MXPA03005382A - Terapia combinada de dapd con un inhibidor de inosino monofosfato dehidrogenasa. - Google Patents

Abstract

Se ha encontrado de manera inesperada un farmaco resistente a una cepa del VIH que exhibe un comportamiento de farmaco inocuo al virus cuando se da en combinacion con un ??- D-1,3-dioxolanil nucleosido y un inhibidor de IMPDH. En una modalidad no limitante, la cepa de VIH es resistente a un ?? - D-1,3-dioxolanil nucleosido.

Description

TERAPIA COMBINADA DE DAPD CON UN INHIBIDOR DE INOSINO MONOFOSFATO DEHIDROGENASA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento o profilaxis de la infección por el virus de la inmunodeficiencía humana (VIH) en un hospedero, que comprende administrar esas composiciones.

ANTECEDENTES DB LA INVENCION El SIDA, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, es una enfermedad catastrófica que ha alcanzado proporciones globales. Desde Julio de 1998 hasta Junio de 1999 se reportaron un total de 47,083 casos de SIDA en los Estados Unidos únicamente. Con más de 2.2 millones de muertes en 1998, el VIH/SIDA se ha convertido ahora en la cuarta causa líder de mortalidad y su impacto se está incrementando. Se dice que la muerte por SIDA ha alcanzado un registro de 2.6 millones por año, mientras que las nuevas infecciones por VIH continúan propagándose a una velocidad creciente, de acuerdo a un reporte de UNAIDS reciente . El SIDA llamó por primera vez la atención del Centro para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) en 1981 cuando un hombre homosexual aparentemente sano cayó con Sarcoma de Karposi (KS) y Neumonía de Carinii . Neumoquística (PCP) , dos enfermedades oportunistas que se sabía solo se presentaban en pacientes xnmunodeficientes . 5 Un par de años después, el agente causante del SIDA; un retrovirus asociado con la limfoadenopatía, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) fue aislado por Instituto Pasteur en París, y más' tarde confirmado por una fuente dependiente en el Instituto Nacional de 10 Cancerología de los Estados Unidos. En 1986, en la segunda Conferencia Internacional sobre el SIDA en París, se presentaron reportes preliminares sobre el uso de un fármaco contra el SIDA. Este fármaco, la 3 ' -azido-3 ' -desoxi-timidina 15 (AZT, Zidovudina, Retrovirus) , fue aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) y se convirtió en el primer fármaco a ser utilizado en la lucha contra el SIDA. Desde el advenimiento de la AZT, varios análogos nucleosídicos han mostrado tener 20 actividad antiviral potente contra el virus de la inmunodeficiencia humana del tipo I (VIH-I) . en particular, un número de 2' , 3' -didesoxi-2' , 3 ' -dideshidro- nucleósidos han mostrado tener una actividad anti-VIH-1 ' potente. La 2' , 3' -dideso'xí-2' , 3' -dideshidro-timidina 25 ("D4T"; también referida como 1- (2 , 3-didesoxi- ~D- I glicero-pent-2-eno-furanosil) timidina) es actualmente vendida para el tratamiento del VIH bajo el nombre de Stavudina por Bristol Myers Squibb. Se ha reconocido que pueden emerger variantes del VIH resistentes a fármacos después del tratamiento prolongado con un agente antiviral. La resistencia a fármacos ocurre más típicamente por mutación de un gen que codifica para una enzima utilizada en la reproducción viral, y de manera más típica en el caso del VIH, la transcriptasa inversa, proteasa o ADN polimerasa.

Recientemente, se ha demostrado que la eficacia de un fármaco contra la infección por VIH puede ser prolongada, almacenada, o restablecida medíante la administración de dos compuestos en combinación o alteración con un segundo, o quizá un tercer, compuesto antiviral que induce a una mutación diferente de la causada por el fármaco principal. De manera alternativa, la farmacocinética, biodistribución u otros parámetros del fármaco pueden ser alteradas por esa terapia combinada o alternada. En general, la terapia combinada es preferida típicamente sobre la terapia alternada debido a que incluye presiones simultáneas múltiples sobre el virus. No se puede predecir, sin embargo, que mutaciones serán inducidas en el genoma del VIH-1 por un fármaco dado, si la mutación es permanente o transitoria, como una célula infectada con una secuencia de VIH-1 mutante responderá a la terapia con otros agentes en combinación o de manera alternada. Esto es exacerbado por el hecho de que existe una pausa en los datos sobre la cinética de resistencia a fármacos en cultivos celulares a largo plazo tratados con los agentes antirretrovirales modernos. Han sido aisladas variantes resistentes del VIH-1 a la 3' -azido-3' -deoxitimidina (AZT) , 2', 3'-didesoxinosina (DDI) o 2' , 3' -didesoxicitidina (DDC) de pacientes que recibieron monoterapia a largo plazo con esos fármacos (Larder BA, Darby G, Richman DD. Science 1989; 243:1731-4; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG, et al. Science 1991; 253:1557-9; St Clair MH, Martin JL, Tudor WG, et al. Science 1991; 253:1557-9; y Fitzgibbon JE, Ho ell RM, Haberzettl CA, Sperber SJ, Gocke DJ, Dubin DT. Anti icrob Agents Chemother 1992; 36:153-7). Las evidencias clínicas de la referencia indican que la resistencia a la AZT es un predictor de un resultado clínico pobre tanto en niños como en adultos (Mayers DL. Lecture at the Thirty-second Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. (Anaheim, CA. 1992); Tudor-Williams G, St Clair MH, McKinney RE, et al. Lancet 1992; 339:15-9; Ogino T, Dankner W , Spector SA. J Pediatr 1993; 123; 1-8; Crumpacker CS, D'Aquila RT, Johnson VA, et al., Third Workshop on Viral Resistance.

(Gaithersburg, MD. 1993); y Mayers D, y el RV43 Study Group. Third Workshop on Viral Resistance. (Gaithersburg, MD. 1993)). El rápido desarrollo de resistencia del VIH a inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosidica (NNRTI) también ha sido reportada en cultivo celular y en ensayos clínicos en humanos (Nunberg JH, Schleif WA, Boots EJ, et al. J Virol 1991; 65 (9) : 4887-92; Richman D, Shih CK, Lowy I, et al. Proc Nati Acad Sci (EUA) 1991; 88:11241—5; Mellors JW, Dutschman GE, Im GJ, Tramontano E, Winkler SR, Cheng YC. Mol Pharm 1992; 41:446-51; Richman DD y el Equipo de Estudio ACTG 164/168. Second International HIV-1 Druge Resistance Workshop. (Noordwijk, Holanda. 1993); y Saag MS, Emini EA, Laskin OL, et al. N Engl J Med 1993; 329:1065-1072) . En el caso del NNRTI 1/ 697, 661, el VIH-1 resistente a fármacos emergió dentro de 2-6 semanas de inicio de la terapia en iniciación con el retorno de viremia a niveles previos al tratamiento (Saag MS, Emini EA, Lakin OL, et al. N Engl J Med 1993; 329:1065-1072) . El descubrimiento de viremia asociada con la aparición de cepas resistentes a fármacos también ha sido notado con otras clases de inhibidores del VIH-1, incluyendo los inhibidores de proteasa (Jacobsen H, Craig CJ, Duncan IB; Haengii M, Yasargil K, Mous J. Third Workshop on Viral Resistance- (Gaithersburg, MD. 1993) ) . Esta experiencia ha conducido la idea de que debe ser evaluado el" potencia del resistencia a fármacos de VIH-1 inicialmente en la evaluación preclinica de todas las nuevas terapias para el VIH-1. 1 , 3-Dioxolanil Nucleósidos El excito de varios nucleósidos sintéticos en la inhibición de la reproducción del VIH in vivo o in vitro ha conducido a un número de investigadores a diseñar y probar nucleósidos que sustituyen un heteroá omo del átomo de carbono en la posición 3' del nucleósido. Norbeck, et al., describe que la (+/-)-!-[ (2-ß, 4-ß) -2- (hidroximetil) -4-dioxolanil] timina (referida como (+/-) -dioxolan-T) exhibe una actividad modesta contra el VIH (CE50 de 20 µ en células ATH8), y no es tóxica a células control no infectadas a una concentración de 200 µ?. Tetrahedron Letters 30 (46) , 6246, (1989) . En Abril 11,1988, Bernard Belleau, Dilip Dixit, y Nghe Nguyen-Ba en la solicitud de patente presentada por BioChem Pharma U.S.S.N. 07/179,615 la cual describe un grupo genérico de 1,3-dioxolan nucleósidos sustituidos en la posición 2 y en la posición 4 racémicos para el tratamiento del VIH. La solicitud de patente ?615 que maduró en la Publicación de Patente Europea No. 0 337 713; la Patente Estadounidense No. 5,041,449; y la Patente Estadounidense No. 5,270,315 cedidas a BioChem Pharma, Inc. En Diciembre 5, 1990, Chung K. Chu y Raymond F.

Schinazi presentaron la U.S.S.N. 07/622,762, la cual describe un proceso asimétrico para la preparación de ß- D-l, 3-dioxolan nucleósidos enriquecidos enantioméricamente vía síntesis estereoespecífica, y ciertos nucleósidos preparados por este, incluyendo la (-) - (2R, R) -9- [ (2-hidroximetil) - 1, 3-dioloan-4-il] guanina (DXG) , y su uso para tratar el VIH. Esta solicitud de patente se expidió como Patente Estadounidense No. 5,179,104.

DXG En Mayo 21,1991, Tarek Mansour, et al., en la U.S.S.N. 07/703,379 de BioChem Pharma dirigida a un método para obtener los enantiómeros de 1, 3-dioxolano nucleósidos utilizando una síntesis estereoselectiva que incluye condensar un intermediario de 1 , 3-dioxolano unido covalsnteraente a un auxiliar quiral con un ácido Le is de sililo. La solicitud correspondiente fue presentada en Europa como EP 0 515 156. En Agosto 25, 1992, Chung K. Chu y Raymond F.

Schinazí presentaron la U.S.S.N. 07/935,515, que describe ciertos compuestos de ß-D-dioxolanil purina enriquecidos enantioméricamente para el tratamiento de humanos infectados con VIH de la fórmula: donde R es OH, Cl, NH2 o H, o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable de los compuestos opcionalmente en un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable. El compuesto donde R es cloro es referido como (-) - (2R, 4R) -2-amino-6-cloro-9- [ (2- hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-il] urina . El compuesto donde R .es hidroxi es la (-) - (2R, R) -9- [ (2-hidroxi- metil) -1, 3-dioxolan-4-il] guanina. El compuesto donde R es a ino es (-) - (2R, R) -2-amino-9- [ (2-hidroximetil) -1, 3- dioxolan-4-il] adenina . El compuesto donde R es hidrógeno es (-) - (2R, R)-2-amino-9- [ (2-hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-il] purina. Esta solicitud se expidió como Patentes Estadounidenses Nos. 5,925,643 y 5,767,122. En 1992, im et al., publicó un articulo que enseña como obtener el . (-) -L-p-dioxolan-C y (+)-??-ß-- dioxolan-T a partir de 1, 6-anhidro-L-p-glucopiranosa . Kim et al., Potent anti-HIV and anti-HBV Activíties of (-) -L-ß-Dioxolane-C and (+) -L-/3-Dioxolane-T and Their Asymmetric Syntheses, Tetrahedron etters Vol 32(46), pp 5899-6902. En Octubre 28, 1992, Raymond Schinazi presentó la U.S.S.N. 07/967,460 dirigido el uso de los compuestos descritos en la U.S.S.N. 07/935,515 para el tratamiento de la hepatitis B. Esta solicitud ha sido expedida como Patentes Estadounidenses Nos. 5,444,063; 5,684,010; 5,834,474; y 5,830,898. En 1993, Siddiqui, et al., en BioChem y Glaxo publicación que el cis-2, 6-diaminopurin dioxolano puede ser desaminado selectivamente utilizando adenosina desaminasa. Siddiqui, et al., Antiviral Optically Puré dioxolane Purine Nucleoside Analogues, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 3(8), pp 1543-1546 (1993) . La (-) - (2R, 4R) -2-amino-9- [ (2-hidroximetil) -1,3-dioxolan-4-il] adenina (DAPD) es un inhibidor selectivo de la producción del VIH-1 in vitro como inhibidor de la transcriptasa inversa (RTI) . Se piensa que la DAPD es desaminada in vivo por la adenosina desaminasa, una enzima ubicua, para producir la (-) -ß-D-dioxolan guanina (DXG) , la cual es posteriormente convertida al 5'-trifosfato (DXG-TP) correspondiente. El análisis bioquímico ha demostrado que DXG-TP es un impotente inhibidor de la transcriptasa inversa de VIH (HIV-RT) con una Ki de 0.019 µ?.

Triangle Pharmaceuticals, Inc. (Durham, N. C.) está actualmente desarrollando este compuesto para el tratamiento del VIH y VHB bajo convenio de licencia de la Universidad de Emory en colaboración con Abbott Laboratories, Inc.

Ribavirina La ribavirina (?-ß-D-ribofuranosil-l, 2, 4-triasol-3-carboxamida) es un análogo nucleosidico antiviral sintético, que no induce interferón, de amplio espectro, vendido bajo el nombre comercial de Virazole (The Merck Index, lth edition, Editor: Budavari, S., Merck & Co . , Inc., Rah ay, NJ, pl304, 1989). La Patente Estadounidense No. 3,798,209 y la RE29,835 describen y reclaman la ribavirina. En los Estados Unidos, la ribavirina fue aprobada por primera vez como una forma en aerosol para el tratamiento de un cierto tipo de infección de virus respiratorio en niños. La ribavirina es estructuralmente similar a la guanocina y tiene actividad in vitro contra varios ADN y ARN virus incluyendo los Flaviviridae (Gary L. Davis Gastroenterology 118 : S104-S114 , 2000). La ribavirina reduce los niveles de amino transferasa en suero a normales en 40% de los pacientes, pero no baja los niveles - en suero de HCV-RNA (Gary L. Davis Gastroenterology 118 : S104-S114, 2000). De este modo, la ribavirina sola no es efectiva para reducir los niveles de ARN viral. Esta está siendo estudiada en combinación con DDI como un tratamiento anti-VIH. Más reciente, se ha mostrado que exhibe actividad contra las hepatitis A, B y C. Desde el inicio de la crisis del SIDA, la gente ha utilizado ribavirina como un tratamiento anti VIH, sin embargo, cuando se utiliza como onoterapia, varios estudios controlados han mostrado que la ribavirina no es efectiva contra el VIH. No tiene efecto sobre las células T4, células TS o antigeno p24. Se ha reportado que la combinación de IFN y ribavirina para el tratamiento de infección por VHC es efectiva en el tratamiento de pacientes sensibles al IFN (Battaglia, A.M. et al., Ann. Pharmacother . 34:487-494, 2000) . Los resultados son prometedores para este tratamiento combinado tanto antes del desarrollo de la hepatitis como cuando la enfermedad histológica está presente (Berenguer, M. et al. Antivir. Ther. 3(Suppl. 3):125-136, 1998). Los efectos laterales de la terapia combinada incluyen la hemolisis, síntomas similares al catarro, anemia y fatiga (Gary L. Davis. Gastroenterology 118:S104-S114, 2000) .

RIBAVIRINA Acido icofenólico El ácido microfenólico (ácido 6- ( -hidroxi-6-metoxi~7-metil-3-oxo~5-ftalaníl) -4-metil-4-hexanóico) es conocido por reducir la velocidad de la síntesis de novo de monofosfato de guanosina por la inhibición de la inosino monofosfato deshidrogenase ("IMPDH") . También reduce la proliferación de linfocitos.

ACIDO MICOFENOLICO Los científicos han demostrado que el ácido micofenólico tiene un efecto sinérgico cuando es combinado con el Abacavir (Ziagen) in vitro. El ácido micofenólico agota la guanocina, uno de los bloques constitutivos esenciales del ADN. El abacavir es un análogo de la guanocina y por- lo tanto, debe de competir con la producción natural o guanocina del cuerpo para tener un efecto terapéutico. El agotamiento de la guanocina ocurre naturalmente, el ácido micofenólico mejora la absorción del abacavir por la célula. Los científicos han determinado que la combinación de ácido micofenólico y abacavir es altamente activa contra virus resistentes al abacavir. Sin embargo, de manera notable la combinación de ácido micofenólico y zidovudina o estavudina fue antagónica, probablemente debido a la inhibición de la fosforilación de timidina por el ácido micofenólico . 39th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, San Francisco, California, September 26-29,1999. Heredia, A., Margolis, D.M., Oldach, D. , Hazen, R. , Redfield, R.R. (1999) Abacavir in combination with the IMPDH inhibitor mycophenolic acid, is active against multi-drug resistant HIV. J Acquir Immune Defic Syndr.; 22:406-7. Margolis, D.M., Heredia, A., Gaywee, J. , Oldach, D. , Drusano, G., Redfield, R.R. (1999) Abacavir and mycophenolic acid, an inhibitor of inosine monophosphate dehydrogenase, have profound and synergístic anti- HIV activity. J Acquir Immune Defic Syndr., 21:362-370. La Patente. Estadounidense No. 4,686,234 describe varios derivados del ácido micofenólico, su síntesis y usos en el tratamiento de trastornos autoinmunes, psoriasis, y enfermedades inflamatorias, incluyendo en particular, la artritis reumatóide, tumores, virus y para el tratamiento del rechazo de haloingertos . En Mayo 5, 1995, Morris et al., en la Patente Estadounidense No. 5,665,728, describió un método para prevenir o tratar la enfermedad vascular hiperproliferativa en un mamífero mediante la administración de una cantidad antiproliferativa efectiva de rapamicina sola en combinación con ácido micofenólico .

• A la luz del tratamiento global de la epidemia del VIH, un objeto de la presente invención es proporcionar nuevos métodos y composiciones para el tratamiento del VIH. Otro objeto de la presente invención es proporcionar métodos y composiciones para tratar cepas de VIH resistentes a fármacos.

SUMARIO DE LA INVENCION Se ha encontrado de manera inesperada que una cepa del VIH resistente a fármacos exhibe el comportamiento de un virus sensible a fármacos cuando se da la combinación de un ß-D-l, 3-dioxolanil nucleosídico y un inhibidor de IMPDH. En una modalidad no limitante, la cepa de VIH es resistente al ß-D-l , 3-dioxolanil nucleósido . La presente invención, se dirige a composiciones y métodos para el tratamiento profilaxis del VIH, y en particular con una cepa del VIH resistente a fármacos, incluyendo pero sin limitarse a una cepa de VIH resistente a DAPD y/o DXG, en un hospedero infectado, y en particular un humano, que comprende administrar una cantidad efectiva de una ß-D-dioxolanil purina 1,3-dioxolanil nucleósido (" ß-D-l, 3-dioxolanil nucleósidos" ) de la fórmula: donde R es H, OH, Cl, NH2 o NRV R1 y R2 don independientemente hidrógeno, alquilo o cicloalquilo, y R3 es H, alquilo, arilo, acilo, fosfato, incluyendo monofosfato, difosfato o trifosfato o una entidad de fosfato estabilizada, incluyendo un fosfolípido, un éter y un lipido o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable, en combinación o de manera alternada con un inhibidor de la inosino monofosfato deshidrogenase (IMPDH) . En una modalidad, la ß-D-l, 3-dioxolanil purina, enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, se administra en combinación o de manera alternada con el inhibidor de la IMPDH, por ejemplo ribavirina, ácido micofenólico, ribosido de benzamida, tiazofurin, selenazofurin, 5-etinil-l-p-D-ribofuranosilimidazol-4-carboxamida (EICAR) , o tetrohidrofuran-3-il-éster del ácido (S) -N-3- [3- (3-metoxi-4-oxazol-5-il-fenil) -ureido] -bencil-carbámico (VX-497), el cual efectivamente hace disminuir la CE50 para DXG cuando se prueba contra cepas de HIV-1 naturales o mutantes. En una modalidad, el inhibidor de la IMPDH es el ácido micofenólico . En otra modalidad preferida de la invención, el inhibidor de la IMPDH es 1 ribavirina. En una modalidad preferida, el nucleósido es administrado en combinación con el inhibidor de la IMPDH. En una modalidad preferida, el nucleósido es DAPD. En otra modalidad, la ß-D-l, 3-dioxolanil purina enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, es administrado en combinación o de manera alternada con un compuesto que reduce la velocidad de la síntesis de novo de guanocina o desoxiguanocin nucleótidos. En una modalidad preferida, el DAPD es administrado en combinación o de manera alternada con la ribavirina o el ácido micofenólico, lo cual reduce la velocidad de la síntesis de novo de los guanocin nucleótidos . En otra modalidad más, la ß-D-l , 3-dioxolanil purina enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, es administrado en combinación o de manera alternada con un compuesto que incrementa efectivamente la concentración intracelular de DXG-TP. En otra modalidad preferida más, el DAPD es administrado en combinación o de manera alternada con la ribavirina o el ácido micofenólico, lo que incrementa efectivamente la concentración intracelular de DXG-TP. Se ha descubierto también que, por ejemplo, esta combinación de fármaco puede ser utilizada para tratar cepas de VIH resistentes a DAPD y resistentes a DXG. Las cepas de VIH resistentes a DAPD y DXG, después del tratamiento con la combinación de fármacos descrita, exhiben características de virus sensibles al fármaco. Por lo tanto, en otra modalidad más de la presente invención, la ß-D-l , 3-dioxolanil purina enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, es administrada en combinación o de manera alternada con el inhibidor de la IMPDH que revierte efectivamente la resistencia a fármacos observada el cepas imitantes de HIV-1. En otra modalidad más de la presente invención, la ß-D-l, 3-dioxolanil purina enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, es administrado en combinación o de manera alternada con uh inhibidor de la IMPDH que revierte efectivamente la resistencia a los fármacos DAPD o DXG observada en cepas mutantes de VIH-1. En general, durante la terapia alternada, se administra una dosis efectiva de cada agente en serie, mientras que en la terapia combinada, se administran dosis efectivas de dos o más agentes en conjunto. Las dosis dependerán de factores como la absorción, biodistribución, metabolismo y velocidades de excreción de cada fármaco, asi como otros factores conocidos por aquellos expertos en la técnica. Debe notarse que los valores de la dosis también variaran con la severidad de la condición a ser aliviada. Debe comprenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes y programas de dosificación específicos deberán ser ajustados con el tiempo de acuerdo a la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las composiciones. Los ejemplos de intervalos de dosis adecuados pueden encontrarse en la literatura científica y en el Physicians Desk Reference. Muchos ejemplos de intervalos de dosis adecuados para otros compuestos descritos aquí también se encuentran en la literatura pública o pueden ser identificados utilizando procedimientos conocidos. Esos intervalos de dosis pueden ser modificados según se desee para lograr un resultado deseado . Los regímenes combinados y alternados descritos son útiles en la prevención y tratamiento de infecciones por VIH y otras condiciones relacionadas como el complejo relacionado con el SIDA (ARC) , linfadenopatía generalizada persistente (PGL) , condiciones neurológicas relacionadas con el SIDA, anticuerpo anti-VIH positivo y condiciones de VIH positivas, sarcoma de Kaposi, púrpura trombocitopemica e infecciones oportunistas. Además, esos compuestos o formulaciones pueden ser utilizadas profilácticamente para prevenir o retardar el progreso de la enfermedad clínica en individuos que son positivos al anticuerpo anti-VIH o antígeno del VIH o que han sido expuestos al VIH.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se ha encontrado de manera inesperada que una cepa de VIH resistente a fármacos exhibe el comportamiento de virus sensible a fármacos cuando se da en combinación de ß-D-l, 3-dioxolanil nucleósido y un inhibidor de la IMPDH. En una modalidad no limitante, la cepa de VIH es resistente al ß-D-l , 3-dioxolanil nucleósido . La IMPDH cataliza la oxidación dependiente de NAD del inocin-5 ' -monofosfato (IMP) a xantocin-5'-monofosfato (XMP) , la cual es el paso necesario en la síntesis de guanocin nucleótido. Se ha descubierto que la reducción de los niveles de 5' -trifosfato de desoxiguanocina (dGTP) intracelular a través de la inhibición de la inosino monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) incrementa efectivamente la concentración intracelular de DXG-TP aumentando por lo tanto la inhibición de la reproducción del VIH. Esto por si solo, sin embargo, no puede explicar la sensibilidad inesperada de una forma del VIH resistente a fármacos al ß-?-1,3-dioxolanil nucleósido administrado en presencia de un inhibidor de la IMPDH. Por lo tanto, la presente invención está dirigida a composiciones y métodos para el tratamiento profilaxis del VIH, y en particular a una cepa del VIH resistente a fármacos, como cepa de VIH resistente a DAPD y/o DXG, en un hospedero, por ejemplo, un mamífero, y en particular un humano, que comprende administrar una cantidad efectiva de una ß-D-l, 3-dioxolanil purina enriquecida enantioméricamente de la fórmula: donde R es H, OH, Cl, N¾ o Ní^R2; R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo o cicloalquilo, y R3 es H, alquilo, arilo, acilo, fosfato, incluyendo monofosfato, difosfato o trifosfato o una entidad de fosfato estabilizada, incluyendo un fosfolipido, o un éter-lípido o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable, en combinación o de manera alternada con un inhibidor de la inosino monofosfato deshidrogenase (IMPDH) . En una modalidad, la ß-D-l , 3-dioxolanil purina, enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, es administrada en combinación o de manera alternada con un inhibidor de la IMPDH, por ejemplo la ribavirina, ácido micofenólico, ribosido de benzamida, tiazofurin, selenazofurin, 5-etinil-l-p-D-ribofuranosilimidazol-4-carboxamide (EICAR) , o tetrahidrofuran-3-il-éster de ácido (S) -N-3- [3- ( 3-metoxi-4-oxazol-5-il-fenil ) -ureido] -bencil-carbámico (VX-497)-, el cual efectivamente hace disminuir la CE50 para el DXG cuando se prueba contra cepa de VIH-1 naturales o mutantes. En una modalidad preferida el inhibidor de la IMPDH es el ácido micofenólico . En otra modalidad preferida de la invención, el inhibidor de la IMPDH es la ribavirina. En una modalidad preferida, el nucleósido es administrado en combinación con el inhibidor de la IMPDH. En otra modalidad preferida, el nucleósido es DAPD. En otra modalidad, la ß-D-l, 3-dioxolanil purina enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, es administrado en combinación o de manera alternada con un compuesto que reduce la velocidad de síntesis de novo de nucleotidos de guanocina y desoxiguanocina. En una modalidad preferida, el DAPD es administrado en combinación o de manera alternada con la ribavirina o ácido micofenólico, lo cual reduce la velocidad de síntesis de novo de los guanocin nucleotidos ." En otra modalidad más, la ß-D-l, 3-dioxolanil purina enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, es suministrado en combinación o de manera alternada con un compuesto que incrementa efectivamente la concentración intracelular del DXG-TP. En otra modalidad preferida más, el DAPD es administrada en combinación o de manera alternada con ribavirina o ácido micofenólico, lo que incrementa efectivamente la concentración intracelular de DXG-TP. También se ha descubierto que, por ejemplo, esta combinación de fármacos puede ser utilizada para tratar cepas de VIH resistentes al DAPD y resistentes al DXG. Las cepas de VIH resistentes al DAPD y DXG, después del tratamiento con la combinación de fármacos descrita, exhiben características de virus sensibles a fármacos. Por lo tanto, en otra modalidad más de la presente invención. La ß-D-l , 3-dioxolanil purina enriquecida enantiomérica, y en particular el DAPD, es administrada en combinación o de manera alternada con un inhibidor de la IMPDH que revierte efectivamente la resistencia a fármacos observada en cepas mutantes de VIH-1. En otra modalidad más de la presente invención, la ß-D-l, 3-dioxolanil purina enriquecida enantioméricamente, y en particular el DAPD, es administrado en combinación o de manera alternada con un inhibidor de la IMPDH que revierte efectivamente la resistencia a los fármacos DAPD o DXG observada en cepas mutantes de HIV-1.

I . Definiciones El término "protegido" como se utiliza aquí y a menos que se defina de otro modo se refiere a un grupo que es agregado a un átomo de oxígeno, nitrógeno o fósforo para evitar solución adicional o para otros propósitos. Es conocida una amplia variedad de grupos protectores de oxígeno y nitrógeno por aquellos expertos en la técnica de la síntesis orgánica. El término halo, como se utiliza aquí, . incluye al cloro, bromo, yodo, y flúor. El término alquilo, como se utiliza aquí, a menos que se especifique otra cosa, se refiere a un hidrocarburo saturado lineal, ramificado, o cíclico, primario, secundario o terciario típicamente de Ci a Cío, y específicamente incluye al metilo, trifluorometilo, etilo, propílo, isopropilo, ciclopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, pentilo, ciclopentilo, isopentilo, neopentilo, hexilo, isohexilo, ciclohexilo, ciclohexilmetilo, 3-metilpentilo, 2, 2-dimetilbutilo, y 2 , 3-dimetilbutilo . El término incluye grupos alquilo sustituidos y no sustituidos. Las entidades con las cuales el grupo alquilo puede ser sustituido son seleccionadas del grupo que consiste de hidroxilo, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato, o fosfonato, protegidos, o sin proteger, según sea necesario, como es sabido por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se enseña en Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John iley and Sons, Second Edition, 1991, incorporada aquí como referencia . El término alquilo inferior, como se utiliza aquí, y a menos que se especifique otra cosa, se refiere a un grupo alquilo saturado de Ci a C4 lineal, ramificado, o si es apropiado, cíclico (por ejemplo, ciclopropilo) , incluyendo las formas sustituidas o no sustituidas. A menos que se establezca específicamente otra cosa en esta solicitud, cuando el alquilo es una entidad adecuada, el alquilo es el preferido. De manera similar, cuando el alquilo o alquilo inferior es una entidad adecuada, se prefiere al alquilo no sustituido o alquilo inferior. El término arilo, como se utiliza aquí, y a menos que se especifique otra cosa, se refiere a fenilo, bifenilo o naftilo y de manera preferible fenilo. El término incluye porciones sustituidas y no sustituidas. El grupo arilo puede estar sustituido con una o más entidades seleccionadas del grupo que consiste de hidroxilo, amino, alquilamino, arilamino, alcoxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato o fosfonato, no protegido o protegido cuando sea necesario, como es sabido por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se enseña en Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Segunda Edición, 1991. El término acilo se refiere a un éster de ácido carboxilico en el cual la entidad no carbonilica del grupo éster es seleccionada de alcoxialquilo lineal, ramificado, o alquilo cíclico o alquilo inferior, incluyendo metoximetilo, aralquilo incluyendo bencilo, ariloxialquilo como el fenoximetilo, arilo incluyendo fenilo opcionalmente sustituido con halógeno (por ejemplo, F, Cl, Br o I), alquilo de Ci a C4 o alcoxí de Ci a C4, ésteres de sulfonato como el alquilo o aralquil sulfonilo, incluyendo el metansulfonilo, el éster de mono, di o trifosfato, trifilo o monometoxitritilo, bencilo sustituido, trialquilsililo (por ejemplo dimetil-t-butilsilil) o difenilmetilsililo . Los grupos arilo en los ésteres comprenden, de manera óptima, un grupo fenilo. El término "acilo inferior" se refiere a un grupo acilo en el cual la entidad no carbonilica es alquilo inferior . El término "enriquecido enantioméricamente" se utiliza a través de la especificación para describir un compuesto el cual incluye aproximadamente 95% o más, de manera preferible al menos 96%, de manera más preferible al menos 97%, de manera aún más preferible, al menos 98% y de manera aún más preferible aproximadamente 99% o más de un solo enantiómero de ese compuesto. Cuando un nucleósido de una configuración particular (D o L) es referido en esta especificación, se presume que el nucleósido es un nucleósido enriquecido enantioméricamente, a menos que se establezca otra cosa. El término "hospedero" como se utiliza aqui, se refiere a un organismo unicelular o multicelular en el cual el virus puede reproducirse, incluyendo lineas celulares y animales, y de manera preferible un humano.

De manera alternativa, el hospedero puede contener una parte del genoma viral , cuya reproducción o función puede ser alterada por los compuestos de la presente invención, el término hospedero se refiere específicamente a células infectadas, células transíectadas con todo o parte del genoma viral y animales, en particular, primates (incluyendo chimpancés) y humanos. En la mayoría de aplicaciones en animales de la presente invención, el hospedero es un paciente humano. Las aplicaciones veterinarias, en ciertas aplicaciones, sin embargo, son claramente anticipadas por la presente invención (como en el virus de la inmunodeficiencia simia en chimpancés) . Los profármacos farmacéuticamente aceptables se refieren a un compuesto que es metabolizado, por ejemplo hidrolizado u oxidado, en el hospedero para formar el compuesto de la presente invención. Los ejemplos típicos de profármacos incluyen compuestos que tienen grupos protectores biológicamente lábiles sobre una entidad funcional del compuesto activo. Los profármacos incluyen compuestos que pueden ser oxidados, reducidos, aminados, desaminados, hidroxilados , deshidroxilados, hidrolizados , deshidrolizados, alquilados, desalquilados, acilados, desacilados, fosforilados , desfosforilados para producir el compuesto activo. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen a aquéllas derivadas de bases y ácidos inorgánicos u orgánicos farmacéuticamente aceptables. Las sales adecuadas incluyen aquellas derivadas de metales alcalinos como el potasio y el sodio, metales alcalinotérreos como el calcio y magnesio, entre numerosos otros ácidos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Los compuestos de esta invención poseen actividad antiviral, o son metabolizados a un compuesto que exhibe esa actividad.

II. Sales y Profármacos Farmacéuticamente Aceptables En casos donde cualquiera de los compuestos como se describe aqui son suficientemente básicos o ácidos para formar sales de ácidos o bases no tóxicas estables, la administración del compuesto como una sal farmacéuticamente aceptable puede ser apropiada. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables son sales de adición de ácido formadas con ácidos, las cuales forman un anión fisiológicamente aceptable, por ejemplo, tosilato, metansulfonato, acetato, citrato, malonato, tartarato, succinato, benzoato, ascorbato, oc-cetoglutarato y a-glicerofosfato . También pueden ser formadas sales inorgánicas adecuadas, incluyendo, sales de sulfato, nitrato, bicarbonato y carbonato.

Las sales farmacéuticamente pueden ser obtenidas utilizando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica, por ejemplo por la reacción de un compuesto suficientemente básico como una amina con un ácido adecuado para dar un anión fisiológicamente aceptable. También pueden ser producidas sales de metal alcalino (por ejemplo, sodio, potasio o litio) o metal alcalino térreo (por ejemplo calcio) de ácidos carboxilicos . Cualquiera de los nucleósidos descritos aqui pueden ser administrados como un profármaco nucleotidico para incrementar la actividad, biodisponibilidad, estabilidad o alterar de otro modo las propiedades del nucleósido. Se conocen numerosos ligandos de profármacos nucleotidicos . En general, la alquilación, acilación u otra modificación lipofilica del grupo hidroxilo del compuesto o del mono, di o trifosfato del nucleósido incrementará la estabilidad del nucleótido. Los ejemplos de grupos sustituyentes que pueden reemplazar a uno o más hidrógenos sobre la entidad fosfato son el alquilo, arilo, esferoides, carbohidratos, incluyendo azúcares, 1 , 2-diacilglicerol y alcoholes. Muchos son descritos en R. Jones y N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1-17. Cualquiera de esos pueden ser utilizados en combinación con los nucleósidos descritos para lograr un efecto deseados. Cualquiera de los compuestos que son descritos aquí para utilizarse en terapia combinada o alternada pueden ser administrados como un profármaco acilado, donde el término acilo se refiere a un éster de ácido carboxilico en el cual la porción no carbonilica del grupo éster seleccionada de alcoxialquilo lineal, ramificado o alquilo cíclico o alquilo inferior, incluyendo metoximetilo, aralquilo incluyendo bencilo, ariloxialquilo, como el fenoximetilo, arilo incluyendo fenilo opcionalmente sustituido con halógeno, alquilo de Ci a C4 o alcoxi de Cx a C4, ésteres de sulfonato como el alquil o aralquil sulfonilo incluyendo el metansulfonilo, el éster de mono, di o trifosfato, trifilo o monometoxitritilo, bencilo sustituido, trialquilsililo (por ejemplo dimetil-t-butilsililo) . El nucleósido activo u otro compuesto que contenga hidroxilo también puede ser proporcionado como un lipido éter (y particularmente un lipido de 5' -éter o un lipico de 5'-fosfoéter para un nuleósido) , como se describe en las siguientes referencias, las cuales se incorporan aquí como referencia: Kucera, L.S., N. Iyer, E. Leake, A. Raben, odest E.K., D.L.W., y C. Piantadosi. 1990. "Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation." AIDS Res. Hum. Retro Viruses. 6:491-501; Piantadosi, C, J. arasco C.J., S.L. Morris-Natschke, K.L. Meyer, F. Gumus, J.R. Surles, K.S. Ishaq, L.S. Kucera, N . Iyer, C.A. Wallen, S. Piantadosi, y E.J. Modest. 1991. "Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity.". J. Med. Chem. 34:1408.1414; Hosteller, .Y., D.D. Richman, ?.?. Carson, L.M. Stuhmiller, G.M.T. van Wijk, y H. van den Bosch. 1992. 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Los ejemplos no limitantes de las patentes Estadounidenses que describen sustituyentes lipofilicos adecuados que pueden ser incorporados covalentemente en el nucleósido u otro compuesto que contenga hidroxilo o amina, preferiblemente en la posición 5 ' -OH del nucleósido o preparaciones lipofilicas, incluyen a las Patentes Estadounidenses Nos. 5,149,794 (Sep. 22, 1992, Yatvin et al.); 5,194,654 (Mar. 16, 1993, Hostetler et al., 5,223,263 (Junio 29, 1993, Hostetler et al.); 5,256,641 (Oct. 26, 1993, Yatvin et al.); 5,411,947 (Mayo 2, 1995, Hostetler et al.); 5,463,092 (Oct. 31, 1995, Hostetler et al.); 5,543,389 (Ago. 6, 1996, Yatvin et al.); 5,543,390 (Ago. 6, 1996, Yatvin et al.); 5,543,391 (Ago. 6, 1996, Yatvin et al.); y 5,554,728 (Sep. 10, 1996; Basava et al.), todas las cuales se incorporan aqui como referencia. Las solicitudes de patente anteriores que describen sustituyentes lipofilicos que pueden ser unidos a los nucleósidos de la presente invención, preparaciones lipofilicas, incluyen a las WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, y WO 91/19721. Los ejemplos no limitantes de profármacos nucleotidicos son descritos en las siguientes referencias: Ho, D.H.W. (1973) "Distribution of Kinase and deaminase of ?ß-D- arabinofuranosylcytosine in tissues of man and muse." Cáncer Res. 33, 2816-2820; Holy, A. (1993) Isopolar phosphorous-modified nucleotide analogues," In: De Clercq (Ed. ) , Advances in Antiviral Drug Design, Vol. I, JAI Press, pp. 179-231; Hong, C. I., Nechaev, A., and West, C. R. (1979a) "Synthesis and antitumor activity of ?ß-D- arabino-furanosylcytosine conjugates of cort sol and cortisone. " Bicohem. Biophys. Rs. Commun. 88, 1223-1229; Hong, C. I., Nechaev, A., Kirisits, A.J. 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III . Composiciones Farmacéuticas . Los humanos que padecen de los efectos causados por cualquiera de las enfermedades descritas aquí, y en particular, una infección causada por una cepa de VIH resistente a fármacos, pueden ser tratados mediante la administración al paciente de una cantidad efectiva del p-D-1, 3-dioxolanil nucleósido, y en particular, DAPD o DXG, en combinación o de manera alternada con un inhibidor de la IMPDH, incluyendo la ribavirina o el ácido micofenólico, o una sal o éster farmacéuticamente aceptable de los mismos en presencia de un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable. Los materiales activos pueden ser administrados por cualquier ruta apropiada, por ejemplo, oral, parenteral, ¾enteral, intravenosa, intradérmica, subcutánea, tópica, nasal, rectalmente, en forma liquida o sólida. Los compuestos activos son incluidos en el excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable a una cantidad suficiente pera proporcionar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto para inhibir la reproducción viral in vivo, especialmente la reproducción del VIH, sin causar efectos tóxicos serios al paciente tratado. "Cantidad inhibidora" significa una cantidad de ingrediente activo suficiente para ejercer un efecto inhibidor de acuerdo a lo medido por, por ejemplo, un ensayo como el descrito aquí. Una dosis preferida del compuesto para todas las condiciones mencionadas anteriormente estará en el intervalo de aproximadamente 1 a 50 mg/kg, de manera preferible de 1 a 20 mg/kg, de peso corporal por día, de manera general de 0.1 hasta aproximadamente 100 mg por kilogramo de peso corporal del receptor por día. El intervalo de dosis efectiva de los derivados farmacéuticamente aceptables puede ser calculado sobre la base del peso del nucleósido original a ser proporcionado. Si el derivado exhibe actividad en si, la dosis efectiva puede ser estimada como anteriormente utilizando el peso del derivado, o por otros medios conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los compuestos administrados convenientemente en cualquier forma de dosificación unitaria adecuada, incluyendo pero sin limitarse a una que contenga de 7 a 3000 mg, de manera preferible de 70 a 1400 mg de ingrediente activo por forma de dosificación unitaria. Una dosis oral de 50 a 1000 mg usualmente es conveniente. Idealmente, al menos uno de los ingredientes activos, aunque preferiblemente la combinación de los ingredientes activos, deberá ser administrado para lograr concentraciones pico en plasma del compuesto activo de aproximadamente 0.2 a 70 mM, de manera preferible de aproximadamente 1.0 a 100 mM. Esto puede ser lograda, por ejemplo, por medio de la inyección intravenosa de una solución del- 0.1 al 10% del ingrediente activo, opcionalmente en solución salina, o administrada como un bolo del ingrediente activo. La concentración del compuesto activo en la composición de fármaco dependerá de la absorción, distribución, metabolismo y velocidades de excreción del fármaco, asi como otros factores conocidos por aquellos expertos en la técnica. Debe notarse que los valores de la dosis también variarán con la severidad de la condición a ser aliviada. Debe comprenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deberán ser ajustados con el tiempo de acuerdo a las necesidades individuales y al juicio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las composiciones, y que los intervalos de concentración expuestos aquí con ejemplares únicamente y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reclamada. El ingrediente activo puede ser administrado a la vez, o puede ser dividido en un número de dosis más pequeñas a ser administradas o varios intervalos de tiempo. Un modo de administración preferido del compuesto activo es el oral. Las composiciones orales generalmente incluirán un diluente inerte o un excipiente comestible. Ellos pueden ser encerrados en cápsulas de gelatina o comprimidos en tabletas. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado con excipientes y utilizado en forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Los agentes aglutinantes compatibles, y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles pueden ser incluidos como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguiente ingrediente, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante como la celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina, un excipiente, como el almidón o lactosa, un agente desintegrante como el ácido alginico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante como el estearato de magnesio o Esterotes; un deslizante como el dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante como la sucrosa o sacarina; un agente saborizante como la menta piperita, salicilato de metilo o sabor naranja. Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, esta puede contener, además del material del tipo anterior, un portador líquido como un aceite graso. Además, las formas de dosificación unitaria pueden contener varios otros materiales los cuales modifican la forma física de la dosis unitaria, por ejemplo, recubrimientos de azúcar, goma selladora, u otros agentes entéricos . Los compuestos pueden ser administrados como un componente de un elíxir, suspensión, jarabe, oblea o galleta, goma de mascar o similar. Un jarabe puede contener, además de los compuestos activos, sucrosa como agente edulcorante y ciertos preservativos, tintes y colorantes y sabores. Los compuestos o sus derivados o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos también pueden ser mezclados con otros materiales activos que no impartan la acción deseada, o con materiales que suplementen la acción deseada, como antibióticos, antifungales, antiinflamatorios, inhibidores de proteasa, u otros agentes antivirales nucleosidicos o no nucleosidicos , como se discutió con mayor detalle anteriormente. Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación palenteral, intradérmica, subcutánea, o tópica pueden incluir los siguientes componentes: un diluente estéril como agua par inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilen glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como el alcohol bencílico o metilparabenos ; antioxidantes como el ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes como el ácido etilendiamintetraacético; amortiguadores como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para ajusfar la tonicidad como el cloruro de sodio o dextrosa. La preparación original puede ser encerrada en ampolletas, jeringas desechables o frascos de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Si se administra intravenosamente, los excipientes preferidos son solución salina fisiológica o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Si se administran por medio de un aerosol o inhalación nasal, esas composiciones son preparadas de acuerdo a técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros preservativos adecuados, promotores de la absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarburos, y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes conocidos en la técnica. Si se administran rectalmente en forma de supositorios, esas composiciones pueden ser preparadas mezclando el fármaco con un excipiente no inicial adecuado, como la manteca de cacao, ésteres de propilen glicoles de glicéridos sintéticos, los cuales son sólidos a temperaturas ordinarias, pero que se licúan y/o disuelven en la cavidad rectal para liberar el fármaco. En una modalidad preferida, los compuestos activos con preparados con excipientes que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados . Pueden ser polímeros biodegradables, biocompatibles, como el acetato de etilen vinilo, polianhíd;tidos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos parta la preparación de esas formulaciones serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Los materiales también pueden ser obtenidos comercialmente de Alza Corporation. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antigenos virales) también son preferidos como excipientes farmacéuticamente aceptables. Esas pueden ser preparadas de acuerdo a métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente Estadounidense No. 4,522,811 (la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Por ejemplo, las formulaciones liposomales pueden ser preparadas disolviendo los lipidos apropiados (como la estearoil fosfatidil etanolamina, estearoil fosfatidil colina, aracadoil fosfatidil colina, y colesterol) en un solvente inorgánico que se evapora entonces, dejando detrás una película delgada de lípido seco sobre la superficie del recipiente. Entonces se introduce en el recipiente una solución acuosa en el compuesto activo o sus derivados de monofosfato, difosfato y/o trifosfato. El recipiente es entonces agitado manualmente para liberar el material lípido de los lados de recipiente y para dispersar los agregados lipidíeos, formando por lo tanto la suspensión liposomal.

IV. Terapias Combinadas y Alternadas para el Tratamiento de la Infección por VIH En general, durante la terapia alternada, se administra una dosis efectiva de cada agente en serie, mientras que la terapia combinada, se administran dosis efectivas de dos o, más agentes en conjunto. La dosis dependerá de factores como la absorción, biodistribución, metabolismo y velocidades de expresión de cada fármaco, así como de otros factores conocidos por aquellos expertos en la técnica. Debe notarse que los valores de la dosis también variarán con la severidad de la condición a ser aliviada. Debe comprenderse además que para cualquier sujeto particular, regímenes y programas de dosificación específico deberán ser ajustado con el tiempo de acuerdo a las necesidades individuales y el juicio profesional de la persona que administre o supervise la administración de las composiciones. Los ejemplos de intervalos de dosis adecuados pueden encontrarse en la literatura científica y en el Physicians Desk Reference. Muchos ejemplos de intervalos de dosis adecuados para otros compuestos aquí también se encuentran en la literatura pública o pueden ser identificados utilizando procedimientos conocidos. Esos intervalos de dosis pueden ser modificados según se desee para lograr un resultado deseado. Los regímenes combinados y alternados descritos son útiles en la prevención y tratamiento de infecciones por VIH y otras condiciones relacionadas como el complejo relacionado con el SIDA (ARC) , linfadenopatía generalizada persistente (PGL) , condiciones neurológicas relacionadas con el SIDA, anticuerpo anti-VIH positivo y condiciones de VIH positivas, sarcoma de Kaposi, púrpura trombocitopémica e infecciones oportunistas. Además, esos compuestos o formulaciones pueden ser utilizadas profilácticamente para prevenir o retardar el progreso de la enfermedad clínica en individuos que son positivos al anticuerpo anti-VIH o antígeno del VIH o que han sido expuestos al VIH. También se ha descubierto que, por ejemplo, esta combinación de fármacos puede ser utilizada para tratar cepas de VIH resistentes al DAPD y resistentes al DXG . Las cepas de VIH resistentes al DAPD y DXG, después del tratamiento con la combinación de fármacos descrita, exhiben características de virus sensibles a fármacos. Además, los compuestos de acuerdo a la presente invención pueden ser administrados en combinación o de manera alternada con uno o más agentes antivirales, anti-HBV, anti-HCV o antiherpéticos o interferón, agentes anticáncer, antiproliferativos o antibacteriales, incluyendo otros compuestos de la presente invención, ciertos compuestos de acuerdo a la presente invención pueden ser efectivos para mejorar la actividad biológica de ciertos agentes de acuerdo a la presente invención reduciendo el metabolismo, catabolismo o inactivación de otros compuestos, y por lo tanto, son coadministrados para este efecto pretendido. Los ejemplos ilustrativos y no limitantes de la presente invención son proporcionados a continuación. Esos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención.

V. Ribavirina en Combinación con DAPD La ribavirina (RBV) fue analizada in vitro por su actividad contra el VIH-1 y por sus efectos sobre la actividad anti-VIH in vitro de dos análogos de dGTP, DAPD y DXG. La RBV también fue evaluada por su citotoxicidad por la linea celular adaptada en el laboratorio MT2 y en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . La RBV es un inhibidor de la enzima IMP deshidrogenasa . Esta enzima es parte de la vía utlizada por células para la síntesis de novo de GTP.

Ensayos de Citotoxicidad: La RBV fue probada por su citotoxicidad en la linea de células T adaptada en laboratorio MT2 y en PBMC utilizando un ensayo basado en XTT. El ensayo con XTT (hidróxido de 2 , 3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfoxifenil) -5 [ (fenilamino) carbonil] -2H-tetrazolio) es un ensayo de citoprotección colorimétrico in vitro. La reducción de XTT por las deshidrogenasas de las mitocondrias da como resultado la escisión del anillo de tetrazolio del XTT, produciendo cristales de formazan anaranjados, los cuales son solubles en solución acuosa. La solución anaranjada resultante fue leida en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 450 nM. La RBV fue preparada en DMSO al 100% a una concentración final de 100 mM. Para los ensayos de citotoxicidad, se preparó una solución 2 mM de RBV en medios e cultivo celular (RPMI suplementado con 10% de suero de carnero fetal, L-Glutamina 1 mg/ml y 20 µg/ml de gentamicina) seguido por diluciones en serie de 2 veces sobre una placa de 96 pozos. Las células fueron agregadas a la placa de 3xl04/pozo (MTX) y 2xl05/pozo (PMBC) y las placas fueron incubadas durante 5 dias a 37 °C en. un incubador con 5% de C02 (la adición de las células a la placa diluyó el compuesto a una concentración alta final de 1 mM) . Al final de la incubación de 5 dias, se agregó XTT a cada pozo y se incubó a 37 °C durante 3 horas seguido por la adición de isopropanol acidificado. La placa fue leída a 450 nm en un lector de placa de 96 pozos. Se generó una curva de respuesta a la dosis utilizando los valores de absorción de las células que crecieron en ausencia del compuesto como protección del 100%. La RBV no fue tóxica en los ensayos a una concentración de hasta 1 mM, Tabla 1.

Tabla 1. Citotoxicidad de RBV Ensayos de Sensibilidad Ensayo de XXT La RBV fue probada por su actividad contra la cepa de xxLAI del VIH-1 en la línea celular adaptada en el laboratorio MT2. Se hicieron diluciones de RBV en medios de cultivo celular en una placa de 96 pozos; la concentración más alta probada fue de 100 µ?. Se probaron muestras por triplicado del compuesto. Las células MT2 fueron infectadas con xxLAI con una multiplicidad de infección (MOI) de 0.03 durante 3 horas a 37 °C en 5% de C02. Las células infectadas fueron cultivadas a 3.0xl04/pozo en una placa de 96 pozos que contenia diluciones de fármaco y se incubaron durante 5 días a 37 °C en CO2. La actividad antiviral de la RBV fue determinada utilizando el ensayo de XTT descrito anteriormente. Este método ha sido modificado en un ensayo de susceptibilidad y ha sido utilizado en una variedad de pruebas antivirales in vitro y es fácilmente adaptable a cualquier sistema con un virus lítico (Weislow, O.S., et . al. 1989). Utilizando los valores de absorción de los controles celulares como protección del 100% y sin fármaco, las células infectadas por el virus como 0% de protección, se generó una curva de respuesta a la dosis graficando el % de protección sobre el eje de las Y y la concentración de fármaco sobre el eje de las X. De esta curva se determinaron los valores de CE50. La RBV no fue activa contra el VIH-1 en esos ensayos en alguna de las concentraciones probadas.

Ensayo de P24 La RBV también fue probada por su actividad contra la cepa de xxLAI del VIH-1 en PBMC utilizando un ensayo de ELISA basado en p24. En este ensayo, se incubaron sobrenadantes celulares sobre pozos de microelisa recubiertos con anticuerpos para el antigeno del núcleo de p24 de VIH-1. Posteriormente, se agregó conjugado de anti-VIH-1 marcado con peroxxdasa de rábano. El anticuerpo marcado se unió a los complejos anticuerpo/antigeno en fase sólida previamente formados. La adición del sustrato de tetrametilbencidina da como resultado la formación de un color azul. El color se tornó a amarillo cuando la reacción se detuvo. Las placas fueron entonces analizadas sobre un lector de placas calibrado a 490 nm. La absorbancia es una medición directa de una cantidad de VIH-1 producida en cada pozo y una disminución en el color indica producción viral. Se hicieron diluciones de RBV en medios de cultivo celular en una placa de 96 pozos, la concentración más alta de RBV probada fue de 100 µ?. Las PBMC se obtuvieron de donadores negativos a VIH-1 por la formación de bandas sobre gradientes de ficol, estimuladas con fitohemaglutinina (PHAP) durante 48 horas antes de la infección con VHI-1, e infectadas con virus durante 4 horas a 37 °C a una MOI de 0.0001. Las células infectadas fueron sembradas en placas de 96 pozos que contenían diluciones en serie de 5 veces de RBV. Las placas fueron incubadas durante 3 días a 37 °C. La concentración de virus en cada pozo fue determinada utilizando el ensayo de p24 de NEN. Utilizando los valores de absorción de los controles celulares como protección del 100% y libre de fármacos, las células infectadas con virus como una protección de 0%, se generó una curva de respuesta a la dosis graficando el por ciento de protección sobre el eje de las Y y la concentración de fármaco . sobre el eje de las X. De esta curva, se determinaron los valores de CE50. La RBV inhibió la reproducción de VIH-1 en PBMC con una CE50 media de 20.5 µ? + 11.8.

Ensayos de Combinación Se evaluaron los efectos de RBV sobre la actividad anti-VIH-1 in vitro de DAPD y DXG utilizando los ensayos de MT2/XTT y PBMC/p24 descritos anteriormente. También se analizaron los efectos de la RBV sobre la actividad de la Abacavir y la AZT.

Ensayos de MT2/XTT Se efectuaron ensayos de combinación utilizando varias concentraciones de DAPD, DXG, ABACAVIR y AZT solos o con una combinación fija de RBV. Se efectuaron diluciones en serie de cinco veces del compuesto de prueba sobre placas de 96 pozos con las siguientes concentraciones de fármaco: 100 µ? de DAPD, 50 µ de DXG, 20 µ? de Abacavir y 10 µ? de AZT. Las concentraciones de RBV utilizadas fueron de 1, 5, 10, 20 40 y 60 µ?. Los ensayos se efectuaron en la linea celular MT2 como se describió anteriormente en la sección del ensayo de sensibilidad XXT. Se encontró que la adición de 40 y 60 uM de RBV, en combinación con los compuestos listados anteriormente era tóxica en esos ensayos, por lo tanto, los valores de EC50 para los compuestos fueron determinados en presencia y ausencia de 1, 5, 10 y 20 µ? de RBV (Tabla 2) .

Tabla 2. Efectos de la RBV sobre la actividad antiviral de DAPD, DXG, Abacavir y AZT en células MT2 Valores de CE50 Media (µ?) * número de réplicas La adición de 1, 5, 10 y 20 µ? de RBV hizo disminuir los valores de CE50 obtenidos para DAPD y DXG. La Tabla 3 ilustra las diferencias del doble en los valores de CE50 obtenidas para cada uno de los compuestos en combinación con RBV.

Tabla 3. Diferencias del doble en los valores de CE50 en combinación con RBV en células MT2 La adición de 20 µ? de RBV tuvo el mayor efecto sobre la' actividad antiviral de DAPD y DXG con una disminución de 14.2 y 12 veces en los valores de CE50 aparente, respectivamente. La adición de RBV no tuvo efecto (una diferencia de menos de 2 veces en la CE50 aparente) sobre la actividad del Abacavir. La adición de 20 µ? de RBV dio como resultado un incremento de más de 6 veces la CE50 aparente de la AZT indicando que la combinación es antagonista con respecto a la inhibición del VIH. Se obtuvieron resultados similares con la adición de 1, 5 y 10 µ? de RBV, aunque en un grado menor que el observado con la mayor concentración de RBV.

Matantes del VIH-1 resistentes a DAPD También se analizó el efecto de la RBV sobre la actividad del DAPD y DXG contra cepas mutantes de VIH (Tabla 4). Las cepas resistentes analizadas incluyeron virus creados por mutagénesis dirigida al sitio, K65R y L74V, asi como un virus recombinante que contiene mutaciones en las posiciones 98S, 116Y, 151M y 215Y. El esqueleto natural del cual esos mutantes fueron creados, xxLAI, también fueron analizados por comparación. Las concentraciones de DAPD y DXG probadas fueron como se describió en la sección del ensayo de combinación de T2/XTT. La RBV fue probada en combinación con DAPD y DXG a una concentración fija de 20 µ? . Los virus mutantes probados demostraron todos un incremento en los valores de CE50 (de más de cuatro veces) para ambos del DAPD y DXG indicando resistencia a esos compuestos la adición de 20 µ? de RBV hizo disminuir los valores de CE50 del DAPD y DXG contra esos virus. Los valores de CE50 determinados para DAPD y DXG en presencia de 20 µ? de RBV fueron de al menos 2.5 veces menores que aquellos obtenidos por el virus natural. Esos resultados se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Efectos de la RBV sobre la actividad antiviral de DAPD y DXG: Virus Resistentes valores de CE50 (µ?) a [RBV] =20 µ? bindica la diferencia en veces de WT Ensayos de PBM /p24. También se efectuaron ensayos de combinación en PBMC utilizando varias concentraciones de DAPD, DXG, Abacavir y AZT solos o con una concentración fija de RBV. Las dilusiones de los compuestos y las condiciones de ensayo fueron como se describieron anteriormente. Las concentraciones de RBV utilizadas fueron 1, 5, 10, 20, 40 y 60 µ?. Se encontró que la adición de 40 y 60 µ? de RBV, en combinación con los de RBV se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Efectos de la RBV sobre la actividad antiviral de DAPD, DXG, Abacavir y AZT en PMBC Valores de CE50 media (µ?) a= número de replicas La adición de 1 µ? de RBV resultó en una ligera disminución (menos de 3 veces) en la CE50 de DAPD y DXG y Abacavir, pero no tuvo efecto sobre el valor de la CE50 obtenida para la AZT . Esos efectos se volvieron más pronunciados con el incremento de las concentraciones de RBV. La Tabla 6 ilustra las diferencias en veces de los valores de CE50 obtenidas para cada uno de los compuestos en combinación con 1, 5, 10 y 20 µ? de RBV.

Tabla ß. Diferencias en veces de los valores con RBV La RBV inhibió la reproducción del VIH-1 en PBMC con una CE50 de 20.5 µ?. La ribavirina no fue tóxica a esas células a concentraciones de hasta 1 mM dando como resultado un índice terapéutico de >48. La adición de 20 µ? de RBV a DAPD, DXG y Abacavír inhibió completamente la reproducción del VIH en PBMC a todas las concentraciones probadas pero tuvo poco efecto sobre la actividad de la AZT. La adición de concentraciones menores de RBV también tuvo un efecto significativo sobre la actividad de DAPD, DXG y Abacavir. En la línea celular MT2, la RBV no fue activa contra la reproducción del VIH. La adición de 20 µ de RBV hizo disminuir la CE50 aparente del DAPD y DXG, 14.2 y 12 veces respectivamente. La adición de 20 µ? de RBV no tuvo efecto sobre la actividad del Abacavir y dio como resultado un incremento de 6 veces en la CE50 aparente de la AZT indicando que la combinación es antagonista con respecto a la inhibición del VIH. Se obtuvieron resultados similares en MT2 con la adición de 5 y 10 µ? de RBV, aunque en un grado menor que el observado con la mayor concentración de RBV. Cuando se probó contra cepas mutantes de VIH-1, la combinación de 20 µ? de RBV con DAPD o DXG hizo diminuir los valores de CE50 de esos compuestos a menos que aquellos observados con el virus natural, es decir las cepas de virus previamente resistentes son ahora sensibles a la inhibición por DAPD y DXG. Weislow, O.S., R. iser, D.L. Fine, J. Bader, R.H. Shoemaker, y M. R. Boyd. 1989. Nuevo ensayo con formación soluble para los efectos citopáticos del VIH-1: Aplicación a la selección de flujo alto de productos sintéticos y naturales para la actividad antiviral del SIDA. J. of NCI . 81:577-586.

VI . Acido Micofenolico en Combinación con DAPD Se analizó el ácido micofenolico (MPA) in vitro por su actividad -contra el VIH-1 y por sus efectos sobre la actividad anti-VIH in vitro de dos análogos de dGTP, DAPD y DXG. El MPA también fue evaluado por su citotoxicidad en la linea celular NT2 adaptada en el laboratorio y en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . El MPA es un inhibidor de la enzima IMP deshidrogenasa . Esta enzima es parte de la via utilizada por las células para la síntesis de novo de GTP. También se efectuaron ensayos de combinación con Abacavir, AZT y FTC.

Ensayos Citotóxlcos: Se probó el MPA por su citotoxicidad sobre la línea de células T MT2 adaptada en el laboratorio y en PBMC utilizando un ensayo basado en XTT. El ensayo de XTT (hidróxido de 2, 3-bis (2~metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -5 [ (fenilamino) carbonil] -2H-tetrasolio) es un ensayo de citoprotección colorimétrico in vitro. La reducción de XTT por las deshidrogenasas de las mitocondrias da como resultado la escisión del anillo de tetrasodio de XTT, produciendo cristales de formazan anaranjados, los cuales son solubles en solución acuosa. La solución anaranjada resultantes es leída en un espetrofotometro a una longitud de onda de 450nM. El MPA fue preparado en DMSO al 100% a una concentración final de lOOmM. Para los ensayos de citotoxicidad, se preparó una solución de MPA a 200 µ? en medios de cultivo celular (RPMI suplementado con 10% de suero de carnero fetal, 1 mg/ml de L-Glutamina y 20 ug/ml gentamicina) seguido por dilusiones en serie de 2 veces sobre una placa de 96 pozos. Las células fueron agregadas a la placa a 3xl04/pozo (MTX) y 2xl05/pozo (PBMC) y las placas fueron incubadas durante 5 dias a 37 °C en un incubador con 5% de CO2 (la adición de las células a la placa dividió el compuesto a una concentración alta final de 100 µ?) . Al final de la incubación de 5 dias, se agregó XTT a cada pozo y se incubó a 37 °C durante 3 horas seguido por la adición de isopropanol acidificado. La placa fue leída a 450nm en un lector de placas de 96 pozos. Se generó una curva de respuesta a la dosis utilizando los valores de absorción de las células que crecieron en ausencia del compuesto como protección del 100%. El MP7A fue tóxico en ambas líneas celulares con una dosis citotóxica del 50% (CC50) de 5.7 µ? en la línea celular MT2 y 4.5 µ? en PBMC. Véase la Tabla 7.

Tabla 7. Citotoxicidad del MPA Ensayos de Sensibilidad Ensayo de XXT El MPA fue probada por su actividad contra la cepa de xxLAI del VIH-1 en la línea celular MT2 adaptada en el laboratorio. Se hicieron diluciones de MPA en medios de cultivo celular en una placa de 96 pozos; la concentración más alta probada fue de 1 µ? . Se probaron muestras por triplicado del compuesto. Las células MT2 fueron infectadas con xxLAI a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.03 durante 3 horas a 37°C en 5% de CO2. Las células infectadas fueron cultivadas a 3.0xl0 /pozo en una placa de 96 pozos que contenia diluciones de fármaco y se incubaron durante 5 dias a 37 °C en CO2. La actividad antiviral del MPA se determinó utilizando el ensayo de XTT descrito anteriormente. Este método ha sido modificado en un ensayo de susceptibilidad y ha sido utilizado en una variedad de pruebas antivirales in vitro y es fácilmente adaptable a cualquier sistema con un virus Utico ( eislo , O.S., et . al. 1989). Utilizando los valores de absorción de las células control como protección del 100% y sin fármaco, las células infectadas por el virus como una protección del 0%, se generó una curva de respuesta a la dosis graficando el % de protección sobre el eje de las Y y la concentración de fármaco sobre el eje de las X. Para esta curva se determinaron los valores de CE50. El MPA no fue activo contra el VIH-1 en esos ensayos y a ninguna de las concentraciones probadas.

Ensayo de P24 También se probó el MPA por su actividad contra la cepa de xxLAI del VIH-1 en PBMC utilizando un ensayo de ELISA basado en p24. En este ensayo, los sobrenadantes celulares son incubados sobre pozos de microelisa recubiertos con anticuerpos para el antigeno del núcleo de p24 del VIH-1. Posteriormente, se agregó conjugado de anti-VIH-1 marcado con peroxidasa de rábano. El anticuerpo marcado se une a los complejos anticuerpo/antigeno en fase sólida previamente formados. La adición del sustrato de tetrametilbencidina da como resultado la formación de un color azul. El color se torna a amarillo cuando la reacción se detiene. Las placas fueron entonces analizadas sobre un lector de placas calibrado a 490 nm. La absorbancia es una medición directa de una cantidad de VIH-1 producida en cada pozo y una disminución en el color indica disminución en la producción viral. Se hicieron diluciones de MPA en medios de cultivo celular en una placa de 96 pozos, la concentración más alta de MPA probada fue de 1 µ?. Las PBMC se obtuvieron de donadores negativos al VIH-1 por la formación de bandas sobre gradientes de ficol, estimuladas con fitohemaglutinina (PHAP) durante 48 horas antes de la infección con VHI-1, e infectadas con virus durante 4 horas a 37 °C a una MOI de 0.0001. Las células infectadas fueron sembradas en placas de 96 pozos que contenían diluciones en serie de 5 veces de ???. Las placas fueron incubadas durante 3 días a 37 °C. La concentración de virus en cada pozo fue determinada utilizando el ensayo de p24 de NEN. Utilizando los valores de absorción de los controles celulares como una protección del 100% y libre de fármaco, las células infectadas con virus como una protección del 0%, se generó una curva de respuesta a la dosis graficando el por ciento de protección sobre el eje de las Y y la concentración de fármaco sobre el eje de las X. De esta curva, se determinaron los valores de CE50- El MPA inhibió la reproducción de VIH-1 en PBMC con una CE50 media de 95 nM + 29. Ensayos de Combinación Se evaluaron los efectos de MPA sobre la actividad anti-VIH-1 in vitro de DAPD y DXG utilizando los ensayos de MT2/XTT y PBMC/p24 descritos anteriormente. También se analizaron los efectos de la RBV sobre la actividad de la Abacavir y la AZT y FTC. Ensayos de MT2/XTT Se efectuaron ensayos de combinación utilizando varias concentraciones de DAPD, DXG, Abacavir, AZT y FTC solos o con una concentración fija de MPA. Se efectuaron diluciones en serie de cinco veces del compuesto de prueba sobre placas de 96 pozos con las siguientes concentraciones de fármaco: DAPD - 100 µ?, DXG - 50 µ?, Abacavir - 20 µ? y AZT - 10 µ? y FTC- 10 µ?. las concentraciones de MPA utilizadas fueron de 1, 0.5, 0.25, 0.1 y 0.01 µ . Los ensayos se efectuaron en la linea celular MT2 como se describió en la sección 3.1. Se encontró que la adición de 1 y 0.5 µ? de MPA, en combinación con los compuestos listados anteriormente, era tóxica en esos ensayos, por lo tanto, los valores de EC50 para los compuestos fueron determinados en presencia y ausencia de 0.25, 0.1 y 0.01 µ? de MPA (Tabla 8) .

Tabla 8. Efectos del ??? sobre la actividad antiviral de DAPD, DXG, Abacavir, AZT y FTC en células MT2 Valores de CE50 (µ ) a= número de réplicas La adición de 0.01 µ? de MPA no tuvo efecto sobre los valores de CE50 obtenidos para cualquiera de los compuestos. La Tabla 9 ilustra las diferentes de veces en los valores de CE50 obtenidos para cada uno de los compuestos en combinación con 0.1 y 0.25 µ? de MPA.

Tabla 9. Diferencias en veces de los Valores CE50 en combinación con MPA en células MT2 La adición de 0.25 µ? de MPA tuvo el mayor efecto sobre la actividad antiviral del DAPD y de DXG con disminuciones de 16.7 y 10.5 veces en los valores de CE50 aparentes, respectivamente. La adición de 0.25 µ? de MPA tuvo poco efecto sobre la actividad del Abacavir y FTC, la disminución de menos de 2 veces en la CE50 aparente, dio como resultado un incremento de 2.3 veces en la CE50 aparente de la AZT indicando que la combinación es antagónica con respecto a la inhibición del VIH. Se obtuvieron resultados similares con la adición de 0.1 µ? de MPA, aunque en un grado menor que observado por la mayor concentración de MPA.

Matantes de VIH-1 Resistentes a DAPD También se analizó el efecto de MPA sobre la actividad del DAPD y DXG contra cepas mutantes de VIH (Tabla 10) . Las cepas resistentes analizadas incluyeron virus creados por mutagénesis dirigida al sitio, K65R y L74V, asi como un virus recombinante que contenia mutaciones en las posiciones 98S, 116Y, 151M y 215Y. El esqueleto natural en el cual esos mutantes fueron creados, xxLAI también fue probado por comparación. Las concentraciones de DAPD y DXG fueron probadas como se describió en la sección 4.11. El MAP fue probado en combinación con DAPD y DXG a una concentración fija de 0.25 µ?. El DAPD y el DXG fueron activos contra todas las cepas naturales de VIH probadas. Los virus mutantes probados demostraron todos valores de CE50 incrementados para el DAPD y DXG indicando 'resistencia a esos compuestos. La adición de 0.25 µ? de MPA hizo disminuir los valores de CE50 de DAPD y DXG contra esos virus. Esos valrores determinados por la DAPD y DXG en presencia de 0.25 µ? de MPA fueron similares a aquéllos obtenidos para el virus natural.

Tabla 10. Efecto del MPA sobre la Actividad Antiviral de DAPD y DXG: Virus Resistente Valores de CE50 (µ ) a[MPA]=0.25 µ b indica la diferencia en veces de WT Ensayos de PBMC/p24 También se efectuaron ensayos de combinación en PBMC utilizando varias concentraciones de DAPD, DXG, Abacavir, AZT y FTC solos o con una concentración fija de MPA. Las diluciones de los compuestos y las condiciones de ensayos fueron como se describieron anteriormente. Las concentraciones de MPA utilizadas fueron de 1, 0.5, 0.25, 0.1 y 0.01 µ?. Se encontró que la adición de 1 y 0.5 µ? de MPA, en combinación con los compuestos listados anteriormente, era tóxica en esos ensayos. Los valores de CE50 determinados para los compuestos en presencia y ausencia de 0.25, 0.1 y 0.01 µ? de MPA se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11. Efectos del MPA sobre la actividad antiviral del DAPD, DXG, Abacavir, AZT y FTC en PMBC Valores de CE50 media (µ?) a= número de réplicas La adición de 0.01 um de MPA hizo disminuir la CE50 para 'la DAPD y el DXG pero no tuvo efecto sobre los valores de CE50 obtenidos para el Abacavir, AZT y FTC (un cambio de menos de 2 veces en la CE50) . La adición de 0.1 y 0.25 µ? de MPA hizo disminuir la CE50 para la DAPD, DXG y Abacavir, pero no tuvo efecto sobre los valores de CE50 obtenidos para la AZT y FTC. La Tabla 12ilustra las diferencias en veces de los valores EC50 obtenidos para cada uno de los compuestos en combinación con 0.01, 0.1 y 0.25 µ? de MPA.

Tabla 12. Diferencias en Veces de los Valores de CE50 con MPA El ácido micofenólico inhibió la reproducción del VIH-1 en PBMC con un CE5o de 0.095 µ?. El valor de CC50 obtenido para el MPA en esas células fue de 4.5 µ? dando un índice terapéutico de 47. La adición de 0.25 µ? de MPA al DAPD, DXG y Abacavir inhibió completamente la reproducción del VIH en PBMC a todas las concentraciones probadas pero tuvo poco efecto sobre la actividad del AZT y FTC (cambio de menos de 2 veces en la EC50) - La adición de concentraciones más bajas de MPA también tuvo un efecto significativo sobre' la actividad del DAPD, DXG, pero tuvo poco efecto sobre la actividad del Abacavir, AZT y FTC. En la linea celular MT2, el MPA no tuvo actividad contra la reproducción del VIH. La adición de 0.25 µ? de MPA hizo disminuir la CE50 aparente del DAPD y DXG, 16.7 y 10.5 veces respectivamente. La adición de 0.25 µ? de ??? tuvo poco efecto sobre la actividad del Abacavir y el FTC dio como resultado un incremento de 2.3 veces en la CE50 aparente para la AZT indicando que la combinación es antagonista con respecto a la inhibición del VIH. Se obtuvieron resultados similares en MT2 con la adición de 0.1 µ? de MPA, aunque en un grado menor que el otorgado con la mayor concentración de MPA. Cuando se probó contra las cepas de VIH-1 mutantes, la combinación de 0.25 MPA con DAPD o DXG hizo disminuir los valores de CE50 de esos compuestos a menos que aquéllos observados con el virus natural, es decir, que las cepas de virus previamente resistentes son ahora sensibles a la inhibición por DAPD y DXG.

Concentració de DXG-TP en PBMC Se evaluó el efecto del ácido micofenólico sobre la concentración intracelular de trifosfato de DXG (DXG-TP) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) . Las PBMC se obtuvieron de donadores negativos al VIH, estimulados con fitohemaglutinina, y se incubaron a 37 °C en medios completos suplementados con varias concentraciones de DXG (5 µ? ó 50 µ? en presencia o ausencia de 0.25 µ? de ácido micofenólico). Las PBMC fueron cosechadas después de 48 ó 72 horas de incubación y los niveles de DXG-TP intracelulares determinados por 1C-MS-MS como se describe más adelante. La adición de 0.25 µ? de ácido micofenólico incrementó la concentración media de DXG-TP intracelular en 1.7 veces en comparación con los niveles en las células incubadas con DXG únicamente. El método bioanalitico para el análisis de DXG-TP de células mononucleares de sangre periférica utiliza la extracción en fase sólida por pares de iones (SPE) y la CLAP por pares de iones acoplada a la espectrometría de masas por ionización por electrorrocío (ESI) . Muestras de PB C sedimentadas que contienen aproximadamente 0.5 X 107 células son diluidas con una solución que contiene el estándar interno (2' , 3' -didesoxicitidin-5' -trifosfato (ddCTP) ) y el DXG-TP y ddCTP son extraídos selectivamente utilizando SPE por pares de iones sobre un cartucho C-18. El DXG-TP y el ddCTP son separados con CLAP por pares de iones de microboros sobre una columna analítica aters Xterra MS C18 con tiempos de retención de aproximadamente 10 minutos. Los compuestos de interés son detectados en el modo positivo por ESI-MS/MS sobre un espectómetro de masas de triple cuadrupolo Micromass Quattro LC. Mientras se analizan muestras de PBMC con DXG-TP, seis puntos, 1/x2 ponderado, se utilizan curvas de calibración, que fluctúan de 0.08 a 1.65 pmoles/106 células, para cuantificar las muestras. Típicamente, muestras de control de calidad (QC) , a dos concentraciones (0.008 y 1.65 pmoles/106 células), son analizadas por duplicado en cada ensayo analítico para verificar la exactitud del método. El método bioanalítico tiene una' eficiencia de extracción reproducible de aproximadamente el 80%. La cuantificación de (LOQ) es de 0.008 pmoles/106 células. El intervalo del ensayo es de 0.008 a 1.65 pmoles/106 células . Esta invención ha sido descrita con referencia a sus modalidades preferidas. Las variaciones y modificaciones de la invención, serán obvias a aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción detallada de la invención. Se pretende que todas esas variaciones y modificaciones sean incluidas dentro del alcance de esta invención.

Claims (37)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiéndose descrito 3.a invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REI INDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un hospedero, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de una ß-D-l , 3-dioxolanil purina de la fórmula: o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, donde R es H, OH, Cl, NH2 o NRV R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo o cicloalquilo, y R3 es H, alquilo, arilo, acilo, fosfato, incluyendo monofosfato, difosfato o trifosfato o una entidad de fosfato estabilizada, incluyendo un fosfolípido, o una combinación de un eterlipido con al menos un inhibidor de la inosino monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) , opcionalmente en un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la ß-?-1,3-dioxolanil purina es la (-) - (2R, 4R) -2-amino-9- [ (2-hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-il] -adenina (DAPD) .

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la ß-?-1,3-dioxolanil purina es la (-) - (2R, 4R) -9- [ (2-hidroxímetil) -1, 3-dioxolan-4~il] -guanina (DXG) .

4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el inhibidor de la IMPDH es seleccionado del grupo que consiste de ribavirina, ácido micofenólico, ribosido de benzamida, tiazofurin, selenazofurin, 5-etinil-l- -D-ribofuranosilimidasol-4-carboxamida (EICAR) y tetrahidrofuran-3-il-éster del ácido (S) -N-3- [3- (3-metoxi-4-oxazol-5-il-fenil) -ureido] -bencil-carbámico (VX-497) .

5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque los inhibidores de la IMPDH es ácido micofenólico .

6. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque los inhibidores de la IMPDH es ribavirina.

7. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la ß-?-1,3-dioxolanil purina está enriquecida enantioméricamente .

8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, en un excipiente farmacéuticamente aceptable para liberación oral.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, en un excipiente farmacéuticamente aceptable para liberación intravenosa.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, en un excipiente farmacéuticamente aceptable para liberación parenteral.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, en un excipiente farmacéuticamente aceptable para liberación tópica.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 1, en un excipiente farmacéuticamente aceptable para liberación sistémica.

13. Un método para el tratamiento o profilaxis de una infección por una cepa de VIH resistente a fármacos en un hospedero, caracterizado porque comprende una cantidad efectiva de una ß-D-l , 3-dioxolanil purina de la fórmula: o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, donde R es H, OH, Cl, NH2 o NÍ^R2; R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo o cicloalquilo, y R3 es H, alquilo, arilo, acilo, fosfato, incluyendo monofosfato, difosfato o trifosfato o una entidad de fosfato estabilizada en combinación o alternada con un inhibidor de la inosino monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) , opcionalmente en un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la ß-?-1,3-dioxolanil purina es la (-) - (2R, R) -2-amino-9- [ (2-hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-il] -adenina (DAPD) .

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la ß-?-1,3-dioxolanil purina es la (-) - (2R, 4R) -9- [ (2-hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-il] -guanina (DXG) .

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-15, caracterizado porque el inhibidor de la IMPDH es seleccionado del grupo que consiste de ribavirina, ácido micofenólico, ribosido, de benzamida, tiazofurin, selenazofurin, 5~etinil-l-p-D-ribofuranosilimidasol-4-carboxamída (EICAR) y tetrahidrofuran-3-il-éster del ácido (S) -N-3- [3- (3-metoxi-4-oxazol-5-il-fenil) -ureido] -bencil-carbárnico (VX-497) .

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los inhibidores de la IMPDH es ácido micofenólico .

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los inhibidores de la IMPDH es ribavirina.

19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la infección por VIH es resistente al DAPD y/o DXG.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13-19, caracterizado porque el hospedero es un humano.

21. Un método para el tratamiento o profilaxis de la infección por una VIH en un hospedero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de una ß-D-l , 3-dioxolanil purina de la fórmula: o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, donde R es H, OH, Cl, NH2 o NR1^; R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo o cicloalquilo, y R3 es H, alquilo, arilo, acilo, fosfato, incluyendo monofosfato, difosfato o trifosfato o una entidad de fosfato estabilizada en combinación o alternada con un inhibidor de la inosino monofosfato deshidrogenase (IMPDH) , opcionalmente en un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la ß-?-1,3-dioxolanil purina es la (-) - (2R, 4R) -2-amino-9- [ (2-hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-il] -adenina (DAPD) .

23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la ß-?-1,3-dioxolanil purina es la (-) - (2R, 4R) -9- [ (2-hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-íl] -guanina (DXG) .

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, caracterizado porque el inhibidor de la IMPDH es seleccionado del grupo que consiste de ribavirina, ácido micofenólico, ribosido de benzamida, tiazofurin^ selenazofurin, 5-etinil-l-p-D- ribofuranosilimidasol-4-carboxamida (EICAR) y tetrahidrofuran-3-il-éster del ácido (S) -N-3- [3- (3- metoxi-4-oxazo1-5-i 1-feni1 ) -ureido] -bencil-carbámico (VX- 497) .

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque los inhibidores de la IMPDH es ácido micofenólico .

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque los inhibidores de la IMPDH es ribavirina.

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-26, caracterizado porque el hospedero es un humano.

28. El uso de una cantidad efectiva de una ß- D-l, 3-dioxolanil purina de la fórmula: o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, donde R es H, OH, Cl, NH2 o ^R2; R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo o cicloalquilo, y R3 es H, alquilo, arilo, acilo, fosfato, incluyendo monofosfato, difosfato o trifosfato o una entidad de fosfato estabilizada en combinación o alternada con un inhibidor de la inosino monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) , opcionalmente en un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable para uso en terapia médica.

29. El uso de una cantidad efectiva de una ß-D-1 , 3-dioxolanil purina de la fórmula: o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, donde R es H, OH, Cl, NH2 o NR1R2 ; R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo o cicloalquilo, y R3 es H, alquilo, arilo, acilo, fosfato, incluyendo monofosfato, difosfato o trifosfato o una entidad de fosfato estabilizada en combinación o alternada con uno o más inhibidores efectivos de la inosino monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) , opcionalmente en -un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un hospedero.

30. El uso de una cantidad efectiva de una ß-D-1, 3-dioxolanil purina de la fórmula: o su sal o profármaco farmacéuticamente aceptable, donde R es H, OH, Cl, NH2 o NF^R2 ; R1 y R2 son independientemente hidrógeno, alquilo o cicloalquilo , y R3 es H, alquilo, arilo, acilo, fosfato, incluyendo monofosfato, difosfato o trifosfato o una entidad de fosfato estabilizada, en combinación o alternada con uno o mas inhibidores efectivos de la inosino monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) , opcionalmente en un excipiente o diluente farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una infección por VIH en un hospedero.

31. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, donde la ß-D-l, 3-dioxolanil purina es la (-) - (2R, R) -2~amino-9- [ (2-hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-il] -adenina (DAPD) .

32. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, donde la ß-D-l, 3-dioxolanil purina es la (-) - (2R, 4R) -9- [ (2-hidroximetil) -1, 3-dioxolan-4-il] -guanina (DXG) .

33. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, donde el inhibidor de la IMPDH es seleccionado del grupo que consiste de ribavirina, ácido micofenólico, ribosido de benzamida, tiazofurin, selenazofurin, 5-etinil-l-p-D-ribofuranosilimidasol-4-carboxamida (EICAR) y tetrahidrofuran-3-il-éster del ácido (S) -N-3- [3- (3-metoxi-4-oxazol-5-il-fenil ) -ureido] -bencil-carbámico (VX-497) .

34. El uso de conformidad con las reivindicaciones 29 ó 30, donde los inhibidores de la IMPDH es ácido micofenólico .

35. El uso de conformidad con las reivindicaciones 29 ó 30, donde los inhibidores de la IMPDH es ribavirina.

36. El uso de conformidad con las reivindicaciones 29 ó 30, donde la infección por VIH es resistente al DAPD y/o DXG.

37. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-36, donde el hospedero es un humano.