MXPA05003597A - Formulaciones nutricionales que contienen sustancias simbioticas. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan las composiciones nutricionales que comprenden oligofructosa, sialilactosa y bacterias probioticas, las cuales son utiles en la erradicacion de microorganismos patogenos en los tractos gastrointestinales de los pacientes.

Description

FORMULACIONES NUTRICIONALES QUE CONTIENEN SUSTANCIAS SIMBIOTICAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere a las formulaciones nutricionales que contienen simbióticos y al uso de tales formulaciones en la promoción del crecimiento de microorganismos benéficos, y la inhibición y erradicación de organismos patógenos en el tracto gastrointestinal de los pacientes. Más específicamente, esta invención se refiere a las formulaciones nutricionales que contienen oligofructosa y sialilactosa en combinación con cepas específicas de bacterias probióticas. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los simbióticos son "mezclas de probióticos y prebióticos que afectan benéficamente al hospedero al mejorar la supervivencia y la implantación de suplementos dietéticos microbianos vivos en el tractos gastrointestinal del hospedero". (Andersson et al. "Health effects of probiotics and prebiotics : A literature review on human studies" . Scand. J. Nutr. 45: 58-75 (2001)). Los prebióticos son ingredientes alimenticios no digeribles que pueden afectar benéficamente al hospedero al estimular selectivamente el desarrollo y/o la actividad de una o un número limitado de especies de bacterias ya Ref.: 162959 establecidas en el colon, y de este modo mejoran en efecto la salud del hospedero. (Gibson et al., "Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics. J. Nutrition 125: 167-176 (1995)). La oligofructosa es un prebiotico bien conocido que pasa a través del intestino delgado sin ser digerida, llegando al intestino grueso. En el intestino grueso, la oligofructosa es fermentada únicamente por una gama limitada de microorganismos que incluyen la mayoría de las especies de Bifidobacteria, por ejemplo, especies de bacterias benéficas para la salud humana. (Ver, por ejemplo, Bouhnik et al., "Short Chain Fructo-Oligosaccharide Administration Dose-Dependently Increases Fecal Bifidobacteria in Healthy Humans", J. Nutrition, 129-113-116 (1999)). Se sabe que la oligofructosa es un sustrato específico para las Bifidobacterias . (Ver, por ejemplo, Mitsuoka et al., "Effect of Fructo-oligosaccharides on Interstinal Microflora" , Die Nahrung, 3, 5-6: 427-436 (1987)). - Las bifidobacterias producen ácidos grasos de cadena corta como sub-productos de su metabolismo, dando como resultado una reducción del-pH del tracto digestivo. La Patente de los Estados Unidos No. 5,849,324 describe un método para reducir la incidencia de la otitis media al administrar enteralmente una cantidad efectiva de un oligosacárido no digerible libre de nitrógeno. Los oligosacáridos específicos son aquellos de la fructosa, xilosa y galactosa. La Patente de los Estados Unidos No. 5,827,526' describe un método para reducir la duración de la diarrea al administrar enteralmente , en una base profiláctica, una cantidad efectiva de un oligosacárido no digerible libre de nitrógeno . La Patente de los Estados Unidos No. 5,688,777 describe un método para inhibir la infección por Clostridium difficile al administrar enteralmente una cantidad efectiva de un oligosacárido no digerible libre de nitrógeno. La administración de oligosacáridos de fructosa específicos, redujo o eliminó C. difficile, medida por las unidades formadoras de colonias en heces (ufe), en ratones infectados. Las . sialilactosas son oligosacáridos que comprenden un ácido siálico y el disacárido lactosa. Los ácidos siálicos son una familia de aminoazúcares que contienen 9 o más átomos de carbono que son derivados N- y 0-sustituidos del ácido neuramínico. La especie más común del ácido siálico es el ácido N-acetilneuramínico . Las sialilactosas aparecen de manera natural en la leche humana así como en leche de otros mamíferos. No obstante, las sialilactosas están presentes a concentraciones perceptiblemente mayores en leche humana en comparación a otras especies de mamífero. Las dos especies principales de sialilactosa en la leche son 3 ' -sialilactosa y 6'-sialilactosa . Estas especies aparecen de manera natural en la leche humana a una proporción relativa de 1:3 (3' :6') . Se sabe que la sialilactosa tiene propiedades anti-adhesivas para las bacterias patógenas específicas. Por ejemplo, la sialilactosa actúa para inhibir la toxina del cólera in vit.ro (Idota et al., "Inhibition of Cholera Toxin by Human Milk Fractions and Sialyllactose", Biosci. Biotech. Biochem. 59: 417-419) y Helicobacter pylori (Simón et al., "Inhibition of Helicobacter pylori binding to Gastrointestinal Epithelial Cells by Sialic Acid-Containing Oligosaccharides" , Infection and Immunity, 750-757 (1997)). En vista de sus propiedades antiadhesivas, la sialilactosa ha sido utilizada para tratar un número de condiciones médicas. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 5,260,280 describe una composición que contiene oligosacáridos que tienen ácido siálico, que neutraliza los efectos de la enterotoxina bacteriana. Las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,514,600, 5,753,630 y 5,883,079 describen los métodos para tratar o prevenir una úlcera en el estómago- o el duodeno, o para inhibir la infección por Helicobacter pylori, respectivamente, al administrar una cantidad efectiva de un oligosacárido que contiene ácido siálico. La Patente de los Estados Unidos No. 5,620,965 se refiere a las composiciones para inhibir el enlace de la bacteria Helicobacter pylori a células del estómago o el duodeno mediante la administración de una cantidad efectiva de ciertos oligosacáridos . La Patente de los Estados Unidos No. 5,834,423 describe los derivados de ácido siálico que promueven la proliferación de bifidobacterias y el uso de cantidades efectivas de ciertos oligosacáridos sialilados como un agente antidiarreico . Los oligosacáridos sialilados comprenden 3'-sialilactosa y 6 ' -sialilactosa . El documento WO200160346 describe una composición nutricional que comprende las sustancias prebióticas oligofructosa y sialilactosa, que actúan sinérgicamente para estimular el desarrollo de las bifidobacterias benéficas. Los probióticos son ingredientes alimenticios microbianos vivos que tienen un efecto benéfico sobre la salud humana. (Salminen et al., "Functional food science and gastrointestinal physiology and function" . Brit. J. Nutr. 80 (suppl. 1): S147-S171 (1998)). Las bacterias probióticas más comúnmente son "bacterias de ácido láctico", llamadas asi debido a que éstas fermentan el carbohidrato hasta ácido láctico. Las cepas específicas más frecuentemente estudiadas incluyen los miembros de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium. (Sanders, "Probiotics" . Food Technol . 53: 67-77 (1999)). Algunas bacterias productos de ácido láctico producen especialmente ácido láctico como un producto principal de su metabolismo. Algunas producen predominantemente la forma "L" levógira del ácido láctico [ácido L (+) -láctico, otras producen predominantemente la forma "D" dextrogira de ácido láctico, mientras que otras producen el , ácido D-láctico y el ácido L-láctico. El L(+)-lactato es un intermediario normal del metabolismo de los mamíferos. El L(+)-lactato es oxidado rápidamente y de manera eficiente, por el hígado, el riñon y el cerebro. En contraste, el D(-)-lactato no es bien utilizado por los tejidos de mamífero, y puede conducir a acidosis en el infante humano . La especie de Lactobacill s casei GG, una bacteria probiótica comúnmente denominada como "Lactobacillus GG" o "LGG" , produce predominantemente la forma L levógira del ácido láctico [ácido L (+) -láctico] . LGG es encontrado en las heces de infantes y niños pequeños después de la administración oral. (Sepp et al., "Effect of administration of Lactobacillus casein . strain GG on the gastrointestinal microbiota of newborns" . Microb. Ecol. Health Dis. 6: 309-314 (1997); Sheen et al., "Short Report: A placebocontrolled study of Lactobacillus GG colonization in one-to-three-year-old Peruvian children". Am. J. Trop. Med. Hyg. 52: 389-392 (1995)). Un producto de leche que contiene LGG acortó significativamente la duración de la diarrea en niños pequeños. (Kaila et al., "Enhancement of the circulating antibody secreting cell response in human diarrhea by a human Lactobacillus strain" . Pediatr. Res. 32: 141-144 (1992); Isolauri et al . , "The human Lactobacillus strain (Lactobacillus casei sp GG) promotes recovery from acute diarrhea in children. Pediatrics . 88: 90-97 (1991)). Lactobacillus acidophilus produce cantidades aproximadamente iguales del D(-)-lactado y el L (+) -lactato . La leche fermentada que contiene L. acidophilus (cepa CRL730) y L. casei (cepa CRL431) eliminaron la enfermedad diarreica en cuatro días en promedio en infantes con síndrome de postgastroenteritis. La leche fermentada restauró la flora fecal a una flora predominantemente de ácido láctico. (Gonzales et al., "Biotherapeutic role of fermented milk" . Biotherapy. 8: 129-134 (1995) ) . La Patente de los Estados Unidos No. 5,908,646 describe un método para inhibir el desarrollo o actividad de especies de Clostridium en un producto alimenticio humano, mediante la adición de una cantidad efectiva del microorganismo benéfico, L. rha nosus [L. casei subespecie rhamnosus] , que produce predominantemente ácido L (+) -láctico . La Patente de los Estados Unidos No. 5,902,578 se refiere a una composición que contiene células viables de tres microorganismos específicos, benéficos para los microorganismos intestinales humanos, para prevenir la diarrea. Específ camente, los tres microorganismos son Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium infantis. La diarrea puede ser provocada por el tratamiento con antibiótico o por infección con un virus, una bacteria (por ejemplo, E. colí) o un parásito. La Patente de los Estados Unidos No. 5,716,615 se refiere a una composición que contiene varias bacterias diferentes para el tratamiento de trastornos gastrointestinales. Los microorganismos pueden ser seleccionados de especies liofilizadas de lactobacillus, incluyendo L. acidophilus, especies liofilizadas de bifidobacterium, incluyendo B. longum, B. infantis y B. bifidum, y Streptococcus thermophilus. B. lactis es una bacteria productora de ácido L(+)-láctico. ¦ Históricamente, B. lactis Bb-12 fue identificada en la literatura como "Bifidobacterium bifidum" . (Fukushima et al . , "Effect of a probiotic formula on intestinal immunoglobulin A production in healthy children" . Int. J. Food Microb. 42-39-44 (1998)). Una formula infantil no fermentada que contiene B. bifidum y Streptococcus thermophilus redujo la incidencia de diarrea aguda y la difusión de rotavirus. (Saavedra et al., "Feeding of Bifidobacterium bifidum and Streptococcus thermophilus to infants in hispital for prevention of diarrhoea and shedding of rotavirus". The Lancet . 344: 1046-49 (1994)).

. Una formula infantil fermentada que contiene B. bifidum y S. theirmophilus indujo una mayor prevalencia de colonización por bifidobacterias del intestino y un menor pH de las heces que una fórmula control no fermentada . (Langhendries et al., "Effect of a fermented infant formula containing viable Bifidobacteria on the fecal flora composition and pH of healthy full-term inf n s" . J. pediatr. Gastroenterol . Nutr. 21: 177-181 (1995)). Las fórmulas no fermentadas que contienen B. bifidum y S. thermophilus apoyaron el desarrollo interrumpido en niños desnutridos. Las fórmulas basadas- en leche que contenían las dos bacterias indujeron colonización probiotica del intestino. (Haschke -et al. (1998)) "Clinical triáis prove the safety and efficacy of the probiotic strain Bifidobacterium Bbl2 in follow-up formula and growing-up milks" . Monatsschr. Kinderheilkd. 146: S26-30 (1998). El documento W02000010582 describe las composiciones y metodologías para la utilización de una o más especies de cepas de bacterias productoras de ácido láctico, preferentemente cepas de Bacillus coagulans, para el control de patógenos del tracto gastrointestinal, incluyendo patógenos del tracto gastrointestinal resistentes a antibióticos, y sus enfermedades asociadas. La alimentación con una fórmula infantil que contiene el probiótico B. bifidum (efectivamente B. lactis Bbl2) y los galacto-oligosacáridos prebióticos para los niños normales, produjo una flora de las heces más favorables, con menos Clostridia y más bifidobacterias . (Fukushima et al. "Effect of follow-up formula containing Bifidobactería (NAN BP) on fecal flora and fecal metabolites in healthy children" . Bioscience Microflora. 16: 65-72 (1997)). La Patente de los Estados Unidos No. 6,241,983 describe una composición que contiene microorganismos intestinales humanos benéficos y una fuente de fibra dietética para promover la salud gastrointestinal . Más específicamente, el microorganismo puede ser seleccionado de especies de lactobacillus y bifidobacterium. Las fuentes de fibra dietética incluyen pentosanos, beta-glucanos, pectinas y polisacáridos pécticos, mananos, arabinanos y galactanos, oligosacáridos de fructosa, y mezclas de los mismos. La Patente de los Estados Unidos No. 5,744,134 reivindica una composición que contiene microorganismos intestinales humanos, benéficos y una fuente de fibra dietética para promover la salud gastrointestinal . Más específicamente, el microorganismo puede ser seleccionado de especies -de lactobacilus y bifidobacterium. Las fuentes de fibra dietética son inulina, oligosacáridos de fructosa, pectina, goma guar y mezclas de los mismos. El documento W02001015714 describe una composición útil para mejorar la inmunidad general. La composición incluye uno o más micronutrientes , uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de un prebiótico, probiótico y simbiótico, y excipiente en lípido o basado en carbohidrato . El documento WO2000033854 describe una preparación que tiene una acción promotora de la salud, en particular para la prevención y/o tratamiento de trastornos del tracto digestivo, que contiene uno o más probióticos y uno o más oligosacáridos no digeribles. Los probióticos son preferentemente elegidos de cepas bacterianas tales como una cepa de Lactobacillus o una especie de Bifidobacterium, y de cepas de levadura tales como una cepa de una especie de Saccharomyces . Los prebióticos pueden incluir goma de algarrobo hidrolizada, inulina, arabinogalactano, arabinoxilano, beta-glucano, L-arabinano, galactomanano y glucomanano . La Patente Europea EP-904784 describe una preparación nutricional con acción promotora de la salud, en particular con respecto a la prevención y tratamiento de desórdenes del tracto gastrointestinal, que comprende una cantidad efectiva de células viables de cada uno de los siguientes microorganismos: Bifidobacterium; Enterococcus faecium; y una cepa de Lactobacillus que produce predominantemente L(+)-lactato levógiro. Las especies ejemplares de bifidobacterium incluyen B. infantis y B. lactis.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención está relacionada a las composiciones nutricionales que comprenden oligofructosa, sialilactosa y bacterias probioticas. La presente invención está además dirigida a un método para inhibir o erradicar los organismos patógenos en el tracto gastrointestinal de pacientes, que comprende administrar enteralmente al paciente una composición que incluye oligofructosa, sialilactosa y bacteria probiótica. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los presentes inventores han encontrado que la combinación de oligofructosa, sialilactosa y bacterias probioticas erradica la infección intestinal con bacterias patógenas, particularmente E. coli enteropatógeno, y puede por lo tanto ser utilizada para la profilaxis de la diarrea debido al E. coli enteropatógeno. Las bacterias probióticas-preferidas para el uso en las presentes formulaciones incluyen L. acidophilus y B. lactis. La sialilactosa útil en las presentes composiciones, comprende 3 ' -sialilactosa y 6 ' -sialilactosa . Preferentemente, la sialilactosa utilizada en la presente es la 3 ' -sialilactosa . La sialilactosa puede ser preparada de acuerdo a cualquiera de los métodos descritos, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,575,916; 5,714,075; ,278,299; 5,374,541; y 5,876,980. No obstante, será reconocido por aquellos expertos en la técnica que cualquier otro método de síntesis y purificación de sialilactosa puede ser útil para preparar la sialilactosa utilizada en las presentes composiciones. La oligofructosa útil en esta invención puede ser preparada mediante cualquier método conocido de síntesis y/o aislamiento . Un forma comercialmente disponible de la oligofructosa útil en esta invención es Raftilose® disponible de Orafti S.A., Tienen, Bélgica. La oligofructosa comprende una serie de oligosacáridos encontrados de manera natural en los vegetales, tales como cebolla y la raíz de la planta de achicoria. La oligofructosa puede ser preparada industrialmente a partir de una polifructosa de origen natural (inulina) la cual puede ser encontrada en muchas plantas, incluyendo cebollas, puerros, trigo, achicoria y alcachofa de Jerusalem. La achicoria es la más comúnmente utilizada. La oligofructosa puede ser recuperada en cantidades suficientes de estas plantas mediante métodos conocidos en la técnica. La inulina de origen natural comprende oligofructosa y polímeros superiores de fructosa. La oligofructosa derivada de la inulina a partir de plantas tales como achicoria contiene cadenas de polifructosa y cadenas de polifructosa por una unidad de glucosa terminal.

La oligofructosa puede ser preparada mediante la síntesis en vez de mediante procedimientos de extracción . La oligofructosa puede ser sintetizada a partir de la sucrosa mediante transfructosilación, que es lograda por medio de una enzima, la ß-fructofuranosidasa, la cual enlaza los ironómeros de fructosa adicionales a la molécula de sucrosa. La oligofructosa formada de esta manera contiene unidades de fructosa enlazadas a una unidad de glucosa terminal . Los ej emplos de tales oligosacáridos de fructosa son cestosa (GF2) , nistosa (GF3 ) y f ructofuranosil-nistosa (GF4 ) . Una oligofructosa que comprende una mezcla de oligosacáridos preparados mediante métodos tales como éstos, es nutraFlora®, disponible de GTC Nutrition Company, Golden, CO . EUA . Los probióticos adecuados útiles en la presente invención son Bif idobacterium y Lactobacillus . Bif idobacterium lactis BB1 y Lactobacillus aciáophilus NCFM® son disponibles de Rhodia Inc . Las composiciones nutricionales de la presente invención pueden comprender (o pueden ser capaces de comprender después de la dilución con agua) 0.1 g/litro a 10 g/litro de oligofructosa; 6 mg/litro a 10 g/litro de sialilactosa; 10s a 1014 unidades formadoras de colonias (cfu) por litro de Lactobacillus; y 106 a 1014 cfu/litro de Bif idobacterium . Preferentemente , las presentes composiciones comprenden (o pueden ser capaces de comprender después de la dilución con agua) 0 . 3 g/litro a 6 g/litro de oligofructosa; 60 mg/litro a 1 g/litro de sialilactosa; 108 a 1012 unidades formadoras de colonias (cfu) por litro de Lactobacillus; y 108 a 1012 cfu/litro de Bifidobacterium. Más preferentemente las presentes formulaciones comprenden (o pueden ser capaces de comprender después de la dilución con agua) 1 g/litro a 3 g/litro de oligofructosa; 100 mg/litro a 600 g/litro de sialilactosa; 109 a 1011 unidades formadoras de colonias (cfu) por litro de Lactobacillus; y 109 a 1022 cfu/litro de Bifidobacterium y aún más preferentemente aproximadamente 3 g/litro de oligofructosa; aproximadamente 100 mg/litro de sialilactosa; aproximadamente 3 X 1010 cfu/litro de Lactobacillus; y 3 X 1010 cfu/litro de Bifidobacterium. Las composiciones nutricionales de la presente invención pueden ser utilizadas en combinación con o en la forma de diversos productos nutricionales, tales como la fórmula infantil, la fórmula de seguimiento, bebida para niños que empiezan a andar, leche, yogurt, productos basados en fruta para niños más grandes (tal como jugos de fruta) , caramelos, goma de mascar, pastillas, polvos, tabletas, etc. Preferentemente, las presentes conposiciones- nutricionales son utilizadas en la forma de una fórmula infantil. Cuando se utiliza como una fórmula infantil, ésta puede estar en la forma de un líquido o un polvo listo para utilizarse, el cual puede ser mezclado con agua y alimentado al niño. Es más preferido que la presente formulación sea agregada a la fórmula infantil en forma de polvo.

La fórmula infantil adecuada para el uso con la presente invención debe contener todas las vitaminas y minerales consideradas esenciales en una dieta diaria para niño. Es,tas vitaminas y minerales deben estar presentes en cantidades nutricionales significativas. Los ejemplos de vitaminas, minerales y otros nutrientes que pueden ser incluidos en las fórmulas infantiles en las cuales van a ser agregadas las presentes formulaciones, incluyen vitamina A, complejo de vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E, vitamina K, calcio, magnesio, sodio, potasio, fósforo, cobre, zinc, cloruro, yodo, selenio, hierro, niacina, ácido fólico, ácido pantoténico, biotina, colina, inositol y manganeso. La fórmula infantil puede contener una o más fuentes de lípidos como serán reconocidas por aquellos expertos en la técnica . La fórmula infantil puede contener además otras sustancias que se sabe tienen un efecto benéfico. Los ejemplos de tales sustancias incluyen nucleotidos, inmunoglobulinas, ácidos grasos poliinsaturados , etc. La presente invención es además ilustrada con referencia al siguiente ejemplo no limitante. EJEMPLO 1 Una fórmula infantil preferida de acuerdo a la presente invención proporciona los siguientes nutrientes cuando 127.3 gramos de la fórmula infantil se diluyen a un volumen de un litro con agua: Nutriente Unidades por litro Energía Kcal 672 Proteína g 15 Suero de leche : proporción de caseína 60-40 Grasa g 36 Carbohidrato, incluyendo g 72 Oligofructosa g 3.0 Sialilactosa mg 100 L. acidophilus NCFM cfu 3 X 10 10 B. lactis BB1 cfu 3 X 10 Vitamina A RE 750 Carotenoides naturales mixtos IU 400 Vitamina D mcg 10.6 Vitamina E IU 7.4 Vitamina K mcg 67.0 Vitamina Bl (tiamina) mcg 1000 Vitamina B2 (riboflavina) mcg 1500 Vitamina B6 (piridoxina) mcg 600 Vitamina B12 (cianocobalamina) mcg 2.0 Niacina mcg 9.0 Ácido fólico mcg 80 Ácido pantoténico mcg 3000 Biotina mcg 90 Vitamina C (ácido ascórbico) mg 20 Colina mg 100 Inositol mg 33 Calcio mg 460 Fósforo mg 333 Magnesio mg 64 Hierro mg 8.0 Zinc mg 6.0 Manganeso mcg 50 Cobre mcg 560 Yodo mcg 100 Sodio mg 160 Potasio mg 650 Cloro mg 433 Selenio mcg 14 El siguiente experimento ilustra la efectividad de Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium lactis para erradicar la infección intestinal con E. coli enteropatógeno . EXPERIMENTO Se diseñó el siguiente experimento para evaluar una combinación de Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium lactis como un medio de profilaxis de la diarrea debida al E. coli enteropatógeno ("EPEC") al infectar intencionalmente a monos infantes con este patógeno. Monos r esus infantes neonatos (Macaca mulato) fueron alimentados ya sea, en una base exclusiva, con fórmula infantil humanizada (S26, disponible de Wyeth Nutrition) o leche materna del nacimiento. Al comienzo de las ocho (8) a nueve (9) semanas de edad, a los monos se les administraron 10s unidades formadoras de colonias (ufe) de Escherichia coli (EPEC) E2348/69. El EPEC fue administrado ya sea en la fórmula infantil humanizada o en la leche materna mediante incubación orogástrica. Se evaluaron lá consistencia de las heces, el apetito, la temperatura corporal y la deshidratación. Se obtuvieron frotis rectales de cada mono en el día de la administración de EPEC y a los 3, 6 y 19 ó 21 días después de la inoculación. Un probiótico fue preparado mediante el mezclado de 150 gramos de una mezcla igual de L. acidophilus NCFM® (una marca de North Carolina Dairy Foundation) y Bifidobacterium infantis BB1 (ambos obtenidos de Rhodia Inc.) que contenía 1010 ufe/g de cada microorganismo. El probiótico fue incorporado dentro de la fórmula humanizada únicamente. Siete .días antes de la conclusión del estudio, todos los monos alimentados con la fórmula fueron cambiados a fórmulas suplementadas con la mezcla probiótica descrita anteriormente. El probiótico fue alimentado a un título de 1.3xl019 üfc/litro de cada bacteria. Fueron recolectados frótis rectales y se realizó una evaluación microbiana como se describe más adelante.

Con el fin de evaluar la colonización de las bacterias patógenas y probióticas exógenamente introducidas, se desarrolló un ensayo de reacción en cadena de polimerasa (PCR) el cual fue capaz de identificar las especies microbianas específicas. Los cebadores fueron diseñados para detectar únicamente las especies de interés con la exclusión de otras especies en el género. El ADN fue aislado de dos grupos de muestras de cultivos fecales desarrollados sobre placas LAC25, un primer grupo se desarrolló aeróbi camente y un segundo grupo se desarrolló anaeróbi camente . Ambos grupos de cultivos fecales fueron subsecuentemente congelados. Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo como sigue: 94°C por 30 segundos, 50°C por 1 minuto, y 72°C por 1 minuto para 5 ciclos, inmediatamente seguido por 94°C por 30 segundos, 56°C por 1 minuto, y 72°C por 1 minuto por 30 ciclos. Se incorporó un periodo de extensión final (10 minutos a 72°C) para asegurar la síntesis completa de todos los productos de ADN. Los productos de PCR fueron separados mediante electroforesis en gel de agarosa y visualizados mediante transiluminación. La identificación de B. lactis y L. acidophi lus fue confirmada mediante técnicas ribosomales 16S. Las regiones del gen de ARNr 16S de longitud especifica proveniente de B. lactis y L. acidophilus fueron amplificados por PCR a partir del ADN genómico aislado de colonias bacterianas. Debido a la homología de los genes de ARNr 16S a través de las especies, los cebadores fueron diseñados a partir de E. coli (posiciones 005 y 531) que generaron específicamente productos ident i f icabl es de longitud completa a partir de la especie de interés. El secuenciamiento por ciclos de los productos de amplificación de ARNr 16S se llevó a cabo utilizando la ADN-polimerasa AmpliTaq FS y terminadores de colorante de dRhodamina y fueron sometidos a electrofo es i s sobre un secuenciador de ADN ABI Prism 377. Los datos fueron analizados utilizando el software de edición y montaje de ADN PE/Applied Biosystems . Las secuencias provenientes de los productos de amplificación fueron comparadas a la base de datos de secuencias y produjeron una homología de secuencia de ARNr 16S con más de 99% de precisión que es indicadora de una concordancia a nivel de especie . Los pares de cebadores fueron diseñados con base en estas identificaciones. Las bases de datos públicas de ADN fueron consultadas para determinar las regiones de ADN de las bacterias las cuales fueron apropiadas para los pares de cebadores de PCR únicos. Los pares de cebadores B. lactis fueron dirigidos a una región de 413 pares de bases de B. lactis mientras que los pares de cebadores de L. acidophilus fueron dirigidos a una región de 460 pares de bases de L. acidophilus. Con el fin de facilitar la identificación sobre geles de agarosa, los cebadores para L. acidophilus fueron modificados mediante la adición de colas GC. Los pares de cebadores diseñados para detectar específicamente L. acidophilus fueron validados contra L. rhamnosus, L. plantarum y L. rhamnosus GG. Los pares de cebadores diseñados para detectar específicamente B. lactis fueron validados contra B. adolescentis, B. infantis y B. bifidum. Únicamente se detectó la especie de interés en cada caso. La metodología de PCR fue también desarrollada y utilizada para determinar si los animales habían sido colonizados por E. coli enteropatógeno (EPEC) E2348/69 exógenamente introducido. El método de PCR consistió del aislamiento de ADN a partir de cada una de las sesenta muestras · congeladas antes de la reacción de PCR descrita anteriormente. Con base en la información secuencial publicada, los cebadores de PCR para EPEC fueron diseñados para detectar específicamente una región de 326 pares de bases del gen que codifica para la proteína BFP de EPC. Los cebadores de EPEC diseñados para detectar EPEC fueron validados contra E. coli enterotoxigénico (ETEC) . Únicamente se detectó EPEC. Muestras fecales provenientes de monos fueron examinadas para la presencia de ADN de EPEC mediante PCR. EPEC no fue detectado en ninguna de las muestras tomadas en el día de tratamiento 0, el día de la infección. En el día de tratamiento 3 (después de la infección con EPEC) , todas las muestras probadas fueron positivas para EPEC. Sorprendentemente, en el día final del estudio, el día de tratamiento 19 ó 21, no se detectó EPEC de cualquiera de las muestras fecales tomadas a partir de los monos alimentados con la fórmula suplementada con probiótico mientras que EPEC fue detectado en todas las muestras fecales provenientes de los monos alimentados con leche materna. La Tabla 1 describe los resultados de la determinación por PCR. Los monos inoculados con EPEC tuvieron muestras positivas a EPEC por hasta tres semanas después de la inoculación simple de EPEC. Esto sugiere la colonización exitosa de estos monos. Los monos alimentados con la fórmula suplementada con los probióticos después de la inoculación con EPEC y la colonización, tuvieron muestras fecales negativas a EPEC por el final del estudio. En contraste, los monos alimentados con leche materna que no recibieron probióticos permanecieron positivos a EPEC.

Tabla 1 Monos Alimentados con Fórmula ID del animal Día EPEC B. L. acldop ilus lactis 47 0 - ND ND 3 + ND ND 6 + - - 5 19 - + + 48 0 - ND ND 3 - ND ND 6 + - - 19 - + - 40 0 - ND ND 3 + ND ND 6 + - - 19 - + - 57 0 - ND ND 3 + ND ND 6 + - - 19 - + + 63 0 -/+ ND ND 3 + ND ND 6 + - - 19 - + + 91 0 - ND ND 3. + ND ND 6 + - - 19 - + + Monos Alimentados con Fórmula ID del animal Dia EPEC B. lactls L. acldophilus 100 0 - ND ND 3 + ND ND 6 + + - 21 - + - 105 0 - ND ND 3 + ND ND 6 + + - 21 - + - 109 0 - ND ND 3 + ND D 6 + - - 21 - + - Monos Alimentados con Leche Materna ID del animal Dia EPEC B. lactls Ir. acidophllus 118 0 - ND ND 3 + ND ND 6 + + - ND = no determinado; -/+ indica resultados variantes entre duplicados La colonización intestinal de los probióticos (L. acidophilous NCFM y Bifidobacteria lactis BBI) fue confirmada mediante análisis de PCR como se describió anteriormente, después de que completó el régimen de suplementación con probiótico en los monos alimentados con fórmula. La Tabla 1 demuestra que los probióticos humanos enteralmente administrados, colonizaron a monos rhesus infantes. Concurrentemente, no se detectó E. coli patógeno a partir de los aislados obtenidos de los tractos gastrointestinales de los monos. La fórmula infantil del Ejemplo 1 puede ser utilizada similarmente para erradicar E. coli patógeno de los tractos gastrointestinales de monos . La presente invención puede ser ejemplificada en otras formas específicas sin apartarse del espíritu y de los atributos esenciales de la misma, y en consecuencia, debe hacerse referencia a las reivindicaciones anexas, en vez de a la especificación anterior como indicadora del alcance de la invención . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición nutricional, caracterizada porgue comprende oligofructosa, sialilactosa y bacterias probióticas .
2. 2. Una composición nutricional de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la bacteria probiótica es actobacillus acidophilus y Bifidobacterium l"a.ct.is.
3. 3. Una composición nutricional de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende, o es capaz de comprender después de la dilución con agua, 0.1 g/litro a 10 g/litro de oligofructosa; 6 mg/litro a 10 g/litro de sialilactosa; 10e a 1014 ufe/litro de L. acidophilus y 106 a 1014 ufe/ de B. lactis.
4. 4. Un método para erradicar organismos patógenos en el tracto gastrointestinal de un paciente en necesidad de los mismos, caracterizado porque comprende administrar enteralmente al paciente una composición nutricional que ¦comprende oligofructosa, sialilactosa y bacterias probióticas .
5. 5. El uso de oligof uctosa , sialilactosa y bacterias probióticas en la fabricación de un medicamento para erradicar organismos patógenos en el tracto gastrointestinal, el medicamento está en la forma de una composición nutricional para la administración enteral .
6. 6. Una composición nutricional de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es para el uso como un producto farmacéutico.
7. 7. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde el medicamento está en la forma de una fórmula infantil .
8. 8. El uso de conformidad con la reivindicación 5 ó 7, en donde la bacteria probiótica es Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium lactis.
9. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el medicamento comprende , - o es capaz de comprender después de la dilución con agua, 0.1 g/litro a 10 g/litro de oligofructosa; 6 mg/litro a 10 g/litro de sialilactosa; 106 a 1014 ufe/litro de L. acidophilus y 106 a 1014 ufe/ de B. lactis.
10. 10. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el medicamento contiene, o es capaz de contener después de la dilución con agua, 0.3 g/litro a 6 g/litro de oligofructosa ; 60 mg/litro a 1 g/litro de sialilactosa; 10a a 1012 ufe/litro de L. acidophilus; y 108 a 1012 ufe/litro de B. lactis.
11. 11. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el medicamento comprende, o es capaz de comprender después de la dilución con agua, 0.3 g/litro a 6 g/litro de oligof uctosa; 60 mg/litro a 1 g/litro de sialilactosa; 108 a 1012 ufe/litro de L. acidophilus; y 108 a 1012 ufe/litro de B. lactis.
12. 12. El uso de oligofructosa ; sialilactosa; bacterias Lactobacillus acidophilus y Bifidobacterium lactis, en la fabricación de un medicamento para la profilaxis de la diarrea debida a E. coli enteropatógena, el medicamento está en la forma de una fórmula infantil para la administración enteral .