MXPA02003789A

MXPA02003789A - Particulas virales con epitopes internos exogenos.

Info

Publication number: MXPA02003789A
Application number: MXPA02003789A
Authority: MX
Inventors: Hellendoorn Koen
Original assignee: Dow Chemical Co
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2002-09-30
Also published as: AR026066A1; CA2387626A1; WO2001027282A1; AU1085201A; KR20020040868A; GB9924352D0; KR100880477B1; JP2003534771A; IL149077A0; CN101591647A; CN1471580A; AU785020B2; BR0014861A; CO5280142A1; CZ20021303A3; PL354933A1; WO2001027282A8; EP1235910A1; ZA200202815B

Abstract

La presente invencion se relaciona con la expresion de peptidos en particulas virales y mas particularmente con la expresion de peptidos en el interior del capsido viral. Se describen metodos para modificar los virus, de tal manera que los epitopes exogenos se expresen en el interior del capsido viral. Los virus que se pueden modificar incluyen virus de ARN de cadena (+), especialmente virus de ARN de cadena (+) de planta, tales como el virus de mosaico de caupi. La expresion interna es especialmente util para la expresion de epitopes hidrofobicos. Las particulas virales modificadas tambien encuentran uso como vacunas, y como tales son capaces de producir una respuesta inmune.

Description

PARTÍCULAS VIRALES CON EPÍTOPES INTERNOS EXÓGENOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la expresión de péptidos sobre las partículas virales, y de manera más particular, con la expresión de péptidos en la parte interna del cápsido viral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las vacunas son uno de los logros más grandes de la ciencia biomédica y la salud pública. Al inicio del siglo 20, las enfermedades infecciosas eran ampliamente prevalentes en los Estados Unidos de Norteamérica y exigían un tributo enorme sobre la población. Por ejemplo, en 1900, se reportaron 21 ,064 casos de viruela, y 894 pacientes murieron.

En 1920, se reportaron 469,924 casos de sarampión, y 7575 pacientes murieron; se reportaron 147,991 casos de difteria, y murieron 13, 170 pacientes. En 1922, se reportaron 107,473 casos de tosferina, y murieron 5099 pacientes. Estas enfermedades se han eliminado ampliamente en los Estados Unidos de Norteamérica. A pesar de este éxito, más de 5 millones de infantes mueren a nivel mundial cada año a causa de enfermedades que se pudieron haber evitado con las vacunas existentes. Sin embargo, muchas de las vacunas que existen actualmente se deben refrigerar, lo cual hace que su distribución en los países en desarrollo sea difícil. Además, no existen o no hay vacunas disponibles para las enfermedades que se asocian con promedios significativos de morbidez o mortalidad. Por ejemplo, más de 250 millones de personas están infectadas de manera crónica con el virus de la hepatitis B; la malaria provoca de 1 -2 millones de muertes al año; las enfermedades diarreicas (por ejemplo, las infecciones que causa el rotovirus, Schigella sp. , el Vibrio cholera, y la toxina que produce la E. coli), matan anualmente un estimado de 4-5 millones de personas. El Centro para el Control de las Enfermedades ha identificado diferentes factores para conseguir el potencial completo de las vacunas (www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/ 00056803.htm). Estas sugerencias incluyen la búsqueda de nuevos planteamientos para el envío y la administración de las vacunas. Un planteamiento nuevo es el desarrollo de vacunas que estimulan los dos tipos de respuestas inmunes: respuestas humorales mediadas por las células B y respuestas celulares mediadas por las células T auxiliares. Sin embargo, los intentos para crear vacunas que estimulen respuestas inmunes tanto humorales, como celulares, o que de preferencia induzcan una respuesta inmune celular, se han encontrado con dificultades. Por ejemplo, las vacunas de péptidos sintéticos y las vacunas de proteínas recombinantes frecuentemente son deficientemente inmunogénicas y tienden a inducir respuestas humorales y no a inducir respuestas inmunes celulares. Las vacunas de ADN pueden inducir las respuestas inmunes tanto humorales como celulares. Sin embargo, permanece la cuestión en cuanto a cuáles serán las consecuencias de la expresión del antígeno a largo plazo. De conformidad con lo anterior, lo que se necesita en la *-" •iipmg-j • - 3 - En particular, el mecanismo de administración deberá ser útil para inducir las respuestas inmunes tanto celulares, como humorales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 5 La presente invención se relaciona con la expresión de los péptidos sobre las partículas virales, y de manera más particular, con la expresión de los péptidos sobre la parte interna o el cápsido viral. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un compuesto que comprende una partícula viral quimérica que tiene un cápsido, en 10 donde el cápsido tiene un lado interno y un lado externo, el cápsido que comprende cuando menos un péptido exógeno en el lado interno del cápsido. En algunas modalidades preferidas, la partícula viral se puede ensamblar en una célula o tejido anfitrión. En algunas modalidades, la partícula viral tiene forma de icosaedro. En algunas modalidades 15 preferidas, la partícula viral es un comovirus. En algunas modalidades que se prefieren de manera particular, la partícula viral es el virus de mosaico de caupí. En algunas modalidades, el péptido exógeno se inserta en una proteína de capa de la partícula viral. En algunas modalidades preferidas, el péptido exógeno tiene de 5 a 20 aminoácidos. En otras 20 modalidades preferidas, el péptido exógeno se inserta en un punto de 5 a 20 aminoácidos a partir del término N de una proteína de capa, de manera que el ensamble de la partícula viral no se imposibilita en una célula anfitriona. En algunas modalidades que se prefieren de manera particular, el péptido exógeno se inserta en la VP-S del virus de mosaico de caupí, 25 entre un residuo de tirosina en la posición 1 1 , y un residuo de tirosina TFjí duplicado en la posición 12. En otras modalidades que se prefieren de manera particular, el péptido exógeno se inserta en la VP-S del virus de mosaico de caupí, entre un dipéptido que comprende un residuo de valina en la posición 10, y un residuo de tirosina en la posición 1 1 y un dipéptído duplicado que comprende un residuo de valina en la posición 12, y un residuo de tirosina en la posición 13. En todavía otras modalidades preferidas, el péptido exógeno se inserta en la VP-S del virus de mosaico de caupí, entre un residuo de valina en la posición 10, y un residuo de valina duplicado en la posición 1 1 . En modalidades adicionales, la partícula viral no contiene ácido nucleico. En otras modalidades, el péptido exógeno codifica un epítope que puede reconocer el sistema inmune del animal. En algunas modalidades preferidas, el epítope exógeno es un epítope de linfocito T citotóxico. En las modalidades que se prefieren de manera particular, el péptido exógeno contiene un epítope de linfocito T citotóxico con aminoácidos de flanqueo que se derivan a partir de una fuente que ocurre de manera natural del epítope. En algunas modalidades, el péptido exógeno es un epítope de célula auxiliar T. En algunas modalidades preferidas, el péptido exógeno contiene un epítope de célula auxiliar T con secuencias de aminoácidos de flanqueo que se derivan a partir de una fuente que ocurre de manera natural del epítope. En todavía otras modalidades, el péptido exógeno es un epítope de célula B. En modalidades adicionales, el péptido exógeno contiene un epítope de célula auxiliar T con secuencias de aminoácidos de flanqueo que se derivan a partir de una fuente que ocurre de manera natural del epítope.

En algunas modalidades, la partícula viral quimérica contiene un segundo péptido exógeno que se expresa en la superficie exterior del cápsido viral. En las modalidades preferidas, el segundo péptido exógeno se expresa en la superficie exterior del cápsido viral, en donde el péptido se inserta en el ciclo ßC'-ßC" de la VP-S del virus de mosaico de caupí. En otras modalidades preferidas, el segundo péptido exógeno se expresa sobre la superficie exterior del cápsido viral, en donde el péptido se inserta en el ciclo ßB-ßC de la VP-S del virus de mosaico de caupí. En todavía otras modalidades preferidas, el segundo péptido exógeno se expresa sobre la superficie externa del cápsido viral, en donde el péptido se inserta en el ciclo ßE-aB del VP-L del virus de mosaico de caupí. En otras modalidades, la presente invención proporciona una composición de vacuna que se caracteriza porque tiene una cantidad efectiva de una partícula viral que comprende un cápsido que tiene un lado interno y un lado externo, el cápsido que comprende cuando menos un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno está en el lado interno del cápsido. En todavía otras modalidades, la presente invención proporciona una formulación que comprende como un ingrediente activo, una partícula viral que comprende un cápsido que tiene un lado interno y un lado externo, y el cápsido que comprende cuando menos un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno está en el lado interno del cápsido y un adyuvante. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un compuesto que comprende una proteína de capa viral, en donde la proteína de capa viral incluye un péptido exógeno, la proteína de capa tíLM atea.

V /iilral se configura a modo de ensamblarse dentro de un cápsido viral que tiene un lado interno y un lado externo, en donde el péptido exógeno se expresa en el lado interno del cápsido viral. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona un proceso para preparar una partícula viral que comprende la provisión de una célula anfitriona y un ácido nucleico que codifica una partícula viral, la partícula viral que comprende: i) una proteína de capa viral, la proteína de capa viral que comprende un lado interno y un lado externo, y ii) un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno se inserta en el lado interno de la proteína de capa viral; transfectar la célula anfitriona con el ácido nucleico, de manera que se produzcan las partícula virales. En todavía otras modalidades, la presente invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un animal que requiere este tratamiento, cuyo método comprende la administración a un animal de una partícula viral que comprende un cápsido que tiene un lado interno y un lado externo, el cápsido que comprende cuando menos un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno está en el lado interno del cápsido. En todavía modalidades adicionales, la presente invención proporciona un producto que se puede obtener mediante el proceso que comprende la provisión de una célula anfitriona y el ácido nucleico que codifica una partícula viral, la partícula viral que comprende: i) una proteína de capa viral, la proteína de capa viral que comprende un lado interno y un lado externo, y ii) un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno se inserta en el lado interno de la proteína de capa viral; transfectar la célula anfitriona con el ácido nucleico, de manera que se produzcan las partículas virales. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un paquete comercial que comprende una partícula viral que comprende un cápsido que tiene un lado interno y un lado externo, el cápsido que comprende cuando menos un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno está en el lado interno del cápsido como un ingrediente activo, junto con las instrucciones para el uso del mismo. En otras modalidades, el presente compuesto comprende una partícula de virus quimérica que expresa un epítope interno, como se describe en la presente en cualesquiera de los ejemplos. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico que codifica una partícula viral, la partícula viral que comprende: i) una proteína de capa viral que comprende un lado interno y un lado externo, y ii) un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno se inserta en el lado interno de la proteína de capa viral. La presente invención no se limita a ningún tipo particular de vector. En realidad, se contempla una variedad de vectores, que incluyen, pero no se limitan, a los vectores de ARN (por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un virus de ARN de cadena (+)) o los vectores de ADN (por ejemplo, el ADN de plásmido que codifica un virus de ARN de cadena (+)).

De igual manera, la presente invención no se limita a ninguna partícula viral en particular. En realidad, se contempla una variedad de partículas virales, que incluye, pero no se limita a, partículas virales en forma de ^^ ^^ -y... . m~& * ,*** g¡H^^^^^^^ bastoncillos y partículas virales en forma de icosaedro. La presente invención no se limita a ningún virus de cadena (+) de planta en particular. En realidad, una variedad de virus de ARN de cadenas (+) de plantas encuentra un uso en la presente invención. En algunas modalidades preferidas, el virus de ARN de cadena (+) de planta, es un comovirus. En las modalidades que se prefieren de manera particular, el virus de ARN de cadena (+) de planta, es un virus de mosaico de caupí. En algunas modalidades, la proteína de capa se deriva a partir de un virus de ARN de cadena (+). La presente invención no se limita a las proteínas de capa a partir de ningún virus de ARN de cadena (+) particular. En realidad, se contemplan las proteínas de capa a partir de una variedad de virus de ARN de cadena (+). En algunas modalidades preferidas, la proteína de capa es a partir de un virus de ARN de cadena (+) de planta. La presente invención no se limita a la inserción del péptido exógeno en ningún lugar en particular. De hecho, se contempla la inserción en una variedad de ubicaciones. En algunas modalidades, la proteína de capa viral tiene un término N , y el péptido exógeno se inserta en una posición de desde 5 a 20 aminoácidos a partir del término N, de manera que no se imposibilita el ensamble de esa proteína de capa viral. En algunas modalidades preferidas, la proteína de capa viral es la VP-S del virus de mosaico de caupí y el péptido exógeno se inserta entre un residuo de tírosina en la posición 1 1 de la VP-S y un residuo de tirosina duplicado que se diseña en la posición 12 de la VP-S. En otras modalidades preferidas, la proteína de capa viral es la VP-S del virus de mosaico de caupí y el péptido exógeno se inserta entre un dipéptido que comprende un residuo de valina en la posición 10, y un residuo de tirosina en la posición 1 1 de la VP-S, y un dipéptido duplicado que comprende un residuo de valina que se diseña en la posición 12 y un residuo de tirosina que se diseña en la posición 13 de la VP-S. La presente invención no se limita a los péptidos exógenos de ningún tipo en particular. En realidad, se puede expresar una variedad de péptidos exógenos en los vectores de la presente invención. En algunas modalidades, el péptido exógeno es hidrofóbico. En otras modalidades, el péptido exógeno es un epítope de linfocito T citotóxico. En modalidades adicionales, el péptido exógeno es un epítope de célula T auxiliar. En todavía otras modalidades, el péptido exógeno es un epítope de célula B. La presente ¡nvención no se limita a los vectores que codifican solamente un solo péptido exógeno. De hecho, la presente invención contempla que se pueda expresar más de un péptido exógeno a partir de los vectores. En algunas modalidades, la proteína de capa viral comprende además un segundo péptido exógeno. En las modalidades preferidas, el segundo péptido exógeno se inserta en el lado externo de la proteína de capa viral. En algunas modalidades que se prefieren de manera particular, la proteína de capa viral es la VP-S que tiene un ciclo ßC'-ßC" y el segundo péptido exógeno se inserta en el ciclo ßC'-ßC". En otras modalidades preferidas, la proteína de capa viral es el VP-L que tiene un ciclo ßE-aB y el segundo péptido exógeno se inserta en este ciclo ßE-aB. Los vectores de la presente ¡nvención también incluyen otros componentes, tales como elementos reguladores. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica además un promotor que se enlaza de manera operable al ácido nucleico que codifica una partícula viral. La presente invención no se limita a ningún promotor en particular. En realidad, se contempla una variedad de promotores, que incluyen, pero no se limitan , a promotores de planta específicos de tejido y promotores de planta constitutivos. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos que comprenden proporcionar: i) el vector que se describió anteriormente y ii) células anfitrionas; y b) transfectar las células anfitrionas con el vector, para producir células anfitrionas transfectadas bajo condiciones tales que las células anfitrionas transfectadas expresen la partícula viral. La presente ¡nvención no se limita a la transfección de ninguna célula anfitriona en particular. En realidad, se contempla la transfección de una variedad de células anfitrionas, que incluyen, pero no se limitan, a células anfitrionas que se seleccionan a partir del grupo que consiste de células en planta, células de cultivo de tejido vegetal, protoplastos de planta, y las células en el tejido vegetal. En todavía otras modalidades, la presente invención incluye las células anfitrionas que se producen mediante estos métodos. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos que comprenden: proporcionar una planta transfectada con el vector que se describió anteriormente y cultivar la planta bajo condiciones tales que se produzca la partícula viral. En algunas modalidades preferidas, los métodos comprenden además el paso de purificar las partículas virales a partir de la planta.

En modalidades adicionales, la presente invención proporciona las composiciones que comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína de capa viral, que comprende un péptido exógeno, la proteína de capa viral se configura a modo de ensamblarse dentro de un cápsido viral que tiene un lado interno y un lado externo, en donde el péptido exógeno se expresa en el lado interno del cápsido viral. La presente invención no se limita a ningún tipo particular de ácido nucleico. En realidad, se contempla una variedad de ácidos nucleicos, que incluyen, pero no se limitan, al ARN (por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un virus de ARN de cadena (+)) o ADN (por ejemplo, ADN de plásmido que codifica un virus de ARN de cadena (+)). De igual manera, la presente invención no se limita a ninguna partícula viral en particular. En realidad, se contempla una variedad de partículas virales, que incluyen, pero no se limitan, a partículas virales en forma de bastoncillos y partículas virales en forma de icosaedro. La presente ¡nvención no se limita a ningún virus de cadena (+) de planta en particular. De hecho, una variedad de virus de ARN de cadena (+) de plantas encuentran uso en la presente ¡nvención. En algunas modalidades preferidas, el virus de ARN de cadena (+) de planta, es un comovirus. En las modalidades que se prefieren particularmente, el virus de ARN de cadena (+) de planta, es un virus de mosaico de caupí. En algunas modalidades, la proteína de capa viral se deriva a partir de un virus de ARN de cadena (+). La presente ¡nvención no se limita a las proteínas de capa a partir de ningún virus de ARN de cadena (+) en particular. De hecho, se contemplan las proteínas de capa a partir de una variedad de virus de ARN de cadena (+). En algunas modalidades preferidas, la proteína de capa es a partir de un virus de ARN de cadena (+) de planta. La presente ¡nvención no se limita a la inserción del péptido exógeno en ningún lugar en particular. De hecho, se contempla la inserción en una variedad de ubicaciones. En algunas modalidades, la proteína de capa viral tiene un término N , y el péptido exógeno se inserta en una posición de desde 5 a 20 aminoácidos a partir del término N, de manera que no se imposibilita el ensamble de esa proteína de capa viral. En algunas modalidades preferidas, la proteína de capa viral es la VP-S del virus de mosaico de caupí y el péptido exógeno se inserta entre un residuo de tirosina en la posición 1 1 de la VP-S y un residuo de tirosina duplicado que se diseña en la posición 12 de la VP-S. En otras modalidades preferidas, la proteína de capa viral es la VP-S del virus de mosaico de caupí y el péptido exógeno se inserta entre un dipéptido que comprende un residuo de valina en la posición 10, y un residuo de tirosina en la posición 1 1 de la VP-S, y un dipéptido duplicado que comprende un residuo de valina que se diseña en la posición 12 y un residuo de tirosina que se diseña en la posición 13 de la VP-S. La presente invención no se limita a los péptidos exógenos de ningún tipo en particular. De hecho, una variedad de péptidos exógenos se puede expresar en los vectores de la presente ¡nvención. En algunas modalidades, el péptido exógeno es hidrofóbico. En otras modalidades, el péptido exógeno es un epítope de célula T auxiliar. En todavía otras modalidades, el péptido exógeno es un epítope de célula B. La presente invención no se limita a los ácidos nucleicos que codifican solamente un solo péptido exógeno. De hecho, la presente invención contempla que se pueda expresar más de un péptido exógeno por parte de los ácidos nucleicos. En algunas modalidades, la proteína de capa viral comprende además un segundo péptido exógeno. En las modalidades preferidas, el segundo péptido exógeno se inserta en el lado externo de la proteína de capa viral. En algunas modalidades que se prefieren de manera particular, la proteína de capa viral es la VP-S que tiene un ciclo ßC'-ßC" y el segundo péptido exógeno se inserta en el ciclo ßC'-ßC". En otras modalidades preferidas, la proteína de capa viral es el VP-L que tiene un ciclo ßE-aB y el segundo péptido exógeno se inserta en este ciclo ßE-aB. Los ácidos nucleicos de la presente invención también incluyen otros componentes, tales como elementos reguladores. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica además un promotor que se enlaza de manera operable al ácido nucleico que codifica una partícula viral. La presente invención no se limita a ningún promotor en particular. En realidad, se contempla una variedad de promotores, que incluyen, pero no se limitan, a promotores de planta específicos de tejido y promotores de planta constitutivos. En todavía modalidades adicionales, la presente invención proporciona partículas virales que comprenden un cápsido que tiene un lado interno y un lado externo, el cápsido que comprende cuando menos un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno está en el lado interno del cápsido. La presente invención no se limita a ninguna partícula viral en particular. En realidad, como se describió anteriormente, la presente invención abarca una variedad amplia de partículas virales. En algunas modalidades, la presente invención proporciona una planta que expresa las partículas virales. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona partículas virales de fruta, hojas, tubérculos, tallos o purificadas, que se aislan de la planta. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para inducir una respuesta inmune que comprende proporcionar i) partículas virales (que se describieron anteriormente) que comprenden una pluralidad de proteínas de capa que tienen un lado interno y un lado externo, las proteínas de capa que comprenden un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno está en el lado interno de las proteínas de capa; y ii)un sujeto; y b) exponer al sujeto a la partícula viral bajo condiciones tales que el sujeto desarrolle una respuesta inmune al péptido exógeno. En algunas modalidades preferidas, las partículas virales se proporcionan a partir de una fuente vegetal. En todavía modalidades adicionales, la presente invención proporciona vectores que comprenden el ácido nucleico que codifica una secuencia de proteína de capa viral que tiene insertada en la misma, una secuencia de péptidos exógenos, la proteína de capa viral que comprende una segunda mutación de sitio, de manera que la proteína de capa viral pueda ensamblarse dentro de un cápsido viral. La presente ¡nvención no se limita a ninguna segunda mutación de sitio en particular. En realidad, se contempla una variedad de segundas mutaciones de sitio, que incluyen, pero no se limita, a segundas mutaciones de sitio tanto en la VP-S como el VP-L del virus de mosaico de caupí. En las modalidades que se prefieren i. A^fie^-..»... »m. t-*>-j»-M aBÍÉhiÍ*,- MiilM fc?ijÍM¡?l r de manera particular, la segunda mutación de sitio se selecciona a partir del grupo que consiste de F91 S en VP-S, F180L en VP-S, M177V en VP-S, I 124V en VP-S, R2102K en VP-L, I2045 en VP-L, M177T en VP-S, A2092T en VP-L, G80D en VP-S. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para inducir las segundas mutaciones de sitio en una proteína de capa viral que comprende proporcionar i) un vector que comprende el ácido nucleico que codifica una partícula viral, la partícula viral que comprende una proteína de capa viral, la proteína de capa viral que comprende un lado interno y un lado externo, y ii) un péptido extraño, en donde el péptido extraño se inserta en el lado interno de la proteína de capa viral y ii) una primera planta anfitriona; infectar la primera planta anfitriona con el vector, de manera que se exprese la partícula viral; monitorear la primera planta anfitriona hasta que aparezcan las lesiones tardías en las hojas que se infectaron directamente; aislar las partículas vírales a partir de las lesiones tardías, para proporcionar partículas virales aisladas; e inocular una segunda planta anfitriona para obtener una infección secundaria. En algunas modalidades, los métodos comprenden además el paso de monitorear la segunda planta anfitriona por la aparición de síntomas sistémicos. En algunas modalidades preferidas, los síntomas sistémicos aparecen en un marco de tiempo que se puede comparar con aquel de la planta infectada con las partículas virales de control. En otras modalidades, los métodos comprenden además los pasos del Método de la Reivindicación 84, que comprende adicionalmente los pasos de aislar las partículas virales a partir de las lesiones sistémicas, las partículas virales que comprenden un genoma; y secuenciar el genoma de las partículas virales. En algunas modalidades, la presente invención proporciona las partículas virales que produce el método. En algunas modalidades, la presente invención proporciona una composición de vacuna que comprende una partícula viral que comprende un cápsido que tiene un lado interno y un lado externo, el cápsido que comprende cuando menos un péptido exógeno, en donde el péptido exógeno está en el lado interno del cápsido. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona métodos para inducir una respuesta inmune humoral, la cual comprende la administración a un animal de la composición de vacuna. En todavía otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para mejorar una respuesta inmune a un epítope de célula B que comprende proporcionar i) una partícula viral modificada que comprende un epítope de célula B y un epítope de CTL interno en un complejo inmunogénico; y ii) un animal; y administrar la partícula viral modificada al animal. La presente invención no se limita a un epítope de CTL en particular. De hecho, se contempla una variedad de epítopes de CTL que incluyen, pero no se limitan, a un mimótopo de péptido 2F10 de la clase "a" determinante del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. La presente invención también proporciona métodos para mejorar una respuesta inmune a una epítope de célula B que comprende proporcionar i) una partícula viral modificada que comprende un epítope de célula B y un epítope de CTL interno en un complejo antigénico; y un animal; y b) administrar la partícula viral modificada al animal. La presente invención no se limita a un epítope de CTL en particular. En realidad, se contempla una variedad de epítopes de CTL que incluyen, pero no se limitan, a un mimótopo de péptido 2F10 de la clase "a" determinante del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para mejorar una respuesta inmune a un epítope de célula B que comprende proporcionar i) una partícula viral modificada que comprende un epítope de célula B y un epítope de célula T auxiliar en un complejo inmunogénico; y ii) un animal; y administrar la partícula viral modificada al animal. La presente invención no se limita a un epítope de célula T en particular. En realidad, se contempla una variedad de epítopes de célula T que incluyen, pero no se limitan, al epítope de la auxiliar T universal del toxoide del tétanos. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona métodos para mejorar una respuesta inmune a un epítope de célula B que comprende proporcionar i) una partícula viral modificada que comprende un epítope de célula B y un epítope de célula T auxiliar en un complejo antigénico; y ¡i) un animal; y administrar la partícula viral modificada al animal. La presente invención no se limita a ningún epítope de célula T en particular. En realidad, se contempla una variedad de epítopes de célula T que incluyen, pero no se limitan, al epítope de la auxiliar T universal del toxoide del tétanos. - l í BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la secuencia del término N de la proteína VP-S del CPMV e ilustra en dónde se pueden insertar los péptidos extraños. La Figura 2 muestra los resultados de un ensayo CTL para ratones que se vacunaron con las partículas de virus quiméricas, de conformidad con una modalidad de la ¡nvención (ver Ejemplo 6); la liberación de cromo a partir de las células objetivo que se cargaron con el péptido objetivo derivado del LCMV o se miden las células sin cargar usando una estación de trabajo BetaMax. La Figura 3 muestra un mapa de restricción del vector pCP26 que se usa en la mayoría de las construcciones genéticas que se describen.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la expresión de péptidos sobre las partículas virales, y de manera más particular, a la expresión de los péptidos en la parte interna del cápsido viral. El uso de partículas virales quiméricas (CVP's, por sus siglas en inglés) como vacunas, representa una estrategia atractiva para mejorar el almacenamiento y entrega de las vacunas. En las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,874,087 y 5,958,422 (cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia), se describe el uso de las CVPs. Estas patentes describen el desarrollo de los vectores que codifican los genomas del Virus de Mosaico de Caupí (CPMV) modificados que contienen los insertos de los péptidos en la proteína de capa. Los vectores son útiles para la producción de partículas virales en las cuales se presenta el péptido sobre la superficie de la partícula viral. Después de las definiciones, se describen los sistemas de expresión de partículas virales, los insertos de los péptidos y los sitios para la inserción, y los usos para las partículas virales modificadas.

DEFINICIONES Para facilitar el entendimiento de la invención, más adelante se define un número de términos. El término "partícula viral" como se usa en la presente, se refiere al cápsido de un virus completa o parcialmente ensamblado. Una partícula viral puede o no puede contener ácido nucleico. El término "cápsido viral" como se usa en la presente, se refiere a una capa de proteína que rodea el ácido nucleico viral en un virus de tipo silvestre. Los cápsidos virales tienen superficies internas y superficies externas. La superficie interna de una cápsido viral, es la superficie que se expone normalmente al ácido nucleico viral. La superficie externa de una cápsido viral, es la superficie que se expone generalmente al medió ambiente. El término "proteína de capa viral" como se usa en la presente, se refiere a una proteína que interactúa con otras proteínas para ensamblar y formar parte del cápsido viral. Los ejemplos de proteínas de capa viral incluyen, pero no se limitan, a las proteínas de capa VP-S y VP- L del virus de mosaico de caupí. El lado interno de una proteína de capa viral, es la porción de la proteína de capa que se expone sobre la superficie interna del cápsido viral. El lado externo de una proteína de capa viral, es la porción de la proteína de capa que se expone sobre la superficie externa del cápsido viral. El término "virus de ARN en cadena (+)" como se usa en la presente, se refiere a un virus que tiene un genoma de ARN , en donde el ARN aislado es directamente infeccioso cuando se introduce a un anfitrión apropiado. Se sabe que los virus de ARN de cadena (+) infectan una variedad de anfitriones animales, fungosos, y vegetales. Los ejemplos de virus de ARN de cadena (+) incluyen, pero no se limitan, a los Picornovirus (por ejemplo, el poliovirus), y virus a partir de las siguientes familias: Caulimoviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Geminiviridae, Reoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae, Tobamovirus, y Tombusvirídae. El término "síntomas", cuando se usa con referencia a la infección de virus vegetal, se refiere a la aparición de indicadores de la infección viral en la planta. Estos indican tanto las lesiones locales, como los síntomas sistémicos. Las lesiones locales, tales como las lesiones necróticas, lesiones cloróticas, y manchas de anillo, ocurren en o cerca del sitio de la infección. Los síntomas sistémicos aparecen a través de toda la planta e incluyen patrones de mosaico, patrones moteados, enanismo, amarillamiento y necrosis. El término "infección sistémica" como se usa en la presente, se refiere a las infecciones virales que se extienden desde el sitio de la infección inicial. En las plantas, la infección sistémica ocurre cuando los virus se mueven desde las células infectadas dentro de la vasculatura (por ejemplo, el floema) de la planta. En muchos virus, este movimiento se media mediante una proteína de movimiento que modifica la plasmadesmata. El término "icosaedro", cuando se usa con referencia al cápsido viral o la partícula viral, se refiere a un cápsido que exhibe la simetría en icosaedro general: simetría giratoria en 5 partes a través de cada uno de los 12 vértices, simetría giratoria en 3 partes alrededor de un eje a través del centro de cada uno de las 20 caras triangulares, y simetría giratoria en 3 partes alrededor de un eje a través del centro de cada uno de las treinta orillas. Los icosaedros están conformados de 60 unidades de construcción idénticas (las cuales pueden comprender más de una subunidad) o múltiples de 60 unidades de construcción idénticas. Los contactos de la interunidad no son precisamente idénticos a través de todo el cápsido; sin embargo, toda la unión de la interunidad incluye el mismo tipo general de contacto, de manera que los enlaces de la interunidad se puedan describir como casi equivalentes. Se contempla que algunos virus en icosaedro, especialmente virus en icosaedro grandes (por ejemplo, los adenovirus), se pueden desviar desde los criterios estructurales y geométricos que observaron los virus en icosaedro más pequeños. Los ejemplos de virus en icosaedro incluyen, pero no se limitan, a los poliovirus, adenovirus, y virus a partir de las siguientes familias: Caulimovirídae, Bromoviridae, Comoviridae, Geminiviridae, Reoviridae, Partitiviridae, Sequiviridae, y Tombusviridae. El término "epítope" como se usa en la presente, se refiere a un determinante antigénico, el cual está en cualquier región de una macromolécula con la capacidad o el potencial para producir, y combinarse con, el anticuerpo específico (esto es, que puede fijarse a una inmunoglobulina o receptor de célula T específico). El término "hidrofóbico", cuando se usa con referencia a un péptido o epítope, se refiere a un péptido o epítope que tiene aproximadamente el 20 por ciento o más de residuos de aminoácidos hidrofóbicos (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano, y metionina). El término "epítope de linfocito T citotóxico" como se usa en la presente, se refiere a un epítope que se puede reconocer mediante un linfocito T citotóxico. El término "epítope de célula T auxiliar" como se usa en la presente, se refiere a un epítope que se puede reconocer mediante una célula T auxiliar. El término "epítope de célula B" como se usa en la presente, se refiere a un epítope que se puede reconocer mediante una célula B. El término "respuesta inmune" como se usa en la presente, se refiere a la reacción de un animal, mediada por el sistema inmune, a un antígeno o inmunógeno y se puede caracterizar por la producción de anticuerpos y/o la estimulación de la tolerancia mediada por célula o inmune. El término "complejo antigénico" como se usa en la presente, se refiere al complejo que contiene cuando menos un epítope que se puede combinar con una inmunoglobulina o receptor superficial de la célula. ?ti¡á?Í?áJi»itÉt*?. t , ¡. .-. 1JAla^ ...L t a.AM. ^a.1-^. - -* »..........

El término "complejo inmune" como se usa en la presente, se refiere a un péptido es suficientemente similar de manera estructural a un epítope, para inducir una reacción inmune en contra de ese epítope, aun cuando las dos secuencias no compartan ninguna homología ni similitud al nivel de los aminoácidos (en el caso de un mimótopo de péptido), o, en el caso en donde el mimótopo represente una configuración estructural que adopte una molécula no proteínica, tal como un carbohidrato, el mimótopo puede reaccionar con las moléculas inmunes que se dirigen en contra del epítope no proteínico. Como se usa en la presente, el término "¡nmunoglobulina" se refiere al producto secretado de la célula de plasma (por ejemplo, la célula B activada), que comprende dos polipéptidos de cadena pesada que se acomplejan con dos polipéptidos de cadena ligera, los cuales hacen juntos un sitio de fijación para las proteínas. Como se usa en la presente, el término "proteínas del grupo I de histocompatibilidad mayor de Clase I MHC" se refiere a las proteínas codificadas por los genes del grupo de histocompatibilidad mayor y los cuales están implicados en la presentación efectiva de los antígenos sobre los linfocitos T CD8+. Como se usa en la presente, el término "proteínas del grupo II de histocompatibilidad mayor de Clase II MHC" se refiere a las proteínas codificadas por los genes del grupo de histocompatibilidad mayor y los cuales están implicados en la presentación efectiva de los antígenos sobre los linfocitos T CD4+. El término "planta" como se usa en la presente, se refiere a una pluralidad de células vegetales, las cuales se diferencian grandemente en una estructura que está presente en cualquier etapa del desarrollo de una planta. Estas estructuras incluyen, pero no se limitan, a una fruta, retoño, tallo, hoja, pétalo de flor, etcétera. El término "tejido vegetal" incluye los tejidos diferenciados y no diferenciados de las plantas que incluyen, pero no se limitan, a raíces, retoños, hojas, polen, semillas, tejido de tumor y diferentes tipos de células en cultivo (por ejemplo, células únicas, protoplastos, embriones, callo, etcétera). El tejido vegetal puede estar in planta, en cultivo orgánico, cultivo de tejido, o cultivo celular. El término "protoplasto" como se usa en la presente, se refiere a las células vegetales aisladas en las cuales se han removido las paredes celulares. En general, los protoplastos se producen de conformidad con los métodos convencionales (Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,743,548; 4,677,066; 5, 149,645 y 5, 508, 184; todas las cuales se incorporan a la presente como referencia). El tejido vegetal se puede dispersar en un medió apropiado que tenga un potencial osmótico apropiado (por ejemplo, 3 a 8 por ciento en peso de un poliol de azúcar) y una o más hidrolasas de polisacárido (por ejemplo, pectinasa, celulasa, etcétera), y la degradación de la pared celular permitió que se procediera durante un tiempo suficiente, para proporcionar los protoplastos. Después de la filtración, se pueden aislar los protoplastos mediante centrifugación y se pueden volver a suspender después para el tratamiento o uso subsecuente. La regeneración de los protoplastos que se mantienen en cultivo para las plantas completas, se realiza mediante los métodos que se conocen en la técnica (Ver, por ejemplo, Evans y colaboradores, Handbook of Plant Cell Culture, 1 : 124- 176, MacMillan Publishing Co, New York

[1983]; Binding, Plant Protoplasts, p.21 -37, CRC Press, Boca Ratón

[1985] y Potrykus y Shillito, Methods in Enzymology, volumen 1 18, Plant Molecular Biology, A. y H. Weissbach eds. , Academic Press, orlando

[1986]. El término "gen" como se usa en la presente, se refiere a una secuencia de ADN que comprende el control y las secuencias de codificación necesarias para la producción de un polipéptido o precursor de proteína. El polipéptido se puede codificar mediante una secuencia de codificación de longitud completa o mediante cualquier porción de la secuencia de codificación, siempre que se retenga la actividad de la proteína deseada. "Nucleósido", como se usa en la presente, se refiere a un compuesto que consiste de una base de purina [guanina (G) o adenina (A)] o pirimidina [timina (T), uridina (U), o citidina (C)] que se enlaza de manera covalente a una pentosa, mientras que "nucleótido" se refiere a un nucleótido fosforilado en uno de sus grupos de hidroxilo de pentosa. Un "ácido nucleico" como se usa en la presente, es una secuencia de nucleótidos que se enlaza de manera covalente en la posición 3' de la pentosa de un nucleótido que se une por un grupo de fofodiéster a la posición 5' de la pentosa de la siguiente, y en la cual los residuos del nucleótido (bases) se enlazan en la secuencia específica; esto es, un orden lineal de nucleótidos. Un "polinucleótido", como se usa en la presente, es un ácido nucleico que contiene una secuencia que es mayor de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud. Un oligonucleótido, como se usa en la presente es un polinucleótido corto o una porción de un polinucleótido. Un oligonucleótido típicamente contiene una secuencia de aproximadamente dos a aproximadamente cíen bases. La palabra "oligo" se usa algunas veces en lugar de la palabra "oligonucleótido". Se dice que las moléculas de ácido nucleico tienen un "término 5'" (extremo 5') y un "término 3'" (extremo 3'), porque los enlaces del fosfodiéster del ácido nucleico ocurren en el carbono 5' y el carbono 3' del anillo de pentosa de los mononucleótidos sustitutos. El extremo de un ácido nucleico en el cual el enlace nuevo sería con el carbono 5', es su nucleótido de terminal 5'. El extremo de un ácido nucleico en el cual el enlace nuevo sería con el carbono 3', es nucleótido de terminal 3'. Un nucleótido de terminal, como se usa en la presente, es el nucleótido en la posición extrema del término 3'- o 5'-. Se dice que las moléculas de ADN tienen "extremos 5'" y "extremos 3'", debido a que los mononucleótidos se hacen reaccionar para hacer oligonucleótidos de una manera tal que el fosfato 5' de un anillo de pentosa del mononucleótido se une al oxígeno 3' de su vecino en una dirección, por medió de un enlace de fosfodiéster. Por lo tanto, se hace referencia a un extremo de un oligonucleótido como el "extremo 5'" si su fosfato 5' no está enlazado al oxígeno 3' de un anillo de pentosa del mononucleótido, y como el "extremo 3'" si su oxígeno 3' no está enlazado a un fosfato 5' de un anillo de pentosa del mononucleótido subsecuente. Como se usa en la presente, también se puede decir que una . ,.?I ,-JJ^a,.J»^.A.^¡H ia¡ J„ssa?^.i.- .. secuencia de ácidos nucleicos, aún si son internos a un oligonucleótido o polinucleótido más largo, tiene extremos 5' y 3'. En una molécula de ADN ya sea lineal o circular, se hace referencia a los elementos discretos como estando "corriente arriba", o 5' de la "corriente abajo" o elementos de 3'. Esta terminología refleja el hecho de que la transcripción procede de una manera 5' a 3' a lo largo de la cadena de ADN . Típicamente, los elementos promotores y mejoradores que dirigen la transcripción de un gen enlazado, se localizan generalmente en 5' o corriente arriba de la región de codificación. Sin embargo, los elementos mejoradores pueden ejercer su efecto aún cuando se localizan en 3' del elemento promotor y la región de codificación. La terminación de la transcripción y las señales de poliadenilación se localizan en 3' o corriente abajo de la región de codificación. El término "tipo silvestre", cuando se hace con relación a un gen, se refiere a un gen que tiene las características de un gen que se aisla a partir de una fuente que ocurre de manera natural. El término "tipo silvestre", cuando se hace con relación a un producto del gen, se refiere a un producto del gen que tiene la característica de un producto del gen que se aisla a partir de una fuente que ocurre de manera natural. Un gen de tipo silvestre es aquel que se observa de manera más frecuente en una población y por lo tanto se designa arbitrariamente como la forma "normal" o de "tipo silvestre" del gen. En contraste, el término "modificado" o "mutante" cuando se hace con referencia a un gen o a un producto del gen se refiere, respectivamente, a un gen o producto de gen que despliega modificaciones en secuencia y/o propiedades funcionales (esto es, ! . ??? *'k * , características alteradas) cuando se comparan con el gen o el producto del gen de tipo silvestre. Se nota que los mutantes que ocurren de manera natural se pueden aislar; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas cuando se comparan con el gen o producto del gen de tipo silvestre. Como se usa en la presente, el término "sobre expresión" se refiere a la producción de un producto del gen en organismos transgénicos, que excede los niveles de producción en los organismos normales o sin transformar. Como se usa en la presente, el término "cosupresión" se refiere a la expresión de un gen extranjero que tiene homología substancial con un gen endógeno que resulta en la supresión de la expresión tanto del gen extraño, como del endógeno. Como se usa en la presente, el término "niveles alterados" se refiere a la producción de producto(s) del gen en los organismos transgénicos, en cantidades o proporciones que difieren de aquellas de los organismos normales o sin transformar. El término "recombinante", cuando se hace con relación a una molécula de ADN, se refiere a una molécula de ADN que está compuesta de segmentos de ADN unidos juntos por medió de técnicas biológicas moleculares. El término "recombinante", cuando se hace con relación a un proteína o un polipéptido, se refiere a una molécula de proteína que se expresa usando una molécula de ADN recombinante. El término "secuencia nucleótida de interés", se refiere a cualquier secuencia nucleótida, la manipulación de la cual pudiera juzgarse deseable por cualquier razón (por ejemplo, conferir cualidades mejoradas), por alguien experto en la técnica. Estas secuencias nucleótidas incluyen, pero no se limitan, a las secuencias de codificación de genes estructurales (por ejemplo, genes reporteros, genes marcadores de selección, oncogenes, genes resistentes a los fármacos, factores de crecimiento, etcétera), y secuencias reguladoras de no codificación, las cuales no codifican un ARNm ni producto de proteína (por ejemplo, secuencia promotora, secuencia de poliadenilación, secuencia de terminación, secuencia mejoradora, etcétera). Como se usa en la presente, el término "región de codificación", cuando se usa con relación al gen estructural, se refiere a las secuencias nucleótidas que codifican los aminoácidos que se encuentran en el polipéptido naciente, como un resultado de la traslación de una molécula de ARNm. Típicamente, la región de codificación se fija en el lado 5' mediante la terna nucleótida "ATG", la cual codifica la metionina iniciadora y en el lado 3' mediante un codon de detención (por ejemplo, TAA, TAG, TGA) . En algunos casos, también se sabe que la región de codificación inicia mediante una terna nucleótida "TTG". Como se usa en la presente, los términos "complementario" o "complementaridad", cuando se usan con relación a los polinucleótidos, se refieren a los polinucleótidos que se relacionan mediante las reglas de pareo de bases. Por ejemplo, la secuencia 5'-AGT-3' es complementaria para la secuencia 5'-ACT-3'. La complementaridad puede ser "parcial", en la cual solamente algunas bases de los ácidos nucleicos se hacen coincidir, de conformidad con las reglas de pareo de bases. O, puede haber complementaridad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos.

El grado de complementaridad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y resistencia de la hibridización entre las cadenas de ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como los métodos de detección que dependen de la fijación entre los ácidos nucleicos. Un "complemento" de una secuencia de ácidos nucleicos, como se usa en la presente, se refiere a una secuencia nucleótida cuyos ácidos nucleicos muestran una complementaridad total para los ácidos nucleicos de la secuencia de ácidos nucleicos. El término "homología", cuando se usa con relación a los ácidos nucleicos, se refiere a un grado de complementaridad. Puede haber homología parcial u homología completa (esto es, identidad). "Identidad de secuencia" se refiere a una medida de correspondencia entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas, y se da como un porcentaje con referencia a la longitud de comparación total. El cálculo de identidad toma en cuenta aquellos residuos nucleótidos o de aminoácidos que son idénticos y en las mismas posiciones relativas en sus secuencias más largas respectivas. Los cálculos de identidad se pueden realizar mediante los algoritmos contenidos dentro de programas de computadora, tales como "GAP" (Genetics Computer Group, Madison, Wis) y "ALIGN" (DNAStar, Madison, Wis.). Una secuencia parcialmente complementaria es una que cuando menos parcialmente inhibe (o compite con) una secuencia completamente complementaria de hibridizarse a un ácido nucleico objetivo y se hace referencia a ella usando el término funcional i .*.A*mHtaM[t¡||i na [ .,ji»»a. ,¿^_ ... fc ... i*. ?tí¡¡¿.V?tíff**m*«?jBtíJÍ . "sustancialmente homologa". La ¡nhibición de la hibridización de la secuencia completamente complementaria con la secuencia objetivo se puede examinar usando un ensayo de hibridización (mancha Southern o Northern, hibridización de solución y similares), bajo condiciones de estringencia baja. Una secuencia o sonda sustancialmente homologa competirá por, e inhibirá la fijación (esto es, la hibridización) de una secuencia que es completamente homologa con un objetivo, bajo condiciones de estringencia baja. Esto no quiere decir que las condiciones de estringencia baja sean tales como para que se permita la fijación no específica; las condiciones de estringencia baja requieren que la fijación de dos secuencias una con la otra, sea una interacción específica (esto es, selectiva). Se puede probar la ausencia de fijación no específica mediante el uso de un segundo objetivo, el cual carece hasta de un grado parcial de complementaridad (por ejemplo, menos de aproximadamente 30 por ciento de identidad); en la ausencia de fijación no específica, la sonda no se hibridizará con el segundo objetivo no complementario. Cuando se usa con referencia a una secuencia de ácido nucleico de doble cadena, tal como un ADNc o clon genómico, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a cualquier sonda que se pueda hibridizar con cualesquiera o con ambas cadenas de la secuencia de ácido nucleico de doble cadena, bajo condiciones de estringencia baja como se describió infra. Las condiciones de estringencia baja, cuando se usan con referencia la hibridización del ácido nucleico, comprenden condiciones equivalentes a la fijación o hibridizacíón a 42°C en una solución que consiste de 5X SSPE (43.8 g/l NaCI, 6.9 g/l NaH2PO4 »H2O y 1.85 g/l EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH), SDS al 0.1 por ciento, 5X reactivo de Denhardt [50X de Denhardt contiene por 500 ml: 5 g Ficoll (Tipo 400, Pharmacia), 5 g BSA (Fraction V; Sigma)] y 100 µg/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por lavado en una solución que comprende 5X SSPE, SDS al 0.1 por ciento a 42°C cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Las condiciones de estringencia elevada, cuando se usan con referencia la hibridización del ácido nucleico, comprenden condiciones equivalentes a la fijación o hibridización a 42°C en una solución que consiste de 5X SSPE (43.8 g/l NaCI, 6.9 g/l NaH2PO4«H2O y 1.85 g/l EDTA, pH ajustado a 7.4 con NaOH), SDS al 0.5 por ciento, 5X reactivo de Denhardt y 100 µg/ml ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguido por lavado en una solución que comprende 0.1X SSPE, SDS al 1.0 por ciento a 42°C cuando se emplea una sonda de aproximadamente 500 nucleótidos de longitud. Cuando se usa con referencia a la hibridización del ácido nucleico, la técnica sabe bien que se pueden emplear numerosas condiciones equivalentes para comprender condiciones de estringencia ya sea bajas o elevadas; se consideran factores tales como la longitud y la naturaleza (ADN , ARN, composición base) de la sonda y la naturaleza del objetivo (ADN, ARN, composición base, presentes en la solución o inmobilizada, etcétera) y la concentración de las sales y otros componentes (por ejemplo, la presencia o ausencia de formamida, sulfato jlh¿ ntAA..?atoá.. m* JümAie-* • ^^^ "-•^k.^,,^,^,.^.^..^.^^ de dextrano, glicol polietileno), y se puede variar la solución de hibridización para generar condiciones de hibridización de estringencia ya sea baja o elevada, diferentes de, pero equivalentes a, las condiciones que se alistan anteriormente. La "estringencia", cuando se usa con referencia a la hibridización del ácido nucleico, típicamente ocurre en un rango de desde aproximadamente Tm-5°C (5°C por debajo del Tm de la sonda) hasta aproximadamente 20°C a 25°C por debajo de Tm. Como entenderán aquellos expertos en la técnica, se puede usar la hibridización estringente para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos idénticas o para identificar o detectar secuencias de polinucleótidos similares o relacionadas. Bajo "condiciones estringentes", una secuencia de ácido nucleico de interés se hibridizará con su complemento exacto y las secuencias que se relacionan de manera estrecha. Se dice que las moléculas de polipéptidos tienen un "término amino" (término N) y un "término carboxi" (término C), debido a que los enlaces del péptido ocurren entre el grupo amino de estructura base de un primer residuo de aminoácido y el grupo carboxilo de estructura base de un segundo residuo de aminoácido. Típicamente, el término de un polipéptido en el cual el enlace nuevo sería con el término carboxi de la cadena de polipéptido en crecimiento, y las secuencias de polipéptido, se escriben de izquierda a derecha empezando con el término amino. Como se usa en la presente, los términos "péptido exógeno" o "péptido extraño" se refieren a un péptido que no está en su ambiente natural (esto es, se ha alterado por la mano del hombre). Por ejemplo, un id. . «bfa^»^.-. . . . »J?.a.i?fc **-^ ijL *á^.*^4i?* ti *jhá js&ála???» gen de péptido exógeno incluye un péptido que se ha insertado dentro de otro polipéptido o que se ha agregado o fusionado con un polipéptido. Como se usa en la presente con referencia a una secuencia de aminoácidos o una proteína, el término "porción" (como en "una porción de una secuencia de aminoácidos"), se refiere a los fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden fluctuar en tamaño de cuatro residuos de aminoácidos a la secuencia completa de aminoácidos, menos un aminoácido. Como se usa en la presente, el término "proteína de fusión" se refiere a una proteína quimérica que contiene la proteína de interés (por ejemplo, la proteína de capa viral), unida a un fragmento de proteína exógena (por ejemplo, un epítope hidrofóbico). El término "aislado" cuando se usa con relación a un ácido nucleico, como en "una secuencia de ácidos nucleicos aislada"), se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que se identifica y se separa a partir de cuando menos un ácido nucleico contaminante con el cual se asocia ordinariamente en su fuente natural. El ácido nucleico aislado es el ácido nucleico presente en una forma o ambiente que es diferente de aquel en el cual se encuentra en la naturaleza. En contaste, los ácidos nucleicos no aislados, son los ácidos nucleicos tales como el ADN y el ARN que se encuentran en el estado en el que existen en la naturaleza. Por ejemplo, se encuentra una secuencia de ADN dada (por ejemplo, un gen) en el cromosoma de la célula anfitriona en proximidad con los genes vecinos; las secuencias de ARN , tal como la secuencia de ARNm específica que codifica una proteína específica, se encuentran en la célula como una mezcla con muchos otros ARNm's que codifican una multitud de proteínas.

Sin embargo, una secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende la SEQ I D NO:X incluye, a modo de ejemplo, esas secuencias de ácidos nucleicos en las células que ordinariamente contienen la SEQ I D NO:X, en donde la secuencia de ácidos nucleicos está en una ubicación cromosomal o extracromosomal diferente de aquella de las células naturales, o se flanquea de cualquier otra manera por una secuencia de ácidos nucleicos diferente de la que se encuentra en la naturaleza. La secuencia de ácidos nucleicos aislada puede estar presente en forma de una sola cadena o de cadena doble. Cuando se va a utilizar una secuencia de ácidos nucleicos aislada para expresar una proteína, la secuencia de ácidos nucleicos contendrá como mínimo, cuando menos una porción de cadena de sentido o de codificación (esto es, la secuencia de ácidos nucleicos puede ser de una sola cadena). De manera alternativa, podría contener las cadenas tanto sentido, como anti-sentido (esto es, la secuencia de ácidos nucleicos pudiera ser de doble cadena). Como se usa en la presente, el término "purificada" se refiere a las moléculas o adiciones de moléculas (por ejemplo, las partículas virales), ya sea secuencias nucleicas o de aminoácidos, que se remueven de su medió ambiente natural, aislan o separan. Una "secuencia de ácidos nucleicos aislada" es por lo tanto una secuencia de ácidos nucleicos purificada. Las moléculas "sustancialmente purificadas" están cuando menos 60 por ciento libres, de preferencia cuando menos 75 por ciento libres, y de más preferencia cuando menos 90 por ciento libres de otros componentes con los cuales se asocian de manera natural.

Como se usa en la presente, los términos "vector" y "vehículo" se usan de manera intercambiable con referencia a las moléculas de ácido nucleico que transfieren el(los) segmento(s) de ADN de una célula a otra.

Los vectores pueden incluir plásmidos, bacteriófagos, virus, cósmidos, y similares. El término "vector de expresión" o "cartucho de expresión", como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y las secuencias de ácidos nucleicos apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación que se enlaza de manera operable en un organismo anfitrión particular. Las secuencias de ácidos nucleicos necesarias para la expresión en los procariotes, usualmente incluyen un promotor, un operador (opcional), y un sitio de fijación de ribosoma, frecuentemente junto con las otras secuencias. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, mejoradores, y señales de terminación y de poliadenilación. Los términos "vector de objetivo" o "construcción de objetivo" se refieren a las secuencias de oligonucleótidos que comprenden un gen de interés flanqueada a cada lado mediante una secuencia de reconocimiento, la cual es capaz de la recombinación homologa de la secuencia de ADN que se localiza entre las secuencias de reconocimiento de flanqueo. Los términos "en combinación operable", "en orden operable" y "enlazado de manera operable", como se usan en la presente, se refieren al enlace de las secuencias de ácidos nucleicos de tal manera que se produzca una molécula de ácido nucleico que pueda dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula de proteína deseada. El término también se refiere al enlace de las secuencias de aminoácidos de tal manera que se produzca una proteína funcional. Las señales de control transcripcionales en los eucariotes comprenden los elementos "promotor" y "mejorador". Los promotores y mejoradores consisten de configuraciones cortas de secuencias de ADN que interactúan de manera específica con las proteínas celulares en transcripción (Maniatis y colaboradores, Science, 236: 1237, 1987) . Los elementos promotores y mejoradores se han aislado a partir de una variedad de fuentes eucarióticas que incluyen los genes de levadura, insectos, mamíferos y células vegetales. También se han aislado los elementos promotores y mejoradores a partir de virus y los elementos de control análogos, tales como los promotores, también se encuentran en los procariotes. La selección de un promotor y mejorador particulares, depende del tipo de célula que se usa para expresar la proteína de interés. Algunos promotores y mejoradores eucarióticos tienen un rango de anfitrión amplio, mientras que otros son funcionales en un subconjunto limitado de tipos de células (para repasar, ver Voss y colaboradores, Trends Biochem. Sci. , 1 1 :287, 1986; y Maniatis y colaboradores, supra, 1987). Los términos "elemento promotor", "promotor", o "secuencia promotora" como se usan en la presente, se refieren a una secuencia de ADN que se localiza en la región de codificación de proteína de extremo 5' (esto es, precede) de un polímero de ADN. La ubicación de la mayoría de , ..^k. -'•J,-i -»-*-;a-'i?i?i?i?r?i?r???fl?í?¡?i??-tnnr?r los promotores que se conocen en la naturaleza, preceden a la región que se transcribió. El promotor funciona como un interruptor, que activa la expresión de un gen. Si se activa el gen, se dice que se transcribe o que participa en la transcripción. La transcripción incluye la síntesis del ARNm a partir del gen. El promotor, por lo tanto, sirve como un elemento regulador transcripcional y también proporciona un sitio para la iniciación de la transcripción del gen dentro del ARNm. Los promotores pueden ser específicos de tejido o específicos de célula. El término "específico de tejido" como se aplica a un promotor, se refiere a un promotor que puede dirigir la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés, a un tipo específico de tejido (por ejemplo, las semillas) en la ausencia relativa de expresión de la misma secuencia de nucleótidos de interés, en un tipo diferente de tejido (por ejemplo, las hojas). La especificidad de tejido de un promotor se puede evaluar mediante, por ejemplo, enlazar de manera operable un gen reportero a la secuencia promotora, para generar una construcción reportera, que introduce la construcción reportera dentro del genoma de una planta de manera que la construcción reportera se integre dentro de cada tejido de la planta transgénica resultante, y que detecta la expresión del gen reportero (por ejemplo, que detecta el ARNm, proteína, o la actividad de una proteína que codificó el gen reportero) en diferentes tejidos de la planta transgénica. La detección de un nivel más elevado de expresión del gen reportero en uno o más tejidos con relación al nivel de expresión del gen reportero en otros tejidos, muestra que el promotor es específico para los tejidos en los cuales se detectan niveles más elevados de expresión. El término "específico del tipo de célula" como se aplica a un promotor, se refiere a un promotor que puede dirigir la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés en un tipo específico de célula, en la ausencia relativa de expresión de la misma secuencia de nucleótidos de interés, en un tipo diferente de célula, dentro del mismo tejido. El término "específico del tipo de célula" cuando se aplica a un promotor, también significa un promotor que puede promover la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés en una región dentro de un solo tejido. Se puede evaluar la especificidad del tipo de célula de un promotor, usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el manchado inmunohistoquímico. De manera breve, se empapan secciones de tejido en parafina, y se hacen reaccionar las secciones de parafina con un anticuerpo primario, el cual es específico para el producto de polipéptido que se codificó mediante la secuencia de nucleótidos de interés, cuya expresión se controla mediante el promotor. Se permite que un anticuerpo secundario etiquetado (por ejemplo, conjugado de peroxidasa), el cual es específico para el anticuerpo primario, se fije al tejido seccionado y se detecta la fijación específica (por ejemplo, con avidina/biotina) mediante microscopía. Los promotores pueden ser constitutivos o regulables. El término "constitutivo" cuando se hace con referencia a un promotor, quiere decir que el promotor puede dirigir la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos enlazada de manera operable, en la ausencia de un estímulo (por ejemplo, choque de calor, productos químicos, luz, etcétera). Típicamente, los promotores constitutivos pueden dirigir la expresión de B. A&*T?«f-t a i*t*M, A. j^» jj. *Jiiuito¡ttá».a¿ita » ..JAi.il >i un transgen en sustancialmente cualquier célula y cualquier tejido. Los promotores vegetales constitutivos ejemplares incluyen, pero no se limitan, a los promotores de Virus de Mosaico de Coliflor SD (CaMV SD; ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5, 352,605, que se incorpora a la presente como referencia), sintasa de manopina, sintasa de octopina (oes), superpromotor (ver, por ejemplo, la WO 95/14098), y la ub¡3 (ver, por ejemplo, Garbarino y Belknap, Plant Mol. Biol. 24: 1 19-127

[1994]). Estos promotores se han usado exitosamente para dirigir la expresión de las secuencias de ácidos nucleicos heterólogos en tejido vegetal transformado. En contraste, un promotor "regulable" es uno que puede dirigir un nivel de transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos que se enlazan de manera operable, en la presencia de un estímulo (por ejemplo, choque de calor, productos químicos, luz, etcétera), el cual es diferente del nivel de transcripción de la secuencia de ácidos nucleicos que se enlazan de manera operable, en la ausencia del estímulo. Como se usa en la presente, el término "elemento regulador" se refiere a un elemento genético que controla algún aspecto de la expresión de la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador que facilita la iniciación de la transcripción de una región de codificación que se enlaza de manera operable. Otros elementos reguladores son las señales de empalme, señales de poliadenilación, señales de terminación, etcétera. El mejorador y/o promotor puede ser "endógeno" o "exógeno" o "heterólogo". Un mejorador o promotor "endógeno" es uno que se enlaza de manera natural con un gen dado en el genoma. Un mejorador o promotor "exógeno" o "heterólogo" es uno que se coloca en yuxtaposición con un gen por medió de manipulación genética (esto es, técnicas biológicas moleculares), de manera que la transcripción del gen se dirige mediante el mejorador o promotor enlazado. Por ejemplo, un promotor endógeno en combinación operable con un primer gen se puede aislar, remover, y colocar en combinación operable con un segundo gen, haciéndolo mediante lo mismo un "promotor heterólogo" en combinación operable con el segundo gen. Se contempla una variedad de estas combinaciones (por ejemplo, el primer y segundo genes pueden ser de la misma especie, o de diferentes especies). La presencia de las "señales de empalme" sobre un vector de expresión frecuentemente da como resultado niveles más elevados de expresión del transcrito recombinante en las células anfitrionas eucarióticas. Las señales de empalme median la remoción de intrones a partir del transcrito de ARN primario y consisten de un sitio de donador y receptor de empalme (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York

[1989] páginas 16.7-16.8). Un sitio donador y receptor de empalme que se usa comúnmente, es la unión de empalme a partir del ARN 16S del SV40. La expresión eficiente de las secuencias de ADN recombinante en las células eucarióticas requiere la expresión de las señales que dirigen la terminación y poliadenilación eficientes del transcrito resultante. Las señales de terminación de transcripción se ... ¿»*f^>J,^,i<M^,a>jA^,tji MfcB^ ..m¿^ . encuentran generalmente corriente abajo de la señal de poliadenilación y son de unos cuantos cientos de nucleótidos de longitud. El término "sitio poli(A)" o "secuencia poli(A)" como se usa en la presente, denota una secuencia de ADN que dirige tanto la transcripción como la poliadenilación del transcrito de ARN incipiente. Es deseable la poliadenilación eficiente del transcrito recombinante, ya que los transcritos que carecen de una cola poli(A) son inestables y se degradan rápidamente. La señal poli(A) que se utiliza en un vector de expresión puede ser "heteróloga" o "endógena". Una señal poli(A) endógena, es una que se encuentra de manera natural en el extremo 3' de la región de codificación de un gen dado en el genoma. Una señal poli(A) heteróloga es una que se ha aislado a partir de un gen y que se coloca en 3' a otro gen. Una señal poli(A) heteróloga que se usa comúnmente, es la señal poli(A) de SV40. La señal poli(A) de SV40 está contenida en un fragmento de restricción Bam \/Bcl\ de 237 bp y dirige tanto la terminación, como la poliadenilación (Sambrook, supra, 16.6-16.7). Los términos "infectar" e "infección" con una bacteria, se refieren a la co-incubación de una muestra biológica objetivo (por ejemplo, célula, tejido, etcétera) con la bacteria, bajo condiciones tales que las secuencias de ácidos nucleicos contenidos dentro de la bacteria, se introduzcan dentro de una o más células de la muestra biológica objetivo. Los términos "bombardear", "bombardeo", y "bombardeo biolístico", se refieren al proceso para acelerar las partículas hacia una muestra biológica objetivo (por ejemplo, célula, tejido, etcétera), para efectuar una herida de la membrana celular de una célula en la muestra biológica objetivo y/o la entrada de las partículas dentro de la muestra biológica objetivo. Los métodos para el bombardeo biolístico se conocen en la técnica (por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,584,807, cuyo contenido se incorpora a la presente como referencia), y están disponibles comßrcialmente (por ejemplo, el acelerador de microproyectil impulsado por gas helio (PDS- 1000/He, BioRad)). El término "microherir" cuando se hace con referencia al tejido vegetal, se refiere a la introducción de heridas microscópicas en ese tejido. La microherida se puede conseguir por medió de, por ejemplo, el bombardeo de partículas como se describe en la presente, o por medió de escoriar el tejido. El término "transfección" como se usa en la presente, se requiere a la introducción de ADN extraño dentro de las células eucarióticas. La transfección se puede conseguir por medió de una variedad de elementos conocidos en la técnica, que incluyen la coprecipitación de ADN con fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transfección mediada por polibreno, electroporación, microinyección, fusión de liposomas, lipofección, fusión de protoplasto, infección retroviral, y biolística. El término "transgénico", cuando se usa con referencia a una célula, se refiere a un célula que contiene un transgen, o cuyo genoma se ha alterado mediante la introducción de un transgen. El término "transgénico", cuando se usa con referencia a un tejido o a una planta, se refiere a un tejido o planta, respectivamente, que comprende una o más células que contienen un transgen, o cuyo genoma se ha alterado mediante la introducción de un transgen. Las células, tejidos y plantas tranegénicos, se pueden producir mediante diferentes métodos que incluyen la introducción de un "transgen" que comprende ácido nucleico (usualmente ADN) dentro de una célula objetivo o la integración del transgen dentro de un cromosoma de una célula objetivo por medió de la intervención humana, tal como mediante los métodos que se describen en la presente. El término "gen extraño" se refiere a cualquier ácido nucleico (por ejemplo, la secuencia del gen) que se introduce dentro del genoma de una célula por medió de manipulaciones experimentales y puede incluir secuencias de genes que se encuentran en esa célula, siempre que el gen que se introduzca contenga alguna modificación (por ejemplo, un mutación de punto, la presencia de un gen marcador seleccionable, etcétera) con relación al gen que ocurre de manera natural. El término "transformación" como se usa en la presente, se refiere a la introducción de un transgen dentro de una célula. La transformación de una célula puede ser estable o transiente. El término "transformación transiente" o "transformado de manera transiente", se refiere a la introducción de una o más transgenes dentro de una célula, en la ausencia de la integración del transgen dentro del genoma de la célula anfitriona. La transformación transiente se puede detectar mediante, por ejemplo, el ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA, por sus siglas en inglés), el cual detecta la presencia de un polipéptido codificado por uno o más de los transgenes. De manera alternativa, la transformación transiente se puede detectar por medió de detectar la actividad de la proteína (por ejemplo, la ß-glucoronidasa) codificada por el transgen. El término "transformante transiente" se refiere a una célula que ha incorporado de manera transiente uno o más transgenes. En contraste, el término "transformación estable" o "transformado de manera estable", se refiere a la introducción e integración de uno o más transgenes dentro del genoma de una célula. La transformación estable de una célula se puede detectar mediante la hibridización de mancha Southern del ADN genómico de la célula, con las secuencias de ácidos nucleicos que pueden fijarse a uno o más de los transgenes. De manera alternativa, la transformación estable de una célula también se puede detectar mediante la reacción de cadena de polimerasa del ADN genómico de la célula, para amplificar las secuencias del transgen. El término "transformante estable" se refiere a una célula que ha integrado de manera estable uno o más transgenes dentro del ADN genómico. De esta manera, un transformante estable se distingue de un transformante transiente porque, mientras que el ADN genómico a partir del transformante estable contiene uno o más transgenes, el ADN genómico del transformante transiente no contiene un transgen.

A. Sistemas de Expresión de la Partícula Viral Para producir partículas de virus modificadas de conformidad con esta invención, se modifica el ácido nucleico viral por medió de introducir una secuencia de nucleótidos que codifica para el péptido extraño (por ejemplo, un antígeno de virus animal) en la parte del genoma viral que codifica para una porción de la proteína de capa expuesta a la rf r -- -** ?-« •«*- parte interna del cápsido viral, infectando las células anfitrionas o los organismos con el ácido nucleico viral modificado, y cosechando las partículas ensambladas del virus modificado. Este procedimiento se realiza mejor mediante la manipulación directa del ADN del virus en el caso de los virus de ADN o mediante la manipulación de un ADNc que corresponde al ARN de un virus de ARN. De conformidad con lo anterior, en algunas modalidades, la presente ¡nvención proporciona los vectores que codifican una partícula viral que se ha modificado, a modo de expresar un péptido exógeno o extraño en la superficie interna del cápsido viral. En las modalidades que se prefieren de manera particular, se modifica la secuencia de ácidos nucleicos que codifican una proteína de capa viral mediante la inserción de una secuencia que codifica un péptido exógeno, de manera que cuando la proteína de capa viral se ensambla adentro de un cápsido, el péptido exógeno se presenta sobre la superficie interna del cápsido. En las modalidades adicionales, la secuencia que codifica el péptido exógeno se inserta en una porción de una proteína de capa viral, de manera que no se interfiere de manera sustancial ni se rompe el ensamble de la proteína de capa viral dentro de un cápsido. Una gran variedad de partículas virales encuentran uso en la presente invención. Se contempla que tanto los virus de ADN como de ARN son adecuados para la modificación, mediante los métodos que se describen en la presente. En las modalidades que se prefieren de manera particular, la partícula viral modificada es un virus vegetal. En modalidades preferidas adicionales, los virus vegetales son de preferencia virus en icosaedro. Hasta la fecha, todos los virus vegetales con simetría en icosaedro para los cuales se han elucidado estructuras de cristal, se caracterizan por la presencia de una conformación de barril ß de ocho cadenas canónica. Por lo tanto, es probable que esta sea una configuración común a todos los virus de icosaedro vegetales. De esta manera, el virus vegetal en icosaedro preferido, se puede seleccionar a partir de las siguientes familias de virus: Caulimoviridae, Bromoviridae, Comoviridae, Ge iniviridae, Reoviridae, Partitiviridae, Sequiviridaß, y Tombusviridae; y los siguientes géneros de virus: Luteovirus, Marafiviris, Sobemovirus, Tymovirus, Enamovirus, e lldeavirus. En las modalidades que se prefieren de manera particular, la partícula viral modificada es de la familia Comoviridae. Los comovirus son un grupo de cuando menos catorce virus vegetales, los cuales infectan predominantemente legumbres. Sus genomas consisten de dos moléculas de ARN de sentido positivo de una sola cadena de diferentes tamaños, las cuales se encapsulan de manera separada en partículas isométricas de aproximadamente 28 nm de diámetro. A los dos tipos de partículas de nucleoproteína se les llama componentes intermedió (M) e inferior (B), como una consecuencia de su comportamiento en los gradientes de densidad de cloruro de cesio, conociéndose las partículas de ARNs dentro de las partículas como ARN M y B, respectivamente. Los dos tipos de partículas tienen una composición de proteína idéntica, que consiste de 60 copias de una proteína de capa grande (VP37; VP-L) y una pequeña (VP23; VP-S). Además de las partículas de nucleoproteína, las preparaciones de comovirus contienen una cantidad variable de cápsidos vacíos (solamente proteína), los cuales se conocen como componentes superiores (T). En el caso del miembro tipo del grupo del comovirus, el virus de mosaico de caupí (CPMV), se sabe que tanto el ARN M, como el B, se poliadenilan y tienen una proteína pequeña (VPg) que se enlaza de manera covalente con su término 5'. Los estudios más limitados sobre otros comovirus, sugieren que estas características las comparten los ARNs de todos los miembros del grupo. Los dos ARNs del CPMV se han secuenciado y muestran que consisten de 3481 (M) y 5889 (B) nucleótidos, que excluyen las colas poli(A) (van Wezenbeek y colaboradores, EMBO J. 2:941 -46

[1983]; Lomonossoff y Shanks, EMBO J. 2:2253-2258

[1983]).

Los dos ARNs contienen un marco de lectura abierto único, largo, la expresión de los productos de gen virales que ocurren a través de la síntesis y la disociación subsecuente de polipéptidos precursores grandes.

Aunque se requieren los dos ARNs para la infección de las plantas completas, el ARN B más grande es capaz de la réplica independiente en los protoplastos, aunque no se produce ninguna partícula de virus en este caso (Goldbach y colaboradores, Nature 286:297-300

[1980]). Esta observación, que se acopla con los estudios genéticos anteriores, estableció que las proteínas de capa se codifican mediante el ARN M. Un mapa de densidad de electrones de 3.5 ángstrom del CPMV, muestra que existe una clara relación entre el CPMV y los virus vegetales T=3 tales como los tombusvirus, en particular la planta enana tupida de tomate (TBSV) y los sobemovirus, en particular el mosaico de frijol sureño (SBMV). Los cápsidos de estos últimos virus se componen de 180 subunidades de proteínas de capa idénticas, consistiendo cada una t ^l ¿||É g £^^ de un dominio de barril ß único. Estas pueden ocupar tres posiciones diferentes, A, B, y C, dentro de los viriones. Se mostró que las dos proteínas de capa del CPMV consistían de tres dominios de barril ß diferentes, derivándose dos de ellos del VP37 y uno del VP23. De esta manera, en común con los virus T=3, cada partícula del CPMV se hace con 180 estructuras de barril ß. El dominio único a partir del VP23 ocupa una posición análoga a aquella de las subunidades de tipo A del TBSV y el SBMV, mientras que los dominios de terminal N- y C- del VP37 ocupan las posiciones de las unidades de tipo C y B, respectivamente. El análisis de difracción de rayos X de cristales del CPMV y otro miembro del grupo, el virus jaspeado de vaina de frijol (BPMV) muestra que las estructuras de 3-D del BPMV y el CPMV son muy similares y son típicas del grupo de comovirus en general. En las estructuras del CPMV y el BPMV, cada barril ß consiste principalmente de 8 cadenas de hoja ß antiparalela que se conectan mediante ciclos de longitud variable. Las hojas ß se llaman las hojas B, C, D, E, F, G, H e I, y se hace referencia a los ciclos de conexión como los ciclos ßB-ßC, ßD-ßE, ßF-ßG, y ßH-ßl. Los comovirus también se relacionan de manera estructural con los picornavirus animales. Los cápsidos del picornavirus consisten de 60 copias de cada una de las tres proteínas de capa diferentes VP1 , VP2 , y VP3, consistiendo cada una de un dominio de barril ß único Como en el caso de los comovirus, estas proteínas de capa se liberan mediante la disociación de una poliproteína precursora y se sintetizan en el orden VP2-VP3-VP1. La comparación de la estructura tridimensional del CPMV *****"'• '" »MtttMfcifa-Í'** fc i¿M&JW*¿IU?* con aquella de los picornavirus, ha mostrado que los dominios de terminal N- y C- del VP37, son equivalentes al VP2 y el VP3 respectivamente, y que el VP23 es equivalente con el VP1 . La equivalencia entre la posición estructural y el orden del gen, sugiere que el VP37 corresponde a una forma no disociada de las dos proteínas del cápsido del picornavirus, VP2 y VP3. Una de las diferencias principales entre los comovirus y los picornavirus, es que las subunidades de proteína de los comovirus carecen de las inserciones grandes entre las cadenas de los barriles ß que se encuentran en los picornavirus, aunque la arquitectura fundamental de las partículas es muy similar. Los cuatro ciclos (ßB-ßC, ßD-ßE, ßF-ßG, y ßH-ßl) entre las hojas ß, no son críticos para mantener la integridad estructural de los viriones, sino que, de conformidad con esta invención, se usan como sitios de expresión de las secuencias de péptidos extrañas, tales como sitios antigénicos a partir de virus animales. Una ventaja del Comoviridae es que el cápsido contiene 60 copias de cada una de las dos proteínas de capa constituyentes, permitiendo mediante lo mismo que se presenten 60-180 copias de un péptido por virión, en donde los dominios de la proteína de capa viral individuales se han manipulado de manera que expresen los péptidos insertados. Dentro de la familia del Comoviridae, se prefieren el virus de mosaico de caupí y el virus jaspeado de vaina de frijol. El CPMV es un virus de ARN bipartita y con el objetivo de manipular el genoma de cualquier virus de ARN para que exprese los péptidos extraños, es deseable usar los clones del ADNc del ARN . De conformidad con lo anterior, en algunas modalidades, la presente invención proporciona los vectores de ADNc que codifican una partícula vira! modificada para expresar un péptido exógeno en la parte interna del cápsido viral. Los clones del ADNc de longitud completa de las dos moléculas de ARN del CPMV están disponibles, las cuales se pueden manipular para insertar las secuencias de oligonucleótidos que codifican un péptido exógeno. En algunas modalidades que se prefieren de manera particular, el vector es el CP26. En otras modalidades, el vector contiene ARN B o ARN M o una variante u homólogo del ARN B o el ARN M. En algunas modalidades, la variante o el homólogo puede hibridizar a una cadena superior o menor del ARN B o el ARN M, bajo condiciones de estringencia de bajas a elevadas. En las modalidades que se prefieren de manera particular, la variante u homólogo contiene una secuencia que codifica un péptido exógeno. En algunas modalidades, se usa el ADNc para generar transcritos in vitro que son infecciosos cuando se inoculan en las plantas.

De conformidad con lo anterior, en algunas modalidades, la presente invención proporciona vectores de ARN que codifican una partícula viral que se modifica para expresar un péptido exógeno en la parte interna del cápsido viral. Sin embargo, el contagio de los transcritos es significativamente menor que aquel de los ARNs del virión natural, probablemente como un resultado de la presencia de residuos no virales en el término de los transcritos. También se pueden provocar dificultades por la exposición de los transcritos a agentes degenerativos durante la inoculación. Por esta razón, los transcritos se estabilizan usualmente por J?.^^at,Í£-.fa fc»»a,ltt»3.«?.. . ,„.¿,. .JI?Í ¡¡^A.?^—^**'-. -*^- medió de cubrir sus extremos 5'. En todavía otras modalidades preferidas, las partículas virales que se modificaron también incluyen un péptido exógeno que se presenta sobre la superficie externa del cápsido viral. Los métodos para presentar los péptidos exógenos en la parte externa del cápsido viral se proporcionan en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,874,087 y 5,958,422, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia. En modalidades adicionales, se usa el ADNc para inocular directamente las plantas. En estas modalidades, las secuencias que codifican la partícula viral modificada se enlazan de manera operable a un promotor que se expresa en el tejido vegetal. Los promotores que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan, a los promotores de Virus de Mosaico de Coliflor SD (CaMV SD; ver por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,352,605, que se incorpora a la presente como referencia), sintasa de manopina, sintasa de octopina (oes), superpromotor (ver, por ejemplo, la WO 95/14098), y la ubi3 (ver, por ejemplo, Garbarino y Belknap, Plant Mol. Biol. 24: 1 19-127

[1994]). Esta técnica supera algunos de lo problemas que se encuentran con el uso de los transcritos que se generan in vitro y es aplicable a todos los virus de ARN vegetal. En el caso de un virus de ADN , se introduce el ADN mismo adentro de la planta. De esta manera, el péptido extraño se expresa ¡nicialmente como parte de la proteína del cápsido y se produce mediante lo mismo como parte de la partícula de virus completa. El péptido se puede producir de esta manera como una molécula conjugada que se propone para el uso como tal. De manera alternativa, la modificación genética del virus se puede diseñar con el objetivo de permitir la liberación del péptido deseado, mediante la aplicación de los agentes apropiados, los cuales efectuarán la disociación a partir de la partícula del virus. Con el objetivo de producir virus modificados a una escala comercial, no es necesario preparar inóculos inefectivos (transcritos de ADN o ARN) para cada lote de producción viral. En algunas modalidades se puede usar un inoculo inicial para infectar plantas y se puede pasar el virus modificado resultante en las plantas, para producir virus completos o ARN viral como inoculo para lotes subsecuentes. En algunas modalidades, el cápsido viral no contiene ácido nucleico. Los métodos son conocidos en la técnica para el enriquecimiento selectivo y la purificación de viriones "vacíos" (Ver, por ejemplo, van Kammen y de Jaeger, Cowpea Mosaic Virus, In: CMI/AABN Description of Plant Viruses 197, Commonwealth Agricultural Bureaux

[1978], y WO 98/56933, la descripción de las cuales se incorpora a la presente como referencia).

B. Expresión de Péptidos Exógenos en la Parte Interna del Cápsido Viral Una de las limitaciones de las tecnologías de expresión viral que se describieron anteriormente, es el hecho de que los péptidos cargados de manera positiva o los péptidos hidrofóbicos que se insertan en uno de los ciclos superficiales de las proteínas de capa, eliminan el contagio viral, debido a un plegado de proteína perturbado, agregación de -~* *•*&* "** l ttí&M *¿**¿<**»-* -— * partículas, o un transporte viral perturbado. La no viabilidad de estas partículas es un gran impedimento para la expresión de algunos epítopes. Los epítopes que se cargan de manera positiva se pueden compensar mediante la expresión de algunos aminoácidos acidices adicionales (por ejemplo, plMM8, plMM9; Bendalm-nane y colaboradores, J. Mol. Biol 290(1 ):9-20

[1999]). La expresión de los residuos hidrofóbicos sobre la superficie, sin embargo, ha sido muy difícil hasta ahora. El uso de los sitios de inserción alternativos sobre la superficie de! virus no resuelve el problema. La inserción de los epítopes en el término C de la VP-S, la cual está en la superficie también, en general da características similares. Esta limitación de la tecnología hace difícil expresar la mayoría de los epítopes de célula T. Más adelante se describe el descubrimiento de nuevos sitios de inserción: 1. Sitios de Inserción En general, el ARN o ADN exógeno se puede insertar dentro del genoma de virus de la planta en una variedad de configuraciones. Por ejemplo, se puede insertar como una adición de! ácido nucleico existente o como una sustitución para parte de la secuencia existente, siendo determinada la selección mayormente por la estructura de la proteína del cápsido y la sencillez con la cual se pueden hacer las adiciones o los reemplazos, sin interferencia con la capacidad del virus modificado de manera genética para ensamblarse en las plantas. La determinación del tamaño permisible y más apropiado de adición o eliminación para los propósitos de esta invención, se puede conseguir en cada caso particular mediante el experimento a la luz de la presente descripción. Parece que el uso de los insertos de adición ofrece más flexibilidad que los insertos de 7 reemplazos en algunos casos. La presente invención demuestra que la inserción de epítopes en las proteínas de capa viral de manera que se expresen en la superficie interna o el lado de una cápsido viral. En general, cualquier porción de una proteína de capa vira! que se exponga sobre la superficie interna de un cápsido viral ensamblado, es un sitio candidato para la inserción del epítope. En algunas modalidades de la presente invención, estos sitios se seleccionan mediante el análisis de estructuras de alta resolución (por ejemplo, el análisis de estructura de cristal) de los cápsidos virales. En modalidades adicionales de la presente ¡nvención, se modifica la proteína de capa viral en el sitio identificado por medió de insertar un epítope. Los vectores (por ejemplo, los vectores de ADNc o de ARN) que codifican el virus modificado, se usan entonces para infectar un anfitrión apropiado (por ejemplo, protoplastos, tejido vegetal, o plantas completas). Si la infección ocurre (por ejemplo, como se ensayó mediante la aparición de lesiones locales en una planta), entonces el sitio es útil para la expresión de un epítope. En algunos casos, la selección en serie de los virus infecciosos identifica las mutaciones que llevan a un contagio mayor, incluyendo las partículas virales capaces de infección sistémica (que se discute más adelante con más detalle). La presente invención se ejemplifica por la inserción de un péptido extraño dentro de la VP-S del CPMV. En algunas modalidades, el sitio de inserción está en el término N de la VP-S. En modalidades ' afeafa***'!.* --*.»» _.^^J,JftijM.t..a¿?faa A1..i ¡». adicionales, el péptido extraño se inserta en un punto entre los aminoácidos 5 y 20 del término N , de preferencia entre los aminoácidos 7 y 15 del término N, y de más preferencia entre los aminoácidos 9 y 12 del término N. En las modalidades preferidas , la inserción del péptido extraño no perturba la función (por ejemplo, el ensamble) del virus in vivo. El término N está, de conformidad con la estructura de alta resolución, en el interior del virión, más bien que en la superficie externa.

La presente invención no se limita a un mecanismo de acción en particular. En realidad, no es necesario un entendimiento del mecanismo de acción para practicar la invención. No obstante, como una estrategia para la expresión de los epítopes en el término N de la VP-S del CPMV, parece deseable insertar el epítope entre una duplicación de Y1 1 o V10Y1 1 . El término N desempeña un papel en el ciclo de vida viral, debido a que lo reconoce la proteasa viral durante el procesamiento de políproteína. No se sabe el tamaño exacto del sitio de reconocimiento, pero en analogía con el sitio de reconocimiento entre el VP37 y la MP (proteína de movimiento), es probablemente de 10-1 1 aminoácidos (Verver y colaboradores, Virology 242:22-27

[1998]). Los primeros 10 aminoácidos de la VP-S se proyectan desde el barril ß de la VP-S y no interactúan con ningún otro residuo. Y1 1 marca el límite entre el término N de la VP-S y el resto de la proteína de capa pequeña y está en un paquete hidrofóbico que se forma mediante Q73, R 165 y H71 . la inserción en Y1 1 aparentemente no interrumpe el proceso de la poliproteína. Otros factores también hacen de este un sitio deseable. Se desconoce la distribución del ARN adentro del CPMV. Sin embargo, en el i*f*~-^*-, -i^iJ ?? ]t^µ+.tl*. •-^*^'-^^-^.^--^: ^jgj^jj M^ ^¡^¡¡j^ componente intermedió del comovirus jaspeado de vaina de frijol, se observó algún ARN en la estructura de cristal. Las interacciones de la proteína de ARN principal tienen lugar en el término N del VP37. Este pudiera ser muy bien el caso para el CPMV. Las fotografías Crío E.M. del CPMV muestran que existe probablemente un espacio vacío pequeño en los ejes de simetría de cinco partes, justo por debajo de la cubierta de la proteína. Además, el término N de la VP-S contiene dos residuos cargados de manera negativa, lo cual hace poco probable que haya una interacción con la estructura base de azúcar-fosfato del ARN también. De esta manera, no es probable que la inserción en el término N de la VP-S interfiera con las interacciones del ARN y existe un espacio para acomodar el péptido extraño. De manera adicional, probablemente el término N de la VP-S esté bien estructurado, y el término cinco de la simetría que se relaciona con las moléculas de la VP23 en el virión, forma un anillo (Lin y colaboradores, Journal of Virology 74(1 ): 493-504

[1991]). los factores B indican que los aminoácidos 1 -9 son flexibles. Las inserciones en esta región muy probablemente perturbarán el anillo, pero probablemente no afectarán el plegado del barril ß. Podría ser relevante que los experimentos de pepscano indiquen que el término N de la VP-S en el CMPV y en un número de otros virus vegetales en icosaedro, representan uno de los epítopes de célula B más fuertes. Esto es consistente con la noción de que este dominio (normalmente enterrado dentro del cápsido), se expone de manera temporal a través del comportamiento dinámico (esto es, la "respiración") del virión que se ensambló, tal como los CVPs. De conformidad con lo anterior, en algunas modalidades, la ^t,.^,.*..^ ....^ ( í.í M^l f] i|í i. *«M¡~J^b.*a »a^Jk?iá> SújLJu£lábt*Í^ presente invención proporciona un CPMV modificado, que tiene un péptido extraño insertado en Y1 1 . En todavía otras modalidades, el péptido extraño insertado entre una duplicación de Y1 1 de VP-S. En otras modalidades, la presente invención proporciona un CPMV modificado que tienen un péptido extraño insertado entre una duplicación de V10Y1 1 de VPS. La presente invención no está limitada a ningún mecanismo particular de acción. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo de acción para practicar la ¡nvención. Sin embargo, se contempla que flanquear un péptido extraño con una duplicación de Y1 1 o V10Y1 1 , conserva el contexto hidrofóbico de Y1 1 . La duplicación de Y1 1 representa una modificación diseñada del vector viral que se ha hecho para facilitar el acomodo de péptidos extraños adentro del cápsido del CPMV. En general, se han probado difíciles de diseñar otros cambios a la secuencia de aminoácidos del CPMV, puesto que muchas mutaciones observadas de novo que ocurren en partículas que despliegan péptidos en el aspecto externo de la partícula se han limitado a cambios dentro del péptido extraño mismo. Se insertaron exitosamente muchos epítopes en la posición Y1 1 , dando razón a una muy buena infección en las plantas caupí. Muchas construcciones tuvieron una duplicación de V10Y1 1 , que en dos casos (pNLAL7/pMAL8 y pMV14/pMV15) resultaron ser útiles para evitar mutaciones en el epítope, o para hacer la construcción infecciosa. En una construcción (pTr4), solamente se duplicó V10 (porque el epítope empieza y termina con Val), y además en este caso la construcción fue infecciosa. Estos resultados hacen que aconsejable duplicar cuando menos V10, y si es posible V10Y1 1 en construcciones nuevas. 2. Péptidos Los péptidos extraños que se pueden incorporar dentro de los virus de plantas de conformidad con esta invención, pueden ser de tipos altamente diferentes y se sujetan solamente a la limitación de que la naturaleza y tamaño del péptido extraño, y el sitio en el cual se coloca éste, o en la partícula de virus, no interfiera con la capacidad del virus modificado para ensamblarse cuando se cultive in vitro o in vivo. En un concepto amplio, los virus modificados se pueden formar a partir de cualesquier péptidos biológicamente útiles (usualmente polipéptidos), cuya función requiere una conformación particular para su actividad. Esto se puede conseguir mediante la asociación del péptido con una molécula más grande (por ejemplo, para mejorar su estabilidad), o el modo de presentación en un sistema biológico particular. Los ejemplos de esos péptidos son hormonas de péptido; enzimas; factores de crecimiento; antígenos de origen protozoario, viral, bacteriano, o fungal; anticuerpos que incluyen anticuerpos antiidiótípicos; inmunorreguladores y citocinas (por ejemplo, interferonas e interleucinas); receptores; adhesinas; y partes de precursores de cualquiera de los tipos anteriores de péptidos. El péptido contiene de preferencia más de 5 aminoácidos. La presente invención permite la expresión de una amplia variedad de péptidos extraños en la superficie interior de los cápsidos virales. En algunas modalidades, el péptido es de 5-20 aminoácidos, de preferencia de 7-15 aminoácidos, y de mayor preferencia de 8-12 aminoácidos. Sin embargo, se contempla que el límite en el tamaño extraño esté limitado únicamente por la capacidad del virus quimérico para acomodar un péptido extraño y todavía ser capaz de ensamblarse dentro de un virus infeccioso in planta. En las modalidades preferidas, el péptido extraño tiene propiedades inmunológicas. De conformidad con lo anterior, en algunas modalidades, el péptido extranjero es un antígeno o 11 nmunógeno. En la siguiente Tabla 1 se proporcionan los ejemplos de los epítopes que se han insertado exitosamente. En algunas modalidades, el epítope es un epítope de células B. En otras modalidades, el epítope es un epítope de células T. En algunas modalidades preferidas, el péptido extraño es un epítope de linfocito T citotóxico, que es reactivo hacia los linfocitos T citotóxicos. En general, los epítopes de células T son hidrofóbicos. En algunas modalidades, los epítopes tienen un pl de más de 7.0 (por ejemplo, pH BV16, pLCMV2, PVSVI) y son hidrofóbicos, o contienen trechos hidrofóbicos largos (por ejemplo, pLCMV2 y pHBV16). Algunos de estos epítopes se han insertado previamente en el ciclo ßBßC de VP-S, dando síntomas buenos (epítope HBV corto), moderados (epítope LCMV), o ninguno (péptido 2F10). En algunas modalidades preferidas, el péptido corresponde con las SEQ ID NOs: 4-17. En otras modalidades, el péptido está codificado por una secuencia de ácidos nucleicos que corresponde a los SEQ I D NOs: 18-31 . *¡t¡ai^?*-r*?....aM^» *^...,-.,i.^.?^t. „ ¿jfc^afi¿^ , ^B&.,t..)^ ,..<ráiM fcttt*..Hl«t,.MftOh??ti¡ÍÉÍ¿-«' ^-^».«?áa¡Í¡«¿M^fa1fe1if?iail lfc El uso del sitio de inserción en el término N de VP-S tuvo claras ventajas sobre los sitios de inserción que se usaron antes, en el sentido de que ahora es posible expresar epítopes hidrofóbicos o básicos.

Esto abre todo un nuevo rango de posibilidades para la expresión de epítopes extraños en el CPMV. Puesto que el nuevo sitio de inserción es en el interior de la partícula de virus, no es probable una respuesta de anticuerpos fuerte al epítope insertado. Sin embargo, el término N escondido de muchos virus de planta resulta estar entre las partes más inmunogénicas del virus. La explicación más probable para este fenómeno es el comportamiento dinámico (respiración) de las partículas. Por esta razón, se probó la respuesta de las células B al péptido 2F10 en BBV16. La ausencia de cualquiera de los anticuerpos a-2F10 indica claramente que el epítope en esta construcción está escondido. 3. Mutaciones en Segundo Sitio Sorprendentemente, se ha encontrado que las partículas de virus quiméricos que contienen un péptido extraño en el término N de VP-S (esto es, una partícula de despliegue interno) son particularmente ..t.-*,*** ***.-: ^aa&a^^=^ii^a^^ ft^t aa^M^iafeMi tiifíilhi ^ ^ ^^= s ^^^aat propensas a selección para mutaciones que afectan la secuencia de las proteínas de capa in planta en sitios diferentes a la inserción misma. Estas mutaciones de novo se caracterizan por las siguientes características: las nuevas mutaciones ocurren espontáneamente y se seleccionan en la planta anfitriona; y ocurre una proporción muy grande de las mutaciones en posiciones distantes y próximas a la inserción del péptido extraño. Interesantemente, muchas de las mutaciones efectúan cambios en las secuencias de aminoácidos en las proteínas de capa localizadas en dominios de los que se cree que están involucrados en la interacción proteína-proteína entre subunidades del cápsido. Mediante la infección de una planta anfitriona con una construcción de partícula de virus quimérico novedosa que contenga un epítope internalizado, es posible seleccionar y aislar partículas de virus novedosas en las que se alteren aminoácidos diferentes a aquellos presentes en el inserto. Además, está claro que las mutaciones de novo en una posición dada en una proteína de capa dada, pueden surgir independientemente del tiempo, y llevar nuevamente a mutaciones inducidas y seleccionadas por separado en precisamente la misma posición en proteínas que comprenden el cápsido. En adición, el hecho de que se puede alterar un residuo aminoácido dado a diferentes aminoácidos (esto es, cambios no conservadores), sugiere que es más importante remover de la estructura la restricción que ejerce el aminoácido original, que establecer una sustitución de aminoácido particular. Además, las sustituciones de aminoácidos están naturalmente limitadas a aquellas que son el resultado de mutaciones de (un solo) punto en posiciones no tambaleantes en los codones. En consecuencia, se proporciona un método para identificar las posiciones en el cápsido CPMV, permisivo para la selección de mutaciones compensatorias ("puntos calientes"). El método es independiente del péptido internalizado expresado y su punto preciso de inserción adentro de ese cápsido. Todavía más sobresalientemente, se pueden seleccionar mutaciones de segundo sitio, tercer sitio y otras en proteínas de capa del CPMV, mediante la infección de una planta anfitriona con una quimera que exprese internamente un péptido extraño. En donde ocurren esas mutaciones de tercer sitio y otras, se mejora la infectividad y productividad de la partícula de virus quimérico novedosa sobre aquella de su contraparte con solamente una mutación de novo (solamente de segundo sitio). Además, si se usa el genoma del virus alterado para presentar un péptido diferente, tanto la infectividad como la productividad de esa partícula de virus es mayor que las que se ven con el vector de virus de tipo silvestre que expresa el mismo péptido. De esta manera, la invención proporciona un medió para generar vectores virales mejorados, capaces de mayor productividad en la planta que los vectores CPMV de tipo silvestre consanguíneos. De conformidad con lo anterior, en algunas modalidades, la presente invención también proporciona vectores que contienen mutaciones de segundo y tercer sitio, que mejoran la infectividad de las partículas virales que contienen inserciones de epítopes, y métodos para seleccionar esas mutaciones. En algunas modalidades, las mutaciones están en VP-S, mientras que en otras modalidades, las mutaciones están en el VP-L. En la siguiente Tabla 2 se describen siete mutaciones de segundo sitio y dos mutaciones de tercer sitio. De conformidad con lo anterior, la presente invención también proporciona un banco de vectores que contiene una diversidad de vectores virales mutados que se pueden seleccionar para la expresión del epítope. En el Ejemplo 12 se proporciona un protocolo detallado para la selección e identificación de estas mutaciones.

La presente invención no está limitada a un mecanismo de acción particular. De hecho, no es necesario un entendimiento del yfaj mecanismo de acción para utilizar la presente invención. No obstante, la mayoría de los aminoácidos mutados probablemente están envueltos en las interacciones intermoleculares proteína-proteína. Phe91 está en la interfase de dos moléculas VP23 vecinas. La mutación F91 S debilitará definitivamente esta interacción. Phe180 está en la interfase de una molécula VP23 y VP37, e interactúa con Phe2045 y Ala2047. La mutación F180L inhibe estas interacciones. Met177 tiene una interacción hidrofóbica con la cadena lateral de Arg97 del dominio C de VP37. Tanto la mutación M 177V como la M177T hacen esta interacción imposible. Arg 2102 está probablemente cerca en espacio al término N de una VP37 vecina. Existe una interacción intramolecular con E2121 , la cual es imposible cuando tiene lugar la mutación R2102K. Algunos de los residuos mutados, sin embargo, están escondidos en una de las proteínas de capa, y es menos probable predecir las consecuencias estructurales. Una posible explicación para cuando menos algunas de las mutaciones es que existe una necesidad de una estabilidad de partícula reducida, para asegurar la descapsidación eficiente del virus. Puesto que los términos N de VP-S forman un anillo, los epítopes insertados pueden interactuar unos con los otros, y estabilizar la partícula de virión. Parece que algunos epítopes tienen una tendencia mucho más fuerte a hacer ésto que otros. Por lo tanto, hay una clara aplicación para las mutaciones de segundo sitio. En algunas modalidades de la presente invención, las mutaciones se pueden utilizar en construcciones que por sí mismas no son infecciosas (por ejemplo, pSEN2, ver la Tabla 2 anterior). Se contempla que ésto incremente el rango de posibilidades para el uso del nuevo sitio de inserción. De conformidad con lo anterior, un planteamiento útil es la producción de un banco de vectores con todas las mutaciones de segundo y tercer sitio que se hayan observado, en el que se puedan clonar los nuevos epítopes. En algunas modalidades, la selección por el vector más viable puede tener lugar en la planta. 4. Expresión en Combinación con Epítopes Externos La presente invención también abarca partículas y vectores virales que codifican partículas virales que expresan epítopes tanto en el interior como en el exterior del cápsido viral. Estas partículas se llaman partículas de virus quimérico de anfidespliegue (ADCVPs). La presente invención no está limitada a ningún mecanismo particular de acción. De hecho, no es necesario un entendimiento del mecanismo para practicar la invención. No obstante, se contempla que la coexpresión de los epítopes de células T y células B en la partícula viral puede llevar a una respuesta inmune mejorada al epítope de células B. De conformidad con lo anterior, en algunas modalidades, la presente ¡nvención comprende una partícula viral (o vector que codifica una partícula viral) que expresa un epítope de células B en el exterior del cápsido viral, y un epítope de células T en el interior del cápsido viral. En algunas modalidades preferidas, la partícula viral es CMPV y el epítope de células T está insertado en el término N de VP-S. En todavía otras modalidades, el epítope de células T está insertado en medió de una duplicación de Y1 1 o V10Y1 1 , y el epítope de células B está insertado ya sea en el ciclo ßBßC, el ciclo ßB'ßC", o el término carboxilo de VP-S o el ciclo ßEßA de VP-L. En el Ejemplo 7 se proporcionan ejemplos de ADVCPs.

C. Usos de las Partículas Virales Modificadas Los vectores y las partículas virales de la presente invención tienen muchos usos. En algunas modalidades, las partículas virales se usan para inducir una respuesta ya sea inmunogénica o antigénica en un animal. Por lo tanto, las partículas virales son útiles en la protección de animales, incluyendo humanos, contra enfermedades provocadas por patógenos. En otras modalidades, las partículas encuentran uso como vacunas contra el cáncer. En modalidades adicionales, las partículas virales se utilizan para hacer una composición de vacuna. En las modalidades preferidas, la composición de vacuna comprende una partícula viral modificada y un adyuvante (por ejemplo, QS-21 ). Después la vacuna se administra al animal como se sabe en la técnica.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar ciertas modalidades y aspectos preferidos de la presente invención, y no se considerarán como limitando el alcance de la misma. En la descripción que sigue, aplican las siguientes abreviaturas: M (molar); mM (milimolar); µM (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); mmol (milimoies); µmol (micromoles); nmol (nanomoles); gm (gramos); mg (miligramos); µm (microgramos); pg (picogramos); L (litros); ml (mililitros); µl (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); µm (micrómetros); nm (nanómetros); °C (grados Centígrados); ADNc (ADN de copia o complementario); ADN (ácido desoxirribonucleico); ADNss (ADN de una sola cadena); ADNds (ADN de doble cadena), dNTP (trifosfato de desoxirribonucleótido); CPMV (Virus de Mosaico de Caupí); ADVCP (partícula de virus quimérico de anfidespliegue); CTL (linfocito T citotóxico); CVP (partícula de Virus Quimérico); ELISA (ensayo inmunosorbente enlazado por enzima); MP (Proteína de Movimiento); VLP (Partícula Parecida a Virus); VP-L (proteína de virus-grande [proteína de capa de 37 kDa]); VP-S (proteína de virus- pequeña [proteína de capa de 23 kDa]). El vector que se usó en todos los experimentos descritos posteriormente es pCP26. Este se deriva a partir de pCP7 descrito en (Dalsgaard y colaboradores, Nat. Biotech. 15, 248-252

[1997]) y consiste de: el vector comercialmente disponible Bluescript p BS 1 1 BS SK+ (Stratagene, CA) habiendo sido clonado en un cartucho que comprende el promotor de planta constitutivo del virus de mosaico de coliflor (CAMV 35S) ligado a una molécula de ADNc que corresponde con el ARN2 del virus de mosaico de caupí infeccioso, en el cual se han suprimido los nucleótidos que codifican los 24 aminoácidos de terminal N, y se ha diseñado una mutación de nt3295 (T-»A), que introduce un sitio de endonucleasa de restricción Psfl . En la secuencia de la estructura base del vector se han diseñado las siguientes mutaciones de punto, para crear nuevos sitios de endonucleasa de restricción: Eco47lll (T-»C en nt960) y Sa/I, (T->C en nt1005). Se ha suprimido la secuencia de polienlazador entre Sa/I y Kpn\ . Puesto que se ha removido la mayoría del polienlazador en esta construcción, existe un sitio de restricción EcoO 1091 único, cerca del sitio Nhe\ que normalmente se usa para inserciones en el ciclo ßBßC de VP-S. Esto se muestra en la Figura 1 , que indica la estrategia de clonación para la inserción de epítopes en medió de una duplicación de TyrH de VP-S o CPMV. Los dos sitios de restricción se usan para insertar oligonucleótidos que codifican diferentes epítopes. A menos que se declare de otra manera, la inoculación de las plantas anfitríonas con ADNc que codifica partículas de virus quimérico, descrita en los siguientes ejemplos, se realizó esencialmente como se delínea en Daísgaard y colaboradores, supra, y Dessens y Lomonossoff, J . Gen. Virol. 74, 889-892

[1993]). Para conseguir la expresión simultánea de combinaciones de terminal N más epítopes superficiales en VP-S de CPMV, se digieren dos plásmidos, cada uno codificando un epítope en un sitio de inserción diferente, con Nhel y fíamHI, dando como resultado fragmentos de 1 .3kb y 5 kb. El fragmento más pequeño contiene la secuencia que codifica el término N de VP-S, y el fragmento más grande contiene secuencias que codifican el ciclo ßBßC, el ciclo ßB'ßC" y el término C de VP-S. Las construcciones que contienen múltiples epítopes se hacen mediante la purificación de los fragmentos que contienen los epítopes insertados, y ligándolos juntos usando técnicas de biología molecular estándares (Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning-A laboratory manual, 2a. edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press

[1989]).

Ejemplo 1 Este ejemplo demuestra la expresión de un péptido en el interior de un cápsido viral. En particular, los péptidos derivados de un mimótopo del determinante clase "a" del antígeno superficial de hepatitis B, se insertan en la VP-S del CPMV. Se reporta que una secuencia derivada a partir del anticuerpo monoclonal anti idiotípico contra el antígeno superficial de hepatitis B (H BsAg), AVYYCTRGYHGSSLY (SEQ ID NO: 33), y un octómetro altamente hidrofóbico, derivado a partir de esta misma secuencia (GYHGSSLY; SEQ ID NO: 34) son efectivos para montar un cognado de respuesta inmune con aquel generado por el determinante "a" del antígeno superficial de H BV mismo ( Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 5,531 ,990; 5,668,253; 5,744, 135; y 5,856,087, cada una de las cuales está incorporada a la presente como referencia). El mismo péptido genera una respuesta de ayuda T específica al HBV. Por lo tanto, el péptido, designado 2F10, y sus derivados son mimótopos del determinante "a". El pentadecámero y el octómero derivados a partir de 2F10 se pueden expresar en la superficie externa de las partículas de CPMV. El octómero se expresa en el ciclo ßBßC de la VP-S, y en el ciclo ßEßCA de VP-L (Brennan y colaboradores, Microbiology 145:21 1 -220 [1991 ]) generando partículas quiméricas designadas respectivamente, H BV7 y HBV14. Ambas CVPs son capaces de montar una infección en plantas de caupí después de la inoculación. El pentadecámero se puede expresar de manera diferente en el ßBßC de la VP-S, para generar una construcción conocida como H BV2; en el término C de VP-S para producir H BV8; y en el ciclo ßEaB de VP-L (HBV3). Para estas tres construcciones los síntomas están restringidos a las hojas inoculadas, aún después del paso del virus purificado a otras plantas. En otras palabras, no hay ninguna selección in planta para los virus J é..*Í??»*»J'>?*"»*»**'***-*~~?~*- i quiméricos adentro de la población capaz de montar un ciclo de infección viable. Para superar esta limitación técnica ambos péptidos se expresan como inserciones distintas en el término N de la VP-S. El octámero (HBV 15) y el pentadecámero (H BV 16) se insertan en medió de Tyr1 1 y Ser12. Se elige esta posición porque el término N está implicado en la fijación de una proteasa de poliproteína viral que se cree que requiere cuando menos los diez aminoácidos con terminal N. Por lo tanto, una consecuencia deseada de insertar un péptido extraño dentro del término N de VP-S, es evitar la ablación de la fijación de la proteasa, con el objeto de ejecutar su función. Dado que el dominio de terminal N nativo incluye un residuo de tirosina en la posición 1 1 , parece importante mantener la presencia de este residuo en un motivo aminoácido contiguo. Puesto que los péptidos mismos terminan cada uno con un residuo de tirosina, no es necesaria una duplicación de Tyr1 1 con el objeto de expresarlos internamente en este caso (ver también el Ejemplo 2 a continuación). En todas las plantas inoculadas con ADNc, el H BV 15 produce síntomas en la planta anfitriona indistinguibles de aquellos producidos en una infección por CPMV de tipo silvestre. Las partículas purificadas a partir de 62 gramos de hoja, después del procedimiento estándar para la purificación del CPMV, Daisgaard y colaboradores, supra, rindieron 64.5 mg. El HBV 16 produce síntomas en 3 de 5 plantas inoculadas con ADNc. Sin embargo, en las plantas que se inocularon subsecuentemente con virus purificados a partir del ciclo de infección inicial, se observan síntomas iguales a una infección de tipo silvestre. El rendimiento de virus purificado de estas plantas son 13 mg de 23 gramos (0.57 miligramos/gramo de material de planta) después de un procedimiento estándar para la purificación de CPMV (como se mencionó anteriormente). Ambos virus se analizan en un gel de poliacrilamida al 15 por ciento de desnaturalización. La proteína de capa pequeña no muestra ninguna disociación de estos péptidos internos como se puede ver algunas veces para los péptidos desplegados en los ciclos superficiales del CPMV.

Ejemplo 2 Este Ejemplo demuestra la expresión y el despliegue interno de un péptido hidrofóbico que corresponde a un epítope de CTL (MAL 7) derivado a partir de la proteína de circunsporozoita de Plasmodium berghei. El P. berghei es un agente causal de protozoario unicelular de malaria en el hombre. Un péptido que corresponde a un epítope de la proteína de circunsporozoita con la secuencia de aminoácidos SYIPSAEKI, se puede expresar en el ciclo ßBßC de la VP-S (dando origen a una partícula de virus quimérico designada Mal 4), y en dos posiciones diferentes en el término C de VP-S (para generar respectivamente, Mal 5 y Mal 6). El mismo péptido se puede expresar en el término N de VP-S entre "una duplicación de un residuo de tirosina en la posición 1 1 en la proteína (Tyr1 1 ; cf. Ejemplo 1). Esta construcción se designa MAL 7. Inicialmente después de la inoculación de ADNc que codifica el CPMV MAL 7 modificado sobre las hojas de las plantas de caupí anfitrionas, la construcción no genera síntomas sistémicos. Sin embargo, después de 21 días, son visibles lesiones locales muy claras en las hojas primarias de dos de cinco plantas, indicando el establecimiento de una infección mediada por el CVP inoculado. El virus purificado de estas lesiones locales se transfiere directamente a dos grupos, cada uno de tres plantas de caupí jóvenes. Las lesiones locales se hicieron visibles dentro de los siguientes 5 días, y la infección sistémica subsecuente sigue dentro de una semana. Esta viabilidad fuertemente mejorada en toda la probabilidad indica la selección de un virus desde adentro de la población que lleva una mutación de novo en este genoma. El ARN del virus purificado 8 días después de la inoculación en los segundos dos grupos de plantas de caupí se somete a RT-PCR y se realiza la secuenciación del ADNc resultante. El análisis revela una mutación de punto, que se observa que ha surgido independientemente en ambos conjuntos de plantas, y que se verifica en cada caso mediante la secuenciación en las cadenas tanto más como menos que produce el ADNc en la reacción RT-PCR. Sin embargo, esta inversión no está presente en el 100 por ciento de los virus aislados, puesto que en esta posición se observa una mezcla de dos nucleótidos en los cromatógrafos del secuenciador automatizado de cada aislado. Sin embargo, notablemente, en cada caso se cambia una adenosina a una guanosina en la secuencia de nucleótidos, provocando una mutación de Glu a Gly en el péptido, en el nivel aminoácido. Cuando las hojas superiores de las plantas se analizan 3 semanas después de la inoculación, todavía se observa una mezcla de genomas virales, pero el genoma mutado está presente en números aparentemente mayores que la secuencia original, según se juzga mediante el examen de los cromatógrafos. Esto indica que la VP-L mutada tiene una ventaja competitiva sobre la partícula quimérica no mutada en su capacidad para montar y progresar una diseminación sistémica del virus adentro de su anfitrión. Debido a la secuencia mutada del péptido, no se puede usar esta construcción para un análisis inmunológico del epítope de interés. Sin embargo, ésta ejemplifica dos elementos de la internalización del sistema de péptidos. Primeramente, la utilidad de una duplicación del residuo de tirosina en la secuencia nativa del genoma CPMV entre el cual se demuestran las inserciones de los péptidos extraños. En algunos casos se requiere ésto para mantener el sitio de fijación putativo para la proteasa de poliproteína viral. En segundo lugar, se demuestra la habilidad para seleccionar in vivo las partículas de virus quimérico alteradas cuyas características las produzcan dispuestas a infección y a la diseminación sistémíca adentro de una planta de caupí. En este caso particular, la alteración en el genoma viral recombinante afecta directamente el péptido extraño insertado mismo. Las mutaciones que afectan a los péptidos desplegados externamente en el CPMV se pueden ver en casos en donde surge la presión de selección in planta porque el péptido posee características de carga que desequilibran el pl (ver Definiciones) de la corteza de la proteína de cápsido global. El resultado descrito aquí no es anticipado porque la razón fundamental detrás de la internalización de los péptidos es que la carga superficial inherente en el péptído en cuestión no debe representar una restricción una vez que el péptido se despliega adentro del virión. El siguiente ejemplo identifica una consecuencia completamente inanticipada de la internalización de los péptidos adentro de partículas quiméricas de CPMV.

Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra la generación in vivo y el subsecuente aislamiento de las mutaciones de novo en los genomas de virus quiméricos que confieren una ventaja selectiva sobre el genoma de virus quimérico de tipo silvestre cognado en la progresión de la infección y la diseminación sistémica de CVPs que expresan internamente a los péptidos MAL 7. La quimera mutante resultante descrita en el Ejemplo 2 (anterior) es, sorprendentemente, viable con respecto a la capacidad del virus recombinante para montar y progresar un ciclo de infección "natural", incluyendo la diseminación sistémica adentro de la planta anfitriona. Sin embargo, en un intento por eliminar cualesquier restricciones estructurales que, a través de la presión de selección, pudieran dar como resultado la mutación reportada en MAL7 anterior, se modifica el sitio de inserción. La inspección del factor de temperatura de estructura de cristal muestra que Val10 está en una conformación relativamente rígida, mientras que el residuo Asp9 es muy flexible. Esto sugiere que debería ser posible duplicar Val10Tyr1 1 con el objeto de conservar simultáneamente el sitio de fijación de proteasa, y para cambiar residuos cargados potencialmente desestabilizadores adentro del péptido MAL7, a una posición con más terminales C en el término N de VP-S, con respecto a Val 10Tyr1 1 original. La quimera resultante se designa MAL8. La construcción MAL8 se usa para infectar plantas de caupí anfitrionas en un estudió separado. El perfil de la infección inicial es como se ve para MAL 7 en el Ejemplo 2. En detalle, una planta de cada cinco inoculadas con ADNc que codifica MAL 8 produce una lesión local después de 21 días, indicando una infección limitada sin diseminación sistémica aparente del virus. El virus purificado a partir de la lesión local se usa para inocular plantas de caupí frescas. Los síntomas de diseminación sistémica de la partícula de virus quimérico adentro de la planta son detectables después de 5 días. Esto es indicativo de infectividad mejorada, más probablemente la consecuencia de una mutación en el genoma viral. Los genomas de virus aislados de la segunda ronda de infección con MAL 8 se producen en ADNc, usando RT- PCR y el gen que codifica VP-S se secuencia a lo largo de ambas cadenas. Se confirma una mutación de novo en la posición de nucleótido 2931 , alterando una timidina a un residuo de citosina, generando mediante lo mismo un cambio de aminoácido de fenilalanina en la posición 191 , a una serina. Este cambio no conservador ocurre en un punto en la proteína de capa pequeña, VP-S, que está situada en la interfase entre las proteínas VP-S vecinas en el virión. Esta mutación es aparentemente permisiva para el ensamble viable in vivo y la diseminación sistémica de una partícula de CPMV quimérico, en la que se expresa internamente un péptido. Estos datos indican que se pueden seleccionar diferentes mutaciones de novo permisivas para el ensamble in planta de CVPs, capaces de expresar internamente un péptido extraño, y capaces de montar la infección de una diseminación sistémica adentro de una planta anfitriona de caupí, usando CVPs que expresen el mismo péptido internamente. Esto demuestra además que la localización de la mutación adentro de la partícula de virus, y que se activa presumiblemente por las restricciones estructurales generadas por el péptido insertado, depende hasta cierto grado del sitio de inserción preciso que se use, y no meramente del péptido mismo.

Ejemplo 4 Este Ejemplo demuestra un procedimiento in vivo para la selección y aislamiento de las mutaciones de novo en genomas de virus quiméricos que confieren una ventaja selectiva sobre el genoma de virus quimérico de tipo silvestre cognado, en la progresión de la infección y la diseminación sistémica de CVPs que expresan internamente péptidos. Con el objeto de reglamentar la posibilidad de que el fenómeno descrito en los Ejemplos 2 y 3 está restringido a CVPs que expresan internamente péptidos de malaria, se siguió un procedimiento para seleccionar partículas de virus quimérico que expresaran internamente péptidos en donde ocurrieran mutaciones de segundo sitio putativas. Se pueden seleccionar mutaciones permisivas para viabilidad (queriendo decir ensamble dentro de viriones recombinantes in planta), infectividad, diseminación sistémica o productividad mejoradas, como se describe posteriormente. Para los propósitos de la demostración del procedimiento, se describe el método de enriquecimiento y selección con referencia a un péptido, APGNYPAL, que define un epítope CTL derivado a partir de la nucleoproteína del virus Sendai. Brevemente, se diseña el ADNc para codificar una partícula de virus quimérico en la que el péptido (APGNYPAL, SEQ ID NO: 10) se inserta entre residuos de tirosina en, respectivamente, la terminal amino de posición 1 1 , y en la terminal carboxi de posición 20 al péptido una vez insertado en VP-S del CPMV. La tirosina en la posición 20 representa una duplicación de la tirosina en la posición 1 1 en la VP-S nativa, y se usa para mantener el sitio de fijación de proteasa de poliproteína putativa (como se describió antes). La construcción resultante se designa pSEN 1 . Después de la inoculación e las plantas de caupí anfitrionas con SEN 1 , son lentos para aparecer los síntomas de infección viral. Después de 18 días es visible la infección sistémica en solamente una de cada cinco plantas inoculadas. Los síntomas en las otras cuatro plantas están restringidas a lesiones locales en las hojas inoculadas. Se aislan las partículas de virus de las cuatro plantas en las que la infección está restringida a lesiones locales en las hojas, con los virus siendo aislados de una sola lesión. El ARN genómico como se aisla ex planta se transcribe inversamente mediante RT-PCR. La secuenciación subsecuente en ambas cadenas del ADNc así producido indica que los genomas de los virus aislados de las cuatro plantas contenían secuencias inalteradas. Después de otros 7 días (en el día 25 posterior a la infección) se observó diseminación sistémica en 3 de cada 5 plantas inoculadas. Se purificó el virus de las hojas sistémicamente infectadas y el ARN transcrito inversamente. El análisis de la secuencia del ADNc resultante revela una mutación de novo en el nucleótido 3199, cambiando un residuo de guanosina por la timidina de tipo silvestre. Consecuentemente, se incorpora un residuo de leucina en la posición 180 de la proteína de capa pequeña (VP-S) en lugar de la fenilalanina. Esta secuencia genómica mutada se correlaciona con la infección exitosa de plantas de caupí por CVP quimérico que expresa internamente un péptido derivado del virus de Sendaí. Esto ejemplifica la amplia utilidad de la interacción de virus de planta-anfitrión como un medió dinámico para enriquecer y seleccionar genomas de CPMV novedosos que codifiquen partículas de virus quimérico capaces de acomodar péptidos extraños expresados adentro del cápsido. Tomado junto con los Ejemplos 2 y 3, este ejemplo demuestra que el proceso de selección in vivo puede funcionar en, y aplicarse a CVPs que expresen internamente muchos péptidos diferentes, y que las mutaciones permisivas para mejor infectividad y diseminación sistémica de CVPs pueden ocurrir en muchos sitios diferentes adentro de la proteína de capa pequeña del CPMV.

Ejemplo 5 Este ejemplo demuestra la expresión internamente de un epítope CTL derivado a partir del virus de coriomeningitis linfocítica (LCMV). Los ejemplos delineados anteriormente demuestran que los péptidos con propiedades físico-químicas no conductoras a la expresión externamente de CVPs, se pueden expresar internamente. Sin embargo, es probable que haya una restricción de tamaño en los péptidos que se pueden insertar para que se expresen internamente en el virión del CPMV.

Por lo tanto, no es probable que los péptidos extraños sujetos a la expresión interna sean mayores a 20 residuos de longitud (aunque no es imposible que la experimentación empírica pueda identificar péptidos de mayor longitud que sean capaces de ser desplegados internamente). Una clase de péptidos que caen dentro de este rango de tamaño son los »« »AiMj^. Mtaiaa^-*^iA*^np««aB»J^g^^»-'-"-^^-Jí^ ?i 1 llamados epítopes de linfocito de célula T citotóxico (CTL). De manera importante, los epítopes CTL, en adición a ser típicamente de 6-9 residuos de longitud, son independientes de la conformación. De hecho, hay fuerte evidencia de que los epítopes CTL funcionan como epítopes lineales. Por lo tanto, esos epítopes deben ser ampliamente receptivos a inserción internamente en CVPs. Uno de esos epítopes (RPQASGVYMGNLTAQ; SEQ I D NO: 6) se encuentra en el virus de coriomeningitis linfocítica. Cuando se despliega externamente en CVPs esta secuencia presenta problemas debido a su elevada carga positiva. Por lo tanto, se añaden tres aminoácidos extra (ácido glutámico, glicina y alanina) a su término N , en un esfuerzo por generar un péptido con una carga superficial más neutra cuando ésta se expresa externamente en una CVP. Los síntomas producidos después de la infección de una planta de caupí anfitriona por esta construcción particular, son variables e impredecibles, puesto que el virus quimérico producido es intrínsecamente inestable. En adición, hay disociación severa del epítope externamente presentado, y en ratones no se pudo medir ninguna respuesta de células T específica para las partículas de virus quimérico. Con el objeto de confirmar que los epítopes CTL constituyen una clase importante de péptidos extraños capaces de expresión internamente en CVPs, se inserta ADN que codifica este epítope CTL conocido del virus de coriomeningitis linfocítica (RPQASGVYMGNLTAQ; SEQ ID NO: 6) dentro del término N de la VP-S. El mismo epítope (sin los aminoácidos adicionales Glu, Gly y Ala) se inserta en el término N de la VP-S, en una posición entre Tyr1 1 y un residuo de tirosina duplicado, inmediatamente corriente abajo del " -ttF'- - -*""-- péptido extraño en una construcción de proteína de capa pequeña, conocida como LCMV2. La inoculación del ADN da como resultado síntomas virales en 3 de cada 5 plantas inoculadas. El análisis RT-PCR seguido mediante la secuenciación del producto ADNc verifica que la secuencia de la construcción quimérica no se altera, y corresponde con aquella inoculada dentro de la planta. El rendimiento del virus es de 25 miligramos de 29 gramos de hojas. El análisis mediante electrofóresis en un gel de poliacrilamida de desnaturalización al 15 por ciento, confirma que no hay ninguna disociación del péptido LCMV como se anticipaba para un péptido que se internaliza. Por lo tanto, se demuestra que un péptido representativo de una clase grande e ¡nmunológicamente importante de epítopes, los epítopes de linfocito T citotóxico (CTL), se puede expresar internamente en una partícula de virus quimérico. Por otra parte, el mismo péptido particular confirma que la internalización de péptidos cargados positivamente en CVPs representa una solución técnica a la impredecibilidad del comportamiento y la inestabilidad potencial de CVPs que expresan internamente péptidos con esas características. Además, esto demuestra que un péptido de 15 residuos aminoácidos de longitud se puede acomodar exitosamente adentro de una CVP, sin el requerimiento de mutaciones de segundo sitio.

Ejemplo 6 Este ejemplo demuestra la eficacia inmunológica de los epítopes de CTL expresados internamente en las partículas de virus quimérico. La construcción de CVP descrita anteriormente, LCMV2, que expresa un epítope de CTL del virus de coriomeningitis linfocítica en el interior de la partícula, se usa para inmunizar ratones. En el día 0 y el día 14 se inyectaron subcutáneamente 100 µg, con o sin un adyuvante, QS- 21 . Como un control, también se inoculó CPMV de tipo silvestre en animales de prueba, con y sin QS21 . En el día 42 se removieron los bazos, y se realizaron ensayos CTL 8 días después (ver Current Protocols in Immunology, Volumen 1 , sección 3.1 1.4 y ff). Las células T citotóxicas purificadas a partir de los ratones infectados con LCMV2 en QS21 , promovieron la lisis de hasta el 46 por ciento de las células objetivo (Figura 2). No se vio ninguna respuesta de CTL al LCMV2 en la ausencia de adyuvante. En ratones inoculados con CPMV de tipo silvestre, no se observó ninguna respuesta de CTL específica, con o sin el adyuvante. Aparte de la respuesta de CTL, se observó una respuesta de ayudante T específica al epítope muy fuerte, en células purificadas de los bazos de ratones inyectados con LCMV2. Está claro por el desempeño inmunológico de la construcción de LCMV2, que los CVPCs con epítopes desplegados en el interior de las partículas, pueden inducir tanto una respuesta de CTL a un péptido específico, como una respuesta de ayudante T específica al péptido fuerte. No se observó ninguna respuesta de CTL, sin embargo, en ratones inmunizados con MAL8, VSV1 , o SEN 1 . Esto puede tener que ver con las dificultades para procesar el epítope en las células que presentan el antígeno.

Ejemplo 7 Este ejemplo demuestra la síntesis de partículas de virus quimérico de anfidespliegue (ADCVPs, que son partículas de virus quimérico individuales que expresan simultáneamente epítopes interna y externamente en un solo virión. La habilidad para expresar péptidos adentro de CPVs estables, tomada junto con la habilidad (separadamente) para expresar un rango grande de péptidos externamente en CVPs estables, da origen a la posibilidad de que en una sola partícula se puedan presentar simultáneamente cuando menos dos péptidos; uno internamente, el otro externamente. En particular, ia presencia internamente de un epítope de célula ayudante T puede mejorar la respuesta inmune a otros epítopes coexpresados externamente en las mismas partículas. Para probar ésto se hace uso del concepto de un epítope (GVSTAPDTRPAPGSTA; SEQ ID NO: 35) asociado con una forma variante de la proteína de mucina epitelial polimórfica que se encuentra predominantemente en las células de tumores sólidos. El perfil inmunológico de este epítope en CVPs está bien caracterizado. Las combinaciones de péptidos de los que se sabe que son reactivos en modelos animales se insertan en sitios seleccionados, mediante la manipulación genética molecular del genoma de CPMV. Hasta la fecha, tres sitios externos están establecidos como puntos de inserción viables en VP-S para el despliegue externo de los péptidos en CVPs: el ciclo ßBßC, el ciclo ßB'ßC", y el término carboxilo; mientras que se representa un cuarto sitio de inserción externo en los CVPs mediante el ciclo ßEaB de la VP-L. Para probar la eficacia de la combinación de epítopes internamente con epítopes externamente en una sola CVP, se hacen combinaciones como se delinean en la siguiente Tabla 3.

Las siguientes construcciones inducen buenos síntomas (ver antes): MUC39, HCG 16, MUC41 , MUC42, y MUC47. Estos resultados indican que se pueden combinar las inserciones en el ciclo ßBßC o el ciclo ßB'ßC" de VP-S de manera más efectiva con inserciones pequeñas (8 aminoácidos) en el término N de VP-S, dentro del rango de tamaños de inserción demostrado anteriormente para este sitio de CVP interno. Sin ^sa^n t^fa^^ia. íiiíityit-iii^^MSi^ lBÉi embargo, las inserciones en el término C de VP-S aparentemente no son sensibles al tamaño de las inserciones en el término N adentro del rango establecido de tamaños de inserción.

Ejemplo 8 Este Ejemplo demuestra la eficacia inmunológica de partículas de virus quimérico de anfidespliegue (ADCVPs) para producir respuesta de ayudante T específicas. Se investigó el efecto estimulante de un epítope de ayudante de célula T en el término N sobre la respuesta inmune a un epítope de célula B insertado en otro lugar, mediante la comparación inmunológica de una CVP que expresa un epítope de célula ayudante T externamente, con dos partículas de anfidespliegue diferentes que expresan el mismo epítope de célula ayudante T internamente, en conjunción con diferentes epítopes de célula B. H BV15 es una CVP que expresa un octámero derivado a partir del péptido 2F10 en un sitio interno (ver el Ejemplo 1 anterior); M UC 39 expresa el mismo octámero internamente junto con un péptido derivado de la mucina variante humana asociada con tumores sólidos, MUC1 p (MUC 14) expresado externamente en el ciclo ßBßC; y MUC42 expresa simultáneamente el mismo mimótopo de 2F10 internamente, y un péptido derivado de MUC1 p (MUCL) externamente en el término C de VP-S (ver el Ejemplo 7 precedente). Se inmunizaron tres grupos, cada uno de 5 ratones, con 5 pg de HBV15, MUC39 o MUC42, en la presencia de QS-21 , en los días 0 y 21 .

Se recolectó el suero en los días 21 , 28 y 42, y se examinó para ver los anticuerpos específicos tanto a 2F 10 como a MUC 1 , mediante ELISA. En * ^tÉi St^a^e^ ^'^^-!ii:te3 la Tabla 4 se resumen los títulos medios de los anticuerpos específicos para el péptido de mucina.

En cada punto de tiempo, los ratones inmunizados con CPMV- MUC39 generaron títulos de anticuerpos anti-MUC más altos (aproximadamente una dilución más alta) que los ratones inmunizados con CPMV-MUC14, sugiriendo que puede haber un efecto estimulante del epítope ayudante T sobre la respuesta de células B anti-MUC. De los ratones inmunizados con CPMV-MUC42, uno de cada cinco produjeron el anticuerpo específico a MUC1 p; mientras que cuando no se coexpresó 2F10 con un epítope de célula ayudante T, ningún ratón produjo el anticuerpo específico a MUC1 . Esta reacción estuvo en un nivel modesto en el día 28, y el título declina para el día 42. Por lo tanto, la presencia del 2F10, un epítope de célula ayudante T, puede mejorar la respuesta a un epítope de célula B ejemplificado por el péptido Mud p. Cuando se examinaron las respuestas de las células T específicas a 2F10 (Tabla 5), las células del bazo de los ratones fe^^^ £''tfia^i»fc^ ¿j ¿^^^á j^^^ ^ fto MMi ^ ^&iL inmunizados con CPMV-MUC39 proliferaron en respuesta al péptido 2F10. Consistente con los niveles relativamente bajos de los anticuerpos específicos al péptido Mud p producidos por la construcción MUC42 (Tabla 5), no hay ninguna estimulación aparente de proliferación de células T citotóxicas específicas por el péptido 2F10 en este ensayo.

Estos datos indican que se puede usar la coestimulación de una respuesta inmune con un epítope de CTL para activar una respuesta mejorada a un péptido presentado conjuntamente, pero no relacionado.

Ejemplo 9 Este Ejemplo demuestra la expresión e internalización de un epítope de ayudante T universal poderoso, a través de la selección de mutaciones de novo adicionales, en sitios aparte de en el péptido insertado. Se sabe que un epítope de ayudante T, derivado a partir del toxoide de tétano (VDDALI NSTKIYSYFPSV; SEQ I D NO: 15) tiene un efecto inmunoestimulador fuerte en un amplio rango de organismos, y con un rango correspondientemente amplio de haplotipos. Con el objeto de mejorar adicionalmente las propiedades inmunogénicas del CPMV como un sistema que presenta el epítope, se puede incorporar el toxoide de tétanos dentro de las partículas de virus quimérico. Con el objeto de conseguir ésto, se reemplaza la valina en la posición 10 (VaM O) con el epítope mismo. Puesto que el epítope de toxoide de tétanos empieza y termina con un residuo de valina, existen por omisión diez aminoácidos "nativos" en el término N del virus mutado, que probablemente sean suficientes para mantener el sitio de fijación de proteasa de poliproteína putativa. Esta construcción resultante se designa TT4. Después de la inoculación del ADNc directamente sobre las plantas de caupí, Daisgaard y colaboradores, supra, la construcción TT4 muestra síntomas de infección desde el día 14 hacia adelante, en la forma de lesiones locales en las hojas inoculadas. No tuvo lugar la infección sistémica de las plantas anfitrionas. Los virus purificados a partir de estas lesiones locales se transfieren directamente sobre plantas de caupí jóvenes en una infección de segunda ronda. Las lesiones locales se vuelven visibles dentro de los 5 días de infección, con la infección sistémica evidente dentro de unos 7 días adicionales. Esta viabilidad mejorada en toda la probabilidad indica la selección adentro de la población de virus en la que ha ocurrido una mutación de novo en el genoma viral. El ARN del virus purificado 10 días después de la inoculación del segundo grupo de plantas de caupí se somete a RT-PCR, y se realiza la secuenciación del ADNc resultante. El análisis revela muchas mutaciones de punto individuales, las cuales se verifican mediante la secuenciación del ADNc en la cadena opuesta. En conjunto se observan iá ..-i..¡ ¿ -.....AiAtA -,. ,-!. 1,. **,..» , ,.. *,* £.***. .» -?jtatt?í . . ..^ ^Jt^. seis mutaciones de novo en los diferentes clones: -G2388A, que da como resultado una mutación Arg2102Lys en la proteína VP-L. (Esta mutación se observa surgiendo independientemente en tres clones separados); -A3188G, que lleva a una mutación Met177Val en la proteína VP-S; -A3029G, que lleva a una mutación lle 124Val en la proteína VP-S; y, -G2388A que da como resultado una mutación lle2045Met en la proteína VP-S. Con el objeto de probar si estas mutaciones son suficientes para producir la construcción TT4 infecciosa en una infección primaria, se generaron 3 construcciones nuevas, usando como la estructura base del vector genomas de partículas de virus quimérico novedosos que contienen respectivamente, las mutaciones G2388A (Arg2102Lys en VP-L), LA A3188G (Met177Val en VP-S) y A3029G (lle124Val). Las plantas inoculadas con estos clones nuevos mostraron síntomas locales de infección 6 días posteriores a la inoculación, y síntomas sistémicos dentro de otros 4 días. Esta es una clara indicación de que las mutaciones de segundo sitio, individuales, son suficientes para producir la construcción TT4 revisada infecciosa. Esta construcción proporciona una demostración de muchas características de la inserción de los epítopes en la superficie interna del CPMV. En el primer caso, ésto demuestra que el ayudante T así como los epítopes de CTL se pueden presentar como péptidos desplegados ^^^ .s..tos^<ji^s ¿A»*t¿a«aikH^,-fc^^^ ¡t¡?.. ,i t.*¡ internamente en el CVPS. Además, está claro que no se tiene que duplicar Tyr1 1 con el objeto de generar CVPs capaces de montar una infección viable en plantas. La presencia de 10 aminoácidos naturalmente ocurrentes en el término N del CPMV es suficiente para viabilidad e infectividad. También está claro que hay muchas mutaciones de segundo sitio diferentes que pueden mejorar grandemente la viabilidad de una construcción con un epítope insertado en el término N de la VP-S del CPMV, y que estas mutaciones pueden ocurrir ya sea en la VP-S misma, o en la VP-L (la proteína de capa grande). El hecho de que las mutaciones particulares se encuentran independientemente en clones separados, enfatiza que ciertas mutaciones de segundo sitio se seleccionan más rápidamente que otras. Esto representa un medió para identificar puntos calientes mutacionales en el vector viral de utilidad, para crear partículas de virus quimérico novedosas que clonen vehículos capaces de generar CVPs novedosos para desplegar un amplio rango de péptidos extraños.

Ejemplo 10 Este Ejemplo demuestra la expresión e internalización de un epítope de ayudante T universal poderoso, derivado del toxoide de tétanos, en combinación con un epítope de células B insertado en un ciclo de VP-L en el CPMV externo. Puesto que el toxoide de tétanos es un epítope de ayudante T universal, vale la pena investigar la posibilidad de combinar el despliegue de este epítope en el interior del CPMV, como se describe en el Ejemplo 9, de tal manera que éste se coexprese en una * .. ,,,. fe^jna*^ ,.«.,, - jifr nr-A ---». ^.J^A.,*. .**^.^.^.^.^^^.^^ . ; sola partícula con epítopes presentados en la superficie externa de una CVP. Con este fin, se hace una construcción en la que se insertan dos péptidos derivados de Pseudomonas aerugiosa en tandeo en el ciclo ßEaB del dominio B de la VP-L (péptidos 9 y 10 de la proteína de membrana externa, TDAYNQKLSERRAGADNATAEGRAI N RRVEAE; SEQ ID NO:36; Brennan y colaboradores, supra), mientras que el epítope de toxoide de tétanos se inserta en el término N de la VP-S. Esta construcción se designa pPAE14. Después de la inoculación del ADNc directamente sobre las plantas de caupí, la construcción PAE14 mostró síntomas de infección (lesiones locales en las hojas inoculadas) desde el día 14 en adelante. Sin embargo, no siguió la infección sistémica de las plantas anfitrionas. El virus purificado a partir de estas lesiones locales se transfiere directamente sobre plantas de caupí jóvenes, con el objeto de iniciar una infección secundaria. Las lesiones locales se hicieron visibles dentro de los siguientes 5 días, y siguió la infección sistémica subsecuente dentro de la siguiente semana. Esto indica la selección de un virus novedoso, cuyo genoma ha acumulado una mutación de novo. Se sometió el ARN de los virus purificados 10 días posteriores a la inoculación del segundo grupo de plantas de caupí, a RT-PCR y se realizó la secuenciación del ADNc resultante. El análisis revela muchas mutaciones de un solo punto en la población, que se conformaron mediante ia secuenciación del ADNc de la cadena opuesta. Las mutaciones observadas en los diferentes clones son: -A3029G, que lleva a la mutación Me 124Val en la VP-S (Cf. Ejemplo 9 en donde ocurre una mutación diferente en esta misma posición); y -T3189C, que da como resultado la mutación Met177Thr. (Como anteriormente, en el Ejemplo 9 se reporta una mutación diferente en esta misma posición). Este ejemplo indica que es posible expresar simultáneamente un epítope en el interior de un virus de planta quimérico tal como CPMV, en combinación con un epítope en VP-L, de tal manera que éste se presente externamente. Las mutaciones de segundo sitio que se observaron indican que se pueden encontrar mutaciones similares para diferentes construcciones (por ejemplo, A3029G en el Ejemplo 9 y en el presente), y que pueden ocurrir diferentes mutaciones así seleccionadas en una sola posición de aminoácido, llevando a una CVP con ¡nfectividad grandemente mejorada.

* Ejemplo 1 1 Este Ejemplo demuestra la expresión e internalización de un epítope de ayudante T universal poderoso, derivado del toxoide de tétanos, en combinación con un epítope de células B presentado en el CPMV externo, insertado en un ciclo de VP-S. Puesto que es posible combinar la expresión de un epítope de ayudante T universal de una superficie interna del CPMV, con un epítope en la superficie externa del virus, por medió de hacer uso del ciclo ßEaB del dominio B de la VP-L (Ejemplo 10), vale la pena intentar combinar la expresión del epítope de toxoide de tétanos con la expresión de epítopes en el ciclo ßBßC de VP-S. En el Ejemplo 7 se describe un planteamiento similar con el mimótopo 2F 10 del virus de hepatitis B. Por lo tanto se hizo una construcción en la que el epítope de toxoide de tétanos se inserta en el término N de VP-S, como se describió en el Ejemplo 9, mientras que se inserta un péptido de mucína (GVTSAPDTRPAPGSTA; SEQ I D NO: 37) en el ciclo ßBßC de VP-S, entre Ala22Pro23 esencialmente como se describe en Daisgaard y colaboradores, supra. Esta construcción se designa pMUC51 . Después de la inoculación del ADNc sobre las plantas de caupí, el MUC51 no mostró ningún síntoma de infección, aún después de 21 días. Por esta razón, se hizo una construcción de ADNc, idéntica a pMUC51 , excepto que se codifica una mutación de segundo sitio como se reportó en el Ejemplo 9 (A3188G: Met177Val) en el vector de virus quimérico. Esta construcción novedosa se designa pMUC53. Después de la inoculación del ADNc sobre las plantas de caupí, la construcción MUC53 no mostró síntomas de infección hasta el día 14. No ocurrió la infección sistémica de las plantas anfitrionas. Los virus purificados a partir de estas lesiones locales se transfieren directamente sobre plantas de caupí jóvenes para cebar un segundo ciclo de infección. Las lesiones locales se volvieron visibles dentro de los siguientes 5 días, y siguió rápidamente una infección sistémica subsecuente dentro de los siguientes 7 días. Esto indica probablemente la selección de otra mutación en el genoma del virus. Los virus se purificaron de las plantas 10 días posteriores a la inoculación, y el ARN genómico se produjo en ADNc mediante RT-PCR. El análisis de la secuencia de ambas cadenas complementarias confirmó la ocurrencia de mutaciones de novo adicionales: . * JfcMt^t J».fJ*-*-^a>B_Mltrf> fcAflftjfc> ^^?^a^-A»' *Z-& í '» -> -G2357A, que lleva a Ala492Thr en la VP-L; y -G2898A, que provoca GlydOAsp en la VP-S. Estos experimentos muestran muchas características útiles de la internalizacíón de los epítopes. Está claro que es posible combinar ia inserción de epítopes en el ciclo ßBßC de la VP-S, con epítopes en el término N de la VP-S, aún si el último epítope tiene 18 residuos aminoácidos de longitud. Además éstos muestran que en algunos casos las mutaciones de segundo sitio solas no son suficientes para generar una construcción infecciosa, pero que se necesitan seleccionar mutaciones de tercer sitio para proporcionar partículas de virus quimérico capaces de montar una infección. En el Ejemplo 12 a continuación se describe un método para seleccionar esas mutaciones de orden más elevado, así como las mutaciones de segundo sitio.

Ejemplo 12 El siguiente Ejemplo presenta un protocolo para la selección de genomas de partículas de virus quiméricos novedosos, capaces de la internalización y/o anfidespliegue de los péptidos. La consideración de los ejemplos anteriores informa una razón principal para la selección in vivo de partículas de virus de planta novedosas, capaces de acomodar internamente péptidos refractivos a internalización o anfidespliegue usando CVPs de tipo silvestre como vectores. Por lo tanto, se pueden usar el siguiente protocolo y las variantes del mismo para seleccionar vectores CVP novedosos. 1 . Una secuencia que codifica un péptido se clona dentro i^AAit^ x. ,^j,.^.. ^?^^^— ^.. de una molécula de ADNc infecciosa que codifica CPMV-ARN (por ejemplo, pCP7 o pCP26), por medió de la ligación de dos o más oligonucleótidos hibridizados o un fragmento de ADN de una fuente extraña. Se puede hacer uso de los sitios de restricción que son adyacentes a la secuencia que codifica el término N de VP-S (por ejemplo, los sitios ?/ 7ß1 y Eco01091 únicos). La localización exacta en la que se inserta de preferencia el péptido es de preferencia entre VaH O y Tyr1 1 , entre una duplicación de Val10Tyr1 1 , o entre una duplicación de Tyr1 1 . También es posible usar el clon de ADNc en el que ya se haya insertado el péptido (por ejemplo, ßBßC de VP-S), de al manera que se puedan codificar y presentar simultáneamente en una partícula muchos epítopes. 2. En el caso del virus de mosaico de caupí, se inoculan plantas de caupí de aproximadamente 10-14 días de edad (o en cualquier otro momento durante el crecimiento de la planta y antes del inicio del florecimiento*) con el clon como se construyó en el paso 1 , en combinación con un clon de ADNc que codifique a CPMV-ARN 1 . (Cualquier otro anfitrión susceptible para CPMV se puede infectar en un momento adecuado antes del inicio del florecimiento*). [*Los virus son capaces de montar una infección sistémica en la planta anfitriona apropiada hasta que se haya detenido la fase de crecimiento, y en el caso de plantas que florecen, hasta que ocurre el florecimiento]. 3. Se monitorean las plantas de cerca para ver la aparición de los síntomas de infección. Para una buena partícula de réplica, se pueden esperar las lesiones locales en las hojas inoculadas después de 4-6 días, aunque éstas no siempre son claras. Se pueden esperar los . ¡ üHH lf| niMinijjf iji AMi síntomas sistémicos después de 10-14 días posteriores a la infección. Si hay signos claros de infección sistémica, se cosechan las plantas 3-4 semanas posteriores a la infección, y se purifica el virus (paso 5). Si se toman 14 días o más antes de que aparezcan las primeras lesiones locales, y no hay ningún síntoma sistémico o hay muy pocos hasta 3 semanas posteriores a la infección, es probable que hayan ocurrido mutaciones espontáneas in planta. En este caso, se necesita transferir el virus a plantas frescas, como en el paso 4. Si no hay síntomas detectables en absoluto, se pueden requerir mutaciones adicionales (ver los pasos 7 y 8). 4. Si los únicos síntomas son lesiones locales en lugar de lesiones sistémicas, que se hacen evidentes 2 semanas o más posteriores a la infección (y antes del inicio del florecimiento, o el cese de la fase de crecimiento de la planta), éstas se cortan de las hojas y se transfieren individualmente a un tubo de ensayo. A cada tubo de ensayo se añade algo de agua o cualquier regulador del pH adecuado para el almacenamiento de las partículas de virus, y se trituran los fragmentos de la hoja. La suspensión resultante se usa para inocular plantas de caupí jóvenes frescas (u otra planta anfitriona apropiada), como se describe en el paso 2. Esto llevará a lesiones locales aproximadamente 5 días posteriores a la infección, y a síntomas sistémicos 3-6 días después. Las hojas se cosechan. El virus se puede purificar a partir de las hojas, por ejemplo, mediante la extracción con cloroformo/butanol, seguida por precipitación por PEG (van Kammen y de Jaeger Cowpea mosaic virus, In: CMI/AAB Description of Plant Viruses 197, bÉ', á ^-r .állÉÍi.t??pr^ Commonwealth Agricultural Bureaux

[1978]). Se purificaron muestras de cada planta individual para el análisis de la secuencia (Brennan y colaboradores, supra). 6. La partículas virales se usan en una reacción de RT estándar con un cebador que es capaz de hibridación específica a, y cebación de transcripción inversa ya sea del gen VP-S o el gen VP-L. El producto de RT se amplifica por medió de PCR, usando cebadores que amplifiquen ya sea el gen VP-S o el gen VP-L, o ambos. Se secuencian los productos de PCR, de tal manera que se pueda determinar la secuencia de la VP-S o la VP-L en ambas cadenas. Si no hay mutaciones en los epítopes insertados, la construcción se puede usar para, entre otras cosas, análisis inmunológicos. 7. Si se identifican mutaciones de segundo sitio, éstas se pueden introducir en derivados novedosos de los clones de ADNc descritos en el paso 1 , ya sea mediante mutagénesis dirigida al sitio, o mediante el corte y el empaste de los fragmentos del ADNc del paso 6 dentro del clon infeccioso. 8. Si en el paso 4 no hay síntomas en absoluto, se puede introducir una mutación de segundo sitio conocida identificada en una construcción diferente, o cualquier otra mutación que pueda generar un clon infeccioso, en el clon de ADNc hecho en el paso 1 y modificado como en el paso 6. Con la nueva construcción repetir todo el procedimiento de infección, siguiendo los pasos 2-5. Si hay buenos síntomas en el paso 4, la mutación introducida puede ser suficiente para la infección y réplica de CVPs in planta. Si solamente hay lesiones locales, es probable que hayan tenido lugar mutaciones de tercer sitio. Esto se puede investigar o confirmar por medió de seguir los pasos 5 y 6. 9. Se puede hacer un banco de vectores de virus con diferentes mutaciones de tercer sitio o de tercer sitio (o de sito adicional), adentro de las cuales se pueda ligar un epítope, como se describe en el paso 1 anterior. En este caso es importante proceder con la transferencia de una lesión local en el paso 4, para asegurarse de que las plantas sistémicamente infectadas contengan un solo clon del virus.

Ejemplo 13 Este Ejemplo demuestra la aplicación de una mutación de segundo sitio de novo para mejorar la infectividad y réplica de un vector de virus que exprese un péptido extraño diferente del péptido cuya expresión interna generaba la presión para la selección de la mutación in vivo. Un péptido derivado a partir de la proteína de nucleocápsido del Virus de Sendai (con la secuencia de aminoácidos, HGEFAPGNYPALWYSA; SEQ ID NO: 1 1 ) se inserta en el término N de la VP-S del CPMV, en un sitio entre los residuos de tirosina duplicados (esto es, la terminal amino Tyr1 1 al péptido insertado y un segundo residuo de tirosina inmediatamente de terminal carboxilo a la secuencia insertada). Esta construcción se designa pSEN2. Después de la inoculación del ADNc en las plantas de caupí, el SEN2 no mostró ningún síntoma después de 21 días. Por esta razón, se hizo una construcción que era similar a pSEN2 , pero que difería en que el vector de virus quimérico contenía una mutación de segundo sitio, Phe91 Ser, seleccionada en una construcción que .« ..,....* -« -¿t^HÉf-? titftri -jrttr ?i ' t*¡2j**~** *i**.* s&¡*i » expresaba un epítope de malaria (MAL8; ver el Ejemplo 3). Esta construcción se designa pSEN3. Después de la inoculación de ADNc en plantas caupí, la construcción SEN3 mostró síntomas de infección en las hojas inoculadas desde tan temprano como el día 6, y los síntomas sistémicos aparecieron 4 días después en 4 de cada 5 plantas inoculadas. Se cosecharon las plantas 21 días posteriores a la infección. El virus se purificó a partir de las hojas inoculadas, y se observó un rendimiento de 50 mg de virus de 47 g de hojas. Se sometió el ARN del virus purificado 21 días posteriores a la inoculación a RT-PCR, y se realizó el secuenciación del ADNc resultante en ambas cadenas. El análisis reveló que la secuencia no cambió de la secuencia de la construcción pSEN3 que se usó para inocular las plantas. Esto demuestra claramente que es posible aplicar una mutación de segundo sitio particular, seleccionada en una construcción que exprese un péptido internamente, para facilitar la expresión internamente de otro péptido no relacionado insertado en esencialmente la misma posición. Esto indica que las mutaciones de segundo sitio tienen amplia utilidad en la expresión internamente de péptidos, y en principio en la construcción de otras partículas de anfidespliegue, de conformidad con los Ejemplos 7 y 8. Por lo tanto es posible seguir los medios delineados en los Ejemplos 12 y 13 en la presente, para construir un banco de vectores que se puedan probar para ver la expresión de péptidos en el interior del virus, sin experimentación indebida.

Ejemplo 14 Este Ejemplo demuestra la expresión de un epítope de células T en el interior de una partícula de virus de planta, para contrarrestar la exposición de ese epítope a los elementos de la respuesta inmune humoral (por ejemplo, anticuerpos circulantes) y la inmunomodulación por ruta de presentación de inmunógeno o antígeno. La finalidad de muchas vacunas basadas en péptidos es la inducción de una respuesta celular más bien que humoral (anticuerpo) al epítope que se esté presentando. En particular, la intervención terapéutica en cáncer se está reconociendo incrementadamente como siendo la más efectiva si se puede estimular una respuesta inmune celular. Sin embargo, puesto que también los anticuerpos que circulan en el suero pueden reconocer al epítope de interés presentado, siempre existe la posibilidad de que el inmunógeno introducido para estimular una respuesta inmune deseada pueda inducir una respuesta humoral más bien que celular al péptido presentado. Además, la presencia accidental de anticuerpos circulantes capaces de fijar la composición ¡nmunogénica o antigénica introducida, puede imposibilitar la estimulación apropiada y efectiva de una respuesta inmune deseada por medió de despejar el complejo. De hecho, éste es potencialmente un problema con cualquier sistema de presentación de péptidos en el que los péptidos se desplieguen en el exterior de un portador macromolecular tal como la hemociasnina limpete de orificio (KLH). Por otra parte, la expresión de un péptido tal como un epítope adentro de una partícula, por ejemplo, en un virus quimérico de planta, protege a ese péptido de la fijación de anticuerpos. Esto no solamente iMifi-fÉm líií ' rr - íiiinii li ajiíí ?? ' .1 iíilíti.Míilitiirilrii ffilti Mil ?f- IJíiTl " impide una respuesta humoral no deseada al epítope, sino que también ayuda para permitir que el péptido sobreviva el despeje y la proteólísis hasta que éste se haya presentado a, y procesado mediante las células de presentación de antígeno (APCS) del sistema inmune. Por estas razones, la internalización de epítopes en el CPMV u otros virus de plantas tiene aplicabilidad para la expresión de epítopes que puedan correaccíonar con anticuerpos circulantes, y en consecuencia se puede usar para dirigir el tipo de respuesta inmune de una respuesta humoral a una celular. Esto también es válido para la expresión de mimótopos de péptido. Para aplicaciones inmunoterapéuticas con péptidos se requiere la inducción de células T particularmente citotóxicas. Para que ésto suceda, se deben enviar epítopes capaces de producir una respuesta de células T citotóxicas, y presentarse por medió de las células, de tal manera que el epítope del péptido se procese y se presente en las moléculas MHC 1 1. La presentación por esta ruta contrarresta una respuesta de anticuerpos directa y, en vez de eso, produce la estimulación de poblaciones de linfocitos T citotóxicos específicos. Esos linfocitos subsecuentemente tienen por objetivo las células que despliegan el péptido en cuestión directamente, llevando a la lisis de la célula o a la evacuación de las células objetivo o antígenos después de la opsonificación. Se sabe que un péptido derivado de una proteína, mucina, que se encuentra en grandes cantidades en la superficie de células de cáncer humano de pecho (y otros), es capaz de inducir respuestas CTL en ratones cuando se acoplan a un portador. El polipéptído de mucina, como se encuentra en las células de cáncer, difiere de la forma ubicuita de la proteína que se encuentra en la superficie de muchas células no de cáncer, en el sentido de que éste se modifica post-traslacionalmente de manera diferente. En los intentos por inmunizar animales de prueba con una vacuna que contiene péptido de mucina, se encontró que los anticuerpos reactivos transversalmente de Mud p cambian la respuesta inmune producida de una celular a una humoral. Cuando se usa el mismo inmunógeno para vacunar humanos, sigue una respuesta de anticuerpos en lugar de una respuesta celular, puesto que el péptido antigénico reacciona transversalmente con los anticuerpos contra el epítope Gal alfa(1 ,3)Gal, normalmente presente en los determinantes de algunos agrupamientos de sangre en humanos, pero no se encuentra en ratones. Una solución técnica es expresar el mismo péptido como una inserción en el término N de la VP-S del CPMV, entre una duplicación de Tyr1 1. Cuando se usan estas partículas para inmunizar humanos, los anticuerpos no se pueden fijar al epítope insertado directamente. Una respuesta celular al epítope tiene lugar de preferencia a través de la captación y presentación del péptido Mud p en las células de presentación del antígeno (APCs). La estimulación de subpoblaciones de CTL específica para el epítope de péptido Mud p, da como resultado la lisis o evacuación de las células objetivo que llevan esencialmente el mismo epítope en sus membranas celulares.

Ejemplo 15 Este Ejemplo demuestra la producción de una CPV que íiL- ?.? .ti. >dtt* »**»**«-«—*"«- »• M ^ ^ i. ^,^^ j ^?-1 l contiene un epítope de CTL de virus de sarampión. Se insertó un epítope CTL de virus de sarampión (LDRLVRLIG; SEQ ID NO: 13), que estaba positivamente cargado, en el término N de VP-S, entre una duplicación de Y1 1 . Esta construcción es pMV14. Las plantas inoculadas con esta construcción no mostraron ningún síntoma. Se insertó el mismo epítope entre una duplicación de V10Y1 1 (=pMV15), y ahora se observaron síntomas en dos de cada cinco plantas inoculadas. Cuando se transfirió el virus purificado a plantas de caupí jóvenes, se observaron muy buenos síntomas. Se secuenciaron ambos genes de proteína de capa completamente, y se encontraron que eran correctos.

Ejemplo 16 Este Ejemplo demuestra la producción de una CPV que contiene un epítope de CTL de virus de estomatitis vesicular. Se ha expresado exitosamente un epítope CTL de virus de estomatitis Vesicular (RGYWQGL; SEQ ID NO: 12) en partículas TY, y estas partículas indujeron respuestas CTL muy buenas en ratones (Layton y colaboradores, Immunology 87: 171 -178

[1996]). Se insertó este mismo epítope entre Y1 1 duplicado en VP-S de CPMV. Esta construcción es PVSVI. Se vieron buenos síntomas en 4 de cada 5 plantas inoculadas con esta construcción. El virus dio muy buenos rendimientos (0.79 miligramos/gramo de hojas).

Ejemplo 17 Este Ejemplo demuestra la construcción de vectores que contienen oligoalanina flaqueando un epítope CTL. Se sabe que para el procesamiento apropiado de los epítopes CTL mediante las células de presentación de antígeno, son cruciales los residuos que flanquean al epítope. Se sabe muy poco, sin embargo, de cuáles residuos son óptimos en conjunción con ciertos epítopes. Se ha observado que la inserción de trechos cortos de alaninas en cualquier sitio del epítope puede ser de ayuda para mejorar la respuesta a un epítope CTL insertado en un portador de proteína (Del Val y colaboradores, Cell 66: 1 145-1 153 [1991 ]). Se ha hecho un vector con cinco alaninas entre una duplicación de V10Y1 1 , mientras hay un sitio Notl único en este inserto (=pP35). El vector por sí mismo fue infeccioso para las plantas de caupí, aunque los síntomas vírales se suprimieron con respecto al virus WT. La inserción de epítopes en este trecho oligo-A puede ser útil para estudiar la optimización del procesamiento del epítope CTL, en caso de que los epítopes solamente den respuestas inmunes débiles. Se insertó un epítope de malaria en el sitio Notl para hacer pMAL1 1 . Esta construcción dio buenos síntomas en las plantas. Puesto que no se observó ninguna respuesta CTL en el epítope de virus de sarampión de pMV15 en ratones (ver anteriormente), se hizo una construcción adicional en la que se flanqueó este epítope por muchas alaninas en cualquier lado. Esta construcción, pMV16, no fue infecciosa en las plantas de caupí. En analogía a pSEN3 (ver anteriormente), se aplicó una mutación de segundo sitio de una construcción no relacionada, a pMV16 (M177V, derivado de pTT4). Esta construcción, que se llamó pNW17, no dio ningún síntoma en las plantas. Los siguientes vectores virales de planta útiles están en depósito en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. , USA, bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento y Regulaciones de Patentes bajo el mismo: pTB2 (ATCC Número 75280) y pTBU5 (ATCC 75281 ). Los detalles de construcción de estos plásmidos se declaran en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,589,367 incorporada a la presente como referencia. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la especificación anterior están incorporadas a la presente como referencia. Para aquellos expertos en la técnica serán evidentes diferentes modificaciones y variaciones de las composiciones y métodos descritos de la invención, sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Aunque se ha descrito la invención en conexión con modalidades preferidas particulares, se debe entender que la ¡nvención reivindicada no se debe limitar indebidamente a esas modalidades específicas. De hecho, se pretende que diferentes modificaciones de los modos descritos para realizar la ¡nvención, que sean evidentes para aquellos expertos en la técnica y en los campos relacionados con la misma, estén dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

A, á. *A*J *? t? L.. -. ^-^ ^ - 10Í LISTADO DE SECUENCIAS <110> Hellendoom, Koen <120> Partículas Virales con Epítopes Internos Exógenos <130> DOW-04661 <150> GB9924352.9 <151> 1999-10-14 <160> 37 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> m¡sc_característica <222> ()••() <223> Sintético <400> 1 Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp Val 1 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> ^^i^ ^^jlH ^I^^JÜ^^j^j váte&iB?B wt gMi?Á-ü <221> misc_característica <222> ()••() <223> Sintético <400> 2 Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp Val Tyr 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 3 Gly Pro Val Cys Ala Glu Ala Ser Asp 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> mise característica tíA ?*.i?^t~M?^.*^^^.^^J^^?^?m^ .^ * ,*^^,.... .?Jk LA, <222> ()-•() <223> Sintético <400> 4 Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu 1 5 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> ()••() <223> Sintético <400> 5 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> ()-() lffBtttjA*' J'*4'Í- -- ^ -¡KM'-»- * . -.-z-tM ?&c? Atd .í . <223> Sintético <400> 6 Arg Pro Gln Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gln 1 5 10 15 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característíca <222> ()••() <223> Sintético <400> 7 Ser Tyr lie Pro Ser Ala Glu Lys lie 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> ()-•() <223> Sintético <400> 8 Ser Tyr lie Pro Ser Ala Gly Lys lie 10 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 9 Ala Ala Ala Ser Tyr Me Pro Ser Ala Glu Lys lie Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> mise característica ??A+*?.?JL á¿ . ?H^ ^X ~^ mM^. <222> 0-0 <223> Sintético <400> 10 Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu 1 5 <210> 1 1 <21 1 > 16 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 1 1 His Gly Glu Phe Ala Pro Gly Asn Tyr Pro Ala Leu Trp Ser Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 12 Arg Gly Tyr Val Tyr Gln Gly Leu 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 13 Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu lie Gly 1 5 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> HÉJÜ' hÉÉilhÉtfl tiltll iViiti ítt1ií?Mr?i?if?t??íitlrii?Hl??h??1?ln?flt¡Pii'-f--*' -^«— ^ -*- <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 14 Ala Ala Ala Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu Me Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 15 Val Asp Asp Ala Leu He Asn Ser Thr Lys Me Tyr Ser Tyr Phe Pro 1 5 10 15 Ser Val <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 16 Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln 1 5 10 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> mísc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 17 Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 <210> 18 <211> 21 <212> ADN Í]ttl?l??tlttrtrfT If£a------- 5 ?it?l?'1 f ' lf?i?ttf??rt,'a' ¿a'~ *^ bt??-* *-'**— -**^*^^ ** ** t <213> Artifícial/Desconoci <220> <221 > misc_característíca <222> 0-0 <223> Sintético <400> 18 ggttatcatg gttctagttt g 21 <210> 19 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 19 gctgtttatt attgtactag aggttatcat ggttctagtt tg 42 <210> 20 <21 1 > 45 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > mise característica 'Í-ÉI :? ~fffrfr ""-*'"'-— '""»^'!'^fcJj'*»t*^ .,.gLi. .& ?.?-? <222> 0-0 <223> Sintético <400> 20 agacctcaag cttctggtgt ttatatgggt aatttgactg ctcaa 45 <210> 21 <21 1 > 27 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 21 tcttatattc cttctgctga aaagatt 27 <210> 22 <21 1 > 48 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 22 gcagcggcct cttatattcc ttctgctgaa aagattgcgg ccgctgct 48 <210> 23 <21 1 > 24 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 23 gctcctggta attatcctgc tttg 24 <210> 24 <211> 48 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 24 catggtgaat ttgctcctgg taattatcct gctttgtggt cttatgct 48 <210> 25 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 25 agaggttatg tttatcaagg ttg 23 <210> 26 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 26 ttggatagat tggttagatt gattggt 27 <210> 27 <211> 45 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 27 gcagcggcct tggatagatt ggttagattg attggggccg ctgct 45 <210> 28 <211 > 54 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 28 gtggatgatg ctttgattaa ttctactaag atttatagtt attttccttc tgtt 54 <210> 29 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 w- A"tr ir * <223> Sintético <400> 29 atgcaatgga actctactac ttttcatcaa actttgcaa 39 <210> 30 <211> 1 5 <212> ADN <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 30 gcagcggccg ctgct 1 5 <210> 31 <21 1 > 9 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 31 Tyr Ser Pro Cys Met He Ala Ser Thr <210> 32 <211 > 10 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 32 Val Tyr Ser Pro Cys Met Me Ala Ser Thr 1 5 10 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221> misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 33 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu Tyr 10 15 <210> 34 <21 1 > 8 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 34 Gly Tyr His Gly Ser Ser Leu Tyr 1 <210> 35 <21 1 > 16 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 35 Gly Val Ser Thr Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 1 5 10 15 <210> 36 <21 1 > 32 <212> PRT <213> Artificial/Desconocido <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 36 Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg Ala Gly Ala Asp 1 5 10 15 Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ala He Asn Arg Arg Val Glu Ala Glu 20 25 30 <210> 37 <21 1 > 16 <212> PRT <213> Artificial/Desconocí <220> <221 > misc_característica <222> 0-0 <223> Sintético <400> 37 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 1 5 10 15 11"-rr1'íitrf'"ii'i*'itfc""*tf""'ik'"Ji"" ' sfeA

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un compuesto que comprende una partícula viral quimérica que tiene un cápsido, en donde el cápsido tiene un lado interior y un lado exterior, el cápsido comprendiendo cuando menos un péptido exógeno en dicho lado interior del cápsido. 2. Una partícula viral quimérica según la reivindicación 1 , que es capaz de ensamblarse en una célula o tejido anfitrión. 3. Una partícula de virus quimérico según la reivindicación 1 o 2, en la que el virus es icosaedro. 4. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el virus es un comovirus. 5. Una partícula de virus quimérico según la reivindicación 4, en la que el virus es el virus de mosaico de caupí. 6. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el péptido exógeno se inserta en una proteína de capa. 7. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el péptido exógeno tiene de 5 a 20 aminoácidos. 8. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el péptido exógeno se inserta en un punto de -5 a 20 aminoácidos del término N de una proteína de capa, el ensamble de la partícula viral no se imposibilita en una célula anfitriona. 9. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el péptido exógeno se inserta en VP-S del virus de mosaico de caupí, entre un residuo de tirosina en la posición 1 1 y un residuo de tirosina duplicado en la posición 12. 10. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el péptido exógeno se inserta en VP-S del virus de mosaico de caupí, entre un dipéptido que comprende un residuo de valina en la posición 10 y un residuo de tirosina en la posición 1 1 , y un dipéptido duplicado que comprende un residuo de valina en la posición 12 y un residuo de tirosína en la posición 13. 1 1 . Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el péptido exógeno se inserta en VP-S del virus de mosaico de caupí, entre un residuo de valina en la posición 10 y un residuo de valina duplicado en la posición 1 1 . 12. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , en la que la partícula viral no contiene ácido nucleico. 13. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el péptido exógeno codifica un epítope que puede reconocerse por un sistema inmune animal. 14. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que el epítope exógeno es un epítope de linfocito T cítotóxico. 15. Una partícula de virus quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que el péptido exógeno contiene un epítope de linfocito T citotóxico con aminoácidos de flanqueo derivados de una fuente naturalmente ocurrente del epítope. 16. Una partícula viral quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el péptido exógeno es un epítope de célula ayudante T. 17. Una partícula viral quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y la reivindicación 16, en la que el péptido exógeno contiene un epítope de célula ayudante T, con secuencias de aminoácidos de flanqueo derivadas de una fuente naturalmente ocurrente del epítope. 18. Una partícula viral quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que el péptido exógeno es un epítope de célula B. 19. Una partícula viral quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 y la reivindicación 18, en la que el péptido exógeno contiene un epítope de célula ayudante T, con secuencias de aminoácidos de flanqueo derivadas de una fuente naturalmente ocurrente del epítope. 20. Una partícula viral quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que contiene un segundo péptido exógeno expresado en la superficie externa del cápsido viral. 21. Una partícula viral quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que contiene un segundo péptido exógeno expresado en la superficie externa del cápsido viral, en donde dicho péptido se inserta en el ciclo ßC '-ßC" de VP-S del virus de mosaico de caupí. 22. Una partícula viral quimérica según cualquiera de las Uk . ~ ,* A??ÍL reivindicaciones 1 a 20, que contiene un segundo péptido exógeno expresado en la superficie externa del cápsido viral, en donde dicho péptido se inserta en el ciclo ßB-ßC de VP-S del virus de mosaico de caupí. 23. Una partícula viral quimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, que contiene un segundo péptido exógeno expresado en la superficie externa del cápsido viral, en donde dicho péptido se inserta en el ciclo ßE-aB de VP-L del virus de mosaico de caupí. "***"*"falMka - ' « *" " »»* **-** -****-***-- RFSUMFN La presente invención se relaciona con la expresión de péptidos en partículas virales, y más particularmente con la expresión de péptidos en el interior del cápsido viral. Se describen métodos para modificar los virus, de tal manera que los epítopes exógenos se expresen en el interior del cápsido viral. Los virus que se pueden modificar incluyen virus de ARN de cadena (+), especialmente virus de ARN de cadena (+) de planta, tales como el virus de mosaico de caupí. La expresión interna es especialmente útil para la expresión de epítopes hidrofóbicos. Las partículas virales modificadas también encuentran uso como vacunas, y como tales son capaces de producir una respuesta inmune.