MXPA05004604A - Composicion para el tratamiento de la infeccion por virus flaviviridae. - Google Patents

Abstract

Las composiciones, el uso, el articulo de fabricacion y el procedimiento para el tratamiento de un mamifero infectado con un virus de la familia Flaviviridae se proporciona comprendiendo la administracion al mamifero infecta de un compuesto que tiene la formula I (ver formula I): En el que, A se selecciona de: alquilo C1-C6 y cicloalquilo C3-C6; y B se selecciona de: fenilo o tiazolilo, ambas de las cuales estan opcionalmente sustituidas con un grupo seleccionado de NH(R1) y NH(CO)R1, en el que R1, es alquilo C1-C6; R es OH o un derivado de sulfonamida; o una sal farmaceuticamente aceptable de la misma.

Description

COMPOSICIÓN PARA EL TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR VIRUS FLAVIVIRIDAE Campo de la Invención La presente invención se refiere a compuestos, composiciones, uso y procedimiento para el tratamiento de una infección viral por Flaviviridae en un mamífero. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso y a un procedimiento de tratamiento que comprende la administración de un compuesto seleccionado de una familia de compuestos de péptidos macrocíclicos .

Antecedentes de la Invención La familia de virus Flaviviridae está incluida en los virus de cadena de RNA positiva comprendiendo un número de virus humanos patogénicos tales como virus del género hepacivirus, que incluyen hepatitis C, virus del género flavivirus, que incluyen virus de la fiebre del dengue, virus de la encefalitis, virus del Nilo Oeste y virus de la fiebre amarilla, y virus del género pestivirus, que incluyen el virus de la diarrea bovina y el virus de la enfermedad de la frontera, todos los cuales son patógenos animales. Los virus más recientemente descubiertos, virus de la hepatitis G (HGV) y virus de la hepatitis GB (GBV-A, B, C) , se considera también provisionalmente que son miembros de la familia Flaviviridae que pertenecen a un género distinto. Los virus del dengue, miembros de la familia de los Flavíviridae se transmiten por mosquitos. Hay cuatro serotipos que causan enfermedades humanas extendidas, una de las cuales causa fiebre hemorrágica del dengue, y aproximadamente el 40% de la población que vive en regiones tropicales y subtropicales del mundo está en riesgo de infección. Del millón de casos de fiebre hemorrágica por año, aproximadamente el 5% son fatales. Actualmente no hay ninguna vacuna efectiva o fármaco antiviral para proteger contra las enfermedades del dengue. Los pestivirus tales como el virus de la diarrea bovina (BVDV) , el virus de la peste porcina clásica (CSFV) y el virus de la enfermedad de la frontera (BDV) comprenden un grupo de patógenos animales económicamente importantes que afectan al ganado vacuno, cerdos y ovejas. Estos virus RNA de sentido positivo se clasifican como un género separado en la familia Flaviviridae. Los virus GB se han clasificado como miembros de la familia Flaviviridae, pero no se han asignado a un género en particular en base al análisis de las secuencias genómicas . Estos virus RNA, además de infectar humanos, pueden causar hepatitis de resolución aguda en tamarinos infectados experimentalmente . Los virus dentro de la familia Flaviviridae poseen un número de similitudes a pesar de una homología de secuencia general relativamente baja entre sus miembros. El genoma de estos virus es un RNA de cadena simple pequeña («10 kilobases de longitud) que tiene una fase de lectura simple abierta (ORF) . El ORF codifica una poliproteína de aproximadamente 3000 aminoácidos que contienen proteínas estructurales en su extremo 5' y proteínas no estructurales (NS) en su extremo 3'. La poliproteína se procesa proteolíticamente tanto por virus como por las proteínas codificadas del hospedador en polipéptidos maduros, los cuales son como sigue para HCV: NH2-{C-E1-E2-P7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B}-COOH. La proteína del núcleo o nucleocápsida (C) y las dos glucoproteínas de la envoltura (El y E2) representan las proteínas estructurales constitutivas de los viriones . Estas proteínas estructurales se siguen por las proteínas no estructurales (NS) , al menos algunas de las cuales se piensa que son esenciales para la replicación viral del RNA. Las actividades enzimáticas se han adscrito a varias de estas proteínas NS . En particular, la proteína NS3 contiene secuencias similares a la serina proteasa y la helicasa de unión a nucleósido trifosfato de pestivirus y flavivirus . El análisis de los alineamientos de secuencia han predicho la existencia de un dominio serina proteasa similar a tripsina dentro de la región N-terminal de los flavi-, pesti-, hepaci- y GB-virus . Las similitudes de secuencia entre dominios proteolíticos NS3 de los virus Flaviviridae están bien establecidas (Ryan MD y col. 1998) . El dominio proteasa NS3 del HCV comparte una similitud de secuencia de aproximadamente el 77-90% entre los genotipos HCV y una similitud de secuencia de aproximadamente el 25-50% con otros miembros de la familia Flaviviridae . Con respecto a la estructura tridimensional, las coordenadas atómicas disponibles de las diversas proteasas cristalizadas de HCV y dengue NS3 muestran una arguitectura general que es característica del pliegue relativo a tripsina (Kim y col. 1996, Love y col. 1996; M rthy y col. 1999) . Muchos estudios han establecido ahora firmemente que la parte N-terminal de la región NS3 codifica una serina proteasa que o tiene un papel muy específico y de crucial importancia en el procesamiento de la poliproteína en Flaviviridae. En hepacivirus, pestivirus y virus GB, la poliproteína procesadora muestra un requerimiento de la parte final de la proteína NS4A. La proteína NS4A actúa como un cofactor que potencia la eficiencia de escisión de la proteasa NS3 (Lin y col., 1995; Kim y col., 1996; Steinkuler y col., 1996) . En flavivirus, este requerimiento para potenciar la actividad de la proteasa NS3 se proporciona por la parte inicial de la proteina NSB2n. La organización y estructura genómica de GBV-B y HCV son similares a pesar del hecho de que la homología de secuencia entre las secuencias de poliproteínas de GBV-B y HCV es de aproximadamente 25-30%. Dadas las similitudes aparentes de virus dentro de la familia de virus Flaviviridae, sería deseable desarrollar agentes terapéuticos efectivos contra los virus de Flaviviridae, y más particularmente efectivos contra los miembros patógenos de la familia Flaviviridae.

Breve Descripción de la Invención De acuerdo con ello, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una composición anti-virus Flaviviridae que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable en combinación con un compuesto de la fórmula (I) : Fórmula (I) en la que, A se selecciona de: alquilo de Ci.-C6 y cicloalquilo de C3-C6; y B se selecciona de: fenilo o tiazolilo, ambos de los cuales están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de NH (R1 ) y NHÍCOJR1, en los que R1 es alquilo de Ci-C6; R es OH o un derivado de sulfonamida, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar un mamífero infectado con un virus de la familia Flaviviridae que comprende administrar al mamífero infectado una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I) como se define anteriormente. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar a un mamífero infectado con un virus de la familia Flaviviridae en el que una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I) como se define anteriormente se coadministra con al menos un agente adicional seleccionado de: un agente antiviral, un agente inmunomodulador, un inhibidor del HCV, un inhibidor del VIH, un inhibidor del HAV y un inhibidor del HBV; al mamífero infectado . En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para tratar o prevenir una infección de un mamífero causada por un virus de la familia Flaviviridae que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I) y al menos un agente adicional seleccionado de: un agente antiviral, un agente inmunomodulador, un inhibidor del HCV, un inhibidor del VIH, y un inhibidor del HAV y un inhibidor del HBV.

En un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un compuesto de Formula (I) como se define anteriormente, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de infección viral por Flaviviridae. En un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona un articulo de elaboración que comprende empaquetar el material contenido con el cual es una composición efectiva para inhibir un virus de la familia Flaviviridae y el material empaquetado comprende una etiqueta la cual indica que la composición se puede usar para tratar infección con un virus de la familia Flaviviridae y, en el que dicha composición comprende un compuesto de la fórmula (I) como se define anteriormente . Mientras no se vinculen con cualquier modo de acción particular, la familia de péptidos macrocíclica representada generalmente por la formula (I) como se expone anteriormente se cree que interactúa en un sitio de unión a sustrato conservado en el dominio proteasa NS3. Los estudios de estructura cristalina confirman que los compuestos macrociclicos presentes interactúan en el sitio de unión a sustrato con el dominio NS3 del HCV, una región que se conserva funcionalmente entre los virus Flaviviridae. Otros objetos, ventajas y características de la presente invención llegarán a ser más patentes en la lectura de la siguiente descripción no restrictiva de las realizaciones preferidas con referencia a las Figuras y Tablas acompañantes en las cuales: Breve Descripción de las Tablas Las Tablas 4-8 proporcionan una comparación de similitud de secuencia entre miembros de la familia Flaviviridae.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 proporciona una comparación de poliproteinas o virus que pertenecen a la familia Flaviviridae (tomada de: Ryan y col., 1998, J. Gen. Virology 79, 947-959); la Figura 2 es una comparación de secuencia del dominio de la proteasa NS3 entre los genotipos y subtipos de HCV; las Figuras 3A-B son las curvas CI50 de un compuesto de péptido macrociclico de acuerdo con la fórmula (I) frente al genotipo de las proteasas NS3-NS4A de HCV la y Ib, respectivamente; las Figuras 4A-B son los gráficos de Dixon y Cornish-Bowden del péptido macrociclico de la Figura 3 frente a las proteasas NS3-NS4A del genotipo la de HCV; las Figuras 5A-B son los gráficos de Dixon y Cornish-Bowden del péptido macrociclico de la Figura 3 frente a las proteasas NS3-NS4A del genotipo Ib de HCV; la Figura 6 ilustra la inhibición de la replicación de GBV-B por péptidos macrocíclicos de acuerdo a la fórmula (I) en los hepatocitos de tamarino en cultivo; la Figura 7 ilustra gráficamente la inhibición dependiendo de dosis de la replicación GBV-B mediante el péptido macrociclico III de la Figura 6; y la Figura 8 ilustra la estructura cristalina tridimensional de la estructura del péptitío NS3-NS4A del HCV formando un complejo con un péptido macrociclico de acuerdo con la fórmula (I) .

Descripción Detallada de la Invención Definiciones A no ser que se defina otra cosa, los términos y la nomenclatura científicos y tecnológicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertenece la invención. Generalmente, los procedimientos para el cultivo de células, infección, procedimientos de biología molecular y similares son procedimientos comunes usados en la técnica. Tales técnicas estándar se pueden encontrar en manuales de referencia tales como por ejemplo Sambrook y col. (1989) y Ausubel y col. (1994) . El término "Fiaviviridae" como se usa en el presente documento para designar una familia viral significa que 1G comprende virus del género hepacivirus, tales como la hepatitis C, virus del género flavivirus, tales como los virus de la fiebre del dengue, los virus de la encefalitis, los virus del Nilo Oeste y los virus de la fiebre amarilla, y virus del género pestivirus, tales como el virus de la diarrea bovina y el virus de la enfermedad de la frontera. El virus de la hepatitis G (HGV) y el virus de la hepatitis GB se incluyen también en esta familia viral aunque los géneros de estos virus no se han determinado aún. Además, todos los subtipos y genotipos de los virus anteriormente mencionados están también comprendidos dentro de la familia Flavivirídae, incluyendo por ejemplo, HCV la, HCV Ib, HCV 2a-c, HCV 3a-b, HCV 4a, HCV 5 y HCV 6a, h, d & k, igual que GBV-A, B & C. El término "mamífero" como se usa en el presente documento está significando que comprende humanos, igual que mamíferos no humanos los cuales son susceptibles a la infección por un virus Flavivirídae incluyendo animales domésticos, tales como vacas, cerdos, caballos, perros y gatos, y ovejas. Con respecto a los compuestos de la fórmula (I) administrados en el tratamiento de la infección con Flavivirídae, el término "alquilo de Ci_6" o "Ci-C6" como se usa en el presente documento, bien solo o bien en combinación con otro sustituyente, significa sustituyentes alquilo de cadena lineal o ramificada acíclicos que contienen de uno a seis átomos de carbono e incluyen, por ejemplo, metilol, etilol, propilo, isopropilo, butilo, tere-butilo, hexilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo, 1, 1-dimetiletilo . El término "cicloalquilo de ^-s" como se usa en el presente documento, bien solo o bien en combinación con otro sustituyente, significa un sustituyente cicloalquilo que contiene de tres a seis átomos de carbono e incluye ciclopropilo, ciciobutilo, ciclopentilo, y ciclohexilo. El término "sal farmacéuticamente aceptable" significa una sal de un compuesto de la formula (I) el cual es, dentro de la panorámica del juicio medico mediante sonda, adecuado para uso en contacto con los tejidos de humanos y animales inferiores sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica, y similares, proporcionales con una relación razonable beneficio/riesgo, generalmente soluble o dispersable en agua o aceite, y efectiva para su uso deseado. El término incluye sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables y sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables. Listas de sales adecuadas se encuentran, por ejemplo, en S. M. Birge y col. J. Pharm. Sci., 1977, 66, pp. 1-19. El término "sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable" quiere decir aquellas sales las cuales retienen la efectividad y las propiedades biológicas de las bases libres y las cuales no son desagradables biológicamente o de otro modo, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhidrico, ácido sulfúrico, ácido sulfámico, ácido nítrico, ácido fosfórico, y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido tricloroacético, ácido trifluoroacético, ácido adípico, ácido alginico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzenosulfónico, ácido benzoico, ácido 2-acetoxibenzoico, ácido butírico, ácido canfórico, ácido canforsulfónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido diglucónico, ácido etansulfónico, ácido glutámico, ácido glicólico, ácido glicerfosfórico, ácido hemisúlfico, ácido heptanoico, ácido hexanoico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido 2-hidroxietanosulfónico (ácido isetiónico) , ácido láctico, ácido aleico, ácido hidroximaleico, ácido mélico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido mesitilenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido naftalenosulfónico, ácido nicotínico, 2-naftalenosulfonico, ácido oxálico, ácido pamoico, ácido pectínico, ácido fenilacético, ácido 3-fenilpropiónico, ácido pícrico, ácido piválico, ácido propiónico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido sulfanílico, ácido tartárico, ácido p-toluensulfónico, ácido undecanoico, y similares. El término "sal de adición básica farmacéuticamente aceptable" quiere decir aquellas sales las cuales retienen la efectividad y las propiedades biológica de los ácidos libres y las cuales no son indeseables biológicamente o de ninguna otra forma, formadas con bases inorgánicas tales como amoniaco o hidróxido, carbonato, o bicarbonato de amonio o un catión metálico tal como sodio, potasio, litio, calcio, magnesio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio, y similares. Se prefieren particularmente las sales de amonio, potasio, sodio, calcio, y magnesio. Las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, compuestos amina cuaternarios, incluyendo aminas sustituidas que se dan en la naturaleza y resinas intercambiadoras de iones básicas y aminas cíclicas, aminas sustituidas, tales como metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, dietilamina, trietilamina, isopropilamina, tripropilamina, tributilamina, etanolamina, dietanolamina, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilpiperidina, compuestos tetrametilamonio, compuestos tetraetilamonío, piridina, N,N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, dibencilamina, N, -dibenzilfenetilamina, 1-efenamina, N, N' -dibenciletilendiamina, resinas poliamina, y similares. Las bases no tóxicas particularmente preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina, y cafeína.

El término "derivado sulfonamida" como se usa en el presente documento significa un grupo sulfonamida de la fórmula -NHS02-R2 en el que R2 es -alquil (Ci~8) , -cicloalquil (C3-7) o {-alquil (C1-6) -cicloalquil (C3-6) } ,· los cuales se sustituyen opcionalmente de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro, 0-alquil (Ci_e) / amido, amino o fenilo, o R2 es arilo C6 o Cío el cual se sustituye opcionalmente de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro, alquil (Ci-6) , 0-alquil (Ci_6) , amido, amino o fenilo. El término "agente antiviral"' como se usa en el presente documento quiere decir un agente (compuesto o biológico) que es efectivo para inhibir la formación y/o replicación de un virus en un mamífero. Esto incluye agentes que interfieren bien con mecanismos del hospedador o bien con mecanismos virales necesarios para la formación y/o replicación de un virus en un mamífero. Los agentes antivirales incluyen, por ejemplo, ribavirina, amantadina, VX-497 (merimepodib, Vértex Pharmaceuticals ) , VX-498 (Vértex Pharmaceuticals) , levovirina, viramidina, Ceplene (maxamina) , XTL-001 y XTL-002 (XTL Biopharmaceuticals) . El término "agente inmunomodulatorio" según se usa en el presente documento significa aquellos agentes (compuestos o biológicos) que son efectivos en incrementar o potenciar la respuesta del sistema inmune en un mamífero. Los agentes inmunomodulatorios incluyen, por ejemplo, interferones de clase I (tales como interferones a-, ß- y omega, tau-interferones , interferones consenso y asialointerferones) , interferones de clase II (tales como interferones-?) e interferones pegilados. El término "inhibidor de la proteasa NS3 del HCV" como se usa en el presente documento quiere decir un agente (compuesto o biológico) que es efectivo para inhibir la función de la proteasa NS3 del HCV en un mamífero. Los inhibidores de proteasa NS3 del HCV incluyen, por ejemplo, aquellos compuestos descritos en los documentos WO 99/07733, O 99/07734, WO 00/09558, WO 00/09543 o WO 00/59929, WO 03/064416; WO 03/064455; WO 03/064456 y el candidato Vértex en fase de predesarrollo se identifica como VX-950. El término "inhibidor de HCV" como se usa en el presente documento quiere decir un agente (compuesto o biológico) que es efectivo para inhibir la formación y/o replicación de HCV en un mamífero. Esto incluye agentes que interfieren bien con mecanismos del hospedador o bien con mecanismos virales del HCV necesarios para la formación y/o replicación del HCV en un mamífero. Los inhibidores de HCV incluyen, por ejemplo, agentes que inhiben una diana seleccionada de: proteasa NS3, helicasa NS3, polimerasa HCV, proteasa NS2/3 o IRES. Ejemplos específicos de inhibidores de HCV incluyen ISIS-14803 (ISIS Pharmaceuticals) . El término "inhibidor de polimerasa del HCV" como se usa en el presente documento quiere decir un agente (compuesto o biológico) que es efectivo para inhibir la función de una polimerasa del HCV en un mamífero. Esto incluye, por ejemplo, inhibidores de la polimerasa de NS5B en HCV. Los inhibidores de polimerasa del HCV incluyen no-nucleósidos, por ejemplo, aquellos compuestos descritos en los documentos: · WO 03/010140 (Boehrínger Ingelheim) , • WO 03/010141 (Boehringer Ingelheim) , • WO 03/007945 (Boehringer Ingelheim), • WO 02/100846 Al y WO 02/100851 A2 (ambos Shire) , • WO 01/85172 Al y WO 02/098424 Al (ambos GSK) , · WO 00/06529 y WO 02/06246 Al (ambos Merck), • WO 01/47883 y WO 03/000254 (ambos Japan Tobacco) y • EP 1 256 628 A2 (Agouron) . Además otros inhibidores de polimerasa del HCV incluyen también análogos de nucleósidos, per ejemplo, aquellos compuestos descritos en los documentos: • WO 01/90121 A2 (Idenix) , • WO 02/069903 A2 (Biocryst Pharmaceuticals Inc.), y • WO 02/057287 A2 y WO 02/057425 A2 (ambos erck/Isis) . Ejemplos específicos de inhibidores de una polimerasa HCV, incluyen JTK-002/003, JTK-109 (Japan Tobacco), y NM283 (Idenix) . El término "inhibidor del VIH" como se usa en el presente documento quiere decir un agente (compuesto o biológico) que es efectivo para inhibir la formación y/o replicación del VIH en un mamífero. Esto incluye agentes que interfieren bien con los mecanismos del hospedador o bien con los mecanismos virales necesarios para la formación y/o replicación del VIH en un mamífero. Los inhibidores del VIH incluyen, por ejemplo, inhibidores nucleosídicos , inhibidores no-nucleosídicos, inhibidores de proteasa, inhibidores de fusión e inhibidores de integrasa. El término "inhibidor del HAV" como se usa en el presente documento quiere decir un agente (compuesto o biológico) que es efectivo para inhibir la formación y/o replicación del HAV en un mamífero. Esto incluye agentes que interfieren bien con los mecanismos del hospedador o bien con los mecanismos virales necesarios para la formación y/o replicación del HAV en un mamífero. Los inhibidores del HAV incluyen vacunas contra la hepatitis A, por ejemplo, Havrix (GlaxoSmithKline) , VAQTA® (Merck) y Avaxim® (Aventis Pasteur) . El término "inhibidor del HBV" como se usa en el presente documento quiere decir un agente (compuesto o biológico) que es efectivo para inhibir la formación y/o replicación del HBV en un mamífero. Esto incluye agentes que interfieren bien con los mecanismos del hospedador o bien con los mecanismos virales necesarios para la formación y/o replicación del HBV en un mamífero. Los inhibidores del HBV incluyen, por ejemplo, agentes que inhiben la DNA polimerasa viral del HBV o las vacunas contra el HBV. Ejemplos específicos de inhibidores del HBV inhibidores incluyen lamivudina (Epivir-HBV®), Adefovir-Dipivoxil, Entecavir, FTC (Coviracil®) , DAPD (DXG) , L-FMAU (Clevudina®) , AM365 (Amrad) , Ldt (telbivudina) , monoval-LdC (valtorcitabine) , ACH-126,443 (L-Fd4C) (Achillion) , MCC478 (Eli Lilly), Racivir (RCV) , Fluoro-L y D nucleósidos, Robustaflavone, ICN 2001-3 (ICN) , Bam 205 (Nóvelos), XTL-001 (XTL) , Imino-Azúcares (Nonil-DNJ) (Synergy) , HepBzyme; y productos immunomoduladores tales como: interferón alfa 2b, HE2000 (Hollis-Eden) , Theradigm (Epimmune) , EHT899 (Enzo Biochem) , timosin alfa-1 (Zadaxin®) , vacuna de DNA contra el HBV (PowderJect) , vacuna de DNA contra el HBV (Jefferon Center) , antigeno del HBV (OraGen) , BayHep B® (Bayer) , Nabi-HB® (Nabi) y anti-hepatitis B (Cangene) ; y productos de vacuna contra el HBV tales como los siguientes: Engerix B, Recombivax HB, GenHevac B, Hepacare, Bio-Hep B, TwinRix, Comvax, Hexavac. El término "interferón de clase I" como se usa en el presente documento quiere decir un interferón seleccionado de un grupo de interferones que se unen todos al receptor tipo I . Esto incluye tanto interferones de clase I producidos naturalmente como interferones de clase I producidos sintéticamente. Ejemplos de interferones de clase I incluyen a-, ß-, d-, omega-interferones, tau-interferones , interferones consenso, asialo-interferones . El término "interferón de clase II" como se usa en el presente documento quiere decir un interferón seleccionado de un grupo de interferones que se unen todos al receptor tipo II.

Ejemplos de interferones de clase II incluyen ?-interferones . Además, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en el presente documento con respecto a compuestos de la fórmula I quiere decir una cantidad del compuesto la cual es efectiva para tratar una infección viral con Flaviviridae, es decir para inhibir o al menos reducir la replicación viral, mientras no sea una cantidad que sea tóxica para un mamífero que se esté tratando o una cantidad que pueda por el contrario causar efectos adversos significativos en un mamífero. El término "transportador" se usa para hacer referencia a compuestos o mezclas de compuestos para combinación con los presentes compuestos terapéuticos los cuales facilitan la administración de los mismos y/o potencian la función de los compuestos terapéuticos para inhibir un virus de la familia Flaviviridae incluyendo, por ejemplo, diluyentes, excipientes, adjuvantes y vehículos. Estabilizadores, colorantes, aromatizantes, agentes antimicrobianos, y similares se pueden combinar también con el compuesto terapéutico. Además, en algunos casos, el pH de la formulación se puede ajusfar con ácidos farmacéuticamente aceptables, bases o tampones para potenciar la estabilidad del compuesto formulado o su forma en desarrollo. Otros aditivos adecuados incluyen aquellos con los cuales alguien experto en la técnica estaría familiarizado con que funcionen para incrementar las características de la presente combinación mientras que no afecten adversamente su función. Se puede hacer referencia al documento "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17a Ed. , Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985, para transportadores que serian adecuados para mezclar con los presentes compuestos terapéuticos. El término "farmacéuticamente aceptable" como se usa en el presente documento con respecto a un compuesto transportador está significando indicar que el transportador es adecuado para administración a un mamífero, es decir es no tóxico y no causa ningún efecto adverso cuando se usa en cantidades apropiadas para funcionar como un transportador.

Realizaciones Preferidas Composición anti-virus Flavivizidae En una primera realización de la presente invención, se proporciona una composición eficaz para tratar un mamífero infectado con un virus de la familia Flaviviridae. La composición comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable en combinación con un compuesto de la fórmula (I) : Fórmula (I) en el que, A se selecciona de: alquilo de Ci-C6 y cicloalquilo de C3-Ce) y B se selecciona de: fenilo o tiazolilo, los cuales ambos se sustituyen opcionalmente con un grupo seleccionado de NH ( 1) y NfKCOJR1, en los que R1 es alquilo de Ci-C6; R es OH o un derivado de sulfonamida, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En una realización, A de la fórmula (I) es un grupo ramificado alquilo de C4-C6 o cicloalquilo de C4-C6. En una realización preferida, A es ciclopentilo o terc-butilo. En otra realización, B de la fórmula (I) es fenilo o un tiazol substituido en la posición 2 con NH (R1) o NH(CO)R1 en los cuales R1 es un alquilo de C1-C4. En una realización preferida, B es un tiazol sustituido en la posición 2 con NH (R1) o NH(CO) R1 en el cual R1 es un alquilo de C1-C4. Más preferiblemente, B es 4-tiazol sustituido en la posición 2 con NH(CO)CH3 o con NHCH(CH3)2. En una realización preferida adicional, R de la fórmula (I) es OH o un grupo sulfonamida de la fórmula -NHS02-R2 en la que R2 es -alquil (Ci-6) , -cicloalquil (C3_6) , ambos sustituidos opcionalmente 1 ó 2 veces con halo o fenilo, o R2 es arilo de C6 sustituido opcionalmente 1 ó 2 veces con halo o alquil (Ci_s) . Más preferiblemente, R es OH o un grupo sulfonamida en el que R2 es metilo, ciclopropilo o fenilo. En una realización más preferida, la presente invención se lleva a cabo con un compuesto de la fórmula (I) en el cual A es tere-butilo y B es fenilo como se expone a continuación en la fórmula del compuesto (II) : En otra realización más preferida, la presente invención se lleva a cabo con un compuesto de la fórmula (I) en el cual A es tere-butilo y B es 4-tiazol sustituido en su posición 2 con NH(CO)CH3 como se expone a continuación en la fórmula del compuesto (III) : En una realización más preferida, la presente invención se lleva a cabo con un compuesto de la fórmula (I) en el cual A es ciclopentilo y B es 4-tiazol sustituido en su posición 2 con NHCH(CH3)2 como se expone a continuación en la fórmula del compuesto (IV) : En una realización más preferida, la presente invención se lleva a cabo con un compuesto de la fórmula (I) en el cual A es ciclopentilo, B es 4-tiazol sustituido en su posición 2 con NHCH(CH3)2, y R es un grupo sulfonamida en el que R2 es fenilo como se expone a continuación en la fórmula del compuesto (VI) : En una realización más preferida, la presente invención se lleva a cabo con un compuesto de la fórmula (I) en el cual A es ciclopentilo, B es 4-tiazol sustituido en su posición 2 con NHCH(CH3)2, y R es un grupo sulfonamida en el que R2 es metilo como se expone a continuación en la fórmula del compuesto (VII) : En una realización más preferida, la presente invención se lleva a cabo con un compuesto de la fórmula (I) en el cual A es ciclopentilo , B es 4-tiazol sustituido en su posición 2 con NHCH (CH3) 2 y R es un grupo sulfonamida en el que R2 es ciclopropilo como se expone a continuación en la fórmula del compuesto (VIII) : Procedimiento de Tratamiento En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para tratar un mamífero infectado con un virus de la familia Flaviviridae que comprende administrar a un mamífero infectado una composición farmacéutica que comprende un transportador farmacéuticamente aceptable en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto que tiene la fórmula (I) , (II) , (III) , (IV), (VI), (VII) o (VIII) como se definen anteriormente. De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I), (II), (III), (IV), (VI), (VII) o (VIII) se administra a un mamífero infectado con un virus Flaviviridae. Para ser terapéuticamente efectiva, se administra al mamífero infectado una dosificación de entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, preferiblemente entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día del compuesto. Típicamente, el procedimiento implicará administración del compuesto de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces por día o alternativamente, como una infusión continua. Tal administración se puede usar como una terapia aguda o crónica. Como se apreciará por alguien experto en la técnica, se pueden requerir las dosis inferiores o superiores que aquellas enumeradas anteriormente. La dosificación específica y los regímenes de tratamiento dependerán de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo y dieta del mamífero infectado, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la severidad y el curso de la infección, la predisposición del paciente a la infección y el juicio del médico que trata. Generalmente, el tratamiento se inicia con pequeñas dosificaciones sustancialmente menores que la dosis óptima del péptido. De ahí en adelante, la dosificación se incrementa mediante incrementos pequeños hasta que se alcanza el efecto óptimo bajo las circunstancias. En general, el compuesto se administra más deseablemente a un nivel de concentración que generalmente proporcionará un efecto terapéutico sin causar ningún efecto secundario dañino o deletéreo . La administración del compuesto terapéutico en el tratamiento de la infección viral con Flaviviridae puede ser mediante una cualquiera de varias vias que incluyen administración oralmente, parenteralmente o por medio de un reservorio implantado. El término "parenteral" como se usa en el presente documento incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, e intralesional . Se prefieren la administración oral o la administración mediante inyección. Las formas de dosificación oralmente aceptables incluyen, pero no se limitan a, cápsulas, comprimidos, y suspensiones y disoluciones acuosas. Como se expuso anteriormente, el compuesto de la fórmula (I), (II), (III), (IV), (VI), (VII) o (VIII) se administra en combinación con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del o de los transportadores variará, por supuesto, con la forma de dosificación. De acuerdo con ello, en el caso de los comprimidos para uso oral, los trasportadores los cuales se usan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maiz. Los agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, se agregan también típicamente. Para la administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maiz seco. Cuando las suspensiones acuosas se administran oralmente, el ingrediente activo se combina con agentes emulsificadores y de suspensión. Si se desea, se pueden agregar ciertos agentes edulcorantes y/o aromatizantes y/o colorantes. Las preparaciones inyectables que incluyen suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables, se formulan de acuerdo a técnicas conocidas en el arte que usan agentes dispersantes o humectantes adecuados tales como Tween 80 y agentes de suspensión. La cantidad del presente compuesto terapéutico que se combina con los materiales transportadores para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del hospedador tratado y el modo de administración en particular. Una preparación típica contendrá de aproximadamente un 5% a aproximadamente un 95% de compuesto terapéutico (p/p) . Preferiblemente, tales preparaciones contendrán de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 80% de compuesto terapéutico . En otro aspecto, una terapia de combinación se contempla en la que el compuesto de la formula (I) , (II) , (III), (IV), (VI), (VII) o (VIII), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se co-administra con al menos un agente adicional seleccionado de: un agente antiviral, un agente inmunomodulador, un inhibidor del HCV, un inhibidor del VIH, un inhibidor del HAV, un inhibidor del HBV, y un agente terapéutico efectivo para tratar los síntomas de la infección viral. Ejemplos de tales agentes se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Estos agentes adicionales se pueden combinar con los compuestos de la invención para crear una forma de dosificación farmacéutica única. Alternativamente estos agentes adicionales se pueden administrar separadamente al paciente infectado como parte de una forma de dosificación múltiple, por ejemplo, usando un kit. Tales agentes adicionales se pueden administrar al paciente antes de, concurrentemente con, o tras la administración del compuesto terapéutico de la fórmula (I), (II), (III), (IV), (VI), (VII) o (VIII), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Cuando se utiliza una terapia de combinación, tanto el presente compuesto como los agentes terapéuticos y/o profilácticos estarían presentes a niveles de dosificación de entre aproximadamente 10-100%, y más preferiblemente entre aproximadamente 10-80% de la dosificación administrada normalmente en un régimen de monoterapia.

Articulo de Fabricación En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un articulo de fabricación que comprende material de empaquetamiento contenido en el cual está una composición efectiva para tratar un mamífero infectado con un virus de la familia Flaviviridae y el material de empaquetado comprende una etiqueta la cual indica que la composición se puede usar para tratar infección mediante un virus de la familia Flaviviridae, en el que dicha composición comprende un compuesto de la fórmula (I), (II), (III), (IV), (VI), (VII) o (VIII) como se definen anteriormente.

Virus Flaviviridae Particularmente, las diferentes realizaciones de la presente invención se pueden dirigir a distintos virus, particularmente virus los cuales son patógenos en mamíferos. Preferiblemente, los compuestos de composiciones anteriormente mencionados se pueden usar para el tratamiento de los virus del género hepacivirus, tales como Hepatitis C. Los ejemplos preferidos de los virus HCV se seleccionan de los genotipos: 1, 2, 3, 4, 5, y 6. Los ejemplos más preferidos de los virus HCV se seleccionan de los genotipos: 2, 3, 4, 5, y 6. Preferiblemente, los virus HCV se seleccionan de los subtipos: HCV la, HCVlb, HCV 2a-c, HCV 3a-b, HCV 4a, HCV 5 y HCV 6a, h, d y k. Más preferiblemente, los virus HCV se seleccionan de los subtipos: HCV la, HCV 2a-c, HCV 3a-b, HCV 4a, HCV 5 y HCV 6a, h, d y k. Alternativamente, los compuestos de la invención pueden estar dirigidos contra virus del género flavivirus, tales como los virus de la fiebre del dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus del Nilo Oeste y virus de la fiebre amarilla. Preferiblemente, la invención se refiere al tratamiento de la enfermedad viral en un humano causada por el virus del dengue. Preferiblemente, la invención se refiere al tratamiento de la enfermedad viral en un humano causada por el virus de la encefalitis japonesa. Alternativamente, la invención se refiere al tratamiento de la enfermedad viral en un humano causada por el virus de la fiebre amarilla. Alternativamente, la invención se refiere al tratamiento de la enfermedad viral en un humano causada por el virus del Nilo Oeste . Además, la invención se puede referir al tratamiento de la enfermedad viral causada por virus del género pestivirus, tales como el virus de la diarrea bovina (BVDV) , el virus de la peste porcina clásica (CSFV) y el virus de la enfermedad de la frontera (BDV) . Preferiblemente, la invención se refiere al tratamiento de las enfermedades virales en el ganado causadas por BVDV. Alternativamente, la invención se refiere al tratamiento de las enfermedades virales en cerdos causadas por CSFV. Alternativamente, la invención se dirige al tratamiento de las enfermedades virales en ovejas causadas por BDV. Además, los virus GB también se pueden tratar con la composición de la presente invención. Incluidos en esta familia viral están el virus de la hepatitis G (HGV) y el virus de la hepatitis GB. Los ejemplos preferidos se seleccionan de: GBV-A, B y C. Preferiblemente, la invención se refiere al tratamiento de la enfermedad viral en un humano causada por GBV-C. Alternativamente, la invención se refiere al tratamiento de la enfermedad viral en un humano causada por GBV-A. Alternativamente, la invención se refiere al tratamiento de la enfermedad viral en un humano causada por HGV. Se ejemplifican realizaciones de la presente invención mediante los siguientes ejemplos específicos los cuales no son para interpretarse como limitantes.

Ejemplos Las abreviaturas usadas en los ejemplos incluyen: Abu: ácido aminobutírico; DABCYL: ácido 4-((4-(dimetzlamxno) fenil) azo) benzoico; DME : Medio Eagle Modificado de Dulbecco; DMSO: dimetilsulfóxido; EDANS : ácido 5-((2-aminoetil) amino) aftaleno-l-sulfónico; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; IPTG: isopropil-b-D-tiogalactósido; LB: Luria-Bertoni (como en caldo LB) ; Nva: norvalina; PenStrep: penicilina/estreptomicina; PCR: reacción en cadena de la polimerasa; r.m.s.: raíz cuadrada media; RT-PCR: reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; y TCEP: clorhidrato de tris (2-carboxietil) fosfina.

Síntesis de Compuestos de la fórmula (I) Los compuestos de Formula (I) se prepararon usando el protocolo destacado en detalle en el documento WO 00/059929, publicado el 12 de octubre de 2000. En particular, se hace referencia a la página 89, ejemplo 34C para la preparación del compuesto (IV) .

Ejemplo 1 - Inhibición de proteasas NS3-NS4A HCV de diferentes genotipos por compuestos II, III y IV NS3/4A del HCV la y Ib Para la producción de la proteina heterodimera NS3-NS4A del genotipo Ib del HCV, un cDNA de longitud completa del HCV se clonó mediante RT-PCR usando RNA extraído del suero de un individuo infectado por HCV de genotipo Ib (proporcionado por el Dr. Bernard Willems, Hópital St-Luc, Montreal, Canadá) . La región de DNA que codifica la proteína heterodimera NS3-NS4A se amplificó mediante PCR (cebador directo: ' CTCGGATCCGGCGCCCATCACGGCCTAC3' (SEC. DE IDEN . No. 1) ; cebador inverso: 5' CTCTCTAGATCAGCACTCTTCCATTTCATCGAA3' ) (SEC. DE IDENT. No.2)) del cDNA del HCV de longitud completa y se subclonó en el vector de expresión baculovirus pFastBac™ HTa (Gibco/BRL) . Para el genotipo la del HCV, el DNA que codifica la proteina heterodimérica NS3-NS4A se amplificó mediante PCR (cebador directo: 5' CTCTCTAGATCAGCACTCTTCCATTTCATCGAACTC3' (SEC. DE IDENT. No.3); cebador inverso: 'CTCGGATCCGGCGCCCATCACGGCCTACTCCCAA3' (SEC. DE IDENT. No.4)) de la cepa H77 del genotipo la del HCV (proporcionado por ViroPharma Inc., Exton, PA, US) y subclonado como se describe anteriormente. La clonación en el vector de expresión baculovirus FastBac™ HTa generó una proteina recombinante de fusión que contiene 28 residuos N-terminales adicionales que comprenden una etiqueta de hexahistidina y un sitio de escisión de proteasa rTEV. El sistema de expresión baculovirus Bac-to-Bac™ (Gibco/BRL) se usó para producir el baculovirus recombinante para la expresión de proteínas. La proteasa heterodímera etiquetada His NS3-NS4A se expresó infectando las células de insecto Sf21 (Invitrogen) a una densidad de 106 células/ml con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección de 0.1-0.2 a 27°C. El cultivo infectado se recogió de 48 a 64 horas más tarde mediante centrifugación a 4°C. El sedimento celular se homogenizó en 50 mM de fosfato de sodio, pH 7.5, 40% glicerol (p/v) , ß-mercaptoetanol 2mM. La proteasa heterodímera His-NS3-NS4A se extrajo después del lisado celular con NP-40 al 1.5%, Tritón X-100 al 0.5%, NaCl 0.5M, y un tratamiento con DNasa. Después de ultracentrifugación (lOO.OOOxg durante 30 minutos a 4°C) , el extracto soluble se diluyó 4 veces en fosfato sódico 50 mM, pH 7.5, NaCl 0.5 M y cargado en una columna Pharmacia Hi-Trap Ni+2-quelante. La proteír.a heterodimérica His-NS3-NS4A se eluyó usando un gradiente de imidazol a 50-400 mM preparado en fosfato sódico 50 mM, pH 7.5, glicerol al 10% (p/v) , NP-40 al 0.1%, NaCl 0.5 M. Se verificó la co-purificación del complejo proteico maduro NS3 y NS4A mediante análisis de bandas Western de las proteínas purificadas que usan un antisuero anti-NS3 y un antisuero anti-NS4A producidos en el laboratorio. El dominio de proteasa NS3 purificado y el péptido H2N-PDREVLYREFDEMEEC-OH (SEC. DE IDENT. No. 5) se usaron para immunizar conejos para la producción de antisueros específicos para NS3 y NS4A respectivamente. El aminoácido N-terminal correcto de ambas proteínas se confirmó mediante secuenciación N-terminal de aminoácidos (PE Biosystems 491/491C Procise Sequencer) . Las enzimas purificadas se almacenaron a -80°C en fosfato de sodio 50 mM, pH 7.5, glicerol al 10% (p/v), NaCl 0.5 M, imizadol 0.25 M, NP-40 al 0.1%.

NS3/4A del HCV 2b y 3a Los genes de la proteasa NS3-NS4 de los genotipos 2b y 3a del HCV se amplificaron a partir del RNA aislado a partir de las muestras clínicas de pacientes infectados por el HCV obtenidas del Dr. G. Steinmann (Alemania) usando RT-PCR. Los cebadores usados para la RT-PCR fueron 5' CTCGGATCCGGCTCCCATTACTGCTTAC3' (SEC. DE IDENT. No. 6) como el cebador directo y 'GACGCGTCGACGCGGCCGCTCAGCACTCTTCCATTTCACTGAA3' (SEC. DE IDENT. No.7) como el cebador inverso para la NS3-NS4A del genotipo 2b del HCV y; 5 ' CTCGGATCGGGCCCCGATCACAGCATACGCC3 ' (SEC. DE IDENT. No. 8) como el cebador directo y ' CACCGCTCGAGTCAGCATTCTTCCATCTCATCATATTGTTG3' (SEC. DE IDENT. No. 9) como el cebador inverso para el genotipo 3a del HCV. Cada cebador contenia un único sitio de restricción para subclonar el fragmento en el vector de expresión bacteriano pETlla. El clonaje dentro del vector generó una proteina de fusión recombinante conteniendo 28 residuos adicionales N-terminales que comprendían una etiqueta de hexahistidina y un sitio de escisión de la proteasa rTEV. Los plásmidos recombinantes se usaron para transformar la cepa bacteriana BL21 DE3 pLysS para la expresión de proteínas y la expresión de proteínas recombinantes se indujo por la adición de IPTG. Tras la expresión, las células se recogieron mediante centrifugación a 4°C y el sedimento celular se lisó en un tampón que contenía fosfato sódico 50mM, NaCl 0.5 , glicerol al 40%, NP-40 al 1.5%, Tritón X-100 al 0.5% y la fracción de proteínas soluble se hizo pasar a través de una columna de afinidad quelante HiTrap de 5 mi como se describió anteriormente. Una etapa de purificación de poli (ü) -Sefarosa se puede llevar a cabo opcionalmente con el fin de eliminar los productos de degradación y los contaminantes.

Ensayo de Proteasa NS3 del HCV In Mitro El sustrato fluorogénico depsipéptido usado para valorar la inhibición de actividad proteasa de la proteina heterodimérica NS3-NS4A de los HCV la, Ib, 2b, 2a-c y 3a fue antranilil-DDIVPAbu[C(O)-O]-AMY(3-N02)T -0H (SEC. DE IDENT. No.10). Este sustrato se escinde entre los residuos de aminobutírico (Abu) y los residuos de alanina. La secuencia DDIVPAbu-AMYTW (SEC. DE IDENT. No.11) se deriva de la secuencia DDIVPC-SMSYTW (SEC. DE IDENT. No. 12) que corresponde al sitio de escisión natural NS5A/NS5B. La introducción del residuo aminobutírico en la posición Pl resultó en un decrecimiento significativo del producto de inhibición N-terminal mientras que la supresión del residuo de serina en la posición P3 incrementó la eficiencia de desactivación interna. La actividad proteasa se ensayó en Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, citrato de sodio 0.25 M, n-dodecil-p-D-maltosido al 0.01%, TCEP 1 mM. El ensayo se llevó a cabo en una placa Microfluor®2 White Ü-Bottom Microtiter®. Se incubaron 5 µ? del sustrato y diversas concentraciones del compuesto prueba con 1.5 nM de proteina heterodímera NS3-NS4A del HCV la o Ib durante 45 minutos a 23°C bajo agitación suave. El contenido final de DMSO no excedió del 5.25%. La reacción se terminó mediante la adición de una disolución de ácido 2- [N-morfolino] etansulfónico 1 M a pH 5.8. La fluorescencia se controló usando el lector BMG POLARstar Galaxy de placa de 96 pocilios con un filtro de excitación de 320 nm, y un filtro de emisión de 405 nm. El nivel de inhibición (% de inhibición) de cada pocilio conteniendo el compuesto de prueba se calculó con la siguiente ecuación (FU = unidad de fluorescencia) : FU · pocilio — FU ¦ blanco % · inhibición = noo FU ¦ control - FU · blanco J Los valores de porcentaje de inhibición calculados se usaron después para determinar CI50, el factor pendiente (n) y la inhibición máxima (Imáx) mediante el procedimiento de rutina de regresión no lineal NLIN de SAS usando la siguiente ecuación : % - inhibición = J^x [ÍnkÍbÍdor7 [inhibidor]" + CI so" Determinación de la constante de inhibición (Ki) y modo de inhibición El sustrato depsipéptido fluorogénico antranilil-D(d)EIVP-Nva[C (O) -O] AMY ( 3-N02) TW-OH (SEC. DE IDENT. No.13) se usó para valorar el mecanismo de inhibición y las constantes de inhibición del compuesto (IV) frente a las proteasas NS3-NS4A del HCV. Se escindió entre los residuos de norvalina y los de alanina. La disolución de trabajo de sustrato se preparó en DMSO a la concentración de 200 µ? a partir de la disolución de reserva de sustrato (2 mM en DMSO almacenada a -20°C) . La concentración final de sustrato en el ensayo variaba de 0.25 a 8 µ?. La constante de inhibición (¾.) para el compuesto (IV) se determinó usando un procedimiento de velocidad en el estado estacionario (Morrisson y col. 1985) . La actividad proteasa se determinó controlando el cambio de fluorescencia asociado con la escisión del sustrato fluorogénico desactivado internamente usando un espectrofluorofotómetro SLM-AMINCO® 8100 (emisión a 325 nm y excitación a 420 nm) . La reacción de escisión se controló en presencia de 0.25-8 µ? de sustrato, 0.3 nM de la proteina heterodimera NS3-NS4A del HCV la o Ib y diversas concentraciones del compuesto prueba IV en Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, citrato de sodio 0.25 M, n-dodecil-p-D-maltosido al 0.01%, TCEP 1 mM. Los análisis en el estado estacionario de la inhibición de las proteasas heterodimerasa NS3-NS4A del genotipo la y del genotipo Ib del HCV se llevaron a cabo usando los procedimientos gráficos de Dixon y Cornish-Bowden . En el procedimiento gráfico de Dixon, la velocidad reciproca 1/V se traza frente a la concentración del compuesto prueba a varias concentraciones de sustrato (S) . En el procedimiento gráfico de Cornish-Bowden, la razón S/V se traza frente a la concentración del compuesto prueba a varias concentraciones S. Para ambos procedimientos, los puntos se hallan en una linea recta en cada valor de S. Para un compuesto prueba competitivo, el gráfico de Dixon muestra lineas a diferentes valores de S que intersectan en un único punto, mientras que el gráfico de Cornish-Bowden muestra lineas paralelas a diferentes valores de S. El K¿ se estimó adecuando los datos a la ecuación que describe la unión competitiva : Inhibición de proteasas NS3 del HCV La actividad de las proteasas NS3/NS4A heterodímeras de los genotipos la, Ib, 2b, 2a-c y 3a del HCV se determinó en presencia del compuesto (IV) usando el ensayo fluorogénico enzimático in vitro. Las curvas CI50 se analizaron individualmente mediante el procedimiento Sí¾S NLIN. Para la proteasa NS3-NS4A del HCV la, se obtuvo del análisis de dos lotes del compuesto (IV) un valor promedio de CI50 de 4.3 nM. ün valor promedio de CI50 de 3.4 nM se obtuvo del análisis de dos lotes del compuesto (IV) en presencia de -la proteasa NS3-NS4A del HCV Ib. Tabla 1 CI50 de diferentes inhibidores de proteasa NS3 en HCV de diferentes genotipos n/d= no ec o Las Figuras 3A y 3B ilustran las curvas CI50 del compuesto (IV) frente a las proteasas NS3-NS4A del HCV la y Ib, respectivamente . Se encontró que el compuesto (IV) es un compuesto prueba competitivo de las proteasas NS3-NS4A del genotipo la y del genotipo Ib del HCV tras la adecuación de los datos a la ecuación que describe la unión competitiva con GraFit y también de los procedimientos gráficos de Dixon y Cornish-Bowden. Para ambas enzimas de genotipos del HCV, el gráfico de Dixon mostró que las lineas a diferentes valores de S están intersectando en un único punto, mientras que el gráfico de Cornish-Bowden muestra lineas paralelas a diferentes valores de S. Se obtuvo una ?± de 0.30 nM para el compuesto (IV) del análisis de velocidad del estado estacionario con la proteasa NS3-NS4A del genotipo la del HCV, mientras que se obtuvo una K± de 0.66 nM con la proteasa NS3-NS4A del genotipo Ib del HCV, KA de 90 nM, 86 nM y 83 nM con el genotipo 3a, el genotipo 2a-c y el genotipo 2b del HCV respectivamente. Las Figuras 4 y 5 son los gráficos de Dixon y de Cornish-Bowden del compuesto (IV) frente a las proteasas NS3-NS4A del genotipo la y el genotipo Ib del HCV, respectivamente.

Ejemplo 2 - Inhibición del replicón la y/o Ib del HCV Ensayos de replicón de RNA del HCV la y Ib basados en células La replicación del RNA del HCV se manifestó en HCV y Ib que contiene replicón, las lineas celulares derivadas de Huh-7 se desarrollaron en Boehringer Ingelheim (Canadá) Ltd. , R & D (documento WO 02/052015) . Estas células se usan para establecer un ensayo basado en células de replicación de RNA de HCV sensible para los compuestos prueba candidatos a análisis. Las células Huh7 que mantienen de forma estable un replicón subgenómico del HCV se establecieron como se describe previamente (Lohman y col. 1999; documento WO 02/052015). Las células se sembraron en un grupo de 96 pocilios de cultivo celular a 1 X 104 células por pocilio en DMEM complementado con FBS al 10%, penstrep (Life Technologies) y geneticina ?µ?/ml. Las células se incubaron en una incubadora con atmósfera con C02 al 5% a 37 °C hasta la adición de diversas concentraciones del compuesto prueba. El compuesto prueba se preparó para usar en el ensayo como sigue. El compuesto prueba en DMSO al 100% se agregó diluido en un medio de ensayo para una concentración final de DMSO del 0.5% y la disolución se sónico durante 15 minutos y se filtró a través de una Unidad de Filtro Millipore de 0.22 µ?. Las diluciones seriadas de los compuestos prueba se prepararon usando Medio de Ensayo (que contiene DMSO al 0.5%). El medio de cultivo celular se aspiró de la placa de 96 pocilios conteniendo las células, y la dilución apropiada del compuesto prueba en medio de ensayo se transfirió a los pocilios independientes de la placa de cultivo celular los cuales se incubaron a 37° con C02 al 5%. Tras un periodo de incubación de 3 días, las células se lavaron con PBS y se extrajo el RNA celular total con el RNeasy Mini Kit® y Qiashredder® de Qiagen. El RNA de cada pocilio se eluyó en 50 µ?. de ¾0. Se cuantificó el RNA mediante la densidad óptica a 260 nra en el espectrofotómetro de ultravioleta-visible Cary 1E®. El número de copias del replicón de RNA del HCV se evaluó mediante RT-PCR en tiempo real con el sistema de detección de secuencia Abi Prism® 7700. El kit TAQMAN EZ® RT-PCR proporciona un sistema para la detección y análisis de RNA. La detección directa del producto de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) de trascripción inversa con ningún procedimiento posterior se lleva a cabo controlando el incremento en fluorescencia de una sonda de DNA marcada con tinción. La secuencia de nucleótidos de ambos cebadores y la sonda se localiza en la región 5' del genoma del HCV. El número de copias del replicón se evaluó después usando una curva estándar hecha con cantidades conocidas de copia del replicón (suplementada con 50 ng de Huh-7 de RNA tipo salvaje) sometidas a ensayo en la misma mezcla de reacción. Los siguientes parámetros de ciclo térmico se usaron para la reacción RT-PCR en el sistema de detección de secuencia ABI Prism® 7700. Las condiciones se optimizaron para la detección del HCV. La cuantificación se basa en el ciclo de umbral, donde el gráfico de la amplificación cruza un umbral de fluorescencia definido. La comparación de los ciclos de umbral proporciona una medida altamente sensible de la concentración modelo relativa en diferentes muestras. El control durante los primeros ciclos, cuando la fidelidad de la PCR está en su punto más alto, proporciona datos precisos para la identificación segura. La concentración modelo relativa se puede convertir a números reales usando la curva estándar del HCV con número de copias conocido.

Adecuación a la curva de CE5g con Procedimientos NLIN de SAS El nivel de inhibición (porcentaje de inhibición) de cada pocilio que contiene compuesto prueba se calculó con la siguiente ecuación (CN = número de copias de replicón del HCV) : CN ¦ control - CN · pocilio % · inhibición = * 100 CN ¦ control Los valores de porcentaje de inhibición se usaron después para determinar CE50, factor de pendiente (n) e inhibición máxima (Imáx) mediante el procedimiento de SAS de rutina de regresión no lineal NLIN usando la siguiente ecuación : % . inhibición= ¡^ [inhibidor]" [inhibidor]" + CE50" Tabla 2 CE50 (nM) de diferentes inhibidores de proteasa NS3 en HCV de diferentes genotipos En ensayos basados en células del replicón del HCV, el compuesto (IV) mostró una inhibición dependiente de dosis de replicación de RNA del HCV con CE50 de 2.1 nM y 1 nM usando células que contenían replicón del genotipo la y el genotipo Ib del HCV, respectivamente. No se observó citotoxicidad a concentraciones mayores de 1000 nM. Estos resultados indican que los compuestos II, III, IV, VI, VII y VIII son inhibidores potentes y específicos de replicación de RNA del HCV basada en células. El compuesto V es un compuesto de una clase diferente pero el cual está relacionado en estructura, y es también activo frente a la proteasa NS3 pero menos potente. Este compuesto se usará más tarde como un control para comparar niveles de actividad inhibitoria.

Los compuestos VI, VII y VIII tienen las siguientes estructuras : compuesto (VI) compuesto (VII) compuesto (VIII) Ejemplo 3 - Inhibición de proteasa NS3/4A del GBV-B por compuestos II, III y IV Clonación de proteasa NS3/NS4A del GBV-B Se aisló el gen de proteasa NS3/NS4A del GBV-B en su longitud completa de suero de tamarino infectado. El RNA total se aisló del suero usando el kit de extracción de RNA viral de Qiagen® de acuerdo con protocolo estándar. La selección de los cebadores de la transcriptasa inversa y las reacciones de PCR se seleccionaron con base en la secuencia publicada (Muerhoff, A.S y col. 1995) y número de acceso del Banco de Genes U22304 (directa: 5' CGCATATGGCACCTTTTACGCTGCAGTGTC3' (SEC. DE IDENT. No.14); inversa: 5 ' CGCGCGCTCGAGACACTCCTCCACGATTTCTTC3 ' (SEC. DE IDENT. No.15)). El producto RT-PCR amplificado se clonó en el plásmido que contiene etiqueta de polihistidina pET-29 entre los sitios Ndel y Xhol en trama con la etiqueta de polihistidina. Esta construcción produce una proteína recombinante con una etiqueta de polihistidina en su extremo C-terminal. El plásmido se transformó en BL21 DE3 pLysS para la expresión de la proteína. El clon pGBV-B de E. coli se cultivó en un medio LB hasta una densidad celular (??e??) de 0.6 momento en el cual se agregó IPTG a una concentración de 0.2 mM. La inducción se hizo a 23°C durante un periodo de 4 horas. La proteína NS3/NS4A-His del GBV-B se purificó de acuerdo al procedimiento descrito por Zhong y col., 1999. La fracción soluble se purificó en una columna de afinidad quelante de Ni2+ de Pharmacia® Hi-Trap usando un gradiente de imidazol de 50 a 400 mM. Esta etapa se siguió por cromatografía de la preparación de proteína en una columna de filtración de gel Superdex® 200. La concentración de la preparación de proteínas se determinó mediante el ensayo de proteínas Bradford.

Ensayo de la proteasa NS3 del GBV-B in vitro El sustrato depsipéptido usado para valorar la inhibición de la actividad proteasa de la proteina heterodimera NS3-NS4A del GBV-B fue Ac-DED (EDANS) EE-Abu [C (O) -O] ASK (DABCYL) -NH2 (SEC. DE IDENT. No. 16) . Este sustrato se escinde entre los residuos aminobutirico (Abu) y los residuos de alanina y los productos de la reacción se analizaron por HPLC. La actividad proteasa se ensayó en Tris-HCl 50 mM, pH 8.0, citrato de sodio 0.25 M, n-dodecil- -D-maltosida al 0.01%, TCEP 1 mM. El ensayo se llevó a cabo en una placa Microfluor®2 White Ü-Bottom Microtiter® . 5 µ? del sustrato y diversas concentraciones de los compuestos prueba se incubaron con 0.4 nM de la proteina heterodimera NS3-NS4A del GBV-B durante 2 horas a 23°C bajo agitación suave. El contenido final de DMSO no excederá el 5.25%. La reacción se terminará mediante la adición de una disolución de ácido 2- [N-morfolino] etansulfónico 1 M a pH 5.8. Para la cuantificación, los productos de escisión y el sustrato se separaron mediante HPLC en una columna Perkin-Elmer® 3x3CR C8. La separación se llevó a cabo eluyendo inicialmente a 3.5 ml/min con una disolución acuosa que contenia ácido fosfórico al 0.05% y SDS 3 mM. Se aplicó después durante 10 minutos un gradiente lineal 0—45% de acetonitrilo en ácido fosfórico al 0.05%. La absorbancia se controló a 210 nm. El ensayo se llevó a cabo en presencia de los compuestos prueba II, III, IV y V. El CI50 obtenido para cada compuesto prueba en presencia de proteina NS3-4A del GBV-B se indica en la Tabla 3. TABLA 3 El compuesto V es un compuesto de una clase distinta el cual está relacionado en su estructura y es también activo contra la proteasa NS3 pero menos activo que los compuestos II, III y IV. Este compuesto se incluyó para demostrar que el grado de actividad de los compuestos II, III y IV se mantuvo entre HCV y GBV-B.

Inhibición de la replicación de GBV-B en hepatocitos de tamarino en cultivo Los hepatocitos aislados de tamarinos no infectados se mantuvo en cultivo en un medio definido durante varios dias. El modelo de cultivo celular fue como se describe en Beames y col. 2000. Tres dias después de colocar en placas, las células se infectaron con plasma que contenia GBV-B. Después de la adsorción viral, los virus se eliminaron y las células se incubaron en presencia y ausencia de compuestos prueba candidatos a una concentración de 10 µ?. Las células se recogieron 7 dias después de la infección. Los niveles de RNA de GBV-B se cuantificaron a partir del RNA celular total por un ensayo de PCR en tiempo real que usa una combinación cebador-sonda que reconoce una parte del gen de la cápsida del GBV-B (Beames y col . 2000) . A pesar del CI5o inferior obtenido en el ensayo enzimático, los resultados ilustrados en la Figura 6, muestran que se observó una reducción en los niveles de RNA viral de más de 3 a nivel logarítmico cuando las células se incubaron en presencia del compuesto III y una reducción de 2 a nivel logarítmico en presencia del compuesto V (cuando los resultados se expresaron como g.e. (equivalentes de genoma) de RNA). Los resultados obtenidos con este ensayo de replicación viral más representativo demuestran que estos compuestos son antivirales efectivos para reducir la producción de virus GBV-B.

Ejemplo 4 - Comparación de secuencias de proteasas NS3 en la familia Flavivirldae Se obtuvieron las secuencias de proteasas de otros virus de la familia de virus Flaviviridae a partir de un análisis BLAST (Altschul y col. 1997) NCBI seguido por la notificación de taxonomia. La búsqueda de secuencias de proteasa se hizo usando criterios específicos que recuperan todas las secuencias de Flaviviridae con similitud a la proteasa de HCV excluyendo las propias secuencias del HCV. Cuando fue posible se usó una secuencia "NP_" de NCBI para representar un grupo particular de virus relacionados ya que estas secuencias "NP_" son secuencias "de referencia" (RefSeq) . Además, cuando no se conocían, los extremos N-terminal y C-terminal NS3 para las proteasas se determinaron a partir de la similitud con la proteasa NS3 del HCV. Los alineamientos de secuencia de proteasas para las seis cepas del HCV contra los diferentes grupos de virus se llevaron a cabo usando ALIGNX (VectorNTI®) basado en CLUSTALW (Thompson, JD, y col., 1994). A partir de estos alineamientos, el porcentaje de similitud se calculó entre todas las secuencias individuales y se expresó en las Tablas 4-8. La similitud se basó en los siguientes grupos de aminoácidos; [ILVM] , [FWY] , [KR] , [DE], [GA], [NQ], [ST] . La Tabla 4 representa identidades y similitudes entre varios genotipos y subtipos del HCV. Alguien puede ver que las identidades varían entre 70%-89% mientras que las similitudes varían entre 77%-95% demostrando que la proteasa NS3 se conserva altamente entre los HCV. Además, a partir del alineamiento de secuencia de aminoácidos del dominio proteasa NS3 de diversos genotipos de HCV representativos (Figura 2) y la localización de los residuos conservados en la estructura tridimensional (Figura 8), alguien puede ver que los residuos en el sitio activo se conservan altamente entre genotipos y subtipos de HCV. La Tabla 5 es un análisis de las similitudes entre los dominios de la proteasa NS3 del virus GB y de la proteasa del virus HCV. Las similitudes varían entre 43-49%, mientras que las similitudes entre los dominios de NS3 entre el HCV y los pestivirus varían del 25 al 30% (Tabla 6) . Las similitudes entre el HCV y el virus del dengue varían también alrededor del 30% (Tabla 7), igual que la similitud entre el HCV y los Flavivirus (Tabla 8) . En contraste, la Tabla 9 muestra que las similitudes entre el dominio de la proteasa NS3 de HCV y la proteasa del Citomegalovirus Humano (HCMV) gira alrededor del 20%. El HCMV es un virus de los herpes virus y tiene una serina proteasa que tiene una tríada catalítica diferente de las proteasas Flaviviridae. La proteasa del virus HCMV no se considera por lo tanto que es similar a las proteasas NS3 de Flaviviridae. Este contraste se ilustrará adicionalmente cuando se hace comparación de las similitudes entre el aminoácido en contacto con nuestros inhibidores en Flaviviridae y HCMV.

Ejemplo 5 - Estudios del cristal estructural tridimensional Para analizar adicionalmente las similitudes entre Flaviviridae, se obtuvo una estructura cristalina de la proteasa NS3 del HCV formando un complejo con un inhibidor, y los aminoácidos directamente en contacto con el inhibidor se analizaron en otros Flaviviridae para valorar los grados de similitud de estos importantes puntos de contacto. Se obtuvo un co-cristal de la proteasa NS3-péptido NS4A formando un complejo con el compuesto macrociclico (II) que produjo difracción en los rayos X a una resolución de 2,75 Á. El compuesto macrociclico II se encontró en el sitio activo de la proteasa NS3 y se definió claramente en la diferencia de densidad de electrones. Esta estructura revela detalles moleculares de como el compuesto prueba se interacciona con el sitio activo y proporciona entendimiento adicional en el mecanismo de inhibición de la proteasa NS3 del HCV. La estructura del complejo de la proteasa NS3 con el compuesto prueba II (Figura 8) define mejor el sitio de unión de las presentes series de compuestos prueba basados en sustrato. A partir de esta estructura del co-complejo, los residuos directamente en contacto con el compuesto prueba es decir dentro de 3 Á (H57, G137, S139, A156 y A157) son indicativos del sitio activo, como se predice mediante el modo competitivo de inhibición, y por la conservación entre secuencias representativas de genotipos y varios subtipos de HCV en este sitio. Otros residuos en contacto dentro de 4Á del compuesto prueba se enumeran en la Tabla 10. Los análisis de comparación revelan que estos aminoácidos se conservan altamente entre Flaviviridae variando entre un 59% y un 76%. La conservación de estos residuos entre Flaviviridae es indicativa de que los inhibidores de la proteasa NS3 del HCV inhibirían también otros miembros de la familia de virus Flaviviridae. En contraste, el nivel de similitud del sitio catalítico de la proteasa del HCMV y los puntos de contacto de la Tabla 10 están en el mismo intervalo que la similitud para la proteasa entera (~20%) ilustrando una vez más el hecho de que otra serina proteasa no de Flaviviridae no es diana de los compuestos de la fórmula (I) · Otros estudios estructurales llevados a cabo entre los dominios de proteasa del HCV y el virus del dengue han mostrado que todas las seis cadenas del sitio de unión del inhibidor del dominio C-terminal estén fuertemente conservadas y son de longitud comparable. La superposición de 68 átomos de carbono a del dominio C-terminal de la proteasa Den2 (residuos 87-167) y del HCV incluyendo la mayoría de los residuos en la Tabla 10 (residuos 69-189) produce desviación a.r.m.s. de 0.9 Á. (Murthy y col., 1999).

Discusión Los virus dentro de la familia Flaviviridae poseen un número de similitudes (Figura 1) a pesar de una homología de secuencia general relativamente baja entre sus miembros (Tablas 4-8) . En particular, la proteína NS3 contiene secuencias con similitud a la proteasa y la helicasa de unión a nucleósido trifosfato de pestivirus y flavi irus . El dominio de la proteasa NS3 del HCV comparte una similitud de secuencia de aproximadamente 77-95% entre los genotipos del HCV (Figura 1) y una similitud de secuencia de aproximadamente 25-50% con otros miembros de la familia Flaviviridae (Tablas 4-8) . Además, la organización y estructura genómicas del GBV-B y el HCV son similares a pesar del hecho de que la homología de secuencia entre las secuencias de poliproteína del GBV-B y el HCV es de aproximadamente 25 a 30%. Esta baja similitud está sin embargo superada por el hecho de que los residuos que vienen en contacto con el inhibidor están altamente conservados dentr del dominio proteasa de Flaviviridae, una fuerte indicación de que esta familia de compuestos se uniría también a otros Flaviviridae. La actividad del compuesto IV obtenido contra GBV-B es una demostración positiva de esa hipótesis. Con respecto a la estructura tridimensional, los coordinados atómicos disponibles de las diversas proteasas NS3 cristalizadas de HCV y dengue mostraron una arquitectura general que es característica del pliegue similar a tripsina.

Muchos estudios han establecido ahora firmemente que la parte N-terminal de la región NS3 codifica una serina proteasa que tiene un papel muy especifico y fundamental en el procesamiento de la poliproteina viral dentro de la Flaviviridae. Todos los resultados producidos en los experimentos anteriores tienden a sostener el punto de vista de que los compuestos de la fórmula (I) son activos contra miembros de la familia de virus Flaviviridae: • 6 compuestos relacionados han mostrado ser activos contra el HCV Ib y tienen actividad similar contra el HCV la (Tabla 2) ; • 3 de estos compuestos se probaron también contra los HCV 3a, 2a-c y 2b y se encontró también que son activos (Tabla 1) ; • estos 3 mismos compuestos se probaron en el ensayo enzimático contra el GBV-B y se halló que son activos (Tabla 3) ; • 1 de estos compuestos se probó en cultivo celular contra la replicación de GBV-B en células de tamarino y se halló que es activo (Figura 6) ; • 1 de estos compuestos manifestó un modo de unión que se sitúa en una región altamente conservada entre todos los miembros de Flaviviridae (Figura 8); • estudios han demostrado fuerte similitud estructural y funcional entre las proteasas NS3 del HCV y el virus del dengue. Dadas todas las similitudes de virus dentro de la familia de virus Flaviviridae, parece altamente probable que los compuestos de la fórmula (I) son efectivos contra miembros de la familia de virus Flaviviridae, y más particularmente, efectivos contra los miembros patogénicos de la familia Flaviviridae.

REFERENCIAS - Altschul S.F. y col. 1997, Nuciere Acids Res. 25, 3389-3402 - Ausubel y col. 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, Nueva York - Beames, B. y col. 2000, J. Virol., 74, 11764-11772 - Butriewicz, N. y col. 2000, J. Virol., 74r 4291-4301 - Kim JL, y col. 1996, Cell; 87 : 343-355. - Lin, C. y col. 1995, J. Virol. 69, 4373-4380 - Lohmann y col. 1999, Science 285, 110 - Love R. A. y col. 1996 Cell 87, 331-342 - Morrison, J.F. y Stone, S.R. 1985, Mol. Cell. Biophys . 2, 347-368 - Muerhoff, A.S. y col. 1995 J. Virol.69, 5621-5630 - Murthy, H. M. y col. 1999, J. Biol. Chem. 274(9), 5573-5580 - Remington, 1995, The Science and Practice of Pharmacy - Ryan, M. D. y col. 1998 J. Gen. Virol. 79, 947-959 - Sambrook y col. 1989, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs - Scarselli, E . , y col. 1997, J. Virol . 71, 4985-4989 - Steinkuler, C. y col. 1996, J. Biol. Chem. 271, 6367-6373. - Thompson, y col. 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673- 4680 - Zhong, W. y col. 1999, Virology 261, 216-226 o O Tabla 4 - Identidades y similitudes entre proteasas NS3 (Jl se obtuvo similitud de valoración definiendo las siguientes similitud de aminoácidos: [ILV ], [FWY], £KR], £DEJ, [GA], INOJ, [ST] dominios (180 aminoácidos) de los diferentes genotipos y subtipos TABLA 5 - PORCENTAJE DE SIMILITUD DEL DOMINIO PROTEASA NS3 DEL HCV(181 AA) CON PROTEASAS GBNS3 DE LA FAMILIA FLAVIVIRIDAE Matriz: [ILVM] , [FWY] , [KR] , [DE] , [GA] , [NQ] , [ST] TABLA 6 - PORCENTAJE DE SIMILITUD DEL DOMINIO PROTEASA NS3 DEL HCV(181 AA) CON PROTEASAS NS3 DE PESTIVIRUS NS3 DE LA FAMILIA FLAVIVIRIDAJE uv-¿= virus ae la aiarrea covina TABLA 7 - PORCENTAJE DE SIMILITUD DEL DOMINIO PROTEASA NS3 DEL HCV(181 AA) CON PROTEASAS NS3 DEL FLAVIVIRUS LLEVADO POR MOSQUITO DE LA FAMILIA FLAVIVIRIDAE Dengue 1 Dengue 2 Dengue 3 Dengue 4 NP 05943 NP 056776 NP_040961 NP_073286 3 la 26 27 28 29 AF271632 Ib 29 29 30 31 D90208 2a 27 29 28 28 D00944 2b 29 29 29 29 D10988 3a 27 29 29 29 D17763 10a 28 29 30 29 D63821 4a 27 27 28 30 Y11604 5a 29 30 31 30 Y13184 6a 29 30 30 31 Y12083 lia D63822 29 29 30 30 -1 s Cn Tabla 8 - Porcentaje de similitud del dominio proteasa NS3 del HCV (181 aa) con proteasas NS3 del flavivirus de la familia flaviviridae WVN= virus del Nilo Oeste JEV= virus de la encefalitis japonesa Kunjin= virus Kunjin YFV= virus de la fiebre amarilla MVEV= virus de la encefalitis del valle Murray TABLA 9 - PORCENTAJE DE SIMILITUD DEL DOMINIO PROTEASA DEL HCV (181 AA) CON EL DOMINIO PROTEASA DEL CITOMEGALOVIRUS HUMANO (256 AA) proteasa del HCMV la AF271632 20 Ib D90208 20 2a D00944 21 2b D10988 20 3a 18 D17763 10a D63821 18 4a Y11604 19 5a Y13184 19 6a Y12083 19 lia D63822 19 I— 1 o O Cn Tabla 10 - Diferencias de aminoácidos en el dominio de unión a inhibidor de la proteasa NS3 entre virus de la familia flavivirdae (dentro de los 4 A del inhibidor) HCV40_1b : Secuencia de un aislado de HCV 1b que se usó como referencia para este análisis n : número de secuencias de todos los genotipos de HCV que se usan en el estudio An : número de secuencias de que contienen esta modificación % Sim : % de similitud + : Similitud de acuerdo con la matriz [ILVM], [FWY], [KR], [DE], [GA], [NQ], [ST] = : Similitudes que son únicas para el miembro GBV-B del grupo GBV GBVa : el aminoácido marcado es el residuo encontrado para la proteasa NS3 del GBV-B b : porcentaje de similitud para GBV-B

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Uso de un compuesto de la fórmula (I) :
2. Fórmula (I) en la que, A se selecciona de: alquilo de Ci~C6 y cicloalquilo de C3-C6; y B se selecciona de: fenilo o tiazolilo, ambos de los cuales están opcionalmente sustituidos con un grupo seleccionado de NH (R1) y NHfCOlR1, en los que R1 es alquilo de Ci-C6; y R es OH o un grupo sulfonamida de la fórmula -NHS02-R2 en el que R2 es -alquil (Ci_g) , -cicloalquil (C3-7) o { -alquil (Ci_6) -cicloalquil (C3_ 6) }, los cuales se sustituyen opcionalmente de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro, O- alquil ( is) , amido, amino o fenilo, o R2 es arilo C6 o Cío el cual se sustituye opcionalmente de 1 a 3 veces con halo, ciano, nitro, alquil (Ci-6) , O-alquil (C1-6) , amido, amino o fenilo; o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma; para la preparación de un medicamento para el tratamiento de la infección viral con Flaviviridae en un mamífero . 2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde A de la fórmula (I) es un grupo ramificado alquilo de C4-C6 o cicloalquilo de C4-C6; B de la fórmula (I) es fenilo o un tiazol sustituido en la posición 2 con NH (R1) o NH(CO) R1 en el cual R1 es un alquilo de Ci-C4; y R es OH o un grupo sulfonamida de la formula -NHS02-R2 en el que R2 es -alquil (Ci-e) , -cicloalquil (C3-6) , tanto opcionalmente sustituido 1 ó 2 veces con halo como con fenilo, o R2 es arilo C6 opcionalmente sustituido desde 1 6 2 veces con halo o alquil (Ci_ e) ·
3. 3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en donde A es ciclopentilo o tere-butilo; B es un tiazol sustituido en la posición 2 con NH (R1) o NH(CO) R1 en el cual R1 es un alquilo de Ci-C4; y R es OH o un grupo sulfonamida en el que R2 es metilo, ciclopropilo o fenilo.
4. 4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho compuesto es un compuesto de la fórmula (I) en el que R es OH.
5. 5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que R es un grupo sulfonamida de la formula -NHS02-R2 en el que R2 es -alquil (Ci_6) , -cicloalquil (C3_6) , ambos opcionalmente sustituidos 1 6 2 veces con halo o fenilo, o R2 es arilo Ce opcionalmente sustituido desde 1 ó 2 veces con halo o alquil (Ci_6) .
6. 6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que A es ciclopentilo; B es un tlazol sustituido en su posición 2 con NHCH(C¾)2; y R es OH o un grupo sulfonamida en el que R2 es metilo, ciclopropilo o fenilo .
7. 7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho mamífero es un humano, y la Flaviviridae se selecciona del grupo constituido por virus de la fiebre amarilla, virus del Nilo Oeste, virus de la fiebre del dengue, virus de la encefalitis japonesa, virus GB A o C y virus de la hepatitis G.
8. 8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho mamífero es un bovino doméstico, y la Flaviviridae se selecciona del BVDV, virus de la enfermedad de la frontera.
9. 9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho mamífero es un cerdo, y la Flaviviridae es el Virus de Fiebre Porcina Clásica.
10. 10. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho mamífero es un humano, y la Flaviviridae es virus de la hepatitis C.
11. 11. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho mamífero es un humano, y la Flaviviridae se selecciona del grupo constituido por Virus de la Fiebre Amarilla, Virus del Nilo Oeste, virus de la fiebre del Dengue, virus de la Encefalitis Japonesa, virus GB A o C y virus de la hepatitis G.
12. 12. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho mamifero es un bovino doméstico, y la Flaviviridae se selecciona del BVDV, virus de la enfermedad de la frontera.
13. 13. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho mamifero es un cerdo, y la Flaviviridae es el Virus de Fiebre Porcina Clásica.
14. 14. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho virus Flaviviridae comprende una proteasa NS3 que comprende residuos de aminoácidos seleccionados de: H57, G137, S139, A156 y A157.
15. 15. Un articulo de fabricación que comprende empaquetar el material contenido en el cual está una composición efectiva para inhibir un virus de la familia Flaviviridae y el material de empaquetamiento comprende una etiqueta la cual indica que la composición se puede usar para tratar infección por un virus de la familia Flaviviridae y, en el que dicha composición comprende un compuesto de la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1.