MXPA03009313A - Metodos y medios para uso de receptores de celulas t restringidos por hla-dq y peptidos derivados de prolamina unidos a hla-dq. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un receptor de celula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o un fragmento funcional del mismo capaz de reconocer un peptido derivado de prolamina. La presente invencion tambien proporciona peptidos derivados de prolamina, aislados, recombinantes o sinteticos implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos. En otra modalidad mas la invencion proporciona un equipo de diagnostico que comprende un receptor de celula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante de acuerdo a la invencion o una celula hospedera que comprende un receptor de celula T de acuerdo a la invencion o un anticuerpo de acuerdo a la invencion y medios de deteccion adecuados. Ese equipo de diagnostico es, por ejemplo, muy util para detectar en alimentos, componentes de alimentos o muestras de pacientes (sospechosos) la presencia de peptido derivado de prolamina implicado en la enteropatia inmune relacionada con alimentos (por ejemplo: esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la infancia).

Description

METODOS Y MEDIOS PARA USO DE RECEPTORES DE CELULAS T RESTRINGIDOS POR HLA-DQ Y PEPTIDOS DERIVADOS DE PROLAMINA UNIDOS A HLA-DQ DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se relaciona con el campo de la biología molecular y la inmunología. De manera más específica, la invención se relaciona con enteropatías inmunes relacionadas con alimentos, como el esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis y alergias a los alimentos de la infancia. Como una de las representantes principales de esta familia de enfermedades, describiremos a la enfermedad celiaca (EC) o esprue o estomatitis celiaca con mayor detalle como representativa de las aplicaciones de la presente invención. La enfermedad celiaca (EC) o esprue o estomatitis celiaca es un trastorno del intestino delgado caracterizado por hiperplasia de células crípticas y atrofia vellosa, acompañada por un incremento en el número de linfocitos intraepiteliales . Los síntomas características son un síndrome de la mala absorción de moderado a severo, diarrea, caquexia y pérdida de peso, pero puede algunas veces incluir linfoma u otros tipos de cáncer. La enfermedad es causada por una sensibilidad al gluten (prolamina) y se precipita en individuos susceptibles por la ingestión de proteínas de cereal. La terapia actual de la EC implica principalmente el REF: 151048 el tratamiento dietético de pacientes sensibles al gluten con dietas que carecen de compuestos de cereal como la harina, los cuales privan a esos pacientes de esos alimentos fibroso típicos como por ejemplo el pan. El gluten de trigo comprende una mezcla de dos proteína, gluteninas y gliadinas, las cuales contienen 35-45% de glutamina (Q) y 12-20% de prolina (P) . Las gluteninas son de alto peso molecular, que comprenden aproximadamente 500-1000 aminoácidos, unidos covalentemente cabeza a cola por puentes disulfuro, formando complejos multiméricos . Las ' gluteninas son responsables de la elasticidad y extensibilidad del gluten. Las gliadinas son de bajo peso molecular más bajo, comprenden aproximadamente 250-600 aminoácidos, son monoméricas, y son responsables de la viscosidad del gluten. Los criterios para productos libres de gluten son establecidos por el Codex Alimentarius Committee "Nutrición y Alimentos para Usos Dietéticos Especiales" que se reúne cada 1.5 años. El criterio actual se basa en la determinación de nitrógeno. Para ser considerado libre de gluten un producto puede contener como máximo 50 mg de N por 100 gramos de producto. La determinación de nitrógeno es únicamente útil cuando existe cierta relación entre la cantidad de nitrógeno y la cantidad de gluten. Esto es solo cierto, en cierto grado, para el trigo. Mediante la determinación de la cantidad de gluten (por la medición de nitrógeno) no se obtienen datos relevantes sobre la cantidad de compuestos tóxicos que estén realmente implicados en el desarrollo y persistencia de la enteropatia inmune relacionada con alimentos. La presente invención reconoce este problema y describe medios y métodos para determinar la cantidad de péptidos derivados de prolamina (tóxicos) implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos. La presente invención también describe fármacos novedosos basados en péptidos derivados de prolamina identificados. En una primera modalidad la invención proporciona un receptor de células T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente funcional y/o fragmento del mismo capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina. Ese receptor de células T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o variaciones del mismo pueden ser obtenidos por métodos como se describe aquí dentro de la parte experimental. La parte experimental describe respuestas de células T específicas del gluten en pacientes pediátricos con enfermedad celiaca positivos a HLA-DQ2. De manera breve, se recolectaron biopsias de células T de pacientes pediátricos sospechosos de enfermedad celiaca de acuerdo a lo indicado por síntomas clínicos típicos y/o pruebas antiendomisio positiva. Las biopsias fueron cultivadas con una digestión de gluten con tripsina/pepsina o la misma preparación que había sido adicionalmente tratada con transglutaminasa tisular (tTG) . La parte experimental también describe respuestas de células T especificas al gluten en pacientes adultos con enfermedad celiaca positivos a HLA-DQ2. De manera breve, se recolectaron biopsias intestinales de pacientes adultos que fueron diagnosticados de acuerdo a lo descrito anteriormente y se cultivaron biopsias con gluten que había sido digerido con pepsina y tripsina o con quimotripsina . Los cultivos, de origen pediátrico . o adulto, que mostraron evidencia de proliferación de células T fueron expandidos y probados para determinar su especificidad. Las clonas de células T específicas del gluten fueron generadas a partir de líneas de células T específicas del gluten y finalmente el receptor de células T de cada clona de células T fue clonado y se determinó un número de secuencias de receptores de células T. Está claro para un experto en la técnica que una línea de células T y/o una clona de células T y/o un receptor de células T implicado en otra enteropatía inmune relacionada con alimentos (por ejemplo el esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos) se obtiene sometiendo, por ejemplo, el material obtenido de una biopsia, de pacientes que padecen de esa enfermedad, a métodos análogos como se describe aquí para pacientes con enfermedad celiaca. Un equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismo se define aquí como un derivado y/o un fragmento que tiene el mismo tipo de actividad/f nción (en el caso del receptor de .células T esto significa: al menos capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina unido a HLA-DQ) posiblemente en cantidades diferentes. Está claro para un experto en la técnica que existen diferentes formas de arribar a un equivalente funcional y/o fragmento funcional. Un equivalente funcional es por ejemplo un mutante puntual o un mutante de supresión o un equivalente derivado de otras especies. Otra posibilidad para arribar a un equivalente/fragmento funcional es mediante la aplicación de un método de evolución mdlecular a, por ejemplo, un receptor de células T o un equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismo. La parte experimental describe aquí métodos y medios para probar la actividad/función de esas moléculas (evolucionadas) . Un péptido derivado de prolamina es definido típicamente como un péptido derivado de proteínas de almacenamiento de semillas como las gliadinas, gluteninas, secalinas, hordeínas 'y aveninas. Un receptor de células T restringido por HLA-DQ se define típicamente como un receptor de células T el cual, de manera preferible, es capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina el cual está asociado con una molécula de HLA-DQ. De manera más preferible el péptido derivado de prolamina está asociado con una molécula de HLA-DQ2 o HLA-DQ8. Esa molécula de HLA-DQ2 o HLA-DQ8 está por ejemplo presente sobre una célula presentadora de antígenos (CPA) . En una modalidad preferida la invención proporciona un receptor de células T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante ? equivalente funcional y/o fragmento del mismo capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina, donde el péptido derivado de prolamina puede ser obtenido de una proteina seleccionada de gliadinas, gluteninas, secalinas, hordeinas o aveninas. Las gliadinas y gluteninas son proteínas de almacenamiento de la semilla del trigo. Las secalinas son proteínas de almacenamiento de la semilla del centeno; las hordeinas son proteínas de almacenamiento de la semilla de cebada y las aveninas son proteínas de almacenamiento de la semilla de avenas. En otra modalidad más la invención proporciona un receptor de células T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente funcional y/o fragmento del mismo capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina, donde el péptido derivado de prolamina está modificado. En una modalidad aún más preferida la invención proporciona un receptor de células T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente funcional y/o fragmento del mismo capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina, donde el péptido derivado de prolamina está desanudado. Las moléculas de HLA-DQ2 y HLA-DQ8 tienen una preferencia por residuos cargados negativamente en varias posiciones en los péptidos unidos. El aminoácido glutamina puede ser convertido a ácido glutámico (un proceso llamado desamidación) por condiciones ácidas o actividad de glutaminasa (por ejemplo glutaminasa tisular = tTG) . Proporcionando un péptido derivado de prolamina con carga más negativa (por ejemplo, por desamidación) la unión de HLA-DQ es mejorada o facilitada. Se ha demostrado que el reconocimiento de células T de complejos de HLA-DQ-péptido de gluten puede ser mejorado o depender aún de la desamidación de péptidos derivados de prolamina. En otra modalidad la invención proporciona un receptor de células T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente funcional y/o fragmento del mismo capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina unido a HLA-DQ, donde el péptido derivado de prolamina comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la Tabla 2 y/o la Tabla 5 (la referencia a la Tabla 5 incluye la referencia a la Tabla. 5A y la Tabla 5B) . La Tabla 2 describe no solamente los péptidos caracterizados sino también los epitopos mínimos de los péptidos. La comparación de los péptidos caracterizados contra los epitopos mínimos proporciona al experto en la técnica información sobre cuales aminoácidos en los péptidos caracterizados pueden ser modificados sin alterar el epitopo mínimo. Además, ahora también es posible reemplazar, por ejemplo, un aminoácido hidrofóbico en, por ejemplo, el epitopo mínimo, con otro aminoácido hidrofóbico y determinar el efecto de esa sustitución sobre, por ejemplo, la proliferación de las células T. Por lo tanto está claro que un equivalente funcional y/o un fragmento funcional de un péptido derivado de prolamina está también incluido aquí. Ese péptido puede ser modificado o, de manera más preferible, desanudado, para mejorar o facilitar el reconocimiento por el receptor de células T restringido por HLA-DQ de acuerdo a la invención. En otra modalidad la invención proporciona un receptor de células T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina donde el péptido derivado de prolamina está flanqueado por aminoácidos que representan sitios de procesamiento de antigenos . Un receptor de célula T está compuesto de dos polipéptidos anclados a la membrana, a y ß, cada uno de los cuales contiene un dominio constante (C) y un dominio variable (V) . Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) son los lazos o bucles hipervariables en un extremo de la TCR que reconoce la superficie antigénica compuesta formada por una molécula de MHC y un péptido unido. Los dominios variables del polipéptido a y ß contienen cada tres CDR (CDRlot, CDR2a, CDR3a, CDRpi, CDRP2, y CDR 3) . Se sabe que principalmente los lazos del CDR3 son responsables de la interacción 'con los residuos peptidicos. Han sido determinadas las secuencias de CDR (por ejemplo la secuencia del CDR3) de 5 clonas de células T. Esas secuencias son descritas en la Tabla 6. Por lo tanto, la invención proporciona una secuencia (o equivalente funcional y/o fragmento funcional de la misma) de un dominio variable de un receptor de células T restringido por HLA-DQ especifico para un péptido derivado de prolamina definido como se describe en la Tabla 6. Además, la invención también proporciona un dominio variable (o un equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismc) de un receptor de células T restringido por HLA-DQ que comprende una secuencia descrita en la Tabla 6. La invención también comprende un receptor de células T restringido por HLA-DQ (o un equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismo), el cual comprende un dominio variable con una secuencia como se describe en la Tabla 6. Un equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismo se define aquí como un equivalente y/o fragmento que es capaz de efectuar la misma actividad, posiblemente en diferentes cantidades. En otra modalidad la invención proporciona un ácido nucleico que codifica para un receptor de células T restringido por HLA-DQ o equivalente funcional y/o fragmento del mismo de acuerdo a la invención capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina. Además, la invención proporciona un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo a la invención. En otra modalidad más la invención proporciona una célula huésped que comprende un receptor de células T restringido por HLA-DQ o un equivalente y/o fragmento funcional del mismo de acuerdo a la invención, un ácido nucleico de acuerdo a la invención o un vector de acuerdo a la invención. En una modalidad más preferida la célula hospedera es inmortal. En una modalidad aún más preferida la célula hospedera comprende además un correceptor de CD4 y un receptor de- célula T asociado con CD3 complejo. El CD3 complejo comprende de manera preferible cadenas gama, delta, épsilon, y zeta. La presencia de un correceptor de CD4 en la célula hospedera es opcional debido a que, se sabe en la técnica que la ausencia de un correceptor CD4 no evita que un receptor de célula T sea funcional. De manera preferible, una célula hospedera de acuerdo a la invención comprende además un componente inducible para detectar la activación de la célula T. Un ejemplo de esé componente inducible es un promotor de factor nuclear de células T activadas (NFAT) acopladas al gen reportero LacZ (NFAT-lacZ) . De manera preferible, esa célula hospedera es seleccionada del grupo de PEER, MOLT-3 o MOLT-4, Jurkat, y HPB-ALL. Está claro para un experto en la técnica que también son aplicables otras células hospederas, en tanto permitan la expresión funcional de un receptor de células T restringido por HLA-DQ. Una célula hospedera de acuerdo a la invención que comprende un constructo de NFAT-lacZ permite la detección de la activación del receptor de células T via la medición de la actividad LacZ con un sustrato fluorescente o cromogénico. La activación del receptor de células T conduce a la inducción del promotor NFAT el cual dirige la expresión del gel LacZ que codifica para la enzima ß-galactocidasa . Está claro para un experto en la técnica que el receptor de células T restringido por HLA-DQ o un equivalente funcional y/o fragmento del mismo debe no solo ser capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina sino también ser capaz de activar la respuesta apropiada. En otra modalidad la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un receptor de células T restringido por HLA-üQ recombinante o aislado o un equivalente y/o fragmento funcional del mismo de acuerdo a la invención,, o un ácido nucleico de acuerdo a la invención o un vector de acuerdo a la invención. Esa composición farmacéutica es útil para el tratamiento de la enteropatia inmune relacionada con alimentos, por ejemplo el esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez. En otra modalidad la invención proporciona un péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético o un equivalente y/o fragmento funcional del mismo, opcionalmente acoplado a una molécula portadora, donde el péptido derivado de prolamina está implicado en la enteropatia inmune relacionada con alimentos. Ese péptido es preferiblemente capaz de asociarse con una molécula de HLA-DQ (o de manera más preferible con una molécula de HLA-DQ2 o HLA-DQ8) , facilitando por lo tanto el reconocimiento por un receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante de acuerdo a la invención. El portador es definido aquí como un componente que proporciona un péptido derivado de prolamina con la capacidad de inducir una respuesta inmune apropiada. Los ejemplos de esos portadores son la hemocianina de lapa (KLH) o seroalbúmina humana (HSA) . El experto en la técnica está consciente del hecho de que existen muchas más moléculas portadoras. La producción de péptidos sintéticos y/o recombinantes es bien conocida dentro de la técnica. Los ejemplos para la producción de péptidos sintéticos y métodos para aislar péptidos derivados de prolamina de por ejemplo el gluten son descritos aquí dentro de la parte experimental. Una modalidad preferida es un péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético o un equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismo, opcionalmente acoplado a una molécula portadora, donde el péptido derivado de prolamina está implicado en la enteropatia inmune relacionada con alimentos y donde el péptido derivado de prolamina puede ser obtenido de una proteina seleccionada del grupo de las gliadinas, gluteninas, secalinas, hordeinas o aveninas. En una modalidad aún más preferida el péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético de acuerdo a la invención está modificado, de manera preferible desamidado. Con la desamidación el péptido se vuelve más negativamente cargado para mejorar o aún facilitar el reconocimiento por el receptor de células T de acuerdo a la invención. En otra modalidad preferida de la invención más se proporciona un péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético de acuerdo a la invención, donde el péptido derivado de prolamina comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la Tabla 2 y/o la Tabla 5. Está claro que un equivalente funcional y/o fragmento funcional de ese péptido derivado de prolamina está también incluido aqui. Ahora que han sido descritos esos péptidos específicos, es fácil determinar los sitios de procesamiento correspondientes que son usados por ejemplo por proteasas. El conocimiento de esos sitios de procesamiento es usado para construir proteínas (por ejemplo vía la tecnología del ADN recombinante) las cuales no son ya procesadas, midiendo por lo tanto la producción de péptidos derivados de prolamina implicados en la enteropatía inmune relacionada con alimentos. En otra modalidad la invención proporciona un péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético, de acuerdo a la invención, donde el péptido derivado de prolamina está flanqueado por aminoácidos que representan sitios de procesamiento de antígenos . De manera preferible la invención proporciona un péptido derivado de prolamina aislado recombinante, o sintético de acuerdo a la invención, donde la enteropatía inmune relacionada con alimentos es seleccionada del grupo que consiste del esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez. La invención también proporciona un anticuerpo aislado o sintético o equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismo, que reconoce específicamente un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención. Ese péptido es preferiblemente capaz de asociarse con una- molécula de HLA-DQ, facilitando ;por lo tanto el reconocimiento por un receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante de acuerdo a la invención. Ese anticuerpo puede ser obtenido por ejemplo inmunizando a un animal inmunocompetente con un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención o un fragmento inmunogénico y/o equivalente (por ejemplo un péptido desamidado) del mismo y cosechando anticuerpos policlonales del animal inmunizado, o puede ser obtenido por otros métodos conocidos en la técnica como mediante la producción de anticuerpos monoclonales o anticuerpos (de una sola cadena) o proteínas de unión expresadas · de ácido nucleico recombinante derivado de una biblioteca de ácido nucleico, por ejemplo obtenible vía técnicas de presentación de fagos. Con ese anticuerpo, la invención también proporciona un inmunoensayo que comprende un anticuerpo de acuerdo a la invención. Muchos inmunoensayos están disponibles dentro de la técnica, por ejemplo el ELISA (Ensayo Inmunosolvente Ligado a Enzima) o electroinmunotransferencia Western . Además, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo de 'acuerdo a la invención o un vector que comprende ese ácido nucleico o una célula hospedera que comprende un ácido nucleico o un vector que codifica para un anticuerpo de acuerdo a la invención. En otra modalidad más la invención proporciona una equipo de diagnóstico que comprende un receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante de acuerdo a la invención o una célula hospedera que comprende un receptor de célula T de acuerdo a la invención o un anticuerpo de acuerdo a la invención y medios adecuados de detección. Ese equipo de diagnóstico es, por ejemplo, muy útil para detectar en alimentos, componentes o muestras de alimentos de pacientes (sospechosos) la presencia de un péptido derivado de prolamina implicado en la enteropatía inmune relacionada con alimentos (por ejemplo: esprue o estomatitis .celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez. Actualmente ese equipo de diagnóstico cuantitativo y cualitativo para determinar la presencia y/o cantidad de péptido derivado de prolamina no está disponible. Actualmente son usados son ensayos diferentes para la detección gluten. Un ensayo determina el contenido de nitrógeno del alimento (componentes) como una medida de la presencia de gluten. El otro ensayo utiliza anticuerpos específicos de gluten en sistemas de ELISA. Sin embargo, ambos sistemas de ensayo no prueban los péptidos derivados de prolamina tóxicos implicados en la enteropatía inmune relacionada con alimentos. Un equipo de diagnóstico comprende, por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo a la invención que reconoce específicamente un péptido derivado de prolamina tóxico implicado en la enteropatía inmune relacionada con alimentos. Otra ventaja del equipo de diagnóstico como se describe en la presente solicitud es la capacidad de probar alimentos (componentes) los cuales no pueden probados o no pueden ser probados de manera confiable por los ensayos de gluten usados actualmente. Los ensayos existentes difícilmente informan cuando el alimento (componentes) contienen cantidades significativas de otros compuestos que contienen nitrógeno (por ejemplo otras proteínas) o cuando el alimento (componentes) contiene proteínas de prolamina parcialmente hidrolizadas que no son reconocidas por los anticuerpos actualmente usados en los equipos de ELISA. Los ejemplos de alimentos (constituyentes) para los cuales los ensayos existentes son problemáticos son la cerveza, melazas y salsa de soya. Además, los ensayos existentes carecen del nivel de sensibilidad requerido para muchas aplicaciones. De manera preferible un equipo de diagnóstico' de acuerdo a la invención usa diferentes tipos de receptores de células T o células hospederas que comprenden un tipo diferente de receptor de célula T (o células T que comprenden receptores de células T múltiples) de acuerdo a la invención o diferentes anticuerpos, cada una capaz de reconocer otro péptido derivado de prolamina implicado en la enteropatía inmune relacionada con alimentos. Por lo tanto son detectados péptidos derivados de prolamina múltiples implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos. En la técnica están disponibles diferentes tipos de medios de detección y los expertos en la técnica saben como seleccionar los medios apropiados de detección. Los ejemplos son sustancias cromogénicas o fluorigénicas . La invención proporciona de este modo métodos y medios para la verificación de un componente reactivo de células T en alimentos, componentes o muestras de alimentos de pacientes (sospechosos) . Además, la invención proporciona un método para hacer disminuir o, de manera más preferible, inhibir completamente la unión de un receptor de células T restringido por HLA-DQ a un péptido derivado de prolamina implicado en la enteropatia inmune relacionada con alimentos que comprenden proporcionar una sustancia bloqueadora del receptor de células T. Mediante la disminución, y de manera más preferible, la inhibición completa de la unión de un receptor de célula T restringido por HLA-DQ a un péptido derivado de prolamina, los efectos inmunes relacionados con la enteropatia alimenticia (por ejemplo esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez) disminuyen o, de manera preferible disminuyen completamente. Esa sustancia bloqueadora se asocia con el receptor de célula T y evita la actividad del receptor de célula T. Por ejemplo, esa sustancia bloqueadora es una variante natural o sintética . de un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención y es especialmente muy adecuada para usarse como terapia contra la sensibilidad al péptido derivado de prolamina. Está claro que la unión de la sustancia bloqueadora para un receptor de célula T restringido por HLA-DQ no permite la señalización funcional de una célula T que comprende al receptor de célula T. Los péptidos derivados de prolamina adicionales de acuerdo a la invención son usados para preparar agentes terapéuticos capaces de eliminar un subco unto de células, directa o indirectamente, especialmente células T sensibles a gluten. Esto significa que un agente el cual, típicamente comprende un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención como reconocido selectivamente por células T, agente el cual induce la eliminación de las células que reconocen al péptido, es administrado al paciente. Ese agente más típicamente también comprende una porción tóxica para mediar la eliminación de células T específicas de la prolamina . En otra modalidad más, la invención proporciona un método para hacer disminuir (o de manera más preferible inhibir completamente) la unión de péptidos derivados de prolamina implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos (por ejemplo esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical,, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez) a moléculas de HLA-DQ que comprenden proporcionar sustancias que bloquean la unión de los péptidos a las moléculas de HLA-DQ. Mediante la disminución, y de manera más preferible, la inhibición completa de la unión a un péptido derivado de prolamina a una molécula de HLA-DQ, los efectos inmunes relacionados con la enteropatia alimenticia disminuye, o de manera más preferible, disminuyen completamente. Una sustancia bloqueadora se asocia, con, por ejemplo, una molécula de HLA-DQ y evita que el péptido derivado de prolamina se asocie con la molécula de HLA-DQ y por lo tanto se evita el reconocimiento de ese complejo como receptor de célula T restringido por HLA-DQ. Esa sustancia bloqueadora es, por ejemplo, una variante natural o sintética de un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención. Está claro que la unión de la sustancia bloqueadora a HLA-DQ es tal que hace disminuir o, de manera más preferible, hace disminuir completamente la unión de un péptido derivado de prolamina implicado en la enteropatia inmune relacionada con alimentos a la molécula de HLA-DQ. Otra forma de hacer disminuir o, de manera más preferible inhibir completamente la unión de un péptido derivado de prolamina a una molécula de HLA-DQ es proporcionar un anticuerpo que se asocie con el péptido derivado de prolamina o con el receptor de célula T restringido por HLA-DQ. En otra modalidad más de la invención se proporciona un método para detectar y/o enumerar las células T que contienen un receptor de célula T de acuerdo a la invención, que comprende complejos tetraméricos de HLA-DQ y un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención. Los métodos para arribar a ese. complejo tetramérico son conocidos en la técnica. Otra modalidad de la invención proporciona un método para detectar y/o enumerar las células T que portan o contienen un receptor de célula T de acuerdo a la invención que comprende liposomas (sintéticos) que comprenden complejos de HLA-DQ y un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención. Los métodos para arribar a esos complejos son conocidos por los expertos en la técnica. Esos datos proporcionan una herramienta novedosa para la detección y enumeración de células T que comprenden un receptor de célula T de acuerdo a la invención. La invención proporciona además un método para hacer diminuir la cantidad de péptidos derivados de prolamina tóxicos en alimentos o componentes de alimentos, que comprende incubar un receptor de . célula T aislado o recombinante de acuerdo a la invención o una célula hospedera que comprende un receptor de célula T de acuerdo a la invención o a un anticuerpo de acuerdo a la invención con el alimento o componente de alimento. Por ejemplo, un anticuerpo de acuerdo a la invención es acoplado a un material portador apropiado (por ejemplo perlas libres o material de una columna) y el alimento o componente de alimento es puesto en contacto con el alimento acoplado. La cantidad de péptidos derivados de prolamina implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos se reduce (de manera preferible disminuye completamente) a un nivel aceptable. De manera preferible se usa un método para hacer disminuir la cantidad de péptidos derivados de prolamina, que son obtenidos de proteínas como las gliadinas, gluteninas, secalinas, hordeinas, o aveninas . Además, la invención proporciona un método para seleccionar y/o producir un cereal, que comprende proporcionar un receptor de célula T aislado o recombinante de acuerdo a la invención o una célula hospedera que comprende un receptor de célula T de acuerdo a la invención o un anticuerpo de acuerdo a la invención. Con ese método se selecciona y/o produce un cereal que carece de al menos un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención. El método de acuerdo a la invención también es efectuado por una célula hospedera que expresa un receptor de célula T de acuerdo a la presente invención junto con una célula presentadora de antígenos que expresa HLA-DQ apropiado o un anticuerpo de acuerdo a la presente invención. Ese método para seleccionar y/o producir un cereal comprende por ejemplo, los siguientes pasos. El gluten, es aislado de una cepa de trigo particular, digerido por una enzima apropiada o con una mezcla de enzimas. Un anticuerpo de acuerdo a la invención es usado en un inmunoensayo para detectar péptidos derivados de prolamina tóxicos en la preparación de glutan digerido. Comparando cepas/variantes de trigo múltiples para determinar la presencia/ausencia de péptidos derivados de prolamina (implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos) , son seleccionadas cepas de trigo que son útiles para los experimentos de producción o crianza. Los cereales son seleccionados por la presencia o ausencia de péptidos derivados de prolamina. Esos cereales seleccionados son entonces producidos vía métodos agrícolas y/o industriales en alimentos o productos alimenticios para individuos sensibles al gluten. El cereal, en esta solicitud, se relaciona con granos o hierbas o plantas relacionadas que producen estos y con el producto alimenticio (preparado) . En particular el gluten de trigo, pero también de centeno, y en un menor grado de cebada o avena pueden causar enfermedad. Debido a que los péptidos derivados de prolamina implicados en el enteropatia inmune relacionada con alimentos son descritos aquí, ahora es posible modificar genéticamente el genoma de cereales para generar nuevos cereales con una fuente disminuida de péptido derivado de prolamina tóxico. Las modificaciones son, por ejemplo, generadas por mutaciones puntuales en la secuencia de ácido nucleico de la prolamina o son generadas reemplazando esa secuencia por otra secuencia que no de lugar a péptidos derivados de la prolamina implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos. Un cereal y/o especie seleccionada de acuerdo al método de la invención es usado para preparar alimento bajo o preferiblemente libre de péptidos liberados de prolamina implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos. En otra modalidad, la invención proporciona un análogo de un péptido derivado de prolamina de acuerdo con la invención caracterizado porque el análogo es un antagonista de la actividad de las células T que contienen un receptor de célula T restringido por HLA-DQ que reconoce al péptido derivado de prolamina. Los ejemplos de péptidos derivados de prolamina de acuerdo a la -invención son descritos en la Tabla 2 y/o la Tabla 5. Ahora que son descritos esos péptidos específicos, está dentro del alcance' de un experto en la técnica producir análogos. Está claro que la unión de- ese antagonista a un receptor de célula T restringido por HLA-DQ no permite la señalización funcional de un célula T que comprende el receptor de célula T. En otra modalidad la invención proporciona un composición farmacéutica que comprende un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la siguiente invención. Esa composición farmacéutica es usada para la inducción de tolerancia contra el péptido derivado de prolamina. Para la inducción de tolerancia se dan dosis de péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención repetidamente, por ejemplo intravenosamente, pero las otras rutas de administración también son adecuadas. Otra posibilidad es la administración oral o nasal repetida de ese péptido derivado de prolamina. El péptido derivado de prolamina de acuerdo a la presente invención se dá solo, o en combinación con otros péptidos derivados de prolamina (tóxicos] , o como partes de moléculas más grandes, o acoplado a material/moléculas portadoras o excipientes. Una composición farmacéutica que comprende un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la presente invención es usado también para la eliminación de un cierto subconjünto de células T o para el tratamiento de la sensibilidad al gluten. De manera preferible esa composición farmacéutica de acuerdo a la presente invención contiene varios, diferentes tipos de, péptidos derivados de prolamina. En otra modalidad más se hace uso de un inhibidor de proteasa o de sustancias neutralizantes de ácido para evitar la generación de un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención o un polipéptido que comprende un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención. Las proteínas de las cuales se derivan los péptidos derivados de prolamina no son capaces de unirse a una molécula de HLA-DQ directamente y deben primero ser procesados por proteasas para proporcionar un péptido o péptidos capaces de unirse a una molécula de HLA-DQ. Los péptidos derivados de prolamina y los polipéptidos que comprenden un péptido derivado de prolamina de acuerdo a la invención están unidos a moléculas de HLA-DQ y por lo , tanto son reconocidos por un receptor de célula T. Mediante la prevención de la formación de péptidos derivados de prolamina, se evita la unión a moléculas de HLA-DQ y el reconocimiento por receptores de células T. Una forma de evitar que sea generado un péptido derivado de prolamina es inhibiendo la enzima (por ejemplo por inhibidores de proteasa) que es capaz de procesar las proteínas de las cuales son derivados los péptidos derivados de prolamina (por ejemplo gluteninas y/o gliadinas) . Otra forma de evitar que sean generados péptidos derivados de prolamina es inactivar la enzima, que es capaz de procesar las proteínas de las cuales los · péptidos derivados de prolamina son derivados proporcionando sustancias neutralizantes. La pepsina y tripsina son ejemplos de enzimas que trabajan bajo condiciones ácidas y proporcionando sustancias neutralizantes los efectos de esas enzimas disminuyen o, de manera más preferible son completamente inhibidos. La invención será explicada con mayor detalle en la siguiente descripción detallada la cual no limita la invención. PARTE EXPERIMENTAL Niños con EC Se incluyeron 22 pacientes caucasoides con EC en el presente estudio. Su edad al momento del diagnóstico (primera biopsia del intestino delgado) fue entre los 1 y 9 años de edad (edad promedio de 3.6 años, ED 1.8; 1 año de edad, 3 pacientes; 2 años de edad,, 3 pacientes; 3 años de edad, 8 pacientes; 4 años de edad, 5 pacientes; 6 años de edad, 2 pacientes; 9 años de edad, 1 paciente) . Todos los pacientes expresaron la enfermedad asociada con el alelo de DQ2 codificado por DQA1*05/DQB1*02.

Antígenos y péptidos . Se preparó una digestión de gluten con pepsina/tripsina de acuerdo a lo descrito [1] . Los péptidos fueron sintetizados por química de Fmoc estándar en un sintetizador de péptidos múltiples (SyroII) . La integridad de los péptidos sintéticos fue verificada por CLAPfi y espectrometría de masas . El tratamiento con transglutaminasa tisular (tTG) fue efectuado incubando los péptidos con esta enzima (Sigma; T-5398) a una concentración de 500 µg/ml y 100 µg/ml respectivamente a 37°C durante 4 horas como mínimo, en TEA-acetato 50 mM pH 6.5, CaCl2 2 M. Aislamiento de líneas de células T específicas para el gluten. Las líneas de células T específicas para gluten, policlonales, fueron generadas a partir de biopsias de intestino delgado de pacientes con enfermedad celiaca de acuerdo a lo descrito [1,2]. De manera breve, las biopsias del intestino delgado fueron cultivadas con una preparación de gluten tratada con tripsina/pepsina o una preparación de gluten tratada con tTG/tripsina/pepsina. Después de una ronda de reestimulación con las preparaciones de gluten en presencia de PBMC autólogas las células fueron expandidas con IL-2 probadas por su especificidad y congeladas hasta su uso adicional . Las clonas de células T fueron generadas de acuerdo a lo descrito anteriormente [1,2] . En ensayos de proliferación en los cuales se usaron CPA apareadas y no apareadas se encontró que las lineas y/o clonas de células T respondieron a la estimulación con la preparación de gluten en presencia de CPA positivas a HLA-DQ2 únicamente. Además, la respuesta pudo ser bloqueada con anticuerpos específicos de DQ. Se obtuvo el consentimiento de todos los padres para el estudio, el cual fue aprobado por el comité de ética del hospital . Ensayos de proliferación de células T. Los ensayos de proliferación se efectuaron por duplicado en 150 µ? de medio de cultivo (RPMI1640 [Gibco] , con un contenido de 10% de suero humano) en 'placas de fondo plano de 96 pozos (Falcon) usando 104 células T estimuladas con 105 PBMC irradiadas (3000 RAD) en presencia o ausencia de antígenos a las concentraciones indicadas. 48 horas después, los cultivos fueron pulsados con 0.5 µ?? de 3H-timidina y cosechados 18 horas más tarde. Otra forma de efectuar un ensayo de proliferación de células T se describe más adelante . Se incubaron pozos por triplicado con CPA irradiada durante la noche con antígeno en placas de 96 pozos de fondo en forma de U en un volumen total de 100 µ? antes de que fueran agregadas las células T (5 x 104) en un volumen de 50 µ?. Se agregó [3H] -timidina 2 días después y las placas fueron incubadas 12-16 h adicionales antes de que fuera contada la incorporación de [3H] -timidina en un Betaplate Counter (Wallac Turku) . Se usaron ¦ células B linfoblastoides DR3+DQ2+ (irradiadas con 80 Gy) como CPA. La restricción por HLA de TCC fue determinada primero comparando la respuesta proliferativa a un péptido pulsado, B-LCL SWEIG positivo a DQA1*05/DQB1*0301 con y sin una cadena de DQB1*0201 transfectada adicional. Esta restricción fue confirmada por la inhibición de la activación de células T con un anticuerpo monoclonal (SPV-L3, DQ monomorfico) usando un B-LCL homocigóticas a DQA1*05/DQB1*0201 como CPA. Los resultados obtenidos de ambos exámenes de proliferación de células T proporcionan datos comparables. Purificación por GLAP de la digestión de gluten con pepsina/tripsina . Aproximadamente 1 mg de una digestión enzimática de gluten fue fraccionado con CLAP micro-fi (SMART system, columna C2/C18, se 2.1/10, Pharmacia) usando un gradiente de acetonitrilo de 0 al 70% (2%/min, velocidad de flujo de 100 µ?/min, con un contenido del 0.1% de ácido trifluoroacético) . La segunda dimensión de fraccionamiento por CLAPfi fue efectuada con un gradiente de 0.5% de acetonitrilo por min, y en una tercera ronda el ácido trifluoroacético fue reemplazado con ácido heptafluorobutirico al 0.1%. Espectrometría de masas. La espectrometría de masas de ionización por electrorrocío fue efectuada sobre los picos más abundantes presentes en la fracción de CLAP utilizando un espectrómetro de masas híbrido Q-TOF ( icromass, Manchester, RU) bioactiva de acuerdo a lo descrito [1,2]. De manera breve, los precursores fueron seleccionados con el cuadrupolo y los fragmentos fueron recolectados con una alta eficiencia con el espectrómetro de masas de tiempo de vuelo ortogonal. El gas de colisión aplicado fue argón (presión de 4X10"5 mbar) y el voltaje de colisión de aproximadamente 30 V. Otra forma de efectuar la espectrometría de masas se describe más adelante. Los espectros de masas de ionización por electrorrocío (ESI por sus siglas en inglés) fueron registrados en un espetrometro de masas de Tiempo de Vuelo de cuadrupolo (Q-TOF) ( icromass, Manchester, RU) y los espectros de ionización por desorción con láser ayudada por matriz iónica (MALDI) fueron adquiridos en un instrumento Bruker Reflex II MALDI-TOF (Bruker-Daltonik, Bremen, Alemania) . Después de la purificación, las muestras fueron rociadas desde agujas de nanoelectrorrocío (MDS Proteomics, Odense, DK) mantenida a 800 V hacia un cono sifonador espumador (40 V) . En experimentos de disociación inducida por colisión (DIC) (8.7xl0~5 mBar de argón, energía de colisión de 32 a 40 eV) , los iones del producto fueron analizados por el analizador TOF ortogonal. Los resultados obtenidos de ambos métodos proporcionan datos comparables. Búsqueda en la base de datos. Se usó el programa PeptideSearch para la elucidación de la secuencia. Las · búsquedas de similitud en las bases de datos se efectuaron sobre la base de las secuencias del péptido de gluten recién identificadas por búsquedas FASTA en un subconjunto seleccionado de proteínas de trigo del banco de datos Swiss Prot . Pacientes celiacos adultos. Se incluyeron trece pacientes adultos con enfermedad celiaca en el estudio, el cual fue aprobado por el comité de ética regional. Los pacientes CD411 y CD410 no fueron tratados, mientras que los pacientes CD380, CD377, CD421, CD370, CD387, CD423, CD429, CD430, CD432, CD436 y CD450 estuvieron en una dieta libre de gluten. Todos los sujetos expresaron la enfermedad asociada con la moléculas DQ2 codificada por los alelos DQA1*05/DQB1*02. Amplificación, clonación y producción de ?-gliadinas recombinantes . La amplificación, clonación y producción de gliadinas recombinantes se efectúo como se describió anteriormente [6]. De manera breve la amplificación del ADN genómico aislado de la cepa de trigo Nórdico Mj0lner fue efectuada usando cebadores diseñados para amplificar la ?-gliadina madura de longitud completa. Se clonaron productos PCR de tamaño apropiado en el vector de expresión pET17xb. Se efectuaron ciclos de secuenciamiento de clonas de gliadina sobre los productos de la PCR usando el equipo de premezclado de secuenciamiento de ciclo terminador de tinte Thermo Sequenase (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo al manual de los fabricantes. Los productos del secuenciamiento fueron corridos en un secuenciador de ADN ??? Prism 377XL (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut, EUA) . Los plásmidos que contienen los genes de ?-gliadina de longitud completa fueron expresados en E. coli usando el sistema de expresión pET. La gliadina fué extraída de E. coli por incubación en etanol al 70% a 60 °C durante 2 horas y precipitada mediante la adición de NaCl a una concentración final de 1 M. Los análisis de la preparaciones de gliadina en SDS PAGES teñidas con Azul de Coomassie revelaron bandas dominantes del peso apropiado con solo pequeñas contaminaciones. Purificación bioquímica de fragmentos de gliadina recombinante estimuladora de células T. El método de preparación de fragmento de gliadina activa de células T ha sido descrito en otra parte [4] . De • manera breve, se disolvieron 10 mg de la proteína ?-5 recombinante (preparada como se describió en la sección anterior) en urea 8 /NH4HCO3 0.4 M y a continuación se redujo, se alquilató y se dializó contra NH4HCO3 0.1 M/CaCl2 0.1 mM. Después de la digestión con a-quimiotripsina (1 : 100peso/peso) el material fue sometido a filtración en gel usando una columna FPLC con Superdex 200 HR 10/30 (Amersham Pharmacia Biotech) en un amortiguador de NH4HCO3 0.1 M. Antes de probar el reconocimiento de células T las fracciones fueron tratadas con 100 µg/ml de tTG de cobayo (Sigma Chemical Co.) en CaCl2 0.8 mM. Las fracciones que contenían material estimulador fueron preparadas adicionalmente por cromatografía de intercambio aniónico (Mono-Q PC 1.6/5; Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada con amortiguador de Tris /HCl 5 mM, pH 6.5, y reveladas con un gradiente con un punto final a NaCl 50 mM. Las fracciones MonoQ estimuladoras de las células T fueron posteriormente sometidas a CLAP en fase- inversa (µ??? C2/C18; Pharmacia) usando un gradiente de ensayo de amortiguador al 100% (0.1% de TFA en ¾0) hasta amortiguador B al 100% (80% de acetonitrilo, 19.9% de H20, 0.1% de TFA). El Mono-Q y la CLAP en fase inversa se efectuaron en un sistema SMART (Pharmacia) . Preparación de antxgeno. La digestión con pepsina, pepsina-tripsina o quimotripsina de la gliadina cruda se efectuó como se describió anteriormente [7,8]. Los péptidos fueron comprados de Research Genetics o sintetizados en el Instituto de Química Orgánica, de la Universidad de Tübingen, Alemania. Los últimos péptidos sintéticos fueron preparados por síntesis de péptidos en fase sólida múltiple en un sistema robótico (Syro MultiSynTech, Bochum, Alemania) usando la química de Fmoc/OtBu y resina de 2-clorotritilo (Senn Chemicals AG, Dielsdorf, Suiza) [9]. La identidad de los péptidos fue confirmada por espectrometría de masas de electrorrocío y la pureza fue analizada por CLAP-FI. El tratamiento de los péptidos con tTG de cobayo se efectúo a 37 °C durante 2 horas en PBS y CaCl2 1 mM usando 100 g/ml de tTG. Células T especificas para la gliadina. El cultivo y los ensayos de células T se efectuaron en RPMI 1640 suplementado con 15% de suero humano inactivado con calor, reunido, 2-ME 0.001 M, penicilina/estreptomicina y 2.5 µ?/p?? de Plasmocina (InvivoGen) . La generación de líneas de células T fue efectuada como se describió anteriormente [4] . De manera breve, se cultivó una sola biopsia de espécimen durante la noche en una cámara de cultivo de órganos por inmersión en medio de cultivo con antígeno de gliadina. Las biopsias de los pacientes CD380, CD410, CD370, CD387, CD411 y CD430 fueron desafiadas con una digestión de gliadina con pepsina-tripsina, las biopsias del paciente CD436 fueron estimuladas con una digestión de gladina con pepsina, las biopsias de los pacientes CD377, CD421 y CD423 fueron estimuladas con gliadina digerida con quimotripsina y las biopsias del paciente CD432, CD429 y CD450 fueron estimuladas con gluten digerido con quimotripsina. La gliadina de Sigma Chemical Co., la gliadina extraída de harina preparada de la cepa de trigo Kadett, o el gluten extraído de las cepas de trigo Avie o Mj0lner fueron usadas como antígenos. Después del desafío, las biopsias fueron cortadas con un escalpelo y tratadas con colagenasa A, o pasadas a través de una Medimachine (DAKO) para producir suspensiones de una célula, se filtraron a través de un filtro de 70 µp? y se sembraron en placas de fondo en forma de U de 96 pozos que contenían PBMC . autólogas irradiadas junto con 10 U/ml de IL-2. Las células fueron cultivadas en 5% de C02 a 37°C. Las TCC se establecieron a partir de TCL especificas del antígeno sembrando a dilución limitante en un volumen de 20 µ? en presencia de 2xl04 PBMC irradiadas alogénicas, 3 µg de PHA y 10 U/ml de IL-2. Las TCL y TCC fueron expandidas por estimulación periódica con 3 µg/ml de PHA, 10 U/ml de IL-2 y PBMC irradiadas alogénicas. Secuenciamiento de clonas de células T. Para el secuenciamiento receptor de célula T se aisló el ARNm de clonas de células T. El ARMm fue transcrito en ADNc y el uso del gen V-alfa y V-beta del receptor de célula T fue determinado usando cebadores específicos para V-alfa y V-beta. Los fragmentos de ADNc relevantes fueron secuenciados por la compañía BaseClear (Leiden, Holanda) . RESULTADOS 1. Establecimiento de líneas de células T (TCL) específicas de gluten de pacientes pediátricos Para investigar la respuesta de células T específicas del gluten inicial después de la inducción de la enfermedad, se recolectaron biopsias de células T de pacientes que se sospechaba padecían enfermedad celiac-a de acuerdo a lo indicado por síntomas clínicos típicos y/o o una prueba anti-endomisio positiva. La edad de los pacientes al momento de la biopsia fue de entre 1 año y 9 años. En el presente estudio solo han sido incluidos los pacientes con diagnóstico confirmado de enfermedad celiaca. Todos los pacientes expresaron el alelo DQ2 asociado con la enfermedad (DQA1*05/DQB1*02) . Cuando se obtuvieron biopsias múltiples de un paciente, las biopsias individuales fueron cultivadas con una digestión de gluten con tripsina/pepsina (llamada gluten aquí posteriormente) o la misma preparación que había sido adicionalmente tratada con tTG (llamada aquí posteriormente tTG-gluten) . 5 días después se agregó IL-2 y los cultivos que mostraron evidencia de proliferación de células T fueron expandidos y probados por su especificidad en un ensayo de proliferación usando las dos preparaciones de gluten y las células presentadoras de antígenos apareadas con HLA-DQ (véase más adelante) . Con una excepción únicamente tuvimos éxito en hacer crecer células T específicas del gluten de biopsias de pacientes que fueron diagnosticados con enfermedad celiaca (no mostrados) . Las líneas de células T específicas de gluten fueron seleccionadas después de un estimulo inicial con gluten o tTG-gluten (Figura 1) . Se obtuvieron 26 líneas de células T reactivas con el gluten en conjunto, de 22 pacientes. Se adquirieron 16 líneas de células T después del ' estimulo primario de las biopsias con gluten (Figura 1A) . De esas 16 lineas únicamente 5 respondieron al estimulo con gluten, mientras que las restantes respondieron al tTG-gluten (Figura 1A) . Se adquirieron 10 lineas de células T después de la estimulación primaria de las biopsias con tTG-gluten, todas las cuales respondieron al estimulo con tTG-gluten mientras que una también respondió al gluten (Figura IB) . De este modo, una gran parte de la respuesta de las células T especificas del gluten en pacientes pediátricos parece estar dirigida hacia el gluten desamidado pero en 5 de 22 pacientes (~25%) también fue evidente una respuesta hacia el gluten no desamidado. 2. Generación de clonas de células T (TCC) especificas del gluten Las clonas de células T especificas del gluten fueron generadas a partir de lineas de células T especificas del gluten en 9 pacientes (Tabla 1) . Esas clonas fueron probadas contra gluten y tTG-gluten en presencia de células presentadoras de antigeno apareadas con HLA-DQ. Se observaron 3 patrones de reactividad: i) clonas de células T que no respondieron al gluten pero que respondieron al tTG-gluten (Tabla 1, tTG-gluten únicamente) ; ii) clonas de células T que responden tanto al gluten como al tTG-gluten, el tratamiento con tTG con frecuencia mejora esta reactividad (Tabla 1, gluten y tTG-gluten) ; iii) clonas de células T que respondieron al gluten pero no al tTG-gluten (Tabla 1, gluten únicamente) . En 8 de 9 pacientes se encontraron respuestas de células T clónales dependientes de tTG. En 6 pacientes, sin embargo, también se observaron respuestas específicas al gluten no desamidado. De este modo de acuerdo con los' resultados obtenidos con las líneas de células T policlonales una gran proporción de las respuestas específicas al gluten está dirigida hacia el gluten desamidado pero las respuestas al gluten no desamidado también son comunes en pacientes pediátricos. Tabla 1. Clonas de células T específicas del gluten derivadas de líneas de células T específicas del gluten, policlonales, de niños con enfermedad celiaca.

Paciente Edad Tipificación # de # de clonas de células T (Años) HLA clonas de correspondientes a células T* tTG- Gluten y gluten gluten tTG- únicamente únicanente0 gluten MS 4.3 DQ2 , DR3 13 12 1 — NV 1.2 DQ2 , DR3DR7 18 18 — — SV 2.4 DQ2 , DR3DR7 37 2 32 3 # de clonas generadas a partir de la linea de células T reactivas a gluten, policlonales el tratamiento con tTG del gluten afecta de manera diferente las respuestas de las células T clónales a gluten : tTG-gluten únicamente: clonas de células T que responden al tTG-gluten únicamente. tTG-gluten y gluten: clonas de células T que corresponden a gluten y tTG-gluten, y el tTG con frecuencia mejora la reactividad de las células T. Gluten únicamente: clonas de células T que responden al gluten únicamente. § Número de clonas de células T que exhiben la reactividad especifica al gluten indicada 1 NB y SB son gemelos idénticos, los otros pacientes no están emparentados.

Tabla 2. Secuencia de aminoácidos de péptidos de gluten estimuladores de células T novedosos La secuencia de aminoácidos de cuatro epitopos de gluten novedosos podrían ser comparadas con secuencias de proteínas de bases de datos, y son nombradas después del origen del péptido: Glia-oc, Glia-?, y Glt, para las moléculas de oc-gliadina, ?-gliadina y glutenina respectivamente. Los dos epitopos de gluten restante son indicados con Glu. La secuencia de aminoácidos de los péptidos caracterizados, los epitopos mínimos requeridos para la estimulación de las células T y la designación de las clonas de células T (TCC) usadas para caracterizar los péptidos, están indicados. Los residuos de glutamina que son desamidados específicamente por tratamiento con tTG están indicado en negritas .

Designación Péptido Epitopo Clona caracterizado mínimo Célula T Glra-a20 (93-206) PFRPQQPYPQPQPQ nd* JB20 Glia-y30(222-236) VQGQGIIQPQQPAQL IIQPQQPAQ SV30 Glt-156 (40-59) QQQQPPFSQQQQSPF PFSQQQQSPF MS156 SQQQQ Gltl7 (46-60) QQPPFSQQQQQPLPQ PFSQQQQQ V17 Glu-21 QPQPFPQQSEQSQQP QSEQSQQPFQPQ SV21 FQPQPF Glu-5 QQXSQPQXPQQQQXP QXPQQPQQF JP437 y : QQPQQF* no determinado * es isoleucina o leucina 3. Caracterización de epitopos de gluten novedosos A continuación determinamos la especificidad de varias de las clonas de células T especificas del gluten. Hasta este punto las clonas fueron probadas primero contra péptidos correspondientes a los tres péptidos derivados de gliadina estimuladores de células T restringidos por HLA-DQ2 conocidos (véase más adelante) . Este análisis indicó que la gran mayoría de células T no respondió a esos péptidos, y de este modo fue probable que sean reactivos hacia péptidos de gluten ya identificados (no mostrados) . Para caracterizar esos péptidos novedosos hemos usado dos métodos diferentes . Primero identificamos los epitopos de gluten de una digestión de (tTG-) gluten con pepsina/tripcina. Las digestiones fueron fraccionadas por CLAPfi repetitiva y los epitopos en las fracciones estimuladoras de células T fueron identificados por espectrometría de masas como se describió [1,2]. Este método condujo a la caracterización de 3 péptidos estimuladores de células T novedosos: Glia-y30 (222-236) , Glu-21, y Glu-5 (Tabla 2). En segundo lugar probamos las clonas de células T contra un conjunto de 250 péptidos de gluten sintéticos. Las secuencias, tanto de gliadina como de glutenina, fueron derivadas de bases de datos de gluten. Los 5 péptidos reunidos, no tratados y tratados con tTG, fueron probados en un ensayo de proliferación de células T. Después de la identificación de los péptidos estimuladores de células T reunidos los péptidos individuales en ese conjunto fueron analizados para identificar al péptido estimulador de células T. Un ejemplo representativo de este procedimiento se da en la Figura 2. La clona JB20 respondió a 5 de los 50 péptidos reunidos (Figura 2A) . El análisis de la secuencia de los péptidos presentes en esos conjuntos indicó que la secuencia PQQPYPQPQPQ estaba presente en todos los conjuntos estimuladores de células T y de este modo probablemente es responsable de la actividad estimuladora de las células T (Figura 2B) . La prueba de los péptidos individuales confirmó esto (no se muestra) . Este método ha conducido a la identificación de tres péptidos estimuladores de células T novedosos adicionales: Glia-a20 (93-106) , Glt-156 (40-59) y Glt-17(46-60) (Tabla 2). Los últimos dos péptidos, aunque distintos, muestran un mayor grado de homología de secuencia, por ejemplo comparten la secuencia QQPPFSQQQQ (véase la tabla 2) . Para cuatro de esos seis péptidos novedosos la desamidación por tTG permitió o aumentó la actividad estimuladora de células T (véase más adelante) . Por lo tanto, el efecto del tratamiento con tTG fue determinado por análisis espectral de masas de los péptidos originales y los péptidos tratados con tTG de acuerdo a lo descrito anteriormente [3] . Un ejemplo representativo de este procedimiento se muestra en la Figura 3. Este análisis indicó que los residuos de glutamina subrayados en la Tabla 2 son modificados por tTG. Para identificar la secuencia peptídica mínima requerida para la inducción de la estimulación de células T, se sintetizaron variaciones con truncación N- y C- terminal de esos 5 péptidos y se probaron por su actividad estimuladora de células T esencialmente como se describió anteriormente [1,2]. Un ejemplo representativo de este procedimiento se muestra en la Figura . Este análisis ha conducido a los epitopos mínimos indicados en la Tabla 2. 4. El análisis de clonas de las respuestas de las células T a péptidos de gluten novedosos demuestran 3 modos de respuesta . Posteriormente probamos la respuesta de las clonas de células T a los péptidos identificados en la forma desamidada y no desamidada (Figura 5) . Se encontró que la respuesta de la clona de célula T SV30 hacia el péptido Glia-y30 era en gran medida indiferente a la desamidación. En contraste, la respuesta hacia los péptidos Glia-a20, Glt-17 y Gltl57 requirió una desamidación anterior. Aunque la respuesta al péptido Glu-5 depende de la desamidación en el caso de la TCC JP43, esta no fue influenciada por la desamidación en el caso de la TCC NP27. Finalmente, la desamidación abolió la respuesta hacia el péptido Glu-21. De este modo, de acuerdo con los resultados mostrados en la Tabla 1, el efecto de la tTG sobre la estimulación de células T específicas del gluten es heterogéneo y puede ser positiva, neutra y negativa. 5. Reactividad de células T hacia secuencias peptídicas variantes, naturales Las búsquedas de homología en una base de datos de gliadina/glutenina dedicada indicaron que los péptidos de gliadina identificados representan secuencias relativamente raras (no mostradas) . En contraste, se encontraron muchas variantes naturales de las secuencias de glutenina. Una búsqueda con la secuencia QQPPFSQQQQ, la cual es compartida entre los péptidos de glutenina estimuladores de células T, produjo 95 aciertos en la base de datos de gliadina/glutenina (no mostrada) . El análisis adicional reveló que esto representó 34 secuencias distintas pero homologas. De esas, 32 fueron secuencias de glutenina, mientras que 2 fueron derivadas de gliadina. Ocho de esas secuencias fueron seleccionadas, sintetizadas y probadas por su actividad estimuladora de células T (Figura 6) . Se encontró que cinco de los péptidos estimulan a la clona de célula T reactiva con Gltl56 MS156, mientras que la clona de célula T V17 respondió a 7 de esos péptidos. De este modo, la respuesta de esas clonas de célula T especificas de glutenina es altamente promiscua y dirigida a péptidos homólogos de gluteina múltiples. Extrañamente, aunque cada clona exhibió un patrón de reactividad único, ambas clonas respondieron a la estimulación con homólogos derivados de glutenina y gliadina. 6. Heterogeneidad en péptidos de gluten hacia respuestas de células T pediátricas. Posteriormente se probaron las clonas de células T especificas del gluten de todos los pacientes contra péptidos de gluten restringidos por HLA-DQ2 caracterizados previamente asi como contra los péptidos reportados en el presente estudio. Los resultados obtenidos con clonas representativas de cada paciente son resumidos en la Tabla 3. Se encontraron respuestas a algunos péptidos en un paciente únicamente, mientras que se encontraron respuestas a los péptidos Glu-5 y Glia-a20 novedosos asi como al . péptido gama-gliadina identificado anteriormente en varios pacientes. Esos, de este modo representan péptidos más inmunodominantes en pacientes pediátricos. Las respuestas de células T hacia los péptidos de ct-gliadina que han sido reportados como inmunodominantes en pacientes adultos fueron encontradas en tres pacientes pediátricos, entre los cuales los gemelos idénticos muestran una reactividad muy similar contra los epitopos del gluten. Además, en esos 9-· pacientes observamos 8 patrones de reactividad diferentes como consecuencia del tratamiento con tTG del gluten (Tabla 3) . Esos resultados indican una respuesta altamente diversa contra los diferentes péptidos. Tabla 3. Vista general de las respuestas de las células T contra los epitopos DQ2 La reactividad de células T de las lineas de células T y/o clonas de células T de pacientes pediátricos fueron probadas contra los epitopos DQ2 .descritos aqui y los epitopos previamente publicados Glia-a.2 ( 62-75) PQPQLPYPQPQLPY, Glia-a9 ( 57-68 ) QLQPFPQPQLPY, y. Glia-yl(138-153) QPQQPQQSFPQQQRPF [4,5]. Los bloques marcados con tTG indican respuestas que dependen de la desamidación, los bloques no marcados con tTG indican respuestas que no toleran desamidación. Para los bloques no marcados la influencia de la desamidación las respuestas no ha sido determinada o no es influenciada por la desamidación.

Pacientes Epxtopos de gluten DQ2 novedosos Glia Glia Glia jóvenes -?? -a.2 -cc9 Glia Glia Glt Glt Glu Glu -oc20 -?30 -17 -156 -5 -21 LP JB JP 7. Amplificación, clonación y secuenciamiento de los genes de ?-gliadina. Para expresar . un panel de genes de ?-gliadina se aisló ADN genómico de la cepa de trigo Mj0lner (una cepa de trigo que comúnmente crece en Noruega) . Se diseñaron cebadores de PCR para amplificar todas las ?-gliadinas maduras conocidas. El secuenciamiento de ADN parcial de 29 clonas independientes contenidas de una PCR con esos cebadores ?-gliadina específicos dió 12 secuencias no relacionadas con la gliadina y 17 secuencias de gliadina. La separación posterior de los genes de gliadina para la expresión identificó 11 clonas que podrían ser expresadas de manera productiva y purificadas. El secuenciamiento de esos genes de gliadina identificó 11 secuencias únicas. Al nivel de proteína esas 11 secuencias de ADN distintas se tradujeron en 5 ?-gliadinas distintas (?-1, Y_2, .?-3, ?-4 y ?-5, respectivamente, números de acceso AJ133613, AJ416336, AJ416337, AJ416338 y AJ 416339) (Figura 7) y todas tuvieron los epitopos Glia-?-? y Glia-y-30 conocidos. Efectuando una búsqueda BLAST para las secuencias de proteínas deducidas en todas las bases de secuencias de proteínas no redundantes mayores, en toda la mayoría de las bases de datos de secuencias de proteína no redundantes, únicamente una de las ?-gliadinas recombinante (?-l) dió un apareamiento idéntico con una entrada previa (número de - acceso del genBank AJ133613) . 8. Fragmentos proteolíticos , de gliadina ?-5 recombinante estimuladora de células T intestinales. Puesto que las proteínas de gliadina son insolubles a concentraciones de sal fiosiológicas, las ?-gliadinas recombinantes se hicieron solubles por digestión con pepsina o quimotripsina antes de usarse en ensayos de células T. Esos antígenos solubles fueron entonces tratados con transglutaminasa tisular y probados por su capacidad para estimular un panel de TCL específicas del gluten que se había encontrado previamente no responden a epitopos de ?-gliadina conocidos (Glia-?-? y Glia-y-30) (Tabla 4) . Inicialmente, encontramos que una linea de células T del paciente CD411 (TCL CD411E) respondieron a todas las gliadina recombinantes tratadas con tTG (?-l a ?-5) , pero no tuvieron o solo tuvieron una respuesta baja a las mismas gliadinas no tratadas con tTG. Puesto que esta línea de células T no reconoció a ninguno de los epitopos de ?-gliadina conocidos (Glia-?-? y Glia-y-30) esto indicó que la respuesta fue hacia los nuevos epitopos peptídicos identificados en la ?-gliadina. Tabla 4. Separación o selección de líneas de células T intestinales contra un panel de ?-gliadinas recombinantes .

TCL + y-1 y-2 7-3 ?-4 ?-5 380 E 29.9 1.7 1.54 1.9 1.4 1.1 377.5 7.4 1.2 1.1 1.3 1.5 1.2 411 E 17.5 3.2 2.1 5.8 7.2 6.6 421.1.1 18.9 0.9 0.9 1.3 0.7 0.7 430 l.d 23.6 1.7 1.7 1.5 1.9 1.9 410 12.8 1.4 0.6 1.2 1.6 0.6 Se probaron líneas de células T (TCL) aisladas de seis pacientes adultos con EC para el reconocimiento de 5 diferentes y-gliadinas recombinantes digeridas con quimotripsina y tratadas con tTG (y-1 a ?-5) . Las TCL que no responden a ninguno de los dos epitopos de y-gliadina caracterizados anteriormente DQ2-y-I [5] y DQ2-y-II fueron elegidas. La gliadina digerida con quimotripsina de la variedad de Kadett fue usada como control positivo (+) . Los resultados se dan como índice de estimulación (IE) , calculado con la ayuda de la siguiente fórmula: (cpm después de la estimulación específica - cmp de fondo) /cpm de fondo. Para identificar los epitopos .reactivos de células T en ?-gliadina, fueron aislados fragmentos peptidicos de una de las gliadinas recombinantes (?-5) después de una serie de pasos de purificación bioquímica usando dos clonas de células T producidas a partir de la linea de células T CD411E para identificar fracciones positivas (TCC CD411 E2.47 y TCC CD411 E2.104, referidas como TCC 411A y TCC 411C, respectivamente). La gliadina recombinante ?-5 fue tratada con quimotripsina y separada usando cromatografía de exclusión por tamaño (columna Superdex 200 HR 10/30) . Las fracciones fueron tratadas entonces con tTG de cobayo y probadas para el reconocimiento por TCC 411A (Figura 8A) y TCC 411C. La fracción 36 estimúló de manera más eficiente las clonas de células T y posteriormente fue sometida a cromatografía de intercambio iónico (Mono-Q PC 1.6/5). De manera notable, solo se unió una pequeña proporción a la columna, mientras que la mayoría del material se encontró en "flujo pasante" (fracciones 2, 3 y 4) . No obstante, cuando se encontró material activo en esas primeras fracciones (Figura 8B) , aplicamos la fracción 2 de MonoQ reactiva con las células T a la CLAP en fase inversa ^RPC C2/C18) . Esto produjo dos fracciones (fracciones 14 y 16) que estimularon a la TCC 411A (Figura 8C) . La fracción 16 también estimuló a la TCC 411C. El análisis de esas fracciones por espectrometría de masas por ionización por Electrorrocío (ESI) idenficó 8 diferentes péptidos agrupados en tres diferentes regiones de la ?-5 recombinante ¦ (Figura 9) . De manera interesante, la fracción 14 tuvo péptidos que se superpusieron completamente al epitopo Glia-y-30 y parcialmente al epitopo Glia-?-? mientras que la fracción 16 tuvo péptidos que se superpusieron completamente al epitopo Glia-?-?. 9. Identificación de 3 epitopos de célula T restringidos por DQ2 novedosos en la gliadina ?-5. Para identificar los epitopos de célula T contenidos dentro de las fracciones de CLAP 14 y 16 de la gliadina ?-5, los péptidos superpuestos que abarcan las regiones I (16 péptidos) y II (18 péptidos) (Figura 10) fueron sintetizados. Esos péptidos fueron probados contra cinco TCC; TCC 411A y B y TCC 430 A, B y C. Las últimas tres TCC fueron generadas a partir de la línea de células T intestinal (TCL CD430) que respondió a varios péptidos de la región I y II. Se encontraron dos tipos de patrones de reactividad de células T contra péptidos de la región I. El primer tipo de patrón de reactividad es e emplificado por la TCC 430B y la TCC 430C. Esas TCC fueron reactivas con el péptido mínimo ?-5 (66-78) (definido como el epitopo DQ2-y-III, Tabla 5A) en una forma dependiente de tTG estricta (Figura 11A) . La TCC 411A y la TCC 411B representan el segundo tipo de patrón de reactividad contra el péptido de la región I. Esas TCC reconocieron el péptido ?-5 (60-79) (definido como el epitopo DQ2-y-V; Tabla 5A) , y para esas TCC la desamidación por tTG no tuvo influencia sobre el reconocimiento de células T, ni sobre la gliadina cruda tratada con quimotripsina ni sobre el péptido (Figura 11B) .

Se encontró un solo tipo de patrón de reactividad, representado por TCC 430A, contra los péptidos de la región II. Esta TCC reconoció el péptido ?-5 (102-113) (definido como el epitopo DQ2-y-IV Tabla 5A) en una forma dependiente de tTG estrictamente, y la TCC tuvo una respuesta débil que fue mejorada fuertemente por el tratamiento por tTG contra la gliadina cruda tratada con quimotripsina (Figura 8C) . 10. Identificación de un tercer epitopo de a-gliadina que se agrupa con los epitopos DQ2-a-I y DQ2-a-II Durante la selección o separación de las células T recientemente generadas dentro de nuestro laboratorio aclaramos que existia un tercer epitopo de a-gliadina dentro de la gliadina recombinante a-2 (número de acceso AJ33612) . Fueron identificadas dos clonas de células T que . fueron estimuladas por la gliadina recombinante a-2 pero no respondieron a cualquiera de los epitopos peptidicos DQ2- -I o DQ2-a-II. Debido a que el patrón de agrupamiento epitópico observado con los epitopos DQ2-a-I o DQ2-a-II fue también evidente con los epitopos en el recombinante y~5, investigamos si el epitopo DQ2-a-II también se agrupó con los epitopos DQ2-0C-I y DQ2-cc-II. En realidad, la prueba del péptido (a-2 (64-75)) con la sustitución Q-E en la posición 72 y superponiéndose parcialmente con ambos epitopos DQ2-oc~I y DQ2-oc-II estimuló eficientemente a ambas de la TCC CD370.2.25 y la TCC CD370 E3.19 (referidas como TCC 370A y TCC 370B) (Figura 12A) mientras que el DQ2-GC-I y DQ2-a-II no. La prueba de este péptido nativo no estimuló a esas dos clonas de células T. La glutamina en la posición 72 es dirigida naturalmente por tTG y se localiza en la misma posición dentro del fragmento repetitivo de siete residuos como para los otros dos epitopos. La prueba de este nuevo péptido (oc-2 ( 64-75 ) E72/DQ2-CC-III (Tabla 5A) contra la TCC CD387 E9 especifica de DQ2-a-I y la TCC CD436.5.4 especifica de DQ2-0C-II produjo una respuesta de células T baja, y entonces solo una concentración de péptido muy alta (50 µ?) , indicando que este epitopo es distinto de los epitopos DQ2-oc-I y del DQ2-0C-II (Figuras 12B y 12C) . Tabla 5. Las secuencias dadas bajo A son epitopos novedosos identificados con clonas de células T y han sido caracterizadas por fragmentos/péptidos de la proteina gamma-5 recombinante y un panel de péptidos sintéticos. Los péptidos descritos bajo B son péptidos sintéticos de la gamma-gliadina M36999 la cual estimula a una o más lineas de células T. Las partes subrayadas muestran los epitopos minimos deducidos. Tabla 5A: Epitopos de gliadina restringidos por DQ2 Epitopo Péptido Secuencia1 Clonas de células T (TCC) /lineas de células T (TCL) DQ2-y-III ?-5 (66-78) FPQQPQQPYPQQP2 TCC: 430B, 430Q E68,E71 DQ2-y-IV ?-5 (102-113) FSQPQQQFPQPQ3 TCC: 30A E106, E108 TCL: CD411 E, QD429.1.6 DQ2-y-V ?-5 (60-79) LQPQQPFPQQPQQPYPQQPQ TCC: 411A, 411B TCL:CD411 E DQ2-a-III a-2 (64-75) PQLPYPQPQLPY TCC: 370A, 370B, E72 TCI: CD418.3, CD411 E, CD433.1, CD380 E3 Tabla 5b: Epitopos de dodecapéptido derivados de ?- gliadina reconocidos por células T.

Epitopo Designación Secuencia Homología con Clonas de peptídica4,5 los epitopos células T (TCC) /líneas de células T (TCL) M2 M36999 (11-30) WPQQQPFPQPQQPFCQ DQ2-a-I TCL: CD4111E QPQR CD432.1.2 M7 36999 (61-80) QFPQTQQPQQPFPQPQ DQ2-a-I TCL:CD411E QTFP CD432.1.2 DQ2-y-IV QFPQTQQPQQPFPQPQ QTFP Tabla 5b: Epitopos de dodecapéptido derivados de ?-gliadina reconocidos por células T (Continuación) . Epitopo Designación Secuencia Homología con Clonas de peptídica4,5 los epitopos células T (TCC) /lineas de células T (TCL) 8 M36999 (71-90) PFPQPQQTFPQQPQLP DQ2-y-III TCL : CD411E FPQQ MIO M36999 (91-110) PQQPFPQPQQPQQPFP DQ2-a-I TCL: CD411E QSQQ MI2 M36999 (111-130) PQQPFPQPQQQFPQPQ DQ2-y-IV TCL: CD411E, QPQQ CD432.1.2, CD429.1.6 1 Los residuos de glutamina dirigidos por tTG están en negritas' El análisis de EM/EM indicó desamidación mediada por tTG de glutaminas en la posición 3 y en las posiciones 6 ó 7. 3 La desamidación mediada por tTG de las glutaminas en las posiciones 106 y 108 es requisito para el reconocimiento de células T. 4 Las secuencias homologas de los epitopos en la Tabla 5 están subrayadas. 5 Los residuos de glutamina dirigidos por tTg no se determinaron . 11. Epitopos identificados en la ?-gliadina M36999 usando péptidos superpuestos También probamos el conjunto de péptidos 23x20 méricos que están superpuestos por 10 residuos y que cubren casi toda la gama gliadina M36999 [10] y los seleccionados por reconocimiento de esos péptidos después del tratamiento con tTG por- un panel de 6 lineas de células T policlonales especificas del gluten. Cinco de esas lineas de células T tuvieron una respuesta a los péptidos derivados de gama gliadina: A la linea de células T del paciente CD411 (TCL CD411E) produjo una fuerte respuesta contra los péptidos M2, El, y 12 y una respuesta débil hacia los péptidos M8 , MIO y M13 (Figura 13, Tabla 5B) . Además, la linea de células T del paciente CD432 (TCL CD432.1.2) tuvo una respuesta a los péptidos M2, M7 y M12 (Figura 13, Tabla 5B) , mientras que la linea de células T del paciente CD450 (TCL CD450.2.2) únicamente produjo respuestas a los péptidos M90 y M91, los cuales incluyen la secuencia del epitopo DQ2-y-II. La TCL CD429.1.6 produjo una respuesta al péptido M12 y la TCL CD423.1.3 produjo una respuesta al péptido M13, el cual incluye la secuencia del epitopo DQ2-y-I. Los péptidos M2 y M7 contienen secuencias que son notablemente similares a la de la epitopo DQ2-a-I. Además, el péptido M7 también incluye secuencias que son muy similares a las del epitopo 0?)2-?-??, como el péptido M12. El último difiere del epitopo DQ2-y-IV únicamente en una sola sustitución de S a P. Esas similitudes de secuencia probablemente producen algún grado de reactividad cruzada y probablemente los péptidos M2, M7 y M12 albergan epitopos novedosos que contienen similitudes con otros epitopos de células T. 12. Reactividad cruzada entre lineas de células T aisladas de pacientes adultos con enfermedad celiaca y los péptidos novedosos identificados con las clonas de células T de pacientes pediátricos y viceversa. Las lineas de células T aisladas de biopsias del intestino delgado de 22 pacientes adultos con enfermedad celiaca fueron probados contra los péptidos de gluten novedosos que fueren identificados con las clonas de células T de niños con enfermedad celiaca. Nueve de esas lineas de células T respondieron a esos péptidos. En particular se observó reactividad contra los péptidos Glia-alfa2, el Glia-gama30, y Glu-5 pero no contra los péptidos Glt-17, Glt-156 y Glu-21. Las lineas de células T aisladas de biopsias de intestino delgado de 16 niños con enfermedad celiaca fueron probadas contra los péptidos Glia-alfa2 y Glia-alfa9 previamente identificados [4] . Ocho de esas lineas de- células T respondieron a uno o ambos de esos péptidos . Esos datos indican que algunos péptidos derivados de prolamina son solo reconocidos por clonas/lineas de células T derivadas de pacientes adultos o pediátricos con EC y que otros péptidos derivados de prolamina son reconocidos por ambos grupos de pacientes. Esta observación es por ejemplo usada para el desarrollo de un método de diagnóstico sensible basado en los péptidos derivados de prolamina descritos aquí y su ocurrencia en los diferentes grupos de pacientes . 13. Secuencias de aminoácidos de CDR3 del receptor de célula T de clonas de células T especificas de gluten seleccionadas . De 5 de. las 7 clonas de células T descritas en la Tabla 2, fue determinada la secuencia de aminoácidos de CDR3 del receptor de célula T de las clonas de células T especificas de gluten seleccionadas. El uso del gen Va y ?ß del receptor de célula T fue determinado usando cebadores específicos de Va y ?ß . Los resultados son descritos en la Tabla 6. Para la clona de célula T MS156 se encontraron cinco secuencias de CDR3 distintas pero claramente relacionadas. Para las clonas SV30, SV21, y P27 únicamente ha sido determinada la secuencia de aminoácidos de la cadena ß del receptor de célula T. Tabla 6: Secuencias de aminoácidos CD3 de receptores de células T de clonas de células T específicas del gluten seleccionadas. Se muestran los segmentos del gen Va y ?ß conocidos usados y la secuencia de aminoácidos determinada de la región CDR3 y la designación del elemento J usado .

Clona de Gen V del NDN1 Región J Célula T receptor de usada célula T usado MSI56 AV23S1 CA VPQ ETSGSRLTFGEGTQLTVNPD AJ58 BV6 CASS IRQ GNTIYFGEGSWLTW BJ1S3 (original) CASS LYW SSYEQYFGPGTRLTVT BJ2S7 (variante) CASS FGAGGQK YNEQFFGPGTRLTVL BJ2S1 (variante) CASS LYW SSYEQYFGPGTRLTVT BJ2S7 (variante) CASS IiASASGEY TQYFGPGTRLTVL BJ2S3 (variante) JP437. AV1S1 CAV NV GGATNKLIFGTGTLLAVQPN AJ32 BV21S3 CA3SL FGGI TDTQYFGPGTRLTVL BJ2S3 Clona de Gen V del NDN1 Región J Célula T receptor de usada célula T usado P27 BV13S3 CASSE GQSGS EAFFGQG BJ1S1 SV21 BV4S1 CASV SVGQ QETQYFGPG BJ2S5 SV30 BV13S3 CAS TIQGG ETQYFGPG BJ2S5 1 inserción nucleotídica del segmento D. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1B. Respuestas específicas del gluten de líneas de células T de pacientes pediátricos como enfermedad celiaca Reconocimiento de gluten de líneas de células T de intestino delgado generadas después del desafío inicial con gluten con gluten (A) , y con tTG-gluten (B) . Las líneas de células T fueron seleccionadas por el reconocimiento del gluten (barras sombreadas) , y/o tTG-gluten (barras negras) . Las respuestas fueron consideradas positivas cuando la estimulación específica del gluten fue tres veces superior al fondo: SI > 3. Las líneas de células T que fueron usadas para la clonación están subrayadas . * Líneas que no fueron probadas contra tTG-gluten. Figura 2. Identificación del epitopo de gliadina Glia-a20 para la TCC JB20 El epitopo Glia-oc20 es caracterizado probando la respuesta de clonas de células T contra 50 p ptidos reunidos + tTG, cada uno conteniendo 5 péptidos de gliadina y/o glutenina. Fueron' reconocidos cinco grupos por la TCC JB20. La comparación de la secuencia de los péptidos indicó una sola secuencia (subrayada) que estuvo presente en los grupos estimuladores pero no en los grupos no estimuladores, por ejemplo el grupo 67. Esto fue confirmado por el reconocimiento de células T de una versión recién sintetizada de este péptido, llamada Glia-oc20. El indicado es el valor en cpm sin tratar (valor medio 312 ± 324) . Figuras 3A-3C. Análisis espectral de masas de la desamidacion del epitopo Glia-y30 (A) Masas iónicas del fragmento esperadas basadas en el epitopo Glia-y30 basadas en la secuencia de aminoácidos. (B) Fragmentos observados del epitopo Glia-y30, los iones b están indicados de acuerdo al panel A. (C) Fragmentos observados del epitopo Glia-y30 después de la desamidacion por tTG (C) . La diferencia de masa entre los iones b 228 y 413 en el panel B, y entre 228 y 414 en el panel C corresponden a la secuencia GQ y GE respectivamente, indicando la conversión de Q a E en la posición 4. De manera similar, la Q en la posición 10 es convertida a E por tratamiento con tTG de acuerdo a lo indicado por la desviación de 2 Da del ion blO de 1049 a 1051. Figura 4. Determinación del epitopo mínimo para Glia-y30. Los epitopos mínimos fueron determinados a través de pruebas de péptidos superpuestos que se basaron en la secuencia de la proteína del péptido Glia~Y30. Esta Figura representa la respuesta de célula T de TCC SV30 contra el péptido originalmente identificado ( subrayado) , y respuestas contra péptidos superpuestos. La secuencia mínima requerida para la introducción de proliferación de células T es IIQPQQPAQ. Figura 5. Reconocimiento de los epitopos de DQ2 novedosos . El efecto de la desamidación sobre reconocimiento de epitopos de gluten novedosos por clonas de "células G muestra tres patrones principales. Para reconocimiento de células T de epitopos de gluten Glt-17 (46-60) , Glt-156(40-59), y Glia-oc20 (93-106) se requiere el tratamiento con tTG. Se encontraron respuestas iguales o mejores después de la desamidación por tTG para los epitopos Glia-y30 y Glu-5. En el tercer patrón la reacción de célula T contra el epitopo Glu-21 es bloqueada por la desamidación del péptido, este epitopo sin embargo contiene un residuo de ácido glutámico natural que proporciona una carga negativa para la unión potencia a HLA DQ2. Figura 6. Respuestas a dos clonas de célula T contra péptidos homólogos Las búsquedas de homología con una secuencia parcial del epitopo Glt-156 (QQPPFSQQQQ) produjeron 34 apareamientos únicos en la base de datos de gluten. Se determinó la respuesta de células T contra ocho de esos péptidos de gluten homólogos y se encontró que eran distintas para las diferentes clonas de células T. La TCC NV17 responde contra todos los péptidos excepto el péptido 15, mientras que la TCC MS156 no reconoce los péptidos 12, 13 y 15. Figura 7. Alineación de la secuencia de aminoácidos de las clonas de ?-gliadina ?-l a ?5 Los números de acceso EMBL de la secuencia de ADN y los nombres de las clonas están indicados . Una secuencia de aminoácidos de consenso se da arriba de la alineación. Las secuencias N-terminal M y C-terminal Y y R no son de gliadina que se introdujeron como parte del vector de expresión. Las secuencias de los seis residuos N-terminales y los 8 residuos C-terminales son determinadas por cebadores usados para la amplificación por PCR. Figuras 8A-8C. Purificación bioquímica de fragmentos peptídicos estimuladores de TCC 411A de la gliadina recombxnante ?-5 La fracción de Superdex reactiva de células T 36 de la digestión con quimotripsina de ?-5 recombinante tratada con tTG (A) fue separada por cromatografía de intercambio iónico. La fracción MonoQ 2 tuvo material activo (B) y fue separada adicionalmente por CLAP en fase inversa. Ambas fracciones 14 y 16 produjeron un pico estimulador de células T pequeño (C) y fueron sometidas a espectrometría de masas ESI. Las respuestas de células T se dan en cmp. Figura 9. Fueron identificados ocho fragmentos peptidicos con espectrometría de masas ESI sobre las fracciones de CLAP en fase inversa 14 y 16. Esos péptidos se agrupan en tres diferentes regiones dentro de la ?-5 recombxnante y están indicados debajo de los extractos de secuencia. Figura 10. Péptidos sintéticos superpuestos que abarcan las regiones I y II de la gliadina ? recombxnante Los epitopos de célula T en ?-5 fueron identificados probando péptidos sintéticos superpuestos que abarcan las regiones I (16 péptidos) y II (18 péptidos) contra TCC derivadas de los pacientes CD411 y CD430. Figuras 11A-11C. Reactividad de clonas de célula T específicas para los epitopos DQ2-y-lll, DQ2-y-V o DQ2-y-I La prueba de variantes truncadas de los epitopos A) DQ2-y-III y C) DQ2-y-IV por su capacidad para estimular a la TCC 43OC y la TCC 43 OA, respectivamente. Para el epitopo B) DQ2-y-V ninguna de las variantes de truncación más cortas estimuló a la TCC 411A. Los péptidos fueron probados en su forma nativa (barras blancas) o después del tratamiento con tTG de cobayo (barras negras) . Los péptidos fueron probados a 10 µ?. Las respuestas se dan en cpm. Figuras 12A-12C. Reactividad de tres clonas de células T, cada una específica para cualquiera de los epitopos DQ2-0C-I, DQ2-0C-II o el DQ2-0C-III Prueba del péptido a-2 (64-75) con sustitución Q-E en la posición 72 (definido como DQ2-V-III) y parcialmente superpuesto con ambos de los epitopos DQ2-CC-I y DQ2-CC-II estimuló eficientemente a la TCC 370B mientras que los DQ2-0C-I y DQ2-0C-II no (A) . La prueba del epitopo DQ2-a-III contra la TCC CD387 E9 (B) específica de DQ2-a-I y la TCC CD436.5.4 (C) específica de DQ2-a-II. Las respuestas se dan en cpm. Figura 13. Reconocimiento de células T de algunos péptidos tratados con tTG derivados de la ?-gliadina M36999 Prueba de los péptidos M2, M7, M8 , MIO y M12 contra las líneas de células T CD411 E y CD432.1.6. Los resultados se dan como el índice de estimulación, calculado por la división de la respuesta proliferativa al antígeno por el fondo (T+APC) . Los péptidos fueron probados a 10 µ?.

. REFERENCIAS 1. al van de, Y., Kooy, Y.M.C., Veelen, van P., August, S.A., Drijfhout J.W. y Koning, F.Glutenin is involved in the gluten-driven mucosal T cell response. Eur. J. Immunol. 29, 3133-3139 (1999). 2. Wal van de Y, Kooy Y, Veelen van P, Pena S, Mearin L, Molberg- Q, Lundin L, Mutis T, Benckhuijsen W, Drijfhout J.W, y Koning F. Small intestinal cells of celiac disease patients recognize a natural pepsin fragment of gliadin. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 95, 10050-10054 (1998) 3. Wal van de Y, Kooy Y, Veelen van P, Pena S, Mearin L, Papadopulos G y Koning F. Cutting Edge: Selective deamidation by tissue transglutaminase strongly enhances giadin-specific T cell reactivity. J. Immunol. 161, 1585-1588 (1998). 4. Arentz-Hansen, H., R. Korner, O. Molberg, H.Quarsten, W.Vader, Y. . Kooy, K.E. Lundin, F. Koning, P.Roepstorff, L.M.Sollid, y S.N.McAdam. 2000. The intestinal T cell response to alpha-gliadin in adult celiac disease is focused on a single deamidated giutamine targeted by tissue transglutaminase. J. Exp.Med. 191:603-612. 5. Sjostrom, H . , K.E. Lundin, O. Molberg, R. Korner, S.N.McAdam, D.Anthonsen, H.Quarsten, O.Noren, P.Roepstorff, E.Thorsby, y L.M.Sollid. 1998. Identification of a gliadin T-cell epitope in coeliac disease: general importance of gliadin deamidation for intestinal T-cell recognition. Scand.J. Immunol . 48:111-115. 6. Arentz-Hansen, E.H., S.N.McAdam, O.Molberg, C. Kristiansen, y L. . Sollid, 2000. Production of a panel of racombinant gliadins for the characterisation of T cell reactivity in coeliac disease. Gut 46:46-51. 7. Lundin, K.E., H.Scott, T.Hansen, G.Paulsen, T. S. Halstensen, O.Fausa, E.Thorsby, y L.M. Sollid. 1993. Gliadin-specific, HLA-DQ (alfa 1*0501, beta 1*0201) restricted T cells isolated from the small intestinal mucosa of celiac disease patients. J.Exp.Med. 178:187-196. 8. Molberg, O., S . N . McAdam, R.Korner, H. Quarsten, C. Kristiansen, L. Madsen, L. Fugger, H.Scott, O.Noren, P. Roepstorff, K.E. Lundin, H. Sjostrom y L.M. Sollid. 1998. Tissue transglutaminase selectively modifies gliadin peptides that are racognized by gut-derived T cells in celiac disease. Nat.Med. 4:713-717. 9. Jung, G. 1996. Combinatorial peptide and nonpeptide librarles - A handbook for the search of lead structures. In Combinatorial peptide and nonpeptide librarles - A handbook for the search of lead structures. G. Jung, editor, Verlag Chemie, Weinheim. 10. Scheets, K. and C.Hedgcoth. 1988. Nucleotide sequence of a gamma-gliadin gene: Comparisons with other gamma-gliadin sequences show the structure of gamma-gliadin genes and the genaral primary structure of gamma-gliadins . Plant Science 57:141-150. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones. 1. ün receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo, caracterizado porque es capaz de reconocer un péptido derivado de prolamina. 2. El receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque péptido derivado de prolamina puede ser obtenido de una proteina seleccionada de gliadinas, gluteninas, secalinas, hordeinas o aveninas . 3. El receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el péptido derivado de prolamina está modificado. . El receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el péptido derivado de prolamina está desanidado. 5. El receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el péptido derivado de prolamina comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de acuerdo a lo descrito en la Tabla 2 y/o la Tabla 5. 6. El receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el péptido derivado de prolamina está flanqueado por aminoácidos que representan sitios de procesamiento de antigenos. 7. El receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 8. ün vector, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7. 9. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende un receptor de célula T restringida por HLA-DQ o equivalente y/o fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico de conformidad con al reivindicación 7 o un vector de conformidad con la reivindicación 8. 10. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula hospedera es inmortal. 11. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque comprende además un correceptor de CD4 y un receptor de célula T asociada con el CD3 complejo. 12. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque comprende un componente inducido para detectar la activación de células T. 13. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el componente inducible comprende un promotor para el factor nuclear de células T activadas (NFAT) acoplado al gen reportero LacZ (NFAT-lacZ) . 14. La célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizada porque es seleccionada del grupo de PEER, OLT-3, MOLT-4, Jurkat o HPB-ALL. 15. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un receptor de célula T restringido por HLA-DQ aislado o recombinante o equivalente y/o fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 o un vector de conformidad con la reivindicación 8. 16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque sirve para el tratamiento de la enteropatía inmune relacionada con alimentos . 17. La composición f rmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la enteropatia inmune relacionada con alimentos es esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez. 18. Un péptido derivado de prolamina, aislado, recombinante o sintético o un equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismo, opcionalmente acoplado a una molécula portadora, caracterizado porque el péptido derivado de prolamina está implicado en la enteropatia inmune relacionada con los alimentos. 19. El péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el péptido derivado de proteina puede ser obtenido de una proteína del grupo de las gliadinas, gluteninas, secalinas, hordeínas o aveninas. 20. El péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque el péptido derivado de prolamida está modificado. 21. ¦ El péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético de conformidad con la reivindicación 18 a 20, caracterizado porque el péptido derivado de prolamina está desanudado. 22. El péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético de conformidad con la reivindicación 18 a 21, caracterizado porque el péptido derivado de prolamida comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos como se describe en la Tabla 2 y/o Tabla 5. 23. El péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético de conformidad con la reivindicación 18 a 22, caracterizado porque el péptido derivado de prolamida está flanqueado por aminoácidos que representan sitios de procesamiento de antigenos. 24. El péptido derivado de prolamina aislado, recombinante o sintético de conformidad con la reivindicación 18 a 23, caracterizado porque la enteropatia inmune relacionada con alimentos es la esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez. 25. Un anticuerpo aislado o sintético o equivalente funcional y/o fragmento funcional del mismo, caracterizado porque reconoce específicamente un péptido derivado de prolamina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24. 26. Un inmunoensayo, caracterizado porque comprende un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25. 27. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica para un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25. 28. Un vector, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27. 29. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27 o un vector de conformidad con la reivindicación 28. 30. Un equipo de diagnóstico, caracterizado porque comprende : un receptor de célula G restringido por HLA-DQ aislado o recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25 y medios de detección adecuados. 31. El equipo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque sirve para detectar en alimentos, componentes de alimentos o muestras biológicas, la presencia de un péptido derivado de prolamina implicado en la enteropatía inmune relacionado con alimentos. 32. El ensayo de diagnóstico de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la enteropatia inmune es selecciona del grupo de esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez. 33. · Un método para hacer disminuir la unión de un receptor de célula T restringido por HLA-DQ a un péptido derivado de prolamina implicado en la enteropatia inmune relacionada con alimentos, caracterizado porque comprende proporcionar una sustancia bloqueadora. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la enteropatia inmune relacionada con alimentos es esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez . 35. El uso de una sustancia bloqueadora capaz de hacer disminuir la unión de un receptor de célula T restringido por HLA-DQ a un péptido derivado de prolamina implicado en la enteropatia inmune relacionada con alimentos para el agotamiento de células T que contienen el receptor de célula T restringido por HLA-DQ. 36. Un método para hacer disminuir la unión de péptidos derivados de prolamina implicados en la enteropatia inmune relacionada con alimentos a moléculas de HLA-DQ, caracterizado porque comprende proporcionar sustancias que bloquean la unión de los péptidos a las moléculas de HLA-DQ. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la enteropatia inmune relacionada con alimentos es esprue o estomatitis celiaca, esprue o estomatitis tropical, giardiasis o alergias a alimentos de la niñez . 38. Un método para detectar y/o enumerar las células T que contienen o portan un receptor de célula T de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende complejos tetraméricos de HLA-DQ y un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24. 39. Un método para detectar y/o enumerar las células T que contienen o portan un receptor de célula T de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque comprende liposomas que comprenden complejos de HLA-DQ y un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24. 40. Un método para hacer disminuir la cantidad de péptidos derivados de prolamina tóxicos en alimentos o componentes de alimentos, caracterizado porque comprende incubar un receptor de células T aislado o recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25 con el alimento o componente de alimento. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el péptido derivado de prolamina puede ser obtenido de una proteína seleccionado del grupo de gliadinas, gluteninas, secalinas, hordeinas o aveninas . 42. Un método para seleccionar y/o crear o producir un cereal, caracterizado porque comprende proporcionar un receptor de célula T aislado o recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una célula hospedera de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25. 43. Un cereal, caracterizado porque puede ser obtenido por un método de conformidad con la reivindicación 42. 44. El uso de un cereal de conformidad con la reivindicación 43, para la inclusión en una dieta para un individuo sensible al gluten. 45. Un producto alimenticio para un individuo sensible al gluten, caracterizado porque comprende un cereal de conformidad con la reivindicación 43. 46. Un análogo de un péptido derivado de prolamina, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, caracterizado porque el análogo es un antagonista de la actividad de las células T que reconocen al péptido derivado de prolamina. 47. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un péptido derivado de prolamina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24. 48. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque sirve para la inducción de tolerancia. 49. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque sirve para el tratamiento de la sensibilidad al gluten. 50. La composición farmacéutica de conformidad corla reivindicación 47, caracterizada porque sirve para la eliminación de las células T sensibles al gluten. 51. El uso de un inhibidor de proteasa para evitar la generación de péptido derivado de prolamina de conformidad con las reivindicaciones 18 a 24 o un polipéptido, que comprende un péptido derivado de prolamina de conformidad con las reivindicaciones 18 a 24. 52. El uso de sustancias neutralizantes de ácido para evitar la generación de un péptido derivado de prolamina de conformidad con las reivindicaciones 18 a 24 o un polipéptido que comprende un péptido derivado de prolamina de conformidad con las reivindicaciones 18 a 24.