MXPA04007213A - Terapia de bloqueo de la aldosterona para prevenir o tratar trastornos relacionados con la inflamacion. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para prevenir o tratar un trastorno relacionado con la inflamacion tal como miocarditis, cardiomiopatia, vasculitis y enfermedad de Behcet en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento tratar al sujeto con una cantidad terapeuticamente eficaz de un bloqueador de aldosterona suficiente para alterar la expresion de uno o mas productos de expresion implicados, directa o indirectamente, en la regulacion de la inflamacion o en la remodelacion cardiaca en el sujeto.

Description

JERAPÍA^^LOCí IEO^E ,A^L^S E^QNA^PA A P g €Nít TRATAR TRASTORNOS RELACIONADOS CON LA INFLAMACION CAMPO DE LA INVENCION Esta invención está en el campo de la prevención o tratamiento de trastornos relacionados con la inflamación y más particularmente trastornos cardiovasculares relacionados con la inflamación. Más específicamente, esta invención se refiere al uso de una terapia de bloqueo de la aldosterona en la prevención o tratamiento de enfermedades cardiovasculares incluyendo aterosclerosis. ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las prostaglandinas juegan un papel importante en el proceso inflamatorio y la inhibición de la producción de prostaglandina, especialmente la producción de PGG2l PGH2 y PGE2, ha sido un objetivo habitual en el descubrimiento de fármacos antiinflamatorios. Sin embargo, los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) comunes que son activos en la reducción del dolor inducido por la prostaglandina e hinchazón asociada con el proceso de inflamación también son activos afectando otros procesos regulados por la prostaglandina no asociados con el proceso de inflamación. De esta forma, el uso de altas dosis de los AINE más comunes puede producir graves efectos-secundarios, incluyendo-úlceras potencialmente mortales, que imitan-su poiejtóa erapéuticcs-Una altemativa^ Qs-A4NE~es-el-t.so de corticoestereide-, que también producen graves efectos secundarios, especialmente cuando está implicada una terapia a largo plazo. Se ha descubierto que los AINE evitan la producción de prostaglandinas inhibiendo enzimas en la ruta humana ácido araquidónico/prostaglandina, incluyendo la enzima ciclooxigenasa (COX). El reciente descubrimiento de una enzima inducible asociada con la inflamación (denominada "ciclooxigenasa-2 (COX-2)" o "prostaglandina G/H sintasa II") proporciona un objetivo viable de inhibición que reduce más eficazmente la inflamación y produce menos efectos secundarios y menos notorios. Últimamente se entiende mejor el papel de la inflamación en enfermedades cardiovasculares. Ridker y col. (New Engl. J. Med. , 336, 973-9 (1997)) describe un posible papel de la inflamación en enfermedades cardiovasculares. J. Boyle (J. Path., 181 , 93-9 (1997)) describe la asociación de la ruptura de placas e inflamación aterosclerótica. En las patentes de Estados Unidos 5,380,738, 5,344,991 , 5,393,790, 5,434,178, 5,474,995, 5,510,368 y en los documentos WO WO96/06840, WO96/03388, WO96/03387, WO96/ 9469, WO96/25405, WO95/15316, WO94/15932, WO94/27980, WO95/00501 , WO94/13635, WO94/20480 y WO94/26731 se han descrito compuestos que inhiben de forma selectiva la ciclooxigenasa-2. Las [pirazol-1-il]bencenosulfonamidas se han descrito como ir4tHbktores-de-GÍGloaxigenasa-2~ y— son-premetedoras en-el-tf atemiento-de-la pre-clínicos y clínicos. Su uso para tratar la inflamación en enfermedades vasculares se ha descrito en la patente de Estados Unidos 5,466,823.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1-A muestra patrones de difracción en polvo de rayos-X de epierenona en forma H. La figura 1-B muestra patrones de difracción en polvo de rayos-X de epierenona en forma L. La figura 1-C muestra patrones de difracción en polvo de rayos-X del solvato de metiletilcetona de epierenona. La figura 2-A muestra un termograma por calorimetría de barrido diferencial (CBD) de forma L no triturada cristalizada directamente con metiletilcetona. La figura 2-B muestra un termograma por calorimetría de barrido diferencial (CBD) de forma L preparada por desolvatación de un solvato obtenido por cristalización de epierenona de alta pureza a partir de metiletilcetona. La figura 2-C muestra un termograma por calorimetría de barrido diferencial (CBD) de forma L preparada cristalizando un solvato de una solución de epierenona de alta pureza en metiletilcetona, desolvatando el solvato para raducWa-fcir«a4--y ^ diferencial (CBD) de forma H no triturada preparada por desolvatación de un solvato obtenido por digestión de epierenona de baja pureza con disolventes apropiados. La figura 2-E muestra un termograma por CBD para el solvato de metiletilcetona. La figura 3-A muestra el espectro de infrarrojos (reflectancia difusa, DRIFTS) de epierenona de forma H. La figura 3-B muestra el espectro de infrarrojos (reflectancia difusa, DRIFTS) de epierenona de forma L. La figura 3-C muestra el espectro de infrarrojos (reflectancia difusa, DRIFTS) de! solvato de metiletilcetona de epierenona. La figura 3-D muestra el espectro de infrarrojos (reflectancia difusa, DRIFTS) de epierenona en solución de cloroformo. La figura 4 muestra el espectro 13C RMN para la forma H de epierenona. La figura 5 muestra el espectro 13C RMN para la forma L de epierenona. La figura 6-A muestra el análisis de termogravimetría para el solvato de metiletilcetona. La figura 7 muestra un patrón de difracción en polvo de rayos X de una forma cristalina de 7-metil hidrogeno 4",5":9",11"-diepox¡-17-hidroxi-3-oxo-1-7-'-pregrano-7^2+-d¡ear ^ dernetiletilcetona La figura 8 mucotra un patrón de-dt raeción en polvo de rayos X de la forma cristalina de 7-metil hidrogeno 11 ",12"-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17"-pregn-4-eno-7",21-dicarboxilato, (-lactona aislada de isopropanol. La figura 9 muestra un patrón de difracción en polvo de rayos X de la forma cristalina de 7-metil hidrogeno 17-hidroxi-3-oxo-17"-pregna-4,9(11 )-dieno-7",21-dicarboxilato, (-lactona aislada de n-butanol. La figura 10 muestra los patrones de difracción en polvo de rayos X de la torta húmeda de (solvato de metiletilcetona) obtenida a partir de cristalizaciones con metiletilcetona dopadas con diepóxido al (a) 0%, (b) 1 %, (c) 3% y (d) 5%. La figura 11 muestra los patrones de difracción en polvo de rayos X de los sólidos secos obtenidos a partir de cristalizaciones con metiletilcetona dopadas con diepóxido al (a) 0%, (b) 1 %, (c) 3% y (d) 5%. La figura 12 muestra los patrones de difracción en polvo de rayos X de los sólidos secos obtenidos a partir de la cristalización con metiletilcetona con dopaje al 3% de diepóxido (a) sin trituración del solvato antes del secado, y (b) triturando el solvato antes del secado. La figura 13 muestra los patrones de difracción en polvo de rayos X de la torta húmeda (solvato de metiletilcetona) obtenido de cristalizaciones con metiletilcetona dopadas con 11 ,12-epóxido al (a) 0%, (b) 1 %, (c) 5% y (d) 10%. La figura 14 muestra los patrones de difracción en polvo de rayos X de los sólidos secos obtenidos a partir de cristalizaciones con metiletilcetona te adas^i^7 2-e ó iela-a (a^ pureza del material de partida, velocidad de refrigeración y temperatura final basado en los datos presentado en el cuadro X-7A. La figura 16 muestra un gráfico semi normal preparado usando el gráfico cúbico de la figura 18 para determinar las variables que tienen un efecto estadístico significativo en la pureza del material final. La figura 17 es un gráfico de interacción basado en los resultados de el cuadro X-7A que muestra la interacción entre la pureza del material de partida y la velocidad de refrigeración en la pureza del material final. La figura 18 muestra un gráfico cúbico de una fracción en peso de forma H, pureza de material de partida, velocidad de refrigeración y temperatura final basado en los datos del cuadro X-7A. La figura 19 muestra un gráfico semi normal preparado usando el gráfico cúbico de la figura 21 para determinar las variables que tienen un efecto estadístico significativo en la pureza del material final. La figura 20 es un gráfico de interacción basado en los resultados presentados en el cuadro X-7A que muestra la interacción entre la pureza del material de partida y la temperatura final en la pureza del material final. La figura 21 muestra un patrón de difracción de rayos X de eplerenona amorfa. La figura 22 muestra un termograma por CBD de eplerenona amorfa. La-figura 23~muestFa cambios~er a-presión sanguínea-sistólica-eñ- un estudio con ratas infundidas con ongiotcnsifte-H La figura 24 muestra la prevención mediante eplerenona (epoximexrenona) de inflamación vascular en el corazón de ratas infundidas con angiotensina II. La figura 25 muestra la falta de expresión de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en el corazón de una rata infundida con vehículo. La figura 26 muestra la inducción de la expresión de COX-2 en el corazón de una rata infundida con Ang II La figura 27 muestra la prevención mediante eplerenona de la inducción de la expresión de COX-2 en el corazón de una rata infundida con Ang II. La figura 28 muestra la falta de expresión de osteopontina en el corazón de una rata infundida con vehículo. La figura 29 muestra la prevención mediante eplerenona de la inducción de la expresión de osteopontina en el corazón de ratas infundida con aldosterona. La figura 30 muestra la prevención mediante eplerenona de la regulación al alza de osteopontina en el miocardio de ratas infundidas con aldosterona. La figura 31 muestra la prevención mediante eplerenona de la regulación al alza de COX-2 en el miocardio de ratas infundidas con aldosterona. La-fi§^ra-32-fflttesír^a^re en^ n-de miocardio en ratas infundidas-con-atéo * La figura 33 muestra la co-expresión regulada al alza de COX-2 y osteopontina en el medio de la arteria coronaria de ratas infundidas con aldosterona. La figura 34 muestra algunos de los mecanismos para inflamación y lesión vascular inducida con aldosterona. La figura 35 muestra la inhibición de una mayor excreción proteica urinaria mediante tratamiento con eplerenona en ratas espontáneamente hipertensas tratadas con captopril infundidas con angiotensina II propensas a apoplejías. La figura 36 muestra la reducción en las evaluaciones histopatológicas de lesión renal con tratamiento de eplerenona en ratas espontáneamente hipertensas tratadas con captopril infundidas con angiotensina II propensas a apoplejías. La figura 37 muestra una mayor supervivencia y menor lesión cerebral con tratamiento de eplerenona en ratas espontáneamente hipertensas propensas a apoplejías. La figura 38 muestra una reducción en la lesión cerebral con tratamiento de eplerenona en ratas espontáneamente hipertensas propensas a apoplejías. La figura 39 muestra la inhibición de una expresión temprana de COX-2 miocárdica en ratas hipertensas infundidas con aldosterona tratadas con L5 ig^ra^0^u^stfa-J rWbÍGÍóF- de-ufia-expresión temprana de osteopontina miocárdica en ratas hipertensas infundidas con aldosterona tratadas con eplerenona. La figura 41 muestra la inhibición de una expresión temprana de MCP-1 miocárdica en ratas hipertensas infundidas con aldosterona tratadas con eplerenona. La figura 42 muestra la inhibición de una expresión temprana de ICAM-1 y VCAM- miocárdicas en ratas hipertensas infundidas con aldosterona tratadas con eplerenona. La figura 43 muestra el aumento de presión sanguínea sistólica con la infusión de aldosterona y la reducción de este aumento con la infusión de aldosterona y el tratamiento con eplerenona. La figura 44 muestra las evaluaciones de histopatología miocárdica a los 28 días para ratas de control, para ratas infundidas con aldosterona y para ratas infundidas con aldosterona y tratadas con eplerenona y la relación entre el peso cardíaco y el peso corporal para ratas infundidas con aldosterona y para ratas infundidas con aldosterona y tratadas con eplerenona. La figura 45 muestra los niveles de osteopontina circulante el día 28 para ratas de control, ratas infundidas con aldosterona y para ratas infundidas con aldosterona y tratadas con eplerenona. La figura 46 muestra la expresión relativa de ARNm a los 28 días para citoquinas inflamatorias en ratas de control, en ratas infundidas con aldosterona-y-en-Fatas-infundidas con-aldostefoña-y-tratadas con eplerenona: BESGR+P€4QN-BETAÍtrAB; La presente invención se refiere al uso de un bloqueador de aldosterona para la prevención o tratamiento de trastornos relacionados con la inflamación. Más específicamente, esta invención se refiere al uso de un bloqueador de aldosterona para prevenir enfermedades cardiovaculares relacionadas con la inflamación. La presente invención proporciona un procedimiento para prevenir o tratar trastornos cardiovasculares en un sujeto en necesidad del mismo. El procedimiento comprende tratar al sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un bloqueador de aldosterona o derivado o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El procedimiento anterior será útil, pero sin limitación, para prevenir o tratar trastornos relacionados con la inflamación en un sujeto, incluyendo, pero sin limitación, trastornos del corazón, renales y cerebrales relacionados con la inflamación y particularmente trastornos relacionados con inflamación vascular. El procedimiento será útil para la prevención o tratamiento de enfermedad de las arterias coronarias, aneurisma, arteriesclerosis, aterosclerosis incluyendo aterosclerosis de transplante cardíaco, infarto de miocardio, embolia, apoplejía, miocarditis, cardiomiopatía, trombosis, incluyendo trombosis venosa, angina incluyendo angina inestable, calcificación (tal como calcificación vascular y calcificación valvar), enfermedad e inflamación de Kawasaki (tal como inflamaeión^eHas— placas— coronarte^ por bacterias incluyendo inflamación inducida por C tamydia, inflamación inducida— or parásitos e inflamación inducida por virus). El procedimiento es útil para tratar o prevenir afecciones alterando la expresión de uno o más productos de expresión que regulan directa o indirectamente la inflamación. Los trastornos cardiovasculares relacionados con la inflamación pueden estar mediados, completamente o en parte, por uno o más productos de expresión que pueden sufrir una mayor o menor expresión. Dichos productos de expresión pueden incluir, pero sin limitación, moléculas orgánicas, proteínas, moléculas basadas en ADN o ARN y redes o agregados de tales productos, actuando conjuntamente o por separado, para producir directa o indirectamente un efecto. Pueden producirse secuencial o simultáneamente cambios en los patrones de expresión de dichos productos de expresión, implicando dos o más productos de expresión. Estos productos de expresión pueden tener efectos directos o indirectos en los tejidos u órganos del sujeto, induciendo o amplificando un efecto patológico inducido por otras moléculas o productos de expresión. Estos productos de expresión pueden producir efectos pro-inflamatorios mediante un aumento o disminución de la expresión, dependiendo de su función como productos de expresión pro-inflamatorios o antiinflamatorios, respectivamente. El procedimiento es particularmente útil para tratar o prevenir afecciones moderando la regulación al alza de los componentes pro- inflamatorios que se encuentran en los tejidos afectados, incluyendo ciclooxigenasa-2 y osteopontina. H°fdtíyei^pero^Tr^ttrnitación, Hos^traslornos qoe se sabe que ???? tp?t componente inflamatorio y los que pueden estar mediados por aldosterona. El procedimiento anterior también incluye el tratamiento de pacientes con un bloqueador de aldosterona que requiere la moderación de la expresión regulada al alza de la ciclooxigenasa-2 u osteopontina. La isoforma de ciclooxigenasa-2 puede inducirse en tejidos incluyendo, pero sin limitación, riñon, corazón, páncreas y cerebro, dando como resultado la expresión regulada al alza de esta enzima pro-inflamatoria, que puede causar daño tisular u orgánico de leve a grave. En el procedimiento anterior, la administración de un bloqueador de aldosterona se usa para moderar la expresión regulada al alza de la ciclooxigenasa-2. En otra modalidad, el procedimiento de la expresión de citoquina se modera mediante la inhibición o bloqueo de un factor nuclear implicado en la transcripción de las citoquinas pro-inflamatorias, tales como inhibición o bloqueo de NF-kappaB. El procedimiento anterior también es útil para prevenir o tratar afecciones que pueden surgir en tejidos incluyendo, pero sin limitación, riñon, corazón y cerebro, en los que puede inducirse una expresión regulada al alza de la proteína pro-inflamatoria osteopontina, dando lugar a un daño tisular y de órgano de leve a grave. En el procedimiento anterior, la administración de un bloqueador de la aldosterona se usa para moderar la expresión regulada al alza de la osteopontina. En otra modalidad, la presente invención es útil para prevenir o tratar afecciones en tejidos y órganos incluyendo, pero sin limitación, riñon, corazón cerebTO7donde"prjede producírse a~expresión"TegTj1ada al alza de uno euate^ef^e½s 3fedti€íes-^e^ 8, VCAM-1 e ICAM-1 , dando lugar a un daño tisular u orgánico de leve a grave. En el procedimiento anterior la administración de un bloqueador de la aldosterona se usa para moderar la expresión regulada al alza de uno cualquiera de MCP-1 , IL-1 , IL-6, VCAM-1 e ICAM-1. En la figura 34 se muestran ejemplos no limitantes de productos de expresión, cuya expresión puede moderarse para reducir enfermedades cardiovasculares relacionadas con la inflamación mediante tratamiento con un bloqueador de aldosterona e incluyen la regulación al alza de uno o más de los siguientes: (a) receptores para la angiotensina II y endotelina; (b) moléculas de activación de monocitos tales como avp3 (adhesión, proliferación, migración) y CD44 (migración); (c) mediadores de la inflamación vascular tal como interferón-? (Inf-?), interleuquina-1 (IL-1 ), factor a de necrosis tumoral (TNF-a), interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-8 (IL-8) y fractalquina; (d) NADH/NADPH oxidasa para producir radicales superóxido que dañan el tejido; y (e) ¡nhibidor-1 activador de plasminógeno protrombótico (PAI-1 ) que causa una reducción del activador de plasminógenos de tejido activo (t-PA). En otra modalidad de la invención, los ejemplos no limitantes de productos de expresión cuya expresión puede moderarse para reducir enfermedades cardiovasculares relacionadas con la inflamación mediante tfa amtente^3fi-w^teqtieadQf— de- aldos^ef&na- doyeri-ono o más deHos-siguientes: reactivos de fase aguda tales como proteína C-react¡va (CRP), citoquinas pleiotrópicas tales como interleuquina-6 (IL-6), IL-12, molécula-1 de adhesión intracelular soluble (slCAM-1 ), troponina T o I, proteína de choque térmico 65 (HSP65), amiloide, fosfolipasa A2, fibrinógeno, ruta de señalización CD40/CD40L y mediadores de la adhesión tales como integrinas de unión al colágeno a1 ß1 (células mesenquimales) y a2pi (células epiteliales).

Dosificaciones y régimen de tratamiento La cantidad de bloqueador de aldosterona que se administra y el régimen de dosificación para los procedimientos de esta invención dependen de diversos factores incluyendo la edad, el peso, el sexo y el estado médico del sujeto, la gravedad del efecto patogénico, la vía y frecuencia de administración y el bloqueador de aldosterona empleado en particular y por tanto puede variar ampliamente. Puede ser apropiada una dosis administrada diariamente a un sujeto de aproximadamente 0.001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferiblemente entre aproximadamente 0.005 y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aún más preferiblemente entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente ^ O^mg/kg de- p¾"SO~ corpora rmas preferiblemente- entre reximadamente 0.01 y-5-mg kg-de peso corporal. La eafítideé-do antagonista de aldosterona que se administra a un sujeto humano estará típicamente en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 2,000 mg. En una modalidad de la presente invención, el intervalo de dosificación es de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 500 mg. En otra modalidad de la presente invención, el intervalo de dosificación es de aproximadamente 0.75 a aproximadamente 250 mg. En otra modalidad de la presente invención, el intervalo de dosificación es de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 mg. En otra modalidad de la presente invención, el intervalo de dosificación es de aproximadamente 10 a 100 mg. En otra modalidad de la presente invención, el intervalo de dosificación es de aproximadamente 25 a aproximadamente 100 mg. En otra modalidad de la presente invención, el intervalo de dosificación es de aproximadamente 25 a aproximadamente 75 mg. En el presente procedimiento se abarca una dosis diaria de bloqueador de aldosterona que no produce un efecto diurético y/o anti-hipertensivo sustancial en un sujeto. La dosis diaria que puede administrarse de una a cuatro dosis por día. La dosificación del bloqueador de aldosterona puede determinarse y ajustarse en función de la medida de la presión sanguínea o marcadores alternativos apropiados (tales como péptidos natriuréticos, endotelinas y otros marcadores alternativos que se analizan más adelante). La presión sanguínea y/o niveles de marcadores alternativos después de la administración del bloqueador de aldosterona pueden compararse frente a los niveles básales correspondientes antes-de la administración~del-bloqueador-de-aldosterona-para necesario. Los ejemplos no limitantes de marcadores alternativos útiles en el procedimiento son marcadores alternativos para enfermedades renales y cardiovasculares.

Dosificación Profiláctica Es beneficioso administrar el bloqueador de aldosterona profilácticamente, antes de un diagnóstico de dichos trastornos cardiovasculares relacionados con la inflamación, y continuar con la administración del bloqueador de la aldosterona durante el periodo de tiempo en que el sujeto es susceptible a trastornos cardiovasculares relacionados con la inflamación. A los susceptibles a efectos patológicos se les puede asignar una dosis profiláctica de un compuesto bloqueador de aldosterona. Tales dosis profilácticas del bloqueador de aldosterona pueden ser, aunque no necesariamente, inferiores a las dosis usadas para tratar el efecto patogénico específico de interés.

Dosificación para patologías cardiovasculares La dosificación para tratar patologías de la función cardiovascular puede determinarse y ajustarse en función de la medición de concentraciones en sangre de péptidos natriuréticos. Los péptidos natriuréticos son un grupo de péptidos estructuralmente similares pero genéticamente distintos que tienen diversas ^acctones-en la^omeostasts cardiovascular— renal y-endocrrnar EL péptido natriurético auricular ("ANP") y el péptido natftwéttee-eefebfal ("BNP") son de origen celular miocárdico y el péptido natriurético tipo C ("CNP") es de origen endotelial. ANP y BNP se unen al receptor A del péptido natriurético ("NPR-A") que, mediante el monofosfato de 3',5'-guanosina cíclico (GMPc) media la natriuresis, vasodilatación, inhibición de renina, antimitogénesis y propiedades lusitrópicas. Los altos niveles de péptidos natriuréticos en sangre, particularmente niveles de BNP en sangre, se observan generalmente en sujetos en condiciones de expansión del volumen en sangre y después de una lesión vascular tal como un infarto de miocardio agudo y permanecen altos durante un largo período de tiempo después del infarto (Uusimaa y col: Int. J. Cardiol. 1999; 69:5-14). Ino rorli irrinn í ol ó tiH * notríi irA+ir* . ra1 r*¡An I n iw l basal medido antes de la administración del bloqueador de aldosterona indica una disminución del efecto patológico de la aldosterona y por lo tanto proporciona una correlación con la inhibición del efecto patológico. Los niveles en sangre del nivel deseado de péptido natriurético pueden compararse frente al nivel basal correspondiente antes de la administración de bloqueador de aldosterona para determinar la eficacia del presente procedimiento en el tratamiento del efecto patológico. En función de tales mediciones del nivel de péptido natriurético, puede ajustarse la dosificación del bloqueador de aldosterona para reducir el efecto cardiovascular patológico. Asimismo, también pueden identificarse patologías cardiacas y determiiwseHe^osffieaeión^prepiada^ urinarios de GMPc. Un aumento del nivel en plasma de GMPc es comparable a una reducción en la presión arterial media. El aumento de la excreción urinaria de GMPc se correlaciona con la natriuresis. También pueden identificarse patologías cardíacas mediante una reducción de la fracción de eyección o la presencia de infarto de miocardio o insuficiencia cardiaca o hipertrofia ventncular izquierda. La hipertrofia ventricular izquierda puede identificarse mediante un ecocardiograma o imágenes de resonancia magnética y puede usarse para controlar el progreso del tratamiento y lo apropiado del tratamiento. Por lo tanto, en otra modalidad de la invención, los procedimientos de la presente invención pueden usarse para reducir los niveles de péptidos natri uréticos , particularmente niveles de BNP, tratando por tanto también patologías cardiovasculares relacionadas.

Dosificación para patologías renales La dosificación para tratar patologías de la función renal puede determinarse y ajustarse en función de la medición de proteinuria, microalbuminuria, disminución de la velocidad de filtración glomerular (GFR) o disminución de la depuración de creatinina. La proteinuria se identifica por la presencia de más de 0.3 g de proteína urinaria en un período de recogida de la orina de 24 horas. La microalbuminuria se identifica por un aumento de la albúmina urinaria ¡nmunoensayable. En función de tales mediciones, puede ajustaree- a-dosifiGaGór4^e^bl©q patoJogico-reflal Dosificación para neuropatías La neuropatía, especialmente neuropatía periférica, puede identificarse y ajustarse la dosificación mediante un examen neurológico de déficits sensoriales o capacidad motora sensorial.

Dosificación para patologías de retinopatía La retinopatía puede identificarse y ajustarse la dosificación mediante un examen oftalmológico.

Marcadores de la inflamación Ciertos marcadores pueden ser indicativos de o responsables de estados de inflamación o pre-inflamación. La medición de estos marcadores pueden ser útil en la determinación de una dosificación apropiada del bloqueador de aldosterona a administrar o en la determinación de una dosis eficaz de un bloqueador de aldosterona después de la administración. Son ejemplos no limitantes de tales marcadores: osteopontina; reactivos de fase aguda tales como proteína C reactiva (CRP), fibrinógeno, Factor VIII, cobre en suero (proteína vehículo ceruloplasmina), hierro en suero (proteína vehículo ferritina), inhibidor 1 activador de plasminógenos (PAI-1 ) y lipoproteína (a); péptidos natriuréticos; endotelinas; VCAM-1 , ICAM-1 ; IL-1 p; TNF- , IL-6; IL-8, 60X=2; fractalquinarMCP-1 y trigtrcérido — Terapias-de combinación Los procedimientos de la presente invención pueden comprender adicionalmente la administración de otros ingredientes activos o terapias en combinación con la administración del bloqueador de aldosterona. Por ejemplo, el bloqueador de aldosterona empleado en los presentes procedimientos puede administrarse a un sujeto en combinación con otros fármacos activos usados en el tratamiento de la hipertensión y afecciones y trastornos cardiovasculares y renales. Los fármacos activos administrados con el bloqueador de aldosterona pueden incluir, por ejemplo, los fármacos seleccionados entre el grupo compuesto por inhibidores de renina, antagonistas de la angiotensina II, inhibidores ACE, diuréticos que no tienen efecto sustancial de bloqueo de la aldosterona y ácido retinoico. La fase "terapia combinada" (o "co-terapia"), cuando se usa con respecto a combinaciones de fármacos, pretende abarcar la administración de cada agente de una forma secuencial en un régimen que proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de fármacos y también pretende abarcar la co-administración de estos agentes de una forma sustancialmente simultánea, tal como en una única cápsula o inyección que tiene una relación fija de estos agentes activos o en múltiples cápsulas o inyecciones separadas para cada agente. La frase "antagonista de la angiotensina II" incluye, por ejemplo, los antagonistas de la angiotensina II descritos en el documento WO96/40257. La frase "inhibidor de la enzima de conversión de la angiotensina (- inhibidor-AGE^-incluye-un-agente o compuesto, o una combinación de dos-o- más agentes o compuestos que puedeñ-Bleqoea r-paretal o completemeftte74a-conversión enzimática de la forma decapéptido de la angiotensina ("angiotensina I") en la forma octapéptido vasoconstrictora de la angiotensina ("angiotensina II"). El bloqueo de la formación de la angiotensina II puede afectar a la regulación del equilibrio de líquidos y electrolitos, a la presión sanguínea y al volumen de sangre mediante la eliminación de acciones primarias de angiotensina II. En estas acciones primarias de angiotensina II se incluyen la estimulación de la síntesis y secreción del receptor de aldosterona por la corteza adrenal y el aumento de la presión sanguínea por constricción directa de los músculos lisos de las arteriolas. Los ejemplos de inhibidores ACE que pueden usarse en terapia combinada incluyen, pero sin limitación, los siguientes compuestos: AB-103, ancovenina, benzaprilat, BRL-36378, BW-A575C, CGS-13928C, CL-242817, CV-5975, Equaten, EU-4865, EU-4867, EU-5476, foroximitina, FPL 66564, FR-900456, Hoe-065, I5B2, indolapril.cetometilureas, KRI-1 177, KRI-1230, L-681 176, libenzapril, MCD, MDL-27088, MDL-27467A, moveltipril, MS-41 , nicotínamina, pentopril, fenaceína, pivopril, rentiapril, RG-5975, RG-6134, RG-6027, RGH-0399, ROO-9 , RS- 0085-197, RS-2039, RS 5139, RS 86127, RU-44403, S-8308, SA-291 , spiraprilat, SQ-26900, SQ-28084, SQ-28370, SQ-28940, SQ-31440, Synecor, utibapril, WF-10129, Wy-44221 , Wy-44655, Y-23785, Yissum P-0154, zabicípril, Asahi Brewery AB-47, alatriopril, BMS 182657, Asahi Chemical C-111 , Asahi Chemical C-112, Dainippon DU-1777, mixanpril, Prentylrzofenoprilatráeido 1-(--f^earboxi»6^4^iperieHn^ o€ta^ldro-1 H-ir^l-2^arboxílic9r^ÍG Qjee^P T 7, Chiesi CHF 1514, Fisons-FPL-66564, ¡drapril, Marión Merrell Dow MDL-100240, perindoprilat y Servier S-5590, alacepril, benazepril, captopril, cilazapril, delapril, enalapril, enalaprilat, fosinophl, fosinoprilat, imidapril, lisinopril, perindopril, quinapril, ramipril, acetato de saralasina, tempocapril, trandolapril, ceranapril, meoxipril, quinaprilat y spirapril. Un grupo de inhibidores ACE de interés particular consiste en alacepril, benazepril, captopril, cilazapril, delapril, enalapril, enalaprilat, fosinophl, fosinoprilat, imidapril, lisinopril, perindopril, quinapril, ramipril, acetato de saralasina, temocapril, trandolarpil, ceranapril, moexipril, quinaprilat y spirapril. Muchos de estos inhibidores ACE están disponibles en el mercado. Por ejemplo, un inhibidor ACE muy preferido, captopri!, se vende en E.R. Squibb & Sons, ln., Princeton, N.J., ahora parte de Bristol-Meyers-Squibb, con el nombre comercial "CAPOTEN" y en forma de dosificación en comprimido a dosis de 12.5 mg, 50 mg y 200 mg por comprimido. Enalapril o maleato de enalapril y lisinopril son dos inhibidores ACE muy preferidos vendidos en Merck y CO., West Point, Pa. Enalapril se vende con el nombre comercial "VASOTEC" en forma de dosificación en comprimidos en dosis de 2.5 mg, 5 mg, 10 mg y 20 mg por comprimido. Lisinopril se vende con el nombre comercial "PRINIVIL" en forma de dosificación en comprimidos en dosis de 5 mg, 10 mg, 20 mg y 40 mg por comprimido. El diurético puede seleccionarse entre varias clases conocidas, tales-eemo tiazidas-y sulfenamidas relacionadas, diuréticos ahorradores de etasiOr^ttiféíieos-o^l-asa-yH^u^ limitantes de tiazidas bendroflumetiazida, benztiazida, clorotiazida, ciclotiazida, clorhidrotiazida, hidroflumetiazida, metilclotiazida, politiazida y triclormetiazida. Son ejemplos no limitantes de sulfonamidas relacionadas con tiazidas clortalidona, quinetazona y metolazona. Son ejemplos no limitantes de diuréticos ahorradores de potasio triametereno y amilorida. Son ejemplos no limitantes de diuréticos del asa, es decir, diuréticos que actúan en el miembro ascendente del asa de Henle del riñon, furosemida y ácido etinacrílico. Son ejemplos no limitantes de diuréticos orgánicos de mercurio mercaptomerina sódica, meretoxilina, procaína y mersalilo con teofilina. En una modalidad, la terapia combinada comprende administrar a un sujeto humano un inhibidor ACE, un compuesto epoxi-esteroideo que es un antagonista del receptor de aldosterona y un diurético del asa que no tienen una actividad antagonística sustancial sobre la aldosterona. Tal terapia combinada sería útil, por ejemplo, para prevenir o tratar trastornos cardiovasculares relacionados con la inflamación en un mamífero. También puede usarse un agente diurético sin actividad antagonista sustancial de aldosterona junto con un inhibidor ACE y el compuesto epoxi-esteroideo. Como alternativa, la terapia combinada puede comprender administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor ACE, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto epoxi-esteroideo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un diurético del asa sin actividad antagonista-sustancial de^aldosterona y-una cantidad-terapéutieamerite-eftcaz de- digoxina a un-sujeto-humano para tratar o proveflir-trastornos cardiovasculares-relacionados con la inflamación. Los inhibidores de la ruta ciclooxigenasa en el metabolismo del ácido araquidónico usados en la prevención del trastorno cardiovascular pueden inhibir la actividad de la enzima mediante diversos mecanismos. A modo de ejemplo, los inhibidores usados en los procedimientos descritos en este documento pueden inhibir la expresión de la actividad enzimática. El bloqueo de la expresión de la ciclooxigenasa-2 en el lugar de la lesión inflamatoria usando un bloqueador de aldosterona, es muy ventajoso ya que minimiza los efectos gástricos secundarios que pueden producirse con AINE no selectivos, especialmente cuando se espera un tratamiento profiláctico largo. Los antagonistas de! receptor de aldosterona usados en los procedimientos de la presente invención son generalmente compuestos esteroideos de tipo espirolactona. La expresión "de tipo espirolactona" pretende caracterizar una estructura que comprende un resto lactona unido a un núcleo esteroide, típicamente en el anillo del esferoide "D", mediante una configuración de enlace espiro. Una subclase de compuestos antagonistas de aldosterona de tipo espirolactona consiste en compuestos antagonistas de aldosterona epoxi-esteroideos tales como eplerenona. Otra subclase de compuestos antagonistas de aldosterona de tipo espirolactona consiste en compuestos antagonistas de aldosterona no epoxi-esteroideos tales como la espironolactona. Los compuestos antagonistas de aldosterona epoxi-esteroideos usados en-el-procedimiento-deHa-presente-invención generatmente tienen-urr núctee-estefeide sustttu ido con un-reste-ée-tipe-epoxi. La expresiéfl-Fe-sto-^de- pQ- epoxi" pretende abarcar cualquier resto caracterizado por tener un átomo de oxígeno como puente entre dos átomos de carbono, ejemplos de los cuales incluyen los siguientes restos: _ epo?xietilo 1 ,2-e Apoxip_ropiloCHJ_ El término "esteroideo", como se usa en la frase "epoxi-esteroideo" denota un núcleo proporcionado mediante un resto ciclopenteno-fenantreno que tiene los anillos, "A", "B", "C" y "D" convencionales. El resto de tipo epoxi puede unirse al núcleo ciclopentenofenantreno en cualquier posición acoplable o sustituible, es decir, condensado con uno de los anillos del núcleo esteroideo o el resto puede sustituirse en un anillo miembro del sistema del anillo. La frase "epoxi-esteroideo" pretende abarcar un núcleo esteroideo que tiene uno o una pluralidad de restos tipo epoxi unidos al mismo.

Los antagonistas epoxi-esteroideos de aldosterona adecuados para uso en los presentes procedimientos incluyen una familia de compuestos que tienen un resto epoxi condensado con el anillo "C" del núcleo esteroideo. Se prefieren especialmente compuestos 20-espiroxano caracterizados por la presencia de un resto epoxi 9", 11 "-sustituido. Los compuestos 1 a 1 1 del cuadro 1 que se proporciona más adelante son compuestos epoxi-esteorideos 9", 1 1 "- sustituidos ilustrativos que pueden usarse en los presentes procedimientos. Estos epoxi-esteroides pueden prepararse por procedimientos descritos en Grob col. patente de Estados Unidos N°— ^5§?332. Otros procedimientos adicionales para la preparación de compuestos 9,11-epoxi-esteroideos y sus sales se describen en Ng y col., WO97/21720 y Ng y col., W098/25948.

CUADRO 4 Antagonista del receptor de aldosterona Compuesto N° Estructura y Nombre ácido pregn-4-en-7,21 -d¡carboxílico, 9,1 1-epoxi-17-hidrox¡-3-oxo-, ?-lactona, metí! éster (7a 11a 17BV- ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9,11-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-, dimetil éster, (7a, 11a, 17ß)- El compuesto epierenona es de particular interés (también se conoce como epoximexrenona) que es el compuesto 1 mostrado anteriormente. La epierenona es un antagonista del receptor de aldosterona y tiene una mayor especificidad para receptores de aldosterona que, por ejemplo, espirolactona. La selección de epierenona como antagonista de aldosterona en el presente procedimiento podría ser beneficiosa para reducir ciertos efectos secundarios tales como ginecomastia que tienen lugar con el uso de antagonistas de aldosterona eon-menos especificidad: Lr>s~¾nra oTíTs as en aítfosteTDTranro- e^xi^sTeroideos acrec dos para uso en los presentes procedimientos incluyen una familia de compuestos de tipo espirolactona definidos por la fórmula III: donde — _ / es Cs^O í¾ H SCOR donde R es diquilo inferior de hasta 5 átomos de carbono, y donde ^c15-c½ es Los restos alquilo inferior incluyen grupos ramificados y no ramificados, preferiblemente metilo, etilo y n-propilo. Los siguientes son compuestos específicos de interés con fórmula III: 7a-acetiltio-3-oxo-4, 5-androstadien-[ 7(ß-1 ')-spiro-5']perhidrofuran-2'-ona; 3-oxo-7a-propioniltio-4,15-androstadien-[ 7(p-1 ')-spiro- 5']perhidrofuran-2'-ona; 5']perh¡drofuran-2'-ona; 15a, 16a-metilen-3-oxo-4,7a-propioniltio-4-androsten-[17(ß-1 ')- spiro-5']perhidrofuran-2'-ona; 6ß,7ß,15a, 16a-d¡met¡len-3-oxo-4-androsten-[17(ß-1 ')-spiro- 5']perhídrofuran-2'-ona; 7a-acetiltio-15ß, 16p-metilen-3-oxo-4-androsten-[17(ß-1 ')-spiro- 5']perhidrofuran-2'-ona; 15ß,16ß-met¡len-3-oxo-7ß-propion¡lt¡o-4-apdrosten-[17(ß-1 ')-spiro- 5']perh¡drofuran-2'-ona; y 6ß,7ß, 5ß,16ß-dimetilen-3-oxo-4-androsterl-[ 7(ß-1 spiro- 5']perh¡drofuran-2'-ona. Los procedimientos para fabricar compuestos de fórmula I se describen en la patente de Estados Unidos N° 4.129.564 de Wiechart y col. expedida el 12 de diciembre de 1978. Otra familia de compuestos no epoxi esteroideos de interés se define mediante la fórmula III: en la que R1 es alquilo C1-3 o acilo C -3 y R2 es H o alquilo C1-3. Los siguientes son compuestos específicos de interés de fórmula i - 1a-acetilt¡o-15p,16p-met¡len-7a-metilt¡o-3-oxo-17 -pregn-4-en- 21 ,17-carbolactona; y 15ß,16p-metilen-1 a,7a-dimetiltio-3-oxo-17a-pregn-4-en-21 ,17- carbolactona. Los procedimientos para fabricar los compuestos de fórmula III se describen en la patente de Estados Unidos N° 4.789.668 de Nickisch y col. expedida el 6 de diciembre de 1988. Otra familia de compuestos no epoxi esteroideos de interés se define mediante la fórmula IV: en la que R es alquilo inferior, siendo los grupos alquilo inferior preferidos metilo, etilo, propilo y butilo. Los compuestos específicos de interés incluyen: ácido 3p,21-dihidroxi-17"-pregna-5,15-dien-17-carboxílico (- lactona; ácido 3p,21-dihidroxi-17"-pregna-5,15-dien-17-carboxílico (-lactona 3-acetato; ácido 3p,21-dihidroxi-17"-pregn-5-en-17-carboxílico (-lactona; — ácido ^3|^21-dihtdroxH ''-preg -5-eft-4^-ea½exíli€G- Raciona- -3-acetato; ácido 21-hidroxi-3-oxo-17"-pregn-4-en-17-carboxílico (-lactona; ácido 21-hidroxi-3-oxo-17"-pregna-4,6-dien-17-carboxílico (-lactona; ácido 21-hidroxi-3-oxo-17"-pregna-1 ,4-dien-17-carboxílico (-lactona; ácido 7"-aciltio-21-hidroxi-3-oxo-17"pregn-4-en-17-carboxílico (lactona; y ácido 7"-acetiltio-21-hidroxi-3-oxo-17"-pregn-4-en-17-carboxílico (-lactona. En la patente de Estados Unidos N° 3.257.390 de Patchett expedida el 21 de junio de 1966 se describen procedimientos para fabricar compuesto de fórmula IV. Otra familia de compuestos no epoxi esteroideos de interés se representa mediante la fórmula V: en la que E' se selecciona entre el grupo compuesto por radicales efflero,-v¡ eñó7 (alcani5i inferior)tioetrleno F' se-seleccíorta entre-el-grupo ¡nferior)t¡oprop¡leno; R es un radical metilo excepto cuando E' y E" son radicales etileno y (alcanoil inferior)tioetileno, respectivamente, en cuyo caso R se selecciona entre el grupo compuesto por hidrógeno y radicales metilo; y la selección de E' y E" es tal que al menos está presente un radical (alcanoil inferior)tio. Una familia preferida de compuestos no epoxi esteroideos de fórmula IV se representa por la fórmula VI: Un compuesto más preferido de fórmula VI es lactona 1-acetiltio- 7"-(2-carboxietil)-17 -hidroxi-androst-4-en-3-ona. Otra familia preferida de compuestos no epoxi-esteroideos dentro de la fórmula IV se representa por la fórmula VII: ?- ?3^01?f?€¾??5-G?88- ?^6?€}?5 ?? la fÓFFFHjli siguientes: lactona 7"-acetilt¡o-17"-(2-carboxietil)-17p-hidroxi-androst-4-en-3-ona; lactona 7 -acetiltio-17"-(2-carboxietil)-17 -hidroxi-androst-4-en- 3- ona; lactona 1 ",7"di-acet¡ltio-17"-(2-carboxietil)-17 -hidroxi-androsta-4,6-dien-3-ona; lactona 7"-acetiltio-17"-(2-caGboxietil)-17 -hidroxi-androsta-1 )4-dien-3-ona; lactona 7"-acetiltio-17"-(2-carboxietil)-17p-hidroxi-19-norandrost- 4- en-3-ona; y lactona 7"-acet¡ltio-17"-(2-carboxietil)-17p-hidrox¡-6"-metilandrost-4-en-3-ona. En las fórmulas IV-VI, el término "alquilo" pretende incluir radicales alquilo lineales y ramificados que contienen de uno a aproximadamente ocho carbonos. La expresión "(alcanoil inferior)tio" abarca o alquilo inferior 1 — s radicales de formula El compuesto spironolactona que tiene la siguiente estructura y nombre formal es de particular interés: "spironolactona": acetato de ?-lactona del ácido 17-hidrox¡-7"-mercapto-3-oxo-17"-pregn-4-en-21 -carboxílico. Se describen procedimientos para fabricar compuestos de fórmulas V-VII en la patente de Estados Unidos N° 3.013.012 de Celia y col. que se expidió el 12 de diciembre de 1961 . G.D. Searle & Co., Skokie, Illinois comercializa la spironolactona con el nombre comercial "ALDACTONE" en forma de dosificación en comprimidos de 25 mg, 50 rng y 100 g por comprimido. Otra familia de antagonistas de aldosterona esteroideos contemplada en la presente invención está ilustrada por la drospirenona [6R-(ßa^a,ßß,?a,??ß,^ß, a,?da,??a,^ß)]-? ,?.^,ß,?,ß,?,? ?,1 1 ,12,13,14,15,16,20,21 ^6X3 603^^0-10,13-dimetilespiro[17H-dicicloprop3[6,7:15, 6]ciclopenta[a]fenantren-17,2'(5'H)-furan]-3,5'(2H)-diona, número de registro CAS 67392-87-4. En la patente GB 1550568 1979, documento de prioridad DE 2652761 1976 se describen procedimientos para fabricar y usar drospirenona.

El término "tratamiento" o "tratar" incluye la administración, a una persona en necesidad, de una cantidad de un bloqueador de aldosterona que inhibirá o invertirá el desarrollo de una afección cardiovascular patológica. El término "prevención" o "prevenir" incluye prevenir la aparición conjuntamente de trastornos cardiovasculares clínicamente evidentes o prevenir la aparición de un trastorno cardiovascular de una etapa preclínicamente evidente en pacientes. Esto incluye el tratamiento profiláctico de aquéllos con riesgo de desarrollar un trastorno cardiovascular. La frase "terapéuticamente eficaz" pretende cualificar la cantidad de los dos agentes dados en combinación que conseguirán el objetivo de mejorar ía gravedad del trastorno y ¡a frecuencia de incidencia, mientras se evitan efectos secundarios adversos. El término "sujeto" para propósitos de tratamiento incluye cualquier ser humano o animal susceptible de o que padece un trastorno inflamatorio y es preferiblemente un ser humano. El sujeto, por ejemplo, puede estar en peligro debido a la dieta, exposición a infección bacteriana o viral, por tener presentes marcadores comunes, por estar genéticamente predispuestos a un trastorno cardiovascular y similares. El término "aldosterona" pretende incluir la aldosterona y ésteres de aldosterona tales como, por ejemplo, aldosterona-18-acetato, aldosterona-20-acetato y aldosterona-21 -acetato. é ¾s1óTT^o~queadort qtre— oede— Fedtic4r o inh kti^-e^- ^o- isiol gico— de la aldasleiona, _Los bloqueadores de la aldosterona pueden ser un inhibidor de aldosterona o un antagonista del receptor de aldosterona. Los bloqueadores de aldosterona de la presente invención se incluyen, a grandes rasgos, en dos categorías; inhibidores de aldosterona y antagonistas del receptor de aldosterona. La expresión "inhibidor de aldosterona" denota un compuesto que reduce o interrumpe directa o indirectamente la síntesis o actividad de la aldosterona. La expresión "antagonista de aldosterona" y "antagonista del receptor de aldosterona" denota un compuesto que puede unirse a un receptor de aldosterona, como inhibidor competitivo de la acción de la propia aldosterona en el lugar del receptor, de forma que modula la actividad de aldosterona mediada por el receptor. Los ejemplos de inhibidores de aldosterona de la presente invención incluyen, pero sin limitación: inhibidores de aromatasa tales como R-76713, R-83842, CGS-16949A (fadrozol), CGS-20267 (letrozol), CGS-20267, aminoglutetamida, CGS-47645, ICI-D-1033, derivados de cromona y xantona e YM-511 ; inhibidores de la 12-lipoxigenasa tales como PDGF, TNF, IL-1 , IL-1 beta, BW755c, fenidona, baicaleína, aminoguanidina, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), cinnamil-3,4-dihidroxi-a-cianocinnamato (CDC), panaxinol, pioglitazona y ribozima de escisión del ARNm; inhibidores de ?4~5?7?( tales- ^omo^t^-vinilprogesterona— — 18=etinilpregfesterenaT -ácidos — clotrimazol, miconazol, etomidato, spironolactona y 23-0586; factores natriuréticos auriculares tales como ANP, ANF y fragmentos de ANF; inhibidores de 17,20-lisasa tales como YM-55208 e YM-53789; inhibidores de la síntesis de prostaglandina tales como indometacina, meclofenamato, aminoglutetamida y aspirina; inhibidores PKC tales como esfingosina, retinal, H-7, estaurosporina y trifluoperazina; benzodiazepinas tales como diazepam y midazolam; bloqueadores de calcio tales como amlodipina y mibefradil; inhibidores de diacilglicerol lipasa tales como RHC-80267 [1 ,6-bis- (ciclohexiloximinocarbonilamino)-hexano]; ionóforos de potasio tales como valinomicina y cromacalim; bloqueadores del transporte de electrones (inhibidores metabólícos) tales como antimicina A, cianuro, rotenona y amita!; dopamina (hormona de inhibición de la prolactina), Clorbutol, 18-etinil-11- desoxicorticoesterona (18-EtDOC) y etanol. Ciertos compuestos, por ejemplo, 11 ß-hidroxi androst-4-en-3-ona 17-espirolactona, actúan como inhibidor de aldosterona sintasa y como antagonista del receptor de aldosterona. Tales compuestos también están contemplados en la presente invención y se incluyen dentro de la definición de "bloqueador de aldosterona". Además, se sabe que los inhibidores de angiotensina II e inhibidores de la enzima de conversión de la angiotensina (ACE) reducen la síntesis de aldosterona. Los inhibidores de angiotensina II incluyen análogos de^a^gióleTTsíñ^nrfales l¾ñ ¾ñg ¾ñs1na~ i Des-asp1 ^thr8 (t-Ary-t-Val-t- — L-lle-L-His-L-Pro-L-lle) y angiotensina II Des-asp1 -ala8 (L-Arg-L-Val-L-Tyr-L-lle-L-Hls-L-Pro-L-Ala); y antagonistas del receptor de la angiotensina II tales como Candesartan; Eprosartan; Irbesartan; Losarían; Telmisartan; y Valsarían. El término "pro-inflamatorio" caracteriza moléculas producidas en el cuerpo para inducir, activar o potenciar una respuesta inflamatoria en un órgano o tejido. El término "hídrido" denota un átomo de hidrógeno sencillo (H). Este radical hídrido puede unirse, por ejemplo, a un átomo de oxígeno para formar un radical hidroxilo o pueden unirse dos radicales hídrido a un átomo de carbono para formar un radica! metüen.o (-CH2-). Cuando se usa, solo o en combinación con otros términos tales como "haloalquílo", "alquilsulfonilo", "alcoxialquilo" e "hidroxialquilo", el término "alquilo" abarca radicales lineales o ramificados que tienen de uno a aproximadamente veinte átomos de carbono o, preferiblemente, de uno a aproximadamente doce átomos de carbono. Son radicales alquilo más preferidos radicales "alquilo inferior" que tienen de uno a aproximadamente diez átomos de carbono. Los más preferidos son los radicales alquilo inferior que tienen de uno a aproximadamente seis átomos de carbono. Los ejemplos de tales radicales incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, íerc-butilo, pentilo, /so-amilo, hexilo y similares. El término "alquenilo" abarca radicales lineales o ramificados que tienerral nerios tm doble-enlaee ear^ono-eai¾o o^e-dos^ aproximadamente- doce átomos de carbono. Son radicales alquenilo más preferidos radicales "alquenilo inferior" que tienen de dos a aproximadamente seis átomos de carbono. Los ejemplos de radicales alquenilo incluyen etenilo, propenilo, alilo, propenilo, butenilo y 4-metilbutenilo. El término "alquinilo" denota radicales lineales o ramificados que tienen de dos a aproximadamente veinte átomos de carbono o, preferiblemente, de dos a aproximadamente doce átomos de carbono. Son radicales alquinilo más preferidos los radicales "alquinilo inferior" que tienen de dos a aproximadamente diez átomos de carbono. Son más preferidos los radicales alquinilo inferior que tienen de dos a aproximadamente seis átomos de carbono. Los ejemplos de tales radicales incluyen propargilo, butinilo y similares. Los términos "alquenilo", "alquenilo inferior" abarcan radicales que tienen orientaciones "cis" y "trans" o, alternativamente, orientaciones "E" y "Z". El término "cicloalquilo" abarca radicales carbocíclicos saturados que tienen de tres a doce átomos de carbono. Son radicales cicloalquilos más preferidos radicales "cicloalquilo inferior" que tienen de tres a aproximadamente ocho átomos de carbono. Los ejemplo de tales radicales incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo. El término "cicloalquenilo" abarca radicales carbocíclicos parcialmente insaturados que tienen de tres a doce átomos de carbono. Son radicales cicloalquenilo más preferidos radicales "cicloalquenilo inferior" que tienen de cuatro a aproximadamente ocho átomos de carbono. Los ejemplos de tales radicales incluyen eieleper+taéieRil©- y— cielofrexenilo.— El- término "haloaiquilo" abarca radicales donde uno cualquiera o más de los átomos de carbono alquilo están sustituidos con halo como se ha definido anteriormente. Se incluyen específicamente los radicales monohaloalquilo, dihaloalquilo y polihaloalquilo. Un radical monohaloalquilo, por ejemplo, puede tener un átomo de yodo, bromo, cloro o fluoro en el radical. Los radicales dihalo y polihaloalquilo pueden tener dos o más de los mismos átomos halo o una combinación de diferentes radicales halo. "Haloaiquilo inferior" abarca radicales que tienen 1-6 átomos de carbono. Los ejemplos de radicales haloaiquilo incluyen fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, heptafluoropropilo, difluorocíorometilo, dic!orofluorometi!o, difluoroetilo, difluoropropilo, dicloroetilo y dicloropropilo. El término "hidroxialquilo" abarca radicales alquilo lineales o ramificados que tienen de uno a aproximadamente diez átomos de carbono uno cualquiera de los cuales puede estar sustituido con uno o más radicales hidroxilo. Son radicales hidroxialquilo más preferidos radicales "hidroxialquilo inferior" que tienen de uno a seis átomos de carbono y uno o más radicales hidroxilo. Los ejemplos de tales radicales incluyen hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo, hidroxibutilo e hidroxihexilo. Los términos "alcoxi" y "alquiloxi" abarcan radicales lineales o ramificados que contienen oxi teniendo cada uno porciones alquilo de uno a aproximadamente diez átomos de carbono. Son radicales alcoxi más preferidos radicales "alcoxi inferior" que tienen de uno a seis átomos- de carbono. tes-ejemples-de-tales- radicales-incluyen- metoxi .,- 4 propoxt,43trto>d y íerc-butoxh B éflTHno— alcoxialquilo^ incluye cadicaies-alquiJo que tienen uno o más radicales alcoxi unidos al radical alquilo, es decir, para formar radicales monoalcoxialquilo y dialcoxialquilo. Los radicales "alcoxi" pueden sustituirse adicionalmente con uno o más átomos halo, tales como fluoro, cloro o bromo, para proporcionar radicales haloalcoxi. Son radicales haloalcoxi más preferidos radicales "haloalcoxi inferior" que tienen de uno a seis átomos de carbono y uno o más radicales halo. Los ejemplos de tales radicales incluyen fluorometoxi, clorometoxi, trifluorometoxi, trifluoroetoxi, fluoroetoxi y fluoro propoxi. El término "arilo", solo o en combinación, significa un sistema aromático carbocíclico que contiene uno, dos o tres anillos que pueden unirse conjuntamente de manera colgante o pueden condensarse. El término "arilo" abarca radicales aromáticos tales como fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indano y bifenilo. Los restos arilo también pueden sustituirse en un posición sustituible con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente entre alquilo, alcoxialquilo, alquilaminoalquilo, carboxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilalquilo, alcoxi, aralcoxi, hidroxilo, amino, halo, nitro, alquilamino, acilo, ciano, carboxi, aminocarbonilo, alcoxicarbonilo y aralcoxicarbonilo. El término "heterociclilo" abarca radicales en forma de anillo saturado, parcialmente insaturado e insaturado que contienen heteroátomos, en los que los heteroátomos pueden seleccionarse entre nitrógeno, azufre y oxígeno. Los ejemplos de radicales heterociclico saturados incluyen grupos heteromonocíclicos saturados de 3 a 6 miembros que contienen — 1=4 átomos de —nitrógeno- {por ejemplo, pirrolidinilo, imidazoHdifHle^ — ptperidin&, — ipefazm lo^ — etc); — gwpo — teteromonaclclicos_ saturados de 3 a 6 miembros que contienen de 1 a 2 átomos de oxígeno y de 1 a 3 átomos de nitrógeno (por ejemplo, morfolinilo, etc); grupos heteromonocíclicos saturados de 3 a 6 miembros que contienen de 1 a 2 átomos de azufre y de 1 a 3 átomos de nitrógeno (por ejemplo tiazolidinilo), etc. Los ejemplos de radicales heterocíclicos parcialmente insaturados incluyen dihidrotiofeno, dihidropirano, dihidrofurano y dihidrotiazol. El término "heteroarilo" abarca radicales heterocíclicos insaturados. Los ejemplos de radicales heterocíclicos insaturados, también denominados radicales "heteroarilo" incluyen grupos heteromonocíclicos insaturados de 3 a 6 miembros que contienen de 1 a 4 átomos de nitrógeno, por ejemplo, pirrolilo, pirrolinilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, pirimidüo, pirazinilo, piridazinílo, triazolilo (por ejemplo, 4/-/-1 ,2,4-triazolilo, 1H-1 ,2,3-triazolilo, 2H-1.2.3-triazolilo, etc.), tetrazolilo (por ejemplo, 1 H-tetrazolilo, 2H-tetrazolilo, etc.), etc.; grupo heterociclilo insaturado condensado que contiene de 1 a 5 átomos de nitrógeno, por ejemplo, ¡ndolilo, isoindolilo, indolizinilo, benzimidazolilo, quinolilo, isoquinolilo, indazoillo, benzotriazolilo, tetrazolopiridazinilo (por ejemplo, tetrazolo[1 ,5-b]piridazinilo, etc), etc. grupo heteromonocíclico insaturado de 3 a 6 miembros que contiene un átomo de oxígeno, por ejemplo, piranilo, furilo, etc.; grupo heteromonocíclico insaturado de 3 a 6 miembros que contiene un átomo de azufre, por ejemplo, tienilo, etc; grupo heteromonocíclico insaturado de 3 a 6 miembros que contiene de 1 a 2 átomos de oxígeno y de 1 a 3 átomos de nitrógenOj por ejemplo oxazolilOi tsoxazofílo, oxadi¾zeWe-(per -ejemplo, 1 , 2 ^-ox^az^jlQ— t,¿,4^ox-adjazoi ilo^ 1 ,2,5-oxadiazolilo, etc). etc.; grupo heterociclilo insaturado condensado que contiene de 1 a 2 átomos de oxígeno y de 1 a 3 átomos de nitrógeno (por ejemplo, benzoxazolilo, benzoxadiazolilo, etc); grupo heteromonocíclico insaturados de 3 a 6 miembros que contienen de 1 a 2 átomos de azufre y de 1 a 3 átomos de nitrógeno, por ejemplo, tiazolilo, tiadiazolilo, (por ejemplo, 1 ,2,4-tiadiazolilo, 1 ,3,4-tiadiazolilo, 1 ,2,5-tiadiazolilo, etc.) etc.; grupo heterociclilo insaturado condensado que contiene de 1 a 2 átomos de azufre y de 1 a 3 átomos de nitrógeno (por ejemplo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, etc) y similares. El término también abarca radicales donde los radicales heterocíclicos están condensados con radicales arilo. Los ejemplos de tales radicales bicíclicos condensados incluyen benzoíurano, benzotiofeno y similares. Dicho "grupo heterociclilo" puede tener de 1 a 3 sustituyentes tales como alquilo, hidroxilo halo, alcoxi, oxo, amino y alquilamino. El término "alquiltio" abarca radicales que contienen un radical alquilo lineal o ramificado de uno a aproximadamente diez átomos de carbono unidos a un átomo de azufre divalente. Son radicales alquiltio más preferidos radicales "alquiltio" inferior que tienen radicales alquilo de uno a seis átomos de carbono. Son ejemplos de tales radicales alquiltio inferior metiltio, etiltio, propiltio, butiltio y hexiltio. El término "alquiltioalquilo" abarca radicales que contienen un radical alquiltio unido mediante el átomo de azufre divalente a un radical alquilo de uno a aproximadamente diez átomos de carbono. Son radicales alquiltioalquilo más-preferidosHos-radieales -alquiltiQalquilo-mfeFiores" que-tienen-r-ad ¡cales- a†quitcr^e^no-a-seis-ateffi alquiltioalquilo inferior incluyen metiltiometilo. El término "alquilsulfinilo" abarca radicales que contienen un radical alquilo lineal o ramificado de uno a diez átomos de carbono, unido a un radical -S(=0)- divalente. Son radicales alquisulfinilo más preferidos radicales "alquilsulfinilo inferior" que tiene radicales alquilo de uno a seis átomos de carbono. Los ejemplos de tales radicales alquilsulfinilo inferiores incluyen metilsulfinilo, etilsulfinilo, butilsulfinilo y hexilsulfinilo. El término "sulfoniio" usado solo o unido a otros términos tales como alquiisulfonilo, denota respectivamente radicales divalentes -S02-. El término "alquiisulfonilo" abarca radicales alquilo unidos a un radical sulfoniio donde el alquilo es como se ha definido anteriormente. Son radicales alquiisulfonilo más preferidos radicales "alquiisulfonilo inferior" que tienen de uno a seis átomos de carbono. Los ejemplos de tales radicales alquiisulfonilo inferior incluyen metilsulfonilo, etilsulfonilo y propilsulfonilo. Los radicales "alquiisulfonilo" pueden sustituirse además con uno o más átomos halo tales como fluoro, cloro o bromo para proporcionar radicales haloalquilsulfonilo. Los términos "sulfamilo", "aminosulfonilo" y "sulfonamidilo" denotan NH2O2S-. El término "acilo" denota un radical proporcionado por el resto después de la retirada de hidroxilo de un ácido orgánico. Los ejemplos de tales radicales acilo incluyen radicales alcanoílo y aroílo. Los ejemplos de tales radicales alcanoílo inferior incluyen formilo, acetilo, propionilo, butirilo, ¡sobutirilo, valerilo, ¡sovalerilo, pivaloílo, hexanoílo, trifluoroacetilo. El término "carbonilo" asado solo-o ran-otros términosT-tal-eomo-alc^iearbonilo- denota -(G=0)--EI término- ^roflo^barea-ratHeales-aftle-cen un radical -€afbor lo-Gomo se -ba — definido anteriormente. Los ejemplos de aroílo incluyen benzoílo, naftoilo y similares y el arilo en dicho aroílo puede estar sustituido adícionalmente. Los términos "carboxi" o "carboxilo" usados solos o con otros términos tales como "carboxialquilo" denotan -CO2H-. El término "carboxialquilo" abarca radicales alquilo sustituidos con un radical carboxi. Se prefieren más los radicales "carboxialquilo inferior" que abarcan radicales alquilo inferior como se ha definido anteriormente y pueden sustituirse adícionalmente en el radical alquilo con halo. Los ejemplos de tales radicales carboxialquilo inferior incluyen carboximetilo, carboxietilo y carboxipropilo. El término "alcoxicarbonilo" significa un radical que contiene un radical alcoxi, como se ha definido anteriormente, unido mediante un átomo de oxígeno a un radica! carbonilo. Se prefieren más los radicales "alcoxicarbonilo inferior" con porciones alquilo que tienen de 1 a 6 carbonos. Los ejemplos de tales radicales alcoxicarbonilo (éster) inferior incluyen metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, butoxicarbonilo y hexiloxicarbonilo sustituidos o no sustituidos. Los términos "alquilcarbonilo", "arilcarbonilo" y "aralquilcarbonilo" incluyen radicales que tienen radicales alquilo, arilo y aralquilo, como se ha definido anteriormente, unidos a un radical carbonilo. Los ejemplos de tales radicales incluyen metilcarbonilo, etilcarbonilo, fenilcarbonilo y bencilcarbonilo sustituidos o no sustituidos. El término "aralquilo" abarca radicales alquilo sustituidos con arilo tales como bencilo, aralquilo — puede— sustituiré— acHcionalmerite— eQñ~heA&^^^tí & ^£Q) 1- ^a\Qa\qu^\o~ ^-haloalcoxi. Los términos bencilo fenilmetilo son intercambiables. El término "heterociclilalquilo" abarca radicales alquilo sustituidos con heterociclilo saturados y parcialmente insaturados, tales como pirrolidinilmetilo, y radicales alquilo sustituidos con heteroarilo tales como piridilmetilo, quinolilmetilo, tienilmetilo, furiletilo y quinoliletilo. El heteroarilo en dicho heteroaralquilo puede sustituirse adicionalmente con halo, alquilo, alcoxi, haloalquilo y haloalcoxi. El término "aralcoxi" abarca radicales aralquilo unidos mediante un átomo de oxígeno a otros radicales. El término "aralcoxialquilo" abarca radicales aralcoxi unidos mediante un átomo de oxígeno a un radical alquilo. El término "aralquiltio" abarca radicales aralquilo unidos a un átomo de azufre. El término "aralquiltioalquiio" abarca radicales aralquiltio unidos mediante un átomo de azufre a un radical alquilo. El término "aminoalquilo" abarca radicales alquilo sustituidos con uno o más radicales amino. Se prefieren más los radicales "aminoalquilo inferior". Los ejemplos de tales radicales incluyen aminometilo, aminoetilo y similares. El término "alquilamino" denota grupos amino que se han sustituido con uno o dos radicales alquilo. Se prefieren radicales "/V-alquilamino inferior" que tienen porciones alquilo que tienen de 1 a 6 átomos de carbono. El alquiloamino inferior adecuado puede ser mono- o dialquilamino tal como W-metilamino, N-etilamino, ? ,/V-dimetilamino, N,N-dietilamino o similares. El término "arilamino" denota grupos amino que se han sustituido con uno o dos radicales arilo, tales como /V-fenilamino. Los radteales^aritamino" pueden-sustitüirse^dieio ' o-del-raéieal. El tófñwre^raJqwlammo^^^ mediante un átomo de nitrógeno amino a otros radicales. Los términos "N-arilaminoalquilo" y "A/-aril-A/-alquil-aminoalquilo" denotan grupos amino que se han sustituido con un radical arilo o un radical arilo y un radical alquilo, respectivamente, y que tienen el grupo amino unido a un radical alquilo. Los ejemplos de tales radicales incluyen /V-fenilaminometilo y A/-fenil-A/-metilamínometilo. El término "aminocarbonilo" denota un grupo amida de fórmula -C(=0)NH2. El término "alquilaminocarbonilo" denota un grupo aminocarbonilo que se ha sustituido con uno o dos radicales alquilo en el átomo de nitrógeno amino. Se prefieren los radicales "AZ-alquilaminocarbonilo", "/V,A/-dialquilaminocarbonilo" Se prefieren los radicales "N-alquilaminocarbonüo inferior" y "/V,.A/-dialqui!am¡nocarbonilo inferior" con porciones alquilo inferior como se han definido anteriormente. El término "alquilaminoalquilo" abarca radicales que tienen uno o más radicales alquilo unidos a un radical aminoalquilo. El término "ariloxialquilo" abarca radicales unidos a un radical aminoalquilo. El término "ariloxialquilo" abarca radicales que tienen un radical arilo unido a un radical alquilo mediante un átomo de oxígeno divalente. El término "ariltioalquilo" abarca radicales que tienen un radical arilo unido a un radical alquilo mediante un átomo de azufre divalente. Los compuestos utilizados en los procedimientos de la presente invención pueden estar presentes en forma de bases libres o sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables de las mismas. El término "sales farmacéuticamente— aceptables— abarca -sales— usadas habitualmente -paca- formar sales^e-iT^ales^c llQos^ -pa a formar sales^de adición de ácidos libres o bases libres. La naturaleza de la sal no es crítica, con la condición de que sea farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de compuestos de fórmula I pueden prepararse con un ácido inorgánico o ácido orgánico. Algunos ejemplos de tales ácidos inorgánicos son ácido clorhídrico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, carbónico, sulfúrico y fosfórico. Los ácidos orgánicos apropiados pueden seleccionarse entre las clases de ácidos orgánicos alifático, cicloalifático, aromático, aralifático, heterocíclico, carboxílico y sulfónico, ejemplos de los cuales son ácidos fórmico, acético, propiónico, succínico, glicólico, glucónico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, glucurónico, maleico, fumárico, pirúvico, aspártico, glutámico, benzoico, antranílico, mesílico, 4-hidroxibenzoico, fenilacético, mandélico, embónico (pamoico), metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónnico, pantoténico, 2-hidroxietanosulfónico, toluenosulfónico, sulfanílico, ciclohexilamínosulfónico, esteárico, algénico, b-hidroxibutírico, salicíclico, galactárico, y galacturónico. Los sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables incluyen sales metálicas preparadas con sales de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y cinc o sales orgánicas preparadas con /V./V'-dibenciletilendiamina, cloro-procaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina) y procaína. Todas estas sales pueden prepararse por medios convencionales con el compuesto correspondiente haciendo reaccionar, por ejemplo el ácido apropiado o-la base apropiada con_el compuest La^resei^e4A ©octón-com -ende-una 8mposicÍári farmacéutica para la prevención de trastornos cardiovasculares, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un bloqueador de aldosterona junto con al menos un vehículo, adyuvante o diluyente farmacéuticamente aceptable (denominados colectivamente en este documento como materiales "vehículo") y, si se desea, otros ingredientes activos. Los compuestos activos de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía adecuada conocida para los especialistas en la técnica, preferiblemente en forma de composición farmacéutica adaptada a tal vía y en una dosis eficaz para el tratamiento que se pretende realizar. Los compuestos activos y la composición pueden administrarse, por ejemplo, por vía oral, intravascular, intraperitoneal, intranasa!, intrabronquial, subcutánea, intramuscular o tópica (incluyendo aerosol). La administración del bloqueador de aldosterona puede realizarse por vía oral, o mediante inyecciones intravenosas, intramusculares o subcutáneas. La formulación puede estar en forma de bolo o en forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas para inyección estéril e isotónica. Estas soluciones y suspensiones pueden prepararse a partir de polvos o gránulos estériles que tienen uno o más vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables o un aglutinante tal como gelatina o hidroxipropil-metilcelulosa, junto con uno o más de un lubricante, conservante, tensioactivo o agente de dispersión. Para a administración oral, la- composición farmacéutica puede La composición farmacéutica se prepara preferiblemente en forma de unidad de dosificación que contiene una cantidad particular de ingrediente activo. Son ejemplos de tales unidades de dosificación comprimidos o cápsulas. Éstas pueden contener ventajosamente una cantidad de cada ingrediente activo de aproximadamente 0.5 a 250 mg, preferiblemente de aproximadamente 25 a 150 mg. Una dosis diaria adecuada para un mamífero puede variar ampliamente dependiendo de la enfermedad del paciente y de otros factores. Sin embargo, puede ser apropiada una dosis de aproximadamente 0.01 a 30 mg/kg de peso corporal, particularmente de aproximadamente 1 a 15 mg/kg de peso corporal. Los ingredientes activos también se pueden administrar por inyección como una composición en la que, por ejemplo, se puede usar solución salina, dextrosa o agua como vehículo adecuado. Una dosis diaria adecuada de cada componente activo es de aproximadamente 0.01 a 15 mg/kg de peso corporal inyectado por día en múltiples dosis dependiendo de la enfermedad que se esté tratando. Una dosis diaria preferida sería de aproximadamente 1 a 10 mg/kg de peso corporal. Los compuestos indicados para terapia profiláctica se administrarán preferiblemente en una dosis diaria generalmente en un intervalo de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 15 mg por kilogramo de peso corporal por día. Una dosificación más preferida será un intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg por kilogramo de peso corporal. La más preferida es mg de compuesto activo por forma de dosificación unitaria. La más preferida es una forma de dosificación que contiene de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 25 mg de compuesto activo por unidad de dosificación. En una terapia combinada preferida, un antagonista del receptor de aldosterona puede estar presente en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 200 mg. El régimen de dosificación para tratar una enfermedad con el procedimiento de esta invención se selecciona de acuerdo con una diversidad de factores incluyendo el tipo, edad, peso, sexo y estado de salud del paciente, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración, y el compuesto particular empleado y, por tanto, puede variar ampliamente. Para propósitos terapéuticos, los componentes activos de este procedimiento se combinan normalmente con uno o más adyuvantes apropiados para la vía de administración indicada. Si se administran per os, los componentes pueden mezclarse con lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres^ de-eelulesa-de áeidos-alGanoiGOs, alquil esteres de celulosa, talco,- tete-esteá teor estoarato do magnesio, óxido de magnesia.-sales -sódicas^ cálcicas de ácidos fosfóricos y sulfúricos, gelatina, goma arábiga, alginato sódico, polivinilpirrolidona, y/o alcohol de polivinilo, y después comprimirse o encapsularse para una administración conveniente. Dichas cápsulas o comprimidos pueden contener una formulación de liberación controlada que puede proporcionarse en una dispersión de compuesto activo en hidroxipropilmetil celulosa. Las formulaciones para administración parenteral pueden estar en forma de soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas isotónicas estériles. Estas soluciones y suspensiones pueden prepararse con polvos o gránulos estériles con uno o más de los vehículos o diluyentes mencionados para usar en las formulaciones para administración oral. Los componentes pueden disolverse en agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, alcohol bencílico, cloruro sódico, y/o diversas soluciones tampón. En la técnica farmacéutica se conocen bien y ampliamente otros adyuvantes y modos de administración.

Formas en estado sólido de antagonistas epoxi-esteroideos de aldosterona Los procedimientos la presente invención abarcan la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de eplerenona en cualquiera de sus formas en estado sólido, como una o más formas en estado sólido-per-se-o en-fonria-de -e©mposieiórv a rmacéutica-que comprende una o — 5 s^n-eetado-sólido e- a -eplerenona.— Estas nuevas^formas en — estado sólido incluyen, sin limitación, eplerenona cristalina solvatada, eplerenona cristalina no solvatada, y eplerenona amorfa. En una modalidad, la eplerenona administrada de acuerdo con los procedimientos de la presente invención es una forma cristalina no solvatada de eplerenona con el patrón de rayos X de difracción en polvo descrito a continuación en el cuadro 1A (denominado en este documento "polimorfo de mayor punto de fusión" o "Forma H"). La eplerenona de Forma H se describe en la Publicación Internacional N° WO 01/42272, cuya descripción se incorpora en este documento como referencia. En otra modalidad, la eplerenona se administra en forma de una composición farmacéutica en la que toda la cantidad de eplerenona contenida en la composición está presente como una fase pura de Forma H. En otra modalidad, la eplerenona se administra en forma de una composición farmacéutica en la que toda la cantidad de eplerenona contenida en la composición está presente como una fase pura de Forma L. La eplerenona Forma L se describe en la Publicación Internacional N° WO 01/41535, cuya descripción se incorpora por referencia en este documento. En otra modalidad, la eplerenona se administra en forma de una composición farmacéutica en la que toda la cantidad de eplerenona contenida en la composición está presente como eplerenona cristalina solvatada en fase pura. En otra modalidad, la eplerenona se administra en forma de una — composición farmacéutica en la que la composición comprende una primera forma en estado sólido de epierenona y una segunda forma en estado sólido de epierenona, y la primera y segunda formas en estado sólido de epierenona se seleccionan entre Forma H, Forma L, epierenona solvatada y epierenona amorfa. En general, la relación en peso de dicha primera forma en estado sólido con dicha segunda forma en estado sólido es preferiblemente al menos aproximadamente 1 :9, preferiblemente aproximadamente 1 :1 , más preferiblemente al menos 2:1 , más preferiblemente al menos aproximadamente 5:1 y aún más preferiblemente a! menos aproximadamente 9:1. Las formulaciones de epierenona también se describen en la Publicación Internacional N° WO 00/33847 y WO 01/41770 cuyas descripciones se incorporan en este documento como referencia. En otra modalidad, la epierenona se administra en forma de composición farmacéutica en la que la composición comprende Forma H y Forma L. La relación de cantidad de Forma L con Forma H en la composición está generalmente entre aproximadamente 1 :20 y aproximadamente 20:1. En otras modalidades, por ejemplo, esta relación está entre aproximadamente 10:1 y aproximadamente 1 :10; aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1 :5; aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1 :2; o aproximadamente 1 :1. Aunque cada una de las modalidades anteriores puede abarcar la a mmistfadóñ-de-una forma en estado-sólido de eple^eflooa-sobre- a amplio intervalo de tamaños de partícula de eplerenona, se ha descubierto que juntando la selección de la forma en estado sólido de la eplerenona con una reducción en el tamaño de partícula de la eplerenona se puede mejorar la biodisponibilidad de la eplerenona no formulada y de las composiciones farmacéuticas que comprenden la forma en estado sólido de eplerenona. En otra modalidad, el tamaño de partícula D90 de la eplerenona no formulada o de la eplerenona usada como material de partida en la composición es menor de aproximadamente 400 micrometros, preferiblemente menor de aproximadamente 200 micrometros, más preferiblemente menor de aproximadamente 150 micrometros, todavía más preferiblemente menor de aproximadamente 100 micrometros, y aún más preferiblemente menor de aproximadamente 90 micrometros. En otra modalidad, el tamaño de partícula D90 está entre aproximadamente 40 micrometros a aproximadamente 100 micrometros. En otra modalidad, el tamaño de partícula D90 está entre aproximadamente 30 micrometros a aproximadamente 50 micrometros. En otra modalidad, el tamaño de partícula D9o está entre aproximadamente 50 micrometros a aproximadamente 150 micrometros. En otra modalidad, el tamaño de partícula Dgo está entre aproximadamente 75 micrometros a aproximadamente 125 micrometros. En otra modalidad, el tamaño de partícula D90 de la eplerenona no formulada o de la eplerenona usada como material de partida en la composieión-genef al mente-es menor-de aproximadamente- 1 S-m icr-ómetros ,- preferiblemente — menor — e — apfe*tmademefrte — 4- — miefómetr&s1 — más preferiblemente menor de aproximadamente 800 nm, aún más preferiblemente menor de aproximadamente 600 nm, y aún más preferiblemente menor de aproximadamente 400 nm. En otra modalidad, el tamaño de partícula Dg0 está entre aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1 micrometro. En otra modalidad, el tamaño de partícula D90 está entre aproximadamente 100 nm a aproximadamente 800 nm. En otra modalidad, el tamaño de partícula D9o está entre aproximadamente 200 nm a aproximadamente 600 nm. En otra modalidad, el tamaño de partícula D90 está entre aproximadamente 400 nm aproximadamente 800 nm. Las formas en estado sólido de epierenona con un tamaño de partícula menor de aproximadamente 15 micrómetros se pueden, preparar de acuerdo con las técnicas aplicables de reducción de tamaño de partícula conocidas en la técnica. Tales técnicas incluyen, pero sin limitación, las descritas en las patentes de Estados Unidos N° 5,145,684, 5,318,767, 5,384,124 y 5,747,001. Las patentes de Estados Unidos N° 5,145,684, 5,318,767, 5,384,124 y 5,747,001 se incorporan expresamente en este documento en su totalidad. De acuerdo con el procedimiento de la patente de Estados Unidos N° 5,145,684, por ejemplo, se preparan partículas de una tamaño adecuado dispersando la epierenona en un medio líquido de dispersión y moliendo en húmedo la mezcla en presencia de medio de trituración para reducir las partículas al tamaño deseado. Si es necesario o verttajoso7 se^puede reducirel tamaño de las partículas en- presencia de-un moeKf½a ef- e-st ee í¡e e^ El término "amorfo" aplicado a la eplerenona se refiere al estado sólido en el que las moléculas de eplerenona están presentes en una disposición desordenada y no forman una red cristalina o celda unitaria cristalina distinguible. Cuando se somete a difracción en polvo de rayos X, la eplerenona amorfa no produce picos cristalinos característicos. Cuando se hace referencia en esta solicitud a "punto de ebullición" de una sustancia o solución, el término "punto de ebullición" significa el punto de ebullición de la sustancia o solución en las condiciones del proceso aplicables. El término "forma cristalina" aplicado a la eplerenona se refiera a una forma en estado sólido en el que las moléculas de eplerenona están dispuestas para formar una red cristalina distinguible (i) que comprende celdas unitarias distinguibles, y (ii) que produce picos de difracción cuando se someten a radiación de rayos X. El término "cristalización" como se usa en esta solicitud se refiere a la cristalización y/o recristalización dependiendo de las circunstancias aplicables que se refieren a la preparación del material de partida de eplerenona. El término "digestión" significa un procedimiento en que una suspensión de eplerenona sólida en un disolvente o mezcla de disolventes se calienta al punto de ebullición del disolvente o mezcla de disolventes en las coTidiciones-aplicabtes defproeedimiento.

H — término "cristalización — di ecta- — como — se — usa — en — este-documento se refiere a la cristalización de la epierenona directamente con un disolvente adecuado sin la formación y desolvatación de una forma intermedia cristalina solvatada en estado sólido de epierenona. El término "tamaño de partícula" como se usa en este documento, se refiere al tamaño de partícula medida con técnicas convencionales de medición de tamaño de partícula, tales como dispersión de luz láser, fraccionamiento por flujo en campo de sedimentación, espectroscopia por correlación fotónica, o centrifugación en disco. El término "tamaño de partícula Dg0" significa el tamaño de partícula de al menos el 90% de las partículas medidas con tales técnicas de medición de tamaño de partícula convencionales. El término "pureza" significa la pureza química de la epierenona de acuerdo con un análisis HPLC convencional. Como se usa en este documento, "epierenona de baja pureza" significa generalmente epierenona que contiene una cantidad eficaz de un promotor de crecimiento de Forma H y/o un inhibidor de crecimiento de Forma L. Como se usa en este documento, "epierenona de alta pureza" significa generalmente epierenona que no contiene, o que contiene menos de una cantidad eficaz de un promotor de crecimiento de Forma H y/o un inhibidor de crecimiento de Forma L. El término "pureza de fase" significa la pureza en estado sólido de la epierenona con respecto a una forma cristalina particular o amorfa de la epierenona determinada por-pFoeedimientes-analítiGGS de-espectroscopia-por- El análisis de rayos X en un único cristal indica que la conformación molecular de la eplerenona difiere entre la Forma H y la Forma L, particularmente con respecto a la orientación del grupo éster en la posición 7 del anillo esteroideo. La orientación del grupo éster puede definirse por el ángulo de torsión C8-C7-C23-02. En la red cristalina de la Forma H, la molécula de eplerenona adopta una conformación en la que el grupo metoxi del éster se alinea aproximadamente con el enlace C-H en la posición 7 y el grupo carbonilo se posiciona aproximadamente sobre el centro del anillo B-esteroideo. El ángulo de torsión C8-C7-C23-02 es aproximadamente -73.0° en esta conformación. En esta conformación, el ángulo de torsión C8-C7-C23-02 es aproximadamente -73.0°. En esta orientación, el átomo de oxígeno carbonilo del grupo éster (01 ) está en contacto estrecho con el átomo de oxígeno del anillo 9,1 1-epóxido (04). La distancia 01-04 es de aproximadamente 2.97Á, que está justo por debajo de la distancia de contacto de van der Waal de 3.0Á (strponiendo-tin rad½~de-v¾Fbder-Waal de^kSÁ pafa el oxígeno), — ¦ En la red- cftstaltn a -de fa-Fer-m a L, la molécula -de eplerenona adopta una conformación en la que el grupo éster rota aproximadamente 150°C en relación con la Forma H y tiene un ángulo de torsión C8-C7-C23-02 de aproximadamente +76.9°. En esta onentación, el grupo metoxi del éster se 5 dirige hacia el segmento 4,5-alqueno del anillo A-esteroideo. En esta orientación, la distancia entre el átomo de oxígeno del grupo éster (01 ,02) y el átomo oxígeno del anillo 9,1 1-epóxido aumenta en relación a la distancia calculada para la Forma H. La distancia 02-04 es de aproximadamente 3.04Á, justo por encima de la distancia de contacto de van der Waal. La distancia 01-lü 04 es de aproximadamente 3.45Á. La molécula de eplerenona parece adoptar una conformación característica de la Forma L en las formas cristalinas solvatadas analizadas hasta la fecha por difracción de rayos X de un solo cristal. 15 2. Difracción de rayos X en polvo Las diversas formas cristalinas de eplerenona se analizaron con un difractómetro de polvo Siemens D5000 o un Difractómetro Multipropósito Inel. Para el difractómetro de polvo Siemens D5000, se midieron los valores 2q de 2 a 50 de los datos brutos, con incrementos de 0.020 y periodos entre 20 etapas de dos segundos. Para el Difractómetro Multipropósito Inel, las muestras se colocaron en un recipiente para muestras de aluminio y se recogieron datos brutos durante 30 minutos para todos los valores de dos theta^simultáneamente Íes-euaé es A^A& 1 C estableGef o¾^afámetres-sigoi¾cali o& de los máximos principales en términos de valores 2q e intensidades para las formas cristalinas de epierenona Forma H (preparada por desolvatación del solvato de etanol obtenido por digestión de epierenona de baja pureza), Forma L (preparada por desolvatación de la metiletilcetona obtenida por recristalización de la epierenona de alta pureza), y solvato de metiletilcetona (preparada por la conversión en suspensión a temperatura ambiente de epierenona de alta pureza en metiletilcetona), respectivamente (radiación de rayos X con longitud de onda de 1 .54056 Angstroms). Puede haber pequeños desplazamientos en la posición de los picos de los patrones de difracción de la Forma H y Forma L como resultado de imperfecciones en el espaciado de los planos de difracción de cristal por la forma de fabricación de la Forma H y Forma L (es decir, desolvatación de un solvato). Además, la forma H se aisla de un solvato preparado por digestión de la epierenona bruta. Este procedimiento tiene como resultado una menor pureza química global (aproximadamente 90%) de la Forma H. Finalmente, se espera que las formas solvatadas de la epierenona muestren algún desplazamiento en el posicionamiento de los picos de difracción debido a la mayor movilidad de las moléculas de disolvente en los canales de disolvente dentro de la red cristalina.

CUADRO 1 ? Datos forma H Angulo 2-theta espacio d Angstrom Intensidad % Intensidad 6.994 12.628 1188 7.2 8.291 10.655 2137 13 10.012 8.827 577 3.5 1 1.264 7.849 1854 1 1.3 12.04 7.344 7707 46.8 14.115 6.269 3121 19 14.438 6.13 15935 96.8 15.524 5.703 637 3.9 16.169 5.477 1349 8.2 16.699 5.305 1663 10.1 16.94 5.23 1692 10.3 17.147 5.167 2139 13 17.66 5.018 6883 41.8 17.91 4.949 16455 100 18.379 4.823 3106 18.9 18.658 4.752 1216 7.4 19.799 4.48 1499 9.1 20.235 4.385 383 2.3 21.707 4.091 1267 7.7 21.8 4.073 1260 7.7 GUADRC B- Datos forma L Angulo 2-theta espacio d Angstrom Intensidad Cps % Intensidad 7.992 11.054 11596 26.6 10.044 8.799 12048 27.6 1 1 .206 7.889 4929 1 1.3 12,441 7,109 1747 4 12.752 6.936 4340 9.9 13.257 6.673 2444 5.6 14.705 6.019 43646 100 15.46 5.727 2670 6.1 15.727 5.63 7982 18.3 16.016 5.529 3519 8.1 17.671 5.015 8897 20.4 17.9 4.951 2873 6.6 18.352 4.83 612 1.4 18.703 4.74 689 1.6 19.524 4.543 1 126 2.6 20.103 4.413 3753 8.6 20.63 4.302 1451 3.3 21.067 4.214 876 2 21.675 4.097 2760 6.3 Angulo 2-theta espacio d Angstrom Intensidad Cps % Intensidad 7.584 1 1.648 5629 32.6 7.753 1 1.393 15929 92.3 10.151 8.707 2877 16.7 11.31 7.817 701 4.1 12.646 6.994 1027 5.9 13.193 6.705 15188 88 13.556 6.526 14225 82.4 14.074 6.287 1966 1 1.4 14.746 6.002 2759 16 15.165 5.837 801 4.6 15.548 5.694 1896 11 17.031 5.202 7980 46.2 17.28 5.127 17267 100 17.706 5.005 6873 39.8 18.555 4.778 545 3.2 18.871 4.699 1 1 12 6.4 20.158 4.401 1396 8.1 20.725 4.282 2644 15.3 21.787 4.076 1 127 6.5 22.06 4.026 451 2.6 22.864 3.886 1542 8.9 23.412 3.796 14185 82.2 23.75 3.743 1 154 6.7 24.288 3.662 3063 17.7 25.253 3.524 1318 7.6 25.503 3.49 1736 10.1 25.761 3.455 1225 7.1 26.176 3.402 1346 7.8 26.548 3.355 1098 6.4 27.357 3.257 1944 1 1.3 27.605 3.229 21 16 12.3 27.9 3.195 858 5 28.378 3.142 583 3.4 28.749 3.103 763 4.4 29.3 3.046 1 182 6.8 29.679 3.008 2606 15.1 30.402 2.9377 2184 12.6 30.739 2.9063 648 3.8 19.766 4.488 1704 9.9 Fn las figuras 1-A, 1 -B y 1 -C se muestran respectivamente ejemplos gráficos de los patrones de difracción de rayos X de las formas cristalinas de epierenona de la Forma H, Forma L y de solvato de metiletilcetona. La Forma H muestra picos distinguibles a 7.0+0.2, 8.3+0.2 y 12.0+0.2 grados dos-theta. La Forma L muestra picos distinguibles a 8.0±0.2, 12.4±0.2, 12.8±0.2 y 13.3±0.2 grados dos-theta. La forma cristalina del solvato de metiletilcetona muestra picos distinguibles en 7.6±0.2, 7.8±0.2 y 13.6±0.2 grados dos-theta. 3. Temperatura de fusión/descomposición Se determinaron las temperaturas de fusión y/o descomposición de ¡as formas cristalinas no solvatadas de epierenona usando un calorímetro diferencial de barrido de TA Instruments 2920. Cada muestra (1-2 mg) se puso en una placa de aluminio cerrada o no cerrada herméticamente y se calentó a 10°C/minuto. Los intervalos de fusión/descomposición se definieron a partir del comienzo extrapolado al máximo de la endotermia de fusión/descomposición. La fusión de las formas cristalinas no solvatadas de epierenona (Forma H y Forma L) se asoció con la descomposición química y la pérdida de disolvente atrapado de la red del cristal. La temperatura de fusión/descomposición también se vio afectada por la manipulación del sólido antes del análisis. Por ejemplo, la Forma L no triturada (tamaño de partícula D90 de apróximadameñte~ 8O-450 micrómetros) preparaba por cristalización directa en un disolvente apropiado o por desolvatación de un solvato obtenido por cristalización de epierenona de alta pureza en un disolvente o mezcla de disolventes apropiada tenía generalmente un intervalo de fusión de aproximadamente 237-242°C. La Forma L triturada (tamaño de partícula D90 de aproximadamente 80-100 micrómetros) (Forma L preparara por cristalización de un solvato en una solución de epierenona de alta pureza en un disolvente o mezcla de disolventes apropiada y desolvatando el solvato para producir la Forma L, y triturando la Forma L resultante) tenía generalmente un intervalo de fusión/descomposición menor y más amplio de aproximadamente 223-234°C. La Forma H no triturada (tamaño de partícula D90 de aproximadamente 180-450 micrómetros) preparada desolvatando un solvato obtenido por digestión de epierenona de baja pureza, tenía generalmente un intervalo de fusión/descomposición más alto de aproximadamente 247-251 °C. En las figuras 2-A, 2-B, 2-C y 2-D se dan algunos ejemplos de termogramas CBD de (a) Forma L no triturada cristalizada directamente con metiletilcetona, (b) Forma L no triturada preparada desolvatando un solvato obtenido por cristalización de epierenona de alta pureza con metiletilcetona, (c) Forma L preparada triturando un solvato desolvatado obtenido por cristalización de epierenona de alta pureza con metiletilcetona, y (d) Forma H no triturada preparada por desolvatación de un solvato obtenido por digestión de epierenona de baja pureza con metiletilcetona. Los termogramas CBD de las formas solvatadas de epierenona se determinaron usando un calorímetro diferencial de barrido Perkin Elmer Pyris 1. Cada muestra (1-10 mg) se puso en una placa de aluminio no cerrada herméticamente y se calentó a 10°C/m¡nuto. Uno o más eventos endotérmicos a menores temperaturas se asociaron con cambios en la entalpia que tuvieron lugar al perder disolvente de la red del cristal del solvato. La endotermia o endotermias de mayor temperatura se asociaron con la fusión/descomposición de la Forma L o de la Forma H de la epierenona. En la figura 2-E se muestra un ejemplo del termograma por CBD para la forma cristalina de epierenona solvatada con metiletilcetona. 4. Espectroscopia de absorción infrarroja El espectro de absorción infrarrojo de las formas no solvatadas de la epierenona (Forma H y Forma L) se obtuvo con un espectrofotómetro Magna System 550 DRIFT Nicolet (transformada de Fourier de reflectancia infrarroja difusa). Se usó un sistema de recogida Spectra-Tech y una taza de micromuestra. Las muestras (5%) se analizaron en bromuro de potasio y se exploraron de 400-4000 cm"1. El espectro de absorción infrarrojo de la epierenona en una solución de cloroformo diluido (3%) o de las formas cristalinas solvatadas se obtuvo con un espectrofotómetro Bio-Rad FTS-45. Las muestras en solución de cloroformo se analizaron usando una celda de solución de 0.2 mm de recorrido con placas de la sal cloruro sódico. Los espectros FTIR de solvato se recogieron usando un accesorio micro-MIR de LBJM_(multiple reflectancia interna). Las muestras se barrieron de 400-4000 cm" . En las figuras 3-A, 3-B, 3-C y 3-D se muestran ejemplos de los espectros de absorción infrarrojos de (a) Forma H, (b) Forma L, (c) el solvato de metiletilcetona y (d) eplerenona en solución de cloroformo, respectivamente. El cuadro 2 muestra bandas ilustrativas de absorción de la eplerenona en Forma H, Forma L y formas cristalinas del solvato de metiletilcetona. También se describen bandas ilustrativas de absorción de la eplerenona en solución de cloroformo como comparación. Por ejemplo, se observaron diferencias entre la Forma H y la Forma L o el solvato de metiletilcetona en la región carbonilo del espectro. La Forma H tenía una frecuencia de vibración stretching del carbonilo del éster de aproximadamente 1739 cm'1 mientras que la Forma L y el solvato de metiletilcetona tenían una frecuencia de vibración stretching correspondiente de aproximadamente 1724 y 1722 cm"1, respectivamente. La frecuencia de vibración stretching del carbonilo del éster tiene lugar aproximadamente a 1727 cm"1 en la eplerenona en solución de cloroformo. El cambio en la frecuencia de vibración stretching del carbonilo del éster entre la Forma H y la Forma L refleja el cambio en la orientación del grupo éster entre las dos formas cristalinas. Además, la frecuencia de vibración stretching del éster de la cetona conjugada en el anillo A-esteroide cambia de aproximadamente 1664-1667 cm"1 en la forma H o el solvato de metiletilcetona a aproximadamente 1655 cm"1 en la Forma L. La vibración stretching correspondiente de carbonilo tiene lugar a aproximadamente 1665 cm"1 en la solución diluida. Otra diferencia entre la Forma H y la Forma L se observó en la región de vibración stretching C-H. La Forma H tiene una absorción a aproximadamente 1399 cm"1 que no se observa en la Forma L, el solvato de metiletilcetona o en la epierenona en solución de cloroformo. La frecuencia de vibración stretching a 1399 cm"1 tiene lugar en la región de CH2 que separa los grupos metileno C2 y C21 adyacentes a los grupos carbonilo. 5. Resonancia magnética nuclear El espectro 13C RMN se obtuvo en un campo de 31.94 MHz. En las figuras 4 y 5 respectivamente se muestran ejemplos de los espectros 13C RMN de la Forma H y Forma L de epierenona. La Forma H de epierenona analizada para obtener los datos reflejados en la figura 4 no era de fase pura e incluía una pequeña cantidad de epierenona de Forma L. La Forma H se distingue más claramente por las resonancias del carbono a aproximadamente 64.8 ppm, 24.7 ppm y 19.2 ppm. La Forma L se distingue más claramente por las resonancias del carbono a aproximadamente 67.1 ppm y 16.0 ppm. 6. Termogravimetría Se realizaron análisis termogravimétricos de los solvatos usando un analizador termogravimétrico de TA Instruments TGA 2950. Las muestras se colocaron en un recipiente de aluminio no cerrado herméticamente bajo una purga de nitrógeno. La temperatura inicial fue 25°C, aumentando la temperatura a una velocidad de aproximadamente 10°C/minuto. En la figura 6- A se muestra un ejemplo del perfil del análisis de termogravimetría para el solvato de metiletilcetona. 7. Parámetros de celda unitaria A continuación, en los cuadros 3A, 3B y 3C se resumen los parámetros de celda unitaria calculados para la Forma H, la Forma L y varias formas cristalinas solvatadas.

CUADRO 3A CUADRO 3B 1 Las moléculas del solvato no estaban completamente refinadas debido al desorden de las moléculas de disolvente en los canales.

CUADRO 3C 1 Las moléculas del solvato no estaban completamente refinadas debido al desorden de las moléculas de disolvente en los canales. A continuación, en el cuadro 4 se presenta información adicional de las formas cristalinas solvatadas de epierenona seleccionadas. Los datos de celda unitaria presentados en el cuadro 3A anterior del solvato de metiletilcetona son también representativos de los parámetros de celda unitaria de muchos de estos solvatos cristalinos de epierenona adicionales. La mayoría de los solvatos cristalinos de epierenona ensayados son sustancialmente ¡soestructu rales entre sí. Aunque puede haber algunos cambios menores en los picos de difracción en polvo de rayos X de una forma cristalina solvatada a otra debido al tamaño de las moléculas del disolvente incorporado, los patrones de difracción son, en general, sustancialmente iguales y los parámetros de celda unitaria y posiciones moleculares son sustancialmente idénticos para la mayoría de los solvatos ensayados.

CUADRO 4 1 Definida como la temperatura de desolvatación extrapolada de la etapa final de pérdida de peso de disolvente determinada por análisis termogravimétrico a una velocidad de calentamiento de 10°C/minuto bajo una purga de nitrógeno. Sin embargo, las temperaturas de desolvatación puedep_vers,a afectadas por el procedimiento de fabricación del solvato. Distintos procedimientos pueden producir distinto número de lugares de nucleación capaces de iniciar la desolvatación en el solvato a menores temperaturas. La celda unitaria del solvato se compone de cuatro moléculas de epierenona. La estequiometría de las moléculas de epierenona y las moléculas de disolvente en la celda unitaria se presenta también en el cuadro 4 anterior para varios solvatos. La celda unitaria de la Forma H se compone de cuatro moléculas de epierenona. La celda unitaria de la Forma L se compone de dos moléculas de epierenona. Las celdas unitarias de solvato se transforman durante la desolvatación en celdas unitarias de Forma H y/o Forma L cuando las moléculas de epierenona experimentan traslación y rotación para rellenar los espacios dejados por las moléculas del disolvente. En el cuadro 4, también se presentan las temperaturas de desolvatación para varios solvatos distintos. 8. Propiedades Cristalinas de las Moléculas de Impureza. Algunas impurezas seleccionadas en la epierenona pueden inducir la formación de Forma H durante la desolvatación del solvato. En particular, se evaluó el efecto de las dos siguientes moléculas de impurezas: hidrógeno 4a,5a:9",1 1 a-diepoxi-17-hidroxi-3-oxo-17a-pregnano-7a,21 -dicarboxilato de 7-metilo, ?-lactona 3 (el "diepóxido"); e hidrógeno 11a,12a-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17a-pregn-4-en-7",21-dicarboxilato de 7-metilo, ?-lactooa- el - -2-epó-xido"), El efecto de estas moléculas de impurezas en la forma cristalina de la epierenona resultante de la desolvatación se describe con más detalle en los ejemplos de esta solicitud. Dada la similitud en la estructura de un solo cristal de hidrógeno 17-hidroxi-3-oxo-17"-pregna-4,9(1 1 )-dien-7a,21-dicarboxilato de 7-metilo, lactona 5 (la "9,1 1-olefina") y la Forma H, se toma como hipótesis que la 9,1 1- olefina también puede inducir la formación de Forma H durante la desolvatación del solvato.

El diepóxido. 1 1 ,12-olefina y 9.1 1-olefina pueden prepararse como se describe a continuación, por ejemplo, en los ejemplos 47C, 47B y 37H de Ng y col., W098/25948, respectivamente. Se aisló una única forma cristalina de cada compuesto de impureza. En las figuras 9, 10 y 1 1 se dan patrones de difracción en polvo de rayos X representativos de las formas cristalinas aisladas del diepóxido, 11 ,12-epóxido y 9,1 1-olefina, respectivamente. El patrón de difracción en polvo de rayos X de cada molécula de impureza es similar al patrón de difracción en polvo de rayos X de la Forma H, sugiriendo que la Forma H y los tres compuestos de impurezas tienen estructuras cristalinas similares. También se aislaron cristales individuales de cada compuesto de impureza y se sometieron a determinación de estructura con rayos X para verificar que estos tres compuestos adoptan estructuras cristalinas similares a la de la Forma H. Los cristales individuales del diepóxido se aislaron de metiletilcetona. Los cristales individuales del 1 1 ,12-epóxido se aislaron de isopropanol. Los cristales individuales de la 9,1 1-olefina se aislaron de n-butanol. Los datos de estructura cristalina determinados para la forma cristalina de cada impureza se dan en el cuadro 5. El sistema cristalino resultante y los parámetros de celda fueron sustancialmente iguales para las formas cristalinas Forma H, diepóxido, 1 1 ,12-epóxido, y 9,1 1-olefina.

CUADRO 5 Los cuatro compuestos presentados en el cuadro 5 cristalizan en el mismo grupo espacial y tienen parámetros de celda similares (es decir, son isoestructurales). Se toma como hipótesis que el diepóxido, 11 ,12-epóxido y 9,11 -olefina presentan una conformación de Forma H. La relativa facilidad de aislamiento de un empaquetamiento de Forma H (directamente de la solución) de cada compuesto de impureza, indica que la red de la Forma H es un modo de empaquetamiento estable para esta serie de compuestos estructuralmente similares.

Preparación de la Eplerenona El material de partida de eplerenona usado para preparar las nuevas formas cristalinas de la presente invención se puede preparar usando los procedimientos descritos en Ng y col., WO97/21720; y Ng y col., W098/25948, particularmente en el esquema 1 descrito en WO97/21720 y W098/25948.

Preparación de Formas Cristalinas 1 . Preparación de Forma Cristalina Solvatada Las formas cristalinas solvatadas de la eplerenona se pueden preparar por cristalización de eplerenona con un disolvente adecuado o mezcla de disolventes adecuados. Un disolvente adecuado o mezcla de disolventes adecuados comprende generalmente un disolvente orgánico o mezcla de disolventes orgánicos que solubiliza la eplerenona junto con cualquier impureza a una temperatura elevada, pero al enfriarse, preferiblemente cristaliza el solvato. La solubilidad de la eplerenona en tal disolvente o mezcla de disolventes es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 mg/ml a temperatura ambiente. El disolvente o mezcla de disolventes se selecciona preferiblemente entre los disolventes usados previamente en el proceso para preparar el material de partida de eplerenona, particularmente aquellos disolventes que serían farmacéuticamente aceptable si estuviesen contenidos en la composición farmacéutica final que comprende la forma cristalina de eplerenona. Por ejemplo, un sistema disolvente que comprende cloruro de metileno que prod ce_ m_ solv^o_que_co^^ no_es_- deseable. Cada uno de los disolventes usados es preferiblemente un disolvente farmacéuticamente aceptable, particularmente un disolvente de Clase 2 o de Clase 3 como se define en "Impurities: Guideline For Residual Solvents", Conferencia Internacional de Harmonización de Requerimientos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos de Uso en Seres Humanos (Recomendado para adopción en la Etapa 4 del Proceso ICH el 17 de Julio de 1997 por el ICH Steering Committee). Aún más preferiblemente, el disolvente o mezcla de disolventes se selecciona entre el grupo compuesto por metiletilcetona, 1 -propanol, 2-pentanona, ácido acético, acetona, acetato de butilo, cloroformo, etanol, isobutanol acetato de isobutilo, acetato de metilo, propionato de etilo, n-butanol, n-octanol, ¡sopropanol, acetato de propilo, propilenglicol, t-butanol, tetrahidrofurano, tolueno, metanol y acetato de t-butilo. Aún más preferiblemente, el disolvente se selecciona entre el grupo compuesto por metiletilcetona y etanol. Para preparar la forma cristalina solvatada de eplerenona, se solubiliza una cantidad del material de partida de eplerenona en un volumen del disolvente y se enfría hasta que se forman cristales. La temperatura del disolvente a la que se añade la eplerenona al disolvente se seleccionará generalmente en base a la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, la temperatura del disolvente es normalmente de al menos apm*iiiiajiamanie_25^ de ebullición del disolvente, v más preferiblemente de aproximadamente 25°C por debajo del punto de ebullición del disolvente al punto de ebullición del disolvente. Alternativamente, puede añadirse disolvente caliente a la epierenona y refrigerar la mezcla hasta que se forman cristales. La temperatura del disolvente en el momento en que se añade a la epierenona en este momento se seleccionará en base a la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, la temperatura del disolvente es típicamente al menos 25°C, preferiblemente de aproximadamente 50°C al punto de ebullición del disolvente y más preferiblemente de aproximadamente 15°C por debajo del punto de ebullición del disolvente al punto de ebullición del disolvente. La cantidad de material de partida de epierenona mezclada con un volumen dado de disolvente dependerá igualmente de la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Normalmente, la cantidad de epierenona añadida al disolvente no se solubilizará completamente en ese volumen de disolvente a temperatura ambiente. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, la cantidad de material de partida de epierenona mezclada con un volumen dado de disolvente es normalmente de al menos aproximadamente 1.5 a aproximadamente 4.0 veces, preferiblemente de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 3.5 veces, y más preferiblemente aproximadamente 2.5 veces, la cantidad de_ eplerenona que se solubilizará en ese volumen de disolvente a temperatura ambiente. Después de que el material de partida de eplerenona se ha solubilizado completamente en el disolvente, normalmente la solución se enfría despacio para cristalizar la forma cristalina solvatada de eplerenona. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, la solución se enfría a una velocidad menor de aproximadamente 20°C/minuto, preferiblemente a una velocidad de aproximadamente 10°C/minutos o más lenta, más preferiblemente a una velocidad de aproximadamente 5°C/minuto o más lenta, y aún más preferiblemente a una velocidad de aproximadamente 1°C/minuto o más lenta. La temperatura final a la que se recoge la forma cristalina solvatada dependerá de la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, la temperatura final es normalmente menor de aproximadamente 25°C, preferiblemente menos de aproximadamente 5°C, y más preferiblemente menos de aproximadamente -5°C. Reducir la temperatura final generalmente favorece la formación de forma cristalina solvatada. Alternativamente, pueden usarse otras técnicas para preparar el solvato. Algunos ejemplos de tales técnicas incluyen, sin limitación, (i) disolver el material de partida de eplerenona en un disolvente y añadir un disolvente complementario para ayudar en la cristalización de la forma cristalina del solvato, (ii) crecimiento por difusión de vapor del solvato, (iii) aislamiento del solvato por evaporación, tal como evaporació por rotación, y C'v transformación de la suspensión. Los cristales de la forma cristalina solvatada preparada como se ha descrito anteriormente se pueden separar del disolvente por cualquier medio convencional tal como por filtración o centrifugación. Una mayor agitación del sistema disolvente durante la cristalización tiene como resultado generalmente un menor tamaño de las partículas de cristal. 2. Preparación de la Forma L con Solvato La eplerenona de Forma L puede prepararse directamente de la forma cristalina solvatada por desolvatación. La desolvatación puede realizarse por cualquier medio de desolvatación convencional tal como, pero sin limitación, calentar el solvato, reducir la presión ambiente alrededor del solvato o combinaciones de las mismas. Si se calienta el solvato para retirar el disolvente, como por ejemplo en un horno, la temperatura del solvato durante el proceso normalmente no excede la temperatura enantiotrópica de transición para la Forma H y la Forma L. Esta temperatura preferiblemente no excede aproximadamente 150°C. La presión de desolvatación y el tiempo de desolvatación no son críticos. La presión de desolvatación es aproximadamente 1 atmósfera o menos. Sin embargo, sí se reduce la presión de desolvatación, la temperatura a la que puede realizarse la desolvatación y/o el tiempo de desolvatación se reducen igualmente — Barticulairaente, _paca- los_ solvatos coa- mayores temperaturas de desolvatacion, secar al vacío permitirá el uso de temperaturas de secado menores. El tiempo de desolvatacion sólo tiene que ser el suficiente para permitir la desolvatacion, y por tanto que termine la formación de la Forma L. Para asegurar la preparación de un producto que comprende sustancialmente sólo Forma L, el material de partida de eplerenona es normalmente una eplerenona de alta pureza, preferiblemente eplerenona sustancialmente pura. El material de partida de eplerenona usado para preparar eplerenona en Forma L es al menos 90% puro, preferiblemente al menos 95% puro, y más preferiblemente al menos 99% puro. Como se discute en más detalle en otro apartado de esta solicitud, ciertas impurezas en el material de partida pueden afectar de forma adversa la producción y el contenido en Forma L del producto obtenido con el proceso. El producto de eplerenona cristalizada preparado de esta forma con un material de partida de eplerenona de alta pureza comprende generalmente al menos 10% de Forma L, preferiblemente al menos 50% de Forma L, más preferiblemente al menos 75% de Forma L, aún más preferiblemente al menos 90% de Forma L, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de Forma L y aún más preferiblemente sustancialmente Forma L de fase pura. 3. Preparación de Forma H con Solvato Se puede preparar un producto que comprende Forma H sustancialmente de la misma manera descrita anteriormente para la preparación de la Forma L (i) usando un material de partida de eplerenona de baja pureza en lugar de un material de partida de eplerenona de alta pureza, (¡i) sembrando el sistema disolvente con cristales de Forma H en fase pura o (iii) una combinación de (i) y (ii).

A. Uso de impurezas como promotores e inhibidores del crecimiento La presencia y cantidad de impurezas seleccionadas en el material de partida de eplerenona, más que la cantidad total de todas las impurezas en el material de partida de eplerenona, afectan al potencial de formación de Forma H durante la desolvatación del solvato. La impureza seleccionada es generalmente un promotor del crecimiento de la Forma H o un inhibidor de crecimiento de la Forma L. Puede contenerse en el material de partida de eplerenona, contenerse en el disolvente o mezcla de disolventes antes de añadir el material de partida de eplerenona y/o añadirse al disolvente o mezcla de disolventes después de añadir el material de partida de eplerenona. Bonafede et al., "Selective Nucleation and Growth of an Organic Polymorph by Ledge-Directed Epitaxy on a Molecular Crystal Substrate", ¡ Amer. Chem. Soc, Vol. 1 17, No. 30 (2 de Agosto de 1995) discute el uso de promotores e inhibidores de crecimiento en sistemas polimorfos y se incorpo_ra_ por referencia en este documento. En la presente invención, la impureza comprende generalmente un compuesto con una única estructura de cristal sustancialmente idéntica a la estructura única de cristal de la Forma H. La impureza es preferiblemente un compuesto con un patrón de difracción en polvo de rayos X sustancialmente idéntico al patrón de difracción en polvo de rayos X de la Forma H, y más preferiblemente se selecciona entre el grupo compuesto por el diepóxido, el 1 1 ,12-epóxido, la 9,1 1 -olefina y combinaciones de las mismas. La cantidad de impureza que se necesita para preparar cristales de Forma H puede depender típicamente, en parte, del disolvente o mezcla de disolventes y de la solubilidad de la impureza en relación a la eplerenona. En la cristalización de la Forma H con un disolvente de metiletilcetona, por ejemplo, la relación en peso del diepóxido con el material de partida de eplerenona de baja pureza es normalmente de al menos 1 :100, preferiblemente al menos aproximadamente 3:100, más preferiblemente entre aproximadamente 3:100 y aproximadamente 1 :5, y aún más preferiblemente entre 3:100 y aproximadamente 1 :10. El 11 ,12-epóxido tiene una mayor solubilidad en metiletilcetona que el diepóxido y generalmente requiere una mayor cantidad de 1 1 ,12-epóxido necesario para preparar cristales de Forma H. Cuando la impureza comprende el 1 1 ,12-epóxido, la relación en peso del diepóxido con el material de partida de eplerenona de baja pureza es normalmente de al menos aproximadamente 1 :5, más preferiblemente al menos aproximadamente 3:25. y aún más aproximadamente entre aproximadamente 3:25 y aproximadamente 1 :5. Cuando se usan tanto el diepóxido como el 11 ,12-epóxido en la preparación de los cristales de Forma H, la relación en peso de cada impureza con el material de partida de eplerenona puede ser menor que la relación correspondiente cuando sólo se usa esa impureza en la preparación de cristales de Forma H. Generalmente, se obtiene una mezcla de Forma H y Forma L cuando se desolvata un solvato que comprende la impureza seleccionada. La fracción en peso de Forma H en el producto resultante de la desolvatación inicial del solvato es normalmente menor de aproximadamente 50%. El tratamiento posterior de este producto por cristalización o digestión, como se discute a continuación, aumentará generalmente la fracción en peso de Forma L en el producto.

B. Siembra Los cristales de Forma H también pueden prepararse sembrando el sistema disolvente con cristales de Forma H en fase pura (o un promotor de crecimiento de Forma H y/o un inhibidor de crecimiento de Forma L como se ha discutido anteriormente) antes de la cristalización de la eplerenona. El material de partida de eplerenona puede ser una eplerenona de baja pureza o una eplerenona de alta pureza. Cuando se desolvata el solvato resultante preparado con uno u otro material de partida, la fracción en peso de Forma H en el producto es normalmente al menos aproximadamente un 70% y puede La relación en peso de cristales de siembra de Forma H añadidos al sistema disolvente al material de partida de eplerenona añadido al sistema disolvente es de al menos aproximadamente 0.75:100, preferiblemente entre aproximadamente 0.75:100 a aproximadamente 1 :20, y más preferiblemente entre aproximadamente 1 :100 a aproximadamente 1 :50. Los cristales Forma H de siembra pueden prepararse por cualquiera de los procedimientos descritos en esta solicitud para la preparación de cristales de Forma H, particularmente la preparación de cristales de Forma H por digestión como se discute más adelante. Los cristales de siembra de Forma H pueden añadirse de una vez, en múltiples adiciones o de forma sustancialmente continúa durante un periodo de tiempo. Sin embargo, la adición de cristales de siembra de Forma H se completa generalmente antes de que la eplerenona comience a cristalizar en la solución, es decir, el sembrado se completa ante de alcanzar el punto de enturbiamiento (el extremo inferior de la zona metaestable). El sembrado se realiza normalmente cuando la temperatura de la solución varía desde aproximadamente 0.5°C por encima del punto de enturbiamiento a aproximadamente 10°C por encima del punto de enturbiamiento, preferiblemente entre aproximadamente 2°C a aproximadamente 3°C por encima del punto de enturbiamiento. Según aumenta la temperatura por encima del punto de enturbiamiento a la que se añaden las semillas, aumenta generalmente la cantidad de siembra que se necesita para la cristalización de cristales de Forma H.

El sembrado tiene lugar preferiblemente no sólo por encima del punto de enturbiamiento, sino dentro de la zona metaestable. El punto de enturbiamiento y la zona metaestable dependen de la solubilidad y concentración de la eplerenona en el disolvente o mezcla de disolventes. Para una dilución de 12 volúmenes de metiletilcetona, por ejemplo, el extremo superior de la zona metaestable está generalmente entre aproximadamente 70°C y aproximadamente 73°C y el extremo inferior de la zona metaestable (es decir, el punto de enturbiamiento) está entre aproximadamente 57°C y 63°C. Para una concentración de 8 volúmenes de metiletilcetona, la zona metaestable es incluso más estrecha porque la solución está sobresaturada. A esta concentración, el punto de enturbiamiento de la solución tiene lugar de aproximadamente 75°C a aproximadamente 76°C. Como el punto de ebullición de la metiletilcetona es aproximadamente 80°C en condiciones ambiente, el sembrado para esta solución tiene lugar normalmente entre aproximadamente 76.5°C y el punto de ebullición. En el ejemplo 7 se describe un ejemplo ilustrativo no limitante de siembra con Forma H. El producto de eplerenona cristalizada obtenido usando un promotor de crecimiento de Forma H o un inhibidor de crecimiento de Forma L, y/o sembrado de Forma H comprende generalmente al menos 2% de Forma H, preferiblemente al menos 5% de Forma H, más preferiblemente al menos 7% de Forma H, y aún más preferiblemente al menos aproximadamente 10_%_de Eorma H_Genexalmente,^Lpioductojd.e_epierenona^ cristalizada restante es Forma L.

C. Forma H preparada triturando epierenona En otra alternativa más, se ha descubierto que se puede preparar una pequeña cantidad de Forma H triturando adecuadamente epierenona. Se han observado concentraciones de Forma H en epierenona triturada tan altas como de aproximadamente 3%. 4. Preparación de Forma L con solvato preparado con epierenona de baja pureza Como se ha discutido anteriormente, la cristalización de epierenona de baja pureza para formar un solvato seguido de desolvatacion del solvato produce generalmente un producto que comprende Forma H y Forma L. Se puede preparar un producto con un mayor contenido de Forma L con epierenona de baja pureza sustancialmente de la misma manera como la que se ha descrito anteriormente para la preparación de Forma H sembrando el sistema disolvente con cristales de Forma L en fase pura, o usando un promotor de crecimiento de Forma L y/o un inhibidor de crecimiento de Forma H. El protocolo de siembra y la relación en peso de la cantidad de cristales de siembra de Forma L añadidos al sistema disolvente a la cantidad de material de partida de epierenona añadida al sistema disolvente son generalmente similares a las relaciones descritas previamente para la preparación de epierenona de Forma H sembrando con cristales de Forma H en fase pura.

El producto cristalizado de epierenona preparado de esta manera comprende generalmente al menos 10% de Forma L, preferiblemente al menos 50% de Forma L, más preferiblemente al menos 75% de Forma L, más preferiblemente al menos 90% de Forma L, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de Forma L, y aún más preferiblemente Forma L sustancialmente en fase pura. Los protocolos de siembra descritos en esta sección y en la sección anterior respecto a la preparación de epierenona en Forma H pueden permitir también un mejor control del tamaño de partícula de la epierenona cristalizada. 5. Cristalización de Forma L directamente de la solución También se puede preparar epierenona en Forma L por cristalización directa de epierenona en un disolvente o mezcla de disolventes adecuada sin la formación de un solvato intermedio y por tanto sin la necesidad de desolvatar. Normalmente, (i) el disolvente tiene un tamaño molecular que es incompatible con el espacio de canal disponible en la red cristalina del solvato, (ii) la epierenona y las impurezas son solubles en el disolvente a elevadas temperaturas, y (iii) al enfriarse, se obtiene como resultado la cristalización de la epierenona no solvatada de Forma L. La solubilidad de la epierenona en el disolvente o mezcla de disolventes es generalmente de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 mg/ml a tempjsmtujra^jmta^ preferiblemente uno o más disolventes seleccionados entre el grupo compuesto por metanol, acetato de etilo, acetato de isopropilo, acetonitrilo, nitrobenceno, agua y etilbenceno. Para cristalizar la epierenona de Forma L directamente en la solución, se solubiliza una cantidad del material de partida de epierenona en un volumen del disolvente y se enfría hasta que se forman cristales. La temperatura del disolvente a la que se añade la epierenona al disolvente se seleccionará generalmente en base a la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, esta temperatura del disolventes es normalmente de al menos aproximadamente 25°C, preferiblemente de aproximadamente 30°C al punto de ebullición del disolvente, y más preferiblemente de aproximadamente 25°C por debajo del punto de ebullición del disolvente al punto de ebullición del disolvente. De forma alternativa, se puede añadir disolvente caliente a la epierenona y se puede enfriar la mezcla hasta que se forman cristales. La temperatura del disolvente en el momento en el que se añade a la epierenona se seleccionará generalmente en base a la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, la temperatura del disolvente es normalmente de al menos 25°C, preferiblemente de aproximadamente 50°C al punto de ebullición del disolvente y más preferiblemente de aproximadamente 15°C por debajo del punto de ebullición del disolvente al punto de e bidlición jdel jd i soLve n te La cantidad de material de partida de epierenona mezclada con un volumen dado de disolvente dependerá igualmente de la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Normalmente, la cantidad de epierenona añadida al disolvente no se solubilizará completamente en ese 5 volumen de disolvente a temperatura ambiente. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, la cantidad de material de partida de epierenona mezclada con un volumen dado de disolvente es normalmente de al menos aproximadamente 1 .5 a aproximadamente 4.0 veces, preferiblemente de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 3.5 10 veces, y más preferiblemente aproximadamente 2.5 veces, la cantidad de epierenona que se solubilizará en ese volumen de disolvente a temperatura ambiente. Para asegurar la preparación de un producto que comprende Forma L en fase sustancialmente pura, el material de partida de epierenona 15 es generalmente una epierenona de alta pureza. El material de partida de epierenona es preferiblemente al menos 65% puro, más preferiblemente al menos 90% puro, aún más preferiblemente al menos 98% puro, y aún más preferiblemente al menos 99% puro. Después de que el material de partida de epierenona se ha 20 solubilizado completamente en el disolvente, normalmente la solución se enfría despacio para cristalizar la forma cristalina solvatada de epierenona. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, por ejemplo, - . la solución se enfría a_ una _ j_eloj3jdad_men.or__cLe aproximadamente- 1.0°C/minuto, preferiblemente a una velocidad de aproximadamente 0.2°C/minutos o más lenta, más preferiblemente a una velocidad de entre aproximadamente 5°C/minuto y aproximadamente 0.1°C/minuto. La temperatura final a la que se recogen los cristales de la Forma L dependerá de la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, la temperatura final es normalmente menos de aproximadamente 25°C, preferiblemente menos de aproximadamente 5°C, y más preferiblemente menos de aproximadamente -5°C. Alternativamente, se pueden usar otras técnicas para preparar los cristales de Forma L. Algunos ejemplos de tales técnicas incluyen, sin limitación, (i) disolver el material de partida de epierenona en un disolvente y añadir un disolvente complementario para ayudar en la cristalización de la epierenona en Forma L, (ii) crecimiento por difusión de vapor de epierenona en Forma L, (iii) aislamiento de epierenona en Forma L por evaporación, tal como evaporación por rotación, y (iv) transformación de la suspensión. Los cristales de la forma cristalina solvatada preparada como se ha descrito anteriormente §e pueden separar del disolvente por cualquier medio convencional tal como por filtración o centrifugación. Además, también se puede preparar epierenona en Forma L digiriendo (como se describe a continuación) una suspensión de epierenona de alta pureza en metiletilcetona y filtrando la epierenona digerida al punto de ebullición de la suspensión. 6. Preparación de Forma H directamente a partir de la solución Se toma como hipótesis que si la cristalización se realiza por encima de la temperatura enantiotrópica de transición (Tt) de la Forma H y Forma L, particularmente si hay presentes promotores de crecimiento de Forma H y/o inhibidores de crecimiento de Forma L o si el disolvente se ha sembrado con cristales de Forma H en fase pura, la Forma H debería cristalizar directamente en la solución ya que la Forma H es más estable a estas altas temperaturas. El sistema disolvente usado comprende preferiblemente un disolvente de alto punto de ebullición tal como nitrobenceno. Los promotores de crecimiento de Forma H incluirían, sin limitación, el diepóxido y la 1 1 ,12-olefina. 7. Digestión de epierenona con un disolvente También se pueden preparar las formas cristalinas solvatadas, la Forma H y la Forma L de epierenona por digestión de un material de partida de epierenona en un disolvente o mezcla de disolventes adecuada. En este proceso de digestión, se calienta una suspensión de epierenona al punto de ebullición del disolvente o mezcla de disolventes. Por ejemplo, una cantidad de material de partida de epierenona se combina con un volumen de disolvente o mezcla de disolventes, se calienta a reflujo, y el destilado se retira mientras se añade una cantidad adicional de disolvente de forma simultánea con la retirada del destilado. Alternativamente, el destilado se puede condensar y reciclarse sin adición de más disolvente durante el proceso de digestión. Normalmente, una vez que se ha retirado o condensado y reciclado el volumen original de disolvente, la suspensión se enfría y se forman cristales solvatados. Los cristales solvatados se pueden separar del disolvente por cualquier medio convencional adecuado tal como por filtración o centrifugación. La desolvatación del solvato como se ha descrito previamente produce eplerenona en Forma H o en Forma L dependiendo de la presencia o ausencia de impurezas seleccionadas en los cristales solvatados. Un disolvente o mezcla de disolventes adecuada comprende generalmente uno o más de los disolventes descritos previamente en este documento. El disolvente puede seleccionarse, por ejemplo, entre el grupo compuesto por metiletilcetona y etanol. La cantidad de material de partida de eplerenona añadida al disolvente usada en el proceso de digestión es generalmente suficiente para mantener una suspensión (es decir, la eplerenona no está completamente solubilizada en el disolvente o mezcla de disolventes) al punto de ebullición del disolvente o mezcla de disolventes. Los valores ilustrativos incluyen, sin limitación, aproximadamente un gramo de eplerenona por cuatro mi de metiletilcetona y aproximadamente un gramo de eplerenona por ocho mi de etanol. Generalmente, la solución se enfría lentamente una vez se completa el intercambio del disolvente para que cristalice la forma cristalina solvatada de eplerenona. Por ejemplo, para los disolventes probados, la solución se enfría a una velocidad menor de aproximadamente 2Q°C/minuto, preferiblemente aproximadamente 10°C/minuto o más lenta, más preferiblemente aproximadamente 5°C/minuto o más lenta, y aún más preferiblemente aproximadamente 1°C/minuto o más lenta. La temperatura final a la que se recoge la forma cristalina solvatada dependerá de la curva de solubilidad del disolvente o mezcla de disolventes. Para la mayoría de los disolventes descritos en este documento, la temperatura final es normalmente menos de aproximadamente 25°C, preferiblemente menos de aproximadamente 5°C, y más preferiblemente menos de aproximadamente -5°C. Si se desea un producto que comprende principal o exclusivamente Forma L, normalmente se digiere un material de partida de eplerenona de alta pureza. El material de partida de eplerenona de alta pureza es al menos 98% puro, más preferiblemente al menos 99% puro, y aún más preferiblemente al menos 99.5% puro. El producto digerido de eplerenona preparado de esta manera comprende generalmente al menos 10% de Forma L, preferiblemente al menos 50% de Forma L, más preferiblemente al menos 75% de Forma L, más preferiblemente al menos 90% de Forma L, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de Forma L y aún más preferiblemente Forma L en fase sustancialmente pura. Sí se desea un producto que comprende principal o exclusivamente Forma H, normalmente se digiere un material de partida de e I e re no n a_d e_haja_puxeza_ELmate rial de partida^de eplerenona-de~ baja pureza contiene generalmente sólo el promotor rfe nracimiftntn. rte Forma H y/a inhibidor de crecimiento de Forma L necesario para producir la Forma H. Preferiblemente, el material de partida de epierenona de baja pureza es al menos 65% puro, más preferiblemente al menos 75% puro, y aún más 5 preferiblemente al menos 80% puro. El producto digerido de epierenona preparado de esta manera comprende generalmente al menos 10% de Forma H, preferiblemente al menos 50% de Forma H, más preferiblemente al menos 75% de Forma H, más preferiblemente al menos 90% de Forma H, aún más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de Forma H y aún más 10 preferiblemente Forma H en fase sustancialmente pura. 8. Preparación de epierenona amorfa Se puede preparar epierenona amorfa en pequeñas cantidades mediante la trituración adecuada de epierenona sólida, tal como por 15 aplastamiento, trituración y/o micronización. La epierenona amorfa en fase pura se puede preparar, por ejemplo, liofilizando una solución de epierenona, particularmente una solución acuosa de epierenona. Estos procesos se ilustran a continuación en los ejemplos 13 y 14. 20 EJEMPLOS DE TRABAJO Los siguientes ejemplos contienen descripciones detalladas de _^Lo 3J^£iiiiiüej3tos_^ eplerenona descritas en esta solicitud Fstas Hftsr.ri nionfis detalladas caen dentro del alcance de la invención, y sirven para ejemplificar la invención. Estas descripciones detalladas se presentan con propósito ilustrativo y no pretenden restringir el alcance de la invención. Todas las partes son en peso y las temperaturas en grados Centígrados a menos que se indique lo contrario. El material de partida de eplerenona usado en cada uno de los siguientes ejemplos se preparó de acuerdo con el esquema 1 descrito en Ng y col., W098/25948.

EJEMPL0 Preparación de (a) solvato de metiletilcetona con material de partida de eplerenona de alta pureza y (b) eplerenona en Forma L cristalina con el solvato resultante A. Preparación del solvato de metiletilcetona: Se disolvió eplerenona de alta pureza (437 mg; pureza mayor de 99% con menos de 0.2% de diepóxido y 1 1 ,12-epóxido presente) en 10 mi de metiletilcetona calentando a ebullición en una placa caliente con agitación magnética a 900 rpm. La solución resultante se dejó enfriar a temperatura ambiente con agitación magnética continua. Una vez a temperatura ambiente, la solución se traspasó a un baño a 1°C manteniendo la agitación durante una hora. Después de una hora, el solvato de metiletilcetona se recogió por filtración al vacío- B. Preparación de eplerenona cristalina en FoimaJ- El solvato sólido de metiletilcetona preparado en la etapa A anterior se secó en un horno a 100°C durante cuatro horas a presión ambiente. Se determinó que el sólido seco era Forma L por análisis CBD y XPRD.

EJEMPLO 2 Preparación de solvatos adicionales con material de partida de eplerenona de alta pureza Se prepararon más formas solvatadas cristalinas sustituyendo la metiletilcetona con uno de los siguientes disolventes: /7-propanol, 2-pentanona, ácido acético, acetona, acetato de butilo, cloroformo, etanol, isobutanol, acetato de isobutilo, isopropanol, acetato de metilo, propionato de etilo, n-butanol, n-octanol, acetato de propilo, propilenglicol, f-butanol, tetrahidrofurano y tolueno y realizando la cristalización sustancialmente como se describe en la etapa A anterior del ejemplo 1. La eplerenona en Forma L se formó con cada uno de los solvatos sustancialmente como se describe en la etapa B del ejemplo 1.

EJEMPLO 3 Preparación de solvato de metiletilcetona por crecimiento por difusión de vapor Se disolvió eplerenona (400 mg; pureza mayor de 99.9%) en 20 mi de metiletilcetona calentando en una placa caliente para formar una solución madre. Se traspasó una cantidad de 8 mi de solución madre a un primer vial de escintilación de 20 mi y se diluyó a 10 mi con metiletilcetona (80%). Se traspasó una cantidad de 10 mi de solución madre a un segundo vial de escintilación de 20 mi y se diluyó a 10 mi con metiletilcetona (40%). Los 2 mi finales de solución madre se diluyeron a 10 mi con metiletilcetona (20%). Los cuatro viales que contenían las diluciones se traspasaron a una jarra desecadora que contenía una pequeña cantidad de hexano como antidisolvente. La jarra desecadora se cerró herméticamente y se dejó que el vapor de hexano se difundiera en las soluciones de metiletilcetona. En la muestra de dilución al 80% surgieron cristales de solvato de metiletilcetona al día siguiente.

EJEMPLO 4 Preparación de Solvato de Metiletilcetona por Evaporación Rotatoria Se pesan aproximadamente 400 mg de eplerenona (pureza mayor de 99,9%) en un matraz de 250 mLd_e_fondo_jrjedondjo__Se añade- disolvente (150 mi) al matraz y, si es necesario, la solución se calienta levemente hasta que el sólido se disuelve. La solución transparente resultante se coloca en un evaporador por rotación Buchi con una temperatura de baño de aproximadamente 85°C y el disolvente se retira al vacío. La retirada del disolvente se interrumpe cuando quedan aproximadamente 10 mi de disolvente en el matraz de fondo redondo. Los sólidos resultantes se analizan con un procedimiento apropiado (XPRD, CBD, TGA, microscopía, etc) para la determinación de la forma.

EJEMPLO 5 Transformación de la suspensión Se añadieron aproximadamente 150 mg de eplerenona en Forma L y 150 mg de eplerenona en Forma H a 5 mi de acetato de etilo. La suspensión resultante se dejó agitar a 300 rpm (agitación magnética) durante una noche. Al día siguiente se recogió una muestra del material sólido por filtración. Los análisis de la muestra por XPRD indicaron que la muestra estaba compuesta en su totalidad por eplerenona en Forma L.

EJEMPLO 6 Preparación de (a) solvato con un material de partida de epierenona de baja pureza y (o) epierenona en Forma H cristalina con el solvato resultante Se prepararon muestras que contenían distintas cantidades de la impureza hidrógeno 4a,5a:9a, 1 1 a-diepoxi-17-hidroxi-3-oxo-17a-pregnano-7 ,21 -dicarboxilato de 7-metilo, ?-lactona (el "diepóxido") o la impureza hidrógeno 1 1 a,12a-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-17a-pregn-4-en-7a,21 -dicarboxilato de 7-metilo, ?-lactona (el "1 1 , 12-epóxido") añadiendo la cantidad deseada de impureza a un vial de escintilación de 7 mi junto con una cantidad de epierenona suficiente para proporcionar una masa total de muestra de 100 mg. El porcentaje en peso de diepóxido o 1 ,12-epóxido en cada muestra se da en los cuadros X-6A y X-6B, respectivamente. Se añadió un agitador magnético de tipo micro-pulga a cada vial de escintilación junto con 1 mi de metiletilcetona. Los viales se cerraron de forma holgada y el sólido se disolvió calentando a reflujo en una placa caliente con agitación magnética. Una vez se disolvió el material sólido, las soluciones se dejaron enfriar a temperatura ambiente en la placa caliente. La agitación magnética se mantuvo durante el periodo de enfriamiento. Después de que las soluciones alcanzasen la temperatura ambiente, los sólidos se recogieron por filtración al vacío y se analizaron inmediatamente por difracción en polvo de rayos X (XPRD). Después, lüs~solídos sé~iñtrodujeron en un horno ~a ~X00°O y se secaron secos se analizó por XPRD controlando el área del pico de difracción de la Forma H a aproximadamente 12.1 grados dos-theta. Todos los patrones de difracción XPRD se registraron usando un Difractómetro Multipropósito Inel.

CUADRO X-6A CUADRO X-6B A. Resultados del Diepóxido La figura 13 muestra los patrones de rayos X de difracción en polvo de la torta húmeda (solvato de metiletilcetona) obtenida con cristalizaciones de metiletilcetona con impurezas de diepóxido al (a) 0%, (b) 1 %, (c) 3% y (d) 5%. Las intensidades de los picos se han normalizado para facilitar la comparación. No hay picos característicos de Forma H o del — diepóxido presentes en los patrones de difracción. Los — patrones son característicos del solvato de metiletilcetona de eplerenona. La figura 14 muestra los patrones de difracción de rayos X en polvo de los sólidos secos obtenidos con cristalizaciones de metiletilcetona con impurezas de diepóxido al (a) 0%, (b) 1 %, (c) 3% y (d) 5%. Las intensidades de los picos se han normalizado para facilitar la comparación. No se detectó Forma H en las muestras secas correspondientes a las cristalizaciones de metiletilcetona con niveles de impureza de 0 y 1 %. Se detectó Forma H en las muestras secas correspondientes a las cristalizaciones de metiletilcetona con niveles de dopaje de 3 y 5%. El área del pico de difracción de la Forma H a aproximadamente 12.1 grados dos theta y el contenido estimado de Forma H de cada muestra se da a continuación en el cuadro X-6C.

CUADRO X-6C Los resultados mostrados en el cuadro X-6C confirman que la presencia del diepóxido afecta la formación de Forma H durante la desolvatación. Estos resultados indican que el diepóxido es eficaz induciendo la formación de eplerenona en Forma H cuando se incorpora en y/o se adsorbe en los cristales de solvato de metiletilcetona. El experimento con 3% de impureza de diepóxido se repitió para analizar el impacto de la forma de preparación en la cantidad de Forma H formada durante la desolvatación. En este experimento, el solvato de metiletilcetona obtenido en la cristalización con impurezas se dividió en dos porciones. La primera porción de dejó sin tratar mientras que la segunda porción se trituró ligeramente en un mortero para inducir un mayor niveles de defectos en los cristales. Las dos porciones se secaron a 100°C durante una hora a presión ambiente. Los sólidos secos se analizaron por XPRD. En la figura 15 se dan Jos patrones XPRD para JLos _sólidos_ secos en las istaUzaciones coíw^etiJetiU^to a- c^^ triturar el solvato antes de secar, y (b) triturando el solvato antes de secar. Los patrones XPRD indicaron una mayor cantidad de Forma H en la muestra triturada en relación con la muestra no triturada. Estos resultados sugieren que las condiciones en las que el solvato de metiletilcetona se aisla y se manipula pueden afectar a la forma cristalina que se obtiene como resultado de la desolvatación.

B. Resultados del 1 1 ,12-epóxido La figura 16 muestra los patrones de difracción de rayos X en polvo de la torta húmeda (solvato de metiletilcetona) obtenida con cristalizaciones de metiletilcetona con impurezas de 11 ,12-epóxido al (a) 0%, (b) 1 %, (c) 5% y (d) 10%. Las intensidades de los picos se han normalizado para facilitar la comparación. No hay picos característicos de Forma H o de 11 ,12-epóxido presentes en los patrones de difracción. Los patrones son característicos del solvato de metiletilcetona de eplerenona. La figura 17 muestra los patrones de difracción de rayos X en polvo de los sólidos secos obtenidos con cristalizaciones de metiletilcetona con impurezas de 11 ,12-epóxido al (a) 0%, (b) 1 %, (c) 5% y (d) 10%. Las intensidades de los picos se han normalizado para facilitar la comparación. No se detectó Forma H en las muestras secas correspondientes a las cristalizaciones de metiletilcetona con niveles de impureza de 0, 1 % y 5%. Se detectó— For-ma — H— en — las — muestras — secas — correspondientes — a las alizaciones-de-meiiletUceio^ pico de difracción de la Forma H a 12,1 grados dos theta y el contenido estimado de Forma H de cada muestra se da a continuación en el cuadro X-6D.

CUADRO X-6D Los resultados mostrados en el cuadro X6D confirman que la presencia del 1 1 ,12-epóxido afecta a la formación de Forma H durante la desolvatación. El porcentaje de impureza en la cristalización de la metiletilcetona que se necesita para inducir la formación de eplerenona en Forma H parece ser mayor para el 1 1 ,12-epóxido que para el diepóxido.

EJEMPLO 7 Efecto de cristalización y secado en la forma final del cristal Se realizaron los siguientes cuatro experimentos que analizan el efecto de la cristalización y secado en la forma final del cristal: (i) cristalización en metiletilcetona de epierenona (diseño estadístico 23+3 del experimento), (ii) cristalización de residuo de aguas madres de baja calidad, (iii) cristalización de epierenona de alta pureza con sembrado de Forma H y (iv) cristalización de epierenona de baja pureza con siembra de Forma L. Las variables en el diseño del experimento incluían la velocidad de enfriamiento, nivel de pureza del material de partida, y temperatura final de cristalización. Para los propósitos de este ejemplo, epierenona de alta pureza se define como epierenona ultra-pura triturada (los análisis HPLC mostraron que este material era 100.8% puro) y epierenona de baja pureza se definió como epierenona pura al 89%, Para preparar la epierenona de baja pureza, se analizaron y eplerenona para producir un material que era 61.1 % epierenona, 12.8% diepóxido y 7.6% 1 1 ,12-epóxido. Después, este material se mezcló con una cantidad suficiente de epierenona de alta pureza para dar la epierenona al 89%.

A. Cristalización en metiletilcetona En el experimento de cristalización en metiletilcetona, todos los ensayos se realizaron usando 60 g de epierenona de alta pureza. La temperatura final superior se definió como 45°C y la temperatura final inferior se definió como 5°C. Velocidad de enfriamiento alta se definió como enfriamiento a 3°C/minuto y velocidad de enfriamiento baja se definió como enfriamiento a 0.1°C/minuto. Los puntos medios fueron enfriamiento a 1.5°C/minuto, epierenona pura al 94.5% y 25°C como temperatura final. Después de una lectura antecedente con el FTIR, se cargaron 250 mi de metiletilcetona en un reactor de 1 I Mettler RC-1 , MP10 y se agitó a 100 rpm. Después de varios barridos, se cargó la epierenona en el reactor seguida de 470 mi más de metiletilcetona. La agitación se incrementó a 500 rpm para suspender los sólidos y la temperatura del lote se aumentó a 80°C. La temperatura de lote se mantuvo a 80°C para asegurar la disolución de la epierenona. En la solución transparente resultante fueron generalmente visibles motas blancas o negras. Después, la temperatura de lote se redujo progresivamente -a4a velocidad deseada asta-la- emperatura-f4nal-deseadar donde se mantuvo durante una hora antes de traspasarse a un matraz de transferencia y filtrarse. Después, el reactor, el matraz de transferencia y la torta se lavaron con 120 mi de metiletilcetona. Una vez el lavado pasó a través de la torta, se interrumpió. Se secaron aproximadamente 10 g de cada torta húmeda en un horno de vacío en condiciones normales a 75°C con una ligera purga de nitrógeno. En los experimentos "alto, alto, alto" y "bajo, bajo, bajo" descritos a continuación, el secado en lecho fluido se realizó en condiciones altas y bajas. El secado en lecho fluido alto se definió como 100°C con ventilador a nivel "4" mientras que el secado en lecho fluido bajo se definió como 40°C con ventilador a nivel "1".

B. Cristalización de residuo de aguas madres de baja calidad En el experimento de cristalización de residuo de aguas madres de baja calidad, se cargaron 60 g del material puro al 61.1 % y 720 mi de metiletilcetona directamente en un reactor de 1 I ettler RC-1 , MP10. El material puro al 61.1 % no se mezcló con eplerenona de alta pureza antes de introducirse en el reactor. La mezcla resultante se calentó a 80°C y era una suspensión opaca a esa temperatura. La cristalización continuó y la mezcla se filtró a 45°C en condiciones de refrigeración rápida.

C. Sembrado de Forma H En el experimento de siembra de Forma H, se cargaron 60 g de eplerenona pura (100.8%) y 720 mi de OLeJLÜetilcelQnaj^^ Mettler RC-1 , MP10. La mezcla se calentó a 80°C y después se enfrió a 25°C a una velocidad de 1.5°C/minuto. Cuando la solución se había enfriado a 62°C, se sembró con 3 g de cristales de Forma H en fase pura para iniciar la cristalización. Los cristales de siembra de Forma L se prepararon con los procesos de digestión descritos a continuación en el ejemplo 9.

D. Sembrado de Forma L En el experimento de siembra de Forma L, se cargaron 66.6 g de epierenona al 89.3% (preparada mezclando 48.3 g de epierenona al 100% con 18.3 g de epierenona al 61.1 %) y 720 mi de metiletilcetona en un reactor de 1 I Mettler RC-1 , MP10. La mezcla se calentó a 80°C y después se enfrió a 25°C a una velocidad de 1 .5°C/minuto. Cuando la solución se había enfriado a 63°C, se sembró con 3 g de cristales de Forma L en fase pura para iniciar la cristalización. Los cristales de siembra de Forma L se prepararon con los procesos de cristalización y desolvatación descritos anteriormente en el ejemplo 1. Los resultados de los experimentos se presentan en el cuadro X-7A. En el experimento de cristalización n+1 , sólo se detectó Forma H en los experimentos que empleaban epierenona de baja pureza en los que el producto contenía el diepóxido. También se observaron altos niveles de diepóxido en el producto final con mayores velocidades de enfriamiento. El experimento de cristalización de residuo de aguas madres de baja calidad produjo un material de baja calidad que parecía ser_uDa_m.ezcla_ del diepóxído y Forma H al analizarse por difracción de rayos X en polvo. El experimento de siembra de Forma H (en el que se sembró epierenona de alta pureza con Forma H) produjo un producto que era 77% de Forma H basado en análisis de difracción de rayos X en polvo, pero Forma H en su totalidad por CBD. Sin embargo, no se había comprobado la linealídad del modelo de difracción de rayos X en polvo por encima de aproximadamente 15% de Forma H. Este fue el único experimento de los cuatro experimentos de este ejemplo en el que se creó Forma H en ausencia del diepóxido. El experimento de siembra de Forma L (en el que se sembró epierenona de baja pureza con Forma L) produjo un producto que era Forma L en su totalidad. Los datos obtenidos del secado en lecho fluido alto de la epierenona parecían corresponder a los datos obtenidos por secado en el horno de vacío. Los secados en lecho fluido bajo produjeron resultados que diferían de los de los secados en horno de vacío.

CUADRO X-7A co elocidad de enfriamiento: (+) = 3°C/min; (0) = 1.5°C/min; y (-) = 0.1 °C/min. 2 Punto de enfriamiento: (+) = 45°C; (0) = 25°C; y (-) =5°C- 2 Punto de enfriamiento: (+) = 45°C; (0) = 25°C; y (-) =5°C-^ Nivel de Impurezas: (+) = pureza del material de partida de eplerenona 89.3%; (++) = pureza del material de ¿plerenona 61.1 %; (0) = pureza del material de partida de eplerenona 100.8%; y (-) = pureza del material de ¿plerenona 94.5%. ? Porcentaje en peso después de secar el solvato en un horno de vacío a 75°C. Parece ser una mezcla de Forma H y diepóxido al analizarlo por XPRD. * Parece ser 77% de Forma H cuando se analiza por XPRD y 100% Forma H cuando se analiza por CBD.

Ar-PaTeza-del-Mateftal En la figura 18 se muestra un gráfico cúbico de pureza del producto, pureza del material de partida, velocidad de refrigeración y temperatura final en base a los datos presentados en el cuadro X-7A. El gráfico cúbico sugiere que el uso de un material de mayor pureza al inicio de la cristalización generará un producto mayor pureza. La temperatura en el punto final de la cristalización no parece afectar en gran medida a la pureza del producto. Sin embargo, la velocidad de enfriamiento parece tener efecto con un producto ligeramente menos puro obtenido como resultado de una mayor velocidad de enfriamiento. De hecho, el nivel de diepóxido fue generalmente mayor con velocidades de enfriamiento más altas. La figura 9 muestra un gráfico semi normal preparado usando el gráfico cúbico para determinar aquellas variables, si las hubiera, con un efecto estadísticamente significativo en la pureza del producto. La pureza del material de partida tenía el mayor efecto estadísticamente significativo en la pureza del producto, aunque se observó también la velocidad de enfriamiento y la interacción entre la velocidad de enfriamiento y la pureza del material de partida también como efectos estadísticamente significativos. La figura 20 muestra un gráfico de interacción basado en estos resultados que muestra la interacción entre la pureza del material de partida y la velocidad de refrigeración en la pureza del producto. Con la eplerenona de alta pureza (material de partida de eplerenona al 100,8%) la velocidad de erTfriam†en†o~parece-qt.e-tiene poeo-o-nulo-efecto-en - a-pufeza-GnaL-Sin al 83,3%) la pureza del material disminuye según aumenta la velocidad de enfriamiento. Este resultado sugiere que en las cristalizaciones de eplerenona realizadas a mayores velocidades de enfriamiento cristalizan más impurezas.

B. Contenido de Forma H En la figura 21 se muestra un gráfico cúbico de fracción en peso de Forma H, pureza del material de partida, velocidad de refrigeración y temperatura final basado en los datos presentados en el cuadro X-7A. El gráfico cúbico sugiere que el uso de una eplerenona de mayor pureza al inicio de la cristalización producirá una menor cantidad de Forma H. La temperatura final de cristalización también parece tener un efecto en la forma del producto final. La velocidad de enfriamiento no parece afectar en gran medida la formación de Forma H aunque se puede obtener algo de Forma H como resultado de enfriar más rápido al extremo inferior de temperatura en presencia de impurezas. La figura 22 muestra un gráfico semi normal preparado usando los resultados del gráfico cúbico para determinar aquellas variables, si las hubiera, con un efecto estadísticamente significativo en la cantidad de Forma H del material final. Se observó que la pureza del material de partida, la temperatura final de cristalización y la interacción entre las dos variables eran efectos estadísticamente significativos. Con la eplerenona de alta pureza (material de partida _de _ contenido final de Forma H. No se obtuvo Forma H con la eplerenona pura. Sin embargo, con la eplerenona de baja pureza (material de partida de eplerenona al 89.3%) había Forma H presente en ambos casos, con cantidades significativamente mayores de Forma H a temperaturas finales superiores. El cuadro X-7B presenta la fracción en peso de Forma H medidas en materiales secos usando un lecho fluido (LAB-LINE/P.R.L. Hi- Speed Fluid Bed Dryer, Lab-Une Instruments, Inc.) o un horno de vacío (Baxter Scientific Products Vacuum Drying Oven, odel DP-32). Se observó un contenido de Forma H similar para materiales comparables secados en el lecho de fluido alto o en el horno de vacío. Sin embargo, se observó una diferencia entre materiales comparables secados en el lecho fluido bajo en relación con el horno de vacío.

CUADROJG7B- EJEMPLO 8 Cristalización de una mezcla de Forma H y Forma L con metiletilcetona para preparar un solvato, y (b) desolvatación del solvato para preparar Forma L Se combinó eplerenona en Forma H (10 g) con 80 mi de metiletilcetona. La mezcla se calentó a reflujo (79°C) y se agitó a esta temperatura durante aproximadamente 30 minutos. Después, la suspensión resultante se enfrió con un protocolo de mantenimiento por etapas, manteniendo la suspensión a 65°C, 50°C, 35°C y 25°C durante aproximadamente 90 minutos en cada temperatura. La suspensión se filtró y se aclaró con aproximadamente 20 mi de metiletilcetona. El sólido aislado se secó inicialmerrte-en- el filtro -y después en-un^ bomo_de. -vacío_ a_4O-5ü¾CL_ El se€ado-se-Gom letó-e 4Jív cMTio-de- vacío aJ30tlJuO°J[L_EI jsólido de_s_olvatado_ se obtuvo con una recuperación del 82%. XPRD, MIR y CBD confirmaron que el sólido tenía una estructura cristalina de Forma L.

EJEMPLO 9 Digestión de material de partida de eplerenona de baja pureza con un disolvente para preparar Forma H A. Digestión con disolvente etanol: Se combinó eplerenona de baja pureza (24.6g; 64% en peso analizado por HPLC) con 126 mi de etanol 3A. La suspensión se calentó a reflujo y se retiró el destilado. Se añadieron simultáneamente 126 mi de etanol 3A mientras se retiraban 126 mi de disolvente por destilación atmosférica. Después de completar el intercambio de disolvente, la mezcla se enfrió a 25°C y se agitó durante una hora. El sólido se filtró y se aclaró con etanol 3A. El sólido se secó al aire para dar el solvato de etanol. El solvato se secó adicionalmente en un horno de vacío a 90-100°C durante seis horas para obtener 14,9 g de eplerenona en Forma H.

B. Digestión con disolvente metiletilcetona En un proceso de digestión alternativo, se digirió 1 gramo de eplerenona de baja pureza (aproximadamente 65% pura) en 4 mi de metilet ileet©na-du ante 2- horas, -Después-deJas-dos nonas, Ja juezcla se. dejó_ disolvente para preparar Forma L A. Digestión con Disolvente Etanol: Se digirió eplerenona de alta pureza (1 g) con 8 mi de etanol durante aproximadamente dos horas. Después, la solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y los sólidos se recogieron por filtración al vacío. El análisis de los sólidos por XPRD inmediatamente después de la filtración indicó que los sólidos eran un solvato (presumiblemente un solvato de etanol). Los sólidos se secaron posteriormente a 100°C a presión atmosférica durante 30 minutos. El sólido seco se analizó por XPRD y se determinó que era principalmente Forma L (no se detectó Forma H).

B. Digestión con disolvente metiletilcetona Se digirieron 1 gramo de eplerenona de alta pureza en 4 mi de metiletilcetona durante 2 horas. Después de las dos horas, la mezcla se dejó — enfriar a temperatura ambiente y los sólidos se recogieron por filtración al vaefor €f-sótido se anal izó-iflroed4atameüte- po PRD_y^s e determinó que era un solvato de eplerenona (presumiblemente el solvato de metiletilcetona). El solvato se secó posteriormente a 100°C a presión atmosférica durante 30 a 60 minutos. El sólido seco se analizó por XPRD y se determinó que era principalmente Forma L sin picos de difracción de Forma H.

EJEMPLO 11 Cristalización de Forma L directamente de la solución Procedimiento A: Se disolvió eplerenona (2.5 g) en acetato de etilo calentando a 75°C. Una vez disuelta la eplerenona, la solución se mantuvo a 75°C durante 30 minutos para asegurar la completa disolución. Después, la solución se enfrió a 1 °C/min a 13°C. Una vez a 13°C, la suspensión se dejó agitar durante dos horas a 750 rpm con un agitador en cabeza. Los cristales se recogieron por filtración al vacío y se secaron en un horno de vacío a 40°C durante una hora. El patrón XPRD y el termograma CBD del sólido eran característicos de la eplerenona en Forma L. En análisis termogravimétrico (TGA) del sólido indicó que no se daba pérdida de peso respecto al sólido hasta los 200°C.

Procedimiento B: En un procedimiento alternativo, se disolvieron 2 g de eplerenona -en~350-mLde-aeetonitri!o/agua 45/85%-calentando_en_una_placa caliente-con agitadóJiJiLagnética, Una vez disuelta la epierenona. la solución se dejó enfriar durante una noche con agitación magnética. El sólido resultante se recogió por filtración al vacío. Los cristales eran birefringentes y tenían un hábito cristalino triangular en forma de placa. El sólido tenía un XPRD y CBD característico de la epierenona en Forma L. El TGA indicó que no se producía pérdida de peso hasta los 200°C.

Procedimiento C: En un procedimiento alternativo, se introdujeron 640 mg de epierenona en un matraz de 50 mi con 20 mi de etilbenceno. La suspensión resultante se calentó a 1 16°C y se convirtió en una solución transparente. La solución transparente se enfrió a 25°C durante 30 minutos. La nucleación comenzó a 84°C durante el periodo de enfriamiento. Los sólidos resultantes se filtraron de la solución y se secaron al aire para dar 530 mg de sólidos (recuperación del 83%). La microscopía con etapas en caliente y XPRD confirmaron que los sólidos eran cristales de Forma L.

Procedimiento D: En un procedimiento alternativo, se añadieron 1 .55 g de epierenona a 2.0 mi de nitrobenceno y se calentó a 200 °C. La suspensión resultante se agitó durante una noche a 200°C. La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente (convección natural de aire) y al siguiente día se aisló el sólido.-Se_determinó-que^el^ólido_era_eplerenoj3a_^ Forma L por XP_RD_y Procedimiento E: En un procedimiento alternativo, se añadieron 5.0 g de eplerenona (pureza mayor de 99%) a 82 g de metanol (104 mi). Mientas se agitaba (210 rpm), la solución se calentó a 60°C y se mantuvo a esa temperatura durante 20 minutos para asegurar la disolución completa. Después, la solución se enfrió a -5°C a una velocidad de 0.16°C/minuto con agitación. Los cristales se recogieron por filtración y se secaron en un horno de vacío a 40°C durante 20 horas. Se determinó que los sólidos secos eran eplerenona en Forma L pura mediante análisis XPRD y CBD.

Procedimiento F: En un procedimiento alternativo, se añadieron 6,0 g de eplerenona (solvato de etanol que contenía etanol al 9% y con una pureza corregida de 95.2%) a 82 g de metanol (104 mi). Mientras se agitaba (210 rpm), la solución se calentó a 60°C y se mantuvo a esa temperatura durante 20 minutos para asegurar la disolución completa. Después, la solución se enfrió a 50°C a una velocidad de 0.14°C/minuto y se mantuvo a esa temperatura durante aproximadamente 2.5 horas. Después, la solución se enfrió a -5°C a una velocidad de 0.13°C/minuto con agitación. Los cristales se recogieron por filtración y se secaron en un horno de vacío a 40°C durante 16 horas- Se determinó que los-sólidos-secos^ran^pleffiQona^jn^ rma-L-puxa^ tante^RáJtsis-XPR& y-CBD EJEMPLO 12 Cristalización de Forma H directamente en la solución Se añadieron 150.5 mg de diepóxido y 2.85 g de epierenona a 1.5 mi de nitrobenceno. La mezcla se agitó magnéticamente a 200°C durante varias horas. Después, la suspensión se dejó enfriar a temperatura ambiente por convección natural de aire. La muestra se secó y se analizó por microscopía de luz polarizada y XPRD. El XPRD indicó que la muestra era una mezcla de Forma H y Forma L. Los cristales eran translúcidos por microscopía, indicando que no se produjo desolvatación (ni la conversión a Forma H o Forma L).

EJEMPL0 13 Preparación de epierenona amorfa por trituración Se rellenó aproximadamente la mitad de un recipiente de acero Wig-L-Bug con aproximadamente 60 g de epierenona (pureza mayor de 99.9%). Se puso una bola de acero y un tapón encima del recipiente y se agitó durante 30 segundos con el aparato Wig-L-Bug. Se rascó la epierenona de la superficie el recipiente Wig-L-Bug y se agitó el recipiente durante 30 segundos másT El sélido-resultante^e^an-alizó-por-XPRD^- CBD y_se,deteritiinÓLque_era.

EJEMPLO 14 Preparación de epierenona amorfa por liofilización Se introdujeron aproximadamente 100 g de epierenona bruta en un matraz que contenía 400 mi de agua. La solución se calentó ligeramente durante cinco minutos, y después se sónico y se calentó con agitación durante cinco minutos más. Se filtraron aproximadamente 350 mi de solución de epierenona en un matraz redondo de 1000 mi que contenía 50 mi de agua HPLC. La solución se congeló de forma ultrarrápida en un baño de hielo seco/acetona durante un periodo de uno a dos minutos. El matraz se acopló a un liofilizador Labconco Freezone 4.5 y se secó durante una noche. Los sólidos del matraz se traspasaron a una botella pequeña parda. Se observó una pequeña muestra con microscopía de luz polarizada a 10X, 1 .25X Optivar en aceite de Cargille (1 .404) y se observó que era al menos 95% de epierenona amorfa. Las figuras 24 y 25 muestran el patrón XPRD y el termograma CBD obtenido para la epierenona amorfa. El pico observado a 39 grados dos theta en la figura 24 es atribuible al recipiente de muestra de aluminio.

EJEMPLO 15 Composición de eplerenona polimorfa Se prepararan comprimidos que contienen dosis de 25 mg, 50 mg, 100 mg y 200 mg de eplerenona en Forma L y tienen la siguiente composición: EJEMPL0 16 Composición de eplerenona polimorfa Se preparan cápsulas (cápsula de gelatina dura, N° 0) que contienen una dosis de 100 mg de eplerenona y tienen la siguiente composición: Ingrediente Cantidad (mg) Epierenona en Forma L 90.0 Epierenona en Forma H 10.0 Lactosa hidratada (NF) 231 .4 Celulosa Microcristalina, NF 45.4 Talco, USP 10.0 Croscarmelosa sódica, NF 8.0 Laurilsulfato Sódico Sódico, NF 2.0 Dióxido de Silicio coloidal, NF 2.0 Estearato de Magnesio, NF 1.2 Peso Total de Carga de la Cápsula 400.0 EJEMPLO 17 Composición de Epierenona Polimorfa Se preparan cápsulas (cápsula de gelatina dura, tamaño N° 0) que contienen una dosis de 200 mg de epierenona y tienen la siguiente composición: ingrediente Cantidad (mg) Eplerenona en Forma L 190.0 Eplerenona en Forma H 10.0 Lactosa hidratada, NF 147.8 Celulosa Microcristalina, NF 29.0 Talco, USP 10.0 Croscarmelosa sódica, NF 8.0 Laurilsulfato Sódico Sódico, NF 2.0 Dióxido de Silicio coloidal, NF 2.0 Estearato de Magnesio, NF 1.2 Peso Total de Carga de la Cápsula 400.0 EJEMPLO 18 Preparación de Eplerenona Triturada Primero se eliminan los grumos del solvato de metiletilcetona seco haciéndolo pasar a través de un tamiz con malla 20 en un Fitzmill. El sólido sin grumos después se muele usando un disco de piñones Alpine Hosakawa con resaltos que funciona con refrigeración con nitrógeno líquido a una velocidad de alimentación de aproximadamente 250 kg/hora. La pulverización con piñón produce eplerenona pulverizada con un tamaño D90 de-aproximadamente 65-1 QQ-mierómetros, Poolacenes-suieto Ciertos grupos son más propensos a los efectos de modulación de enfermedad de la aldosterona. Los miembros de estos grupos que son sensibles a la aldosterona también son típicamente sensibles a la sal, donde la presión sanguínea de los individuos aumenta y se reduce generalmente con un mayor y menor consumo de sodio, respectivamente. Aunque no se pretender limitar la presente invención a estos grupos en la práctica, se contempla que estos grupos sujeto pueden ser particularmente adecuados para la terapia con una dosis anti-inflamatoria de un bloqueador de aldosterona de la presente invención. En una modalidad de la presente invención, el sujeto es preferiblemente un miembro, parcial o totalmente, del grupo étnico Japonés o del grupo étnico Negro. La hipertensión en Japón es un problema significativo. Una estimación reciente sugiere que alrededor de 30 millones de adultos japoneses sufren hipertensión (Saruta T. J. Clin. Ther. MedA 997; 13:4024-9). Aunque el control de la presión sanguínea ha mejorado recientemente en Japón, el control de la tensión todavía se considera insuficiente (Shimamoto; K. Japanese Cases. Nihon Rinsyo (Clinical Medicine in Japan), 2000;58 (Suppl):593-6). Trends in blood pressure and urínary sodium and potassíum excretion in Japan: reinvestigation ¡n the 8th year after the Intersalt Study. Nakagawa H, y col.: Hum Hypertens~\ 999 Nov:13(11 )735-41 , recomendó que la población japonesa aumentase el potasio y redujese el sodio en la alimentación Sin -ambaráoslas dietas dfiLjDasJLricción de sodio tienen poca aceptación. Un estudio japonés de Kobayashi y col. prescribió una dieta restringida a 5-8 gramos/día que tampoco consiguió una buena aceptación. (Kobayasai, Y y col.: Jpn J 1983;47:268-74). El Ministerio de Salud y Bienestar de Japón ha recomendado restringir el sodio a menos de 10 gramos/día (Guidelines on treatment of hypertension in the elderly, 1995-a tentative plan for comprenhensive research projects on aging and health- Member of the Research Group for "Guidelines on Treatment of Hypertension in the Elderly", Comprehensive Research Projects on Aging and Health, The Ministry of Health and Welfare of Japan). Ogihara T, col.: Nippn Roñen Igakkai Zasshi. 1996;33(12):945-75). A pesar de 10 años de iniciativas para educar al público, todavía sigue existiendo una alta tasa de no aceptación (estimada mayor de aproximadamente el 50%) medida con niveles de sodio en la orina entre individuos normales e hipertensos en Japón. (Kobayashi Y, y col.: Jpn J:47(2):268-75). Además, los japoneses muestran dos grupos, sensibles a la sal y no sensibles a la sal (Preventive nutritional factors in epidemiology: interaction between sodium and calcium. Mizushime S, Clin Exp Pharmacol P/7ys/o/1999;26:573). Se cree que muchos hipertensos japonenses son sensibles a la sal. Por consiguiente, los miembros del grupo étnico japonés que muestran la combinación de sensibilidad a la sal, alta ingestión de sodio e incapacidad de limitar el consumo voluntario de sodio se benefician partieularmente-con la terapja^eJa^resentaiavenciÓJL En otra modalidad_de la presente invención, por tanto, el sujeto en necesidad de tratamiento es un individuo sensible a la sal que es, parcial o totalmente, miembro del grupo étnico japonés e, ínter alia, tiene o es susceptible de tener hipertensión y/o enfermedad cardiovascular, particularmente enfermedades cardiovasculares seleccionados entre uno o más miembros del grupo compuesto por insuficiencia cardiaca, disfunción diastólica del ventrículo izquierdo, cardiomiopatía hipertrófica e insuficiencia cardiaca diastólica. De forma similar, la hipertensión en Negros es un problema significativo. Muchos Negros hipertensos y normotensos son sensibles a la sal (Svetkey, LP y col.: Hypertension. 1996;28:854-8). Los datos epidemiológicos acumulados indican que la prevalencia de hipertensión entre negros es mayor que entre blancos en casi todos los grupos de una misma edad y sexo. Los Negros hipertensos tienen generalmente una mayor incidencia de disfunción ventricular izquierda, ataques y daños renales (pero una menor incidencia de enfermedad isquémica del corazón) que los blancos hipertensos. (Eisner, GM. Am J Kidney Dis 1990;16(4 Suppl 1 ):35-40). Las razones de las tasas epidémicas de hipertensión entre negros americanos de deben principalmente al entorno: la alta ingestión de sodio y alcohol, obesidad, inactividad física y estrés psicosocial se han identificado como causas. (Flack, JM, y col.: J ASsoc Acad Minor Phys 1991 ;2:143-50). La causa del problema en poblaciones negras y blancas es incierta pero parece que una diferencia en _el Jtratamiento_de_l_ sodio. p_uede_ negros. Las anormalidades renales intrínsecas o inducidas por la hipertensión que limitan la capacidad natriurética, menor actividad de la bomba de Na+, K(+)-ATPasa, otros problemas en el transporte de iones en la membrana, exposición diferencial a fuentes de estrés psicosocial, mayor resistencia a la insulina y factores de alimentación (menor ingestión de calcio y potasio) se han sugerido como posibles factores. (Flack, JM y col.: Hypertension; 1991 ;17(1 Suppl):l1 15-21 ). Un estudio ha indicado que las diferencias genéticas también pueden ser responsables de la sensibilidad a la sal en negros. (Svetkey, LP y col.: Hypertension 1996;28:854-8). La hipertensión entre los negros se trata inicialmente restringiendo la ingestión de sodio en la dieta. Si el control de la dieta es insuficiente, se recomienda la administración de un agente antihipertensor de eficacia 24 horas y que reduce la resistencia vascular periférica promueve la excreción de sodio y mejora potencialmente la hemodinámica. (Eisner, GM. Am J Kidney Dis 1990; 16(4 Suppl 1 ):35-40). Los negros, sin embargo, generalmente responden de forma distinta a los agentes antihipertensores en comparación con los blancos. En general, las monoterapias con antagonistas del receptor beta-adrenérgico o inhibidores ACE son menos eficaces en negros que en blancos. Los hombres negros tienden a responder menos a inhibidores ACE que las mujeres negras (Eisner, GM. Am J Kidney Dis 1990;16(4 Suppl 1 ):35-40). Por consiguiente, los miembros del grupo étnico de raza negra -que muestran la combinación de sensibilidad a la sal, alta ión-de-sodio- incapacidad da I i m itar_eLcojsjJmo voluntario de sodio se benefician particularmente con la terapia de la presente invención. En otra modalidad de la presente invención, por tanto, el sujeto en necesidad de tratamiento es un individuo sensible a la sal que es, parcial o totalmente, miembro del grupo étnico de raza negra e, ínter alia, tiene o es susceptible de tener hipertensión y/o enfermedad cardiovascular, particularmente enfermedades cardiovasculares seleccionados entre uno o más miembros del grupo compuesto por insuficiencia cardiaca, disfunción diastólica del ventrículo izquierdo, cardiomiopatía hipertrófica e insuficiencia cardiaca diastólica.

Individuos sin modulación Un individuo sin modulación demuestra una escasa respuesta positiva en la velocidad de flujo sanguíneo renal y en la producción adrenal de aldosterona a una alta ingestión de sodio o a la administración de angiotensina II. Tales individuos sin modulación pueden mostrar adicionalmente mayores niveles de insulina en ayunas y un mayor incremento de los niveles de insulina estimulados con glucosa. (Ferri y col.: Diabetes 1999;48:1623-30). La resistencia a la insulina también está asociada con un mayor riesgo de infarto de miocardio. Por consiguiente, en otra modalidad de la presente invención el sujeto en necesidad de tratamiento es un individuo sensible a la sal y sin modülación- ue-/»te' a/'35- (i) tiene-0-es_susceptibJe_de. tenerjesistencja JJ Ja resistencia a la insulina muestra un aumento similar con la edad. Por consiguiente, en una modalidad de la presente invención el sujeto en necesidad de tratamiento es un individuo sensible a la sal que tiene al menos 55 años, preferiblemente al menos aproximadamente 60 años de edad y más preferiblemente al menos aproximadamente 65 años e, inter alia, tiene o es susceptible de tener resistencia a la insulina, particularmente diabetes mellitus de Tipo I o Tipo II y/o resistencia a la glucosa.

Alcohólicos desintoxicados y en recuperación Los alcohólicos desintoxicados y en recuperación son habitualmente sensibles a la sal (Genaro C y col.: Hypertension 2000:869- 874). Por consiguiente, en otra modalidad de la presente invención, el sujeto en necesidad de tratamiento es un individuo sensible a la sal e inter alia, un alcobóWeo-desiñtoxiGado-o en-recuperación Obesidad — Los individuos obesos son habitualmente sensibles a la sal. Un estudio de Bonner (MMW Fortschr Med 1999;14:34-6) estimó que el 44% de todos los pacientes hipertensos tienen sobrepeso y tienen asociados adicionalmente sensibilidad a la sal, alto nivel intracelular de calcio, retención de sodio y mayor salida cardiaca. Además, Dimsdale y col. (Am J Hypertens 1990; 3:429-35) informó de que los pacientes obesos tenían más probabilidades de aumentar su respuesta sistólica en respuesta a la sal. Adicionalmente, los niños sensibles a la sal también tienen una mayor probabilidad de obesidad y enfermedad cardiovascular. (Falkner B y col.: Am J Clin Nutr 1997;65:618S-621 S). Incluso en individuos con la tensión normal, los sujetos sensibles al sodio tienden a pesar más que los sujetos resistentes al sodio (Rocchini AP y col.: Am J Med Sci 1994; 307 Suppl 1 :S75-80). Por consiguiente, en otra modalidad de la presente invención el sujeto en necesidad de tratamiento es un individuo sensible a la sal e, ínter alia, es obeso.

Evaluación biológica Los trastornos cardiovasculares en seres humanos son afecciones complejas, iniciadas habitualmente por hipertensión vascular o un infarto de miocardio (MI). Para determinar la probabilidad de eficacia de una terapia para trastornos cardiovasculares es importante determinar la potencia jEns¾ 'A" se deteFmmó — la— eficacia— del — antagonistas _d la aldosterona eplerenona (epoximexrenona) en un modelo de rata hipertensa con inflamación vascular usando una infusión con angiotensina II. En el ensayo "B" se describe un ensayo que evalúa la eficacia del antagonista de aldosterona eplerenona (epoximexrenona) en un modelo en ratas usando infusión de aldosterona para producir hipertensión con inflamación vascular. En el ensayo "C" se describe otro ensayo que evalúa la eficacia del antagonista de la aldosterona eplerenona (epoximexrenona) en un modelo en ratas usando infusión de aldosterona para producir hipertensión con inflamación vascular. Además, pueden usarse ensayos clínicos para evaluar la terapia con antagonista de aldosterona en seres humanos. Se han publicado numerosos ejemplos de tales pruebas terapéuticas, incluyendo las del estudio RALES 003 descrito en American Journal of Cardiology 78, 902-907 (1996) o el estudio RALES 004 descrito en el New England Journal of Medicine 341 , 709-717 (1999).

ENSAYOLA Modelo de infusión In vivo de an iotensina II Protocolo Procedimientos: - Ratas Wistar macho (n=50, 10/grupo; PC=200 g - NaCI al 1 % para beber - Grupos experimentales 1 . control 2. Angiotensina II (25 ng/min, se por minibomba alzet) 3. Angiotensina II (25 ng/min, se) + eplerenona 100 mpk 4. Angiotensina II (25 ng/min, se) + adrenalectomía + dexametasona (12 g/kg/d, sc) 5. Angiotensina II (25 ng/min, se) + adrenaletomía + dexametasona (12 µg/kg/d, se) + aldosterona (40 mg/kg/d, se mediante minibomba alzet) - SBP medido cada semana mediante el procedimiento "ta il cuff o de manguito en la cola. - Mediciones cada 24 horas de ingestión de comida y líquido y expulsión de orina - Muestras de orina recogidas cada día para la determinación de electrolitos en orina. - Sacrificio ~por extracción efe^sangre-despu s-de 4 -semanas-La -sangre-se — reeeqe-e h ubos-seGQS--paf^la^^ en suero v en tubos que contienen EDTA para la medición de niveles de aldosterona y corticosterona. - Los corazones se pigmentaron con hematoxilina y eosina y se analizan para determinar anormalidades morfológicas (es decir, necrosis, lesión vascular).

Resultados Presión sanguínea. La presión sanguínea sistólica aumentó en todos los animales que recibían la infusión de angiotensina II. Ni la epierenona ni la adrenalectomía redujeron la presión de sangre en comparación con animales que recibían vehículo. La infusión de aldosterona aumentó la presión sanguínea en ratas adrenalectomizadas con angiotensina ll/sal. La figura 23 demuestra este aumento en la presión sanguínea sistólica.

Excreción de electrolitos. Se usó la relación entre la excreción diaria en orina de Na+ y la excreción en orina de K+ (relación U Na+/K+) como índice de natriuresis. La relación Na+/K+ fue similar en todos los grupos antes del inicio de los tratamientos y aumentó de forma similar en todos los animales con el inicio de la dieta alta en sal. La relación Na+/K+ en orina no cambió en animales que recibían la infusión de angiotensina II hasta el día 17, en el que aumentó significativamente en estos animales con respecto a las ratas infundidas con vehículo. Un -efecto -similar tuvo lugar con los animales ífrftmdides- con- a nojotensina- IL que, _xari b ia n_ e p I e re n o n a . que mostraron aumentos en la relación Na+/K+ desde el día 14 a partir de la infusión. Sin embargo, las ratas tratadas con eplerenona no mostraron en ningún momento una mayor relación Na+/K+ que las ratas infundidas con angiotensina II tratadas con vehículo. De hecho, solo se observo una diferencia significativa el día 21 , cuando las ratas infundidas con angiotensina II tratadas con vehículo mostraron una mayor relación Na+/K+ que los animales tratados con eplerenona, lo que indica que en estas condiciones experimentales, la eplerenona no produjo ningún efecto diurético o natriurético significativo. Los animales adrenalectomizados con o sin infusión de aldosterona mostraron siempre una mayor relación Na+/K+ que los animales con la glándula suprarrenal intacta.

Daño en miocardio. Siete de los diez animales tratados con sal/angiotensina II desarrollaron cambios vasculares inflamatorios en las arterias coronarias. Estos cambios se caracterizaron por la infiltración de leucocitos en el espacio perivascular, principalmente con macrófagos. La necrosis fibrinoide del medio también se observó en algunas arterias. En algunos casos en los que las lesiones eran extensas hubo necrosis del cardiomiocito asociada en el miocardio circundante. En estos casos se observaron hemorragias parenquimales, consistentes con los descubrimientos de necrosis en el miocardio. Estas lesiones inflamatorias vasculares se observaron en solo uno de los-diez^niraales_infundidos con. ajicjotensina_lL - tje-r efeierar^epleremrja-a^ de que estos animales eran tan hipertensos como las ratas ¡nfundidas con angiotensina II y tratadas con vehículo, (véase figura 24). De forma similar, la adrenalectomía evitó las lesiones vasculares inflamatorias del corazón. Sin embargo, el reemplazo de la aldosterona se restauró la inflamación coronaria y miocárdica grave y la lesión observada en ratas ¡nfundidas con angiotensina II, con la glándula suprarrenal-intacta y tratadas con vehículo. La inmunopigmentación de los corazones de ratas ¡nfundidas con angiotensina II con un anticuerpo específico de ciclooxigenasa 2 identificó la presencia de esta enzima en áreas de inflamación alrededor de las arterias, principalmente en monocitos/macrófagos. La pigmentación con ciclooxigenasa-2 también se observo en las células del músculo liso vascular del medio de las arterias coronarias, incluso sin haber evidencia de alteraciones morfológicas o agregados inflamatorios en el espacio perivascular (figura 26). El tratamiento con eplerenona, así como la adrenalectomía redujo notablemente, y en la mayoría de los casos completamente, la expresión de la ciclooxigenasa-2 en los corazones de ratas ¡nfundidas con angiotensina-ll (véanse figuras 25 y 27). La introducción de aldosterona en ratas adrenalectomizadas ¡nfundidas con angiotensina II recuperó la presencia de ciclooxigenasa-2 en las arterias coronarias. La osteopontina (también conocida como activación-1 temprana de Célula T, Eta-1 ) es una glicoproteína segregada con características pro-inflamatorias -que- media- la -ciuiraioatracciójv -activación. y_ jTiigracjón_ de monocitos.- la^iamuriopiamentación_ de corazones de ratas infundidas con angiotensina II que han bebido solución salina con un anticuerpo específico de osteopontina identificó la presencia de osteopontina en el medio de las arterias coronarias. El tratamiento con eplerenona y la adrenalectomía evitaron la expresión de osteopontina en los corazones de ratas infundidas con angiotensina II que habían bebido solución salina (figuras 28 y 29). La introducción de la aldosterona devolvió la expresión de osteopontina en animales adrenalectomizados.

ENSAYO B Modelo de infusión in vivo de aldosterona Protocolo 2 Procedimientos: - Ratas Sprague Dawley macho (n=39, PC=250 g) - NaCI al 1 % para beber - Uni-nefrectomía realizada durante la implantación de mini-bombas - Grupos experimentales 1. Control 2. Aldosterona (0.75 mg/hr, se via minibomba alzet) 3. Aldosterona (0.75 mg/hr, se via minibomba alzet) + eplerenona 100 mpk-t t?. 4-AldosteTOna -75 roq/h-k sc^ia, minibomba alzet) + KCI al 0.6% en el líquido para beber - Los grupos 1 , 2 y 3 recibieron sólo KCI al 0,3% en la solución de bebida - La SBP se midió con sondas de radiotelemetría insertadas en la aorta abdominal - Se sacrificaron a las 4 semanas - Los corazones se recogieron y se dividieron en dos mediante una sección transversal en la mitad de los ventrículos: la mitad superior se almacenó en formalina. La parte inferior se congeló en nitrógeno líquido para el análisis bioquímico. - Los corazones se pigmentaron con hematoxilina y eosina y el pigmento específico de colágeno rojo picro-sirio y se analizaron para determinar la fracción de volumen de colágeno intersticial y anormalidades morfológicas (es decir, necrosis, lesión vascular). - La concentración de hidroxiprolina se midió en los corazones congelados. La determinación de osteopontina y COX-2 se realizó por T-PCR cuantitativo (Taqman). La osteopontina también se identificó en el corazón por inmunoquímica.

Resultados- Presión sanguínea. La presión sanguínea sistólica aumentó en todos animales que recibían infusión de aldosterona. El tratamiento con eplerenona redujo significativamente, pero no normalizó, la presión sanguínea. La figura 43 muestra gráficamente estos resultados.

Lesión miocárdica. Las ratas uni-nefrectomizadas que bebían solución salina no tuvieron lesión en el miocardio. La determinación del colágeno intersticial por determinación histológica de la fracción de volumen de colágeno intersticial o por determinación bioquímica de concentración de hidroxiprolina evidenció la ausencia de fibrosis miocárdica en los animales que recibían tratamiento con aldosterona/sal. Sin embargo, el examen de los corazones pigmentados con hematoxilina-eosina de ratas tratadas con aldosterona/sal evidenció graves lesiones vasculares inflamatorias. Estas lesiones fueron idénticas a aquellas descritas en el protocolo 1. La administración de eplerenona evitó completamente los cambios inflamatorios vasculares en ratas uni-nefrectomízadas que bebían solución salina ¡nfundida con aldosterona (figura 32), aunque no normalizó la presión sanguínea. Los aumentos de potasio en la alimentación no tuvieron efectos significativos en el desarrollo de lesiones inducidas con aldosterona ya que estos animales mostraron niveles similares de lesión a los de las ratas tratadas con aldoste ona sal-que-recíbieron vehículo Los-flive es-de osteopontin a_en_ s u e ro de cada grupo se midieron a los 28 días (ratas que bebían NaCI al 1 %, ratas que bebían NaCI al 1% con aldosterona y ratas que bebían NaCI al 1 % con aldosterona y epierenona). La figura 48 muestra la notable reducción en niveles de osteopontina circulante en ratas tratadas con epierenona. También se realizó una inmunopigmentación con osteopontina en los corazones de estos animales. No se detectó osteopontina en animales uninefrectomizados que bebían solución salina que no recibían aldosterona. Sin embargo, la osteopontina se identificó claramente en el medio de las arterias coronarias de animales que recibían infusión de aldosterona. El tratamiento con epierenona evitaba la expresión de osteopontina en los corazones de ratas infundidas con aldosterona (figuras 30 y 40). Los aumentos en el potasio de la dieta no redujeron la expresión de la osteopontina. La determinación de ARNm de osteopontina con RT-PCT cuantitativo mostró una regulación al alza aguda (7 veces) de esta citoquina en los corazones de ratas tratadas con sal/aldosterona que recibían vehículo (expresión relativa de ARNm: 1.7±0.2 frente a 12.15±1.7, P<0.0001 ). Este efecto se evitó con epierenona (expresión relativa de ARNm: 2.5±0.6, P<0.0001 frente al grupo de aldosterona/sal+vehículo). De forma consistente con el papel de la ciclooxigenasa-2 en el desarrollo de inflamación vascular inducida con aldosterona, la expresión de ARNm de COX-2 aumentó en 3 veces en ratas con tratamiento con aldosterona/sal+vehículo (expresión relativa de ARNm: -1 ,2*0,1-2 -frente- _a -3.7_±0^_P<0.0001). JguaL que_ los efectos-BDJajexpresion de osteopontina, la eplerenona evitó el aumento de la expresión de COX-2 en ratas tratadas con aldosterona/sal (expresión relativa de ARNm: 1 .8±0.36, P<0.01 frente al grupo aldosterona/sal+vehículo, véanse figuras 31 y 39). Los datos anteriores sugieren que la aldosterona media un fenotipo inflamatorio vascular en el corazón de ratas hipertensas. Este fenotipo está asociado con la regulación de la citoquina osteopontina y la enzima cicloox¡genasa-2 en células del músculo liso vascular y en el medio arterial, que pueden mediar la inflamación perivascular observada y la consiguiente lesión isquémica/necrótica de las arterias coronarias y el miocardio. Sin verse limitado a ninguna teoría, se cree que este es el mecanismo que media las alteraciones vasculares observadas en enfermedades tales como insuficiencia cardiaca, enfermedad de la arteria coronaria, miocarditis vírica o auto-inmune, periarteritis nodosa, ataques y nefrosclerosis. La figura 33 revela que la osteopontina y la ciclooxigenasa-2 se expresan en regiones similares de la pared de la arteria coronaria. Aunque la teoría no forma parte de la presente invención, la figura 34 muestra un mecanismo propuesto para este modelo. En estos ejemplos el tratamiento con eplerenona evitó la inflamación vascular del corazón en un grado similar al de la adrenalectomía, tal y como se demostró en el protocolo 1. Los efectos de la eplerenona fueron en gran medida independientes de las reducciones en la presión sanguínea sistólica, como se demostró en el protocolo 1. La falta de efecto-diurético -o _natriurélico_ deJa_eplexenona_en_ ratas poj^ gioten sina- 417sal— sugiera _q e_lQ=_efectos protectores del antagonista selectivo de la aldosterona también fueron independientes de sus efectos potenciales en los tejidos epiteliales. Además, el hecho de que una alta ingestión de potasio en la alimentación no pudiera imitar los efectos de la eplerenona va en contra de la posibilidad de que la eplerenona proporciona beneficio mediante sus propiedades de limitación del potasio. De esta forma, se propone que la aldosterona puede tener efectos perjudiciales directos en la vasculatura coronaria no relacionados con los efectos de esta hormona en la homeostasís de electrolitos en tejidos epiteliales o con sus efectos en la presión sanguínea. La administración de eplerenona a seres humanos podría proporcionar un beneficio terapéutico por sus efectos antiinflamatorios en órganos vascularizados incluyendo, pero sin limitación, corazón, riñon y cerebro, como se sugiere en el presente experimento.

ENSAYO C Estudio adicional de infusión in vivo de aldosterona Se expandió el procedimiento del Ensayo B en un ensayo posterior. Se dio de beber NaCI al 1%-KCI al 0.3% a ratas Sprague Dawley uninefrectomizadas y uno de los siguientes tratamientos: vehículo, infusión de aldosterona; o infusión de aldosterona en combinación con eplerenona (100 mg/kg/día). El tratamiento aldosterona/sal indujo hipertensión grave en ratas -después de 30 días¡ que se redujo de forma-sigriiñcativa^cQn la epleLe.nona. El después de 7, 14 o 30 días de tratamiento. El análisis histopatológico reveló lesiones vasculares inflamatorias que comenzaron a los 14 días y que se extendieron al miocardio circundante y tuvieron como resultado cambios isquémicos/necróticos focales. Las lesiones fueron precedidas por la expresión y aumento progresivo de moléculas proinflamatorias. La regulación al alza de moléculas proinflamatorias y el daño miocárdico y vascular asociado se atenuó notablemente con el tratamiento con epierenona. Estos datos demuestran que la epierenona es eficaz en la reducción de la presión sanguínea y en proporcionar protección al órgano final frente a lesiones inflamatorias vasculares inducidas con aldosterona en el corazón.

Animales Se introdujeron ratas Sprague Dawley macho con un peso de 230 a 250 g (Harían Sprague Dawley Industries, Indianapolis, IN) en un habitáculo con un ciclo diario de 12 horas de luz/12 horas oscuridad a una temperatura ambiente de 22±1°C (n=96). A los animales se les dejó una semana para adaptarse después de la llegada y tenían acceso libre a dieta para roedores TEKLAD 22/5 (Harían TEKLAD, Madison, Wl) y agua del grifo hasta el inicio del experimento. ¾otocolo-expBrimeníal Antes del procedimiento quirúrgico, los animales se pesaron y asignaron individualmente a uno de los siguientes grupos: (i) control con alta dosis de sal (vehículo/pienso normal/agua para beber con NaCI al 1 % y KCI al 0.3%, n=31 en 3 momentos en los grupos), (II) control de aldosterona (aldosterona/alimento normal/ agua para beber con NaCI al 1% y KCI al 0.3%, n=28 en 3 momentos), (III) 100 mg/kg/día eplerenona (aldosterona/alimento con eplerenona/agua para beber con NaCI al 1 % y KCI al 0.3%, n=30 en 3 grupos de tiempo). El suplemento de cloruro potásico se añadió a la solución salina para evitar la hipopotasemia potencial asociada con el exceso de aldosterona.

Tratamiento En el momento del procedimiento quirúrgico, se insertó un minibomba osmótica Alzet 2002 (Alza Corp., Palo Alto, CA) que contenía vehículo (etanol al 9%/propilenglicol al 87%/dH20 al 4%) o 1 .0 mg/ml de d-aldosterona (Sigma Chemical, St. Louis, MO) de forma subcutánea en la nuca. La aldosterona se administró a una dosis de 0.75 µg/hora. La eplerenona se incorporó en dieta para roedores TEKLAD 22/5 (Harían TEKLAD, Madison, Wl) en una concentración de 1 mg/g de pienso (calculado para administrar 100 mg/kg/día). El trabajo analítico previo ha demostrado la estabilidad de la eplerenona en esta dieta así como la homogeneidad obtenida después de la preparación:- Se saerifiearar^animales d^ 44 ó 30 díasjieiralamiaotQ Procedimiento quirúrgico Los animales a sacrificar después de 7 ó 14 días de tratamiento se uninefrectomizaron y se les implantó una minibomba Alzet. Los animales tratados durante 30 días fueron uninefrectomizados, se les implantaron minibombas Alzet y unidades de telemetría por radio (modelo TA11 PA-C40, Data Sciences Inc., St. Paul, MN) de acuerdo con el siguiente procedimiento. Los animales se anestesiaron con isoflurano al 5% (SOLVAY Animal Health Inc., endota Heights, MN) que se administró en 02 usando un instrumento de anestesia VMS (Matrix Medical, Inc., Orchard Park, NY). La anestesia se mantuvo con isoflurano al 1-2% durante todo el procedimiento quirúrgico. El lugar en el que se realiza la cirugía se recortó, se frotó con nolvasan y se roció con betadine. Se realizó una incisión rostral-caudal a través de la piel desde la base de las costillas a la región púbica usando un bisturí N°1 1. Se realizó una segunda incisión a través de los músculos de la pared abdominal para exponer la cavidad peritoneal. La uretra, arteria y vena renal del riñon izquierdo se aislaron, se ataron con hilo de seda 4-0 y se extirpó el riñon y se desechó. Los órganos se desplazaron cuidadosamente con retractores de tejido para exponer la aorta abdominal. Un segmento de 1 .5 cm rostral a la bifurcación de la aorta abdominal en las arterias iliacas se limpió de exceso de tejido conectivo y se usó hilo de seda 4-0 para preparar un anclaje adyacente región Uropiada-para parar_eL exceso de flujo sanguíneo. Usando una aguja doblada de calibre 21 , se penetró la aorta abdominal. Se insertó la cánula de la unidad de telemetría por radio y se estabilizó en la aorta usando un anclaje de seda 4-0. Los órganos se reposicionaron y la unidad de telemetría por radio se colocó sobre los órganos. La pared abdominal se cerró usando un patrón de sutura sin interrupciones con hilo de seda 4-0 y la piel se cerró posteriormente usando hilo de seda 4-0 con un patrón de sutura sin interrupciones. A los anímales se les inyectó alrededor de las suturas 100 µ? del anestésico Márcame HCI (Sanofí Winthrop Pharmaceuticals, New York, NY) y se les administró una inyección (i.m.) del antibiótico Mandol ((Eli Lilly & Co., Indianapolís, IN). El seguimiento post-operativo incluyó el control de los animales en un calentador durante la recuperación de la anestesia hasta que se estableció el decúbito esternal. Los animales se controlaron diariamente para detectar signos de dolor e infección en el lugar de la cirugía. Los animales que mostraban malestar continuado después de la cirugía se trataron con 0.1-0.5 mg/kg s.c. de Buphrenorphíne (Ríckett & Colman Pharmaceuticals, Inc., Richmond, VA). Después, a los animales se les dio acceso a agua de grifo y dieta para roedores TEKLAD 22/5 (Harían TEKLAD, Madison, Wl).

Análisis de presión sanguínea La presión sanguínea arterial transmitida por telemetría se calculó con el programa DATAQUEST A.R.T. Versión .1.1-Gold Software (Data ScieftcesJctemaíioDaL-SL_Paul. MN). Los datos se recogieron durante un periodo de 24 horas con la velocidad de recogida ajustada a una lectura de 10 segundos cada 5 minutos para cada animal. El periodo de 24 horas usado fue de 6:00 a.m. a 6:00 a.m.

Sacrificio Al finalizar el tiempo de cada experimento, los animales se anestesiaron con pentobarbital (65 mg/kg/ i.p., Sigma Chemical, St. Louis, MO) y se pesaron con una balanza Mettler PM6000 (Mettler-Toledo, Inc., Highstown, NJ). La cavidad abdominal se abrió para exponer la aorta abdominal. Se insertó una aguja de calibre 16 en la aorta abdominal y se extrajo sangre al animal en una jeringa de 12 ce. La muestra de sangre se traspasó inmediatamente a tubos de recolección de suero de vidrio (Terumo Medical Corp., Elkton, MD) para un análisis de nivel de fármaco. Las muestras se introdujeron en hielo húmedo hasta que se completó la recogida de muestras y se centrifugó durante 15 minutos a 3.000 rpm a 4°C. Después de la extracción de sangre, los corazones y ríñones se aislaron, se extrajeron, se aclararon en solución salina tamponada con fosfato fría y se secaron. Los ríñones se partieron inmediatamente por el eje largo con una cuchilla y se introdujeron en formalina tampón neutral al 10% (NBF, Richard, Alien Scíentific, Kalamazoo, MI). En los corazones, el ventrículo derecho (VD) se separó del ventrículo izquierdo (VI) y se pesaron ambos ventrículos- usando — una_ balanza M_ettler_AE16_3_ (Mettler-Toledo, ???^_ Hl hstow ^J ^ al 10%. Una sección coronal de 2 mm del vértice del VI se retiró y congeló en hielo seco/isopentano para analizar la expresión genética y la porción restante del VI se introdujo en NBF al 10% para su fijación. El ajuste final en húmedo se completo después de 3-4 días de fijación, cuando se retiró una segunda sección coronal de 2 mm para el análisis de hidroxiprolina y una tercera sección de 2 mm se retiró de la sección ecuatorial para histología.

Procesado y pigmentación del tejido Las regiones ecuatoriales del corazón se procesaron de la manera habitual en parafina con un procesador de tejidos automático (Hypercenter XP, Shandon/Lipshaw Inc., Pittsburgh, PA) y se introdujo en parafina fresca con el lado apical hacia abajo (Shandon Embedding Center, Shandon/Lipshaw Inc.). Se cortaron secciones de 5 y 10 µ?? de cada bloque de tejido usando un microtomo rotativo Leica RM2035 (Leica Inc., Houston, Texas) y se montaron sobre placas de microscopio Superfrost/Plus (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Se pigmentaron secciones de 10 µ?? con el pigmento específico de colágeno, Rojo Picrosirius F3BA (Ácido Pícrico Saturado (Sigma Chemical, St. Louis, MO) con Rojo Sirio F3BA al 0.1 % (p/v) (C.l. N° 35780, Pfaltz & Bauer, Inc., Waterbury, CN). (6). Los tejidos se hidrataron con agua. Las placas se incubaron posteriormente en agua destilada con Ácido Fosfomolíbdico al 0.2% (p/v) (Sigma Chemical, St. Louis, MO)~düTamte~ tSmirnutos, se-traspasó-a-pigmente-Reje- PÍGFOsirius-F3BA-al 0.1% -durante ^I IJQ- jniDiitQS. se introdujo en etanol al 95% en peso/ácido acético al 1 % (v/v) durante 1 minuto seguido de dos incubaciones de 1 minuto en etanol al 100% y se aclaró en xileno durante 1 minuto. Las placas se cubrieron con un cristal N°1 usando Medio de Montaje Histológico Permount (Fisher Scientific). Se cortaron dos placas montadas con secciones de 5 µ?? de cada animal. Una placa se procesó con pigmentación H&E y otra con pigmentación de Ácido Peryódico Schiff (PAS). Las H&E y PAS se usaron para la evaluación patológica de los corazones.

Análisis histopatolóqicos La semi-cuantificación de la lesión miocárdica se realizó como se ha descrito previamente con modificaciones menores (7). En resumen, se usó una escala de 0 a 4 para evaluar el nivel de lesión en el miocardio. Una puntuación de 0 representaba que no se había producido daño. Una puntuación de 1 representaba la presencia de lesiones vasculares y perivasculares sin lesión en el cardiomiocito. Se dio una puntuación de 2 cuando se observó claramente un área clara necrosis miocárdica. La necrosis miocárdica se definió como la presencia de cambios necróticos en los cardiomiocitos tales como piknosis o cariolisis nuclear, fibras onduladas marginales sin contracción e hipereosinofilia del citoplasma o evidencia clara de destrucción de la membrana del cardiomiocito. Cuando se encontraron dos o más áreas distintas de necrosis (implicando la presencia de dos regiones infartadas distintas), los— corazones- recibieron- una puntuación de 3. La pxjÍÜüadón_á_Sje asignó a corazones que mostraron áreas extensas de necrosis que comprendían más del 50% del ventrículo izquierdo.

Análisis de imágenes Se usaron las placas pigmentadas con Rojo Picrosirius F3BA para cuantificar el colágeno intersticial con un Sistema de Análisis de Imágenes Videometric 150 (Oncor Inc., Gaitherbuth, MD). En resumen, las imágenes se capturaron usando un objetivo Nikon E Plan 10/0.25; 160/-(Nikon Inc. Garden City, NY) unido a un microscopio Nikon Optiphot (Nikon Inc.). Una Videocámara en Color Toshiba 3 CCD (Modelo IK-T30T, Toshiba Corp, Japón) proporcionaba las imágenes del microscopio en formato RGB a un ordenador 386 con una tarjeta gráfica V150. La aplicación de la tarjeta gráfica V150 (Oncor Inc.) convirtió las imágenes RGB a formato HIS (Brillo, Intensidad, Saturación) para la proyección y análisis en un monitor en color Sony Triniton (Modelo PVM-1342Q, Sony Corp. Tokio, Japón) con un aumento de 305x. Una vez que la imagen se proyectó en el monitor, el brillo, intensidad y saturación de los pixeles a medir se definió por un proceso denominado de umbral. Después, la aplicación V150 midió los pixeles que estaban dentro de los límites del umbral. El sistema se calibró con una escala micrométrica (EM Sciences, FT. Washington, PA 19034) que permitió expresar los datos en mm2 o pm2. Después de cada medida, los datos se salvaron automáticamente en formato ASCII y se traspasaron a Microsoft Excel versión 7.0 para la suma InmunQhisloquímíca Se desparafinizaron secciones de 5 µ?t? en xileno (dos, incubaciones de 5-10 minutos) y se rehidrataron con incubaciones de 3 minutos en etanol como se indica a continuación: dos incubaciones en etanol al 100% seguidas de dos incubaciones en alcohol al 95% y una incubación en alcohol al 70%. Una vez hidratadas, las secciones se aclararon en agua del grifo durante 1 minuto y agua destilada durante 1 minuto. La actividad peróxido endógena se bloqueó introduciendo las placas en H2O2 al 3.0% durante 15 minutos seguido de un aclarado de 5 minutos en agua destilada. Las placas se procesaron para la recuperación de antígenos usando ácido cítrico, pH 6.0. Las placas se calentaron a ebullición, se enfriaron durante 20 minutos a 25°C y se aclararon en agua destilada. Las placas se pigmentaron usando un autopigmentador DAKO (DAKO Corporation, Carpintería, CA). Antes de la pigmentación, las placas se aclararon e incubaron en tampón de bloqueo durante 20 minutos. El tampón de bloqueo se describe en el kit Vectastain AVC (Vector Labs, Burlingame, CA) y contiene 10 mi de TNB (NEN TSA Biotin System kit, CatN0 NEL700A, NEN Life Science Products, Boston, A) y 3 gotas de suero normal (correspondiente al anticuerpo secundario). Los anticuerpos primarios usados para la pigmentación incluyen: Osteopontina, diluida a 1 :100 (monoclonal de ratón, CatN0 MPHIbl O, Developmental Studies Hybridoma Bank, The University of lowa, lowa City, IA); ED-1 diluida a 1 :500 (glicoproteína anti-macrófago, monoclonal de ratón, MAB1435, Chemicon International lnc„ Temecula, CA); CD-3 diluido a 1 :300 (anti élulaJ^-anli de conejo purificado por afinidad, A0452, DAKO Corporation, Carpineria, CA); ICAM-1 diluido a 1 :100 (purificado por afinidad - policlonal de cabra, M-19:sc-1511 , Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); VCAM-1 diluido a 1 :100 (purificado por afinidad - policlonal de cabra, C-19:sc-1504, Santa Cruz Biotechnology). Las placas se incubaron con anticuerpos primarios durante 60 minutos, seguido de anticuerpos biotinilados a una concentración final de 5 µ?/ml durante 30 minutos a 25°C. La pigmentación se visualizó con el kit Vectastaina ABC-AP (Vector Laboratories) y con pigmentación con diaminobencidina (DAKO Corporation, Carpintería, CA). Las placas se aclararon en agua y se contra-pigmentaron con hematoxilina durante aproximadamente 30 segundos. La IgG del mismo isotipo (Sigma Chemical, St Louis, MO) se usó como control negativo para los anticuerpos primarios.

Hibridación in situ de ARIMm de osteopontina Se generaron sondas de ARN basadas en una secuencia de osteopontina de rata (GenBank, número de serie NM 008608-1 ). En resumen, se generó un fragmento de ADNc de osteopontina de rata por RT-PCR usando los siguientes cebadores: cebador directo 5 -TGG CAC ATT TGT CTT; cebador inverso 3' AGC CCA TCC AGTC. El fragmento de ADNc se insertó en el plásmido de PCR II usando el kit de clonación TA (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Las sondas se marcaron en 100 µ? de reacción de transcripción in vitro -que-Gontenía^ rRNasin_(2_U , DNasa Q-5- Tampón JEE_ (PRO EGA, Madison, Wl), 33P-UTP 5 µ? (50 pC¡) (Elkin Pelmer, Boston, MA) y ARN polimerasas apropiadas (ARN Polimerasa Sp6 (20 Upl); ARN Polimerasa T7 (15 ??µ?), PROMEGA) durante 60 minutos a 37°C. El marcador libre se retiró de la reacción usando Microconcentradores Microcon YM-50 (Amicon, Bedford, MA). Las secciones se desparafinizaron en xileno, se rehidrataron en soluciones de etanol graduadas como las descritas anteriormente y se fijaron en paraformaldehído al 4% (EMS, Ft. Washington, PA) durante 10 minutos a 4°C. Después, los tejidos se digirieron con Proteinasa K (5 mg/ml, 10 min, 37°C, Roche, Indianapolis, IN) y se lavaron en tampón SSC 0.5 X (tampón Solución Salina-Citrato Sódico) (10 minutos). La prehibridación se realizó después de la deshidratación secuencial en series graduadas de etanol, el proceso inverso al descrito anteriormente para la rehidratación, seguido de incubación en tampón de hibridación (formamida al 50%, SSC 2 X, sulfato de dextrano 10% v/v) durante 2 hora a 42°C. La hibridación se realizó durante una noche usando tampón de hibridación que contenía ARNt (50 µ9/?t??, Sigma, St. Louis, MO) y la sonda marcada apropiada a 55°C. Después, los tejidos hibridados se lavaron sucesivamente en tampón SSC 2X, tampón EDTA-SSC 0.1 X (SSC 0.1 X, EDTA 1 mM), y tampón SSC 2X durante 1 hora 40 minutos. Las placas se deshidrataron finalmente en series graduadas de etanol como se ha descrito anteriormente que contenían NH4OAc (2 minutos cada una) y se secaron en un secador al vacío durante 1 .5 horas a temperatura ambiente. -Los -tejidos se expusieron durante una noche a una a^aJla^e_Jós oj i^J- s_placas se recubrieron con emulsión fotográfica (Kodak, Rochester, NY) y se expusieron a 4°C durante 3-5 semanas antes de su revelado. Las placas reveladas se contrapigmentaron con hematoxilina y eosina.

Principios del análisis TaqMan El ensayo fluorogénico de 5'-nucleasa (Taqman PCR) usando el Sistema de Detección de Secuencia de Applied Biosystems 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) permitió una detección/cuantificación en tiempo real de un gen específico mediante el seguimiento del aumento de fluorescencia de una sonda de oligonucleótido específica del gen marcada con pigmento. Las sondas de los genes referencia y diana se marcaron en el extremo 5' con un pigmento reportero de 6-carboxifluoresceína y en el extremo 3' con un pigmento ¡nactivador de 6 carboxi-?,?,?',?'-tetrametilrodamina (TAMRA). Cuando la sonda se híbrida con el gen diana, la fluorescencia de 6FAM se evitó por la proximidad de TAMRA. La actividad exonucleasa de Taq polimerasa liberó los pigmentos de la sonda de oligonucleótido desplazando la sonda de la secuencia diana dando como resultado una excitación de la fluorescencia en proporción directa a la cantidad de mensaje diana presente. Los análisis de los datos se realizaron usando el software del Sistema de Detección de Secuencia de Applied Biosystems.

Cebadores y sond ^aí,marL_ TGF3 1. ANP, colágeno I, colágeno III Los cebadores y sondas se diseñaron usando Software de Análisis de Oligo Cebadores, Versión 5.0 (National Biosciences Inc. (NBI-)Wojciech Rychlik, Cascade, CO). Los cebadores fueron sintetizados por Life Technologies (Grand Island, NY) y las sondas fueron sintetizadas por Applied Biosystems. Los conjuntos cebador/sonda se diseñaron a partir de secuencias conocidas de genes de ratas a analizar. Todos los valores de los genes diana se normalizaron a un gen de referencia, ciclofilina expresada constitutivamente. Las secuencias de los conjuntos cebador/sonda pueden encontrarse en el cuadro 8.

Iodos Jos-oliaoj ucleótid os se escriben 5'-3'. Los cebadores no están marcados y todas las sondas están marcadas en el extremo 5' con pigmento reportero 6-carboxifluoresceína (6FAM) y en el extremo 3' con pigmento de inactivación de 6-carboxi-N,N-N',N'-tetrametilrodamina (TAMRA).

Aislamiento de ARN: TGFP1 , ANP, colágeno I, colágeno III Se extrajo el ARN de tejido congelado (-70°C) de ventrículo izquierdo (VI) (aproximadamente 10-20 mg) usando 1.5 mi de RNA-STAT 60 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Leedo Medical Laboratories, Inc., Houston, Texas). En resumen, los tejidos se homogeneizaron usando un homogeneizador de tejidos equipado con una sonda de 5 mm (Ultra-Turrax T8 Homogeneizer, IKA Works, Inc. Wilmington, NC). Después de la homogeneización, se incubó un volumen igual de cloroformo de calidad molecular (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) mezclando periódicamente durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 12,000 g durante 10 minutos y se precipitó ARN de la capa superior añadiendo un volumen igual de isopropanol de calidad molecular (Sigma Chemical Co.) seguido de incubación durante una noche a -80°C. El ARN se granuló por centrifugación a 12,000 g, se lavó con etanol al 75% y se solubilizó en agua sin nucleasa (Promega, Madison, Wl). El ARN se diluyó y analizó espectrofotométricamente para determinar su concentración y pureza (A260/A280 = 1.9 - 2.0 con un rendimiento medio de 2-5 µ9 de ARN).

T¾r÷S€i pGÍóft flv^¾aJ^ III Se sintetizó ADNc bicatenario añadiendo 400 ng de ARN (4 µ?) a un volumen final de 20 µ? que contenía 15% de agua sin nucleasa (Promega, Madison, Wl), Tampón RT 1X (Life Technologies, Grand Island, NY), DTT 10 m (Life Technologies), 0.5 mM de cada uno de dATP, dTTP, dGTP, dCTP (PE Biosystems, Foster City, CA), Oligo d(T)15 2.5 µ? (Oligo Therapeutics, Inc., Wilsonville, OR), 40 unidades de RNAsin (Promega) y 200 unidades de Transcriptasa Inversa SuperScript II (Life Technologies). Las reacciones se realizaron en tubos de reacción de paredes finas con tapones (Applied Biosystems) para asegurar temperaturas de reacción precisas. Las reacciones se realizaron usando un ciclador térmico GeneAmp 9600 (Applied Biosystems) de acuerdo con el siguiente protocolo: 1 hora a 37°C, 5 minutos a 95°C y 10 minutos a 4°C.

Análisis TaqMan: TGF31 , ANP, colágeno I, colágeno III Cada reacción PCR contenía los componentes que se indican a continuación: 2.5 µ? (50 ng) de cada ADNc añadido a 22.5 µ? de una mezcla PCR que contenía: 38.5% agua sin nucleasa (Promega), Tampón PCR II 1X, MgCI2 2m , 0.0511/µ? AmpliTaq Gold (PCR Core Reagent Kit, N808-0228, Applied Biosystems), 300 nM de cebador directo y 300 nM de cebador inverso (Life Technologies), 200 nM sonda (Applied Biosystems) y 200 µ? de cada uno de dATP, dTTP, dGTP y dCTP (Applied Biosystems). Las reacciones se prepararon en tubos ópticos MicroAmp con tapones ópticos MicroAmp (Applied- iosystem&) y se introíliijfíroQ en el Detector de Secuencia 7700. El siguiente protocolo se aplicó a todas las reacciones: 10 minutos a 95°C (activación de la polimerasa), 40 ciclos de 10 segundos a 95°C (desnaturalización) y 1 minuto a 57°C (hibridación).

Cebadores y sondas Taqman: COX-2, osteopontina, MCP-1 , ICAM-1 , VCAM-1 Los cebadores y sondas se diseñaron usando Primer Express Software suministrado con el Sistema de Detección 7700 y fueron sintetizados por Applied Biosystems. Se realizaron curvas patrón usando diluciones de 5 veces de ARN total (de 200 ng a 320 pg) para determinar la eficacia de cada conjunto cebador/sonda en la reacción Taqman antes del análisis de las muestras experimentales. Los conjuntos de cebador/sonda se diseñaron a partir de secuencias conocidas de genes de ratas a analizar. Todos los valores de los genes diana se normalizaron a un gen de referencia, ciclofilina expresada constitutivamente. Las secuencias de los conjuntos cebador/sonda pueden encontrarse en el cuadro 8.

Aislamiento de ARN: COX-2, osteopontina, MCP-1 , ICAM-1. VCAM-1 Se extrajo el ARN de tejido cardiaco congelado (-80°C) de rata usando el Totally RNA Isolation Kit (Ambion, Inc., Austin, TX). El tejido se aplastó-usando-un-mortero de-.ace.ro_in.oxidable_qua se_haJ3íajenfriadp a -80°C e traspa ó^ -u^ borooc^neizador^nunceL ÍKones. Vineland. NJ) que contenía 3-10 mi de tampón de desnaturalización frío. El tejido se homogeneízó y traspasó a un tubo de centrifugación estéril de polipropileno de 15 mi. Se añadió un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol de isoaminlo (25:24: 1 ), las muestras se agitaron enérgicamente durante 1 minuto y se incubaron en hielo durante al menos 15 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 30 minutos a 10,000 g. La fase acuosa se retiró, se añadió 1/10 volumen de una solución de acetato sódico (NaOAc 3,0M, pH 4.5) y las muestras se agitaron o invirtieron durante 10 segundos y se añadió ácido-fenol (premezclado con alcohol de isoamilo):cloroformo (5: 1 , Ambion, Inc.) a un volumen equivalente al volumen de muestra de partida. Las muestras se agitaron enérgicamente durante 1 minuto seguido de 15 minutos de incubación en hielo y se centrifugaron durante 30 minutos a 10,000 g. La fase acuosa se retiró y se introdujo en un tubo de polipropileno limpio. Se añadió un volumen igual de isopropanol (Sigma, St. Louis, MO) y las muestras se mezclaron e incubaron durante una noche a -20°C. Las muestras se centrifugaron durante 30 minutos a 10,000 g, el sobrenadante se retiró y el gránulo de ARN se resuspendió en agua sin ADNasa/ARNasa. Las muestras se congelaron a -80°C durante al menos 2 horas, se descongelaron en hielo húmedo y se diluyeron para su cuantificación. Todo el ARN se purificó adicionalmente por digestión con DNasa para retirar ADN genómico y por precipitación LiCI para eliminar los carbohidfatosT Ga a-ARN- 100iig-)~se incubó durante 45 minutos-a 37?C on una widad de lNAasaJRodieiDiaanQSticcs, Indianapolis. IN) y 10 unidades de inhibidor de ARNasa (Applied Biosystems, Foster City, CA) en un tampón que contenía Tris 40 mM pH 7.8, MgCI2 6 mM, CaCI2 10 mM. La ADNasa y el tampón se retiraron usando el protocolo RNeasy Mini para limpieza de ARN (Qiagen, Valencia, CA). Después, el ARN precipitó con LiCI 7.5M/EDTA 50 mM (Ambion Inc., Austin, TX) en un volumen igual a la mitad del volumen de muestra, se incubó durante una noche a -20°C y se centrifugó durante 30 minutos a 13-16,000 g a 4°C. Todo el ARN se congeló durante al menos dos horas a -80°C, se descongeló, se diluyó y se analizó espectrofotométricamente para determinar la concentración y pureza.

Análisis TaqMan: COX-2, osteopontina. MCP-1 , ICAM-1. VCAM- 1 Las reacciones TaqMan se realizaron como se indica a continuación. Diez µ? (200 ng) del ARN total (procesado con DNAasa y precipitado con LiCI) se añadió a 15 µ? de una mezcla de reacción RT-PCR que contenía: 12.5 µ? de Mezcla Maestra PCR de una etapa 2X sin uracil-A/-glicosilasa (contiene ADN Polimerasa AmpliTaq Gold , dNTP con dUTP, referencia pasiva y componentes tampón optimizado), 0.625 µ? de una MultiScribe 40X y Mezcla Inhibidora de ARNasa, 0.625 µ? de cebador directo 20 µ?, 0.625 µ? de cebador inverso 20 µ?, 0.5 µ? de sonda TaqMan 5µ? y 0.125 µ? de agua sin ADNasa/ARNasa. Las reacciones se prepararon por duplicado en placas ópticas de reacción de 96 pocilios MicroAmp con tapones ópticos — MicroAm o cubiertas adhesivas (Applied Biosvstems) y se introdujeron en el Detector de Secuencia 7700. El siguiente protocolo se aplicó a todas las reacciones: 30 minutos a 48°C (transcripción inversa), 10 minutos a 95°C (inactivación de transcriptasa inversa y activación de la polimerasa), 40 ciclos de 15 segundos a 95°C (desnaturalización) y 1 minuto a 60°C (hibridación).

Ensayo de hidroxiprolina La concentración de hidroxiprolina en el miocardio se midió con un ensayo colorimétrico que cuantifica la reacción entre hidroxiprolina oxidada y p-dimetilaminobenzaldehído como se ha descrito previamente (4). En resumen, los tejidos (180-250 mg) se secaron durante 18 horas a 60°C usando un bloque de calor Reacti-Therm (Pierce, Rockford, IL) y se pesaron. Los tejidos secos y un control positivo de colágeno (Colágeno Bovino Tipo I, Sigma, St. Louis, MO) se hidrolizaron con 2 mi de HCI 6N durante 3 hora a 150°C en el bloque de calor Reacti-Therm. El ácido se evaporó en una atmósfera de gas nitrógeno, las muestras se rehidrataron en 1 mi de tampón citrato-acetato (NaOAc 0.7M, citrato 0.2 , ácido cítrico 45 mM, pH 6.0) en presencia de 4 mi de isopropanol y se filtraron a través de un filtro Millex LCR de 0.45 µ?? (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI). El contenido de hidroxiprolina se midió incubando 60µ? de muestra hidrolizada o colágeno convencional con 350 µ? de tampón citrato-acétató^isoprópañol (t¾mpón~citrato-acetato-con sopropanol^l 40%^/v-)-y OO- 25°C. Se añadió reactivo de Erlich (1.25 mi, p-dimetilaminobenzaldehído 3.5 en ácido perclórico al 70% con isopropanol al 80%, v/v) para la visualización y cuantificación de la hidroxiprolina. Las muestras se incubaron a 60°C durante 30 minutos, se enfriaron a temperatura ambiente y se controló la absorbancia a 558 nm. El contenido de hidroxiprolina se cuantificó con una curva patrón preparada recientemente de trans-4-hidroxi-L-prolina (Sigma, St. Louis, MO). Todas las muestras y patrones se realizaron por duplicado.

Análisis estadístico Los datos se analizaron usando un análisis de varianza en una dirección (ANOVA). Como las presunciones de normalidad dentro de los grupos e igualdad de varianza entre grupos no podían satisfacerse, los análisis se realizaron sobre los valores transformados en el rango de los datos en bruto (análisis no paramétrico). El nivel alfa=0.05 de significancia se usó para las comparaciones planeadas entre las medias. El procedimiento de Diferencias Menos Significativas (LSD) se usó para las comparaciones planeadas entre grupos. Los datos se analizaron usando un PROC TTEST en el paquete software estadístico SAS (SAS PC, versión 6.12, SAS Institute, Cary, NC). Todos los datos se presentan como media ± error típico de la media (SEM). 5xdusióji e-anirnales Tres animales murieron durante el experimento: la rata n° 17 (grupo aldosterona + sal, muerta después de 24 días de infusión), rata n° 64 (grupo aldosterona + sal, muerta después de la cirugía) y la rata n° 5 (grupo de vehículo, muerta después de la cirugía). Otros animales se excluyeron si se descubrían múltiples parámetros que no representaban al grupo de tratamiento al que se habían asignado (por ejemplo, más de 3 desviaciones típicas de la media del grupo de tratamiento). Tres de estos animales se excluyeron del estudio: rata n° 57 (protocolo de 7 días, grupo de aldosterona + sal), rata n° 97 (protocolo 14 días, grupo de aldosterona + sal), rata n° 24 (protocolo 30 días, grupo de 100 mg/kg/dia eplerenona). Estos tres animales mostraron una expresión de los genes marcadores inflamatorios (COX-2, osteopontina, MCP-1 , ICAM- y VCAM-1 ) mayores de tres desviaciones típicas de la media del grupo de tratamiento. La rata n° 24 también se excluyó como resultado de disfunción en la unidad de telemetría. Los valores generados para estos animales se muestran en el cuadro 9.10-cuadro 9.19, separados de los datos de los otros animales en los cuadros de datos.

CUADRO 9,10 Datos Individuales usados para el cuadro 10 Control: vehículo + sal Rata 1 2 4 6 7 8 9 10 Día Presión Sanguínea Sisl tólica (mm Hg) 3 1 18 130 121 1 18 4 120 122 125 123 5 126 123 125 127 6 132 129 1 30 131 7 133 32 134 131 8 135 133 133 129 9 131 131 133 128 10 130 132 128 124 — 1 16 135 127 1 1 130 130 129 125 — 1 18 138 128 12 130 128 126 124 — 124 143 128 13 131 127 128 121 — 123 143 126 14 142 122 126 125 -- 128 148 128 15 144 128 127 128 — 125 134 127 16 132 133 127 128 — 125 134 123 17 133 133 127 123 — 124 140 128 18 134 133 129 121 — 126 143 128 19 125 129 120 125 — 124 140 128 20 1 19 131 121 125 122 139 126 21 123 131 125 126 120 136 128 22 127 128 128 126 125 133 129 23 129 133 131 125 128 138 131 24 132 134 130 125 132 140 130 25 133 131 125 125 128 36 129 26 132 131 127 126 132 141 130 = No se recogieron da os por problemas técnicos Aldosterona + sal Rata 1 1 12 13 14 15 16 18 19 20 Día Presión Sanguínea Sistólica (mmHg) 3 1 16 152 1 15 127 143 122 — 124 159 4 120 149 122 134 129 135 — 125 152 5 126 158 124 142 129 137 — 128 151 6 132 170 136 157 144 149 — 135 158 7 140 179 139 165 153 154 — 145 165 8 145 182 143 160 158 154 — 146 163 9 150 191 148 172 172 159 — 151 169 10 156 196 149 175 175 165 — 151 172 1 1 154 201 155 178 181 163 — 155 175 = o se recogeron aos por pro emas cncos E lerenonaJ^aldosteiox Rata 21 22 23 25 26 27 28 29 30 24* Día Presión Sanguínea Sistólica (mmHg) 3 123 126 130 128 119 125 126 125 130 4 130 128 131 139 122 126 128 130 134 5 132 134 132 143 123 127 127 133 142 6 133 142 136 152 126 133 137 140 150 7 140 142 143 156 132 140 140 141 156 8 142 146 141 156 131 138 138 139 152 9 142 146 139 154 130 133 137 141 151 10 143 143 138 158 134 136 139 142 149 1 1 145 139 138 160 136 137 140 145 152 12 147 140 139 165 137 139 140 148 154 13 148 144 137 170 140 140 140 149 153 14 146 142 138 178 43 144 143 152 161 - 15 145 143 37 173 143 144 141 149 156 16 148 137 137 179 145 145 143 150 164 17 148 141 143 182 149 148 143 160 174 18 151 146 144 187 152 149 148 162 177 19 156 147 145 192 153 154 150 166 177 20 159 147 146 92 155 151 151 168 176 21 162 148 52 200 159 154 155 175 182 22 162 149 153 203 160 58 155 176 185 23 169 157 157 209 163 160 159 180 191 24 168 164 159 21 1 163 162 161 180 195 25 174 165 161 215 165 161 161 182 198 26 178 I ?6 M63 G?23 16 166 16 192 G2?2 - = No se recogieron datos por problemas técnicos * Los datos de este animal no se consideraron en el análisis estadístico y no se incluyeron en los resultados finales CUADRQ-kU Datos Individuales usados para el cuadro 11 Control: vehículo + sal AldosteronaJ^sal * Los datos de este animal no se consideraron en el análisis estadístico y no se incluyen en los resultados finales. pierenona + aldosterona = No se recogieron datos por problemas técnicos CUADRO 9.12 Datos Individuales usados para el cuadro 12 Control: vehículo + sal _= No-se_recogieroji datos_p_qr_pjO blejrias técn icos nd = no se recogieron datos por falta de muestra de ARNm Aídosterona-^-sal no se incluyen en os resutados inales.

Epl emr+a^ aidosterona sal nd = No se recogieron datos por falta de muestra ARNm — CUADROL9JL3_ Datos Individuales usados para el cuadro 13 Control: vehículo + sal Aldosterona + sal Epte eflona + aldosterona- +sal 24* 273 822 178 3.9 21 1 46 13.45 * Los datos de este animal no se consideraron en el análisis estadístico y no se incluyen en los resultados finales.

CUADRO 9.14 Datos Individuales usados para el cuadro 14 Control: vehículo + sal Ateto ste ro n a ·+- sai * Los datos de este animal no se consideraron en el análisis estadístico y no se incluyeron en los resultados finales. €plefenona^aldosterena--*-sal CUADRO 9.15 Datos Individuales usados para el cuadro 15 Control: vehículo + sal N° Necrosis Fracción de Hidroxiprolin ARNm ARNm miocárdic Volumen de a ^g/mg) Colágeno Colágeno a (0-4) Colágeno % KAU) III (AU) 87 0.0 4.6 2.03 0.90 0.96 88 0.0 3.9 2.20 1 .60 1 .60 89 0.0 6.5 4.51 0.92 0.80 90 0.0 4.4 4.07 0.58 0.65 91 0.0 6.3 4.93 1.28 1 .42 92 0.0 3.1 4.00 0.94 1 .05 93 0.0 4.9 2.89 1.14 1.00 94 0.0 3.9 3.24 1 .07 1 .02 95 0.0 3.2 3.21 1 .56 1.00 96 0.0 3.7 3.16 0.80 0.56 127 0.0 4.9 2.66 nd nd 128 0.0 6.0 2.70 nd nd 129 0.0 6.1 2.84 nd nd Me 0.0 4.7 3.26 1.08 1.01 d SE 0.0 0.4 0.24 0.10 0.10 M nd = slo se recogieron datos por falta de muestra de ARNm * Los datos de este animal no se consideraron en el análisis estadístico y no se incluyeron en los resultados finales. £ lerercü3a^aldDste otia^+_S3l N° Necrosis Fracción de Hidroxiprolin ARNm ARNm miocárdic Volumen de a (ng/mg) Colágeno Colágeno a (0-4) Colágeno (%) KAU) III (AU) 133 1.0 4.1 2.95 0.86 0.60 134 0.0 6.2 5.97 0.86 1.19 135 1.0 3.9 6.52 0.90 1 .16 136 0.0 3.7 5.35 1.65 1.24 137 0.0 4.2 6.80 1 .14 1.70 138 0.0 3.5 5.32 1.44 1.81 139 1 .0 3.3 2.72 0.50 0.60 140 0.0 3.7 3.13 1.24 1.61 141 0.0 5.2 2.41 1.69 2.21 142 2.0 5.6 2.81 2.03 1.80 143 0.0 6.0 5.03 3.02 3.77 Med 0.5 4.5 4.46 1.39 1.61 SEM 0.2 0.3 0.50 0.21 0.26 CJUADRQ Q.tfi Datos Individuales usados para cuadro 16 Control: vehículo + sal N° Necrosis Fracción de Hidroxiprolin ARNm ARNm miocárdic Volumen de a ^g/mg) Colágeno Colágeno a (0-4) Colágeno (%) KAU) III (AU) 1 0.0 4.3 2.00 1 .69 1 .43 2 0.0 4.1 2.71 0.90 0.98 4 0.0 6.4 2.95 1 .65 1 .02 6 0.0 7.9 3.02 0.90 1.28 7 0.0 5.8 2.81 0.97 0.62 8 0.0 7.7 5.84 1 .03 0.54 9 0.0 6.0 5.45 0.69 0.94 10 0.0 7.1 7.03 0.92 0.48 Me 0.0 6.2 3.98 1 .09 0.91 d SE 0.0 0.5 0.65 0.13 0.12 M Aldosterona + sal Epierenona + aldosterona + sal * Los datos de este animal no se consideraron en el análisis estadístico y no se Incluyeron en los resultados finales.

CUADRO 9.17 Datos Individuales usados para el cuadro 17 Control: vehículo + sal nd = No se recogieron datos por falta de muestra de ARNm Aldosterona + sal no se incluyeron en los resultados finales.

Epierenona + aldosterona nd = No se recogieron datos por falta de muestra de ARNm CUADRO 9.18 Datos Individuales usados para cuadro 18 Control: vehículo + sal nd = No se recogieron datos por falta de muestra de ARNm Aldosterona + sal incluyeron en os resuta os finales.

N° COX-2 Osteopontin MCP1 TGF-ß ICAM VCAM (AU) a(AU) (AU) (AU) (AU) (AU) 133 1.56 4.03 1.78 0.58 1.20 0.54 134 1.04 1.00 1.37 0.62 1.36 0.66 135 0.70 0.77 1.27 1.04 0.95 0.61 136 1.41 8.43 1.75 1.42 1.26 0.61 137 3.78 1.59 1.60 1.29 1.56 0.67 138 1.86 3.97 1.24 1.49 0.98 0.86 139 6.19 3.93 1.92 0.71 1.51 1.21 140 1.87 2.13 1.24 1.21 0.79 1.00 141 0.99 0.72 1.89 1.44 0.98 0.68 142 1.92 4.76 2.21 1.69 1.72 1.60 143 0.86 0.99 1.20 2.41 0.83 0.68 Media 2.02 2.94 1.59 1.26 1.19 0.83 SEM 0.49 0.72 0.10 0.16 0.09 0.10 Datos individuales usados para cuadro 19 Control: vehículo + sal nd = No se recogieron datos por falta de muestra de ARNm ©sterem-fc-sal — nd = No se recogieron datos por falta de muestra de ARNm Eple emi^a-^ldestefORa^t-salt nd = No se recogieron datos por falta de muestra de ARNm 24* 12.21 54.57 8.14 1 .35 2.92 4.01 * Los datos de este animal no se consideraron en el análisis adístico y no se incluyeron en los resultados finales.

—Resultados Presión sanguínea La presión sanguínea permaneció normal en los controles de vehículo + sal durante el experimento (cuadro 10). La aldosterona + sal indujo un aumento progresivo en la presión sanguínea con el tiempo. En los animales que recibían epierenona + aldosterona + sal, la presión sistólica se redujo de forma significativa en los días 8-30. Sin embargo, la presión sanguínea permanecía alta en comparación con los controles de vehículo + sal.

CUAD£O_JJ0L Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con epierenona en la presión sanguínea con el tiempo Estos valores se expresan gráficamente en la figura 1 Los valores son la media ± SEM de los valores obtenidos cada 5 minutos durante un periodo de 24 horas. * Significativamente diferente de vehículo + sal, p<0.05. —"-Significativamente diferente de-aldostecona J-_saL p<QJ15 Eesn corporal JiÍpejtofia miocárdica y ANP Los pesos corporales eran significativamente menores en animales que recibían tratamiento de aldosterona + sal en los días 7, 14 y 30 en comparación con los controles de vehículo + sal de tensión normal (cuadros 11-13). La reducción en el peso corporal inducida por el tratamiento de aldosterona + sal se atenuó de forma significativa con la administración de epierenona en el día 30 (cuadro 11 ; figura 45). Se dio una hipertrofia ventricular izquierda y derecha significativa en respuesta al tratamiento de aldosterona + sal. La hipertrofia del ventrículo izquierdo fue evidente después de 7 días de tratamiento de aldosterona + sal (cuadro 1 1 ) mientras que la hipertrofia del ventrículo derecho solo fue evidente después de 30 días de tratamiento de aldosterona + sal (cuadro 13). La epierenona no afectó a los pesos absolutos de los ventrículos ni a las relaciones de longitud de tibia con peso ventricular inducidas con el tratamiento de aldosterona + sal (cuadros 1 1 -13). También se observaron aumentos significativos en los niveles de ARNm de péptido natriurético auricular (ANP) en animales tratados con aldosterona + sal (cuadros 11- 3). La regulación al alza de ARNm de ANP se redujo de forma significativa por epierenona después de 30 días de tratamiento, pero no después de 14 días (cuadro 13).

CUADRO.11 Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona en ratas después de 7 días de tratamiento Los valores son la media ± SEM medidos después de 7 días de tratamiento * Significativamente diferente de vehículo + sal, p<0.05. N° Significativamente diferente de aldosterona + sal, p<0.05. La dosis de eplerenona fue de 100 mg/kg/día ANP = péptido natriurético auricular AU = unidades arbitrarias, medidas en relación a la expresión de ciclofilina CUA0RO42 Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona en ratas después de 14 días de tratamiento Los valores son la media ± SEM medidos después de 14 días de tratamiento * Significativamente diferente de vehículo + sal, p<0.05. La dosis de eplerenona fue de 100 mg/kg/día ANP = péptido natriurético auricular AU = unidades arbitrarias, medidas en relación a la expresión de ciclofilina CUADRO 13 Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona en ratas después de 30 días de tratamiento Los valores son la media ± SEM medidos después de 30 días de tratamiento * Significativamente diferente de vehículo + sal, p<0.05. N° Significativamente diferente de aldosterona + sal, p<0.05. La dosis de eplerenona fue de 100 mg/kg/día ANP = péptido natriurético auricular AU = unidades arbitrarias, medidas en relación a la expresión de ciclofilina Rbresís-miocárdica Los niveles de fracción de volumen de colágeno intersticial e hidroxiprolina no fueron estadísticamente distintos en ningún momento entre los grupos del experimento (cuadros 14-16). Se detecto un aumento moderado en colágeno de tipo I en los tratamientos de aldosterona + sal y aldosterona + epierenona + sal a los 30 días en comparación con los controles de vehículo + sal (cuadro 16). Los niveles de ARNm de colágeno de tipo III no aumentaron de forma significativa en ningún momento (cuadros 14-16).

Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona sobre la lesión y ibrosis en el miocardio de ratas después de 7 días de tratamiento Los valores son la media ± SEM medidos después de 7 días de tratamiento La dosis de eplerenona fue de 100 mg/kg/día ICVF = Fracción de volumen de colágeno intersticial Colágeno-I = ARNm de colágeno tipo I Colágeno-lll = ARNm de colágeno tipo III AU = unidades arbitrarias, medidas en relación a la expresión de ciclofilina CUADRO 15 Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona sobre la lesión y fibrosis en el miocardio de ratas después de 14 días de tratamiento Los valores son la media ± SEM medidos después de 14 días de tratamiento La dosis de eplerenona fue de 100 mg/kg/día ICVF = Fracción de volumen de colágeno intersticial Colágeno-I = ARNm de colágeno tipo I Colágeno-lll = ARNm de colágeno tipo III AU = unidades arbitrarias, medidas en relación a la expresión de ciclofilina CUADRCLlfi Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona sobre la lesión y fibrosis en el miocardio de ratas después de 30 días de tratamiento Los valores son la media ± SEM medidos después de 30 días de tratamiento * Significativamente diferente de vehículo, p<0.05. N° Significativamente diferente de aldosterona + sal, p<0.05. La dosis de eplerenona fue de 100 mg/kg/día ICVF = Fracción de volumen de colágeno intersticial Colágeno-I = ARNm de colágeno tipo I Colágeno-lll = ARNm de colágeno tipo III AU =-unidades arbitrarias,jTiedidas-e relación-aJa expxesián-de-ciclofilina - HistopatcdQQLajleJjiuQcaidiQ Se evaluó el daño al tejido miocárdico después de 7, 14 y 30 días de tratamiento usando un sistema de evaluación semi-cuantitativo. Los corazones de los controles de vehículo + sal fueron histológicamente normales en todo momento. No se identificaron lesiones vasculares o miocárdicas en corazones de ratas que recibían aldosterona + sal después de 7 días de tratamiento (cuadro 14). Por el contrario, se observaron alteraciones de las arterias focales y miocárdicas a partir de los 14 días de tratamiento (cuadros 15 y 16). Los cambios cualitativos en las arterias y miocardio fueron similares después de 14 días y 30 días de tratamiento de aldosterona + sal pero la frecuencia y gravedad aumentó con el tiempo. Como se ilustra en la figura 44, la administración de epierenona atenuó notablemente las lesiones en el miocardio en todos los momentos (cuadros 14-16).

Expresión Genética de Mediadores Inflamatorios Se evaluaron los niveles de expresión de múltiples moléculas proinflamatorias usando análisis cuantitativo PCR Taqman (cuadros 17-19). Los niveles de expresión de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y proteína-1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1 ) aumentaron significativamente de forma similar con el tratamiento de aldosterona + sal en todos los momentos. La expresión de osteopontina también se reguló al alza notablemente después de 14 días (aumento de ~6 veces) y 30 días (-13 veces) de tratamiento de aldosterona + sal (cuadros 18-19 ). Los niveles de ARNm de factor de 19 imiento de tra^fo™aGtÓ ^ 6t - Jfío- ¾ F-p ) no-se-jegularoc al-aza ea ningún de los momentos examinados. La expresión del ARNm de la molécula 1 de adhesión intracelular (ICA - ) se reguló al alza al día 14 y 30 de tratamiento de aldosterona + sal aunque los aumentos fueron moderados (cuadros 9-10). La expresión genética de la molécula 1 de adhesión celular vascular (VCAM-1 ) aumentó dos veces el día 30 de tratamiento de aldosterona + sal, sin embargo este aumento no alcanzó la significancia estadística (cuadro 19). La expresión de todos los genes marcadores se redujo de forma significativa con la eplerenona en comparación a la expresión genética en animales tratados con aldosterona + sal (figura 46).

CUADRO 17 Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona en la expresión relativa de ARNm de los marcadores inflamatorios en ratas después de 7 días de tratamiento Los valores son medias de la expresión del ARNm en unidades arbitrarias + después de 7 días de tratamiento (respecto a la expresión de ciclofilina). * Significativamente diferente de vehículo + sal, p<0.05. N° Significativamente diferente de aldosterona + sal, p<0.05. La dosis de eplerenona fue de 100 mg/kg/día COX-2 = ciclooxigenasa-2 MCP-- = pjOteína-1^u¡m atrayente_monociIo^^ TGF-ß? = factor de crecimiento de transformación beta 1 ICAM = molécula-1 de adhesión intracelular VCAM = molécula-1 de adhesión celular vascular CUADRO 18 Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona en la expresión relativa de ARNm de los marcadores inflamatorios en ratas después de 14 días de tratamiento Los valores son medias de la expresión del ARNm en unidades arbitrarias ± SEM después de 14 días de tratamiento (respecto a la expresión de ciclofilina). — N° Significativamente diferente de aldosterona + sal, p<0.05. La dosis de epierenona fue de 100 mg/kg/día COX-2 = ciclooxigenasa-2 MCP-1 = proteína-1 quimioatrayente monocitos TGF-ß? = factor de crecimiento de transformación beta 1 ICAM = molécula-1 de adhesión intracelular VCAM = molécula-1 de adhesión celular vascular CUADRO 19 Efectos del tratamiento de aldosterona + sal sola o en combinación con eplerenona en la expresión relativa de ARNm de los marcadores inflamatorios en ratas después de 30 días de tratamiento Los valores son medias de la expresión del ARNm en unidades arbitrarias ± SEM después de 14 días de tratamiento (respecto a la expresión de ciclofilina). * Significativamente diferente de vehículo + sal, p<0.05. N° Significativamente diferente de aldosterona + sal, p<0.05. La dosis de eplerenona fue de 100 mg/kg/día COX-2 = ciclooxigenasa-2 MCP-1 = proteína-1 quimioatrayente monocitos TGF-ß? = factor de crecimiento de transformación beta 1 ICAM = molécula-1 de adhesión intracelular VCA = molécula-1 de adhesión celular vascular Inmunohistoquímica El análisis molecular de la respuesta proinflamatoria inducida con aldosterona + sal se caracterizó adicionalmente usando análisis inmunohistoquímicos. La mayoría de las células adheridas al endotelio e infiltradas en el espacio perivascular se pigmentaron en positivo para un anticuerpo monocito/macrófago (ED-1 ) y en negativo para un anticuerpo de célula T (CD-3). Hubo una expresión significativa de osteopontina evidente en los corazones de ratas tratadas con aldosterona + sal en comparación con la ausencia de pigmentación de osteopontina en corazones de controles de vehículo + sal. La expresión de osteopontina se localizó principalmente en las células del medio de arterias coronarias afectadas y en algunas no afectadas, pero también estaba presente en algunos macrófagos del espacio perivascular y en áreas de necrosis miocárdica. No se encontró evidencia de expresión significativa de osteopontina en los cardiomiocitos. La pigmentación ICAM-1 se identificó en células endoteliales y en el espacio vascular, sin embargo, VCAM-1 se expresó principalmente en células endoteliales. La administración de eplerenona redujo notablemente la pigmentación inducida con el tratamiento de aldosterona + sal en el tejido miocárdico para todas las p_roiejoas_maicaíiQi_e_valnadas Hibridación in-situ de ARNm de osteopontina Se realizó una hibridación in-situ para localizar la expresión de osteopontina en el tejido miocárdico. La mayor parte de ARNm de la osteopontina se encontró en las células del medio de las arterias coronarias; sin embargo, el mensaje de osteopontina también se identificó en células perivasculares y células infiltradas en áreas isquémicas y necróticas. El ARNm de osteopontina no estaba presente de forma evidente en cardiomiocitos o en áreas intersticiales no afectadas.

Conclusión El tratamiento de ratas con aldosterona en presencia de sal indujo inflamación vascular y daño en el tejido cardiaco. Este daño inducido con el tratamiento de aldosterona + sal estuvo precedido de una respuesta inflamatoria caracterizada por el aumento de moléculas proinflamatorias. La eplerenona atenuó notablemente esta respuesta inflamatoria vascular inicial y la posterior lesión en el miocardio. Hay disponibles otros modelos animales que son apropiados para la evaluación de la prevención de afecciones cardiovasculares incluyendo la prevención de aterosclerosis. Véase Stehbens, Prog. Card. Dis., XXIX, 1007-28 (1986) y Zhang y col., Science, 258, 468-71 (1992). En otra modalidad de la presente invención, se describe un procedimiento para tratar o prevenir vasculitis. La enfermedad de Behcet (BD) es un trastorno multisistema caracterizado por la vasculitis. Se ha sugerido que la BD y la enfermedad diverticular del colon pueden estar asociadas.

Sahan C y col. Behcet's Disease and Diverticulosis Dig Surg 2001; 18(5):421-2. Los bloqueadores de aldosterona usados en los procedimientos de la presente invención son útiles en el tratamiento y prevención de inflamación cardiovascular. Por lo tanto, los procedimientos de la presente invención serán útiles en el tratamiento y prevención de la enfermedad de Behcet y enfermedad diverticular, incluyendo enfermedad diverticular del colon. En otra modalidad de la presente invención, se describe un procedimiento para tratar o prevenir la miocarditis. En otra modalidad de la presente invención, se describe un procedimiento para tratar o prevenir la cardiomiopatía.

Miocarditis autoinmune experimental en ratas (EA ) La cardiomiopatía dilatada en ratas después de una miocarditis autoinmune inducida con miosina cardiaca puede usarse como modelo animal de insuficiencia cardiaca crónica. La miocarditis autoinmune experimental se induce en ratas Lewis por inmunización con miosina cardiaca porcina. La miocarditis grave aguda caracterizada por la aparición de células gigantes multinucleadas en las lesiones se provoca el día quince después de la inmunización. La miocarditis fulminante continúa hasta aproximadamente el día veintiocho, después la infiltración de células inflamatorias disminuye en el miocardio. Después de curar la miocarditis de células gigantes autoinmunes, es evidente una insuficiencia cardiaca crónica que se parece a Ja_ 7 cardiomiopatía humana dilatada. Los períodos de terapia pueden ser, por ejemplo, de seis semanas a partir de aproximadamente el día veintinueve. En un ejemplo, se forman grupos para determinar la eficacia de los tratamientos. Por ejemplo, se pueden formar cuatro grupos. Un grupo puede ser un grupo de control tratado con un vehículo tal como solución salina, por ejemplo. Los otros grupos pueden estar compuestos por ratas a las que se les administrará una dosificación baja, una dosificación media y una dosificación alta de un bloqueador de aldosterona. En un ejemplos particularmente preferido, a un primer grupo se le administra una dosificación baja de aproximadamente veinte miligramos de epoximexrenona por kilogramo de peso corporal por día. A un segundo grupo se le administra una dosificación media de aproximadamente cien miligramos de epoximexrenona por kilogramo de peso corporal por día. A un tercer grupo se le administra una dosificación alta de aproximadamente quinientos miligramos de epoximexrenona por kilogramo de peso corporal por día. La eficacia puede demostrarse midiendo diversos indicadores de remodelación cardiaca. Algunos indicadores no limitantes incluyen: parámetros hemodinámicos tales como presión sistólica en el ventrículo izquierdo, presión final diastólica en el ventrículo izquierdo; descubrimientos patológicos tales como peso del corazón, relación de peso entre el corazón y el cuerpo, área de fibrosis miocárdica y determinación de componentes de fibras de colágeno; y expresión de distintas proteínas de traducción de ARNm que se sabe que afectan a la remodelación tales como el factor-ß de crecjm[ento__de transíoimación (TGF-ß). Se cree que los procedimientos de la presente invención serán eficaces para tratar y prevenir miocarditis y cardiomiopatia. La superfamilia del factor-ß de crecimiento de transformación (TGF-ß) de los factores de crecimiento y diferenciación regula un intervalo muy amplio de funciones biológicas en el adulto, y tiene una importancia central en la formación de patrones y en la determinación del destino de una células durante el desarrollo embrionario. El TGF-ß tiene una amplia diversidad de efectos biológicos. En particular, estimula la producción de componentes de la matriz extracelular y suprime la degradación de la matriz extracelular inhibiendo la expresión de proteasas y aumentando la expresión de inhibidores de proteasa. Estos efectos en el crecimiento y en la matriz extracelular son importantes en la progresión de la cardiomiopatia. Un modelo en ratones APOe de la aterosclerosis se ha descrito en Roselear y col. {Arteríoscle. Thromb. Vasc. Biol., 16, 1013-18 (1996)). El bloqueador de aldosterona debe ser activo en la prevención de lesiones ateroscleróticas. Aunque esta invención se ha descrito con respecto a modalidades específicas, los detalles de estas modalidades no deben entenderse como limitaciones. Todos los documentos de patentes a los que se ha hecho referencia en este documento se incorporan como referencia.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- El uso de un bloqueador de aldosterona para preparar un medicamento para prevenir o tratar un trastorno relacionado con la inflamación seleccionado entre el grupo compuesto por miocarditis, cardiomiopatía, vasculitis y enfermedad de Behcet en un sujeto, en donde dicho medicamento altera la expresión de uno o más productos de expresión implicados, directa o indirectamente, en la regulación de la inflamación o la remodelación cardiaca en dicho sujeto. 2. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho trastorno relacionado con la inflamación es miocarditis. 3. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho trastorno relacionado con la inflamación es cardiomiopatía. 4. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho trastorno relacionado con la inflamación es vasculitis. 5. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho trastorno relacionado con la inflamación es la enfermedad de Behcet. 6. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha expresión de uno o más productos de expresión implicados, directa o indirectamente, en la regulación de la inflamación o_r_emo.d elacióa cardiaca en el sujeto se seleccionan entre el grupo compuesto por: ciclooxigenasa-2, osteopontina, MCP-1 , ICAM-1 , VCAM-1 , ANF, avP3, lnf-?, IL- 1 , TNF-a, NADH/NADPH oxidasa, radicales libres superóxido, TXA2, b-FGF, CD44, endotelina, receptor de la angiotensina II, t-PA activa, t-PA inactiva, PAI- 1 , CRP, IL-6, IL-10, IL-12, Troponina T, HSP65, amiloide, Fosfolipasa A2, fibrinógeno, CD40/CD40L, interleuquina-8, NF kappaB, factor-ß de crecimiento de transformación, la integrina de unión al colágeno a1 ß1 y la integrina de unión al colágeno a2p 7. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dos o más de dichos productos de expresión se co-expresan simultáneamente. 8. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho producto de expresión comprende ciclooxigenasa-2. 9. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde dicha ciclooxigenasa-2 se co-expresa con uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por osteopontina, MCP-1 , interleuquina-8, NF kappaB, factor ß de crecimiento de transformación, ICAM-1 y VCAM-1. 10. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho producto de expresión comprende osteopontina. 11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde dicha osteopontina se co-expresa con uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por ciclooxigenasa-2, MCP-1 , nrTterleuqu¡na-87N kappaB7factor ß de crecimiento de transformación, ICAM-1 y VCAM-1. 12. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho producto de expresión comprende MCP-1. 13. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde dicho MCP-1 se co-expresa con uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por ciclooxigenasa-2, osteopontina, interleuquina-8, NF kappaB, factor ß de crecimiento de transformación, ICAM-1 y VCAM-1. 14. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho producto de expresión comprende ICAM-1. 5. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde dicho ICAM-1 se co-expresa con uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por ciclooxigenasa-2, osteopontina, MCP-1 , interleuquina-8, NF kappaB, factor ß de crecimiento de transformación y VCAM-1. 16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho producto de expresión comprende VCAM-1. 17. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 16, en donde dicha VCAM-1 se co-expresa con uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por ciclooxigenasa-2, osteopontina, interleuquina-8, NF kappaB, factor ß de crecimiento de transformación, ICAM-1 y MCP-1. 8,— EI-usG-eomo el que se reclama en-la-reivindicación~67-en- donde dicho producto de expresión comprende interleuquina-8. 19. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en donde dicha interleuquina-8 se co-expresa con uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por ciclooxigenasa-2, osteopontina, VCAM-1 , NF kappaB, factor ß de crecimiento de transformación, ICAM-1 y MCP-1. 20. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho producto de expresión comprende NF kappaB. 21. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 20, en donde dicho NF kappaB se co-expresa con uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por ciclooxigenasa-2, osteopontina, VCAM-1 , interleuquina-8, factor ß de crecimiento de transformación, ICAM-1 y MCP-1. 22. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicho producto de expresión comprende factor ß de crecimiento de transformación. 23. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde dicho factor ß de crecimiento de transformación se co-expresa con uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por ciclooxigenasa-2, osteopontina, VCAM-1 , interleuquina-8, NF kappaB, ICAM-1 y MCP-1. 24. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en do cteires^Tnás^rcdartos-de-expre^ 25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho bloqueador de aldosterona es un antagonista del receptor de aldosterona. 26. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es un compuesto de tipo espirolactona. 27. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho compuesto de tipo espirolactona se selecciona entre el grupo compuesto por: 7a-acetiltio-3-oxo-4,15-androstadien-[17(ß-1 ')-spiro-5']perhidrofuran-2'-ona; 3-oxo-7a-propioniltio-4,15-androstadien-[17(p-1 ')-spiro-5']perhidrofuran-2'-ona; 6p,7p-metilen-3-oxo-4,15-androstad¡en-[17 -1')-sp¡ro-5']perhidrofuran-2'-ona; 15a,16 -metilen-3-oxo-4,7a-propioniltio-4-androsten-[17( -1 ')-spiro-5']perhidrofuran-2'-ona; 6p,7p,15a,16a-dimetilen-3-oxo-4-androsten-[17(p-1 ')-spiro-5']perhidrofuran-2'-ona; 7a-acetiltio-15p,16p-metilen-3-oxo-4-androsten-[17(ß-1 ')-spiro-5']perhidrofuran-2'-ona¡ 15ß, 16p-metilen-3-oxo-7p-propioniltio-4-androsten-[17(ß-1 ')-spiro-5']perhidrofuran-2'-ona; y 6 ,7p,15p,16p-dimetilen-3-oxo-4-androsten-[17(p-1 ')-spiro-5']perhidrofuran-2'-ona. 28. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es espironolactona. 29. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es un antagonista de aldosterona epoxi-esteroideo. 30.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29. en donde dicho compuesto epoxi-esteroideo tiene un resto epoxi condensado al anillo "C" del núcleo esteroideo de un compuesto 20-espiroxano. 31. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde dicho compuesto 20-espiroxano se caracteriza por la presencia de un resto epoxi sustituido en 9a, 1 1 ß. 32. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde dicho compuesto epoxi-esteroideo se selecciona entre el grupo compuesto por: ácido pregn-4-en-7,21 -dicarboxílico, 9,1 1-epoxi-17-hidrox¡-3-oxo-, ?-lactona, metil éster, (7a, 1 1a, 17ß)-; ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9,11-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-, dimetil éster, (7a, 1 1a, 17ß)-; ácido 3?-ciclopropa[6,7]pregna-4,6-dien-21 -carboxílico, 9,11-epoxi-6,7-dihidro-17-hidroxi-3-oxo-, ?-lactona, (6ß, 7ß, 1 a, 17ß)-; ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9, 1 -epoxi-17-hidroxi-3-oxo-,7-(1-metiletil) éster, sal monopotasio, (7a, 1 1a, 17ß); ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9,1 -epoxi-17-hidroxi-3-oxo-,7-metiletil) éster, sal monopotasio, (7a, 1 1 a, 17ß)-; ácido 3'H-ciclopropa[6,7]pregna-1 ,4,6-trien-21-carboxílico, 9,1 -epoxi-6,7-dihidro-17-hidroxi-3-oxo-, ?-lactona, (6ß, 7ß, 1 1 a)-; ácido 3'H-ciclopropa[6,7]pregna-4,6-dien-21-carboxílico, 9,11-epox¡-6,7-dihidro-17-hidroxi-3-oxo-, éster metílico, (6ß, 7ß, 11 a, 17ß)-; ácido 3?-ciclopropa[6,7]pregna-4,6-dien-21-carboxílico, 9,1 1-epoxi-6,7-dihidro-17-hidroxi-3-oxo-, sal monopotasio, (6ß, 7ß, 1 1a, 17ß)-; ácido 3'H-ciclopropa[6,7]pregna-4,6-dien-21-carboxílico, 9,11-epoxi-6,7-dihidro-17-hidroxi-3-oxo-, ?-lactona, (6ß, 7ß, 1 a, 17ß)-; ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9,1 -epoxi-17-hidroxi-3-oxo-, ?-lactona, éster etílico, (7a, 11a, 17ß)- y ácido pregn-4-en-7,?1-riicarhoxílicoT 9,1 -epoxi-17-hidroxi-3-oxo-, ?-lactona, 1 -metiletil éster, (7a, 11a, 17ß)-. 33.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aidosterona es epoximexrenona. 34.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aidosterona es el ácido pregn-4-en-7,2 -dicarboxílico, 9, 1-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-dimetil éster, (7a, 1a, 17ß)-. 35. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aidosterona es el ácido 3?-ciclopropa[6,7]pregna-4,6-dien-21-carboxilico, 9,11 -epoxi-6,7-dihidro-17-hidrox¡-3-oxo-, ?-lactona, (6ß, 7ß, 11 a, 17ß)- 36. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aidosterona es el ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9,1 1-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-,7-(1-metiletil) éster, sal monopotasio, (7a, 1 1a, 17ß)-. 37. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aidosterona es el ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9,11 -epoxi-17-hidroxi-3-oxo-,7-metil) éster, sal monopotasio, (7a, 11a, 17ß)-. 38.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aidosterona es el ácido 3?-ciclopropa[6,7]pregna-1 ,4,6-trien-21-carboxílico, 9,1 1-epoxi-6,7-dihidro-17-hidroxi-3-???-, ?-lactona, (6ß, 7ß, 11a)-. 39.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es el ácido 3?-ciclopropa[6,7]pregna-4,6-dien-21-carboxílico, 9,11-epoxi-6,7-dihidro-17-hidroxi-3-oxo-, éster metílico, (6ß, 7ß, 1 1a, 17ß)-. 40.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es el ácido 3?-ciclopropa[6,7]pregna-4,6-dien-21 -carboxilico, 9, 1 -epoxi-6,7-dihidro-17-hidroxi-3-oxo-, sal monopotasio, (6ß, 7ß, 1 1 a, 17ß)-. 41. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es el ácido 3?-ciclopropa[6,7]pregna-4,6-dien-21 -carboxilico, 9,11-epoxi-6,7-dihidro-17-h¡droxi-3-oxo-, ?-lactona, (6ß, 7ß, 11 a, 17ß)- 42. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es el ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9,1 1-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-, ?-lactona, éster etílico, (7a, 1 1 a, 17ß)-. 43. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es el ácido pregn-4-en-7,21-dicarboxílico, 9,1 1-epoxi-17-hidroxi-3-oxo-, ?-lactona, 1-etil éster, (7a, 1 1 a, 17ß)-. 44. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en donde dicho antagonista del receptor de aldosterona es drospirenona. 45.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 25, en 46.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde la cantidad de epoximexrenona administrable está entre aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 500 mg por día. 47.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz de epoximexrenona administrable está entre aproximadamente 0.5 mg y aproximadamente 100 mg por día. 48. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz de epoximexrenona administrable está entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 00 mg por día. 49. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz de epoximexrenona administrable está entre aproximadamente 0.5 mg y aproximadamente 25 mg por día. 50. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 45, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz de epoximexrenona administrable está entre aproximadamente 0.5 mg y aproximadamente 10 mg por día. 51. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho bloqueador de la aldosterona es 1 1 p-hidroxi-androst-4-en-3-ona 17- espirolactona o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 52.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho bloqueador de la aldosterona es un inhibidor de aldosterona. 53.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 52, en donde-dicho inhibidor-de-aldosterona se-selecciona entre el grupo compuesto — de P450 P, factores natriuréticos auriculares, inhibidores de 20-lisasa, inhibidores PKC, benzodiazepinas, bloqueadores de calcio, inhibidores de diacilglicerol lipasa, ¡onóforos de potasio, bloqueadores del transporte de electrones y etanol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 54. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 52, en donde dicho inhibidor de aldosterona es un inhibidor de la diacilglicerol lipasa. 55. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 54, en donde dicho inhibidor de la diacilglicerol lipasa es 1 ,6-bis- (ciclohexiloximinocarbonilamino)-hexano o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 56. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 52, en donde dicho inhibidor de aldosterona es un compuesto de benzodiazepina. 57. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 56, en donde dicho compuesto diazepina es diazepam, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 58. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 52, en donde dicho inhibidor de aldosterona es un inhibidor de aromatasa. 59. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 58, en donde dicho inhibidor de aromatasa es fadrozol, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 60. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 52, en ~ac e~ctichcrinhTbidcTd donde dicho inhibidor de lipoxigenasa es fenidona, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. 62. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 52, en donde dicho inhibidor de aldosterona es un inhibidor P450np. 63. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde dicho inhibidor P450-| P es 18-vinilprogesterona, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. 64. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho bloqueador de aldosterona es un inhibidor de aldosterona sintasa. 65. - El uso de un bloqueador de aldosterona para preparar un medicamento para prevenir o tratar un trastorno relacionado con la inflamación en un sujeto, en donde dicho medicamento altera la expresión de uno o más productos de expresión seleccionados entre el grupo compuesto por interleuquina-8, NF kappaB y factor-ß de crecimiento de transformación.