MXPA02010869A - Anticuerpos monoclonales humanos para celulas dendriticas. - Google Patents

Anticuerpos monoclonales humanos para celulas dendriticas.

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Abstract

Se divulgan anticuerpos monoclonales humanos aislados y porciones de union con antigeno de los mismos que se unen especificamente a celulas dendriticas. Se divulgan tambien conjugados de inmunotoxinas y antigeno bi-especificos que incluyen los anticuerpos o porciones de anticuerpos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos en un animal transgenico no humano, por ejemplo, un raton transgenico capaz de producir multiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos mediante recombinacion V-D-J e intercambio de isotipos. Se divulgan tambien composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos humanos, animales transgenicos no humanos e hibridomas que producen los anticuerpos humanos, y metodos terapeuticos y de diagnostico para utilizar los anticuerpos humanos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA CÉLULAS DENDRITICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células dendriticas son células especializadas del sistema inmunológico con la capacidad única de iniciar respuestas de linfocitos T y B primarias y secundarias. Caracterizadas co o células de presentación de antigeno profesionales (APCs), las células dendríticas expresan MHC y moléculas co-estimuladoras esenciales en el cebado de linfocitos T aives. Esta propiedad única de las células dendríticas, que se conoce también como "ayudante de la naturaleza", ha provocado un gran interés por su posible función en las enfermedades auto-inmunológicas así como por su potencial de explotación en la inmunoterapia de varias enfermedades . Avances recientes en el cultivo de células dendríticas han incrementado en gran medida nuestra comprensión de este tipo complejo de células. Existen varios tipos de células dendríticas que se distinguen por su linaje, localización en tejidos, fenotipo, y función. El tipo de células dendríticas que se asocia de manera más prominente con los linfocitos T para el inicio de respuestas inmunológicas es de origen de médula ósea. Las células dendríticas derivadas de médula ósea pueden ser segregadas adicionalmente en 1) células dendríticas tímicas que son de origen linfoide y parecen estar involucradas específicamente en la deleción de linfocitos T en proceso de maduración, 2) células de Langerhans, que son del linaje de mieloide y tienen una función APC especializada en la piel, y 3) células dendríticas derivadas de linaje de mieloides encontradas particularmente en la sangre, bazo, y nodos linfáticos. Las características de las células dendríticas derivadas del linaje mieloide (incluyendo células de Langerhans) son las siguientes: 1) capacidad de absorción de antígenos, y procesamiento para presentación, 2) capacidad de migración selectiva en tejidos, y 3) capacidad de estimulación directa de linfocitos T (tanto naives como cebados) . A pesar de los avances recientes en la caracterización de células dendríticas, se sabe muy poco en cuando a los receptores específicos de células dendríticas o moléculas. Existen numerosas moléculas asociadas con células dendríticas que son compartidas con otras células mieloides y no mieloides, sin embargo, reactivos muy limitados están disponibles los cuales son específicos para células dendríticas. Reactivos, en particular anticuerpos, que reaccionan específicamente o de manera preferente con células dendríticas tienen un potencial importante como agentes de enfoque para inducir respuestas inmunológicas potentes a antígenos de enfermedades infecciosas o tumores. Estos agentes de enfoque específico para células podrían ser también manipuladas para suministrar toxinas para eliminar APCs potentes (por ejemplo, células dendríticas) en trasplante de médula ósea y órgano, o bien otras enfermedades auto-inmunes. Por consiguiente, agentes de enlaces específicos para células dendríticas serían de gran valor terapéutico y de diagnóstico. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen específicamente a células de presentación de antígenos (APCs) y, en particular, células dendríticas, así como composiciones que contienen tales anticuerpos, ya sea solos o combinados (por ejemplo, mezclados o unidos) con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por consiguiente, los anticuerpos y composiciones de la presente invención pueden ser utilizados en varias terapias marcadas por células dendríticas, por ejemplo, para lograr la presentación de antígenos o bien para tratar enfermedades mediadas por APC. En ciertas modalidades, los anticuerpos humanos se caracterizan por un enlace de alta afinidad con células dendríticas, y por su capacidad de afectar el crecimiento de células dendríticas y/o función mediante el enfoque de moléculas o células con funciones definidas (por ejemplo, célula tumoral, bacteria, virus, o célula efectora) a células dendríticas. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención pueden utilizarse como agentes de diagnóstico o terapéuticos ín vivo e in vi tro. En otras modalidades, los anticuerpos humanos se caracterizan por su unión con epítopos novedosos particulares (por ejemplo, receptores) en células dendríticas. En otras modalidades, los anticuerpos humanos se caracterizan por su unión con el receptor de mañosa de macrófago, o bien un receptor relacionado. Anticuerpos humanos aislados de la presente invención abarcan varios isotipos de anticuerpos como por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Típicamente, incluyen los isotipos IgCl (por ejemplo, IgGlK) e IgM. Los anticuerpos pueden ser de longitud entera (por ejemplo un IgGl o IgG4) o bien pueden incluir solamente una porción de enlace de antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv, o bien un fragmento Fv de cadena única) . En una modalidad, los anticuerpos humanos son anticuerpos humanos recombinantes. En otra modalidad, los anticuerpos humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que contiene un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano fusionados sobre una célula inmortalizada. Anticuerpos humanos particulares de la presente invención incluyen los producidos por hibridomas conocidos aquí como A3, A5, A23, A24, A33, B9, Bll, B33, B47, C8, CIO, C20, C28, C29, C30, C35, El, E8, ElO, E18, E20, E21 y E24. En otra modalidad, anticuerpos humanos de la presente invención se caracterizan por una unión específica con células dendríticas y una o varias de las propiedades siguientes : una afinidad de enlace constante de por lo menos aproximadamente 107 M"1, de preferencia aproximadamente 109 M"1, y con mayor preferencia, aproximadamente 1010 M_1 a 1011 M_1 o más; una constante de asociación (Kassoc) de por lo menos aproximadamente 103, con mayor preferencia aproximadamente 104 y con mayor preferencia aproximadamente 105 M_1S_1; d) una constante de disociación (Kdis) de aproximadamente 10~3 s-1, de preferencia aproximadamente 10~4 s_1, con mayor preferencia, 10"5 s_1, y con mayor preferencia 10"6 s"1; e) la capacidad de opsonizar células dendríticas; f) la capacidad de internalizarse después de unión sobre células dendríticas; g) la capacidad de unirse con células dendríticas in si tu ( por ejemplo, en tejidos humanos); h) la capacidad de activar células dendríticas (por ejemplo, inducir la liberación de citocina, expresión de moléculas superficiales inmunomoduladoras); o i) la capacidad de inhibir el crecimiento y/o mediar la fagocitosis y matar células dendríticas en presencia de 5 células efectoras de ser humano en una concentración de aproximadamente 10 µl/ml o menos (por ejemplo, in • vi tro) . En una modalidad, anticuerpos humanos aislados de la presente invención se unen a células dendríticas con una constante de 10 afinidad de aproximadamente por lo menos 107 M"1. de preferencia aproximadamente 108 M-1, con mayor preferencia, • aproximadamente 109 M-1, y con mayor preferencia aproximadamente 1010 a 1011 M_1 o más fuerte. En otro aspecto, la invención ofrece moléculas de ácido 15 nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones de unión de antígeno, de la invención. Por consiguiente, los vectores de expresión recombinantes que incluyen los ácidos nucleicos codificadores de anticuerpos de la presente invención, y células huéspedes transfectadas con tales vectores, están 20 también contemplados dentro del marco de la presente invención, así como métodos para elaborar los anticuerpos de la invención mediante el cultivo de estas células huéspedes. En otro aspecto, la invención ofrece células B aisladas de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón 25 transgénico, que pueden expresar varios isotipos (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgM) de anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a células dendríticas. De preferencia, las células B aisladas son obtenidas a partir de un animal no humano transgénico como por ejemplo, un ratón transgénico, que ha sido inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de aproximadamente 104 y con mayor preferencia aproximadamente células dendríticas. De preferencia, el animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano. Las células B aisladas son después inmortalizadas para proporcionar una fuente (por ejemplo un hibridoma) de anticuerpos monoclonales humanos para células dendríticas . Por consiguiente, la presente invención ofrece también un hibridoma capaz de producir anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a células dendríticas. En una modalidad, el hibridoma incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende el transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano, fusionados sobre una célula inmortalizada. El animal no humano transgénico puede ser inmunizado con una separación purificada o enriquecida de células dendríticas para generar hibridomas que producen anticuerpos. Hibridomas particulares de la invención incluyen A3, A5, A23, A24, A33, B9. Bll, B33, B47, C8, CIO, C20, C28, C29, C30, C35, El, E8, ElO, E18, E20, E21 y E24. En otro aspecto, la invención proporciona un animal no humano transgénico como por ejemplo, un ratón transgénico (conocido también aquí como un "HuMab") , que expresa anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a células dendríticas. En una modalidad particular, el animal no humano transgénico es un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano. El animal no humano transgénico puede ser inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de células dendríticas. De preferencia, el animal no humano transgénico, por ejemplo, el ratón transgénico, puede producir isotipos múltiples de anticuerpos monoclonales humanos para células dendríticas (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgM) sometiéndose a recombinación V-D-J y cambio de isotipos. El cambio de isotipos puede ocurrir, por ejemplo, mediante cambio clásico o no clásico de isotipo. En otro aspecto, la presente invención ofrece métodos para producir anticuerpos monoclonales humanos que reaccionan específicamente con células dendríticas. En una modalidad, el método incluye la inmunización de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano, con una preparación purificada o enriquecida de células dendríticas. Células B (por ejemplo, células B esplénicas) del animal son después obtenidas y fusionadas con células de mieloma para formar células de hibridoma, inmortales que secretan anticuerpos monoclonales humanos contra células dendríticas. Anticuerpos monoclonales humanos aislados anti células dendríticas de la presente invención, o bien porciones de unión de antígeno de los mismos, pueden derivarse o enlazarse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab'). Por ejemplo, un anticuerpo o porción de unión de antígenos de la presente invención puede estar unida funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro tipo) con una o varias entidades moleculares como por ejemplo otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multi específico) . Por consiguiente, en un aspecto la presente invención presenta un anticuerpo de célula anti-dendrítica humano o un fragmento del mismo, conjugado a una porción terapéutica, por ejemplo, un fármaco citotóxico, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento de la misma, un radio isótopo o una pequeña molécula, por ejemplo, un compuesto inmunomodulador (por ejemplo, anti-inflamatorio) o bien un fármaco anti- cáncer. Anticuerpos anti-células dendríticas de ser humano de la presente invención pueden estar también unidos a un antígeno, de tal manera que el antígeno sea enfocado a células dendríticas que internalizan, procesan y presentan el antígeno. El antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno de célula tumoral, un antígeno microbiano, un antígeno viral o un auto-antígeno. En otro aspecto, la presente invención ofrece un método para inducir o incrementar una respuesta inmunológica contra un antígeno (por ejemplo, un antígeno de célula tumoral, un antígeno microbiano, o un antígeno viral) en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de un complejo molecular que comprende por lo menos una especificidad de enlace para un componente en la superficie de una célula dendrítica unida a por lo menos un antígeno, en donde el componente de la superficie de la célula dendrítica media la internalización del complejo molecular cuando está unido por especificidad de unión. En una modalidad, la respuesta inmunológica comprende anticuerpos que se unen al antígeno. En otra modalidad, la respuesta inmunológica comprende células T que se unen al antígeno, como componente de un complejo MHC-I o MHC-II. En un aspecto, el anticuerpo anti células dendríticas o un fragmento del mismo, puede emplearse para enfocar células enteras (por ejemplo, una célula tumoral, una célula efectora) o patógenos para células dendríticas para la inducción de una respuesta inmunológica. En una modalidad, una célula puede ser transfectada o transducida con una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti célula dendrítica de ser humano de la presente invención de tal manera que el anticuerpo anti célula dendrítica sea expresado en la superficie de la célula. En otra modalidad, un anticuerpo anti célula dendrítica de ser humano de la presente invención puede ser reticulado, anclado o etiquetado químicamente directamente o de otra manera sobre la superficie celular de una célula (por ejemplo, una célula tumoral, una bacteria o un virus) de tal manera que la célula pueda ser enfocada hacia células dendríticas. En un aspecto adicional, la invención ofrece un método para inmunizar un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad efectiva de un complejo molecular que comprende por lo menos la especificidad de enlace para un componente en la superficie de una célula dendrítica unida a por lo menos un antígeno, en donde el componente en la superficie de la célula dendrítica media la internalización del complejo molecular cuando está unido por especificidad de unión. En otro aspecto, la presente invención presenta una molécula biespecífica o multiespecífica que comprende por lo menos una primera especificidad de unión para células dendríticas y una segunda especificidad de unión de un receptor Fc, por ejemplo, un receptor Fc?RI de ser humano un receptor Fc de ser humano. En otro aspecto, la presente invención ofrece una molécula biespecífica o multiespecífica que comprende por lo menos una primera especificidad de unión de para células dendríticas y una segunda especificidad de unión para un antígeno en una célula blanco. Una célula blanco es una célula cuya eliminación sería benéfica para el huésped, por ejemplo, una célula tumoral, un patógeno microbiano, o un virus o una célula infectada con virus. Moléculas multiespecíficas de la presente invención incluyen también moléculas tri-específicas, tetra-específicas y otras moléculas multiespecíficas . En una modalidad, la molécula multiespecífica incluye una porción de factor anti-realce (EF) , por ejemplo, una molécula que se une a una proteína superficial involucrada en una actividad citotóxica. En una modalidad particular, moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención comprenden por lo menos un anticuerpo, o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena única). En una modalidad particular, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo totalmente humano o una porción del mismo, o bien un anticuerpo "quimérico" o un anticuerpo "humanizado" o una porción del mismo (por ejemplo, tiene una región variable, o bien por lo menos una región de determinación de complementaridad (CDR) , Que se deriva de un anticuerpo no humano (por ejemplo, murino) con la(s) porción (es) restante (s) siendo de origen humano). En una modalidad, el por lo menos un anticuerpo o fragmento del mismo de la molécula biespecífica o multiespecífica se une a un receptor Fc, como por ejemplo un receptor de IgG de ser humano, por ejemplo, uno receptor Fc-gamma (Fc?R) , como por ejemplo, FcyRI (D}CD64), Fc?RII (CD32) , y Fc?RIII (CD16) . Un receptor de Fc? preferido es el receptor Fc? de alta afinidad, FcyRI . Sin embargo, otros receptores Fc, como por ejemplo receptores de IgA de ser humano (por ejemplo FcaRI) también puede ser enfocarse. El receptor de Fc se localiza de preferencia en la superficie de una célula efectora, por ejemplo, un monocito, macrófago o una célula polimorfonuclear activada. En una modalidad preferida, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas se unen a un receptor de Fc en un sitio que es distinto del sitio de unión de Fc de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG o IgA) del receptor. Por consiguiente, la unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas no son bloqueadas por niveles fisiológicos de inmunoglobulinas. En otro aspecto, la presente invención ofrece células efectoras específicas para blanco que comprenden una célula efectora que expresa un receptor de Fc, por ejemplo, un macrófago o una célula PMN activada, unida a una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención, que se une a una célula efectora a través de su receptor Fc, y se une también a una célula dendrítica de tal manera que la célula efectora sea enfocada hacia las células dendríticas. En otro aspecto, la presente invención ofrece composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas y de diagnóstico, que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un anticuerpo monoclonal humano de la invención, o una porción de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a células dendríticas. En una modalidad, la composición comprende la combinación de los anticuerpos humanos o porciones de unión con antígenos de los mismos, de preferencia cada uno se une a un epítopo distinto. Por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal de ser humano que media la muerte altamente efectivo de células dendríticas en presencia de células efectoras puede combinarse con otro anticuerpo monoclonal humano que inhibe el crecimiento de células dendríticas. Así, la combinación proporciona varias terapias adecuadas para proporcionar el beneficio terapéutico máximo. Composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden la combinación de por lo menos un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención, o bien porciones de unión de antígeno del mismo, y por lo menos una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención, o bien otros agentes terapéuticos (por ejemplo, agentes citotóxicos) están también dentro del alcance de la presente invención. En otro aspecto, la invención ofrece método para inhibir la proliferación y/o diferenciación de células dendríticas mediante la inhibición del crecimiento y/o mediante la inducción de la fagocitosis y/o la muerte de células dendríticas por células efectoras humanas, como por ejemplo células poli-morfonucleares de ser humano (PMNs) , monocitos y macrófagos, empleando un anticuerpo, o porción de unión de antígeno del mismo (o bien un anticuerpo biespecífico o multiespecífico) de la presente invención. En una modalidad, el método comprende la puesta en contacto de una célula dendrítica ya sea in vi tro o in vivo con un anticuerpo monoclonal humano o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos de la invención, o bien una porción de unión con antígeno del mismo, en presencia de una célula efectora humana. El método puede emplearse en cultivo, por ejemplo in vi tro o ex vi vo (por ejemplo, cultivos que contienen células dendríticas y células efectoras) . Por ejemplo, una muestra que contiene células dendríticas y células efectoras puede cultivarse in vitro, y combinarse con un anticuerpo de la presente invención, o una porción de unión con antígeno del mismo (o bien una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención) .
Alternativamente, el método puede efectuarse en un sujeto, por ejemplo, como parte de un protocolo in vivo (por ejemplo, protocolo terapéutico o profiláctico) . Para métodos in vivo, el anticuerpo o porción de unión con antígeno del mismo (o bien una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención) , puede administrarse a un sujeto humano que padece de una enfermedad mediada por célula dendrítica. Estas enfermedades incluyen, por ejemplo, enfermedad auto-inmunológica, enfermedad inflamatoria, así como enfermedad de injerto versus huésped. Enfermedades auto-inmunes ejemplares que pueden ser tratadas (por ejemplo, mejoradas o prevenidas empleando los métodos y composiciones de la invención incluyen, sin limitarse a estos ejemplos, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes melitus, miastenia gravis, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, lupus eritematoso, síndrome de Reiter, y enfermedad de Graves . En una modalidad, el sujeto puede ser tratado adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, incrementa o inhibe la expresión o actividad de receptor Fc, por ejemplo, un receptor Fc o un receptor Fc?, mediante por ejemplo el tratamiento del sujeto con una citocina. Las citocinas preferidas para su administración durante el tratamiento con la molécula biespecífica y multiespecífica incluyen factor estimulador de colonias de granulocitos G-CSF) , factor de estimulación de colonias de macrófagos (GM-CSF) , interferon-? (IFN-?, y factor de necrosis tumoral (TNF) . Composiciones aisladas de anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención pueden también administrarse en combinación con otras terapias conocidas, por ejemplo, terapias anti-inflamatorias o inmuno-supresoras, o bien citotoxinas . En otro aspecto, la presente invención ofrece uno método para detectar in vi tro o in vivo la presencia de células dendríticas en una muestra, por ejemplo, para diagnosticar una enfermedad relacionada con células dendríticas. En una modalidad, esto se logra mediante la puesta en contacto de una muestra a muestrear, junto con una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención o una porción de unión con antígeno del mismo (o bien una molécula biespecífica o multiespecífica) , bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y una célula dendrítica. La formación de complejos se detecta después (por ejemplo, utilizando ELISA) en ambas muestras, y cualquier diferencia estadísticamente significativa en la formación de complejos entre la muestra indica la presencia de célula dendrítica en la muestra de prueba. Otras características y ventajas de la presente invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la reactividad de anticuerpos monoclonales humanos Bll, C20 y E21 con células dendríticas y líneas de células hematopoyéticas U937, CEM, T]P-1 y L540, de conformidad con lo evaluado por citometría de flujo. La unión fue medida por intensidad media de la fluorescencia. La Figura 2 muestra una unión dependiente de la dosis de anticuerpos monoclonales de ser humano Bll, C20 y E21 con células dendríticas, de conformidad con lo evaluado por citometría de flujo. La unión fue medida por intensidad media de fluorescencia. La Figura 3 muestra la reactividad dependiente de la dosis de anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendríticas derivas de células madres CD34+, de conformidad con lo evaluado por citometría de flujo. La unión fue medida por intensidad media de fluorescencia. La Figura 4 muestra la unión de anticuerpo monoclonal de ser humano Bll con células dendríticas y macrófagos, de conformidad con lo evaluado por citometría de flujo. La Figura 5 muestra la unión de anticuerpo monoclonal de ser humano Bll con THP-1 inducido a diferenciase en un fenotipo de células dendríticas, de conformidad con lo evaluado por citometría de flujo. La Figura 6 muestra la unión de anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendríticas de macaco, de conformidad con lo evaluado por citometría de flujo. La unión fue medida por intensidad media de fluorescencia. La Figura 7 muestra la internalización porcentual de anticuerpo monoclonal humano Bll por células dendríticas con 5 el paso del tiempo a una temperatura de 37 °C. La Figura 8 muestra la presentación incrementada de antígeno • a través del anticuerpo Bll en comparación con el antígeno solo, de conformidad con lo medido por estimulación de células T específicas para toxoide de tétanos. 10 La Figura 9 muestra el constructo Bll ScFv que fue creado por enlace de los dominios VL (SEQ ID NO:l y 2) V„ (SEQ ID NO: 3 y • 4) de anticuerpo monoclonal humano Bll. La Figura 10 muestra una comparación de enlace entre el anticuerpo monoclonal humano entero Bll y fragmentos (Fab')2 15 de Bll con células dendríticas, de conformidad con lo medido por análisis FACS. La Figura 11 muestra el porcentaje de internalización FITC- dextrano por células dendríticas. La Figura 12 muestra que la conjugación de antígeno con Bll 20 incrementa la presentación de antígeno puesto que se requiere de cantidades de 10 a 100 veces menores de toxoide de tétanos conjugado con el anticuerpo Bll para lograr el mismo nivel de estimulación T en comparación con el toxoide de tétanos solo. La Figura 13 muestra las secuencias de nucleótidos y 25 aminoácidos correspondientes de las cadenas ligera variable (VL) y pesada variable (VL) de anticuerpo Bll. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece terapias novedosas basadas en anticuerpos para modular una respuesta inmunológica contra un antígeno, y para tratar y diagnosticar enfermedades mediadas por células dendríticas. Terapias de la presente invención emplean anticuerpos monoclonales humanos aislados, o bien porciones de enlace con antígeno de los mismos, que se unen a un epítopo presente en células de presentación de antígeno (APC) , particularmente células dendríticas y células relacionadas. En una modalidad, los anticuerpos humanos son producidos en animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, capaz de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para células dendríticas (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) sometiéndose a una recombinación V-D-J y cambio de isotipo. Por consiguiente, varios aspectos de la invención incluyen anticuerpos humanos, fragmentos de anticuerpo y miméticos de anticuerpo, composiciones farmacéuticas de los mismos, así como animales transgénicos no humanos, y células B e hibridomas para reparar tales anticuerpos monoclonales. Métodos de uso de los anticuerpos de la presente invención para detectar células dendríticas o tipo de célula relacionado que expresan un antígeno de célula dendrítica, o bien para inhibir el crecimiento, diferenciación y/o actividad de una célula dendrítica, ya sea in vi tro o in vivo, se encuentran también dentro del marco de la presente invención. Con el objeto de proporcionar una comprensión más fácil de la presente invención, se definen p rimero algunos términos. Definiciones adicionales se presentan a lo largo de la descripción detallada. El término "célula dendrítica" como se emplea aquí, incluye células dendríticas maduras e inmaduras, así como células progenitoras mieloides relacionadas que pueden diferenciarse en células dendríticas o células de presentación de antígeno relacionadas (por ejemplo, monocitos y macrófagos) en la medida en que expresan antígenos en común con células dendríticas. Como se emplea aquí, el término "relacionado" incluye una célula que se deriva de una célula progenitora común o de un linaje celular. En una modalidad preferida, la unión de un antígeno de la presente invención con una célula dendrítica inhibe el crecimiento de celas dendríticas. En otra modalidad preferida, la unión de un anticuerpo de la invención con células dendríticas media un efecto sobre el crecimiento y/o la función de células dendríticas mediante el enfoque de las moléculas o células con funciones definidas (por ejemplo, células tumorales, células efectoras, patógenos microbianos) hacia células dendríticas. En una modalidad adicional, la unión de un anticuerpo de la presente invención con una célula dendrítica resulta en la internalización del anticuerpo por la célula dendrítica. Como se emplea aquí, el término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada consiste de una región variable de cadena pesada (abreviada aquí como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consiste de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera consiste de una región variable de cadena ligera (abreviada a continuación como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas a su vez en regiones de hipervariabilidad, que se conocen como regiones de determinación de complementaridad (CDR) , intercaladas como regiones que son más conservadas conocidas como regiones de marco (FR) . Cada VH y VL consiste de tres CDRs y cuatro FRs, colocados desde la terminal amino hasta la terminal carboxi en el siguiente orden: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de envase que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina con tejidos huéspedes o factores, incluyendo varias células del sistema inmunológico (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. El término "porción de unión con antígeno" de un anticuerpo (o bien simplemente "porción de anticuerpo") , como se emplea aquí, se refiere a uno o varios fragmentos de un anticuerpo que conserva la capacidad de unirse específicamente con un antígeno (por ejemplo, un antígeno en una célula dendrítica) . Se ha mostrado que la función de unión con antígeno de un anticuerpo puede efectuarse a través de fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término de "porción de unión con antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL u CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazado por un puente disulfuro en la región de articulación, (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento de dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341:544-546 ), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementaridad aislada (CDR) . Además, aún cuando los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden estar unidos, utilizando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que permite su elaboración como una sola cadena de proteína en donde el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocida como cadena única Fv (scFv) ; véase por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única están también contemplados dentro del marco del significado del término "porción de unión con antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen empleando técnicas convencionales conocidas por parte de los expertos en la materia, y los fragmentos son tamizados para determinar si son útiles de la misma manera que los anticuerpos intactos. El término "molécula biespecífica" incluye cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido, o complejo de proteína o péptido, que tiene dos especificidades de enlace diferentes que se unen o interactúan, por ejemplo, (a) con una célula dendrítica y (b) con un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora. En otra modalidad, una molécula biespecífica de la presente invención tiene dos especificidades de unión diferentes que se unen o interactúan con (a) una célula dendrítica y (b) un antígeno en una célula blanca (por ejemplo, una célula tumoral) . El término "molécula multiespecífica" o "molécula heteroespecífica" se contempla para que incluya cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido, o un complejo de proteína o péptido, que tiene más de dos especificidades de unión diferentes que se unen o interactúan por ejemplo (a) una célula dendrítica, (b) un receptor de Fc en la superficie de una célula efectora y (c) con por lo menos otro componente. Por consiguiente, la invención incluye, sin limitarse a estos ejemplos, moléculas biespecíficas, tri-específicas, tetra-específicas, o bien multiespecíficas de otro tipo dirigidas hacia antígenos de superficie celular, como por ejemplo, antígeno de células dendríticas, y a receptores Fc en células efectoras, o bien un antígeno en una célula blanco (por ejemplo, una célula tumoral) . El término "anticuerpos biespecíficos" incluye además diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpo bivalente, biespecíficos en donde los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena de polipéptidos, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando así los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de enlace con antígenos (véase, por ejemplo, Holliger, P., y colaboradores (1993) Proc. Nati , Acad. Sci . USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., y colaboradores (1994) Structure 2:1121-1123) . Como se emplea aquí, el término "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, fragmentos de unión de anticuerpos (por ejemplo, Fab) , derivados de los mismo, o bien regiones de unión de antígeno, unidos entre ellos, por lo menos de los cuales tienen especificidades diferentes. Estas especificidades diferentes incluyen una especificidad de enlace para una célula dendrítica, y una especificidad de enlace para un receptor Fc en una célula efectora, o un antígeno o epítopo en una célula objetivo, por ejemplo, una célula tumoral. El término "anticuerpo humano", como se emplea aquí, incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de ser humano. Los anticuerpos humanos de la presente invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencia de inmunoglobulina germinal de ser humano (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica para sitios in vi tro o bien por mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se emplea aquí, no se contempla para que incluya anticuerpos en donde secuencias de CDR derivados de la línea germinal de otras especies de mamíferos, por ejemplo, un ratón, haya sido injertado en secuencias de estructura de ser humano. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición molecular individual. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una sola especificidad de enlace y afinidad por un epítopo particular. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una sola especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de ser humano. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales de ser humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano, fusionados sobre una célula inmortalizada. El término "anticuerpo humano recombinante", como se emplea aquí, esta contemplado para que incluya todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados, aislados por medios recombinantes, por ejemplo, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina de ser humano (descritos adicionalmente en la sección I, abajo) ; anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos de ser humano combinatoria recombinante, o bien anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que involucran el empalme de secuencias de gen de inmunoglobulina de ser humano a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de ser humano. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a mutagénesis in vi tro (o bien cuando un animal transgénico para secuencias de Ig de ser humano se emplea, mutagénesis somática in vivo) , y por consiguiente las secuencias de las regiones de VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que mientras son derivadas y relacionadas con las secuencias VH y VL de línea germinal de ser humano, no pueden existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo de ser humano in vivo . Como se utiliza aquí, un anticuerpo "anticuerpo heterólogo" se define con relación al organismo no humano transgénico que produce dicho anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos codificadora que corresponde a lo que se encuentra en un organismo que no consiste del animal no humano transgénico, y generalmente a partir de una especie otra que la especie del animal no humano transgénico. Como se emplea aquí, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene unas cadenas pesadas y ligeras de orígenes de organismos diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada de ser humano asociada con una cadena ligera de murino es un anticuerpo heterohíbrido. Ejemplos de anticuerpos heterohíbridos incluyen anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, comentados supra . Un "anticuerpo aislado", como se emplea aquí, se contempla para referirse a un anticuerpo que es sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a células dendríticas y células de presentación de antígeno derivadas de mieloides relacionadas (por ejemplo, monocitos y macrófagos, y es sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a células otras que células de dendríticas) . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a una célula dendrítica puede sin embargo tener una reactividad cruzada con otras células, por ejemplo, tipos de células que expresan un antígeno que se relaciona al antígeno correspondiente en una célula dendrítica. Además, el anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o sustancias químicas. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aisladas" que tienen especificidades diferentes son combinados en una composición bien definida. Como se emplea aquí, los términos "unión específica" y "se enlaza específicamente con" se refiere a la especificidad de la unión de anticuerpo con un antígeno o tipo de célula predeterminado. Un anticuerpo que "se une específicamente a" o "es específico para" un antígeno particular o tipo particular de célula, se une al antígeno o al tipo de célula con una selectividad en comparación con otros antígenos y tipos de células. Mientras cada anticuerpo de la presente invención se une específicamente con un epítopo objetivo particular (por ejemplo, presente en la superficie de una célula dendrítica) , anticuerpos específicos de la presente invención en ciertas modalidades pueden presentar cierta reactividad cruzada con otras APCs. En otras modalidades, los anticuerpos específicos reaccionan solamente con células dendríticas. Típicamente, el anticuerpo se une con una afinidad de por lo menos aproximadamente 1 x 107 M"1, y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es por lo menos 2 veces mayor que su afinidad de unirse con un antígeno no específico (por ejemplo, BSA, caseína) otro que el antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se emplea de manera intercambiable aquí con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". Como se emplea aquí, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a una afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 107 M"1, de preferencia una afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 109 M_1, con mayor preferencia una afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 1010M-1, ÍO^M-1, 101M_1 o mayor, por ejemplo, hasta 1013M_1 o mayor. Sin embargo, una unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, una unión de "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a una afinidad de unión de por lo menos aproximadamente 1 x 107M_1. El término "Kassoc", como se emplea aquí, se refiere a la constante de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "Kis", como se emplea aquí, se refiere a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Como se emplea aquí, el término "isotipo" se refiere a una clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGl) codificada por genes de región constante de cadena pesada. Como se emplea aquí, el término "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno a través del cual la clase, o isotipo de un anticuerpo cambia de una clase Ig a un anticuerpo de las demás clases de Ig. Como se emplea aquí, un "isotipo no cambiado" se refiere a la clase isotípica de cadena pesada que es producida cuando no se observa ningún cambio de isotipo; el gen CH que codifica el isotipo no cambiado es típicamente el primer gen CH inmediatamente corriente abajo a partir del gen VDJ funcionalmente rearreglado. Una conmutación de isotipo ha sido clasificada como clásica o no clásica. Un cambio de isotipo clásico ocurre mediante eventos de recombinación que incluyen por lo menos una región de secuencias de cambio en el transgen. Un cambio de isotipo no clásico puede ocurrir, por ejemplo, por recombinación homologa entre sµ de ser humano y ?µ de ser humano (deleción asociada con d) . Mecanismos alternativos de cambio no clásico, por ejemplo, recombinación intertransgen y/o intercromosómica, entre otros mecanismos, pueden ocurrir y efectuar un cambio de isotipo. Co o se emplea aquí, el término "secuencia de cambios" se refiere a las secuencias de ADN responsables de recombinación de cambio. Una secuencia "donadora de cambio", típicamente una región de cambio µ, se encontrará 5' (es decir, corriente arriba) de la región de constructo a remover durante la recombinación de cambio. La región "aceptadora de cambio" estará entre la región de constructo a romper y la región constante de reemplazo (por ejemplo, ?, e, etc.) . Puesto que no hay ningún sitio específico en donde ocurre siempre una recombinación, la secuencia génica final típicamente no podrá predecirse a partir del constructo. Como se emplea aquí, un "patrón de glicosilación" se define como el patrón de unidades de carbohidrato unidas covalentemente a una proteína, más específicamente, a una proteína de inmunoglobulina. Un patrón de glicosilación de un anticuerpo heterólogo puede caracterizarse como siendo sustancialmente similar a patrones de glicosilación que ocurren naturalmente en anticuerpos producidos por la especie del animal transgénico no humano, cuando una persona con conocimientos ordinarios en la materia reconocería el patrón de glicosilación del anticuerpo heterólogo como más similar a dicho patrón de glicosilación en la especie del animal transgénico no humano que a la especie a partir de la cual se derivaron los genes CH del transgen. El término "que ocurre naturalmente" como se emplea aquí se aplica a un objeto que se refiere al hecho que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo virus) que puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio ocurre naturalmente . El término "rearreglado" como se emplea aquí se refiere a una configuración de un locus inmunoglobulina de cadena pesada o de cadena ligera en donde un segmento V se coloca inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un locus de gen de inmunoglobulina rearreglado puede ser identificado en comparación con ADN de línea germinal; un locus rearreglado tendrá por lo menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado. El término "no rearreglado" o bien "configuración de línea germinal" como se emplea aquí, con referencia a un segmento V se refiere a la configuración en la cual el segmento V no es recombinado de tal manera que se encuentra inmediatamente adyacente a un segmento D o J. El término "molécula de ácido nucleico", como se emplea aquí, se contempla de tal manera que incluya moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de una sola cadena o bien de doble cadena, pero de preferencia es ADN de doble cadena. El término "moléculas de ácido nucleico aisladas", como se emplea aquí, con referencia a ácidos nucleicos que codifican anticuerpos porciones de anticuerpo (por ejemplo, VH, VL, CDR3) que se unen a células dendríticas, se refiere a una molécula de ácido nucleico en la cual las secuencias de nucleótidos que codifican el anticuerpo o la porción de anticuerpo están libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos que se unen a células otras que células dendríticas, dichas otras secuencias pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano. En cuanto a ácidos nucleicos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando están óptimamente alineados y comparados, son idénticos, con inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos, en por lo menos aproximadamente el 80% de los nucleótidos, habitualmente por lo menos aproximadamente de 90% a 95%, y con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente de 98% a 99.5% de los nucleótidos. Alternativamente, existe una homología sustancial cuando los segmentos se hibridan en condiciones de hibridación selectivas, al complemento de la cadena. La identidad porcentual entre dos secuencias depende del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de homología = # de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de espacios y longitud de cada espacio, que deben introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse empleando un algoritmo matemático, de conformidad con lo descrito en los ejemplos no limitativos abajo. La identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótidos puede ser determinada empleando el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en http : //www. gcg. com) , empleando una matriz NWSgapdna y un peso de espacio de 40, 50, 60, 70, o 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. La identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede ser determinada empleando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ( Comput . Appl . Biosci . , 4:11-17 (1988)) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), empleando una tabla de residuo de pesos PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4. Además, la identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinada empleando el algoritmo de Needleman y Wunsch ( J. Mol . Bi ol . (48):444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en http: //www. gcg. com) , empleando ya sea una matriz Blossum 62 o bien una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o bien 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o bien 6. Las secuencias de ácidos nucleico y proteínas de la presente invención pueden ser utilizadas adicionalmente como una secuencia de "secuencia de investigación" para efectuar una búsqueda contra base de datos públicas para identificar, por ejemplo, secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden efectuarse los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y colaboradores (1990) J. Mol . Biol . 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden efectuarse con el programa NBLST, resultado = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Búsquedas de proteínas BLAST pueden efectuarse con el programa XBLAST, calificación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteínas de la invención. Para obtener alineamientos espaciados para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST de conformidad en Altschul y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res . 25 (17) : 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por omisión de los programas respectivos (pro ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden emplearse. Véase http: //www.ncbi .nlm.nih.gov. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado de células, o bien en forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico es "aislado" o bien "tornado sustancialmente puro" cuando es purificado de otros componentes similares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, por técnicas estándares, incluyendo tratamiento alcalina/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columnas, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas bien conocidas. Véase, F. Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular] , Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987) . Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención, mientras frecuentemente en una secuencia nativa (excepto en el caso de sitios de restricción modificados o similares) , a partir de ADNc, genómico o mezclas, pueden ser mutadas, de conformidad con técnicas estándares para proporcionar secuencias de gen. Para secuencias codificadoras, estas mutaciones pueden afectar secuencias de aminoácidos según se desea. En particular, secuencias de ADN sustancialmente homologas derivadas de V, D, J naives, constantes, cambios, y otras secuencias de este tipo descritas aquí se contemplan (en donde el término "derivado" indica que una secuencia es idéntica o modificada a partir de otras secuencias) . El término "unida de manera operante" o "unida de manera operable" significa que las moléculas están funcionalmente unidas entre ellas y que el cambio de actividad o estado de una molécula ese afectado por la actividad o estado de la otra molécula. Un ácido nucleico es "enlazado de manera operante" cuando se coloca en una relación funcional con otras secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o realzador se encuentra unido de manera operante a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia. Con relación a secuencias reguladoras de transcripción, la expresión unido de manera operante significa que las secuencias de ADN unidas son contiguas y, en caso necesario, unen dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en cuadro de lectura. Para secuencias de cambio, la expresión unido de manera operante indica que las secuencias pueden efectuar una recombinación de cambio.
Típicamente, dos polipéptidos unidos de manera operante están unidos covalentemente a través de enlaces de péptido. El término "vector", como se emplea aquí, tiene el propósito de referirse a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual ha estado unida. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el cual segmentos adicionales de ADN pueden unirse. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos adicionales de ADN pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) pueden ser integrados en el genoma de una célula huésped al introducirse en la célula huésped, y por consiguiente son replicados juntos con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los cuales están unidos de manera operante. Tales vectores se conocen a continuación como "vectores de expresión recombinantes" (o bien simplemente, "vectores de expresión") . En general, vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante son frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente especificación, el término "plásmido" y el término "vector" pueden emplearse de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma de vector más comúnmente empleada. Sin embargo, la invención incluye otras formas de vectores de expresión, por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados defectuosos para replicación) , que sirven funciones equivalentes. El término "célula huésped recombinante" (o bien simplemente "células huésped") , como se emplea aquí, se refiere a una célula en la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Se entenderá que tales términos se contemplan para referirse no solamente a la célula sujeto particular sino a la progenie de dicha célula. Puesto que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsecuentes debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie de hecho puede no ser idéntica a la célula de origen, pero sigue incluida dentro del alcance del termino "célula huésped" como se emplea aquí . Varios aspectos de la presente invención se describirán a continuación con detalles en las subsecciones siguientes. I. Producción de anticuerpos humanos para células dendríticas Mientras métodos particularmente preferidos de generación de anticuerpos monoclonales humanos (mAbs) de la presente invención se describen con detalles aquí, varias otras técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohier y Milstein, Nature 256:495 (1975) pueden también emplearse. Aún cuando los procedimientos de hibridación de células somáticas se prefieren, otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales pueden emplearse, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos. El sistema de animal preferido para preparar hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridomas en sistemas de murino es un procedimiento bien establecido. Protocolos de inmunización y técnicas para aislar esplenocitos inmunizados para fusión son bien conocidas. Socios de fusión (por ejemplo, células de mieloma de murino) y procedimientos de fusión son también bien conocidos. En una modalidad preferida, anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra células dendríticas son generados empleando ratones transgénicos que llevan parte del sistema inmune del ser humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, que se conocen a continuación como ratones "HuMAb" contienen un miniloci de gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada de ser humano no arreglada (µ y ?) y cadena ligera K, junto con mutaciones enfocadas que desactivan loci de cadenas µ y K endógenos (Lonberg, N y colaboradores (1994) Nature 368 (6474) : 856-859) . Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida de IgM de ratón o K y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadenas pesadas y ligeras de ser humano son sometidos a cambio de clase y mutación somática para generar monoclonales IgGK de ser humano de alta afinidad (Longerg, N y colaboradores (1994), supra; reseñado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology [Manual de Farmacología Experimental] 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern . Rev. Immunol . Vol. 13:65-93, y Harding, F y Lonberg, N. (1995) Ann N. Y. Acad. Sci 764:536-546) . La preparación de ratones HuMab se describe con detalles en la sección II abajo y en Taylor, L y colaboradores (1992) . Nucl eic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J y colaboradores (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon y colaboradores (1993) Proc. Nati . Acad. Sci USA 90:3720-3724; Choi y colaboradores (1993) Nature Geneti cs 4:117-123; Chen, J y colaboradores (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon y colaboradores (1994) J. Immunol 152:2912-2920; Lonberg y colaboradores (1994) Na ture 368 (6474) : 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor , L y colaboradores (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern . Rev.
Immunol . Vol. 13:65-93; Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann .
N. Y. Acad. Sci . 764:536-546; Fishwild, D y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, cuyos contenidos se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Véase además, las Patentes Norteamericanas Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas de Lonberg y Kay, y GenPharm International; Patente Norteamericana No. 5,545,807 de Surani y colaboradores; Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/24884, publicada el día 11 de Junio de 1998; WO 94/25585, publicado el día 10 de Noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada el día 24 de Junio de 1993; WO 92/122645; publicada el día 23 de Diciembre de 1992; WO 92/03918, publicada el 19 de Marzo de 1992, cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Inmunizaciones HuMab Para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos para células dendríticas, ratones HuMab pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de células dendríticas, de conformidad con lo descrito por Lonberg, N y colaboradores (1994) Nature 368(6474): 856-859; FishWild, D y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 y WO 98/24884. De preferencia, los ratones tendrán de 6 a 16 semanas de edad al momento de la primera inmunización. Por ejemplo, una preparación purificada o enriquecida de células dendríticas (1-10 millones de células) puede emplearse para inmunizar los ratones HuMab de manera intraperitoneal. En el caso en el cual las inmunizaciones empleando una preparación purificada o enriquecida de células dendríticas no resultan en anticuerpos, ratones pueden también ser inmunizados con un lisado de células dendríticas para promover respuestas inmunes . La experiencia acumulada con varios antígenos ha mostrado que los ratones transgénicos HuMAb responden mejor cuando son inicialmente inmunizados de manera intraperitoneal (IP) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido por inmunización IP cada dos semanas (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmunológica puede ser monitoreada en el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas por sangrados retroorbitales . El plasma puede ser tamizado, por ejemplo, por ELISA o bien citometría de flujo (de conformidad con lo descrito abajo) , y ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anticélulas dendríticas pueden ser utilizadas para fusiones. Ratones pueden recibir refuerzos intravenosos con antígeno 3 días antes del sacrificio y remoción del bazo. Se espera que 2-3 fusiones para cada antígeno puedan ser necesarias. Varios ratones serán inmunizados para cada antígeno. Por ejemplo, un total de doce ratones HuMAb de las cepas HC07 y HC012 pueden ser inmunizados . Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos para cél ulas dendrí ticas Los esplenocitos de ratón pueden ser aislados y fusionados con PEG sobre una línea de células de mieloma de ratón con base en protocolos estándares. Los hibridomas resultantes son después tamizados para la producción de anticuerpos específicos para antígenos. Por ejemplo, suspensiones celulares individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados son fusionadas a una sexta parte del número de células de mieloma de ratón no secretorias P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50%. Las células son colocadas en placas a aproximadamente 2 x 105 células en placa de microtitulación de fondo redondo, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene 20% de suero de clon fetal, 18% de medio acondicionado "653", 5% de origen (IGEN), L-glutamina 4mM, L~glutamina lmM, piruvato de sodio 1 M, HEPES 5mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y IX HAT (Sigma; se agrega HAT 24 horas después de la fusión) . Después de dos semanas, las células son cultivadas en medio en el cual HAT es reemplazado por HT. Pozos individuales son después tamizados por ELISA para determinar la presencia de anticuerpos IgM y IgG monoclonales humanos anticélulas dendríticas. Una vez que ocurre un crecimiento extensivo del hibridoma, se observa el medio habitualmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan el anticuerpo son colocados de nuevo en placas, tamizados otra vez, y si siguen siendo positivos para anticuerpos humanos monoclonales anticélulas dendríticas IgG, pueden ser subclonados por lo menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables son después cultivados in vi tro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización. Caracterización de Enlace de Anticuerpos Monoclonales Humanos con Células Dendríticas Para caracterizar la unión de anticuerpos de células dendríticas monoclonales humanas de la invención, hibridomas fueron tamizados como por ejemplo para determinar reactividad positiva con células dendríticas por citometría de flujo. En resumen, células dendríticas son cosechadas y lavadas, y después se agregan a placas de 96 pozos y se incuban con diluciones de sobrenadantes de hibridoma (o bien anticuerpo monoclonales en PBS que contiene 0.1% de Tween 80 y 20% de suero de ratón) a una temperatura de 4° durante 1 hora. Las placas son después lavadas, incubadas adicionalmente con anticuerpos secundarios (por ejemplo FITC o bien anti IgG humano marcado con PE) durante una hora a una temperatura de 4°C. después de lavado las células son fijadas con paraformaldehído al 1%, y analizadas. Las muestras pueden ser analizadas por instrumento FACScan empleando luz y propiedades de difusión lateral para enfocarse a células individuales. Un ensayo alternativo que emplea microscopía de fluorescencia puede utilizar (además o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células pueden ser teñidas exactamente de conformidad con lo descrito arriba y examinadas por microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener una sensibilidad disminuida según la densidad del antígeno. Hibridomas que se unen con alta avidez a células dendríticas serán subclonados y caracterizados adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que conserva la reactividad de las células de origen (por citometría de flujo) puede seleccionarse para formar un banco de células de 5-10 frascos almacenados a una temperatura de -140°C y para purificación de anticuerpo. Para purificar anticuerpos humanos anticélulas dendríticas, hibridomas seleccionados pueden ser cultivados en frascos giratorios de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden ser filtrados y conservados antes de cromatografía por afinidad con proteína A-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . IgG eluída puede ser revisa por electroforesis en gel y cromatografía del líquido de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución amortiguadora puede ser intercambiada en PBS y la concentración puede ser determinada por OD28o empleando un coeficiente de extinción de 1.43. los anticuerpos monoclonales pueden ser formados en alícuotas y almacenados a una temperatura de -80°C. Para determinar si los anticuerpos monoclonales humanos anticélulas dendríticas se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado empleando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL) . Estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados pueden efectuarse empleando citometría de flujo de conformidad con lo definido arriba. La unión de anticuerpo monoclonal biotinilado puede detectarse con una sonda de strep-avidina-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se puede efectuar ELISAs de isotipos. Pozos de placas de microtitulación pueden ser revestidos con 10 µg/ml de Ig antihumana durante la noche a una temperatura de 4°C. después de bloqueo con BSA al 5%, las placas reaccionan con 10 µg/ml de anticuerpos monoclonales o controles de isotipos purificados a temperatura ambiente durante dos horas. Los pozos pueden después ser reaccionados con IgGl de ser humano o bien sondas conjugadas con fosfatas alcalina específica para IgG de ser humano, después de lavado las placas son reveladas con sustrato de pNPP (1 mg/ml) y analizadas a OD de 405-650. IgGs de ser humano anticélulas dendríticas pueden ser probadas adicionalmente para reactividad con células dendríticas por análisis Western Blot. En resumen, extractos de células provenientes de células dendríticas pueden prepararse y someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato sódico (SDS) . Después de la electroforesis, los antígenos separados serán transferidos a membranas de nitrocelulosa, bloqueados con suero de ratón al 20%, y sondeados con los anticuerpos monoclonales para ser probados. La unión de IgG de ser humano puede ser detectada utilizando fosfatasa alcalina anti IgG humana y reveladas con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co . , St. Louis, MO) . Actividades fagocíticas y de matanza de células de anticuerpos monoclonales humanos para células dendríticas Además de unirse específicamente a células dendríticas, anticuerpos monoclonales humanos anticélulas dendríticas pueden ser probados para determinar su capacidad para mediar la fagocitosis y muerte de células dendríticas. La prueba de actividad de anticuerpo monoclonal in vitro puede proporcionar un tamizado inicial antes de la prueba de modelos in vivo. En resumen, células polimorfonucleares (PMN) , o bien otras células efectoras, de donadores sanos pueden ser purificadas por centrifugación de densidad Ficoll Hypaque, seguido por lisis de eritrocitos contaminantes. PMNs lavadas, pueden ser suspendidas en RPMI complementado con suero de becerro fetal desactivado térmicamente al 10% y mezcladas con células dendríticas marcadas con 51Cr en varias proporciones entre células efectoras y células dendríticas (células efectoras: células dendríticas). IgG purificadas anticélulas dendríticas pueden después agregarse en varias concentraciones. IgG human irrelevante puede emplearse como control negativo. Ensayos pueden efectuarse durante 0-120 minutos a una temperatura de 37 °C. muestras pueden ser ensayadas para histolisis mediante la medición de la liberación de 51Cr en el sobrenadante de cultivo. Anticuerpos monoclonales anticélulas dendríticas pueden también probarse en combinaciones entre ellos para determinar si la histolisis es incrementada por anticuerpos monoclonales múltiples. Anticuerpos monoclonales humanos que se unen a células dendríticas pueden también ser probados en un modelo in vivo (por ejemplo en ratones) para determinar su eficacia en la mediación de la fagocitosis y la muerte de células dendríticas. Estos anticuerpos pueden seleccionarse, por ejemplo en base en los siguientes criterios, que no pretenden ser exclusivos: 1) unión con células dendríticas vivas; 2) Alta afinidad de unión con células dendríticas; 3) Unión con epítopos únicos en células dendríticas (para 4) eliminar la posibilidad que anticuerpos monoclonales con actividades complementarias cuando se emplean en combinación compitan por unión con el mismo epítopo) ; 5) Opsonización de células dendríticas; 6) Mediación de la inhibición del crecimiento fagocitosis y/o muerte de células dendríticas en presencia de células efectoras de ser humano; 7) Internalización después de unión con células dendríticas; 8) Unión con células dendríticas in situ (por ejemplo en tejidos humanos) ; 9) Activación de células dendríticas (por ejemplo inducir la liberación de citosinas, expresión de moléculas de superficie inmunomoduladoras (por ejemplo CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD40, y CD54 (ICAM); 10) Unión a receptor de manos de ser humano en células dendríticas; y 11) Unión a un antígeno de células dendríticas que es conservado entre primates. Anticuerpos monoclonales humanos preferidos de la invención cumplen uno o varios, y de preferencia todos estos criterios.
En una modalidad particular, los anticuerpos monoclonales humanos se emplean en combinación, por ejemplo como composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales anticélulas dendríticas o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos anticélulas dendríticas que tienen actividades diferentes pero complementarias pueden combinarse en una sola terapia para lograr un efecto terapéutico o de diagnóstico deseado. Una ilustración de esta situación sería una composición que contiene un anticuerpo monoclonal humano anticélula dendrítica rápidamente internalizado por células dendríticas, combinado con otro anticuerpo monoclonal humano anticélula dendrítica que induce actividades de célula de presentación de antígenos de células dendríticas, por ejemplo, liberación de citosinas inmunoestimuladoras. II. producción de animales no humanos transgénicos que generan anticuerpos monoclonales humanos anticélulas dendríticas En otro aspecto la presente invención ofrece animales transgénicos no humanos como por ejemplo ratones transgénicos, que pueden expresar anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a células dendríticas, de preferencia con alta afinidad. En una modalidad preferida, los animales no humanos transgénicos, por ejemplo, los ratos transgénicos (ratones HuMab) , tienen un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano. En una modalidad, los animales no humanos transgénicos, por ejemplo, los animales transgénicos han sido inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de células dendríticas y/o lisado de células dendríticas. De preferencia, los animales no humanos transgénicos, por ejemplo, los ratones transgénicos, pueden producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para células dendríticas (por ejemplo IgG, IgA, y/o IgE) sometiéndose a recombinación V-D-J y cambio de isotipos. El cambio de isotipos puede ocurrir, por ejemplo mediante cambio clásico o no clásico de isotipos. El diseño de un animal no humano transgénico que responde a una estimulación de antígeno foráneo con un repertorio de anticuerpos heterólogos requiere que los transgenes de inmunoglobulina heterólogos que se encuentran en el animal transgénico funcionen correctamente en la vía de desarrollo de células B. en una modalidad preferida, una función correcta de transgen heterólogos de cadena pesada incluye cambio de isotipo. Por consiguiente, los transgenes de la presente invención son construidos para producir cambio de isotipo y uno o varios de los siguientes: (1) expresión específica de tipo de célula y de alto nivel, (2) re-arreglo de gen funcional, (3) activación y respuesta a exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señales, (6) hipermutación somática, y (7) dominación de locus de anticuerpo de transgen durante la respuesta inmunológica. No todos los criterios antes mencionados tienen que cumplirse. Por ejemplo, en modalidades en las cuales los loci de inmunoglobulina endógena del animal transgénico son funcionalmente afectados, el transgen no tiene que activar una exclusión alélica. Además, en las modalidades en las cuales el transgen comprende un gen de inmunoglobulina de cadena pesada y/o de cadena ligera, funcionalmente re-arreglado, el segundo criterio de re-arreglo de gen funcional es innecesario, por lo menos para el transgen ya re-arreglado. Para antecedentes en cuanto a inmunología molecular véase a Fundamental Immunology (inmunología fundamental) segunda edición (1989) Paul William E., ed., Raven Press, N.Y., que se incorpora aquí por referencia. En ciertas modalidades, los animales no humanos transgénicos utilizados para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención contienen transgenes de cadena pesada y de cadena ligera de inmunoglobulina heteróloga re-arreglada, no re-arreglada, o bien de una combinación re-arreglada y no re-arreglada en la línea germinal del animal transgénico. Cada uno de los transgenes de cadena pesada comprende por lo menos un gen CH. Además, el transgen de cadena pesada puede contener secuencias de cambio de isotipo funcional que son capaces de soportar el cambio de isotipo de un transgen heterólogo que codifica genes CH múltiples en las células B del animal transgénico. Tales secuencias de cambio pueden ser las secuencias que ocurren naturalmente en el locus de inmunoglobulina de línea germinal a partir de especies que sirven como fuentes de genes de CH de transgen, o bien tales secuencias de cambio pueden ser derivadas de las secuencias que ocurren en la especie que debe recibir el constructo de transgen (el animal transgénico) . Por ejemplo, un constructo de transgen de ser humano que se utiliza para producir un ratón transgénico puede producir una frecuencia más alta de cambios de evento de isotipo si incorpora secuencias de cambio similares a las secuencias que ocurren naturalmente en el locus de cadena pesada de ratón, puesto que probablemente las secuencias de cambio de ratón son optimizadas para funcionar con el sistema de enzima recombinasa de cambio de ratón mientras que las secuencias de cambio de ser humano no lo son. Secuencias de cambio pueden ser aisladas y clonadas por métodos de clonación convencionales, o bien pueden ser sintetizadas de novo a partir de oligonucleótidos sintéticos que se empalman diseñados con base en la información de secuencia publicada con relación a secuencias de región de cambio de inmunoglobulina (Mills y colaboradores Nucí. Acids Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras y colaboradores, Intl. Immunol. 1:631-642 (1989), que se incorporan aquí por referencia). Para cada uno de los animales transgénicos anteriores, transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera heterólogos funcionalmente arreglados se encuentran en una fracción significativa de células B del animal transgénico por lo menos el 10%) . Los transgenes utilizados para generar los animales transgénicos de la presente invención incluyen un transgen de cadena pesada que comprende ADN que codifica por lo menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de diversidad, un segmento de gen de unión y por lo menos un segmento de región constante. El transgen de cadena ligera de inmunoglobulina comprende ADN que codifica por lo menos un segmento de gen variable, o segmento de gen de unión y por lo menos un segmento de gen de región constante. Los segmentos de gen que codifican los segmentos de gen de cadena ligera y de cadena pesada son heterólogos con el animal no humano transgénico en la medida en que son derivados de ADN que codifica segmentos de cadena pesada y de cadena ligera e inmunoglobulina de una especie que no consiste del animal no humano transgénico o bien corresponden a dicho ADN. En un aspecto de la invención, el transgen es construido de tal manera que los segmentos de gen individuales no estén re-arreglados, es decir, no estén re-arreglados para que codifiquen una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina funcional. Tales transgenes no arreglan soportan la recombinación de segmentos de gen de V, D y J (re-arreglo funcional) y de preferencia soportan la incorporación de la totalidad o una parte de un segmento de gen de región de D en la cadena pesada de inmunoglobulina re-arreglada resultante dentro del animal no humano transgénico cuando está expuesto a células dendríticas. En una modalidad alternativa, los transgenes comprenden un " inilocus" no re-arreglado. Tales transgenes comprenden típicamente una porción sustancial de los segmentos C, D y J así como un sub-grupo de los segmentos de gen V. En tales constructos de transgen, las varias secuencias reguladoras, por ejemplo, promotores, realizadores, regiones de cambio de clase, secuencias donadoras de empalmes y secuencias aceptadoras de empalmes para procesamiento de ARN, señales de recombinación y similares, comprenden secuencias correspondientes derivadas del ADN heterólogo. Tales secuencias reguladoras pueden estar incorporadas en el transgen a partir de la misma especie o de una especie relacionada del animal no humano utilizado en la invención. Por ejemplo, segmentos de gen de inmunoglobulina de ser humano pueden ser combinados en un transgen con una secuencia realizadora de inmunoglobulina de roedor para su uso en un ratón transgénico. De manera alternativa, secuencias reguladoras sintéticas pueden estar incorporadas en el transgen, en donde dichas secuencias reguladoras sintéticas no son homologas a una secuencia de ADN funcional de la cual se sabe que ocurre naturalmente en los genomas de mamíferos. Secuencias reguladoras sintéticas son diseñadas de conformidad con reglas de consenso como por ejemplo, las reglas que especifican las secuencias permisibles de un sitio aceptador de empalmes o un motivo promotor/realizador. Por ejemplo, un minilocus comprende una porción de un locus de inmunoglobulina genómica que tiene por lo menos una deleción interna (es decir, no en una terminal de la porción) de una porción de ADN no esencial (por ejemplo, una secuencia de intervención; intron o porción del mismo) en comparación con el locus de Ig de línea germinal que ocurre naturalmente. En una modalidad preferida de la invención, el animal transgénico utilizado para generar anticuerpos humanos para células dendríticas contiene por lo menos una, típicamente 2-10 y a veces 25-50 o más copias del transgen descrito en el Ejemplo 12 del documento WO 98/24884 (por ejemplo pHCl o pHC2) generado con un animal que contiene una copia única de un transgen de cadena ligera descrito en los Ejemplos 5, 6, 8 ó 14 de WO 98/24884, y la progenie criada con el animal con deleción de JH descrito en el Ejemplo 10 de WO 98/24884, cuyos contenidos se incorporan expresamente aquí por referencia. Los animales son criados hasta ser homocigóticos para cada uno de estos tres rasgos. Tales animales tienen el genotipo siguiente: una copia simple (por grupo de cromosomas haploides) de un minilocus no re-arreglado de cadena pesada de ser humano (descrito en el Ejemplo 12 de WO 98/24884), una copia simple (por grupo de cromosomas haploides) de un constructo de cadena ligera K de ser humano re-arreglado (descrito en el Ejemplo 14 de WO 98/24884), y una deleción en cada locus de cadena pesada de ratón endógeno que remueve la totalidad de los segmentos JH (descritos en el Ejemplo 10 de WO 98/24884) . Tales animales son criados con ratones que son homocigóticos para la deleción de los segmentos de JH (Ejemplos 10 de WO 98/24884) para producir progenie homocigótica para la deleción de JH y hemicigótica para los constructos de cadena pesada y ligera de ser humano. Los animales resultantes son inyectados con antígenos y utilizados para la producción de anticuerpos monoclonales humanos contra estos antígenos. Células B aisladas de un animal de ese tipo son monoespecíficas con relación a las cadenas pesadas y ligeras de ser humano puesto que contienen solamente una copia de cada gen. Además, serán monoespecíficas con relación a cadenas pesadas de ser humano y de ratón puesto que ambas copias de gen de cadena pesada de ratón endógena no son funcionales en virtud de la deleción que abarca la región JH introducido de conformidad con lo descrito en el Ejemplo 9 y en el Ejemplo 12 del documento WO 98/24884. Además, una fracción sustancial de células B será monoespecífica con relación a cadenas ligeras de ser humano o de ratón puesto que la expresión de la copia simple del gen de cadena ligera K de ser humano re-arreglado excluirá alélica e isotípicamente el re-arreglo de los genes de cadena lambda y K de ratón endógenas en una fracción significativa de células B. El ratón transgénico de la modalidad preferida presentará una producción de inmunoglobulina con un repertorio significativo, idealmente sustancialmente similar a lo de un ratón naive. Así, por ejemplo, en modalidades en las cuales los genes de Ig endógenos han sido desactivados, los niveles totales de inmunoglobulina estarán dentro de un rango de aproximadamente 0.1 a 10 mg/ml de suero, de preferencia dentro de un rango de 0.5 a 5 mg/ml, de suero, e idealmente por lo menos aproximadamente 1.0 mg/ml. Cuando un transgen capaz de efectuar un cambio a IgG a partir de IgM ha sido introducido en el ratón transgénico, la proporción en ratón adulto entre IgG sérica y IgM es de preferencia aproximadamente 10:1. La proporción entre IgG y IgM será mucho menor en un ratón inmaduro. En general, más que aproximadamente 10%, de preferencia de 40 a 80% de las células B de bazo y nodo linfático expresan exclusivamente proteína IgG de ser humano. El repertorio se acercará de manera ideal a lo mostrado en un ratón transgénico, habitualmente por lo menos aproximadamente 10% tan alto de preferencia de 25 a 50% o más. En general, por lo menos aproximadamente mil inmunoglobulinas diferentes (idealmente IgG) , de preferencia de 104 a 106 o más, serán producidas según primariamente el número de regiones V. J y D diferentes introducidas en el genoma del ratón. Estas inmunoglobulinas reconocerán típicamente aproximadamente la mitad o más de las proteínas altamente antigénicas, por ejemplo, proteínas de células dendríticas. Típicamente, las por lo menos aproximadamente mil inmunoglobulinas diferentes (idealmente IgG) , de preferencia de 104 a 106 o más, serán producidas según primariamente el número de regiones V. J y D diferentes introducidas en el genoma del ratón. Estas inmunoglobulinas reconocerán típicamente aproximadamente la mitad o más de las proteínas altamente antigénicas, por ejemplo, proteínas de células dendríticas. Típicamente, las inmunoglobulinas presentarán una afinidad por antígenos preseleccionados de por lo menos aproximadamente 107M_1, de preferencia por lo menos aproximadamente 109M_1, de preferencia por lo menos aproximadamente 101:LM_1, ÍO^M-1, 1022M- 1, o más, por ejemplo, hasta 1013M-1 o más. En algunas modalidades, puede ser preferible generar los ratones con repertorios predeterminados para limitar la selección de genes V representados en la respuesta de anticuerpo a un tipo de antígeno predeterminado. Un transgen de cadena pesada que tiene un repertorio predeterminado puede comprender, por ejemplo, genes de VH de ser humano que se utilizan de manera preferente en respuestas de anticuerpo al tipo de antígeno predeterminado en seres humanos . Alternativamente, ciertos genes de VH pueden estar excluidos de un repertorio definido por varias razones (por ejemplo, tener una baja probabilidad de codificar regiones V de alta afinidad para el antígeno predeterminado; tener una baja propensión a someterse a mutación somática y afinación de afinidad; o bien son inmunogenéticos para ciertos humanos) . Así, antes del rearreglo de un transgen que contiene varios segmentos de gen de cadena pesada o de cadena ligera, tales segmentos de gen serán fácilmente identificados, por ejemplo, por hibridación o secuenciamiento de ADN, perteneciendo a una especie de organismo otro que el animal transgénico. Los ratones transgénicos de la presente invención pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de células dendríticas y/o lisado de células dendríticas de conformidad con lo descrito previamente. Los ratones producirán células V las cuales serán sometidas a cambio de clase a través de recombinación de cambio intratransgénico (cambio cis) y expresan inmunoglobulinas que reaccionan con células dendríticas. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos de secuencia de ser humano en donde los polipéptidos de cadena pesada y de cadena ligera son codificados por secuencias de transgen de ser humano, que pueden incluir secuencias derivadas por mutación somática y uniones recombinatorias de región V, así como secuencias codificadas por línea germinal; estas inmunoglobulinas de secuencia de ser humano pueden ser referidas como siendo sustancialmente idénticas para una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen VL o VH de ser humano y JL o un segmento de JL de ser humano aún cuando otras secuencias no de línea germinal pueden estar presentes como resultado de una mutación somática y uniones de recombinación V-J y V-D-J diferenciales. Con relación a tales anticuerpos de secuencias humanas, las regiones variables de cada cadena son típicamente codificadas en por lo menos 80% por segmentos de gen V, J y, en el caso de cadenas pesadas D de ser humano; frecuentemente por lo menos el 85% de las regiones variables son codificados por secuencias de línea germinal de ser humano presentes en el transgen; frecuentemente de 90 a 95% o más de las secuencias de región variable son codificados por secuencias de línea germinal de ser humano presentes en el transgen. Sin embargo, puesto que secuencias que no son de línea germinal son introducidas por mutación somática y unión VJ y VDJ, los anticuerpos de secuencias de ser humano tendrán frecuentemente ciertas secuencias de región variada (y con menor frecuencias, secuencias de región constante) que no son codificadas por segmentos de gen V, D, ó J de ser humano como se encuentra en el (los) transgen (es) de ser humano en la línea germinal de los ratones. Típicamente, tales secuencias que no son de línea germinal (o bien posiciones individuales de nucleótidos) se agruparán en CDRs o bien cerca de CDRs, o bien en regiones en las cuales mutaciones somáticas se juntan. Los anticuerpos de secuencias de ser humano que se unen a un antígeno predeterminado pueden resultar de cambio de isotipo, por ejemplo los anticuerpos humanos que comprenden una cadena ? de secuencia de ser humano (por ejemplo, ?l, ?2a, ?2B o ?3) y una cadena ligera de secuencia de ser humano (por ejemplo, K) se producen. Tales anticuerpos de secuencias de ser humano con cambio de isotipo contienen frecuentemente una o varias mutaciones somáticas, típicamente en la región variable y frecuentemente en o dentro de aproximadamente 10 residuos de una CDR) , como resultado de maduración por afinidad o selección de células B por antígeno, especialmente subsecuente a un reto antigénico secundario (o bien subsecuente) . Estos anticuerpos de secuencias de humanas de alta afinidad pueden tener afinidades de enlace de por lo menos 1 x 109 M-1' típicamente por lo menos 5 x 109 M_1, frecuentemente más que 1 x 1010 M_1, y a veces 5 x 1010 M_1 a 1 x 1011 M"1 o más. Otro aspecto de la invención se refiere a las células B de ratones que pueden ser utilizados para generar hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales de ser humano que se unen con alta afinidad (por ejemplo, más que 2 x 109 M"1) a células dendríticas. Así, en otras modalidades de la invención, estos hibridomas son utilizados para generar una composición que comprende una inmunoglobulina que tiene una constante de afinidad (Ka) de por lo menos 2 x 10 9M_1 para enlace con células dendríticas, en donde dicha inmunoglobulina comprende : Una cadena ligera de secuencia de ser humano que consiste de (1) una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen VL de ser humano y un segmento JL de ser humano, y (2) una región constante de cadena ligera que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen CL de ser humano; y Una cadena pesada de secuencia de ser humano que consiste de (1) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de polipéptido sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen VH de ser humano, opcionalmente una región D y un segmento JH de ser humano, y (2) una región constante que tiene una secuencia de polipéptido sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptido codificada por un segmento de gen CH de ser humano. El desarrollo de anticuerpos monoclonales de ser humano de alta afinidad contra células dendríticas se facilita a través de un método para ampliar el repertorio de segmentos de gen de región variable de ser humano en un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de inmunoglobulina de ser humano integrado, dicho método comprende la introducción en el genoma de un transgen de gen V que comprende segmentos de gen de región V que no están presentes en dicho transgen de inmunoglobulina de ser humano integrado. Frecuentemente, el transgen de región V es un cromosoma artificial de levadura que comprende una porción de un conjunto de segmentos de gen VH o VL (V?) de ser humano, que puede ocurrir naturalmente en un genoma humano o bien puede ser empalmado separadamente junto con métodos recombinantes, que puede incluir segmentos de gen V omitidos o bien desordenados. Frecuentemente, por lo menos 5 o más segmentos de gen V funcionales están contenidos en el YAC. En esta variación, es posible elaborar un ratón transgénico producido por le método de expansión de repertorio V, en donde el ratón expresa una cadena de inmunoglobulina que comprende una secuencia de región variable codificada por un segmento de gen de región V presente en el transgen de región V y una región C codificada en el transgen de Ig de ser humano. A través del método de expansión de repertorio V, ratones transgénicos que tienen por lo menos 5 genes V distintos pueden ser generados; así como ratones que contienen por lo menos aproximadamente 25 genes 24 V o más. Algunos segmentos de gen V pueden ser no funcionales (por ejemplo pseudogenes y similares) ; estos segmentos pueden ser conservados o bien pueden ser removidos selectivamente por métodos recombinantes disponibles al experto en la materia, si se desea. Una vez que la línea germinal de ratón ha sido manipulada para que contenga una YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V expandido, sustancialmente no presente en el transgen de Ig de ser humano que contiene los segmentos de gen J y C, el rasgo puede ser propagado e integrado en otros fondos genéticos, incluyendo fondos en donde YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V ampliado es integrado en una línea germinal de ratón que tiene un transgen de Ig de ser humano diferente. Múltiples YACs funcionales que tienen un repertorio de segmentos V expandido pueden ser integrados en una línea germinal para funcionar con un transgen de Ig de ser humano (o bien múltiples tansgenes de Ig de ser humano) . Aún cuando se conoce aquí como transgenes YAC, a estos transgenes cuando están integrados en el genoma les puede faltar sustancialmente secuencias de levadura, tales como secuencias requeridas para replicación autónoma en levadura; tales secuencias pueden ser removidas opcionalmente por manipulación genética (por ejemplo, digestión por restricción y electroforesis en gel de campo impulsado o bien otro método adecuado) después de replicación en levadura ya no es necesario (es decir, antes de la introducción en una célula ES de ratón o procigoto de ratón) . Métodos para propagar el rasgo de expresión de inmunoglobulina de secuencia humana, incluyen la crianza de un ratón transgénico que tiene el (los) transgen (es) de Ig de ser humano y opcionalmente que tienen también un YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V ampliado. Tanto segmentos de gen VH como VL pueden estar presentes en el YAC. El ratón transgénico puede ser criado en cualquier fondo deseado por el practicante, incluyendo fondos que contienen otros transgenes humanos, incluyendo transgenes de Ig de ser humano y/o transgenes que codifican otras proteínas de linfocito de ser humano. La invención ofrece también inmunoglobulina de secuencia humana de alta afinidad producida por un ratón transgénico que tiene Un transgen de YAC de repertorio de región V ampliado. Aún cuando lo anterior describe una modalidad preferida del animal transgénico de la presente invención, otras modalidades se contemplan las cuales han sido clasificadas en cuatro categorías: I . Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesado no rearreglado y ligero rearreglado; II. Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesado no rearreglado y ligero no rearreglado; III. Animal transgénico que contiene un transgen de inmunoglobulina pesado rearreglado y ligero no rearreglado; y IV. Animales transgénicos que contienen transgenes de inmunoglobulina pesados rearreglados y ligeros rearreglados . Entre estas categorías de animal transgénico, el orden preferido de preferencia es el siguiente II>I>III>IV en donde los genes endógenos de cadena ligera (o bien por lo menos el gen K) han sido noqueados por recombinación homologa (o bien otros métodos) y I>II>III>IV en donde los genes endógenos de cadena ligera no han sido noqueados y deben ser dominados por exclusión alélica. III. Moléculas biespecificas/multiespecificas que se unen a células dendríticas En otra modalidad de la invención, anticuerpos monoclonales humanos para células dendríticas, o bien porciones de unión con antígeno de los mismos, pueden ser derivados o enlazados a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab') para generar una molécula biespecífica o multiespecífica que se une a múltiples sitios de unión o epítopos blanco. Por ejemplo, una anticuerpo o porción de unión con antígeno de la presente invención puede estar enlazada funcionalmente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro tipo) a una o varias otras moléculas de unión, por ejemplo, otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de enlace. Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que comprenden por lo menos una primera especificidad de enlace para células dendríticas y una segunda especificidad de enlace par un segundo epítopo blanco. En una modalidad preferida de la invención, el segundo epítopo blanco es un antígeno en una célula objetivo, por ejemplo un antígeno de célula tumoral, un antígeno microbiano, un antígeno viral o un autoantígeno. Estas moléculas biespecíficas y multiespecíficas enfocan células dendríticas hacia células objetivo de tal manera que las células dendríticas puedan modular una respuesta inmunológica contra dicha célula objetivo o antígeno de célula objetivo. En otra modalidad de la invención, el segundo epítopo objetivo es un receptor Fc, por ejemplo, Fc?RI humano (CD64) o bien un receptor Fca humano (CD89) . Por consiguiente, la invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que pueden unirse tanto con células efectoras que expresan Fc?R, FcaR, o FceR (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMNs)), como a células dendríticas. Estas moléculas biespecíficas y multiespecíficas enfocan células dendríticas hacia células efectoras y, como los anticuerpos monoclonales humanos de la invención, pueden desencadenar actividades de células efectoras mediadas por receptor Fc, por ejemplo fagocitosis de células dendríticas, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpo (DAC) , liberación de citocinas, o bien generación de anión superóxido. Moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención pueden incluir además una tercera especificidad de enlace, además de una especificidad de enlace anti-Fc o un antígeno anticélula objetivo, y una especificidad de enlace anti células dendríticas. En una modalidad, la tercera especificidad de enlace es una porción de factor antireaice (EF) , por ejemplo, una molécula que se une a una proteína superficial involucrada en una actividad citotóxica, e incrementa de esta forma la respuesta inmunológica contra la célula objetivo. La "porción de factor antirealce" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional, o bien un ligando que se une a una molécula dada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y resulta de esta forma en una mejora del efecto de los determinantes de enlace para el receptor Fc, antígeno de célula objetivo o célula dendrítica. La "porción antifactor de incremento" puede unir un receptor Fc, un antígeno de célula objetivo, o célula dendrítica. Alternativamente, la porción antifactor de incremento puede unirse a una entidad diferente de la entidad a la cual se unen la primera especificidad de enlace y la segunda especificidad de enlace. Por ejemplo, la porción antifactor de realce puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo, a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1) o bien otra célula inmunológica que resulta en una respuesta inmunológica incrementada contra la célula blanco. En una modalidad, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención comprenden como especificidad de unión por lo menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv o bien un Fv de cadena simple. El anticuerpo puede también ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o bien un fragmento mínimo del mismo, por ejemplo, un Fv o un constructo de cadena simple de conformidad con lo descrito en Ladner y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,946,778, expedida el día 7 de Agosto de 1990, cuyos contenidos se incorporan expresamente por referencia. En una modalidad, moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención comprenden una especificidad de enlace para un antígeno en una célula objetivo, por ejemplo, un antígeno de célula tumoral, un antígeno microbiano, un antígeno viral, o un autoantígeno, y una segunda especificidad de unión para células dendríticas. En otra modalidad, moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención comprenden una especificidad de unión para una Fc?R o FcaR presente en la superficie de una célula efectora, y una segunda especificidad de unión para células dendríticas. En una modalidad, la especificidad de unión para un receptor Fc se proporciona a través de un anticuerpo monoclonal humano, cuya unión no es bloqueada por inmunoglobulina humana G (IgG) . Como se emplea aquí, el término "receptor de IgG" se refiere a cualesquiera de los 8 genes de cadena ? ubicados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor soluble o transmembrana que están agrupados en tres clases de receptores Fc?: Fc?RI (CD64), Fc?RII (CD32), y Fc?RIII (CD16) . En una modalidad preferida, el receptor Fc? es un receptor Fc?RI de alta afinidad de ser humano. El Fc?RI de ser humano es una molécula de 72 kDa, que muestra alta afinidad para IgG monomérica (108 - 109 M_1) . La producción y caracterización de estos anticuerpos monoclonales preferidos son descritos por Fanger y colaboradores en la solicitud PCT WO 88/00052 y en la Patente Norteamericana No. 4,954,617, cuyas enseñanzas se incorporan totalmente aquí por referencia. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de Fc?RI, Fc?RII o Fc?RIII en un sitio distinto del sitio de unión de Fc? del receptor y, por consiguiente, su unión no es bloqueada sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Anticuerpos anti- Fc?RI específicos útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce mAb 32 esta disponible en American Type Culture Collection, ATCC Número de acceso HB9469. mAb 22 anti Fc?RI, fragmentos F(ab')2 de mAb 22, pueden obtenerse a partir de Medarex, Inc. (Annandale, N.J.) . En otras modalidades, el anticuerpo anti-receptor Fc? es una forma humanizada de un anticuerpo monoclonal 22 (H22) . La producción y caracterización del anticuerpo H22 es descrita en Graciano, R.F. y colaboradores (1995) J. Immunol 155 (10) : 4996-5002 y PCT/US93/10384. la línea de células que producen anticuerpo H22 fue depositada ante el American Type Culture Collection el día 4 de Noviembre de 1992 bajo la designación HA022CL 1 y tiene el número de acceso CRL 11177. En otras modalidades preferidas, la especificidad de enlace para un receptor Fc se proporciona a través de un anticuerpo que se une a un receptor de IgA de ser humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89) ) , cuya unión de preferencia no es bloqueada por inmunoglobulina A (IgA) . El término "receptor de IgA" incluye el producto génico de un a-gen (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Este gen es conocido por codificar varias isoformas de transmembrana alternativamente empalmadas de 55 110 kDa. FcaRI (CD89) es expresado constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinofílicos y neutrofílicos, pero no en poblaciones de células no efectoras. FcaRI tiene afinidad media (« 5 x 107 M"1) tanto para IgAl como IgA2, que se eleva al exponerse a citosinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H.C. y colaboradores (1996) Critical Reviews in Immunology [Reseñas críticas en inmunología], 16:423-440). Cuatro anticuerpos monoclonales específicos para FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen con FcaRI fuera del dominio de enlace de ligando de IgA, han sido descritos (Monteiro, R.C. y colaboradores, 1992, J. Immunol . 148:1764) . FcaRI y Fc?RI son receptores de activadores preferidos para su uso en la invención puesto que (1) son expresados primariamente en células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMNs, macrófagos y células dendríticas; (2) son expresados en niveles altos (por ejemplo, 5,000-100,000 por célula) ; (3) son mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, DAC, fagocitosis); (4) mediar una presentación incrementada de antigenos, incluyendo autoantígenos, enfocados hacia ellos. En otras modalidades, moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención comprenden además una especificidad de unión que reconoce, por ejemplo, se une a células dendríticas, por ejemplo, un antígeno en una célula dendrítica. En una modalidad preferida, la especificidad de unión es proporcionada por un anticuerpo monoclonal de la presente invención. Un "anticuerpo específico para células efectoras" como se emplea aquí se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional que se une al receptor Fc de células efectoras. Anticuerpos preferidos para su uso en la presente invención unen el receptor Fc de células efectoras en un sitio que no es unido por inmunoglobulina endógena. Como se emplea aquí, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmunológica involucrada en la fase efectora de una respuesta inmune, a diferencia de las fases cognoscitivas y de activación de una respuesta inmunológica. Célula inmunológicas ejemplares, incluyen una célula de un origen mieloide o linfoide, por ejemplo, linfocitos (por ejemplo, células B y células T que incluyen células T citolíticas (CTLs) ) , células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares, granulocitos, mastocitos, y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fc específicos y llevan a cabo funciones inmunológicas específicas. En modalidades preferidas, una célula efectora puede inducir una citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (DAC), por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, monocitos, macrófagos, que expresan FcR están involucrados en la muerte específica de células objetivo y presentan antígenos a otros componentes del sistema inmunológico, o bien se unen a células que presentan antígenos. En otras modalidades, una célula efectora puede someter a fagocitosis un antígeno objetivo, célula objetivo, o microorganismo. La expresión de un FcR particular en una célula efectora puede ser regulada por factores humorales tales citosinas. Por ejemplo, la expresión de Fc?RI es regulada de manera ascendente por interferon gamma (IFN-?) . Esta expresión incrementada elevada la actividad citotóxica de células que llevan Fc?RI contra blancos. Una célula efectora puede someter a fagocitosis o lisis un antígeno objetivo o una célula objetivo. La expresión "célula blanco" o "célula objetivo" se refiere a cualquier célula indeseable en un sujeto (por ejemplo, un ser humano o un animal) que puede ser enfocada por una composición (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano, una molécula biespecífica o multiespecífica) de la invención. En una modalidad, la célula blanco es una célula dendrítica. En otras modalidades, una célula blanco incluye una célula tumoral, un patógeno microbiano, un virus, o una célula infectada por virus. Mientras se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden ser empleados en las moléculas biespecíficas o multiespecíficas de la presente invención son anticuerpos monoclonales de murino, quiméricos y humanizados. Anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón-ser humano (es decir, anticuerpos quiméricos) pueden ser producidos por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal de murino (o bien otras especies) es digerido con enzimas de restricción para remover la región que codifica el Fc de murino, y la porción equivalente de un gen que codifica una región constante de Fc de ser humano es sustituida. (Véase Robinson y colaboradores, Publicación de Patente Internacional PCT/US 86/02269; Akira y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M. Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger y colaboradores, Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,816,567; Cabilly y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 125,023; Better y colaboradores, (1988 Science 204:1041-1043); Liu y colaboradores (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu y colaboradores, 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun y colaboradores (1987) PNAS 84:214-218; Níshimura y colaboradores, 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood y colaboradores (1985) Nature 314:446-449; y Shaw y colaboradores, 1988, J. Nati Cáncer Inst. 80:1553-1559). El anticuerpo quimérico puede ser humanizado adicionalmente mediante el reemplazo de secuencias de la región variable Fv que no están involucradas directamente en unión con antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables de Fv de ser humano. Reseñas generales de anticuerpos quiméricos humanizadas proporcionadas por Morrison, S.L., 1985, Sci ence 229:1202-1207 y por Oi y colaboradores, 1986, BioTechniques 4:214. Estos métodos incluyen el aislamiento, manipulación y expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o una parte de las regiones variables de Fv de inmunoglobulina de por lo menos una cadena pesada o una cadena ligera. Fuentes de dicho ácido nucleico son bien conocidas por parte de los expertos en la materia y, por ejemplo, pueden obtenerse a partir de 7E3, un hibridoma que produce anticuerpo anti-GPIIbIIIa. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo quimérico o fragmento del mismo, puede 5 entonces ser clonado en un vector de expresión apropiado. Anticuerpos humanizados adecuados pueden ser producidos • alternativamente por sustitución de CDR, patente Norteamericana No. 5,225,539; Jones y colaboradores, 1986 Nature 321:553-525; Verhoeyan y colaboradores, 1988 Science 10 239:1534; y Biedler y colaboradores, 1988 J. Immunol. 141:4053-4060. • Todas las CDRs de un anticuerpo humano particular pueden ser reemplazadas con por lo menos una porción de una CDR no humana o bien solamente algunas de las CDRs pueden ser 15 reemplazadas por CDRs no humanas. Es solamente necesario reemplazar el número de CDRs que se requiere para unión del anticuerpo humanizado con el receptor Fc. Un anticuerpo puede ser humanizado por cualquier método, que es capaz de reemplazar por lo menos una porción de una CDR de 20 un anticuerpo humano con una CDR derivada de un anticuerpo no humano. Winter describe un método que puede ser utilizado para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (solicitud de Patente de la Gran Bretaña (GB 2188638A, presentada el día 26 de Marzo de 1987), cuyos 25 contenidos se incorporan expresamente aquí por referencia.
Los CDRs de ser humano pueden ser reemplazadas por CDRs no humanas empleando mutagénesis dirigidas hacia sitio de nucleótidos de conformidad con lo descrito en la Solicitud Internacional WO 94/10332 titulada, Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes [Anticuerpos Humanizados para Receptores Fc para Inmunoglobulina G en Fagocitos Mononucleares Humanos] . Asimismo, dentro del alcance de la presente invención, se encuentran anticuerpos quiméricos y humanizados en los cuales aminoácidos específicos han sido sustituidos, removidos o agregados. En particular, anticuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región de estructura, como para mejorar la unión al antígeno. Por ejemplo, en un anticuerpo humanizado que tiene CDRs de ratón, aminoácidos ubicados en la región de estructura humana pueden ser reemplazados por los aminoácidos ubicados en las posiciones correspondientes en el anticuerpo de ratón. Se sabe que tales sustituciones mejoran la unión de los anticuerpos humanizados con el antígeno en algunos casos. Anticuerpos en los cuales aminoácidos han sido agregados, removidos o sustituidos se conocen aquí como anticuerpos modificados o bien anticuerpos alterados. El término anticuerpo modificado se contempla también para incluir anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que han sido modificados por ejemplo por remoción, adición o sustitución de porciones del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser modificado mediante la remoción de la región constante y su reemplazo por una región constante cuyo propósito es incrementar la vida media, por ejemplo, vida media sérica, estabilidad o afinidad del anticuerpo. Cualquier modificación se encuentra dentro del alcance de la presente invención en la medida en que la molécula biespecífica y multiespecífica tiene por lo menos una región de unión con antígeno específica para un Fc?R y activa por lo menos una función efectora. Moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención pueden elaborarse empleando técnicas químicas (véase, por ejemplo, D.M. Kranz y colaboradores (1981) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 78:5807), técnicas de "polidoma" (véase Patente Norteamericana No. 4,474,893, de Reading), o bien técnicas de ADN recombinante. En particular, moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención pueden prepararse mediante la conjugación de las especificidades de unión constituyentes, por ejemplo, las especificidades de unión anti-FcR y anticélulas dendríticas, empleando métodos conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos proporcionados aquí. Por ejemplo cada especificidad de unión de la molécula biespecífica y multiespecífica puede ser generada separadamente y después conjugada entre ellas. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, varios agentes de acoplamiento o de reticulación pueden ser empleados para conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5, 5' -ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DNTB) , o-fenilendimaleimida (oPDM) , N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , y 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase, por ejemplo, Karpovsky y colaboradores (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan y colaboradores (Science (1985) 229:81-83), y Glennie y colaboradores (J. Im unol. (1987) 139:2367-2375). Agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) . Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos (por ejemplo, dos anticuerpos humanizados), pueden ser conjugados a través de enlace sulfhidrilo de las regiones bisagras de terminal C de las dos cadenas pesadas. En la modalidad particularmente preferida, la región bisagra es modificada de tal manera que contenga un número impar de residuos sulfhidrilo, de preferencia un residuo sulfhidrilo, antes de la conjugación.
Alternativamente, ambas especificidades de enlace pueden ser codificadas en el mismo vector y expresada y ensambladas en la misma célula huésped. Este método es especialmente útil cuando la molécula biespecífica y multiespecífica es mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ó bien una proteína de fusión ligando x Fab. Una molécula biespecífica y multiespecífica de la presente invención, por ejemplo, una molécula biespecífica puede ser una molécula de cadena única, como por ejemplo, un anticuerpo biespecífico de cadena única, una molécula biespecífica de cadena única que comprende un anticuerpo de una sola cadena, y un determinante de enlace, o bien una molécula biespecífica de cadena única que comprende dos determinantes de unión. Moléculas biespecíficas y multiespecíficas pueden también ser moléculas de cadena simple o bien pueden comprender por lo menos dos moléculas de cadena simple. Métodos para preparar moléculas biespecíficas y multiespecíficas se describen por ejemplo en la patente Norteamericana No. 5,260,203; patente Norteamericana No. 5,455,030; patente Norteamericana No. 4,881,175; patente Norteamericana No. 5,132,405; patente Norteamericana No. 5,091,513; patente Norteamericana No. 5,476,786; patente Norteamericana No. 5,013,653; patente Norteamericana No. 5,258,498 y en la patente Norteamericana No. 5,482,858. La unión de las cadenas biespecíficas y multiespecíficas con sus blancos específicos puede ser confirmada por ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA) , un radioinmunoensayo (RÍA) , un análisis FACS, un bioensayo (por ejemplo inhibición de crecimiento) o bien un Ensayo Western Blot. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular mediante el empleo de un reactivo etiquetado (por ejemplo, un anticuerpo) , específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo pueden ser detectados utilizando, por ejemplo, un anticuerpo enlazado a enzima o bien un fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente con los complejos anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden ser detectados empleando cualesquiera de varios otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser etiquetado de manera radioactiva y utilizado en un radioinmunoensayo (RÍA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques [Principios de Radioinmunoensayos, Séptimo Curso de Capacitación en Materia de Técnicas de Ensayo de Radioligandos], The Endocrine Society, Marzo, 1986, que se incorpora aquí por referencia. El isótopo radiactivo puede ser detectado por medios, por ejemplo el uso de un contador de gama o un contador de centelleo o bien mediante autoradiografía . IV. Conjugados de Anticuerpo/Inmunotoxinas En otro aspecto, la presente invención presenta un anticuerpo monoclonal anti-células dendríticas, de ser humano o un fragmento del mismo, conjugado a una porción terapéutica, como por ejemplo una citotoxina, un fármaco o un radioisótopo. Cuando están conjugados con una citotoxina, estos conjugados de anticuerpo se conocen como "inmunotoxinas" . Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células (por ejemplo, mata las células) . Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitocina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, cochicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitranmicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Agentes terapéuticos incluyen, sin limitarse a ellos, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina) , agentes de alquilación (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina de platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina (antes daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antes actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes antimicótícos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) . Un anticuerpo de la presente invención puede estar conjugado a un radioisótopo, por ejemplo, yodo radiactivo, con el objeto de generar radiofarmacéuticos citotóxicos para el tratamiento de un trastorno relacionado con célula dendríticas, como por ejemplo una enfermedad autoinmunológica o inflamatoria, o bien una enfermedad de injerto versus huésped. Los conjugados de anticuerpo de la presente invención pueden ser utilizados para modificar una respuesta biológica dada, y la porción farmacéutica no se considera como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción farmacéutica puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo de la misma, como por ejemplo abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas, o bien toxinas de difteria; una proteína, como por ejemplo factor de necrosis tumoral o bien interferon-gamma; o bien, modificadores de la respuesta biológica, por ejemplo linfocinas, interleucina-1 ("IL-1") , interleucina-2 ("IL-2") , interleucina-6 ("IL-6") , factor de estimulación de colonias de macrófagos granulocitos ("GMCSF") , factor de estimulación de colonias de granulocitos ("G-CSF"), y otros factores de crecimiento.
Técnicas para conjugar una porción terapéutica de este tipo con anticuerpos son bien conocidos, véase por ejemplo, Arnon y colaboradores, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs In Cáncer Therapy" [Anticuerpos Monoclonales para el Inmunoenfoque de Fármacos en Terapia contra el Cáncer] , en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy [Anticuerpos Monoclonales y Terapia contra el Cáncer] , Reisfeld y colaboradores. (eds), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ; Hellstrom y colaboradores, "Antibodies For Drug Delivery" [Anticuerpos para Administración de Fármacos], en Controlled Drug Delivery [Administración Controlada de Fármacos] (2a Edición), Robinson y colaboradores (eds.) páginas 623-653 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Torpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Review" ["Vehículos Anticuerpos de Agentes Citotóxicos en Terapia contra el Cáncer: una reseña], en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications [Anticuerpos Monoclonales '84: aplicaciones Biológicas y Clínicas], Pinchera y colaboradores (eds.), páginas 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cáncer Therapy" [Análisis, Resultados y Perspectivas Futuras del Uso Terapéutico de Anticuerpos Radiomarcados en Terapia contra el Cáncer] , en Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy [Anticuerpos Monoclonales para Detección y Terapia del Cáncer], Baldwin y colaboradores (eds.) páginas 303-16 (Academic Press 1985) , y Torpe y colaboradores, "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates" [Preparación y Propiedades Citotóxicas de Conjugados Anticuerpo-Toxina], Immunol. Rev., 62:119-58 (1982) . En otro aspecto, anticuerpos humanos específicos para células dendríticas pueden ser empleados para enfocar directamente células enteras (por ejemplo, una célula tumoral, una célula efectora, o un patógeno microbiano, hacia células dendríticas. Anticuerpos anti-células dendríticas o bien fragmentos de unión de antígeno de los mismos pueden ser expresados directamente en la superficie de una células, por ejemplo por transfección o transducción de una célula con un vector que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo específico para células dendríticas de ser humano de la presente invención, o bien fragmento de unión de antígeno del mismo. Esto puede efectuarse, por ejemplo, por transfección de la célula blanco con un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que contiene un dominio de transmembrana y un anticuerpo anti-células dendríticas de ser humano, o fragmento de unión de antígeno del mismo. Métodos para generar tales ácidos nucleicos, proteínas de fusión y células que expresan tales proteínas de fusión se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente Norteamericana No. de Serie 09/203,958 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Alternativamente, anticuerpos anti-células dendríticas, o bien fragmentos de unión de antígeno de las mismas, pueden estar unidas a una célula o un patógeno a través del uso de enlazadores químicos, etiquetas de lípidos, o bien otros métodos relacionados (deKruif, J y colaboradores (2000) Nat . Med. 6:223-227; Nizard, P. y colaboradores (1998) FEBS Lett . 433:83-88). Células con anticuerpos anti-células dendríticas anclados en la superficie, o bien fragmentos de enlace de antígeno de los mismos pueden emplearse para inducir respuestas inmunológicas específicas contra las células, por ejemplo, una célula tumoral o un patógeno microbiano. V. Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención ofrece composiciones terapéuticas, por ejemplo composiciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo monoclonal o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos, o bien porción (es) de enlace con antígeno, de la presente invención, formuladas juntas con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir además otros reactivos terapéuticos, como por ejemplo otros anticuerpos, citotoxinas o fármacos (por ejemplo, inmunosupresores) , y pueden ser administradas solas o en combinación con otras terapias, como por ejemplo radiación.
En una modalidad, anticuerpos monoclonales anti-células dendríticas de ser humano que tienen actividades complementarias se emplean en combinación, por ejemplo, como composición farmacéutica, que comprende dos o más anticuerpos monoclonales anti-células dendríticas de ser humano. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano que media la muerte altamente efectiva de células dendríticas en presencia de células efectoras puede ser combinado con otro anticuerpo monoclonal humano que inhibe el crecimiento de las células dendríticas. En otra modalidad, un anticuerpo monoclonal humano rápidamente internalizado por células dendríticas puede ser combinado con otro anticuerpo monoclonal humano que induce actividades de células de presentación de antígeno de células dendríticas, por ejemplo, liberación de citocinas inmunoestimuladoras. En otra modalidad, la composición comprende una molécula biespecífica o multiespecífica de la invención o bien una combinación de moléculas biespecíficas o multiespecíficas de la invención (por ejemplo, que contienen por lo menos una especificidad de enlace para un receptor Fc y por lo menos una especificidad de enlace para células dendríticas) . En otra modalidad, la composición comprende por lo menos una especificidad de enlace para células dendríticas funcionalmente enlazadas a otra entidad molecular, por ejemplo, una citotoxina, o un antígeno, por ejemplo, un antígeno en una célula blanco. Como se emplea aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y anti-fúngicos, agentes de retardo de absorción e isotónicos, y similares fisiológicamente compatibles. De preferencia, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión) . Según la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, molécula biespecífica y multiespecífica, puede ser revestido en un material para proteger el compuesto contra la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto. La expresión "una sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no proporciona ningún efecto toxicológico indeseado (véase, por ejemplo Berge, S.M. y colaboradores (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Sales de adición de ácido incluyen las sales derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido bromhídrico, ácido bromoyódico, ácido fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos monocarboxílicos y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Sales de adición de bases incluyen las sales derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no toxicas, por ejemplo N,N' -dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares. Una composición de la presente invención puede ser administrada a través de varios métodos conocidos en la técnica. Como lo observará un experto en la materia, la vía y/o modo de administración variará según los resultados deseados. Los compuestos activos pueden ser preparados con vehículos que protegerán el compuesto contra una liberación rápida, como por ejemplo formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados . Polímeros biodegradables, biocompatibles pueden emplearse, por ejemplo, acetato de etileno vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son patentados o conocidos generalmente de los expertos en la materia, véase por ejemplo Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems [Sistema de Administración de Fármaco de Liberación Sostenida y Controlada], J.R., Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Para administrar un compuesto de la presente invención a 5 través de ciertas vías de administración, puede ser necesario revestir el compuesto o bien co-administrar el compuesto con • un material para activar su desactivación. Por ejemplo, el compuesto puede ser administrado a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo liposoma, o un diluyente. Diluyentes 10 farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones salinas y soluciones amortiguadoras acuosas. Liposomas incluyen • emulsiones CGF de agua-en-aceite-en-agua así como liposomas convencionales (Strejan y colaboradores (1984) J. Neuroimmunol . 7:27). 15 Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. 20 Excepto en la medida en que un medio convencional o agente es incompatible con el compuesto activo, el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención se contempla. Compuestos activos suplementarios pueden también incorporados en las composiciones. 25 Composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como solución, microemulsión, liposoma o bien otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etano, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y propilenglicol líquido, similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, a través del uso de un revestimiento, por ejemplo lecítina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en el caso de dispersión, y mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo sales de monoestearato y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno de los ingredientes o una combinación de los ingredientes mencionados arriba, según lo requerido, seguido por microfiltración de esterilización. En general, se preparan dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo en el vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los mencionados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secados en vacío y secado por congelación (liofilización) que proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada de manera estéril del mismo. Regímenes de dosificación se ajustan con el objeto de proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, un bolo único puede ser administrado, varias dosis divididas pueden ser administradas durante un período de tiempo o bien la dosis puede ser reducida proporcionalmente o incrementada proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente provechoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Una forma de unidad de dosificación como se emplea aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una unidad predeterminada de compuesto activo que se calcula para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la presente invención dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos como compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfato de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, por ejemplo palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, propil galato, alfa-tocoferol, y similares; y (3) agentes de quelación de metal, como por ejemplo ácido cítrico, ácido etilendiamin tetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares . Para las composiciones terapéuticas, formulaciones de la presente invención incluyen las formulaciones adecuadas para administración oral, nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en forma de dosificación unitaria y pueden ser preparadas a través de cualquier método conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de ingrediente activo que puede ser combinado con un material de vehículo para producir una forma de dosificación individual variará según el sujeto a tratar, y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material vehículo para producir una forma de dosificación individual será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, esta cantidad se encontrará dentro de un rango de aproximadamente 0.01 por ciento a aproximadamente 99 por ciento del ingrediente activo, de preferencia de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, con mayor preferencia de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento. Formulaciones de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal incluyen también pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de rocío que contienen tales vehículos como se sabe en la técnica que son apropiadas. Formas de dosificación para administración tópica o transdérmicas de composiciones de esta invención incluyen polvos, rocíos, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservador, amortiguador, o impelente que pueda requerirse. Las expresiones "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como se emplea aquí, se refieren a modos de administración otros que la administración enteral y tópica, habitualmente por inyección, e incluye, sin limitarse a estos ejemplo, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal . Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de olivo y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se puede mantener una fluidez apropiada, por ejemplo mediante el uso de materiales de revestimiento tales como lecitina, por el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en caso de dispersiones y por el uso de surfactantes. Estas composiciones pueden contener adyuvantes, tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos puede asegurarse tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico y similares, puede también ser deseable incluir agentes isotónicos tales como azucares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, una absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede proporcionarse mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando los compuestos de la presente invención son administrados como agentes farmacéuticos, a seres humanos y animales, pueden ser administrados solos o bien como composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, de 0.01 a 99.5% (de preferencia de 0.1 a 90%) del ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden ser utilizados en forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, son formulados en formas de dosificación farmacéuticamente aceptable por métodos convencionales conocidos por parte de los expertos en la materia. Niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser variados con el objeto de obtener una cantidad de ingrediente activo que es efectivo para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular, composición específica y modo de administración particular sin ser toxico para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de varios factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o el éster, sal, o amida de la misma, la vía de administración, la hora de administración, la velocidad de expresión del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia medica previa del paciente tratado, y factores similares bien conocidos en la técnica medica. Un médico o veterinario con una habilidad ordinaria en la materia puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría empezar con dosis de los compuestos de la invención empleadas en la composición farmacéutica en niveles inferiores que los niveles requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado, e incrementar gradualmente la dosificación hasta lograr el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la presente invención será una cantidad del compuesto que es la menor dosis efectiva para producir un efecto terapéutico. Dicha dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos arriba. Se prefiere que la administración sea intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, o subcutánea, de preferencia cerca del sitio del objetivo. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición terapéutica puede ser administrada como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sub-dosis administradas separadamente a intervalos apropiados en el dia, opcionalmente en formas de dosificación unitarias. Mientras es posible administrar solo un compuesto de la presente invención, es preferible administrar el compuesto de la presente invención como una formulación farmacéutica (composición) . Composiciones terapéuticas pueden ser administradas con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la presente invención puede ser administrada con un dispositivo de inyección hipodérmico sin agujas, como por ejemplo dispositivo divulgados en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o bien 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: Patente Norteamericana No. 4,487,603, que divulga una bomba de micro-infusión implantable para suministrar fármaco a un régimen controlado; Patente Norteamericana No. 4,486,194, que divulga un dispositivo terapéutico para administrar fármaco a través de la piel; Patente Norteamericana No. 4,447,233, que divulga una bomba de infusión de fármaco para administrar un fármaco a un régimen de infusión precisa; Patente Norteamericana No. 4,447,224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; la Patente Norteamericana No. 4,439,196, que divulga un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámaras múltiples; y Patente Norteamericana No. 4,475,196, que divulga un sistema de administración de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan aquí por referencia. Muchos otros implantes de este tipo, sistemas de administración, y módulos son conocidos por parte de los expertos en la materia. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención pueden ser formulados para asegurar una distribución apropiada in vivo . Por ejemplo, la barrera hemato-encefálica ( (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la presente invención atraviesan la barrera hemato-encefálica (si se desea) , pueden ser formulados por ejemplo en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o varias porciones que son transportadas selectivamente en células específicas u órganos específicos, incrementando así la administración enfocada de fármaco (véase por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin . Pharmacol . 29:685). Porciones de enfoque ejemplares incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,416,016 de Low y colaboradores); manósidos (Umezawa y colaboradores, (1988) Biochem Biophys . Res . Común . 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman y colaboradores (1995) FEBS Lett . 357:140; M. Owais y colaboradores (1995) Antimicrob. Chemother. 39:180); receptor de proteína A de surfactante (Briscoe y colaboradores (1995) Am. J. Physiol . 1233:134), diferentes especies las cuales pueden comprender las formulaciones de la invención, así como componentes de las moléculas inventadas; pl20 (Schreier y colaboradores (1994) J. Biol . Chem. 269:9090; véase también K. Keinanen; M: L: Laukkanen (1994) FEBS Lett . 346:123; J. J: Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. En una modalidad de la invención, los compuestos terapéuticos de la presente invención son formulados en liposomas; en una modalidad más preferida, los liposomas incluyen una porción de enfoque. En una modalidad más preferida, la composición terapéutica en el liposoma son administrados por inyección de bolo en un sitio cercano al tumor o infección. La composición puede estar fluida en la medida en que existe una capacidad de manejarla fácilmente con jeringa. Debe presentar estabilidad en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.
Una "dosificación terapéuticamente efectiva" modula de preferencia el crecimiento y/o la actividad de células dendríticas en por lo menos aproximadamente 20%, con mayor preferencia en por lo menos aproximadamente 40%, con preferencia aún mayor en por lo menos aproximadamente 60%, y con preferencia todavía mayor en por lo menos aproximadamente en 80% con relación a sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular el crecimiento y/o la actividad de células dendríticas puede ser evaluada en un sistema de modelo de animal predictivo de la eficacia de la presentación y/o inmunomodulación de antígeno. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede ser evaluada mediante el examen de la capacidad del compuesto para modular la estimulación de células inmunogénicas por células dendríticas, como por ejemplo in vi tro a través de ensayos descritos aquí y conocidos por parte del experto en la materia. En una modalidad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede inhibir el crecimiento y/o actividad de células dendríticas, o bien puede mejorar de otra manera síntomas, por ejemplo, síntomas de auto-inmunidad, en un sujeto. En otra modalidad una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede incrementar el procesamiento y presentación de antígenos por células dendríticas, y por consiguiente incrementar respuestas inmunológicas contra un inmunógeno o 1UO antigen blanco. Una persona con conocimientos normales en la materia podría determinar tales cantidades con base en factores tales como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, la actividad inmune en el sujeto, y la composición particular o vía de administración seleccionada. La composición debe ser estéril y fluida en la medida en que la composición puede administrarse a través de una jeringa. Además de agua, el vehículo puede ser una solución salina amortiguada isotónica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol. Y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Una fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, a través del uso de un revestimiento, por ejemplo, lecitina, mediante el mantenimiento de un tamaño requerido de partículas en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, poli-alcoholes, tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción de largo plazo de las composiciones inyectables puede ser proporcionada mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina. Cuando el compuesto activo es protegido adecuadamente, de conformidad con lo descrito arriba, el compuesto puede ser administrado oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. VI . Usos y Métodos de la Invención Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales humanos para células dendríticas y derivados/conjugados de los mismos) de la presente invención tienen utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vi tro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas pueden ser administradas a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o bien en un sujeto, por ejemplo, in vi vo para tratar, prevenir o diagnosticar varios trastornos. Como se emplea aquí, el término "sujeto" incluye seres humanos y animales no humanos. El término "animales no humanos" de la presente invención incluye todos los vertebrados, como por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, como por ejemplo primates no humanos, ovejas,, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. En una modalidad particular, los anticuerpos humanos y derivados de los mismos se emplean in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar varias enfermedades mediadas por células dendríticas o relacionadas con células dendríticas. En una modalidad, los animales humanos preferidos incluyen un paciente humano que tiene una enfermedad mediada por células dendríticas o una enfermedad relacionada con células dendríticas. Por ejemplo, los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser utilizados para tratar un sujeto con un trastorno auto-inmune, un trastorno del sistema inmunológico, o un trastorno inflamatorio, por ejemplo, un trastorno caracterizado por una actividad inmunológica aberrante o indeseada asociada con una inmuno-modulación por células dendríticas. Trastornos auto-inmunes, del sistema inmunológico, e inflamatorios que pueden beneficiarse del tratamiento con las células anti-dendríticas humanas de la invención incluyen artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes mellitus, miastenia grave, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, lupus eritematoso, síndrome de Reiter, y enfermedad de Graves. Por ejemplo, un sujeto afectado por un trastorno auto-inmunológico puede beneficiarse de la inhibición de la presentación mediada auto-antígeno mediada por células dendríticas. Otros ejemplos de enfermedades que pueden ser tratadas empleando los anticuerpos anti- células dendríticas de ser humano de la invención incluyen rechazo de trasplante y enfermedad de injerto versus huésped. Rechazo de Trasplante En años recientes ha habido una mejora considerable de la eficiencia de técnicas quirúrgicas para transplantar tejidos y órganos tales como piel, riñon, hígado, corazón, pulmón, páncreas y médula ósea. Tal vez el problema sobresaliente principal es la falta de agentes satisfactorios para inducir una tolerancia inmunológica en el receptor del alo-injerto u órgano transplantado. Cuando células u órganos alogenéicos son transplantados en un huésped (es decir, el donador y el receptor son individuos diferentes de la misma especie) , el sistema inmunológico del huésped presentará probablemente una respuesta inmunológica contra los antígenos foráneos en el transplante (enfermedad de huésped versus injerto) que provoca la destrucción del tejido transplantado. Células CD8+, células CD4+ y monocitos están involucrados en el rechazo de los tejidos del transplante. Los agentes terapéuticos de la presente invención son útiles para inhibir las respuestas inmunológicas inducidas por alo-antígenos mediadas por células dendríticas en el receptor evitando así que estas células participen en la destrucción del tejido u órgano transplantado. Enfermedad de Injerto versus Huésped Un uso relacionado para los agentes terapéuticos de la presente invención es en la modulación de la respuesta inmunológica involucrada en la enfermedad de "injerto versus huésped" (GVHD) , GVHD es una enfermedad potencialmente fatal que ocurre cuando células inmunológicamente competentes son transferidas a un receptor alogenéico. En esta situación, las células inmuno-competentes del donador pueden atacar tejidos en el receptor. Los tejidos de la piel, epitelios intestinales e hígado son blancos frecuentes y pueden ser destruidos durante el transcurso de GVHD. La enfermedad presenta un problema especialmente severo cuando un tejido inmunogénico es transplantado, por ejemplo, transplante de médula ósea; pero GVHD menos severa ha sido también reportada en otros casos, incluyendo transplantes de corazón y de hígado. Los agentes terapéuticos de la presente invención se utilizan para inhibir la actividad de células de presentación de antígeno de huésped, por ejemplo, células dendríticas. En otra modalidad, los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser utilizados para modular una respuesta inmunológica en un sujeto hacia un antígeno. Los anticuerpos anti-células dendríticas de ser humano de la presente invención pueden emplearse para enfocar un antígeno hacia una célula dendrítica y por consiguiente modular la presentación y procesamiento de antígeno, de tal manera que se induzca una respuesta inmunológica al antígeno. El antígeno puede ser un antígeno tumoral, o bien un antígeno de patógeno, por ejemplo, un patógeno microbiano. El patógeno puede ser un virus (por ejemplo VIH), una bacteria, un hongo, o un parásito. El antígeno puede ser también un componente de un depósito de amiloide en un paciente, como por ejemplo un paciente que padece de enfermedad de Alzheimer y el antígeno es Aß péptido. Por ejemplo, un complejo molecular que comprende por lo menos una especificidad de unión para un componente en la superficie de una célula dendrítica unida a un antígeno, en donde la unión del complejo con la célula dendrítica media la internalización del complejo molecular, puede ser administrado a un sujeto para inducir o incrementar una respuesta inmunológica contra el antígeno. La respuesta inmunológica generada contra el antígeno incluye anticuerpos que se unen al antígeno y células T que se unen al antígeno como componente de un complejo MHC-I o MHC-II. Por consiguiente, los anticuerpos anti-células dendríticas de ser humano de la presente invención pueden también utilizarse para mediar la inmunización enfocada hacia células dendríticas de un sujeto. Por ejemplo, un sujeto puede ser inmunizado con un complejo molecular que comprende por lo menos una especificidad de enlace para un componente en la superficie de una célula dendrítica enlazada a un antígeno, en donde la unión del complejo sobre la célula dendrítica media la internalización del complejo molecular y, por ejemplo, incrementa el procesamiento y la presentación del antígeno. En otro aspecto, anticuerpos humanos específicos humanos para células dendríticas pueden ser utilizados para enfocar directamente células enteras, por ejemplo, una célula tumoral, una célula efectora, o un patógeno microbiano, hacia células dendríticas. Anticuerpos anti-células dendríticas o bien fragmentos de enlace de antígeno de los mismos pueden ser expresados directamente en la superficie de una célula, por ejemplo, por transfección o traducción de una célula con un vector que contiene secuencias de ácido nucleico que codifican un anticuerpo específico para células dendríticas de ser humano de la invención. Alternativamente, anticuerpos anti-células dendríticas, o bien fragmentos de unión de antígeno de los mismos, pueden estar unidos a una célula o un patógeno a través del uso de enlazadores químicos, o bien etiquetas de lípidos o bien otros métodos relacionados. Células con anticuerpos anti-células dendríticas anclados en la superficie o bien un fragmento de enlace de antígeno de los mismos, pueden utilizarse para inducir respuestas inmunológicas específicas contra la célula, por ejemplo, una célula tumoral, o un patógeno microbiano. Así, los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados para estimular la repuesta inmunológica a patógenos, toxinas, y auto-antígenos. Ejemplos de patógenos para los cuales este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil, incluyen patógenos para los cuales actualmente no existe vacuna efectiva, o bien patógenos para los cuales las vacunas convencionales no son totalmente efectivas. Estos patógenos incluyen, sin limitarse a ellos, VIH, Hepa ti tis (A, B. y C) , Infl uenza, Herpes, Giardia , Malaria , Leishmania , Staphylococus Aureus, Pseudomonas auruginosa . Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención pueden ser probadas inicialmente para actividad de enlace asociada con uso terapéutico o de diagnóstico in vi tro. Por ejemplo, composiciones de la invención pueden ser probadas empleando los ensayos citométricos de flujo y de internalización descritos en los ejemplos abajo. Además, la actividad de estas moléculas para desencadenar por lo menos una actividad efectora-mediada por célula efectora, incluyendo la citólisis de células dendríticas puede ensayarse. Protocolos para ensayar para fagocitosis y citólisis mediada por células efectoras se conocen en la técnica. Las composiciones (por ejemplo', anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención tienen utilidad adicional en la terapia y diagnóstico de enfermedades mediadas por células dendríticas o enfermedades mediadas con células dendríticas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas multiespecíficas o biespecíficas pueden emplearse, por ejemplo, para provocar in vivo o in vi tro una o varias de las actividades biológicas siguientes: opsonizar una célula dendrítica; mediar la fagocitosis o citólisis de una célula dendrítica en presencia de células efectoras humanas; inhibir el crecimiento de una célula dendrítica; ser internalizado por una célula dendrítica; o bien enfocar un antígeno para una célula dendrítica.
Métodos de administración de las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención son conocidos en la técnica. Dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y peso del sujeto y del fármaco particular utilizado. Las moléculas pueden estar acopladas a radionúclidos, como por ejemplo DD°I, 90Y, 105Rh, etc. de conformidad con lo descrito en Goldenberg, D. M. y colaboradores (1981) Cáncer Res. 41:4354-4360, y en EP 0365 997. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención pueden también estar acopladas a agentes inmunomoduladores. Células efectoras específicas para blanco, por ejemplo, células efectoras enlazadas a composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención pueden también emplearse como agentes terapéuticos. Células efectoras para enfocar pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales, y otras células que llevan receptor de IgG o IgA. Si se desea, las células efectoras pueden obtenerse del sujeto a tratar. Las células efectoras específicas para blanco pueden ser administradas como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 108-109 pero variará según el propósito terapéutico. En una modalidad, la cantidad será suficiente para obtener la localización en por lo menos una célula dendrítica, y efectuar la muerte de la célula, por ejemplo, por fagocitosis. En otra modalidad, células dendríticas específicas para blanco, por ejemplo, células dendríticas enlazadas a composiciones de la invención pueden emplearse como agentes terapéuticos para localización en una célula blanco, por ejemplo, una célula tumoral, patógeno microbiano, virus, o bien célula infectada con virus, o bien para enfocar un antígeno y para efectuar una respuesta inmunológica contra la célula blanco o un antígeno blanco, por ejemplo mediante procesamiento y presentación de antígeno. Las vías de administración pueden variar también. Una terapia con células efectoras específicas para blanco o células dendríticas específicas para blanco puede efectuarse en combinación con otras técnicas para la remoción de células enfocadas. Por ejemplo, una terapia anti células dendríticas que utiliza las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención y/o células efectoras equipadas con estas composiciones puede emplearse en combinación con quimioterapia o terapia inmunomoduladora, por ejemplo, terapia antiinflamatoria o inmunosupresora. Además, una inmunoterapia de combinación puede emplearse para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas por ejemplo hacia células dendríticas. Por ejemplo, anticuerpos anti células dendríticas unidos a anti-FcgammaRI o anti-CD3 pueden emplearse en combinación con agentes de enlace específico con receptores de IgG o IgA. En otra modalidad, células dendríticas enfocadas por ejemplo con anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas de la invención, pueden emplearse en combinación con una terapia inmunomoduladora, por ejemplo, inmunoestimulación, para incrementar una respuesta inmunológica contra una célula blanco o un antígeno blanco. Una terapia dirigida a células dendríticas puede combinarse con otras formas de inmunoterapia, por ejemplo tratamiento con citosinas (por ejemplo, interferones, TNFa, GM-CSF, G-CSF, IL-2) . Moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención pueden también utilizarse para modular actividades de células dendríticas, por ejemplo, procesamiento y presentación de antígeno, así como modular el nivel de un antígeno correspondiente en una célula dendrítica, por ejemplo mediante el hecho de tapar y eliminar receptores en la superficie de la célula. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención que tienen sitios de unión complementarios, por ejemplo, porciones de IgGl, -2, o -3 o IgM que se unen con complemento, pueden también emplearse en presencia de complemento. En una modalidad, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprende células blanco con un agente de enlace de la invención y células efectoras apropiadas puede ser complementado por la adición de complemento o suero que contiene complemento. La fagocitosis de células blanco revestidas con un agente de enlace de la presente invención puede ser mejorada mediante la unión de proteínas de complemento. En otra modalidad, células blanco revestidas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención pueden también ser lisadas por complemento. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención pueden también administrarse juntas con complemento. Por consiguiente, dentro del alcance de la presente invención se encuentran composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas o suero o complemento. Estas composiciones son provechosas en la medida en que el complemento se localiza en cercanía estrecha de los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas. Alternativamente, los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas de la invención el complemento o suero pueden administrarse separadamente.
En otra modalidad, el sujeto puede ser tratado adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, incrementa o inhibe la actividad de células inmunológicas y/o la expresión o actividad de receptores FcD o FcD, mediante por ejemplo, el tratamiento del sujeto con una citosina. Citocinas preferidas para su administración durante el tratamiento con la molécula multiespecífica incluyen un factor de estimulación de colonias de granulocito (G-CSF) , factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , interferon-? (IFN-?), y factor de necrosis tumoral (TNFa). Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención pueden también emplearse para enfocar, por ebemplo, células dendríticas, por ejemplo, para marcar tales células. Para un uso de este tipo, el agente de enlace puede estar unido a una molécula que puede ser detectada. Así, la invención ofrece métodos para localizar y ex vivo o in vi tro células dendríticas. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzima. En una modalidad, la invención ofrece métodos para detectar la presencia de células dendríticas o un antígeno de células dendríticas en una muestra, o bien para medir la cantidad de células dendríticas o antígeno de células dendríticas, que comprende la puesta en contacto de la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de enlace de antígeno del mismo, con enlace específico con células dendríticas o un antígeno de células dendríticas, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y células dendríticas o un antígeno de células dendríticas. La formación de un complejo es detectada, en donde una formación de complejo diferente entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicación de la presencia de células dendríticas o de un antígeno de células dendríticas en la muestra . En otra modalidad, la invenció no ofrece un método para detectar la presencia o cuantificar la cantidad de células dendríticas in vivo o in vi tro . El método comprende (i) la administración a un sujeto de una composición (por ejemplo, una molécula multiespecífica o biespecífica) de la invención o un fragmento de la misma, conjugada a un marcador detectable; (ii) la exposición del sujeto a un dispositivo para detectar dicho marcador detectable para identificar áreas que contienen células dendríticas. Así mismo, dentro del alcance de la invención se encuentra kits que comprenden las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención e instrucciones de uso. El kit puede contener además por lo menos un reactivo adicional, por ejemplo, citosina o complemento, o bien uno o varios anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en células dendríticas distintas del primer anticuerpo humano) . La presente invención se ilustra adicionalmente a través de los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitativos. El contenido de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas mencionadas en esta solicitud se incorporan expresamente aquí por referencia. EJEMPLOS Ejemplo 1 Producción de anticuerpos monoclonales humanos contra células dendriticas Anticuerpos monoclonales humanos anti células dendríticas fueron generados mediante la inmunización de la cepa HC07 de ratones HuMAb con preparaciones de células dendríticas. Ratones HC07 HuMAb fueron generados de conformidad con lo descrito en las patentes norteamericanas Nos. 5,770,429 y 5,545,806, cuyas divulgaciones enteras se incorporan aquí por referencia. En particular, ratones HC07 fueron inmunizados cuatro con inyecciones intraperitoneales de células dendríticas humanas emulsificadas en adyuvante de Freund. En resumen, células dendríticas fueron preparadas de la siguiente manera. Células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs) fueron obtenidas por centrifugación por gradiente de densidad de la sangre entera o bien preparaciones de aféresis de plaquetas Leukopak. Monocitos fueron aislados por adherencia sobre frascos de cultivo tisular durante 2 horas, y después diferenciados en células dendríticas por incubación con 2 ng/ml de GM-CSF y 10 ng/ml de IL-4 en medio libre de suero de macrófago (Gibco) durante 5 a 9 días. Células para inmunizaciones fueron utilizadas frescas o almacenadas congeladas a una temperatura de -80° C. Los ratones fueron inmunizados cada 2-3 semanas. Finalmente, una inyección intravenosa de células dendríticas en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) fue efectuada antes de una esplenectomía. Los bazos de los ratones que respondieron fueron cosechados y dispersados en células individuales. Para generar hibridomas que producen anticuerpos anti células dendríticas, esplenocitos de ratones con plasma que contiene anticuerpos anti células dendríticas fueron fusionados con células de mieloma P3X63-Ag8.653 (depositada ante la ATCC bajo la designación ATCC CR1580, células de mieloma de ratón no secretorias) y PEG. Hibridomas fueron seleccionados por cultivo en medio que contenía HAT. Después de la terminación del crecimiento de los hibridomas (aproximadamente 10-14 días) cada pozo que contenía hibridomas fue tamizado para la producción de IgG de ser humano ELISA de IgG antihumana.
Hibridomas positivos fueron tamizados y seleccionados con base en las siguientes propiedades: (1) producción de anticuerpos IgG humana, y (2) unión con células dendríticas. Los hibridomas que secretan IgG humana fueron probadas para determinar su reactividad con varios tipos de células sanguíneas por citometría de flujo. Células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes por cultivo durante 5-7 días en medio complementado con GM-CSF y IL-4. Granulocitos (PMN), monocitos y linfocitos fueron obtenidos a partir de sangre entera heparamizada. Las células fueron incubadas con sobrenadantes de hibridoma a partir de clones positivos para IgG a una temperatura de 4° C. La unión fue detectada con una sonda de cabra anti IgG (Fc) humana marcada con FITC. La fluorescencia asociada con célula fue determinada por análisis empleando un instrumento FACScalibur. Varios hibridomas que fueron tamizados produjeron anticuerpos IgGlK de ser humano que demostraron reactividad con células dendríticas de conformidad con lo evaluado por citometría de flujo (por ejemplo, A3, A5, A23, A24, A33, B9, Bll, B33, B47, C8, CIO, C20, C28, C29, C30, C35, El, E8, ElO, E18, E20, E21 y E24) , como se muestra en la tabla 1 abajo. Algunos de los anticuerpos humanos demostraron una reactividad preferencial muy elevada con células dendríticas en comparación con otros tipos de células sanguíneas.
TABLA 1 Anticuerpos monoclonales humanos con reactividad para células dendríticas Mab Linfocitos Monocitos PMNs células Humano dendríticas A3 - +/- +/- + A5 - +/- - +/- A23 - + - +/- A24 - ++ + ++ A33 - +/- - +/- B9 +/- +++ + +++ Bll +/- - +++ B33 - +/- - +/- B47 - +/- +/- +/- C8 - +/- - +/- CIO - +/- +/- + C20 - +/- +/- ++ C28 - +/- - +/- C29 - +/- +/- ++ C30 - - +/- C35 - +/- - ++ El - +/- - + E8 - + + ++ ElO - + + +++ E18 - + + ++ E20 + ++ +/- +++ E21 +/- ++ +/- +++ E24 - +/- - +/- Claves: - no se detectó enlace +/- enlace débil/equívoco + enlace bajo/significativo ++ enlace elevado +++ enlace extremadamente elevado Ejemplo 2. Caracterización de Anticuerpos Monoclonales Humanos contra Células Dendriticas I . Especificidad de enlace de anticuerpos humanos purificados anti-células dendríticas con células dendríticas Varios hibridomas que secretan anticuerpos de IgG humana con especificidad para células dendríticas fueron sub-clonados y expandidos para purificación. Anticuerpos monoclonales fueron aislados a partir de sobrenadantes de cultivos de hibridoma efectuados en frascos giratorios en un incubador humidificado que contenía C02 al 5%. Anticuerpos fueron purificados por cromatografía en una columna Protein A-agarose según las especificaciones del fabricante (Pierce, Rockford IL) . Los anticuerpos humanos purificados fueron después probados para probar su reactividad con células dendríticas y líneas de células que representan varios otros tipos de células hematopoyéticas utilizando citometría de flujo. En resumen, células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes por cultivo durante 5-7 días en medio complementado con GM-CSF e IL-4 de conformidad con lo descrito arriba. Las líneas de células U937, CEM, THP-I y L540 fueron cultivadas en medio complementado con suero fetal bovino al 10%. Las células fueron cosechadas, lavadas e incubadas con concentraciones saturantes de anticuerpos monoclonales humanos Bll, C20, E21 o un control de isotipo (IgGl humana) a una temperatura de 4°C con agitación durante 1 hora. La unión con anticuerpo fue detectada mediante incubación adicional con una sonda de cabra anti IgG(Fc) humana marcada con FITC durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Las células fueron lavadas, fijadas con paraformaldehído al 1%, y la fluorescencia asociada con células fue analizada empleando un instrumento FACScalibur (Beckton Dickinson) con programática CellQuest. Como se muestra en la Figura 1, el anticuerpo monoclonal humano Bll se unió exclusivamente con células dendríticas. El anticuerpo monoclonal C20 se unión específicamente con células dendríticas y demostró también bajo nivel de reactividad con las líneas de células de tipo monocito U-937 y THP-1, y la línea de células de linfoma de Hodgkin L540. De manera similar, el anticuerpo monoclonal humano E21 se unió de manera preferente con células dendríticas, pero reaccionó también a un nivel bajo con células L540 y células THP-1. Estos datos demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos Bll, C20 y E21 reconocen diferentes antígenos y que se unen de preferencia a células dendríticas en comparación con otras células de linaje hematopoyético. II . Unión dependiente de la dosis de anticuerpos humanos purificados anti-células dendríticas con células dendriticas La reactividad dependiente de la dosis de anticuerpos monoclonales humanos purificados anti-células dendríticas Bll, C20 y E21 con células dendríticas fue examinada por citometría de flujo. Células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba. Las células fueron cosechadas e incubadas con varias concentraciones de los anticuerpos monoclonales Bll, C20 E21 o un control de isótopo a 4°C. Se detectó el enlace de anticuerpos con una sonda de cabra anti IgG(Fc) humana marcada con FITC, y la fluorescencia asociada con células fue determinada empleando un instrumento FACScalibur con una programática CellQuest. Cada anticuerpo monoclonal demostró un enlace dependiente de la dosis con células dendríticas en comparación con un anticuerpo IgG de control con isotipo correspondiente, como se muestra en la Figura 2. Estos datos demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos purificados Bll, C20 y E21 se enlazan de manera dependiente de la concentración con células dendríticas. La intensidad variable del enlace entre los anticuerpos anti-células dendríticas indica que reconocen moléculas únicas o epítopos en las células dendríticas. III . Enlace de anticuerpo humano Bll con células dendriticas derivadas de células madres CD34+ Debido a su disponibilidad, las células dendríticas diferenciadas de los monocitos de la sangre circulante son el tipo más comúnmente utilizado de células dendríticas tanto para investigación como para aplicaciones clínicas. Sin embargo, las células dendríticas derivadas de células madres progenitoras pueden también emplearse y pueden representar con mayor precisión las células dendríticas en tejidos humanos Por consiguiente, en el siguiente estudio, células dendríticas diferenciadas a partir de células progenitoras CD34+ fueron evaluadas para determinar su reactividad con anticuerpo monoclonal humano Bll por citometría de flujo. Un anticuerpo monoclonal purificado Bll fue dializado de manera extensa contra un amortiguador de carbonato de sodio 0.3 M, pH9.5, para marcado con isotiocianato de fluorescencia (FITC) . Una solución madres de FITC fue preparada mediante la disolución de 1 mg de FITC sólido en un ml de DMSO. La solución madre de FITC fue agregada gota a gota con mezclado constante en una cantidad para proporcionar 50 µg de FITC por mg proteína de anticuerpo. Después de la adición de FITC, la solución fue incubada en la oscuridad durante 1-3 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo marcado con FITC fue aislado por filtración en gel en una columna Sephadex G-10 equilibrada en PBS. Células progenitoras CD34+ y medios de diferenciación de células dendríticas fueron obtenidos a partir de Poetic Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD) . Las células fueron diferenciadas según las instrucciones del fabricante. Células dendríticas fueron cosechadas e incubadas con varias concentraciones de Bll-FITC o un anticuerpo de control de isotipo (IgG humana-FITC) a una temperatura de 4°C. La fluorescencia asociada con células fue determinada por análisis empleando un instrumento FACScalibur con programática CellQuest. Los resultados se muestran en la Figura 3 y demuestran que el anticuerpo monoclonal humano Bll se une a células dendríticas diferenciadas a partir de células madres CD34+ de manera dependiente de la dosis. Por consiguiente, el antígeno blanco Bll es expresado en células dendríticas que son derivadas de monocitos y de células madres progenitoras. IV. Unión de anticuerpo humano Bll con macrófagos y células dendriticas La capacidad de anticuerpo monoclonal humano anti-células dendríticas, Bll, para unirse con macrófagos en comparación con células dendríticas, fue evaluada por citometría de flujo. Células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba. Macrófagos fueron preparados a partir de células mononucleares adherentes por cultivo durante 5-7 días con M-CSF. Las células fueron cosechadas e incubadas con 10 µg/ml de anticuerpo monoclonal Bll o un anticuerpo de control de isotipo a una temperatura de 4°C. La unión de anticuerpo humano fue detectada con una sonda de cabra anti IgG(Fc) humana marcada con FITC. La fluorescencia asociada con células fue determinada por análisis empleando un instrumento FACScalibur con programática CellQuest. Los resultados se presentan en la Tabla 4 y demuestran que el anticuerpo humano Bll se une a macrófagos a una menor magnitud que a las dendríticas. Así, el antígeno blanco Bll es también expresado en macrófagos, aún cuando el nivel de expresión es menor que el nivel observado en las células dendríticas. La reactividad del anticuerpo monoclonal Bll con macrófagos no es sorprendente debido a la similaridad entre las células dendríticas y los macrófagos. Puesto que estos dos tipos de células comparten propiedades estructurales y propiedades funcionales, incluyendo la capacidad de estimular respuestas de linfocitos T y B, la reactividad cruzada de anticuerpo Bll con macrófagos puede ser benéfica para etiquetar células de presentación de antígeno. V. Inducción de antígeno blanco de anticuerpo humano Bll en células THP-1 El anticuerpo monoclonal humano Bll fue probada utilizando citometría de flujo para enlace con células THP-1, una línea de células de tipo monocito derivada de una leucemia monocítica humana, antes y después que las células hayan sido inducidas a diferenciarse hacia un fenotipo de células dendríticas. En resumen, células THP-1 fueron cultivadas en medio de cultivo estándar o en medio complementado con GM-CSF e IL-4. Las células fueron incubadas con 10 µg/ml de anticuerpo monoclonal Bll-FITC o un anticuerpo de control de isotipo (IgG humana-FITC) a una temperatura de 4°C. La fluorescencia asociada con células fue determinada por análisis empleando un instrumento FACScalibur con una programática CellQuest. Los resultados se muestran en la Figura 5. Estos datos demuestran que, en condiciones normales de cultivo, las células THP-1 no expresan el antígeno blanco Bll sin embargo, cuando las células THP-1 son impulsadas hacia un fenotipo de células dendríticas por cultivo en medio que contiene GM-CSF e IL-4, la expresión del antígeno blanco de Bll es inducida de manera concomitante. Por consiguiente, estos resultados confirman adicionalmente la especificidad del anticuerpo humano Bll para un antígeno blanco (Bll) asociado específicamente con células dendríticas. VI . Unión de anticuerpo humano Bll con células dendríticas de macaco El modelo de animal (mono) de macacos cynomolgus puede proporcionar una información relevante en cuanto a la aplicación clínica de anticuerpos, a condición que el antígeno blanco sea conservado entre primates. Por consiguiente, la reactividad cruzada del anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendríticas provenientes de mono cynomolgus fue evaluada por citometría de flujo. Sangre de cynomolgus fresca fue obtenida de Sierra Biomedicals, y células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes por cultivo con GM-CSF e IL-4. Células dendríticas fueron incubadas con 10 µl/ml de anticuerpo monoclonal Bll-FITC o un anticuerpo de control de isotipo (IgG humana-FITC) a una temperatura de 4°C. La fluorescencia asociada con célula fue determinada por análisis utilizando un instrumento FACScalibur. Como se muestra en la figura 6, el anticuerpo monoclonal humano Bll se une a células dendríticas derivadas de macacos cynomolgus, lo que sugiere que el antígeno blanco de Bll es conservado en primates. VII . Enlace de anticuerpo humano Bll con células dendríticas en tejidos humanos La reactividad del anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendríticas a partir de tejidos humanos fue evaluada por inmunohistoquímica. Estos experimentos fueron también diseñados para evaluar la reactividad cruzada potencial de anticuerpo Bll con otras células o antígenos de tejidos humanos . Criosecciones de tejidos humanos fueron obtenidas a través de autopsia o biopsia quirúrgica e integrados en medio Tissue-Tek O.C.T. y almacenadas congeladas a una temperatura inferior a -701°C. Los tejidos fueron seccionados a 5mm, fijados durante 10 minutos con acetona, y secados durante la noche. Se fijaron platinas con formalina amortiguada neutral al 10% durante 10 segundo antes de la tinción. Se empleó una técnica de inmunoperoxidasa indirecta. Las secciones fueron teñidas primero con Bll FITC o bien el anticuerpo FITC con isotipo correspondiente diluido en PBS que contenía IgG agregada térmicamente para bloquear el enlace dependiente de Fc. Anticuerpos primarios fueron detectados empleando un anticuerpo anti-FITC de conejo, seguido por un reactivo anti-conejo marcado con peroxidasa. Cada platina fue leída por un patólogo certificado y el enlace fue calificado de conformidad con las claves siguientes: + (equívoco), 1+ (débil), 2+ (moderado), 3+ (fuerte), 4+ (intenso), Neg. (negativo) . Los resultados mostrados en la Tabla 2 a continuación demuestran una tinción clara de las células dendríticas y de ciertos macrófagos en todos los tejidos examinados. No se observó ningún tinción específica con el anticuerpo de control de isotipo. Estos datos demuestran que el anticuerpo monoclonal humano Bll se une a células dendríticas en tejidos humanos, así como a macrófagos en tejidos humanos aún cuando en menor medida.
El enlace mínimo de Bll con células mononucleares en el bazo y células progenitoras de médula ósea puede representar enlace con células dendríticas inmaduras. El anticuerpo humano Bll no reaccionó de manera cruzada con otros tipos de células o tejidos en las muestras probadas, lo que demuestra adicionalmente la especificidad de este anticuerpo para células dendríticas y, en menor magnitud, para macrófagos.
TABLA 2 Inmunohistoquímica de Enlace de Anticuerpo Monoclonal Humano Bll con Tejidos Humanos Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Piel: Células dendríticas dérmicas 3+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Amígdala: Células dendríticas intersticiales y/o subepiteliales 2+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Hígado: Células dendríticas intersticiales 2+ , células de Kupffer 2+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Mama: Células dendríticas dérmicas/subcutáneas/intersticiales 3-4+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Bazo: Células dendríticas intersticiales 3-4+, cordones de Billiroth que forran las células Reticuloendoteliales 2+, células mononucleares ocasionales en zona marginal 2+, células mononucleares escasas a ocasionales en PALS/folículos 2+, otros elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Riñon: Células dendríticas intersticiales 3-4+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Nodo linfático: Células dendríticas capsulares 3-4+, células dendríticas subcapsulares/macrófagos 3+, células dendríticas foliculares 2-3+, células dendríticas paracorticales 2-3+, células dendríticas de seno medular/macrófagos 1-2+, otros elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Cerebro: Células dendríticas meníngeas/periteleales 3-4+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Testículos: Células dendríticas intersticiales 3-4+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Páncreas: Células dendríticas intersticiales 3-4+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Corazón: Células dendríticas intersticiales 3-4+, todos los demás elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Intestino Delgado: Células dendríticas intersticiales 3-4+, células dendríticas de lamina propia/macrófagos 2-3+, células dendríticas de parche de Peyers/macrófagos 2-3+, otros elementos negativos. Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Médula ósea: Células dendríticas intersticiales 3-4+, progenitores hematopoyéticos 2+, otros elementos negativos.
Anticuerpo: Bll-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Pulmón: Células dendríticas intersticiales 3-4+, macrófagos alveolares 3-4+, otros elementos negativos. Anticuerpo: IgGl-FITC (2 µg/ml) Tejido y reactividad: Todos los tejidos probados: todos los elementos negativos. Estudios de reactividad cruzados tisulares fueron efectuados en el Pathology Associates International, Frederick, MD estudio #IM598. VIII. Enlace de fragmentos Fv de cadena única (ScFv) de anticuerpos humanos Bll con células dendriticas humanas La reactividad de un fragmento Fv de cadena única de anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendríticas provenientes de tejidos humanos fue evaluada por citometría de flujo. El ScFv de Bll fue construido uniendo los dominios VL (SEQ ID NO: 1 y 2) y VH (SEQ ID NO: 3 y 4) del anticuerpo monoclonal humano Bll como se muestra en la figura 9. Secuencias de EFG fueron incorporadas con el objeto de detectar la unión del ScFv con células dendríticas empleando anticuerpos anti-EFG. Células dendríticas fueron incubadas con ScFv de Bll durante una hora a una temperatura de 4°C, después lavadas antes de incubación con sonda anti-EFG-FITC durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Las muestras fueron analizadas empleando análisis FACS. Los resultados del análisis FACS demostraron que el fragmento de ScFv de Bll de anticuerpo monoclonal humano Bll se unió a células dendríticas humanas. Por consiguiente, el ScFv puede utilizarse como vacuna o bien como inmunotoxina mediante enlace del ScFv a un antígeno seleccionado o toxina seleccionada, respectivamente. IX. Enlace de fragmentos F(ab')2 de anticuerpo humano Bll con células dendríticas humanas La reactividad de fragmentos F(ab')2 del anticuerpo monoclonal humano Bll con células dendríticas de tejidos humanos fue evaluada por citometría de flujo. Estos experimentos fueron también diseñados para evaluar si la porción de Fc de anticuerpo humano Bll está involucrada significativamente en el enlace de Bll con células dendríticas. Fragmentos F(ab')2 fueron preparados por digestión de mAb de Bll purificado con pepsina bajo condiciones estándares. Los fragmentos F(ab')2 fueron purificados por cromatografía L de proteína. Células dendríticas, preparadas frescas a partir de monocitos humanos por cultivo en GM-CSF e IL-4, fueron incubadas con anticuerpo entero o bien fragmentos de anticuerpo F(ab')2 durante 1 hora a una temperatura de 4°C. Las células fueron lavadas antes de incubación con sonda anti IgG humana-F(ab' ) 2-PE durante 1 horas a una temperatura de 4°C. Las células fueron lavadas otra vez antes de análisis empleando un instrumento FACScalibur y programática Cellquest . Los resultados del análisis FACs demostraron que el anticuerpo monoclonal humano entero Bll y fragmentos F(ab')2 de Bll se unían a células dendríticas con características cinéticas similares, lo que indica que la porción Fc del anticuerpo monoclonal entero no contribuye significativamente al enlace de Bll con células dendríticas. Ejemplo 3 Caracterización de Antígeno Blanco Bll I . Inmunoprecipitación de antígeno blanco de anticuerpo monoclonal humano Bll a partir de células dendriticas El anticuerpo monoclonal humano Bll fue utilizado para inmunoprecipitar su antígeno blanco correspondiente a partir de células dendríticas. En resumen lisados celulares provenientes de células dendríticas fueron preparados e incubados con anticuerpo monoclonal Bll o un anticuerpo IgG de control de isotipo a una temperatura de 4°C. Complejos anticuerpo-antígeno fueron capturados con anti IgG humana-agarosa, y separados por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Una banda que corresponde a un peso molecular de aproximadamente 180 kilodaltones fue evidente en los inmunoprecipitados de anticuerpo Bll provenientes de dos preparaciones diferentes de lisados de células dendríticas, pero no en la muestra de control. Por consiguiente, estos estudios de inmunoprecipitación mostraron que el anticuerpo monoclonal humano Bll reconoce un antígeno blanco en células dendríticas con un peso molecular aproximado de 180 kilodaltones, de conformidad por lo analizado con SDS-PAGE.
II. secuenciamiento de terminal N del antígeno blanco de anticuerpo monoclonal humano Bll a partir de células dendríticas . Después de inmunoprecipitación de conformidad con lo descrito arriba, el antígeno blanco de Bll fue sometido a secuenciamiento de aminoácido de terminal N para determinar su homología con proteínas conocidas. Lisados celulares fueron preparados a partir de células dendríticas y se dejó incubar con el anticuerpo monoclonal Bll a una temperatura de 4°C. Complejos anticuerpo-antígeno fueron capturados con anti IgG humana-agarosa, y separados por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. Proteínas provenientes del gel fueron transferidas a nitrocelulosa y la banda correspondiente al antígeno blanco de anticuerpo monoclonal Bll fue eludía a partir de secuenciamiento de aminoácidos de terminal N. El secuenciamiento de terminal N y la búsqueda de base de datos fue efectuada en Midwest Analytical, Inc. (St. Louis, MO) . El secuenciamiento de los 15 residuos de aminoácidos de la terminal N del antígeno blanco de anticuerpo monoclonal Bll reveló una homología de secuencias de proteína con el receptor de mañosa de macrófago humano, de la siguiente manera: DDXXQFLIXXEDXKR (SEQ ID NO: 5) antígeno Bll LDTRQFLIYNEDHKR (SEQ ID NO: 6) Receptor de mañosa de macrófago Una búsqueda computerizada de la base de datos de proteína humana no identificó ninguna otra proteína que tuviera una homología significativa con el antígeno de Bll. En un estudio adicional, lisados de células dendríticas fueron depurados de proteínas de unión no especifica mediante incubación durante la noche con agarosa cargada-anti IgG de ratón. La agarosa fue removida por rotación y el sobrenadante depurado fue recuperado y incubado durante la noche con agarosa-IgG anti-humana previamente cargada con anticuerpo Bll. La agarosa fue lavada con PBS y hervida con amortiguador de carga reductor. Finalmente, la agarosa fue removida por rotación y el sobrenadante fue cargado en un gel. El anticuerpo Bll inmunoprecipitó una proteína de aproximadamente 150-180 kD. Esta proteína fue absorbida en una membrana PVDF y enviada a Midwest Analytical, Inc. para propósito de microsecuenciamiento . Los resultados del microsecuenciamiento de terminal N del antígeno blanco de anticuerpo monoclonal Bll revelaron la siguiente secuencia de proteína: LLDTR QFLIY LEDTK RCVDA (SEQ ID NO: 7) . Esta secuencia correspondió otra vez con la secuencia del receptor de mañosa de macrófago de ser humano (No. de Acceso GenBank NPJ302429) con identidad de 100% en 20 aminoácidos de conformidad con lo determinado empleando el algoritmo BLAST en el sito Web del National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/) . Estos datos indican que la molécula blanco en células dendríticas reconocida por el anticuerpo monoclonal humano Bll es el receptor de mañosa de macrófago. III. Bll inhibe la absorción de FITC-dextrano por células dendríticas El siguiente experimento fue diseñado para probar si el anticuerpo Bll bloquea el receptor de mañosa y por consiguiente puede emplearse, por ejemplo, para prevenir o inhibir la interacción de patógenos con el receptor de mañosa (por ejemplo, infección celular) . Células dendríticas fueron incubadas con FITC-dextrano (50 µg/ml) y o bien IgG humana de control de isotipo o bien Bll HuMAb (25 µg/ml) durante 30 minutos a las temperaturas indicadas en la figura 11. Se sabe que las moléculas de dextrano son internalizadas específicamente por células dendríticas a través del receptor de mañosa (F. Sallustro y colaboradores, J. Exp. Med. 1995, 185:389-400). La absorción de dextrano marcado (FITC) fue determinada por análisis FACS (es decir, intensidad de fluorescencia de las muestras de células dendríticas empleando un instrumento FACScalibur) . El porcentaje de absorción de FITC-dextrano fue establecido en 100% a una temperatura de 37°C y 0% a una temperatura de 4°C. Como se muestra en la figura 11, en anticuerpo Bll bloqueó la absorción de FITC-dextrano en 61.5% en estas condiciones.
Estos resultados sugieren que el anticuerpo monoclonal humano Bll puede ser utilizado para bloquear la interacción de patógenos con el receptor de mañosa. Ejemplo 4 Actividad de Anticuerpos Humanos Anti-células Dendríticas I. Internalización de anticuerpos monoclonales humanos Bll por células dendríticas La magnitud con la cual el anticuerpo humano Bll es internalizado después de enlace con células dendríticas fue evaluada por citometría de flujo. Células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba. Las células fueron incubadas con una concentración de saturación de anticuerpo monoclonal Bll-FITC a una temperatura de 4°C durante 1 hora para permitir un enlace superficial máximo del anticuerpo, lavadas con PBS frío para remover el anticuerpo en exceso, y después incubadas a una temperatura de 37°C durante varios períodos de tiempo para permitir la internalización del anticuerpo. Las muestras fueron después lavadas con PBS frío para detener la reacción, lavadas adicionalmente con PBA al 0.1%, pH 2.5 para remover el anticuerpo unido en la superficie de las células. La fluorescencia restante es anticuerpo Bll-FTIC que ha sido internalizado. Células de control fueron inmediatamente lavadas con PBA al 0.1%, pH 2.5 y mantenidas a una temperatura de 4°C para representar una internalización mínima o bien lavadas solamente con PBA al 0.1%, pH 7 para representar una carga máxima de anticuerpo Bll-FITC. La internalización porcentual de anticuerpos fue calculada a través de la siguiente fórmula: % de internalización = (intensidad de fluorescencia media de la muestra - intensidad de fluorescencia media de control lavado con ácido a 4°C) / (intensidad de fluorescencia media de control lavado con PBS a 4°C - intensidad de fluorescencia media de control lavada con ácido a 4°C) . Los resultados, que aparecen en la figura 7, demuestran que el anticuerpo monoclonal humano Bll es internalizado de manera eficiente después de unión con células dendríticas. Esta propiedad inesperada del anticuerpo monoclonal anticélulas dendríticas humano Bll indica que el anticuerpo puede ser utilizado para suministrar agentes, por ejemplo antígenos y toxinas, de manera intracelular a células dendríticas. II: Internalización de Bll-FITC por Células Dendriticas Se utilizó también una visualización microscópica para confirmar que el anticuerpo Bll es internalizado después de enlace con células dendríticas. Células dendríticas fueron generadas mediante la incubación de monocitos con GM-CSF (10 ng/ml) e IL-12 (50 ng/ml) bajo condiciones no adherente durante 7 días. Estas células fueron combinadas con mAb Bll-FITC (1 µg) en presencia de IgG human (600 µg) y anti-CD32 mAb IV.3 (10 µg) para bloquear la absorción no especifica e incubadas a una temperatura de 37°C. Células de control fueron incubadas en hielo durante todo el procedimiento. Después de 15 minutos y 60 minutos a una temperatura de 37°C, células dendríticas fueron colocadas en hielo y teñidas con anti-CDllc-PE (1 µg) . La internalización de mAb Bll fue examinada por microscopía confocal utilizando un microscopio confocal de exploración láser BioRad MRC1024. Células fueron exploradas para fluorescencia empleando la línea 488 nm de un láser 15 mW Kr/Ar y dos fotodetectores dicroico (522/35 nm para fluorescencia FITC y dicroico 605/32 nm para fluorescencia PE). Se utilizó un objetivo 63X Plan-APO 1.4 NA (Cari Zeiss, Inc., Thornwood, NY) en combinación con un ajuste de iris de 2.1 que permitió la detección de secciones ópticas de la imagen de fluorescencia que tenían aproximadamente 1.0 µm de espesor. Imágenes representativas fueron seleccionadas a partir de las platinas a través del centro de las células después de seccionar la célula entera. Los resultados confirmaron que Bll mAb fue rápidamente internalizado por células dendríticas después de enlace con el receptor de mañosa, lo que sugiere otra vez que este anticuerpo puede suministrar eficientemente antígenos o toxinas en células de presentación de antígeno. De manera consistente por los datos de FACS, la internalización fue evidente dentro de 15 minutos, y casi completa dentro de una hora. III. Presentación mejorada de antígeno por células dendríticas después de administración enfocada de antígeno con anticuerpo monoclonal humano Bll Con el objeto de determinar si el anticuerpo monoclonal humano es Bll puede ser utilizado para incrementar al procesamiento y la presentación de antígenos por células dendríticas, el anticuerpo fue conjugado de antígeno de toxoide de tétanos (TT) empleando el reactivo de reticulación química SMCC. Células dendríticas fueron preparadas a partir de células mononucleares adherentes de conformidad con lo descrito arriba, con la excepción que células fueron cultivadas en recipientes de Teflón. Células dendríticas fueron cosechadas y colocadas de nuevo en placas de microtitulación de 96 pozos a razón de 5,000 células por pozo en medio libre de suero de macrófago con suero fetal de becerro al 10%. Anticuerpo monoclonal Bll conjugado con toxoide de tétanos o bien toxoide de tétano solo se agregó en varias concentraciones a las células dendríticas. Células T específicas para toxoides de tétanos autólogas generadas por incubación de células mononucleares con toxoide de tétanos seguido por IL-2 fueron agregadas a cada pozo que contenía células dendríticas a razón de 50,000 células por pozo. Las células fueron cultivadas juntas durante 7 días a una temperatura de 37° C y ensayadas para determinar el número de células vivas empleando un ensayo basado en MTT de conformidad con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, Wl) . La capacidad de inducir células dendríticas para estimular específicamente Linfocitos T específicos para toxoide de tétano fue comparada después de exposición de las células a toxoide de tétano o bien toxoide de tétanos-anticuerpo Bll. Los resultados (Figura 8) mostraron que la conjugación de toxoide de tétanos como antígeno modelo para Bll provoca una presentación de antígenos significativamente más eficiente de conformidad con lo medido por la proliferación de células T específicas para antígeno. En otro experimento, 3H-Thymadine utilizada como la lectura para la proliferación de células T después de carga de células dendríticas ya sea con Bll conjugado con toxoide de tétanos (TT) o bien con toxoide de tétanos mezclado con anticuerpo Bll (control no conjugado) . Como control adicional, un anticuerpo de bloqueo para Fc?RII (CD32) , mAb IV-3, fue agregado a algunos pozos que contenían el conjugado Bll-TT para determinar si este receptor de Fc contribuía a un procesamiento y una presentación incrementada de antígeno por Bll-TT. Al dia siguiente, células fueron combinadas con células T específicas para toxoide de tétanos previamente establecidas, recién descongeladas, durante 4 días. Las células fueron coincubadas con 3H-Thymadine a una temperatura de 37° C durante el día final. La cantidad de 3H incorporada en las células T fue ensayada. Como en el caso del experimento previo, los resultados (Figura 12) demostraron que la conjugación de toxoide de tétanos como antígeno modelo para Bll provoca una presentación significativamente más eficiente de antígeno de conformidad con lo medido por proliferación de células T específicas para antígeno. La adición de cantidades en exceso de mAb IV.3 no alteró significativamente la presentación incrementada de antígeno por conjugado Bll-TT, lo que muestra que la interacción de Bll-TT con Fc?RII no se requiere para esta actividad. Globalmente, los resultados de estos estudios mostrados en la figuras 8 y 12, indican que cantidades de 10 a 100 veces menores de toxoide de tétanos conjugado con anticuerpo Bll se requieren para lograr el nivel de estimulación de células T en comparación con toxoide de tétanos solo. Además, el grado absoluto de estimulación de células T como se muestra en la figura 8 fue dos veces mayor cuando el toxoide de tétanos fue enfocado hacia células dendríticas con anticuerpo Bll. Así, los datos demuestran que un antígeno puede ser conjugado con un anticuerpo monoclonal humano Bll que el antígeno enfocado hacia anticuerpo es procesado y presentado con mayor eficiencia que un antígeno no enfocado, lo que provoca unas respuestas de células T específicas para antígeno mejoradas. Ejemplo 5 Caracterización de anticuerpo monoclonal humano E21 contra células dendríticas I. Análisis de peso molecular de antigeno de anticuerpo humano E21 Lisado de células dendríticas fueron preparados a partir de células dendríticas humanas cultivadas. En resumen, células dendríticas fueron lavadas y suspendidas de nuevo en Tritón X-100 que contenía amortiguados de lisis a una temperatura de 4° C. El lisado no fraccionado fue cargado en SDS-gel de poliacrilamida 4-15% y después la proteína fue transferida a nitrocelulosa. El blot fue incubado con 10 ug/ml de E21 seguido por sonda de fosfatasa alcalina anti IgG humana y visualizada empleando peroxidasa de rábano agrio. Los resultados de este experimento demostraron que el antígeno de anticuerpo monoclonal humano E21 tiene un peso molecular aproximado de 36-40 kilodaltones. II. Enlace de anticuerpo humano E21 con células dendriticas humanas dérmicas y epidérmicas Como se muestra en la figura 1, Ab E21 monoclonal humano se unió de manera preferente con células dendríticas. Este experimento fue diseñado para probar la reactividad de anticuerpo humano E21 con células dendríticas dérmicas y epidérmicas por análisis de inmunohistoquímica de piel congelada con E21. Secciones congeladas de pile humana fueron teñidas con FITC-21 o FITC-huIgG, y detectadas empleando sonda anti conejo-FITC. Los resultados del análisis inmunocitoquímico demostraron que el anticuerpo humano E21 reacciona tanto con células dendríticas dérmicas/macrófagos como con células dendríticas epidérmicas (células de Langerhans) en secciones de piel humana . III. Enlace de anticuerpo humano E21 con células dendríticas de macaco El modelo de animal (mono) de macaco cinomolgus puede proporcionar una información relevante en cuanto a la aplicación clínica de anticuerpos, a condición que el antígeno blanco sea conservado entre primates. Por consiguiente, la actividad cruzada de anticuerpo monoclonal humano E21 con células dendríticas a partir de mono cynomolgus fue evaluada por citometría de flujo. Monocitos de cynomolgus fueron diferenciados en células dendríticas con tratamiento GM-CSF y IL-4, y probados para enlace con E21 por citometría de flujo. Las células dendríticas fueron incubadas con E21 durante 1 hora a una temperatura de 4° C, después lavadas antes de incubación con una sonda antilgG humana-FITC durante 1 hora a una temperatura de 4° C. Las muestras fueron analizadas empleando un instrumento FACScalibur. Conclusión Los ejemplos anteriores demuestran la generación de anticuerpos monoclonales humanos que reaccionan específicamente con alta afinidad con células dendríticas.
En particular, el anticuerpo monoclonal humano Bll reconoce específicamente el receptor de mañosa de macrófago de ser humano en células dendríticas. Además, el anticuerpo monoclonal humano Bll es internalizado eficientemente por células dendríticas, e incrementa el procesamiento y la presentación de antígenos por células dendríticas. El anticuerpo monoclonal humano E21 se une a un antígeno diferente que Bll en células dendríticas humanas. El anticuerpo E21 reacciona también de manera cruzada con células dendríticas derivadas de macaco cynomolgus (mono) , lo que sugiere que el antígeno E21 es conservado en los primates y ofrece por consiguiente un modelo de animal relevante para desarrollo adicional del anticuerpo. Estos resultados soportan la conclusión en el sentido que los anticuerpos monoclonales humanos enteros de la presente invención, incluyendo fragmentos, conjugados y moléculas biespecíficas de los mismos, puede ser utilizados para el diagnóstico y tratamiento de trastornos relacionados con células dendríticas. Equivalentes Los expertos en la materia reconocerán, o bien podrán determinar empleando solamente experimentos de rutina muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita aquí. Tales equivalentes están abarcados en las reivindicaciones adjuntas.
LISTA DE SECUENCIAS <110> Medarex, Inc. <120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS PARA CÉLULAS DENDRÍTICAS <130> MXI-166PC <150> USSN 60/203,126 <151> 2000-05-08 <150> USSN 60/230,739 <151> 2000-09-07 <160> 7 <170> FastSEQ para Windows versión 4.0 <210> 1 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> (1)...(321) <400> 1 gac ate cag atg acc cag tet cea tec tea ctg tet cea tet gta gga 48 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cag ggt att age agg tgg 96 Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly He Ser Arg Trp 20 25 20 tta gcc tgg tat cag cag aaa cea gag aaa gcc cct aag tec ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu He 35 40 45 tat gct gca tec agt ttg caá agt ggg gtc cea tea agg ttc age ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggg acá gat ttc act etc acc ate age ggc ctg cag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tat tac tgc caá cag tat aat agt tac cct cgg 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 acg ttc ggc caá ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15 Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly He Ser Arg Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu He 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser G—ly_, V .a**l*. P *r Ao*, SeCr- Arir* ?.-h.?ee S5eerr GGlly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Gly leu Gln Pro 65 70 75 " 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 <210> 3 <211> 348 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)...(348) <400> 3 gag gtg cag ctg gtg cag tet gga gca gag gtg aaa aag ecc ggg gag 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 tet ctg agg ate tec tgt aag ggt tet gga gac agt ttt acc acc tac 96 Ser Leu Arg He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Asp Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tgg ate ggc tgg gtg cgc cao atg ecc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144 Trp He Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggg ate ate tat cct ggt gac tet gat acc ata tac age ceg tec ttc 192 Gly He He Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr He Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 caá ggc cag gtc acc ate tea gcc gac aag tec ate age acc gcc tac 240 Gln Gly Gln Val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag tgg age age ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 acg aga ggg gac cgg ggc gtt gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc 336 Thr Arg Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 acc gtc tec tea 348 Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 " 15 Ser Leu Arg He Ser Cys Lys Giy Ser Gly Ase Ser Phe Thr Thr Tyr 20 25 " 30 Trp He Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Giy Lys Gly Leu Giu Trs Met 35 40 45 Gly He He Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr He Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser He Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Asp Arg Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANTE <222> (1).-(15) <223> Xaa = cualquier aminoácido <400> 5 Asp Asp Xaa Xaa Gln Phe Leu He Xaa Xaa Gl- Asp Xaa Lys Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Asp Thr Arg Gln Phe Leu He Tyr Asn Glu Asp His Lys Arg 1 5 10 15 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Leu Leu Asp Thr Arg Gln Phe Leu He Tyr Leu Glu Asp Thr Lys Aro 1 5 í 1n0 15 Cys Val Asp Ala 20

Claims (1)

REIVINDICACIONES Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se enlaza con células dendríticas. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células son células humanas. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células son derivadas de monocitos o células madres progenitoras. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que no se une a células no dendríticas de tejidos humanos seleccionados dentro del grupo que consiste de piel, amígdala, hígado, mama, bazo, riñon, nodo linfático, cerebro, testículo, páncreas, corazón, intestino delgado, médula ósea, y pulmón. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, que se enlaza con macrófagos. El anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones 1-5 que se une a antígeno de macrófago humano Bll que tiene un peso molecular aproximado de 180 kD según lo medido por SDS-PAGE y que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en SEQ ID NO: 7. El anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones 1-6 que se une al receptor de mañosa de macrófago. El anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones
1-7 que inhibe la unión, opcionalmente a través de un patógeno, con el receptor de mañosa. 9. El anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones 1-8 que es internalizado después de la unión con células dendríticas. 10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 que se une a antígeno de células dendríticas humanas E21 que tiene un peso molecular aproximado de 30-40 kD de conformidad con lo medido por SDS-PAGE. 11. El anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones 1-10 que comprende una cadena pesada de IgGl o IgG3. 12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11 que comprende una cadena ligera kappa. 13. El anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones 1-12 producido por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera fusionado en una célula inmortalizada. 14. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une a células dendríticas, en donde el anticuerpo tiene por lo menos una de las características seleccionadas dentro del grupo que consiste de: a) la capacidad de unirse al receptor de mañosa presente en células dendríticas humanas con una constante de asociación de equilibrio de enlace (Ka) de por lo menos aproximadamente 107 M_1; b) la capacidad de opsonizar células dendríticas humanas; 5 c) la capacidad de ser internalizado después de unión con células dendríticas humanas; y d) la capacidad de bloquear la unión con el receptor de mañosa en células dendríticas humanas. 15. El anticuerpo humano de cualesquiera de las 10 reivindicaciones 1-14, que es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de una sola cadena. 16.Un anticuerpo monoclonal humano aislado codificado por ácidos nucleicos de cadena pesada de IgG humana y cadena ligera kappa humana que comprenden secuencias de 15 nucleótidos en sus regiones variables de conformidad con lo presentado en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, y modificaciones de secuencias conservadoras de los mismos. 17.Un anticuerpo monoclonal humano aislado que tiene 20 regiones variables de cadena pesada de IgG y cadena ligera kappa que comprenden las secuencias de aminoácidos mostrados en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente, y modificaciones de secuencias conservadoras de las mismas. 25 18. Un hibridoma que comprende una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humano y un transgen de cadena ligera fusionado sobre una célula inmortalizada, en donde el hibridoma produce una cantidad detectable de anticuerpo monoclonal humano que se une a células dendríticas. 19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, en donde el anticuerpo se une al receptor de mañosa de macrófago . 20. El hibridoma de conformidad con la reivindicación 18, en donde el anticuerpo comprende las regiones variables de cadena pesada de IgG y cadena ligera kappa que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente, y modificaciones de secuencias conservadoras de las mismas . 2l.Un animal no humano transgénico que expresa un anticuerpo monoclonal humano que se une a células dendríticas humanas, en donde el animal no humano transgénico tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano. 22.Un método para producir un anticuerpo monoclonal humano que se une a células dendríticas humanas, que comprende : inmunizar un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano con células dendríticas humanas o un componente de superficie del mismo, de tal manera que se produzcan anticuerpos a través de las células B del animal; aislar células B del animal; y fusionar las células B con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales que secretan anticuerpos monoclonales humanos que se unen a células dendríticas humanas. 23.Una molécula bi-específica que comprende una primera especificidad de enlace para una célula dendrítica humana y una segunda especificidad de enlace para un antígeno blanco, en donde la primera especificidad de enlace es un anticuerpo monoclonal humano. 24. La molécula bi-específica de la reivindicación 23, en donde el antígeno comprende un componente de un patógeno. 25. La molécula bi-específica de la reivindicación 23, en donde el antígeno comprende un antígeno tumoral . 26. La molécula bi-específica de cualesquiera de las reivindicaciones 23-25, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de una sola cadena. 27.Un complejo molecular que comprende un anticuerpo monoclonal humano que se une a una célula dendrítica humana unida a un antígeno. 28. El complejo molecular de conformidad con la 5 reivindicación 27, en donde el antígeno comprende un componente de un patógeno. 29.El complejo molecular de conformidad con la reivindicación 27, en donde el antígeno comprende un antígeno tumoral o un auto-antígeno. 10 30. El complejo molecular de cualesquiera de las reivindicaciones 27-29, en donde la porción de anticuerpo del complejo comprende un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de una sola cadena. 31.Una composición que comprende un anticuerpo monoclonal 15 humano aislado de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 32.Una composición que comprende una combinación de dos o más anticuerpos de conformidad con cualesquiera de las 20 reivindicaciones 1-17 en donde cada uno de dichos anticuerpos se une a un epítopo distinto en una célula dendrítica. 33. Una composición que comprende un complejo molecular de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 25 27-30 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 34. La composición de conformidad con la reivindicación 33 que comprende además un adyuvante. 35. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de un anticuerpo monoclonal humano que se une a células dendríticas. 36. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 34, que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. 37.Un método para enfocar un antígeno hacia una célula dendrítica en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una composición de las reivindicaciones 33 ó 34. 38.Un método para inducir o incrementar una respuesta inmunológica contra un antígeno en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una composición de las reivindicaciones 33 ó 34. 39.El método de conformidad con la reivindicación 38, en donde la respuesta inmunológica comprende la presentación de un antígeno como componente de un complejo MHC-I o MHC-II. 40.Un método para inmunizar un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una composición de las reivindicaciones 33 ó 34. 4l.El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 37-40, en donde la composición es administrada en una cantidad suficiente para inducir la liberación de citocinas o células dendríticas. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 37-40, en donde la composición es administrada en una cantidad suficiente para modular la expresión de uno o varios receptores inmunomoduladores en la superficie de células dendríticas. El método de conformidad con la reivindicación 42, en donde el receptor inmunomodulador se selecciona dentro del grupo que consiste de: CD80 (B7.1), CD86 (b7.2), CD40, y CD54 (ICAM) . Un método para prevenir la unión de un patógeno con el receptor de mañosa de ser humano en células dendríticas, que comprende la puesta en contacto del anticuerpo de cualesquiera de las reivindicaciones 1-17 con células dendríticas en una cantidad suficiente para prevenir la unión del patógeno con las células. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde el patógeno es un virus o una bacteria. Un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una composición que contiene el antígeno tumoral de la reivindicación 29 en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento del tumor. Un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad auto-inmune en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una composición que contiene un auto-antígeno de la reivindicación 29 en una cantidad suficiente para tratar o prevenir la enfermedad auto-inmune. El método de conformidad con la reivindicación 47, en donde la enfermedad es una enfermedad de injerto versus huésped.
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