MXPA02005514A - Inmunoensayo para insecticidas de neonicotinilo. - Google Patents

Abstract

(ver formula) La presente invencion proporciona inmunogenos para generar anticuerpos anti-neonicotinoide asi como anticuerpos, metodos, reactivos y equipos para determinar la presencia de uno o mas insecticidas y neonicotinoides en una muestra por inmunoensayo. La presente invencion tiene aplicacion particular en la determinacion de la concentracion de insecticidas neonicotinoides aplicados a materiales para la propagacion de plantas tales como semillas, el anticuerpo selectivo para un compuesto de formula (I), donde A es 2- cloropirid-5-ilo o 2-clorotiazol-5-ilo; R y R3 son independientemente hidrogeno o alquilo de C1-C4; R1 y R2 son independientemente hidrogeno o alquilo de C1-C4 o Rl y R2 son tomados juntos con los atomos de nitrogeno los cuales estan unidos forman un anillo de imidazolina o una oxadiacina; y X es N-NO2 o N-CN. Tambien se reclama un compuesto de formula (IA) y un conjugado proteico de formula (II) en el cual PR es un residuo de proteina de una molecula portadora seleccionada del grupo que consiste de un derivado de proteina purificada (PPD, tuberculina) de virus de Diptheria, seroalbumina bobina, seroalbumina bobina cationizada, seroalbumina humana, ovoalbumina y hemocianina de lapa de bocallave; o un residuo de enzima seleccionado del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano y ?-galactosidasa.

Description

Descripción de la Invención Esta invención se relaciona con inmunoensayos para plaguicidas y con anticuerpos y reactivos para llevar a cabo tales ensayos. La invención se relaciona además con métodos para llevar a cabo tales ensayos y con equipos que comprende reactivos para practicar tales métodos . La invención tiene aplicación particular a la detección y cuantificación de insecticidas neonicotinoides en una muestra.

Insecticidas El uso de insecticidas sintéticos para controlar plagas de insectos en cultivos es una práctica universal . Esta práctica ha ganado un alto grado de éxito comercial debido a que ha demostrado que tal control puede incrementar el rendimiento de un cultivo. Sin embargo, el uso efectivo de insecticidas requiere un manejo prudente en vista de la resistencia de los compuestos y preocupaciones ambientales y de exposición de los trabajadores. Una solución aplicada a este problema ha sido la provisión de insecticidas novedosos, más altamente activos para reducir la necesidad de insecticidas agudamente tóxicos más viejos y para reducir los porcentajes de carga ambiental. Una nueva clase de 'insecticidas que está ganando un reconocimiento significativo en el mercado son los llamados PEF: 139438 insecticidas "neonicotinoides". Los compuestos de esta clase incluyen, por ejemplo, los compuestos imidacloprid, acetamiprid y tiametoxam que son descritos en las patentes Estadounidense nos. 4742060 y 5304566 y EP580553A2, respectivamente. El tratamiento directo de materiales de propagación de plantas (tales como semillas) con insecticidas son las aplicaciones objetivo que dirigen la necesidad de una reducción de la exposicón ambiental y de los trabajadores el aumento de la resistencia de las plagas cuando se aplica solo o en conjunto con aplicaciones de insecticidas foliares o para zureos. Sin embargo, debe tenerse cuidado para asegurarse que los aparatos para recubrir semillas estén apropiadamente calibrados de modo que el insecticida sea aplicado uniformemente al material en forma de semilla para evitar problemas con el desempeño del insecticida y fitotoxicidad de semillas, entre otros. Pueden utilizarse medidas analíticas para determinar si el equipo para recubrir semillas ha sido calibrado apropiadamente, si está siendo operado apropiadamente y si los lotes de semillas tratados pueden ser liberados para su transporte. Sin embargo, los métodos tradicionales para detectar residuos de insecticida en las semillas consumen mucho tiempo son extremadamente costosos, puesto que requieren procedimientos analíticos altamente especializados y caros tales como la cromatografía gas-líquido o líquidos de alto desempeño. Ambas técnicas cromatográficas requieren instrumentación cara que es costosa de mantener y que debe ser operada por técnicos altamente calificados. Las instalaciones para el tratamiento de semillas y cultivadores usualmente no tienen tal equipo o personal en su plantilla de modo que deben ser transportadas muestras de semillas a laboratorios analíticos lejanos. Cuando las muestras son analizadas sobre una base de tuno rápido por tales laboratorios, la instalación de tratamiento puede recibir datos analíticos aproximadamente 20 horas después del transporte. Análisis menos rápidos dan como resultado retrasos más prolongados. Esos retrasos dan como resultado muchas horas de tiempo de máquina desocupada en la instalación de recubrimiento. También se incurre en retrasos en el transporte de semillas recubiertas. Existe una necesidad urgente en la técnica de mejorar las técnicas de medición existentes para hacerlas menos caras, más eficientes y más fácilmente manejables. Los métodos deseados también deberán ser útiles fuera del laboratorio bajo condiciones de canto, de modo que puedan proporcionar de manera rápida y confiable a un cultivador o personal para tratamiento de semillas e información sobre la presencia y concentraciones de un insecticida dado en una muestra de semillas. A este respecto, es importante que los métodos puedan diferenciar el material pesticida activo de otros productos permitiendo la determinación cuantitativa del ingrediente activo deseado presente en la semilla sin embargo, aún permanece el número de limitaciones serie en los métodos analíticos clásicos. Algunas de esas limitaciones serían operadas mediante el uso déla tecnología de inmunoensayo .

Inmunoensayos y Detección de Plaguicidas Aunque desarrollados principalmente para uso medico» y veterinario, los inmunoensayos han comenzado a encontrar más aplicaciones en la arena agrícola. Por ejemplo, son disponibles inmunoensayos para la detección y cuantificación de enfermedades de cultivos, aflatoxinas y ciertos antibióticos. Aunque los inmunoensayos para la detección de plaguicida han sido descritos en la literatura científica (véase más adelante) , ellos se han vuelto disponibles sobre una base comercial únicamente en la última década. Los inmunoensayos dependen de reactivos de anticuerpos altamente específicos y aparatos analíticos relativamente simples para detectar y/o cuantificar una amplia variedad de materiales objetivo. El anticuerpo, más que el instrumento o condiciones de operación, proporciona la especificidad analítica. Los inmunoensayos pueden por lo tanto ser efectuados en muestras relativamente crudas. Además, los métodos inmunoensayo han sido optimizados para utilizarse en escenarios diferentes a los de laboratorio, remotos, permitiendo su uso en el campo así como en los laboratorios especializado. '* Se conocen métodos inmunológicos para la detección "5 de ciertos herbicidas, incluyendo el ácido 2,4- diclorofenoxiacético (Fleeker, J. , J. Assoc. Off. Anal . Chem . 70:874-878 (1986)), clorosulfuron (Kelley, M. et al., J.

Agrie. Food Chem . 33:962-965 (1985)), haloacetamidas ( inzenburger, P.A. et al. (Publicación de Patente Europea EP 0 340198, 1989), y una variedad de plaguicidas, incluyendo el diflubenzuron ( ie, S. I. et al. J. Agrie. Food Chem . 30:949-957 (19828)), metalaxil (Ne some, .H., J. Agrie. Food Chem . 33:528-530)) y paration (Ercegovich, C.D. et al., J. Agrie . Food Chem . 29:559-563 (1981)). También ha sido 5 descrito un método para la detección inmunológica de atracina (Patente Estadounidense No. 4,530,786). También son conocidos ensayos inmunológicos para cianina, diclofo-metil, pentaclorofenol, 2,4,5-T y terbutrin. Todos los métodos inmunológicos anteriores 0 utilizaban antisueros policlonales que eran obtenidos de animales huésped (típicamente conejos) inmunizados con un antígeno apropiado (inmunógeno) . Más recientemente, han sido descritos anticuerpo monoclonales (Acm) específicos para la atracina y sus derivados y productos de degradación, y el uso de tales Acm en inmunoensayos, (Schaleppi et al., Publicación de Patente Europea EP 365818 (1990)). Debido a su bajo peso molecular, los insecticidas no son inmunogénicos y no producen anticuerpos específicos para huésped animal. En consecuencia, el desarrollo de un inmunoensayo para insecticida requiere un número de pasos, comenzando por el diseño de haptenos, derivados de los insecticidas que mantiene la especificidad estructural de las moléculas del insecticida que permiten a la vez la conjugación a una proteína "portadora" inmunogénica de peso molecular mayor. Además, para separar anticuerpos durante el proceso de su producción, también pueden ser preparados haptenos adicionales cuyas estructuras químicas varíen del hapteno utilizado para inmunizar animales. Finalmente, una vez obtenido la preparación de anticuerpo (ya sea policlonal o monoclonal) , debe ser desarrollado un inmunoensayo suficientemente sensible. Las estrategias básicas utilizadas en los inmunoensayo modernos han sido descritas en numerosas referencias (Véase, por ejemplo, Voller, A. et al., eds., Immunoassays For The 80' S, University Park, 1981; Voller, A., *The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)", Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, alkersville, Md.; Voller, A. et al., J. Cli n . Pathol . 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth . Enzymol . 73:482-523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, Fia., 1980). Esencial a cada método es la generación de curvas de calibración utilizando cantidades conocidas del analito deseado. Un método de "anticuerpo marcado" en uso común es referido como el ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA) . Aquí, un conjugado proteico de la visión (llamado "recubrimiento" o "antígeno de selección") es preparado utilizando una proteína que no esta relacionada estructuralmente con la proteína portadora utilizada en el inmunógeno de plaguicida, contra el cual se generaron anticuerpos antiplaguicida. El conjugado de antígeno de recubrimiento es inmovilizado sobre un soporte en fase sólida tal como la superficie del pozo de una microplaca, lo que da como resultado la cantidad fija de plaguicida en fase sólida por reacción. Se agrega una cantidad conocida de anticuerpo junto con al muestra de prueba. El plaguicida inmovilizado compite con el plaguicida libre en la muestra desconocida por un número limitado de sitios de unión de anticuerpo. La interacción entre el anticuerpo y el analito en al fase líquida inhibe la unión del anticuerpo al plaguicida en fase sólida. El anticuerpo unido en fase sólida es detectado por un segundo anticuerpo conjugado con la enzima específico para la región constante de la cadena pesada del anticuerpo antiplaguicida. Muchos segundos anticuerpos ligados a enzimas se encuentran comercialmente disponibles para tal uso. Después de lavar el segundo anticuerpo no unido, el segundo anticuerpo inmovilizado es detectado típicamente agregando un sustrato cromogénico para la enzima, lo cual da como resultado un producto de reacción coloreado formado en proporción directa a la cantidad del segundo anticuerpo unido. La cantidad de producto de reacción es de este modo inversamente proporcional a la cantidad de analito en la muestra desconocida. Una modificación del método de "anticuerpo marcado" elimina el uso del antígeno de recubrimiento. El inmunoensayo enzimático (EIA) inmoviliza al anticuerpo antiplaguícida ante una fase sólida. Un hapteuo de plaguicida es acoplado covalentemente a una enzima, y el conjugado enzimático resultante es incubado con muestras en micropozos o tubos de cultivo recubiertos con anticuerpo antiplaguicida. Al plaguicida en a muestra compite con el conjugado de > hapteno de plaguicida-enzima por la unión al anticuerpo inmovilizado. La fase sólida es lavada para remover los materiales no unidos y el conjugado anticuerpo-enzima unida es detectado mediante la adición del sustrato cromogenico. Véase, por ejemplo Bush ay, R.J., L.P. Perkins, S.A. Savage, S.L. Lekousi, y B.S. Ferguson. 1998. La determinación de residuos de atracina en agua y suelo por inmunoensayo enzimático. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 40:647-654; Fleeker, J.R. y L.W.

Cook. 1991. Confiabilidad del inmunoensayo enzimático comercial en la detección de atracina en agua. P. 78-85 en M. Vanderlann, L.H. Stanker, B.E. Watkins, y D.W. Roberts., eds. Inmunoensayos para el análisis de trazas químicas. ACS Symposium Series 451. Washington, D.C.: American Chemical Society. Existe la necesidad en el campo agrícola de un método para analizas semillas tratadas con ingredientes activos tales como insecticidas que puedan llevarse a cabo en el campo o dentro de una instalación para el tratamiento de semillas . La presente invención proporciona haptenos 'e inmunógenos neonicotinoides para generar anticuerpos antinicotinoides así como anticuerpos, métodos, reactivos y equipos para determinar la presencia de uno o mas insecticidas neonicotinoides en una muestra por inmunoensayo. La presente invención tiene particular aplicación en la determinación de la concentración de insecticidas neonicotinoides aplicados a materiales para la propagación de plantas tales como semillas. El método de inmunoensayo de la invención permite al personal de las instalaciones de tratamiento de semillas, donde son aplicados insecticidas neonicotinoides a las semillas, medir cuantitativamente la cantidad de ingrediente activo aplicado. El método implica una extracción rápida de los ingredientes activos de la semilla y la medición rápida basada en un inmunoensayo de la solución de extracto. Esas mediciones pueden ser utilizadas para determinar si el equipo para recubrir semillas ha sido calibrado apropiadamente, esta operando apropiadamente y si el lote de semillas tratadas puede ser liberado para su transporte. El ensayo esta diseñado de modo que sea simple de cooperar, por lo que requiere únicamente equipo y reactivo de laboratorio comunes. Por lo tanto, el personal que carece de experiencia para efectuar inmunoensayos será ^capaz de conducir exitosamente la prueba descripción pues de unos cuantos ensayos de práctica. Se ha encontrado que los conjugados neonicotinoides antigenicos (inmunógenos) pueden ser producidos mediante la conjugación de un hapteno plaguicida neonicotinoide a una molécula portadora tal como un derivado de proteína purificada (PPD, tuberculina) del virus de la Diptheria, seroalbumina bovina, seroalbumina humana, ovoalbumina y hemociani nade lapa de bocallave a una hapteno neonicotinoide. También pueden ser producidos conjugados de materiales derivados tales como seroalbúmina bovina derivada, seroalbúmina bovina cationizada y similares. Véase A. Muckerheide, R. Apple, A. Pesce y J.G. Michael (1987) J. Immunol. 138:833-837. Esos inmunógenos pueden entonces ser inyectados en animales huésped que producirán anticuerpos para el hapteno neonicotinoide los cuales pueden se cosechados. Esos anticuerpos pueden entonces ser utilizado en una variedad de procedimientos de inmunoensayo para detectar los insecticidas neonicotinoides correspondientes, 5 utilizando varios marcadores conocidos para marcar al insecticida o al anticuerpo. En algunas modalidades de inmunoensayos, es inmovilizado un derivado de insecticida neonicotinoide o un anticuerpo. 'Pueden ser utilizados ambos -u? anticuerpos policlonales o monoclonales en la práctica de la 10 presente invención. Los anticuerpos pudieron mostrar unión selectiva a los insecticidas neonicotinoides deseados aún en presencia de otros ingredientes plaguicidas activos, incluyendo otros insecticidas neonicotinoides incorporados en una formulación para recubrir semillas. 15 Los métodos de detección que pueden ser aplicados a la practica de la presente invención para la medición de los insecticidas neonicotinoides en una muestra incluyen biosensores y sistemas enzimáticos, fluorescentes, quimioluminicentes y radiometricos . Tales ensayos pueden 20 utilizar formatos heterogéneos u homogéneos y pueden utilizar placas de micropozos, tubos de cultivo y perlas de látex partículas como fase sólidas. Los inmunoensayos de la presente invención son utilizados para determinar la concentración de compuestos de 25 insecticidas neonicotinoides tales como el imidacroprid, nitenpiram, acetamiprid, tiametoxan, tiacloprid y clotiadid en una muestra tal como un material para la propagación de plantas. La presente invención proporciona inmunoensayos 5 para probar una muestra para determinar la presencia de insecticidas neonicotinoides. En tales inmunoensayos, la reacción (antígeno) neonicotinoide/anticuerpo puede ser detectada por una variedad de métodos, utilizando varios , 1 -3 marcadores para marcar cualquiera del antígeno o anticuerpo 10 para permitir la detección del producto de reacción. Además, la inmovilización del antígeno el anticuerpo facilitará la detección en muchos casos. Los ensayos antígeno/anticuerpo pueden ser clasificados de manera general en dos categorías, 15 heterogéneos y homogéneos. Los ensayos heterogéneos requieren la separación del componente marcado unido del componente marcado libre antes de la detección de un producto de reacción. Los ensayos homogéneos no requieren tal paso de separación. Los ensayos pueden además ser (1) competitivos, 20 por ejemplo, donde el antígeno compite con el anticuerpo marcado con un antígeno en fase sólida o donde el antígeno compite con el antígeno marcado con el anticuerpo en fase sólida o (2) no competitivo donde existe una relación directa entre la marca y el anticuerpo o antígeno.

Los métodos de inmunoensayo que pueden ser utilizados en la práctica de la presente invención para detectar insecticidas neonicotinoides en una muestra incluyen inmunoensayos enzimáticos, fluorescentes quimioluminiscentes y biosensores, así como un radioinmunoensayo. En inmunoensayos ligados a enzima (ELISA) , de acuerdo con la presente invención, los haptenos correspondientes a los insecticidas neonicotinoides de interés pueden ser marcados directamente con una enzima o indirectamente mediante el uso de anticuerpos marcados con enzima los cuales bajo condiciones apropiadas catalizan la reacción con un sustrato. La actividad enzimática es detectada típicamente por la formación de un producto de reacción coloreado, es decir, un punto final coloreado que pueden ser fácilmente detectado por el ojo o medido por medios espectroscópicos o de reflectancia . En las técnicas de inmunoensayo fluorescente para el uso en la presente invención, los haptenos correspondientes a los insecticidas neonicotinoides de interés pueden ser marcados directamente con flurocromos, o indirectamente con anticuerpos marcados con fluorocromo. Los fluorocromos son tintes que absorben radicación (por ejemplo, luz ultravioleta) , excitados por éstos, y que emiten luz (por ejemplo, luz visible) .

En una modalidad de la presente invención, el método para determinar la concentración de insecticida neonicotinoide en una muestra comprende los pasos de: (a) proporcionar una fase sólida con un anticuerpo inmovilizado selectivo para el insecticida neonicotinoide (b) poner en contacto una muestra con el anticuerpo inmovilizado en presencia de una cantidad conocida de un conjugado de hapteno de insecticida neonicotinoide- enzima; (c) lavar la fase sólida del paso (d) para remover cualquier conjugado de hapteno-enzima o muestra; (d) hacer reaccionar un sustrato cromogénico específico para el conjugado hapteno-enzima con la fase sólida lavada del paso (c) para generar un cromógeno; y (e) medir la cantidad de cromógeno producido por el paso (d) para determinar la cantidad de conjugado-hapteno unido-enzima y en consecuencia la cantidad de insecticida neonicotinoide en la muestra. En una modalidad, el inmunoensayo es suministrado en forma de un equipo que incluye tubos recubiertos con anticuerpo, el conjugado hapteno neonicotinoide-enzima, el sustrato enzimático, y solución para determinar la producción de la señal colorimétrica. Aunque la invención con frecuencia es descrita con referencia al uso de anticuerpos policlonales, aquellos expertos en la técnica también reconocerán que podrían ser utilizados anticuerpos monoclonales como una alternativa al uso de anticuerpos policlonales. El término "anticuerpos" es utilizado aquí para referirse de manera genérica a anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos monoclonales para insecticidas neonicotinoides para utilizar en la práctica de la presente invención son producidos utilizando técnicas de inmunización e hibridoma bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. Las líneas celulares de hibridoma adecuadas son producidas preferiblemente mediante la fusión de una célula productora de anticuerpos y una célula de mieloma derivada de especies murinas. Las células productoras de anticuerpo son preferiblemente células de bazo. Puede ser utilizada cualquier línea celular del mieloma adecuada, sin embargo es deseable utilizar una línea celular bien caracterizada de las cuales existe un número en uso común. De igual modo, los anticuerpos policlonales para insecticidas neonicotinoides para utilizarse en la práctica de la presente invención también se producen utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. La presente invención también proporciona la preparación de un anticuerpo IgG policlonal el cual se une al menos a un insecticida neonicotinoide, la preparación del anticuerpo producido por un método que comprende los pasos de: (a) administrar a un huésped una cantidad predeterminada de una cantidad que comprende un insecticida neonicotinoide o un equivalente inmunológico acoplado a una proteína portadora biológicamente aceptable, (b) recolectar el suero del huésped, y (c) purificar el anticuerpo IgG del suero. Un equivalente inmunológico de un antígeno tiene la capacidad, cuando es introducido en un huésped, de aumentar la producción de anticuerpos para el antígeno. Como se hizo notar anteriormente, los inmunoensayos de la presente invención tienen aplicación particular en la detección de la cantidad de un insecticida neonicotinoide que ha sido aplicado a un material de propagación de plantas. Debe comprenderse que el término "material para la propagación de plantas" denota todas las partes generativas de la planta tales como semillas las cuales pueden ser utilizadas para la multiplicación de material de plantas posteriores y vegetativas tales como cortes y tubérculos (por ejemplo papas) . Pueden mencionarse, por ejemplo, las semillas (en el sentido estricto) , raíces, frutas, tubérculos, bulbos, rizomas y partes de plantas. También pueden mencionarse plantas germinadas y plantas jóvenes, las cuales van a ser transplantadas después de la germinación o después de la emergencia del suelo. Esas plantas jóvenes pueden ser protegidas antes del trasplante por un tratamiento total o parcial por inmersión.

En una modalidad, el insecticida neonicotinoide detectable por el ensayo de la presente invención esta representado por la fórmula: adonde A es 2-cloropirid-5-ilo o 2-clorotiazol-5- ilo; 10 R y R son independientemente hidrógeno o alquilo de C;L-C4; R1 y R2 son independientemente hidrógeno o alquilo de C?-C4 o R1 y R2 tomados junto con los átomos de nitrógeno los cuales esta unidos forman un anillo de , imidazolina u 15 oxiadiazina; y X es N-N02 o N-CN.

En otra modalidad, el insecticida neonicotinoide detectable por el ensayo de la presente invención esta 20 representado por la fórmula O donde a, R3 y X son como se definieron anteriormente para la fórmula (I) . En una modalidad preferida, el inmunoensayo de la presente invención emplea anticuerpos policlonales para un insecticida neonicotinoide. Esos anticuerpos pueden ser obtenidos del suero de un animal inmunizado. La inmunización puede efectuarse inyectando el inmunógeno (conjugado de hapteno-antigeno PPD) en una especie productora de anticuerpos, típicamente un mamífero y de manera preferible un conejo u oveja. Típicamente, una inyección inicial es seguida por una serie de inyecciones de refuerzo posteriores para maximizar la respuesta al anticuerpo. De manera óptima, el régimen de inyección es en dosis múltiples dadas a conejos blancos Nueva Zelanda hembra. La cantidad de inmunógeno inyectado varía pero debe ser adecuada para producir una cantidad detectable de anticuerpo. La producción de anticuerpo puede ser verificada analizando los sueros obtenidos en sangrados de ensayo utilizando EIA, ELISA o ensayo de inmunoensayo fluorescente indirecto. Pueden ser utilizadas las mismas marcas utilizadas en otros ensayos inmunométricos conocidos para marcar el hapteno utilizado en la presente invención. Entre esas pueden mencionarse moléculas reporteras (RM) incluyendo enzimas, tales como la fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa. Además, pueden ser utilizadas marcas fluorescentes, luminiscentes o radiactivas tales como la fluoresceina, rodamina, luminol, acridio e isótopos radiactivos 125I, etc, o partículas coloidales tales como el oro y el selenio, etc. Finalmente, pueden ser utilizados fluoroforos de acrilato de lantanido tales como el europio y terbio para generar señales fluorescentes resueltas temporalmente. Los marcadores enzimáticos más comunes son la peroxidasa de rábano (HRP) y la fosfatasa alcalina. En una modalidad, es utilizado un espectofotómetro para detectar la cantidad de neonicotinoide en una muestra. Sin embargo, los métodos de la presente invención pueden ser adaptados por aquellos expertos en la técnica para utilizar otros tipos de detectores cromogenicos . De manera similar, el producto de reacción detectado no se limita a un cromofero sino que incluye otras marcas como se describió anteriormente . Se ha encontrado que los haptenos de las siguientes fórmulas (IA), (IB) y (IIA) son útiles para la producción de conjugados neonicotinoides antigénicos (inmunogenos) y conjugados de ensayo: Hapteno (IA) donde A es 2-cloropirid-5-ilo o 2-clorotiazol-5- ilo; R es hidrógeno o alquilo de C?-C4; R1 y R2 son independientemente hidrógeno o alquilo 0 de C1-C4 o R1 y R2 tomados junto con los átomos de nitrógeno los cuales están unidos forman un anillo de .imidazolidina u oxadiazina; N es un número entero de 1 a 5 (preferiblemente un número entero de 3. a 5); y 5 X es O, N-N02 o N-CN.

Hapteno (IB) donde A, R1, R2, R3 y X son como se definen en al fórmula (IA) ; y E es un solo enlace covalente o es una porción enlazante de fórmula -(CH2)m- donde m es un entero de 1 a 3. Ejemplo 1: Hapteno (IIIA) donde A, R3, X y n son como se definen en la fórmula (IA) . Hapteno (IIIB) donde A, R3 y X son como se define en la fórmula (IA) y E es como se define en la fórmula (IB) . Los haptenos de fórmulas (IIIA) y (IIIB) pueden ser preparados por analogía con la siguiente metodología: derivado de (N-cianoimido) 2- (N-cianoimido) 2-aminoetantiol carbonato tiazolidina sustituida CN El hapteno deseado ( IIIA) o ( IIIB) es preparado utilizando un . derivado de 2-aminoetantiol apropiado seleccionado de un grupo de las fórmulas : (HE) donde R tiene el significado dado anteriormente para la fórmula (I) . Se ha encontrado que los siguientes haptenos son particularmente útiles en ?a practica de la presente invención: donde N en cada caso es un número entero de 1 a 5; de manera preferible N es un número entero de 3 a 5. Los conjugados neonicotinoides antigénicos (inmunogenos) y conjugados de ensayo pueden ser producidos mediante la conjugación de un hapteno plaguicida neonicotinoide con una molécula portadora o molécula reportera, según pueda ser el caso, utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Han sido tomados dos métodos básicos. El primero utiliza ,enlazantes que se volverán parte del conjugado. Esos .enlazantes son homobifuncionales o heterobifuncionales, e incluyen a aquellos capaces de formar, por ejemplo, enlaces disulfuro a través de los grupos tiol de las porciones de cisteína en las proteínas del sustrato, o de la formación de enlaces amida entre el grupo amino N-terminal o las cadenas laterales amino residuos de .lisina y porciones de acilo activadas tales como los esteres de succinimidilo. En general, este método implica grupos funcionales altamente reactivos sobre el enlazante y es razonablemente fácil con respecto a los sustratos para la conjugación. Sin embargo, con frecuencia es útil emplear grupos funcionales que puedan ser menos reactivos, tales como aquellos capaces deformar ' hidrazona . Un segundo método, particularmente útil en la conjugación de dos porciones proteicas, utiliza un agente deshidratante tal como una carbodiimida para efectuar la formación de, por ejemplo, nuevos enlaces peptídicos mediante la reacción de una porción de carboxilo sobre un miembro del conjugado con un grupo amino libre del otro. En este caso, el reactivo no se vuelve parte del conjugado. Esta reacción no es particularmente fácil puesto que el grupo carboxilo no esta activado; la carbodiimida proporciona el intermediario activo y desvía el equilibrio removiendo los elementos acuosos para formar el enlace peptídico. Ambos métodos de conjugación han sido conducidos de manera general en solventes acuosos debido a que el material proteico que forma el conjugado es fácilmente desnaturalizado. Las proteínas están diseñadas para ser estables en un ambiente acuoso y se sabe que se desnaturalizan aún en solventes, tales como el etanol, el cual se concebiría razonablemente análogo a un medio acuoso. También, los componentes del conjugado proteico tienden a ser relativamente insolubles en solventes no acuosos. Se ha encontrado que los conjugados de hapteno de la siguiente fórmula son útiles en la práctica de la invención: donde A, Ri, R2, R3, n y X tiene los significados dados en la fórmula (IA) anteriormente y PR es un residuo proteico de: (1) una molécula portadora tal como un derivado de proteína purificada (PPD, Tuberculina) del virus de la Diptheria, seroalbumina bovina, seroalbumina humana, ovoalbúmina y hemocianina de lapa de bocallave, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa. Además, los conjugados de hapteno de la siguiente fórmula son igualmente útiles: donde A, Ri, R2, R3, E y X tiene los significados dados en al fórmula (IB) anteriormente. Se ha encontrado que los siguientes conjugados son particularmente útiles en al practica de la presente invención: donde n en cada caso en un número entero de 1 a 5, de manera preferible n es un número entero de 3 a 5. El anticuerpo policlonal no marcado utilizado en el proceso de la presente invención para unirse al conjugado de neonicotinoide antigénico o hapteno-RM en al muestra que este siendo tratado puede ser inmovilizado sobre cualquiera de los soportes comúnmente utilizados en ensayos inmunometricos. Entre aquellos que pueden ser utilizados están el papel filtro, perlas de látex o poliestireno y polietileno, poliestireno, polipropileno u otras placas de pozos o tubos de prueba apropiados. Este soporte puede ser hecho de cualquier polímero de origen natural o sintético, o de un material amorfo tal como el vidrio. De manera ventajosa, son utilizadas membranas de nitrocelulosa o nylon para las tiras reactivas, y polivinilo, polipropileno, poliestireno u otros plásticos para las perlas o microplacas. También pueden ser utilizados geles o partículas basadas en agarosa, acrilamida o látex. Adicionalmente, cualquiera de los dispositivos inmunocromatográficos, tiras de prueba y dispositivos de flujo lateral conocidos en la técnica pueden ser adaptados al proceso de la presente invención. Entre los dispositivos de flujo lateral adecuados, pueden mencionarse, por ejemplo, el tipo de dispositivo de flujo lateral descrito en la patente estadounidense 4,366,241. Las técnicas para unir anticuerpos a tales materiales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Una fuente adecuada para obtener anticuerpos unidos a un soporte es, por ejemplo, Beacon Analytical Systems, Inc. (Portland, Maine) . Para preparar una muestra de semilla para utilizase en el ensayo, las submuestras representativas de semillas de un lote tratado con neonicotinoide (por ejemplo, de 5 a 100 gramos de semilla de cañóla; de 10 a 200 gramos de semilla de sorgo, trigo, algodón, maíz de campo o maíz dulce) son dispersadas en un solvente adecuado tal como la acetona, acetonitrilo, etanol, isopropanol, metanol o mezclas de esos solventes con varios porcentajes de agua. Las mezclas de solvente-agua adecuadas incluyen por ejemplo de 1 a 50% de MeOH/H0 y de 1 a 20% de acetonitrilo/H20. Las semillas dispersas son mezcladas por agitación vorticial y a continuación colocadas en un baño de sonicacion durante aproximadamente 20 minutos y seguidas por agitación vorticial adicional. El contenido se deja sedimentar. Una porción conocida del extracto líquido es removida y agregada a una cantidad conocida de una solución de, por ejemplo, 1% de acetonitrilo/agua. El extracto es dividido adicionalmente para llevar la concentración del neonicotinoide extraído al intervalo de la curva de calibración. Se ha encontrado que diluciones de mil a seis mil veces son útiles. El ensayo toma aproximadamente treinta y cinco minutos para efectuarse. La extracción y preparación del extracto para el análisis toma aproximadamente 30 minutos. Por lo tanto, puede extraerse y analizarse una muestra de semillas en aproximadamente una hora y cinco minutos. En una modalidad, pueden ser analizadas hasta dos muestras de semillas (con estas cinco muestras por muestra de semilla) a la vez. Pueden ser detectadas concentraciones de insecticidas neonicotinoides de aproximadamente diez mil partes por millón hasta media parte por billón en el inmunoensayo de acuerdo a la presente invención. Sin embargo, el método es adecuado para cualquier cantidad de insecticida neonicotinoide presente, en tanto la cantidad de insecticida neonicotinoide en una muestra o extracto de muestra caiga o pueda ser apropiadamente diluida para caer dentro del intervalo de la curva de calibración. La preparación del antígeno, la producción de los anticuerpos policlonales y los inmunoensayos se ilustran con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1- Procedimineto Sintético para el Hapteno de Tiametoxan sulfato de O-metil isourea 1.1 1.4 1.1 2-metil-1-nitroisourea Disolver sulfato de O-metil isourea (38.5g) en una mezcla de ácido nítrico (120 ml) /ácido sulfúrico (280 ml) a 0°C y agitar durante 2 h a 0 °C. Verter cuidadosamente la mezcla sobre hielo triturado con agitación y a continuación remover el hielo triturado por filtración. Disolver los cristales similares a agujas d en acetato de etilo y hacer la solución alcalina mediante la adición de carbonato de potasio. Secar la solución sobre sulfato de magnesio y filtrar. Concentrar el filtrado para producir un polvo blanco (5 g) . 1.2 Se prepara una solución de 3g de clorhidrato de 4-aminobutirato de metilo (1.1a) y 15 ml de agua. El pH es ajustado a 11 mediante la adición por goteo de NaOH 2N mientras la solución es enfriada en un baño de hielo. El matraz de reacción esta equipado con un electrodo de pH y termómetro y la solución básica clara transparente es agitada rápidamente a medida que es agregada 2-metil-l-nitroisourea (2.38g) en pequeñas porciones para mantener la temperatura de la solucione por debajo de 2 °C. Cuando la adición es completa, agitar la reacción durante 1.5 h a 0 °C; nótese que el pH se ha estabilizado a 9.6. agregar THF (1 ml) y agitar durante 2 h adicionales. Diluir la reacción con agua y verter sobre acetato de etilo. Después de que la fase orgánica se separe, secar al fracción orgánica sobre sulfato de magnesio y filtrarla solución. Concentrar el filtrado para producir un aceite claro. Someter a cromatografía instantánea el aceite crudo sobre gel de sílice eluyendo con dicloro etano/acetonitrilo 3:1 para dar 750 mg del producto deseado como un sólido blanco. 1.3 4 Combinar el producto de 1.2 (1.44g) con paraformaldheído (422 mg) , ácido metansulfónico (0.023 ml) , y ácido fórmico (10 ml) y calentar a 55 °C durante 15 h. Concentrar la reacción in vacuo. Suspender el aceite marrón resultante en tolueno y separar .azeotrópicamente la solución hasta sequedad. Disolver el aceite resultante en THF/dioxano/acetonitrilo 1:1:1 y tratar este con exceso de diazometano. Agitar esta solución durante 30 min y tratar la solución con ácido acético. Concentrar la mezcla de reacción hasta un aceite. Reconstituir el aceite con acetato de etilo, lavar con solución de bicarbonato de sodio diluida, secar sobre sulfato de magnesio, reconcentrar hasta un aceite. Purificar este aceite por cromatografía instantánea en diclorometano/acetonitrilo 3:1 para proporcionar 658 mg del éster butírico de oxadiazinamina deseada (1.3) como un aceite claro. 1.4 Disolver el producto de 1.3 (l.lg) d en acetonitrilo (50 ml) y agregar 3g de carbonato de potasio.

Agregar clorometil clorotiazol en una porción y calentar la mezcla de reacción a 55 °C durante 20 h. Enfriar la mezcla de reacción a temperatura ambiente y filtrar para remover sólidos. Concentrar el filtrado marrón resultante hasta un aceite. Purificar el aceite por cromatografía instantánea en diclorometano/acetonitrilo 3:1 para dar 894 mg del compuesto deseado como un aceite amarillo/marrón. 1.5 Disolver el compuesto 1.4 (372 mg) en 8 ml de HCl conc y 1 ml de agua y agitar durante 6 h a temperatura ambiente. Diluir la mezcla de reacción con agua y basificar cuidadosamente mediante la adición de NaOH ÍN hasta que se alcance un pH de 4.5. Extraer con acetato de etilo y secar la fracción orgánica sobre sulfato de magnesio. Concentrar la fracción orgánica seca hasta un aceite y purificar por cromatografía instantánea en diclorometano/acetonitrilo' 1 : 1 para dar el producto deseado 1.5 (100 mg) . (1.5) Ejemplos 2-5 Haptenos de Tiametoxam Se utilizó la metodología sintética del Ejemplo 1 para preparar los siguientes haptenos de tiametoxam mostrados en la Tabla 1 reemplazando el intermediario 1.1a con un compuesto análogo apropiado de la fórmula NH2 (CH2) nC02R(l. lb) donde n es un número entero de l a 5 y R es H o alquilo de C?_C4.

Tabla 1 Ej empl o n 2 1 3 2 4 4 5 5 Ejemplos 6-9- Haptenos de Tiametoxam Se utilizó la metodología sintética del Ejemplo 1 para preparar los siguientes haptenos de tiametoxam mostrados en la Tabla 2 reemplazando el intermediario 1.1a con el compuesto análogo apropiado de fórmula (1.1c) donde E es un solo enlace covalente o una porción enlazante -(CH2)m- donde m es un número entero de 1 a 3; R es H o alquilo de Ci-C4.

Tabla 2 Ejemplo R4 6 Ejemplo R4 1 8 9 Ejemplo 10 - Procedimiento Sintético para el Hapteno de desnxtroxmxno Txametoxam C02H Procedimiento : El hapteno de ácido tiametoxam-butírico (100 mg, 0.275 mol) y el anisol (6.5 ml) fueron combinados en un matraz de fondo esférico de 10 ml equipado con agitador magnético y un condensador de reflujo. El matraz fue colocado en un baño de aceite y calentado a 165°C durante 2h. El anisol fue removido bajo presión reducida a 50°C durnate 5h. El producto oleoso resultante (90.2 mg) fue 93% puro por análisis por CLAP.

Datos espectroscópicos para la Caracterización: CLAP: "Keystone Scientific Aquasil C-18 5u (25 x 0.46 cm) ; Acetonitrilo: Acido Fosfórico 20 mM (40:60); 1.0 ml/min; T= 40C; UV @ 240 nm (BW= 100 nm) ; Tiempo de Ensayo: 13 min.; Tiempo de Retención: 4.6 min. TCF: (gel de diol) Diclorometano/Acetonitrilo, 2:1 Rf= 0.25 H RMN (CD3CN, 300 MHz) : d 7.43 (t, 1H) , 4.78 (s, 4H) , 4.75 (s, 4H) , 4.48 (d, 2H) , 3.29 (t, 2H) , 2.27 (t, 2H) , 1.73 (c, 2H) .

Espectro de Masas EI/DEP: m/z 319 (M+) Análisis de combustión: Teórico: C, 41.32; H, 4.41; N, 13.14; Encontrado: C, 40.13; H, 4.43; N, 12.99 Ejemplos 11-18 - Haptenos de desnitroxmino Tiametoxam Se utilizó la metodología sintética del Ejemplo 10 para preparar los siguientes haptenos de desnitroimino tiametoxam mostrados en la Tabla 3 reemplazando el compuesto obtenido en el ejemplo 1 con un compuesto análogo apropiado de los ejemplos 2-9.

Tabla 3 Ejemplo R3 15 CO2H 16 17 18 Ejemplos 19-27 - Haptenos de Imidacloprid Se utilizó la metodología sintética del Ejemplo 1 para preparar los siguientes haptenos de imidacloprid mostrados en la Tabla 4 mediante el uso del derivado de nitroguanidilo obtenido en 1.2 o un análogo del mismo obtenido mediante el reemplazo del intermediario 1.1'a? con un análogo apropiado de fórmula 1.1b o 1.1c como se muestra en los ejemplos 2-9 Tabla 4 Ejemplo R° 26 27 Ejemplos 28-36 - Haptenos de desnitroimino Imidacloprid Se utilizó la metodología sintética del Ejemplo 10 para preparar los siguientes haptenos de desnitroimino imidacloprid mostrados en la Tabla 5 reemplazando el compuesto obtenido en el ejemplo 1 con un compuesto análogo apropiado de los ejemplos 19-27.

Tabla 5 Ejemplo 37-45 - Haptenos de Clotxadxn Se utilizó la metodología sintética del Ejemplo 1 para preparar los siguientes haptenos de clotiadin mostrados en la Tabla 6 mediante el uso del derivado de nitroguanidilo obtenido en 1.2 o un análogo del mismo obtenido mediante el reemplazo del intermediario 1.1a con un análogo apropiado de fórmula 1.1b o 1.1c como se muestra en los ejemplos 2-9. Tabla 6 Ejemplo Rb 37 -CH2C02H 38 -CH2CH2C02H 39 - CH2CH2CH2C02H 40 -CH2CH2CH2CH2C02H 41 -CH2CH2CH2CH2CH2C02H 42 Ejemplo Rß 43 44 45 Ejemplos 46-54 - Haptenos de desnitroimino Clotiadin Se utilizó la metodología sintética del Ejemplo 10 para preparar los siguientes haptenos de desnitroimino clotiadin mostrados en la Tabla 7 reemplazando el compuesto obtenido en el ejemplo 1 con un compuesto análogo apropiado de los ejemplos 37-45.

Tabla 7 O Ej emplo Ry 46 -CH2C02H 47 -CH2CH2C02H 48 - CH2CH2CH2C02H 49 -CH2CH2CH2CH2C02H 50 -CH2CH2CH2CH2CH2C02H 51 CO2H 52 53 H Ej emplo Ra 54 Ejemplo 55-63 - Haptenos de Tiacloprxd Se utilizó la metodología sintética especificada para los haptenos de fórmula (IIIA) y (IIIB) para prepara los siguientes haptenos de clotiadin mostrados en la Tabla 8.

Tabla 8 Ej emplo R1U 55 -CH2C02H 56 -CH2CH2C02H 57 - CH2CH2CH2C02H 58 -CH2CH2CH2CH2C02H Ej emplo R1U 59 -CH2CH2CH2CH2CH2C02H 60 CO2H 61 62 63 Ejemplo 64- Preparación del Inmunógeno de Txametoxam 64.1 Preparar una solución del derivado de proteína purificado (tuberculina, PPD) en PBS 0.01M, pH 7.4, a una concentración de 1 mg/ml. Ajustar el pH de una alícuota de 0.5 ml de esta solución a 4.5-5.0 con HCl 0.1M. 64.2 Disolver el hapteno de tiametoxam del ejemplo 1 (1 mg) en 250 µl de ácido 2- (N-morfolina) -etansulfónico 0.1M, pH 4.5. Combinar las soluciones de hapteno y PPD. 64.3 Disolver 1 ng de clorohidrato de 1- (dimetilaminopropil) -3-etilcarbodiimida (EDC) en 100 µl de agua destilada, desionizada. Inmediatamente agregar la solución de EDC a la solución de hapteno-PPD de 3.2. Mezclar la solución de hapteno-PPD-EDC por rotación durante 2 horas a temperatura habiente. Transferir la mezcla de reacción a una bolsa de diálisis con un corte de peso molecular de 1000-2000 Daltons. Dializar extensivamente contra dos litros de PBS a 4 °C con tres cambios/día durante cuarenta y ocho horas.

Ejemplo 65- Preparación del Inmunógeno de Imidacloprid Se utilizo la metodología del ejemplo 64 para preparar un inmunógeno de imidacloprid utilizando el hapteno del ejemplo 21.

Ejemplo 66- Preparación del Inmunogeno de Clotiadin Se utilizó la metodología del ejemplo 64 para preparar un inmunogeno de clotiadin utilizando el hapteno del ejemplo 39.

Ejemplo 67- Preparación del Inmunogeno de Tiacloprid Se utilizó la metodología del ejemplo 64 para preparar un inmunógeno de clotiadin utilizando el hapteno del ejemplo 67.

Ejemplo 68- Programa de Inmunización y Cosecha de Anticuerpos Para la inmunización inicial, disolver el inmun geno del ejemplo 64 en adyuvante completo de Freund. Inocular conejos blancos Nueva Zelanda hembra, inyectar aproximadamente 24 µg de inmunogeno en cada sitio. Inmunizar de manera similar ovejas excepto que se inyectan a aproximadamente 38 µg de inmunogeno en cada sitio. En inmunizaciones posteriores, disolver el inmunogeno en adyuvante completo de Freund. Dejar reposar los animales durante dos semanas entre inmunizaciones y dejar diez días después de la inmunización.

Administrar inyecciones de refuerzo y sangrar los animales durante nueve mese, punto en el cual son exanguinados. Los anticuerpos policlonales son cosechados utilizando técnicas conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Ejemplo 69- Preparación de Conjugados de Hapteno- Enzima 69.1 El hapteno de tiametoxan del ejemplo 1 (3.1 mg) , N-hidroxisucinimida (NHS) (4.0 mg) , y EDC ( 4 . 6 mg) son combinados en un frasco pequeño. Esos materiales son secados bajo un flujo suave de nitrógeno durante 15 minutos a temperatura ambiente. 69.2 Se agrega dimetilformamida seca (2.0 mL) y la mezcla es sonicada durante 1 minuto. La solución resultante es incubada durante la noche a temperatura ambiente. 69.3 La peroxidasa de rábano (8.5 mg) disuelta en amortiguador de carbonato (2.0 mL, 0.05M, pH 9.6), en un frasco pequeño. El frasco es colocado en un baño de hielo. 69.4 Se agrega lentamente un total de 100 µl de solución de hapteno-NHS-EDC de 6.2 durante una hora y la mezcla es incubada con agitación durante 2 horas. La mezcla de reacción es pasada sobre una columna de Sefadex G-25M equilibrada con PBS (0.01M, pH 7.2). El conjugado enzimático recolectado en los primeros 3.0 mL de eluato y se agrega un volumen igual de glicerol; se almacena a -20 °C.

Ejemplo 70- Inmunoensayo de Semilla de Cañóla Tratada con Txametoxan. Una porción de extracto de semilla es diluida en MeOH al 1%/H20 hasta que la concentración esperada de tiametoxan caiga dentro del intervalo de la curva de calibración, 0.5 a 120 partes por billón. Los tubos recubiertos con anticuerpos son marcados y colocados en un soporte de tubos de modo que el primer y último tubo sean estándares y los estándares y muestras restantes son intermezclados . El soporte de los tubos sujeta cada tubo de modo que el soporte puede ser invertido sin que se pierdan los tubos. Se agrega una alícuota de un estándar o muestra (0.5 mL) a todos los tubos correspondientes. Se agrega solución de conjugado enzimático (5.0 mL) a todos los tubos. El soporte es agitado suavemente para mezclar el contenido de todos los tubos. Los tubos son incubados durante 20 minutos a temperatura ambiente. El soporte es invertido para decantar el contenido de todos los tubos. Se agrega H20 destilada a todos los tubos para desbordar utilizando una botella de lavado oscilante y el lavado es decantado. Los tubos son lavados tres veces adicionales. Después del lavado final, el soporte es invertido y los tubos son suavemente golpeados sobre una toalla de papel limpia para remover el exceso de lavado. El sustrato enzimático (0.50 L) es agregado a todos los tubos los cuales son incubados durante 10 minutos a temperatura ambiente. El soporte es agitado suavemente durante 2.5 minutos durante esta incubación. Se agrega una solución de interrupción acida (HCl 1M, 0.5 mL) a todos los tubos para terminar la generación de señales. Como se muestra en la tabla 10, al abosrbancia del producto de reacción es medida a 450 nm. Las absorbancias de los estándares son utilizados para construir una curva de calibración, una función de regresión en forma de Y=m Ln(X)+B. La absorbancia de cada muestra es insertada en al función para conocer la concentración de plaguicida neanicotinoide en la muestra diluida. La concentración resultante es multiplicada por el factor de dilución para calcular la cantidad de plaguicida neonicotinoide en la muestra original.

Tabla 10. Curva estándar tiplea para el inmunoensayo de tiametoxan.

Concentración de Tiametoxan Absorbancia a 450 nm (respuesta analítica) 120 0.3145 20 0.6636 3 1.0283 0.5 1.3618 Unidades de Partes por Billón. La función que describe la respuesta de los estándares de tiametoxan es generada por análisis de regresión. Este conjunto de datos produce una curva estándar de Y=-.191 Ln(X)+1.23, r=-.999 en la cual y= la respuesta analítica y X= la concentración de los estándares de tiametoxan.

Ejemplo 71- Prueba de Reactividad Cruzada de Semillas de Cultivo Tratadas con Tiametoxan. 71.1 Extracción de semillas Muestras de semillas tratadas son submuestreadas agregando aleatoriamente 50 g de algodón, maíz de campo, sorgo, maíz dulce y trigo o 40 g cañóla a recipientes de boca ancha de 8 onzas. La cañóla es submuestreada cuatro veces; se utilizan cientos de muestras de los otros tipos de semillas. Se agrega solvente (150 ml) y la capa es ligeramente sellada. El algodón es extraído en acetonitrilo 5%/agua, mientras que las otras semillas utilizan un sistema de solvente de metanol al 20%/agua. El recipiente es agitado vigorosamente con la mano durante 30 segundos y clocado en un baño de agua sonicante a una temperatura ambiente durante 20 minutos. Las muestras son agitadas una segunda vez como se describió anteriormente. El contenido de cada recipiente se deja sedimentar durante aproximadamente 5 minutos y se remueve una alícuota (10 ml) para análisis. La alícuota es diluida en metanol al 1%/agua para llevar los residuos del intervalo a la curva estándar. 71.2 Análisis del Inmunoensayo Los tubos de cultivo de poliestireno recubiertos con anticuerpos son marcados y colocados en el soporte de tubos de modo que el primer y último tubo sean estándares y los estándares y muestras restantes son mezcladas. Las soluciones muestra y estándar (0.50 m) son agregadas a los tubos correspondientes. Se agrega un volumen similar de solución de conjugado enzimático. El soporte es agitado suavemente para mezclar las soluciones y se deja incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente. El contenido de todos los tubos es removido invirtiendo el soporte sobre una bandeja de acero inoxidable. Cada tubo es lavado desbordando con agua destilada. El soporte es invertido sobre el colector para eliminar el agua de lavado. El lavado se repite cuatro veces. A continuación el soporte es invertido y golpeado suavemente sobre una toalla de papel para remover la mayoría del lado restante. (Algo de líquido restante en los tubos no afecta los resultados del ensayo) . Ser agrega solución de sustrato enzimático (0.50 ml) a los tubos, los cuales son incubados durante 10 minutos a temperatura ambiente. El soporte es agitado suavemente a intervalos de 2.5 minutos para asegurar que la enzima mantenga un suministro amplio de sustrato. La generación de la señal de color azul termina mediante la adición de solución de interrupción acida (0.50 ml) . La absorbancia de la solución en cada tubo es medida espectofotometricamente a 450 nm. La concentración de analito en la muestra es determinada a partir de una función de regresión en forma de y= m ln (x) + b. 71.3 Determinación de la reactividad cruzada La reactividad cruzada, o especificidad, , del inmunoensayo es evaluada para determinar si las sustancias de prueba encontradas en los recubrimientos de semillas interferirían con al medición del tiametoxan. Las sustancias de prueba son disueltas en metanol al 1%/agua a concentraciones que fluctúan de 1000 a 0.01 ng/ml. Las alícuotas de cada concentración son analizadas de acuerdo a lo descrito anteriormente. La reactividad de cada sustancia de prueba en este intervalo es determinada como se describió anteriormente en Brady, J.F; Turner, J. ; Skinner, D.H. "Aplicación de un inmunoensayo enzimático de triasulfuron al análisis de residuos incluidos en muestras de suelo y agua". J. Agrie. Food Chem. 1995, 43:2542-2547. 71.4 Resultados Entre las sustancias de prueba analizadas, únicamente se encontró que el tiametoxan es significativamente reactivo con el inmunoensayo (Tabla 9 más adelante) . Por lo tanto, este inmunoensayo es específico para el tiametoxan. La suhmuestras de los lotes de semillas tratadas se analizaron por inmunoensayo y por CLAP. Los resultados de esos análisis de muestran en la Tabla 11. La Tabla 11 describe la correlación de los resultados promedio del inmunoensayo utilizando un anticuerpo policlonal y un análisis por CLAP de cuarenta muestras de semilla para el tiametoxan. El mejor ajuste de la línea de regresión indica que se obtuvieron resultado similares por cada método.

Tabla 9 Reactividad cruzada del inmunoensayo tiametoxam Sustancia de Por ciento de Reactividad en Prueba Relación al Tiametoxam Tiametoxam 100 Clotiadina <1.0 Imidacloprida 2NR Clorpirifos NR Difenoconazol NR Fludioxonil NR Pentacloronitrobenceno NR Metalaxil NR Mefenoxam (JR-Metalaxil) NR Fluxofenim NR Carboxin NR Captan NR Sistan (Miclobutanil) NR TCMTB NR Primifos-metilo NR Tiofanato-metilo NR Reactividad de la sustancia de prueba en relación a la reactividad del tiametoxam expresada como un porcentaje. ~2NR, no reactivo.

Será reconocido por los expertos en la técnica que pueden hacerse numerosas variaciones y modificaciones a la invención como se describió anteriormente, sin apartarse del espíritu o alcance de la invención como se describe ampliamente .

Tabla 11, Comparación de los resultados analíticos obtenidos por inmunoensayo y por CLAP.

Partes Por Millón de Tiametoxam Encontradas por Inmunoensayo CLAP Tipo de Semilla Muestra Réplica de los Análisis •"•Medio Cañóla 294642 3517 2586 3403 4139 4327 3594 3724 294681 4191 3416 3643 3591 4718 3912 3915 294682 3034 3299 2687 3534 4254 3362 3769 294683 3264 3104 3614 3860 3445 3457 3875 10 294684 2761 3367 3617 3685 3409 3368 3920 Ol Sorgo 294643 1659 1865 1662 1661 1929 1755 1732 294643 1613 1654 1678 1771 1998 1743 1732 Las réplicas de los análisis (cinco) de cada muestra se condujeron por inmunoensayo. El valor medio de todos los análisis del inmunoensayo por cada muestra se compararon con los 15 resultados de la CLAP para esas muestras por análisis de regresión. Esto produjo una función de regresión de Y = 1.00X + 10.9, r = .976, N = 40, donde Y = PPM de Tiametoxam encontradas por inmunoensayo y X = PPM de Tiametoxam encontradas por CLAP.

Tabla 11. Comparación de los resultados analíticos obtenidos por inmunoensayo y por CLAP (continuación) .

Partes Por Millón de Tiametoxam Encontradas por Inmunoensayo CLAP Tipo de Semilla Muestra 1Réplica de los Análisis xMedio 294685 1348 1855 1601 1984 1979 1753 1853 294686 1717 2054 1966 1981 1980 1940 1870 294687 1943 1880 2244 1767 2165 2000 1861 10 294688 1972 1821 1746 1864 1626 1806 1923 CTl o Trigo 294644 651 664 611 573 612 622 624 294689 628 688 684 569 741 662 712 294689 690 732 655 753 710 708 712 294690 930 817 690 794 898 826 745 15 xLas réplicas de los análisis (cinco) de cada muestra se condujeron por inmunoensayo. El valor medio de todos los análisis del inmunoensayo por cada muestra se compararon con los resultados de la CLAP para esas muestras por análisis de regresión.

Tabla 11. Comparación de los resultados analíticos obtenidos por inmtuioensayo y por CLAP (continuación) .

Partes Por Millón de Tiametoxam Encontradas por Inmunoensayo CLAP Tipo de Semilla Muestra Réplica de los Análisis 1Medio 294691 757 565 625 700 806 691 731 294692 1057 994 893 740 845 906 731 294692 915 861 604 658 599 727 731 10 Algodón 294645 2149 2091 2309 2320 2505 2275 2694 cr. 294677 2774 2477 2602 3369 3329 2910 2829 294678 2220 3587 2945 2870 2853 2895 2907 294679 2427 3275 2471 2795 2538 2701 2757 294680 1967 2006 2255 2056 2119 2080 2933 15 1Las réplicas de los análisis (cinco) de cada muestra se condujeron por inmunoensayo. El valor medio de todos los análisis del inmunoensayo por cada muestra se compararon con los resultados de la CLAP para esas muestras por análisis de regresión.

Tabla 11. Comparación de los resultados analíticos obtenidos por inmtuioensayo y por CLAP (continuación) .

Partes Por Millón de Tiametoxam Encontradas por Inmunoensayo CLAP Tipo de Semilla Muestra Réplica de los Análisis 1Medio 294680 2963 2750 2510 2934 2481 2728 2933 294645 2115 2576 2865 3146 2649 2670 2694 10 Maíz dulce 298296 469 428 364 375 455 418 390 298297 750 390 480 514 499 527 397 298298 554 — 476 426 481 484 368 298299 456 440 377 412 387 414 372 298300 448 343 375 388 410 393 385 15 •"•Las réplicas de los análisis (cinco) de cada muestra se condujeron por inmunoensayo. El valor medio de todos los análisis del inmunoensayo por cada muestra se compararon con los resultados de la CLAP para esas muestras por análisis de regresión.

Tabla 11. Comparación de los resultados analíticos obtenidos por inmunoensayo y por CLAP (continuación) .

Partes Por Millón de Tiametoxam Encontradas por Inmunoensayo CLAP Tipo de Semilla Muestra Réplica de los Análisis Medio 298301 3931 3625 4350 4083 4485 4095 3640 298302 4854 5058 4558 4286 5237 4798 4189 298303 3431 3587 3176 3835 4296 3665 3657 10 298304 5379 5428 4246 4084 3697 4567 3792 s, 298305 3107 4301 2881 4397 4692 3876 3859 Maíz de campo 298307 469 464 567 451 422 475 424 298308 409 384 409 422 386 402 389 15 1Las réplicas de los análisis (cinco) de cada muestra se condujeron por inmunoensayo. El valor medio de todos los análisis del inmunoensayo por cada muestra se compararon con los resultados de la CLAP para esas muestras por análisis de regresión.

Tabla 11. Comparación de los resultados analíticos obtenidos por inmunoensayo y por CLAP (continuación) .

Partes Por Millón de Tiametoxam Encontradas por Inmunoensayo CLAP Tipo de Semilla Muestra Réplica de los Análisis •"•Medio 298309 379 408 368 378 333 373 400 298310 428 395 493 417 552 367 373 298311 320 407 307 402 398 457 383 10 298312 3050 3656 2645 3622 3827 3360 3038 298313 4322 3694 2955 3397 3185 3511 3529 298314 3602 3347 3804 3055 3972 3556 3681 298315 3563 3301 3271 3445 4037 3523 3712 298316 4326 4903 5118 4590 4873 4762 3661 15 •"•Las réplicas de los análisis (cinco) de cada muestra se condujeron por inmunoensayo. El* valor medio de todos los análisis del inmunoensayo por cada muestra se compararon con los resultados de la CLAP para esas muestras por análisis de regresión.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un anticuerpo útil en un inmunoensayo de una muestra para determinar la cantidad de un insecticida neonicotinoide, caracterizado porque el anticuerpo (I) es un anticuerpo policlonal producido inmunizando un animal con un hapteno neonicotinoide conjugado con una proteína portadora inmunogénica, y (II) que se une específicamente al insecticida neonicotinoide . 2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es selectivo para un compuesto de la fórmula donde A es 2-cloropirid-5-ilo o 2-clorot?azol-5-ilo; R y R son independientemente hidrógeno o alquilo R1 y R2 son independientemente hidrógeno o alquilo de Cj.-C4 o R1 y R2 tomados junto con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos, forman un anillo de imidazolina u oxadiacina; y X es N-N02 o N-CN. 3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es selectivo de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de imidacloprid, nitenpiram, acetamiprid, tiametoxam, tiacloprid y cloriadin. Un compuesto de fórmula caracterizado porque A es 2-cloropirid-5-ilo o 2-clorotiazol-5-ilo; R3 es hidrógeno o alquilo de C?-C4; R1 y R2 son independientemente hidrógeno o alquilo de C?-C o R1 y R2 tomados junto con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos, forman un anillo de imidazolina u oxadiacina; N es un número entero de 1 a 4; y X es N-N02 o N-CN. 5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque tiene la fórmula 6. El compuesto de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque tiene la fórmula 7. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque tiene la fórmula O' 8. El compuesto de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque tiene la fórmula 9. un conjugado proteico de fórmula caracterizado porque A es 2-cloropirid-5-ilo o 2-clorotiazol-5-ilo; R es hidrógeno o alquilo de C?-C4; R1 y R2 son independientemente hidrógeno o alquilo de C?~C4 o R1 y R2 tomados junto con los átomos de nitrógeno a los cuales están unidos, forman un anillo de imidazolina u oxadiacina; N es un número entero de 1 a 4; X es N-N02 o N-CN; y PR es un residuo de proteína de una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de un derivado de proteína purificada (PPD, Tuberculina) del virus de la Diptheria, sero albúmina bovina, sero albúmina bovina cationizada, sero albúmina humana, ovalbúmina y hemocianina de lapa de bocallave; o un residuo enzimático seleccionado del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa. 10. El conjugado proteico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque tiene la fórmula 11. El conjugado proteico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque tiene la fórmula 12. Un método para determinar la concentración de un insecticida neonicotinoide en una muestra, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) proporcionar una fase sólida con un anticuerpo inmovilizado selectivo para el insecticida neonicotinoide; (b) poner en contacto la muestra con el anticuerpo inmovilizado en presencia de una cantidad conocida de un conjugado de hapteno de insecticida neonicotinoide-enzima; (c) lavar la fase sólida del paso (b) para remover cualquier conjugado o muestra de hapteno-no unido-enzima; (d) hacer reaccionar un sustrato cromogénico específico del conjugado de hapteno-enzima con la fase sólida lavada del paso (c) para generar un cromógeno; y (e) medir la cantidad de cromógeno producido por el paso (d) para determinar la cantidad de conjugado de anticuerpo-hapteno unido-enzima y en consecuencia la cantidad de insecticida neonicotinoide en la muestra. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la muestra se obtiene extrayendo un material de propagación de plantas en un solvente adecuado. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el material para la propagación de plantas es una semilla. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la semilla es seleccionada del grupo que consiste de cañóla, sorgo, trigo, algodón, maíz de campo o maíz dulce. 16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal producido inmunizando un animal con un insecticida neonicotinoide conjugado a una proteína portadora inmunogénica . 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la proteína portadora inmunogénica es una molécula seleccionada del grupo que consiste de un derivado de proteína purificado (PPD, Tuberculina), del virus de la Diptheria, sero albúmina bovina, sero albúmina bovina cationizada, sero albúmina humana, ovalbúmina y hemocianina de lapa de bocallave. 18. Un equipo útil para un inmunoensayo de una muestra para determinar la cantidad de un insecticida neonicotinoide, caracterizado porque el equipo comprende, en combinación con uno o más recipientes: (a) una fase sólida con un anticuerpo inmovilizado selectivo de un insecticida neonicotinoide; (b) un conjugado enzimático que comprende un conjugado enzimático para un hapteno neonicotinoide; 19. El equipo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo policlonal producido inmunizando un animal con un conjugado neonicotinoide a una proteína portadora inmunogénica. 20. El equipo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la enzima es peroxidasa de rábano. 21. El equipo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el anticuerpo se une específicamente a un insecticida neonicotinoide seleccionado del grupo que consiste de imidacloprid, nitenpiram, acetamiprid, tiametoxam, tiacloprid y cloriadin. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona inmunógenos para generar anticuerpos anti-neonicotinoide así como anticuerpos, métodos, reactivos y equipos para determinar la presencia de uno o más insecticidas y neonicotinoides en una muestra por inmunoensayo. La presente invención tiene aplicación particular en la determinación de la concentración de insecticidas neonicotinoides aplicados a materiales para la propagación de plantas tales como semillas, el anticuerpo selectivo para un compuesto de fórmula (I) , donde A es 2-cloropirid-5-ilo o 2-clorotiazol-5-ilo; R y R3 son independientemente hidrógeno o alquilo de C?-C ; R1 y R2 son independientemente hidrógeno o alquilo de C?-C o R1 y R2 son tomados juntos con los átomos de nitrógeno los cuales están unidos forman un anillo de imidazolina o una oxadiacina; y X es N-N02 o N-CN. También se reclama un compuesto de fórmula (IA) y un conjugado proteico de fórmula (II) en el cual PR es un residuo de proteína de una molécula portadora seleccionada del grupo que consiste de un derivado de proteína purificada (PPD, tuberculina) de virus de Diptheria , seroalbúmina bobina, seroalbúmina bobina cationizada, seroalbúmina humana, ovoalbúmina y hemocianina de lapa de bocallave; o un residuo de enzima seleccionado del grupo que consiste de fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa. 75