MXPA03006818A - Metodos y composiciones para modular el sistema inmune de animales. - Google Patents

Abstract

Se describen metodos y composiciones para modular el sistema inmune de animales. El solicitante ha identificado que la administracion oral de inmunoglobulinas purificadas de sangre de animal puede modular los niveles de IgG, TNF-a en el suero u otros componentes de inmunidad no especifica para el tratamiento de trastornos de disfuncion inmune, potenciacion de protocolos de vacunacion y mejoramiento de la salud en general y ganancia de peso en animales, incluyendo seres humanas.

Description

¦ - -¦ METODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR EL SISTEMA INMUNE DE ANIMALES A QUIEN CORRESPONDA: 5 Sépase que nosotros, JOY M. CAMPBELL, RONALD E. STROHBEHN, ERIC M. WEAVER, BARTON S. BORG, LOUIS E. RUSSELL, FRANCISCO JAVIER POLO POZO, JOHN D. ARTHINGTON, y JAMES D. QUIGLEY, III; hemos inventado ciertas mejorías nuevas y útiles en METODOS Y COMPOSICIONES PARA 10 MODULAR EL SISTEMA INMUNE DE ANIMALES de las cuales lo siguiente es una especificación: ANTECEDENTES DE LA INVENCION 15 La fuente principal de nutrientes para el cuerpo es la sangre, la cual está compuesta de proteínas altamente funcionales que incluyen inmunoglobulina, albúmina, fibrinógeno y hemoglobina. Las inmunoglobulinas son productos de células B maduras (células de plasma) y hay cinco inmunoglobulinas distintas aludidas como 20 clases. M, D, E, A y G. IgG es la clase principal de inmunoglobulina en la sangre. La administración intravenosa de productos de inmunoglobulina se ha usado durante mucho tiempo en un intento para regular o aumentar el sistema inmune. La mayor evidencia con respecto a los efectos de IgG intravenosa en el sistema inmune 25 sugiere que la porción de la fracción constante (Fe) de la molécula juega una función reguladora. Las propiedades de unión del antígeno específico de una molécula individual de IgG son conferidas por una disposición esférica de tres dimensiones inherente en las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de dos cadenas ligeras y dos pesadas de la molécula. La región constante puede ser separada de la región variable si la molécula intacta es escindida mediante una enzima proteolítica tal como papaína. Tal tratamiento produce dos fracciones con especificidad de anticuerpo (fracciones Fab) y una fracción relativamente constante (Fe). Numerosas células en el cuerpo tienen receptores de membrana distintos para la porción de Fe de una molécula de IgG (Fcr). Aunque algunos receptores de Fcr unen IgG libre, la mayoría la une más eficientemente si un antígeno está unido a la molécula anticuerpo. La unión de un antígeno resulta en un cambio de configuración en la región Fe que facilita la unión a un receptor. Una interacción compleja de señales proporciona equilibrio y lo apropiado para una respuesta inmune generada en cualquier momento dado en respuesta a un antígeno. Las respuestas específicas de antígeno se inician cuando células de presentación de antígeno especializado introducen antígeno, formando un complejo con las moléculas complejas de mayor histocompatibilidad para los receptores de un inductor de células T auxiliar específico capaz de reconocer ese complejo. La IgG parece estar involucrada en la regulación de ambas reacciones alérgica y autoinmune. La inmunoglobulina intravenosa para manipulación inmune ha sido propuesta hace mucho, pero ha logrado resultados mixtos en el tratamiento de estados de enfermedad. Una revisión detallada del uso de inmunoglobulina intravenosa como terapia de fármaco para manipular el sistema inmune se describe en New England Journal of Medicine Dwyer, John M . , Vol. 326, No. 2 , páginas 1 07-1 16, cuya descripción se incorpora a la presente por referencia. Existe un esfuerzo y necesidad continuos en la técnica de composiciones y métodos mejorados para la modulación inmune de animales. La inmuno-modulación apropiada es esencial para mejorar la respuesta a patógenos, vacunas, para aumentar la ganancia de peso y mejorar la eficiencia de alimentación, para supervivencia mejorada por reto de enfermedad, salud mejorada y para tratamiento de estados de enfermedad con disfunción inmune. Es un objetivo de la presente invención proporcionar métodos y composiciones farmacéuticas para tratar animales con estados de enfermedad con disfunción inmune. Es aun otro objetivo de la invención proporcionar métodos y composiciones para inmuno-modulación de animales incluyendo humanos para optimizar la respuesta a antígenos presentados en protocolos de vacunación. Es aun otro objetivo de la invención proporcionar métodos y composiciones para inmuno-modulación de animales incluyendo humanos para una respuesta óptima del sistema inmune cuando hay reto de enfermedad.

Es aun otro objetivo de la invención aumentar la ganancia de peso, mejorar la salud global y mejorar la eficiencia alimenticia de animales modulando apropiadamente el sistema inmune de dichos animales. Es aun otro objetivo de la invención proporcionar una composición farmacéutica novedosa que comprende plasma purificado, componentes o derivados del mismo, los que pueden ser administrados oralmente para crear una respuesta de IgG o TNF-a en suero. Estos y otros objetivos de la invención serán aparentes a partir de la descripción detallada de la invención que sigue.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCI ON De acuerdo con la invención, los solicitantes han identificado plasma purificado y aislado, componentes y derivados del mismo, los cuales son útiles como una composición farmacéutica para modulación inmune de animales incluyendo humanos. De acuerdo con la invención, una composición de plasma que comprende inmunoglobulina, cuando se administra oralmente, regula y disminuye las respuestas de inmunidad no-específica e induce una disminución y regulación de niveles de IgG y niveles de TNF-a en suero con relación a animales alimentados no oralmente con fracciones de inmunoglobulina o plasma. Una composición de plasma administrada oralmente que comprende inmunoglobulina afecta el estado global inmune de los animales cuando se exponen a un antígeno, protocolos de vacunación, y para tratamiento de estados de enfermedad con disfunción inmune. Los solicitantes han mostrado de manera inesperada que la administración oral de proteína de plasma puede inducir un cambio en inmunoglobulina y TN F-a en suero así como también otras respuestas de inmunidad no específicas. Esto es inesperado ya que tradicionalmente se pensó que las proteínas del plasma tales como inmunoglobulinas , deben ser introducidas de manera intravenosa para afectar I gG, TN F-a, u otros componentes circulantes de inmunidad no específica. En contraste, los solicitantes han demostrado que la globulina oral es capaz de tener impacto en niveles de IgG o TNF-a en suero circulante. Además, este efecto puede observarse en tan poco como 14 días. Esto simplifica grandemente la administración de composiciones inmuno-moduladoras tales como inmunoglobulina ya que estas composiciones, de acuerdo con la invención, pueden ser ahora agregadas simplemente a alimentos o aun a agua para modular la vacunación, para modular reto de enfermedad, o para tratar animales con estados de enfermedad con disfunción inm une. También de acuerdo con la invención, los solicitantes han demostrado que la modulación de IgG y TNF- en suero tiene impacto en la respuesta del sistema inmune para estimulación como en protocolos de vacunación o trastornos con disfunción inmune. La modulación de IgG y TNF- en suero, de acuerdo con Ja invención , permite al sistema inmune de los animales responder más efectivamente a reto permitiendo una respuesta de regulación más alta significativamente en la presencia de un estado de enfermedad o presentación de antígeno. Además este régimen de impactos de regulación inmune y eficiencia de ganancia, así como el costo bio-energético asociado con función inmune acentuada requiere cantidades significativas de energía y nutrientes lo cual se desvía de tales cosas como el crecimiento celular y la ganancia de peso. La modulación del sistema inmune permite que la energía y nutrientes se usen para otras funciones productivas tales como el crecimiento y la lactancia. Ver, Buttgerut y colaboradores, "Bioenergética de Funciones Inmunes: Aspectos Fundamentales y Terapéuticos", Immunoloqy Today, Abril 2000, Vol. 21 , No. 4, pp. 192-199. Los solicitantes han identificado también que mediante el consumo oral, la región de Fe de la composición de hemoglobina es esencial para la comunicación y/o modulación subsiguiente de la IgG en suero sistémico. Esto es único, ya que ésta es la porción inmune no específica de la molécula la cual después del consumo oral modula IgG en suero sistémico sin administración intravenosa como se indicó previamente (Dwyer, 1962). Las fracciones específicas de anticuerpo produjeron menos de una respuesta sin la estructura terciaria de Fe. Adicíonalmente, la porción de globulina con confirmación intacta dio una mejor reacción que las cadenas pesada y ligera cuando se separó de las mismas.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que representa el efecto de administración oral de proteína de plasma sobre respuestas de anticuerpo para una vacunación primaria y secundaria para rotavirus. La Figura 2 es una gráfica que representa el efecto de administración oral de proteínas de plasma sobre respuestas de anticuerpo para una vacunación primaria y secundaria para PRRS. Las Figuras 3A y 3B son gráficas que representan el peso corporal de grupos con agua tratada y con plasma tratado respectivamente después de un reto de enfermedad respiratoria. La Figura 4 es una gráfica que representa el por ciento de pavos restante después del reto de enfermedad respiratoria. La Figura 5 es una gráfica que representa el por ciento de pavos restante antes del reto de enfermedad respiratoria. La Figura 6 es una gráfica que representa el efecto supresor de la administración oral de proteínas de plasma y fracciones sobre la producción TN F-a.

DESCRIPC ION DETALLADA DE LA I NVENCION De acuerdo con la invención, el Solicitante ha proporcionado en la presente una composición farmacéutica que comprende componentes purificados y concentrados a partir de plasma de animal el cual es útil al practicar los métodos de la invención. De acuerdo con la invención, gama-globulina aislada a partir de fuentes animales tales como suero, plasma, huevo o leche se administra oralmente en conjunto con protocolos de vacunación o para tratamiento de varios estados de enfermedad con disfunción inmune para modular la estimulación del sistema inmune. De manera muy sorprendente se ha encontrado que la administración oral de esta composición disminuye los niveles de IgG y TNF- en suero con relación a la no administración de la composición farmacéutica. Empezando de un estado menos estimulado, el sistema inmune es capaz de montar una respuesta más agresiva al reto. Además, son mejorados los estados de enfermedad asociados con niveles altos de IgG y/o TN F-a. Como se usa en le presente con referencia a la composición de la invención , serán usados los términos "plasma", "globulina", "gama-globulina" e "inmuno-globulina". Todos estos tienen la intención de describir una composición de plasma o sus componentes o fracciones del mismo purificados a partir de fuentes animales incluyendo sangre, huevo o leche los cuales retienen la región de Fe de la molécula de inmuno-globulina. Esta incluye también inmuno-globulinas recombinantes transgenicas purificadas a partir de bacterias, plantas o animales transgénicos. Esta se puede administrar mediante plasma rociado en seco, o globulina que ha sido purificada adicionalmente a partir de la misma, o cualquier otra fuente de globulina de suero que esté disponible. Una de tales fuentes de globulina purificada es NutraGammax™ o JmmunoLin™ disponible de Proliant I nc. La globulina se puede purificar de acuerdo con cualquiera de los métodos disponibles en la técnica, incluyendo aquellos descritos en Akita, E. M . y S. Nakai, 1 993. Comparación de cuatro métodos de purificación para la producción de inmuno-globulinas a partir de huevos puestos por gallinas inmunizadas con una cepa de E. coli enterotoxigénica. Journal of Immunological Methods 160:207-214; Steinbuch , M . y R. Audran. 1 969. El aislamiento de IgG a partir de sueros de mamíferos con la ayuda de ácido caprílico. Archivos de Biochemistry and Biophysics 1 34:279-284; Lee, Y. , T. Aishima, S. Nakai, y J . S. Sim. 1 987. Optimización para fraccionación selectiva de proteínas de plasma de sangre de bovino utilizando polietilenglicol. Journal of Agricultural and Food Chemistry 35:958-962; Polson , A. , G . . Potgieter, J . F. Langier, G. E. F. Meras, y F. J. Toubert. 1 964. Biochem . Biophys. Acta. 82:463-475. Plasma de animal a partir del cual se puede aislar inmuno-globulina incluye plasma de cerdo, bovino, ovino, aves, equino, o cabra. Adicionalmente, los solicitantes han identificado que fuentes de especies cruzadas de las gama globulinas proporcionan aun los efectos de la invención. Se pueden obtener concentrados del producto mediante secado por rociado, liofilización, o cualquier otro método de secado, y se pueden usar concentrados en su forma l íquida o congelada. El ingrediente activo puede ser también microencapsulado, protegido y estabilizado de alta temperatura, oxidantes, humedad como pH, etc.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en tabletas, cápsulas, ampolletas para uso oral, polvo granulado, crema, tanto como un ingrediente único como asociado con otros excipientes o compuestos activos, o aun como un aditivo de alimento. Un método para lograr un concentrado de composición de gama-globulina de la invención es como sigue, aunque la globulina puede ser entregada como un componente del plasma. El concentrado de inmuno-globulina se deriva de sangre de animal. La fuente de la sangre puede ser a partir de cualquier animal que tenga sangre que incluya plasma e inmuno-globulinas. Por conveniencia, se prefiere la sangre de plantas de procesamiento de ganado, cerdos y aves. Se agrega anticoagulante a la sangre entera y después la sangre se centrifuga para separar el plasma. Se puede usar cualquier anticoagulante para este propósito, incluyendo citrato de sodio y heparina. Personas expertas en la técnica pueden apreciar fácilmente tales anticoagulantes. Después se agrega calcio al plasma para promover la coagulación, la conversión de fibrinógeno a fibrina; sin embargo, son aceptables otros métodos. Esta mezcla se centrífuga después para eliminar la porción de fibrina. Una vez que la fibrina es eliminada del plasma que resulta en suero, el suero puede usarse como una fuente principal de Ig. Alternativamente, se podría inactivar también esta porción del mecanismo de coagulación utilizando varios anticoagulantes.

El plasma desfribinado se trata en seguida con una cantidad de compuesto de sal o polímero suficiente para precipitar la fracción de albúmina o globulina del plasma. Ejemplos de compuestos de fosfato que pueden usarse para este propósito incluyen todos los polifosfatos, incluyendo hexametafosfato de sodio y polifosfato de potasio. La globulina puede ser aislada también mediante la adición de polietilenglicol o sulfato de amonio. En seguida de la adición del compuesto de fosfato, se baja el pH de la solución de plasma para estabilizar el precipitado de albúmina. El pH no debe ser disminuido por debajo de 3.5, ya que esto causará que se dañen las proteínas en el plasma. Se puede usar cualquier tipo de ácido para este propósito, siempre que sea compatible con la solución de plasma. Personas expertas en la técnica pueden determinar fácilmente tales ácidos. Ejemplos de ácidos adecuados son HCI , ácido acético, H2SO4, ácido cítrico, y H2PO4. El ácido se agrega en una cantidad suficiente para bajar el pH del plasma hasta un rango designado. Generalmente, esta cantidad fluctuará desde una relación de aproximadamente 1 :4 hasta 1 :2 de ácido a plasma. El plasma se centrífuga después para separar la fracción de globulina de la fracción de albúmina. El siguiente paso en el proceso es elevar el pH de la fracción de globulina con una base hasta que ya no sea corrosiva para el equipo de separación. Bases aceptables para este propósito incluyen NaÓH, KOH y otras bases alcalinas. Tales bases son fácilmente determinables por aq uellos expertos en la técnica. El pH de la fracción de globulina se eleva hasta que está dentro del rango no corrosivo que estará generalmente entre 5.0 y 9.0. La fracción de inmuno-globulina de preferencia se microfiltra después para eliminar cualesquiera bacterias que pudieran estar presentes. El concentrado final de inmuno-globulina puede ser secado opcionalmente por rociado hasta un polvo. El polvo permite empacado más fácil y el producto permanece estable durante un periodo de tiempo más largo que el concentrado de globulina materia prima en forma líquida o congelada. Se ha encontrado que el polvo concentrado de inmuno-globulina contiene aproximadamente 35-50% de IgG. Además de la administración con portadores convencionales, se pueden administrar ingredientes activos mediante una variedad de técnicas especializadas de entrega de fármaco las cuales son conocidas por aquellos de pericia en fa técnica. Se dan los siguientes ejemplos para propósitos de ilustración solamente y no se pretende de ningún modo que limiten la invención. Aquellos expertos en las técnicas médicas apreciarán fácilmente que las dosis y programas de la inmuno-globulina variarán dependiendo de edad, salud, sexo, tamaño y peso del paciente más bien que de la administración, etc. Estos parámetros se pueden determinar para cada sistema mediante procedimientos y análisis bien establecidos, por ejemplo, en fase I, II y II I de ensayos clínicos. Para tal administración, el concentrado de globulina puede ser combinado con un portador farmacéuticamente aceptable tal como un vehículo o excipiente líquido adecuado y un aditivo o aditivos auxiliar opcional. Los vehículos o excipientes líquidos son convencionales y están disponibles comercialmente. Ilustrativos de los mismos son agua destilada, salina fisiológica, soluciones acuosas.de dextrosa y los similares. En general, además de los compuestos activos, las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden contener excipientes y auxiliares adecuados que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las formas de dosificación oral abarcan tabletas, grageas y cápsulas. Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican en una manera que es por sí misma bien conocida en la técnica. Por ejemplo, las preparaciones farmacéuticas pueden hacerse por medio de procesos convencionales de mezclado, granulación, fabricación de grageas, disolución y liofilización. Los procesos a usarse dependerán finalmente de las propiedades físicas del ingrediente activo utilizado. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, por ejemplo, lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo, fosfato tricálcico o fosfato ácido de calcio, así como también aglutinantes tales como almidón, pasta, usando, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, carboximetil celulosa de sodio, y/o polivinil pirrolidona. Si se desea, se pueden agregar agentes de desintegración, tales como los almidones antes mencionados, así como también almidón de carboximetil, polivinil pirrolidona entrelazado, agar, o ácido algínico, o una sal del mismo, tal como alginato de sodio. Los auxiliares son agentes reguladores de flujo y lubricantes, por ejemplo, tales como sílice, talco, ácido esteárico o sales del mismo, tales como estearato de magnesio o estearato de calcio y/o polietilenglicol. Los núcleos de las grageas pueden suministrarse con recubrimientos adecuados los cuales, si se desea, pueden ser resistentes a los jugos gástricos. Para este propósito pueden utilizarse soluciones concentradas de azúcar, las cuales pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, polientilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes o mezclas de solventes orgánicos adecuados. Con el fin de producir recubrimientos resistentes a los jugos gástricos, se pueden agregar soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas, tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetil celulosa, colorantes y pigmentos a los recubrimientos de tableta o gragea, por ejemplo, para identificación o con el fin de caracterizar combinaciones diferentes de dosis de compuesto. Otras preparaciones farmacéuticas que pueden utilizarse oralmente incluyen cápsulas de ajuste por presión hechas de gelatina, así como también cápsulas suaves, selladas hechas de gelatina y un plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener los compuestos activos en la forma de gránulos que pueden mezclarse con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas suaves, los compuestos activos se disuelven o suspenden de preferencia en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polientilenglicoles líquidos. Se pueden agregar además estabilizadores. Se encontró que las dosis orales de proteína de globulina o plasma de acuerdo con la invención, modulan la respuesta inmune primaria y secundaria a vacunas para rotavirus y PRRS ayudando a modular la IgG y/o TNF-a. y el sistema inmune. Además, se encontró que la administración oral de proteínas de plasma modulan (aumentan) el sistema inmune tanto en animales de partida como después de un reto de enfermedad respiratoria. Los componentes de Ig purificados no solamente mejoran la eficiencia de alimentos y supervivencia después de un reto de enfermedad, sino que refuerza también el sistema inmune de animales de partida para combatir mejor (disminuir los efectos de) un reto inmune futuro. Los métodos de la invención incluyen también la prevención y tratamiento de enfermedades e infecciones gastrointestinales, síndrome de malabsorción, inflamación intestinal, enfermedades respiratorias y mejora estados autoinmunes y reducción de reacciones inflamatorias sistémicas en humanos y animales. Las composiciones del fármaco, preparaciones alimenticias y dietéticas serían válidas para mejorar el estado inmune en humanos y animales, para enfermedades asociadas con IgG elevada, enfermedades asociadas con TNF-a elevada, u otras enfermedades asociadas con disfunción reguladora inmune, para el soporte y tratamiento de procesos de malabsorción en humanos y animales, para tratamiento de situaciones clínicas que padecen de mala nutrición y para la prevención y tratamiento de enfermedad respiratoria en humanos y animales. Entre estos procesos de malabsorción se incluyen el síndrome del intestino delgado, diarrea no tratable de origen autoinmune, línfoma, post-gastrectom ía, seborrea, carcinoma del páncreas, resección pancreática amplia, insuficiencia mesentérica vascular, amiloidosis, escleroderma, enteritis eosinofílica. Las citaciones clínicas asociadas con mala nutrición incluirían colitis ulcerante, enfermedad de Crohn, caquexia cancerosa debido a enteritis crónica a partir del tratamiento de quimio o radioterapia y patología médica e infecciosa y comprende malabsorción severa tal como SIDA, fibrosis cística, fístula enterocutánea de bajo débito e insuficiencia renal infantil. El complemento dietético administrado vía el agua reforzaría el sistema inmune en humanos y animales para retos de enfermedad respiratoria. Ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no están limitados a, influenza avícola, enfermedad respiratoria crónica, sinusitis infecciosa, neumonía, cólera de aves y sinovitis infecciosa. Los usos clínicos de la composición incluirían de manera típica estados de enfermedad asociados con disfunción inmune, particularmente estados de enfermedad asociados con estimulación inmune crónica. Ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no están limitados a, miastenia gravis, esclerosis múltiple, lupus, poliomiositis, s índrome de Sjogren, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, penfigoide bullous, enfermedad ocular relacionada con la tiroides, ureítis, síndrome de Kawasaki, síndrome de fatiga crónica, asma, enfermedad de Crohn, enfermedad de injerto vs. huésped, virus de inmunodeficiencia humana, trombocitopenia, neutropenia y hemofilia. La administración oral de IgG, TNF-a u otros componentes activos del plasma para modular la Inmunidad no específica circulante tiene ventajas tremendas sobre la administración parenteral. Los más obvios son los riesgos asociados con la administración intravenosa incluyendo: reacciones alérgicas, el riesgo incrementado de transferencia de enfermedad de la sangre humana tal como H IV o Hepatitis, el requerimiento para la misma fuente de especie, el costo de administración y los beneficios de IgG oral es neutralización mayor de endotoxina y la estimulación "basal" del sistema inmune; el uso potencial de IgG xenogenéica. La invención de los solicitantes proporciona un método no invasivo para modular la respuesta inmune. Este se puede usar para tratar desórdenes autoinmunes (por ejemplo, reacciones de Rhesus, lupus, artritis reumatoide, etc.) y otras condiciones donde la inmunomodulación, inmunosupresión o inmunoregulación es el resultado deseado (transferencia de órganos, desórdenes inmuno-estimuladores crónicos, etc.). En otra modalidad la invención puede ser utilizada para inmunoterapia oral (utilizando anticuerpos) como una alternativa al I VI G. Pero, anterior a la invención de los solicitantes, no se podían producir las cantidades masivas de anticuerpos requeridas para tratamiento sostenido debido a que I VI G requeriría I VI G humano. Con la administración oral de anticuerpo, se puede usar una fuente de especie diferente, sin la amenaza de reacción alérgica. Esto abre la puerta a la leche, calostro, suero, plasma, huevos, etc., de cerdos, ovejas, cabras, ganado, etc., como los medios de producir las cantidades relativamente grandes de inmunoglobulina que serían requeridas para tratamiento sostenido. La administración oral de anticuerpo puede: 1) Modular la respuesta inmunológica para exposición a un antígeno parecido/similar. La información producida a partir de la inmunización de cerdos con rotavirus o PRRS, muestra que la administración oral de inmunoglobulina modifica la respuesta inmune subsiguiente a antígeno administrado de manera intramuscular. La comunicación ocurre vía los efectos de IgG en las células inmunes ubicadas en el tracto Gl (principalmente en epitelio intestinal y tejido linfático). El plasma administrado a los animales podría contener tradicionalmente anticuerpo para tanto PRRS como rotavirus. La investigación previa ha demostrado que el calostro (anticuerpo maternal) tiene este mismo efecto cuando se administra antes del cierre intestinal. El solicitante ha demostrado que el anticuerpo puede modular la respuesta inmune en un animal posterior al cierre intestinal; 2) Las concentraciones de IgG y TNF-a en suero son menores con la administración oral de proteínas de plasma. Este efecto proporciona beneficios para la prevención o tratamiento de muchas condiciones diferentes (por ejemplo, de Crohn, IBD, I BS, sepsis, etc.) que los efectos inmunosupresores de anticuerpos específicos. Este efecto no es específico de anticuerpo. Aunque no se desea limitar por ninguna teoría se postula que las proteínas de plasma pueden neutralizar una cantidad significativa de endotoxina en el lumen del intestino. En los cerdos recientemente destetados, esa función de barrera de intestino es puesta en peligro y "fugará" endotoxina. La endotoxina (LPS) es uno de los compuestos inmunoestimulador más potente conocido. Así, como un auxiliar de post-destete, esta invención puede mejorar una respuesta del animal a la endotoxina mediante la modulación del sistema inmune que evita la sobreestimulación. La ruta de alimentación es importante para los diferentes efectos. La alimentación parenteral incrementa la permeabilidad intestinal y se sabe que aumenta substancialmente la probabilidad de sepsis y endotoxemia cuando se compara con la alimentación enteral. El suministro oral de inmunoglobulina mejora la función de barrera intestinal y reduce la absorción de endotoxina. La absorción reducida de endotoxina reducirá la cantidad de endotoxina adherida en plasma lo cual incrementaría la capacidad de neutralización del plasma cuando se compara con anímales de control. La invención de los solicitantes describe la inmunomodulación, consistente con las observaciones de los efectos de IVI G en la literatura. Además, se observó el efecto de inmunomodulación de IgG con diferentes fuentes de especie de IgG administrada oralmente. Esto es muy importante en la medicina para seres humanos, particularmente para condiciones autoinmunes (o casos dónde se desea inmunomodulación).

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APMIS 103:721-730.

Habiendo descrito la invención con referencia a composiciones particulares, teorías de efectividad y similares, será aparente para aquellos de pericia en la técnica que no se pretende que la invención esté limitada por tales modalidades o mecanismos ilustrativos y que pueden hacerse modificaciones sin apartarse del alcance o espíritu de la invención, como se define por las reivindicaciones adjuntas. Se pretende que todas de tales modificaciones y variaciones obvias queden incluidas dentro del alcance de la presente invención como se define en las reivindicaciones adjuntas. - Las reivindicaciones intentan cubrir los componentes y pasos reivindicados en cualquier secuencia que sea efectiva para satisfacer los objetivos intentados en esas, a menos que el contexto indique específicamente lo contrario.

EJEMPLO 1 Método Preferido de Fabricación para Concentrado de Globulina Lo siguiente ilustra un método preferido para fabricar el concentrado de globulina de la presente invención: Plasma 1 Recalcificación de plasma r i Centrifugar para eliminar fibrina I Filtro I Precipitación de sal i Centrifugar Fracción Rica en Globulina Desechar EJEMPLO 2 Necesidad de Globulina Intacta La investigación previa demuestra que el consumo de plasma oral mejora el comportamiento de cerdos en destete (Coffey y Cromwell, 1995). La información indica que la fracción de peso molecular alto presente en plasma influencia el comportamiento del cerdo (Cain, 1995; Owen y colaboradores, 1995; Pierce y colaboradores, 1995, 1996; Weaver y colaboradores, 1 995). La fracción de alto peso molecular está compuesta principalmente de proteína de IgG. La proteína G de inmunoglobuliina es un compuesto de aproximadamente 150, 000 PM que consiste de dos cadenas de polipéptidos de 50,000 PM designadas como cadenas pesadas y dos cadenas de 25,000 PM, designadas como cadenas ligeras (Kuby, 1997). Un enfoque para la hidrólisis de IgG intacta ha sido demostrada en laboratorio con la enzima pepsina. Una breve digestión con enzima pepsina producirá un fragmento de PM 1 00, 000 compuesto de dos fragmentos parecidos a Fab (Fab = aglutinación de antígeno). El fragmento de Fe de la molécula intacta no se recupera a medida que es digerido en fragmentos múltiples (Kuby, 1 997). Un segundo tipo de procesamiento de concentrado rico en globulina es mediante la reducción de unión de disulfuro con bloqueo subsiguiente para evitar la reformación de uniones de disulfuro. Las secciones reducidas resultantes de la molécula de globulina son cadenas pesadas y ligeras libres intactas. En el primer ejemplo el objetivo fue cuantificar el impacto por consumo oral de diferentes fracciones de plasma y globulina de plasma hidrolizada con pepsina en la ganancia diaria promedio, toma promedio de alimentación diaria, morfología intestinal, parámetros de sangre y actividad enzimática intestinal en cerdos en destete.

Materiales y Métodos Animales y Dietas. Sesenta y cuatro cerdos enchiquerados individualmente promediando 6.85 kg de peso corporal y 21 días de edad fueron asignados a cuatro tratamientos dietéticos en un diseño de bloque completo aleatorizado. Se usaron dos cuartos con 32 chiqueros cada uno. Los cuartos de lactancia conten ían animales previamente de la misma piara de origen y no se limpiaron antes de colocar los animales de prueba para estimular un entorno de reto. A los cerdos se les dio acceso a voluntad a agua y alimentación . Los tratamientos dietéticos se representan en la Tabla I que consiste de: 1 ) control; 2) plasma al 6% secado por rociado; 3) globulina al 3.6% secada por rociado; y 4) globulina al 3.6% digerida con pepsina secada por rociado. Las dietas son con base en alimento de maíz-soya, suero seco que reemplaza a la harina de pescado anchoveta con plasma en base de proteína igual. Se incluyeron fracciones de plasma, relativas al plasma, en una base igual de fracción de plasma. Las dietas conteniendo Usina al 1 .60% se reformularon para un perfil ideal de aminoácidos (Chung y Baker, 1 992). Las dietas se convirtieron en granza 54.4° C o menos y fueron alimentadas a partir del d ía 0-14 posterior al destete. Recopilación de Datos. Pesos individuales de cerdos se recolectaron en los días 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14 posteriores al destete. La toma de alimento y registro de diarrea se recolectaron diariamente desde el d ía 0 hasta el 14 posteriores al destete. Se recolectó sangre los días 0, 7 y 14 posteriores al destete. La sangre se centrifugó y el suero fue congelado para análisis subsiguiente. Al término del estudio (día 14), se sacrificaron seis cerdos/tratamiento seleccionados aleatoriamente para obtener muestras para medición de altura de vellos, profundidad de cripta, actividad enzimática intestinal y pesos de órganos (intestino, hígado, pulmón, corazón, bazo, timo, riñon, estómago y páncreas). Inmediatamente después de la eutanasia, se abrió la cavidad corporal y se ubicó la unión ileal-cecal. Se removió el intestino delgado y se disectó libre de adherencias mesentéricas. Se removió un metro craneal a la unión ileal-cecal, 1 0 cm de intestino (íleo) y se fijó en formalina regulada con fosfato para mediciones de histolog ía subsiguientes. De la sección media del duodeno, se raspó la mucosa, se pesó y se congeló para análisis enzimático subsiguiente. Histología. Las muestras yeyunales se empotraron en parafina y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y seanalizaron utilizando microscopía con luz para medir la profundidad de cripta y altura de vellos. Se midieron cinco sitios para profundidad de cripta y altura de vellos en cada cerdo. Análisis de Enzima. Se midieron las actividades de lactasa y maltasa en los raspados mucosales de acuerdo con Dahlqvist, 1 964.

Análisis de Suero. Se analizaron la proteína y albúmina totales de acuerdo con paquetes de Diagnóstico de ROCHE para un sistema de COBAS M IRA. Se analizó IgG de suero de acuerdo con Etzel y colaboradores. (1 997) . Análisis Estadístico. Se analizaron los datos como un diseño de bloque completo aleatorizado. Los cerdos se alojaron individualmente y el chiquero fue la unidad experimental. Se realizó análisis de variancia utilizando procedimientos GLM de SAS (SAS/STAT Versión 6. 1 1 SAS I nstitute, Cary, NC). La suma de cuadrados del modelo consistió de bloque y tratamiento, utilizando el peso inicial como una covariable. Se reportan las medias cuadradas mínimas para tratamientos.

Resultados En la Tabla 2 se presentan la ganancia diaria promedio (ADG) y la toma de alimento diaria promedio (ADFI). No se notaron diferencias para ADG o ADFI a partir de los días 0-6. A partir de los días 0-14, el plasma y la globulina mejoraron (P< 0.05) ADG y ADFI en comparación con el control, mientras que el tratamiento con globulina digerida con pepsina fue intermedio. Se registraron los pesos de los órganos y se expresaron como g/kg de peso corporal (Tabla 3). No se notaron diferencias en corazón, riñon, hígado, pulmón, intestino delgado, estómago, timo o bazo; sin embargo, el peso del páncreas se incrementó (P< 0.05) debido a la inclusión de globulina y globulina digerida con pepsina en comparación con el control. El tratamiento con plasma fue intermedio. En la Tabla 4, se presentan los parámetros de sangre. En comparación con el control, IgG en suero de cerdos alimentados con globulina (día 14) fue inferior (P< 0.08), mientras que el de los tratamientos con plasma y globulina digerida con pepsina, fueron intermedios. No se notaron diferencias (P> 0.10) en proteína total. La albúmina en suero se incrementó (P< 0.08) en el día 14 con el tratamiento con globulina y plasma en comparación con el control, mientras que el del grupo de globulina digerida con pepsina fue intermedio. En la Tabla 5 se presentan la actividad enzimática, la morfología intestinal y la marca fecal. No se notaron diferencias (P> 0.10) en la altura de vellos y profundidad de cripta. La actividad de lactasa y maltasa duodenal se incrementó (P< 0.07) debido al consumo de globulina digerida con pepsina en comparación con la dieta del control, mientras que los otros tratamientos dietéticos fueron intermedios. La marca fecal se redujo (P< 0.07; representando una deposición más firme) debido a la adición de globulina digerida con pepsina en comparación con el control mientras que la marca fecal de y plasma mientras la globulina fue intermedia.

Tablas Tabla 1. Composición de dietas experimentales (como se alimentaron, %).a Ingredientes Control Plasma Globulina Globulina Digerida con Pepsina aíz 42.932 43. .012 42.962 42.957 SBM 47% 23.000 23. 000 23.000 23.000 Suero Seco 17.000 17. .000 17.000 17.000 Harina de Pescado Anchoveta 8.500 3.400 3.400 Plasma 6 .000 Globulina 3.600 Globulina Digerida con Pepsina 3.600 Aceite de soya 4.300 5. .100 4.800 4.800 Lactosa 2.118 2 .118 2.118 2.118 Dical 18.5% 0.400 1. .700 1.150 1.150 Piedra Caliza 0.070 0.435 0.290 0.290 Oxido de Zinc 0.400 0.400 0.400 0.400 Mecadox 0.250 0.250 0.250 0.250 Sal 0.250 0.250 0.250 0.250 Premix 0.400 0.400 0.400 0.400 L-Lisina HCL 0.250 0.195 0.290 0.290 L-Treonina 0.090 DL-Metionina 0.040 0.140 0.090 0.095 a Las dietas se formularon para contener 1 .60% de lisina, 0.48% de metionina, 14% de lactosa, 0.8% de calcio y 0.7% de fósforo y se alimentaron desde el día 0 al 14 posterior al destete.

Tabla 2. Efecto de plasma secado por rociado y fracciones de plasma en la ganancia diaria y toma de alimento promedios (Kg/d).1 Tratamiento Control Plasma Globulina Globulina SEM Digerida por Pepsina ADG, kg/d D 0-6 0.037 0.094 0.080 0.073 0.029 D 0-14 0.169a 0.242b 0.234b 0.222ab 0.025 ADFI, kg/d D 0^6 0.104 0.134 0.132 0.128 0.018 D 0-14 0.213a 0.276b 0.278b 0.254ab 0.021 Los valores son las medias cuadradas mínimas con 16 cerdos/tratamiento. ab Medias en una hilera sin letras exponenciales comunes son diferentes (P< 0.10) .

Tabla 3. Efecto de fracciones de plasma secado por rociado y plasma sobre los pesos de órganos (g/kg de peso corporal).1 Pesos de Organos Control Plasma Globulina Globulina SEM g/kg BW Digerida con Pepsina intestino 44.21 50 .65 50. 34 44.7 3.43 Hígado 32.34 31 . .20 30. 23 32.2 1 .42 Bazo 1 .74 1 .83 1 .81 2.06 0.16 Timo 1 .45 1 .39 1 .32 1.36 0.20 Corazón 4.93 4 .89 4 .94 4.93 0.22 Pulmón 1 1 .26 1 1 . 28 12. 14 1 1.95 1 .03 Estómago 6.96 7 .06 6 .61 6.84 0.32 Riñon 4.76 5 .75 5 .66 5.45 0.47 Páncreas 1 .93a 2 .20ab 2. .42b 2.34b 0.1 1 Los valores son las medias cuadradas mínimas de cerdos/tratamiento . ab Medias en una hilera sin letras exponenciales comunes son diferentes (P< 0.05) .

Tabla 4. Efecto de fracciones de plasma secado por rociado y plasma en parámetros de sangre. '2 Control Plasma Globulina Globulina SEM Digerida con Pepsina IgG, mg/mL DO 4.84a 5.70 4.83a 5.05a 0.34 D7 4.98 4.71 4.66 4.96 0.17 D 14 4.88b 4.43ab 4.30a 4.54ab 0.24 Proteína Total, g/dL DO 4.55 4.59 4.54 4.65 0.07 D7 4.39 4.37 4.35 4.47 0.08 D 14 4.22 4.30 4.29 4.20 0.07 Albúmina, g/d L DO 3.03 3.02 3. 1 1 3.09 0.06 D7 2.98 3.03 3.02 3.01 0.06 D 14 2.61 a 2.78b 2.80¾ 2.71 ab 0.07 1 Los valores son las medias cuadradas m ínimas de cerdos/tratamiento. 2 El día 0 usado como un covariable para análisis en D7 y D 14. ab Medias en una hilera sin letras exponenciales comunes son diferentes (P< 0.08) .

Tabla 5. Efecto de fracciones de plasma secado por rociado y plasma en actividades enzimáticas, morfología intestinal y marca fecal.1 Control Plasma Globulina Globulina SEM digerida con pepsina Maltasa, 7.97a 11.08a" 10.93ab 13.30° 1.93 umol/mg, Prot/hr Lactasa, 1.14a 1.57ab 1.55ab 2.15b 0.31 umol/mg, Prot/hr Altura Vellos, 378.7 370.7 374.0 387.7 34.4 MIcrón Profundidad 206.3 191.0 195.0 192.7 9.3 Cripta, Micrón Marca Fecal 5.12b 5.06b 4.19ab 2.88a 0.65 1 Los valores son las medias cuadradas mínimas de 6 cerdos/tratamiento. ab Medias dentro de una hilera sin letras exponenciales comunes son diferentes (P< 0.07).

EJEMPLO 3 Cantidad e Impacto de Inclusión Dietética de Fracciones de Plasma Variables En el segundo experimento el objetivo fue cuantificar el impacto de la inclusión dietética de fracciones de plasma diferentes y el efecto de la separación de cadenas pesadas y ligeras de la IgG sobre la ganancia diaria promedio, la toma de alimento diaria promedio, pesos de los órganos y parámetros sanguíneos de cerdos en destete.

M ateriales y Métodos Animales y Dietas. Se asignaron noventa y seis cerdos enchiquerados individualmente promediando 5.89 kg de peso corporal y 21 días de edad a cuatro tratamientos dietéticos en un diseño de bloque completo aleatorizado. Los animales fueron bloqueados con el tiempo entre 3 cuartos de lactancia insalubres. Se les dio a los cerdos acceso a voluntad a agua y alimento . Los tratamientos dietéticos (Tabla 6) consistieron de: 1 ) control; 2) plasma secado por rociado 1 0%; 3) globulina secada por rociada 6%; y 4) material tratado rico en globulina para reducir las uniones de disulfuro de la molécula de IgG (H+L). Las dietas fueron con base en alimento de maíz-soya suero seco reemplazando alimento de soya con plasma en una base igual de Usina. Las fracciones de plasma se agregaron con relación al plasma en una base de fracción de plasma igual. Las dietas conten ían Usina 1 .60% y se formularon para un perfil ideal de aminoácidos (Chung y Baker, 1992). Las dietas fueron en forma de comida y se alimentaron desde el día 0-14 posterior al destete.

Recolección de Datos. Se recolectaron pesos individuales de cerdos en los d ías 0, 2 , 4, 6, 8, 1 0, 12 y 14 posteriores al destete. Se recolectaron toma de alimento y marca de diarrea diariamente desde el día 0 hasta el 14 posteriores al destete. Se reco lectó sangre en los días 0, 7 y 14 posteriores al destete. La sangre se centrifugó y se congelaron muestras de suero para análisis subsiguiente. Al término del estudio (día 14) , se sacrificaron nueve cerdos/tratamiento para obtener los pesos de los órganos (intestino , corazón, h ígado, bazo, timo, pulmón, riñon , estómago y páncreas).

Análisis de Suero. Se analizaron proteína, albúmina y urea nitrógeno totales, de acuerdo con paquetes de Diagnóstico ROCH E para un sistema de COBAS M I RA. Se analizó IgG en suero de acuerdo con Etzel y colaboradores. (1997).

Análisis Estadístico. Se analizaron los datos como un diseño de bloque completo aleatorizado utilizando procedimientos GLM de SAS (SAS/STAT Versión 6.1 1 SAS Institute, Cary, N C). Los cerdos se alojaron individualmente y el chiquero fue la unidad experimental. La suma de cuadrados del modelo consistió de bloque y tratamiento, utilizando el peso inicial como una covariable. Se reportan las medias cuadradas mínimas para tratamientos.

Resultados Desde el día 0 hasta el 6 (Tabla 7), el plasma incrementó el ADF I (P< 0. 1 0) en comparación con control y H+L, mientras que la globulina fue intermedia. Desde el día 7 hasta el 14 el plasma aumentó el ADFI (P< 0.10) en comparación con tratamientos de control y H+L. La toma de alimento diario promedio de cerdos alimentados con globulina se incrementó en comparación con el control. Desde el día 0 hasta el 14, el plasma y la globulina aumentaron (P< 0.10) en comparación con los tratamientos de control y H+L dietéticos. La ganancia diaria promedio se presenta en la Tabla 8. La ganancia diaria promedio fue similar a ADFI para días 0-6. Desde el día 7 al 14 y 0 al 14, el plasma y la globulina incrementaron (P<0.10) el ADG en comparación con el control, mientras que H+L fue intermedio. Los parámetros sanguíneos se presentan en la Tabla 9. La IgG en suero y urea nitrógeno (día 14) fueron inferiores (P< 0.05) por la inclusión dietética de plasma y globulina en comparación con el control. El efecto de H+L fue intermedio . El tratamiento dietético no tuvo efecto en la proteína de suero. La albúmina en suero (día 7) se disminuyó (P< 0.05) debido a la inclusión de plasma en comparación con los otros tratamientos dietéticos. No se notaron diferencias en la marca fecal. La longitud intestinal y pesos de órganos se presentan en la Tabla 10. No se notaron diferencias en pesos de órganos o longitud intestinal debido al tratamiento dietético.

Tablas Tabla 6. Composición de dietas experimentales (como se alimentaron, Ingredientes Control . Plasma Globulina H + L Maíz 37.937 44.96 40.006 40.034 Alimento Soya 47% 18 18 18 18 Suero Seco 14 14 14 14 Lactosa 6.253 6.253 6.253 6.253 Plasma 10 Globulina 6 H + L 6 Concentrado de Proteína de Soya 17.31 9.07 9.07 Aceite de soya 3.219 3.047 3.187 3.186 Dicaí 8.5% 1.79 .493 2.133 2.146 Piedra Caliza 0.562 0.354 0.46 0.42 Premix 0.55 0.55 0.55 0.55 Sal 0.15 0.15 0.15 0.15 DL-Metionlna 0.083 0.152 0.092 0.096 L-L¡sina HCL 0.146 0.041 0.099 0.095 a Las dietas se formularon para contener 1.60% de lisina, 0.48% de metionina, 16% de lactosa, 0.9% de calcio y 0.8% de fósforo y se alimentaron desde el día 0 al 14 posterior al destete.

Tabla 7. Efecto de plasma secado por rociado y fracciones de plasma en la toma promedio diaria de alimento (g/d).1 Los valores son las medias cuadradas mínimas de 24 cerdos/tratamiento. abc Medias en una hilera sin letras exponenciales comunes son diferentes (P<0.10) .

Tabla 8. Efecto de plasma secado por rociado y fracciones plasma en ganancia promedio diaria (g/d).1 1 Los valores son las medias cuadradas mínimas con 16 cerdos/tratamiento. a c Medias en una hilera sin letras exponenciales comunes son diferentes (P< 0.10).

Tabla 9. Efectos de fracciones de plasma secado por rociado en parámetros de sangre.1,2 Control Plasma Globulina H + L SEM igG, mg/mL DO 0.674 0.664 0.584 0.661 0.037 D7 0.668 0.643 0.624 0.673 0.021 D14 0.631b 0.555a 0.545a 0.596a" 0.022 Urea N. mg/dL DO 8.53 9.78 9.94 9.87 0.68 D7 17.55b 14.65a 16.48ab 17.56b 1.01 D14 17.57° 10.48a 14.73 15.56b0 0.87 Proteína Total, g/dL DO 4.58 4.46 4.56 4.56 0.076 D7 4.69 4.60 4.53 4.74 0.106 D14 4.55 4.49 4.59 4.49 0.080 Albúmina, g/dL DO 2.69 2.64 2.75 2.69 0.069 D7 2.92b 2.79a 2.92b 2.94b 0.045 D14 2.83 2.76 2.86 2.80 0.060 Los valores son las medias cuadradas mínimas de 24 cerdos/tratamiento. 2 El día 0 usado como una covariable para análisis en D7 y D14. ab Medias en una hilera sin letras exponenciales comunes son diferentes (P< 0.05).

Tabla 10. Efecto de fracciones de plasma secado por rociado y plasma sobre la longitud intestinal (centímetros) y los pesos de órganos (g/kg de peso corporal).1 Control Plasma Globulina H + L SEM Long. Int. (cm) 911.02 935.55 912.70 910.74 33.14 Peso de órgano, (g/kg BW) Intestino 41.48 41.79 42.82 41.04 2.16 Hígado 26.61 32.61 32.29 31.09 1.10 Bazo 2.05 2.32 2.44 2.17 0.22 Timo 1.15 1.45 1.15 1.15 0.14 Corazón 6.12 6.14 5.77 5.80 0.22 Pulmón 12.24 12.33 13.65 11.63 0.74 Estómago 9.26 9.14 0.08 10.08 0.58 Riñon 6.18 6.57 6.10 6.30 0.21 Páncreas 2.70 2.61 2.54 2.70 0.11 1 Los valores son las medias cuadradas mínimas de S cerdos/tratamiento.

Discusión Consistente con la investigación publicada (Coffey y Cromwell, 1995) estos datos indican que cuando se incluye en la dieta plasma y globulina aumenta el rendimiento (ADG, ADFI) en comparación con el control. La globulina digerida con pepsina y la fracción de H+L resultaron en una mejoría intermedia en rendimiento. La actividad enzimática (lactasa y maltasa) se incrementaron y la marca fecal fue mejorada con la adición de todas las fracciones del plasma (plasma, globulina, globulina digerida con pepsina, H&L) en comparación con el control. La concentración de IgG en suero y BUN fueron menores después del consumo de tratamientos de plasma o globulina en comparación con el control, globulina digerida con pepsina p H&L. La habilidad de la administración oral de plasma o globulina para provocar una respuesta sistémica fue inesperada como se demostró por la IgG en suero inferior comparada con el control. Las diferencias anotadas entre las fracciones de plasma y globulina en comparación con la globulina digerida con pepsina o H+L es que la estructura terciaria de la región de Fe está intacta solamente en las fracciones de plasma y globulina. La globulina digerida con pepsina tiene la región de Fe digerida, mientras que en la fracción de H+L, la región de Fe permanece intacta, pero sin confirmación terciaria. La región de Fab está aún intacta en la globulina digerida con pepsina. La región variable es capaz aún de unir antígeno en la preparación de H+L (APC, información sin publicar). Así, los resultados indican que la interacción de anticuerpo-antígeno (región de Fab) es importante para efectos locales (marca fecal reducida, actividad de lactasa y maltasa incrementada), mientras que la región intacta de Fab y Fe de las fracciones de plasma y globulina es importante para modular la respuesta de IgG en suero sistémica.

EJ EMPLO 4 Efecto de Dosis Orales de Proteína de Plasma en Respuestas Inmunes Activas para Vacunaciones Primaria y Secundaria para Rotavirus y de PRRS en Lechones.

Perspectiva General Para examinar la influencia de proteína de plasma complementaria en respuestas inmunes activas que siguen a vacunaciones primaria y secundaria para rotavirus y PRRS.

Métodos Se utilizaron diez puercas inducidas para cría de cerdos en un momento común. Se asignaron tratamientos aleatoriamente en cada alumbramiento. La entrega de tratamiento ocurrió dos veces por semana (intervalos de 3 ó 4 días) vía un aplicador con tubo estomacal. Ocurrió una serie de siete aplicaciones antes de la vacunación final y destete. Los tratamientos consistieron de: control (10 mL de salina) e IgG en plasma (0.5 g entregados en un volumen final de 8 mL). Todos los cerdos recibieron una vacunación primaria (oralmente=rotavirus; ¡nyección=PRRS) diez días antes del destete. Se dio una vacunación secundaria en el momento del destete vía inyección intramuscular. Se recolectaron muestras de sangre antes de la vacunación primaria (10 días antes del destete), antes de la vacunación secundaria (en el destete), y en intervalos de tres días hasta doce días posteriores al destete.

Resultados Los cerdos dosificados con proteína de plasma experimentaron disminuciones significativas (P<0.05) en titulaciones de anticuerpos específicos siguientes a la vacunación de refuerzo. Esta respuesta se vio para ambas titulaciones de anticuerpos, para rotavirus (Figura 1 ) y para PRRS (Figura 2).

Discusión Estos datos proporcionan una excelente indicación del efecto de proteína de plasma oral en el lechón. La activación inmune actúa como una gran energía y reserva de nutrientes. Cuando el sistema inmune es activado, la energ ía y nutrientes son canalizados a la producción de productos inmunes (inmunoglobulina, citocinas, proteínas de fase aguda, etc.) y retirados para el crecimiento. El plasma oral puede modular el sistema inmune, permitiendo por esto que la energía y nutrientes sean redirigidos a otras funciones productivas tales como el crecimiento.

EJEMPLO 5 Evaluación de Entrega de Plasma vía el Agua en Pavos bajo Reto de Enfermedad. Perspectiva General Para evaluar sangre o fracciones de la misma tales como suero, plasma o porciones purificadas de los mismos conteniendo de preferencia inmunoglobuliría, cuando se administran a animales, en particular aves, y específicamente a pavos vía su agua, efectúa pérdida por muerte en una manera positiva cuando los pavos son retados por enfermedad. La invención demuestra mejoría en comportamiento de pavos específicamente durante el período de iniciación si han consumido proteínas de plasma en el agua. Globalmente, la entrega de proteínas de plasma vía el agua aumenta la eficiencia del alimento y por ciento restante (supervivencia), después de desafío respiratorio auxiliares en pavos de iniciación.

Materiales y Métodos Ochenta pollos de pavos Nicholas machos de un día de edad se asignaron aleatoriamente para tratamientos con agua. El peso corporal inicial fue de 59 g. Se aplicaron tratamientos en un diseño factorial que consiste de 1 ) reto por enfermedad o sin reto por enfermedad y 2) agua tratada con plasma o agua regular. Los pollos de pavo fueron alojados de 6 ó 7 pavos por corral utilizando un total de 12 corrales en piso. Los pavos de reto se separaron de los pavos sin reto para paliar la contaminación cruzada. Se midieron diariamente el peso corporal, la toma de alimento y las tomas de agua. Se les dio a los pavos dietas comercialmente disponibles. Se íes dio diariamente tratamientos con agua fresca. Las concentraciones de plasma en el agua tratada fueron alteradas regularmente consistiendo de 1 .3%, 0.65%, 0.325% y 1.3% para los días 0-7, 7-14, 14-21 y 21 -49, respectivamente. Los pavos se retaron en el día 35 con pastura para inducir un reto respiratorio. Se registraron diariamente signos clínicos y pérdida por muerte en los días 0-49. En el día 49, se terminó el estudio y todos los pavos fueron sujetos a necropsia. Se analizaron los datos como un diseño factorial utilizando los procedimientos GL de SAS (SAS/STAT versión 8, SAS lnstitute, Cary, N C). El modelo de suma de cuadrados consistió de reto y tratamiento con agua. Se reportaron las medias de cuadrados menores. Se analizó la pérdida por muerte después del reto utilizando análisis de SAS de supervivencia.

Resultados Los datos de comportamiento antes del reto se presentan en la Tabla 1 1. Puesto que los pavos no fueron retados antes del día 35, solamente se reportan los efectos principales. La inclusión de plasma vía el agua incrementó (P<0.001 ) la ganancia diaria promedio (ADG) en los días 0-7, mientras que no se notaron mejorías adicionales en ganancia hasta el día 35. No se notaron diferencias (P>0.05) en la toma de alimento diaria promedio (ADFI) en los d ías 0-35. La desaparición de agua aumentó (P<0.05) en los d ía 0-7 , 0-14 y 0-21 a partir del consumo de plasma vía el agua en comparación con los controles alimentados con agua sin tratar. La eficiencia alimenticia (G/F) se incrementó (P<0.05) en los d ías 0-7 , 7-14, 0-14 y 0-28 debido al consumo de agua tratada con plasma en comparación con agua no tratada. No se notaron diferencias (P>0.05) en G/F y desaparición de agua durante el resto del estudio hasta el día 35. La información de comportamiento después del reto se presenta en la Tabla 12. No se notaron diferencias (P>0.05) en ADG, ADF I y desaparición de agua desde el consumo de agua tratada con plasma en comparación con ag ua tratada para grupos de reto o sin reto. La eficiencia alimenticia se mejoró (P<0.05) en pavos de reto desde los d ías 35-42 y días 35-49 debido al consumo de agua tratada con plasma en comparación con agua sin tratar; mientras que, no se notaron diferencias (P>0.05) en pavos sin reto debido al consu mo de agua tratada con plasma. El peso corporal de grupos tratados y no tratados con plasma después del reto se muestra en las Figuras 3A y 3B . Siete pavos que consumen agua no tratada después del reto fueron eliminados o muertos a partir del reto como se representa en la Fig ura 3A. Un pavo que consume agua tratada después del reto pierde peso y muere debido al reto como se muestra en la Fig ura 3B. La Figura 4 demuestra el por ciento remanente después del reto, mientras que la Figura 5 demuestra el por ciento remanente antes del reto. No se notaron diferencias (P>0.05) en por ciento remanente después del período del reto en pavos no retados, mientras que pavos retados que consumen agua tratada con plasma habían incrementado (P<0.05) por ciento remanente en comparación con pavos de reto que consumen agua sin tratar (Figura 4). No se notaron diferencias (P>0.05) en por ciento remanente antes del reto (días 0-35) debido al consumo de agua tratada (Figura 5).

Discusión El estudio actual demuestra mejorías en comportamiento de los pavos durante el período de inicio debido al consumo de proteínas de plasma en el agua. Además, después de un reto respiratorio, el consumo de proteínas de plasma vía el agua mejoró la supervivencia y disminuyó las supresiones. De manera global, la entrega de proteínas de plasma vía el agua aumenta la eficiencia de alimentación y el por ciento remanente (supervivencia) después del reto respiratorio y auxiliares en pavos de inicio.

Tablas Tabla 11. Efecto principal de tratamiento con agua en el comportamiento en pavos. ADG Agua Plasma SEM P D 0-7 14.38 16.62 0.42 0.0003 D 7-14 31.64 32.06 0.69 0.6587 D 14-21 50.01 51.18 1.3 0.5152 D 21-28 77.53 78.56 2.18 0.7372 D 28-35 98.85 101.85 3.39 0.5281 D 0-14 23.13 24.34 0.48 0.0728 D 0-21 32.09 33.29 0.7 0.2212 D 0-28 43.51 44.52 1.04 0.4854 D 0-35 54.57 55.99 1.42 0.4772 ADFI Agua Plasma SEM P D 0-7 19.13 18.93 0.47 0.7757 D 7-14 39.32 37.62 1.18 0.3361 D 14-21 59.69 61.54 1.38 0.3736 D 21-28 99.82 97.44 2.14 0.455 D 28-35 162.65 161.66 4.77 0.8871 D 0-14 29.22 28.27 0.75 0.4002 D 0-21 39.38 39.36 0.9 0.9889 D 0-28 54.49 53.88 1.1 0.7081 D 0-35 76.12 75.44 1.78 0.7922 Desaparición de Agua Agua Plasma SEM P D 0-7 68.58 79.8 3.21 0.0387 D 7-14 122.25 131.68 3.29 0.077 D 14-21 171.3 186.18 4.94 0.066 D 21-28 236.65 251.42 8.97 0.2779 D 28-35 313.1 339.22 .59 0.1497 D 0-14 95.41 105.74 3 0.0407 D 0-21 120.71 132.56 3.26 0.0332 D 0-28 149.7 162.27 4.42 0.0791 D 0-35 182.38 197.66 5.43 0.0819 Ganancia/ Alimentación Agua Plasma SEM D 0-7 0.74 0.88 0.03 0.0111 D 7-14 0.79 0.85 0.01 0.0019 D 14-21 0.84 0.83 0.02 0.9194 D 21-28 0.76 0.8 0.01 0.0897 D 28-35 0.6 0.63 0.02 0.2613 D 0-14 0.77 0.86 0.02 0.0032 D 0-21 0.8 . 0.85 0.02 0.0544 D 0-28 0.78 0.82 0.01 0.0272 D 0-35 0.71 0.74 0.01 0.061 8 Efecto de tratamiento de agua y reto en comportamiento Sin Reto Reto Agua Plasma SE M P Agua Plasma SEM P D 35-42 117.92 114.77 5.89 0.6991 124.06 135.1 1 6.09 0.1913 D 42-49 123.04 124.58 5.36 0.8342 131.46 138.14 6.19 0.4177 D 35-49 120.45 119.69 5.28 0.9167 129.16 136.65 6.1 0.3574 ADF I Sin Reto Reto Agua Plasma SEM P Agua Plasma SEM P D 35-42 194.51 181.67 7.54 0.2628 199.56 208.75 7.54 0.4134 D 42-49 242.85 225.3 14.99 0.4318 239.62 249.28 14.99 0.661 D 35-49 218.69 203.48 9.72 0.30 1 219.59 229.02 9.72 0.5124 Desaparición de Agua Sin Reto Reto Agua Plasma SEM P Agua Plasma SEM D 35-42 472.24 400.46 29.62 0.1096 459.28 500.85 29.62 D 42-49 507.57 516.09 29.22 0.8418 475.92 524.5 29.21 0.2735 D 35-49 489.91 450.74 31.48 0.3724 469.52 512.68 31.48 0.3291 Ganancia/Alimentación Sin Reto Reto Agua Plasma SEM P Agua Plasma SEM P D 35-42 0.06 0.58 0.02 0.5063 0.54 0.65 0.02 0.0149 D 42-49 0.5 0.56 0.05 0.3527 0.48 0.54 0.05 0.3255 D 35-49 0.54 0.57 0.02 0.4125 0.51 0.59 0.02 0.0319 EJEMPLO 5 Los Efectos de Plasma Administrada Oralmente Sobre las Funciones Inmunológicas La respuesta inmunológica a la administración de proteína en plasma no ha sido estudiada. Sin embargo, se ha encontrado que algunos de los componentes individuales del calostro o leche tienen efectos ¡nmuno-modulatorios. La IgA y slgA tienen funciones antiinflamatorias en neonatos. La Eíbl encontró que la administración oral de ¡nmunoglobulina humana reduce la producción de TNF-a circulante mediante macrófagos aislados y reduce también las concentraciones de ¡nmunoglobulina en infantes afectados por enterocolitis necrosante. Schriffrin encontró que el calostro fue efectivo en la modulación de colitis experimental. En un estudio no controlado, Schriffrin y sus colegas encontraron que la complementacion dietética de una fracción dé caseína rica en TGF- ß2 fue útil en la modulación de la inflamación en la enfermedad de Crohn en sujetos humanos1. El modo de acción no ha sido elucidado, pero se encontró que TGF- 2 inhibe la expresión del receptor MHC de clase I I inducido por ?-interferón en neonatos. La expresión del receptor MHC de clase I I se sabe también que es regulado en animales recién destetados. Otros péptidos encontrados en la leche, calostro y plasma podrían tener también efectos anti-inflamatorios. También, se ha mostrado que la administración parenteral de TGF-ß? mejora la supervivencia de ratones retados con salmonela. Además, la administración oral de inmunoglobulina a partir de proteínas en plasma ha mostrado que mejora la ganancia de peso y toma de alimento en animales jóvenes. La TNF-a es una citocina central en procesos inflamatorios y tienen efectos negativos en el apetito y la utilización de proteína1 , 1. Y, es bien sabido que la producción de TNF-a es estimulada con la exposición de fagocitos a endotoxina. Las proteínas de plasma contienen inmunoglobulina, proteínas aglutinantes de endotoxina, lecitinas aglutinantes de mannan, y TGF-ß. La mezcla de proteínas, citocinas y otros factores podrían jugar un papel en la reducción de la exposición del sistema inmune a bacterias derivadas y endotoxina del lumen y por lo tanto, después de la activación del sistema inmune. El objetivo de este experimento fue estudiar los efectos inmunomoduladores de la administración de proteína de plasma en animales más allá del período posterior al destete mediante la medición de: (a) estallido respiratorio en monocitos sangu íneos periféricos, (b) estallido respiratorio en macrófagos peritoneales, (c) fagocitosis en macrófagos peritoneales, y (d) producción de NF-a de macrófagos perifonéales en la presencia y ausencia de lipopolisacárido. 2.0 Procedimientos para el Experimento I y I I 2.1 Animales Experimento I 60 ratones hembra Balb/c White fueron recibidos desde Criarles iver Laboratories. Al recibirse, los animales fueron alojados en 4 por jaula, Al inicio de la dosificación el rango de peso corporal fue de 15-19 g. Se asignaron tres jaulas para una dieta de prueba, para un total de 12 animales por dieta. La dosificación tuvo que ser escalonada en tres días sucesivos para acomodar el procesamiento requerido a necropsia. De manera que en el día 1 después del arribo se inició la dosificación en los animales en la jaula 1 de cada grupo de tratamiento/control, en el día 2 se inició la dosificación en todas las segundas jaulas y en el día 3 se dosificaron las terceras jaulas de todos los grupos. La necropsia fue escalonada de manera similar de manera que los animales fueran dosificados durante un total de 7 días. Todas las jaulas se etiquetaron con los números de animales y dieta designada. El cuarto de animales se mantuvo entre 18.9 y 27.8° C. La eliminación se mantuvo en un ciclo de 12 horas encendida - 12 horas apagada.

Experimento II Ratones hembra (73) Balb/c White fueron recibidos de Charles River Laboratories, el 18 de junio de 2001 y se utilizaron 72 animales en el estudio. Estos animales nacieron el 7 de mayo de 2001 . Al recibirse, los animales fueron alojados 3 por jaula. Al inicio de la dosificación el rango de peso corporal fue de 15 - 19 g. Se asignaron 3 jaulas a una dieta de prueba, para un total de 9 animales por dieta. La dosificación tuvo que ser escalonada entre 3 días sucesivos para acomodar el procesamiento requerido por la necropsia. De manera que al día 1 después del arribo se inició la dosificación en los animales en la jaula 1 de cada grupo de tratamiento/control, en el día 2 se inició la dosificación en todas las segundas jaulas y en el día 3 se dosificaron las terceras jaulas de todos los grupos. La necropsia se escalonó de manera similar de manera que los animales fueran dosificados durante un total de 7 días. Todos los ratones se dosificaron mediante alimentación forzada oral con 100 de LPS 2 días después del inicio del tratamiento con una dieta individual y 5 días antes del final del estudio. Todas las jaulas se etiquetaron con los números de animales y dietas designadas. El cuarto de los animales se mantuvo entre 18.9 y 27.8° C. La iluminación fue en un ciclo de 12 horas encendida - 12 horas apagadas. 2.2 Procesamiento de Lavado Peritoneal, Sangrado y Muestras de Sangre Se cosecharon células de cada animal mediante lavado peritoneal. Después de la terminación se sacaron los músculos abdominales de los órganos abdominales y 9 mi de PBS estéril se inyectaron a la cavidad peritoneal. El abdomen se masajeó y se recuperaron 6 - 8 mi de fluido de lavado. Los cuatro ratones alojados juntos se reunieron para formar una muestra. Las muestras se mantuvieron en hielo antes de procesar. Las células se centrifugaron y la granza se re-suspendió en 1 mi de Medio Modificado de Aguila de Dulbeccco (DMEM) con suero de bovino fetal y penicilina/estreptomicina. Se determinaron los números de células utilizando un Contador Coulter Z1 . Después de recolectar las células del lavado, se abrió la cavidad abdominal y se recolectó sangre de la arteria renal y se transfirió a un tubo de vacutainer de 3 mi conteniendo EDTA. Una vez más 4 ratones fueron reunidos para formar una muestra. Las muestras de sangre se diluyeron en PBS para un volumen total de 8 mi. Esta mezcla se colocó en capa arriba de 3 mi de Histopaque®-1077. Las muestras se centrifugaron y la interfase opaca que contiene células mononucleares se removió con una pipeta de pasteur. Después de un total de 3 lavados en PBS la granza se re-suspendió en 0.5 mi de PBS. Se determinaron los números de células usando un Contador Coulter Z1 . 2.3 Estallido Respiratorio Después que se determinaron los conteos celulares, ambas muestras, la de monocitos y peritoneal se ajustaron a una concentración de 1 x 106 células por mi. Todas las muestras se ensayaron por triplicado. Un ciento (100) de ul de cada suspensión de células (1 x 105 células/pozo) se agregó a una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Se agregó diacetato de 2,7-dicolorofluoresceína (Sondas Moleculares) a cada pozo y la placa se incubó a 37° C para permitir la toma del sustrato por las células. Enseguida de la incubación se agregó acetato de midistato Phorbol (PMA) (Sigma) a los pozos por triplicado a una concentración de 10 ng/pozo con el fin de estimular la producción de oxígeno radical. La placa se incubó después a 37° C, Después de una hora de incubación se agregaron 200 ul de cada 2, 7-diclorofluoresceína estándar (Polysciences) a la placa. El incremento en producto fluorescente se midió entonces usando el lector de microplaca de fluorescencia Cytofluor 4000 (PerSeptive Biosystems) (longitudes de onda: excitación - '485, emisión - 530). La información se exportó del programa de Cytofluor a Excel. La distribución de placa de Excel se copió después se pasó a un expediente Softmax Pro (Dispositivos Moleculares), donde se determinaron los resultados automáticamente mediante interpolación de la curva estándar. 2.4 Fagocitosis Se agregó un ciento (100) ul de cada suspensión celular a 5 pozos en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos, a una concentración de 1 x 1 06 celdas por mi (1 x1 05 células/pozo). Se agregaron 50 ul de medio (DM EM) a cada pozo, haciendo el volumen final de 1 50 ul. Se usaron cinco pozos conteniendo solamente D M EM como testigos de placa. Cada muestra o testigo se corrió en un juego de cinco (5) replicados. Las células se incubaron a 37° C y se examinaron después bajo un microscopio. Durante el período de incubación , se preparó la suspensión de biopartículas de E. coli K-12 H BSS (Sondas Moleculares). La mezcla se agitó hasta formar un vórtice y se trató con sonido. Después del período de una hora de incubación , las placas se centrifugaron y se aspiró el sobrenadante mediante aspiración con vacío. Se agregaron 1 00 ul de la mezcla de E. co/ /HBSS a cada pozo y se incubaron durante dos horas a 37° C. Enseguida de la incubación, se aspiraron las biopartículas de E. coli mediante aspiración con vacío y se agregaron 1 00 ul de solución de sal azul de tripano/citrato-balanceado (Sondas Moleculares) a cada pozo. Después de aproximadamente 1 minuto, se eliminó el azul de tripano mediante aspiración con vacío y el producto fluorescente se midió usando un lector de microplaca de fluorescencia Cytofluor 4000 (Longitudes de onda: excitación - 485, emisión - 530). 2.5 Ensayo de Citocina Se agregó un ciento (1 00) uL de la suspensión de células de 1 x 1 0B células/m L a 1 0 pozos de replicado de una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. Cinco de los pozos contenían L PS (1 ug por pozo), los otros cinco pozos no tenían ningún LPS. La placa se incubó a 37° C durante 24 horas. Después de la incubación, se reunieron los sobrenadantes de los pozos de replicado y se almacenaron a -20° C hasta su ensayo. Se evaluó la producción de TN F-a e I L-1 0 en el sobrenadante usando paquetes de ELI SA para ratón de R&D Systems. 3.0 MATERIAL Los materiales fueron como sigue: Dieta A - Control (Leche Descremada) Dieta B - Suero Porcino (PP) Dieta C - Proteína de Plasma de Bovino (BP) Dieta D - Fase Ligera de Plasma Tratada con Nalco (B L) Dieta E - Fase Pesada de Plasma Tratada con Nalco (BH) Los tratamientos dietéticos para el Experimento I I fueron como sigue: 1 . Control (Leche Descremada) 2. Concentrado de Ig, 2.5% 3. Concentrado de Ig, 0.5% 4. S uero de Bovino, 5% 5. Suero de Bovino, 1 % 6. Fase pesada, 0.5% 7. H P Activado , 0.5% 8. HP, Sin ceniza, activado, 0.1 % 3. 1 Almacenaje y Manejo de Material de Estudio Las dietas de prueba se almacenaron a 4o C en sus bolsas originales de ziploc. Se usaron lentes, guantes de seguridad y una bata de laboratorio durante el manejo. 3.2 Aplicación del Material de Estudio Se llenaron platos de alimentación dos veces al d ía y se dejaron comer a los animales a voluntad durante siete días.

Resultados y Discusión De acuerdo con la invención encontramos que el plasma de origen de especies ya sea bovina o porcina resultó en menos producción de TNF-a mediante ambos macrófagos peritoneales estimulados y sin estimular. Además, la administración de tanto la fase pesada como la ligera de plasma tratado con dióxido de silicio al 5% resultó en una producción reducida de TNF-a aunque en diferentes concentraciones. Las fracciones no fueron evaluadas a concentraciones iguales, sin embargo. El cambio en TN F-a que acompañó la estimulación de macrófagos fue mayor cuando los animales fueron alimentados con una fracción de plasma, independientemente de la fuente o concentración. Esta observación indica que la receptividad inmunológica del macrófago se aumenta con la adición de plasma y/o sus componentes para la dieta de ratones jóvenes. En el segundo experimento, confirmamos el efecto supresor de las fracciones de plasma en producción de TN F-a estimulando macrofagos peritoneales. . Sin embargo el nivel de complementación y la fracción alteraron el efecto. El precipitado de Nalco redujo la producción de TN F-a en células no estimuladas en ambos, 0.5 y 0. 1 %. La fracción rica en inmu noglobulina suprimió la producción de TNF-a a 0.5 %, pero no a 2.5% . La adición de suero suprimió la producción de TN F-a a 5%, pero no a 1 .0%. Las condiciones experimentales en el Experimento I I difirieron del Experimento previo. Los ratones en este estudio fueron retados todos con endotoxina en el d ía 1 en un intento de preparar el sistema inmune en todos los animales. Reportes previos han encontrado que preparando macrofagos se reducirá la receptividad ¡nmunológica por el reto subsiguiente. Los resultados del primer experimento parecería que confirman esta observación . Los macrofagos aislados de animales alimentados con la dieta de control produjeron niveles superiores de TN F-a en el estado no estimulado y por lo tanto produjeron menos TNF-a cuando se estimularon con LPS que los animales alimentados con dietas complementadas con plasma y/o fracciones. Los niveles de TNF-a fueron marcadamente diferentes en los anímales de control de los dos experimentos . La producción de TNF-a fu e 1 5 veces más grande en el primer experimento que en el segundo experimento. No obstante, aunque la activación del sistema inmune fue más baja en ambos experimentos, la receptividad inmunológica fue mayor en ratones alimentados con una dieta complementada con una fracción de plasma. Ambas concentraciones de TNF-a e 1L-10 aumentaron marcadamente con la exposición de macrófagos a LPS. El plasma es rico en proteínas, péptidos, citocinas y otras sustancias inmunomodulatorias biológicamente activas. Las fracciones de plasma administradas en estos experimentos difirieron en composición y régimen de inclusión dietética. El efecto de estas fracciones en la producción de TNF- fue consistente en los dos experimentos. Los animales alimentados con plasma y/o fracciones de la misma produjeron menos TN F-a en un estado no estimulado y, por lo tanto, respondieron con producción incrementada de TNF- a la estimulación con endotoxina. Los resultados de estos dos experimentos son consistentes con el concepto de que ambas, las fracciones ricas en inmunoglobulina y las fracciones de dióxido de silicio reducen la estimulación del sistema inmune. La administración oral de proteínas de plasma o sus fracciones es un medio novedoso de reducir la producción y niveles de TNF-a.

Tabla 13. Los efectos de la administración de proteína de plasma bovino y porcino en mediciones de respuesta inmune en ratones.

Tratamiento TNF- , pg/ml Estallido Respiratorio -LPS + LPS TNF- -LPS + LPS cambio Control 1540a 1867a 322a 17.4a 23.9a Plasma Porcino 70b 1156b 1085b 12.2b 13.6b Plasma Bovino 28b 1135b 1107b 10. b 11.1b Plasma Bovino 36b 1260b 1101 b 10.6b 13.7b (Fase Pesada) Plasma Bovino 34b 1135b 1124b 9.3b 11.2b (Fase Ligera) Tabla 14: Resultados de Fagocitosis Media para Macrófag Peritoneales (Figura 5) Dieta Animal Resultado Se No. Medio Control 1-12 298 47.6 P 3-24 264 46.2 BP 25-36 3 1 52.1 BL 37-48 360 66.5 BH 49-60 375 63.9 Tabla 15. Producción de TNF- en macrófagos peritoneales cultivados a partir de ratones alimentados con componentes de proteína de plasma. Tratamiento Producción de TNF-a, pg/ml -LPS + LPS Cambio Control 128a 296a 169a Conc. de Ig, 2.5% 1 Q7ab 308a 201ab Conc. de Ig, 0.5% 20b 325a 306b Suero Bovino, 5% 5b 371a 366b Suero Bovino, 1% 30a 306a 176a Fase Pesada, 0.5% 48ab 271a 223ab HP Activado, 0.5% 30ab 303a 272a HP sin Ceniza, 11b 352a 341b Activado, 0.1% Tabla 16. Producción de IL-10 en macrófagos peritoneales cultivados de ratones alimentados con componentes de proteína de plasma. Tratamiento Producción de IL-10, pg/ml -LPS +LPS Cambio Control 80a 237a 156a Conc. de Ig, 2.5% 92a 366a 274a Conc. de Ig, 0.5% 45a 374a 329a Suero Bovino, 5 22a 389a 347b Suero Bovino, 1 % 1 16a 354a 238a Fase Pesada, 0.5% 64a 348a 284a HP Activado, 0.5% 54ab 394a 339 HP sin Ceniza, 32b 412a 381 b Activado, 0.1 % Lista de Referencias Wolf H , EIBL M M. El efecto anti-inflamatorio de una preparación oral de inmunoglobulina (IgA-lgG) y su posible relevancia para la prevención de enterocolitis necrosante. Acta Paediartr Suppl 1994;396:37-40 Wolf HM, Hauber I, Gulle H. Samstag A, Fischer MB, Ahmad RU , Eibl MM. Propiedades anti-inflamatorias de IgA de suero humano: inducción de antagonista receptor de IL-1 y desregulación mediada con Fe aR (CD89) de factor-alfa (TNF- a) de necrosis de tumor e IL-6 en monocitos humanos. Clin. Exp. Immunol. 1996; 1 05:537-43. Eibl M M , Wolf HM. Furnkranz H, Rosenkranz A. Prevención de Enterocolitis Necrosante en infantes de bajo peso al nacer mediante alimentación con IgA-lgG. The New England Journal of Medicine 1988;319(1 ):1 -7. Caldarini dBM, Schiffrin EJ, Ogawa dF, Caccamo DV, Ledesma dPM, Celener D, Bustos-Fernandez L. Prevención de colitis ulcerante inducida por carragenano en cobayos por suero de calostro de bovino. Medicina (B.Aires) 1987;47(3):273-7. Beattie RM, Schiffrin EJ, Donet-Hughes A, Huggett AC, Domizio P, McDonald TT, Walker-Smith JA. Nutrición polimérica como la terapia principal en niños con enfermedad de Crohn de intestino delgado. Aliment. Pharmacol.Ther. Dic.1994;8(6):609- 15. Donet-Hughes A. Schiffrin EJ, Huggett AC. Expresión de antígenos de MHC por células epiteliales intestinales. Efecto de transformar el factor -beta 2 de crecimiento (TGF-beta 2). Clin. Exp. Immunol. Feb. 1995;99(2):240-4. Zijlstra RT, McCracken BA, Odie J , Donovan SM, Gelberg H B, Petschow BW.Zuckermann FA, Gaskins HR. Malnutrición modifica respuestas inflamatorias del intestino delgado en cerdos al rotavirus. J. Nutr. Abr; 1999; 129(4):838-43. Donet-Hughes A, Duc N, Serrant P, Vidal K, Schiffrin EJ . Moléculas bioactivas en leche y su papel en la salud y la enfermedad: el papel de transformar factor-beta de crecimiento. Immunol. Cell Biol.. Feb. 2000. ; 78(1 )74-9. 78(1 );74-9. Galdiero M, Marcatili A, Cipollaro di, Nuzo I , Bentivoglio C, Romano CC. Efecto de transformar factor beta de crecimiento en infección del tifimurium por salmonela en ratones. Infecí. Immn. Mzo. 1999; 67(3): 1432-8. Owen KQ, Nelssen JL, Goodband RD, Tokach MD, Friesen KG, Richert BT, Smith JW, Russell LE, Efecto de varias fracciones de plasma porcino secado por rociado en el comportamiento de cerdos recién destetados [Resumen]. In: J-Anim Sci. (Suppl) 2000. Pierce J L, Cromwell GL, Lindemann MD, Monegue HJ, Weaver EM, Russell LE. Globulina de bovino secado por rociado para cerdos recién destetados [Resumen]. In: J .Anim.Sci (Suppl.) 1996. Yeh SS, Schuster MW. Caquexia geriátrica: el papel de citocinas. Am. J. Clin. Nutr. 1999 Ago;70(2): 183-97. Rozenfeld RA, Huang W, Hsueh W. Efectos de antibióticos y entornos libres de gérmenes sobre daño inducido por endotoxina (LPS) y sobre actividad de Iifosfolipasa A2 (PLA2- I I) de grupo intestinal [Resumen]. In: FASEB Journal 1999;643.5.

Claims (44)

R E IVINDICAC IONES

1. Un método para modular la respuesta inmune de un animal durante protocolos de vacuna que comprende: administrar a dicho animal en forma oral una cantidad inmunomoduladora de una preparación que comprende plasma de una fuente animal.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha fuente animal es sangre y sus fracciones.

3. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha fuente animal es huevo y sus fracciones.

4. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha fuente animal es leche y sus fracciones.

5. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha inmunoglobulina animal es recombinante.

6. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha inmunoglobulina recombinante se expresa en una planta.

7. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha inmunoglobulina recombinante se expresa en una bacteria.

8. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha administración es anterior a la vacunación.

9. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha administración es simultanea con la vacunación.

10. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha administración es inmediatamente después de la vacunación.

11. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha administración se entrega vía el suministro de agua de dicho animal.

12. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha vacunación es vacuna para Rotavirus

13. El método de la reivindicación 1 , en donde dicha vacunación es vacuna para PRRS.

14. Un complemento dietético para uso en la modulación del sistema inmune y mejorar la ganancia de peso y eficiencia alimenticia de animales que comprende: Administrar a dicho animal una preparación de inmunoglobulina, en donde dicha administración ocurre para el animal a los diez días posteriores al destete o más viejos.

15. El complemento de la reivindicación 14, en donde dicha fuente animal es sangre y sus fracciones.

16. El complemento de la reivindicación 14, en donde dicha fuente animal es huevo y sus fracciones.

17. El complemento de la reivindicación 14, en donde dicha fuente animal es leche y sus fracciones.

18. El complemento de la reivindicación 14, en donde dicha inmunoglobulina animal es recombinante.

19. El complemento de la reivindicación 14, en donde dicha inmunoglobulina recombinante se expresa en una planta.

20. El complemento de la reivindicación 14, en donde dicha inmunoglobulina recombinante se expresa en una bacteria.

21 . Un complemento dietético para uso en la modulación del sistema inmune y mejoramiento de la eficiencia alimenticia y supervivencia de animales que comprende: administrar a dicho animal una preparación de ¡nmunoglobulina, en donde dicha administración ocurre para el animal cuando está en estados de reto de enfermedad y en animales de inicio.

22. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicha fuente animal es sangre y sus fracciones.

23. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicha fuente animal es huevo y sus fracciones.

24. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicha fuente animal es leche y sus fracciones .

25. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicha ¡nmunoglobulina es recombinante.

26. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicha ¡nmunoglobulina recombinante se expresa en una planta.

27. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicha ¡nmunoglobulina recombinante se expresa en una bacteria.

28. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicha administración es vía el agua de suministro de dicho animal.

29. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicha administración varía desde aproximadamente 0.325%-1.3% de concentración de plasma en dicho suministro de agua.

30. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dicho animal está en la familia de las aves.

31. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dichos estados de reto de enfermedad consisten de estados de enfermedad respiratoria.

32. El complemento de la reivindicación 21 , en donde dichos estados de enfermedad respiratoria se seleccionan del grupo que consiste de: influenza de aves, enfermedad respiratoria crónica, sinusitis infecciosa, neumonía, cólera de aves de corral, sinovitis infecciosa o cualquier otro estado de enfermedad asociado con niveles alterados de IgG o TNF-a.

33. Un método para modular la respuesta inmune de un animal durante períodos de tensión que comprende: administrar a dicho animal en forma oral una cantidad inmunomoduladora de una preparación que comprende inmunogiobulina de una fuente animal.

34. El método de la reivindicación 33, en donde dicha fuente animal es sangre y sus fracciones.

35. El método de la reivindicación 33, en donde dicha fuente animal es huevo y sus fracciones.

36. El método de la reivindicación 33, en donde dicha fuente animal es leche y sus fracciones.

37. El método de la reivindicación 33, en donde dicha inmunogiobulina animal es recombinante.

38. El método de la reivindicación 33, en donde dicha inmunogiobulina recombinante es una planta.

39. El método de la reivindicación 33, en donde dicha inmunogiobulina recombinante se expresa en una bacteria.

40. El método de la reivindicación 33, en donde dicha administración se hace 10 días posteriores al destete.

41. El método de la reivindicación 33, en donde dicha administración es vía el suministro de agua de dicho animal.

42. El método de la reivindicación 33, en donde dicha administración vía dicho suministro de agua comienza con animales de un día de edad o por reto de enfermedad.

43. El método de la reivindicación 33, en donde dichos períodos de tensión incluyen enfermedades respiratorias de dicho animal.

44. El método de la reivindicación 33, en donde dichos estados de enfermedad respiratoria se seleccionan del grupo que consiste de: influenza de aves, enfermedad respiratoria crónica, sinusitis infecciosa, neumonía, cólera de aves de corral, sinovitis infecciosa o cualquier otro estado de enfermedad asociado con niveles alterados de IgG o TNF-a.