MXPA03010535A - Inhibidores de las src y otras proteinas cinasas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona compuestos de fórmula l:en donde A es N o CR, y G , R1, R2 y R3 son como se describióen la especificación. Estos compuestos son inhibidores de la proteína cinasa, particularmente inhibidores de la proteína cinasa Src de mamífero, involucrada en la proliferación celular, la muerte celular y la respuesta a estímulos extracelulares. La invención también se relaciona con métodos para producir estos inhibidores. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los inhibidores de la invención y métodos para utilizar estas composiciones en el tratamiento y prevención de varios trastornos.

Description

INHIBIDORES DE LAS SRC Y OTRAS PROTEÍNAS CINASAS CAMPO TÉCNICO DE A INVENCIÓN La presente invención se relaciona con los inhibidores de las cinasas c-Jun N terminales (JNK) y con las cinasas que pertenecen a la familia Src de las proteínas cinasas, especialmente las proteínas cinasas Src y Lck. Las cinasas de la familia Src están implicadas en el cáncer, trastornos inmunes y trastornos óseos. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los inhibidores de la invención y métodos para utilizar las composiciones en el tratamiento de varios trastornos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células de mamíferos responden a los estímulos extracelulares activando las cascadas de señalamiento que son mediadas por los miembros de la familia de la proteína cinasa activada por el mitógeno (MAP) , la cual incluye las cinasas reguladas por la señal extracelular (ERK) , las cinasas MAP p38 y las cinasas c-Jun N terminales (JNK) . Las cinasas MAP (MAPK) se activan por una variedad de señales que incluyen los factores de crecimiento, las citocinas, la radiación UV, y los agentes que inducen a la tensión. Las MAPK son cinasas de P03./158-VPI serina/treonina y su activación ocurre por la fosforilación doble de la treonina y la tirosina en el segmento Thr-X-Tyr en el anillo de activación. Las MAPK fosforilan varios sustratos, incluyendo los factores de transcripción, los cuales, a su vez, regulan la expresión de conjuntos específicos de genes y por lo tanto, mediante una respuesta específica a los estímulos. Una familia de las cinasas de particular interés es la familia Src de las cinasas. Estas cinasas están implicadas en el cáncer, la diefunción del sistema inmune y las enfermedades de remodelación ósea. Para las revisiones generales, véase Thomas y Brugge, Annu . Rev. Cell Dev.

Biol . (1997) 13, 513; Lawrence y Niu, Pharmacol . Ther. (1998) 77, 81; Tatosyan y Mizenina, Biochemi stry (Moscú) (2000) 65, 49; Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25 (7) , 717, (2000) . Los miembros de la familia ?rc incluyen las siguientes ocho cinasas en los mamíferos: Src, Fyn, Yes, Fgr, Lyn, Hck, Lck y Blk. Estas son proteínas cinasas no receptoras que fluctúan en masa molecular de 52 a 62 kD . Todas están caracterizadas por una organización estructural común que está comprendida de seis dominios funcionales distintivos: dominio 4 de homología Src (SH4) , un dominio único, dominio SH3 , dominio SH2 , un dominio catalítico (SH1) , y una región reguladora C terminal. Tatosyan et al.

P03/158-VPI Biochemistry (Moscú) 65, 49-58 (2000) . Basándose en estudios publicados, las cinasas Src están consideradas como objetivos terapéuticos potenciales para varias enfermedades humanas. Los ratones que tienen deficiencia de Src desarrollan osteopetrosis, o acumulación ósea, debido a una reabsorción ósea deprimida por los osteoclastos . Esto sugiere que la osteoporosis que resulta de una reabsorción ósea anormalmente alta, puede tratarse inhibiendo la Src. Soriano et al., Cell , 69, 551 (1992) y Soriano et al., Cell , 64, 693 (1991). Se ha logrado la supresión de la destrucción ósea artrítica mediante la sobreexpresión de la CSK en sinoviocitos y osteoclastos reumatoides. Takayanagi et al., J". Clin . Invest . , 104, 137 (1999). Las CSK, o la cinasa Src C terminal, fosforila y por lo tanto, inhibe la actividad catalítica de la Src. Esto implica que la inhibición de la Src puede evitar la destrucción de las articulaciones que es característica en pacientes que sufren de artritis reumatoide. Boschelli et al., Drugs of the Future 2000, 25(7), 717, (2000). La Src también juega un papel en la reproducción del virus de la hepatitis B. El factor de transcripción codificado viralmente HBx activa la Src en un paso requerido para la propagación del virus. Klein et al., EMBO J. , 18, 5019, (1999) y Klein et al., Mol . Cell . Biol . , P03/158-VPI 17, 6427 (1997) . Varios estudios han relacionado la expresión de la Src con cánceres tales como cáncer de colon, mama, hepático y pancreático, ciertas leucemias de las células B y linfornas. Talamonti et al., J. Clin . Invest . , 91, 53 (1993); Lutz et al., Biochem . Biophys . Res . 243, 503 (1998); Rosen et al-, J. Biol. Chem., 261, 13754 (1986); Bolen et al., Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 84, 2251 (1987); Masaki et al., Hepatology, 27, 1257 (1998); Biscardi et al., Adv. Cáncer Res . , 76, 61 (1999); Lynch et al., Leuke ia, 7, 1416 (1993) . Además, se ha demostrado que la Src antisentido expresada en las células de tumores de ovario y colon, inhiben el crecimiento del tumor. Wiener et al., Clin . Cáncer Res . , 5, 2164 (1999); Staley et al., Cell Growth Diff . , 8, 269 (1997). Otras cinasas de la familia de la Src también son objetivos terapéuticos potenciales. La Lck juega un papel en la señalización de las células T. Los ratones que carecen del gen Lck tienen una capacidad deficiente para desarrollar timocitos. La función de la Lck. como un activador positivo de la señalización de las células T sugieren que los inhibidores de la Lck pueden ser útiles para tratar enfermedades autoinmunes , tales como la artritis reumatoide. Molina et al., Nature, 357, 161 (1992) . La Hck, Fgr y Lyn, se han identificado como P03/158-VPI mediadores importantes de la señalización de la integrina en los leucocitos mieloides . Lowell et al., J. Leukoc . Biol . , 65, 313 (1999). La inhibición de estos mediadores de la cinasa puede por lo tanto, ser útil para tratar la inflamación. Boschelli et al., Druga of the Future 2000, 25(7) , 717, (2000) . En las proteínas cinasas c-Jun NH terminales, también conocidas como JNK, se han identificado tres genes distintos, JNK1, JNK2, JNK3 , y existen al menos diez diferentes isoformos de empalme de las JNK, en las células de mamífero [Gupta et al., EMBO J. , 15, 2760-70 (1996)]. Los miembros de la familia JNK son activados por las citocinas proinflamatorias, tales como el factor de la necrosis del tumor (TNFa) , y la interleucina-lß (IL-lß) , así como por una agresión ambiental, incluyendo la anisomicina, la irradiación UV, hipoxia y choque osmótico [Minden et al., Biochemica et Biophys ica Acta, 1333, F85-F104 (1997) ] . Los substratos corriente debajo de las JNK, incluyen los factores de transcripción c-Jun, ATF-2, Elkl, p53 y una proteína del dominio de la muerte celular (DENN) [Zhang et al., Proc . Nati . Acad . Sci . USA, 95, 2586-91 (1998) ] . Cada isoformo de la JNK se une a estos sustratos con diferentes afinidades, sugiriendo una regulación de las trayectorias de señalización por una especificidad del P03/158-VPI sustrato de diferentes JNK in vivo (Gupta et al-, supra) . Las JNK, junto con otras MAPK, también se han implicado en la mediación de la respuesta celular al cáncer, agregación de las plaquetas inducida por la trombina, trastornos de la inmunodeficiencia, enfermedades autoinmunes, muerte celular, alergias, osteoporosis y enfermedades cardiacas. Las condiciones terapéuticas relacionadas con la activación de la trayectoria de la JNK incluyen la leucemia mielógena crónica (CML, por sus siglas en inglés), la artritis reumatoide, el asma, la osteoartritis, la isquemia, el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas . Varios reportes han detallado la importancia de la activación de la JNK asociada con la enfermedad del hígado o episodios de isquemia hepática [Nat . Genet. 21, 326-9 (1999); FEBS Lett . 420, 201-4 (1997); J. Clin . Invest . 102, 1942-50 (1998); Hepatology 28, 1022-30 (1998) ] . También se ha reportado un papel de la JNK en la enfermedad cardiovascular, tal como el infarto al miocardio o falla cardiaca congestiva, puesto que se ha mostrado que la JNK media las respuestas hipertróficas a varias formas de tensión cardiaca [Circ . Res . 83, 167-78 (1998); Circulation 97, 1731-7 (1998); J. Biol . Chem . 272, 28050-6 (1997); Circ . Res . 79, 162-73 (1996); Circ . Res . 78, 947-53 P03/158-VPI (1996); J. Clin . Invest . 97, 508-14 (1996)]. Se ha demostrado que la cascada de la JNK también desempeña un papel en la activación de las células T, incluyendo la activación del promotor IL-2. Así, los inhibidores de la JNK tienen un valor terapéutico potencial en la alteración de las respuestas inmunes patológicas [ ". Immunol . 162, 3176-87 (1999); Eur. J. Immunol . 28, 3867-77 (1998); J. Exp . Med . 186, 941-53 (1997); Eur. J. Immunol . 26, 989-94 (1996) ] . También se ha establecido un papel de la activación de la JNK en varios cánceres, sugiriendo el uso potencial de los inhibidores de la JNK en el cáncer. Por ejemplo, la JNK activada de manera constitutiva, está asociada con la tumorigénesis mediada por HTLV-1 [Oncogene 13, 135-42 (1996)]. Los efectos proliferativos del bFGF y OSM en las células del sarcoma de Kaposi (KS, por aus siglas en inglés) , están mediados por su activación de la trayectoria de señalización de la JNK [J. Clin . Invest . 99, 1798-804 (1997)]. Otros efectos proliferativos de otras citocinas implicadas en la proliferación del KS, tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) , IL-6 y TNFa, también están mediados por la JNK. Además, la regulación del gen c-jun en célulaa transformadas p210 BCR-ABL, corresponde con la actividad de la JNK, sugiriendo un papel de los inhibidores de la JNK P03/158-VPI en el tratamiento para la leucemia mielógena crónica (CML) [Blood 92, 2450-60 (1998)]. La JNK1 y la JNK2 se expresan ampliamente en una variedad de tejidos. En contraste, la JNK3 se expresa selectivamente en el cerebro y en una extensión menor en el corazón y los testículos [Gupta et al., supra; Mohit et al., Neuron 14, 67-78 (1995); Martin et al., Brain Res . Mol . Brain Res . 35, 47-57 (1996)]. La JNK3 se ha relacionado con la apoptosis neuronal inducida por el ácido caínico, que indica un papel de la JNK en la patogénesis de la neurotoxicidad del glutamato. En el cerebro humano adulto, la expresión de la JNK3 , se localiza en una subpoblacidn de las neuronas piramidales CAÍ, CA4 y del subículo del hipocampo y las capas 3 y 5 de la neocorteza [Mohit et al., supra] . Las neuronas CAÍ de los pacientes con hipoxia aguda mostraron una fuerte inmunorreactividad nuclear a la JNK3 comparada con el teñido citoplasmático difuso, mínimo, de las neuronas hipocámpicas de los tejidos cerebrales de pacientes normales [Zhang et al., supra] . Así, parece que la JNK3 está involucrada en el daño hipóxico e isquémico de las neuronas CAÍ en el hipocampo. Además, la JNK3 se localiza inmunoquímica ente con las neuronas vulnerables en la enfermedad de Alzheimer [Mohit et al., supra] . La ruptura del gen JNK3 causó la resistencia de los ratones al ácido caínico, agonista del P03/158-VPI receptor del glutamato excitotóxico, incluyendo los efectos en la actividad convulsiva, la actividad transcripcional AP-1 y la apoptosis de las neuronas hipocámpicas, indicando que la trayectoria de señalización de la JNK3 es un componente crítico en la patogénesis de la neurotoxicidad del glutamato [Yang et al., Nature, 389, 865-870 (1997)]. Basándose en estos hallazgos, la señalización de la J?K, especialmente aquélla de la J?K3 , se ha implicado en las áreas de las enfermedades neurodegenerativas activadas por la apoptosis, tales como la Enfermedad del Alzheimer, Enfermedad de Parkinson, ALS (Esclerosis Lateral Amiotrófica) , epilepsia y convulsiones, Enfermedad de Huntington, lesiones cerebrales traumáticas, así como también apoplejía isquémica y hemorrágica. En consecuencia, existe todavía una gran necesidad de desarrollar inhibidores potentes de las proteínas cinasaa J?K3 , Src y Lck, que sean útiles en el tratamiento de varias enfermedades o condiciones asociadas con la activación de la J?K3 , Src y Lck.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se ha encontrado ahora que los compuestos de esta invención, y las composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos, son efectivos como inhibidores de las proteínas cinasas Src, Lck y JNK3. Estoa compuestos tienen P03/158-VPI la fórmula general I o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde A es nitrógeno CH, y R1, R2, R3 y G son como se describe posteriormente. Estos compuestos y las composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos, son útiles para tratar o aminorar la severidad de una variedad de trastornos, tales como el cáncer, enfermedad autoinmune, osteoporosis, y enfermedades inflamatorias.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un compuesto de fórmula I: o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: P03/158-VPI G es -XR o -XAr; cada X se selecciona de manera independiente de una cadena de alquilideno de C?_6, en donde una o dos unidades de metileno no adyacentes de X, están reemplazadas de manera independiente por -0-, -NR- , -S-, -C(0)-, -C(0)NR-, -NRC(O)-, -NRC(0)NR-, -SO-, -S02-, -NRS02-, -?02NR- o -NRS02NR-; A es N o CR; cada R se selecciona de manera independiente de hidrógeno o un grupo alifático de C?_8 opcionalmente suatituido, o dos grupoa R unidos al mismo nitrógeno se toman juntos con el nitrógeno para formar un anillo heterocíclico de 3-7 miembros que tiene 0-2 heteroátomos, además del nitrógeno unido a los mismos, seleccionado de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre; con la condición de que cuando G es -N(R)2, los dos grupos R no se toman juntos para formar un anillo; Ar es un anillo monocíclico opcionalmente sustituido de 5-6 miembros, saturado, parcialmente no saturado o completamente no saturado, que tiene de cero a tres heteroátomos aeleccionadoa de manera independiente de nitrógeno, azufre u oxígeno, o un anillo bicíclico opcionalmente sustituido de 8-10 miembros, saturado, parcialmente no saturado, o completamente no saturado, que tiene de cero a cuatro heteroátomos seleccionados de manera P03/158-VPI independiente de nitrógeno, azufre u oxígeno; R1 es T(n)-R o T(n)-Ar; n es cero o uno; T se selecciona de -C(0)-, -C02-, -C(0)C(0)-, -C(0)CH2C(0) -, -CONR-, -S(0)2- o -S(0)2NR-; R2 se selecciona de hidrógeno, Ar, o un grupo alifático de C?_B opcionalmente sustituido con 1-3 grupos seleccionados de manera independiente de oxo, OR, ?R, S02R, C(0)R, C02R, CN, N(R)2, =N-OR, =NN(R)2# =NNHC(0)R, =NNHC02R, =NNHS02R, Ar, NRC(0)N(R)2, NRC(0)R, NRC02R, C(0)N(R)2, S02N(R)2 o NRS02N(R)2; y R3 se selecciona de R o Ar. Como se utilizan aquí, deberán aplicarse las siguientes definiciones, a menos que se indique de otra manera. La frase "opcionalmente sustituido", se utiliza de manera indistinta con la frase "sustituido o no sustituido" . A menos que se indique de otra manera, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo, y cada sustitución es independiente de la otra. El término "alifático" o "grupo alifático", como se utiliza aquí, significa una cadena de hidrocarburo de C?-CB de cadena lineal o ramificada, que está completamente saturada o que contiene una o más unidades de insaturacidn, P03/158-VPI o un hidrocarburo de C3-C8 monocíclico o un hidrocarburo de CB-Ci2 bicíclico, que está completamente saturado o que contienen una o máa unidades de insaturación, pero el cual no es aromático (también referido aquí como "carbociclo" o "cicloalquilo"), que tiene un solo punto de unión al reato de la molécula, en donde cualquier anillo individual en el sistema anular bicíclico tiene 3-7 miembros. Por ejemplo, los grupos alifáticos adecuados incluyen, de manera no exclusiva, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo lineales o ramificados, e híbridoa de los mismos, tales como (cicloalquil) alquilo, (cicloalquenil) alquilo o (cicloalquil) alquenilo . Los términos "alquilo", "alcoxi", "hidroxialquilo", "alcoxialquilo", y "alcoxicarbonilo", utilizados solos o como parte de una porción más grande, incluyen cadenas lineales y ramificadas que contienen de uno a doce átomos de carbono. Loa términos "alquenilo" y "alquinilo", utilizados solos o como parte de una porción más grande, deben incluir cadenas lineales y ramificadas que contienen de dos a doce átomos de carbono. El término "heteroátomo" significa nitrógeno, oxígeno o azufre, e incluye cualquier forma oxidada de nitrógeno y azufre, y la forma cuaternizada de cualquier nitrógeno básico. También, el término "nitrógeno", incluye un nitrógeno auatituible de un anillo heterocíclico. Como P03/158-VPI un ejemplo, en un anillo saturado o parcialmente no saturado que tiene 0-3 heteroátomos seleccionados de oxígeno, azufre o nitrógeno, el nitrógeno puede ser N (como en el 3 , 4-dihidro-2H-pirrolilo) , NH (como en pirrolidinilo) o NR+ (como en el pirrolidinilo N sustituido) . El término "arilo", utilizado solo o como parte de una porción más grande como en "aralquilo", "aralcoxi", o "ariloxialquilo" , se refiere a sistemas anulares monocíclicos, bicíclicos y tricíclicos, que tienen un total de cinco a catorce miembros en el anillo, en donde al menos un anillo en el sistema es aromático y en donde cada anillo en el aietema contiene de 3 a 7 miembros en el anillo. El término "arilo", puede utilizarse de manera indistinta con el término "anillo de arilo". El término "arilo" también ae refiere a aistemas anulares de heteroarilo como se define aquí posteriormente. El término "heterociclo", "heterociclilo", o "heterocíclico", como se utiliza aquí, significa sistemas anulares no aromáticos, monocíclicos, bicíclicos o tricíclicoa, que tienen de cinco a catorce miembroa en el anillo, en el cual uno o máa miembros del anillo es un heteroátomo, en donde cada anillo en el sistema contiene de 3 a 7 miembroa en el anillo. El término "heteroarilo", utilizado solo o como parte de una porción más grande, como en "heteroaralquilo" P03/15B-VPI o "heteroarilalcoxi" , se refiere a sistemas anulares monocíclicos, bicícliclos y tricíclicos, que tienen un total de cinco a catorce miembros en el anillo, en donde al menos un anillo en el sistema es aromático, al menos un anillo en el sistema contiene uno o más heteroátomos; y en donde cada anillo en el sistema contiene de 3 a 7 miembros en el anillo. El término "heteroarilo", puede utilizarse de manera indistinta con el término "anillo de heteroarilo" o el término "heteroaromático" . Un grupo arilo (incluyendo aralquilo, aralcoxi, ariloxialquilo y lo similar) , o heteroarilo (incluyendo heteroaralquilo y heteroarilalcoxi y lo similar) , puede contener uno o más eustituyentes . Los auatituyentea adecuados en el átomo de carbono no saturado de un grupo arilo, heteroarilo, aralquilo o heteroaralquilo, se seleccionan de halógeno, -R° , -OR° , -SR°, 1 , 2-metilendioxi , 1, 2-etilendioxi, fenilo (Ph) substituido opcionalmente con R° ; -O(Ph) opcionalmente sustituido con R° ; -CH2 (Ph) opcionalmente sustituido con R° , -CH2CH2(Ph) opcionalmente sustituido con R° ; -N02; -CN; -N(R°)2; -NR°C(0)R°; -NR°C(0)N(R°)2; -NR°C02R° ; -NR°NR°C (O) R° ; -NR°NR°C (O) N (R° ) 2 ; -NR°NR°C02R°; -C (O) C (O) R° ; -C (O) CH2C (O) R° ; -C02R° , -C (O) R° ; -C(0)N(R°)2; -OC(0)N(R°)2; -S (0) 2R° ; -S02N(R°)2; -S(0)R°; -NR°S02N(R°)2; -NR°S02R°; -C (=S) N (R° ) 2 ; -C (=NH) -N (R° ) 2 ; O - (CH2)yNHC (0) R° ; en donde cada R° se selecciona de P03/158-VPI hidrógeno, un grupo alifático de C?_6 opcionalmente sustituido, un anillo de heteroarilo o heterocíclico de 5-6 miembros no sustituido, fenilo, -O(Ph), o -CH2(Ph). Loa austituyentes opcionales en el grupo alifático de R° ae seleccionan de NH2, NH(grupo alifático de C?_4) , N(grupo alifático de C1_4)2, halógeno, grupo alifático de C?_4) , OH, O(grupo alifático de C?_4) , N02, CN, C02H, C0 (grupo alifático de C^) , O (grupo haloalifático de C?_4) , o grupo haloalifático de C?_4. Un grupo alifático o un anillo heterocíclico no aromático puede contener uno o más sustituyentes. Los sustituyentes adecuados en el carbono saturado de un grupo alifático o de un anillo heterocíclico no aromático, se seleccionan de aquelloa listados anteriormente para el carbono no saturado de un grupo arilo o heteroarilo y de los siguientes: =0, =S, =NNHR*, =NN(R*)2, =NNHC (O) R*, =NNHC02 (alquilo) , =NNHS02 (alquilo) o =NR*, en donde cada R* ae selecciona de manera independiente de hidrógeno, o un grupo alifático de C?_6 opcionalmente sustituido. Los sustituyentes opcionales en el grupo alifático de R* se seleccionan de NH2, NH(grupo alifático de C1-4) , N(grupo alifático de C?-4)2, halógeno, grupo alifático de C?_4, OH, 0 (grupo alifático de C?_4) , N02 CN, C02H, C02 (grupo alifático de Ci_4) , O (grupo haloalifático de C?-4) , o halo (grupo alifático de C?-4) .

P03/158-VPI Loa austituyentes opcionales sobre el nitrógeno de un anillo heterocíclico no aromático se seleccionan de R+, -N(R+)2, -C(0)R+, -C02R\ -C(0)C(0)R+, -C (0) CH2C (0) R+, -S02R+, -S02N(R+)2, -C(=?)N(R+)2, -C (=NH) -N (R+) ?, o -NR+S02R+; en donde cada R+ es hidrógeno, un grupo alifático de C?_6 opcionalmente sustituido, fenilo opcionalmente suatituido, -O(Ph) opcionalmente eustituido, -CH2 (Ph) opcionalmente sustituido, -CH2CH2 (Ph) opcionalmente sustituido, o un anillo de heteroarilo o heterocíclico de 5-6 miembros no sustituido. Los sustituyentes opcionales en el grupo alifático o el anillo de fenilo de R* se seleccionan de NH2, NH (grupo alifático de C?_4) , N(grupo alifático de C?- )2, halógeno, grupo alifático de C?_4) , OH, 0 (grupo alifático de C?_4) , N02 CN, C02H, C02 (grupo alifático de C?_4) , 0 (grupo haloalifático de C?-4) , o halo (grupo alifático de C?-4) . El término "cadena de alquilideno", ae refiere a una cadena de carbono lineal o ramificada que puede eatar completamente saturada o tener una o más unidades de insaturación, y que tiene dos puntoa de unión al reato de la molécula. Una combinación de sustituyentes o variables es permisible únicamente si tal combinación da como resultado un compuesto estable o químicamente factible. Un compuesto eatable o un compuesto químicamente factible es uno que no se altera sustancialmente cuando se mantiene una P03/158-VPI temperatura de 40 °C o menos, en la ausencia de humedad u otras condiciones químicamente reactivas, durante al menos una semana . Será evidente para alguien con experiencia en la técnica que ciertos compuestos de esta invención pueden existir en las formas tauroméricas, todas esas formas tauroméricas de loa compuestos están dentro del alcance de la invención. A menos que se indique de otra manera, las estructuras descritas aquí, también pretenden incluir todas las formas estereoquímicas de la estructura, es decir, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico. Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos únicos, así como las mezclas enantioméricas y estereoméricas de los presentes compuestos, están dentro del alcance de la invención. A menos que se indique de otra manera, las estructuras descritas aquí también pretenden incluir los compuestos, que difieren únicamente en la presencia de uno o más átomos enriquecidoa isotópicamente. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras, excepto por el reemplazo de un hidrógeno por un deuterio o tritio, o el reemplazo de un carbón por un carbón enriquecido por 13C o 4C, están dentro del alcance de esta invención. Tales compuestos son útiles, por ejemplo, como herramientas o sondas analíticas en los ensayos biológicos.

P03/158-VPI Los grupos G preferidos de fórmula I son -X-R y -X-Ar, en donde X es una cadena de alquilideno de C?-4, y en donde una o dos unidades de metileno no adyacentes de X están reemplazadas de manera independiente por -S-, -SO-, -S02-, -0- o -NH- . Los grupos X más preferidos de fórmula I ae seleccionan de -S-, -0-, -NH- , -S02-, -NHCH2CH2NHCH2CH2-, -NHCH2CH2CH2- , -NHCH2CH2?CH2CH2- , o -NHCH2CH2-. Loa grupos R preferidos dentro de la porción -X-R de fórmula I se aeleccionan de un grupo alifático de C?_6 opcionalmente sustituido, y de manera más preferida, un alquilo de C?-4 opcionalmente sustituido. Los sustituyentes preferidos en el grupo R de -X-R de fórmula I seleccionan de halo, CN, oxo, N(R°)2, OH, 0R° , C02R° , C(0)R°, C(0)N(R°)2, NR°C02R°, SR° , NR°?02R°, S02R° , NR°C(0)R°, 0C(0)R° o NR°C(0)N(R°)2, en donde cada grupo R° se selecciona de manera independiente de hidrógeno o un grupo alifático de C?_4. Loa grupos R más preferidos de -X-R de fórmula I se seleccionan de metilo, etilo, iaopropilo, isobutilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, CH2CN, CH20H, CH2CH20CH3 , CH2CH2CF3, CH2siclopropilo, CH2C(0)CH3, CH2CH2N(Me)2, CH2CH2NHC (0) CH3, CH2CH2NHC02CH3 , CH2CH2OC(0)CH3, CH2CH(NH2)C02Et, CH2C=CCH3, o CH2CH(Me)2. Los grupos Ar preferidos dentro de la porción -X-Ar de fórmula I, se seleccionan de un anillo de arilo o P03/158-VPI un anillo saturado de 5-6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre, o un anillo de arilo o heteroarilo bicíclico de 9-10 miembros, opcionalmente sustituido que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los grupos Ar más preferidos dentro de -X-Ar de fórmula I son anillos opcionalmente sustituidos seleccionados de fenilo, piridilo, imidazolilo, tienilo, tiazolilo, [1, 3] dioxanilo, piperidinilo, morfolinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, furanilo, tetrahidrofuranilo, piranilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirrolilo, piperacinilo, tiomorfolinilo, naftilo, oxazolilo, triacinilo, tetrazolilo, ditiolanilo, dioxalanilo, benzofuranilo, benzotienilo o indolilo. Los grupos R1 preferidos de fórmula I son T(ll)-Ar. Los grupos Ar preferidos dentro de la porción R1 se seleccionan de un anillo de arilo o un anillo saturado de 6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 nitrógenos, o un anillo bicíclico parcialmente no saturado o completamente no saturado de 9-10 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los grupos Ar más preferidos dentro de la porción R1 son anillos suatituidoe opcionalmente seleccionados de fenilo, P03/158-VPI ciclohexilo, piridilo, naftilo, quinolinilo, isoquinolinilo, o indanilo. Los sustituyentes preferidos en Ar de R1 de fórmula I se seleccionan de R° , halógeno, N02, CN, 0R°, SR°, N(R°)2, C02R°, C(0)R°, C0N(R°)2, fenilo, S02R° , o NR°C(0)R°, en donde cada R° se seleccionan de manera independiente de hidrógeno o un grupo alifático de C?_4 opcionalmente sustituido. Los sustituyentea más preferidos en Ar de R1 de fórmula I, se seleccionan de metilo, etilo, oxo, CF3, OMe, C(0)Me, C (0) fenilo, CH=CH, C02H, C(0)NH2, SMe, C02Me, flúor, S02Me, N02, CN, cloro, N(Me)2, NHC(0)Me, NH2, cianofenilo, C02Et, CH20H, CH20Me, 3-CH2C02H-fenilo, o 3-CH2CH2C02H-fenilo. Los grupos R2 preferidos de fórmula I, se seleccionan de R, CH2N(R)2, o CH2Ar, en donde R es hidrógeno o un grupo alifático de C?_4 opcionalmente sustituido, y Ar es un anillo saturado o no saturado de 6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre. Los grupos R2 más preferidos de fórmula I son metilo, etilo, CH2 (morfolin-4-ilo) , CH2N(Me)2, CH2N(Et)2, CH2N(Me)CH2C02CH3, o CH2 (?i?eracin-1-ilo) . Los grupos R3 preferidos de fórmula I se seleccionan de un anillo alifático cíclico de 5-7 miembros, o de un anillo monocíclico saturado, parcialmente no P03/158-VPI saturado, o completamente no saturado de 6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene de cero a tres heteroátomoa, seleccionados de manera independiente de nitrógeno, azufre u oxígeno. Los grupos R3 más preferidos de fórmula I se seleccionan de un anillo de ciclohexilo, ciclopentilo, fenilo, piridilo, pirimidinilo o piridacinilo opcionalmente sustituido. Una modalidad preferida de esta invención se relaciona con un compuesto de fórmula I en donde G es S-R, como se muestra por la fórmula general IA siguiente: IA o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde A, R, R1, R2 y R3 son como se definió anteriormente. Los grupos R, R1, R2 y R3 preferidos de fórmula IA son aquellos descritos para la fórmula I anterior. De acuerdo con una modalidad más preferida, la presente invención se relaciona con un compuesto de fórmula HA: P03/158-VPI IIA o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde A, R, Ar, R2 y R3 son como ae definió anteriormente . Los grupos Ar, R2 y R3 preferidos de fórmula IIA son aquellos descritos para la fórmula I anterior. La Tabla 1 siguiente muestra los ejemplos representativos de los compuestos IIA, en donde A es N y Ar es un anillo de fenilo opcionalmente suatituido.

Tabla 1. Ejemplos de los Compuestos de la fórmula IIA: P03/158-VPI P03/158-VPI P03/158-VPI P03/158-VPI P03/158-VPI P03/158-VPI Los ejemplos de compuestos de Formula IIA, en donde R2 es metilo, R3 es fenilo, y R1 es diferente de fenilo, se muestran a continuación en la Tabla 2.

P03/158-VPI Tabla 2. Ejemplos de los Compueatos de Fórmula HA: P03/158-VPI Los ejemplos representativos de los compuestos de fórmula HA, en donde A es CH, G es ?-Me, R1 es fenilo, R3 es fenilo, y R2 es diferente de metilo, se muestran en la Tabla 3 a continuación.

P03/158-VPI Tabla 3. Ejemplos del Compuesto HA Otra modalidad de esta invención se relaciona con un compuesto de fórmula IB o IB' : IB IB' o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde cada X se selecciona de manera independiente de una cadena de alquilideno de C?_4 y en donde una o dos unidades de metileno no adyacentea de X se P03/158-VPI reemplazan de manera independiente por -S-, -S02-, -0-, o -NH- , y en donde A, R, Ar, R1, R2 y R3 son como se definió anteriormente . Los grupos R, Ar, R1, R2 y R3 preferidos, dentro de las fórmulas IB y IB' , son como se describió anteriormente para la fórmula I. La Tabla 4 siguiente muestra los ejemplos específicos de los compuestos de fórmula IB y IB' .

Tabla 4. Ejemplos de los Compuestos IB IB-l IB-2 IB-3 IB-4 P03/158-VPI IB-5 IB-6 IB-7 IB-8 IB-9 IB-10 IB-11 IB-12 P03/158-VPI IB' -2 IB' -3 IB' Otras modalidades de esta invención ae relacionan con compuestos de fórmula I, en donde G es -NH-R (fórmula IC) , G es -NH-Ar (fórmula ID) , G es -O-R (fórmula IE) , G es -O-Ar (fórmula IF) , G es -S02-R (fórmula 10) , G es -S02-Ar (fórmula IH) , G es -S (0) -R (fórmula IJ) , y G es -S (0) -Ar (fórmula IK) . Los ejemplos específicos de estas modalidades, en donde R3 es fenilo, se muestran a continuación en la Tabla 5.

P03/158-VP? Tabla 5 P03/158-VPI Los compuestos de esta invención pueden prepararse en general, por los métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica para loa compuestos análogos, como se ilustra por el Esquema de Reacción general siguiente y los ejemplos preparativos que siguen.

P03/158-VPI Esquema de Reacción I HA ia Reactivos y condiciones: (a) (CH3CO) 2C=C (SR) 2, 60°C; (b) DMF-DMA, tolueno, reflujo; (c) R1-NHC (=NH) NH2 , MeOH, reflujo El Esquema de Reacción I anterior, muestra una ruta general para preparar los presentes compuestos, en donde R3 es piridilo. En el paso (a) la piridinilhidracina ae condensa con la 3- (bie-alquilsulfanil-metilen) -pentan-2,4-diona, por ejemplo, utilizando la 3- (bia-metilsulfanil-metilen) -pentan-2 , 4-diona para proporcionar 2 (en donde R es metilo) . El tratamiento de 2 con dimetilformamida-dimetilacetal (DMF-DMA) , de acuerdo con el paso (b) , proporciona la enamina 3. El compuesto 3 puede ciclarse con varios derivados de guanidina para proporcionar los compuestos de fórmula HA. La oxidación de un compuesto HA con oxona, proporciona el compuesto de sulfonilo correspondiente de fórmula IG. El grupo sulfonilo de IG, a su vez, puede desplazarse por varias aminas, para P03/158-VPI proporcionar IC. De manera alterna, el grupo sulfonilo o el grupo sulfóxido correspondiente puede desplazarse por -?Ar, -?R, -OAr, u -OR para proporcionar otros compuestos de esta invención, utilizando los métodos conocidos para alguien con experiencia en la técnica. La actividad de un compuesto utilizado en esta invención como un inhibidor de la JNK3 , Lck o Src, puede probarse in vi tro, in vivo o en una línea celular de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Los enaayoa in vi tro incluyen ensayos que determinan la inhibición de la actividad de la fosforilación o la actividad de la ATPasa de la JNK3 , Lck o Src, activada. Los ensayos in vi tro alternativos cuantifican la capacidad de un inhibidor para unirse a la JNK3 , Lck o Src. La unión del inhibidor puede medirse radiomarcando el inhibidor antea de la unión, aislando el complejo de inhibidor/JNK3 , inhibidor/Lck, o inhibidor/?rc, y determinando la cantidad de unión de la radiomarca. De manera alternativa, la unión del inhibidor puede determinarse corriendo un experimento de competencia en donde los nuevos inhibidorea ae incuban con JNK3 , Lck o Src, unida a radioligandos conocidoa. Laa condiciones detalladas para probar un compuesto utilizado en esta invención como un inhibidor de la cinasa JNK3 , Lck o Src, se exponen en los Ejemplos siguientes. De acuerdo con otra modalidad, la invención P03/158-VPI proporciona una composición que comprende un compuesto de esta invención, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. La cantidad del compuesto en las composiciones de esta invención es tal, que es efectiva para inhibir de manera detectable una proteína cinaaa, particularmente la JNK3 , Lck o Src, en una muestra biológica o en un paciente. De manera preferida, la composición de esta invención se formula para la administración a un paciente en necesidad de tal composición. De manera más preferida, la composición de esta invención se formula para la administración oral a un paciente . El término "paciente", como se utiliza aquí, significa un animal, de manera preferida un mamífero, y de manera aún más preferida un humano. El término "portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable", se refiere a un portador, adyuvante o vehículo no tóxico, que no destruye la actividad farmacológica del compuesto con el cual se formula. Los portadores, adyuvantes o vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en las composiciones de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, intercambiadores de iones, alúmina, eetearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como P03/158-VPI seroalbúmina humana, sustancias amortiguadoras tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, salea o electrolitos, tales como sulfato de protamina, fosfato ácido disódico, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, salea de zinc, sílice coloidal, triailicato de magnesio, polivinil pirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina anhidr . La expresión "inhibe de manera detectable", como se utiliza aquí, significa un cambio mensurable en la actividad de la JNK3 , Lck o Src, entre una muestra que contiene la composición y una cinasa JNK3 , Lck o Src, y una muestra equivalente que comprende la cinasa JNK3 , Lck o Src, en ausencia de la composición. Un "derivado farmacéuticamente aceptable", significa cualquier sal, éater, sal de un éster u otro derivado de un compuesto de esta invención no tóxico, que tras la administración a un recipiente, es capaz de proporcionar, ya sea directa o indirectamente, un compuesto de esta invención o un metabolito o residuo inhibidor activo del mismo. Las eales farmacéuticamente aceptables de los P03/158-VPI compuestos de esta invención, incluyen aquéllas derivadas de ácidos y bases inorgánicos y orgánicos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de las sales de ácido adecuadas incluyen acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencensulfonato, bisulfato, butirato, citrato, alcanforato, alcanforsulfonato, ciclopentanpropionato, digluconato, dodecilsulfato, etaneulfonato, formiato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, glicolato, semisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietaneulfonato, lactato, maleato, malonato, metansulfonato, 2 -naftalensulfonato, nicotinato, nitrato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Otros ácidos, tales como el oxálico, aunque por eí miemoe no son farmacéuticamente aceptablea, pueden emplearse en la preparación de las sales útiles como intermediarios para la obtención de los compueetos de la invención y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables. Las sales derivadas de laa bases apropiadas, incluyen metales alcalinos (por ejemplo, sodio y potasio), metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), salee de amonio y N+ (alquilo de C?_4)4. Esta invención también considera la cuaternización de cualesquier grupos que P03/158-VPI contengan nitrógeno básico de los compuestos descritos aquí . Pueden obtenerse los productos dispersables o solubles en agua o aceite mediante tal cuaternización. Las composiciones de la presente invención pueden administrarse oralmente, parenteralmente, mediante inhalación por rocío, tópicamente, rectalmente, naealmente, bucalmente, vaginalmente o vía un recipiente implantado. El término "parenteral", como se utiliza aquí, incluye las técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuacular, intraarticular, intrasinovial , intraeaternal, intratecal, intrahepática, intraleaional e intracraneal. De manera preferida, las composicionee ee adminietran oralmente, intraperitonealmente o intravenosamente. Las formae inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas. Eataa suepeneiones pueden formularee de acuerdo con las técnicas conocidas en la técnica, utilizando agentes de dispersión o humectantes adecuados, y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspeneión inyectable eetéril en un diluyente o eolvente no tóxico, parenteralmente aceptable, por ejemplo, una eolución en 1 , 3 -butandiol . Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer y una solución de cloruro de sodio isotónica.

P03/158-VPI Además, los aceites fijos estériles, se emplean convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para eate propósito, cualquier aceite fijo blando puede emplearse, incluyendo loa mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de diglicérido, son útiles en la preparación de soluciones inyectables, puesto que son aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones oleosas pueden contener también un diluyente o dispersante de un alcohol de cadena larga, tal como carboximetil celulosa o agentes dispersantes similares, los cuales se utilizan comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables, incluyendo emulsiones y suspensiones. Otroa tensoactivos utilizados comúnmente, tales como Tweens, ?pans y otros agentes emulsificantes o promotores de la biodisponibilidad, los cuales se utilizan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquidas u otras formaa de doaificacidn farmacéuticamente aceptables, también pueden utilizarse para loa propósitos de la formulación. Las composiciones f rmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrarse oralmente en cualquier forma de dosificación oralmente aceptable, incluyendo, de P03/15B-VPI manera no exclusiva, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas. En el caso de tabletas para uso oral, los portadores utilizados comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. También se agregan típicamente agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para la administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para el uso oral, el ingrediente activo se combina con los agentes emulsificantes y de suspensión. Si se desea, también pueden agregarse ciertos agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes . De manera alternativa, las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención pueden administrase en la forma de supositorios para la administración rectal . Estos pueden prepararse mezclando el agente con un excipiente no irritante adecuado, el cual es sólido a temperatura ambiente, pero líquido a la temperatura rectal, y por lo tanto, se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen la manteca de cacao, cera de abejas y polietilenglicoles . Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención también pueden administrarse tópicamente, especialmente cuando el objetivo del tratamiento incluye áreas u órganos fácilmente accesibles por la aplicación P03/15T-VPI tópica, incluyendo enfermedades de los ojos, la piel o el tracto intestinal inferior. Las formulaciones tópicaa adecuadas se preparan fácilmente para cada una de estas áreas u órganos . La aplicación tópica para el tracto intestinal inferior puede efectuarse en una formulación de supositorio rectal (véase anteriormente) , o en una formulación de enema adecuada. También pueden utilizarse parches tópicamente transdérmicos . Para las aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en un ungüento adecuado que contenga el componente activo suspendido disuelto en uno o más portadores. Los portadores para la administración tópica de los compuestos de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, aceite mineral, petrolato líquido, petrolato blanco, propilenglicol, polioxietileno, compuesto de polioxipropileno, cera emulsificante y agua. De manera alternativa, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en una loción o crema adecuada, que contenga los componentes activoa suspendidos o diaueltos en uno o más portadores f rmacéuticamente aceptablea . Los portadorea adecuados incluyen, de manera no exclusiva, aceite mineral, monoestearato de sorbitan, polisorbato 60, cera de steres de cetilo, alcohol cetearílico, 2- P03/158-VPI octildodecanol , alcohol bencílico y agua. Para uso oftálmico, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse como suspensiones micronizadas en solución salina isotónica, estéril, a pH ajuatado, o de manera preferida, como aoluciones en solución salina isotónica, estéril, a pH ajustado, ya sea con o sin un preservativo tal como cloruro de benzalconio. De manera alternativa, para usos oftálmicos, las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden formularse en un ungüento tal como petrolato. Las composiciones farmacéuticamente aceptables de esta invención, también pueden administrarse mediante un aerosol nasal o por inhalación. Tales composiciones se preparan de acuerdo con las técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica, y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros preservativos adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarbonos, y/u otros agentes solubilizantes o diaperaantes convencionales. De manera más preferida, las composiciones f rmacéuticamente aceptablea de esta invención son formuladas para la administración oral . La cantidad de los compuestos de la presente invención que puede combinarse con los materiales P03/158-VPI portadores para producir una composición en una forma de dosificación única, variará dependiendo del huésped tratado, del modo particular de administración. De manera preferida, las composicionea deben formularse de manera que una dosis entre 0.01-100 mg/kg de peso corporal/día del inhibidor, pueda adminiatrarse a un paciente que recibe eataa composiciones. Deberá entenderse también que una dosificación específica y un régimen de tratamiento para cualquier paciente particular, dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y el juicio del médico tratante y la severidad de la enfermedad particular que se está tratando. La cantidad de un compuesto de la presente invención en la composición dependerá también del compuesto particular en la composición. Dependiendo de la condición particular, o enfermedad a ser tratada o prevenida, pueden administrarse agentes terapéuticos adicionales, los cuales normalmente se administran para tratar o prevenir esta condición en la monoterapia, también pueden estar presentes en laa composiciones de esta invención. Como se utiliza aquí, los agentes terapéuticos adicionales que se administran P03/158-VPI normalmente para tratar o prevenir una enfermedad o condición particular, se conocen como "apropiados para la enfermedad, o condición siendo tratada" . Por ejemplo, los agentes quimioterapéuticos u otros agentes antiproliferativos pueden combinarse con los compuestos de esta invención para tratar enfermedades proliferativas y el cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos conocidos incluyen, de manera no exclusiva, GleevecMR, adriamicina, dexametasona, vincristina, ciclofosf mida, fluorouracilo, topotecano, taxol, interferones, y derivados del platino. Otros ejemplos de loa agentes con los que los compuestos de esta invención también pueden combinarse incluyen, de manera no exclusiva, agentes antiinflamatorios talea como corticoesteroides, bloqueadores de TNF, IL-1 RA, azatioprina, ciclofosfamida y sulf salazina; agentes inmunomoduladores e inmunosupresores talea como la ciclosporina, tacrolimus, rapamicina, micofenolato de mofetilo, interferones, corticoesteroides, ciclofoafamida, azatioprina y sulfasalazina; factores neurotróficos tales como inhibidores de la acetilcolinesterasa, inhibidores de MAO, interferones, anti -convulsivos, bloqueadores del canal iónico, riluzol, y agentes antiparkinsonianos ; agentes para tratar la enfermedad cardiovascular, tales como bloqueadores beta, inhibidores de ACE, diuréticos, P03/158-VPI nitratos, bloqueadores del canal de calcio y estatinas; agentes para tratar enfermedades del hígado, tales como corticoesteroides, coleetiramina, interferones y agentes antivirales; agentes para tratar trastornos sanguíneos tales como corticoesteroides, agentes antileucémicos y factores del crecimiento; agentea para tratar la diabetes, tales como la inaulina, análogos de insulina, inhibidores de la alfa glucosidasa, biguanidas y sensibilizadores a la insulina; y agentes para tratar trastornos de inmunodeficiencia tales como gamma globulina. La cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones de esta invención, no será mayor que la cantidad que se administraría normalmente en una composición que comprenda ese agente terapéutico como el único agente activo. De manera preferida, la cantidad de agente terapéutico adicional en las composiciones descritas actualmente, variará de aproximadamente 50% a 100% de la cantidad normalmente presente en una composición que comprenda ese agente como el único agente terapéuticamente activo. De acuerdo con otra modalidad, la invención se relaciona con un método para inhibir la actividad de la cinasa JNK3 , Lck o Src, en una muestra biológica, que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con un compuesto de esta invención, o una composición que P03/158-VPI comprenda el compuesto. El término "muestra biológica", como se utiliza aquí, incluye, de manera no exclusiva, cultivoa celulares o extractos de los mismos; material de biopsias obtenidos de un mamífero o extractos de loa mismos; y sangre, saliva, orina, heces, semen, lágrimaa u otros fluidos corporales o extractos de los mismos. La actividad de la cinasa JNK3 , Lck o Src, en una muestra biológica es útil para una variedad de propósitos que son conocidos por alguien con experiencia en la técnica. Los ejemplos de tales propósitos incluye, de manera no exclusiva, transfusión sanguínea, transplante de órganos, almacenamiento de especímenes biológicos y ensayos biológicos . De acuerdo con otra modalidad, la invención proporciona un método para tratar o aminorar la severidad de una enfermedad o condición medida por la JNK3 , Lck o Src, en un paciente, que comprende el paso de administrar al paciente una composición farmacéuticamente aceptable de acuerdo con la presente invención. El término "enfermedad mediada por JNK", como se utilizan aquí, significa cualquier enfermedad u otra condición dañina en la cual se sabe que la JNK, juega un papel. Talea condiciones incluyen, de manera no exclusiva, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, P03/158-VPI trastornoa óseos destructivos, trastornos proliferativos, cáncer, enfermedades infeccionas, enfermedades neurodegenerativas, alergias, reperfusión/isquemia en apoplejía, ataques cardiacos, trastornos angiogénicos, hipoxia de loa órganos, hiperplasia vascular, hipertrofia cardiaca, agregación de las plaquetas inducida por trombina y condiciones asociadas con la prostaglandin endoperoxidasa sintaaa-2. Las enfermedades inflamatorias que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, asma, alergias y síndrome de agotamiento respiratorio en adultos. Las enfermedades autoinmunes que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, glomerulonefritia , artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, eacleroderma, tiroiditia crónica, enfermedad de Graves, gastritis autoinmune, diabetes, anemia hemolítica autoinmune, neutropenia autoinmune, trombocitopenia, dermatitis atópica, hepatitis crónica activa, miastenia gravia, eacleroaia múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, psoriasis o enfermedad de injerto va. huésped. Los trastornos óseos destructivos que pueden P03/158-VPI tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, la osteoporosis, osteoartritis y múltiples trastornos óseos relacionados con el mieloma. Las enfermedades proliferativas que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, la leucemia mielógena aguda, la leucemia mielógena crónica, el melanoma metastático, el sarcoma de Kaposi, el mieloma múltiple y la tumorigénesis mediada por HTLV-1. Los trastornos angiogénicos que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, tumores sólidos, neovasculización ocular, hemangiomas infantiles. Las enfermedades infecciosas que pueden tratarse o prevenirse por loa compuestos de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, sepsis, traumatismo séptico, y Shigellosis. Las enfermedades virales que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, infección por hepatitia aguda (incluyendo la hepatitis A, hepatitis B y hepatitis C) , infección por VIH y retinitis CMV. Las enfermedades neurodegenerativas que pueden tratarse o prevenirse por los compuestos de esta invención incluyen, de manera no exclusiva, enfermedad de Alzheimer, P03/158-VPI enfermedad de Parkinaon, esclerosis lateral amiotrófica (ALS, por sus siglas en inglés) , epilepsia, convulsiones, enfermedad de Huntington, lesión traumática del cerebro, apoplejía isquémica y hemorrágica, isquemias cerebrales o enfermedad neurodegenerativa, incluyendo la enfermedad neurodegenerativa activada por la apoptosis, causada por una lesión traumática, hipoxia aguda, isquemia o neurotoxicidad del glutamato. Las "enfermedades mediadaa por JNK", también incluyen la iaque ia/reperfuaión en apoplejía, ataques cardiacos, isquemia miocárdica, hipoxia de los órganoa, hiperplasia vascular, hipertrofia cardiaca, isquemia hepática, enfermedad del hígado, falla cardiaca congestiva, respuestas inmunes patológicas, tales como aquéllas causadas por la activación de las células T y la agregación de las plaquetas inducida por la trombina. Además, los compuestos de la presente invención pueden ser capaces de inhibir la expresión de las proteínas proinflamatorias inducibles . Por lo tanto, otras "condicionea mediadas por JNK", que pueden tratarse por los compuestos de esta invención incluyen el edema, analgesia, fiebre y dolor, tal como el dolor neuromuscular, dolor de cabeza, dolor causado por el cáncer, dolor dental y dolor causado por la artritis. Los compuestos de esta invención también son P03/158-VPI útiles como inhibidores de las cinasae de la familia Src, especialmente la Src y la Lck. El término "enfermedad mediada por Src o mediada por Lck", como se utiliza aquí, aignifica cualquier enfermedad u otra condición dañina en la cual se sabe que la Src o la Lck juega un papel. En consecuencia, estos compuestos son útiles para tratar enfermedades o condiciones que se sabe son afectadas por la actividad de una o más cinasas de la familia ?rc . Tales enfermedades o condiciones incluyen la hipercalcemia, restenosis, osteoporosie, osteoartritis, tratamiento sintomático de la metástasis ósea, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, psoriaeis, lupus, enfermedad del injerto versus el huésped, enfermedad de hipersensibilidad mediada por las células T, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Guillain-Barre, trastorno pulmonar obstructivo crónico, dermatitis por contacto, cáncer, enfermedad de Paget, asma, lesión isquémica o por reperfusión, enfermedad alérgica, dermatitis atópica y rinitis alérgica. Las enfermedades que son afectadas por la actividad de la Src, en particular, incluye la hipercalcemia, osteoporosis, osteoartritis, cáncer, tratamiento sintomático de la metástasis ósea y la enfermedad de Paget . Las enf rmedades que son afectadas por la actividad de la Lck, en particular, incluyen las enfermedades autoinmunes, P03/158-VPI alergias, artritis reumatoide y leucemia. Una modalidad preferida se relaciona con el método utilizado para tratar o prevenir una enfermedad mediada por JNK, seleccionada de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, trastornos óseos destructivos, enfermedades neurodegenerativas, alergias, reperfusión/isquemia en apoplejía, ataques cardiacos, trastornos angiogénicos, hipoxia de los órganos, hiperplasia vascular, hipertrofia cardiaca o agregación de las plaquetas inducida por la trombina. Otra modalidad preferida se relaciona con el método utilizado para tratar o prevenir una enfermedad mediada por Src o Lck, seleccionada de hipercalcemia, osteoporosis, osteoartritis o el tratamiento sintomático de la metástasis ósea. En una modalidad alternativa, los métodos de esta invención que utilizan las composiciones que no contienen un agente terapéutico adicional, comprenden el paao adicional de administrar de manera separada al paciente un agente terapéutico adicional. Cuando estos agentes terapéuticos adicionales se administran de manera separada, pueden administrarse al paciente antes de, secuencialmente o después de la administración de las composiciones de esta invención. Los compuestos de esta invención o las P03/158-VPI composiciones farmacéuticamente aceptables de los mismos, también pueden incorporarse en composiciones para recubrir un dispositivo médico implantable, tal como prótesis, válvulas artificiales, injertos vasculares, atents y catéteres. Los stenta vasculares, por ejemplo, se han utilizado para superar la restenosis (reestrechamiento de la pared del vaso deapués de una lesión) . Sin embargo, los pacientes que utilizan atenta u otros dispositivos implantables corren el riesgo de la formación de coágulos o la activación de las plaquetas. Estos efectos no deseados pueden prevenirse o mitigarse prerrecubriendo el dispositivo con una composición farmacéuticamente aceptable que comprenda un inhibidor de la cinasa. Los recubrimientos adecuados y la preparación general de los dispositivos implantables recubiertos, se describen en las Patentes de loa Eatadoa Unidos 6,099,562; 5,886,026; y 5,304,121. Loe recubrimientos son típicamente materiales poliméricos biocompatibles talea como polímero de hidrogel, polimetildisiloxano, policaprolactona, polietilenglicol, ácido poliláctico, acetato de etilenvinilo, y mezclas de los mismos. Los recubrimientos pueden cubrirse además, mediante un recubrimiento superior adecuado de fluorosilicio, polisacáridos , polietilenglicol, fosfolípidos o combinaciones de los mismos para impartir características de liberación controlada en la composición.

P03/158-VPI Los dispositivos implantables recubiertos con un compuesto de esta invención son otra modalidad de la presente invención. Con el fin de que la invención descrita aquí se entienda más completamente, se exponen loa aiguientes ejemplos. Deberá entenderse que estos ejemplos son para propósitos ilustrativos únicamente y no debe considerarse que limitan en modo alguno la presente invención.

Ejemplos Sintéticos Ej emplo 1. 3- (bis- ?tilsulfanil-mßtilen) -pentan-2, 4-diona: Una suspensión en DMF de 2 , 4-pentandiona (1.0 equivalentes), disulfuro de carbono (1.5 equivalentes) y K2C03 (1.5 equivalentes), se agitó a 0°C durante 3 h. A la suspensión resultante se le agregó yodometano (3.0 equivalentes) a 0°C, y se dejó calentar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y se agitó a esa temperatura durante la noche. A la mezcla de reacción se le agregó acetato de etilo y salmuera, la fase orgánica se lavó con salmuera doa veces y se secó sobre sulfato de magnesio, y se filtró. El solvente se removió bajo presión reducida y el producto se cristalizó para proporcionar el compuesto del título en un rendimiento del 83%.

P03/158-VPI Ejemplo 2. 1- (5-metil-3-mßtilsulfanil-l-plridin-2-il-l-H-pirazol-4-il) -etanona: Una mezcla de piridin-2-il-hidracina (1.0 equivalentes) y 3- (bis-metilsulf nil-metilen) -pentan-2 , 4-diona (1.0 equivalentes), se agitó a 60°C durante la noche. A la mezcla de reacción ae le agregó acetato de etilo y salmuera, la fase orgánica se lavó con salmuera dos veces, se secó sobre sulfato de magnesio, y se filtró. El solvente orgánico se removió bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título.

Ejemplo 3^_ 3-dimßtilamino-l- (5-metil-3-mßtilsulf nil-piridin-2-il-lH-pirazol-4-il) -propendía: Una solución en tolueno de 1- (5-metil-3 -metilsulfañil- 1-piridin-2- il-lH-pirazol -4-il) -etanona (1.0 equivalentes) y DMF-DMA (10.0 equivalentes) se calentó a reflujo durante la noche. A la mezcla de reacción se le agregó acetato de etilo y salmuera, la fase orgánica se P03/158-VPI lavó con salmuera dos veces, se secó sobre sulfato de magnesio, y ae filtró. El solvente se removió bajo presión reducida, y el producto crudo se purificó mediante cromatografía para proporcionar el compuesto del título.

Ejemplo 4. N- (3-bßnciloxi-fenil) -guanidina: Una suspensión en HCl dioxano 4 N de 3-benciloxianilina (1.0 equivalentes) y cianamida (1.0 equivalentes), se agitó a 100°C durante la noche. A la mezcla de reacción se le agregó agua y éter. La capa acuosa ae lavó con éter dos veces. La capa acuosa se ajustó a un pH mayor de 10 con NaOH 1M, y la guanidina deseada se extrajo con cloruro de metileno, se precipitó y filtró. La torta de filtración fue la N- (3 -benciloxi-fenil) -guanidina (rendimiento mayor del 80%) .

Ejemplo 5. (3-bßnciloxi-fßnil) - [4- (5-metil-3-mßtilsulf nil-l-piridin-2-il-lH-pirazol-4-il) -pirimidin-2-il] -amina (HA-124) : Una solución en metanol de 3 -dimetilamino-1- (5- P03/158-VPI metil -metilsulfañil -l-piridin-2-il-lH-pirazol -4-il) -propenona (1.0 equivalentes) y N- (3 -benciloxi-fenil) -guanidina (1.0 equivalentes) se sometió a reflujo durante la noche. La HPLC analítica indicó que la reacción estaba completa en un 40%. A la mezcla de reacción se le agregó acetato de etilo y salmuera. La fase orgánica se lavó con salmuera dos veces, se secó sobre sulfato de magnesio, y se filtró. El producto se precipitó y se filtró para proporcionar el compuesto del título en un rendimiento del 40%.

Ejemplo 6^ áster metílico del ácido fenil-hidracincarboditioico : A una solución agitada de fenilhidracina (30 mmol, 1 equivalente) , en acetonitrilo seco (20 ml) , se le agregó el éster dimetílico del ácido tritiocarbónico (30 mmol, 1 equivalente) , lentamente a temperatura de un baño de hielo. La mezcla se agitó durante 18 horas y se diluyó con éter dietílico (30 ml) . El sólido blanco resultante se filtró y se lavó con éter y se secó bajo nitrógeno para proporcionar el compuesto del título.

P03/158-VPI Ej emplo 7 . 1- ( 5 -metil-3 -metilsulf anil- l- f enil-lH-pirazol-4 -il) -etanona : El éster metílico del ácido N- fenil -hidracincarboditioico (1.98g, 10 mmol), 3-cloro-2,4-pentandiona (1.35 g, 10 mmol), y dietil iaopropilamina (2.0 ml, 12 mmol) , en acetonitrilo (10 ml) , se calentó a 70°C durante 10 horas. La mezcla se diluyó con acetato de etilo (30 ml) y agua (30 ml) . La capa orgánica se lavó con agua (30 ml) . Las capas acuosas se extrajeron nuevamente con acetato de etilo (30 ml , dos veces) . Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio y se concentraron. El sólido resultante se recristalizó con éter dietílico (30 ml) para proporcionar el compuesto del título amarillo pálido.

Ejemplo 8. 3-dimßtilamino-l- (5-mßtil-3-metilsulfanil-fßnil-lff-pirazol-4-il) -propenona: La 1- (5-metil-3-metilsulfanil-l-fenil-lH-pirazol-4-il) -etanona (1.2 g, 5 mmol) y el ?,?-dimetilformamida P03/158-VPI dimetil acetal (1.32 ml , 10 mmol) , se diluyeron en acetonitrilo (2 ml) y se calentaron a 80°C durante 36 horas. La mezcla se diluyó con éter dietílico (10 ml) y hexano (20 ml) , y se calentó brevemente. El sólido amarillo se recolectó y lavó con éter dietílico (5 ml) .

Ejemplo 9. [4- (5-metil-3-metilsulfanil-l-fßnil-lH-pirazol-4-il) -pirimidin-2-il] -fenil-a ina (IIA-1) : La 3-dimetilamino-l- (5-metil-3 -metilsulfanil-1-fenil-lH-pirazol-4-il) -propenona (30 mg, 0.1 mmol) y N-fenilguanidina (15 mg, 1.1 equivalentes) , se auapendieron en acetonitrilo (0.5 ml) , y se calentaron a 100°C durante 24 horae . La mezcla se diluyó con metanol (2 ml) y se calentó brevemente y se enfrió. El sólido resultante ae filtró y se lavó con metanol (1 ml) . El aólido se secó bajo presión reducida para proporcionar el compuesto del título . Se prepararon los siguientes compuestos utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 9 anterior, excepto por el reemplazo de la N-fenilguanidina con la N-f nilguanidina sustituida de manera apropiada.

P03/158-VPI Estos compuestos se purificaron mediante HPLC de fase inversa y se caracterizaron por RMN y LC/MS. Ejemplo 10. (4-fluoro-fenil) - [4- (5-metil-3-metilsulfanil-l-fßnil-lH-pirazol-4-il) -pirimidin-2-il] -amina (HA- 9) Ejemplo 11. (4-cloro-fenil) - [4- (5-metil-3-mßtilsulfanil-l-fenil-lH-pirazol-4-il) -pirimidin-2-il] -amina (IIA-114) Ejemplo 12. (3-cloro-fßnil) - [4- (5-m?til-3-metilsulfanil-l-fenil-lff-pirazol-4-il) -pirimidin-2-il] -amina (IIA-115) Ejemplo 13. (4-nitro-fßnil) - [4- (5-metil-3-mßtilsulfanil-l-fenil-lH-pirazol-4-il) -pirimidin-2-il] -amina (IIA-116) Ej emplo 14. (3 -benciloxi- f ßnil) - [4- (5 -metil-3 -mßtilsulfanil- l- fenil- lJÍ-pirazol-4-il) -pirimidin-2 -il] -amina (HA- 117 ) Ejemplo 15. (4-benciloxi-fenil) - [4- (5-mßtil-3 -metilsulfanil-l-fßnil-lH-pirazol-4-il) -pirimidin-2-il] -amina (IIA-118) Ejemplo 16. 3- [4- (5-metil-3-metilsulfanil-l-fenil-lH-pirazol-4-il) -pirimidin-2-ilamino] -fenol (IIA-119) P03/158-VPI Ensayo de inhibición de la Src Los compuestos se evaluaron como inhibidores de la cinasa Src humana utilizando un ensayo basado en la radioactividad o un ensayo espectrofotométrico .

Ensayo basado en la radioactividad Los compuestos se analizaron como inhibidores de la cinasa Src humana recombinante de longitud completa (de Upstate Biotechnology, cat. no. 14-117), expresada y purificada de células baculovirales . La actividad de la cinasa Src se verificó siguiendo la incorporación de 33P del ATP en la tirosina de un sustrato polimérico poli Glu-Tyr aleatorio, de composición, Glu : Tyr = 4:1 (Sigma, cat. no. P-0275) . Las siguientes fueron las concentraciones finales de los componentes del análisis: HEPES 0.025 M, pH 7.6, MgCl2 10 M, DTT 2 mM, BSA 0.25 mg/ml, ATP 10 µM (1-2 µCi de 33P-ATP por reacción), poli Glu-Tyr 5 mg/ml, y 1-2 unidades de cinasa Src humana recombinante. En un ensayo típico, todos los componentes de la reacción, con la excepción del ATP, se premezclaron y se dividieron en alícuotas en los pozos de una placa de ensayo. Los inhibidores disueltos en DMSO se agregaron a los pozos para dar una concentración final de DMSO de 2.5%. La placa de ensayo se incubó a 30°C durante 10 minutos antes de iniciar P03/158-VPI la reacción con 33P-ATP. Después de 20 minutos de reacción, las reacciones se enfriaron con 150 µl de ácido tricloroacético (TCA, por sus siglas en inglés) al 10%, que contiene Na3P04 20 mM. Las muestras enfriadas se transfirieron a una placa de filtro de 96 pozos (Whatman, UNI-Filter GF/Filtro de Fibra de Vidrio F, cat no. 7700-3310) , instalado en un múltiple a vacío de una placa de filtro. Las placas del filtro ae lavaron cuatro veces con TCA al 10% que contiene Na3P04 20 mM y a continuación 4 veces con metanol. 200 µl del fluido de centelleo se agregaron entonces a cada pozo. Las placas se sellaron, y la cantidad de radioactividad asociada con los filtros ae cuantifico en un contador de centelleo TopCount . La radioactividad incorporada se gráfico como una función de la concentración del inhibidor. Los datos se ajustaron a un modelo cinético de inhibición competitiva, para obtener la Ki del compuesto.

Ensayo de ßspßctrofotometria El ADP producido por el ATP por la fosforilación catalizada por la cinasa src recombinante humana del sustrato poli Glu-Tyr, se cuantificó utilizando un ensayo de enzima acoplada (Fox et al., (1998) Protein Sci . 7, 2249). En este ensayo, una molécula de NADH ae oxida a NAD por cada molécula de ADP producida en la reacción de cinasa. La P03/158-VPI desaparición del NADH puede seguirse convenientemente a 340 nm. Las siguientes concentraciones finales de los componentes del ensayo son: HEPES 0.025 M, pH 7.6, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, poli Glu-Tyr 0.25 mg/ml y cinaaa Src recombinante humana 25 nM. Laa concentraciones finales de los componentea del sistema de enzima acopladas son fosfoenilpiruvato 2.5 mM, NADH 200 µM, piruvato cinaaa 30 µg/ml y lactado deahidrogenasa 10 µg/ml. En un ensayo típico, todos los componentes de la reacción, con excepción del ATP, ae premezclan y se separan en alícuotas en pozos de una placa de ensayo. Los inhibidores disueltos en DMSO se agregan a loa pozos para dar una concentración final de DMSO de 2.5%. La placa de ensayo se incuba a 30°C durante 10 minutos antes de iniciar la reacción con ATP 65 µM. El cambio de la absorbancia a 340 nm con el tiempo, la velocidad de la reacción, se verifica en un lector de placas de dispositivos moleculares. Los datos de velocidad como una función de la concentración del inhibidor se ajustan al modelo cinético de inhibición competitiva para calcular la Ki para el compuesto . Muchos de los compuestos presentes probados en los enaayoa de inhibición de la Src proporcionaron un valor de Ki por debajo de uno micromolar.

P03/1S8-VPI Ensayo de inhibición de la Lck Los compuestos se evaluaron como inhibidores de la cinasa src humana utilizando un ensayo basado en la radioactividad o un ensayo espectrofotométrico .

Ensayo basado en la radioactividad Los compuestos se analizaron como inhibidores de la cinasa Lck de timo bovino de longitud completa (de Upstate Biotechnology, cat. no. 14-106), expresada y purificada de células baculovirales . La actividad de la cinasa Lck se verificó siguiendo la incorporación de 33P del ATP en la tirosina de un sustrato polimérico poli Glu-Tyr aleatorio, de composición, Glu : Tyr = 4:1 (Sigma, cat. no. P-0275) . Las siguientes fueron las concentraciones finales de los componentes del análisis: HEPES 0.025 M, pH 7.6, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, BSA 0.25 mg/ml, ATP 10 µM (1-2 µCi de 33P-ATP por reacción), poli Glu-Tyr 5 mg/ml, y 1-2 unidades de cinasa Src humana recombinante. En un ensayo típico, todos los componentes de la reacción, con la excepción del ATP, se premezclaron y se dividieron en alícuotas en los pozos de una placa de ensayo. Los inhibidores disueltos en DMSO se agregaron a los pozos para dar una concentración final de DM?O de 2.5%. La placa de ensayo se incubó a 30 °C durante 10 minutos antes de iniciar la reacción con 33P-ATP. Después de 20 minutos de reacción, P03/158-VPI las reacciones se enfriaron con 150 µl de ácido tricloroacético (TCA) al 10%, que contiene Na3P04 20 mM. Las muestras enfriadas se transfirieron entonces a una placa de filtro de 96 pozos (Whatman, UNI-Filter GF/Filtro de Fibra de Vidrio F, cat no. 7700-3310) , instalada en un múltiple al vacío de una placa de filtro. Las placas del filtro se lavaron cuatro veces con TCA al 10% que contiene Na3P0 20 mM y a continuación 4 veces con metanol. 200 µl del fluido de centelleo se agregaron entonces a cada pozo. Las placas se sellaron, y la cantidad de radioactividad asociada con los filtros se cuantificó en un contador de centelleo TopCount . La radioactividad incorporada se gráfico como una función de la concentración del inhibidor. Los datos se ajustaron a un modelo cinético de inhibición competitiva, para obtener la Ki del compuesto.

Ensayo espectrofotométrico El ADP producido del ATP por la fosforilación catalizada por la cinasa Lck recombinante humana del sustrato poli Glu-Tyr se cuantificó utilizando un ensayo de enzima acoplada (Fox et al (1998) Protein Sci 7, 2249) . En este ensayo, una molécula de NADH se oxida a NAD por cada molécula de ADP producida en la reacción de la cinasa. La desaparición del NADH puede seguirse de manera conveniente a 340 nm.

P03/158-VPI Las siguientes fueron las concentraciones finales de los componentes del análisis: HEPES 0.025 M, pH 7.6, MgCl2 10 mM, DTT 2 mM, poli Glu-Tyr 5 mg/ml, y cinasa Lck humana recombinante 50 nM. Las concentraciones finales de los componentes del sistema de enzima acoplada fueron fosfoenolpiruvato 2.5 mM, NADH 200 µM, piruvato cinasa 30 µg/ml y lactato deshidrogenasa 10 µg/ml. En un ensayo típico, todos los componentes de la reacción, con la excepción del ATP, se premezclaron y se dividieron en alícuotas en los pozos de una placa de análisis. Los inhibidores disueltos en DMSO se agregaron a los pozos para dar una concentración final de DMSO de 2.5%. La placa de análisis se incubó a 30°C durante 10 minutos antes de iniciar la reacción con ATP 150 µM. El cambio de la absorbancia a 340 nm con el tiempo, la velocidad de la reacción, se verificó en un lector de placas de dispositivos moleculares. Los datos de la velocidad como una función de la concentración del inhibidor, se ajustaron a un modelo cinético de inhibición competitiva, para obtener la Ki del compuesto. Muchos de los presentes compuestos probados en los ensayos de inhibición de la Lck, proporcionaron un valor de K± por debajo de uno micromolar.

P03/158-VPI Ensayos de inhibición de la JNK Clonación, Expresión y Purificación de la Proteína JNK3 Una búsqueda con BLA?T de la base de datos EST utilizando el ADNc de JNK3al publicado como una consulta, identificó una clona EST (#632588) que contiene la secuencia codificante completa para la JNK3al humana. Se utilizan reacciones en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) utilizando polimerasa pfu (Strategene) , para introducir los sitios de restricción en el ADNc para la clonación en el vector de expresión pET-15B en los sitios Ncol y BamHI . La proteína se expresa en E. Coli . Debido a la solubilidad deficiente de la proteína de longitud completa expresada (Met 1-Gln 422) , se produce una proteína truncada N terminalmente que inicia en el residuo Ser en la posición 40 (Ser 40) . Este truncamiento corresponde a Ser 2 de las proteínas JNK1 y JNK2 , y está precedido por un residuo de metionina (inicio) y un residuo de glicina. El residuo de glicina se agrega con el fin de introducir un sitio Ncol para la clonación en el vector de expresión. Además, se realizaron mediante PCR truncamientos C terminales sistemáticos, para identificar un constructo que origine cristales que tengan cualidades de difracción. Un constructo tal, codifica los residuos de aminoácidos Ser40-Glu402 de la JNK3al y está precedido por los residuos Met y Gly.

P03/1S8-VPI El constructo se prepara por PCR utilizando los desoxioligonucleótidos : 5 ' GCTCTAGAGCTCCATGGGCAGCAAAAGCAAAGTTGACAA 3' (cebador hacia delante con el codón de inicio subrayado) (SEQ ID N0:1) y 5 ' TAGCGGATCCTCATTCTGAATTCATTACTTCCTTGTA 3' (cebador inverso con el codón de paro subrayado) (SEQ ID NO: 2), como cebadores y se confirmó mediante la secuenciación del ADN. Los experimentos de control indicaron que la proteína JNK3 truncada tiene una actividad de la cinasa equivalente hacia la proteína básica de la mielina cuando se activa con una cinasa MKK7 corriente arriba in vi tro . La cepa BL21 (DE3) de E. Coli (Novagen) se transforma con el constructo de expresión de JNK3 y crece a 30°C en LB suplementado con 100 µg/ml de carbenicilina en matraces agitados, hasta que las células estuvieron en la fase logarítmica (OD600 ~ 0.8). Se agrega isopropiltio-ß D-galactosidasa (IPTG) a la concentración final de 0.8 mM y las células se recolectan 2 horas después mediante centrifugación. La pasta de las células E. Coli que contiene JNK3 se resuspende en 10 volúmenes/g del amortiguador de lisis (HEPES 50 mM, pH 7.2, que contiene 10% de glicerol (v/v), NaCl 100 mM, DTT 2 mM, PM?F 0.1 mM, Pepstatina 2 µg/ml, 1 µg/ml de E-64 y Leupeptina) . Se usaron las células sobre hielo utilizando un microfluidizador y se centrifugan a P03/158-VPI 100,000 x g durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante a 100,000 x g se diluye a 1:5 con Amortiguador A (HEPES 20 mM, pH 7.0, glicerol al 10% (v/v), DTT 2 mM) , y se purifica mediante cromatografía de intercambio de cationes SP-Sepharose (Pharmacia) (dimensiones de la columna: 2.6 x 20 cm) a 4°C. La resina se lava con 5 volúmenes de columna del Amortiguador A, seguido por 5 volúmenes de columna del Amortiguador A que contiene NaCl 50 mM. La JNK3 unida se eluye con un gradiente lineal de 7.5 volúmenes de columna de NaCl 50-300 mM. La JNK3 se eluye entre NaCl 150-200 mM.

Ejemplo 9. Activación de la JNK3 5 mg de JNK3 se diluyen a 0.5 mg/ml en amortiguador HEPES 50 mM, pH 7.5, que contiene NaCl 100 mM, DTT 5 mM, MgCl2 20 mM y ATP 1 mM. Se agrega GST-MKK7 (DD) a una relación molar de 1:2.5 de GST-MKK7 : JNK3. Después de la incubación durante 30 minutos a 25 °C, la mezcla de reacción se concentra 5 veces mediante ultrafiltración en un Centriprep-30 (Amicon, Beverly, MA) , diluida a 10 ml y se agrega ATP 1 mM adicional. Este procedimiento se repite tres veces para remover el ADP y reaprovisionar el ATP. La adición final de ATP es de 5 mM y la mezcla se incuba durante la noche a 4°C. La mezcla de reacción de JNK3/GST-MKK7 (DD) activada, se intercambia en amortiguador HEPES 50 mM, pH P03/158-VPI 7.5, que contiene 5 mM de DTT y glicerol al 5% (peso/volumen) mediante diálisis o ultrafiltración. La mezcla de reacción se ajusta con fosfato de potasio 1.1 M, pH 7.5, y se purifica mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (a 25°C) utilizando una columna Rainin Hydropore . La GST-MKK7 y la JNK3 inactivada, no se unen bajo estas condiciones, de manera que cuando se desarrolla un gradiente de fosfato de potasio de 1.1 a 0.05 M durante 60 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto, la JNK3 doblemente foeforilada se separa de la JNK fosforilada una sola vez. La JNK3 activada (es decir, la JNK3 doblemente fosforilada), se almacena a -70°C a 0.25-1 mg/ml.

Ejemplo 10. Análisis de inhibición de la JNK Los compuestos se analizan para la inhibición de la JNK3 , mediante un ensayo de enzima acoplada espectrofotométrico . En este ensayo, una concentración fija de JNK3 activada (10 nM) , se incuba con varias concentraciones de un inhibidor potencial disuelto en DMSO durante 10 minutos a 30°C, en un amortiguador que contiene amortiguador HEPES 0.1 M, pH 7.5, que contiene MgCl2 10 mM, fosfoenolpiruvato 2.5 nM, NADH 200 µM, piruvato cinasa 150 µg/ml, lactato deshidrogenasa 50 µG/ml y un péptido receptor EGF 200 µM. El péptido receptor EGF tiene la secuencia KRELVEPLTPSGEAPNQALLR (SEQ ID NO : 3 ) , y es un P03/158-VPI aceptor de fosforilo en la reacción de cinasa catalizada por JNK3. La reacción se inicia por la adición de ATP 10 µM y la placa de análisis se inserta en el compartimiento de la placa de análisis del espectrofotómetro, que se mantiene a 30°C. La disminución de la absorbancia a 340 nm se verifica como una función del tiempo y se determina el porcentaje de inhibición. Se encontró que muchos de los presentes compuestos probados en los análisis de inhibición de la JNK3, inhiben la JNK3. Aunque hemos descrito varias modalidades de esta invención, será evidente que estos ejemplos básicos pueden alterarse para proporcionar otras modalidades, las cuales utilicen los compuestos y métodos de esta invención. Por lo tanto, se apreciará que el alcance de esta invención se definirá por las reivindicaciones anexas, en lugar de por las modalidades específicas, las cuales se ha representado a manera de ejemplo.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES I Un compuesto de fórmula I o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: G es -XR o -XAr; cada X se selecciona de manera independiente de una cadena de alquilideno de C?_6, en donde una o dos unidades de metileno no adyacentes de X, están reemplazadas de manera independiente por -O-, -NR-, -S-, -C(O)-, -C(0)NR-, -NRC (O)-, -NRC(0)NR-, -SO-, -S02-, -NRS02-, -S02NR- o -NRS02NR-; A es N o CR; cada R se selecciona de manera independiente de hidrógeno o un grupo alifático de C?_B opcionalmente sustituido, o dos grupos R unidos al mismo nitrógeno se toman juntos con el nitrógeno para formar un anillo heterocíclico de 3-7 miembros que tiene 0-2 heteroátomos, además del nitrógeno unido a los mismos, seleccionado de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre; con la condición de que cuando G es -N(R)2, los dos grupos R no se P03/158-VPI toman juntos para formar un anillo; Ar es un anillo monocíclico opcionalmente sustituido de 5-6 miembros, saturado, parcialmente no saturado o completamente no saturado, que tiene de cero a tres heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, azufre u oxígeno, o un anillo bicíclico opcionalmente sustituido de 8-10 miembros, saturado, parcialmente no saturado, o completamente no saturado, que tiene de cero a cuatro heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, azufre u oxígeno; R1 es T(n,-R o T(n)-Ar; n es cero o uno; T se selecciona de -C(0)-, -C02-, -C(0)C(0)-, -C(0)CH2C(0) -, -CONR-, -S(0)2- o -S(0)2NR-; R2 se selecciona de hidrógeno, Ar, o un grupo alifático de C?_B opcionalmente sustituido con 1-3 grupos seleccionados de manera independiente de oxo, OR, SR, S02R, C(0)R, C02R, CN, N(R)2, =N-0R, =NN(R)2, =NNHC(0)R, =NNHC02R, =NNHS02R, Ar, NRC(0)N(R)2, NRC(0)R, NRC02R, C(0)N(R)2, S02N(R)2 o NRS02N(R)2; y R3 se selecciona de R o Ar. El compuesto según la reivindicación 1, en donde G es -X-R o -X-Ar, en donde: cada X se selecciona de manera independiente de P03/158-VPI una cadena de alquilideno de C?_4, en donde una o dos unidades de metileno no adyacentes de X, están reemplazadas de manera independiente por -S-, -SO-, -S02-, -0- o -NH- ; R es un grupo alifático de C?_6 opcionalmente sustituido; Ar es un anillo de arilo o un anillo saturado de 5-6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre, o un anillo de arilo o heteroarilo bicíclico de 9-10 miembros, opcionalmente sustituido que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre; y R3 se selecciona de un anillo alifático cíclico de 5-7 miembros, o de un anillo monocíclico saturado, parcialmente no saturado, o completamente no saturado de 6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene de cero a tres heteroátomos, seleccionados de manera independiente de nitrógeno, azufre u oxígeno. 3. El compuesto según la reivindicación 2, en donde : R es un grupo alifático de C?_4, opcionalmente sustituido con halo, CN, oxo, N(R°)2, OH, 0R° , C02R° , C(0)R°, C(0)N(R°)2, NR°C02R°, SR° , NR°S02R°, S02R° , NR°C(0)R°, 0C(0)R° o NR°C(0)N(R°)2, en donde cada grupo R° se selecciona de manera independiente de hidrógeno o un P03/158-VPI grupo alifático de C?_4; Ar es un anillo opcionalmente sustituido seleccionado de fenilo piridilo, imidazolilo, tienilo, tiazolilo, [1, 3] dioxanilo, piperidinilo, morfolinilo, pirrolilo, pirrolidinilo, furanilo, tetrahidrofuranilo, piranilo, imidazolilo, bencimidazolilo, pirrolilo, piperacinilo, tiomorfolinilo, naftilo, oxazolilo, triacinilo, tetrazolilo, ditiolanilo, dioxalanilo, benzofuranilo, benzotienilo o indolilo; y R3 se selecciona de un anillo de ciclohexilo, ciclopentilo, fenilo, piridilo, pirimidinilo o piridacinilo opcionalmente sustituido. 4. El compuesto según la reivindicación 2, en donde : R2 se selecciona de R, CH2N(R)2, o CH2Ar, en donde ; cada R se selecciona de manera independiente de hidrógeno o un grupo alifático de C?_4 opcionalmente sustituido, y Ar es un anillo saturado o no saturado de 6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre. 5. El compuesto según la reivindicación 1, en donde : P03/158-VPI R1 es T(n)-R, en donde n es cero; y Ar se selecciona de un anillo de arilo o un anillo saturado de 6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 nitrógenos, o un anillo bicíclico parcialmente no saturado o completamente no saturado de 9-10 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre . 6. El compuesto según la reivindicación 5, en donde: R1 es fenilo, ciclohexilo, piridilo, naftilo, quinolinilo, isoquinolinilo o indanilo, en donde: R1 está opcionalmente sustituido con 1-3 grupos seleccionados de R°, halógeno, N02, CN, 0R° , SR° , N(R°)2, C02R°, C(0)R°, C0N(R°)2, fenilo, S02R° , o NR°C(0)R°, en donde cada R° se seleccionan de manera independiente de hidrógeno o un grupo alifático de C?_4 opcionalmente sustituido . 7. El compuesto según la reivindicación 6, en donde R1 está opcionalmente sustituido con 1-3 grupos que se seleccionan de manera independiente de metilo, etilo, oxo, CF3, OMe, C(0)Me, C(O) fenilo, CH=CH, C02H, C(0)NH2, SMe, C02Me, flúor, S02Me, N02, CN, cloro, N(Me)2, NHC(0)Me, NH2, cianofenilo, C02Et , CH20H, CH2OMe, 3-CH2C02H-fenilo, o 3 -CH2CH2C02H- fenilo. P03/158-VPI 8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, en donde: R2 se selecciona de R, CH2N(R)2, o CH2Ar, en donde : cada R se selecciona de manera independiente de hidrógeno o un grupo alifático de C?- opcionalmente sustituido, y Ar es un anillo saturado o no saturado de 6 miembros opcionalmente sustituido, que tiene 0-2 heteroátomos seleccionados de manera independiente de nitrógeno, oxígeno o azufre. 9. El compuesto según la reivindicación 2, en donde el compuesto se selecciona de los siguientes compuestos : P03/158-VPI P03/158-VPI P03/158-VPI P03/158-VPI P03/158-VPI P03/158-VPI 10. El compuesto según la reivindicación 5, en donde el compuesto se selecciona de los siguientes compuestos : P03/158-VPI P03/158-VPI 11. El compuesto según la reivindicación 8, en donde el compuesto se selecciona de los siguientes compuestos : P03/158-VPI 12. El compuesto según la reivindicación 2, en donde el compuesto se selecciona de los siguientes compuestos : IB-1 IB-2 P03/158-VPI IB-3 IB-4 IB-5 IB-6 IB-7 IB-8 IB-9 IB-10 P03/158-VPI IB- 11 IB- 12 IB7 -2 IB' -3 IB' -4 13. El compuesto según la reivindicación 2, en donde el compuesto se selecciona de los siguientes compuestos : P03/158-VPI P03/158-VPI 14. Una composición que comprende un compuesto según la reivindicación 1, en una cantidad para inhibir de manera detectable la actividad de la cinasa JNK3 , Lck o Src, y un portador, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable . 15. La composición según la reivindicación 14, que comprende adicionalmente un agente terapéutico adicional, eeleccionado de un agente antiproliferativo, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador, un factor neurotrófico, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un agente para tratar una enfermedad del hígado, un agente antiviral, un agente para tratar trastornos sanguíneos, un agente para tratar la diabetes o un agente para tratar los trastornos de inmunodeficiencia . P03/158-VPI 16. Un método para inhibir la actividad de la cinasa JNK3 , Lck o Src en una muestra biológica, que comprende el paso de poner en contacto la muestra biológica con: a) un compuesto según la reivindicación 1; o b) una composición según la reivindicación 14. 17. Un método para tratar o aminorar la severidad de una enfermedad o condición medida por la JNK3 , Lck o Src, en un paciente, que comprende el paso de administrar al paciente una composición según la reivindicación 14. 18. Un método para tratar o aminorar la severidad de una enfermedad inflamatoria, enfermedad autoinmune, trastornos óseos destructivos, trastornos prolif rativos, enfermedades infeccionas, enfermedades neurodegenerativas, alergias, reperfusión/isquemia en apoplejía, ataques cardiacos, trastornos angiogénicos, hipoxia de los órganos, hiperplasia vascular, hipertrofia cardiaca, agregación de las plaquetas inducida por trombina o una condición asociada con las citocinas proinflamatorias que comprende el paso de administrar al paciente una composición según la reivindicación 14. 19. El método según la reivindicación 18, en donde el método se utiliza para tratar o prevenir una enfermedad inflamatoria seleccionada de pancreatitis aguda, P03/158-VPI pancreatitis crónica, asma, alergias o síndrome de agotamiento respiratorio en adultos. 20. El método según la reivindicación 18, en donde el método se utiliza para tratar o prevenir una enfermedad autoinmune seleccionada de glomerulonefritis, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, escleroderma, tiroiditis crónica, enfermedad de Graves, gastritis autoinmune, diabetes, anemia hemolítica autoinmune, neutropenia autoinmune, trombocitopenia, dermatitis atópica, hepatitis crónica activa, miastenia gravis, esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, psoriaeie o enfermedad de injerto vs. huésped. 21. El método según la reivindicación 18, en donde el método se utiliza para tratar o prevenir los trastornos óseos destructivos seleccionados de la osteoartritis, osteoporosis o múltiples trastornos óseos relacionados con el mieloma. 22. El método según la reivindicación 18, en donde el método se utiliza para tratar o prevenir las enfermedades proliferativas seleccionadae de la leucemia mielógena aguda, la leucemia mielógena crónica, el melanoma metaetático, el sarcoma de Kaposi o el mieloma múltiple. 23. El método según la reivindicación 18, en donde el método se utiliza para tratar o prevenir las P03/158-VPI enfermedades neurodegenerativas seleccionadas de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, isquemias cerebrales o enfermedad neurodegenerativa causada por una lesión traumática, hipoxia o neurotoxicidad del glutamato . 24. El método según la reivindicación 18, en donde el método se utiliza para tratar o prevenir isquemia/reperfusión en ataques cardiacos o isquemia miocárdica, isquemia renal, ataque cardiaco, hipoxia de los órganos, la agregación de las plaquetas inducida por la trombina. 25. El método según la reivindicación 18, en donde el método se utiliza para tratar o prevenir una condición asociada con la activación de las células T o con respuestas inmunes patológicas. 26. El método según la reivindicación 18, en donde el método se utiliza para tratar o prevenir un trastorno angiogénico seleccionado de tumores sólidos, neovasculización ocular o hemangiomas infantiles. 27. El método según la reivindicación 17, en donde la enfermedad seleccionada de hipercalcemia, restenosis, osteoporosis, osteoartritis, tratamiento sintomático de la metástasis ósea, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, P03/158-VPI psoriasis, lupus, enfermedad del injerto versus el huésped, enfermedad de hipersensibilidad mediada por las células T, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Guillain-Barre, trastorno pulmonar obstructivo crónico, dermatitis por contacto, cáncer, enfermedad de Paget, asma, lesión isquémica o por reperfusión, enfermedad alérgica, dermatitis atópica y rinitis alérgica. 28. El método según la reivindicación 27, en donde la enfermedad seleccionada de hipercalcemia, osteoporosis, osteoartritis, o tratamiento sintomático de la metástasis ósea. 29. El método según la reivindicación 17, en donde la enfermedad seleccionada de las enfermedades autoinmunes, alergias, artritis reumatoide y leucemia. 30. El método según la reivindicación 17, que comprende el paso adicional de administrar al paciente un agente terapéutico adicional, seleccionado de un agente antiproliferativo, un agente antiinflamatorio, un agente inmunomodulador, un factor neurotrófico, un agente para tratar una enfermedad cardiovascular, un agente para tratar una enfermedad del hígado, un agente antiviral, un agente para tratar trastornos sanguíneos, un agente para tratar la diabetes o un agente para tratar los trastornos de inmunodeficiencia, en donde: el agente terapéutico adicional es apropiado para P03/158-VPI la enfermedad que se está tratando; y el agente terapéutico adicional se administra junto con la composición como una sola forma de dosificación o de manera separada de la composición, como parte de una forma de dosificación múltiple. 31. Una composición para recubrir un dispositivo implantable, que comprende un compuesto según la reivindicación 1, y un portador adecuado, para recubrir el dispositivo implantable. 32. Un dispositivo implantable, recubíerto con una composición según la reivindicación 31. P03/158-VPI