MXPA02010432A - Metodo para modificar la composicion de lignina e incrementar la digestigbilidad de forrajes in vivo. - Google Patents

Abstract

Se han desarrollado metodos para transformar leguminosas forrajeras o plantas lenosas, con una construccion de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o una enzima acido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o un fragmento de la misma, en orientacion sentido o antisentido, bajo un promotor especifico de tejidos asociado con la lignificacion, dando como resultado la subregulacion del gen homologo correspondiente a traves de inhibicion antisentido o supresion sentido, asi como tambien contenido reducido de lignina y composicion modificada de lignina en las plantas transgenicas; la expresion del transgen de cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa produce una relacion incrementada de lignina de siringilo a lignina de guayacilo en la planta transformada, y digestibilidad de forraje ampliamente mejorada.

Description

MÉTODO PARA MODIFICAR LA COMPOSICIÓN DE LIGNINA E INCREMENTAR LA PIGESTIBILIDAD DE FORRAJES IN VIVO REFERENCIA RECIPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 60/192,086, presentada en marzo 24, 2000.

CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a un método de transformación de plantas, plantas transformadas, y uso de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La lignina es el componente estructural principal, de las paredes celulares vegetales con engrosamiento secundario. Es un polímero complejo de unidades de fenilpropano hidroxiladas y metoxiladas, enlazadas mediante acoplamiento oxidante que es catalizado quizá por peroxidasas y lacasas (Boudet, et al. 1995. "Tansley review No. 80: Biochemistry and molecular biology of lignification", New Phytologist 129:203-236). La lignina imparte resistencia mecánica a tallos y troncos, e hidrofobicidad a elementos vasculares que conducen el agua. Aunque la enzimología básica de la biosíntesis de la lignina es razonablemente bien entendida, quedan aún por definir los pasos reguladores en la biosíntesis y deposición de la lignina (Davin, L. B. y Lewis, N. G. 1992. "Phenylpropanoid metabolism: biosynthesis of monolignols, lignans and neolignans, lignins and suberins", Rec Adv Phytochem 26:325-375). Existe interés considerable en el potencial de la manipulación genética de los niveles y/o la composición de la lignina para ayudar a mejorar la digestibilidad de los forrajes y las propiedades de desfibrado de los árboles (Dixon, et al. 1994. "Genetic manipulation of lignin and phenylpropanoid compounds involved in interactions with microorganisms", Rec Adv Phytochem 28:153178; Tabe, et al. 1993. "Genetic engineering of grain and pasture legumes for improved nutritive valué", Genética 90:181-200; Whetten, R. y Sederoff, R. 1991. "Genetic engineering of wood", Forest Ecology and Management 43:301-316). Se ha reportado que pequeños decrementos en el contenido de lignina impactan en forma positiva la digestibilidad de los forrajes (Casler, M. D. 1987. "In vitro digestibility of dry matter and céll wall constituents of smooth bromegrass forage", Crop Sci 27:931-934). Mediante la mejora de la digestibilidad de los forrajes, se puede lograra mayor rentabilidad en las industrias ganadera y relacionadas. En dasonomía, los tratamientos químicos necesarios para la remoción de la lignina de los árboles, son costosos y potencialmente contaminantes. Las ligninas contienen tres especies de monómeros principales, denominados p-hidroxifenilo (H), guayadlo (G) y siringilo (S), producidos mediante reducción de tioésteres de CoA de ácidos cumárico, ferúlico y sinápico, respectivamente (véanse esquemas 1 y 2). En angiospermas, las unidades de guayadlo y siringilo predominan, y la relación de S/G afecta las propiedades físicas de la lignina. Las unidades S y G se enlazan a través de cinco patrones de unión de dímeros diferentes (Davin, L. B y Lewis, N. G. 1992, Rec Adv Phytochem 26:325-375). Se desconocen actualmente los mecanismos que determinan las proporciones relativas de estos tipos de enlace en un polímero de lignina en particular. Además, existe considerable debate sobre si la composición y estructura de la lignina son firmemente controladas, o son flexibles, dependiendo de la disponibilidad de monómeros ("Lewis, N. G. 1999. "A 20th century roller coaster ride: a short account of lignification", Current Opinión in Plant Biology 2:153-162; Sederoff, et al. 1999, "Unexpected variation in lignin", Current Opinión in Plant Biology 2:145-152).

ESQUEMA 1 Los niveles de lignina aumentan con la madurez progresiva en los tallos de los cultivos forrajeros, incluyendo leguminosas tales como la alfalfa (Jung, H. G. y Vogel, K. P. 1986, "Influence of lignin on digestibility of forage cell wall material", J. Anim Sci 62:1703-1712), y en pastos tales como la cañuela alta (Buxton, D. R. y Russell, J. R. 1988. "Lignin constituents and cell wall digestibility of grass and legume stems", Crop Sci 28:553-558). Además, la composición de lignina cambia con la madurez avanzada hacia una relación de S/G progresivamente mayor (Buxton, D. R. y Russell, J. R. 1988. Crop Sci 28:553-558). Se ha reportado que la concentración de lignina (Albrecht, et al. 1987. "Cell-wall composition and digestibility of alfalfa stems and leaves", Crop Sc/' 27:735-741; Casler, M. D. 1987. Crop Sci 27:931-934; Jung, H. G. y Vogel, K. P. 1986. J. Anim Sci 62:1703-712) y el contenido de metoxilo de la lignina, que reflejan una relación de S/G incrementada (Sewalt, et al. 1996. "Lignin impact on fiber degradation. 1. Quinone methide intermedíates formed from lignin during in vitro fermentation of corn stover", J Sci Food Agrie 71 :195-203), se correlacionan negativativamente con la digestibilidad del forraje en animales rumiantes. Aunque numerosos estudios han vinculado la digestibilidad disminuida del forraje con la relación de S/G incrementada como una función de madurez incrementada (Buxton, D. R. y Russell, J. R. 1988. Crop Sci 28:553-558; Grabber, et al. 1992. "Digestión kinetics of parenchyma and sclerenchyma cell walls isolated from orchardgrass and switchgrass", Crop Sci 32:806-810), otros estudios han cuestionado el efecto de la composición de lignina sobre la digestibilidad (Grabber, et al. 1997. "p-hydroxyphen l, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability", J. Agrie Food Chem 45:2530-2532). Además, las ligninas de gimnospermas latifoliadas son altamente condensadas, careciendo esencialmente de residuos S, y esto las hace menos sujetas a desfibrado químico, en contradicción aparente con el concepto de que reducir la relación de S/G sería benéfico para la digestibilidad del forraje. La falta de consenso reportada sobre la relación de la composición de lignina con la digestibilidad del forraje y el desfibrado químico, se debe en parte al hecho de que los estudios hasta la fecha han sido in vitro, o han comparado materiales vegetales en diferentes etapas de desarrollo, diferentes variedades o incluso diferentes especies. Por lo tanto, sería benéfico el desarrollo de líneas isogénicas que se pudieran comparar directamente para revelar los efectos de la relación de S/G alterada en la digestibilidad del forraje. La formación de las unidades G y S de la lignina, requiere la actividad de enzimas O-metil-transferasa. En angiospermas, la ácido cafeico 3-O-metiltransferasa (COMT) de la biosíntesis de lignina, fue descrita originalmente como bifuncional, convirtiendo el ácido cafeico en ácido ferúlico, y convirtiendo el ácido 5-hidroxiferúlico en ácido sinápico (Davin, L. B. y Lewis, N. G. 1992, Rec Adv Phytochem 26:325-375), como se muestran en los esquemas 1 y 2. La metilación de la porción cafeato ocurre también al nivel del tioéster de CoA, catalizada por la cafeoil CoA 3-O-metiltransf erasa (CCOMT) (Pakusch, et al., 1989, "S-adenosyl-L-methionine: trans-caffeoyl- coenzyme A 3-O-methyltransferase from elicitor-treated parsley cell suspensión cultures", Arch Biochem Biophys 271 :488-494). Se ha propuesto la intervención de la enzima CCOMT en una vía paralela a la formación de monómeros de lignina (Ye, et al. 1994. "An alternative methylation pathway in lignin biosynthesis in Zinnia", Plant Cell 6: 1427-1439; Zhong, et al. 1998. "Dual methylation pathways in lignin biosynthesis", Plant Cell 10:2033-2045). Los estudios de marcación in vivo en Magnolia kobus, han mostrado que el estado de metilación de los monómeros de lignina se puede determinar también al nivel del aldehido o alcohol (Chen, et al. 1999. "Evidence for a novel biosynthetic pathway that regulates the ratio of syringyl to guaiacyl residues in lignin in the differentiating xylem of Magnolia kobus DC", Planta 207:597-603). Esto es apoyado por la observación de que la enzima designada como ferulato 5-hidroxilasa, tiene mayor afinidad por el feruloil aldehido que por el ácido ferúlico, por lo menos en el liquidámbar (Osakabe, et al. 1999. "Coniferyl aldehyde 5-hydroxylation and methylation direct syringyl lignin biosynthesis in angiosperms", Proc Natl Acad Sci. USA 96:8955-8960) y Arabidopsis (Humphreys, et al. 1999. "New routes for lignin biosynthesis defined by biochemical characterization of recombinant ferulate 5-hydroxylase, a multifuncional cytochrome P450-dependent monooxygenase", Proc Natl Acad Sci USA 96:10045-10050). Además, se ha mostrado recientemente que el 5-hidroxiconiferil aldehido es un substrato adecuado para la COMT de varias especies de árboles (Li, et al. 2000. "5-hydroxyconiferyl aldehyde modulates enzymatic methylation for syringyl monolignol formation, a new view of monolignol biosynthesis in angiosperms", J Biol Chem 275:6537-6545). Se ha reportado que el efecto inhibidor del 5-hydroxiconiferil aldehido sobre la metilación del cafeato por la COMT, podría evitar que la COMT lleve a cabo el primer paso de metilación en la biosíntesis de la lignina S (Li, et al. 2000. J. Biol Chem 275:6537-6545). De esta manera, aunque estudios del carácter específico del substrato por la enzima in vitro sugieren que los monómeros de lignina se pueden formar mediante el funcionamiento de una red metabólica compleja, implicando O-metilación en etapas múltiples como se muestra en los esquemas 1 y 2, aún no se ha determinado si esto ocurre in vivo.

ESQUEMA 2 unidad de guayacilo (G) unidad de siringito Varios estudios han destacado las propiedades de las O-metiltransferasas que intervienen en la biosíntesis de lignina en la principal leguminosa forrajera del mundo, la alfalfa (Medicago sativa L.) (Gowri, et al. 1991. "Stress responses in alfalfa (Medicago sativa L.) X. Molecular cloning and expression of S-adenosyl-L-methionine: caffeic acid-3-O-methyltransferase, a key enzyme of lignin biosynthesis", Plant Physiol 97:7-14; Inoue, et al. 1998. "Developmental expression and substrate specificities of alfalfa caffeic acid 3-O-methyltransferase and caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase in relation to lignification", Plant Physiol 117:761-770; Kersey, et al. 1999. "Immunolocalization of two lignin O-methyltransferases in stems of alfalfa (Medicago sativa L.)", Protoplasma 209:46-57). La COMT de alfalfa expresada en E. coli, muestra preferencia (alrededor de 2:1 ) por el ácido 5-hidroxiferúlico sobre el ácido cafeico, mientras que la CCOMT muestra un grado de preferencia similar por la cafeoil CoA, en comparación con 5-hidroxiferuolil CoA (Inoue, et al. 1998. Plant Physiol 117:761-770). Estos estudios sugieren, pero no demuestran, que la COMT puede intervenir preferencialmente en la formación de lignina S en la alfalfa, y CCOMT en la formación de lignina G. La preferencia de COMT por el substrato en extractos crudos de tallos de alfalfa, cambia con la creciente madurez de los entrenudos, en una forma consistente con el incremento en el contenido de grupos metoxilo de la lignina con la madurez creciente (Inoue, et al. 1998. Plant Physiol 117:761-770; Inoue, et al. 2000. "Substrate preferences of caffeic acid/5-hydroxyferulic acid 3-0-methyltransferases in developing stems of alfalfa (Medicago sativa L.)' Arch Biochem Biophys 375:175-182). De esta manera, en entrenudos jóvenes, la actividad muestra una preferencia por el ácido cafeico sobre el ácido 5-hidroxiferúlico, mientras que lo opuesto ocurre en los entrenudos más maduros. Una O-metiltransf erasa con preferencia por el ácido cafeico (COMT II), ha sido separada recientemente de la COMT previamente caracterizada, y no reacciona con antisueros que reconocen los productos de los genes de COMT o CCOMT de alfalfa previamente caracterizados. Esta enzima es más activa ante el ácido cafeico, para el cual tiene un valor de Km muy bajo (aproximadamente 40 veces menor que la COMT asociada con la lignificación), pero metila también ácido 5-hidroxiferúlico, cafeoyl CoA, 5-hidroxiferuolil CoA, quercetina y catecol (Inoue, et al. 2000. Arch. Biochem Biophys 375:175-182). Sólo está presente en los entrenudos jóvenes, y ha desaparecido por el quinto entrenudo. Análisis de hibridación por impresión en tejidos, indican que se ha localizado que los transcritos de COMT y CCOMT desarrollan elementos del xilema en tallos de alfalfa, mientras que se encuentran también transcritos de CCOMT en el floema (Inoue, et al. 1998. Plant Physiology 117:761-770). Estudios de inmunolocalización a los niveles de microscropio electrónico y óptico, demostraron la expresión de COMT y CCOMT en el citoplasma de células de parénquima del xilema de alfalfa (Kersey, et al. 1999 Protoplasma 209:46-57). La presencia de ambas enzimas en las mismas células, es consistente con la hipótesis de la "red metabólica" para la formación de monómeros de lignina. Han habido varios reportes sobre los efectos de la subregulación de la actividad de la COMT sobre el contenido y la composición de lignina en tabaco y álamo transgénicos (Ni, et al. 1994. "Reduced lignin in transgenic plants containing an engineered caffeic acid O-methyltransferase antisense gene", Transgenic Res 3:120-126; Atanassova, et al. 1995. "Altered lignin composition in transgenic tobáceo expressing O-methyltransferase sequences in sense and antisense orientation", Plant J 8:465-477; Van Doorsselaere, et al. 1995. "A novel lignin in poplar trees with a reduced caffeic acid/5-hydroxyferulic acid O-methyltransferase activity", Plant J 8:855-864; Zhong, et al. 1998. Plant Cell 10:2033-2045). Los resultados de estos estudios han sido un poco contradictorios, debido quizá a diferencias no especificadas en la madurez de los tejidos, el uso de transgenes homólogos contra heterólogos, y el uso de diferentes métodos para el análisis de la lignina. Sin embargo, en casos en donde la COMT ha sido reducida hasta niveles menores de aproximadamente 20% del tipo silvestre por expresión de un transgen homólogo, una fuerte reducción en la relación de S/G no va acompañada por cambio aparente alguno en el contenido de lignina (Atanassova, et al. 1995. Plant J 8:465-477; Van Doorsselaere, et al. 1995. Plant J 8:855-864). En el tabaco, la subregulación de la CCOMT lleva a una disminución correspondiente en los niveles de lignina de Klason, acompañada de decrementos en los niveles absolutos de unidades S y G (Zhong, et al. 1998. Plant Cell 10:2033-2045).

La mayoría de los estudios sobre la modificación genética de la biosíntesis de la lignina, en plantas transgénicas, ha usado al promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor para dirigir la expresión de genes sentido o antisentido asociados con la lignificación (Halpin, et al. 1994. "Manipulation of lignin quality by down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase", Plant J 6:339-350; Ni, et al. 1994. Transgenic Res 3: 120-126; Atanassova, et al. 1995. Plant J 8:465-477; Van Doorsselaere, et al. 1995. Plant J 8:855-864; Piquemal, et al. 1998. "Down-regulation of cinnamoyl-CoA reducíase induces significant changes of lignin profiles in transgenic tobáceo plants", Plant J 13:71-83; Zhong, et al. 1998. Plant Cell 10:2033-2045; Baucher, et al. 1999, "Down-regulation of cinnamyl alcohol dehydrogenase in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.) and the effect on lignin composition and digestibility", Plant Mol Biol 39:437-447). Sin embargo, se puede obtener una subregulación más efectiva dirigiendo la expresión del transgen mediante un promotor específico de tejidos vasculares. Por ejemplo, la modificación de la composición de lignina por sobreexpresión de ferulato 5-hidroxilasa en Arabidopsis transgénico, era más efectiva si el transgen era dirigido por el promotor de cinamato 4-hidroxilasa de Arabidopsis asociado con la lignificación, que por el promotor 35S constitutivo (Meyer, et al. 1998. "Lignin monomer composition is determined by the expression of a cytochrome P450-dependent monooxygenase in Arabidopsis", Proc Natl Acad. Sci USA 95:6619-6623). Hasta la fecha, ha habido muy pocos reportes publicados sobre la modificación genética de la lignina en cultivos forrajeros, y la mayoría de los estudios se han concentrado en sistemas modelo tales como Arabidopsis y tabaco, o especies de árboles tales como el álamo. En un estudio, la subregulación de cinamil alcohol deshidrogenasa, una enzima posterior en la vía de monolignol que COMT o CCOMT, llevó a una mejora pequeña pero significativa en la digestibilidad de materia seca in vitro en alfalfa transgénica (Baucher, et al. 1999. Plant Mol Biol 39:437-447). La patente de E.U.A. No. 5,451 ,514 describe un método para alterar el contenido o la composición de lignina en una plata, incorporando establemente en el genoma de la planta un ADN recombinante que codifica para un ARN mensajero que tiene similitud de secuencias con la cinamil alcohol deshidrogenasa. La patente de E.U.A. No. 5,850,020 describe un método para modular el contenido o la composición de lignina, mediante transformación de una célula vegetal con una construcción de ADN con por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una porción funcional de una de varias enzimas aisladas de Pinus radiata (pino) o una secuencia que tiene 99% de homología con el gen aislado: cinamato 4-hidroxilasa (C4H) cumarato 3-hidroxilasa (C3H), fenolasa (PNL), 0-metiltransferasa (OMT), cinamoil-CoA reductasa (CCR), fenilalanina amoníaco-liasa (PAL), 4-cumarato:CoA ligasa (4CL) y peroxidasa (POX). La patente de E.U.A. No. 5,922,928 describe un método para transformar y regenerar especies de Populus para alterar el contenido y la composición de lignina, usando un gen de O-metiltransferasa. Está aún sin resolver la cuestión de cómo la alteración de la relación de S/G podría afectar la digestibilidad de las especies forrajeras. Se ha encontrado ahora que la transformación de plantas con los genes de enzimas COMT o CCOMT de la vía biosintética de la lignina en una orientación sentido o antisentido bajo un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, que conduce a la subregulación del gen homólogo correspondiente, así como también contenido reducido de lignina y composición modificada de lignina en las plantas transgénicas, produce mejoras significativas en la digestibilidad de forrajes, particularmente en el caso de subregulación de la CCOMT.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para modular el contenido de lignina de una leguminosa forrajera, el cual comprende transformar una célula de leguminosa forrajera con un vector que comprende un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación enlazado funcionalmente con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma, o una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma; y generar plantas a partir de la célula de leguminosa forrajera transformada. En otra modalidad, la célula de leguminosa forrajera es cotransformada con un vector que comprende un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación enlazado funcionalmente a una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma, y otro vector que comprende un promotor específico asociado con la lignificación, enlazado funcionalmente a una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma. En otra modalidad, se puede usar en este método una construcción de ADN que comprende en tándem por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metriltransferasa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un primer promotor específico de tejidos asociado con la lignificación y por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un segundo promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde dichos primer y segundo promotores específicos de tejidos asociados con la lignificación, pueden ser iguales o diferentes. El marco de lectura abierto puede estar en una orientación sentido o una orientación antisentido. Un ejemplo de promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, es un promotor PAL2 del frijol. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una leguminosa forrajera que tiene una composición de lignina alterada, el cual comprende transformar una célula de leguminosa forrajera con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransf erasa o fragmento de la misma, o una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación para formar una célula transgénica; y cultivar dicha célula transgénica bajo condiciones que lleven a regeneración y crecimiento de la planta. En otra modalidad, la célula de leguminosa forrajera es cotransformada con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y otra construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación. En otra modalidad, se puede usar en este método una construcción de ADN que comprende en tándem por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransf erasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un primer promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un segundo promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde dichos primer y segundo promotores específicos de tejidos asociados con la lignificación, pueden ser iguales o diferentes. El marco de lectura abierto puede estar en una orientación sentido o una orientación antisentido. Un ejemplo de promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, es un promotor PAL2 del frijol. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para mejorar la digestibilidad de leguminosas forrajeras, el cual comprende incorporar establemente en el genoma de dicha leguminosa forrajera, una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima 3-O-metiltransf erasa o un fragmento de la misma, a partir de la vía biosintética de la lignina bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociados con la lignificación, en donde la expresión de la enzima o fragmento de enzima produce un cambio en la composición de lignina en la leguminosa forrajera. Una enzima útil en este método es la cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa, la cual causa de preferencia una reducción en el contenido de lignina de guayadlo. En otra modalidad, la leguminosa forrajera es cotransformada con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y otra construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación. En otra modalidad, se puede usar en este método una construcción de ADN que comprende en tándem por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransf erasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un primer promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un segundo promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde dichos primer y segundo promotores específicos de tejidos asociados con la lignificación, pueden ser iguales o diferentes. El marco de lectura abierto puede estar en una orientación sentido o una orientación antisentido. Un ejemplo de promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, es un promotor PAL2 del frijol. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una planta leñosa que tiene composición alterada de lignina, el cual comprende transformar una célula de planta leñosa con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación para formar una célula transgénica; y cultivar la célula transgénica bajo condiciones que lleven a regeneración y crecimiento de la planta. En otra modalidad, la célula de planta leñosa es cotransformada con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y otra construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación. En otra modalidad, se puede usar en este método una construcción de ADN que comprende en tándem por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un primer promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un segundo promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde dichos primer y segundo promotores específicos de tejidos asociados con la lignificación, pueden ser iguales o diferentes. El marco de lectura abierto puede estar en una orientación sentido o una orientación antisentido. Un ejemplo de promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, es un promotor PAL2 del frijol. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para modular el contenido de lignina de una planta leñosa, el cual comprende transformar una célula de planta leñosa con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación para formar una célula transgénica; y cultivar la célula transgénica bajo condiciones que lleven a regeneración y crecimiento de la planta. En otra modalidad, la célula de planta leñosa es cotransformada con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y otra construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificadón. En otra modalidad, se puede usar en este método una construcción de ADN que comprende en tándem por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un primer promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un segundo promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde dichos primer y segundo promotores específicos de tejidos asociados con la lignificación, pueden ser iguales o diferentes. El marco de lectura abierto puede estar en una orientación sentido o una orientación antisentido. Un ejemplo de promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, es un promotor PAL2 del frijol. En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para obtener ligninas con patrones alterados de unión de dímeros, el cual comprende transformar una célula vegetal con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransf erasa o una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa o un fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación para formar una célula transgénica; y cultivar la célula transgénica bajo condiciones que lleven a regeneración y crecimiento de la planta. En otra modalidad, la célula vegetal es cotransformada con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y otra construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransf erasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación. En otra modalidad, se puede usar en este método una construcción de ADN que comprende en tándem por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma bajo el control de expresión de un primer promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa de Medicago sativa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un segundo promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde dichos primer y segundo promotores específicos de tejidos asociados con la lignificación, pueden ser iguales o diferentes. El marco de lectura abierto puede estar en una orientación sentido o una orientación antisentido. Un ejemplo de promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, es un promotor PAL2 del frijol. En otro aspecto, la presente invención se refiere a una planta transformada mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra construcciones binarias usadas para la modificación genética de la expresión de COMT y CCOMT en alfalfa transgénica. PAL2 es el promotor PAL2 de fenilalanina amoníaco-liasa del frijol, de -183 a -1226 pares de bases (Liang, et al. 1989. "Developmental and environmental regulation of a phenylalanine ammonia-lyase 13-glucuronidase gene fusión in transgenic tobáceo plants". Proc Natl Acad Sci USA 86:9284-9288) y NOS, el terminador de nopalina sintasa. La direccionalidad de COMT y CCOMT se indica mediante las flechas respecto a la dirección del promotor PAL2. Las construcciones que contienen COMT y CCOMT en orientaciones sentido o antisentido, se obtuvieron mediante duplicación de los cassettes PAL2/COMT/NOS y PAL2/CCOMT/NOS y, por lo tanto, cada ADNc está bajo el control de un promotor PAL2 separado. La introducción de ambos transgenes en una planta individual, se logró también mediante cotransformación (Irdani, et al. 1998. "Construction of a new vector conferring methotrexate resistance in Nicotiana tabacum plants", Plant Mol Biol 37:1079-1084) con construcciones de COMT y CCOMT individuales. Todas las construcciones están en el vector binario pCAMBIA3300. Las figuras 2A-2J ilustran actividades de COMT y CCOMT en tejido del tallo de líneas control y líneas transgénicas de COMT y/o CCOMT. La figura 2A muestra la actividad de COMT en plantas control, transformadas con el vector pCAMBIA3300 vacío. La figura 2B muestra la actividad de COMT en plantas transformadas con COMT en orientación sentido ("SC"). La figura 2C muestra la actividad de COMT en plantas transformadas con una construcción que contiene COMT y CCOMT en orientación sentido ("DS"), o mediante cotransformación con construcciones de COMT y CCOMT antisentido individuales. La figura 2D muestra la actividad de COMT en plantas transformadas con COMT en orientación antisentido ("AC"). La figura 2E muestra la actividad de COMT en plantas transformadas con una construcción que contiene COMT y CCOMT en orientación antisentido ("DA"), o mediante cotransformación con construcciones de COMT y CCOMT antisentido individuales. La figura 2F muestra la actividad de CCOMT en plantas control, transformadas con el vector pCAMBIA3300 vacío. La figura 2G muestra la actividad de CCOMT en plantas transformadas con CCOMT en orientación sentido ("SCC"). La figura 2H muestra la actividad de CCOMT en plantas transformadas con una construcción que contiene COMT y CCOMT en orientación sentido ("DS"), o mediante cotransformación con construcciones de COMT y CCOMT antisentido individuales. La figura 21 muestra la actividad de CCOMT en plantas transformadas con CCOMT en orientación antisentido ("ACC"). La figura 2J muestra la actividad de CCOMT en plantas transformadas con una construcción que contiene COMT y CCOMT en orientación antisentido ("DA"), o mediante cotransformación con construcciones de COMT y CCOMT antisentido individuales. Las barras representan las medias (líneas continuas) y desviaciones estándar (líneas punteadas) de poblaciones control respectivas. Se determinaron las actividades enzimáticas en los entrenudos sexto a noveno de tallos de etapa de desarrollo idéntica. La figura 3 ilustra cromatografías de gases típicas que muestran productos de tioacidólisis de muestras de lignina de plantas de alfalfa de tipo silvestre (WT), suprimidas en COMT (SC5) y suprimidas en CCOMT (ACC305). Las unidades de G, S y 5-hidroxiguayacilo (50HG) están marcadas. Los picos aparecen como dobletes debido a la formación de isómeros eritro y treo de cada producto de degradación. La figura 4 ilustra la secuencia de nucleótidos completa para la región de codificación de 1097 pares de bases de COMT de alfalfa (nucleótidos 31-1128 del Banco de Genes, número de acceso M63853). La figura 5 ilustra la secuencia de nucleótidos completa para la región de codificación de 743 pares de bases de CCOMT de alfalfa (nucleótidos 36-779 del Banco de Genes, número de acceso U20736).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Mediante el uso de los métodos de la presente invención, se puede modificar el contenido y la composición de lignina de una leguminosa forrajera tal como la alfalfa. Las leguminosas forrajeras son transformadas con genes que codifican para enzimas O-metiltransferasa (OMT) de la vía biosintética de la lignina insertados en las orientaciones sentido o antisentido y bajo el control de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación. Este método de transformación puede dar como resultado varios resultados: una subregulación de los genes de OMT homólogos correspondientes, silenciamiento génico, niveles reducidos de actividad de OMT, contenido reducido de lignina y composición de lignina modificada en plantas transgénicas, y digestibilidad incrementada de materiales de plantas transgénicas en animales rumiantes. Mediante la transformación de leguminosas forrajeras con enzimas OMT, ha sido ahora posible producir plantas que tienen contenido y composición de lignina modificados para comparación directa de los efectos del contenido y/o la composición de lignina sobre la digestibiiidad del forraje. Una modalidad preferida de la invención incluye diseñar genéticamente variedades forrajeras con lignina modificada para incrementar la digestibilidad del forraje en animales. En otra modalidad, las plantas son modificadas para alterar las ligninas y mejorar las características de desfibrado para la industria del papel. Los métodos de transformación de la presente invención usan construcciones binarias que comprenden secuencias de ADN que codifican para enzimas O-metiltransferasa (OMT) de la vía biosintética de la lignina, de preferencia en conjunto con una secuencia de gen promotor y una secuencia de terminación. En la presente invención, se usan en el procedimiento de transformación secuencias de ADN completas o parciales aisladas de alfalfa, o producidas mediante medios recombinantes codificando o parcialmente codificando para enzimas O-metiltransferasa (OMT). De preferencia, una secuencia de ADNc de COMT y CCOMT de alfalfa de longitud completa en orientación sentido o antisentido se coloca en un vector binario, en donde el ADNc es dirigido por un promotor asociado con la lignificación. En forma alternativa, las construcciones pueden contener moléculas de ADNc de COMT y CCOMT en tándem en orientaciones sentido o antisentido, en donde cada molécula de ADNc es dirigida independientemente por un promotor asociado con la lignificación. Aunque se prefieren secuencias de ADNc de COMT y CCOMT de longitud completa, se puede usar en la presente invención una secuencia de ADN genómico o una secuencia de ADNc que codifica para una porción de COMT y CCOMT, siempre que la secuencia de ADN sea de longitud suficiente para codificar para un fragmento de la enzima, en donde el fragmento es efectivo para causar inhibición antisentido o silenciamiento génico de la expresión de OMT. Para dirigir la expresión de transgenes en leguminosas forrajeras, se usa un promotor asociado con la lignificación. Cualquier promotor asociado con la lignificación conocido en la técnica, puede ser útil en la presente invención. Sin embargo, puesto que las enzimas COMT y CCOMT se expresan en el parénquima del floema y xilema en la alfalfa, se prefieren promotores asociados con la lignificación, selectivos por el tejido vascular. La secuencia del gen promotor puede ser endógena a la planta objetivo, o puede ser exógena, siempre que el promotor sea funcional en la planta objetivo. Se puede usar un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación para dirigir la producción de ARN sentido o antisentido en el tejido de interés. Un ejemplo de secuencia de gen promotor para su uso en leguminosas forrajeras, es el promotor PAL2 del frijol (Phaseolus vulgarís). Muchas secuencias de terminación de genes, conocidas en la técnica, son útiles en la presente invención. La secuencia de terminación de genes puede ser del mismo gen que la secuencia del gen promotor o de un gen diferente. Un ejemplo de secuencia de terminación de genes es el extremo 3' del gen de nopalina sintasa, o nos. Las construcciones de ADN de la presente invención pueden contener opcionalmente cualquier marcador de selección efectivo en células vegetales, como medio para detectar una transformación exitosa. Ejemplos de marcadores de selección incluyen genes de resistencia a antibióticos o herbicidas. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen un gen de neomicina fosfotransferasa o gen de fosfinotricina acetil transferasa (bar). Por ejemplo, un marcador de selección preferible es el gen bar que codifica para fosfinotricina acetil transferasa, que confiere resistencia a herbicidas a base de fosfinotricina. Los métodos de transformación de la presente invención incluyen cualquier medio conocido en la técnica mediante el cual las leguminosas forrajeras pueden ser transformadas exitosamente usando las construcciones de ADN que se describen en la presente. Se prefiere la transformación mediada por Agrobacterium mediante técnicas biolísticas o de discos foliares, seguido de regeneración a través de embriogénesis somática, organogénesis directa, o técnicas de infiltración en vacío que evitan la necesidad del cultivo de tejidos.

EJEMPLO 1 Modificación de lignina de la alfalfa Plantas de alfalfa fueron transformadas exitosamente usando los métodos de transformación por modificación de lignina de la presente invención. Se obtuvieron plantas de alfalfa que exhiben cambios en el contenido y la composición de lignina. Para dirigir la expresión de transgenes en leguminosas forrajeras, se eligió el promotor PAL2 del frijol, el cual fue caracterizado previamente como asociado a la lignificación, y expresado fuertemente en el tejido vascular de tabaco transgénico (Leyva, et al. 1992. "Cis-element combinations determine phenylalanine ammonia-lyase gene tissue specific expression patterns", Plant Cell 4:263-271 ; Shufflebottom, et al. 1993. "Transcription of two members of a gene family encoding phenylalanine ammonia-lyase leads to remarkably different cell specificities and induction patterns", Plant J 3:835-845). Se obtuvo un número de construcciones de genes para poner a prueba el carácter específico del promotor PAL2 del frijol por el tejido en alfalfa usando el gen reportero GUS, o para dirigir la expresión de los genes de las O-metiltransferasas de alfalfa COMT y/o CCOMT, en orientaciones sentido o antisentido. Se obtuvo el promotor PAL2 del frijol del clon genómico gPAL2 (Cramer, et al. 1989. "Phenylalanine ammonia-lyase gene organization and structure", Plant Mol Biol 12:367-383), y fue clonado en los sitios EcoRI/ßamHI de pUC18. Se usó mutagénesis dirigida a sitio para deletar (eliminar) el sitio ?/cfel en pUC18 para crear el plásmido pUC18-PAL. El marco de lectura abierto del gen GUS fue separado del plásmido PGN100 (Reimann-Philipp, R. y Beachv, R. N. 1993. "Coat protein-mediated resistance in transgenic tobáceo expressing the tobáceo mosaic virus coat protein from tissue-specific promoters", Mol Plant Microbe Interact 6:323-330) mediante digestión con EcoRI/Smal, y dos polienlazadores de ADN que contienen diferentes sitios de restricción, EcoRI-Ssr/ll-?/aíel-fíamHI-Smal y EcoRI-Bg/ll-fíamHI-?/ /el-Smal, fueron introducidos independientemente entre los sitios EcoRI y Smal, respectivamente. Un fragmento de BglWIPsñ que contiene la secuencia del terminador de nopalina sintasa (nos), fue insertado en los sitios BamHUPsfí de pUC18-PAL, para dar los plásmidos pPTNI y pPTN2, los cuales contienen al promotor PAL2 del frijol y al terminador de nos. Para crear el cassette para la expresión del gen gusA, el promotor PAL2 del frijol fue liberado del plásmido pPTN2 mediante digestión con EcoRI, y los extremos fueron llenados con fragmento Klenow, y digeridos entonces con SamHI. El plásmido ubß-GUS (Garbarino J. E. y Belknap W. R. 1994. "Isolation of a ubiquitin-ribosomal protein gene (ub¡3) from potato and expression of ¡ts promoter in transgenic plants", Plant Mol Biol 24:119-127) fue tratado con Xbal, Klenow y BamHl para reemplazar el promotor de ubi3 con el promotor PAL2 aislado del frijol. El cassette de expresión de gusA fue clonado entonces en pCAMB13300 cortado con Hind W/EcoRi, para crear la construcción de expresión de gusA pCAMGUS. Se introdujeron construcciones en LBA4404 de Agrobacteríum tumefaciens, usando el procedimiento de electroporación de Gibco BRL Lifetechnologies (Gibco BRL Lifetechnologies, Rockvitle, MD). Se llevó a cabo transformación de la alfalfa con discos foliares (cv Regen SY), con base en un método descrito anteriormente (Shanin, et al. 1986. "Transformation of cultivated alfalfa using disarmed Agrobacterium tumefaciens", Crop Sci 26:1235-1239; Thomas, et al. 1990. "Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium-transformed tissues", Plant Sci 69:189-198). Se añadió fosfinotricina (5 mg/L) al medio de cultivo para selección de transformantes resistentes. Las plantas de alfalfa fueron cultivadas en el invernadero bajo condiciones estándar. Todas las transformaciones se llevaron a cabo con material clonalmente propagado de una línea seleccionada altamente generable, denominada 4D. Para confirmar el carácter específico del promotor PAL2 del frijol por el tejido en alfalfa transgénica, se obtuvieron varias plantas independientes mediante transformación mediada por Agrobacterium, en donde el vector binario pCAMGUS contenía al gen marcador GUS bajo el control del promotor PAL2 del frijol (-182 a -126 pares de bases) de longitud completa, como se ilustra en la figura 1. Entonces, se llevaron a cabo pruebas histoquímicas de GUS para determinar los sitios celulares de la actividad de promotor de PAL2. Secciones manuales de tallos, raíces y pecíolos de alfalfa, fueron incubadas en hielo durante 30 minutos en paraformaldehído a 2% y regulador de pH de fosfato de sodio a 100 mM, pH 7.0. Entonces, fueron infiltradas en vacío en X-gluc a 2 mM en regulador de pH de fosfato de sodio a 50 mM, pH 7.0, Tritón X-100 a 0.5% durante 10 segundos, seguido de una incubación durante 2 horas a 37°C. Después de tinción, los tejidos verdes fueron blanqueados varias veces en etanol a 70% para permitir la visualización de la tinción azul. Secciones transversales de estas plantas (conteniendo la construcción de PAL2-GUS pCAMGUS) teñidas de azul con el substrato cromógeno X-gluc, revelaron la expresión de GUS en el tejido vascular de raíces, tallos y pecíolos, lo cual no se observó en tejido control no transgénico teñido en forma similar (conteniendo el vector pCAMBIA3300 vacío). Aunque la mayor parte de la tinción en tejidos del tallo y pecíolo fue localizada hacia las células del parénquima vascular, hubo también cierta tinción de las células del mesófilo y células epidérmicas de los pecíolos. Estos resultados fueron reproducidos en otros transformantes independientes. La tinción relativamente selectiva de tejidos vasculares, indicó que el promotor PAL2 del frijol sería adecuado para dirigir la expresión de transgenes sentido y antisentido de COMT y CCOMT, ya que estas enzimas se expresan en el parénquima del floema y xilema en la alfalfa (Kersey, et al. 1999. Protoplasma 209:46-57). Secuencias de ADNc de COMT y CCOMT de alfalfa de longitud completa, en orientaciones sentido y antisentido, se pusieron bajo el control del promotor PAL2 del frijol en el vector binario pCAMBIA3300, como se resume en la figura 1. Construcciones adicionales contenían moléculas de ADNc de COMT y CCOMT en tándem, en orientaciones sentido o antisentido, en donde cada molécula de ADNc fue dirigida independientemente por un promotor PAL2 del frijol, como se muestra en la figura 1. Se aislaron secuencias de codificación de COMT y CCOMT de construcciones de ADNc de OMT separadas en vectores pET (Inoue, et al. 1998. Plant Physiol 117:761-770), que contenían el ADNc de COMT de alfalfa de longitud completa de 1097 pares de bases (Gowri, et al. 1991. Plant Physiol 97:7-14; número de acceso del Banco de Genes M63853) (SEQ ID NO: 1 y figura 4), o el ADNc de CCOMT de alfalfa de longitud completa de 743 pares de bases (número de acceso del Banco de Genes U20736) SEQ ID NO: 2 y figura 5).

Las inserciones de COMT y CCOMT fueron removidas como fragmentos Nde\IBamH\, ligadas en los sitios Nde\/BamH\ de pPTN1 y pPNT2, produciendo los plásmidos pPTNI-COMT y pPTNI-CCOMT para expresión sentido de COMT o CCOMT, respectivamente, y pPTN2-COMT y pPTN2-CCOMT para expresión antisentido de COMT y CCOMT, respectivamente. Los genes quiméricos fueron clonados entonces como fragmentos EcoRMHindW en sitios EcoRUHindW del vector binario pCAMBIA3300, el cual tiene un gen de resistencia a fosfinotricina como marcador seleccionable. Las construcciones binarias resultantes fueron designadas como pCAMCI (COMT individual, sentido), pCAMC2 (COMT individual, antisentido), pCAMCCI (CCOMT individual, sentido), pCAMCC2 (CCOMT individual, antisentido), pCAMCICCI (COMT en tándem, sentido, CCOMT sentido), pCAMC2CC2 (COMT en tándem, antisentido, CCOMT antisentido) y pCAMGUS, como se muestra en la figura 1. Para obtener construcciones para expresión sentido o antisentido de genes de COMT y CCOMT en tándem, los plásmidos pPTN1-COMT y pPTN2-COMT fueron cortados primero con EcoRI, llenados con fragmento Klenow de ADN polimerasa I, y digeridos entonces con Hincñli. Los fragmentos aislados fueron ligados en pPTN1 tratado con Na?, tratado con fragmento Klenow y tratado con HindlW, para crear el vector de lanzadera pPTNI-D. La región de COMT y CCOMT en tándem, junto con el promotor PAL2 y el terminador de nos, fueron cortados con AatW, llenados con fragmento Klenow, digeridos con EcoRI, y finalmente ligados en pCAMBIA3300 cortado con S al/EcoRI, para dar construcciones de expresión binaria con OMTs en orientación sentido o antisentido. Estos fueron designados como pCAMC1CC1 (COMT en tándem, sentido, CCOMT sentido) y pCAMC2CC2 (COMT en tándem, antisentido, CCOMT antisentido). La introducción de transgenes de COMT y CCOMT en la misma planta, se logró también mediante cotransformación usando las construcciones de COMT y CCOMT individuales anteriores. Las construcciones fueron introducidas en la alfalfa mediante transformación de discos foliares mediada por Agrobacterium, seguido de regeneración a través de embriogénesis somática. Después de regeneración (Thomas, et al. 1990. Plant Science 69:189-198) y transferencia al invernadero, las plantas fueron analizadas primero para integración de transgenes de COMT y CCOMT mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los iniciadores usados fueron 5'-GGGTTCAACAGGTGAAACTC-3' y 5'-CCTTCTTAAGAAACTCCATGATG-3' para COMT, y 5'-GGCAACCAACGAAGATCAAAAGC-3' y 5'-CTTGATCCTACGGCAGATAGTGATTCC-3' para CCOMT, que dieron productos de amplificación de 1.1 kb o 0.75 kb de diagnóstico en transformantes de COMT o CCOMT, respectivamente. Aproximadamente 80% de las plantas que sobreviven a la selección, fueron PCR positivas. Muestras de entrenudos (sexto a noveno entrenudos) de tallos de transformantes putativos en la misma etapa de desarrollo, fueron cosechadas y puestas a prueba para actividad enzimática de COMT y CCOMT, como se muestra en la figura 2. Los entrenudos más jóvenes (primero a cuarto) fueron excluidos del tejido usado para el análisis enzimático, debido a que contenían una segunda forma de COMT que no es reconocida por el antisuero enfrentado ante la COMT de alfalfa dirigido mediante la presente estrategia transgénica (Inoue, et al. 2000. Arch Biochem Biophys 375:175-182). Tallos de alfalfa (entrenudos 6 a 9, contando desde la primera hoja totalmente abierta a la punta), fueron colectados y homogeneizados en nitrógeno líquido. El tejido pulverizado fue extraído durante 1 hora a 4°C en regulador de pH de extracción (Tris-HCl a 100 mM, pH 7.5, glicerol a 10%, DTT a 2 mM, MgCI2 a 0.2 mM, PMSF a 1 mM), y desalado el columnas PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo de unión a colorante de Bradford (Bio-Rad) con albúmina de suero de bovino (BSA) como estándar. Las actividades enzimáticas fueron puestas a prueba esencialmente como se describe en otros lados (Gowri, et al. 1991. Plant Physiol 97:7-14; Ni, et al. 1996. "Stress responses in alfalfa (Medicago sativa L.) XXI. Activation of caffeic acid 3-O-methyltransferase and caffeoyl CoA 3-O-methyltransferase genes does not contribute to changes in metabolite accumulation in elicitor-treated cell suspensión cultures", Plant Physiol 112:117-726), con las siguientes modificaciones: Las mezclas de prueba contenían 5 µl de [14CH3]-S-adenosil-L-Met (0.6 mM, 13 µCi/µmol), 5 µl de ácido cafeico (1 mM) o cafeoil CoA (1 mM), 30 µl de regulador de pH de prueba (Tris-HCl a 100 mM, pH 7.5, glicerol a 10%, DTT a 2 mM, MgCI2 a 0.2 mM) y 5 µl de extracto de protema. Fueron incubadas a 30°C durante 30 minutos, detenidas mediante la adición de 50 µl de HCl a 0.2 M (para COMT) o µl de NaOH a 3 M para CCOMT, incubadas a 37°C durante 10 minutos, y acidificadas entonces (para CCOMT) añadiendo 40 µl de HCl a 1 M. Se extrajo ácido ferúlico marcado en 200 µl de hexano: acetato de etilo (1 :1 , en v/v), y 150 µl de las fases orgánicas separadas fueron transferidos a recipientes de escintilación para determinación de radiactividad. Hubo una amplia variación (casi 4 veces) en la actividad de COMT en una población control de 20 plantas independientes transformadas con el vector pCAMBIA3300 vacío, como se muestra en la figura 2A. De veinte transformantes que contenían la secuencia sentido de COMT individual mostrada en la figura 2B, tres líneas (SC4, SC5 y SC52) tenían actividades de COMT fuertemente reducidas, mientras que el resto de la población exhibió, en promedio, un pequeño incremento en la actividad de COMT en comparación con el valor promedio para la población control. Se observó una situación similar con respecto a la actividad de COMT en los transformantes sentido dobles mostrados en la figura 2C, en donde una planta (DS14) mostró actividad de COMT fuertemente subregulada, y el resto de la población tuvo una actividad de COMT promedio ligeramente elevada en comparación con los controles. En la población antisentido de COMT mostrada en la figura 2D, una sola planta (AC310) mostró actividad de COMT fuertemente reducida, en donde el resto de la población general mostró una pequeña reducción promedio en comparación con el valor promedio para la población control. En las líneas antisentido dobles (figura 2E), una planta (DA302) mostró actividad de COMT fuertemente reducida. Hubo menos variación en la actividad de CCOMT que en la actividad de COMT en la población control, según se observa comparando las figuras 2A y 2F. De otra manera, el patrón de actividades de CCOMT en los transformantes que alojan construcciones de CCOMT sentido y antisentido, fue muy similar al observado para COMT. La actividad de CCOMT fue fuertemente subregulada en dos líneas sentido de CCOMT (SCC 19 y SCC 20) como se muestra en la figura 2G, en una línea sentido doble (DS 14) como se muestra en la figura 2H, en dos líneas antisentido (ACC305 y ACC315) como se muestra en la figura 21), y en una línea antisentido de COMT/CCOMT doble (DA302) como se muestra en la figura 2J. Se confirmó la inserción de transgenes en líneas de alfalfa subreguladas de COMT y CCOMT seleccionadas, mediante análisis Southern blot. Se aisló ADN total del tejido foliar de cada línea de alfalfa, usando un equipo de extracción de ADN de plantas nucleón phytopure (Amersham; Arlington Heights, IL). Muestras de ADN (7 µg) fueron digeridas con EcoRI, separadas electroforéticamente y transferidas a una membrana de nylon (Hybond-N, Amersham) mediante procedimientos estándar (Sambrook, et al. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a. ed., New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se sondearon blots con COMT de alfalfa de 1.1 kb marcada con ^P o sonda de secuencia de codificación de CCOMT de 0.75 kb, y fueron lavados bajo condiciones de alta severidad (lavado final de 0.1 x SSC, SDS a 0.1 %, 65°C). La sonda fue marcada con un equipo de marcación de 32P-dCTP (Amersham). Una comparación de los resultados para el control seleccionado y líneas transgénicas subreguladas de COMT y CCOMT, mostró patrones de integración de transgenes indicativos de inserdones de transgenes múltiples de COMT en transformantes independientes: SC4 (COMT individual, sentido), SC5 (COMT individual, sentido), DS14 (doble, sentido), DA302 (doble, antisentido) y AC310 (COMT individual, antisentido), todos mostrando 3 a 5 bandas únicas. Se obtuvieron patrones de integración de transgenes similares que muestran inserciones de transgenes múltiples de CCOMT en transformantes independientes: DA302 (doble, antisentido), ACC305 y ACC315 (CCOMT individual, antisentido) y DS14 (doble, sentido), todos mostrando de 1 a 5 bandas únicas. El análisis gel blot de ARN, confirmó que la actividad reducida de COMT y CCOMT en las diferentes líneas, resultó de una reducción severa en los niveles de transcritos de COMT y CCOMT. Se preparó ARN de hojas de alfalfa usando TRIREAGENT (Molecular Research Center, Inc.) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante. Muestras de ARN total (5-1 Oµg) fueron fraccionadas sobre un gel desnaturalizante de formaldehído de acuerdo con protocolos estándar (Sambrook, et al. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a. ed. New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press), transferidas a una membrana de nylon Hybond-N, e hibridadas con secuencias de ADNc de COMT y CCOMT de alfalfa de longitud completa marcadas radiactivamente a alta severidad, como para gel blots de ADN. Los transcritos de COMT fueron casi indetectables en la fracción de ARN total de líneas sentido SC4, SC5, línea antisentido AC310, la línea sentido doble DSH y la línea antisentido doble DA302. En forma similar, transcritos de CCOMT fueron virtualmente indetectables en líneas antisentido ACC305 y ACC315, y en la línea antisentido doble DA302. Sin embargo, los transcritos de CCOMT fueron relativamente no afectados en la línea sentido doble DS14, en la cual la actividad de CCOMT se reduce hasta aproximadamente 23% del tipo silvestre. Se hicieron comparaciones de los niveles de proteína COMT y CCOMT en las diferentes líneas transgénicas mediante análisis western blot. Se extrajeron proteínas crudas de los entrenudos sexto a noveno de transformantes individuales seleccionados y dos plantas de tipo silvestre, separadas sobre geles de SDS-poliacrilamida de gradiente de 8 a 12% y electrotransferidas sobre membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron incubadas en regulador de pH de bloqueo (PBS conteniendo Tween 20 a 0.05% y leche descremada a 5%) durante 2 horas, e incubadas entonces en regulador de pH de bloqueo con antisueros policlonales monoespecíficos enfrentados ante proteínas COMT y CCOMT de alfalfa recombinantes durante 2 horas (Kersey, et al. 1999. Protoplasma 209:46-57). Las señales fueron detectadas con reactivos de detección para Western blotting de ECL (Amersham), de acuerdo al protocolo del fabricante. Los resultados indicaron pérdida casi completa de proteína COMT en las líneas sentido SC4, SC5 y SC52, en la línea antisentido AC310, en la línea antisentido doble DA302, y en la línea sentido doble DS14. Los niveles de proteína CCOMT fueron casi indetectables en las líneas antisentido ACC305 y ACC315, y fueron fuertemente reducidos en la línea antisentido doble DA302 y la línea sentido doble DSM. La pérdida completa de proteína CCOMT en la línea antisentido de COMT ACC305, fue acompañada inesperadamente de un fuerte incremento en el nivel de proteína COMT, y en la actividad enzimática de COMT (cuadro I). Los resultados anteriores indican que la expresión de las secuencias de OMT del promotor PAL2 del frijol, da como resultado una subregulación mayor de COMT y CCOMT que la que se obtuvo en estudios previos (Ni, et al. 1994. Transgenic Res 3:120-126; Atanassova, et al. 1995. Plant J 8:465-477; Van Doorsselaere, et al. 1995. Plant J 8:855-864; Zhong, et al. 1998: Plant Cell 10:2033-2045). La reducción de la actividad enzimática que resulta de los niveles reducidos de transcritos en plantas que expresan construcciones de genes en orientación sentido, es característica del silenciamiento génico epigenético, el cual puede ocurrir a nivel de transcripción o de postranscripción (Vaucheret, et al. 1998. "Transgene-induced gene silencing in plants", Plant J 16:651-659). Para determinar las bases para las actividades reducidas de COMT y CCOMT en algunas de las líneas transgénicas sentido, se llevaron a cabo análisis continuos de transcripción nuclear con transcritos concluidos in vitro a partir de núcleos aislados de líneas sentido SC4 y SCC19 de tipo silvestre y suprimidas en CCOMT o suprimidas en COMT. Se aislaron núcleos de tejido foliar fresco como es descrito por Cox y Goldberg (Cox, K. H. y Goldberg, R. B. 1988. "Analysis of plant gene expression", Plant Molecular Biology. A Practical Approach. C. H. Shaw, ed., Oxford, IRL Press, pp. 1-35). Las mezclas de reacción y transcripción continuas contenían 125 µl de núcleos, 30 µl de (NH4)2S0 a 1 M, 12 µl de MgCI2 a 100 mM, 3 µl de fosfocreatina a 100 µM, 12 µl de creatina fosfato cinasa (0.25 mg/ml), 15 µl de RNasin (Promega; Madison, Wl), 30 µl de CTP a 5 mM, GTP y mezcla de ATP, 48 µl de agua y 25 µl de 32P-UTP (NEN, 10 µCi/µl). La mezcla de reacción fue incubada a 30°C durante 30 minutos, y tratada entonces con desoxirribonucleasa libre de ribonucleasa (30 unidades, Promega) y proteinasa K (500 µg, GibcoBRL) a 30°C durante 20 minutos. Los transcritos de ARN fueron extraídos con un volumen igual de fenol-cloroformo (1 :1 ), y extraídos de nuevo con un volumen igual de cloroformo. Los nucleótidos no incorporados fueron removidos mediante filtración a través de Sephadex G-50 (Amersham). La radiactividad incorporada en el ARN sintetizado, fue medida entonces mediante hibridación slot blot. Doscientos nanogramos de moléculas de ADNc de COMT, CCOMT o ß-ATPasa (control positivo), fueron desnaturalizados y transferidos a una membrana de nitrocelulosa mediante entrelazamiento con luz UV, e hibridados con sonda de ARN marcada radiactivamente. La hibridación y los lavados se llevaron a cabo a 65°C de acuerdo con Church y Gilbert (Church, G. H. y Gilbert, W. 1984. "Genomic sequencing", Proc Natl Acad Sci USA 81 :65-71). Las autorradiografías fueron cuantificadas usando un formador de imágenes de Molecular Dynamics. Los resultados indicaron que las velocidades de transcripción de COMT y CCOMT fueron esencialmente iguales en líneas de tipo silvestre y subreguladas. Sin embargo, los datos del análisis gel blot de ARN mencionado anteriormente, indicaron que los niveles de transcritos en estado estable en las líneas de COMT y CCOMT sentido, eran apenas una fracción de los niveles control, consistentes con el silenciamiento génico de postranscripción, que es responsable de la expresión reducida de COMT y CCOMT en las líneas de transgenes sentido. El cuadro I resume la actividad de COMT y CCOMT, contenido de lignina y composición de lignina de líneas de alfalfa transgénicas seleccionadas que alojan secuencias de COMT y CCOMT alfa en orientaciones sentido y antisentido. Los niveles de lignina con bromuro de acetilo (AcBr) y lignina de Klason, se expresan como % de materia seca. Los niveles de S, G y 50HG se expresan como mmoles/g de peso seco. La subregulación de COMT no tuvo efecto alguno sobre la actividad de CCOMT, y viceversa, con una excepción notable. La reducción de CCOMT a menos de 4% de la actividad de tipo silvestre en la línea ACC305, estuvo asociada con una duplicación aproximada de la actividad de COMT, en comparación con los niveles de tipo silvestre, un hallazgo consistente con los datos del western blot indicados anteriormente.

CUADRO I Actividad de COMT v CCOMT de líneas de alfalfa transqénicas independientes seleccionadas 2 6.55 23.77 17.79 17.91 152.8 325.2 0 0.47 48 8.19 21.13 17.52 17.64 156.2 279.4 0 0.56 SC4 1.06 20.11 16.48 12.67 10.4 227.9 7.4 0.05 SC5 1.24 22.26 16.35 12.46 8.6 246.1 8.8 0.04 SC52 1.19 22.36 16.83 14.15 17.1 223.7 1.8 0.07 AC310 0.31 22.17 16.97 15.30 0 248.2 0 0 ACC305 14.39 0.78 16.36 14.58 159.1 150.2 0 1.05 ACC315 8.06 10.7 15.31 15.50 164.0 243.6 0 0.69 DS14 0.78 5.59 16.54 14.72 54.0 223.7 0 0.23 DA302 0.81 1.15 16.78 15.06 14.0 303.0 0 0.05 El contenido de lignina en las varias líneas, se determinó de acuerdo con procedimientos estándar para lignina soluble en bromuro de acetilo y de Klason (Lin, S. Y. y Dence, O W. eds., Methods in Lignin Chemistry, Springer Series in Wood Science, Springer-Verlag, Berlín, Heidelberg, 1992). Se usaron 200 mg de muestra seca para análisis de lignina, y se calculó el contenido de lignina de Klason como por ciento en peso de la muestra libre de extracto. Los niveles de lignina de Klason de tres líneas control independientes, promediaron 17.6% de materia seca; este valor fue reducido a entre 15.3% y 12.5% en todas las líneas con actividad de COMT y CCOMT subregulada. Las reducciones más grandes en la lignina de Klason (reducidas hasta 70% del valor del tipo silvestre), se observaron en líneas con COMT con silenciamiento génico. Sin embargo, la lignina de Klason fue reducida también en la línea ACC305, la cual tiene apenas 3.6% de la actividad de CCOMT de tipo silvestre, pero casi el doble de la actividad de COMT de tipo silvestre, y en la línea AC315, con menos de 5% de actividad de CCOMT de tipo silvestre, pero actividad de COMT normal. De esta forma, las reducciones en las actividades de COMT o CCOMT pueden reducir independientemente los niveles de lignina de Klason en la alfalfa. En contraste con los efectos sobre la lignina de Klason, la subregulación de ningún OMT pareció tener un efecto importante sobre la lignina extraíble con bromuro de acetilo. Se llevó a cabo un análisis cualitativo y semicuantitativo de la lignina en las líneas de alfalfa transgénicas, usando métodos de tinción histoquímica. Se llevó a cabo de la manera siguiente el análisis histoquímico de la lignina en secciones transversales del tallo (quinto entrenudo) de alfalfa control (tipo silvestre), línea de COMT antisentido AC310 y línea de CCOMT ACC305 antisentido. Para tinción con reactivo de Maule, secciones manuales de tallos de alfalfa, fueron sumergidas en solución de permanganato de potasio a 1% (en p/v) durante 5 minutos a temperatura ambiente, y lavadas entonces dos veces con ácido clorhídrico a 3% hasta que el color cambiara de negro o café oscuro a café claro. Se preparó reactivo de floroglucinol-HCI mezclando dos volúmenes de floroglucinol a 2% (en p/v) en etanol a 95% con un volumen de HCl concentrado. Se tomaron fotografías dentro de 30 minutos de la tinción. La tinción de secciones transversales de tallo con floroglucinol-HCI, indicó poca o ninguna reducción en la intensidad de tinción en COMT o CCOMT antisentido, en comparación con líneas control. La reducción en la tinción con floroglucinol, se considera con frecuencia como indicativa de una reducción en el contenido de lignina, aunque el reactivo parece ser más específico para grupos de extremo de coniferaldehído en la lignina (Lewis, N. G. y Yamamoto, E. 1990. "Lignin: occurrence, biogénesis and biodegradation", Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 41 :455-496). En contraste, la tinción con reactivo de Maule dio una coloración roja en plantas de tipo silvestre, la cual se perdió en líneas subreguladas de COMT. Se reporta que dicho cambio de color es diagnóstico de reducción de lignina S (Lewis, N. G. y Yamamoto, E. 1990. Plant Physiol Plant Mol Biol 41 :455-496). El análisis de productos de degradación de lignina mediante cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) después de tioacidólisis, es un método que se usa ampliamente para el análisis de la composición de monómeros de lignina (Lapierre, et al. 1985. "Thioacidolysis of lignin: Comparison with acidolysis", J Wood Chem Technol 5:277-292), y se puede extender para analizar patrones de enlaces de dímeros. Se usaron por lo tanto tioacidólisis y el método de desulfuración con níquel de Raney de Lapierre et al. (Lapierre, et al. 1995. "New insight into the molecular architecture of hardwood lignins by chemical degradative method", Res Chem Intermed 21 :397-412), para determinar la composición de lignina y los enlaces interunidades resistentes en líneas de alfalfa transgénicas seleccionadas. Los datos de dichos análisis mostrados en la figura 3 y el cuadro I, indican que la reducción en los niveles de lignina en plantas con actividad de COMT subregulada, está asociada con una disminución mucho mayor en unidades S que en unidades G, produciendo una gran disminución en la relación de S/G, consistente con los resultados de la tinción histoquímica con reactivo de Maule. En efecto, los productos de tioacidólisis de lignina S, no fueron detectados en lo absoluto en la línea antisentido de COMT AC310. En contraste, no hubo reducción alguna de lignina S en líneas con actividad de CCOMT reducida, a menos que hubiera una diminución correspondiente en la actividad de COMT, como en las líneas sentido y antisentido dobles. Sin embargo, los niveles de lignina G fueron reducidos más fuertemente en la línea transgénica ACC305, la línea con la mayor disminución en la actividad de CCOMT. En general, los datos indican claramente que la subregulación de COMT impacta a la lignina S y G, con mayores efectos sobre la lignina S, mientras que la subregulación de CCOMT sólo afecta a la lignina G en la alfalfa. La reducción de la actividad de CCOMT a menos de 5% de la actividad del tipo silvestre, conduce a reducciones en la lignina G sin efecto aparente alguno sobre la lignina S en la alfalfa. Esto contrasta con las reducciones reportadas en la lignina G y S en tabaco transgénico subregulado en la expresión de CCOMT (Zhong, et al. 1998. Plant Cell 10:2033-2045). Por lo tanto, parecería que CCOMT funciona en la biosíntesis de lignina G en la alfalfa, como se ha propuesto previamente en el tabaco (Ye, et al. 1994. Plant Cell 6:1427-1439; Zhong, et al. 1998. Plant Cell 10:2033-2045), pero no en la biosíntesis de lignina S, contrario al modelo de Li, et al. basado en estudios in vitro de carácter específico por la enzima (Li, et al. 2000. J Biol Chem 275:6537-6545). El análisis de trazos en cromatogramas de gases a partir de las reacciones de tioacidólisis, reveló nuevos picos en los productos de reacción a partir de lignina extraída de plantas subreguladas en COMT, como se muestra en la figura 3. Se determinó que estos picos se originan de porciones de 5-hidroxiguayacilo que se podría esperar estarían presentes si la biosíntesis de lignina S estuviera siendo bloqueada principalmente en la segunda etapa de metilación en plantas subreguladas en COMT. Sin embargo, los niveles de unidades de 5-hidroxiguayacilo siempre fueron mucho menores que la reducción correspondiente en las unidades S, como se muestra en el cuadro I. En el polímero de lignina intacto, las diferentes unidades monoméricas están enlazadas entre sí a través de uniones covalentes en un número de diferentes posiciones. Esto da lugar a más de cinco tipos principales de dímeros de lignina que pueden ser analizados mediante GC/MS después de tioacidólisis y desulfuración con níquel de Raney, como se ilustra mediante las cinco estructuras en el cuadro II. Los enlaces 5-5 y 4-0 ocurren sólo entre las unidades G, mientras que los enlaces ß-ß ocurren sólo entre las unidades S. Los enlaces ß-1, ß-5 y ß-6 pueden ocurrir entre dos unidades G o entre una unidad G y una unidad S. De esta manera, los cinco tipos de enlace básicos pueden dar como resultado nueve dímeros de lignina diferentes. Los niveles de estos dímeros fueron analizados mediante GC/MS, a partir de la serie de plantas de alfalfa control y subreguladas en COMT o CCOMT analizadas previamente para composición de monómeros y contenidos de lignina. El cuadro II ¡lustra los patrones de unión de dímeros de muestras de lignina de plantas de alfalfa de tipo silvestre, suprimidas en COMT y suprimidas en CCOM, después de determinación de la composición de dímeros mediante tioacidólisis seguida de desulfuración con níquel de Raney. Las unidades están en mmoles/g de peso seco. Los niveles de lignina de Klason y las relaciones de S/G de las diferentes líneas, se dan en el cuadro I. Se muestran las estructuras químicas de una selección de los enlaces de dímeros recuperados de la lignina después de tioacidólisis y desulfuración con níquel de Raney. Los resultados en el cuadro II indican que la reducción de la actividad de COMT produjo cuando mucho un pequeño incremento en la recuperación de dímeros que consisten de dos unidades G (5-5, 4-0-5, ß-1 (G), ß-5 (G) y ß-6 (G)). Sin embargo, hubo una pérdida total de dímeros recuperados con enlaces ß-ß o ß-1 o ß-6 mixtos, todos los cuales incluyen unidades S, en plantas con actividad de COMT reducida. En contraste, la reducción de la actividad de CCOMT no llevó a una reducción en dímeros que contienen unidades S. Más bien, la subregulación de CCOMT pareció llevar a una recuperación incrementada de dímeros de ß-5 (G), pero una reducción en dímeros de ß-6 (G). La lignina de la línea ACC305, tuvo la proporción más alta de unidades S ß-ß enlazadas.

CUADRO II Patrone s de unión de dímeros de muestras de lignina de alfalfa de tipo silvestre, suprimidas en COMT v suprimidas en CCOMT Línea 5-5.G 4-0-5.G b-1 ,G b-1 ,M b-5,G b-5,M b-b,S b-6,G b-6,S Es^t e 2 13 3.6 17.9 3.2 19.4 16.9 9.6 11 5 0 48 13.3 3.6 17.5 2.4 20.4 14 9.5 12.4 6.3 0 SC4 16.6 4.1 21.9 0 24.6 19 0 14.2 0 9.4 SC5 17.3 3.6 20.3 0 24.7 14 0 19.2 0 7.1 AC310 15.5 3.4 19.1 0 23.7 15 0 10.6 0 12.4 DA302 16.9 4 21.9 0 30.7 6.4 0 9 0 10.5 DSH 15 3.3 20.7 0 21.5 18.9 0 12.8 0 7.5 Ui ACC305 11.2 2.9 18.6 5.2 22.2 19.5 14.8 10.1 6.6 0 ACC315 14.8 3.6 23.5 5.7 30.1 10.3 4.5 6.2 3.1 0 Considerados en conjunto, los datos anteriores indican que la reducción en la relación de S/G causada por la subregulación de COMT, produce una proporción disminuida de enlaces que implican unidades S. Esto indica que el patrón de enlaces de lignina es determinado por la disponibilidad de monómeros. Sin embargo, hubo también cambios cualitativos en los dímeros de lignina que resultan de subregulación de OMT. De esta manera, los cromatogramas de gases de productos de tioacidólisis/desulfuración con níquel de Raney de lignina de cinco plantas independientes subreguladas en COMT, mostraron un pico principal a 52.9 minutos de tiempo de retención, el cual faltó de trazos correspondientes de plantas de tipo silvestre o subreguladas en CCOMT. El compuesto fue analizado mediante MS, y se mostró que tiene un ion molecular con una relación de masa/carga (m/z) de 504, idéntica a la del éster de ?-p-cumarato de una unidad S, un dímero identificado previamente en la lignina del maíz (Grabber, et al. 1996. "p-Coumaroylated syringyl units in maize lignin: implications for ß-ether cleavage by thioacidolysis", Phytochemistry 43:1189-1194). Sin embargo, el tiempo de retención del nuevo dímero y su patrón de fragmentación de MS, fueron similares, pero no idénticos a los de una muestra auténtica de éster de cumarato de unidad S. La aparición del nuevo dímero se correlacionó con la pérdida de dímeros S-enlazados de la lignina en plantas subreguladas en COMT (cuadro II). Con base en los análisis anteriores, se eligió a la línea SC5 como una línea severamente subregulada en COMT, en la cual la lignina S recuperable estaba virtualmente ausente, y la línea ACC305 se eligió como una línea severamente subregulada en CCOMT, en la cual la lignina G estaba reducida y la relación de S/G incrementada. La línea CK48 se eligió como control. Las líneas fueron propagadas en forma vegetativa, y plantas cultivadas en invernadero fueron cosechadas en la etapa de yema tardía, secadas a 48.8°C, molidas en polvo de 1 mm, y colocadas en bolsas de nylon previamente pesadas (aproximadamente 5 g por bolsa). Estas bolsas fueron colocadas en el rumen de novillos fistulados durante 12, 24, 36 ó 72 horas de digestión. En cada punto de tiempo, se analizaron muestras duplicadas para cada línea en tres diferentes novillos. Después de la digestión, las bolsas fueron extraídas del rumen, lavadas en una máquina de lavado comercial, y secadas en vacío en un secador por congelación. Se calculó la digestibilidad con base en el peso de la muestra antes y después de la digestión. Los resultados del cuadro lll muestran que la digestión total del forraje de las tres líneas, alcanzó un valor de aproximadamente 80% en 12 horas dentro del rumen. Sin embargo, no hubo digestión adicional de forraje del control y líneas subreguladas en COMT más allá de 24 horas en el rumen. En contraste, el forraje de la línea subregulada en CCOMT continuó siendo digerido hasta por lo menos 76 horas dentro del rumen, alcanzando un valor de aproximadamente 89% de digestibilidad. Se mostró que la subregulación de CCOMT mediante procedimientos antisentido o silenciamiento génico, es un método válido para mejorar la digestibilidad del forraje en la alfalfa, y quizá otras leguminosas forrajeras tales como los claveles y tréboles. La falta de eficacia de fuerte subregulación de COMT para mejorar en forma significativa la digestibilidad del forraje indica que, contrariamente a la opinión actual, reducir la lignina S no es una estrategia válida para mejorar la digestibilidad. Más bien, es la reducción en la lignina G, que puede dar como resultado un nivel reducido de condensación de lignina, la que tiene el impacto principal sobre la digestibilidad de la alfalfa.

CUADRO lll Digestibilidad in vivo de la alfalfa en novillos fistulados i ' -4 ?„ * . Tiempo en el ... „ Digestibilidad (%) _. .. Linea de plantas ^ Novillo 1 yNov¡||o 2 ^ Promedio CK48 12h 80.00 78.19 80.83 79.68 24h 83.04 82.95 83.87 83.29 36h 83.98 83.20 83.91 83.70 72h 84.15 82.34 82.02 82.83 SC5 12h 78.89 77.21 81.52 79.21 24h 84.39 84.82 85.75 84.99 36h 84.27 84.92 85.00 84.73 72h 85.12 85.00 84.35 84.82 ACC305 12h 80.91 77.97 81.91 80.26 24h 84.26 85.21 87.21 85.56 36h 86.22 86.86 87.21 86.76 72h 88.55 90.92 87.74 89.07 LISTADO DE SECUENCIAS <110> The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Dixon, Richard A. Guo, Dianjing <120> Método para modificar la composición de lignina e incrementar la digestibilidad de forrajes in vivo <130> 11137/05603 <150> US 60/192,086 <151 > 24-03-2000 <160> 4 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211 > 744 <212> ADN <213> Medicago sativa <220> <221 > CDS <222> (1)..(744) <300> <308> U20736 <309> 07-08-1998 <313> (36)..(779) <400> 1 atg gca acc aac gaa gat caá aag caá act gaa tet gga aga cat caá 48 Met Ala Thr Asn Glu Asp Gln Lys Gln Thr Glu Ser Gly Arg His Gln 1 5 10 15 gaa gtt ggt cae aag agt ctt tta caá agt gat gct ctt tac cag tat 96 Glu Val Gly His Lys Ser Leu Leu Gln Ser Asp Ala Leu Tyr Gln Tyr 20 25 30 att cta gag acc agt gtc ttc cea aga gaa cat gaa gcc atg aaa gag 144 lie Leu Glu Thr Ser Val Phe Pro Arg Glu His Glu Ala Met Lys Glu 35 40 45 ttg aga gag gtc acá gca aaa cae cea tgg aac ate atg acá acc tet 192 Leu Arg Glu Val Thr Ala Lys His Pro Trp Asn Me Met Thr Thr Ser 50 55 60 gca gat gaa gga caá ttt ttg age atg etc ctt aaa ctt ate aat gct 240 Ala Asp Glu Gly Gln Phe Leu Ser Met Leu Leu Lys Leu lie Asn Ala 65 70 75 80 aag aat acc atg gaa att ggt gtc tac act ggc tac tec etc ctt gcc 288 Lys Asn Thr Met Glu lie Gly Val Tyr Thr Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 85 90 95 act gcc cta gct att ect gaa gat gga aag att ttg gct atg gac att 336 Thr Ala Leu Ala lie Pro Glu Asp Gly Lys He Leu Ala Met Asp lie 100 105 110 aac aaa gaa aat tac gaa ttg ggt cta ect gta att aaa aaa gct ggt 384 Asn Lys Glu Asn Tyr Glu Leu Gly Leu Pro Val He Lys Lys Ala Gly 115 120 125 gtt gat cae aaa att gat ttc aga gaa ggt cea gct ctt cea gtt ctt 432 Val Asp His Lys He Asp Phe Arg Glu Gly Pro Ala Leu Pro Val Leu 130 135 140 gat gaa atg ate aaa gac gaa aag aat cat ggt age tac gat ttc att 480 Asp Glu Met He Lys Asp Glu Lys Asn His Gly Ser Tyr Asp Phe He 145 150 155 160 ttt gtg gat gct gac aaa gac aat tac etc aac tac cat aag agg tta 528 Phe Val Asp Ala Asp Lys Asp Asn Tyr Leu Asn Tyr His Lys Arg Leu 165 170 175 att gat ctt gtt aaa gtg gga ggt gtg ate ggg tac gac aac acc tta 576 lie Asp Leu Val Lys Val Gly Gly Val He Gly Tyr Asp Asn Thr Leu 180 185 190 tgg aat gga tet gtg gtt gca ccc ect gat gct cea ttg agg aag tat 624 Trp Asn Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Asp Ala Pro Leu Arg Lys Tyr 195 200 205 gtt agg tac tat aga gat ttt gtt ttg gag ctt aac aag gct ttg gct 672 Val Arg Tyr Tyr Arg Asp Phe Val Leu Glu Leu Asn Lys Ala Leu Ala 210 215 220 gtg gac ect agg att gaa ata tgt atg ctt ect gtt ggt gat gga ate 720 Val Asp Pro Arg He Glu He Cys Met Leu Pro Val Gly Asp Gly He 225 230 235 240 act ate tgc cgt agg ate aag taa 744 Thr He Cys Arg Arg He Lys 245 <210> 2 <211 > 247 <212> PRT <213> Medicago sativa <400> 2 Met Ala Thr Asn Glu Asp Gln Lys Gln Thr Glu Ser Gly Arg His Gln 1 5 10 15 Glu Val Gly His Lys Ser Leu Leu Gln Ser Asp Ala Leu Tyr Gln Tyr 20 25 30 lie Leu Glu Thr Ser Val Phe Pro Arg Glu His Glu Ala Met Lys Glu 35 40 45 Leu Arg Glu Val Thr Ala Lys His Pro Trp Asn He Met Thr Thr Ser 50 55 60 Ala Asp Glu Gly Gln Phe Leu Ser Met Leu Leu Lys Leu He Asn Ala 65 70 75 80 Lys Asn Thr Met Glu lie Gly Val Tyr Thr Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 85 90 95 Thr Ala Leu Ala He Pro Glu Asp Gly Lys He Leu Ala Met Asp He 100 105 110 Asn Lys Glu Asn Tyr Glu Leu Gly Leu Pro Val He Lys Lys Ala Gly 115 120 125 Val Asp His Lys He Asp Phe Arg Glu Gly Pro Ala Leu Pro Val Leu 130 135 140 Asp Glu Met He Lys Asp Glu Lys Asn His Gly Ser Tyr Asp Phe He 145 150 155 160 Phe Val Asp Ala Asp Lys Asp Asn Tyr Leu Asn Tyr His Lys Arg Leu 165 170 175 lie Asp Leu Val Lys Val Gly Gly Val He Gly Tyr Asp Asn Thr Leu 180 185 190 Trp Asn Gly Ser Val Val Ala Pro Pro Asp Ala Pro Leu Arg Lys Tyr 195 200 205 Val Arg Tyr Tyr Arg Asp Phe Val Leu Glu Leu Asn Lys Ala Leu Ala 210 215 220 Val Asp Pro Arg lie Glu He Cys Met Leu Pro Val Gly Asp Gly lie 225 230 235 240 Thr He Cys Arg Arg He Lys 245 <210> 3 <211 > 1098 <212> ADN <213> Medicago sativa <220> <221 > CDS <222> (1 )..(1098) <300> <308> M63853 <309> 10-02-1997 <313> (31)..(1128) <400> 3 atg ggt tea acá ggt gaa act caá ata acá cea acc cae ata tea gat 48 Met Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gln He Thr Pro Thr His He Ser Asp 1 5 10 15 gaa gaa gca aac etc ttc gcc atg caá cta gca agt gct tea gtt ctt 96 Glu Glu Ala Asn Leu Phe Ala Met Gln Leu Ala Ser Ala Ser Val Leu 20 25 30 Pro Met lie Leu Lys Ser Ala Leu Glu Leu Asp Leu Leu Glu He He 35 40 45 gct aaa gct gga ect ggt gct caá att tea ect att gaa att gct tet 192 Ala Lys Ala Gly Pro Gly Ala Gln He Ser Pro He Glu He Ala Ser 50 55 60 cag cta cea acá act aac ect gat gca cea gtt atg ttg gac cga atg 240 Gln Leu Pro Thr Thr Asn Pro Asp Ala Pro Val Met Leu Asp Arg Met 65 70 75 80 ttg cgt etc ttg gct tgt tac ata ate etc acá tgt tea gtt cgt act 288 Leu Arg Leu Leu Ala Cys Tyr He He Leu Thr Cys Ser Val Arg Thr 85 90 95 caá caá gat gga aag gtt cag aga ctt tat ggt ttg gct act gtt gct 336 Gln Gln Asp Gly Lys Val Gln Arg Leu Tyr Gly Leu Ala Thr Val Ala 100 105 110 aag tat ttg gtt aag aat gaa gat ggt gta tec att tet gct ctt aat 384 Lys Tyr Leu Val Lys Asn Glu Asp Gly Val Ser He Ser Ala Leu Asn 115 120 125 etc atg aat cag gat aaa gtg etc atg gaa age tgg tac cae cta aaa 432 Leu Met Asn Gln Asp Lys Val Leu Met Glu Ser Trp Tyr His Leu Lys 130 135 140 gat gca gtc ctt gat ggg ggc att cea ttc aac aag gct tat gga atg 480 Asp Ala Val Leu Asp Gly Gly He Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met 145 150 155 160 acá gcc ttt gaa tac cat gga acá gat cea agg ttt aac aag gtt ttc 528 Thr Ala Phe Glu Tyr His Gly Thr Asp Pro Arg Phe Asn Lys Val Phe 165 170 175 aac aag ggg atg tet gat cae tet acc ate acá atg aag aaa att ctt 576 Asn Lys Gly Met Ser Asp His Ser Thr He Thr Met Lys Lys He Leu 180 185 190 gag acc tac acá ggt ttt gaa ggc ctt aaa tet ctt gtt gat gta ggt 624 Glu Thr Tyr Thr Gly Phe Glu Gly Leu Lys Ser Leu Val Asp Val Gly 195 200 205 ccc atg att ttg aaa tea gct ctt gaa ctt gat etc tta gaa ate att 144ggt ggt act gga gct gta att aac acg att gtc tea aaa tat ccc act 672 Gly Gly Thr Gly Ala Val He Asn Thr He Val Ser Lys Tyr Pro Thr 210 215 220 ata aag ggt ata aat ttt gat tta ccc cat gtc att gaa gat gct cea 720 He Lys Gly He Asn Phe Asp Leu Pro His Val He Glu Asp Ala Pro 225 230 235 240 tet tat cea gga gtt gag cat gtt ggt gga gac atg ttt gtc agt att 768 Ser Tyr Pro Gly Val Glu His Val Gly Gly Asp Met Phe Val Ser He 245 250 255 cea aag gct gat gct gtt ttt atg aag tgg att tgt cat gac tgg agt 816 Pro Lys Ala Asp Ala Val Phe Met Lys Trp He Cys His Asp Trp Ser 260 265 270 gat gag cae tgc ttg aaa ttt ttg aag aac tgc tat gag gca ctg cea 864 Asp Glu His Cys Leu Lys Phe Leu Lys Asn Cys Tyr Glu Ala Leu Pro 275 280 285 gac aat gga aaa gtg att gtg gca gaa tgc ata ctt cea gtg gct cea 912 Asp Asn Gly Lys Val He Val Ala Glu Cys lie Leu Pro Val Ala Pro 290 295 300 gat tea age ctg gcc acá aaa ggt gtg gtt cae att gat gtg ate atg 960 Asp Ser Ser Leu Ala Thr Lys Gly Val Val His He Asp Val He Met 305 310 315 320 ttQ gct cat aat ect ggt ggg aaa gag aga acá caá aaa gag ttt gag 1008 Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Gln Lys Glu Phe Glu 325 330 335 gat ctt gcc aaa ggt gct gga ttc caá ggt ttc aaa gtc cat tgt aat 1056 Asp Leu Ala Lys Gly Ala Gly Phe Gln Gly Phe Lys Val His Cys Asn 340 345 350 gct ttc aac acá tac ate atg gag ttt ctt aag aag gtt taa 1098 Ala Phe Asn Thr Tyr He Met Glu Phe Leu Lys Lys Val 355 360 365 <210> 4 <211 > 365 <212> PRT <213> Medicago sativa <400> 4 Met Gly Ser Thr Gly Glu Thr Gln lie Thr Pro Thr His He Ser Asp 1 5 10 15 Glu Glu Ala Asn Leu Phe Ala Met Gln Leu Ala Ser Ala Ser Val Leu 20 25 30 Pro Met lie Leu Lys Ser Ala Leu Glu Leu Asp Leu Leu Glu He He 35 40 45 Ala Lys Ala Gly Pro Gly Ala Gln He Ser Pro He Glu He Ala Ser 50 55 60 Gln Leu Pro Thr Thr Asn Pro Asp Ala Pro Val Met Leu Asp Arg Met 65 70 75 80 Leu Arg Leu Leu Ala Cys Tyr lie He Leu Thr Cys Ser Val Arg Thr 85 90 95 Gln Gln Asp Gly Lys Val Gln Arg Leu Tyr Gly Leu Ala Thr Val Ala 100 105 110 Lys Tyr Leu Val Lys Asn Glu Asp Gly Val Ser lie Ser Ala Leu Asn 115 120 125 Leu Met Asn Gln Asp Lys Val Leu Met Glu Ser Trp Tyr His Leu Lys 130 135 140 Asp Ala Val Leu Asp Gly Gly He Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met 145 150 155 160 Thr Ala Phe Glu Tyr His Gly Thr Asp Pro Arg Phe Asn Lys Val Phe 165 170 175 Asn Lys Gly Met Ser Asp His Ser Thr lie Thr Met Lys Lys He Leu 180 185 190 Glu Thr Tyr Thr Gly Phe Glu Gly Leu Lys Ser Leu Val Asp Val Giy 195 200 205 Gly Gly Thr Gly Ala Val lie Asn Thr He Val Ser Lys Tyr Pro Thr 210 215 220 lie Lys Gly He Asn Phe Asp Leu Pro His Val He Glu Asp Ala Pro 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Gly Val Glu His Val Gly Gly Asp Met Phe Val Ser He 245 250 255 Pro Lys Ala Asp Ala Val Phe Met Lys Trp He Cys His Asp Trp Ser 260 265 270 Asp Glu His Cys Leu Lys Phe Leu Lys Asn Cys Tyr Glu Ala Leu Pro 275 280 285 Asp Asn Gly Lys Val He Val Ala Glu Cys lie Leu Pro Val Ala Pro 290 295 300 Asp Ser Ser Leu Ala Thr Lys Gly Val Val His He Asp Val He Met 305 310 315 320 Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Gln Lys Glu Phe Glu 325 330 335 sp Leu Ala Lys Gly Ala Gly Phe Gln Gly Phe Lys Val His Cys Asn 340 345 350

Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para mejorar la digestibilidad de una leguminosa forrajera, caracterizado porque comprende incorporar establemente en el genoma de dicha leguminosa forrajera, una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransf erasa o un fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde la expresión de dicha enzima o fragmento de la misma produce un cambio en la composición de lignina en dicha leguminosa forrajera y mejora la digestibilidad de la misma.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende transformar una célula con una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransf erasa de Medicago sativa o un fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación para formar una célula transgénica.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha leguminosa forrajera es cotransformada con por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa o fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicha construcción de ADN comprende en tándem por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima cafeoil CoA 3-O-metiltransferasa o un fragmento de la misma bajo el control de expresión de un primer promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, y por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa o un fragmento de la misma, bajo el control de expresión de un segundo promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde dichos primer y segundo promotores específicos de tejidos asociados con la lignificación, pueden ser iguales o diferentes.

5.- Un método para mejorar la digestibilidad de una leguminosa forrajera, caracterizado porque comprende incorporar establemente en el genoma de dicha leguminosa forrajera una construcción de ADN que comprende por lo menos un marco de lectura abierto que codifica para una enzima ácido cafeico 3-O-metiltransferasa o un fragmento de la misma bajo el control de expresión de un promotor específico de tejidos asociado con la lignificación, en donde la expresión de dicha enzima o fragmento de la misma produce un cambio en la composición de lignina en dicha leguminosa forrajera y mejora la digestibilidad de la misma.

6.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque el contenido de lignina de guayadlo es reducido.

7.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque el marco de lectura abierto está en una orientación sentido.

8.- El método de conformidad con las reivindicaciones 1 , 2, 3, 4 ó 5, caracterizado además porque el marco de lectura abierto está en una orientación antisentido.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor PAL2 del frijol.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho promotor es un promotor P>AL2 del frijol.

11.- Una planta transformada mediante el método de conformidad con la reivindicación 7.

12.- Una planta transformada mediante el método de conformidad con la reivindicación 8.

13.- Una planta transformada mediante el método de conformidad con la reivindicación 9.

14.- Una planta transformada mediante el método de conformidad con la reivindicación 10.