MXPA02007761A - Metodo para identificar y utilizar antagonistas del receptor a2b de adenosina para mediar la proliferacion celular en mamiferos. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a metodos para identificar los agonistas y los antagonistas del receptor A2B adenosina asi como los metodos para usar los antagonistas del receptor A2B adenosina para tratar las enfermedades de proliferacion celular mediada por el receptor adenosina A2B.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICAR Y UTILIZAR ANTAGONISTAS DEL RECEPTOR A,B DE ADENOSINA PARA MEDIAR LA PROLIFERACIÓN CELULAR EN MAMÍFEROS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a métodos para identificar los agonistas dei receptor A2B de la adenosina así como métodos para usar los antagonistas del receptor A2B para tratar las enfermedades de proliferación celular mediadas por el receptor A2B de la adenosina.

ARTE PREVIO La adenosina se libera mediante los tejidos hipóxicos y se cree que son un factor angiogénico que une el metabolismo celular alterado causado mediante la privación 02 para la angiogénesis compensatoria. La adenosina se une por cuatro subtipos de receptores acoplados con la proteína G llamados A^ A2A, A2B y A3. La adenosina del nucleósido se ha implicado en la angiogénesis. Específicamente, se ha demostrado que la activación de la adenosina del receptor A2B de adenosina (AdoR) incrementó la acumulación cAMP, la proliferación celular y la expresión VEGF en las células endoteliales retínales humanas (HREC). Se ha reportado previamente que la activación de A2B AdoR del factor de crecimiento celular endotelial vascular incrementado (VEGF) mARN y la expresión de la proteína en las células endoteliales retínales humanas (HREC). La adenosina también tiene un efecto sinergístíco con la proliferación celular endotelial retinal y la morfogénesis capilar in vitro.

Las anormalidades de la retina, tales como retinopatía o la condición prematura, la degeneración macular y la retinopatía diabética están entre las causas que conducen la ceguera no traumática. Estas enfermedades se caracterizan mediante la neovascularización que resulta del daño isquémico a los vasos retínales, es decir, angiogénesis compensatoria. Además una terapia posible para tratar estas enfermedades es inhibir la neovascularización.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En una modalidad, esta invención es un método para inhibir la proliferación de las células en mamíferos que expresan el receptor A2B adenosina que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista receptor A2B de la adenosina al mamífero.

En otra modalidad, esta invención es un método para probar compuestos para determinar sí ellos son antagonistas del receotor A^ adenosina o agonistas del receptor A2B adenosina. El método incluye preparar una primer y segunda muestra de las células endoteliales retínales humanas, agregando un compuesto para probarse a la primera muestra de las células endoteliales retínales humanas y permitiendo que el compuesto permanezca en contacto con la primera muestra de las células endoteliales retínales humanas para un periodo de tiempo definido y comparando el número de nuevas células creciendo en la primera muestra con el número de nuevas células creciendo en la segunda muestra.

En otra modalidad, esta invención incluye el agonista del receptor A2B adenosina o los compuestos antagonistas identificados mediante los métodos de esta invención.

DECRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 A es un trazo del curso de tiempo de la proliferación HREC inducida por ÑECA (10µmol/l). El efecto de la proliferación de ÑECA se bloquea completamente por los antagonistas A2B específicos 3-N-propilxantina (10 µmol/L) o JW-V1-08 (10µmol/L), en donde: A = Medio celular por pozo (x, 1 ,000) B = Tiempo de incubación (horas).

La Figura 1 B es un trazo de ÑECA inducida por el incremento dependiente de la concentración en la migración HREC comparada a las células no estimuladas (ME , medio esencial mínimo). Los valores para la proliferación inducida por ÑECA y la migración son significativamente diferentes (p<0.05, por ANOVA) de las células no estimuladas, en donde: C = Células por campo de alta energía D = [ÑECA] (µmol/L) y Las Figuras 2A, 2B, 2C y 2D son fotomicrográficas de la formación del tubo celular endotelial en Matrigel. Todas las mícrográficas se toman en 48 hr. Las células de control no estimadas (4A) muestran alguna formación del tubo por 48 hr. En la hora 48 el ÑECA soporta la formación extensiva del tubo (4B). Por contraste, los antagonistas A_3 selectivos JW-V1-08 en 10µmol/L (4C) y 3-N-propilxantina en 10 µmol/L (4D) ambos disminuyen la formación del tubo inducida por ÑECA. Todas las micrográficas son típicas de los resultados observados para las células desde tres donadores separados.

SUMARIO DE LAS ABREVIATURAS HREC- Células endoteliales retínales humanas AdoR- Receptor de adenosina NECA- 5'-N-etilcarboxamido-adenosina ADA- Adenosina deaminasa JW-V1-08- 3-¡sobutil-8-pirrolidinoxantina LDL- Lipoproteína de baja densidad SFM- Medio libre de suero VEGF- Factor de crecimiento endotelial vascular DESCRIPCIÓN DE LA MODALIDAD PREFERIDA La presente invención se refiere a métodos para identificar los antagonistas del receptor A2B adenosina. Esta invención también incluye antagonistas del receptor A2B adenosina identificada por los métodos de esta invención así como los métodos para inhibir la proliferación celular en los mamíferos usando los antagonistas del receptor A2B adenosina.

Un aspecto de esta invención son los métodos para analizar e identificar compuestos que son agonistas y antagonistas del receptor A^ adenosina. Los compuestos identificados por los métodos de esta invención pueden incluir compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos, oligonucleótidos, oligonucleótidos anti-sentido, ribozimas, proteínas, enzimas, anticuerpos y cualquier otro compuesto o composiciones que son responsables para la evaluación mediante los métodos de análisis de esta invención.

Un método para la evaluación de compuestos como antagonistas o agonistas del receptor A2B adenosina de esta invención es una prueba in vitro que mide la habilidad de un compuesto para promover o inhibir el crecimiento de las células endoteliales retínales humanas (HREC). La prueba se describe en detalle en el Ejemplo 1. Los compuestos se analizan usando la prueba mediante la comparación del crecimiento de las células endoteliales retínales humanas expuestas para el compuesto en cuestión para el crecimiento de las células endoteliales retínales en una solución estándar o en la presencia de un compuestos estándar. Los compuestos que estimulan el crecimiento de las células endoteliales retínales humanas en comparación con los agonistas del receptor A2B adenosina mientras que los compuestos que inhiben el crecimiento de las células endoteliales humanas en comparación al estándar son antagonistas del receptor A?B adenosina.

Una segunda prueba que es útil para identificar ios antagonistas y agonistas del receptor A2B adenosina está en una prueba de ratón in vivo. En el modelo de ratón, ratones de una semana de nacidos C57BL/6J se expusieron a 75% de oxígeno por cinco días y posteriormente al ambiente. Cinco días después regresando a las condiciones de oxígeno normales, los ratones desarrollaron mechas neovasculares en la retina cuantíficable. Los compuestos se evaluaron en el método de análisis mediante la administración del compuesto en la cuestión interperítonealmente (IP) para un ratón y posteriormente comparar la cantidad de las mechas neovasculares en los ojos del ratón tratado con la cantidad de mechas neovasculares en los ojos del ratón tratado con la cantidad de mechas neovasculares en los ojos de un ratón no tratado. Los compuestos que inhiben el crecimiento de las mechas neovasculares in vivo son los antagonistas del receptor A2B adenosina.

Otro aspecto importante de esta invención es el descubrimiento de que los antagonistas del receptor A2B adenosina son útiles en el tratamiento de las enfermedades de la proliferación celular en mamíferos. Dichas enfermedades incluyen, pero no se limitan a la proliferación celular endotelial vascular, el cáncer, la restenosis, el rechazo al injerto por el huésped, la gota, la inflamación en general y otras enfermedades proliferativas.

Se ha encontrado que los antagonistas del receptor A^ adenosina son particularmente útiles para inhibir el crecimiento de las células endoteliales vasculares que incluyen pero no se limitan a células endoteliales coronarias, células endoteliales del lecho vascular, células endoteliales tumorales, células endoteliales retinales, células endoteliales dérmicas y las subsecuentes. Un método preferido de esta invención incluye el tratamiento de las enfermedades asociadas con la proliferación de las células endoteliales retinales (neovascularización aberrante) tal como retinopatía diabética y retinopatía en la etapa prematura. Los antagonistas del receptor A B adenosina usados pueden ser un antagonista del receptor A2B adenosina no selectivo, pueden ser un antagonista del receptor A2B adenosina selectivo o pueden incluir una combinación de los antagonistas del receptor A2B adenosina.

Los métodos de esta invención para inhibir la proliferación celular y en particular inhibir la proliferación celular endotelial usando antagonistas del receptor A2B adenosina son aplicables a cualquier mamífero. Sin embargo, se prefiere que los métodos de esta invención se usen para tratar humanos. Los métodos de esta invención se realizando usando cantidades farmacéuticamente efectivas de uno o más compuestos que son antagonistas del receptor A2B adenosina. Dependiendo de su uso intentado, las composiciones pueden estar en la forma de dosis sólidas, semi-sólidas o líquidas, tal como, por ejemplo, tabletas, supositorios, pildoras, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, gases, gotas, pomadas o los similares. Una clase de formas de dosis preferidas son las formas de dosis sólidas, seml-sólidas o líquidas que se administran oralmente en las dosis precisas. Las composiciones pueden incluir uno o más excipientes farmacéuticos convencionales y al menos un compuesto activo de esta invención o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores, adyuvantes, díluyentes, etc.

Para las composiciones sólidas, el sólido no tóxico convencional incluye, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, carbonato de magnesio y pueden usarse los similares. El compuesto activo como se definió anteriormente puede formularse como supositorios usando, por ejemplo, polialquilenglicol, por ejemplo, propilenglicol, como el portador. Las composiciones líquidas farmacéuticamente admínistrable pueden, por ejemplo, prepararse mediante la disolución, dispersión, etc. un activo compuesto como se definió anteriormente y los adyuvantes farmacéuticos opcionales en un excipiente, tal como, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa acuosa, glicerol, etanol y los similares para de esta manera formar una solución o suspensión. Si se desea, la composición farmacéutica para administrarse también puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes de emulsificación o humectación, agentes de estabilización de pH y los similares, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitan, acetato de sodio trietanolamina, oleato de trietanolamina, etc. Los métodos actuales de preparación de dichas formas de dosis se conocen o serán aparentes para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, ver Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publíshíng Company, Easton, Pensilvania, 15ava. Edición, 1975. La composición o formulación a administrarse contendrán en cualquier caso, una cantidad del compuesto activo, una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, en una cantidad efectiva para aliviar los síntomas del sujeto que está siendo tratado. Para la administración oral, una composición farmacéuticamente aceptable no tóxica se forma mediante la incorporación de cualquier excipiente empleado normalmente, tal como, por ejemplo grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, magnesio, carbonato y los similares. Dichas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y los similares. Dichas composiciones pueden contener 10%-95% del ingrediente activo, de preferencia 1-70%.

La administración parenteral se caracteriza generalmente mediante la inyección ya sea subcutánea, intramuscular o intravenosamente. Las inyectables pueden prepararse en formas convencionales, ya sea en soluciones líquidas o suspensiones, las formas sólidas apropiadas para la solución o suspensión en líquido antes de la inyección o como emulsiones. Los excipientes apropiados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o los similares. Si se desea, las composiciones farmacéuticas a administrarse también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes emulslficantes o de humectación, agentes estabilizadores del pH y los similares, tales como por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc.

Cuando se usan para tratar las células endoteliales retínales, las composiciones de esta invención pueden incorporarse dentro de gotas oculares mediante, por ejemplo, combinar uno o más antagonistas del receptor A2B adenosina con una solución salina fisiológicamente compatible o gel que posteriormente se aplica directamente a los ojos en una base regular.

La cantidad del compuesto activo administrado, dependerá, por supuesto del sujeto que se ? está tratando, el peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la manera de administración y el juicio del médico que está prescribiendo. Sin embargo, una dosis efectiva está en el rango de aproximadamente 1 microgramo a aproximadamente 50 miligramos/kg/día. Más preferiblemente, una dosis efectiva oscilará desde aproximadamente 1 microgramo/kg/día. Dado que muchos efectos de los compuestos de esta invención se obtienen a través de dosis de mecanismo similar que están generalmente dentro de los mismos rangos preferidos y generales para todas estas utilidades.

Generalmente, los antagonistas del receptor A2B adenosina se administrarán en los métodos de esta invención en una cantidad terapéuticamente efectiva, es decir, una dosis suficiente para efectuar el tratamiento. La cantidad del compuesto activo administrado, dependerá, por supuesto del sujeto tratado, el peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la ruta de administración y el juicio del médico que prescribe. Además, la frecuenta de la dosis dependerá del método de administración, la aflicción que se está tratando y el grado de aflicción que se está tratando. Por ejemplo, las gotas oculares incluyen un antagonista del receptor A2B adenosina que pueden administrarse en un programa regular de una a 6 veces por un día o incluso más frecuentemente cuando se tratan las células endoteliales retinales.

La administración de los antagonistas del receptor A2B adenosina a los mamíferos para tratar las enfermedades de proliferación celular no se limita a aquellos métodos descritos anteriormente que incluyen ampliamente cualquier método conocido en la técnica para administrar los compuestos farmacéuticamente activos y ios agentes terapéuticos a los mamíferos.

Está dentro del alcance de esta invención administrar uno o más compuestos de esta invención a un mamífero y de preferencia a un humano, medíante otras rutas conocidas de administración de forma de dosis farmacéutica que incluyen, pero no se limitan a, mediante bolo, intravenosa, transdérmica, a través de inhalación, sub-cutánea, oral, parenteral, nasalmente, en gotas oculares, mediante usar micro-bombas o medíante cualquier otro método de administración del agente terapéutico o ruta conocida por aquellos expertos en la técnica.

EJEMPLO 1 En el presente ejemplo, se evaluó el rol del receptor A^ mediante examinar los efectos de los antagonistas A^ AdoR selectivos en la proliferación HREC mediada por AdoR, la formación del tubo capilar y las rutas de transducción de señales.

Resumen del Método: Las HREC se expusieron al análogo de la adenosina 5'-N-etilcarboxamido-adenosína (ÑECA) en la ausencia o presencia de los antagonistas AdoR. La migración se midió usando cámaras Boyden. La proliferación se examinó mediante conteo. El efecto de la activación AdoR en la formación del tubo se estudio usando el crecimiento de las células en Matrigel.

Materiales y Método Cultivo Celular Los cultivos primarios de HREC se prepararon y se mantuvieron como se describió previamente y las células en el pasaje 3-6 se usaron para éstos estudios. La identidad de las células endoteliales en los cultivos se validó mediante demostrar la incorporación celular endotelial de LDL acetilado fluorescentemente marcado y mediante el análisis citométrico de flujo como se describió previamente. Para mantener la pureza de HREC, se tomaron varias etapas precautorias. Las HREC se cultivaron en suero derivado de plasma, que esta libre del factor de crecimiento derivado de plaquetas y no promueve el crecimiento de pericítos (la contaminación del tipo celular en estas preparaciones). Además, los cultivos de HREC se expusieron a tripsina por solo 45 segundos antes del pasaje. Las células endoteliales flotan durante este tratamiento corto de tripsina mientras que los pericitos permanecen unidos al sustrato.

Prueba de Proliferación Las HREC se sembraron en 10 células/cm en placas de 24 pozos y se permitió que se adhirieran durante la noche. Las células se lavaron en solución de sal balanceada de Hank y el medio se reemplazó con suero y medio libre de suplemento de crecimiento (SFM) por 24 horas para inducir el paro del ciclo celular. Las células se lavaron de nuevo y se pre-trataron con 1 U/ml de deaminasa adenosina (ADA) por 30 min. Las celdas fueron las expuestas a ÑECA (10 µmol/L) con o sin 3-N-propilxantina (10 µmol/L), que inhiben grandemente la selectividad para el receptor A^ que otros antagonistas disponibles. Los controles HREC se expusieron a SFM o medio de crecimiento normal. Para los siguientes tres días en intervalos de 24 horas los replicados de los pozos se trataron con tripsina y las células se colectaron y se contaron usando un Contador Coulter. Cada condición se examinó por triplicado en tres experimentos separados usando células de diferentes colores para cada experimento.

Quemotaxis La Quemotaxis celular endotelial se midió en las cámaras de quemotaxis de pozo falso (Nueroprobe, Inc., Bethesda, MD) como se describió previamente. Brevemente, una suspensión celular individual de células endoteliales (3.0 x 10 células/pozo) se prepararon y trataron con ADA (1U/ml). Treinta mililitros de esta suspensión se colocan en cada uno de los 48 pozos inferiores del aparato de pozos falsos. Los pozos se cubrieron con una membrana porosa de polivinilo (poro de 5 µm de diámetro) - y pollcarbonato libre de pirrolidona (Nucleopore, Pleasanton, CA), cubierta con 0.1% de colágeno dérmico. Se les permitió a las celdas unirse a la membrana mediante invertir la cámara por 2 h. Las cámaras posteriormente se colocaron derechas y se expusieron solo a ÑECA (10 µmol/L), las ÑECA se combinaron con 3-N-propilxantina (10 µmol/L), JW-V1-08 (10 µmol/L) u otro congénere de amina xantina del antagonista AdoR no selectivo (XAC, 10 µmol/L) en un volumen de 50 µl. Después de la incubación por 12 h, la membrana se recubre y se desecha libre de células en el costado unido. Las células restantes, aquellas que se han emigrado a través de los poros, se fijan en metanol, se marcan con marcador de Wright modificado y posteriormente se marcan por contador con hematoxilina y eosina. El control positivo fue 10% de suero fetal de bovino y el control negativo fue 1% de albúmina. La quemoquinesis, el incremento no orientado en la migración celular en respuesta a un estímulo, se midió mediante agregar igual concentración de ÑECA o ÑECA más uno de los antagonistas en ambas cámaras superiores e inferiores. Las condiciones de tratamiento se examinaron por triplicado en tres experimentos separados.

Prueba Matrigel La formación del tubo endotelial se examinó en Matrigel. Brevemente, el Matrigel se descongeló y se conservó a 4o c. Las placas multi-pozos y las extremidades en pipeta se enfriaron a -20°C y se agregó Matrigel 125 µl) a cada pozo de una placa de 48 pozos y se permitió que se endureciera por un mínimo de 1h a 37° C. Las HREC se disociaron enzimáticamente (2 min a 37° C en 0.25% de Tripsina-EDTA), se centrifugaron (300 xg, 5 min) y se resuspendieron en medio libre de suero. Los agentes de prueba (100 µl) se prepararon a 2X de la concentración final y 100 µl se agregaron a los pozos. Las HREC (3 x 10 en 100 µl por pozo) posteriormente se agregaron y las placas se incubaron a 37° C. Los pozos se fotografiaron 48h después de colocarlas en placas. Campos idénticos en cada pozo se fotografiaron para minimizar la variación posible debido a la densidad celular variable causada por el establecimiento de células. Las fotografías se dígitalizaron y se usó el software de análisis de imagen (Scion Image) para medir la longitud del tubo total en un área comparable, pre-definida de cada pozo. Todas las condiciones se probaron en pozos duplicados en tres experimentos separados usando células de diferentes donadores.

Resultados Proliferación Celular en Respuesta a ÑECA y los Antagonistas AdoR Los ÑECA (10 µmol/L) se indujeron un incremento tiempo-dependiente en la proliferación HREC como se midió mediante el conteo celular, logrando aproximadamente 80% de la densidad de las células expuestas al medio de crecimiento normal por 3 días. Ambos antagonistas AdoR A2B selectivos probados, 3N-propilxantina a 10 µmol/L y JW-V1-08 a 10 µmol/L, bloquean completamente el efecto proliferador de ÑECA (Figura 1 A).

Efecto de ÑECA y los Antagonistas AdoR en la Migración HREC Los ÑECA estimulados por la quemotaxis HREC cuando se midieron en la prueba de cámara Boyden. La migración incrementada ÑECA en una manera dependiente de la concentración. La adición simultánea de ÑECA y el antagonista AdoR selectivo XAC abolió la migración estimulada con ÑECA de HREC. De igual modo, la co-adición de ÑECA con los antagonistas A2B selectivos JW-V1-08 o 3-N-propilxantina también antagoniza el efecto estimulatorio de ÑECA en la quemotaxis (Figura 1B). Ya sea ÑECA solas o ÑECA en combinación con los antagonistas AdoR indujeron la quemoquinesis.

Efecto de ÑECA en la formación del tubo celular endotelial La Figura 4 muestra fotomicrográficas representativas de la formación del tubo celular endotelial en Matrigel en la ausencia o la presencia de ÑECA solas o en combinación con los antagonistas AdoR. Alguna formación del tubo fue evidente después de 48 h con las células de control no estimuladas (Figura 2A). El tratamiento con ÑECA (10 µmol/L) soportó la formación del tubo extensivo (Figura 2B) que se inhibió 2 por JW-v1-08 (Figura 2C). En las 48 hrs 3-N-propilxantína (Figura 2D) inhibió la formación del tubo, resultando en pocos tubos de longitud menor.

Se midió la longitud total del tubo en fotografías digitalizadas como longitud en píxeles. ECA incrementó la longitud del tubo a más de 2 veces más que las células no tratadas (74.2 ±2.4 en contra 35.7±1.6, respectivamente, p< 0.01). La adición de 3-N-propilxantina o JW-V1-08 disminuyó, pero no negó completamente, la longitud el tubo inducido por ÑECA (53.7 ± 0.9 y 66 ± 1.2, respectivamente, ambos p < 0.01).

Resumen: La proliferación inducida por ÑECA en una manera dependiente de la concentración que se inhibió por los antagonistas A2B AdoR selectivos 3-N-propilxantina y JW-V1-08. La ÑECA estimuló la quemotaxis en una manera dependiente de la concentración. Ambos antagonistas bloquearon el efecto de ÑECA en la migración. La ÑECA mejoró la formación del tubo en Matrigel mientras que ambos antagonistas A2B selectivos atenuaron este efecto.

Los anteriores resultados muestran que los antagonistas A^ AdoR selectivos inhiben la proliferación ECA estimulada, la migración y la formación del tubo capilar. La inhibición A2B AdoR ofrece un medio para inhibir la angiogénesis y en particular la angiogénesis retinal y proporciona un avance terapéutico novedoso para tratar las enfermedades asociadas con la neovascularización aberrante tal como la retlnopatía diabética y la retinopatía en la etapa prematura.

Los resultados del Ejemplo 1 también muestran que el análogo adenosina ÑECA estimulan las etapas clave relevantes para la angiogénesis. ÑECA estimuló la migración celular (como se examinó por la prueba de cámara Boyden) y la formación del tubo capilar (como se examinó por la prueba Matrigel)- ÑECA también estimuló las cascadas de señalización asociadas con la proliferación y la supervivencia celular. Los antagonistas A2B selectivos se usan para atenuar o abolir estos efectos. Estos hallazgos sugieren que los antagonistas A2B AdoR adenosina selectivos pueden atenuar la proliferación celular endotelial que conduce a la angiogénesis aberrante observada en la retinopatía diabética. Consecuentemente, los antagonistas A2B AdoR representan un avance terapéutico novedoso para modular las respuestas neovasculares retinales aberrantes.

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina útil para la inhibición de la proliferación de las células en mamíferos que expresa el receptor A2B adenosína.

2. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde las células que expresa el receptor A2B adenosina son células endoteliales vasculares.

3. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 2, en donde las células endotelíales vasculares que expresa el receptor A2B adenosina se seleccionan del grupo que consiste de células endoteliales coronarias, células endoteliales del lecho vascular.

4. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 3, en donde las células endoteliales del lecho vascular se seleccionan del grupo que consiste de células endoteliales tumorales, células endoteliales retinales, células endoteliales dérmicas y células endoteliales cerebrales.

5. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde las células endoteliales son células endoteliales retinales.

6. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antagonista del receptor A2B adenosina inhibe la expresión del factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF).

7. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antagonista del receptor A2B adenosina es un oligonucleótido antisentido del receptor A2B adenosina.

8. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antagonista del receptor A2B adenosina es un ribozoma A2B específico.

9. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antagonista del receptor A^ adenosina es un antagonista del receptor adenosina no selectivo.

10. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antagonista del receptor A2B adenosina es un antagonista del receptor A;_, adenosina selectivo.

11. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antagonista del receptor A2B adenosina se administra en una cantidad oscilando desde aproximadamente 1 microgramo/kg hasta aproximadamente 50 miligramos/kg.

12. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antagonista del receptor A2B adenosina se administra en una cantidad que oscila desde aproximadamente 1 microgramo/kg a aproximadamente 10 miligramos/kg.

13. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el antagonista del receptor A2B adenosina se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste de oral, nasal, transdérmico, mediante bolo, intravenosamente, en gotas oculares, mediante inhalación y mediante el uso de micro-bombas.

14. El uso de un antagonista del receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el agonista del receptor A2B adenosina se administra en gotas oculares.

15. El uso de un antagonista de¡ receptor A2B adenosina de conformidad con la reivindicación 1 , en donde el mamífero es un humano.

16. Un método para examinar compuestos para determinar si son antagonistas del receptor A?B adenosina o agonistas del receptor A2B adenosina, que comprende las etapas de: a. preparar una primera y segunda muestra de las células endoteliales retinales humanas; b. agregar un compuesto para probarse con la primera muestra de las células endoteliales retinales humanas y permitir que el compuesto permanezca en contacto con la primera muestra de las células endoteliales retinales humanas por un periodo de tiempo definido y c. comparar el número de las nuevas células que crecen en la primera muestra con el número de las nuevas células que crecen en la segunda muestra.

17. Un compuesto antagonista del receptor A2B adenosina identificado por el método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el compuesto origina menos crecimiento de células nuevas en la primera muestra en comparación con la segunda muestra.

18. Un compuesto agonista del receptor A2B adenosina identificado mediante el método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el compuesto origina más crecimiento de nuevas células en la primera muestra en comparación con la segunda muestra.