MXPA05002577A

MXPA05002577A - Uso de moduladores del receptor h4 de histamina para el tratamiento de alergia y asma.

Info

Publication number: MXPA05002577A
Application number: MXPA05002577A
Authority: MX
Inventors: Robin L Thurmond
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2002-09-06
Filing date: 2003-09-05
Publication date: 2005-09-20
Also published as: CA2497788A1; AU2003265961A1; EP1545596A4; JP2006510590A; WO2004021999A3; WO2004021999A2; EP1545596A2

Abstract

Se describen metodos para identificar moduladores del receptor de histamina que afectan la quimiotaxis de celulas cebadas o basofilos, y el uso de dichos moduladores del receptor H4 de histamina par ala prevencion; tratamiento, induccion u otra modulacion deseada de asma y/o respuestas alergicas, o enfermedades y/o condiciones que son moduladas, afectadas o causadas por asma o respuestas alergicas; se describe tambien el uso de moduladores del receptor H4 de histamina para la prevencion, tratamiento, induccion u otra modulacion deseada de respuestas quimiotacticas de celulas cebadas o basofilos, tales como migracion hacia su sitio particular, o enfermedades y/o condiciones que son moduladas, afectadas o causadas por quimiotaxis de celulas cebadas o basofilos.

Description

USO DE MODULADORES DEL RECEPTOR H4 DE HISTAMINA PARA EL TRATAMIENTO DE ALERGIA Y ASMA REFERENCIA RECIPROCA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/408,736, presentada en septiembre 6 de 2002, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Solicitudes relacionadas incluyen solicitud de patente de E.U.A. No. 10/094,357, presentada en marzo 8 de 2002, solicitud provisional de E.U.A. No. 60/408,569, presentada en septiembre 6 de 2002, y solicitud provisional de E.U.A. No. 60/408,579, presentada también en septiembre 6 de 2002, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al uso de moduladores del receptor H4 de histamina para la prevención, tratamiento, inducción u otra modulación deseada de respuestas alérgicas, asma o enfermedades y/o condiciones que son moduladas, afectadas o causadas por asma o respuestas alérgicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La histamina es un transmisor químico multifuncional que señaliza través de receptores de superficie celular que se enlazan a vías intracelulares mediante proteínas de unión a nucleótidos de guanina. Esta clase de receptores de superficie celular de unión a histamina, forma parte de una amplia familia de receptores denominados receptores acoplados a proteína G o GPCRs. Existen actualmente cuatro subtipos de receptores de histamina que se han definido farmacológicamente y se han dividido en las clasificaciones H1 , H2, H3 y H4 (Hill et al., Pharmacol. Rev. (1997) 49(3): 253-278; Hough, Mol. Pharmacol. (2001) 59: 415-419). El receptor H1 de histamina ha sido clonado (Yamashita et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1991) 88(24): 1 1515-11519), y es el objetivo de fármacos tales como la difenhidramina, que bloquea los efectos de la histamina sobre el músculo liso en respuestas alérgicas. El receptor H2 de histamina ha sido clonado (Gantz et al., Proc. Nati. Acad. Sel. U.S.A. (1991) 88(2): 429-433), y es el objetivo de fármacos tales como la ranitidina que bloquea los efectos de la histamina sobre la secreción de ácido en el estómago. El receptor H3 de histamina, del cual se formuló la hipótesis existe en 1983 (Arrang et al., Nature (Londres) (1983) 302(5911): 832-837), ha sido clonado (Lovenberg et al., Mol. Pharmacol. (1999) 55: 1101- 107), y es actualmente un objetivo para el desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central. Existen numerosas funciones adicionales de la histamina en humanos que pueden ser mediadas por receptores de histamina de clase desconocida, por ejemplo, la istamina es conocida por desempeñar una función en el asma; sin embargo, los antihistamínicos actuales que dirigen los receptores H1 y H2 de histamina tienen poca utilidad, si es que alguna, en el tratamiento del asma (Larsen et al., Pharmacother. (2001) 21 : 28S-33S).

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere al uso de moduladores del receptor H4 de histamina para el tratamiento y/o prevención de asma y/o respuestas alérgicas, y las enfermedades y condiciones mediadas por asma y/o respuestas alérgicas. Los moduladores del receptor H4 de histamina pueden usarse para modular respuestas alérgicas en mamíferos, incluyendo la inducción, así como la inhibición, de respuestas alérgicas, dependiendo de si el modulador del receptor H4 de histamina es un agonista, agonista inverso o antagonista de la actividad del receptor H4. Asma y respuestas alérgicas mediadas por leucocitos, basófilos, eosinófilos o células cebadas, son inhibidas por el tratamiento con antagonistas o inhibidores del receptor H4 de histamina. La invención provee en un aspecto métodos para identificar compuestos que modulan la actividad del receptor H4 de histamina de mamífero, que comprenden: combinar un compuesto modulador putativo de actividad de receptor H4 de histamina de mamífero, con receptor H4 de histamina de mamífero y un ligando conocido del receptor H4 de histamina; y medir un efecto del modulador sobre la función de proteína del receptor H4, o su capacidad para unir el ligando, en donde el efecto es actividad de inhibición, activación, antagonista, agonista o agonista inverso, en donde dicho compuesto modulador es un modulador de quimiotaxis de células cebadas. Se proveen también anticuerpos monoespecíficos inmunológicamente reactivos con una proteína del receptor H4 de histamina de mamífero, en donde dicho anticuerpo modula quimiotaxis de células cebadas. En otro aspecto, la invención provee un método para identificar compuestos que modulan la actividad de proteína del receptor H4 de histamina de mamífero, que comprende: combinar un compuesto modulador putativo de actividad de proteína del receptor H4 de histamina de mamífero, con proteína del receptor H4 de histamina de mamífero y un ligando conocido del receptor H4 de histamina; y medir un efecto del modulador sobre la función de proteína o su capacidad para unir el ligando, en donde dicho efecto es actividad de inhibición, activación, antagonista, agonista o agonista inverso, en donde dicho compuesto modulador es un modulador de quimiotaxis de basófilos. Se proveen también anticuerpos monoespecíficos inmunológicamente reactivos con una proteína del receptor H4 de histamina de mamífero, en donde dicho anticuerpo modula quimiotaxis de basófilos ¡n vitro o in vivo. En otro de sus varios aspectos, la invención provee un método para identificar compuestos que modulan la quimiotaxis de células cebadas mediada por el receptor H4 de histamina de mamífero hacia la histamina, que comprende: en presencia o ausencia de un modulador del receptor H4 de histamina, poner células cebadas en proximidad a la histamina bajo condiciones que permitan que las células cebadas se muevan hacia la histamina; y medir un efecto del modulador del receptor H4 de histamina sobre el movimiento de las células cebadas hacia la histamina, en donde un aumento o disminución en la velocidad de movimiento de las células cebadas hacia la histamina, o en el número de células cebadas que se mueven hacia la histamina, es indicativo de que el compuesto de prueba modula la quimiotaxis mediada por el receptor H4 de histamina de las células cebadas hacia la histamina. En otro aspecto, la invención provee métodos para determinar si un modulador del receptor H4 de histamina modula la acumulación subepitelial de células cebadas en la tráquea de un mamífero en respuesta a exposición a histamina o un alérgeno, el método comprendiendo: en presencia o ausencia de pretratamiento con un modulador del receptor H4 de histamina, exponer un mamífero a un aerosol que comprenda histamina o un alérgeno bajo un régimen que daría como resultado, en ausencia del modulador, una cantidad predeterminada de acumulación subepitelial de células cebadas en la tráquea del mamífero; y comparar la cantidad de acumulación subepitelial de células cebadas en la tráquea del mamífero en presencia y ausencia del modulador del receptor H4 de histamina, un cambio en la acumulación de células cebadas en presencia del modulador en comparación con la ausencia del modulador, siendo indicativo de que el modulador del receptor H4 de histamina modula la acumulación subepitelial de células cebadas en la tráquea del mamífero en respuesta a la exposición a histamina o un alérgeno. Otras características y ventajas de ia presente invención se entenderán haciendo referencia a las figuras, descripción detallada y ejemplos siguientes: BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1 : quimiotaxis de células cebadas derivadas de médula ósea de ratón en respuesta a la histamina. Figura 2: la quimiotaxis de células cebadas derivadas de médula ósea de ratón en respuesta a la histamina, puede ser bloqueada por un antagonista específico del receptor H4 de histamina, pero no por antagonistas del receptor H1 , H2 o H3. Figura 3: la quimiotaxis de células cebadas derivadas de médula ósea de ratón en respuesta a la histamina, puede ser bloqueada por un antagonista específico del receptor H4 de histamina, con una IC50 de 38 nM. Figura 4: la acumulación de células cebadas inducida por histamina in vivo en la tráquea del ratón, puede ser bloqueada por un antagonista específico del receptor H4 de histamina. Figuras 5A y 5B: conteo diferencial de células en fluido de lavado broncoalveolar (BAL) a partir del modelo de inflamación pulmonar inducida por ovoalbúmina en ratones tratados con el antagonista del receptor H4 (5-cloro-1 H-benzo¡midazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona. Los valores p de una prueba t no pareada de Student, se dan como sigue: * representa p < 0.05, ** representa p < 0.01 , y *** representa p < 0.001. Figura 5A: los símbolos usados para los tratamientos, son los siguientes: PBS control 1SI; OVA (ovoalbúmina) control, GZl ; OVA + vehículo, ES ; OVA + antagonista de H4 a 50 mg/kg, [22 ; OVA + antagonista de H4 a 20 mg/kg, |=j ; OVA + antagonista de H4 a 5 mg/kg, QH] . Figura 5B: los símbolos usados para los tratamientos, son los siguientes: PBS control, W, OVA (ovoalbúmina) control, GZ! ; OVA + vehículo, IS3 ; OVA + antagonista de H4 a 5 mg/kg, E22 ; OVA + antagonista de H4 a 2 mg/kg, |=! ; OVA + antagonista de H4 a 0.5 mg/kg, OH] . Figura 6: conteo diferencial de células en fluido de lavado broncoalveolar a partir del modelo de inflamación pulmonar inducida por ovoalbúmina en ratones tratados con el antagonista del receptor H4 (5-cioro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona. Los valores p de una prueba t no pareada de Student, se dan como sigue: * representa p < 0.05, ** representa p < 0.0 , y *** representa p < 0.001. Los símbolos usados para los tratamientos, son los siguientes: PBS control, — S — ; OVA (ovoalbúmina) control, — ? — ; OVA + vehículo, ; OVA + antagonista de H4 a 5 mg/kg, — tf— ; OVA + antagonista de H4 a 20 mg/kg, — ^ — ; OVA + antagonista de H4 a 50 mg/kg. Figura 7: efectos del antagonista del receptor H4 (5-cloro-1 H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona sobre la hiperreactividad de vías respiratorias en el modelo de inflamación pulmonar inducida por ovoalbúmina en ratones (n=8). Los valores p de una prueba t no pareada de Student, se dan como sigue: * representa p < 0.05, ** representa p < 0.01 , y *** representa p < 0.001. Los símbolos usados para los tratamientos, son los siguientes: PBS control, 0; OVA control, ES ; OVA + antagonista de H4 a 20 mg/kg, EZl ; OVA + antagonista de H4 a 60 mg/kg, j=| ; OVA + antagonista de H4 a 100 mg/kg, ED .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Y MODALIDADES PREFERIDAS Moléculas de ADN que codifican para un receptor H4 de histamina de mamífero han sido clonadas y caracterizadas, y representan miembros de la clase de receptores que se acoplan a proteínas G (Liu et al., (2001) Mol. Pharmacol. (2001) 59: 420-426; Liu et al., J. Pharmacol. Exp. Therapeut. (2001) 299(1 ): 121-130). Mediante el uso de un sistema de expresión recombinante, se han aislado moléculas de ADN funcionales que codifican para estos receptores H4 de histamina de ratón, rata, conejillo de Indias y humano. La proteína recombinante es útil para una variedad de propósitos que incluyen, pero no están limitados a, identificación de moduladores del receptor H4 de histamina de humano. Los receptores H4 de histamina de ratón, rata y conejillo de Indias tienen una variedad de usos que incluyen, pero no están limitados a, resolver diferencias farmacológicas observadas entre diferentes especies de mamífero, en particular puesto que especies de conejillo de Indias, rata y murino se usan comúnmente en la evaluación preclínica de nuevas entidades químicas que funcionan como moduladores. Dichos moduladores pueden incluir, por ejemplo, agonistas, antagonistas y agonistas inversos. Los moduladores identificados en las pruebas descritas en la presente son útiles, por ejemplo, como agentes terapéuticos, agentes profilácticos y agentes de diagnóstico. Las indicaciones para dichos agentes terapéuticos incluyen, pero no están limitadas a, asma, alergia, inflamación, trastornos cardiovasculares y cerebrovasculares, diabetes mellitus no insulinodependiente, hiperglicemia, constipación, arritmia, trastornos del sistema neuroendocrino, estrés y espasticidad, así como secreción de ácido, úlceras, constricción de vías respiratorias, y disfunción de próstata. En modalidades particulares, los moduladores que subregulan la expresión, actividad o accesibilidad de los receptores H4, se usan como agentes terapéuticos para el tratamiento de rinitis alérgica y/o asma. El término "receptor H4 de histamina de humano", como se usa en la presente, se refiere a proteína de la subclase H4 que puede funcionar como un receptor específico para histamina. La alergia y el asma son dos de los problemas respiratorios más comunes. La alergia se caracteriza típicamente por estornudo, escurrimiento nasal, ojos llorosos o irritados y congestión nasal. La alergia más severa puede ir acompañada de otros síntomas de significado creciente. En la mayoría de los casos, la alergia es desencadenada por exposición a un alérgeno ambiental, por ejemplo, inhalación de alérgenos aerotransportados tales como polen, ácaros del polvo, esporas de mohos o caspa de animales. Otros alérgenos son ingeridos con alimentos o bebidas. Al igual que la alergia, el asma puede ser causado por inhalación de alérgenos, pero puede ser causado por irritantes no específicos, y otros factores tales como el ejercicio. Difiere de la alergia porque se caracteriza por inflamación de vías respiratorias, hiperreactividad bronquial y obstrucción de vías respiratorias. Los síntomas del asma incluyen típicamente jadeo, tos, tensión torácica e insuficiencia respiratoria. La IgE y las células cebadas desempeñan funciones clave en alergia y asma. Por supuesto, incrementos en el número de células cebadas se encuentran en rinitis alérgica crónica y alergia, así como después de exposición a antígenos (Crimi et al., Am. Rev. Resp. Dis. (1991) 144: 1282; Kirby et al., Am. Rev. Resp. Dis. (1987) 136: 379; Slater et al., J. Laryn. Otol. (1996) 10: 929; Gauvreau et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. (2000) 161 : 1473; Amin et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. (2000) 162: 2295; y Kassel et al., Clin. Exp. Allegy (2001 ) 31 : 1432). Una amplia variedad de estímulos puede causar la activación de células cebadas, y después hace que migren a un sitio particular (reclutamiento) y/o que sufran desgranulación. . Estos estímulos pueden ser de naturaleza inmunológica (tales como antígenos o alérgenos) o no inmunológica (tales como agentes químicos). Las células cebadas activadas liberan muchos mediadores inflamatorios, tales como la histamina, los cuales intervienen en las respuestas de fase aguda, incluyendo permeabilidad vascular incrementada, broncoconstricción, vasodilatación y reclutamiento de células inflamatorias. El flujo de células inflamatorias lleva a su vez a la liberación de otros mediadores que facilitan y prolongan la respuesta. Es este proceso inflamatorio crónico, que lleva a la remodelación de tejidos asociada con ambas condiciones. Recientemente, el receptor H4 de histamina ha sido clonado, y se ha demostrado que se expresa en una variedad de células que incluyen, pero no están limitadas a, células cebadas. Otro tipo de célula importante son los basófilos que, en contraste a las células cebadas que residen normalmente en tejidos que comunican directamente con el ambiente, se encuentran circulando en la sangre. En respuesta a estímulos inflamatorios, los basófilos migran hacia el sitio de inflamación. Al igual que las células cebadas, responden a la IgE u otros agentes, y liberan mediadores inflamatorios tales como la histamina. En rinitis alérgica y alergia, existe un incremento en el número de basófilos en las vías respiratorias, en donde se piensa desempeñan una función en las respuestas de fase tardía (Kirby et al. (1987), citado anteriormente; Gauvreau et al. (2000), citado anteriormente; y Braunstahl et al., Am. J. Resp. Crit. Care Med. (2001 ) 164: 858). En general, la alergia puede controlarse, por ejemplo, mediante antihistamínicos (todos antagonistas del receptor H1 ) y descongestionantes; sin embargo, existe aún la necesidad de agentes que modifiquen la enfermedad. Lo mismo es aplicable para el asma, en donde broncodilatadores inhalados y esteroides son las terapias principales. De destacarse es el hecho de que, aunque se piensa que la histamina y las células cebadas son importantes para ambas condiciones, los antagonistas del receptor H1 y H2 actualmente disponibles son sólo útiles en el tratamiento de alergia y tienen poco beneficio, si es que alguno, en asma. Esto sugiere que, para el asma, otros receptores de histamina, tales como el receptor H4, desempeñan una función. Numerosos textos médicos están publicados, y están disponibles para los expertos en los campos de la técnica relevante. Además, se han publicado numerosas publicaciones de investigación médica y científica en los campos de alergia y asma. Ejemplos de textos publicados disponibles sobre el tema de inflamación, incluyen Barnes et al., Asthma and COPD: Basic Mechanisms and Clinical Management, (Academic Press, Londres, 2002); Eric et al., Bronchial Asthma: Principies of Diagnosis and Treatment, (Humana Press, 2001); Mygind, Allergic and Non-Allergic Rhinitis: Clinical Aspects, (W. B. Saunders Company, 1993); Grammer y Greenberger, Patíerson's Allergic Diseases, (Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 2002); Cecil et al., Textbook Of Medicine, décimoctava ed. (W. B. Saunders Company, 1988); y Steadman's Medical Dictionary. La presente invención demuestra que el receptor H4 de histamina interviene en asma y respuestas alérgicas, e interviene particularmente en el reclutamiento de células cebadas o basófilos hacia el sitio de estímulo, y que antagonistas para este receptor son agentes antiasmáticos y/o antialérgicos efectivos. La presente invención provee en ciertas modalidades actualmente preferidas, métodos para modular asma o respuestas alérgicas, que son mediadas directamente o indirectamente por el receptor H4 de histamina. En uno de sus aspectos, la presente invención provee también métodos para inhibir, prevenir, mejorar, inducir o de otra manera afectar asma o respuestas alérgicas que son mediadas por el receptor H4 de histamina, mediante el tratamiento de un mamífero con moduladores del receptor H4 de histamina. Los moduladores del receptor H4 de histamina que son útiles en el método de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que unen el receptor H4 de histamina, ARNi, agentes antisentido u otros agentes que modulan la expresión de genes que codifican para el receptor H4 de histamina, e inhibidores, activadores, antagonistas, agonistas y agonistas inversos del receptor H4 de histamina incluyendo, pero no limitados a, proteínas, ácidos nucleicos u otras moléculas orgánicas. Estos moduladores son útiles para administración a humanos que necesitan de los mismos, y son también útiles para propósitos veterinarios para administración a animales no humanos que incluyen, pero no están limitados a, mamíferos no humanos. Anticuerpos monoespecíficos para el receptor H4 de histamina de mamífero se purifican de antisueros de mamífero que contienen anticuerpos reactivos contra el receptor H4 de histamina de mamífero, o se preparan como anticuerpos monoclonaies reactivos con el receptor H4 de histamina de mamífero, usando la técnica de G. Kohler y C. Milstein (Nature (1975) 256: 495-497). Un anticuerpo monoespecífico, como se usa en la presente, se define como una especie de anticuerpo individual o especies de anticuerpo múltiples con características de unión homogéneas para el receptor H4 de histamina de mamífero. La unión homogénea, como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un antígeno o epítope específico, tales como los asociados con el receptor H4 de histamina de mamífero, como se describió anteriormente. Métodos para preparar anticuerpos monoclonaies y policlonales monoespecíficos se conocen generalmente en la técnica. Es también fácilmente evidente para los expertos en la técnica, que pueden usarse métodos bien conocidos para producir anticuerpos monoespecíficos que producen anticuerpos específicos para fragmentos polipeptídicos del receptor H4 de histamina de mamífero, o polipéptidos nacientes de longitud completa del receptor H4 de histamina de mamífero, o los epítopes individuales del receptor H4 de histamina de mamífero. Específicamente, es fácilmente evidente para los expertos en la técnica, que pueden generarse anticuerpos monoespecíficos que sean específicos para una porción de sólo una especie del receptor H4 de histamina de mamífero o el receptor H4 de histamina totalmente funcional. Es también fácilmente evidente para los expertos en la técnica, que anticuerpos que son específicos para el receptor H4 de histamina pueden causar un cambio en la actividad funcional del receptor incluyendo, pero no limitado a, hacer que el receptor sea activado o inactivado, bloqueado de la unión a su ligando, bloqueado de la liberación de su ligando unido, o evitándose que funcione en la forma normal asociada con un receptor H4 de histamina. Pueden sintetizarse secuencias de nucleótidos que sean complementarias a la secuencia de ADN que codifica para el receptor H4 de histamina de humano u otro mamífero, para terapia antisentido. Estas moléculas antisentido pueden ser ADN, derivados estables de ADN, tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, ARN, derivados estables de ARN, tales como 2'-0-alquilARN, u otros miméticos de oligonucleótidos antisentido del receptor H4 de histamina de humano. Las moléculas antisentido del receptor H4 de histamina de humano pueden introducirse en las células mediante microinyección, encapsulación en liposomas, o mediante expresión a partir de vectores que alojen la secuencia antisentido. La terapia antisentido del receptor H4 de histamina de humano puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en donde sea benéfico reducir la actividad del receptor H4 de histamina de humano. Puede usarse terapia génica del receptor H4 de histamina de humano u otro mamífero, para introducir el receptor H4 de histamina en las células de organismos objetivo. El gen del receptor H4 de histamina puede ser ligado en vectores virales que medien la transferencia del ADN del receptor H4 de histamina de humano, mediante infección de células hospederas del receptor. Vectores virales adecuados incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus de herpes, virus de vaccinia, poliovirus, y similares. En forma alternativa, puede transferirse ADN del receptor H4 de histamina de humano en células para terapia génica mediante técnicas no virales, que incluyen transferencia de ADN dirigida mediada por el receptor usando conjugados de ADN-ligando o conjugados de adenovirus-ligando-ADN, fusión de membranas por lipofección, o microinyección directa. Estos procedimientos y variaciones de los mismos son adecuados para terapia génica del receptor H4 de histamina de humano tanto ex vivo como ¡n vivo. La terapia génica del receptor H4 de histamina de humano puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en donde sea benéfico elevar la actividad del receptor H4 de histamina de humano. La histamina es un transmisor de amina biogénico que funciona con cierta capacidad en casi todas las situaciones fisiológicas y fisiopatológicas. La histamina actúa como un neurotransmisor y neuromodulador en el sistema nervioso central, media asma y respuestas alérgicas, regula la función de las vías respiratorias, controla la secreción de ácido en el estómago, regula la función cardiovascular, así como respuestas arteriales y venosas, y es probable que intervenga en procesos aún por determinar. Los receptores de histamina que median estos efectos no están completamente caracterizados. Una forma de entender qué receptores de histamina intervienen en estos procesos, es desarrollar moduladores químicos (tales como agonistas, antagonistas y agonistas inversos) de los receptores como herramientas de investigación y entidades terapéuticas. Pueden usarse células hospederas recombinantes que expresan el receptor H4 de histamina de mamífero para proveer materiales para un método de selección que identifique dichos agonistas y antagonistas. Como tal, esta invención provee una forma de identificar nuevos agonistas y antagonistas del receptor H4 de histamina que pueden demostrar ser útiles como herramientas de investigación, o que pueden usarse como terapéutica para tratar trastornos que incluyen directamente o indirectamente receptores de histamina, tales como respuestas alérgicas y asma. Pruebas para detectar modulación del compuesto o interacción del receptor H4 de histamina incluyen, pero no están limitadas a, pruebas de unión directa al ligando, pruebas de unión competitiva (o por desplazamiento) al ligando, o pruebas funcionales que miden la respuesta del receptor al ligando, por ejemplo, mediante producción de AMPc o, como en una modalidad preferida, quimiotaxis de células cebadas o basófilos. Aunque pruebas de este tipo general son bien conocidas por los expertos en la técnica, no fueron anteriormente posibles antes de obtener las moléculas recombinantes descritas en la presente, ni fueron apreciadas por tener utilidad práctica antes del descubrimiento de los inventores del efecto fisiológico de bloquear el receptor H4, por ejemplo, inhibición de quimiotaxis de células cebadas, entre otros efectos. Un ejemplo de prueba de unión competitiva, incluye los siguientes pasos: 1. Se transfectan transitoriamente células cultivadas de mamífero, con una molécula de ácido nucleico que codifique para un receptor H4 de histamina, y se desarrollan después en cultivo. 2. Se preparan membranas celulares a partir de las células transfectadas mediante homogenización de las células y separación de la fracción de membrana, por ejemplo, mediante centrifugación. 3. Para los controles, se incuban membranas celulares con histamina marcada detectablemente (por ejemplo, histamina tritiada) en presencia o ausencia de más histamina. 4. Para muestras de prueba, se incuban membranas celulares con histamina marcada detectablemente como se indicó anteriormente, en presencia de varias concentraciones de los compuestos que se van a poner a prueba. 5. Se calculan los valores de K¡ de acuerdo a métodos conocidos. Ciertas modalidades de la invención proveen pruebas ¡n vitro para medir el efecto de un modulador H4 de histamina sobre la quimiotaxis de células cebadas o basófilos hacia la histamina. Para estas pruebas, como se aplica a células cebadas, se obtiene médula ósea de una fuente animal (por ejemplo, ratones), y se cultiva durante un tiempo adecuado en un medio que promueva la diferenciación de las células cebadas. Cavidades de cultivo segmentadas de tamaño de poro adecuado, se revisten con fibronectina. Después de la remoción de la fibronectina, se añade medio de cultivo que contenga histamina a las cámaras inferiores de las cavidades segmentadas. A las cavidades superiores se añaden varias concentraciones de los compuestos que se van a poner a prueba, junto con una alícuota de células cebadas. Las cavidades se incuban bajo condiciones que permitan la migración de las células cebadas de las cámaras superiores a las cámaras inferiores. Después de incubación, se hace el conteo del número de células en las cámaras inferiores, por ejemplo, mediante citometría de flujo. Además, en otro de sus varios aspectos, la invención provee modelos animales in vivo para evaluar el efecto de un modulador del receptor H4 de histamina sobre la acumulación subepidérmica de células cebadas inducida por histamina o alérgeno en la tráquea. Se exponen animales de prueba (por ejemplo, ratones) a un aerosol que comprenda solución salina (control) o histamina durante un período corto (por ejemplo, 20 minutos) en unos cuantos (por ejemplo, dos) días consecutivos. Para animales de prueba, se dosifica previamente a ratones a los que se les dispersó histamina en un gas antes de cada aerosol, con solución salina o un compuesto que se va a poner a prueba. Después de los tratamientos, se sacrifica a los animales y se remueve y se secciona una sección de la tráquea. Las células cebadas se detectan cuantitativamente mediante tinción selectiva, por ejemplo, inmunohistoquímicamente o con azul de toluidina. Las células cebadas pueden cuantificarse además como submucosas o subepiteliales, dependiendo de su ubicación dentro de la sección de la tráquea. La migración de células cebadas en el espacio subepitelial, es indicativa de una respuesta alérgica. Se usan métodos preferidos de la presente invención para identificar compuestos químicos que actúan, por ejemplo, como agonistas, antagonistas o agonistas inversos del receptor H4 de histamina. Como se describe en mayor detalle en el ejemplo 1 , una prueba de selección que incluye unión del receptor H4 a compuestos candidatos, ha permitido identificar varias clases de compuestos que se unen al receptor. La afinidad de unión de estos compuestos se ha correlacionado positivamente con la capacidad de los compuestos para inhibir la quimiotaxis de células cebadas a la histamina. Se ha puesto a prueba además un ejemplo de compuesto en un modelo in vivo, en donde se ha demostrado que el compuesto reduce o inhibe la migración de células cebadas mediada por histamina en el espacio subepitelial de la tráquea. Dicho movimiento es similar al que se piensa ocurre tras la exposición a un alérgeno. Por consiguiente, además de métodos para identificar moduladores del receptor H4 de histamina, las modalidades actualmente preferidas de la presente invención proveen moduladores del receptor H4 identificados mediante las varias pruebas de selección descritas en la presente. Estos moduladores se unen al receptor H4 recombinante in vitro. En una modalidad preferida, poseen una K¡ para el receptor, bajo condiciones definidas en la presente, menor de 1 µ?, más preferiblemente menor de 900 nM, 800 nM, 700 nM o 600 nM, respectivamente, en orden de preferencia ascendente. En modalidades más preferidas, poseen una K¡ para el receptor menor de 500 nM, aún más preferiblemente menor de 400 nM, aún más preferiblemente menor de 300 nM, y aún más preferiblemente menor de 200 nM. En modalidades particularmente preferidas, la K¡ es menor de 100 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM y 10 nM, respectivamente, en orden de preferencia ascendente. En vista de que se ha demostrado que la K¡ de dichos compuestos se correlaciona positivamente con la capacidad del compuesto para inhibir la quimiotaxis de células cebadas mediada por histamina in vitro, los expertos en la técnica apreciarán que pueden usarse compuestos con mayor afinidad de unión para ventaja particular como agentes terapéuticos en el tratamiento de condiciones patológicas asociadas con la transducción de señales mediada por H4 incluyendo, pero no limitadas a, alergia y asma. De conformidad con la presente invención, se ha demostrado que varias clases de compuestos poseen las características moduladoras de quimiotaxis y de unión necesarias mencionadas anteriormente, como se describe en más detalle en los ejemplos más adelante. En uno de sus varios aspectos, la presente invención está dirigida también a métodos para seleccionar compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifica para el receptor H4 de histamina de mamífero, así como la función de proteína del receptor H4 de histamina de mamífero in vitro o in vivo. Compuestos que modulan estas actividades pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas, o moléculas orgánicas no proteináceas. Los compuestos pueden modular aumentando o atenuando la expresión de ADN o ARN que codifique para el receptor H4 de histamina de mamífero, o la función de proteína del receptor H4 de histamina de mamífero. Compuestos que modulan la expresión de ADN o ARN que codifica para el receptor H4 de histamina de mamífero o la función de proteína del receptor H4 de histamina de mamífero, pueden detectarse mediante varias pruebas. Las pruebas pueden ser una prueba simple de "sí/no" que determina si existe un cambio en expresión del ácido nucleico que codifica para el receptor, o un cambio en la función o actividad de la proteína del receptor. Puede hacerse que la prueba sea cuantitativa, comparando la expresión o función de una muestra de prueba con los niveles de expresión del receptor o la función de la proteína del receptor en una muestra estándar. Los moduladores identificados en este procedimiento son útiles como agentes terapéuticos, herramientas de investigación y agentes de diagnóstico. Composiciones farmacéuticamente útiles que comprenden moduladores de la actividad del receptor H4 de histamina de mamífero, mediante unión al receptor u otros mecanismos como se describe en la presente, pueden formularse de acuerdo a métodos conocidos, tales como mediante la mezcla de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de dichos vehículos y métodos de formulación, pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición farmacéuticamente aceptable adecuada para administración efectiva, dichas composiciones contendrán una cantidad efectiva del modulador u otro agente biológicamente activo. Composiciones terapéuticas o de diagnóstico de la invención se administran a un individuo en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar trastornos en los cuales se indica la modulación de la actividad relacionada al receptor H4 de histamina de mamífero. La cantidad efectiva puede variar de acuerdo a una variedad de factores, tales como la condición, el peso, el sexo y la edad del individuo. Otros factores incluyen el modo de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden proveerse al individuo mediante una variedad de vías, tales como la vía subcutánea, tópica, oral, intranasal e intramuscular. El término "derivado químico" describe una molécula que contiene otros sustituyentes químicos o porciones que no son normalmente una parte de la molécula base. Dichas porciones pueden mejorar la solubilidad, vida media, absorción, etc., de la molécula base. En forma alternativa, las porciones pueden atenuar efectos secundarios no deseables de la molécula base, o disminuir la toxicidad de la molécula base. Ejemplos de dichas porciones se describen en una variedad de textos, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences. Los compuestos identificados de acuerdo a los métodos descritos en la presente pueden usarse solos a dosificaciones adecuadas definidas por la prueba de rutina, para obtener inhibición óptima del receptor H4 de histamina de mamífero o su actividad, mientras se reduce al mínimo cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser deseable la coadministración o administración secuencial de otros agentes. La presente invención, en otros de sus varios aspectos, provee también formulaciones farmacéuticas tópicas, orales, sistémicas y parenterales adecuadas para su uso en los métodos de tratamiento de la presente invención. Las composiciones que contienen compuestos o moduladores identificados de conformidad con esta invención como el ingrediente activo para su uso en la modulación del receptor H4 de histamina de mamífero, pueden administrarse en una amplia variedad de formas de dosificación terapéuticas en vehículos convencionales para administración. Por ejemplo, los compuestos o moduladores pueden administrarse en formas de dosificación oral tales como tabletas, cápsulas (cada una incluyendo formulaciones de liberación sostenida y de liberación retardada), pildoras, polvos, gránulos, elíxires, tinturas, soluciones, suspensiones, jarabes y emulsiones, o mediante inyección. Asimismo, pueden administrarse también en forma intravenosa (bolo o infusión), intraperitoneal, subcutánea, tópica con o sin oclusión, o intramuscular, todas usando formas bien conocidas por los expertos en las técnicas farmacéuticas. Una cantidad efectiva pero no tóxica del compuesto deseado puede usarse como un agente modulador del receptor H4 de histamina de mamífero. La dosificación diaria de los productos puede hacerse variar sobre una amplia escala de 0.01 a 1,000 mg por paciente, por día. Para administración oral, las composiciones se proveen de preferencia en forma de tabletas ranuradas o no ranuradas que contienen 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0 y 50.0 miligramos del ingrediente activo para el ajuste sintomático de la dosificación al paciente que se va a tratar. Una cantidad efectiva del fármaco es provista a menudo a un nivel de dosificación de alrededor de 0.0001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día. La escala es más particularmente de alrededor de 0.001 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal por día. Las dosificaciones de los moduladores del receptor H4 de histamina de mamífero se ajustan cuando se combinan para lograr los efectos deseados. Por otra parte, las dosificaciones de estos varios agentes pueden optimizarse y combinarse independientemente para lograr un resultado sinergístico, en donde la patología se reduce más de lo que sería si cualquier agente se usara solo. Para suministro a la vía respiratoria de un paciente que necesita de tratamiento, las composiciones se formulan de preferencia como un aerosol, el cual puede suministrarse nasalmente o mediante un inhalador, como es bien sabido en la técnica. Las cantidades de ingrediente activo se ajustan para esta forma de suministro, de acuerdo a métodos estándar. En forma ventajosa, los compuestos o moduladores de la presente invención pueden administrarse en una dosis diaria individual, o la dosificación diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. Además del suministro oral e intranasal/por inhalación, los compuestos o moduladores de la presente invención pueden administrarse mediante vías transdérmicas, usando las formas de parches de piel transdérmicos bien conocidos por los expertos en la técnica. Para administrarse en forma de un sistema de suministro transdérmico, la administración de la dosificación será, de hecho, continua más que intermitente a lo largo del régimen de dosificación. Para tratamiento de combinación con más de un agente activo en donde los agentes activos están en formulaciones de dosificación separadas, los agentes activos pueden administrarse concurrentemente, o cada uno puede administrarse en tiempos separadamente escalonados. El régimen de dosificación que usa los compuestos o moduladores de la presente invención se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la severidad de la condición que se va a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular del mismo usado. Un médico o veterinario de experiencia habitual, puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva del fármaco que se requiere para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la condición. La precisión óptima para lograr concentraciones de fármaco dentro de la escala que da eficacia sin toxicidad, requiere un régimen basado en la cinética de la disponibilidad del fármaco hacia sitios objetivo. Esto incluye una consideración de la distribución, equilibrio y eliminación de un fármaco. En métodos preferidos de la presente invención, un componente o ingrediente de fármaco activo puede comprender uno o más compuestos o moduladores descritos en la presente, y puede administrarse de preferencia en mezcla con diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticos adecuados (referidos en conjunto en la presente como materiales de "vehículo") seleccionados adecuadamente con respecto a la forma de administración deseada, es decir, tabletas, cápsulas, elíxires, jarabes, y similares orales, y consistente con las prácticas farmacéuticas convencionales.

Por ejemplo, para administración oral en la forma de tabletas o cápsulas, los componentes de fármaco activos pueden combinarse con un vehículo inerte oral, no tóxico y farmacéuticamente aceptable tal como etanol, glicerol, agua, y similares. Además, cuando se desee o sea necesario, pueden incorporarse también aglutinantes, lubricantes, agentes de desintegración y agentes colorantes adecuados en la mezcla. Aglutinantes adecuados incluyen, sin limitación, almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, ceras, y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen, sin limitación, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, y similares. Los desintegradores incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma de xantano, y similares. Para formas líquidas, los componentes de fármaco activos pueden combinarse en agentes de dispersión o suspensión adecuadamente saborizados, tales como las gomas naturales y sintéticas, por ejemplo, tragacanto, acacia, metilcelulosa, y similares. Otros agentes de dispersión que pueden usarse incluyen glicerina, y similares. Para administración parenteral, se prefieren soluciones y suspensiones estériles. Se prefieren preparaciones isotónicas que contienen en general conservadores adecuados, cuando se desea administración intravenosa. Las preparaciones tópicas que contienen un componente de fármaco activo pueden mezclarse con una variedad de materiales de vehículo bien conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, alcoholes, gel de Aloe vera, alantoína, glicerina, aceites de vitamina A y E, aceite mineral, propionato de PPG2 miristilo, y similares, para formar, por ejemplo, soluciones alcohólicas, limpiadores tópicos, cremas de limpieza, geles para la piel, lociones para la piel, y champúes en formulaciones de crema o gel. Los compuestos o moduladores de la presente invención pueden administrarse también en forma de sistemas de suministro por liposomas, tales como vesículas unilaminares pequeñas, vesículas unilaminares grandes y vesículas multilaminares. Los liposomas pueden formarse de una variedad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas. Los compuestos de la presente invención pueden suministrarse también mediante el uso de anticuerpos monoclonaies como vehículos individuales a los cuales las moléculas del compuesto se acoplan. Los compuestos o moduladores de la presente invención pueden acoplarse también con polímeros solubles como vehículos de fármaco dirigibles. Dichos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacril-amidofenol, polihidroxi-etilaspartamidofenol o polietil-eneoxidopolilisina sustituida con residuo de palmitoilo. Además, los compuestos o moduladores de la presente invención pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliacético, caprolactona poliépsilon, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos, policianoacrilatos, y copo!imeros de bloque de hidrogeles entrelazados o anfipáticos. Para administración oral, los compuestos o moduladores pueden administrarse en forma de cápsula, tableta o bolo, o en forma alternativa puede mezclarse en el alimento del animal. Las cápsulas, tabletas y bolos comprenden el ingrediente activo en combinación con un vehículo adecuado tal como almidón, talco, estearato de magnesio o fosfato dicálcico. Estas formas de dosificación unitaria se preparan mezclando íntimamente el ingrediente activo con ingredientes inertes finamente pulverizados adecuados que incluyen diluyentes, llenadores, agentes de desintegración y/o aglutinantes, de modo que se obtenga una mezcla uniforme. Un ingrediente inerte es uno que no reaccionará con los compuestos o moduladores, y que no sea tóxico para el animal que se está tratando. Ingredientes inertes adecuados incluyen almidón, lactosa, talco, estearato de magnesio, gomas y aceites vegetales, y similares. Estas formulaciones pueden contener una cantidad ampliamente variable de los ingredientes activos e inactivos, dependiendo de numerosos factores tales como el tamaño y tipo de la especie animal que se va a tratar y el tipo y la severidad de los síntomas. El ingrediente activo puede administrarse también como un aditivo para el alimento, mezclando simplemente el compuesto con el forraje, o aplicando el compuesto a la superficie del alimento. En forma alternativa, el ingrediente activo puede mezclarse con un vehículo inerte, y la composición resultante puede mezclarse entonces con el alimento, o proveerse directamente al anima!. Vehículos inertes adecuados incluyen harina de maíz, harina de cítricos, residuos de fermentación, granos de soya, granos secos, y similares. Los ingredientes activos pueden mezclarse íntimamente con estos vehículos inertes mediante trituración, agitación, molienda o vuelco, de modo que la composición final contenga de 0.001 a 5% en peso del ingrediente activo. Los compuestos o moduladores pueden administrarse en forma alternativa parenteral mente mediante inyección de una formulación que consista del ingrediente activo disuelto en un vehículo líquido inerte. La inyección puede ser intramuscular, intrarruminal, intratraqueal o subcutánea. La formulación inyectable consiste del ingrediente activo mezclado con un vehículo líquido inerte adecuado. Vehículos líquidos aceptables incluyen los aceites vegetales, tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, y similares, así como solventes orgánicos tales como solketal, glicerol formaldehído, y similares. Como una alternativa, pueden usarse también formulaciones parenterales acuosas. Los aceites vegetales son los vehículos líquidos preferidos. Las formulaciones se preparan disolviendo o suspendiendo el ingrediente activo en el vehículo liquido, de modo que la formulación final contenga de 0.005 a 10% en peso del ingrediente activo. La aplicación tópica de los compuestos o moduladores es posible mediante el uso de una mojadura líquida o un champú que contenga los presentes compuestos o moduladores como una suspensión o solución acuosa. Estas formulaciones contienen en general un agente de suspensión ta! como bentonita, y normalmente contendrán también un agente antiespumante. Son aceptables formulaciones que contengan de 0.005 a 10% en peso del ingrediente activo. Formulaciones preferidas, son aquellas que contienen de 0.01 a 5% en peso de los presentes compuestos o moduladores. Los siguientes ejemplos se proveen con el propósito de ¡lustrar la presente invención sin, no obstante, limitar la misma a los mismos.

EJEMPLO 1 Clonación de ADNc del receptor H4 de histamlna de humano en un vector de expresión de mamífero Se clonaron moléculas de ADNc del receptor H4 de histamina de humano (referidas en conjunto como pH4R) en el vector de expresión de mamífero pCIneo. Se aisló el clon de ADNc del receptor H4 de histamina de humano de la colección de ADNc de tálamo de humano. El ADNc de longitud completa se usó como molde para PCR usando iniciadores específicos con sitios EcoR1 y Not1 para clonación. El producto de PCR se purificó sobre una columna (equipo de purificación de ADN mediante PCR Wizard de Promega), y se digirió con Not1 y EcoR1 (NEB) para crear extremos cohesivos. El producto se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión. El vector pCIneo se digirió con enzimas EcoR1 y Not1 , y se purificó subsecuentemente sobre un gel de agarosa de bajo punto de fusión. El vector lineal se usó para ligar a las inserciones de ADNc del receptor H4 de histamina de humano. Los recombinantes se aislaron, se designaron como receptor H4 de histamina de humano, y se usaron para transfectar células de mamífero (células SK-N-MC) mediante precipitación de ADN con CaP04. Se seleccionaron clones de células estables mediante crecimiento en presencia de G418. Se aislaron clones individuales resistentes a G418, y se mostró que contienen al gen del receptor H4 de histamina de humano intacto. Los clones que contenían las moléculas de ADNc del receptor H4 de histamina de humano, se analizaron para la expresión de pH4R midiendo la inhibición de adenilato ciclasa en respuesta a la histamina, de acuerdo al método de Konig et al. {Mol. Cell. Neurosci. (1991 ) 2(4): 331-337), o midiendo directamente la acumulación de AMPc mediante radioinmunoensayo usando Flashplates (NEN). La expresión se analizó también usando pruebas de unión a [3H]-histamina (Clark et al., Eur. J. Pharmacol. (1992) 210(1): 31-35). Se usaron plásmidos recombinantes que contienen ADN que codifica para el receptor H4 de histamina de humano, para transformar las células COS7 o CHO de mamífero o células HEK293 o L o células SK-N-MC. Se usaron células que expresan el receptor H4 de histamina de humano, establemente o transitoriamente, para poner a prueba la expresión del receptor H4 de histamina de humano, y para actividad de unión a [3H]-histamina. Estas células se usaron para identificar y examinar otros compuestos para su capacidad para modular, inhibir o activar al receptor H4 de histamina de humano, y para competir por la unión a histamina radiactiva. Cassettes que contienen al ADNc del receptor H4 de histamina de humano en la orientación positiva con respecto al promotor, fueron ligados en sitios de restricción 3' adecuados del promotor, e identificados mediante secuenciación y/o mapeo del sitio de restricción. Estos vectores de expresión de ADNc se introdujeron en células hospederas fibroblásticas, por ejemplo, COS-7 (ATCC, # CRL1651 ) y CV-1 tat (Sieckevitz et al., Science (1987) 238: 1575-1578], 293, L (ATCC, # CRL6362), SK-N- C (ATCC # HTB-10), mediante métodos estándar que incluyen, pero no están limitados a, electroporación o procedimientos químicos (liposomas catiónicos, DEAE dextrán, fosfato de calcio). Los sobrenadantes de cultivo de células y células transfectadas, se cosecharon y analizaron para expresión del receptor H4 de histamina de humano como se describe en la presente. Todos los vectores usados para expresión transitoria en mamíferos, pueden usarse para establecer líneas de células estables que expresan al receptor H4 de histamina de humano. Se espera que construcciones de ADNc del receptor H4 de histamina de humano inalteradas clonadas en vectores de expresión, programen células hospederas para obtener proteínas del receptor H4 de histamina de humano. Las células hospederas para transfección incluyen, pero no están limitadas a, CV-1-P [Sieckevitz et al., citado anteriormente], tk-L [Wigler et al., Cell (1977) 11(1): 223-232], NS/0 y dHFr-CHO [Randall J. Kaufman y Phillip A. Sharp, J. Mol. B/o/. (1982) 159: 601-621]. La cotransfección de cualquier vector que contenga ADNc del receptor H4 de histamina de humano con un plásmido de selección de fármaco que incluya, pero no esté limitado a, G418, aminoglucósido fosfotransferasa; higromicina, higromicina-B fosfotransferasa; APRT, xantina-guanina fosforribosil-transferasa, permitirá la selección de clones transfectados establemente. Los niveles del receptor H4 de histamina de humano se cuantifican mediante las pruebas descritas en la presente. Construcciones de ADNc del receptor H4 de histamina de humano fueron ligadas también en vectores que contienen marcadores amplificables de resistencia a fármacos, para la producción de clones de células de mamífero que sintetizan los niveles más altos posibles del receptor H4 de histamina de humano. Después de la introducción de estas construcciones en células, se seleccionaron clones que contienen al plásmido con el agente adecuado, y se logró el aislamiento de un clon que sobreexpresa con un alto número de copias de plásmidos, mediante selección en dosis crecientes del agente. La expresión del receptor H4 de histamina de humano recombinante se logró mediante transfección de ADNc del receptor H4 de histamina de humano de longitud completa, en una célula hospedera de mamífero.

Caracterización del receptor H4 de histamina de humano Se transfectaron células SK-N-MC de humano con pH4R, y se seleccionaron en presencia de neomicina por diez días. Se colectaron colonias individuales, y se desarrollaron en placas de seis cavidades. Las células se depositaron entonces en placas de 96 cavidades, y se desarrollaron hasta confluencia. Las células se incubaron durante 20 minutos con isobutilmetilxantina (1 mM). Las células se estimularon con histamina (100 pM - 100 µ?) durante 5 minutos. Las células se estimularon entonces con forskolina (3 µ?), y se dejaron incubando a 37°C durante 20 minutos. Las células se trataron con HCI a 0.1 N. Las células se congelaron y descongelaron. Se analizaron alícuotas del sobrenadante para su contenido de AMP cíclico, usando un equipo de radioinmunoensayo de AMPc estándar (Flashplates, NEN). El tratamiento con forskolina eleva la concentración intracelular de AMPc. Se consideró que cualquier célula que respondiera a la histamina disminuyendo el contenido de AMPc en respuesta a la forskolina, expresa el receptor H4 de histamina funcional activo de humano. Se mostró que el receptor H4 de histamina de humano recombinante expresado de la molécula de ADN que codifica para el receptor H4 de histamina de humano descrita en la presente, es activado específicamente por la histamina.

EJEMPLO 2 Prueba de unión en el receptor H4 de histamina de humano recombinante Se transfectaron transitoriamente células SK-N-MC o células COS7 con pH4R, y se desarrollaron en placas de cultivo de tejidos de 150 cm2. Las células se lavaron con solución salina, se rasparon con un raspador de células, y se recogieron mediante centrifugación (1000 rpm, 5 minutos). Las membranas celulares se prepararon mediante homogenización de la pella de células en Tris-HCI a 20 mM con un homogenizador de tejidos Polytron durante 10 segundos a alta velocidad. El homogenizado se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se recogió entonces y se centrifugó a 20,000 x g durante 45 minutos a 4°C. La pella final se resuspendió en Tris-HCI a 50 mM. Las membranas celulares se incubaron con 3H-histamina (5-70 nM) en presencia o ausencia de más histamina (10000 nM). La incubación ocurrió a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las membranas se cosecharon mediante filtración rápida en filtros GF/C Whatman, y se lavaron 4 veces con Tris-HCI a 50 mM enfriado en hielo. Los filtros se secaron entonces, se mezclaron con escintilante, y se hizo el conteo de la radiactividad. Las células SK-N-MC o COS7 que expresan al receptor H4 de histamina de humano se usaron para medir la afinidad de unión de otros compuestos, y su capacidad para desplazar la unión al 3H-ligando incubando la mezcla descrita anteriormente en presencia de varias concentraciones de inhibidor o compuesto por poner a prueba. Para estudios de unión competitiva usando 3H-histamina, se calcularon los valores de K¡, con base en un valor de KD determinado experimentalmente de 5 nM, y una concentración del ligando de 5 nM, de acuerdo a Cheng y Prusoff {Biochem. Pharmacol. (1973) 22: 3099-3108): K¡ = (IC50)/(1 + [L]/(KD)). Los resultados de los estudios de unión competitiva se exponen en el cuadro 1 para varios compuestos dentro de tres clases de compuestos, los cuales pueden prepararse como se describe en la solicitud de patente de E.U.A. No. 10/094,357 (véase también la publicación internacional No. WO 02/072548), solicitud provisional de E.U.A. No. 60/408,569, y solicitud provisional No. 60/408,723, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. Una clase comprende el grupo principal f1/p.21 1 H-indol, y es referida en la presente como la clase de "indoi". Otra clase comprende uno de los grupos principales siguientes, y es referida en la presente como la clase de "pirrol bicíclico": f.2/p.21 6H-tieno[2,3]pirrol f.3/p.21 4H-tieno[3,2-b]pirrol f.4/p.21 4tf-furo[3,2-b]pirrol La tercer clase comprende el grupo principal f.1/p.22 1H-bencimidazol, y es referida en la presente como la clase de "benzoimidazol".

CUADRO 1 Compuesto K¡ (nM) (5-Cloro-7-metil-1 H-indol-2-¡l)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 1 (2-Cloro-3-metil-4H-tieno[3,2-b]pirrol-5-il)-(4-met¡I-p¡perazin-1-¡l)- 3 metanona (5-Cloro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 5 (2,3-Dimetil-4H-tieno[3,2-b]pirrol-5-il)-(4-metil-piperaz¡n-1 -il)- 5 metanona (2,3-Dicloro-4H-tieno[3,2-b]pirrol-5-il)-(4-metil-piperazin-1-il)- 5.5 metanona (7-Metil-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 6.6 (7-Amino-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperaz¡n-1 -il)-metanona 7 (5-Bromo-1 H-¡ndol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-¡l)-metanona 8 (5,7-Dicloro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 10 (5-Cloro-1 H-¡ndol-2-il)-piperazin-1-il-metanona 10 (2,3-Dicloro-6H-tieno[2,3-b]pirrol-5-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)- 10 metanona (5-Metil-1 H-indoI-2-il)-(4-metil-p¡perazin-1 -il)-metanona (4,5-Dicloro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 1 (4-Metil-piperazin-1 -il)-(5-tr¡fluorometil-1 H-benzoimidazol-2-il)- 11 metanona (5-Fluoro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-p¡perazin-1-¡l)-metanona 18 (5,7-Difluoro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 19 (5-Amino-1 H-indol-2-il)-(4-metil-p¡perazin-1-¡l)-metanona 19 (5-Hidroxi-1 H-indol-2-il)-(4-met¡l-piperaz¡n-1 -il)-metanona 19 (4-Met¡l-piperazin-1-il)-(3-metil-4H-tieno[3,2-b]pirrol-5-il)-metanona 21 (7-Cloro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-p¡perazin-1-il)-metanona 23 (5-Cloro-1 H-indol-2-il)-[4-(2-hidroxi-etil)-p¡perazin-1 -il]-metanona 25 (2-Cloro-6H-tieno[2,3-b]p¡rrol-5-¡l)-(4-metil-p¡perazin-1-il)-metanona 25 (5-Cloro-1 H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 25 (5-FIuoro-1 H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 26 (5-Cloro- H-indol-2-il)-(3,4-dimetil-piperazin-1-il)-metanona 27 (5,6-Difluoro- H-benzo¡midazol-2-¡l)-(4-metil-piperazin-1-il)- 28 metanona CUADRO 1 (CONTINUACION) (5,7-DimetiI-1H-indol-2-¡l)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona 30 (2-Cloro-3-metil-4H-t¡eno[3,2-b]pirrol-5-¡l)-p¡peraz¡n-1-il-metanona 30 (4-Metil-1H-benzoimidazol-2-il)-(4-metii-piperazin-1-il)-metanona 31 (1 H-Benzo¡midazol-2-¡l)-(4-metil-p¡perazin-1 -N)-metanona 32 (6-Hidrox¡-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 32.5 (5-Cioro1 H-¡ndol-2-il)-((R)-3-metil-p¡peraz¡n-1 -il)-metanona 34 (5-Cloro-1 H-indol-2-il)-((S)-3-met¡l-p¡perazin-1 -il)-metanona 36 (4-Bromo-1 H-¡ndol-2-il)-(4-met¡l-piperazin-1 -il)-metanona 40 (2-Cloro-4H-t¡eno[3,2-b]pirrol-5-il)-(4-metil-p¡peraz¡n-1-il)-metanona 40 (5-Cloro-1 H-¡ndol-2-¡l)-(3-metil-piperaz¡n-1 -il)-metanona 41 (5-Fluoro-1 H-benzoimidazol-2-il)-piperazin-1 -il-metanona 42 (7-Amino-1 H-indol-2-il)-piperaz¡n-1 -il-metanona 43 (4-Met¡l-piperazin-1 -il)-(5-nitro-1 H-¡ndol-2-il)-metanona 46 (7-Hidroxi-1 H-indol-2-¡l)-(4-metil-piperaz¡n-1-il)-metanona 47 (6-Cloro-5-fIuoro-1H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-¡l)- 53 metanona (7-Bromo-1 H-indol-2-¡l)-(4-metil-p¡perazin-1 -il)-metanona 55 (2-Cloro-6H-tieno[2,3-b]pirrol-5-il)-p¡perazin-1-il-metanona 56 (3-Bromo-4H-tieno[3,2-b]pirrol-5-il)-(4-metil-p¡peraz¡n-1-¡l)-metanona 56 (3-Metil-4H-t¡eno[3,2-b]pirrol-5-il)-piperazin-1-il-metanona 80 (4-Metil-p¡perazin-1-il)-(6H-tieno[2,3-b]pirrol-5-¡l)-metanona 85 (5-Cloro-1 H-benzoimidazol-2-il)-piperazin-1 -il-metanona 87 (8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-amida de ácido 1H- 89 benzoimidazol-2-carboxílico (5-Bromo-benzofuran-2-¡l)-(4-metil-p¡perazin-1-il)-metanona 95 (1 H-indol-2-il)-(3-metil-piperazin-1 -il)-metanona 100 (1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 117 (6-Cloro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 124 (4-Met¡l-piperazin-1-il)-(4H-tieno[3,2-b]pirrol-5-il)-metanona 125 (1 H-¡ndol-2-il)-(4-met¡l-piperazin-1 -il)-metanotiona 132 (4-Metil-1 H-benzoimidazol-2-il)-piperazin-1 -Il-metanona 135 (2,3-Dimet¡l-4H-furo[3,2-b]pirrol-5-il)-(4-metil-p¡perazin-1-il)- 140 metanona [5-(3-Metoxi-fenil)-1 H-indol-2-¡l]-(4-metil-p¡perazin-1-il)-metanona 145 (4-Metil-1H-benzolmidazol-2-il)-(3-metil-piperazin-1-il)-metanona 156 (3-Metil-p¡perazin-1-il)-(3-metil-4H-tieno[3,2-b]p¡rrol-5-¡l)-metanona 161 (2-Cloro-6H-tieno[2,3-b]pirrol-5-il)-(hexahidro-pirrolo[1 ,2-a]pirazin-2- 176 il)-metanona (6-Bromo-1 H-indol-2-¡l)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 188 (8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-amida de ácido 5-metiM H- 613 benzoimidazol-2-carboxílico (3-Bromo-4H-t¡eno[3,2-b]p¡rrol-5-il)-(3-metil-piperazin-1-il)-metanona 980 EJEMPLO 3 Unión del ligando a receptores H4 de histamina de mamífero Se determinó la afinidad de 3H-histamina por receptores H4 de histamina de rata, ratón, conejillo de Indias y humano, usando técnicas estándar como se describe en la presente. Se llevó a cabo unión por saturación en membranas de células SK-N-MC transfectadas establemente, con el receptor H4 de histamina adecuado. Los valores de Kp se derivaron de una relación -1/pend¡ente de la regresión lineal de una gráfica de Scatchard (unido/libre contra unido). Los resultados se muestran en el cuadro 2: CUADRO 2 Se determinó la afinidad relativa de varios ligandos del receptor de histamina conocidos, mediante unión competitiva de 3H-histamina a 30 nM. Se calcularon los valores de K¡ para cada ligando, de acuerdo al método de Cheng y Pruscoff (K¡ = IC5o/(1 +[3H-histamina]/Kd). Los valores de KD para 3H-histamina fueron los que se exponen en el cuadro 2. Los resultados se muestran en el cuadro 3: CUADRO 3 EJEMPLO 4 Inhibición de la quimiotaxis de células cebadas inducida por histamina in vitro, por antagonistas del receptor H4 de histamina Este ejemplo demuestra por primera vez el descubrimiento de que los antagonistas del receptor H4 de histamina pueden bloquear la respuesta quimiotáctica de células cebadas en respuesta a un estimulo.

Métodos Cultivo de células cebadas de médula ósea Se diferenciaron células cebadas de médula ósea derivadas de ratones BALB/c o C57b1/6j. Se sacrificó a ratones por asfixia bajo C02 a 95%, y se removieron los fémures. Se aisló asépticamente la médula ósea de los fémures. Las células (5x105/mL) se cultivaron a 37°C con C02 a 5% en medio de cultivo que consistía de medio del R.PMI con FCS a 10%, aminoácidos no esenciales a 0.1 nM, 50 µg/mL de penicilina/estreptomicina y medio de WEHI-3 acondicionado a 20%. Se preparó medio de WEHI-3 acondicionado a partir de células WEHI-3 (ATCC), las cuales se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Iscoves con FCS a 10%, L-glutamina a 4 mM, 1.5 g/L de carbonato de sodio, beta-mercaptoetanol a 0.05 µ? y 50 µg/mL de penicilina/estreptomicina. El sobrenadante filtrado se usó como el medio de WEHI-3 acondicionado. Después de 16 horas en cultivo, las células de la médula ósea se transfirieron a un nuevo matraz. El medio se renovó una vez por semana. Después de cuatro semanas, las células se pusieron a prueba mediante citometría de flujo para receptor de IgE y expresión de CD117 (c-kit). Las células cebadas se incubaron con IgE anti-DNP (ICN Pharmaceuticals, Costa Mesa, CA) o vehículo durante 30 minutos, seguido de anti-lgE marcada con FITC (Pharmingen) o CD117 marcado con FITC (Pharmingen) durante 30 minutos sobre hielo. Las células cebadas cultivadas consistieron de una población homogénea que eran más de 99% positivas para el receptor de IgE, y más de 99% positivas para CD117. Células cebadas de cuatro a ocho semanas de cultivo se usaron para los experimentos.

Prueba de quimiotaxis Se revistieron transwells (Costar, Cambridge, MA) de un tamaño de poro de 8 µ?? con 100 µ? de 100 ng/mL de fibronectina humana (Sigma) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de remoción de la fibronectina, se añadieron 600 µ?_ de medio del RPM! con BSA a 5% en presencia de histamina (variando de 1.25-20 µ ) a la cámara inferior. Para poner a prueba los varios antagonistas del receptor de histamina, se añadieron soluciones de 10 µ de los compuestos a las cámaras superior e inferior. Se añadieron células cebadas (2x105/cavidad) a la cámara superior. Las placas se incubaron durante 3 horas a 37°C. Se removieron las transwells, y se hizo el conteo del número de células en la cámara inferior durante 60 segundos usando un citómetro de flujo.

Resultados La histamina media la quimiotaxis a través del receptor H4 Se investigó la capacidad quimiotáctica de células cebadas hacia la histamina, usando un sistema de transwells. Se añadieron células cebadas a la cámara superior, mientras que se añadió histamina a la cámara inferior.

La histamina indujo un incremento dependiente de la dosis en las células cebadas que migraron en la cámara inferior (figura 1 ). Se usaron antagonistas específicos del receptor de histamina para seleccionar qué receptor de histamina es responsable de la quimiotaxis hacia la histamina. Los antagonistas específicos para los receptores de histamina H1, H2 o H3 no alteraron la quimiotaxis inducida por histamina (figura 2). Sin embargo, un antagonista del receptor H4 de histamina específico, inhibió la quimiotaxis de células cebadas (figuras 2 y 3) en una forma dependiente de la dosis. Los resultados expuestos en el cuadro 2 siguiente muestran una correlación positiva entre la K¡ del compuesto y su capacidad para inhibir la químiotaxis de células cebadas; es decir, en general, cuanto más potente es el compuesto, mejor es la inhibición.

CUADRO 4 Compuesto K¡ % de % de (n ) inhibición inhibición 10 µ? 1 µ (5-Cloro-7-metil-1 H-¡ndol-2-il)-(4-metil-p¡perazin-1 -il)- 1 97 100 metanona (7-Amino-1H-¡ndol-2-¡l)-(4-metil-p¡perazin-1-il)-metanona 7 99 (5-Cloro-1 H-indol-2-il)-piperazin-1 -il-metanona 10 99 (5,7-Difluoro-1 H-indol-2-¡l)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona 19 100 (4-Metil-piperazin-1-¡l)-(3-metil-4H-tieno[3,2-b]p¡rrol-5-¡l- 21 60 metanona (2-Cloro-6H-tieno[2,3-b]pirrol-5-¡l)-(4-metil-piperaz¡n-1-il)- 25 106 103 metanona (5-Cloro-1 H-benzoim¡dazol-2-il)-(4-met¡l-piperazin-1 -il)- 25 97 84 metanona (5,6-Difluoro-1 H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)- 28 97 72 metanona (2-Cloro-4H-t¡eno[3,2-b]pirrol-5-¡l)-(4-metil-piperazin-1-¡l)- 40 92 metanona (5-Cloro-1 H-benzoimidazol-2-il)-piperazin-1 -il-metanona 87 101 8 (2-Cloro-6H-tieno[2,3-b]p¡rrol-5-iI)-hexahidro-pirrolo[1 ,2- 176 0 0 a]pirazin-2-¡l)-metanona (8-metil-8-aza-biciclo[3.2.1]oct-3-il)-amida de ácido 5-metiI- 613 27 66 1 H-benzoimidazol-2-carboxílico (3-Bromo-4H-tieno[3,2-b]pirrol-5-il)-(3-metil-piperazin-1-¡l)- 980 0 0 metanona Indol, control >10k 0 0 Pirrol bicíclico, control >10k 0 0 Benzoimidazol, control >10k 0 0 EJEMPLO 5 Inhibición de la quimiotaxis de células cebadas inducida por histamina. por antagonistas del receptor H4 de histamina in vivo Se expusieron grupos de diez ratones Balb/c hembras (8-12 semanas), a un aerosol de solución salina control o histamina a 0.1 M durante 20 minutos en 2 días consecutivos. Los ratones a los que se les dispersó histamina en un gas, fueron dosificados previamente 15 minutos antes de cada aerosol con solución salina o 20 mg/kg del modulador de H4 (5-cloro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona mediante la vía subcutánea (5 ml/kg). Cuatro horas después de la administración final del aerosol, se sacrificó a los ratones usando una sobredosis de pentobarbital, y una sección de la tráquea se removió y se fijó en formalina. Se llevó a cabo inclusión en parafina y seccionamiento longitudinal de las tráqueas, y las células cebadas se tiñeron con azul de toluidina. Las células cebadas se cuantificaron como submucosas o subepiteliales, dependiendo de su ubicación dentro de cada sección de la tráquea. Se realizaron estadísticas usando la prueba t no pareada de Student. Los resultados (figura 4) muestran que la histamina induce migración de las células cebadas en el espacio subepitelial. Dicho movimiento es similar al que se piensa ocurre tras exposición a alérgenos. Esta migración puede ser bloqueada por un antagonista específico del receptor H4.

EJEMPLO 6 Inhibición de la quimiotaxis de células cebadas por el antagonista del receptor H4 en un modelo animal de asma v rinitis alérgica El modelo animal expuesto en este ejemplo se usa para poner a prueba la observación de que las células cebadas se acumulan en respuesta a inflamación alérgica, y que esta acumulación puede ser bloqueada por los antagonistas del receptor H4. Los compuestos de la presente invención se ponen a prueba en este modelo para demostrar su uso como tratamiento para rinitis alérgica o asma. Se sensibiliza a los ratones mediante inyección intraperitoneal de ovoalbúmina/alumbre (10 µg en 0.2 mL de AI(OH)3; 2%) en el día 0 y el día 14. En los días 21 a 23, se desafía a los ratones mediante PBS u ovoalbúmina, y se sacrifica a los mismos 24 horas después del último desafío en el día 24. Una sección de la traquea se remueve y se fija en formalina. Se realiza inclusión en parafina y seccionamiento longitudinal de las tráqueas, seguida de tinción de las células cebadas con azul de toluidina. En forma alternativa, las tráqueas se congelan en OCT para seccionamiento congelado, y las células cebadas se identifican mediante tinción de IgE. Las células cebadas se cuantifican como submucosas o subepiteliales, dependiendo de su ubicación dentro de cada sección traqueal. La exposición al alérgeno aumenta el número de células cebadas subepiteliales, y se mide la capacidad de los antagonistas del receptor H4 para bloquear este efecto.

EJEMPLO 7 Inhibición de la quimiotaxis de basófilos por antagonistas del receptor H4 de histamina Se aislan basófilos de sangre humana, usando métodos estándar (Tsang et al., Immunological Methods (2000) 233(1-2): 13-20). Las pruebas de quimiotaxis pueden llevarse a cabo usando transwells (Costar, Cambridge, MA) de un tamaño de poro de 8 µ?t? revestidas con 100 de 100 ng/mL de fibronectina humana (Sigma) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la remoción de la fibronectina, se añaden 600 µL· de medio del RPMI con BSA a 5% en presencia de histamina (variando de 1.25 a 20 µ?) a la cámara inferior. Para poner a prueba los varios antagonistas del receptor de histamina, pueden añadirse soluciones de 10 µ? de los compuestos a las cámaras superior e inferior. Pueden añadirse basófilos a la cámara superior. Las placas se incuban durante 3 horas a 37°C. Las transwells se remueven, y se hace el conteo del número de células en la cámara inferior durante 60 segundos usando un citómetro de flujo, o pueden cuantificarse mediante tinción usando tinción de Wright.

EJEMPLO 8 Medición de los incrementos en poblaciones de células cebadas y basófilos en pacientes después de exposición al antígeno Se desafía a pacientes con alergias a alérgenos particulares tales como caspa de gato o polen de pasto, con los antígenos adecuados mediante administración bronquial directa u otros métodos. Se cuantifica el número de células cebadas y basófilos en la mucosa bronquial y mucosa nasal, usando métodos de tinción inmunohistoquímica estándar después de biopsia del tejido. Se estudian los efectos de un modulador del receptor H4 de histamina sobre el incremento en células cebadas y basófilos después de desafío del antígeno, administrando el modulador mediante muchas vías diferentes antes del desafío con el antígeno.

EJEMPLO 9 Medición de las poblaciones de basófilos y células cebadas tisulares en pacientes Se sabe que los pacientes con rinitis alérgica y/o asma tienen incrementos en células cebadas y basófilos en sus vías respiratorias en comparación con sujetos sanos. Se examinan los efectos de un modulador del receptor H4 de histamina sobre la población de células cebadas y basófilos residentes en las vías respiratorias, administrando el modulador mediante muchas vías diferentes por un período determinado. Puede hacerse una comparación del número de células cebadas y basófilos presentes en las vías respiratorias antes, durante y después del tratamiento. Las células se cuantifican usando métodos de tinción inmunohistoquímica estándar después de biopsia del tejido.

EJEMPLO 10 Tratamiento de asma o respuestas alérgicas en pacientes, usando antagonistas del receptor H4 de histamina Se administra a pacientes asmáticos o alérgicos un placebo o antagonista del receptor H4 de histamina, durante un período determinado. A lo largo del curso del tratamiento del asma, se mide la calificación de la severidad de la condición del paciente, el volumen espiratorio forzado en un segundo (FEV1), y la hiperreactividad bronquial (BHR) para broncoconstrictores. Los decrementos en calificación de la severidad del asma, incrementos en FEV1 y decrementos en BHR después del tratamiento con un antagonista del receptor H4 de histamina, son indicativos de un efecto positivo sobre la enfermedad. Además, pueden determinarse decrementos en la respuesta inflamatoria tras tratamiento con antagonistas del receptor H4 de histamina, mediante cambios en las concentraciones en suero del receptor de interleucina-2 soluble (slL-2R), IL-4 y molécula de adhesión intercelular soluble 1 (slCAM-1); conteo de eosinófilos en sangre periférica; y proteína catiónica eosinofílica (ECP). Además, pueden usarse biopsias bronquiales para cuantificar el cambio en las poblaciones de células inflamatorias, tales como eosinófilos, células T, células cebadas, basófilos, y similares.

EJEMPL0 11 Tratamiento de respuestas alérgicas en pacientes usando antagonistas del receptor H4 de histamina Se administra a pacientes con rinitis alérgica un antagonista del receptor H4 de histamina o placebo durante un período determinado. Se mide la eficacia comparando la calificación de los síntomas nasales en el día (promedio de congestión, comezón y estornudo), síntomas oculares, síntomas nocturnos, síntomas nasales de los individuos en el día, evaluaciones globales (por el paciente y por el médico) y calificaciones de la calidad de vida. Además, los efectos sobre la conjuntivitis alérgica pueden cuantificarse usando mediciones de rojez ocular, comezón y días sin síntomas.

EJEMPLO 12 Inhibición del cambio de forma de los eosinófilos inducido por histamina. por antagonistas del receptor H4 de histamina Este ejemplo demuestra que los antagonistas del receptor H4 de histamina pueden bloquear la respuesta del cambio de forma de eosinófilos humanos a la histamina. El cambio de forma en los eosinóíilos, es un evento temprano que lleva a uno o más de varios resultados biológicos diferentes, incluyendo adhesión, quimiotaxis, desgranulación y fagocitosis. Estos eventos corriente abajo se asocian con respuestas alérgicas y otras respuestas inflamatorias/inmunes, incluyendo rinitis alérgica y asma.

Métodos Se aislaron granulocitos humanos de sangre humana, mediante un gradiente de Ficoll. Los glóbulos rojos fueron lisados con 5-1 OX de regulador de pH de lisis de Qiagen a temperatura ambiente durante 5 a 7 minutos. Los granulocitos se cosecharon y se lavaron una vez con regulador de pH para FACS. Las células se resuspendieron a una densidad de 2 x 10s células/mL en regulador de pH de reacción. Para poner a prueba la inhibición por antagonistas específicos del receptor de histamina, se incubaron 90 µL· de la suspensión de células (~2 x 105 células) con 10 µ? de una de las varias soluciones del compuesto de prueba. Después de 30 minutos, se añadieron 11 µ\- de una de las varias concentraciones de histamina. Diez minutos después, las células se transfirieron a hielo, y fueron fijadas con 250 µ? de regulador de pH para fijador enfriado en hielo (formaldehído a 2%) durante 1 minuto. El cambio de forma se cuantificó usando una prueba en dispersor hacia delante de autofluorescencia con válvula de compuerta (GAFS) (Byran et al., Am. J. Crit. Care Med. 165: 1602-1609, 2002).

Resultados Los datos del cuadro siguiente muestran que la histamina induce un cambio de forma en los eosinófilos dependiente de la dosis. Se usaron antagonistas del receptor de histamina (HR) para seleccionar qué receptor de histamina es responsable del cambio de forma. Antagonistas específicos para el receptor H1 (difenhidramina) o el receptor H2 (ranitidina) de histamina, no alteraron el cambio de forma inducido por la histamina. Sin embargo, un antagonista de H3/H4 doble (tioperamida), y un antagonista específico del receptor H4 de histamina, (5-cloro-1 H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona (K¡ = 5 nM), inhibieron el cambio de forma de los eosinófilos inducido por histamina, con valores de IC50 de 1.5 y 0.27 µ?, respectivamente. Los datos se muestran en el cuadro 5: CUADRO 5 Cambio en número de veces Histamina (µ?): ~? 10 1 0.1 0.01 0 Sin antagonista del 1.34 1.31 HR 1.21 1.01 1.00 Antagonista de H4 a 1.09 1.05 1.05 1.01 10 µ? 1.00 Tioperamida a 10 µ? 1.08 1.05 1.01 1.04 1.00 Difenhidramina a 10 1.63 1.50 1.18 1.03 1.00 µ? Ranitidina a 10 µ? 1.64 1.49 1.21 1.04 1.00 EJEMPLO 13 Los antagonistas del receptor H4 modulan la respuesta en un modelo de inflamación alérgica de humano Este ejemplo demuestra que los antagonistas del receptor H4 modulan la respuesta alérgica en animales, a la inflamación pulmonar inducida por ovoalbúmina, un modelo animal común para inflamación alérgica humana.

Métodos Sensibilización y desafío de los animales Se sensibilizaron ratones (n = 8 por grupo) mediante inyección ¡ntraperitoneal de ovoalbúmina/alumbre en los días 0 y 14. En cada uno de los días 21 a 24, se trató previamente a los ratones durante 15 minutos con vehículo o con (5-cloro- H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona antes de un desafío durante 20 minutos con PBS u ovoalbúmina.

Administración de ejemplos de antagonistas del receptor H4 En un experimento, se administró (5-cloro-1 H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona vía oral a 5, 20 ó 50 mg/kg. En un segundo experimento, se administró (5-cloro-1 H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona vía oral a 0.5, 2 ó 5 mg/kg. En un tercer experimento, se administró (5-cloro-1H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona vía subcutánea a 20, 60 ó 100 mg/kg.

Conteo de células/colecta de datos Veinticuatro horas después del último desafío, se sacrificó a los ratones, y se determinó el número total de células, y se hizo un conteo diferencial de células en el fluido de lavado broncoalveolar (BAL).

Monitoreo de la hipersensibilidad de las vías respiratorias Se monitoreó la hipersensibilidad de las vías respiratorias en animales sensibilizados a ovoalbúmina en ratones conscientes mediante pletismografía de cuerpo entero (Buxco). Se trató a los ratones (n = 8 por grupo) como se describió anteriormente, para el conteo de células.

Resultados Análisis del fluido de BAL Después del desafío con ovoalbúmina, hubo un incremento dramático en el número total de células en el fluido de BAL que se debió principalmente a incrementos en el número de eosinófilos. Como se muestra en las figuras 5A y 5B, el número total de células y el número de eosinófilos disminuyeron significativamente a todas las dosis de 5 mg/kg y más de (5-cloro- H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-p¡perazin-1-il)-metanona. La reducción máxima en el número de eosinófilos fue de 50%. Las mismas dosis que proveyeron reducción máxima en eosinófilos, redujeron también significativamente el número de linfocitos. A la dosis más alta puesta a prueba (50 mg/kg), hubo una reducción en el número de macrófagos y un incremento en el número de neutrófilos. Se observó también una reducción en macrófagos a una dosis de 5 mg/kg en el segundo experimento. Estos datos indican que los antagonistas del receptor H4 tales como (5-cloro-1 H-benzoimidazol-2-il)-(4-metil-piperazin-1 -il)-metanona, tienen propiedades antiinflamatorias. Otro antagonista del receptor H4, (5-cloro-1H-indol-2-il)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona, se puso a prueba también en este modelo. La figura 6 muestra los resultados para el conteo diferencial de células en el fluido de BAL. Tanto el número total de células como el número de eosinófilos, disminuyó significativamente a 60 y 100 mg/kg de (5-cloro-1 H-indol-2-i!)-(4-metil-piperazin-1-il)-metanona. La reducción máxima en el número de eosinófilos fue de 50%. A las mismas dosis que proveyeron reducción en eosinófilos, el número de linfocitos disminuyó significativamente.

Análisis de la hipersensibilidad de las vías respiratorias La respuesta de hipersensibilidad de las vías respiratorias a la metacolina, se muestra en la figura 7. Veinticuatro horas después del desafío final de animales sensibilizados con ovoalbúmina, hubo un incremento dramático en la respuesta de la vía respiratoria a la metacolina, medida mediante Penh (pausa intensificada), un índice de broncoconstricción. Esta hipersensibilidad disminuyó mediante tratamiento con (5-cloro-1H-benzoimidazol-2-¡l)-(4-metil-p¡peraz¡n-1-il)-metanona a cualquiera de las tres primeras dosis. Estos datos indican que los antagonistas del receptor H4 no sólo bloquean la inflamación de las vías respiratorias, sino afectan también la hiperactividad alérgica de las vías respiratorias, y de esta manera, serán útiles en el tratamiento de alergias y/o asma en humanos. Las características y ventajas de la invención son evidentes para los expertos en la técnica. Con base en esta descripción, incluyendo los aspectos de resumen, descripción detallada, antecedentes de la invención, ejemplos, dibujos y reivindicaciones, el experto en la técnica será capaz de hacer modificaciones y adaptaciones a varias condiciones y usos. Estas otras modalidades están también dentro del alcance de la invención. Las publicaciones referidas en la presente se incorporan en su totalidad en la misma como referencia.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para identificar compuestos que modulan la actividad del receptor H4 de histamina de mamífero, que comprende: a) combinar un compuesto modulador putativo de actividad del receptor H4 de histamina de mamífero con receptor H4 de histamina de mamífero y un ligando conocido del receptor H4 de histamina; y b) medir un efecto del modulador sobre la función de proteína o su capacidad para unir el ligando, en donde dicho efecto es una modulación seleccionada del grupo que consiste de actividad de inhibición, activación, antagonista, agonista y agonista inverso, en donde dicho compuesto modulador es un modulador de quimiotaxis de células cebadas o quimiotaxis de basófilos. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el efecto medido en el paso b) es inhibición por competencia entre el modulador del paso a) y un ligando del receptor H4 de histamina conocido por unión al receptor. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el efecto medido en el paso b) es modulación de un segundo mensajero intracelular del receptor H4 de histamina. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el segundo mensajero intracelular se selecciona del grupo que consiste de AMPc, calcio y un producto de gen reportero. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho compuesto es un modulador de quimiotaxis de células cebadas. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho compuesto es un modulador de quimiotaxis de basófilos. 7. - Un compuesto identificado usando el método que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto es un inhibidor de una función del receptor H4 de histamina de mamífero y un inhibidor de quimiotaxis de células cebadas o quimiotaxis de basófilos ¡n vivo o in vitro. 8. - El compuesto identificado usando el método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho compuesto es un agonista, antagonista o agonista inverso de un receptor H4 de histamina de mamífero. 9. - El compuesto identificado usando el método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho compuesto modula la expresión de un gen que codifica para el receptor H4 de histamina de mamífero. 10.- Un anticuerpo monoespecífico inmunológicamente reactivo con una proteína del receptor H4 de histamina de mamífero, en donde dicho anticuerpo modula quimiotaxis de células cebadas y quimiotaxis de basófilos. 11.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el anticuerpo bloquea la unión a histamina o la activación de la proteína del receptor H4 de histamina de mamífero. 12.- Una composición farmacéutica que comprende un compuesto activo en el método que se reclama en la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto es un modulador de asma o respuestas alérgicas. 13:- El uso de la composición farmacéutica que se reclama en la reivindicación 12, para preparar un medicamento para tratar a un paciente para modular asma o respuestas alérgicas o una enfermedad o condición que es mediada por asma o respuestas alérgicas, y un receptor H4 de histamina. 14.- Una composición farmacéutica que comprende un compuesto activo en el método que se reclama en la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto es un modulador de quimiotaxis de células cebadas. 15.- El uso de la composición farmacéutica que se reclama en la reivindicación 14 para preparar un medicamento para tratar a un paciente para modular asma o respuestas alérgicas o una enfermedad o condición que es mediada por quimiotaxis de células cebadas, y un receptor H4 de histamina. 16. - Una composición farmacéutica que comprende un compuesto activo en el método que se reclama en la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto es un modulador de quimiotaxis de basófilos. 17. - El uso de la composición farmacéutica que se reclama en la reivindicación 16 para preparar un medicamento para tratar a un paciente para modular asma o respuestas alérgicas o una enfermedad o condición que es mediada por quimiotaxis de basófilos, y un receptor H4 de histamina. 18. - Una composición farmacéutica que comprende un compuesto que modula la actividad del receptor H4 de histamina de mamífero y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto es un modulador de quimiotaxis de células cebadas o basófilos in vitro o in vivo. 19. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el compuesto inhibe quimiotaxis de células cebadas. 20. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el compuesto inhibe quimiotaxis de basófilos. 21. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el compuesto en un agonista, antagonista o agonista inverso de un receptor H4 de histamina de mamífero. 22. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el compuesto modula la expresión de un gen que codifica para el receptor H4 de histamina de mamífero. 23. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque el compuesto modula además el cambio de forma de eosinófilos in vitro o in vivo. 24. - El uso de un compuesto que modula la actividad del receptor H4 de histamina de mamífero y un vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto es un modulador de quimiotaxis de células cebadas o basófilos in vitro o in vivo para preparar una composición farmacéutica para tratar a un paciente para modular asma o respuestas alérgicas o una enfermedad o condición que es mediada por quimiotaxis de células cebadas o basófilos, y un receptor H4 de histamina. 25. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la composición farmacéutica comprende un compuesto que inhibe la quimiotaxis de células cebadas. 26. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la composición farmacéutica comprende un compuesto que inhibe la quimiotaxis de basófilos. 27. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la composición farmacéutica comprende un compuesto que es un agonista, antagonista o agonista inverso de un receptor H4 de histamina de mamífero. 28. - El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la composición farmacéutica comprende un compuesto que modula la expresión de un gen que codifica para el receptor H4 de histamina de mamífero. 29.- El uso como se reclama en la reivindicación 24, en donde la composición farmacéutica comprende un compuesto que modula el cambio de forma de eosinófilos in vitro o in vivo. 30.- Un método para identificar compuestos que modulan la quimiotaxis de células cebadas mediada por el receptor H4 de histamina de mamífero hacia la histamina, el método comprendiendo: a) en presencia o ausencia de un compuesto de prueba que se pone a prueba como un modulador del receptor H4 de histamina, poner las células cebadas en proximidad a la histamina bajo condiciones que permitan el movimiento de las células cebadas hacia la histamina; y b) medir un efecto del modulador del receptor H4 de histamina sobre el movimiento de las células cebadas hacia la histamina, en donde un incremento o disminución en la velocidad de movimiento de las células cebadas hacia la histamina o en el número de células cebadas que se mueven hacia la histamina, es indicativo de que el compuesto de prueba modula la quimiotaxis de las células cebadas mediada por receptor H4 de histamina hacia la histamina.