MXPA04010800A - Procedimiento para producir organismos transgenicos ambientalmente seguros. - Google Patents

Abstract

Se describe un procedimiento para producir un organismo animal o vegetal multicelular transgenico que expresa un rasgo de interes y que tiene una distribucion controlada del rasgo a la progenie, en donde el procedimiento comprende hibridizar un primer organismo multicelular o una celula del mismo que tiene una primera secuencia de ADN heterologa que comprende un primer fragmento de una secuencia nucleotidica que codifica para el rasgo de interes, y un segundo organismo multicelular o una celula del mismo que tiene una segunda secuencia de ADN heterologa que comprende un segundo fragmento de la secuencia nucleotidica que codifica el rasgo de interes, por lo que la primera y segunda secuencias heterologas se disenan de manera que el rasgo de interes surge debido a empalme trans de ARN despues de la hibridacion.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR ORGANISMOS TRANSGENICOS AMBIENTALMENTE SEGUROS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un procedimiento para producir un organismo animal o vegetal multicelular transgénico que expresa un rasgo de interés y que tiene una distribución controlada del rasgo a la progenie u otros organismos. La invención se relaciona adicionalmente con una planta multicelular o un organismo animal que expresa un rasgo, por lo que se controla la distribución del rasgo a la progenie o descendencia, es decir, la probabilidad de transferir el rasgo a la progenie, notablemente por polinización cruzada, es muy bajo. Estas invenciones se relacionan preferiblemente con plantas multicelulares.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El uso comercial de especies de cosechas sometidas a ingeniería genética ha provocado preocupaciones acerca de la posible transferencia de transgenes y rasgos codificados por los transgenes de plantas modificadas genéticamente (plantas GM) en landraces, de padres silvestres u otras variedades de plantas que no son GM o especies de cosechas relacionadas (Ellstrand, N. C, 2001, Plant Physiol. 125, 1543-1545; Quist & Chapela, 2001, JVature, 414, 541-543), las cuales pueden cambiar el equilibrio ecológico en los ecosistemas afectados o generar otros problemas, primero que nada socioeconómicos. Adicionalmente, existen ciertos temores de que los transgenes, especialmente los genes que producen resistencia a antibióticos utilizados como marcadores de transformación puedan escapar a través de lo que se denomina transferencia horizontal a microorganismos circundantes (Chiter et al., 2000, FEBS Lett 481, 164-168), y de esta manera se modifica la microflora de una manera indeseable. Aunque muchas de estas preocupaciones no están bien justificadas científicamente (Christou, P., 2002, Transgenic Res., 11, iii-v) , la creación de sistemas de administración de transgenes controlados es altamente deseable, dado que puede evitar problemas potenciales en el futuro y ayudará a proteger al plasma germinal de las especies vegetales existentes de una manera más eficiente. Además, existen problemas causados por contaminación de cosechas que crecen orgánicamente o cosechas que no son GM con cultivos transgénicos . Esto tiene un impacto grave en la comercialización de cosechas transgénicas así como no transgénicas, una preocupación la cual no puede ser ignorada por los productores . Cualquier material transgénico generado por la tecnología actual y liberado el ambiente tiene el potencial ¦ de persistencia por un período de tiempo muy prolongado. La práctica común de la ingeniería genética vegetal se basa en el uso de casetes (secuencias cortas) de expresión y factores que contienen secuencias codificantes continuas para el gen de interés . Tales casetes de expresión se integran en un cromosoma hospedador y, cuando se produce la hibridación u otro intercambio de información genética entre una planta GM y otro organismo, lícito o ilícito, el cásete de expresión se transmite con una alta probabilidad a la progenie u otro receptor, como una unidad transcripcional funcional. Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para producir un organismo transgénico, de manera principal un organismo vegetal, que exprese un rasgo de interés, por lo que la distribución del rasgo en la progenie se controla y se produce con baja probabilidad. Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un procedimiento controlado y biológicamente seguro para expresar un rasgo de interés en un organismo multicelular o una célula del mismo.

DESCRIPCION GENERAL DE LA INVENCIÓN Los objetivos anteriores se obtienen por un procedimiento (i) de producción de un organismo vegetal o animal multicelular transgénico que expresa un rasgo de interés y que tiene una distribución controlada del rasgo a la progenie, en donde el procedimiento comprende hibridizar un primer organismo multicelular o una célula del mismo que tiene una primera secuencia de ADN heteróloga que comprende un primer fragmento de una secuencia que codifica para el rasgo de interés, y un segundo organismo multicelular o una célula del mismo que tiene una segunda secuencia de ADN heteróloga que comprende un segundo fragmento de la secuencia que codifica para el rasgo de interés, por lo que la primera y segunda secuencias heterólogas se diseñan de manera que el rasgo de interés surge debido al empalme trans de ARN después de la hibridación. Se prefiere la producción de organismos vegetales multicelulares transgénicos . Los objetivos anteriores se obtienen adicionalmente por un procedimiento de: (ii) producción de un organismo vegetal o animal multicelular transgénico que expresa un rasgo de interés y que tiene una distribución controlada a la progenie y la expresión del rasgo, el procedimiento comprende suministrar un organismo multicelular o una célula del mismo que tiene una primera secuencia de ADN heteróloga que comprende un primer fragmento de una secuencia que codifica para el rasgo de interés; y la introducción de una segunda secuencia de ADM (o ARN) heteróloga que comprende un segundo fragmento de la secuencia que codifica para el rasgo de interés, dentro de una célula del organismo multicelular, por lo que la primera y segunda secuencias heterologas se diseñan de manera que la expresión del rasgo de interés surge debido al empalme trans de ARN después de que las células se han cambiado por introducción. Se prefiere la producción de organismos vegetales multicelulares transgénicos . Además, la invención proporciona organismos transgénicos obtenidos o que se pueden obtener por cualquiera de los procedimientos anteriores . Los inventores de esta invención han desarrollado por primera vez un método para volver a los organismos transgénicos ambientalmente seguros en la medida en que el transgen o el rasgo de interés expresado por el organismo tiene una distribución controlada para la progenie del organismo. La invención resuelve un problema principal de la biotecnología, notablemente de la biotecnología vegetal, dado que la transferencia de un transgen a partir de un organismo G u otros organismos ahora se puede controlar y limitar eficazmente. La transferencia de un transgen a otros organismos incluye la transferencia a progenie sexual por polinización cruzada así como transferencia lateral del gen. El procedimiento anterior vuelve asequibles organismos multicelulares modificados genéticamente con una contención controlada de un rasgo de interés . En ambos procedimientos de la invención, la secuencia nucleotídica que codifica o que está involucrada en el rasgo se divide en dos o más fragmentos. Preferiblemente, la secuencia nucleotídica se divide en dos fragmentos . La secuencia nucleotídica típicamente es una secuencia codificante (o un marco de lectura abierto) de un ARN, o preferiblemente de una proteína involucrada en dicho rasgo. Para obtener tales fragmentos, la secuencia nucleotídica preferiblemente se divide de manera que cada fragmento obtenido, por expresión, es incapaz de generar dicho rasgo. La expresión del rasgo requiere la presencia de ambos fragmentos en el mismo organismo, de manera notable en las mismas células del mismo, y la unión por empalme trans de los fragmentos. En la presente, la expresión incluye transcripción, preferiblemente la expresión incluye transcripción y traducción. Cada fragmento preferiblemente contiene una porción de secuencia necesaria para la función del ARN o proteína involucrada en el rasgo. Por ejemplo, si la proteína involucrada en el rasgo es una enzima, cada fragmento preferiblemente contiene aminoácidos necesarios para catálisis o unión de sustrato de la enzima. La siguiente descripción se enfoca en la modalidad preferida, en donde la secuencia nucleotídica se divide en dos fragmentos . El primer fragmento se incorpora en una primera secuencia heteróloga, el segundo fragmento se incorpora en una segunda secuencia heteróloga, por lo que por lo menos la primera secuencia heteróloga es una secuencia de ADN. En el procedimiento (i) ambas secuencias heterólogas son secuencias de ADN. En el procedimiento, (ii) la primera secuencia heteróloga es ADN, mientras que la segunda secuencia heteróloga puede ser una secuencia de ARN o de ADN. Cada secuencia heteróloga preferiblemente contiene, además del fragmento las secuencias necesarias, por ejemplo para transcripción como por ejemplo un promotor y una señal de terminación de transcripción o secuencias necesarias para traducción. La primera o segunda secuencias heterólogas contienen además o codifican para una secuencia capaz de empalme trans de ARN con la segunda o primera secuencia heterólogas respectivamente, para unir el primero y segundo fragmentos por empalme trans . La secuencia capaz de empalme trans de ARN puede ser una ribozima (Rz) capaz de empalme trans . La ribozima de empalme trans se puede seleccionar del siguiente grupo: ribozimas derivadas de intrón grupo I, ribozimas derivadas de intrón grupo II y otras ribozimas diseñadas natural o artificialmente capaces de empalme trans de ARN específico. Además, el empalme trans puede ser mediado por espliceosomas . El procedimiento de la invención también se puede utilizar para ensamblar dos o más rasgos mediante empalme trans. Esto se puede realizar como se ejemplifica en el ejemplo 1 y la figura 5 al tener dos fragmentos involucrados en un rasgo (o involucrados en dos rasgos) de cada secuencia heteróloga . El empalme trans eficaz de la primera y segunda secuencia heterólogas poseen ciertos requerimientos para las secuencias heterólogas. Por ejemplo, la homología del bucle Pl de la ribozima con el extremo 3 ' del fragmento de empalme 5' puede generar restricciones de la secuencia de base del fragmento de empalme 51. Con el in de evitar tales restricciones, la primera o segunda secuencias heterólogas pueden contener un intrón o una parte del mismo de manera tal que el producto de ARN de la reacción de empalme trans contiene un intrón capaz de empalme cis. De manera notable, las secuencias necesarias para el empalme trans en la primera y segunda secuencias de ADN heterólogas incorporan en tal intrón de autoempalme. El intrón de autoempalme después se puede ensamblar en la reacción de empalme trans . Después del empalme trans, cualquier secuencia o secuencias no deseadas necesarias para el empalme trans se pueden cortar del producto de la reacción de empalme trans mediante empalme cis (véase la figura 4) . En la técnica se conoce el diseño de los intrones de empalme cis . En el procedimiento (i) de la invención, cada una de la primera y segunda secuencias de ADN heteróloga incorporadas en un organismo multicelular o células del mismo de acuerdo con los métodos conocidos generalmente en la técnica. Preferiblemente por lo menos uno, y de manera más preferible ambas de las secuencias heterólogas se incorporan de manera estable en un cromosoma del genoma nuclear del organismo. El primero y segundo organismos multicelulares obtenidos de esta manera preferiblemente se vuelven homocigotos con respecto a las secuencias de ADN heterólogas respectivas, de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. El primero y segundo organismos multicelulares pertenecen preferiblemente a la misma familia, de manera más preferible al mismo género, y de manera mucho más preferible a la misma especie de organismos. La primera secuencia de ADN heteróloga en el primer organismo multicelular y la segunda secuencia de ADN heteróloga en el segundo organismo multicelular se pueden incorporar en el mismo cromosoma (de manera homologa) o en cromosomas diferentes (no homólogos) . Se prefiere que se incorporen en el mismo cromosoma. De manera más preferible, se incorporan en el mismo locus del mismo cromosoma. Los métodos para obtener tales posiciones relativas de la primera y segunda secuencias heterólogas se conocen en la técnica. Una posibilidad es producir muchos transformantes con cada una de la secuencias heterólogas. Después, el cromosoma que tenga la secuencia heteróloga incorporada asi como la ubicación de la secuencia transformada en el cromosoma se determinan por métodos genéticos o de biología molecular. Posteriormente, se puede seleccionar un organismo multicelular transformado que tenga la secuencia heteróloga en el lugar adecuado. Esto se puede realizar con un primer y segundo organismos multicelulares, y un par adecuado del primer y segundo organismos se pueden seleccionar. Una posibilidad adicional es utilizar integración dirigida a un locus deseado de un cromosoma particular que hace uso de la recombinación homologa. La integración dirigida preferiblemente se puede realizar utilizando una planta multicelular que tenga un sitio objetivo preintegrado en un cromosoma, en combinación con la recombinación especifica de sitio. Este último enfoque es particularmente útil para introducir la primera y segunda secuencias heterólogas en el mismo locus del mismo cromosoma, dado que la misma línea de organismo inicial que tiene el sitio objetivo preintegrado se puede utilizar para transformar las secuencias heterólogas. La integración dirigida se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional PCT/EP02/03266. En el procedimiento (i) de la invención, el primero y segundo organismos multicelulares o células de los mismos se hibridizan después para obtener el organismo vegetal o animal multicelular transgénico de la invención. La hibridación puede ser una cruza sexual de organismos o fusión de células de los organismos. La fusión celular puede ser una fusión de células germinales o de células somáticas. Si los organismos son plantas, la hibridación puede involucrar polinización de las plantas o fusión de células somáticas de protoplastos . Se prefiere de manera principal la cruza sexual de plantas. La hibridación genera fragmentos que codifican o que están involucrados en el rasgo juntos, en un organismo, de manera que el rasgo de interés surge debido al empalme trans de ARN. El surgimiento debido al empalme trans de AR significa que el empalme trans es una condición necesaria para la expresión del rasgo de interés. La producción del organismo transgenico de la invención puede comprender etapas adicionales, además de la hibridación. En el caso de las plantas, los ejemplos de tales etapas adicionales incluyen: crecimiento y cosecha se semillas, sembrado y crecimiento de la planta de la invención. En el caso de fusión de protoplastos, tales etapas adicionales incluyen: propagación de los protoplastos fusionados para obtener colonias, y regeneración de plantas. Varias ubicaciones relativas de la primera y segunda secuencias heterólogas así como los fragmentos respectivos existen en el organismo vegetal o animal multicelular transgenico de la invención. La primera y segunda secuencias heterólogas en la planta o el animal multicelular transgénico deben colocarse de manera que sean segregados como loci no relacionados. Tales loci no relacionados preferiblemente se colocan de manera que minimizan la recombinación y enlaces entre los loci. Las posiciones relativas generalmente se muestran en la figura 2B utilizan un organismo diploide como un ejemplo. En el caso I de la figura 2B, los fragmentos se localizan en el mismo cromosoma, es decir, están unidos físicamente en la misma molécula de ADN pero separados entre si por secuencias de cromosoma nativas al organismo. Los fragmentos pertenecerán a unidades transcripcionales diferentes. Dado que el entrecruzamiento en la meiosis puede llevar a separación de los fragmentos (o secuencias heterologas que contengan a los fragmentos) , la probabilidad de transferencia del rasgo codificado por ambos fragmentos a la progenie se reduce de manera significativa en comparación con el caso convencional, en donde el rasgo es codificado por una secuencia codificante continua. En el caso II (véase la figura 2B) , el primer y segundo fragmentos se localizan en cromosomas diferentes (cromosomas no homólogos, en oposición a cromosomas alélicos) . La frecuencia de heredar el rasgo codificado por dos fragmentos sobre cromosomas diferentes ante la cruza propia es de aproximadamente 50% y sobre la cruza con un organismo que no presenta ninguno de estos fragmentos, de 25%. Se prefiere el caso II con respecto al caso I. En un caso más preferido (caso III, en la figura 2B) , los dos fragmentos están presentes en cromosoma alélicos (homólogos) . Cuanto más cerca se encuentra en los fragmentos, menor será la frecuencia de transferencia del rasgo a la progenie. En el caso más preferido (caso IV en la figura 2B) , los fragmentos se localizan en el mismo locus . Por lo tanto, el rasgo se segrega rápidamente en la progenie cruzada del organismo vegetal o animal multicelular de la invención. La distribución controlada del rasgo la progenie significa que la probabilidad de transferencia del rasgo a la progenie se reduce de manera significativa en comparación con organismos transgenicos convencionales que tienen un transgen involucrado en el rasgo codificado en un locus de un cromosoma, de manera notable como una unidad transcripcional única. La frecuencia de aparición del rasgo en la progenie ante la cruza del organismo multicelular transgénico de la invención con un organismo carente de la primera y segunda secuencias heterólogas es menor de 10%, preferiblemente menor de 1%, de manera más preferible de 0.1%, e incluso de manera más preferible menor de 0.01%, y de manera mucho más preferible menor de 0.001%. Para comparación, la frecuencia de aparición de un transgen en la progenie por cruza de un organismo transgénico convencional (diploide) que tiene el trangen en una unidad transcripcional única y que es heterocigoto con respecto al transgen con otro organismo de la misma especie que no tiene el transgen es de aproximadamente 50%. En procedimiento (ii) de la invención, el ensamblado de AR involucrado en un rasgo de interés no requiere la hibridación de organismo o células. No obstante, la especificación proporcionada en lo anterior para el procedimiento (i) de la invención, también se aplica al procedimiento (ii) en donde es aplicable y al menos se especifica de manera diferente. En este segundo procedimiento, la primera secuencia heterologa típicamente es ADN que se integra en el genoma nuclear del organismo multicelular. La segunda secuencia heterologa puede ser ARN o ADN. Si es ADN, las secuencias que permiten la transcripción (por ejemplo un promotor funcional en el organismo) en dicho organismo debe proporcionarse con la segunda secuencia heterologa para producir ARN susceptible de empalme trans . Las segunda secuencia heterologa puede ser ARN, por ejemplo cuando se utiliza infección viral basada en el virus de ARN. No obstante, un segundo ARN heterologa de ARN viral se puede introducir indirectamente al introducir ADN susceptible de transcripción al ARN. La segunda secuencia heterologa de ADN o ARN puede o no incorporarse en el genoma nuclear del organismo multicelular. Preferiblemente, no se incorpora en el genoma nuclear. Esto permite un grado extremadamente alto de control de la distribución a la progenie del rasgo codificado en el primero y segundo f agmentos . El organismo multicelular o una célula del mismo que tenga una primera secuencia de ADN heteróloga se puede proporcionar como se describe para el procedimiento (i) . En contraste con el procedimiento (i) el organismo multicelular preferiblemente es heterocigoto con respecto a la primera secuencia heteróloga. La introducción de la primera y segunda secuencias heterólogas puede ser un procedimiento de una etapa o de dos etapas. En el procedimiento de una etapa, la primera y segunda secuencias heterólogas se introducen en un organismo multicelular junto o al mismo tiempo, y preferiblemente por el mismo método de transformación. La primera y segunda secuencias heterólogas se pueden introducir, por ejemplo, como una mezcla (por ejemplo, una mezcla de cepas de Agrobacterium, cada una que contiene una de las secuencias heterólogas en plásmidos T-ADN o Ti) . En el procedimiento de dos etapas, el organismo multicelular o una célula del mismo que tenga la primera secuencia de ADN heteróloga se produce primero, y la segunda secuencia heteróloga se introduce en una etapa independiente. Esta dos introducciones se pueden llevar a cabo por métodos diferentes de transformación o transfección. La introducción se puede realizar por infección viral, infección mediada por Agrobacterium o métodos de transformación no biológicos. Con los procedimientos de la invención se producen organismo vegetales o animales multicelulares transgénicos . Se prefieren plantas multicelulares . Entre los animales se prefieren los mamíferos (por ejemplo ratones, ratas, conejos y animales utilizados para nutrición humana como cerdos y - bovinos) . Se excluye a los humanos. Entre las plantas se prefieren las plantas de cosecha que incluyen cebada, avena, centeno, trigo, maíz, arroz, mijo, papa, semilla de colsa, ajonjolí, tomate, algodón, sorgo y tabaco. Los procedimientos de la invención se pueden aplicar a plantas diploides y poliploides . Los ejemplos para rasgos expresables de acuerdo con la invención, de manera principal en plantas son esterilidad masculina, resistencia a herbicidas, resistencia a insecticidas y un marcador contraseleccionable, morfología del organismo, contenido de la semilla, estabilidad de la semilla, adaptación al clima, contenido de vitaminas, contenido y composición de carbohidratos, contenido y composición de grasas, etcétera. Además, el rasgo puede ser la expresión de una proteína de interés, de manera principal una proteína farmacéutica. Los ejemplos de tales proteínas se proporcionan a continuación. En un caso preferido (véase ejemplo 1) , dos rasgos se expresan en una planta de la invención, por ejemplo un gen de un marcador seleccionable y un gen de interés que confiere un rasgo útil como resistencia a insectos. Los organismos multicelulares y los organismos multicelulares transgénicos de la invención se pueden modificar adicionalmente de manera genética o transitoria, por ejemplo para proporcionar funciones necesarias para el empalme trans o la expresión del rasgo de interés. Además, se puede expresar un segundo trangen involucrado en la expresión del rasgo de interés o un rasgo diferente. El procedimiento de la invención se puede utilizar para una amplia variedad de aplicaciones. Se puede utilizar, por ejemplo, para expresar un rasgo de interés en el organismo transgénico. El rasgo puede ser cualquier propiedad del organismo, ya sea codificado por un solo gen o por varios genes . El rasgo puede ser causado por la expresión de por lo menos un A , o preferiblemente por la expresión de por lo menos una proteína. Pueden ser necesarios dos o más ARN o proteínas para el rasgo. En este caso, puede ser suficiente controlar la expresión de únicamente un ARN o proteína como se describe en la presente. No obstante, es ambientalmente más seguro controlar la totalidad de los ARN o proteínas que producen un rasgo por el procedimiento de la invención (véase el ejemplo 1, figura 5) . La invención también permite ensamblar una secuencia que codifica para una proteína con módulos por ejemplo de péptido señal, dominios de unión, señales de retención, señales de compartimentalización, dominios de activación, dominios con actividades enzimáticas, etiquetas de afinidad y secuencias reguladoras . Tal enfoque modular vuelve sencillo encontrar un cásete de expresión óptimo para un propósito específico o para encontrar un péptido secretor o transitorio óptimo para un gen específico que se va a sobreexpresar y acumular en la célula o en un compartimiento específico de la misma. Puede ser una herramienta útil para estudios genómicos y proteómicos f ncionales . Se puede generar, por ejemplo, una biblioteca de plantas en donde cada miembro de la biblioteca contenga un módulo particular (por ejemplo un péptido señal específico) de una de las clases de módulos anteriores, por ejemplo como el primer fragmento. El segundo fragmento después codificará para una proteína de interés. Después de la hibridación (procedimiento (i)) o la introducción (procedimiento (ii) ) , la secuencia de ARN codificante de la proteína se une al módulo por empalme trans. Se prefiere llevar a cabo este enfoque modular con el procedimiento (ii) de la invención y sin la integración estable de la segunda secuencia heterologa en un cromosoma. En esta invención, un rasgo también se puede expresar en un organismo multicelular transgénico mediante regulación por inactivación de un gen nativo al organismo. Un gen puede ser regulado por inactivación mediante cualquiera de los métodos conocidos, por ejemplo por tecnología antisentido o por los ARN de interferencia pequeños (siARN) . En tales modalidades de la invención, un ARN antisentido o un siARN se proporciona por el producto de la reacción de empalme trans, opcionalmente después de procesamiento adicional similar a empalme cis. Se puede producir siARN en el organismo transgénico al diseñar la primera y segunda secuencias heterólogas de manera que el producto del empalme trans comprende porciones de secuencia que tienen autocomplementariedad para formar una estructura de ARN de cadena doble . La estructura de ARN de cadena doble puede tener una porción de identidad de secuencia para un gen de la célula hospedadora y puede tener una longitud suficiente para inhibir la expresión del gen en la célula. Este método es particularmente útil para estudios genómicos funcionales, de manera principal en combinación con el segundo procedimiento de la invención. El método de inhibición genética por ARN de cadena doble se describe de manera general en WO 99/32619. Un método eficaz de regulación por disminución de cualquier gen objetivo deseado utilizando los ARN de interferencia pequeños se describe en Brummelkamp et al. (Science 296, 550-553) . Estos métodos se pueden combinar fácilmente con el procedimiento de la invención. La aplicación más importante del procedimiento (i) es la producción de semillas híbridas para generar plantas para propósitos agroculturales o para la producción de una proteina en plantas, por lo que las plantas tienen una distribución controlada de un rasgo a la progenie. Las semillas híbridas permiten la generación de plantas que expresan un rasgo de interés que no se expresa en una línea de origen y que se segrega rápidamente en la progenie o descendencia. La aplicación más importante del procedimiento (ii) es el control de expresión de un rasgo de interés. La expresión del rasgo puede ser activado al introducir la segunda secuencia de ADN heterologa. Si la segunda secuencia de ADN heterologa se incorpora dentro de un cromosoma nuclear, el mismo nivel de control de distribución del rasgo es asequible como en el procedimiento (i) . Si la segunda secuencia de ADN heterologa no se incorpora en un cromosoma nuclear, la distribución del rasgo incluso se controla adicionalmente, dado que la transferencia del rasgo a la progenie es extremadamente improbable. La invención proporciona adicionalmente un organismo vegetal o animal multicelular transgénico que expresa un rasgo de interés, el organismo tiene una distribución controlada del rasgo a la progenie, en donde la expresión del rasgo involucra la producción de una molécula de ARN por empalme trans de fragmentos de ARN, por lo que los fragmentos de AR son codificados o están localizados en moléculas nucleotidicas heterólogas diferentes. Se prefieren organismos vegetales. Las moléculas nucleotidicas heterólogas diferentes pueden estar en cromosomas diferentes . Preferiblemente, los fragmentos de ARN son codificados sobre cromosomas alélicos. De manera más preferible, los fragmentos de ARN codifican, después de empalme trans, para una proteína heteróloga. La invención comprende adicionalmente partes o productos de los organismos transgénicos de la invención y semillas de plantas que se obtiene por tal hibridación.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Figura 1 Esquema general de empalme trans mediado por ribozima que resulta en la formación de ARNm funcional . Figura 2 A - muestra el principio general de la invención, en donde la formación mediada por empalme trans de transcriptos funcionales se lleva a cabo en células de la progenie híbrida; B - muestra cuatro posibles ubicaciones relativas de la primera y segunda secuencias de ADN heteróloga en cromosomas hospedadores del organismo multicelular transgénico de la invención. Se utiliza como un ejemplo un organismo diploide que tiene dos cromosomas y un rasgo de interés codificado por dos fragmentos (A y B) . C - muestra el principio básico de obtener las ubicaciones alélicas de la primera y segunda secuencias de ADN heterologa que se proporcionan para empalme trans . Figura 3 Esquema de un procedimiento, en donde el empalme trans, seguido por el empalme cis lleva al ensamblado de un gen funcional de interés (GOI) en una célula vegetal. Figura 4 Esquema general del principio modular, en donde el empalme trans fusiona con un péptido señal de elección con genes diferentes de elección, lo que permite compartimentalizar productos de genes diferentes en progenie híbrid . Figura 5 Esquema de un procedimiento en donde el empalme trans genera la formación de transcriptos que se proporcionan para rasgos de resistencia a insectos y a herbicidas. Rz significa ribozima. Figura 6 Esquema detallado de interacción de ARN complementario para empalme trans mediado por ribozima de fragmentos del gen BAR.

La figura 7 muestra un vector binario piCBVIS.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En esta invención, proponemos dividir la secuencia codificante de un transgen involucrado en la expresión de un rasgo, en dos o más fragmentos capaces de empalme trans a nivel de ARN, e introducir estos fragmentos en cromosomas diferentes del genoma hospedador, preferiblemente en cromosomas alélicos, de un organismo multicelular transgénico. Una vez transcriptos, estos fragmentos se pueden ensamblar por empalme trans de ARN y de esta manera formar un ARN funcional, principalmente ARNm, el cual puede proporcionar el rasgo de interés . Dado que el procedimiento de crianza habitualmente involucra cruzas originales muy específicas la administración de tales sistemas de dos alelos no genera problemas adicionales graves. Cualquier cruce espontánea no deseada entre el organismo transgénico (principalmente un organismo vegetal) de la invención y organismos no deseados desensambla eficazmente el rasgo y por lo tanto suprime la expresión y reduce en gran medida la probabilidad de una transferencia de un gen funcional a progenie ilícita. El procedimiento de la invención permite construir mecanismos que pueden controlar ya sea la expresión del transgen por si mismo o que pueden ser utilizados para controlar la variedad transgenica, dado que la progenie de cualquier cruza ilícita se vuelve no viable. Estas dos posibilidades se contemplan, por ejemplo, en nuestra invención. El sistema de esta invención también permite a un experto en la técnica diseñar esquemas para seleccionar transformantes primarios en base en un marcador seleccionable que es eficaz y operable en la progenie T0 pero los alelos de la cual, ante cruzas subsecuentes, segregan en progenie transgénica diferente y por lo tanto desaparecen como un gen seleccionable funcional . Además, la invención permite el ensamblado rápido in vivo de diferentes genes por cruzas originales que contienen fragmentos diferentes de una unidad transcripcional de interés y de esta manera se permite abarcar dominios funcionales diferentes, tales como mejoradores traduccionales, péptidos de tránsito o de señal o de direccionamiento, etiquetas de purificación, diferentes dominios funcionales de proteínas, etcétera, simplemente al cruzar plantas que presenten los fragmentos deseados de tal unidad de gen funcional/transcripcional . El empalme trans de AR se puede obtener mediante la utilización de ribozimas sometidas a ingeniería. Una de las aplicaciones iniciales del fenómeno de empalme trans fue propuesto por Sullenger y Cech (Nature, 1994 371, 619-622) quienes describieron experimentos en los cuales se utilizó el empalme trans, mediado por ribozimas, para sustituir una porción defectuosa de ARN con una estructura funcional mediante la utilización del intrón de Tetrahy ena grupo I sometido a reingeniería para generar transcriptos lacZ traducibles, en ?. coli. Proponen el empalme trans como un medio general para alterar la secuencia de transcriptos hospedadores específicos para propósitos de tratamiento de muchas enfermedades genéticas. Otro uso del empalme trans se propone por Ayre y colaboradores (1999, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 96, 3507-3512) quienes desarrollaron una tecnología que utiliza el empalme trans mediado por ribozimas para dirigir citotoxinas al interior de células de una manera altamente específica. Utilizaron intrones grupo I para empalmar el ARNm de la toxina A de difteria con el ARNm de virus para inactivar células que expresan ARNm viral y de esta manera inactivar selectivamente células de levadura infectadas. En la figura 1 se muestra el principio general del empalme trans mediado por ribozima derivado por intrón del grupo 1. Otra aplicación importante adicional se desarrolló por Mikheeva y Jarrell (1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 7486-7490) quienes utilizaron intrones del grupo II sometidos a ingeniería para catalizar el ensamblado de genes quiméricos o recombinantes . En esta investigación, se modificó la ribozima de manera que permite el lanzamiento de ARNm del activador de plasminógeno tisular y el ARN quimérico resultante se somete a transcripción inversa en ADN. La solución permite crear unidireccionalmente bibliotecas de genes que codifican para proteínas quiméricas con funciones novedosas . Hasta nuestro mejor conocimiento, no existe técnica anterior que describa el uso del empalme trans mediado por ribozimas para ensamblar rasgos útiles en células vegetales de una manera biológicamente segura y controlable. El esquema general del empalme trans que media el montaje del rasgo en la progenie ?? se muestra en la figura 2A. Ninguna de las dos lineas originales (Px y P2) tiene un gen lineal funcional completo que codifique para el rasgo. En contraste, cada uno contiene fragmentos (A o B) del gen que se localizan preferiblemente sobre cromosomas alélicos . Como un resultado de la polinización entre Px y P2, se genera una progenie con el rasgo funcional , por medio del ensamblado mediado por empalme trans de los fragmentos A y B. Es evidente de la figura que únicamente un cuarto de la progenie Sx derivada de la autopolinización del híbrido primario retendrá el rasgo de interés, mientras que una mitad heredará sólo uno de los dos fragmentos requeridos para proporcionar dicho rasgo y un cuarto no tendrá A o B. También es evidente que la polinización cruzada con cualquier otra planta (cruza ilícita) presentará una cantidad nula de fragmentos A y B que no llevarán a la transmisión del rasgo dado que sólo uno de los dos fragmentos necesarios para cada gen funcional es transmitido a cada planta de la progenie. Las ribozimas sometidas a ingeniería que son capaces de dirigir el ARN seleccionado no es una tarea común, dado que deben cumplirse requerimientos específicos para la estructura de ribozimas . Esto puede comprometer la secuencia del producto sometido a empalme trans y alterar la selección del sitio de empalme. Para volver este enfoque más flexible, un intrón que alberga el sitio de empalme trans puede ser sometido a ingeniería. En esta modalidad, el empalme trans llevará a la formación de un intrón funcional . El intrón puede experimentar adicionalmente empalme cis y generar ARN funcional de un gen de interés (GOI) responsable del rasgo de interés. En la figura 3 se muestra el esquema general de esta solución. En tal solución, que se somete a prueba para cada ribozima específica, es muy útil para experimentos de barrido de evolución/dominio dirigidos dado que permite someter a ingeniería sitios de empalme trans universales. El empalme trans de la invención no se limita la uso de intrones del grupo I y sus derivados . Existen diferentes grupos/clases de intrones clasificados de acuerdo con su organización interna y mecanismo de empalme. Los intrones nucleares tienen en común que presentan dinucleótidos GT-AG en los extremos 5 ' y 31 y que habitualmente requieren formación de espliceosomas para su empalme. Los intrones grupo I y grupo II se denominan en lo siguiente intrones que se encuentran en genes mitocondriales micóticos diferentes. Se clasifican de acuerdo con su organización interna pero tienen en común la capacidad de autocatalizar su propio empalme. Los intrones nucleares se empalman por medio de un mecanismo mediado por snRNP (mediado por espliceosoma) . Existe la literatura abundante que describe los mecanismos y diseño del empalme cis que incluyen empalme alternativo de genes nucleares en diferentes organismos eucarióticos (para una revisión véase Adams et al., 1996, Curr. Opin. Cell Biol., 8, 331-339; Hastings & Krainer, 2001, Curr. Opin. Cell Biol . , 13, 302-309) . El empalme trans que se presenta de manera natural con la relación de un mecanismo mediado por snRNP se describe para una unión de ARN SL (líder empalmado) del extremo 5' de los ARNm en tripanosomas (Agabian, N. , 1990, Cell, 61, 1157-1160; Luo et al., 1999, J. Biol. Chem. , 274, 31947-31954) y Caenorhabditis elegans (Hirsh & Huang, 1990, Mol. Biol. Rep., 14, 115). Estos ARN de "líder empalmado" pequeños consisten de un exón 5' fusionado a secuencias que pueden sustituir funcionalmente snARN Ul en extractos de empalme de snRNP de mamífero. Un empalme trans similar de ARN SL también se muestra en cordados. En el protocordato ascidian Ciona intestinalis, el ARNm de por lo menos siete géneros experimenta empalme trans con SLRNA (Vandenberghe et al., 2001, Genes Dev. , 15: 294-303). El empalme trans de los ARNm también se ha demostrado en células de mamífero (Eul et al., 1995, EMBO J. , 14, 3226-3235; Li et al., 1999, J\ Biol. Chem. , 284, 11060-11071; Caudevilla et al., 2001, FEBS Lett., 507, 269-279) y Drosophila (Dorn et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sel. USA, 98, 9724-9729). Una indicación temprana de que empalme trans puede funcionar en la maduración de ARN nuclear vegetal proviene del análisis del ARNm que codifica para una proteína cinasa (SPK) específica de semilla, dependiente de calcio de arroz (Kawasaki et al., 1999, Plant J. , 18, 625-632). El mapeo de un clon de ADNc para SPK indica que la totalidad del ADNc se divide en dos regiones diferentes, SPK-A y SPK-B, que se localizan en cromosomas diferentes en el arroz. Existen informes de grupos diferentes los cuales demuestran claramente que el empalme trans se puede someter a ingeniería mediante la utilización del mecanismo mediado por esplicesoma (Puttaraju et al., 1999, ta u e Botech. , 17, 246-252; Liu et al., 2001, Nature Biotech. , 20, 47-52). Los introñes de grupo I y grupo II tienen la capacidad de empalmarse a sí mismos fuera del pre-ARNm. Esta reacción puede llevarse a cabo in vitro por el ARN solo.

Tales ARN con actividades catalíticas generalmente se les denominan ribozimas. En esta invención, el término ribozima se utiliza para denominar los ARN catalíticos capaces de realizar reacciones de empalme trans entre moléculas de ARN separadas. Los intrones tanto de grupo I como de grupo II son capaces de empalme trans en sistemas artificiales (Been et al., 1986, Cell, 47, 207-216; Jacquier et al., 1986, Science, 234, 1099-1194; Jarrell et al., 1988, Mol. Cell Biol. 8, 2361-2366) . El empalme trans también se encuentra para intrones del grupo II en genes divididos de cloroplastos (Kohchi et al., 1988, Nucí. Acids Res., 16, 10025-10036) y para un intrón del grupo I en un gen dividido artificialmente en Escheríchia coli (Galloway-Salvo et al., 1990, J. Mol. Biol., 211 , 537-549). Los intrones de grupo I se descubrieron por primera vez en el ARNr de Tetrahymena thermophila (Cech, T.R., 1990, Annu. Rev. Biochem. , 59, 543-568). Requieren una U en la secuencia objetivo inmediatamente 5' del sitio de separación y unen 4 a 6 nucleótidos en el lado 51 del sitio de separación. Existen más de 75 miembros conocidos de este grupo hasta ahora. También se les encuentra en mitocondrias micóticas y vegetales (Richard & Dujon, 1997, curr. Genet. , 32, 175-181; Cho et al., 1998, Proc. Nati. Acad, Sci . USA, 95, 14244-14249), cloroplastos (Turmel et al., 1993, J. Mol. Biol. 232 , 446-46), fago T4 (Galloway et al., 1990, J. Mol. Biol-, 211 , 537-549), cianobacterias y otros organismos.

Existen varios enfoques desarrollados y ribozimas sometidas a ingeniería las cuales se pueden utilizar para llevar a la práctica esta invención (las referencias se mencionan en lo anterior) . Actualmente abarcan el uso de todos los tipos conocidos de intrones con el fin de someter a ingeniería sucesos de empalme trans en células eucarióticas . Además de ser utilizados en esta invención, también son aplicables ribozimas sometidas a ingeniería en la base de intrones de tetraimena del grupo I (documento de E.U.A. 6,015,794; Ayre et al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 96, 3507-3512), mediado por espliceosoma (Puttaraju et al., 1999, Nature Biotech. , 17, 246-252; Liu et al., 2001, Nature Biotech. , 2_0, 47-52; US6,083,702) o empalme trans medido por intrón del grupo II (Mikheeva & Jarrell, 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93_, 7886-7490; documento de E.U.A. 5,498,531) . El procedimiento de la invención se puede utilizar como una manera conveniente de ensamblar una secuencia o una unidad de expresión deseada a partir de diferentes partes en trans, utilizando como módulos o bloques de construcción plantas transgénicas diferentes (véase la figura 4) . Su progenie híbrida se puede colocar junto a módulos heredados de padres diferentes a través del empalme trans mediado por ribozimas sometidas ingeniería. Es posible formar un rasgo de interés al seleccionar el par apropiado de padres transgénicos que contengan los módulos requeridos, de una manera muy similar a la selección de un par apropiado de plantas originales para producir semillas híbridas de alto valor en la crianza tradicional. Los ejemplos de tales módulos incluyen péptidos señal diferentes, dominios de unión, señales de retención, señales de compartimentación, dominios de activación, dominios con actividades enzimáticas, etiquetas de afinidad, secuencias reguladoras, diferentes genes de interés y partes de los mismos . Un ejemplo de aplicación del empalme trans contemplado en nuestra invención es la formación de resistencia a herbicidas y resistencia a insectos mediante empalme trans a partir de precursores no funcionales. En los EJEMPLOS 1 y 2 describimos el diseño de un sistema para la formación, mediada por ribozimas, de los ARNm para BAR y CryIIIA en plantas. En el primer ejemplo se describe el diseño de dos constructos (plásmidos recombinantes) que contienen el primero y segundo fragmento de la invención de un sistema de empalme trans para cada gen de interés in trans. La formación de los rasgos que confieren resistencia a PPT (herbicida fosfinotricina) y resistencia a insectos se presenta exclusivamente en células vegetales que albergan los dos ADN T que se muestran en la figura 5. La transformación conjunta de los dos ADN T se puede seleccionar con facilidad utilizando medios que contienen PPT. El análisis de enlace de ADN T se describe en el ejemplo 2, que permite seleccionar el transformante más apropiado que contenga los ADN T diferentes en cromosomas alélicos diferentes, por ejemplo unidos en repulsión. Se pueden utilizar estrategias diferentes para introducción de secuencias de ADN heteróloga de interés en células, principalmente en células vegetales. Un enfoque se basa en la generación de dos transformantes independientes, cada uno de los cuales contiene una de las dos secuencias de ADN heteróloga involucradas en el empalme trans . Estas secuencias se pueden unir mediante cruza sexual o hibridación de células somáticas a través de fusión de protoplastos (Melchers, G. , 1976, Basic Life Sci . , 8: 455-467; Ratushnyak et al., 1993, Mol. Gen. Genet, 236: 427-432), y de esta manera se proporciona un rasgo de interés en la progenie. De manera alternativa, dos secuencias de ADN heteróloga se pueden integrar de manera estable en la misma célula vegetal durante uno o dos sucesos de transformación independientes. En ambos casos, el análisis genético de la progenie de tales plantas preferiblemente se realiza con el fin de determinar el enlace entre los fragmentos de ADN y para seleccionar la ubicación más preferible de los fragmentos en uno en relación al otro. Si las secuencias de ADN heteróloga que contienen los fragmentos se introducen en plantas diferentes, físicamente no están relacionados en una planta híbrida sino que se localizan en cromosomas diferentes o alélicos (unidos en repulsión) . Además, existe una probabilidad relativamente elevada de que los fragmentos se encuentren unidos físicamente (localizados en el mismo cromosoma) en caso de integración estable de los fragmentos en la misma planta. En un caso, los dos fragmentos están unidos físicamente, por ejemplo se localizan en el mismo cromosoma (figura 2B, caso I) . En este caso, los fragmentos se pueden segregar en progenie debido a una cruza meiótica y de esta manera se proporciona un mejor control sobre la expresión del rasgo y el movimiento, en comparación con la técnica anterior en donde el rasgo es codificado por una secuencia continua. En una modalidad preferida, los fragmentos no están unidos físicamente, por ejemplo, se localizan en dos cromosomas diferentes (no homólogos) (figura 2B, caso II) . En este caso, únicamente la mitad de la progenie propia y un cuarto de la progenie cruzada de la planta heterocigota para ambos fragmentos heredará el rasgo. De manera más preferible, los fragmentos están en cromosomas alélicos diferentes (figura 2B, caso III) . Aquí, toda la progenie propia heredará el rasgo, pero ningún rasgo será heredado por la progenie que resulta de la cruza con plantas que posean a ninguno de los fragmentos si se niega o está ausente la cruza meiótica. La recombinación meiótica entre dos cromosomas alélicos no obstante, puede unir físicamente los fragmentos A y B. la frecuencia de tales sucesos de recombinación depende directamente de la distancia relativa entre los fragmentos sobre dos cromosomas alélicos. Con el fin de suprimir el enlace físico de los fragmentos por recombinación meiótica, los fragmentos preferiblemente se colocan a una distancia relativa corta o, de manera más preferible, en el mismo locus en cromosomas alélicos diferentes (figura 2B, caso IV) y de esta manera se minimiza la frecuencia de recombinación meiótica entre tales fragmentos prácticamente a cero. Existen diferentes soluciones técnicas para obtener la ubicación alélica más preferible de los fragmentos . Tales fragmentos A y B se pueden integrar dentro del ADN cromosómico en un constructo AB (figura 2C) . El diseño del constructo permitirá la separación seleccionable de uno de los fragmentos de ADN heteróloga (A o B) utilizando un mecanismo de rearreglo de ADN controlable (corte, inversión o transposición) y de esta manera se genera progenie que contiene ya sea el fragmento A o el fragmento B en el mismo locus, o que tenga selectividad transcrita ya sea al fragmento A o al fragmento B sin necesidad de retirarlos . Al unir ambos fragmentos o sus transcriptos por cruza de plantas que poseen únicamente uno de los fragmentos o ambos fragmentos, pero únicamente uno de los transcriptos requeridos, generará la expresión del rasgo de interés. Un ejemplo de recombinación controlada de ADN puede ser el flanqueado de los fragmentos A y B con secuencias reconocidas por recombinasas diferentes específicas de sitio y, ante tal reconocimiento, separar selectivamente ya sea el fragmento A o el fragmento B. De manera alternativa, ambos fragmentos pueden ser flanqueados por secuencias para recombinación específica de sitio en tal orientación, de manera que la exposición a la fuente de recombinasa que reconoce tales secuencias llevará a la inversión del fragmento de ADN con ambos fragmentos. La colocación de la región de inicio de transcripción (promotor) justo fuera del fragmento de ADN puede generar la transcripción del fragmento A o B, dependiendo de la orientación de los fragmentos. Otro enfoque comprende el uso de la transposición en donde, por ejemplo, el fragmento B se localiza y transcribe con un elemento susceptible de transposición no autónomo, pero su corte del constructo activará la transcripción del fragmento A. El corte del transposón no necesariamente genera su reinserción en otra parte, de manera que la progenie se puede seleccionar para que contenga únicamente el fragmento A. En los ejemplos, utilizamos el suministro de ADN T mediado por Agrobacterium en células vegetales, en donde el ADN T contiene la primera o segunda secuencias heterólogas como un vector. Se pueden utilizar métodos diferentes para el suministro de vectores al interior de células vegetales tales como introducción directa del vector en las células por medio de bombardeo con microproyectiles, electroporación o transformación de protoplastos mediada por PEG. Se prefiere la transformación de la planta mediada por Agrobacterxum, de manera principal por el procedimiento (i) y para la primera secuencia heteróloga del procedimiento (ii) . De esta manera el ADN se puede transformar en células vegetales por diversas tecnologías adecuadas por ejemplo mediante el vector del plásmido Ti transportado por Agrobacterxum (documentos de E.U.A. 5,591,616; 4,940,838; 5,464,763), bombardeo con partículas o microproyectiles (documentos de E.U.A. 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1) . En principio, también se pueden utilizar otros métodos de transformación de plantas, por ejemplo microinyección (WO 09209696; O 09400583A1; EP 175966B1) , electroporación (EP00564595B1 ; EP00290395B1; WO 08706614A1) , etcétera. La selección del método de transformación depende de la especie vegetal que se va a transformar. Por ejemplo, se puede preferir el bombardeo con microproyectiles para transformación de monocotiledonias mientras que para dicotiledonias generalmente se obtienen mejores resultados con la transformación mediada por Agrobacterium. El sistema de empalme trans descrito en nuestra invención consiste de dos o más fragmentos los cuales se proporcionan en trans. Esto significa que nuestro sistema está mejor controlado y es más seguro, por ejemplo puede tener un nivel de expresión cero en estado no inducido . Los genes de interés, o fragmentos de los mismos que se pueden expresar, en orientación directa o antisentido utilizando esta invención incluyen; enzimas modificadoras de almidón (almidón sintasa enzima de fosforilación de almidón, enzima de desramificación, enzima de ramificación de almidón, enzima II de ramificación de almidón, almidón sintasa unida a granulos) , sacarosa fosfato sintasa, sacarosa fosforilasa, poligalacturonasa, polifructano sacarosa, ADP glucosa pirofosforilasa, ciclodextrina glucosiltransferasa, fructosiltransferasa, glucógeno sintasa, pectina esterasa, aprotinina, avidina, levansacarosa bacteriana, proteína gigA de E. coli, ????4 y ortólogos, enzima de asimilación/metabolismo de nitrógeno, glutamina sintasa, osmotina vegetal, albúmina 2S, taumatina, recombinasa/integrasa específica de sitio (FLP, Cre, recombinasa , Int, SSVI Integrasa R, Integrasa phiC31 o un fragmento activo o variante del mismo) , isopenteniltransferasa, Sea M5 (calmodulina de frijol de soya) , toxina de tipo de coleopterano o un fragmento activo insecticida, proteínas de fusión de enzima de conjugación de ubiquitina (E2) , enzimas que metabolizan lípidos, aminoácidos, azúcares, ácidos nucleicos y polisacáridos , superóxido dismutasa, forma de proenzima inactiva de una proteasa, toxina de proteínas vegetales, rasgos que alteran las fibras en plantas productoras de fibras, toxina activa de coleopterano de Bacillius thuringiensis (toxina Bt2, proteína de cristal insecticida (ICP) , toxina Cryl, endotoxina d, toxina de poliopéptido, protoxina, etcétera) , toxina específica para insecto AaIT, enzimas degradantes de celulosa, celulasa El de Acídothermus celluloticus, enzimas modificadoras de lignina, cinamoil alcohol deshidrogenasa, trehalosa-6-fosfato sintasa, enzimas de la vía metabólica de citocinina, HMG-CoA reductasa, pirofosfatasa inorgánica de E. coli, protelna de almacenamiento de semillas, licopeno sintasa de Erwinia herbicola, ACC oxidasa, proteína codificada por pTOM36, fitasa, cetohidrolasa, acetil CoA reductasa, PHB (polihidroxibutanoato) sintasa, proteína portadora de acilo, napina, EA9, fitoeno sintasa vegetal no superior, proteína codificada por pT0M5 , ET (receptor de etileno) , piruvato fosfato dicinasa plastídica, proteína de poro transmembranal inducible por nemátodos, rasgo que incrementa la función fotosintética o de plásmidos de la célula vegetal, estilbeno sintasa, una enzima capaz de hidroxilar fenoles, catecol dioxigenasa, catecol 2,3-dioxigenasa, cloromuconato cicloisomerasa, antranilato sintasa, proteína AGL15 de Brassica, fructosa 1 , 6-bifosfatasa (FBPasa) , AMV RNA3 , PVY replicasa, PLRV replicasa, proteína de recubrimiento de potivirus, proteína de recubrimiento de CMV, proteína de recubrimiento de TMV, replicasa de luteovirus, AR mensajero de D V, replicasa geminiviral mutante, Uwbellularia californica C12 : 0 que prefiere acil-ACP tioesterasa, planta CIO o C12 : 0 que prefiere acil-ACP tioesterasa, C14 : 0 que prefiere acil-ACP tioesterasa (luxD) , factor A sintasa vegetal, factor B sintasa vegetal, 6-desaturasa, proteína que tiene una actividad enzimática en la oxidación peroxisómica de ácidos grasos en células vegetales, acil-CoA oxidasa, 3-cetoacil-CoA tiolasa, lipasa, acetil-CoA-carboxilasa de maíz, 5-enolpirovilshikimato-3 -fosfato sintasa (EPSP) , fosfinotricina acetil transferasa (BAR, PAT) , proteína CP4, ACC desaminasa, ribozima, proteína que tiene un sitio de separación postraduccional , proteína de fusión que consiste de un dominio de unión de ADN del activador transcripcional Gal4 y un dominio de activación transcripcional , una fusión traduccional de proteína oleosina con proteína de interés capaz de dirigir la proteina de fusión dentro de la fase lipídica, gen DHPS que confiere resistencia a sulfonamida, nitrilasa bacteriana, 2,4-D monooxigenasa, acetolactato sintasa o acetohidroxiácido sintasa (ALS; AHAS) , poligalacturonasa, nitrilasa bacteriana, fusión de la región hidrofóbica aminoterminal de una proteína translocalizadora de fosfato madura que reside en la envoltura interior de membrana de un plástido con proteína de interés para ser dirigida al interior de la membrana, etcétera . Cualquier proteína humana o animal se puede expresar utilizando el sistema de empalme trans . Los ejemplos de tales proteínas de interés incluyen, por ejemplo proteínas de respuesta inmunológica (anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena única, receptores de linfocitos T, etcétera) , antígenos, factores estimulantes de colonias, relaxinas, hormonas polipeptídicas , citocinas y sus receptores, interferones, factores de crecimiento y factores de coagulación, enzimas lisosómicas enzimáticamente activas, polipéptidos fibrinolíticos , factores de coagulación de sangre, tripsinógeno, 1-antitripsina (AAT) así como proteínas conservadoras de función como fusiones, versiones mutantes y derivados sintéticos de las proteínas anteriores. El procedimiento de la invención puede comprender adicionalmente la expresión de un gen que codifique para una proteína supresora o inhibidora de expresión de un gen postranscripcional (PTGS) o una variante conservadora de función o un fragmento de la misma en una planta para suprimir PTGS de la secuencia codificante transgenica. El gen para la proteína supresora PTGS o la variante conservadora de fusión o fragmento de la misma se puede proporcionar a una planta en el mismo vector que presenta la secuencia de codificación transgenica o un vector adicional . La proteína supresora de PTGS preferiblemente es de origen viral o vegetal. Los ejemplos de proteínas supresoras de PTGS son la proteína X p25 del virus de papa, la proteína AC2 del virus del mosaico de cassava africana, la proteína Pl del virus de la roya amarilla del arroz, la proteína 19K del virus de enanismo y amarilleo del tomate, rgs CAM o una variante conservadora de fusión o un fragmento de una de estas proteínas. Tal variante conservadora de función o fragmento preferiblemente tiene una identidad de secuencia de 75% para una de las proteínas anteriores . Los detalles sobre las proteínas supresoras de PTGS y su uso se pueden encontrar en WO0138512. Nuestra invención también es aplicable para genes marcadores seleccionables/calificables y sus funciones con diferentes genes de interés, y por lo tanto permite la selección directa del mejor productor de proteína recombinante . Los ej emplos de tales marcadores seleccinables/clasificables incluyen, por ejemplo, genes o fragmentos de: neomicina fosfotransferasa II (NPTII) higromicina fosfotransferasa, aminoglucósido de 61 -N-acetiltransferasa, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, fosfinotricina acetil transferasa (BAR) , betaina aldehido deshidrogenasa (BADH) , dihidrofolato reductasa (DFR1) , 6' gentamicina acetiltransferasa (6' GAT) , acetolactato sintasa (ALS) , fosfomanosa-isomerasa (PMI) , glifosato óxidoreductasa, acetohidroxiácido sintasa (AHAS) , 2 -desoxiglucosa-6-fosfato fosfatasa (2-DOG-6-P) , luciferasa, proteina fluorescente verde (GFP) y fusiones de genes marcadores seleccionables y susceptibles de cribado. EJEMPLO 1 Diseño de un constructo para ensamblado de un transcripto de BAR y CryIIIA mediado por empalme trans Se diseñan dos constructos de T-ADN (véase la figura 5), uno con r bozima unida al extremo 3' del gen BAR (Gene Bank Acceso X17220) y del extremo 5' del gen CryIIIA (Gene Bank Acceso X70979) y otro - con el extremo 5' del gen BAR y unido a rxbozima con el extremo 31 del gen CryIIIA, utilizando técnicas de biología molecular estándar (Sambrook, Fritsch & aniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, Y, 2a edición). El primer constructo (figura 5, parte superior) presenta el extremo 5 ' de una unidad transcripcional impulsada por promotor 35S que contiene un gen CryIIIA unido al fragmento de 200 pares de bases del gen HPT en orientación directa, y una unidad transcripcional impulsada por el promotor nos que contiene 300 pares de bases (pb) . El fragmento del gen HPT en orientación antisentido seguido por una rxbozima unida al extremo 31 del gen BAR. El segundo constructo (figura 5, segundo desde la parte superior) tiene un fragmento de gen HPT de 200 pb impulsado por el promotor 35S en orientación antisentido seguido por una rxbozima unida al extremo 3' del gen CryIIIA y un extremo 51 impulsado por el promotor nos del gen BAR unido con un fragmento de HPT de 300 pb en orientación directa. Las presentaciones esquemáticas de los constructos asi como los productos de empalme trans se muestran en la figura 5. La figura 6 muestra una imagen detallada del procedimiento de empalme trans que proporciona un gen BAR funcional .

Clonación del extremo 5' del gen BAR en el sistema de empalme trans . Una parte del gen HPT (300 nucleótidos, Gene Bank, Acceso No. V014999, cuya secuencia se muestra en lo siguiente) se selecciona como la secuencia objetivo. HPT es un gen bacteriano, no se relaciona con ninguno de los genes vegetales. El contenido de G/C es de aproximadamente 60%, de manera que el pareamiento de bases entre las partes 5 ' y 31 del vector viral deben ser muy eficientes: atígcígatccccatgígtatcactggcaaacígtgatggacgacaccgícagígGgtccgícgcgcaggctctcgatgagctgaí gctítgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggattícggctccaacaatgtcctgacggacaatggcc gcataacagcggícattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcctcttcíggaggccgt ggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcat Se utilizan los siguientes cebadores para la amplificación de la secuencia objetivo de HPT de 300 pb (los sitios de restricción se escriben con negrillas y están subrayados) : Targhptl : 5'-aígcctc2agttactagaaítgctgaíccccatgtgíatcac-3' Xhol Targhpt3: 5'-tcaggtcgaca¾cctccgctcgaagtagcgcgt-3' Sa!l Targhpt4: 5'-taactctagaattgctgatccccatptqtatcac-3' Xba! Targhpt5: 5'-tcaaaqtaccatacctccgctcaaagtagcgcgt-3' pn1 La secuencia codificante del gen BAR se divide en dos partes y la parte media del dominio de acetiltransferasa (residuos aminoácidos 60-142) para asegurar que no hay resistencia fosfinotricina proporcionada por cualquiera de las partes separadas. Los cebadores utilizados para PCR de los fragmentos de interés son: Pnosl: 5'-cíagaatícatgagcggagaatíaagggagtc-3' EcoRI Barlr: 5'- gíaactcgagtgacttcagcaggtgggtgtag-3' Xhol El extremo 5' del gen BAR junto con el promotor nos se amplifica por PCR utilizando ADN plasmídico pICBV19 (figura 7) como plantilla y los cebadores pnosl y barlr. Este fragmento de PCR se digiere con Xhol y EcoRI y se clona en un fragmento grande de Kpnl-EcoRI digerido binario de pICBV19 junto con targhptl-targhpt5 amplificado y digerido con enzimas de restricción Kpnl y Xhol del fragmento HPT. Esto proporciona pICBV19 que contiene el extremo 5 ' del gen BAR unido a 300 pb de la secuencia codificante de HPT bajo el control del promotor NOS (constructo 1 intermediario) . El constructo pICH1600, que contiene el gen HPT, se toma como plantilla para amplificación por PCR de los fragmentos de HPT.

Clonación de extremo 3 ' del gen BAR del sistema de empalme trans . Para clonación del extremo 3 ' del gen BAR unido con la ribozima, el fragmento Kpn 1 - EcoR 1 de pICBV19 (pNOS-BAR) se sustituye con el promotor pNOS separado de la señal de terminación de transcripción de OCS 3' por los sitios de restricción Salí y Neo 1. Se utilizan los siguientes cebadores para amplificar el extremo 3' del gen BAR: Bar2f : 5'-ggagaagcttggcttcaagagcgtggtcgctg-3'; HindlII Bar3r: 5'-caígccatggtcaaaícícggígacgggcaggacc-3'. Nco1 La secuencia de la ribozima sintética basada en el intrón del grupo I se toma del ARNr 26S del precursor de Tetrahymena thermophila (Koehler et al., 1999, J. Mol. Biol . , 285, 1935-1950; Ayre et al., 1999, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 96, 3507-3512) .

Xbal tctaaactíaícgggígacaaaagttaícaggcatgcacctggtagctagícttíaaaccaatagatígcatcggtttaaaaggca agaccgtcaaattgcgggaaaggggtcaacagccgttcagtaccaagtctcaggggaaacíitgagaíggccttgcaaagggt atggíaataagctgacggacatggtcctaaccacgcagccaagtcctaagtcaacagatcttctgttgatatggatgcagttcaca gactaaaígtcggtcggggaagatgtattcttcÍGataagatatagtcggaccfctcctíaatgggagctagcggaígaagtgaígc aacactggagcogctgggaactaatttgtatgcgaaagtaíattgaítagttttggagtactcgtgaía^gctí Híndlil Esta secuencia de ribozima se ordena en ATG.-Biosynthetics GmbH (P0202001) , insertada en pBluescript II SK(+) entre los sitios de restricción Hindlll y Xbal (plásmido pICH080) y se utiliza para etapas de clonación adicionales. Después la ribozima de pIC080 se fusioan a la versión antisentido del HPT objetivo (fragmentos PCR de Xbal/Sall de 300 pb (amplificado con cebadores Targhpt3 y Targhpt4) para obtener el plásmido intermedio basado en pBS(KS+). Este plásmido se utiliza para aislar un fragmento Hind III/Sal 1 de ribozima unida con 300 pb del fragmento HPT en orientación antisentido. La etapa final en la clonación de este cásete de expresión incluye la ligación de tres vías del fragmento de ribozima -HPT Hind III/Salí con un fragmento de PCR tratado con HindIII/NcoI (cebadores bar2f y bar3r) del extremo 31 del gen BAR y un vector binario modificado digerido con Ncol/Sall pICBV19 (figura 7) . La clonación final proporciona una ribozima que contiene pICBV19 unida al extremo 3 ' del gen BAR bajo el control del promotor NOS (constructo 2 intermediario) . El procedimiento de clonación del gen BAR en dos fragmentos y su ensamblado mediante empalme trans lleva a la sustitución neutra de tres residuos aminoácidos no conservados en la región de división (Glu-Asp Ala-Lys; Gln -Leu) .

Clonación del extremo 5' del gen CryIIIA del sistema de empalme trans . Se selecciona una parte del gen HPT (180 nucleótidos, Gene Bank No. de acceso V014999, cuya secuencia se muestra en lo siguiente) como la secuencia objetivo en este caso. 5'-ctgaactcac cgcgacgtcí gtcgagaagí ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt-3' Esta secuencia no se superpone con el fragmento de HPT de 300 pb utilizado para designar el sistema de empalme trans mediado por ribozima para el gen BAR. Para clonación con el extremo 5! del gen CryIIIA, el fragmento de HPT de 180 pb se amplifica con los cebadores hptlf (51 -gcatctcgag ttactagct gaactcaccg cgacgtct gtc-31) y hpt2r (5 ' -ctgcggatc caaacataac gatcttgtag aaaccatcc-3 ' ) digerido con Xhol y BamHl se liga junto con un fragmento sintético Clal/Xhol del gen CryIIIA (ATG:Biosynthetics GmbH) en un fragmento de Clal/BamHl purificado en gel del constructo 2 intermediario. Se muestran con negrillas los sitios de restricción para Xhol y BamHl en las secuencias del cebador. El constructo final se muestra en la figura 5 (parte superior) . El fragmento 5 ' del gen CryIIIA sintético con el extremo 5' del intrón de actina de arroz (que se muestra en cursivas, Gen Bank acceso No. X63830) flanqueado por los sitios de restricción Clal (extremo 5') y Xhol (extremo 3') : Cla1 5'-atcg atgactgcag acaacaacac cgaagccctc gacagttcta ccactaagga tgttaíccag aaggg atct ccgttgtggg agacctcttg ggcgtggttg gatttccctt cggtggagcc ctcgtgagct tctatacaaa cíttctcaac accatttggc caagcgagga cccttggaaa gcattcatgg agcaagttga agctcttatg gatcagaaga ttgcagatta tgccaagaac aaggctttgg cagaactcca gggccttcag aacaatgtgg aggactacgt gagtgcatig tccagctggc agaagaaccc tgttagctcc agaaatcctc acagccaagg taggatcaga gagitgttct ctcaagccga atcccacttc agaaattcca ígcctagctt ígcíatcícc ggttacgagg ttcttttcct cactacctai gctcaagctg ccaacaccca cttgtttctc cttaaggacg ctcaaatcta tggagaagag tggggatacg agaaagagga cattgctgag ttctacaagc gícaacttaa gctcacccaa gagtacactg accattgcgt gaaaíggtat aacgttggtc tcgataagct cagaggctct tcctacgagt cttgggtgaa cttcaacaga tacaggagag agatgacctt gactgtgctc gatcttatcg cactctttcc cttgtacgat gtgagactct acccaaagga agtgaaaact gagcttacca gagacgtgct cactgaccct attgtcggag tcaacaacct taggggttat ggaactacct EcoR1 tcagcaatat cgaaaactac attaggaaac cacatctctt cgactaictt cacagaattc aattccacac aag gtaaccaccc cgcgtccctc tcctctttct ttctcGgttt tttttttccg tctogtctcg atctttggcc ttggtagttt gggggogaga ggcggcttcg tcgcccagat cggfgcgcgg gaggggcggg BamH1 atctcgcggc tgggtctcgg cgtgcggcog gatcctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgat ccgccgttgt tgggggagat gatggggcgt ftaaaatttc aagtcactcg ag-3' Xhol El fragmento del gen CryIIIA sintético precedido por el extremo 3 ' del intrón de actina 1 de arroz (que se muestra en cursivas) y flanqueado por los sitios de restricción HindIII (extremo 51) y BamHl (extremo 3 ' ) .- Hindlll 5'aagctt gccatgctaa acaagatcag gaagagggga aaagggcact atggtttata tttttatata tttctgctgc tgctcgtcag gcttagatgt gctagatcti tctttcttct tttigtgggt agaatttgaatccctcagca gttcatcg gtagtttttc tittcatgat tígtgacaaa tgcagcctcg tgcggagctt ttttgtag gtttcaa ccaggatact atggtaacga ctccttcaac tattggtccg gtaacíatgt ttccaccaga ccaagcattg gatctaatga catcatcaca tctcccttct atggtaacaa gtccagtgaa cctgtgcaga accttgagtt caacggcgag aaagtctata gagccgtcgc aaacaccaat ctcgctgtgt ggccatccgc agtttactca ggcgtcacaa aggtggagtt íagtcagtat aacgatcaga ccgatgaggc cagcacccag acttacgact ccaaacgtaa cgttggcgca gtctcttggg attctatcga ccaattgcct ccagaaacca cagacgaacc attggagaag ggcíacagcc accaacttaa ctatgtgatg tgcttcttga tgcaaggttc cagagggacc attccagtgt tgacctggac acacaagtcc gtggacttct tcaacatgat cgatagcaag aagatcactc aacttccctt ggtgaaagcc tacaagctgc aatctggtgc ttccgttgíc gcaggtccca gattcactgg aggtgacatc atccagtgca cagagaacgg cagcgcagct actatctacg tgacacctga tgtgtcttac tctcagaagt acagggcacg tattcattac gcaíctacca gccagatcac cttcacactc agcttggatg gagcaccctí caaccagtat íactttgaca agaccaícaa caaaggígac actctcacat acaatagctt caacttggca agtttcagca caccattíga actctcaggc aacaatcttc agatcggcgt caccggtctc agcgccggag acaaagícía caícgacaag attgagttca tcccagígaa ctgaggatcc BamHI 5 La región entre los dos bloques conservados (bloque 2 y bloque 3) dentro del dominio II se selecciona para la división de CryIIIA en dos partes (Schnepf et al., 1998, Microbiol & Mol . Biol. Rev., 62, 775-806). lü Clonación del extremo 3' del gen CryIIIA en el sentido de empalme trans . El fragmento Hindlll/Xbal de ribozima se clona junto con un fragmento de HPT Sacl/Xbal de 180 pb en los 15 sitios Sacl/Hind 111 pBS(KS+), lo que genera un fragmento de ribozima unido con el fragmento de gen HPT en orientación antisentido. El fragmento de HPT se amplifica por PCR con los cebadores hpt3f (5'- gcatagatctct gaactcaccg cgacgtct gtc-3 ' ) y hpt4r (51 -ctgcgagctcaaacataac gatcttgtag aaaccatcc-3 ' ) 20 utilizando el plásmido pICH1600 como la plantilla. El fragmento Hindlll/BamHl sintetizado que contiene el extrema 31 del fragmento cryIIIA precedido por el extremo 3 ' del intrón del gen actina 1 de arroz (véase en lo anterior) , se clona junto con el fragmento Hindlll/Sacl de Ribozima-HPT 25 dentro de los sitios Sacl/BamHl del constructo intermediario, sustituyente al gen GUS con la parte 3 ' unida a ribozima de CryIIIA y lo que genera el constructo final (véase la figura 5, segundo desde la parte superior) .

EJEMPLO 2 Detección de sucesos de empalme trans en células vegetales transformadas El ADN-T de constructos que se muestran en la figura 5, se cointroduce en plantas Arabidopsis tha.lia.na (Col-0) como se describe en por Bent et al., (1994, Science, 285 , 1856-1860) . Las semillas se cosechan tres semanas después de germinación e infiltración al vacío y se criban para detectar transformantes, al rociarlas varias veces con 50 mg/1 de solución de fosfinotricina (PPT) . Los mismos constructos se utilizan también para conformación de disco de hoja mediado por Agrjrojbacteriuni de plantas de Nicotiana (Horsh et al., 1985, Science, 227 , 1229-1231) utilizando 10 mg/1 de PPT. Las plantas transgénicas que muestran resistencia a PPT, albergan dos ADN-T diferentes que presentan las partes diferentes del gen BAR. Ninguna de las plantas resistentes a PPT se recuperan mediante la utilización de solo uno de los dos constructos. Esto sugiere que CryIIIA también estará presente en la célula, dado que sus partes están relacionadas con los fragmentos del gen BAR. Se realiza análisis Southern para seleccionar transgénicos con una sola copia de cada ADN-T. El análisis genético de las progenies i (autopolinizada a partir de T0) y Fl (TQ X cepa original o de tipo silvestre) de los transformantes primarios (T0) permite la selección de plantas transgénicas que presenten dos ADN-T funcionalmente complementarios sobre cromosomas iguales, diferentes o alélicos. Por ejemplo, Ti muestra la segregación PPTr:PPTs = 3:1 y Fa la segregación PPTr:PPTs = 1:1, lo que significa que los ADN-T están unidos y se pueden segregar únicamente como resultado de una cruza meiótica. El caso en donde Tx muestra una segregación PPTr:PPTs = 9:7 y Fi se segrega como PPTr:PPTs = 1:3, significa que los ADN-T se localizan en cromosomas no alélicas diferentes. La generación Ti que muestra la segregación PPTr:PPTs = 1:1 y Fx que segrega como PPTr:PPTs = 0:1, significa que los ADN-T se localizan en cromomosomas alélicos . Este último caso será preferible para trabajar, dado que la transferencia de los rasgos de resistencia a herbicida y resistencia a insectos a través de la polinización cruzada estará muy limitada.

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir un organismo vegetal o animal multicelular transgénico que exprese un rasgo de interés y que tenga una distribución controlada del rasgo a la progenie o descendencia, en donde el procedimiento comprende hibridizar un primer organismo multicelular o una célula del mismo que tenga una primera secuencia de ADN eteróloga que comprende un primer fragmento de una secuencia nucleotidica que codifica para el rasgo de interés, y un segundo organismo multicelular o una célula del mismo que tenga una segunda secuencia de ADN heteróloga que comprenda un segundo fragmento de la secuencia nucleotidica que codifica para el rasgo de interés, por lo que la primera y segunda secuencias heterólogas se diseñan de manera que el rasgo de interés sur a debido al empalme trans de ARN después de la hibridación, y por medio del cual el primero y segundo fragmentos de una secuencia nucleotidica que codifican para el rasgo de interés estén presentes sobre cromosomas alélicos.

2. El procedimiento como se describe en la reivindicación 1, en donde el medio de distribución controlado significa que, ante la cruza del organismo multicelular transgénico con un organismo carente de la primera y la segunda secuencias heterólogas, la frecuencia de aparición del rasgo en los organismos que descienden del anterior es menor de 1%, preferiblemente menor de 0.1%, y de manera más preferible menor de 0.01%, de manera más preferible menor de 0.001%.

3. El procedimiento como se describe en las reivindicaciones 1 ó 2 , en donde por lo menos una de la primera y segunda secuencias de ADN heterólogas comprenden una ribozima para un empalme trans .

4. El procedimiento como se describe en la reivindicación 3 , en donde la ribozima de empalme trans se selecciona del siguiente grupo: ribozimas derivadas de intrón grupo I, ribozimas derivadas de intrón grupo II, y otras ribozimas diseñadas natural o artificialmente capaces de empalme trans de ARN especifico.

5. El procedimiento como se describe en la reivindicación 3, en donde el empalme trans es mediado por un espliceosoma .

6. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el organismo vegetal o animal multicelular transgénico es incapaz de expresar el rasgo de interés en ausencia de la primera o segunda secuencias heterólogas .

7. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el empalme trans resulta en que el AR mensajero es capaz de traducir y producir una proteína, y por lo tanto está dotando al organismo vegetal o animal multicelular transgénico con un rasgo de interés .

8. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el empalme trans resulta en una pluralidad de ARN mensajeros expresables, y de esta manera se generan proteínas múltiples o proteínas quiméricas diferentes .

9. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el empalme trans resulta en ARN de cadena doble.

10. El procedimiento como se describe en la reivindicación 9, en donde el ARN de cadena doble tiene una porción de secuencia idéntica a un ge objetivo suficientemente grande para inhibir la expresión del gen objetivo en el organismo vegetal o animal multicelular transgénico .

11. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el organismo multicelular se proporciona con la primera o segunda secuencia heteróloga por transfección viral, suministro mediado por Agrobacterium, suministro no biológico o por conversión de: (a) una o varias moléculas polinucleotídicas que están preintegradas en el ADN nuclear o que se mantienen de manera autónoma en el núcleo, para formar la primera o segunda secuencias heterólogas.

12. El procedimiento como se describe en la reivindicación 11, que comprende una transformación estable e integración estable de la primera o segunda secuencia heterólogas en un cromosoma del organismo multicelular.

13. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 12 , en donde el organismo multicelular es modificado de manera adicional, genética o transitoriamente para proporcionar funciones necesarias para el empalme trans o la expresión del rasgo de interés .

14. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el primer o segundo fragmentos están unidos operablemente a más de una ribozima de empalme trans o a 2 o más ribozimas de empalme trans diferentes .

15. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la primera o la segunda secuencia heterólogas contienen un intrón o una parte del mismo de manera que el producto de ARN de la reacción de empalme trans contiene un intrón capaz de empalme cis .

16. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el rasgo de interés está relacionado con la esterilidad masculina.

17. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el rasgo se selecciona del siguiente grupo: resistencia a herbicida, resistencia a insecticida, marcador seleccionable, contramarcador seleccionable .

18. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la expresión del rasgo de interés depende del procesamiento correcto de la primera o la segunda secuencias heterólogas.

19. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 18, en donde la primera y la segunda secuencias heterólogas en el organismo vegetal o animal multicelular transgénico segregan un loci diferente.

20. El procedimiento como se describe en la reivindicación 19, en donde los loci diferentes se colocan de manera que minimizan la recombinación y creación de un enlace entre los loci.

21. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 20, en donde la primera y segunda secuencias heterólogas en el organismo vegetal o animal multicelular transgénico se localizan en el mismo locus en cromosomas alélicos.

22. El procedimiento como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 21, en donde la reacción de empalme trans y la traducción del producto de la reacción de empalme trans genera una proteína que tiene un polipéptido unido al mismo mediante reacción de empalme trans, por lo que el polipéptido se selecciona del siguiente grupo: señalización. direccionamiento y polipéptido de transducción de membrana; una etiqueta de reconocimiento y de purificación.

23. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 22, en donde el organismo multicelular transgénico es capaz de producir progenie .

24. El procedimiento como de una de las reivindicaciones 1 a 23, en donde el primer organismo multicelular se vuelve homocigoto con respecto a la primera secuencia de ADN heteróloga y el segundo organismo multicelular se vuelve homocigoto con respecto a la segunda secuencia de ADN heteróloga.

25. El procedimiento de una de las reivindicaciones 1 a 23, en donde el procedimiento se utiliza para producir semillas híbridas de una planta multicelular transgénica.

26. Un organismo vegetal o animal multicelular transgénico que expresa un rasgo de interés, el organismo tiene una distribución controlada del rasgo a la progenie, en donde la expresión del rasgo involucra la producción de una molécula de ARN por empalme trans de fragmentos de ARN, por lo que los fragmentos de ARN se localizan sobre cromosomas alélicos .

27. Un procedimiento para producir un organismo vegetal o animal multicelular transgénico que exprese un rasgo de interés y que tenga una distribución controlada a la progenie y expresión del rasgo, el procedimiento comprende: el suministro de un organismo multicelular o una célula del mismo que tenga una primera secuencia de ADN heteróloga que comprende un primer fragmento o una secuencia que codifique para el rasgo de interés; y la introducción de una segunda secuencia de ADN (o ARN) heteróloga que comprende un segundo fragmento de la secuencia que codifica para el rasgo de interés, dentro de una célula del organismo multicelular, por lo que la primera y segunda secuencias heterologas se diseñan de manera que la expresión del rasgo de interés surge debido al empalme trans de ARN después de que la célula ha sido conmutada por la introducción.

28. El procedimiento de la reivindicación 27, en donde el organismo multicelular o una' célula del mismo que tiene la primera secuencia de ADN heteróloga se produce al introducir la primera secuencia de ADN heteróloga dentro de un organismo multicelular o una célula del mismo.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en donde la primera secuencia de ADN heteróloga y la segunda secuencia de ADN (o ARN) heteróloga se introducen en el organismo multicelular en un procedimiento de una etapa o de dos etapas .