidindiona pioglitazona tiene como resultado el aumento de la expresión de los genes específicos de adipocitos aP2 y adipsina así como de las proteínas transportadas de glucosa GLUT-1 y GLUT-4. Estos datos sugieren que los efectos hipoglucémicos de las tiazolidindionas vistos in vivo pueden mediarse a través del tejido adiposo. Sin embargo, como se estima de la contribución del tejido adiposo al uso de glucosa en el organismo completo oscila sólo del 1-3%, permanece sin aclarar si los efectos hipoglucémicos de las tiazolidindionas pueden deberse a cambios en los adipocitos. Además, el tejido adiposo puede no ser necesario para la farmacología de estos compuestos (Burant, y col. J Clin Invest 100: 2900-2908, 1997). Adicionalmente, las tiazolidindionas están implicadas en los trastornos de la regulación del apetito, véase la solicitud de Patente PCT WO 94/25026 A1 , y en el aumento del contenido graso de la médula ósea (Williams, y col. Diabetes 42, Suplemento 1 , pág. 59A1993). El receptor ? activado por el proliferador de peroxisomas (PPARy) es un miembro huérfano de la superfamilia esteroides/tiroides/retinoides de factores de trascripción activador por ligando. PPARy es uno de una subfamilia de los PPAR estrechamente relacionados codificados por genes independientes (Dreyer y col., Cell 68:879-887, 1992; Schmidt y col, J. Cell Physiol. 146:101-109, 1992; Zhu y col., J. Biol. Chem. 268:26817-26820, 1993; Kliewer y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :7355-7359, 1994). Se han identificado tres PPAR de mamíferos, y se han denominado PPARa, ? y NUC-1. Se han identificado homólogos de PPARa y Y en la rana, Xenopus laevis; sin embargo, un tercer PPAR de Xenopus denominado PPARp no es homólogo de NUC-1 , lo que sugiere que puede haber subtipos adicionales en una de ellas o en ambas especies. Los PPAR se activan en diversos grados por altas concentraciones (micro molar) de ácidos grasos de cadena larga y proliferadores de peroxisomas (Isseman y Green, Nature 347, 645-650, 1990; Gottlicher, Proc. Nati. Acad. USA 89, 4653-4657, 1992). Los proliferadores de peroxisomas son un grupo de componentes estructuralmente diversos que incluyen herbicidas, plastificantes de tipo ftalato, y fármacos hipolipidémicos de la clase fibrato. Aunque estos datos sugieren que los receptores PPAR son receptores auténticos, permanecen "huérfanos" ya que no se ha demostrado que ninguno de estos compuestos interaccionen directamente con PPAR. Los PPAR regulan la expresión de genes diana uniéndose a elementos de secuencia de ADN, denominados elementos de respuesta PPAR (PPRE), como heterodímeros con los receptores de retinoide X (revisado en Keller y Whali, Trends Endocrin. Met 4:291-296, 1993). Hasta la fecha, se han identificado PPRE en los potenciadores de un gran número de genes que codifican proteínas que regulan el metabolismo lipídico incluyendo las 3 enzimas requeridas para la beta-oxidación peroxisomal de ácidos grasos, una acil-CoA deshidrogenase de cadena media, una enzima llave en la beta-oxidación mitocondrial, y aP2, una proteína que une lípidos expresada exclusivamente en adipocitos. La naturaleza de los genes diana de PPAR unida con la activación de PPAR por ácidos grasos y fármacos hipolipidémicos sugiere una función fisiológica para los PPAR en la homeostasis lipídica (revisado en Keller y Whali, Trends Endocrín. Met 4:291-296, 1993). Una segunda isoforma de PPARy, denominada PPARy2, se clonó a partir de una biblioteca de adipocito de ratón (Tontonoz y col., Genes & Dev. 8, 1224-1234, 1994). PPARyl y ?2 difieren sólo en 30 aminoácidos del extremo N-term¡nal del receptor y probablemente proceden de un único gen. PPARy2 se expresa de una manera estrictamente específica del adipocito y su expresión es marcadamente inducida durante el desarrollo de la diferenciación de varias líneas celulares preadipocíticas; además la expresión forzada de PPARy2 mostró ser suficiente para activar el potenciador aP2 específico de adipocitos en líneas celulares no adipocíticas. Estos datos sugieren que PPARy2 juega una función importante en la diferenciación del adipocito. Se publicó que la tiazolidindiona pioglitazona estimula la expresión de un gen quimérico que contiene el potenciador/promotor de la proteína aP2 que une lípidos cadena arriba del gen indicador de la cloranfenicol acetiltransferasa (Harris y Kletzien, Mol. Pharmacol. 45:439-445, 1994). El análisis de la supresión conduce a la identificación de una región de aproximadamente 30 pb responsable de la sensibilidad a la pioglitazona. De manera interesante, en un estudio independiente, este fragmento de 30 pb mostró contener un PPRE (Tontonoz y col., Genes & Dev. 8:1224-1234, 1994). Todos estos estudios sugieren la posibilidad de que las tiazolidindionas modulen la expresión génica a nivel transcripcional a través de las interacciones con un PPAR. Las tiazolidindionas que sensibilizan respecto a insulina han mostrado eficacia como potenciales agentes anticancerígenos en cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer pancreático, y hepatoma (por ejemplo Mueller, E. y col., Molecular Cell (1998), 1(3), 465-470; Tanaka, T. y col., Cáncer Research (2001), 61 (6), 2424-2428; Itami, A. y col., International Journal of Cáncer (2001 ), 94(3), 370-376; Goeke, R. y col., Digestión (2001 ), 64(2), 75- 80; Okano, H y col., Anti- Cáncer Drugs (2002), 13(1 ), 59-65; y documento WO/0243716). Evidencias actuales sugieren que una simple interacción directa con receptores nucleares no puede explicar la farmacología de estos fármacos prometedores. Esfuerzos para mejorar la farmacología dirigiéndose directamente hacia receptores nucleares PPAR todavía no han mostrado un éxito probado. Es posible que pueda ser importante un sitio de acción adicional. Los inventores han mostrado que las tiazolidindionas también se unen directamente a la mitocondria y usan una sonda de fotoafinidad para marcar una proteína de 17 kDa, denominada como "mitoNEET", como la diana potencial para esta interacción. Se describen secuencias de aminoácidos y nucleicas homologas de un polipéptido humano descrito como una proteína no caracterizada de células progenitor/tronco hematopoyéticos (MDS029) (Número de Acceso al Banco de Genes NM_018464). Se describen secuencias de aminoácidos y nucleicas homologas de un polipéptido murino no caracterizado (Número de Acceso del Banco de Genes NM_134007).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Una realización de la presente invención es una familia aislada de polipéptidos de la membrana mitocondrial, que unen tiazolodindionas antidiabéticas que sensibilizan a insulina, codificados por una secuencia de ácidos nucleicos u oligonucleótido aislados descritos en el presente documento. En algunos aspectos, esto incluye la proteína aislada, variantes funcionales, o fragmentos de esta. En otra realización, una variante o fragmento de una proteína de la presente invención retiene la actividad respectiva. La proteína expresada en una línea celular apropiada, la proteína aislada o un fragmento de la proteína puede usarse sola o junto con otras proteínas mitocond ríales asociadas para encontrar compuestos útiles para los tratamientos reivindicados en el presente documento. También se incluye en la invención una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polipéptido de la presente invención o el complemento de la secuencia de ácido nucleico, así como vectores y células huésped que contengan esta secuencia de ácido nucleico. También se proporciona un procedimiento para producir un polipéptido cultivando células huésped transformadas con uno o más vectores descritos en el presente documento en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína codificada por el vector. En otro aspecto, la invención implica un procedimiento para identificar un agente terapéutico de ensayo para el tratamiento de una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada a mitoNEET en un sujeto implicando las etapas de proporcionar una población celular de ensayo capaz de expresar una o más de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención; poner en contacto la población celular de ensayo con el agente terapéutico de ensayo; detectar la expresión de una o más de estas secuencias de ácido nucleico; comparar la expresión con la de las secuencias de ácidos nucleicos en una población celular de referencia de las que se conoce la fase de la enfermedad; e identificar una diferencia en el nivel de expresión, si se da, entre la población celular de ensayo y la población celular de referencia. En realizaciones diferentes, el sujeto puede ser un mamífero o, más preferiblemente, un humano. Adicionalmente, el agente terapéutico de ensayo puede ser un agente de enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada a mitoNEET conocido o un agente de enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada a mitoNEET desconocido. El agente terapéutico puede ser un anticuerpo que tiene selectividad por al menos uno de los polipéptidos de la presente invención. Las enfermedades o afecciones disfuncionales metabólicas asociadas a mitoNEET a tratar se pueden seleccionar de entre las siguientes: dislipidemia incluyendo dislipidemia diabética asociada y dislipidemia mixta, síndrome X (según se define en esta solicitud este abarca al síndrome metabólico), fallo cardíaco, hipercolesterolemia, enfermedad cardiovascular incluyendo aterosclerosis, arteriesclerosis, e hipertrigliceridemia, diabetes mellitus de tipo II, diabetes de tipo I, resistencia a insulina, hiperlipidemia, inflamación, enfermedades epiteliales hiperproliferativas incluyendo eccema y psoriasis y afecciones asociadas con el pulmón y el intestino y regulación del apetito e ingesta de comida en sujetos que sufren de trastornos tales como obesidad, anorexia bulímica, y anorexia nerviosa. En particular, los compuestos de esta invención son útiles en el tratamiento y prevención de diabetes y enfermedades y afecciones cardiovasculares incluyendo hipertensión, aterosclerosis, arteriosclerosis, hipertrigliceridemia, y dislipidemia mixta. En un aspecto, la invención implica un procedimiento de evaluación de la eficacia del tratamiento de una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada a mitoNEET en un sujeto, en el que el procedimiento implica las etapas de proporcionar una población celular de ensayo capaz de expresar una o más de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención; detectar la expresión de una o más de estas secuencias de ácido nucleico; comparar la expresión con la de las secuencias de ácido nucleico en una población celular de referencia de la que se conoce la fase de la enfermedad; e identificar una diferencia en el nivel de expresión, si se da, entre la población celular de ensayo y la población celular de referencia. En diversas realizaciones, el sujeto puede ser un mamífero, o, más preferiblemente, un humano. En otras realizaciones, la población celular de ensayo puede proporcionarse in vitro, ex vivo a partir de un sujeto mamífero, o in vivo en un sujeto mamífero. La expresión de las secuencias de ácido nucleico puede aumentar o disminuir en la población de células de ensayo en comparación con la población de células de referencia. En un aspecto adicional, la invención implica un procedimiento de diagnostico de una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada a mitoNEET, en el que el procedimiento implica las etapas de proporcionar una población de células de ensayo capaz de expresar una o más de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención; detectar la expresión de una o más de estas secuencias de ácido nucleico; comparar la expresión con la de las secuencias de ácido nucleico en una población celular de referencia de la que se conoce la fase de la enfermedad; e identificar una diferencia en el nivel de expresión o cambios postraduccionales incluyendo pero no de forma limitante la fosforilación, si se da, entre la población de células de ensayo y la población de células de referencia. En diversas realizaciones, el sujeto puede ser un mamífero, o, más preferiblemente, un humano. En otras realizaciones, la población de células de ensayo puede proporcionarse in vitro, ex vivo a partir de un sujeto mamífero o in vivo de un sujeto mamífero. La expresión de las secuencias de ácido nucleico puede aumentar o disminuir en la población de células de ensayo en comparación con la población de células de referencia. En un aspecto adicional, la invención implica un procedimiento para identificar o determinar la susceptibilidad, predisposición o presencia de enfermedades o afecciones disfuncionales metabólicas asociadas a mitoNEET en un sujeto. En este aspecto, el procedimiento implica las etapas de proporcionar una población de células de ensayo capaz de expresar una o más de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención; detectar la expresión de una o más de estas secuencias de ácido nucleico; comparar la expresión con la de las secuencias de ácido nucleico en una población celular de referencia para la que se conoce la fase de la enfermedad; e identificar una diferencia en el nivel de expresión, si se da, entre la población de células de ensayo y la población de células de referencia. El sujeto puede ser un mamífero, o, más preferiblemente, un humano. En un aspecto alternativo, la invención implica un procedimiento de tratamiento de enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada a mitoNEET administrando un agente que modula la expresión o actividad de una o más de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención a un paciente que sufre o con riesgo de desarrollar la enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada a mitoNEET. Este agente puede ser uno que disminuya la expresión de una o más secuencias de la presente invención que están reguladas de forma positiva en los tejidos enfermos. Alternativamente, puede ser uno que aumente la expresión de una o más secuencias de la presente invención que están reguladas de forma negativa. Adicionalmente, el agente puede ser un anticuerpo contra un polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos, una molécula de ácido nucleico antisentido, un péptido, un polipéptido agonista, un polipéptido antagonista, un péptidomimético, una molécula pequeña u otro fármaco. La presente invención también se dirige a compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos contra un ácido nucleico que codifica mitoNEET, y que modula la expresión de mitoNEET. También se proporcionan composiciones farmacéuticas y otras que comprenden los compuestos antisentido de la invención. Adicionalmente se proporcionan procedimientos para la modulación de la expresión de mitoNEET en células o tejidos que comprenden el contacto de estas células o tejidos con uno o más compuestos o composiciones antisentido de la invención. Adicionalmente se proporcionan procedimientos para tratar a un animal, particularmente un humano, del que se sospecha que tiene o es propenso a una enfermedad o afección asociada con la expresión de mitoNEET por administración de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de uno o más compuestos o composiciones antisentido de la invención. La invención también incluye un kit que contiene uno o más reactivos para detectar una o más de las secuencias de ácido nucleico de la presente invención. Adicionalmente, la invención implica una serie de sondas de ácidos nucleicos capaces de detectar dos o más de los ácidos nucleicos de la presente invención. Los polipéptidos, ácido nucleicos, anticuerpos, o agentes terapéuticos de la invención pueden usarse para tratar enfermedades o afecciones disfuncionales metabólicas asociadas a mitoNEET en un sujeto. El tratamiento de una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada a mitoNEET puede ser en un mamífero, preferiblemente un humano. En diversas realizaciones, las composiciones terapéuticas que contienen los polipéptidos y ácidos nucleicos de la invención pueden usarse para el tratamiento de diabetes, "síndrome metabólico", enfermedades neurodegenerativas, cánceres, enfermedades cardiovasculares, y enfermedades inflamatorias. Estas composiciones terapéuticas pueden incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable y, adicionalmente un ingrediente activo tal como un agente de diabetes, un agente cardiovascular, un agente anticancerígeno, o un agente antiinflamatorio. También se proporciona un kit que contiene un polipéptido, ácido nucleico, anticuerpo o agente terapéutico identificado por los procedimientos de la presente invención o composiciones de uso en el diagnóstico, tratamiento, o prevención de enfermedades o afecciones asociadas a mitoNEET junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, en el que la composición terapéutica es un polipéptido de la presente invención, un agonista de un polipéptido de la presente invención o un antagonista de un polipéptido de la presente invención. Una realización adicional de la presente invención son marcadores y procedimientos para evaluar la eficacia de los tratamientos de enfermedades o afecciones disfuncionales metabólicas asociadas a mitoNEET basados en el seguimiento del nivel de un ácido nucleico o polipéptido de la presente invención en una muestra biológica. Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figuras 1A - 1 B. Un gel PAGE-SDS del 10-20% representativo (teñido con Coomassie, figura 1A) y autorradiograma (figura 1 B). El entrecruzamiento con 125I-PNU-1010174 se llevó a cabo en mitocondrias de hígado de rata en ausencia (-) o presencia (+) de (ácido [6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazol¡din-5-¡l)metil]fenoxi}etil)piridin-3-¡l]acético) (TZD) 25 µ? como se escribe en el Ejemplo 1. Las calles 1 y 2 son del sedimento mitocondrial enjuagado, calles 3 y 4 representan las mismas incubaciones solubilizadas con Tritón X1 14 al 1 %, y las calles 5 y 6 son el precipitado con sulfato de amonio (AS) del material soluble en Tritón X114 Figuras 2A - 2D. Los precipitados con sulfato amónico de mitoNEET solubles en Tritón X1 14 de 14 incubaciones separadas llevadas a cabo con o sin el competidor se resuspendieron en un volumen total de 200 µ? y se sometieron a HPLC como se describe en el Ejemplo 4. Se muestran los datos representativos de la condición sin competidor. La figura 2C muestra el perfil UV (214 nm). El perfil de 125l de un detector gamma en línea se muestra en la figura 2D. Las figuras 2A y 2B muestran el gel teñido con plata (figura 2A) y el correspondiente autorradiograma (figura 2B) de las fracciones destacadas. Se muestran los datos de una preparación mitocondrial de hígado de rata representativa. El mitoNEET entrecruzado con 125l visto en la fracción 31 no estaba presente en las preparaciones entrecruzadas en la presencia combinada de (ácido [6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5- ¡l)metiI]fenoxi}etil)piridin-3-il]acético) (no mostrado). Figuras 3A - 3B. Los precipitados con sulfato amónico de mitoNEET soluble en Tritón X1 14 de 80 incubaciones separadas llevadas a cabo con o sin competidor se resuspendieron en un tampón de muestra en condiciones reductoras de PAGE-SDS y se sometieron a electroforesis en geles de Tris-Glicina al 18% como se describe en el Ejemplo 4. Los autorradiogramas de un gel representativo (calles alternas sin y con competidor (ácido [6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-t¡azolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acét¡co) se muestran antes (figura 3A) y después (figura 3B) de cortar la banda de interés para la elución del gel. Figura 4. Los péptidos en negrita son péptidos trípticos identificados por MS/MS a partir de la proteína entrecruzada purificada digerida con tripsina. Estos péptidos se incluyen en la secuencia peptídica predicha que contiene estos péptidos que coincide con la búsqueda en la base de datos usando los péptidos identificados. Este polipéptido, que muestra interacción con tiazolidindionas y que radica en la mitocondria se refiere en el presente documento como "mito EET". Figuras 5A - 5C. Las figuras 5A - 5B muestran una escisión con CnBr representativa del mitoNEET entrecruzado. El material eluido a partir de 80 cortes de gel de incubaciones usando mitocondria de cerebro bovino se concentró sin tratamiento adicional o sometiéndolo a escisión con CnBr como se describe en el Ejemplo 6. Después el material concentrado se sometió de nuevo a electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS al 18% y se transfirió a membranas de PVDF. Las membranas se tiñeron con azul de Coomassie (figura 5A) y se expusieron a una película de rayos X (figura 5B). El mitoNEET intacto y el fragmento de CnBr de 6 kDa que contiene la sonda entrecruzada se muestran por las flechas. Los resultados de la secuenciación del N-terminal comparado con la secuencia de la proteína identificada por MS se muestran en la figura 5C. Figuras 6A - 6C. La figura 6B muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácido de mitoNEET bovino (SEC ID N°:4), humano (SEC ID N°:5) y murino (SEC ID N°:6). Las diferencias entre mitoNEET bovino frente a mitoNEET humano y mitoNEET murino frente a mitoNEET humano se indican en negrita. El motivo "NEET" está sombreado. La figura 6A muestra los tres péptidos (A, B y C) que se hicieron para la generación de anticuerpos contra mitoNEET murino como se describe en el Ejemplo 7. Las localizaciones de los péptidos A y C en la secuencia de aminoácidos de mitoNEET murino se indican con subrayado en la figura 6B. La localización del péptido B en la secuencia de aminoácidos de mitoNEET murino se indica con cursivas en la figura 6B. La figura 6C muestra la hélice transmembranal predicha (hélice TM) donde los restos 1-12 están en la cara exterior de la membrana, los restos 13-35 son la hélice TM (mostrada en negrita), y los restos 36-108 están dentro de la membrana. Un sitio predicho de entrecruzamiento está entre los restos M61 y T108. Los restos 105-108 (KKET) son un sitio de fosforilación predicho de la proteína quinasa dependiente de AMPc-GMPc (mostrado subrayado). Los restos 7- 0 (SAVR) y 77-79 (SKK) son un sitio de fosforilación predicho para la proteína quinasa C (mostrado en cursiva). Figuras 7A - 7D. Reacciones de entrecruzamiento con 125l-4-azido-N-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acetil}amino)etil]-2 hidroxibenzamida sin y con competencia con de ácido ([6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolid¡n-5-il)metil]fenoxi}etil)pir¡din-3-il]acetico 25 µ? (- o +, respectivamente) se Nevaron a cabo con fracciones mitocondriales brutas de cerebro, músculo esquelético, e hígado de rata como se describe en el Ejemplo 7. Las membranas se lavaron después, se solubílizaron con Tritón X 114 al 1 %, y se sometieron a electroforesis y transferencia de Western como se describe en el texto. Las trasferencias a PVDF se tiñeron tras la incubación con un suero preinmune (figura 7A) o con antisuero contra el péptido B (figura 7B, ambos a 1 :300). Las imágenes de película de estas dos trasferencias se muestran en las respectivas figuras 7C y 7D. Figuras 8A - 8H. Reacciones de entrecruzamiento con 25l-4-az¡do-N-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-d ¡oxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-iI]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzamida sin y con (ácido [6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolid¡n-5-il)metil]fenoxi}et¡l)piridin-3-il] acético) 25 µ? (TZD - o + , respectivamente) se llevaron a cabo usando fracciones de membrana de cerebro bovino a partir de gradientes de sacarosa discontinuos (B1- B4; densidad 1.1-1.4). Las muestras se sometieron a electroforesis en geles de Tris-glicina al 18% en condiciones reductoras y se tiñeron (figuras 8A - 8B) o se transfirieron a membranas de PVDF para transferencias de Western (figuras 8C - 8E). El análisis de Western se llevó a cabo usando una dilución 1 :30,000 de suero preinmunización del conejo N° 470 (figura 8C), una dilución 1 :30,000 del antisuero postinmunización con péptido B del conejo N° 470 (figura 8D), y anti-prohibitina de conejo (Research Diagnostics, Inc.), una proteína marcadora de la membrana mitocondrial (figura 8E). Los autorradiogramas correspondientes para cada transferencia se localizan debajo de cada una de las figuras 8F - 8H de Western respectivas. Figura 9. Mito NEET sintetizado con una biotina en la extensión N-terminal se unió a perlas de estreptavidina (1 hora). Esto se siguió de un exceso de biotina, y finalmente de membranas solubilizadas de cerebro de rata, músculo esquelético de rata y mitocondria de hígado de rata. Las perlas se lavaron y después las proteínas unidas se eluyeron por reducción del pH (glicina 0.1 M, pH =2.3). Las proteínas eluidas se separaron en un gel PAGE-SDS y se tiñeron con plata para revelar las proteínas eluidas. Un subgrupo de proteínas mitocond ríales se unió selectivamente y después se eluyó de las perlas que contenían mitoNEET (siempre en otra calle). Figura 10. La oxidación del palmitoil-CoA se midió solubilizando mitocondrias con y sin la adición de mitoNEET sintético. Las reacciones se llevaron a cabo en presencia de CoASH, NAD, FAD y palmitoil-CoA 1 mM. El palmitoil-CoA restante a diversos puntos de tiempo tras la incubación se muestra en ausencia (círculos rellenos) y presencia (cuadrados rellenos) de un exceso de péptido mitoNEET sintético 11 A. No se observó pérdida de sustrato en ausencia de membranas mitocond ríales (triángulos vacíos). El sustrato y los productos de CoA generados se midieron por HPLC. Figura 11A - 1 1 D. Inducción de mitoNEET en adipocitos diferenciados. Los sedimentos de membrana se prepararon a partir de preadipocitos 3T3L1 (fibroblastos) y de adipocitos completamente diferenciados y se usaron en reacciones de entrecruzamiento y trasferencias de Western como en las Figuras 8A - 8H. El contenido de proteína mitoNEET (figura 11 C) y el entrecruzamiento (figuras 1 1 B y 11 D) incrementaba en adipocitos diferenciados.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Una realización de la presente invención es una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido mitoNEET de la presente invención. Preferiblemente el ácido nucleico se selecciona entre el grupo compuesto por: una secuencia de ácido nucleico capaz de hibridar en condiciones severas, o que podría ser capaz de hibridarse en estas condiciones excepto por la degeneración del código genético, con la secuencia de ADN de SEC ID N°: 1 , SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3, restos 67-384 de SEC ID N°: 1 , restos 112-435 de SEC ID N°: 2, o restos 133-456 de SEC ID N°: 3; una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente un 70% de homología con la secuencia de ADN de SEC ID N°: 1 , SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3, restos 67-384 de SEC ID N°: 1 , restos 112-435 de SEC ID N°: 2, o restos 133-456 de SEC ID N°: 3; una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de SEC ID N°: 1 , SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3, restos 67-384 de SEC ID N°: 1 , restos 1 2-435 de SEC ID N°: 2, o restos 133-456 de SEC ID N°: 3; y una secuencia complementaria de SEC ID N°: 1 , SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3, restos 67-384 de SEC ID N°:1 , restos 112-435 de SEC ID N°: 2, o restos 133-456 de SEC ID N°: 3. Otra realización de la presente invención es un polipéptido mitoNEET aislado. La secuencia de aminoácidos puede seleccionarse entre el grupo compuesto por: una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 81% de homología con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 4, SEC ID N°: 5, o SEC ID N°: 6; una variante de sustitución, eliminación o inserción de la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 4, SEC ID N°: 5, o SEC ID N°:6; y una variante alélica de SEC ID N°: 4, SEC ID N°: 5, o SEC ID N°: 6.

Variantes de Secuencia El ADN que codifica variantes de secuencia de aminoácidos de mitoNEET pueden prepararse por varios procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no de forma limitante, aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que aparecen naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o sitio-dirigida), mutagénesis por PCR, y mutagénesis por cásete de una variante preparada previamente o una versión no variante de mitoNEET. Estas técnicas pueden utilizar el ácido nucleico de mitoNEET (ADN o ARN), o ácido nucleico complementario del ácido nucleico de mitoNEET. La mutagénesis mediada por oligonucleótido es un procedimiento preferido para preparar variantes de sustitución, eliminación, e inserción del ADN de mitoNEET. Esta técnica es bien conocida en la técnica, por ejemplo como describen Adelman y col, DNA, 2: 183 (1983). Brevemente, el ADN de mitoNEET se altera hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con un molde de ADN, donde el molde es la forma de cadena sencilla de un plásmido o bacteriófago, que contiene la secuencia de ADN no alterada o nativa de mitoNEET. Tras la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda cadena complementaria completa del molde que se incorporará de esta manera el cebador oligonucleótido, y que codificará la alteración seleccionada en el ADN de mitoNEET. Generalmente, se usan oligonucleótidos de al menos 25 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido óptimo tendrá de 12 a 15 nucleótidos que serán completamente complementarios con el molde en cualquier lados del nucleótido o los nucleótidos que codifican para la mutación. Esto asegura que el oligonucleótido hibridará de forma adecuada con la molécula molde de ADN de cadena sencilla. Los oligonucleótidos se sintetizan fácilmente usando técnicas conocidas en la técnica tales como las descritas por Crea y col. {Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 75: 5765, 1978). También pueden generarse moldes de ADN de cadena sencilla por desnaturalización de ADN de plásmido (u otro) de doble cadena usando técnicas estándar.

Para la alteración de la secuencia nativa de ADN (para generar variantes en la secuencia de aminoácidos, por ejemplo), el oligonucleótido se híbrida con el molde de cadena sencilla en condiciones de hibridación adecuadas. Después se añade una enzima polimerizante de ADN, normalmente el fragmento Klenow de ADN polimerasa I para sintetizar la cadena complementaria al molde usando el oligonucleótido como cebador de la síntesis. De esta manera se forma una molécula heterodúplex de modo que una cadena de ADN codifica la forma mutada de mitoNEET, y la otra cadena (el molde original) codifica la secuencia nativa no alterada de mitoNEET. Esta molécula heterodúplex es trasformada después en una célula huésped adecuada, normalmente una procariota tal como E. coli JM101. Las células se disponen en placas de agarosa, y se analizan usando el oligonucleótido cebador marcado con 32-fosfato para identificar las colonias de bacterias que contienen el ADN mutado. La región mutada se recupera después y se sitúa en un vector apropiado para la producción de proteína, generalmente un vector de expresión del tipo típicamente empleado para transformación de un huésped adecuado. El procedimiento descrito anteriormente arriba puede modificarse de modo que se cree una molécula homodúplex en la que ambas cadenas del plásmido contengan la mutación o mutaciones. Las modificaciones son las siguientes: El oligonucleótido de cadena sencilla se híbrida con el molde de cadena sencilla como se describe anteriormente. Se combina una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP), y desoxirribotimidina (dTTP) con una tio-desoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(a35S) (que puede obtenerse de Amersham Corporation). Esta mezcla se añade al complejo molde-oligonucleótido. Tras la adición de la ADN polimerasa a esta mezcla, se genera una cadena de ADN idéntica al molde excepto por las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de ADN contendrá dCTP-(a35S) en lugar de dCTP, que sirve para proteger ésta de la digestión con endonucleasas de restricción. Después de que la cadena molde del heterodúplex de doble cadena se corta con una enzima de restricción adecuada, la cadena molde puede digerirse con nucleasa Exo III u otra nucleasa apropiada pasada la región que contiene el sitio o sitios a mutagenizar. Después se para la reacción para dejar una molécula que sea sólo parcialmente de cadena única. Después se forma un ADN de doble cadena completa homodúplex usando la ADN polimerasa en presencia de los 4 desoxirribonucleótidos trifosfatos, ATP, y ADN ligasa. Esta molécula homodúplex puede después transformarse en una célula huésped adecuada tal como E. coli. JM101 , como se describe anteriormente. El ADN que codifica mutantes de mitoNEET con más de un aminoácido para sustituir puede generarse de varias maneras. Si los aminoácidos están situados próximos dentro de la cadena polipeptídica, pueden mutar de forma simultánea usando un oligonucleótido que codifica para todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos están situados a cierta distancia uno del otro (separados por más de aproximadamente diez aminoácidos), es más difícil generar un único oligonucieótido que codifique todos los cambios deseados. En su lugar, puede usarse uno de dos procedimientos alternativos siguientes. En el primer procedimiento, se genera un oligonucieótido diferente para cada aminoácido que se va a sustituir. Los oligonucleótidos se hibridan después con el molde de ADN de cadena única simultáneamente, y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a partir del molde codificará para todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. El procedimiento alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el muíante deseado. La primera ronda es como se describe para los mutantes sencillos: se usa ADN de tipo silvestre para el molde, un oligonucieótido que codifica la primera sustitución o sustituciones de aminoácidos deseada se híbrida con este molde, y entonces se genera la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el producto ADN mutado de la primera ronda de mutagénesis como molde. De esta manera, este molde ya contiene una o más mutaciones. Después el oligonucieótido que codifica la sustitución o sustituciones de aminoácidos adicionales deseadas se híbrida con este molde, y la cadena de ADN resultante codifica ahora para las mutaciones de la primera y de la segunda ronda de mutagénesis. Este ADN resultante puede usarse como molde para una tercera ronda de mutagénesis, y etc. La mutagénesis por PCR también es adecuada para hacer variantes de aminoácidos de mitoNEET. Aunque el siguiente análisis se refiere al ADN, se entiende que la técnica también puede encontrar aplicación con ARN. La técnica de PCR generalmente se refiere al siguiente procedimiento (véase Elrich, supra, el capítulo de R. Higuchi, pág. 61-70): Cuando se usan pequeñas cantidades de ADN molde como material inicial en una PCR, se pueden usar cebadores que difieren ligeramente en secuencia con respecto a la correspondiente región del ADN molde para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento específico de ADN que difiere de la secuencia del molde sólo en las posiciones en las que los cebadores difieren del molde. Para introducir una mutación en un plásmido de ADN, se diseña uno de los cebadores de forma que solape con la posición de la mutación y que contenga la mutación; la secuencia del otro cebador ha de ser idéntica a un fragmento de secuencia de la cadena opuesta del plásmido, pero esta secuencia puede localizarse en cualquier posición a lo largo del ADN del plásmido. Sin embargo, se prefiere que la secuencia del segundo cebador esté localizada dentro de los 200 nucleótidos a partir del primero, de modo que al final la región completa amplificada de ADN unido por los cebadores pueda secuenciarse fácilmente. La amplificación por PCR que usa una pareja de cebadores como los que se acaban de describir tiene como resultado una población de fragmentos de ADN que difieren en la posición de la mutación especificada por cebador, y posiblemente en otras posiciones, ya que la copia el molde es en cierta medida propensa a errores. Si la proporción entre molde y material de producto es extremadamente baja, la inmensa mayoría de los fragmentos de ADN producidos incorpora la mutación o mutaciones deseadas. Este material producto se usa para reemplazar la región correspondiente en el plásmido que sirve como molde para PCR usando tecnología de ADN estándar. Pueden introducirse simultáneamente mutaciones en posiciones separadas usando un segundo cebador muíante, o llevando a cabo una segunda PCR con diferentes cebadores mulantes y ligando los dos fragmentos de PCR resultantes simultáneamente con el fragmento vector en una ligación de tres (o más) partes. Otro procedimiento para preparar variantes mutagénicos casetes se basa en la técnica descrita por Wells y col. (Gene, 34: 315 > 1985). El material de partida es el plásmido (u otro vector) que comprende el ADN de mitoNEET que se va a mutar. Se Identifican el codón o codones en el ADN de mitoNEET que se van a mutar. Debe haber un sitio único para endonucleasa de restricción a cada lado del sitio o sitios de mutación identificada. Si no existen estos sitios de restricción, pueden generarse usando el procedimiento de mutagénesis mediada por oligonucleótido descrito anteriormente para introducirlos en las localizaciones apropiadas del ADN de mitoNEET. Después de haber introducido los sitios de restricción en el plásmido, el plásmido se corta en estos sitios para linearizarlo. Se sintetiza, usando procedimientos estándar, un oligonucleótido de doble cadena que codifica la secuencia del ADN entre los sitios de restricción pero que contiene la mutación o mutaciones deseadas. Las dos cadenas se sintetizan separadamente y después se hibridan juntas usando técnicas estándar. Este oligonucleótido de doble cadena se denomina el cásete. Este cásete se diseña de manera que tenga los extremos 3' y 5' compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de modo que puede ligarse directamente con el plásmido. Este plásmido contiene ahora la secuencia de ADN mutada de mitoNEET.

Modificación covalente de proteínas Las modificaciones covalentes de una proteína o anticuerpos de la presente invención se incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de modificación covalente ¡ncluye la reacción de restos de aminoácidos diana de un polipéptido con una agente orgánico derivatizante que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los restos N- o C-terminal de una proteína de la presente invención. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar una proteína a una matriz o superficie soporte insoluble en agua para usar en el procedimiento de purificación de anticuerpos, y viceversa. Los agentes de entrecruzamiento normalmente usados incluyen por ejemplo 1 ,1-bis(diazoacetil)-2-feniIetano glutaraldehido, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidil tales como 3,3'-ditiobis(succinimidiIpropionato), maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1 ,8-octano y agentes tales como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato. Otras modificaciones incluyen desamidación de restos de glutaminilo y asparaginilo de los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de restos serilo o treonilo, metilación de los grupos -amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (véase T.E. Creighton, Proteins: Structure y Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Otro tipo de modificación covalente del polipéptido incluido dentro del alcance de esta invención comprende la alteración del patrón de glicosilación nativo del polipéptido. Se pretende para los fines del presente documento que "alteración del patrón de glicosilación nativo" signifique eliminar uno o más restos de carbohidrato encontrados en la secuencia nativa (eliminando los sitios de glicosilación subyacentes o quitando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en la secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas nativas, implicando o un cambio en la naturaleza y proporciones de los diversos restos de carbohidrato presentes. La adición de sitios de glicosilación al polipéptido puede llevarse a cabo alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración puede hacerse, por ejemplo, por la adición, o sustitución, de uno o más restos de serina o treonina en la secuencia nativa (para sitios de glicosilación unida por O). La secuencia de aminoácidos opcionalmente puede alterarse a través de cambios a nivel del ADN, particularmente por mutación de las bases preseleccionadas del ADN que codifica el polipéptido de manera que los codones generados se traducirán en los aminoácidos deseados. Otro medio de aumentar el número de restos de carbohidrato en el polipéptido es por acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al polipéptido. Estos procedimientos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 1 1 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs 259-306 (1981 ). La eliminación de los restos de carbohidrato presentes en el polipéptido puede conseguirse química o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifican los restos de aminoácidos que sirven como diana para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en la técnica y descritas, por ejemplo, por Hakimuddin, y col., Arch. Biochem. Biophys, 259:52 (1987) y por Edge y col., Anal. Biochem., 18:131 (1981 ). La escisión enzimática de restos de carbohidrato en polipéptidos puede obtenerse usando varias endo y exoglicosidasas como describen Thotakura y col., Meth. Enzymol., 138:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente de una proteína o anticuerpo de la presente invención comprenden la unión del polipéptido o anticuerpo a uno de los varios polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera mostrada en las Patentes de Estados Unidos N° 4,640,835; 4,496,689; 4,301 ,144; 4,670,417; 4,791 ,192 ó 4,179,337 (para revisiones véase Roberts M.J. y col., Adv. Drug Del. Rev. 54:459-476, 2002), Harris J.M. y col., Drug Delivery Systems 40:538-551 , 2001 ).

Los grupos funcionales capaces de reaccionar con los grupos o amino o con grupos e-amino del extremo amino terminal de lisinas encontrados en mitoNEET, un modulador, o anticuerpo incluyen: carbonatos tales como el p-nitrofenilo, o succinimidilo; carbonil imidazol; aziactonas; tionas de ¡mida cíclicas, isocianatos o isotiocianatos; cloruro de tresilo (documento EP 714 402, documento EP 439 508); y aldehidos. Grupos funcionales capaces de reaccionar con grupos de ácido carboxílico, grupos de carbonilo reactivos y restos de hidrocarburo oxidados en mitoNEET, un modulador, o anticuerpo incluyen: aminas primarias; e hidrazina y grupos funcionales hidrazina tales como las acilhidrazinas, carbazatos, semicarbamatos, tiocarbazatos, etc. Los grupos mercapto, si están disponibles en el mitoNEET, un modulador o anticuerpo, también pueden usarse como sitios de fijación para polímeros activados adecuados con grupos reactivos tales como tioles; maleimidas, sulfonas y fenilglioxales, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5,093,531 , la descripción de la cual se incorpora en el presente documento como referencia. Otros nucleófilos capaces de reaccionar con un centro electrófilo incluyen, pero no de forma limitante, por ejemplo, hidroxilo, amino, carboxilo, tiol, metileno activo y similares. En una realización preferida de la invención se forman enlaces amina secundaria o amida usando los grupos amino o grupos e-amino N-terminales de las lisinas del mitoNEET, un modulador o anticuerpo y el PEG activado. En otro aspecto preferido de la invención, se forma un enlace amina secundaria entre el grupo amino primario del extremo N-terminal de mitoNEET, un modulador o anticuerpo y un aldehido de PEG de cadena sencilla o ramificada por reducción con un agente reductor adecuado tal como NaCNBH3, NaBH3, Piridina Borano etc. como se describe en Chamow y col., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) y la Patente de Estados Unidos N° 5,824,784. En otra realización preferida de la invención se usan polímeros activados con engarces que forman amida tales como ésteres de succinimidilo, tionas de ¡mida cíclicas, o similares para efectuar el enlace entre el mitoNEET, un modulador o anticuerpo y el polímero, véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos N° 5,349,001 ; la Patente de Estados Unidos N° 5,405,877 y Greenwald, y col., Crit. Rev. Ther. Drug Carríer Syst. 17:101-161 , 2000, que se incorporan en el presente documento como referencia. Un poli(etilenglicol) activado preferido, que puede unirse a los grupos amino libres de mitoNEET, un modulador, o anticuerpo incluyendo una cadena N-hidroxisuccinilimida poli(etilenglicol) sencilla o ramificada, puede prepararse activando ésteres de ácido succínico del poli(etilenglicol) con N-hidroxisuccinilimida. Otras realizaciones preferidas de la invención incluyen el uso de otros polímeros activados para formar enlaces covalentes del polímero con el mitoNEET, un modulador, o antígeno por medio de grupos e-amino u otros. Por ejemplo, pueden usarse formas de isocianato o isotiocianato de polímeros activados terminalmente para formar enlaces a base de urea o tiourea con los grupos amino de lisina. En otro aspecto preferido de la invención, se forman enlaces carbamato (uretano) con grupos amino de la proteína como se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 5,122,614, 5,324,844, y 5,612,640, que se incorporan en el presente documento como referencia. Los ejemplos incluyen polímeros de carbonato de N-succimidilo, carbonato de para-nitrofenilo, y carbonil imidazol activados. En otra realización preferida de esta invención, un carbonato de benzotriazol derivado de PEG se une a grupos amino de mitoNEET, un modulador, o anticuerpo. inserción del ADN en un Vehículo de Clonación El ADNc o ADN genómico que codifica mitoNEET nativo o una variante se inserta en un vector de replicación para clonación posterior (amplificación del ADN) o para expresión. Se dispone de numerosos vectores, y la selección del vector apropiado puede depender de 1 ) si se usan para amplificación de ADN o para expresión de ADN, 2) el tamaño del ADN que se va a insertar dentro del vector, y 3) la célula huésped que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y de la célula huésped con la que es compatible. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no de forma limitante, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la trascripción.

Origen del Componente de Replicación Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Generalmente, en los vectores de clonación esta secuencia es de las que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosomal del huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias replicantes de forma autónoma. Estas secuencias son bien conocidas para varias bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen plasmídico de 2 µ es apropiado para levaduras, y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamíferos (típicamente puede usarse el origen de SV40 sólo porque contiene el promotor temprano). La mayor parte de los vectores de expresión son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicación en al menos un tipo de organismos pero pueden transfectarse en otro organismo para su expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli y después el mismo vector se transfecta en células de levadura o mamífero para expresión incluso si no es capaz de replicar independientemente en el cromosoma de la célula huésped. El ADN también puede amplificarse por inserción en el genoma del huésped. Esto puede conseguirse fácilmente usando especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de ADN que es complementaria con una secuencia encontrada en el ADN genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector tiene como resultado una recombinación homologa con el genoma y la inserción del ADN de mitoNEET. Sin embargo, la recuperación del ADN genómico que codifica mitoNEET es más complicada que la de un vector de replicación exógeno ya que se requiere digestión con enzimas de restricción para escindir el ADN de mitoNEET.

Componente Génico de Selección Los vectores de expresión y clonación deben contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células del huésped transformadas crecidas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionar nutrientes críticos no disponibles en los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Estas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia al fármaco y de esta manera sobreviven al régimen de selección. Los ejemplos de esta selección dominante usan los fármacos neomicina (Southerm y col., J. Molec. Appl. Genet, 1 :327 >1982), ácido micofenólico (Mulligan y col., Science, 209: 1422> 1980) o higromicina (Sugden y col., Mol. Cell. Biol., 5:4 0-4 3> 1985). Los tres ejemplos dados anteriormente emplean genes bacterianos bajo control eucariótico para conferir resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente. Otro ejemplo de marcadores seleccionares adecuados para células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes que incorporan el ácido nucleico de mitoNEET, tales como dihidrofolato reductasa (DHFR) o timidina quinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión selectiva, de modo que sólo los transformantes están excepcionalmente adaptados para sobrevivir en virtud de haber incorporado el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia de forma sucesiva, conduciendo así a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifica mitoNEET. La amplificación es el procedimiento por el cual genes de mayor demanda en cuanto a producción de una proteína crítica para el crecimiento se repiten en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Se sintetizan cantidades aumentadas de mitoNEET a partir de ADN amplificado. Por ejemplo, células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) deficiente en la actividad DHFR, preparada y propagada como describen Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216>1980. Las células transformadas se exponen después a niveles crecientes de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR, y de forma concomitante, a múltiples copias de otro ADN que comprende los vectores de expresión, tales como el ADN que codifica el receptor PF4A. Esta técnica de amplificación puede usarse con cualquier otro huésped apropiado, por ejemplo, CHO-K1 ATCC N° CCL61 , a pesar de la presencia de DHFR endógeno si, por ejemplo se emplea un gen DHFR muíante que es altamente resistente a Mtx (documento EP 117,060). Alternativamente, pueden seleccionarse células huésped (especialmente huéspedes de tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican el receptor PF4A, la proteína DHFR de tipo silvestre, y otro marcador seleccionare tal como la aminoglicósido 3' fosfotransferasa (APH) por crecimiento celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionare tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Véase la Patente de Estados Unidos N° 4,965,199. Un gen de selección apropiado para su uso en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282: 39> 1979; Kingsman y col., Gene, 7:141 >1979; o Tschemper y col., Gene, 10:157 >1980). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa muíante de levadura carente de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, el número de ATCC 44076 ó PEP4-1 (Jones, Genetlcs, 85:12> 1977). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un ambiente efectivo para detectar transformaciones por crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, cepas de levaduras deficientes en Leu-2 (números de ATCC 20,622 ó 38,626) se complementan con plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

Componente Promotor Los vectores de expresión y clonación normalmente contienen un promotor que es reconocido por el organismo huésped y que está unido de forma operativa al ácido nucleico mitoNEET. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas secuencia arriba (5') del codón de iniciación de un gen estructural (generalmente entre aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y traducción de una secuencia de ácidos nucleicos en particular, tal como mitoNEET, al que está unido de forma operativa. Estos promotores típicamente se clasifican en dos clases, ¡nducibles y constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician el aumento de los niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algunos cambios en las condiciones de cultivo, por ejemplo la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. En este momento son bien conocidos un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Estos promotores están unidos de forma operativa al ADN que codifica mitoNEET retirando el promotor de la fuente de ADN por digestión con una enzima de restricción e insertando la secuencia del promotor aislado en el vector. Puede usarse tanto la secuencia nativa del promotor de mitoNEET como muchos promotores heterólogos para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN de mitoNEET. Sin embargo, se prefieren promotores heterólogos, ya que permiten generalmente una transcripción mayor y rendimientos más altos del mitoNEET expresado en comparación con el promotor nativo de mitoNEET. Promotores adecuados para uso con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de la ß-lactamasa y de la lactosa (Chang y col. Nature, 275: 615>1978; y Goeddel y col, Nature, 281: 544> 1979), alcalino fosfatasa, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acid Res., 8: 4057> 1980 y el documento EP 36,776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer y col., Proc. Nati. Acad. Sel. USA, 20:21 -25>1983). Sin embargo, son adecuados de otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo a un especialista unir operativamente éstos con el ADN que codifica mitoNEET (Siebenlist y col., Cell, 20: 269>1980) usando engarces o adaptadores para proporcionar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores de uso en sistemas bacterianos generalmente también contendrán una secuencia Shine Dalgarno (S.D.) operativamente unida al ADN que codifica mitoNEET. Secuencias promotoras adecuadas para usar con huéspedes de levaduras incluyen los promotores de la 3-fosfogliceratoquinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem, 255: 2073> 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149> 1968; y Holland, Biochemistry, 17: 4900> 1978), tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles teniendo la ventaja adicional de una transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotioneinas, gliceraIdehldo-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Promotores y vectores apropiados para usar en expresión en levaduras se describen adicionalmente en Hitzeman y col., documento EP 73.657A. También se usan de forma ventajosa potenciadores de levaduras con promotores de levaduras. Se conocen secuencias promotoras para eucariotas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases secuencia arriba a partir del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases secuencia arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CXCAAT donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal de adición de la cola poli A del extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias están insertadas adecuadamente en vectores de expresión de mamíferos. La transcripción de mitoNEET a partir de vectores en células huésped mamíferas está controlada por promotores obtenidos del genoma del virus tales como el virus del polioma, virus de la viruela de las aves de corral (documento UK 2,211 ,504 publicado el 5 de julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma de aves, citomegaiovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferiblemente el Virus del Simio 40 (SV40), a partir de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo el promotor de la actina o un promotor de inmunoglobulina, a partir de promotores de choque térmico, y a partir del promotor normalmente asociado con la secuencia mitoNEET, de células huésped. Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción SV40 que también contiene el origen de replicación viral de SV40. Fiers y col, Nature, 273: 113 (1978); Mulligan y Berg, Science, 209: 1422-1427 (1980); Pavlakis y col, Proc.

Nati. Acad. Sc¡. USA, 78:7398-7402 (1981 ). El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción E de Hindlll. Greenaway y col., Gene, 18: 355-360 (1982). Un sistema para expresar ADN en huéspedes mamíferos usando el virus del papiloma bovino como vector se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4,419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4,601 ,978. Véase también Gray y col., Nature, 295: 503-508 (1982) sobre la expresión de ADNc que codifica ¡nterferón inmune en células de mono; Reyes y col., Nature, 297: 598-601 (1982) sobre la expresión de ADNc de ¡nterferón ß-humano en células de ratón bajo el control de un promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simplex, Canaani y Berg, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del ¡nterferón ß1 humano en células cultivadas de ratón y de conejo, y Gorman y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células de riñon de mono CV-1 , fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster Chino, células HeLa, y células de ratón NIH-3T3 usando como promotor la secuencia de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous.

Componente del Elemento Potenciador La transcripción de un ADN que codifica mitoNEET de esta invención por eucariotas superiores a menudo se aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de aproximadamente de 10-300 pb que actúan aumentando la transcripción de un promotor. Se han encontrado potenciadores relativamente independientes de orientación y posición 5' (Laimins y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78: 993 >1981 ) y 3'(Lusky y col., Mol. Cell Bio., 3: 1108> 1983) de la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji y col., Cell, 33: 739 >1983) así como dentro de la secuencia codificante misma (Osborne y col., Mol. Cell Bio., 4: 1293 >1984). Se conocen muchas secuencias potenciadoras en los genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucarióticas. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 del lado del origen de replicación tardío (100-270 pb), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado del origen de replicación tardío, y potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297: 17-18 (1982) sobre elementos potenciadores de la activación de promotores eucarióticos. El potenciador puede ayustarse en el vector en posición 5' ó 3' al ADN de mitoNEET, pero preferiblemente está localizado en el sitio 5' a partir del promotor.

Componente de Terminación de Transcripción Vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas (células de levadura, hongo, insecto, planta, animal, humanas, o nucleadas a partir de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias normalmente están disponibles a partir de regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente, 3' de ADN o ADNc eucariótico o viral. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARN mensajero que codifica mitoNEET. Las regiones no traducidas 3' también incluyen sitios de terminación de la transcripción. En la construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de los componentes mencionados anteriormente, las secuencias de codificación y control deseadas, se emplean técnicas de ligación estándar. Plásmidos aislados o fragmentos de ADN se escinden, adaptan y religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Para el análisis que confirme las secuencias correctas en los plásmidos construidos, se usan mezclas de ligación para transformar E. coli K12 cepa 294 (ATCC 31 ,446) y transfectantes satisfactorios seleccionados por resistencia a ampicilina o tetraciclina cuando sea apropiado. Los plásmidos se preparan a partir de los transformantes, se analizan por digestión con endonucleasas de restricción, y/o se secuencian por el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) o por el procedimiento de Maxam y col., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980). Particularmente útiles en la práctica de esta invención son los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero del ADN que codifica mitoNEET. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse de forma eficaz en una célula huésped, de modo que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas de expresión transitoria, comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la conveniente identificación positiva de los polipéptidos codificados por los ADN clonados, así como la rápida selección de estos polipéptidos para propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De esta manera, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención para fines de identificación de análogos y variantes de mitoNEET que tiene actividad similar a mitoNEET. Otros procedimientos, vectores, y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de mitoNEET en cultivos celulares recombinantes de vertebrados se han descrito en Gething y col., Nature, 293: 620-625 >1981 ; Mantei y col., Nature, 281 : 40-46> 1979; Levinson y col., documento EP 117,060; y documento EP 117,058. Un plásmido particularmente útil para la expresión en cultivos de células de mamíferos del receptor PF4A es pRK5 (documento EP publicación N° 307,247) o pSV16B (documento de Estados Unidos N° de Serie 07/441 ,574 presentado el 22 de noviembre de 1989 cuya descripción se incorpora en el presente documento como referencia).

Selección y Transformación de Células Huésped Las células huésped adecuadas para clonar o expresar los vectores del presente documento son las células procarióticas, de levadura, o eucarióticas superiores descritas anteriormente. Las células procarióticas adecuadas incluyen eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo E. coli, Bacilll tal como B. subtilis, especies de Pseudomonas tales como P. aerupinosa, Salmonella typhimurium, o Serratia marcescens. Un huésped E. coli preferido para clonación es E. coli 294 (ATCC 31 ,446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli chi-1776 (ATCC 31 ,537) y E. co// W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Preferiblemente la célula huésped debe secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in vitro, por ejemplo PCR u otras reacciones de la polimerasa de ácidos nucleicos. Además de los procariotas, microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes adecuados para los vectores que contienen el ADN de mitoNEET. Saccharomyces cerevisae, o la levadura común de panadería, es la más comúnmente utilizada entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, otros varios géneros, especies y cepas normalmente están disponibles y son útiles en este documento, tales como S. pombe > Beach y Nurse, Nature, 290: 140 (1981 ), Kluyveromyces lactis> Louvencourt y col., J. Bacteriol., 737 (1983), ya/roiv/a>documento EP 402,226. Pichia pasíor/s>documento EP 183,070, Trichoderma reesia> documento EP 244,234, Neurospora crassa> Case y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979), y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans >Ballance y col., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1 12: 284-289 (1983); Tilburn y col, Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton y col, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 : 1470-1474 (1984) y A. n¡ger> Kelly y Hynes, EMBO J., 4: 475-479 (1985). Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptido mitoNEET glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Estas células huéspedes son capaces de actividades de procesamiento y de glicosilación complejas. En principio, cualquier cultivo de célula eucariótica superior es factible, tanto de cultivos de vertebrados como de invertebrados. Ejemplo de células de invertebrados incluye células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y sus variantes y células huésped de insectos permisivos correspondientes de huéspedes tales como células huésped de Spodoptera fruglperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx morí. Véase, por ejemplo Luckow y col., Bio Technology, 6: 47-55 (1998); Miller y col., in Genetic Engineering, Setlow, J. K. y col., eds., Vol 8 (Plenum Publishing, 1986) pág. 277-279; y Maeda y col., Nature, 315: 592-594 (1985). Varias de estas cepas virales están a disposición pública, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y estos virus pueden usarse como el virus de este documento de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células de Spodoptera frugiperda. Puede usarse como huéspedes cultivos de células de planta de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco. Típicamente, las células de plantas se transfectan por incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que previamente ha sido manipulada para que contenga el ADN de mitoNEET. Durante la incubación del cultivo de células de la planta con A. tumefaciens, el ADN que codifica mitoNEET se transfiere a la célula huésped de la planta de modo que éste es transfectado, y en condiciones apropiadas, expresa el ADN de mitoNEET. Además, se dispone de secuencias reguladoras y de secuencias de señal compatibles con las células de la planta, tales como las secuencias de señalización de poliadenilación y del promotor de la nopalina sintasa. Depicker y col., J. Mol. Appl. Gene, 1 : 561 (1982). Además, segmentos de ADN aislados de la región cadena arriba del gen 780 de ADN-T son capaces de activar o aumentar los niveles de trascripción de los genes expresables en plantas en tejidos vegetales que contienen el ADN recombinante. Véase el documento EP 321 ,196 publicado el 21 de junio de 989. Sin embargo, el interés ha sido superior en las células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivos tisulares) se ha convertido en un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)).

Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea de riñon de mono CV1 transformada con SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651 ); línea de riñon embriónico humano 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, (Graham y col., J. Gen Virol., 36: 59(1977)); células de riñon de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster Chino/- DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proa Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4216 > 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 >1980); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70), células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL- 1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon de perro (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de ratas Buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ); células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68>1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de células de hepatoma humano (Hep G2). Las células huéspedes preferidas son las células de riñon embriónico humano 293 y las de ovario de hámster Chino. Las células huéspedes se transfectan y se transforman preferiblemente con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente de esta invención y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados de forma apropiada para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

Transfección se refiere a la aceptación de un vector de expresión por parte de una célula huésped, se exprese o no de hecho cualquier secuencia codificante. Los especialistas en la técnica conocen numerosos procedimientos de transfección, por ejemplo, CaP04 y electroporación. Una transfección satisfactoria generalmente se reconoce cuando en el interior de la célula huésped tiene lugar alguna indicación de la operatividad de este vector. Transformación significa introducir ADN en un organismo de forma que el ADN sea replicable, bien como un elemento extracromosomal o por integración cromosomal. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se hace usando técnicas estándar apropiadas para estas células. El tratamiento con calcio empleando cloruro calcico, como se describe en la sección 1.82 de Sambrook y col., supra, generalmente se usa para células procarióticas u otras células que contienen barreras de pared celular sustanciales. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células de plantas, como describe Shaw y col., Gene 23: 3 5, (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio de 1989. Para células de mamíferos sin estas paredes celulares, se prefiere el procedimiento de precipitación con fosfato cálcico descrito en las secciones 6.30-16.37 de Sambrook y col, supra. Axel en la Patente de Estados Unidos N° 4,399,216 expedida el 16 de agosto de 1983 describió los aspectos generales de las transformaciones de un sistema huésped de células de mamífero. Las transformaciones dentro de levaduras típicamente se llevan a cabo de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen y col., J. Bact., 130; 946 (1977) e Hsiao y col., Proc. Nati. Acad. Sci (USA), 76: 3829 (1979). Sin embargo, también pueden usarse otros procedimientos para introducir ADN dentro de las células tales como inyección nuclear, electroporación o fusión de protoplastos.

Cultivo de las Células Huésped Las células procarióticas usadas para producir polipéptido mitoNEET de esta invención se cultivan en medios apropiados como se describe generalmente en Sambrook y col. Las células huésped de mamíferos usadas para producir mitoNEET de esta invención pueden cultivarse en varios medios. Medios disponibles en el mercado tales como medio de Ham F10 (Sigma), Medio Esencial Mínimo (>MEM, Sigma). RPMI- 640 (Sigma) y Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (>DMEM, Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, Meth. Enz., 58: 44 (1979), Barnes y Sato, Anal. Blochem., 102: 255 (1980), las Patentes de Estados Unidos N° 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; y 4,560,655; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; la Patente de Estados Unidos N° de registro 30,985, la Patente de Estados Unidos N° 5,122,469, las descripciones de todas la cuales se incorporan en este documento como referencia, pueden usarse como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro sódico, cálcico, magnésico, y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como Gentamicina™), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa o una fuente equivalente de energía. También puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a la concentración apropiada que será conocida por los especialistas en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas usadas previamente con las células huésped seleccionadas para la expresión, que serán evidentes para los especialistas en la técnica. Las células huésped preferidas en esta descripción abarcan cultivos de células ¡n vitro así como células que están dentro de un animal huésped. Se prevé adicionalmente que el mitoNEET de esta invención pueda producirse por recombinación homologa, o con procedimientos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contienen el ADN que codifica mitoNEET. Por ejemplo, un potente elemento promotor/potenciador, un supresor, o un elemento modulador de la trascripción exógena se incorporan en el genoma de la célula huésped deseada en proximidad y orientación suficiente para influir en la transcripción del ADN que codifica el deseado mitoNEET. El elemento control no codifica el mitoNEET de esta invención, pero el ADN está presente en el genoma de la célula huésped. Es deseable un análisis posterior para las células que producen el mitoNEET de esta invención, o niveles aumentados o disminuidos de expresión.

Composiciones Terapéuticas y Administración de mitoNEET Las formulaciones terapéuticas de mitoNEET se preparan para almacenamiento mezclando mitoNEET que tiene el grado de pureza deseado con vehículos excipientes o estabilizantes fisiológicamente aceptables, opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra), en forma de torta liofilizada o en soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones que forman sales tales como de sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, Plurónicos o polietilénglicol (PEG). Las composiciones útiles en el tratamiento de diabetes, "síndrome metabólico", enfermedades neurodegenerativas, cánceres, enfermedades cardiovasculares y enfermedades inflamatorias incluyen, sin limitación, anticuerpos, moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido y ribozimas, moléculas de triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o actividad del producto génico diana. Aunque es posible administrar un ingrediente activo sólo como la materia prima química, se prefiere presentar éste como una formulación farmacéutica. La presente invención comprende una formulación farmacéutica comprendiendo una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención en asociación con al menos un vehículo, adyuvante, o diluyente farmacéuticamente aceptable. La presente invención también comprende un procedimiento para tratar la inflamación o trastornos asociados a inflamación en un sujeto, comprendiendo el procedimiento la administración al sujeto que tiene esta inflamación o trastorno de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la presente invención. En la familia de los compuestos de la presente invención también están incluidas las sales derivadas de éstos farmacéuticamente aceptables. La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" abarca sales que se usan normalmente para formar sales de metales alcalinos y para formar sales de adición de ácidos libres o de bases libres. La naturaleza de la sal no es critica, siempre que sea farmacéuticamente aceptable. Sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de la presente invención se pueden preparar a partir de un ácido inorgánico o a partir de un ácido orgánico. Ejemplos de estos ácidos inorgánicos son: ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, carbónico, sulfúrico y fosfórico. Ácidos orgánicos apropiados pueden seleccionarse a partir de clases alifáticas, cicloalifáticas, aromáticas, aralifáticas, heterocíclicas, carboxílicas y sulfónicas de ácidos orgánicos, ejemplos de estos son ácido fórmico, acético, propiónico, succínico, glicólico, glucónico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, glucurónico, maleico, fumárico, pirúvico, aspártico, glutámico, benzoico, antranílico, mesílico, salicílico, p-hidroxibenzoico, fenilacético, mandélico, embónico (pamoico), metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, pantoténico, toluensulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, sulfanílico, esteárico, ciclohexilaminosulfónico, algénico, ß-hidroxibutírico, salicílico, galactárico y galacturónico. Sales de adición de base farmacéuticamente aceptables adecuadas de compuestos de la presente invención incluyen: sales metálicas hechas a partir de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y cinc o sales orgánicas hechas a partir de ?,?'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metil-glucamina) y procaína. Todas estas sales pueden prepararse por medios convencionales a partir de los correspondientes compuestos de la presente invención por reacción, por ejemplo del ácido o la base apropiado con el compuesto de la presente invención. También se abarcan dentro de esta invención composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más compuestos de la presente invención, en asociación con uno o más vehículos y/o diluyentes y/o adyuvantes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos (colectivamente denominados en este documento como materiales "vehículo") y, si se desea, otros ingredientes activos. Por lo tanto, los compuestos de la presente invención pueden usarse en la fabricación de un medicamento. Las composiciones farmacéuticas de los compuestos de la presente invención preparadas como se describe anteriormente en el presente documento pueden formularse como soluciones o polvos liofilizados para administración parenteral. Los polvos pueden reconstituirse añadiendo un diluyente adecuado u otro vehículo farmacéuticamente aceptable antes de su uso. La formulación líquida puede ser una solución acuosa isotónica tamponada. Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por cualquier ruta adecuada, preferiblemente en forma de una composición farmacéutica adaptada a esta ruta, y en una dosis eficaz para el tratamiento deseado. Los compuestos y composición pueden, por ejemplo, administrarse por vía intravascular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intramedular, oral o tópica. Para administración oral, la composición farmacéutica puede estar en forma, por ejemplo de comprimido, cápsula, suspensión, o líquido. El ingrediente activo puede también administrase por inyección como una composición en la que puede usarse, por ejemplo, solución salina normal isotónica, solución acuosas convencional de dextrosa al 5% o una solución tamponada deacetato sódico o amónico, como vehículo adecuado. Esta formulación es especialmente adecuada para administración parenteral, pero también puede usarse para administración oral o contenida en un inhalador o nebulizador dosificador para insuflación. Puede ser conveniente añadir excipientes tales como polivinilpirrolidona, gelatina, h'idroxicelulosa, goma arábiga, polietilénglicol, manitol, cloruro sódico, o citrato sódico. La composición farmacéutica preferiblemente se hace en forma de una unidad de dosificación que contiene una cantidad en particular del ingrediente activo. Ejemplos de estas unidades de dosificación son comprimidos o cápsulas. La cantidad de compuesto terapéuticamente activo que se administra y el régimen de dosificación para tratamiento de una enfermedad con los compuestos y/o composiciones de esta invención depende de varios factores, incluyendo la edad, peso, sexo y estado médico del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la ruta y frecuencia de administración, y el compuesto particular empleado, y de esta manera puede variar ampliamente. Las composiciones farmacéuticas pueden contener ingrediente activo en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 2,000 mg, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 0.5 a 500 mg y más preferiblemente entre aproximadamente 1 y 100 mg. Una dosis diaria de aproximadamente 0.01 a 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal y más preferiblemente entre aproximadamente 1 a 20 mg/kg de peso corporal, puede ser adecuada. La dosis diaria puede administrase de una a 4 veces al día. Para fines terapéuticos, los compuestos de esta invención normalmente se combinan con uno o más adyuvantes apropiados para la ruta de administración indicada. Si se administran por vía oral, los compuestos pueden mezclarse con lactosa, sacarosa almidón en polvo, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos alquilésteres de celulosa, talco, ácido esteárico, estearato magnésico, óxido magnésico, sales de sodio y calcio de los ácidos fosfórico y sulfúrico, gelatina, goma arábiga, alginato sódico, polivinilpirrolidona, y/o poli(alcohol vindico), y después convertirse en comprimidos o en cápsulas para la administración conveniente. Estas cápsulas o comprimidos pueden contener una formulación para la liberación controlada así como proporcionarse en una dispersión del compuesto activo en un material de liberación sostenida tal como gliceril monoestearato, gliceril diestearato, hidroxipropilmetil celulosa sola o con una cera. Las formulaciones para administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones inyectables estériles isotónicas acuosas o no acuosas. Estas soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos o gránulos estériles que tienen uno o más vehículos o diluyentes de los mencionados para uso en las formulaciones de administración oral. Los componentes pueden disolverse en agua, polietilénglicol, propilénglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de semillas de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, alcohol bencílico, cloruro sódico, y/o diversos tampones. Las preparaciones farmacéuticas se hacen según las técnicas convencionales de farmacia que implican moler, mezclar, granular, y comprimir, cuando sea necesario, para formar comprimidos; o moler, mezclar, y rellenar para formar cápsulas de gelatina dura. Cuando se use un vehículo líquido, la preparación se hará en forma de jarabe, elixir, emulsión, o una suspensión acuosa o no acuosa. Esta formulación líquida se puede administrar de forma oral o cargada en cápsulas de gelatina blanda. Para administración rectal, los compuestos de la presente invención pueden también combinarse con excipientes tales como manteca de cacao, glicerina, gelatina, o polietilénglicoles y moldearse como supositorio. Los procedimientos de la presente invención incluyen administración tópica de los compuestos de la presente invención. Por administración tópica se entiende administración no sistémica, incluyendo la aplicación de un compuesto de la invención externamente sobre la epidermis, en la cavidad bucal e instilación de este compuesto en el oído, ojo y nariz, en el que el compuesto no entra significativamente en el torrente circulatorio. Por administración sistémica se entiende administración oral, intravenosa, intraperitoneal, e intramuscular. La cantidad de un compuesto de la presente invención (referido en lo sucesivo como el ingrediente activo) requerido para efecto terapéutico o profiláctico tras administración tópica variará, por supuesto, con el compuesto elegido, la naturaleza y gravedad de la afección tratada y el animal que sufre el tratamiento, y está en último caso a discreción del médico. Las formulaciones tópicas de la presente invención tanto para uso veterinario como para uso médico humano, comprenden un ingrediente activo junto con uno o más vehículos aceptables por lo tanto, y opcionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico. El vehículo ha de ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudicial para el receptor de ésta. Las formulaciones apropiadas para administración tópica incluyen preparaciones líquidas o semilíquidas adecuadas para la penetración a través de la piel en el sitio en el cual se requiere el tratamiento tales como: linimentos, lociones, cremas, pomadas o pastas, y gotas adecuadas para administración en el ojo, odio o nariz. El ingrediente activo puede comprender, para aplicación tópica, de 0.01 a 5.0% en peso de la formulación. Las gotas de acuerdo con la presente invención pueden comprender soluciones o suspensiones estériles acuosas u oleosas y pueden prepararse disolviendo el ingrediente activo en una solución acuosa apropiada de un agente antibacteriano y/o fungicida y/o cualquier otro conservante adecuado, y preferiblemente incluir un agente tesioactivo. La solución resultante puede clarificarse después por filtración, transferirse a un recipiente adecuado, que después se sella y esteriliza por autoclavado, o mantenerse a 90-100°C durante media hora. Alternativamente, la solución puede esterilizarse por filtración y transferirse a un recipiente mediante una técnica aséptica. Ejemplos de agentes bactericidas y fungicidas adecuados para la inclusión en las gotas son nitrato o acetato fenilmercúrico (0.00217c), cloruro de benzalconio (0.01 % y acetato de clorhexidina (0.01%). Disolventes adecuados para la preparación de una solución oleosa incluyen glicerol, alcohol diluido y popilénglicol. Las lociones de acuerdo con la presente invención incluyen aquellas adecuadas para la aplicación en la piel o en el ojo. Una loción ocular puede comprender una solución acuosa estéril que opcionalmente contenga un bactericida y puede prepararse por procedimientos similares a los de la preparación de las gotas. Lociones o linimentos para aplicación en la piel también pueden incluir un agente para acelerar el secado y para enfriar la piel, tales como un alcohol o acetona, y/o un hidratante tal como glicerol o aceite tal como aceite de ricino o aceite de cacahuete. Las cremas, pomadas, o pastas según la presente invención son formulaciones semisólidas del ingrediente activo para aplicación externa. Pueden hacerse mezclando el ingrediente activo en forma finamente dividida o pulverizado, sólo, o en solución o suspensión en un fluido acuoso o no acuoso, con la ayuda de maquinaria apropiada, con una base grasienta o no grasienta. La base pueden comprender carbohidratos tales como parafina dura, suave o líquida, glicerol, cera de abeja, un jabón metálico; un mucílago; un aceite de origen natural tal como de almendra, maíz, cacahuete, ricino o aceite de oliva; grasa de la lana o sus derivados, o un ácido graso tal como ácido esteárico u oleico, junto con un alcohol tal como el propilénglicol o macrogoles. La formulación puede incorporar cualquier agente tensioactivo adecuado tal como un agente tensioactivo aniónico, catiónico o no iónico tal como ésteres de sorbitan o derivados polioxietileno de éstos. También pueden incluirse agentes de suspensión tales como gomas naturales, derivados de celulosa o materiales inorgánicos tales como sílices silíceos, y otros ingredientes tales como lanolina. Otros adyuvantes y modos de administración son bien y ampliamente conocidos en la técnica farmacéutica. Aunque esta invención se ha descrito con respecto a realizaciones específicas, los detalles de estas realizaciones no han de considerarse como limitaciones. itoNEET o fragmentos que se usan para administración in vivo han de ser estériles. Esto se conseguirá fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes o tras la liofilización y reconstitución. Las composiciones terapéuticas de mitoNEET generalmente se sitúan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa, o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La ruta de administración de mitoNEET o anticuerpo anti-mitoNEET está de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por vía Intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, infraocular, intraarterial o rutas dentro de las lesiones, o por sistemas de liberación sostenida como se apunta a continuación. MitoNEET o su fragmento se administra continuamente por Infusión o por inyección en bolo. El anticuerpo mitoNEET se administra de la misma forma, o por administración dentro del torrente sanguíneo o linfático. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos configurados, por ejemplo películas, o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (Patente de Estados Unidos N° 3,773,919, documento EP 58,481 ), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman y col., Biopolymers, 22: 547-556> 1983), poli (2-hidroxietilmetacrilato) (Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277> 1981 , y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105> 1982), etilen vinil acetato (Langer y col., supra) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133,988). Las composiciones de liberación sostenida de mitoNEET también incluyen mitoNEET atrapado por liposomas. Los lisosomas que contienen mitoNEET se preparan por procedimientos conocidos per se: documento DE 3.218,121 ; Epstein y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77: 4030-4034 (1980); documento EP 52,322; documento EP 36,676; documento EP 88,046; documento EP 143,949; documento EP 142,641 ; solicitud de Patente Japonesa 83-1 8008; Patentes de Estados Unidos N° 4,485,045 y 4,544,545; y documento EP 02 324. Generalmente los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (aproximadamente 200-800 Ángstroms) en los que el contenido lipídico es mayor de aproximadamente 30% de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima con mitoNEET. Una cantidad eficaz de mitoNEET empleada terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos, de la vía de administración y del estado del paciente. Por lo tanto, será necesario que el terapeuta valore la cantidad de dosis y modifique la vía- de administración como se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Típicamente, el clínico administrará el mitoNEET o su fragmento hasta que se alcance una dosis que consiga el efecto deseado. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por ensayos convencionales. Los procedimientos de análisis de mitoNEET o sus anticuerpos usan todos uno o más de los siguientes reactivos: análogo de analito marcado, análogo de analito inmovilizado, pareja de unión marcada, pareja de unión inmovilizada y conjugados estéricos. Los reactivos marcados también se conocen como "trazadores". El mareaje utilizado (y éste también es útil para marcar el ácido nucleico mitoNEET para uso como sonda) es cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión del analito y su pareja de unión. Se conocen numerosos marcadores para su uso en ¡nmunoensayo, los ejemplos incluyen restos que pueden detectarse directamente, tales como marcadores fluorocromo, quimioluminiscentes, o radiactivos, así como restos, tales como enzimas, que han de reaccionar o derivatizarse para ser detectadas. Los ejemplos de estos marcadores incluyen los radioisótopos 32P, 4C, 25l, 3H, y 131l, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceina y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas, por ejemplo luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de Estados Unidos N° 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano rusticano (HRP), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, conjugadas con una enzima que usa peróxido de hidrógeno para oxidar un colorante precursor tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares. Se dispone de procedimientos convencionales para unir covalentemente estos marcadores a proteínas o polipéptidos. Por ejemplo, agentes de unión tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-¡midatos, bencidina bis-diazotizada, y similares pueden usarse para etiquetar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticos descritos anteriormente. Véase, por ejemplo las Patentes de Estados Unidos N° 3,940,475 (fluorimetría) y 3,645,090 (enzimas); Hunter y col., Nature, 144: 945 (1962); David y col., Biochemlstry, 13: 1014-1021 (1974); Paint y col., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); y Nygren, J. Histochem Cytochem., 30: 407-412 (1982). Los marcadores preferidos en este documento son enzimas tales como la peroxidasa de rábano rusticano y fosfatasa alcalina. La conjugación de este marcador, incluyendo las enzimas, al anticuerpo es un procedimiento de manipulación estándar para un experto en técnicas de inmunoensayo. Véase, por ejemplo, O Sullivan y col., "Methods for the Preparation of Enzymology-antiboby Conjugates for Use ¡n Enzyme Immunoassay", en Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone y H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, Nueva York, 1981 ), pág. 147-166. Estos procedimientos de enlace son apropiados para usar con mitoNEET o sus anticuerpos, todos ellos proteínas. Se requieren la inmovilización de reactivos para determinados procedimientos de ensayo. La inmovilización implica separar la pareja de unión de cualquier analito que permanece libre en solución. Convencionalmente esto se consigue bien insolubilizando la pareja de unión o el análogo de analito antes del procedimiento de ensayo, por adsorción a una matriz o superficie insoluble en agua (Bennich y col., Patente de Estados Unidos N° 3,720,760, por acoplamiento covalente (por ejemplo, usando entrecruzamiento con glutaraldehído), o insolubilizando la pareja o análogo posteriormente, por ejemplo, por inmunoprecipitación. Otros procedimientos de ensayo, conocidos como ensayos competitivos o en sandwich, están bien establecidos y se usan ampliamente en la industria de diagnóstico comercial. Los ensayos competitivos dependen de la capacidad de un análogo de trazador para competir con el analito de la muestra ensayada por un número limitado de sitios de unión en una pareja de unión común. Generalmente la pareja de unión se insolubiliza antes o después de la competición y después el trazador y el analito unidos a la pareja de unión se separan del trazador y analito no unidos. Esta separación se consigue decantando (cuando la pareja de unión estaba insolubilizado previamente) o por centrifugación (cuando la pareja de unión se ha precipitado después de la reacción de competición). La cantidad de analito en la muestra ensayada es inversamente proporcional a la cantidad de trazador unido medido como la cantidad de sustancia marcada. Se preparan curvas dosis-respuesta con cantidades conocidas de analito y se comparan con los resultados de ensayos para determinar cuantitativamente la cantidad de analito presente en la muestra de ensayo. Estos ensayos se denominan sistemas ELISA cuando se usan enzimas como marcadores detectables. Otra especie de ensayo competitivo, denominado ensayo "homogéneo", no requiere de una separación de fase. Aquí, se prepara un conjugado de enzima con el analito y se usa de modo que cuando el anti-analito se une al analito, la presencia del anti-analito modifica la actividad enzimática. En este caso, mitoNEET o sus fragmentos inmunológicamente activos se conjugan con un enlace orgánico bifuncional a una enzima tal como la peroxidasa. Los conjugados se seleccionan para uso con un anti-mitoNEET, de modo que la unión del anti-mitoNEET inhibe o potencia la actividad enzimática del mareaje. Este procedimiento per se, se practica ampliamente con el nombre de EMIT. Se usan conjugados esféricos en procedimientos de impedimento estérico para ensayos homogéneos. Estos conjugados se sintetizan uniendo covalentemente un hapteno de bajo peso molecular con un pequeño analito de manera que el anticuerpo contra el hapteno sustancialmente es incapaz de unir el conjugado al mismo tiempo que el anti-analito. Bajo este procedimiento de ensayo el analito presente en la muestra de ensayo se unirá al anti-analito, permitiendo así al anti-hapteno unirse al conjugado, lo que tiene como resultado un cambio en el carácter del hapteno conjugado, por ejemplo, un cambio en ia fluorescencia cuando el hapteno es un fluoróforo. Los ensayos en sandwich son particularmente útiles para la determinación de mitoNEET o anticuerpos anti-mitoNEET. En un ensayo en sandwich secuencial se usa una pareja de unión inmovilizada para adsorber el analito de la muestra de ensayo, la muestra de ensayo se elimina por lavado, el analito unido se usa para adsorber la pareja.de unión marcada, y después se separa el material unido del trazador residual. La cantidad de trazador unido es directamente proporcional al analito de la muestra ensayada. En ensayos en sandwich "simultáneo" la muestra de ensayo no se separa antes de añadir la pareja de unión marcada. Un ensayo en sandwich secuencial usando un anticuerpo monoclonal anti-mitoNEET como anticuerpo uno y un anticuerpo policlonal anti-mitoNEET como el otro es útil para probar la actividad mitoNEET en las muestras. Lo anteriormente mencionado es simplemente un ejemplo de los ensayos de diagnóstico para mitoNEET y sus anticuerpos. Otros procedimientos ya desarrollados o desarrollados a partir de ahora para la determinación de estos analitos están incluidos dentro del alcance de ésta, incluyendo los bioensayos descritos anteriormente.

Anticuerpo Los polipéptidos mitoNEET pueden usarse como inmunógenos para generar anticuerpos usando técnicas estándar para la preparación de anticuerpo policlonal y monoclonal. Puede usarse el polipéptido o la proteína de longitud completa o, alternativamente, los fragmentos peptídicos antigénicos proporcionados por la invención para su uso como inmunógenos. El péptido antigénico de una proteína de la invención comprende al menos 8 (preferiblemente 10, 15, 20, ó 30) restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos y abarca un epítope de la proteína de modo que un anticuerpo provocado contra el péptido forma un complejo inmune específico con la proteína. Los epítopes preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones que están localizadas en la superficie de la proteína, por ejemplo regiones hidrófilas. Puede usarse un trazado hidropático o análisis similares para identificar regiones hidrófilas. Típicamente un inmunógeno se usa para preparar anticuerpos inmunizando a un sujeto adecuado, (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero). Una preparación inmunogénica adecuada puede contener, por ejemplo, el polipéptido sintetizado químicamente y expresado de forma recombinante. La preparación puede incluir además un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente ¡nmunoestimulador similar. El término "anticuerpo" como se usa en el documento se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicam'ente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno, que unen específicamente un antígeno, tales como un polipéptido de la invención. Una molécula que se une específicamente a un polipéptido dado de la invención es una molécula, que se une al polipéptido, pero no se une sustancialmente a otras moléculas de la muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que contenga naturalmente el polipéptido. Los ejemplos de porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina incluyen los fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. El término "anticuerpo" incluye el fragmento Fv que contiene sólo las regiones variables de la cadena ligera y pesada (VL y VH); un fragmento Fv unido por un puente disulfuro (Brinkmann, y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 547-551 (1993)); un fragmento Fab que contiene las regiones variables y partes de las regiones constantes, (Fab)'2, Fabs diméricos o Fabs triméricos, que pueden ser multivalentes y/o multiespecíficos; un anticuerpo de cadena única (ScFv) (Bird y col., Science 242: 424-426 (1988); Huston y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)), multímeros de cadena sencilla (dianticuerpos, trianticuerpos, tetranticuerpos, etc.) que pueden ser multivalentes y/o multiespecíficos. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales. La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contiene sólo una especie de sitio de unión al antígeno capaz de inmunoreaccionar con un epítope en particular. Los anticuerpos policlonales pueden preparase como se describe anteriormente inmunizando un sujeto adecuado con un polipéptido de la invención como inmunógeno. El título de anticuerpo en el sujeto inmunizado puede controlarse a lo largo del tiempo por técnicas estándar, tales como con un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) usando polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo pueden aislarse a partir de mamíferos (por ejemplo, a partir de la sangre) y purificarse posteriormente por técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. Tras un tiempo apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo específico sean mayores, pueden obtenerse a partir del sujeto las células productoras de anticuerpo y usarse para preparar anticuerpos monoclonales por técnicas estándar, tales como la técnica de hibridoma originalmente descrita por Kóhler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497, la técnica de hibridoma de célula B humano (Kozbor y col. (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica de EBV-hibridoma (Colé y col. (1985), Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas es bien conocida (véase generalmente Current Protocols in Immunology (1994) Coligan y col. (eds) John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, N. Y.). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan por análisis de la presencia de anticuerpos en los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma que unen el polipéptido de interés, por ejemplo, usando un ensayo estándar de ELISA. Como alternativa a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, puede identificarse un anticuerpo monoclonal dirigido contra un polipéptido mitoNEET y aislarse por análisis de una librería de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una librería de despliegue de anticuerpo en fago) con el polipéptido de interés. Kits para la generación y análisis de la librería de despliegue en fago están disponibles en el mercado (por ejemplo, la Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, N° de catálogo 27-9400-01 ; y el SurfZAPJ Phage Display Kit de Stratagene, N° de catálogo 240612). Adicionalmente, ejemplos de procedimientos y reactivos particularmente útiles para usar en la generación y análisis de las librerías de despliegue de anticuerpo pueden encontrarse en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5,223,409; la publicación PCT N° WO 92/18619; la publicación PCT N° WO 91/17271 ; la publicación PCT N° WO 92/20791 ; la publicación PCT N° WO 92/15679; la publicación PCT N° WO 93/01288; la publicación PCT N° WO 92/01047; la publicación PCT N° WO 92/09690; la publicación PCT N° WO 90/02809; Fuchs y col., (1991 ) Bio Technology 9: 1370-1372; Hay y col. (1992) Hum. Antibody Hybridomas 3: 81-85; Huse y col. (1989) Science 246: 1275-1281 ; Griffiths y col. (1993) EMBO J. 12: 725-734.

Preparación de Anticuerpo mitoNEET Los anticuerpos policlonales contra mitoNEET se obtienen generalmente en animales por inyecciones múltiples subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) de mitoNEET y un adyuvante. Puede ser útil conjugar mitoNEET o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana a una proteína que es inmunogénica en la especie que se va a inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de lapa de bocallave, la albúmina sérica, tiroglobubina bovina, o inhibidor de la tripsina de soja usando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo, éster de maleimidobenzoilsulfosuccinimida (conjugación a través de los restos de cisteína), N-hidrox¡succin¡mida (a través de los restos de lisina), glutaraldehido, anhídrido succínico, SOCI2, o R1N=C=NR, donde R y R son diferentes grupos alquilo. Normalmente los animales se inmunizan contra los conjugados inmunogénicos o sus derivados combinando 1 mg o 1 pg de conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución por vía intradérmica en múltiples sitios. Un mes después los animales se reinmunizan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de conjugado en adyuvante incompleto de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. De 7 a 14 días después a los animales se les extrae la sangre y se ensaya el título de anti-mitoNEET en el suero. Los animales se reinmunizan hasta la estabilización del titulo. Preferiblemente, el animal es estimulado con el conjugado del mismo mitoNEET, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un agente de entrecruzamiento diferente. Los conjugados también pueden hacerse en cultivos celulares recombinantes como proteínas de fusión. También se usan agentes agregantes tales como alumbre para potenciar la respuesta inmune. Puede ser conveniente inmunizar al animal con un análogo de la célula huésped, que se ha transformado para expresar el receptor diana de otra especie. Los anticuerpos monoclonales se preparan recuperando las células de bazo de los animales inmunizados e inmortalizando las células de forma conveniente, por ejemplo, por fusión con células de mieloma o por transformación con el virus de Epstein-Barr (EB) y seleccionando los clones que expresan el anticuerpo deseado. El anticuerpo monoclonal preferiblemente no presenta reacción cruzada con otros polipéptidos mitoNEET conocidos. Adicionalmente, se pueden producir anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando procedimientos descritos en la publicación PCT N° WO 87/02671 ; la solicitud de Patente Europea 184,187; la solicitud de Patente Europea 171 ,496; la solicitud de Patente Europea 173,494; la publicación PCT N° WO 86/01533; la Patente de Estados Unidos N° 4,816,567; la solicitud de Patente Europea 125,023; Better y co/.( 1988) Science 240: 1041-1043; Liu y col (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu y col. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun y col., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 84: 214-218; Nishimura y col. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood y col. (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw y col. (1988) J. Nati. Cáncer Inst. 80: 1553-1559); Morrison ( 985) Science 229: 1202-1207; Oi y col. (1986) Bio/Techniques 4: 214; la Patente de Estados Unidos N° 5,225,539; Jones y col. (1986) Nature 321 : 552-525; Verhoeyan y col. (1988) Science 239: 534; y Beidler y col. (1988) J. Immunol. 141 : 4053-4060. Particularmente se prefieren anticuerpos completamente humanos para tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Estos anticuerpos pueden producirse usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar los genes de las cadenas pesada y ligera de la ¡nmunoglobulina endógena, pero que pueden expresar los genes de la cadena pesada y ligera humana. Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o una porción del polipéptido mitoNEET. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse usando tecnología convencional de hibridoma. Los transgenes de ¡nmunoglobulina humana hospedados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de las células B, y consecuentemente sufren un cambio de clase y mutación somática. De esta manera, usando esta técnica es posible producir anticuerpos IgG, IgA, e IgE terapéuticamente útiles. Para una revisión de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para un análisis detallado de esta tecnología de producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para la producción de estos anticuerpos, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5,625,126; la Patente de Estados Unidos N° 5,633,425; la Patente de Estados Unidos N° 5,569,825; la Patente de Estados Unidos N° 5,661 ,016; y la Patente de Estados Unidos N° 5,545,806. Además, compañías tales como Abgenix. Inc. (Freemont, California) pueden ocuparse de proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente. También pueden producirse anticuerpos humanos usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo librerías de despliegue de fagos (Homogenous y Winter. J. Mol. Biol., 227: 381 ( 991 ); Marks y col, J.

Mol. Biol., 222: 581 (1991)). Las técnicas de Colé y col. y Boerner y col., también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol., 147(1 ):86-95 (1991 )). De forma similar, pueden hacerse anticuerpos humanos introduciendo loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los que los genes de la inmunoglobulina endógena se han inactivado parcial o completamente. Tras la estimulación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que cercanamente recuerda a las de humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento génico, ensamblaje, y repertorio de anticuerpos. Esta aproximación se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661 ,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio Technology 10, 779783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14, 844-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).

Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos monoclonales, preferiblemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión por al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de unión es para el PA; la otra es para cualquier otro antígeno, y preferiblemente para una proteína, receptor o subunidad de receptor de la superficie celular. Los procedimientos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulinas, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpo, de las que sólo uno tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta normalmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se han descrito en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y col., EMBO J., 10:3655-3659 (1991 ). Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con secuencias del domino constante de la inmunoglobulina. Esta fusión preferiblemente es con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión con la cadena ligera presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo huésped adecuado. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo Suresh y col., Methods in Enzymology, 121 :210 (1986). De acuerdo con otra aproximación descrita en el documento WO 96/27011 , la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo puede someterse a ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros, que pueden recuperarse a partir de un cultivo celular recombinante. La interfaz preferida comprende al menos una parte de la región CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este procedimiento, se sustituyen una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la molécula del primer anticuerpo por cadenas laterales más largas (por ejemplo tirosina o triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño similar o idéntico a la cadena o cadenas laterales largas en la ¡nterfaz de la molécula del segundo anticuerpo sustituyendo las cadenas laterales largas de aminoácidos por otras más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento de los heterodímeros sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros. Pueden prepararse anticuerpos biespecíficos como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpo se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos biespecíficos usando enlace químico. Brennan y col, Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en el que anticuerpos intactos se rompen proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito sódico, agente complejante de ditiol, para estabilizar los ditioles próximos y prevenir la formación de enlaces disulfuros ¡ntermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten después en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte después en el Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden usarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los fragmentos Fab', pueden recuperarse directamente a partir de E. coli y unirse químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby y coi, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizado. Cada fragmento Fab', se secretó separadamente de E. coli y se sometió a acoplamiento químico dirigido ¡n vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de esta manera era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y linfocitos T humanos normales, así como desencadenando la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos usando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar homodímeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este procedimiento también puede utilizarse para la producción de monodímeros de anticuerpo. La tecnología de "dianticuerpo" descrita por Hollinger y coi, Proc. Nati. Acad. Sel. USA 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la preparación de fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado con un domino variable de la cadena ligera (VL) por un engarce, que es demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadenan. Por lo tanto, los dominios VH y VL de un fragmento están forzados a aparearse con los dominios complementarios VL y VH del otro fragmento, formando así dos sitios de unión al antígeno. También se ha publicado otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpos biespecíficos usando dímeros de Fv de cadena única (sFv). Véase, Gruber y col., J. Immunol. 152:5368 (1994). Se contemplan anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos tries pecíf icos (Tutt y col., J. Immunol. 147:60 (1991 )). Anticuerpos biespecificos ejemplo pueden unirse a dos epítopes diferentes en un polipéptido dado en este documento. Alternativamente, un brazo puede combinarse con un brazo que se une una molécula desencadenante de un leucocito tal como una molécula receptora de la célula T (por ejemplo CD2, CD3, CD28, o B7), o receptores Fe para la IgG (FcyR), tales como FCYRI (CD64), FCYRII (CD32) y FCYRIII (CD16) con el fin de enfocar los mecanismos de defensa celular en la célula que expresa la proteína en particular de la presente invención. También pueden usarse anticuerpos biespecificos para localizar agentes citotóxicos para células, que expresan una proteína en particular de la presente invención. Estos anticuerpos poseen un brazo de unión a una proteína de la presente invención y un brazo, que une un agente citotóxico o un quelante de radionúclidos, tales como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés une el polipéptido y además une el factor tisular (TF) Composiciones Farmacéuticas de Anticuerpos Los anticuerpos que unen específicamente un polipéptido identificado en el presente documento, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de análisis descritos en el presente documento, pueden administrarse para el tratamiento de deversos trastornos en forma de composiciones farmacéuticas. Si el polipéptido es intracelular y se usan anticuerpos completos como inhibidores, se prefieren anticuerpos internalizantes. Sin embargo, también pueden usarse lipofecciones o liposomas para distribuir el anticuerpo, o un fragmento del anticuerpo, dentro de las células. Cuando se usan fragmentos de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente con el dominio de unión de la proteína diana. Por ejemplo, basándose en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, pueden diseñarse moléculas peptídicas para que retengan la capacidad de unión con la secuencia de la proteína diana. Estos péptidos pueden sintetizarse químicamente y/o producirse por tecnología de ADN recombinante. Véase, por ejemplo Marasco y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993). La formulación de este documento también puede contener más de un compuesto activo si es necesario para tratar la indicación en particular, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afecten de forma adversa entre ellos. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que potencie su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico, o agente de inhibición del crecimiento. Estas moléculas estarán presentes de forma adecuada en la combinación en cantidades que sean efectivas para el fin pretendido. Los ingredientes activos también pueden incluirse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de fármaco (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas están descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. Las formulaciones usadas para administración in vivo han de estar estériles. Esto se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles. Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones para liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplo de matrices para liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Patente de Estados Unidos N° 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilen vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LLTRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas POR copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprólido), y ácido poli-D-(-)-3-hidrox¡butírico. Aunque polímeros tales como etilen vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante aproximadamente 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo largo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que tiene como resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S ¡ntermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización puede alcanzarse modificando los restos sulfidrilo, liofilizando a partir de soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas.

Uso de mitoNEET y sus Anticuerpos El ácido nucleico que codifica mitoNEET puede usarse como diagnóstico para la tipificación específica de tejido. Por ejemplo, pueden usarse procedimientos tales como hibridación in situ, transferencias de Northern y Southern, y análisis por PCR para determinar si el ADN y/o ARN que codifican mitoNEET están presentes en el tipo o tipos celulares que están siendo evaluados. Los anticuerpos contra el receptor de mitoNEET son útiles en ensayos de diagnóstico de la expresión de mitoNEET en células o tejidos específicos. Los anticuerpos se marcan de la misma manera que se ha descrito anteriormente para mitoNEET y/o se inmovilizan en una matriz insoluble. Los anticuerpos anti-mitoNEET también son útiles para la purificación por afinidad de mitoNEET a partir de cultivos celulares recombinantes o de fuentes naturales. Ensayos diagnósticos adecuados para mitoNEET y sus anticuerpos son conocidos per se. Estos ensayos incluyen ensayos competitivos y en sandwich, y ensayos de inhibición estérica. Los procedimientos competitivos y en sandwich emplean una etapa de separación de fases como parte integral del procedimiento mientras que los ensayos de inhibición estérica se llevan a cabo en una mezcla de reacción simple. Fundamentalmente, se usan los mismos procesamientos para el ensayo de mitoNEET y para las sustancias que unen mitoNEET, aunque ciertos procedimientos serán más favorables dependiendo del peso molecular de la sustancia que está siendo ensayada. Por lo tanto, en el presente documento a la sustancia a ensayar sea la denomina un analito, sin tener en cuenta si su estado es de antígeno o de anticuerpo, y las proteínas que se unen al analito se denominan parejas de unión, sin importar si son anticuerpos, receptores de la superficie celular, o antígenos. Puede usarse un anticuerpo dirigido contra mitoNEET para detectar la proteína (por ejemplo, en un lisado celular o en un sobrenadante celular solubilizado) para evaluar la abundancia y el patrón de expresión del polipéptido. El uso de anticuerpos para inmunoprecipitar mitoNEET puede permitir la valoración del complemento de las proteínas asociadas que pueden ser diagnóstico de disversas afecciones. Los anticuerpos también pueden usarse de manera diagnóstica para controlar los niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse uniendo el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano rusticano, la fosfatasa alcalina, a-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina de fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluyen luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluye luciferasa, luciferina, y aequorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H. La proteína mitoNEET purificada con o sin anticuerpos o membranas que contienen un contenido aumentado de mitoNEET biológicamente activo puede usarse para encontrar/analizar compuestos con utilidades potenciales para diversos usos según se describe a continuación.

Ensayos para Diabetes Pueden usarse diversos ensayos para ensayar los compuestos que interaccionan con proteínas asociadas a mitoNEET y/o mitoNEET. Por ejemplo, además de la evaluación para la interacción directa con mitoNEET, los compuestos pueden evaluarse para la capacidad de influenciar en las actividades enzimáticas que están asociadas con mitoNEET. Esto incluye, aunque sin limitación, enzimas implicadas en la oxidación de ácidos grasos, particularmente en la mitocondria. Un ejemplo de este enfoque es medir la tasa de ß-oxidación de ésteres de acil-CoA grasos usando membranas aisladas o mitocondrias intactas que contienen mitoNEET. Los metabolitos se miden mediante la aparición de productos evaluados por HPLC o mediante la tasa de reducción de cofactores o sustratos (por ejemplo, Figura 9). Los compuestos activos en la modulación de la actividad de mitoNEET, con respecto a estas actividades enzimáticas, pueden entonces evaluarse en células intactas (por ejemplo, hepatocitos, adipocitos, etc) donde los intermedios se miden por HPLC después de extracción de las células. Los compuestos activos que modulan la actividad de mitoNEET en estos ensayos y que también contienen las propiedades apropiadas para llegar a ser agentes terapéuticos (por ejemplo, biodisponibilidad, semivida, etc) entonces podría esperarse que produjeran acciones antidiabéticas en modelos animales de diabetes tales como disminución de los niveles en circulación de glucosa e insulina y mejora de la expresión génica dependiente de insulina (por ejemplo, Hofmann, C, Lomez, K., y Coica, J.R. (1991) Endocrinology, 29:1915- 925; Hofmann, C, Lomez, K., y Coica, J.R. (1992) Endocrinology 130:735-740.) Ensayos para la Actividad Cardiovascular, Endotelial y Angiogénica Pueden usarse diversos ensayos para ensayar mitoNEET en este documento para la actividad cardiovascular, endotelial, y angiogénica. Dichos ensayos incluyen los proporcionados en los Ejemplos posteriores. Los ensayos para evaluar la actividad antagonista de endotelina, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5,773,414, incluye un ensayo de unión al ventrículo de corazón de rata donde mitoNEET se ensaya para su capacidad de inhibir la unión de endotelina-1 yodinizada en un ensayo de receptor, un ensayo de unión a receptor de endotelina que ensaya la unión de células intactas de endotelina-1 radiomarcadas usando células de músculo liso vascular de la arteria renal de conejo, un ensayo de acumulación de inositol-fosfato donde la actividad funcional se determina en células I de rata midiendo los niveles ¡ntracelulares de mensajeros secundarios, un ensayo de liberación de ácido araquidónico que mide la capacidad de compuestos añadidos para reducir la liberación de ácido araquidónico estimulada por endotelina en músculos lisos vasculares cultivados, estudios in vitro (vaso aislado) usando endotelio de conejos macho de New Zealand, y estudios in vivo usando ratas Sprague-Dawley machos. Los ensayos para la actividad de generación tisular incluyen, aunque sin limitación, los descritos en el documento WO 95/16035 (hueso, cartílago, tendón), el documento WO 95/05846 (nervioso, neuronal), y el documento WO 91/07491 (piel, endotelio).

Los ensayos para la actividad de curación de heridas incluyen, por ejemplo, los descritos en Winter, Epldermal Wound Healing, Maibach, Hl and Rovee, DT, Eds. (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pág. 71-112, modificado por el artículo de Eaglstein y Mertz, J. Invest. Dermatol., 71 :382-384 (1978). Hay varios ensayos de hipertrofia cardiaca. Los ensayos ¡n vitro incluyen la inducción de la propagación de miocitos cardíacos de rata adulta. En este ensayo, los miocitos ventriculares se aislan de una única rata (macho Sprague-Dawley), siguiendo esencialmente una modificación del procedimiento descrito en detalle por Piper y col., "Adult ventricular rat heart muscle cells" en Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, ed. (Berlín: Springer-Verlag, 1990), pág. 36-60. Este procedimiento permite el aislamiento de miocitos ventriculares adultos y el cultivo a largo plazo de estas células en el fenotipo de forma de vara. Se ha mostrado que la Fenilefrina y Prostaglandina F2 (PGF2) inducen una respuesta de propagación en estas células adultas. Después se ensaya la inhibición de la propagación de miocitos inducida por PGF2 o análogos de PGF2 (por ejemplo, fluprostenol) y fenilefrina por diversos inhibidores potenciales de hipertrofia cardiaca. La eficacia de la acción anti-hipertensiva puede medirse por un medio indirecto o directo en modelos animales que demuestran hipertensión resistente a insulina (por ejemplo, Hypertension 24(1 ), 106-10, (1994); Metabolism, Clinical and Experimental 44: 1105-9 (1995)). La eficacia de los compuestos identificados por mitoNEET también puede medirse directamente in vitro (por ejemplo, Journal of Clinical Investigation 96:354-60 (1995).

Ensayos para la Actividad Oncológica Para el cáncer, puede usarse una diversidad de modelos animales bien conocidos para entender adicionalmente el papel de mitoNEET en el desarrollo y patogénesis de tumores, y para ensayar la eficacia de agentes terapéuticos candidatos, incluyendo anticuerpos y otros antagonistas de mitoNEET, tales como antagonistas de molécula pequeña. La naturaleza in vivo de dichos modelos los hace particularmente capaces de predecir respuestas en pacientes humanos. Los modelos animales de tumores y cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, candor de pulmón, etc) incluyen animales tanto no recombinantes como recombinantes (transgénicos). Los modelos de animales no recombinantes incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo, modelos murinos. Dichos modelos pueden generarse introduciendo células tumorales en ratones singénicos usando técnicas convencionales, por ejemplo, inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola, implante del bazo, implante intraperitoneal, implante bajo la cápsula renal, o implante orthopin, por ejemplo, células de cáncer de colon implantadas en tejido colónico. Véase, por ejemplo, la publicación PCT N° WO 97/33551 , publicada el 18 de septiembre de 1997. Probablemente, la especie animal usada más a menudo en estudios oncológicos, son ratones inmunodeficientes y, en particular, ratones desnudos. La observación de que un ratón desnudo con hipo/aplasia tímica podría funcionar exitosamente como huésped para xenoinjertos tumorales humanos, ha conducido a su uso generalizado para este propósito. El gen nu recesivo autosómico se ha introducido en una cantidad muy grande de distintas cepas congénicas de ratón desnudo, incluyendo, por ejemplo, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B I O.LP, 017, CM, C57BL, 057, CBA, DBA, DDD, l/st, NC, NFR, NFS, NFS1 N, NZB, NZC, NZW, P, RUI, y SJL. Además, se ha criado una amplia diversidad de animales distintos con defectos ¡nmunológicos heredados distintos de los ratones desnudos y se han usado como receptores de xenoinjertos tumorales. Para detalles adicionales véase, por ejemplo, The Nude Mouse in Oncology, Resé E. Boven y B. Winograd, Eds. (CRC Press, Inc., 1991). Las células introducidas en dichos animales pueden obtenerse de líneas celulares de tumor/cáncer conocidas, tales como cualquiera de las líneas celulares tumorales enumeradas anteriormente, y, por ejemplo, la línea celular B 04-1-1 (línea celular NIH-3T3 estable transfectada con el protooncogén neu); células NIH-3T3 transfectadas con ras; Caco-2 (ATCC HTB-37); o una línea celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II moderadamente bien diferenciada, HT-29 (ATCC HTB-38); o de tumores y cánceres. Las muestras de células de tumor o cáncer pueden obtenerse de pacientes que experimentan cirugía, usando condiciones convencionales que implican congelar y almacenar en nitrógeno líquido. Kannali y col., Br. J.

Cáncer, 48:689-696 (1983). Las células tumorales pueden introducirse en animales tales como ratones desnudos por una diversidad de procedimientos. El espacio subcutáneo (s.c.) en ratones es muy apropiado para el implante de tumor. Los tumores pueden transplantarse s.c. como bloques sólidos, como biopsias en aguja por uso de un trocar o como suspensiones celulares. Para un implante de bloque sólido o por trocar, los fragmentos tisulares tumorales de tamaño adecuado se introducen en el espacio s.c. Las suspensiones celulares se preparan de manera reciente a partir de tumores primarios o líneas celulares tumorales estables, y se inyectan por vía subcutánea. Las células tumorales también pueden inyectarse como implantes subdérmicos. En esta localización se deposita el inoculo entre la parte inferior del tejido conectivo dérmico y el tejido s.c. Los modelos animales de cáncer de mama pueden generarse, por ejemplo, implantando células de neuroblastoma de rata (a partir de las cuales se aisló inicialmente el oncogén i7eu), o células NIH-3T3 transformadas con neu en ratones desnudos, esencialmente como se describe por Drebin y col. En Proc. Nal Acad. Sci. USA, 83:9129-9133 (1986). De manera similar, pueden generarse modelos animales de cáncer de colon haciendo pases de células de cáncer de colon en animales, por ejemplo, ratones desnudos, conduciendo a la aparición de tumores en estos animales. Se ha descrito un modelo de transplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones desnudos, por ejemplo, por Wang y col., Cáncer Research, 54:4726-4728 (1994) y Too y col. Cáncer Research, 55:681 -684 (1995). Este modelo se basa en el llamado "METAMOUSE" vendido por AntiCancer, Inc., (San Diego, California). Los tumores que surgen en los animales pueden retirarse y cultivarse in vitro. Las células de los cultivos in vitro después pueden pasarse a animales. Dichos tumores pueden servir como dianas para el ensayo adicional o la exploración de fármacos. Como alternativa, los tumores resultantes de los pases pueden aislarse, el ARN de células prepasadas, y células aisladas después de una o más rondas de pases pueden analizarse para la expresión diferencial de genes de interés. Dichas técnicas de pases pueden realizarse con cualquier línea celular de tumor o cáncer conocida. Por ejemplo, eth A, CMS4, CMS5, CMS2 1 y WEHI-164 son fibrosarcomas inducidos químicamente de ratones hembra BALB/c (DeLeo y col., J. Exp. Med., 146:720 (1977)), que proporcionan un sistema modelo altamente controlable para estudiar las actividades antitumorales de diversos agentes. Palladino y col., J. Immunol., 138:4023-4032 (1987). Brevemente, las células tumorales se propagan in vitro en cultivo celular. Antes de la inyección en los animales, las líneas celulares se lavan y se suspenden en tampón, a una densidad celular de 10X106 a 10X107 células/ml. Después, se infectan los animales por vía subcutánea con la suspensión celular, dejándolo de una a tres semanas para que aparezca el tumor. Además, el carcinoma de pulmón Lewis (3LL) de ratones, que es uno de los tumores experimentales estudiados más a fondo, puede usarse como modelo tumoral de investigación. La eficacia en este modelo tumoral se ha correlacionado con los efectos beneficiosos en el tratamiento de pacientes humanos diagnosticados con carcinoma de células pequeñas del pulmón (SCCL). Este tumor puede introducirse en ratones normales tras la inyección de fragmentos tumoraies a partir de ratones afectados o de células mantenidas en cultivo. Zupi y col., Br. J. Cáncer, 41 :supl. 4, 30 (1980). La evidencia indica que los tumores pueden iniciarse a partir de la inyección de incluso una única célula y que una proporción muy alta de células tumoraies infectadas sobreviven. Para información adicional acerca de este modelo tumoral véase, Zacharski, Haemostasis, 16:300-320 (1986). Una manera de evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo en un modelo animal con un tumor implantado es medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento. Tradicionalmente, el tamaño de tumores implantados se ha medido con un pie de rey en dos o tres dimensiones. La medida limitada a dos dimensiones no refleja con precisión el tamaño del tumor; por lo tanto, habituaímente se convierte en el volumen correspondiente usando una fórmula matemática. Sin embargo, la medida del tamaño del tumor es muy imprecisa Los efectos terapéuticos de un fármaco candidato pueden describirse mejor como retraso en el crecimiento inducido por el tratamiento y el retraso del crecimiento específico. Otra variable importante en la descripción del crecimiento del tumor es el tiempo para doblar el volumen del tumor. Los programas informáticos para el cálculo y descripción del crecimiento tumoral también están disponibles, tal como el programa del que se ha informado por Rygaard y Spang-Thomsen, Proc. 6a Int. Workshop on Immune-Deficient Animáis Wu and Sheng Ed. (Basel, 1989), p. 301. Se observa, sin embargo, que las respuestas inflamatorias y de necrosis después del tratamiento, pueden realmente dar como resultado un aumento en el tamaño tumoral, al menos inicialmente. Por lo tanto, estos cambios necesitan controlarse cuidadosamente, por una combinación de un procedimiento morfométrico y análisis de citometría de flujo. Además, los modelos animales recombinantes (transgénicos) pueden modificarse por ingeniería genética introduciendo la porción codificante del gen mitoNEET identificado en este documento, en el genoma de animales de interés, usando técnicas convencionales para producir animales transgénicos. Los animales que pueden servir como diana para la manipulación transgénica incluyen, sin limitación, ratones, ratas, conejos, cobayas, ovejas, cabras, cerdos, y primates no humanos, por ejemplo, babuino, chimpancés, y monos. Las técnicas conocidas en la técnica para introducir un transgen en dichos animales incluyen microinyección pronucleica (Patente de Estados Unidos N° 4,873,191 ); transferencia de genes mediada por retrovirus en líneas germinales (por ejemplo, Van der Putten y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:6148-615 (1985)); dirigir genes en células troncales embrionarias (Thompson y col., Cell, 56:313-321 (1989)); electroporación de embriones (Lo, Mol. Cell. Biol., 3:1803-1814 (1983)); y transferencia de genes mediada por esperma. Lavitrano y col., Cell, 57:717-73 (1989). Para un análisis, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4,736,866.

Para el propósito de la presente invención, los animales transgénicos incluyen los que llevan el transgen sólo en parte de sus células ("animales mosaico"). El transgen puede integrarse como un transgen único, o en concatámeros, por ejemplo, tándem cabeza-cabeza o cabeza-cola. La introducción selectiva de un transgen en un tipo celular particular también es posible siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko y col., Proc, Nal Acad. Sci. USA, 89:6232 636 (1992). La expresión del transgen en los animales transgénicos puede controlarse por técnicas convencionales. Por ejemplo, puede usarse análisis de transferencia de Southern o amplificación por PCR para verificar la integración del transgen. Después, puede analizarse el nivel de expresión de ARNm usando técnicas tales como hibridación in situ, análisis de transferencia de Northern, PCR, o inmunocitoquímica. Los animales se examinan adicionalmente para detectar los signos de desarrollo de tumor o cáncer. Como alternativa, pueden consideradrse animales "knock-out" los que tienen un gen deficiente o alterado que codifica mitoNEET identificado en este documento, como resultado de recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica mitoNEET y el ADN genómico alterado que codifica el mismo polipéptido introducido en una célula embrionaria del animal. Puede eliminarse una porción del ADN genómico que codifica mitoNEET o reemplazarse con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador de selección que puede usarse para controlar la integración. Típicamente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante no alterado (tanto en el extremo 5' como 3') en el vector. Véase, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51 :503 (1987) para una descripción de vectores de recombinación homologa. El vector se introduce en una línea de células troncales embrionarias (por ejemplo, por electroporación) y se seleccionan las células en las que se ha recombinado de manera homologa el ADN introducido con el ADN endógeno. Véase, por ejemplo, Li y col., Cell, 69:915 (1992). Después, las células seleccionadas se inyectan en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar quimeras de agregación. Véase, por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practlcal Approach, E. I Robertson, ed. (IRL: Oxford, 1987), pág. 113-152. Después puede implantarse un embrión quimérico en un animal hembra adecuada adoptivo pseudopreñado y el embrión se lleva a término para crear un animal "knock-out". La progenie que contiene el ADN recombinado de manera homologa en sus células germinales puede identificarse por técnicas convencionales y usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homologa. Los animales knock-out pueden caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse frente a ciertas afecciones patológicas y por su desarrollo de afecciones patológicas debidas a la ausencia de mitoNEET. La eficacia de anticuerpos que se unen de forma específica a mitoNEET, y otros candidatos fármaco, también puede ensayarse en el tratamiento de tumores animales espontáneos. Los datos se evalúan respecto a las diferencias en supervivencia, respuesta y toxicidad en comparación con grupos de control. La respuesta positiva puede necesitar pruebas de regresión tumoral, preferiblemente con mejora de la calidad de vida y/o aumento del tiempo de vida. Además, también pueden ensayarse los tumores animales espontáneos, tales como fíbrosarcoma, adenocarcinoma, linfoma, condroma, o leiomiosarcoma de perros, gatos y babuinos. De estos, el adenocarcinoma de mama en perros y gatos es uno de los modelos preferidos ya que su apariencia y comportamiento son muy similares a los de humanos. Sin embargo, el uso de este modelo está limitado por la rara aparición de este tipo de tumor en animales. Otros ensayos metabólicos, cardiovasculares y oncológicos ¡n vitro e in vivo conocidos en la técnica también están disponibles en este documento. Los resultados del estudio metabólico, cardiovascular y oncológico puede verificarse adicionalmente por estudios de unión a anticuerpos en los que se ensaya la capacidad de anticuerpos anti-mitoNEET de inhibir el efecto de mitoNEET en células epiteliales, endoteliales u otras células usadas en los ensayos metabólicos, cardiovasculares y oncológicos. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos y heteroconjugados.

Ensayos de Tumor Basados en Células Los ensayos basados en células y los modelos animales para trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos, tales como tumores, pueden usarse para verificar los descubrimientos de un ensayo cardiovascular, endotelial y angiogénico en este documento, y para entender adicionalmente la relación entre los genes identificados en este documento y el desarrollo y patogénesis del crecimiento celular cardiovascular, endotelial, y angiogénico no deseable. El papel de mitoNEET en el desarrollo y patología del crecimiento celular cardiovascular, endotelial y angiogénico no deseable, por ejemplo, células tumorales, puede ensayarse usando células o líneas celulares que se han identificado como estimuladas o inhibidas por mitoNEET. En un enfoque diferente, se transfectan células de un tipo celular que se sabe que están Implicadas en un trastorno cardiovascular, endotelial y angiogénico particular, con mitoNEET, y se analiza la capacidad de mitoNEET para inducir el crecimiento excesivo o inhibir el crecimiento. Si el trastorno cardiovascular, endotelial y angiogénico es cáncer, las células tumorales apropiadas incluyen, por ejemplo, líneas celulares tumorales estables tales como la línea celular B104-1-1 (línea celular NIH-3T3 estable transfectada con el protooncogén neu) y células NIH-3T3 transfectadas con ras, que pueden transfectarse con el gen deseado y controlarse para el crecimiento tumorigénico. Dichas líneas celulares transfectadas pueden usarse después para ensayar la capacidad de anticuerpos o composiciones de anticuerpos poli o monoclonales para inhibir el crecimiento celular tumorigénico ejerciendo una actividad citoestática o citotóxica en el crecimiento de las células transformadas, o por mediación de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). Las células transfectadas con las secuencias codificantes de los genes identificados en este documento también pueden usarse para identificar fármacos candidatos para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos, tales como cáncer. Además, los cultivos primarios obtenidos de tumores en animales transgénicos (como se ha descrito anteriormente) pueden usarse en los ensayos basados en células en este documento, aunque se prefieren las líneas celulares estables. Las técnicas para obtener líneas celulares continuas de animales transgénicos son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Small y col., Mol. Cell. Biol., 5:642-648 (1985).

Ensayos de Exploración para Fármacos Candidatos. Esta invención abarca procedimientos de exploración de compuestos para identificar los que modulan la función de mitoNEET. Los ensayos de exploración para candidatos moduladores se diseñan para identificar compuestos que se unen o se complejan con mitoNEET, o interfieren de otra manera con la interacción de mitoNEET con otras proteínas celulares. Dichos ensayos de exploración incluirán ensayos susceptibles de exploración de alta transferencia de bibliotecas químicas haciéndolos particularmente apropiados para la identificación de fármacos candidatos de moléculas pequeñas.

Los ensayos pueden realizarse en una diversidad de formatos, incluyendo ensayos de unión proteína-proteína, ensayos de exploración bioquímica, inmunoensayos y ensayos basados en células, que están bien caracterizados en la técnica. Un ejemplo de dichos ensayos, es un intento de superar la inhibición de la ß-oxidación de ácidos grasos causada por un exceso de mitoNEET o actividad de mitoNEET. Los compuestos capaces de superar o modular esta inhibición pasan luego a evaluación adicional como candidatos de descubrimiento de fármacos potenciales. Todos los ensayos para moduladores son similares en que requieren el contacto del candidato con mitoNEET codificado por un ácido nucleico identificado en este documento en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que estos dos componentes interaccionen. En ensayos de unión, la interacción es unión y el complejo formado puede aislarse o detectarse en la mezcla de reacción. En una realización particular mitoNEET y el fármaco candidato se inmovilizan en una fase sólida, por ejemplo, en una placa de microtitulación, por uniones covalentes o no covalentes. La unión no covalente generalmente se consigue recubriendo la superficie sólida con una solución de mitoNEET y secándola. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico para mitoNEET a inmovilizar, para anclarlo a una superficie sólida. Este ensayo se realiza añadiendo el componente no inmovilizado, que puede marcarse por un marcador detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente anclado. Cuando se completa la reacción, los componentes que no han reaccionado se retiran, por ejemplo, lavando, y se detectan los complejos anclados en la superficie sólida. Cuando el componente no inmovilizado en un principio lleva un marcador detectable, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se forma el complejo. Cuando el componente no inmovilizado en un principio no lleva un marcador, la formación de un complejo puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo marcado que se une específicamente al complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interacciona pero no se une a mitoNEET, su interacción con ese polipéptido puede ensayarse por procedimientos bien conocidos para la detección de interacciones proteína-proteína. Dichos ensayos incluyen enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo, entrecruzamiento, co-inmunoprecipitación, y co-purificación a través de gradientes o columnas cromatográficas. Además, las interacciones proteicas pueden controlarse usando un sistema genético basado en levaduras descrito por Fields y colaboradores (Fields y Song, Nature (Londres), 340:245-246 (1989); Chien y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991 )) como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5789-5793 (1991 ). Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura, constan de dos dominios modulares físicamente discretos, uno que funciona como dominio de unión a ADN, y el otro que funciona como dominio de activación de la trascripción. El sistema de expresión de levaduras descrito en las publicaciones anteriores (generalmente referido como el "sistema doble híbrido") tiene la ventaja de esta propiedad y emplea dos proteínas híbridas, en una de las cuales la proteína diana se fusiona al dominio de unión a ADN de GAL4, y otra, en la que las proteínas de activación candidatas se fusionan al dominio de activación. La expresión de un gen informador GAL l-lacZ bajo el control de un promotor activado por GAL4 depende de la reconstitución de la actividad GAL4 mediante la interacción proteína-proteína. Las colonias que contienen los polipéptidos interaccionando se detectan con un sustrato cromogénico para P-galactosidasa. Está disponible en el mercado un kit completo (MATCHMAKER) para identificar interacciones proteína-proteína entre dos proteínas específicas usando la técnica de doble híbrido de Clontech. Este sistema también puede ampliarse para mapear dominios proteicos implicados en las interacciones proteicas específicas así como determinar los restos de aminoácidos que son cruciales para estas interacciones. Los compuestos que interfieren con la interacción de mitoNEET y otros componentes intra o extracelulares pueden ensayarse del siguiente modo: habitualmente se prepara una mezcla de reacción que contiene el producto del gen y el componente intra o extracelular en condiciones y durante un tiempo que permite la interacción y la unión de los dos productos. Para ensayar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión, la reacción se realiza en ausencia y en presencia del compuesto de ensayo. Además, puede añadirse un placebo a una tercera mezcla de reacción, que sirve como control positivo. La unión (formación de complejo) entre el compuesto de ensayo y el componente ¡ntra o extracelular presente en la mezcla se controla como se ha descrito anteriormente. La formación de un complejo en la reacción o reacciones de control pero no en la mezcla de reacción que contiene el compuesto de ensayo indica que el compuesto de ensayo interfiere con la interacción del compuesto de ensayo y su compañero de reacción. Si mitoNEET tiene la capacidad de estimular la proliferación de células endoteliales en presencia del co-mitogen ConA, entonces, un ejemplo de un procedimiento de exploración aprovecha esta capacidad. Específicamente, en el ensayo de proliferación, se obtienen células endoteliales de la vena umbilical humana y se cultivan en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocilios (Costar, Cambridge, MA) y se suplementan con una mezcla de reacción apropiada para facilitar la proliferación de las células, conteniendo la mezcla Con-A (Calbiochem, La Jolla, CA). Con-A y el compuesto a explorar se añaden y después de incubación a 37°C, los cultivos se pulsan con 3-H-timidina y se recogen en filtros de fibra de vidrio (Cambridge Technology, Watertown, MA). La media de incorporación de 3-(H) timidina (cpm) de cultivos triplicados se determina usando un contador de centelleo líquido (Beckman Instruments, Irvine, CA). La incorporación de 3-(H)-timidina significativa indica la estimulación de la proliferación celular endotelial. Para ensayar antagonistas, se realiza el ensayo descrito anteriormente; sin embargo, en este ensayo se añade mitoNEET junto con el compuesto a explorar y la capacidad del compuesto de inhibir la incorporación de 3(H)timidina en presencia de mitoNEET indica que el compuesto es un antagonista de mitoNEET. Como alternativa, los antagonistas pueden detectarse combinando mitoNEET y un antagonista potencial con receptores de mitoNEET unidos a membrana o receptores recombinantes en condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitivo. MitoNEET puede marcarse, tal como por radiactividad, de modo que puede usarse el número de moléculas de mitoNEET unidas al receptor para determinar la eficacia del antagonista potencial. Los ejemplos más específicos de antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de ¡nmunoglobulina con mitoNEET y, en particular, anticuerpos que incluyen, sin limitación, anticuerpos poli y monoclonales y fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos anti-idiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de dichos anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo. Como alternativa, un antagonista potencial puede ser una proteína altamente relacionada, por ejemplo, una forma mutada del mitoNEET que reconoce el receptor pero que no produce efectos, inhibiendo de este modo de manera competitiva la acción de mitoNEET.

En otro ensayo para antagonistas, podrían incubarse células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor con el mitoNEET marcado en presencia del compuesto candidato. Después, podría medirse la capacidad del compuesto para potenciar o bloquear esta interacción. Otro antagonista polipeptídico potencial es una construcción antisentido preparada usando tecnología antisentido, donde, por ejemplo, la molécula antisentido funciona para bloquear directamente la traducción de ARNm (o trascripción) hibridando con el ARNm fijado como objetivo (o ADN genómico) y evitando la traducción de la proteina (o trascripción de ARNm) de una proteína de la presente invención. Puede usarse la tecnología antisentido para controlar la expresión génica a través de la formación de hélices triples o ADN o ARN antisentido, que están ambos procedimientos basados en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Por ejemplo, se usa la porción codificante 5' de la secuencia polinucleotídica, que codifica los polipéptidos maduros de este documento, para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido de aproximadamente 10 a 100 pares de bases de longitud. Se diseña un oligonucleótido de ADN para que sea complementario a una región del gen implicada en la trascripción (tripe hélice - véase Lee y col., Nucí. Acids Res., 6:3073 (1979); Conney y col., Science, 241 :456 (1988); Dervan y col., Science, 251 :1360 (1991 )), evitando de este modo la transcripción y la producción del polipéptido. El oligonucleótido de ARN antisentido híbrida con el ARNm ¡n vivo y bloquea la traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido (antisentido - Okano, Neurochem., 56:560 (1991 ); OHgodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressión (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden suministrarse a células de modo que el ARN o el ADN antisentido pueda expresarse in vivo para inhibir la producción del polipéptido. Cuando se usa ADN antisentido, se prefieren oligodesoxirribonucleótidos obtenidos del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, entre aproximadamente las posiciones -10 y +10 de la secuencia nucleotídica del gen diana. Las moléculas de ARN o ADN antisentido generalmente son de al menos aproximadamente 5 bases de longitud, aproximadamente 10 bases de longitud, aproximadamente 15 bases de longitud, aproximadamente 20 bases de longitud, aproximadamente 25 bases de longitud, aproximadamente 30 bases de longitud, aproximadamente 35 bases de longitud, aproximadamente 40 bases de longitud, aproximadamente 45 bases de longitud, aproximadamente 50 bases de longitud, aproximadamente 55 bases de longitud, aproximadamente 60 bases de longitud, aproximadamente 65 bases de longitud, aproximadamente 70 bases de longitud, aproximadamente 75 bases de longitud, aproximadamente 80 bases de longitud, aproximadamente 85 bases de longitud, aproximadamente 90 bases de longitud, aproximadamente 95 bases de longitud, aproximadamente 100 bases de longitud, o más. Preferiblemente, un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. Puede construirse un ácido nucleico antisentido usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de manera diversa diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas y para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y con sentido, por ejemplo, pueden usarse nucleótidos sustituidos con acridina y derivados de fosforotioato. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-rnetoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiourac¡lo, 3-(3-amino-3-/V-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN tránscrito del ácido nucleico insertado estará en una orientación antisentido al ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección). Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención típicamente se administran a un sujeto o se generan in situ de modo que hibriden con o se unan al ARNm y/o ADN genómico celular que codifica un polipéptido seleccionado de la invención para inhibir de ese modo la expresión, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad de nucleótidos convencional para formar un dúplex estable o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco principal de la doble hélice. Un ejemplo de una vía de administración de moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención incluye inyección directa a un sitio tisular. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico antisentido pueden modificarse para marcar células seleccionadas y después administrarse de manera sistémica. Por ejemplo, para administración sistémica, las moléculas antisentido pueden modificarse de modo que se unan específicamente a receptores o antígenos expresados en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, uniendo las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos, que se unen a los receptores de superficie celular o antígenos. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también pueden suministrarse a células usando los vectores descritos en este documento. Para conseguir concentraciones intracelulares suficientes de las moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vector en las que la molécula de ácido nucleico antisentido está colocada bajo el control de un promotor pol II o pol III fuerte. Una molécula de ácido nucleico antisentido de la invención puede ser una molécula de ácido nucleico a-anomérica. Una molécula de ácido nucleico a-anomérica forma híbridos específicos de doble cadena con ARN complementario en el que, al contrario de las unidades-a habituales, las cadenas están paralelas entre sí (Gaultier y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641 ). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo ARN-ADN quimérico (Inoue y col. (1987) FEBS Lett. 215:327-330). El gen que codifica el receptor puede identificarse por numerosos procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, por ejemplo, panning de ligando, y aislamiento en citofluorímetro en FACS. Coligan y col., Current Protocols in Immun., 1 (2): Capítulo 5 (1991). Preferiblemente, se emplea la clonación de expresión cuando se prepara una ARN poliadenilado a partir de una célula sensible a mitoNEET y se divide una biblioteca de ADNc creada a partir de este ARN en combinaciones y se usa para transfectar células COS u otras células que no son sensibles a mitoNEET. Las células transfectadas que se hacen crecer en portaobjetos de vidrio se exponen ai mitoNEET marcado. MitoNEET puede marcarse por una diversidad de medios incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína quinasa específica de sitio. Después de fijación e incubación, los portaobjetos se someten a análisis autorradiográficos. Las combinaciones positivas se identifican y se preparan subcombinaciones y se retransfectan usando una subcombinación interactiva y procedimientos de reexploración, produciendo eventualmente un clon único que codifica el posible receptor. Como un enfoque alternativo para la identificación de receptor, puede unirse mitoNEET por fotoafinidad con la membrana celular o preparaciones de extractos que expresan la molécula receptora. El material entrecruzado se resuelve por PAGE y se expone a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene el receptor puede escindirse, resolverse en fragmentos peptídicos, y someterse a microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida de microsecuenciación podría usarse para diseñar una serie de sondas oligonucleotídicas degeneradas para explorar la biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica al posible receptor.

Tipos de Trastornos Metabólicos, Cardiovasculares, y Oncológicos a Tratar. El síndrome X (que incluye síndrome metabólico) se define ligeramente como una colección de anormalidades incluyendo hiperinsulemia, obesidad, niveles elevados de triglicéridos, ácido úrico, fibrinógeno, partículas LDL de pequeña densidad, inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI-1 ), y niveles disminuidos de HDL c. Afecciones metabólicas similares incluyen dislipidemia incluyendo dislipidemia diabética asociada y dislipidemia mixta, síndrome X (como se describe en esta solicitud ésta abarca un síndrome metabólico), fallo cardíaco, hipercolesterolemia, enfermedad cardiovascular incluyendo aterosclerosis, arteriosclerosis, e hipertrigliceridemia, diabetes mellitus tipo II, diabetes tipo I, resistencia a insulina, hiperlipidemia, inflamación, enfermedades hiperproliferativas del epitelio incluyendo eccema y psoriasis y afecciones asociadas con el pulmón y el intestino y regulación del apetito e ingesta de comida en sujetos que padecen de trastornos tales como obesidad, bulimia anoréxica, y anorexia nerviosa. En particular, los compuestos de esta invención son útiles en el tratamiento y prevención de diabetes y enfermedades cardiovasculares y afecciones que incluyen hipertensión, aterosclerosis, arteriosclerosis, hipertrigliceridemia, y dislipidemia mixta. MitoNEET, o moduladores del mismo, que tiene actividad en ensayos cardiovasculares, angiogénicos y endoteliales descritos en este documento, y/o cuyo producto génico se ha descubierto que se localiza en el sistema cardiovascular, probablemente tiene usos terapéuticos en una diversidad de trastornos cardiovasculares, endoteliales y angiogénicos, incluyendo trastornos sistémicos que afectan a los vasos, tales como diabetes mellitus. Su utilidad terapéutica podría incluir enfermedades de las arterias, capilares, venas y/o vasos linfáticos. Los ejemplos de tratamiento, más adelante en este documento, incluyen tratar la enfermedad de debilitación muscular, tratar la osteoporosis, ayudar a la fijación de implantes para estimular el crecimiento de células alrededor del implante y por lo tanto facilitar su unión a su sitio pretendido, aumentar la estabilidad de IGF en tejidos o en suero, si es aplicable, y aumentar la unión al receptor IGF (ya que se ha mostrado que IGF in vitro potencia el crecimiento de células progenitoras granulocíticas y eritroides de la médula humana). MitoNEET o moduladores del mismo también pueden emplearse para estimular la eritropoyesis o granulopoyesis, para estimular la curación de heridas o la regeneración tisular y terapias asociadas con respecto al recrecimiento de tejido, tal como tejido conectivo, piel, hueso, cartílago, músculo, pulmón o riñon para promover la angiogénesis, para estimular o inhibir la migración de células endoteliales, y para proliferar el crecimiento de músculo liso vascular y producción de células endoteliales. El aumento en angiogénesis mediada por mitoNEET o agonista podría ser beneficioso para tejidos isquémicos y para el desarrollo coronario colateral en el corazón después de estenosis coronaria. Los antagonistas se usan para inhibir la acción de dichos polipéptidos, por ejemplo, para limitar la producción de tejido conectivo en exceso durante la curación de heridas o fibrosis pulmonar si mitoNEET promueve dicha producción. Esto podría incluir el tratamiento de infarto miocárdico agudo y fallo cardiaco. Además, la presente invención proporciona el tratamiento de hipertrofia cardiaca, independientemente de la causa subyacente, administrando una dosis terapéuticamente eficaz de mitoNEET, o agonista o antagonista del mismo. Si el objetivo es el tratamiento de pacientes humanos, mitoNEET preferiblemente es un polipéptido mitoNEET humano recombinante (polipéptido rhmitoNEET). El tratamiento para hipertrofia cardiaca puede realizarse en cualquiera de sus diversas fases, que puede resultar de una diversidad de diversas afecciones patológicas, incluyendo infarto de miocardio, hipertensión, cardiomiopatía hipertrófica, y regurgitación valvular. El tratamiento se amplía a todas las fases de la progresión de hipertrofia cardiaca, con o sin daño estructural del músculo cardíaco, independientemente del trastorno cardíaco subyacente. La decisión de usar la molécula por sí misma o un agonista de la misma para cualquier indicación particular, frente a un antagonista de la molécula, dependería principalmente de si la molécula de este documento promueve la vascularización cardiaca, la génesis de células endoteliales, o angiogénesis o inhibe estas circunstancias. Por ejemplo, si la molécula promueve la angiogénesis, podría ser útil un antagonista de la misma para el tratamiento de trastornos en los que se desea limitar o evitar la angiogénesis. Los ejemplos de dichos trastornos incluyen tumores vasculares tales como hemangioma, angiogénesis tumoral, neovascularización de la retina, coroide, o córnea, asociada con retinopatía diabética o retinopatía prematura en niños o degeneración macular y vitreorretinopatía proliferativa, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, aterosclerosis, hiperestimulación de ovarios, psoriasis, endometriosis asociada con neovascularización, reestenosis después de angioplastia con balón, sobreproducción de tejido cauterizado, por ejemplo, el que se ve en un queloide que se forma después de cirugía, fibrosis después de infarto de miocárdico, o lesiones fibróticas asociadas con fibrosis pulmonar. Si, sin embargo, la molécula inhibe la angiogénesis, podría esperarse que se usara directamente para el tratamiento de las afecciones anteriores. Por otro lado, si la molécula estimula la angiogénesis podría usarse por sí misma (o un agonista de la misma) para indicaciones donde se desea la angiogénesis tal como enfermedad vascular periférica, hipertensión, vasculitis inflamatoria, enfermedad de Reynaud y fenómeno de Reynaud, aneurismas, reestenosis arterial, tromboflebitis, linfangitis, linfedema, curación de heridas y reparación tisular, lesión por reperfusión isquémica, angina, infartos de miocardio tales como infartos de miocardio agudos, afecciones de corazón crónicas, fallo cardíaco tal como fallo cardíaco congestivo y osteoporosis. Si, sin embargo, la molécula inhibe la angiogénesis, podría usarse un antagonista de la misma para el tratamiento de las afecciones donde se desea la angiogénesis. Los tipos específicos de enfermedades se describen a continuación, donde mitoNEET o agonistas o antagonistas del mismo pueden servir como útiles para marcar fármacos relacionados vasculares o como dianas terapéuticas para el tratamiento o prevención de los trastornos. La aterosclerosis es una enfermedad caracterizada por la acumulación de placas de la íntima aumentando en espesor en arterias, debido a la acumulación de lípidos, proliferación de células de músculo liso, y formación de tejido fibroso en la pared arterial. La enfermedad puede afectar a arterias grandes, medianas y pequeñas en cualquier órgano. Se sabe que los cambios en la función de las células del músculo liso vascular y endotelial juegan un papel importante en la modulación de la acumulación y regresión de estas placas. La hipertensión está caracterizada por una presión vascular aumentada en los sistemas arterial sistémico, arterial pulmonar, o de la vena porta. La presión elevada puede ser el resultado de o dar como resultado una función endotelial alterada y/o enfermedad vascular. La vasculitis inflamatoria incluye arteritis de células gigantes, arteritis de Takayasu, poliarteritis nodosa (incluyendo la forma microangiopática), enfermedad de Kawasaki, poliangitis microscópica, granulomatosis de Wegener, y una diversidad de trastornos vasculares infecciosos relacionados (incluyendo Púrpura de Henoch-Schonlein). Se ha mostrado que la función celular endotelial alterada es importante en estas enfermedades. La enfermedad de Reynaud y el fenómeno de Reynaud se caracterizan por un deterioro anormal intermitente de la circulación a través de las extremidades expuestas al frío. La función celular endotelial alterada se ha mostrado que es importante en esta enfermedad. Las aneurismas son dilataciones saculares o fusiformes del árbol arterial o venoso que están asociadas con células endotelilales y/o células del músculo liso vascular alteradas. La reestenosis arterial (reestenosis de la pared arterial) puede suceder después de angioplastia como resultado de la alteración de la función y proliferación de células del músculo liso vascular y endotelial. La tromboflebitis y linfangitis son trastornos inflamatorios de venas y vasos linfáticos, respectivamente, que pueden ser el resultado de, y/o en, la función celular endotelial alterada. De manera similar, el linfedema es una afección que implica vasos linfáticos alterados como resultado de la función celular endotelial. La familia de tumores vasculares benignos y malignos se caracteriza por proliferación anormal y crecimiento de elementos celulares del sistema vascular. Por ejemplo, los lifangiomas son tumores benignos del sistema linfático que son malformaciones congénitas, a menudo císticas, de los vasos linfáticos que habitualmente suceden en recién nacidos. Los tumores císticos tienden a crecer en el tejido adyacente. Los tumores císticos habitualmente suceden en la región cervical y axilar. También pueden suceder en el tejido blando de las extremidades. Los síntomas principales son vasos linfáticos dilatados, a veces reticulares, estructurados y linfocistis rodeado por tejido conectivo. Los linfangiomas se asume que están causados por vasos linfáticos embrionarios conectados de manera inapropiada o su deficiencia. El resultado es un drenaje linfático local alterado. Otro uso de antagonistas de mitoNEET es en la prevención de angiogénesis tumoral, que implica la vascularización de un tumor para posibilitar su crecimiento y/o metástasis. Este procedimiento es dependiente del crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Los ejemplos de neoplasmas y afecciones relacionadas que implican angiogénesis tumoral incluyen carcinomas de mama, carcinomas de pulmón, carcinomas gástricos, carcinomas esofágeos, carcinomas colorrectales, carcinomas de hígado, carcinoma de ovario, tecomas, arrenoblastomas, carcinomas cervicales, carcinoma endometrial, hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas, coriocarcinoma, cáncer de cabeza y cuello, carcinoma naseofaríngeo, carcinoma laríngeo, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma carvernoso, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas, rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas, carcinomas del tracto urinario, carcinomas tiroideos, tumor de Wilm, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales) y síndrome de Meigs. La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa que conduce a la pérdida visual grave de la población anciana. La forma exudativa de AMD está caracterizada por la neovascularización coroidal y el desprendimiento de células del epitelio pigmentario retinal. Como la neovascularización coroidal está asociada con un empeoramiento drástico en la prognosis, se espera que un agonista de mitoNEET sea útil en reducir la gravedad de AMD. La curación de traumas tal como la curación de heridas y reparación tisular, también es un uso fijado como objetivo para mitoNEET o sus agonistas. La formación y regresión de nuevos vasos sanguíneos es esencial para la curación y reparación de tejidos. Esta categoría incluye crecimiento o regeneración de tejido óseo, cartílago, tendón, ligamento y/o nervioso, así como la curación de heridas y reparación y reemplazamiento tisular, y en el tratamiento de quemaduras, incisiones, y úlceras. MitoNEET o moduladores del mismo que induce el crecimiento de cartílago y/o hueso en circunstancias donde el hueso normalmente no se forma, tiene aplicación en la curación de fracturas óseas y daño o defectos del cartílago en humanos y otros animales. Dicha preparación que emplea mitoNEET o agonistas o antagonistas del mismo puede tener un uso profiláctico en la reducción de fracturas cerradas y abiertas y también en la fijación mejorada de articulaciones artificiales. La formación ósea de nuevo inducida por un agente osteogénico contribuye a la reparación de defectos craneofaciales congénitos, inducidos por traumas, u oncológicos, inducidos por resección, y también es útil en la cirugía plástica cosmética. MitoNEET o moduladores del mismo puede también ser útil para promover un cierre mejor o más rápido de heridas que no se curan, incluyendo sin limitación, úlceras por presión, úlceras asociadas con insuficiencia vascular, heridas quirúrgicas y traumáticas, y similares. Se espera que los moduladores de mitoNEET también puedan mostrar actividad para la generación o regeneración de otros tejidos, tales como órganos (incluyendo, por ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñon, piel, o endotelio), músculo (liso, esquelético, o cardíaco), y tejido vascular (incluyendo endotelio vascular), o para promover el crecimiento de células comprendidas en dichos tejidos. Parte de los efectos deseados puede ser por inhibición o modulación de la cicatrización fibrótica para permitir que el tejido normal se regenere. Los moduladores de mitoNEET también pueden ser útiles para la protección o regeneración del intestino y el tratamiento de fibrosis de pulmón o hígado, lesión por reperfusión en diversos tejidos, y afecciones que son el resultado de daño sistémico por citoquinas. Además, mitoNEET o moduladores del mismo pueden ser útiles para promover o inhibir la diferenciación de tejidos descritos anteriormente a partir de tejidos o células precursoras, o para inhibir el crecimiento de tejidos descritos anteriormente. Los moduladores de mitoNEET también pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades periodontales y en otros procedimientos de reparación dental. Dichos agentes pueden proporcionar un medio para atraer las células formadoras de hueso, estimular el crecimiento de células formadoras de hueso, o inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso. MitoNEET o un agonista o un antagonista del mismo también puede ser útil en el tratamiento de osteoporosis u osteoartritis, tal como a través de la estimulación de la reparación de huesos y/o cartílagos o bloqueando la inflamación o procedimientos de destrucción tisular (actividad colagenasa, actividad de osteoclastos, etc) mediado por procedimientos inflamatorios, ya que los vasos sanguíneos juegan un papel importante en la regulación de la renovación y crecimiento óseos. Otra categoría de actividad de regeneración tisular que puede atribuirse a mitoNEET o moduladores del mismo es la formación de tendones/ligamentos. Una proteína que induce la formación de tejidos tipo tendón/ligamento u otros tejidos en circunstancias en que dicho tejido normalmente no se forma tiene aplicación en la curación de roturas, deformidades, de tendones o ligamentos, y otros defectos de tendones o ligamentos en humanos y otros animales. Dicha preparación puede tener un uso profiláctico en prevenir el daño a tejido de tendones o ligamentos, así como un uso en la mejora de la fijación del tendón o el ligamento al hueso u otros tejidos, y en reparar defectos del tejido del tendón o ligamento. La formación de nuevo de tejido tipo tendón/ligamento inducida por una composición de mitoNEET o agonista o antagonista del mismo contribuye a la reparación de defectos congénitos, inducidos por trauma u otros defectos de tendones o ligamentos de otro origen, y también es útil en la cirugía plástica cosmética para unir o reparar los tendones o ligamentos. Las composiciones en este documento pueden proporcionar un medio para atraer las células formadoras de tendón o ligamento, estimular el crecimiento de células formadoras de tendón o ligamento, inducir la diferenciación de progenitores de células formadoras de tendón o ligamento, o inducir el crecimiento de células de tendón/ligamento o progenitores ex vivo para devolver in vivo para provocar la reparación tisular. Las composiciones de este documento también pueden ser útiles en el tratamiento de tendinitis, síndrome del túnel carpiano, y otros defectos de tendones o ligamentos. Las composiciones también pueden incluir una matriz apropiada y/o agente secuestrante como vehículo como se sabe bien en la técnica. MitoNEET o sus moduladores también pueden ser útiles para la proliferación de células neuronales y para la regeneración de tejido nervioso y cerebral, es decir, para el tratamiento de enfermedades y neuropatías del sistema nervioso central y periférico, así como trastornos mecánicos y traumáticos que implican degeneración, muerte, o trauma de células neuronales o de tejido nervioso. Más específicamente, mitoNEET o su agonista puede usarse en el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso periférico, tal como lesiones nerviosas periféricas, neuropatía periférica y neuropatías localizadas, y enfermedades del sistema nervioso central, tal como enfermedad de Alzheimer, Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, y síndrome de Shy-Drager. Las afecciones adicionales que pueden tratarse de acuerdo con la presente invención incluyen trastornos mecánicos y traumáticos, tales como trastornos de la medula espinal, trauma de cabeza, y enfermedades cerebrovasculares tales como apoplejía. Las neuropatías periféricas que son el resultado de quimioterapia u otras terapias médicas también pueden tratarse usando un agonista de mitoNEET o antagonista del mismo. La lesión por isquemia-reperfusión es otra indicación. La disfunción de células endoteliales puede ser importante tanto en la iniciación, como en la regulación de las secuelas de sucesos que suceden después de la lesión por isquemia-reperfusión. La artritis reumatoide es una indicación adicional. El crecimiento de vasos sanguíneos y la dirección de células inflamatorias a través de la vasculatura es un componente importante en la patogénesis de formas reumatoides y sero-negativas de artritis. MitoNEET o sus moduladores pueden también administrarse profilácticamente a pacientes con hipertrofia cardiaca, para evitar la progresión de la afección y evitar la muerte repentina, incluyendo la muerte de pacientes asintomáticos. Dicha terapia preventiva está particularmente justificada en el caso de pacientes diagnosticados con hipertrofia cardiaca del ventrículo izquierdo masiva (un espesor de pared máximo de 35 mm o más en adultos, o un valor comparable en niños), o en casos en los que la carga hemodinámica en el corazón es particularmente fuerte.

MitoNEET y sus moduladores también pueden ser útiles en la gestión de fibrilación auricular, que se desarrolla en una porción sustancial de pacientes diagnosticados con cardiomiopatía hipertrófica. Las indicaciones adicionales incluyen angina, infartos de miocardio tales como infartos de miocardio agudo, y fallo cardíaco tal como fallo cardíaco congestivo. Las afecciones no neoplásicas adicionales incluyen psoriasis, retinopatías diabéticas y otras retinopatías proliferativas que incluyen retinopatía del prematuro, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, hiperplasias tiroideas (incluyendo la enfermedad de Grave), transplante de córnea y transplante de otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, preeclampsia, ascitis, efusión pericárdica (tal como la asociada con pericarditis), y efusión pleural. En vista de lo anterior, mitoNEET o moduladores del mismo descritos en este documento, que se muestra que alteran o afectan a la función, proliferación, y/o forma de células endoteliales, epiteliales, o especializadas, probablemente juegan un papel importante en la etiología y patogénesis de muchos o todos los trastornos observados anteriormente, y como tales pueden servir como dianas terapéuticas para aumentar o inhibir estos procedimientos o para dirigir fármacos relacionados vasculares en estas enfermedades. 1. Ensayos de Diagnóstico Un procedimiento ejemplar para detectar la presencia o ausencia de un polipéptido o ácido nucleico de la invención en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica a partir del sujeto de ensayo y hacer contactar la muestra biológica con un compuesto o agente capaz de detectar un polipéptido o ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) de la invención de modo que se detecte la presencia de un polipéptido o ácido nucleico de la invención en la muestra biológica. Un agente preferido para detectar ARNm o ADN genómico que codifica un polipéptido mitoNEET, es una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridar con ARNm o ADN genómico que codifica un polipéptido mitoNEET. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ADNc de longitud completa, tal como el ácido nucleico de SEQ ID N°:1 o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones estrictas con un ARNm o ADN genómico que codifica un polipéptido mitoNEET. Se describen en este documento otras sondas apropiadas para usar en los ensayos de diagnóstico de la invención. Un agente preferido para detectar un polipéptido mitoNEET es un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido mitoNEET, preferiblemente un anticuerpo con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo, (por ejemplo, Fab o F(ab')2). El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, se pretende que abarque el mareaje directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, unión física) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como mareaje indirecto de la sonda o anticuerpo por reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Los ejemplos de mareaje indirecto incluyen detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado de manera fluorescente y mareaje de extremo de una sonda de ADN con biotina de modo que pueda detectarse con estreptavidina marcada de manera fluorescente. El término "muestra biológica" se pretende que incluya tejidos, células, y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en el sujeto. Es decir, el procedimiento de detección de la invención puede usarse para detectar ARNm, proteína o ADN genómico en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para detección de ARNm incluyen hibridaciones de Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de un polipéptido mitoNEET incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), transferencias de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para detectar ADN genómico incluyen hibridaciones de Southern. Además, las técnicas in vivo para la detección de un polipéptido mitoNEET incluyen introducir en un sujeto un anticuerpo marcado dirigido contra el polipéptido. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede detectarse por técnicas de formación de imágenes convencionales.

En una realización, la muestra biológica contiene moléculas proteicas del sujeto de ensayo. Como alternativa, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del sujeto de ensayo o moléculas de ADN genómico del sujeto de ensayo. Una muestra biológica preferida es una muestra de leucocitos sanguíneos periféricos aislados por un medio convencional de un sujeto. En otra realización, los procedimientos también implican obtener una muestra biológica control de un sujeto control, hacer contactar la muestra control con un compuesto o agente capaz de detectar un polipéptido mitoNEET o ARNm o ADN genómico que codifica un polipéptido mitoNEET, de modo que se detecte la presencia del polipéptido o ARNm o ADN genómico que codifica el polipéptido en la muestra biológica, y comparar la presencia del polipéptido o ARNm o ADN genómico que codifica el polipéptido en la muestra control con la presencia del polipéptido o ARNm o ADN genómico que codifica el polipéptido en la muestra de ensayo. La invención también abarca kits para detectar la presencia de un polipéptido o ácido nucleico de la invención en una muestra biológica (una muestra de ensayo). Dichos kits pueden usarse para determinar si un sujeto que padece o tiene un riesgo aumentado de desarrollar un trastorno asociado con la expresión aberrante de un polipéptido mitoNEET (por ejemplo, cáncer de próstata independiente de andrógenos). Por ejemplo,' el kit puede comprender un compuesto marcado o agente capaz de detectar el polipéptido o ARNm que codifica el polipéptido en una muestra biológica y un medio para determinar la cantidad del polipéptido o ARNm en la muestra (por ejemplo, un anticuerpo que se une al polipéptido o una sonda oligonucleotídica que se une a ADN o ARNm que codifica el polipéptido). Los kits también pueden incluir instrucciones para ver que el sujeto ensayado padece o tiene un riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con la expresión aberrante del polipéptido si la cantidad del polipéptido o ARNm que codifica el polipéptido está por encima o por debajo del nivel normal. Para kits basados en anticuerpo, el kit puede comprender, por ejemplo: (1 ) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que se une a un polipéptido mitoNEET y; opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une al polipéptido o al primer anticuerpo y está conjugado con un agente detectable. Para kits basados en oligonucleótidos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido marcado de manera detectable, que híbrida con una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido mitoNEET, o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido mitoNEET. El kit también puede comprender, por ejemplo, un agente tamponante, un conservante, o un agente de estabilización de proteínas. El kit también puede comprender componentes necesarios para detectar el agente detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato). El kit también puede contener una muestra control o una serie de muestras control, que pueden ensayarse y compararse con la muestra de ensayo contenida. Cada componente del kit habitualmente se encierra en un recipiente individual y todos los diversos recipientes están en un empaquetamiento único junto con instrucciones para ver si el sujeto ensayado padece o tiene riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión aberrante del polipéptido. 2. Ensayos de Pronóstico Los procedimientos descritos en este documento pueden también utilizarse como ensayos de diagnóstico o pronóstico para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de un polipéptido mitoNEET. Por ejemplo, los ensayos descritos en este documento, tales como los ensayos de diagnóstico precedentes o los siguientes ensayos, pueden utilizarse para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de un polipéptido mitoNEET. Como alternativa, los ensayos de pronóstico pueden utilizarse para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar dicha enfermedad o trastorno. Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento en el que se obtiene una muestra de ensayo a partir de un sujeto y se detecta un polipéptido o ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) de la invención, donde se diagnostica la presencia del polipéptido o ácido nucleico para un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante del polipéptido. Como se usa en este documento, una "muestra de ensayo" se refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés. Por ejemplo, una muestra de ensayo puede ser un fluido biológico (por ejemplo, suero), muestra celular, o tejido. Además, los ensayos de pronóstico descritos en este documento pueden usarse para determinar si puede administrarse a un sujeto un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, péptido mimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro fármaco candidato) para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de un péptido mitoNEET. Por ejemplo, dichos procedimientos pueden usarse para determinar si un sujeto puede tratarse de manera eficaz con un agente específico o clase de agentes específicos (por ejemplo, agentes de un tipo que disminuyen la actividad del polipéptido). Por tanto, la presente invención proporciona procedimientos para determinar si un sujeto puede tratarse de manera eficaz con un agente para un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante de un polipéptido mitoNEET, en el que se obtiene una muestra de ensayo y se detecta el polipéptido o ácido nucleico que codifica el polipéptido (por ejemplo, donde la presencia del polipéptido o ácido nucleico se diagnostica para un sujeto al que puede administrarse el agente para tratar un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante del polipéptido). Los procedimientos de la invención también pueden usarse para detectar lesiones o mutaciones genéticas en un gen de la invención, determinando de este modo si un sujeto con el gen lesionado está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por la expresión o actividad aberrante de un polipéptido mitoNEET. En realizaciones preferidas, los procedimientos incluyen detectar, en una muestra de células del sujeto, la presencia o ausencia de una lesión o mutación genética caracterizada por al menos una alteración que afecta a la integridad de un gen que codifica el polipéptido mitoNEET, o la expresión equivocada del gen que codifica el polipéptido mitoNEET. Por ejemplo, dichas lesiones o mutaciones genéticas pueden detectarse determinando la existencia de al menos uno de: 1 ) una eliminación de uno o más nucleótidos del gen; 2) una adición de uno o más nucleótidos al gen; 3) una sustitución de uno o más nucleótidos del gen; 4) un reordenamiento cromosómico del gen; 5) una alteración en el nivel de un transcrito de ARN mensajero del gen; 6) una modificación aberrante del gen, tal como del patrón de metilación del ADN genómico; 7) la presencia de un patrón de corte y empalme de tipo no silvestre de un tránscrito de ARN mensajero del gen; 8) un nivel de tipo no silvestre de la proteína codificada por el gen; 9) una pérdida alélica del gen; y 10) una modificación post-traduccional inapropiada de la proteína codificada por el gen. Como se describe en este documento, hay una gran variedad de técnicas de ensayo conocidas en la técnica, que pueden usarse para detectar lesiones en un gen. En ciertas realizaciones, la detección de la lesión implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 4,683,195 y 4,683,202), tal como PCR de anclaje o RACE PCR, o como alternativa, en una reacción en cadena de ligamiento (LCR) (véase, por ejemplo, Landegran y col. (1988) Science 241 :1077-1080; y Nakazawa y col. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci USA 91 :360-364), la última de las cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en un gen (véase, por ejemplo, Abravaya y col. (1995) Nucleic Acids Res. 23:675-682). Este procedimiento puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un paciente, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, hacer contactar la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que hibridan específicamente con el gen seleccionado en condiciones de modo que sucede la hibridación y amplificación del gen (si está presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra control. Se anticipa que puede ser deseable usar PCR y/o LCR como etapa de amplificación preliminar junto con cualquiera de las técnicas usadas para detectar mutaciones descritas en este documento. Los procedimientos de amplificación alternativos incluyen: replicación de secuencia autosostenida (Guatelli y col. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, y col. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 173-1177), Q-Beta Replicasa (Lizardi y col. (1988) Bio Technology 6:1197), o cualquier otro procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los especialistas en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si dichas moléculas están presentes en cantidades muy bajas. En una realización alternativa, pueden identificarse mutaciones en un gen seleccionado de una célula muestra por alteraciones en los patrones de escisión de enzimas de restricción. Por ejemplo, se aisla el ADN muestra y control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan los tamaños de longitud de los fragmentos por electroforesis en gel y se comparan. Las diferencias en los tamaños de longitud de fragmento entre el ADN muestra y control indican mutaciones en el ADN muestra. Además, el uso de ribozimas específicas de secuencia (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5,498,531 ) puede usarse para puntuar la presencia de mutaciones específicas por desarrollo o pérdida de un sitio de escisión de ribozima. En otras realizaciones, pueden identificarse mutaciones genéticas hibridando ácidos nucleicos muestra y control, por ejemplo, ADN o ARN, a series de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas de oligonucleótidos (Cronin y col. (1996) Human Mutation 7:244-255; Kozal y col. (1996) Nature Medicine 2:753-759). Por ejemplo, pueden identificarse mutaciones genéticas en series de dos dimensiones que contienen sondas de ADN generadas por luz como se describe en Cronin y col., supra. Brevemente, puede usarse una primera serie de hibridación de sondas para explorar a través de grandes longitudes de ADN de una muestra y control para identificar cambios en bases entre las secuencias haciendo series lineales de sondas solapantes secuenciales. Esta etapa permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa se sigue de una segunda serie de hibridación que permite ia caracterización de mutaciones específicas usando series de sondas más pequeñas, especializadas, complementarias a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada serie de mutación está compuesta de conjuntos de sondas paralelas, una complementaria al gen de tipo silvestre y otra complementaria al gen muíante. En otra realización más, cualquiera de una diversidad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica puede usarse para secuenciar directamente el gen seleccionado y detectar las mutaciones comparando la secuencia de los ácidos nucleicos muestra con la secuencia de tipo silvestre correspondiente (control). Los ejemplos de reacciones de secuenciación incluyen las basadas en técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert ((1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:560) o Sanger ((1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463). También se contempla que cualquiera de una diversidad de procedimientos de secuenciación automatizados puede utilizarse cuando se realizan los ensayos de diagnostico ((1995) Blo Techniques 19:448), incluyendo secuenciación por espectrometría de masas (véase, por ejemplo, la Publicación PCT N° WO 94/16101 ; Cohén y col (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; y Griffin y col. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol 38:147-159). Otros procedimientos para detectar mutaciones en un gen seleccionado incluyen procedimientos en los que se usa la protección frente a agentes de escisión para detectar bases mal apareadas en heterodúplex ARN/ARN o ARN/ADN (Myers y col. (1985) Science 230:1242). En general, la técnica de escisión del apareamiento erróneo A implica proporcionar heterodúplex formados por hibridación de ARN o ADN (marcado) que contiene la secuencia de tipo silvestre con ARN o ADN potencialmente muíante obtenido de una muestra tisular. Los dúplex de doble cadena se tratan con un agente que escinde las regiones de cadena simple del dúplex, tal como las que existirán debido a los malos apareamientos en los pares de bases entre las cadenas control y muestra. Los dúplex ARN/ADN pueden tratarse con ARNasa para digerir las regiones mal apareadas, y los híbridos ADN/ADN pueden tratarse con nucleasa S1 para dirigir las regiones mal apareadas. En otras realizaciones, los dúplex ADN/ADN o ARN/ADN pueden tratarse con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina para digerir las regiones mal apareadas. Después de la digestión de las regiones mal apareadas, el material resultante se separa después por tamaño sobre geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes para determinar el sitio de la mutación. Véase, por ejemplo, Cotton y col. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:4397; Saleeba y col. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. En una realización preferida, el ADN o ARN control puede marcarse para la detección. Aún en otra realización, la reacción de escisión de apareamientos erróneos emplea una o más proteínas que reconocen pares de bases mal apareadas en ADN de doble cadena (llamadas enzimas de reparación de apareamientos erróneos A de ADN) en sistemas definidos para detectar y mapear mutaciones puntuales en ADNc obtenidos de muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde A en malos apareamientos G/A y la timidina ADN glicosilasa de células HeLa escinde T de malos apareamientos G/T (Hsu y col. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). De acuerdo con una realización ejemplar, se híbrida una sonda basada en una secuencia seleccionada, por ejemplo, una secuencia de tipo silvestre a un ADNc u otro producto de ADN de una célula o células de ensayo. El dúplex se trata con una enzima de reparación de apareamientos erróneos de ADN y los productos de escisión, si los hay, pueden detectarse por protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5,459,039. En otras realizaciones, las alteraciones en la movilidad electroforética se usarán para identificar mutaciones en genes. Por ejemplo, puede usarse un polimorfismo de conformación de cadena simple (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo silvestre (Grita y col. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2766; véase también Cotton (1993) Mutat. Res. 285:125-144; Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl 9:73-79). Los fragmentos de ADN de cadena simple de los ácidos nucleicos muestra y control se desnaturalizarán y se dejarán re natural izar. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos de cadena simple varía de acuerdo con la secuencia, y la alteración resultante en la movilidad electroforética posibilita la detección de incluso un único cambio de base. Los fragmentos de ADN pueden marcarse o detectarse con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede potenciarse usando ARN (en lugar de ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, el presente procedimiento usa análisis de heterodúplex para separar moléculas heterodúplex de cadena doble en base a cambios en la movilidad electroforética (Keen y col. (1991 ) Trends Genet 7:5). En otra realización más, el movimiento de los fragmentos mutantes o de tipo silvestre en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de agente desnaturalizante se ensaya usando electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers y col. (1985) Nature 313:495). Cuando se usa DGGE como procedimiento de análisis, se modificará el ADN para asegurar que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo, añadiendo un pulso de GC de aproximadamente 40 pb de ADN rico en GC de alta fusión por PCR. En una realización adicional, se usa un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad del ADN control y muestra (Rosenbaum y Reissner ( 987) Biophys. Chem. 265:12753). Los ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, aunque sin limitación, hibridación de oligonucleótidos selectiva, amplificación selectiva, o extensión de cebadores selectiva. Por ejemplo, los cebadores oligonucleotídicos pueden prepararse de modo que la mutación conocida se coloque de manera centrada y después se hibride con el ADN diana en condiciones que permiten la hibridación sólo si se encuentra una coincidencia perfecta (Saiki y col (1986) Nature 324:163); Saiki y col. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci USA 86:6230). Dichos oligonucleótidos específicos de alelo se híbridan con ADN diana amplificado por PCR o varias mutaciones diferentes cuando los oligonucleótidos están unidos a la membrana de hibridación y se hibridan con ADN diana marcado. Como alternativa, puede usarse tecnología de amplificación específica de alelo que depende de la amplificación de PCR selectiva, junto con la presente invención. Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación específica pueden llevar la mutación de interés en el centro de la molécula (de modo que la amplificación dependa de la hibridación diferencial) (Gibbs y col. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) o en el extremo 3' final de un cebador donde, en condiciones apropiadas, el apareamiento erróneo puede evitar o reducir la extensión por la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11 :238). Además, puede ser deseable introducir un sitio de restricción nuevo en la región de la mutación para crear una detección basada en escisión (Gasparini y col. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se anticipa que en ciertas realizaciones la amplificación también puede realizarse usando Taq ligasa para amplificación (Barany (1991 ) Proc. Nati. Acad. Sci USA 88:189). En dichos casos, el ligamiento sucederá solo si hay una coincidencia perfecta en el extremo 3' de la secuencia 5' haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de amplificación. Los procedimientos descritos en este documento pueden realizarse, por ejemplo, utilizando kits de diagnóstico pre-empaquetados que comprenden al menos un ácido nucleico sonda o reactivo de anticuerpo descrito en este documento, que puede usarse de manera adecuada, por ejemplo, en entornos clínicos para diagnosticar pacientes que muestran síntomas o historial familiar de una enfermedad o dolencia que implica un gen que codifica un polipéptido mitoNEET. Además, puede utilizarse cualquier tipo celular o tejido, preferiblemente leucocitos sanguíneos periféricos, en los que se expresa el polipéptido mitoNEET, en los ensayos de pronóstico descritos en este documento. 3. Farmacogenómica Los agentes, o moduladores que tienen un efecto estimulador o inhibitorio en la actividad o expresión de un polipéptido mitoNEET identificados por un ensayo de exploración descrito en este documento, pueden administrarse a individuos para tratar (profiláctica o terapéuticamente) trastornos asociados con la actividad aberrante del polipéptido. Junto con dicho tratamiento, puede considerarse la farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo a un compuesto o fármaco extraño) del individuo. Las diferencias en los metabolismos de agentes terapéuticos pueden conducir a la toxicidad grave o fallo terapéutico por alteración de la relación entre la dosis y la concentración sanguínea del fármaco farmacológicamente activo. Por lo tanto, la farmacogenómica del individuo permite la selección de agentes eficaces (por ejemplo, fármacos) para tratamientos profilácticos o terapéuticos en base a una consideración del genotipo del individuo. Dicha farmacogenómica también puede usarse para determinar las dosificaciones apropiadas y los regímenes terapéuticos. Por consiguiente, la actividad de un polipéptido mitoNEET, la expresión de un ácido nucleico de la invención, o el contenido de mutación de un gen de la invención en un individuo puede determinarse para seleccionar de este modo el agente o agentes apropiados para el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo. La farmacogenómica se ocupa de variaciones hereditarias clínicamente significativas en respuesta a fármacos debido a la disposición del fármaco alterada y la acción anormal en personas afectadas. Véase, por ejemplo, Linder (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266. En general, pueden diferenciarse dos tipos de afecciones farmacogenéticas. Las afecciones genéticas transmitidas como factor único que altera el modo en el que funcionan los fármacos en el cuerpo se mencionan como "acción del fármaco alterada". Las afecciones genéticas transmitidas como factores únicos que alteran el modo en el que el cuerpo actúa sobre los fármacos se mencionan como "metabolismo del fármaco alterado". Estas afecciones farmacogenéticas pueden suceder como defectos raros o como polimorfismos. Por tanto, la actividad de un polipéptido mitoNEET, la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido, o el contenido de mutación de un gen que codifica el polipéptido en un individuo pueden determinarse para seleccionar de este modo el agente o agentes apropiados para el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo. Además, los estudios farmacogenéticos pueden usarse para aplicar la genotipificación de alelos polimórficos que codifican enzimas que metabolizan fármacos para la identificación de un fenotipo de sensibilidad a fármaco del individuo. Este conocimiento, cuando se aplica para la selección de dosificación o fármaco, puede evitar las reacciones adversas o el fallo terapéutico y potenciar de este modo la eficacia terapéutica o profiláctica cuando se trata un sujeto con un modulador de la actividad o expresión del polipéptido, tal como un modulador identificado por uno de los ensayos de exploración ejemplares descritos en este documento. 4. Control de los Efectos Durante los Ensayos Clínicos. Controlar la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos, compuestos) en la expresión o actividad de un polipéptido mitoNEET (por ejemplo, la capacidad de modular la proliferación y/o diferenciación aberrante de células) puede aplicarse no sólo en exploración de fármacos básicos, sino también en ensayos clínicos. Por ejemplo, la eficacia de un agente, determinado por un ensayo de exploración como se describe en este documento, para aumentar la expresión génica, niveles proteicos o actividad proteica, puede controlarse en ensayos clínicos de sujetos que muestran una expresión génica, niveles proteicos o actividad proteica disminuidos. Como alternativa, la eficacia de un agente, determinada por un ensayo de exploración, para disminuir la expresión génica, niveles proteicos, o actividad proteica, puede controlarse en ensayos clínicos de sujetos que muestran expresión génica, niveles proteicos o actividad proteica aumentados. En dichos ensayos clínicos, pueden usarse como marcadores la expresión o actividad de un polípéptido mitoNEET y, preferiblemente, las de otros polipéptidos que están implicados en el cáncer de próstata. Por ejemplo, y no como limitación, pueden identificarse los genes que incluyen los de la invención, que están modulados en células por tratamiento con un agente (por ejemplo, compuesto, fármaco o molécula pequeña) que modula la actividad o expresión de un polipéptido mitoNEET (por ejemplo, identificado en un ensayo de exploración descrito en este documento). Por tanto, para estudiar el efecto de agentes en el cáncer de próstata, por ejemplo, cáncer de próstata independiente de androgenos, por ejemplo, en un ensayo clínico, pueden aislarse células y prepararse ARN y analizarse respecto a los niveles de expresión de un gen de la invención y otros genes implicados en el trastorno. Los niveles de expresión génica (es decir, un patrón de expresión génica) puede cuantificarse por análisis de transferencia de Northern o RT-PCR, como se describe en este documento, o, como alternativa, midiendo la cantidad de proteína producida, por uno de los procedimientos descritos en este documento, o midiendo los niveles de actividad de un gen de la invención u otros genes. En este sentido, el patrón de expresión génica puede servir como marcador, indicativo de la respuesta fisiológica de las células al agente. Por consiguiente, este estado de respuesta puede determinarse antes, y en diversos puntos durante el tratamiento del individuo con el agente. En una realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para controlar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro fármaco candidato identificado por los ensayos de exploración descritos en este documento) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra de pre-administración de un sujeto antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel de polipéptido o ácido nucleico de la invención en la muestra de pre-administración (opcionalmente, en presencia y ausencia de un andrógeno); (iii) obtener una o más muestras de post-administración del sujeto; (¡v) detectar el nivel del polipéptido o ácido nucleico de la invención y las muestras de postadministración (opcionalmente, en presencia y ausencia de un andrógeno); (v) comparar el nivel (o capacidad de inducirse por andrógeno) del polipéptido o ácido nucleico de la invención en la muestra de pre-administración con el nivel del polipéptido o ácido nucleico de la invención en la muestra o muestras de post-administración; y (vi) alterar la administración del agente al sujeto de acuerdo con esto. Por ejemplo, la administración aumentada del agente puede ser deseable para reducir la expresión o actividad del polipéptido, es decir, para aumentar la eficacia del agente.

Transferencia del Ácido Nucleico Las técnicas de transferencia de ácidos nucleicos in vivo preferidas actualmente incluyen la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, lentivirus, virus del Herpes simplex I, o virus adenoasociados (AAV)) o vectores no virales y sistemas basados en lípidos (los lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son, por ejemplo, DOTMA, DOPE, y DC-Chol; véase, por ejemplo, Tonkinson y col., Cáncer Investigation, 1 M: 54-65 (1996)). Los vectores más preferidos para usar en terapia génica son virus, más preferiblemente adenovirus, AAV, lentivirus, o retrovirus. Un vector viral tal como un vector retroviral incluye al menos un promotor/potenciador transcripcional o elemento o elementos de definición de locus, u otros elementos que controlan la expresión génica por otros medios tales como corte y empalme alterno, exportación de ARN nuclear, o modificación post-traduccional del mensajero. Además, un vector viral tal como un vector retroviral incluye una molécula de ácido nucleico que, cuando se transcribe en presencia de un gen que codifica mitoNEET se une de manera operativa al mismo y funciona como una secuencia de iniciación de la traducción. Dichas construcciones de vector también incluyen una señal de empaquetamiento, repeticiones largas terminales (LTR) o porciones de las mimas, y sitios de unión al cebador en la cadena positiva y negativa apropiados para el virus usado (si no están ya presentes en el vector viral). Además, dicho vector típicamente incluye una secuencia de señal para la secreción de mitoNEET a partir de una célula huésped en la que se coloca.

Preferiblemente, la secuencia señal para este propósito es una secuencia señal de mamífero, más preferiblemente, la secuencia señal nativa para mitoNEET. Opcionalmente, la construcción del vector también puede incluir una señal que dirige la poliadenilación, así como uno o más sitios de restricción y una secuencia de terminación de la traducción. A modo de ejemplo, dichos vectores incluirán típicamente un 5 -LTR, un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un origen de síntesis de ADN de cadena secundaria, y un YLTR o una porción del mismo. Pueden usarse otros vectores que son no virales, tales como lípidos catiónicos, polilisina y dendrímeros. En algunas situaciones, es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que dirige las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, pueden usarse, para fijar como objetivo y/o facilitar la captación, proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis, por ejemplo, proteínas de cápsida o fragmentos de las mismas trópicas para un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que experimentan la internalización en la delación, y proteínas que dirigen la localización intracelular y potencian la semivida intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu y col., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); y Wagner y col, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). Para un análisis de los protocolos de terapia génica y mareaje de genes conocidos actualmente, véase, Anderson y col., Science, 256:808-813 (1992). Véase también el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en el mismo. La terapia génica apropiada y los procedimientos para hacer partículas retrovirales y proteínas estructurales puede encontrarse en, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5,681,746.

Administración Terapéutica La dosis terapéuticamente eficaz de mitoNEET o moduladores del mismo variará, por supuesto, dependiendo de factores tales como la afección patológica a tratar (incluyendo prevención), el procedimiento de administración, el tipo de compuesto a usar para el tratamiento, cualquier co-terapia implicada, la edad, peso, condición médica general, historial médico del paciente, etc., y su determinación está dentro de la especialidad de un médico practicante. Por consiguiente, será necesario para el terapeuta determinar la dosificación y modificar la vía de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico máximo. Si mitoNEET tiene un rango de huésped estrecho para el tratamiento de pacientes humanos, se prefieren formulaciones que comprenden mitoNEET humano, la secuencia nativa de mitoNEET humano. El clínico administrará mitoNEET hasta que se alcance una dosificación que consigue el efecto deseado para el tratamiento de la afección en cuestión. Por ejemplo, si el objetivo era el tratamiento de CHF, la cantidad sería una que inhiba la hipertrofia cardiaca progresiva asociada con esta afección. El progreso de esta terapia se controla fácilmente por ecocardiog rafia. De manera similar, en pacientes con cardiomiopatía hipertrófica, puede administrarse mitoNEET en una base empírica.

Terapias de Combinación La eficacia de mitoNEET o moduladores del mismo en la prevención o tratamiento del trastorno en cuestión puede mejorarse administrando el agente activo de manera seriada o en combinación con otro agente que es eficaz para esos propósitos, en la misma composición o en composiciones separadas. Por ejemplo, para el tratamiento de diabetes o síndromes de resistencia a insulina (por ejemplo, síndrome X), los compuestos/agentes pueden combinarse con moduladores PPARy, metformina, sulfonilureas u otros moduladores de secreción de insulina, inhibidores de a-glucosidasa, y/o insulina. La combinación con otros agentes de disminución de lípidos, especialmente atorvastatina y agentes similares proporcionará un beneficio aumentado. También se prevé la combinación con terapias de pérdida de peso. Para el tratamiento de hipertrofia cardiaca puede, combinarse la terapia con mitoNEET con la administración de inhibidores de factores de la hipertrofia de miocitos cardíacos conocidos, por ejemplo, inhibidores de agonistas cc-adrenérgicos tales como fenilefrina; inhibidores de endotelina-1 tales como BOSENTAN™ y MOXONODIN™; inhibidores de CT-I (Patente de Estados Unidos N° 5,679,545); inhibidores de LIF; inhibidores de ACE; inhibidores de des-aspartato angiotensina I (Patente de Estados Unidos N° 5,773,415), e inhibidores de angiotensina II. Para el tratamiento de hipertrofia cardiaca asociada con hipertensión, puede administrarse mitoNEET en combinación con agentes de bloqueo del receptor P-adrenérgico, por ejemplo, propranolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, o carvedilol; inhibidores de ACE, por ejemplo, quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril, o lisinopril; diuréticos, por ejemplo, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, metilclotiazida, benztiazida, diclorfenamida, acetazolamida, o indapamida; y/o bloqueantes de canales de calcio, por ejemplo, diltiazem, nifedipina, verapamil, o nicardipina. Para el tratamiento de hipertensión, la combinación con otros agentes, especialmente diuréticos proporcionará un beneficio aumentado. Las composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes terapéuticos identificados en este documento por sus nombres genéricos están disponibles en el mercado y son para administrar siguiendo las instrucciones del fabricante para la dosificación, administración, efectos adversos, contraindicaciones, etc. Véase, por ejemplo, Physician's Desk Reference (Medical Economics Data Production Co.: Montvale, N.J., 1997), 51a Edición. Los candidatos preferidos para terapia de combinación en el tratamiento de cardiomiopatía hipertrófica son fármacos de bloqueo P-adrenérgicos (por ejemplo, propranolol, timolol, tertalolol, carteolol, nadolol, betaxolol, penbutolol, acetobutolol, atenolol, metoprolol, o carvedilol), verapamil, difedipina, o diltiazem. El tratamiento de la hipertrofia asociada con alta presión sanguínea puede requerir el uso de terapia de fármacos antihipertensivos, usando bloqueantes del canal de calcio, por ejemplo, diltiazem, nifedipina, verapamil, o nicardipina; agentes bloqueantes P-adrenérgicos; diuréticos, por ejemplo, clorotiazida, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, metilclotiazida, benztiazida, diclorfenamida, acetazolamida, o indapamida; y/o inhibidores de ACE, por ejemplo, quinapril, captopril, enalapril, ramipril, benazepril, fosinopril, o lisinopril. Para otras indicaciones, puede combinarse mitoNEET o moduladores con otros agentes beneficiosos para el tratamiento del defecto óseo y/o de cartílago, heridas, o tejidos en cuestión. Estos agentes incluyen diversos factores de crecimiento tales como EGF, PDGF, TGF- o TGF-, IGF, FGF, y CTGF. Además, mitoNEET o sus moduladores usados para tratar el cáncer pueden combinarse con agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o inhibidores del crecimiento como se ha definido anteriormente. Además, para el tratamiento del cáncer, mitoNEET o un antagonista del mismo se administra apropiadamente de manera seriada o en combinación con tratamientos radiológicos, que impliquen irradiación o administración de sustancias radiactivas. Las cantidades eficaces de los agentes terapéuticos administrados en combinación con mitoNEET o moduladores del mismo serán a la discreción del médico o veterinario. La administración de la dosificación y el ajuste se hace para conseguir el tratamiento máximo de las afecciones a tratar. Por ejemplo, para tratar la hipertensión, estas cantidades tienen en cuenta, en el mejor de los casos, el uso de diuréticos o digital, y afecciones tales como hiper o hipotensión, deterioro renal, etc. La dosis dependerá adicionalmente de factores tales como el tipo del agente terapéutico a usar y el paciente específico a tratar. Típicamente, la cantidad empleada será la misma dosis que la usada si el agente terapéutico dado se administra sin polipéptido PA. Para el tratamiento de carcinoma de mama, puede administrarse mitoNEET o moduladores en combinación con, aunque sin limitación, Trastuzumab (Herceptin) con quimioterapia, paclitaxel, docetaxel, epirrubicina, mitoxantrona, topotecan, capecitabina, vinorelbina, tiotepa, vincristina, vinblastina, carboplatino o cisplatino, plicamicina, anastrozol, letrozol, exemestano, toremifeno, o progestinas. Para el tratamiento de leucemia linfocítica aguda, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación doxorrubicina, citarabina, ciclofosfamida, etopósido, tenipósido, alopurinol, o transplantes de médula ósea autólogos. Para el tratamiento de leucemia mielomonocítica y mielocítica aguda, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, gemtuzumab ozogamicina ( ylotarg), mitoxantrona, idarrubicina, etopósido, mercaptopurína, tioguanina, azacitidina, amsacrina, metotrexato, doxorrubicina, tretinoína, alopurinol, leucaferesis, prednisona, o trióxido arsénico para leucemia promielocítica aguda. Para el tratamiento de leucemia mielocítica crónica, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, busulfan, mercaptopurina, tioguanina, citarabina, plicamicina, melfalan, transplante de médula ósea autólogo, o alopurinol. Para el tratamiento de leucemia linfocítica crónica, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, vincristina, ciclofosfamida, doxorrubicina, cladribina (2-clorodesoxiadenosina; CdA); transplante de médula ósea alogénica, andrógenos o alopurinol. Para el tratamiento de mieloma múltiple, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, etopósido, citarabina, interferón alfa, dexametasona, o transplante de médula ósea autólogo. Para el tratamiento de carcinoma del pulmón (célula pequeña y célula no pequeña), puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, etopósido, mitomicina, ifosfamida, paclitaxel, irinotecan, o terapia de radiación. Para el tratamiento de carcinoma del colon y el recto, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, capecitabina, metotrexato, mitomicina, carmustina, cisplatino, irinotecan, o floxuridina. Para el tratamiento de carcinoma del riñon, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, interferón alfa, progestinas, FUDR de infusión, o fluorouracilo. Para el tratamiento de carcinoma de la próstata, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, cetoconazol, doxorrubicina, aminoglutetimida, progestinas, ciclofosfamidas, cisplatino, vinblastina, etopósido, suramin, PC-SPES, o estramustina fosfato. Para el tratamiento de melanoma, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, carmustina, lomustina, melfalan, tiotepa, cisplatino, paclitaxel, tamoxifen, o vincristina. Para el tratamiento de carcinoma del ovario, puede administrarse mitoNEET o sus moduladores en combinación con, aunque sin limitación, docetaxel, doxorrubicina, topotecan, ciclofosfamida, doxorrubicina, etopósido, o doxorrubicina liposomal. El entrecruzamiento de mitocondrias de hígado de rata en bruto recientemente preparadas o, fracciones (B3/B4) mitocondriales de cerebro bovino almacenadas, congeladas, con 125l-4-azido-A/-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzamida dio como resultado el mareaje del mitoNEET. Para estos estudios de competición con (ácido [6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1,3-tiazolid¡ni-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acético) se usó para mostrar la especificidad de la unión. Como se muestra en las Figuras 1A - 1B, la banda específicamente entrecruzada marcada por la flecha (mitoNEET), se solubilizó con Tritón X 114 al 1 % dando también como resultado un enriquecimiento parcial con respecto a la proteína total. El enriquecimiento adicional y la concentración de mitoNEET se consiguió precipitando la proteína entrecruzada solubilizada con sulfato amónico 0.75 M (AS). Esta fue la concentración óptima de sulfato amónico que permitió la precipitación de la proteína manteniendo el Tritón en solución. La concentración y la retirada de Tritón X 114 fue esencial para la separación óptima por HPLC. El mitoNEET concentrado se separó por HPLC. Se obtuvieron resultados idénticos de las muestras recién preparadas de mitocondrias de hígado de rata o de fracciones mitocondriales de cerebro bovino sugiriendo que estaba implicada una proteína diana similar. Se muestra un patrón representativo de la separación por HPLC en las Figuras 2A - 2D. La identificación del pico radiactivo se simplificó por el detector radiométrico en línea. El pico de mitoNEET eluyó a aproximadamente 30 minutos en estas condiciones a aproximadamente Acetonitrilo al 55%. Las realizaciones paralelas con muestras de incubaciones de entrecruzamiento que contenían el competidor (ácido [6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acético) carecían de este pico (no mostrado). SDS-PAGE junto con autorradiografía demostró que este procedimiento proporciona una purificación excelente de la proteína específicamente entrecruzada con 4-azido-A/-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzamida (Figuras 2A - 2D). La proteína mitoNEET entrecruzada también se concentró en alto rendimiento por un procedimiento de elución con agua a partir de geles no fijados, no teñidos. Para este enfoque, se entrecruzaron 80 tubos individuales con o sin (ácido [6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-iljacético), se solubilizaron con Tritón X 114, se concentraron por precipitación con sulfato amónico, y después se sometieron a SDS-PAGE en geles de Tris Glicina al 18% que no se fijaron o tiñeron. Las bandas de interés se marcaron y se cortaron como se describe en la sección de Procedimientos. Las Figuras 3A - 3B muestra un autorradiograma representativo de un gel representativo antes y después de que se cortara la banda de interés para elución con agua del mitoNEET. La re-exposición de estos geles confirmó que el centro de la banda apropiada se había escindido. Este procedimiento produjo el mayor rendimiento de proteína mitoNEET entrecruzada. Se aclaró el mitoNEET purificado de geles Tris Glicina al 18% no teñidos, no fijados y se procesó para la identificación proteómica. Las preparaciones tanto de las fracciones mitocondriales de hígado de rata como de las mitocondriales bovinas identificaron la misma proteína con una anotación "similar a la proteína MDS029 de células progenitoras/troncales hematopoyétlcas" (Figura 4). La secuencia predicha tanto para las proteínas humanas como de ratón son casi idénticas. Se confirmó la identificación por secuenciación del extremo N-terminal. La secuenciación de la proteína intacta no fue exitosa, sugiriendo que el extremo N-terminal podría estar bloqueado. En digestión en gel con CNBr generó un fragmento entrecruzado de 6 kDa (Figuras 5A - 5C). Los datos de secuencia parcial se obtuvieron de este fragmento manteniendo la identificación por S/MS de la proteína marcada. La secuencia completa predicha bovina, humana, y murina para la proteína identificada se muestra en las Figuras 6A -6C. Las tres secuencias están bien conservadas y son idénticas en la porción que abarca la región de no membrana que contiene el fragmento CNBr que contiene el agente entrecruzante 4-azido-A/-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-d¡oxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzamida. Después se trató de generar anticuerpos contra la proteína preparando péptidos sintéticos. Se seleccionaron tres péptidos de la región que abarca región no membrana predicha y se sintetizaron. Estos se llamaron, en orden desde el extremo N-terminal, "A", "B", y "C" (Figura 6A). Los péptidos se conjugaron y se inyectaron en dos conejos cada uno. En un principio se tituló el suero de cada una de las muestras sanguíneas por transferencias por puntos de los péptidos respectivos. Los sueros de ambos conejos inmunizados con los péptidos "A" y "B" reconocieron los péptidos respectivos. No se encontró reactividad en los conejos inmunizados con el péptido "C". El título más alto (>30,000) se obtuvo en el suero de conejo N° 470 inmunizado con péptido B. No hubo reactividad cruzada de ningún suero con otros péptidos en las transferencias por puntos y no hubo reactividad con ninguno de los sueros preinmunes en diluciones tan bajas como 1 :100 (datos no mostrados). Los antisueros generados frente al péptido A y el péptido B reconocieron el mitoNEET en transferencias de Western, sin embargo, la reactividad mayor fue con el suero generado de conejos inmunizados con péptido B. Las Figuras 7A - 7D muestran una transferencia de Western de reacciones de entrecruzamiento usando fracciones mitocondriales en bruto de cerebro, hígado y músculo esquelético de rata. El anticuerpo reconoció una banda proteica del mismo tamaño que la banda específicamente entrecruzada en cada tejido. El grado de tinción fue proporcional a la intensidad del 125l-4-azido-N-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzamida entrecruzado en estas muestras. Para determinar si la localización subcelular de la banda reconocida en estas transferencias de Western era igual que la de la proteína entrecruzada, se realizaron entrecruzamientos y transferencias de Western en fracciones purificadas por densidad de sacarosa de cerebro bovino. Los estudios previos habían sugerido que las bandas 3 y 4 de densidad de sacarosa estaban enriquecidas para el marcador mitocondrial succinato citocromo C reductasa. Como se esperaba de los resultados previos, la banda entrecruzada estaba enriquecida en estas fracciones mitocondriales (Figuras 8A - 8H). Después de SDS-PAGE, se tiñeron geles representativos para estas muestras para la proteína total (Figuras 8A y 8B) o se transfirieron a membranas para transferencias de Western usando una proteína mitocondirial conocida preinmune (figuras 8C y 8F), anti-péptido B (figuras 8D y 8G), o prohibitina (figuras 8E y 8H). La tinción de prohibitina y mitoNEET estuvo en las mismas fracciones y la tinción de mitoNEET estaba superpuesta por el entrecruzamiento específico de tiazolidindiona (TZD). Los experimentos resumidos en las Figuras 1A hasta 6C muestran la identificación de una nueva diana para tiazolidindionas de sensibilización a insulina (TZD). Los estudios resumidos en las Figuras 7A -7D y 8A - 8H confirman la existencia de esta diana en fracciones mitocondriales. Los estudios resumidos en las Figuras 9 y 10 sugieren que la función de la nueva diana es regular la oxidación de ácidos grasos de cadena larga. El experimento resumido en las Figuras 11 A — 11 D mantiene la opinión de que mitoNEET está implicado en la regulación del metabolismo lipídico. Estos estudios forman la base y soporte de la invención, que incluye el uso de esta nueva diana para encontrar agentes terapéuticos nuevos para tratar enfermedades que se resumen en este documento. Todas las referencias, patentes o solicitudes citadas en este documento se incorporan como referencia en su totalidad como si estuvieran escritas en este documento. La presente invención se ilustrará adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos, que sin embargo, no se deben interpretar como limitantes del alcance de la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis v vodación de 4-azido-A/-f2-({r6-(2- 4-r(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5 il metinfenoxi>etil)piridln-3-¡nacetil>amino)etil1-2-h¡droxibenzamida El compuesto del título se sintetizó por acoplamiento de análogo de ácido carboxílico de pioglitazona, (ácido[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 tiazol¡d¡n-5-¡l)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acético), a una etilamina que contiene un grupo p-azido-bencilo. Se yodó el compuesto purificado, libre de vehículo, con la fase sólida lodogen y el producto yodado se purificó y se almacenó en la oscuridad.

EJEMPLO 2 Se recogieron mitocondrias de cerebro bovino a partir de cerebros bovinos. Este procedimiento implicó la disección de cerebros de novillo recién obtenidos de un matadero local. Los cerebros aclarados se homogenizaron en tampón de fraccionamiento (sacarosa 250 mM, Tris 50 mM, pH=8, que contenía 1 µg/m\ de pepstatina A, 5 µ?/??? de leupeptina, 10 µg/ml de bacitracina, y PMSF 0.1 mM). Después de la retirada de los núcleos a 5000 rpm en un Beckman Ti50, el sedimento mitocondrial se recogió a 20,000 x g (12,500 rpm en un rotor Beckman ??50) y después se enriqueció por centrifugación por densidad de sacarosa. Las fracciones de membrana se recogieron de la parte superior de las bandas de densidad 1.18 y 1.20, se resuspendieron en Tris 50 mM, y se recogieron por centrifugación. Las fracciones ("B3/B4") se almacenaron a -80°C hasta su uso, EJEMPLO 3 Se prepararon fracciones enriquecidas de mitocondrias de hígado, músculo esquelético, y cerebro de rata en bruto del siguiente modo. Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley y se retiraron el músculo de la pata posterior, el hígado, y todo el cerebro a MLB frío (sacarosa 225 mM, K2HP04 6 mM, MgCI2 5 mM, KCI 20 mM, EDTA EGTA 2 mM, pH=7.4. Los tejidos se picaron, aclararon, y se homogenizaron con un polytron (ajuste 7; 3 x 15 segundos) en 5 volúmenes de MLB. Después de la retirada de las células no rotas y los núcleos (750 x g), se recogió la fracción enriquecida mitocondrial a 15,800 x g durante 5 minutos. El sedimento suelto se desechó y el sedimento central denso se resuspendió en MLB y se volvió a recoger a 1 1 ,800 x g durante 10 minutos. Los sedimentos finales se resuspendieron en Tris 50 mM (pH=8) a 5-8 mg/ml de proteína total y se congelaron a -80°C hasta su uso.

EJEMPLO 4 Las reacciones de entrecruzamiento se realizaron en un volumen final de 200 µ?, que contenía 100 µ? de membranas, 50 µ? de DMSO al 4% con o sin tiazolidindiona competitiva (habitualmente (ácido[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acético) 100 µ?, concentración final 25 µ?), y 50 µ? de 25l-4-azido-/V-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazol¡din-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzam¡da libre de vehículo (0.1-0.2 µ??/^?). Se secó una cantidad apropiada de 25l-4-azido-/V-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzamida en acetonitrilo en oscuridad y al vacío inmediatamente antes de usar. Las reacciones se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y se pararon por exposición a luz UV en tubos abiertos (a 180,000 julios en un Stratalinker). Las muestras entrecruzadas después se aclararon con Tris 50 mM (pH=8.0) después de centrifugación en una microfuga TOMY a 15,000 x g durante 5 minutos. Los sedimentos aclarados se resuspendieron en 100 µ? de Tris 50 mM. La solubilización selectiva óptima del mitoNEET selectivamente entrecruzado se obtuvo llevando el sedimento resuspendido a Tritón X 114 al 1%. Después de balanceo a temperatura ambiente durante 5 minutos, la mayor parte del mitoNEET entrecruzado permaneció en el sobrenadante después de centrifugación a 18,000 x g durante 15 minutos. El mitoNEET entrecruzado también permaneció en el sobrenadante después de centrifugación a 450.000 X g en un TLA 100 durante 30 minutos. Esto retiró la mayoría de las proteínas contaminantes. Se retiró Tritón X 114 de la muestra por precipitación con sulfato amónico. La adición de volúmenes iguales de sulfato amónico 1.5 M a la solución de Tritón X 114 desaló las proteínas dejando el detergente en solución. En esta escala, la repetición de este procedimiento 3 veces maximizó el rendimiento de proteína precipitada. Es necesario tener especial cuidado para asegurar que el precipitado proteico no flote en el sobrenadante que contiene Tritón. La proteína precipitada se concentró para la separación directa en geles SDS-PAGE (Tris Glicina al 10-20% o 18%) o para HPLC. La maquinaria de HPLC constaba de una bomba cuaternaria Agilent 1100 serie con degasificador, tomador de muestras automático, y detector de serie de diodo de exploración UV. El detector en línea Gamma era un detector Packard Flow-one ß RAM serie A-500 equipado con una célula de flujo Gamma-C. El programa y los datos se controlaron a través de un PC Gateway E-3100 bajo NT 4.0. Se recogieron datos del espectro UV completo con el módulo Agilent HPLC Chemstation Spectral SW y se procesaron con el programa Agilent Chemstation (rev. a.09.01). Se controló la absorción de UV a 214 nm, que corresponde al máximo de absorción del enlace peptídico. La célula de flujo radiomático era un Gamma-C (volumen de 125 µ?). La célula no requiere líquido de centelleo, por tanto podría recogerse el efluente de HPLC completo. La separación más útil sucede usando una columna de 250 mm de longitud, 5 µ x 4.6 mm de DI, de 80 Á de Tamaño de Poro, de Fase Inversa encapuchada en el extremo Phenomenex Synergi max-RP C12 TMS. La columna auxiliar era un Cartucho RP-1 SecurityGuard (Phenomenex), 4 x 2.0 mm. La selección de la columna y las columnas auxiliares se hizo después de un examen considerable de columnas de proteína convencionales, que no dieron rendimiento apreciable de la proteína diana. Las muestras se eluyeron con un gradiente de elución programado comenzando con solución A al 70% (agua/TFA al 0.05% v/v) y B al 30% (ACN/TFA al 0.05% v/v). El gradiente se mantuvo a B al 30% durante los primeros 15 minutos; después se aumentó B del 30% al 55% durante 30 minutos y después se aumentó al 80% en 15 minutos. Al final de la realización, las condiciones iniciales se restablecieron en un tiempo posterior de 5 minutos de re-ecualización. Los caudales se fijaron a 1 ml/min durante todo el experimento. Se recogieron las fracciones en un Gilson modelo 203 en tubos cónicos de 1.5 mi a 1 ml/tubo, se secaron y se resuspendieron en tampón de muestra Tris Glicina reductor. Las fracciones se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida Tris Glicina al 8% (Invitrogen). En algunos casos los geles se fijaron y se tiñeron con plata; en otros se secaron los geles no fijados no teñidos para maximizar la recuperación de proteínas del gel. La banda de interés se localizó por superposición del autorradiograma. Las proteínas específicamente entrecruzadas se escindieron de los geles de electroforesis.

EJEMPLO 5 Para identificar la proteína entrecruzada aislada, las proteínas entrecruzadas escindidas se redujeron, se alquilaron, y se digirieron in-situ con tripsina porcina modificada (Promega) usando un robot DigestPro (ABIMED). Brevemente, las manchas del gel de proteína se colocaron en viales de reacción y se aseguraron en un bloque de calentamiento/reacción Peltier. Los tubos de recolección de péptidos se prepararon retirando los tapones de microviales de 600 µ? (BioRad) y se colocaron en una rejilla de recolección. Los péptidos digeridos se extrajeron con acetonitrilo al 60%/ácido fórmico al 5%. Los extractos peptídicos se colocaron en una centrífuga Speed-VAC hasta sequedad y se reconstituyeron en 10 µ? de ácido fórmico al 5% en agua. El análisis de espectrometría de masas en tándem NanoLC (nanoLC-MS/MS) se realizó en un instrumento Micromass Qtof ultima acoplado a un Micromass CapLC. Típicamente se inyectaron 5 µ? de una cantidad de muestra total de 5.5 µ? y se pre-concentraron utilizando cambio de columna. Se usó una bomba auxiliar para pre-concentrar y desalar las muestras en una precolumna C18 Pepmap™ (0.3 x 5 mm) suministrando ácido fórmico al 0.1% a 20 µ?/minuto. Después de desalar, la precolumna se cambió en línea con la columna analítica (C18 Pepmap, LC Packings, 75 µ/? de DI) y se eluyó a 300 nl/min con un gradiente de ácido fórmico al 0.1 % en agua y ácido fórmico al 0.1 % que contenía acetonitrilo al 90%, directamente en el Qtof. Se obtuvieron los datos de MS en tándem y se procesaron por el programa Micromass MassLyxn. Los datos de Nanospray MS/MS se usaron para identificar proteínas comparando los datos experimentales con los datos predichos obtenidos de las bases de datos de proteína y ADN. Los datos de MS en tándem se buscaron frente a la base de datos de proteína NCBInr usando programas MASCOT (Matrix Science) mantenidos en el servidor SAM Chemistry MS lab NT.

EJEMPLO 6 Para optimizar la cantidad de material en los geles finales usados para la identificación de proteína y para confirmar la identificación, se marcaron hasta 80 carriles de reacciones individuales y se cortaron las bandas del gel. Se desarrolló un procedimiento para eluir el mitoNEET de estos carriles con el uso de rehidratación y secado. La banda de autorradiograma de 17-kDa se orientó sobre los geles secos y se marcó en cuanto a la posición usando una aguja de calibre 20 en las esquinas superior e inferior de la imagen 125l. Las bandas se cortaron y los cortes de gel seco se rehidrataron con una gota de H20. El mitoNEET "eluido en agua" se concentró y se purificó adicionalmente en SDS-PAGE antes de la identificación MS/MS o se usó para la generación de fragmentos CnBr. Las bandas de proteína de interés se cortaron otra vez con una hoja de escalpelo y los cortes de gel secos se rehidrataron con una gota de H20. La digestión con CnBr se consiguió por incubación con 500 µ? de CnBr 40 mM (Sigma) preparado en ácido fórmico al 70%. Después de una digestión durante una noche a temperatura ambiente, los cortes de gel se llevaron a sequedad en un Concentrador Speed Vac (Savant), se rehidrataron con 500 µ? de agua y se secaron otra vez. Los cortes de gel después se rehidrataron en 200 µ? de H2O y los fragmentos CnBr se liberaron por elución con agua. No sucedió recuperación adicional por electroelución de estos geles. Las muestras se concentraron finalmente y se corrieron en geles de Tris-glicina al 18% (Invitrogen). Después de electroforesis, los geles se transfirieron a Immobilon-Psq (Millipore). Las transferencias se tiñeron con Coomassie R-250 al 0.1 %, se destiñeron y se secaron al aire. Las transferencias se expusieron a una película Biomax MS a -80°C, que identificó un fragmento de 6-kDa que se sometió a secuenciación amino-terminal. La secuenciación amino-terminal se realizó por degradación automatizada de Edman en un secuenciador de proteína Procise cLC Applied Biosystems modelo 492.

EJEMPLO 7 La generación de anticuerpos para confirmar la identificación de mitoNEET implicó primero la identificación de péptidos apropiados para provocar anticuerpos frente a ellos. La proteína identificada como entrecruzante con 4-azido-A/-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridin-3-il]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzamida se evaluó usando una serie de programas informáticos desarrollados dentro de la empresa por F. J. Kezdy y R. A. Poorman. Las regiones de hélice anfifílica de una proteína es muy probable que sean sitios antigénicos. El programa clave examina la proteína para patrones de hélice alfa anfifílica. Estas secuencias después se examinan por los programas de conformación predictivos Cho-Fasman y Robson para ver si de hecho la hélice anfifílica potencial tiene alguna probabilidad de existir en la conformación proteica. Cuando los tres programas están de acuerdo, la secuencia tiene alta probabilidad de producir anticuerpos anti-péptido que reaccionan de manera cruzada con la diana proteica. Se eligieron tres péptidos y se sintetizaron en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 433A. El grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) se usó como el grupo protector del amino N". Cada resto se acopló de manera individual usando un protocolo HBTU/NMP. Después de la retirada del grupo Fmoc N-terminal, se retiraron los grupos protectores de cadena lateral temporales y se escindieron los péptidos de sus resinas por tratamiento con TFA al 95%/eliminadores al 5% (sulfuro de etilmetilo/anisol/1,2-etanoditiol, 1 :3:1) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los péptidos en bruto se precipitaron de las soluciones de escisión con éter dietílico frío, se filtraron, se disolvieron en ácido acético diluido, se evaporaron a sequedad a presión reducida y los restos se redisolvieron y se liofilizaron del agua. Los péptidos en bruto se disolvieron en agua, se filtraron, y se cargaron en una columna de fase inversa preparativa (Vydac C-18, 22 x 250 mm, 10 micrómetros) a 4 ml/minuto de A al 100% (A: TFA al 0.1 % en agua, B: TFA al 0.07% en acetonitrilo). El gradiente usado fue B de 0-10%, 10 minutos, después B de10-50%, 200 minutos. El efluente de la columna se controló por absorbancia a 220 nm y 280 nm. Las fracciones se controlaron en un sistema de fase inversa analítico (Vydac C-18, 4.6 x 250 mm, 5 micrómetros), los disolventes y las longitudes de onda son como los anteriores, con un gradiente lineal de B de 0-70% en 20 minutos a 1.0 ml/min. Se combinaron las fracciones, se evaporó el acetonitrilo a presión reducida, y se liofilizaron las soluciones acuosas. Los péptidos se caracterizaron por espectrometría de masas por electronebulización de acceso abierto. Los péptidos A, B y C (Figuras 6A - 6C) se conjugaron con hemocianina de lapa de bocallave y se inmunizaron conejos por Productos Convance Research (Denver, Pa.). Se inmunizaron dos conejos cada uno en un protocolo de tres inyecciones para cada péptido. En cada caso, se ensayó el suero frente a una curva de dosis concentración moteada (0.01-10 µg) frente a todos los péptidos. Se obtuvieron reacciones positivas a partir de la primera muestra sanguínea en adelante para los péptidos A y B. El péptido C no provocó una respuesta inmune. Los antisueros para A o B no reaccionaron de manera cruzada con ninguno de los otros péptidos. El análisis de Western con estos antisueros se dirigió del siguiente modo. Las muestras proteicas se desnaturalizaron por calor en tampón de muestra reductor y se cargaron en geles SDS/PAGE Tris-glicina al 18%. Después de electroforesis, los geles se electrotransfirieron a membranas PVDF. Las membranas transferidas se bloquearon en TBS, pH 8.0, que contenía leche seca al 5%, Tween-20 al 0.05% y azida sódica al 0.02% durante 2 horas a temperatura ambiente. Se incubó una dilución 1 :30.000 (como se determina por titulación de las bandas de transferencia de ensayo) de suero de péptido B de conejo anti-mitoNEET con membranas bloqueadas durante una noche a 4°C. Las bandas de transferencia control se incubaron con una dilución 1:30,000 de suero preinmunizado obtenido del mismo conejo. Adicionalmente, las bandas de transferencia control se prepararon para la determinación de niveles de prohibitina, un marcador proteico mitocondrial, usando una dilución 1 :400 de anticuerpo de conejo anti-prohibitina (Research Diagnostics Inc.). Después de incubación con el antisuero primario, se lavaron las membranas 6 X 5 minutos con TBS que contenía Tween-20 al 0.05%. Después las membranas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con una dilución 1 :50.000 de IgG monoclonal anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina (Sigma n° A2556) en TBS que contenía leche seca al 5%. Las membranas después se lavaron 3 X 0 minutos en TBS y las bandas inmunorreactivas se identificaron con Sustrato Líquido Azul BCIP/NBT (Sigma n° B-3804). Las bandas de transferencia reveladas se secaron a temperatura ambiente y se expusieron a una película de autorradiografía Biomax MS para determinar el alineamiento correcto de las bandas de proteína inmunorreactiva con la banda radiactiva específicamente entrecruzada. Las Figuras 7A - 7D y 8A - 8H muestran la localización de mitoNEET en las transferencias de Western que corresponden a la proteína específicamente entrecruzada por 125l-4-azido-N-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)piridir^ 3-il]acetil}amino)etil]-2-hidrox¡benzamida.

EJEMPLO 8 El mitoNEET de longitud completa sintetizado como en el Ejemplo 6 se amplió para contener una biotina N-terminal. La unión de mitoNEET a perlas de estreptavidina dio como resultado la asociación selectiva de varias proteínas solubilizadas a partir de fuentes mitocondriales (Figura 9). Se han identificado varias de estas proteínas y se sabe que están implicadas en la oxidación de ácidos grasos. La adición de mitoNEET sintético en exceso a las preparaciones mitocondriales solubilizadas inhibe la oxidación de ácidos grasos (Figura 10). La modulación de la función de mitoNEET podría esperarse que aumentara la oxidación de ácidos grasos. Dicho enfoque para encontrar moduladores útiles como se describe en este documento puede tomarse con péptido sintético o membranas que contienen mitoNEET endógeno o sobreexpresado. Habiendo descrito la invención como antecede, se declara como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS < 10> Pharmacia Corporation Coica, Jerry <120> POLIPEPTIDO MitoNEET DE MEMBRANAS MITOCONDRIALES, MODULADORES DEL MISMO Y PROCEDIMIENTOS PARA USAR EL MISMO. <130>01012/1/PCT <150> 60/431.520 <151 > 2002-11-06 <160>9 <170> Patent In versión 3.2 <210> 1 <211>655 <212>ADN <213>Bos taurus <400> 1 ccacgcgtcc ggcgcgagcc ggtttgtgct cactgtcctg tgcacaccct tgcaagcatc 60 ggcgccatga gtatgacttc cagcgtacga gttgaatgga tcgcagctgt taccattgct 120 gctggaacag ctgcaattgg ttatctagct tacaaaagat tttatgttaa agatcatcgc 180 aacaaatcta tggtaaaccc tcacatccag aaagataacc ccaaggtagt acatgctttt 240 gatatggagg atttgggaga taaagctgtg tactgccgtt gttggaggtc caaaaagttc 300 ccactatgtg atggatctca cacaaaacac aatgaagaaa ctggagacaa cgtgggacct 360 ctgatcatta agaaaaaaga cacttaaatg gacagttttg atgctgcaaa ccaacttgtc 420 atgatgtttc ctgattgctt aattagaatg actaccactt ccgtctaatt cacctgccct 480 gggttctaga tgtgtggtaa actatagctt tcacattcac ggcatttgcc ttacacgtgg 540 aaccattgtg gtgcacatct gttgaaacaa ggaaaaacaa aaaaccaatc tcatggcctg 600 tgggttattt tggtctctta aggatctgtt tctttacatt taaaactgac attag 655 <210>2 <211>636 <212>ADN <2 3>Homo sapiens <400> 2 gatcgcggag tcggtgcttt agtacgccgc tggcaccttt actctcgccg gccgcgcgaa 60 cccgtttgag ctcggtatcc tagtgcacac gcctttgcaa gcgacggcgc catgagtctg 120 acttccagtt ccagcgtacg agttgaatgg atcgcagcag ttaccattgc tgctgggaca 180 gctgcaattg gttatctagc ttacaaaaga ttttatgtta aagatcatcg aaataaagct 240 atgataaacc ttcacatcca gaaagacaac cccaagatag tacatgcttt tgacatggag 300 gatttgggag ataaagctgt gtactgccgt tgttggaggt ccaaaaagtt cccattctgt 360 gatggggctc acacaaaaca taacgaagag actggagaca atgtgggccc tctgatcatc 420 aagaaaaaag aaacttaaat ggacactttt gatgctgcaa atcagcttgt cgtgaagtta 480 cctgattgtt taattagaat gactaccacc tctgtctgat tcaccttcgc tggattctaa 540 atgtggtata ttgcaaactg cagctttcac atttatggca tttgtcttgt tgaaacatcg 600 tggtgcacat ttgtt aaac aaaaaaaaaa aaaaaa 636 <210>3 <2 1>792 <212>ADN <213> Mus musculus <400>3 cccacgcgtc cgcttgccgc ggcgcctgcg cagtggcagt gagtgggccc cgaggtcgcg 60 tcttgccoaa gtctccgcgg tccccagcgc tcgctcgcgc ggtcctgcca cggccttcct 120 gctgcccgcg ccatgggcct cagctccaac tccgctgtgc gagttgagtg gatcgcggcc • 180 gtcacctttg ctgctggcac agccgctctc ggttacctgg cttacaagaa gttctacgct 240 aaagagaatc gcaccaaagc tatggtgaat cttcagatcc agaaagacaa cccgaaggtg 300 gtgcatgcct tcgacatgga ggatctgggg gataaggccg tgtactgccg atgctggagg 360 tctaaaaagt tccccttctg cgatggggct cacataaagc acaacgaaga gactggcgac 420 aacgtaggac ctctgatcat caagaaaaag gaaacctaat ggacagttgc gaggctgcac 480 ccagcgtgtt gtgatgtcac ctgctgattt acgtagaatg gcacccaacc caccgtctga 540 ttggcctccc cggttctaga tgtggttggt ccctgcaaat cacagctctc atatccatgg 600 catcggcctt gctactgaaa catgtggtgc acgtttgttg aaagaagaag aaaggctaaa 660 ccaacctcgt gctatatggg ttattttggt cttgtaagga tccgttcctt taaaataatg 720 gtcttagaat atagttgtat cttgaggtt ' aagtattaaa ttattccaaa atcatgtaaa 780 aaaaaaaaaa aa 792 <210>4 <211> 106 <212>PRT <213>Bos taurus <400>4 Met Ser Met Thr Ser Ser Val Arg Val Glu Trp lie Ala Ala Val Thr 1 5 10 15 lie Ala Ala Gly Thr Ala Ala lie Gly Tyr Leu Ala Tyr LyS Arg Phe 20 25 30 Tyr Val Lys Asp His Arg Asn Lys Ser Met lie Asn Pro His lie Gln 35 40 45 Asp Asn Pro Lys Val Val His Ala Phe Asp Met Glu Asp Leu Gly 50 55 60 Asp Lys Ala Val Tyr Cys Arg Cys Trp Arg Ser Lys Lys Phe Pro Leu 65 70 75 80 Cys Asp Gly Ser His Thr Lys His Asn Glu Glu Thr Gly Asp Asn Val 85 90 95 Gly Pro Leu lie lie Lys Lys Lys Asp Thr 100 105 <210>5 <211> 108 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>5 Met Ser Leu Thr Ser Ser Ser Ser Val Arg Val Glu Trp lie Ala Ala 1 5 10 15 Val Thr lie Ala Ala Gly Thr Ala Ala lie Gly Tyr Leu Ala Tyr Lys 20 25 30 Arg Phe Tyr Val Lys Asp His Arg Asn Lys Ala Met lie Asn Leu His 35 40 45 lie Gln Lys Asp Asn Pro Lys He Val His Ala Phe Asp Met Glu Asp 50 55 SO Leu Gly Asp Lys Ala Val Tyr Cys Arg Cye Trp Arg Ser Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro Phe Cys Asp Gly Ala His Thr Lys His Asn Glu Glu Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Val Gly Pro Leu lie lie Lys Lys Lys Glu Thr 100 105 <210>6 <211> 108 <212>PRT <213> Mus musculus <400>6 Met Gly Leu Ser ser Asn Ser Ala Val Arg Val Gln Trp lie Ala Ala 1 5 10 15 Val Thr Phe Ala Ala Gly Thr Ala Ala Leu Gly Tyr Leu Ala Tyr Lys 20 25 30 Lys Phe Tyr Ala Lys Glu Asn Arg Thr Lys Ala Met Val Asn Leu Gln 35 40 45 lie Gln Lys Asp Asn Pro Lys Val Val His Ala Phe Asp Net Glu Asp 50 55 60 Leu Gly Asp Lys Ala Val Tyr Cys Arg Cys Trp Arg Ser Lys Lys Phe 65 70 75 80 Pro Phe Cys Asp Gly Ala His lie Lys His Asn Glu Glu Thr Gly Asp 85 90 95 Asn Val Gly Pro Leu lie lie Lys Lys Lys Glu Thr 100 105 <210>7 <211>19 <212>PRT <213>Mus musculus <400>7 Cys Gly Gly Lys Ala Met Val Asn Leu Gln lie Gln Lys Asp Asn Pro 1 5 10 15 Lys Val Val <210>8 <211> 19 <212>PRT <213> Mus musculus <4OO>8 Lys Asp Asn Lys Val Val His Ala Phe Asp Met Glu Asp Leu Gly Asp j 5 10 15 Lys Ala Val <210>9 <211>21 <212>PRT <213> Mus musculus <400>9 Cys Gly Gly Asn Glu Glu Thr Gly Asp Asn Val Gly Pro Leu lie lie 1 5 10 15 Lys Lys Lys Glu Thr 20

Claims (5)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un procedimiento para identificar compuestos útiles para el tratamiento, prevención, o diagnosis de una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada con mitoNEET, que comprende la etapa de determinar si dicho compuesto interacciona directamente con mitoNEET.

2.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada con mitoNEET se selecciona entre el grupo compuesto por disfunción metabólica, diabetes, tolerancia alterada a la glucosa, obesidad, un trastorno cardiovascular, un cáncer o tumor, un trastorno neurodegenerativo, o un trastorno inflamatorio. 3 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho procedimiento es para identificar compuestos útiles para el tratamiento, prevención, o diagnosis de diabetes no insulino-dependiente. 4. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho procedimiento es para identificar compuestos útiles para el tratamiento, prevención, o diagnosis de la enfermedad de Alzheimer o Parkinson. 5. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha etapa para determinar si el compuesto interacciona directamente con mitoNEET, comprende la unión específica de un análogo de tiazolodindiona marcado. 6.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho análogo de tiazolodindiona marcado es modulador de PPARy. 7 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicho análogo de tiazolodindiona es 4-azido-/V-[2-({[6-(2-{4-[(2,4-dioxo-1 ,3-tiazolidin-5-il)metil]fenoxi}etil)p¡ridin-3-il]acetil}amino)etil]-2-hidroxibenzamida. 8.- El uso de un compuesto identificado por el procedimiento que se reclama en la reivindicación 1 , para preparar un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada con mitoNEET en un mamífero. 9.- El uso que se reclama en la reivindicación 8, en donde dicha enfermedad o afección disfuncionai metabólica asociada con mitoNEET se selecciona entre el grupo compuesto por diabetes, tolerancia alterada a la glucosa, obesidad, un trastorno cardiovascular, un cáncer o tumor, un trastorno neurodegenerativo, o un trastorno inflamatorio. 0.- El uso que se reclama en la reivindicación 9, en donde dicho medicamento es para tratar diabetes no insulino-dependiente, aterosclerosis, hipertensión, enfermedad de Aizheimer o Parkinson. .- Un anticuerpo que se une de manera inmunoespecífica a un polipéptido mitoNEET. 12. - Un procedimiento para detectar genes expresados de manera diferencial en correlación con una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada con mitoNEET de una célula de mamífero, comprendiendo el procedimiento la etapa de detectar al menos un producto génico expresado de manera diferencial en una muestra de ensayo obtenida de una célula que se sospecha que procede de una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada con mitoNEET, donde el producto génico está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos de mitoNEET, donde la detección del producto expresado de manera diferencial está en correlación con un estado de enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada con mitoNEET de la célula de la que se ha obtenido la muestra de ensayo. 1

3. - Un procedimiento para controlar la progresión de un trastorno metabólico en un paciente, comprendiendo el procedimiento: a) detectar en una muestra del paciente en un primer momento, la expresión de un marcador, donde el marcador es un polipéptido mitoNEET aislado; b) repetir la etapa a) en un momento posterior; y c) comparar el nivel de expresión detectado en las etapas a) y b), y controlar a partir de ahí la progresión del trastorno metabólico. 1

4.- Un procedimiento para evaluar la eficacia de un compuesto de ensayo para corregir la perturbación metabólica, comprendiendo el procedimiento comparar: a) la expresión de un marcador en una primera muestra obtenida de un paciente expuesto al compuesto de ensayo.^donde el marcador es un polipéptido mitoNEET aislado o polipéptido asociado, y b) la expresión de un marcador en una segunda muestra obtenida de un paciente, donde la muestra no está expuesta al compuesto de ensayo, donde un nivel significativamente inferior de expresión del marcador en la primera muestra, en relación con la segunda muestra, es una indicación de que el compuesto de ensayo es eficaz para el tratamiento. 1

5.- Un procedimiento para identificar un compuesto para tratar, prevenir, o diagnosticar una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada con mitoNEET, comprendiendo el procedimiento: (a) obtener una muestra de células de un paciente que tiene una enfermedad o afección disfuncional metabólica asociada con mitoNEET; (b) exponer de manera separada alícuotas de una muestra en presencia de una pluralidad de compuestos de ensayo; (c) comparar la expresión de un marcador o modificación post-traduccional del marcador en cada una de las alícuotas, donde el marcador se selecciona entre el grupo compuesto por los marcadores de SEC ID N° 4, SEC ID N° 5, y SEC ID N° 6, y (d) seleccionar uno de los compuestos de ensayo que altere el nivel de expresión del marcador en la alícuota que contiene ese compuesto de ensayo, en relación con otras composiciones de ensayo.