MXPA01011644A - Proceso para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos con amplificacion del gen zwf. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un proceso para la preparacion de L-aminoacidos mediante fermentacion de la bacteria corineforme, la cual comprende llevar a cabo los siguientes pasos: a) fermentacion de la bacteria que produce el L-aminoacido deseado en la cual al menos se amplifica el gen zwf, b ) concentracion del L-aminoacido en el medio o en las celulas de la bacteria y c)aislamiento del L-aminoacido producido.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACIÓN FERMENTATIVA DE L-.AMINOACIDOS CON AMPLIFICACIÓN DEL GEN ZWF La invención se refiere a un proceso para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, en particular L-lisina, L-treonina y L-triptofano, usando la bacteria corineforme en la cual al menos, el gen zwf es amplificado.

Técnica Anterior Los L-aminoácidos son usados en la nutrición animal, en medicina humana y en la industria farmacéutica. Se sabe que los aminoácidos son preparados por la fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular Corynebacterium glutamicum. Debido a su mayor importancia, el trabajo está siendo constantemente comprometido para mejorar los procesos de preparación. Los mejoramientos a los procesos pueden referirse a las medidas de fermentación, tal como por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición del medio nutriente, tal como por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o la elaboración de la forma del producto mediante por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico, o las propiedades de rendimiento intrínseco del REF. : 134124 mismo microorganismo. Los métodos de mutagénesis, selección y selección mutante, se usan para mejorar las propiedades de rendimiento de estos microorganismos. Las cepas las cuales son resistentes a los antimetabolitos, tal como por ejemplo el ácido a-amino-ß-hidroxivalérico (AHV) análogo de treonina, o son auxotróficas por los metabolitos de importancia regulatoria y producen L-aminoácidos, tal como por ejemplo treonina, se obtienen en esta manera. Los métodos de la técnica de ADN recombinante también han sido empleados por algunos años para el mejoramiento de cepas de Corynebacterium glutamicum, las cuales producen L-aminoácidos.

Objeto de la Invención Los inventores tienen el objeto de proporcionar nuevos procesos mejorados para la preparación fermentativa de L-aminoácidos con la bacteria corineforme.

Descripción de la invención Los L-aminoácidos son usados en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria de productos alimenticios y especialmente en la nutrición animal. Hay por lo tanto, un interés general en proporcionar nuevos procesos mejorados para la preparación de aminoácidos. La invención proporciona uno proceso para la preparación fermentativa de L-aminoácidos, en particular L^ lisina, L-treonina y L-triptofano, usando la bacteria corineforme en la cual la secuencia de nucleótido, la cual codifica para la proteína Zwf (gen zwf) es amplificada, en particular sobre expresada. Las cepas empleadas preferiblemente ya producen L-aminoácidos antes de la ampliación del gen zwf. Las modalidades preferidas se encuentran en las reivindicaciones . El término "amplificación" a este respecto, describe el incremento en la actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo, el cual es codificado por el ADN correspondiente, por ejemplo incrementando el número de copias del gen o genes, que usan un promotor potente o que usan un gen el cual es codificado por una enzima correspondiente (proteína) , que tiene una actividad alta, y opcionalmente combinando estas mediciones. Los microorganismos los cuales proporciona la presente invención, pueden preparar L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa o a partir de glicerol y etanol. Son representativos de la bacteria corineforme, en particular del género Corynebacterium. Del género Corynebacterium, pueden ser mencionadas en particular las especies Corynebacterium glutamicum, las cuales son conocidas entre los especialistas por su habilidad para producir L-aminoácidos. Las cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular de las especies Corynebacterium glutamicum, son, por ejemplo, las cepas de tipo silvestre conocidas. Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavu ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y mutantes que producen L-aminoácidos preparados a partir de estos, tal como, por ejemplo, las cepas que producen L-treonina Corynebacterium glutamicum ATCC21649 Brevibacterium flavum BB69 Brevibacterium flavum DSM5399 Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269 Brevibacterium lactofermentum TBB-10 y tal como, por ejemplo, las cepas que producen L-isoleucina Corynebacterium glutamicum ATCC 14309 Corynebacterium glutamicum ATCC 14310 Corynebacterium glutamicum ATCC 14311 Corynebacterium glutamicum ATCC 15168 Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 y tal como, por ejemplo, las cepas que producen L-triptofano Corynebacterium glutamicum ATCC21850 y Corynebacterium glutamicum KY9218 (pK 9901) y tal como, por ejemplo, las cepas que producen L-lisina Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DSM12866. Se ha encontrado que la bacteria corineforme produce L-aminoácidos, en particular L-lisina, L-treonina y L-triptofano, de una manera mejorada después de la sobre- expresión del gen zwf el cual codifica para la proteína Zwf. Pueden además, ser usados los alelos del gen zwf los cuales resultan de la degeneración del código genético o debido a las mutaciones sentido de la función neutral. La JP-A-09224661 describe la secuencia de nucleótido del gen 6-fosfato deshidrogenasa de glucosa, llamado zwf, de Brevibacterium flavum MJ-223 (FERM BP-1497) . La JP-A-09224661 describe la secuencia de aminoácido N-ter inal del polipéptido Zwf como Met Val lie Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu. Sin embargo, no ha sido posible confirmar esto. En su lugar, se ha encontrado la siguiente secuencia de aminqácido N-terminal: Val Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp. El radical valilo en la posición N-terminal puede ser dividido completamente en el contexto de la modificación post-traduccional, y Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp, son entonces obtenidos como la secuencia de aminoácido N-terminal. Para lograr una amplificación (por ejemplo, sobre-expresión) , se incrementa el número de copias de los genes correspondientes, o es mutado el promotor y la región de regulación o el sitio enlazante de ribosoma corriente arriba del gen estructural. Los casetes de expresión los cuales son incorporados corriente arriba del gen estructural, actúan de la misma forma. Mediante promotores inducibles, es posible adicionalmente, incrementar la expresión en el curso de la formación del L-aminoácido fermentativo. La expresión es del mismo modo, mejorada por medidas para prolongar la vida del m-ARN. Además, la actividad enzimática es también incrementada, previniendo la degradación de la proteína enzimática. Los constructos del gen o genes están ya sea presentes aquí en los plásmidos con un número variante de copias, o se integran y amplifican en el cromosoma. Alternativamente, una sobre-expresión de los genes en cuestión pueden además, lograrse cambiando la composición del medio y el procedimiento de cultivo. Las instrucciones en este contexto, se pueden encontrar por el experto, inter alia, en Martín et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1998)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en la Especificación de Patente Europea EPS 0 472 869, en la Patente Estadounidense 4,601,893 en Schwarzer y Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la Solicitud de Patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 51-24 (1993)), en la especificación Expuesta (Laid-Open) Japonesa JP-A-10-229891, en Jensen y Hammer (Biotechnology y Bioengineering 58, 191-195 (1998)) y en libros de texto conocidos de gética y biología molecular. Por medio del Ejemplo, la proteína Zwf fue sobre-expresada con la ayuda de un plásmido. El vector de introducción pEC-T18mob2 de E. coli-C. glutamicum mostrado en la Figura 1 se usó para esto. Después de la incorporación del gen zwf en el sitio de desdoblamiento de pEC-T18mob2, se form?i el plásmido pEC-T18mob2zwf mostrado en la Figura 2. Otros vectores de plásmidos los cuales son capaces de replicación en la C. glutamicum, tal como por ejemplo, pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991) o pZ8-l (EP-B-0 375 889), puede ser usados en la misma forma. Además, puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, amplificar una o más enzimas de la trayectoria de la biosíntesis particular, de glicólisis, de anaplerosis, de la trayectoria de fosfato pentosa o de la exportación de aminoácidos, además de la amplificación del gen zwf.

Así, por ejemplo, en particular para la preparación de L-treonina, uno o más genes se seleccionan a partir del grupo que consiste de: • el gen hom el cual . es codificado por homoserina deshidrogenasa (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) o el alelo homdr el cual es codificado por una homoserina deshidrogenasa de "retroalimentación resistente" (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991), • el gen gap el cual es codificado por 3-fosfato deshidrogenasa de gliceraldehido (Eikmanns et al., Journal of Bacteriology 1974: 6076-6086 (1992)), • el gen pyc el cual es codificado por piruvato carboxilasa (E^eters-Wendisch et al., Microbiology 144: 915-927 (1998)), • el gen mqo el cual es codificado por malato: oxireductasa de quinona (Molenaar et al., European Journal of Bichemistry 254, 395-403 (1998)), • el gen tkt el cual es codificado por transquetolasa (número de acceso AB023377 del banco de datos de Laboratorios de Biología Molecular Europeos (EMBL, Heidelberg, Alemania) ) , • el gen gdn el cual es codificado por el 6-fosfogluconato deshidrogenasa (JP-A-9-224662) , • el gen thrE el cual es codificado por la exportación de treonina (DE 199 41 478.5; DSM 12840), • el gen zwal (DE 199 59 328.8; DSM 13115), • el gen eno el cual es codificado por enolasa (DE: 199 41 478.5) pueden ser amplificados, en particular sobre expresados, al mismo tiempo. Así, por ejemplo, en particular por la preparación de L-lisina, uno o más genes se seleccionan del grupo que consiste de • el gen dapA el cual es codificado por dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335), • el gen lysC el cual es codificado por una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324), • el gen gap el cual es codificado por 3-fosfato deshidrogenasa de gliceraldehido (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086), • el gen pyc el cual es codificado por piruvato carboxilasa (DE-A-198 31 609) , • el gen tkt el cual es codificado por transquetolasa (número de acceso AB023377 del banco de datos de Laboratorios de Biología Molecular Europeos (EMBL, Heidelberg, Alemania) ) , « • el gen gnd el cual es codificado por 6-fosfogluconato deshidrogenasa (JP-A-9-224662) , • el gen lysE el cual es codificado por la exportación de lisina (DE-A-195 48 222), • el gen zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115), • el gen eno el cual es codificado por enolasa (DE 399 47 791.4) pueden ser amplificados, en particular sobre expresados, al mismo tiempo. Además puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácido al mismo -tiempo, atenuar uno de los genes seleccionados del grupo que consiste de • el gen pck el cual es codificado por piruvato carboxicinasa de fosfoenol (DE 199 50 409.1; DSM 13047), • el gen pgi el cual es codificado por 6-fosfato isomerasa de glucosa (US 09/396,478, DSM 12969), • el gen poxB el cual es codificado por piruvato oxidasa (DE 199 51 975.7; DSM 13114), • el gen zwa2 (DE: 199 59 327.2; DSM 13113) además de la amplificación del gen zwf.

Además para la sobre expresión de la proteína Zwf, puede sin embargo, ser ventajoso par la producción de L-aminoácldos, eliminar las reacciones colaterales indeseables (Nakayama: "Breending of .Amino Acid Producing Micro-organism", en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, ÜK, 1982) . Los microorganismos preparados de conformidad con la invención pueden ser cultivados continuamente o descontinuamente en los procesos de lotes (cultivo en lotes) o en la alimentación de lotes (proceso de alimentación) o proceso de alimentación de lotes repetidos (proceso de alimentación repetitiva) para el propósito de producción de L-aminoácido. Una resumen de métodos de cultivo conocidos se describen en el libro de texto por Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el libro de texto por Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) ) . El medio de cultivo a ser usado debe sugerir los requerimientos de los microorganismos particulares de una manera adecuada. Las descripciones de los medios de cultivo para varios microorganismos están contenidas en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la .American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Los azúcares y carbohidratos, tal como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y grasa de coco, ácidos grasos, tales como por ejemplo ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes, tal como por ejemplo glicerol y etanol, y ácidos orgánicos, tales como por ejemplo ácido acético, pueden ser usados como la fuente de r carbono. Esas substancias pueden ser usadas individualmente o como una mezcla. Los compuestos que contienen nitrógeno orgánico, tales como peptonas, extractos de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor extraído de maíz, harina de soya y urea, o compuestos inorgánicos, tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, pueden ser usados como la fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógenos pueden ser usadas individualmente o como una mezcla. El fosfato dihidrógeno de potasio o fosfato hidrógeno dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio, pueden ser usadas como la fuente de fósforo. El medio de cultivo podría además comprender sales de metales, tales como por ejemplo sulfato de magnesio o sulfato de hierro, las cuales son necesarias para el crecimiento. Finalmente, las substancias esenciales del crecimiento, tales como los aminoácidos y vitaminas, pueden ser empleadas además de las substancias mencionadas anteriormente. Los precursores adecuados pueden sin embargo, ser agregados al medio de cultivo. Las substancias iniciadoras mencionadas pueden ser agregadas al cultivo en la forma de un único lote, o puede ser alimentadas durante el cultivo de una manera adecuada. Los compuestos básicos, tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoniaco, o compuestos de ácidos, tal como ácido fosfórico o ácido sulfúrico, pueden ser empleados • de una manera adecuada para controlar el pH. Las antiespumas, tal como por ejemplo esteres de poliglicol de ácidos grasos, pueden ser empleadas para controlar el desarrollo de la espuma. Las substancias adecuadas que tienen una acción selectiva, por ejemplo antibióticos, pueden ser agregadas al medio para mantener la estabilidad de los plásmidos. Para mantener las condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gases que contienen oxígeno, tal como por ejemplo aire, se introducen en el cultivo. La temperatura del cultivo es usualmente de 20 °C a 45 °C, y preferiblemente de 25°C a 40°C. La cultivación se continúa hasta que se ha formado un máximo de L-aminoácidos. Este objetivo es usualmente alcanzado dentro de las 10 horas a 160 horas. El análisis de los L-aminoácidos pueden llevarse a cabo por cromatografía de intercambio de aniones con derivación de ninhidrina subsecuente, como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190)), o puede tomar lugar por HPLC de fase inversa como se describe por Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51:. 1167-1174) . Los siguientes microorganismos han sido depositados en la Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania) de conformidad con el Tratado de Budapest: Escherichia coli K-12 DH5a/pEC-Tl8mob2 como DSM 13244 Se adjuntan las siguientes figuras: • Figura 1: Mapa del plásmido pEC-T18mob2 Figura 2: Mapa del plasm ?ado pEC-T18mob2zwf * i. »3 %? • Figura 3: Mapa del plásmido pAMCl • Figura 4: Mapa del plásmido pMCl • Figuras 5: Mapa del plásmido pCR2. IpoxBint Los números de pares base declarados, son valores aproximados obtenidos en el contexto de la reproductibilidad .

Re Figura 1 y 2 Las abreviaciones usadas tienen los siguientes significados : Tet: Gen resistente para la tetraciclina oriV: Origen de la replicación codificada del > plásmido de E. coli RP4mob: región mob para la movilización del plásmido rep: Origen de replicación del plásmido codificado de pGAl del plásmido de C. glutamicum per: Gen para controlar el número de copias de pGAl lacZ-alfa fragmento del gen lacZa (N-termino) del gen ß- galactosidasa lacZalfa' : 5' -termino del fragmento del gen lacZa ?lacZalfa: 3' -termino del fragmento del gen lacZa Re Figura 3 y 4 Las abreviaciones usadas tienen los siguientes significados : Neo r: resistencia a la neo icina/canamicina ColEl ori: Origen de la replicación del plásmido ColEl CMV: Promotor de Citomegalovirus lacP: Promotor de lactosa pgi: gen de fosfoglucosa isomerasa lacZ : Parte del gen ß-galactosidasa división de SV40 3' : sitio de división del 3' del virus 40 de Simio polyA SV40: Sitio de poliadenilación del virus 40 de Simio fl(-)ori: Origen de replicación del fago fl- filamentoso SV40- ori: Origen de replicación del virus 40 de Simio kan r : resistencia a la canamicina inserto pgi: Fragmento interno del gen pgi ori: Origen de la replicación del plásmido pBGS8 Re Figura 5 Las abreviaciones usadas tienen los siguientes significados: ColEl ori: Origen de la replicación del plásmido ColEl lacZ: Residuos de clonación del fragmento del gen lacZcc fl ori: origen de la replicación de fago fl KmR: resistencia a la canamicina ApR: resistencia a la ampicilina PoxBint: Fragmento interno del gen poxB Los significados de las abreviaciones para las varias enzimas de restricción (por ejemplo BamHl, EcoRI, etc.) son conocidos a partir de la técnica anterior y se resumen, por ejemplo, por Kessler and Hóltke (Gene 47, 1-153 (1986) ) o Roberts et al. (Nucleic Acids Research 27, 312-313 (1999) ) .

Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustrarán además, esta invención. Las técnicas de biología molecular, por ejemplo aislamiento del ADN del plásmido, tratamiento de enzima de restricción, ligaciones, transformaciones estándares de Escherichia coli etc. usadas son, (a menos que se declare de otro modo), descritas por Sambrook et al., (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA) .

Ejemplo 1 Expresión de la proteína Zwf 1.1 Preparación del plásmido pEC-T18mob2 El vector de introducción pEC-T18mob2 de E. coli -C. glutamicum, se construyó de acuerdo a la técnica anterior. El vector contiene la región de replicación rep del plásmido pGAl, incluyendo el efector de replicación per (US-A- 5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), el gen tetA(Z) que imparte resistencia a la tetraciclina del plásmido pAGl (US-A- 5,158,891; entran en la biblioteca del gen en el Centro Nacional para la Información de Biotecnología (NCBI, Bethesda, MD, USA) con número de acceso AF121000) , la región de replicación oriV del plásmido pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979) ) , el fragmento del gen lacZa que incluye el promotor lac y un sitio de clonación múltiple (mes) (Norrander et al. Gene 26, 101-106 (1983)) y la región mob del plásmido RP4 (Simón et al., (1983) Bio/Technology 1:784-791). El vector construido se transformó en la cepa DH5a de E. coli (Brow (ed.) Molecular Biology Labfax, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK 1991) . La selección para las células que llevan el plásmido se hace colocando en placas el lote de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), el cual ha sido suplementado con 5 mg/l de tetraciclina. El ADN plásmido se aisló a partir de un transformante con la ayuda del Equipo Miniprep Spin QIAprep de Qiagen y se verificó por restricción con la enzima de restricción EcoRI y HindIII y subsecuentemente con electroforesis en gel de agarosa (0.8%) . El plásmido se llamó pEC-T18mob2 y se muestra en la Figura 1. Es depositado en la forma de cepa DH5apEC-T18mob2 K-12 de Escherichia coli, en la Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulture (DSMZ = Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Germany) como, DMS 13244. 1.2 Preparación del plásmido pEC-T18mob2zwf El gen de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 fue primero amplificado por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por medio del siguiente cebador de oligonucleotido : zwf-delantero 5' -TCG ACG CGG TTC TGG AGC AG-3' zwf-inverso: 5' -CTA AAT TAT GGC CTG CGC CAG-3' La reacción PCR se llevó a cabo en 30 ciclos en la presencia de 200 µM de trifosfatos de desoxinucleotido (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) , en cada caso 1 µM del correspondiente oligonucleotido, 100 ng de ADN cromosomal de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 de volumen 10 veces el amortiguador de la reacción y 2.6 unidades de una mezcla de polimerasa Taq-/Pwo-ADN estable al calor (un sistema PCR de Alta Fidelidad Expandido de Roche Diagnostics, Manheim, Alemania) en un termocirculador (PTC-100, MJ Research, Inc., Watertown, USA) bajo las siguientes condiciones: 94 °C por 30 segundos, 64 °C por 1 minuto y 68 °C por 3 minutos. El fragmento amplificado de aproximadamente 1.8 kb de tamaño, fue subsecuentemente ligado con la ayuda del Equipo de Ligación SureClone (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en el sitio de desdoblamiento Smal del vector pUCld de conformidad con las instrucciones del fabricante. La cepa DH5a mcr de E. coli (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649) se transformó con el lote de ligación completo. Los transformantes se identificaron con la ayuda de su resistencia a la carbenicilina en placas de LB-agar que contienen 50 µg/mL de carbenicilina. Los plásmidos se prepararon de 7 de los transformantes y se verificaron por la presencia de 1.8 kb del fragmento PCR como un inserto por análisis de restricción. El plásmido recombinante formado en esta forma es llamado pUCldzwf en lo siguiente. Para la construcción de pEC-T18mob2zwf, pUC18zwf se digirió con Kpnl y Salí, y el producto se aisló con la ayuda del Equipo de Extracción NucleoSpin de Macherey-Nagel (Duren, Alemania) de acuerdo con las instrucciones de manufactura y después se ligó con el vector pEC-T18mob2, el cual también ha sido desdoblado con Kpnl y Salí y desfosforilado. La cepa DH5amcr de E. coli (Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA (1990) 87: 4645-4649), se transformó con el lote de ligación completo. Los transformantes se identificaron con la ayuda de su resistencia a la tetraciclina en placas de LB-agar que contiene 5 µg/mL de tretaciclina. Los plásmidos se prepararon de 12 de los transformantes y se verificaron por la presencia del fragmento PCR de 1.8 kb como un inserto por análisis de restricción. Uno de los plásmidos recombinantes aislado de esta manera se llamó pEC-Tl8mob2zwf (Figura 2) .

Ejemplo 2 Preparación de productores de aminoácido con un gen zwf amplificado La cepa DSM5715 de Corynebacterium glutamicum que produce L-lisina se describe en EP-B-0435132 y la cepa de Brevibacterium flavum DSM5399 que produce L-treonina se describe en EP-B-0385940. Ambas cepas se depositaron en la Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen [Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares] en Braunschweig (Alemania) de conformidad con el Tratado de Budapest . 2.1 Preparación de las cepas DSM5715/pEC-T18mob2zwf y DSM5399/pEC-T18mob2zwf Las cepas DSM5715 y DSM539 se transformaron con el plásmido pEC-T18mob2zwf usando el método de electroporación descrito por Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). La selección de los transformantes toma lugar en el agar LBHIS que comprende 18.5 g/1 de caldo de infusión de cerebro-corazón, 0.5 M de sorbitol, 5 g/1 de Bacto-triptona, 2.5 g/1 de extracto bacto-levadura, 5 g/1 de NaCl y 18 g/1 de Bacto-agar, el cual ha sido suplementado con 5 mg/l de tetraciclina. La incubación se llevó a cabo por 2 días a 33°C. El ADN plásmido se aisló en cada caso de un transformante por métodos convencionales (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology 144, 915-927), desdoblado con las endonucleasa de restricción Xbal y Kpl, y el plás ids se verificó por electroforesis en gel de agarosa subsecuente. Las cepas obtenidas de esta forma se llamaron DSM5715/pEC-T18mob2zwf y DSM5399/pEC-T18mob2zwf. 2.2 Preparación de L-treonina La cepa DSM5399/pEC-T18mob2zwf de C. glutamicum obtenida en el Ejemplo 2.1 se cultivó en un medio nutriente adecuado para la producción de treonina y se determinó el contenido de treonina en el sobrenadante del cultivo. Para esto, la cepa se incubó primero en una placa de agar con el correspondiente antibiótico (agar cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg(l)) por 24 horas a 33°C. Partiendo de este cultivo de placa de agar, se sembró un medio de precultivo (10 ml) en un matraz cónico de 100 ml) . El medio completo CglII se usó como el medio para el precultivo.

Medio CglII NaCl 2.5 g/1 Bacto-Peptona 10 g/1 Bacto-Extracto de Levadura 10 g/1 Glucosa (sometida a autoclave separadamente) 2% (p/v) El pH se llevó a pH 7.4 La tetraciclina (5 mg/l) se agregó a este. El precultivo se incubó por 16 horas a 33 °C a 240 rpm en una maquina sacudidora. Se sembró un cultivo principal de este precultivo, de manera tal que el OD inicial (ßdOnm) del cultivo principal fue 0.1. El medio MM se usó para el cultivo principal. Medio MM CLS (licor extraído de maíz) 5 g/1 MOPS (ácido morfolinopropansulfónico¡ 20 g/1 Glucosa (sometido a autoclave de manera separada) 50 g/1 (NH ) 2S0 25 g/1 KH2P04 0.1 g/1 MgS04 * 7 H20 1.0 g/1 CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS04 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 5.0 mg/l Biotina (estéril filtrada) 0.3 mg/l Tiamina * HCl (estéril filtrada) 0.2 mg/l L-leucina (estéril filtrada) 0.1 mg/l CaC03 25 g/1 El CSL, MOPS y la solución de sal se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso y se sometieron a autoclave. Entonces se agregaron el substrato estéril y las soluciones de vitamina, así como también el CaC03 sometido a autoclave en el estado seco. Se llevo a cabo la cultivación en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con deflectores. Se agregó tetraciclina (5 mg/l) . La cultivación se llevó a cabo a 33°C y a 80% de humedad atmosférica. Después de 72 horas, el OD se determinó a una medición de longitud de onda de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GMBH, Munich) . La cantidad de treonina formada se determinó con un analizador de aminoácido desde un Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) , por cromatografía de intercambio iónico y derivación postcolumna con detección de ninhidrina. El resultado del experimento se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1 2.3 Preparación de L-lisina La cepa C. glutamicum DSM5715/pEC-T18mob2zwf obtenida en el Ejemplo 2.1, se cultivó en un medio nutriente adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina el cultivo sobrenadante. Para esto, la cepa se incubó primero en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l)) por 24 horas a 33°C.

Partiendo de este cultivo de placa de agar, se sembró un precultivo (medio de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml) .

El medio completo CglII se usó como el medio para el precultivo. Medio CglII NaCl 2.5 g/1 Bacto-Peptona 10 g/1 Bacto-Extracto de Levadura 10 g/1 Glucosa (sometida a autoclave separadamente) 2% (p/v) El pH se llevó a pH 7.4 La tetraciclina (5 mg/l) se agregó a esta. El precultivo se incubó por 16 horas a 33°C a 240 rpm en una maquina sacudidora. Se sembró un cultivo principal de este precultivo, de manera tal que el OD inicial (660nm) del cultivo principal fue 0.1. El medio MM se usó para el cultivo principal. Medio MM CLS (licor extraído de maíz) 5 g/1 MOPS (ácido morf olinopropansulf ónico) 20 g/1 Glucosa (sometido a autoclave de manera separada) 58 g/1 (NH4)2S0 25 g/1 KH2P04 0.1 g/1 MgS04 * 7 H20 1.0 g/1 CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS0 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 5.0 mg/l Biotina (estéril filtrada) 0.3 mg/l Tiamina * HCl (estéril filtrada] 0.2 mg/l L-leucina (estéril filtrada) 0.1 mg/l CaC03 25 g/1 El CSL, MOPS y la solución de sal se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso y se sometieron a autoclave. Entonces se agregaron el substrato estéril y las soluciones de vitamina, así como también el CaC03 sometido a autoclave en el estado seco. Se llevo a cabo la cultivación en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con deflector. Se agregó tetraciclina (5 mg/l) . La cultivación se llevó a cabo a 33°C y a 80% de humedad atmosférica. Después de 72 horas, el OD se determinó a una medición de longitud de onda de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GMBH, Munich) . La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácido desde un Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) , por cromatografía de intercambio iónico y derivación postcolumna con detección de ninhidrina.

El resultado del experimento se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2 Ejemplo 3 Construcción de una biblioteca de gen de la cepa de Corynebacterium glutamicum AS019 Se construyó una biblioteca de ADN de la cepa AS019 de Corynebacterium glutamicum (Yoshihama et al., Journal of Bacteriology 162, 591-597 (1985)), usando un sistema ? Zap Express™, (Short et al., (1988) Nucleic Acids Research, 16: 7583-7600), como se describe por O' Donohue (O'Donohue, M. (1997) . Clonación y Análisis Molecular para Cuatro Genes Biosintéticos de Aminoácidos Aromáticos Comunes a partir de Corynebacterium glutamicum. Ph. D. Thesis, National Uníversity of Ireland, Galway) . El equipo ? Zap Express™, se adquirió de Stratagene (Stratagene, 11011 North Torrey Pines, Rd., La Jolla, California 92037), y se usó de conformidad con las instrucciones del fabricante. Se digirió AS19-ADN con la enzima de restricción Sau3A y se ligó a Ba Hl tratado y desfosforilado con equipo ? Zap ExpressTM Ejemplo 4 Clonación y Secuenciamiento del gen pgi 1. Clonación La cepa Escherichia coli DF1311, que lleva mutaciones en los genes pgi y pgl como se describe por Kupor y Fraenkel, (Journal of Bacteriology 100:1296-1301 (1969)), se transformó con aproximadamente 500 ng de la biblioteca de plásmido de AS019 de ? Zap Express™, descrita en el Ejemplo 3. La selección para los transformantes se hizo en un medio mínimo M9, (Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning. A Laboratory Manual Cold Spring Harbour Laboratories, USA) , gue contiene canamicina a una concentración de 50 mg/l e incubación a 37 °C por 48 horas. El ADN del plásmido se aisló de un transformante de conformidad con Birnboim y Doly (Nucleic Acids Research 7: 1513-1523 (1979)) y se designo pAMCl (Figura 3) . 2. Secuenciamiento Para el análisis de secuencia del inserto clonado de pAMCl, se aplicó el método de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74, 5463-5467 (1977), usando los cebadores diferencialmente etiquetados con un extremo fluorescente coloreado. Se llevó a cabo usando el analizador genético ABI prisma 310 de Perkin Elmer Applied Biosystems, (Perkin Elmer Corporation, Norwaik, Connecticut, U.S.A), y el equipo de Reacción Listo de Secuenciamiento de Ciclo Terminador Big Dye™ también de Perkin Elmer. Se llevó a cabo el análisis de secuencia inicial usando los cebadores delanteros e inversos M13 universales obtenidos de Pharmacia Biotech (St. Albans, Herts, AL1, 3AW, UK) : Cebador delantero Universal: GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C > Cebador inverso M13: ' GGA AAC AGC TAT GAC CAT G Los cebadores internos se designaron secuencialmente a partir de la secuencia obtenida, la cual permitió al gen pgi entero, ser deducido. La secuencia de los cebadores internos es como sigue: Cebador interno 1 : GGA AAC AGG GGA GCC GTC Cebador Interno 2: . TGC TGA GAT ACC AGC GGT La secuencia obtenida entonces se analizó usando el programa Strider de ADN, (Marck, (1988) . Nucleic Acids Research 16: 1829-1836), versión 1.0 en una computadora Apple Macintosh. Este programa es permitido para los análisis tales como el empleo del sitio de restricción, análisis de estructura lectora abierta y determinación del empleo de codón. Las búsquedas entre la secuencia de ADN obtenida y aquellas en las base de datos EMBL y Genbank, se lograron usando el programa BLAST, (Altschul et al., (1997). Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402). Las secuencias de proteína y ADN se alinearon usando los programas Clustal V y Clustal W (Higgins y Sharp, 1988 Gene 73: 237-244) . La secuencia así obtenida es mostrada en la SEC ID No.l. El análisis de la secuencia de nucleótido obtenida reveló una estructura lectora abierta de 1650 pares bases, los cuales se designaron como el gen pgi. Codifica para una proteína de 550 aminoácidos mostrada en la SEC ID No. 2: Ejemplo 5 Preparación de un vector de integración para la mutagénesis de integración del gen pgi. Un segmento interno del gen pgi se amplificó por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , usando ADN genómico, aislado de Corynebacterium glutamicum AS019, (Heery y Dunican, (1993) Applied and Environmental ¿F- • Microbiology 59; 791-799) r co o plantilla. Los cebadores pgi X X. usados fueron: Cebador del . : ATG GAR WCC AAY GGH AA Cebador inv. : YTC CAC GCC CCA YTG RTC Con R=A+G; Y=C+T; W =A+T; H=A+T+C. Los parámetros de PCR fueron como sigue: 35 ciclos 9 °C por 1 minuto 47 °C por 1 minuto 72 °C por 30 segundos 1.5 mM de MgCl2 aproximadamente 150-200 ng de plantilla de ADN El producto de PCR obtenido fue clonado en un vector pGEM-T comercialmente disponible recibido de Promega Corp., (Promega UK, Southampton) , usando la cepa E. coli JM109, (Yanish-Perron et al., 1985. Gene, 33: 103-119), como un hospedero. La secuencia del producto de PCR se muestra como la SEC ID No.3. El inserto clonado entonces se cortó como un fragmento de EcoRI y se ligó al plásmido pBGSd (Spratt et al., Gene 41:337-342 (1986)) pretratado con EcoRI. Las enzimas de restricción usadas se obtuvieron de Boehringer Mannheim UK Ltd., (Bell Lañe, Lewes East Sussex BN7 1LG, UK) , y se usaron de conformidad con las instrucciones del fabricante. La E. coli JM109 entonces se transformó con esta mezcla de ligación y los electrotransformantes se seleccionaron en agar ' Luria suplementado con IPTG (isopropil-ß-D-tiogalactopiranosido) , XGAL (5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-galactopiranosido) y kanamicina una concentración de 1 mM, 0.02% y 50 mg/l respectivamente. Las placas de agar se incubaron por doce horas a 37 °C. El plásmido de ADN se aisló de un transformante, caracterizado por el análisis de enzima de restricción, usando EcoRI, BamHl y Salí designado pMCl (figura 4) . El plásmido pMCl se depositó en la forma de cepa DH5a/pMCl de Escherichia coli en el Deutshe Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Alemania) , como DSM 12969 de conformidad con el tratado de Budapest .

Ejemplo 6 Mutagénesis de integración del gen pgi en el DSM 5715 productor de lisina El vector pMCl mencionado en el Ejemplo 5 se sometió a electroporación por el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715. La cepa DSM 5715 es productora de lisina resistente al AEC. El vector pMCl no puede replicarse independientemente en DSM5715 y está retenido en la célula solamente si se ha integrado en el cromosoma de DSM 5715. La selección de clones con pMCl integrados en el cromosoma se llevó a cabo colocando en placas el lote de electroporación en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual. 2da Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), el cual se ha suplementado con 15 mg/l de canamicina. Para la detección de la integración, el fragmento pgi (Ejemplo 5) , se etiquetó con el equipo de hibridación Dig de Boehringer Mannheim por el método de "La Guía de Usuarios Del ^Sistema DIG para Hibridación de Filtro" de Boehringer Mannheim GMBH (Mannheim, Alemania, 1993) . El ADN cromosomal de un transformante se aisló por el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) y en cada caso desdoblados con las enzimas de restricción Salí, Sacl y HindIII. Los fragmentos formados se separaron por electroforesis en gel de agarosa e hibridizaron a 68 °C con el equipo de hibridación Dig de Boehringer. Se encontró de esta forma que el plásmido pMCl se insertó dentro del gen pgi cromosomal de la cepa DSM5715. La cepa se llamó DSM5715: :pMCl.

Ejemplo 7 Efecto de la sobreexpresión del gen zwf con eliminación simultánea del gen pgi en la preparación de lisina . 7.1 Preparación de la cepa DSM5715 : :pMCl/pEC-T18mob2zwf El vector pEC-T18mob2zwf mencionado en el Ejemplo 1.2 se sometió a electroporación por el método de electroporación de Tauch et al. (1994, FEMS Microbiological Letters, 123:343-347) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715::pMCl. La selección para las células que llevan los plásmidos se hizo por la colocación en placas de los lotes de electroporación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2da. Ed. Cold Spríng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), el cual se ha suplementado con 15 mg/l de kanamicina y con 5 mg/l de tetraciclina. El ADN plásmido se aisló de un transformante por métodos convencionales (Peters-Wedish et al., 1998, Microbiology 144, 915-927) y se verificó por el tratamiento con las enzimas de restricción Kpnl y Salí con electroforesis en gel de agarosa subsecuente. La cepa se llamó DSM5715: :?MCl/pEC-T18mob2zwf . 7.2 Preparación de lisina La cepa C. glutamicum DSM5715 : :pMCl/pEC-T18mob2zwf obtenida en el Ejemplo 7.1, se cultivó en un medio nutriente adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina en el cultivo sobrenadante. Para esto, la cepa se incubó primero en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l)) por 24 horas a 33°C. Los cultivos de las cepas de comparación se suplementaron de conformidad con su resistencia a los antibióticos. Partiendo de este cultivo de placa de agar, se sembró un precultivo (medio de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml) . El medio completo CglII se usó como el medio para el precultivo. Medio CglII NaCl 2.5 g/1 Bacto-Peptona 10 g/1 Bacto-Extracto de Levadura 10 g/1 Glucosa (sometida a autoclave separadamente) 2% (p/v) El pH se llevó a pH 7.4 La tetraciclina (5 mg/l) y canamicina (5 mg/l) se agregaron a esta. El precultivo se incubó por 16 horas a 33 °C a 240 rpm en una maquina sacudidora. Se sembró un cultivo principal de este precultivo, de manera tal que el OD inicial (660nm) del cultivo principal fue 0.1. El medio MM se usó para el cultivo principal. Medio MM CLS (licor extraído de maíz) 5 g/1 MOPS (ácido morfolinopropansulfónico) 20 g/1 Glucosa (sometido a autoclave de manera separada) 50 g/1 (NH4)2S04 25 g/1 KH2P04 t 0.1 g/1 MgS04 * 7 H20 1.0 g/1 CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS04 > * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 ' 5.0 mg/l Biotina (estéril filtrada) 0.3 mg/l Tiamina * HCl (estéril filtrada) 0.2 mg/l L-leucina (estéril filtrada) 0.1 mg/l CaC03 25 g/1 El CSL, MOPS y la solución de sal se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso y se sometieron a autoclave. Entonces se agregaron el substrato estéril y las soluciones de vitamina, asi como también el CaC03 sometido a autoclave en el estado seco.

Se llevo a cabo la cultivación en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con deflector. Se agregó tetraciclina (5 mg/l) y canamicina (25 mg/l) . La cultivación se llevó a cabo a 33 °C y a 80% de humedad atmosférica. Después de 72 horas, el OD se determinó a una medición de longitud de onda de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GMBH, Munich) . La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácido desde un Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) , por cromatografía de intercambio iónico y derivación postcolumna con detección de ninhidrina. El resultado del experimento se muestra en la Tabla Tabla 3 Ejemplo 8 Preparación de una biblioteca de gen cósmido genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 . ADN cromosomal de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, se aisló como se describe por Tauch et al., (1995, Plasmid 33:168-179), y parcialmente se desdobló con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Sau3AI, Código no. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfosforilaron con fosfatasa alcalina de salmón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Código No. 1758250) . El ADN del vector cósmido SuperCosl (Wahl et al. (1967) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 64:2160-2164), obtenido de Stratagene (La Jolla, USA, Descripción del Producto SuperCosl Equipo de Vector Cósmido, Código No. 251301) se desdobló con la enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Freburg, Alemania, Descripción del Producto Xbal, Código No. 27-0946-02) y del mismo modo, se desfosforiló con fosfatasa alcalina de salmón. El ADN cósmido entonces se desdobló con la enzima de restricción BamHl (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHl, Código No. 274-0668-04) . El ADN cósmido tratado de esta manera se mezcló con el ADN ATCC13032 tratado y el lote se trató con ligasa de ADN T4 (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Ligasa-ADN-T4, Código no. 27-0870-04) . La mezcla de ligación entonces se empacó en fagos con la ayuda de Extractos de Paquetes Gigapack II XL (Stratagene, La Jolla, USA, Descripción del Producto Extracto de Paquetes Gigapack II XL, Código No. 200217) . Para la infección de la cepa NM554 de E. coli (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Res. 16:1563-1575) , las células entonces se recuperaron en 10 mM de MgS04, y se mezclaron con una alícuota de la suspensión del fago. La infección y la titulación de la biblioteca del cósmido se llevaron a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor) , las células se colocaron en placas en agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) + ampicilina 100 µg/ml. Después de la incubación durante la noche a 37 °C, se seleccionaron los clones individuales recombinantes.

Ejemplo 9 Aislamiento y Secuenciamiento del gen poxB El ADN cósmido de una colonia individual (Ejemplo 7) . Se aisló con el Equipo Miniprep Spin de Qiaprep (Producto No. 27106, Quiagen, Hilden, Alemania) , de conformidad con la instrucciones del fabricante y parcialmente se desdobló con la enzima de restricción Sau3AI, (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto Sau3AI, Producto No. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfosforilaron con fosfatasa alcalina de salmón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, Descripción del Producto SAP, Producto No. 1758250) . Después de la separación por electroforesis en gel, los fragmentos cósmidos en el rango de tamaño de 1500 hasta 2000 pb, se aislaron con el Eguipo de Extracción en Gel de QuiaExII (Producto No. 20021, Quiagen, Hilden, Alemania) . El ADN del vector de secuenciamiento pZero-1, obtenido de Invitrogen (Groningen, Holanda, Descripción del Producto Zero del Equipo de Clonación Antecedente, Producto No. K2500-01) , se desdobló con la enzima de restricción BamHl (Amersham Pharmacia, Freiburg, Alemania, Descripción del Producto BamHl, Producto No. 27-0868-04) . La ligación de los fragmentos cósmidos en el vector de secuenciamiento pZero-1 se llevó a cabo como se describe por Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), la mezcla de ADN se incubó durante la noche con ligasa T4 (Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania) . Esta Mezcla de ligación entonces se sometió a electroporación (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) en la cepa DH5aMCR de E. coli (Grant, 1990, Proceedings of National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) y se colocaron en placas en agar LB (Lennox, 1995, Virology, 1:190) con 50 µg/ml de zeocina. La preparación del plásmido de los clones recombinantes se llevó a cabo con Biorobot 9600 (Producto No. 900200, Quiagen, Hilden, Alemania) . El secuenciamiento se llevó a cabo por el método de detención de cadena didesoxi de Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74:5463-5467) con modificaciones de conformidad con Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se usó el "Equipo de Secuenciamiento de Ciclo Terminador dRhodamina RR", de PE Applied Biosystems (Producto No. 403044, Weiterstadt, Alemania) . La separación por electroforesis en gel y el análisis de la reacción de secuenciamiento, se llevaron a cabo en gel de "Rotiforesis NF Acrilamida/Bisacrilamida" (29:1) (Producto No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el secuenciador "ABI Prisma 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Los datos de la secuencia sin elaborar obtenidos entonces, se procesaron usando un paquete de programa Staden (1986, Nucleic Acids, Research, 14:217-231) versión 97-0.

Las secuencias individuales de los derivados pZerol se ensamblaron en un contigo continuo. El análisis de la región codificante asistida por computadora se preparó con el Programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) . Los análisis adicionales se llevaron a cabo con el "programa de búsqueda BLAST" (Altshul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402), contra el banco de datos no redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, USA) . La secuencia de nucleótido resultante se muestra en la SEC ID No.4. El análisis de la secuencia de nucleótido mostró una estructura lectora abierta de 1737 pares base, la cual^ se llamó la secuencia poxB. El gen poxB codifica a un polipéptido de 579 aminoácidos (SEC ID No.5).

Ejemplo 10 Preparación de un vector de integración para la mutagénesis de integración del gen poxB De la cepa ATCC 13032, el ADN cromosomal se aisló por el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140:1817-1828 (1994)) . Con base a la secuencia del gen poxB conocido por C. glutamicum del Ejemplo 8, se seleccionaron los siguientes aliqanucleótidos por la reacción en cadena de la polimerasa: poxBintl : 5' TGC GAG ATG GTG. AAT GGT GG 3' poxBint2 : 5' GCA TAG GGC AAC GCA TTA GC 3' Los cebadores mostraron ser sintetizados por Biotech MWG (Ebersberg, Alemania) , y la reacción en PCR se llevó a cabo por el método PCR estándar de Innis et al. (Protocolos de PCR. Una guía para métodos y aplicaciones, 1990, Academic Press) con polimerasa Pwo de Boehringer. Con la ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa, se aisló un fragmento de ADN aproximadamente 0.9 kb en tamaño, esto llevando a cabo un fragmento interno del gen poxB y siendo mostrado en la SEC ID No.6. El fragmento de ADN amplificado se ligó con el Equipo de clonación TOPO TA de Invitrogen Corporation (Carisbad, CA, USA; Número de Catálogo K4500-01) en el vector pCR2.1-T0P0 (Mead et al. (1991) Bio/Technology 9:657-663) . La cepa E. coli DH5a se sometió entonces a electroporación con el lote de ligación (Hanahan, In: Clonación de ADN. Un procedimiento práctico. Vol. I. IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985) . La selección para las células que llevan los plásmido se hizo colocando en placas el lote de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2da. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) , el cual se ha suplementado con 25 mg/ml de canamicina. El plásmido de ADN se aisló de un transformante con la ayuda del Equipo Miniprep Spin de QIAprep de Quiagen y se verificó por restricción con la enzima de restricción EcoRI y electroforesis en gel de agarosa subsecuente (0.8%). El plásmido se llamó pCR2. IpoxBint (Figura 5). El plásmido pCR2. IpoxBint se ha depositado en la forma de cepa DH5a/pCR2. IpoxBint de Escherichia coli como DSM 13114 en Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ= Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, Braunschweig, Alemania) , de conformidad con el Tratado de Budapest.

Ejemplo 11 Mutagénesis de integración del gen poxB en el DSM 5715 productor de lisina El vector pCR2. IpoxBint mencionado en el Ejemplo 10 se sometió a electroporación por el método de electroporación de Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters, 123:343-347 (1994)) en Corynebacterium glutamicum DSM 5715. La cepa DSM 5715 es un productor de lisina resistente a AEC. El vector pCR2. IpoxBint no puede replicarse independientemente en DSM5715 y es retenido en la célula solamente si se ha integrado en el cromosoma de DSM 5715. La selección de clones con pCR2. IpoxBint integrados dentro del cromosoma, se llevó a cabo colocando en placas el lote de electroporación en agar LB (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory Manual. 2da Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y), el cual se ha suplementado con 15 mg/l de canamicina. Para la detección de la integración, el fragmento poxBint se etiquetó con el equipo de hibridación Dig de Boehringer por el método de "La Guía de Usuarios del Sistema DIG para la Hibridación del filtro" de Boehringer Mannheim GMBH (Mannheim, Alemania, 1993) . El ADN cromosomal de un integrante potencial se aisló por el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) y en cada caso se desdobló con las enzimas de restricción Salí, Sacl y HindIII. Los fragmentos formados se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se hibridizaron a 68 °C con el equipo de hibridación DIG de Boehringer. El plásmido pCR2. IpoxBint mencionado en el Ejemplo 9 se ha insertado en el cromosoma de DSM5715 dentro del gen poxB cromosomal. La cepa se llamó DSM5715 : :pCR2. IpoxBint .

Ejemplo 12 Efecto de la sobre-expresión del gen zwf con eliminación simultánea del gen poxB en la preparación de lisina. 12.1 Preparación de la cepa DSM5715 : :pCR2. lpoxBint/pEC-T18mob2zwf La cepa DSM5715 : :pCR2. IpoxBint se transformó con el plásmido pEC-Tl8mob2zwf usando el método de electroporación descrito por Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). La selección de los transformantes tomó lugar en agar LBHIS que comprende 18.5 g/1 de caldo de infusión de cerebro-corazón, 0.5 M de sorbitol, 5 g/1 de Bacto-triptona, 2.5 g/1 de Bacto-Extracto de Levadura, 5 g/1 de NaCl y 18 g/1 de Bacto-agar, el cual se ha suplementado con 5 mg/l de tetraciclina y 25 - mg/l de canamicina. La incubación se llevó a cabo por dos días a 33 °C. El plásmido de ADN se aisló en cada caso de un transformante por métodos convencionales (Peters-Wendish et al., 1998, Microbiology 144, 915-927), desdoblado con las endonucleasas de restricción Xbal y Kpnl, y el plásmido se verificó por electroforesis en gel de agarosa subsecuente. La cepa obtenida en esta forma se llamó DSM5715: :pCR2. lpoxBint/pEC-T18mob2zwf . 12. Preparación de L-lisina La cepa C. glutamicum DSM5715 : :pcR2. lpoxBint/pEC-T18mob2zwf obtenida en el Ejemplo 12.1, se cultivó en un medio nutriente adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina el cultivo sobrenadante. Para esto, la cepa se incubó primero en una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con tetraciclina (5 mg/l) ) y canamicina (25 mg/l) ) por 24 horas a 33 °C. Las cepas de comparación se suplementaron de conformidad a su resistencia a los antibióticos. Partiendo de este cultivo de placa de agar, se sembró un precultivo (10 ml de medio en un matraz cónico de 100 ml) . El medio completo CglII se usó como el medio para el precultivo. Medio CglII NaCl 2.5 g/1 Bacto-Peptona 10 g/1 Bacto-Extracto de Levadura 10 g/1 Glucosa (sometida a autoclave separadamente) 2% (p/v) El pH se llevó a pH 7.4 La tetraciclina (5 mg/l) y canamicina (25 mg/l) se agregaron a esta. El precultivo se incubó por 16 horas a 33 °C a 240 rpm en una maquina sacudidora. Se sembró un cultivo principal de este precultivo, de manera tal que el OD inicial (660nm) del cultivo principal fue 0.1. El medio MM se usó para el cultivo principal. Medio MM CLS (licor extraído de maíz) 5 g/1 MOPS (ácido morfolinopropansulfónico) 20 g/1 Glucosa (sometido a autoclave de m >anera separada) 58 g/1 (NH4 ) 2S04 25 g/1 KH2P0 0.1 g/1 MgS04 * 7 H20 1.0 g/1 CaCl2 * 2 H20 10 mg/l FeS04 * 7 H20 10 mg/l MnS04 * H20 5.0 mg/l .< Biotina (estéril filtrada) 0.3 mg/l í Tiamina * HCl (estéril filtrada) 0.2 mg/l L-leucina (es^téril filtrada) 0.1 mg/l CaC03 25 g/1 *«.

El CSL, MOPS y la solución de sal se llevaron a pH 7 con amoniaco acuoso y se sometieron a autoclave. Entonces se agregaron el substrato estéril y las soluciones de vitamina, así como también el CaC03 sometido a autoclave en el estado seco. Se llevo a cabo la cultivación en un volumen de 10 ml en un matraz cónico de 100 ml con deflector. Se agregó tetraciclina (5 mg/l) y canamicina (25 mg/l) . La cultivación se llevó a cabo a 33 °C y a 80% de humedad atmosférica. Después de 72 horas, el OD se determinó a una medición de longitud de onda de 660 nm con un Biomek 1000 (Beckmann Instruments GMBH, Munich) . La cantidad de lisina form >ada se determinó con un analizador de aminoácido desde un Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) , por cromatografía de intercambio iónico y derivación postcolumna con detección de ninhidrina. El resultado del experimento se muestra en la Tabla Tabla 4 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIA <110> Degussa-Hüls AG National University of Ireland, Galway Forschungszentrum Jülich GmbH <120> Proceso para la Preparación Fermentativa de L-aminoácidos usando la Amplificación del gen zwf <130> 990239BT <140> <141> <160> 6 <170> Patßntln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2811 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (373).. (2022) <223> pgi <400> 1 aaaacccgag gggcgaaaat tccaccctaa cttttttggg atcccctttt tccggggaat 60 taattggttt gggtttcaat gggaaaacgg gaaacaatgg gccaaaggtt caaaaacccc 120 aaaagggggc cgggttcaaa ttcccaaaaa aaatggcaaa aaaggggggg ccaaaaccaa 180 gttggccccc aaaccaccgg ggcaacggcc cacccacaaa ggggttgggt taaaggaagg 240 acgcccaaag taagcccgga atggcccacg ttcgaaaaag caggccccaa ttaaacgcac 300 cttaaatttg tcgtgtttcc cactttgaac actcttcgat gcgcttggcc acaaaagcaa 360 gctaacctga ag atg tta ttt aac gac aat aaa gga gtt ttc atg gcg gac 411 Met Leu Phe Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp 1 5 10 att tcg acc acc cag gtt tgg caa gac ctg acc gat cat tac tca aac 459 lie Ser Thr Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn 15 20 25 ttc cag gca acc act ctg cgt gaa ctt ttc aag gaa gaa aac cgc gcc 507 Phe Gln Ala Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala 30 35 40 45 gag aag tac acc ttc tec gcg gct ggc ctc cae gtc gac ctg tcg aag 555 Glu Lys Tyr Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys 50 55 60 aat ctg stt gac gac gcc acc ctc acc aag ctc ctt gca ctg acc gaa 603 Asn Leu Leu Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu 65 70 75 gaa tet ggc ctt cgc gaa cgc att gac gcg atg ttt gcc ggt gaa cae 651 Glu Ser Gly Leu Arg Glu Arg lie Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His 80 85 90 ctc aac aac acc gaa gac cgc gct gtc ctc cae acc gcg ctg cgc ctt 699 Leu Asn Asn Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu 95 100 105 cct gcc gaa gct gat ctg tca gta gat ggc caa gat gtt gct gct gat 747 Pro Ala Glu Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp 110 115 120 125 gtc cae gaa gtt ttg gga cgc atg cgt gac ttc gct act gcg ctg cgc 795 Val His Glu Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg 130 135 140 tca ggc aac tgg ttg gga cae acc ggc cae acg ate aag aag ate gtc 843 Ser Gly Asn Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr He Lys Lys He Val 145 150 155 aac att ggt ate ggt ggc tet gac ctc gga cea gcc atg gct acg aag 891 Asn He Gly He Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys 160 165 170 gct ctg cgt gca tac gcg acc gct ggt ate tca gca gaa ttc gtc tec 939 Ala Leu Arg Ala Tyr Ala Thr Ala Gly He Ser Ala Glu Phe Val Ser 175 180 185 aac gtc gac cea gca gac ctc gtt tet gtg ttg gaa gac ctc gat gca 987 Asn Val Asp Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala 190 195 200 205 gaa tec aca ttg ttc gtg ate gct tcg aaa act ttc acc acc cag gag 1035 Glu Ser Thr Leu Phe Val He Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu 210 215 220 acg ctg tec aac gct cgt gca gct cgt gct tgg ctg gta gag aag ctc 1083 Thr Leu Ser Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu 225 230 235 ggt gaa gag gct gtc gcg aag cae ttc gtc gca gtg tec acc aat gct 1131 Gly Glu Glu Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala 240 245 250 gaa aag gtc gca gag ttc ggt ate gac acg gao aac atg ttc ggc ttc 1179 Glu Lys Val Ala Glu Phe Gly He Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe 255 260 265 tgg gac tgg gtc gga ggt cgt tac tec gtg gac tec gca gtt ggt ctt 1227 Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu 270 275 280 285 tec ctc atg gca gtg ate ggc cct cgc gac ttc atg cgt ttc ctc ggt 1275 Ser Leu Met Ala Val He Gly Pro Arg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly 290 295 300 gga ttc cae gcg atg gat gaa cae ttc cgc acc acc aag ttc gaa gag 1323 Gly Phe His Ala Met Asp Glu His Phe Arg Thr Thr Lys Phe Glu Glu 305 310 315 aac gtt cea ate ttg atg gct ctg ctc ggt gtc tgg tac tec gat ttc 1371 Asn Val Pro He Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe 320 325 330 tat ggt gca gaa acc cae gct gtc cta cct tat tec gag gat ctc age 1419 Tyr Gly Ala Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser 335 340 345 cgt ttt gct gct tac ctc cag cag ctg acc atg gag acc aat ggc aag 1467 Arg Phe Ala Ala Tyr Leu Glp Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys 350 355 360 365 tca gtc cae cgc gac ggc tec cet gtt tec act ggc act ggc gaa att 1515 Ser Val His Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu He 370 375 380 tac tgg ggt gag cct ggc aca aat ggc cag cae gct ttc ttc cag ctg 1563 Tyr Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu 385 390 395 ate cae cag ggc act cgc ctt gtt cea gct gat ttc att ggt ttc gct 1611 He His Gln Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe He Gly Phe Ala 400 405 410 cgt cea aag cag gat ctt cct gcc ggt gag cgc acc atg cat gac ctt 1659 Arg Pro Lys Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu 415 420 425 ttg atg age aac ttc ttc gca cag acc aag gtt ttg gct ttc ggt aag 1707 Leu Met Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys 430 435 - 440 445 aac gct gaa gag ate gct gcg gaa ggt gtc gca cct gag ctg gtc aac 1755 Asn Ala Glu Glu He Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn 450 455 460 cae aag gtc gtg cea ggt aat cgc cea acc acc acc att ttg gcg gag 1803 His Lys Val Val Pro Gly .Asn Arg Pro Thr Thr Thr He Leu Ala Glu 465 470 475 gaa ctt acc cct tet att ctc ggt gcg ttg ate gct ttg tac gaa cae 1851 Glu Leu Thr Pro Ser He Leu Gly Ala Leu He Ala Leu Tyr Glu His 480 485 490 acc gtg atg gtt cag ggc gtg att tgg gao ate aac tec ttc gac caa 1899 Thr Val Met Val Gln Gly Val He Trp Asp lie Asn Ser Phe Asp Gln 495 500 505 tgg ggt gtt gaa ctg ggc aaa cag cag gca aat gac ctc gct ccg gct 1947 Trp Gly Val Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala 510 515 520 525 gtc tet ggt gaa gag gat gtt gac tcg gga gat tet tec act gat tca 1995 Val Ser Gly Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser 530 535 540 ctg att aag tgg tac cgc gca aat agg tagtcgcttg cttatagggt 2042 Leu He Lys Trp Tyr Arg Ala Asn Arg 545 550 caggggcgtg aagaatcctc gcctcatagc actggccgct atcatcctga cctcgttcaa 2102 tctgcgaaca gctattactg ctttagctcc gctggtttct gagattcggg atgatttagg 2162 ggttagtgct tctcttattg gtgtgttggg catgatcccg actgctatgt tcgcggttgc 2222 tgcgtttgcg cttccgtcgt tgaagaggaa gttcactact tcccaactgt tgatgtttgc 2282 catgctgttg actgctgccg gtcagattat tcgtgtcgct ggacctgctt cgctgttgat 2342 ggtcggtact gtgttcgcga tgtttgcgat cggagttacc aatgtgttgc ttccgattgc 2402 tgttagggag tattttccgc gtcacg cgg tggaatgtcg acaacttatc tggtgtcgtt 2462 ccagattgtt caggcacttg ctccgacgct tgecgtgccg atttctcagt gggctacaca 2522 tgtggggttg accggttgga gggtgtcgct cggttcgtgg gcgctgctgg ggttggttgc 2582 ggcgatttcg tggattccgc tgttgagttt gcagggtgcc agggttgttg cggcgccgtc 2642 gaaggtttct cttcctgtgt ggaagtcttc ggttggtgtg gggctcgggt tgatgtttgg 2702 gtttacttcg tttgcgacgt atatcctcat gggttttatg ccgcagatgg taggtgatcc 2762 aaagaattca aaaagcttct cgagagtact tctagagcgg ccgcgggcc 2811 <210> 2 <:211> 550 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Met Leu Phe .Asn Asp Asn Lys Gly Val Phe Met Ala Asp He Ser Thr 1 5 10 15 Thr Gln Val Trp Gln Asp Leu Thr Asp His Tyr Ser Asn Phe Gln Ala 20 25 30 Thr Thr Leu Arg Glu Leu Phe Lys Glu Glu Asn Arg Ala Glu Lys Tyr 35 40 45 Thr Phe Ser Ala Ala Gly Leu His Val Asp Leu Ser Lys Asn Leu Leu 50 55 60 Asp Asp Ala Thr Leu Thr Lys Leu Leu Ala Leu Thr Glu Glu Ser Gly 65 70 75 80 Leu Arg Glu Arg He Asp Ala Met Phe Ala Gly Glu His Leu Asn Asn 85 90 95 Thr Glu Asp Arg Ala Val Leu His Thr Ala Leu Arg Leu Pro Ala Glu 100 105 110 Ala Asp Leu Ser Val Asp Gly Gln Asp Val Ala Ala Asp Val His X?lu 115 120 125 Val Leu Gly Arg Met Arg Asp Phe Ala Thr Ala Leu Arg Ser Gly Asn 130 135 140 Trp Leu Gly His Thr Gly His Thr He Lys Lys He Val Asn He Gly 145 150 155 160 He Gly Gly Ser Asp Leu Gly Pro Ala Met Ala Thr Lys Ala Leu Arg 165 170 175 Ala Tyr Ala Thr Ala Gly He Ser Ala Glu Phe Val Ser Asn Val Asp 180 185 190 Pro Ala Asp Leu Val Ser Val Leu Glu Asp Leu Asp Ala GÍu Ser Thr 195 200 205 Leu Phe Val He Ala Ser Lys Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Leu Ser 210 215 220 Asn Ala Arg Ala Ala Arg Ala Trp Leu Val Glu Lys Leu Gly Glu Glu 225 230 235 240 Ala Val Ala Lys His Phe Val Ala Val Ser Thr Asn Ala Glu Lys Val 245 250 255 Ala Glu Phe Gly He Asp Thr Asp Asn Met Phe Gly Phe Trp Asp Trp 260 265 270 Val Gly Gly Arg Tyr Ser Val Asp Ser Ala Val Gly Leu Ser Leu Met 275 280 285 Ala Val Tle Gly Pro Axg Asp Phe Met Arg Phe Leu Gly Gly Phe His 290 295 300 Ala Mßt Asp Glu His Phß Arg Thr Thr Lys Phß Glu Glu Asn Val Pro 305 310 315 320 He Leu Met Ala Leu Leu Gly Val Trp Tyr Ser Asp Phe Tyr Gly Ala 325 330 335 Glu Thr His Ala Val Leu Pro Tyr Ser Glu Asp Leu Ser Arg Phe Ala 34-0 345 350 Ala Tyr Leu Gln Gln Leu Thr Met Glu Thr Asn Gly Lys Ser Val His 355 360 365 Arg Asp Gly Ser Pro Val Ser Thr Gly Thr Gly Glu He Tyr Trp Gly 370 375 380 Glu Pro Gly Thr Asn Gly Gln His Ala Phe Phe Gln Leu He His Gln 385 390 395 400 Gly Thr Arg Leu Val Pro Ala Asp Phe He Gly Phe Ala Arg Pro Lys 405 410 415 Gln Asp Leu Pro Ala Gly Glu Arg Thr Met His Asp Leu Leu Met Ser 420 425 430 Asn Phe Phe Ala Gln Thr Lys Val Leu Ala Phe Gly Lys Asn Ala Glu 435 440 445 Glu He Ala Ala Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Val Asn His Lys Val 450 455 460 Val Pro Gly Asn Arg Pro Thr Thr Thr He Leu Ala Glu Glu Leu Thr 465 470 475 480 Pro Ser He Leu Gly Ala Leu He Ala Leu Tyr Glu His Thr Val Met 485 490 495 Val Gln Gly Val He Trp Asp He Asn Ser Phe Asp Gln Trp Gly Val 500 505 510 Glu Leu Gly Lys Gln Gln Ala Asn Asp Leu Ala Pro Ala Val Ser Gly 515 520 525 Glu Glu Asp Val Asp Ser Gly Asp Ser Ser Thr Asp Ser Leu He Lys 530 535 540 Trp Tyr Arg Ala Asn Arg 545 550 <210> 3 <211> 462 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 atggagacca atggcaagtc agtccaccgc gacggctccc ctgtttccac tggcactggc 60 gaaatttact ggggtgagcc tggcacaaat ggccagcacg ctttcttcca gctgatccac 120 cagggcactc gccttgttcc agctgatttc attggtttcg ctcgtccaaa gcaggatctt 180 cctgccggtg agcgcaecat gcatgacctt ttgatgagca acttcttcgc acagaccaag 240 gttttggctt tcggtaagaa cgctgaagag atcgctgcgg aaggtgtcgc acctgagctg 300 gtcaaccaca aggtcgtgcc aggtaatcgc ccaaccacca ccattttggc ggaggaactt 360 accccttcta ttctcggtgc gttgatcgct ttgtacgaac acacegtgat ggttcagggc 420 gtgatttggg acatcaactc cttcgaccaa tggggcgtgg aa 462 <210> 4 <211> 2160 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (327) .. (2063) <223> poxB <400> 4 ttagaggcga ttctgtgagg tcactttttg tggggtcggg gtctaaattt ggccagtttt 60 cgaggcgacc agacaggcgt gcecacgatg tttaáatagg cgatcggtgg gcatctgtgt 120 ttggtttcga cgggctgaaa ccaaaccaga ctgcccagca acgacggaaa tcccaaaagt 180 gggcatccct gtttggtacc gagtacccac ccgggcctga aactccctgg caggcgggcg 240 aagcgtggca acaactggaa tttaagagea caattgaagt cgcaccaagt taggcaacac 300 aatagecata aegttgagga gttcag atg gca cae age tac gca gaa caa tta 353 Met Ala His Ser Tyr Ala Glu Gln Leu 1 5 att gac act ttg gaa gct caa ggt gtg aag cga att tat ggt ttg gtg 401 He Asp Thr Leu Glu Ala Gln Gly Val Lys Arg He Tyr Gly Leu Val 10 15 20 25 ggt gac age ctt aat ccg ate gtg gat gct gtc cgc caa tca gat att 449 Gly Asp Ser Leu Asn Pro He Val Asp Ala Val Arg Gln Ser Asp He 30 35 40 gag tgg gtg cae gtt cga aat gag gaa gcg gcg gcg ttt gca gcc ggt 497 Glu Trp Val His Val Arg Asn Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly 45 50 55 gcg gaa tcg ttg ate act ggg gag ctg gca gta tgt gct gct tet tgt 545 Ala Glu Ser Leu He Thr Gly Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys 60 65 70 ggt cct gga aac aca cae ctg att cag ggt ctt tat gat tcg cat cga 593 Gly Pro Gly Asn Thr His Leu He Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg 75 80 85 aat ggt gcg aag gtg ttg gcc ate gct age cat att ccg agt gcc cag 641 Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala He Ala Ser His He Pro Ser Ala Gln 90 95 100 105 att ggt tcg acg ttc ttc cag gaa acg cat ccg gag att ttg ttt aag 689 He Gly Ser Thr Phe Phe Gln Glu Thr His Pro Glu He Leu Phe Lys 110 115 120 gaa tgc tet ggt tac tgc gag atg gtg aat ggt ggt gag cag ggt gaa 737 Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu 125 130 135 ege att ttg cat cae gcg att cag tec acc atg gcg ggt aaa ggt gtg 785 Arg He Leu His His Ala He Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val 140 145 150 tcg gtg gta gtg att cct ggt gat ate gct aag gaa gac gca ggt gac 833 Ser Val Val Val He Pro Gly Asp He Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp 155 160 165 ggt act tat tec aat tec act att tet tet ggc act cct gtg gtg ttc 881 Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr He Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phß 170 175 180 185 ccg gat cct act gag gct gca gcg ctg gtg gag gcg att aac aac gct 929 Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala Ala Leu Val Glu Ala He Asn Asn Ala 190 195 200 aag tet gtc act ttg ttc tgc ggt gcg ggc gtg aag aat gct cgc gcg 977 Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala 205 210 215 cag gtg ttg gag ttg gcg gag aag att aaa tca ccg ate ggg cat gcg 1025 Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu Lys He Lys Ser Pro He Gly His Ala 220 225 230 ctg ggt ggt aag cag tac ate cag cat gag aat ccg ttt gag gtc gge 1073 Leu Gly Gly Lys Gln Tyr He Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly 235 240 245 atg tet ggc ctg ctt ggt tac ggc gcc tgc gtg gat gcg tec aat gag 1121 Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Cys Val Asp Ala Ser Asn Glu 250 255 260 265 gcg gat ctg ctg att cta ttg ggt acg gat ttc cct tat tet gat ttc 1169 Ala Asp Leu Leu He Leu Leu Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe 270 275 280 ctt cct aaa gac aac gtt gcc cag gtg gat ate aac ggt gcg cae att 1217 Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala Gln Val Asp He Asn Gly Ala His He 285 290 295 ggt cga cgt acc acg gtg aag tat ccg gtg acc ggt gat gtt gct gca 126S Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala 300 305 310 aca ate gaa aat att ttg cct cat gtg aag gaa aaa aca gat cgt tec 1313 Thr He Glu Asn He Leu Pro His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser 315 320 325 ttc ctt gat cgg atg ctc aag gca cae gag cgt aag ttg age tcg gtg 1361 Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val 330 33S 340 345 ' gta gag acg tac aca cat aac gtc gag aag cat gtg cct att cae cct 1409 Val Glu Thr Tyr Thr His Asn Val Glu Lys His Val Pro He His Pro 350 355 360 gaa tac gtt gcc tet att ttg aac gag ctg gcg gat aag gat gcg gtg 1457 Glu Tyr Val Ala Ser He Leu Asn Glu Leu Ala Asp Lys Asp Ala Val 365 370 375 ttt act gtg gat acc ggc atg tgc aat gtg tgg cat gcg agg tac ate 1505 Phe Thr Val Asp Thr Gly Met Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr He 380 385 390 gag aat ccg gag gga acg ege gao ttt gtg ggt tca ttc ege cae ggc 1553 Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly 395 400 405 acg atg gct aat gcg ttg cct cat gcg att ggt gcg caa agt gtt gat 1601 Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro His Ala He Gly Ala Gln Ser Val Asp 410 415 420 425 cga aac cgc cag gtg ate gcg atg tgt ggc gat ggt ggt ttg ggc atg 1649 Arg Asn Arg Gln Val He Ala Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met 430 435 440 ctg ctg ggt gag ctt ctg acc gtt aag ctg cae caa ctt ccg ctg aag 1697 Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys 445 450 455 gct gtg gtg ttt aac aac agt tet ttg ggc atg gtg aag ttg gag atg 1745 Ala Val Val Phe Asn Asn Ser Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met 460 465 470 ctc gtg gag gga cag cea gaa ttt ggt act gac cat gag gaa gtg aat 1793 Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn 475 480 485 ttc gca gag att gcg gcg gct gcg ggt ate aaa tcg gta cgc ate acc 1841 Phe Ala Glu He Ala Ala Ala Ala Gly He Lys Ser Val Arg He Thr 490 495 500 505 gat ccg aag aaa gtt cgc gag cag cta gct gag gca ttg 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Arg Asn 35 40 45 Glu Glu Ala Ala Ala Phe Ala Ala Gly Ala Glu Ser Leu He Thr Gly 50 55 60 Glu Leu Ala Val Cys Ala Ala Ser Cys Gly Pro Gly Asn Thr His Leu 65 70 75 80 He Gln Gly Leu Tyr Asp Ser His Arg Asn Gly Ala Lys Val Leu Ala 85 90 95 He Ala Ser His He Pro Ser Ala Gln He Gly Ser Thr Phe Phe Gln 100 105 lio Glu Thr His Pro Glu He Leu Phe Lys Glu Cys Ser Gly Tyr Cys Glu 115 120 125 Met Val Asn Gly Gly Glu Gln Gly Glu Arg He Leu His His Ala He 130 135 140 Gln Ser Thr Met Ala Gly Lys Gly Val Ser Val Val Val He Pro Gly 145 150 155 160 Asp He Ala Lys Glu Asp Ala Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Asn Ser Thr 165 170 175 He Ser Ser Gly Thr Pro Val Val Phe Pro Asp Pro Thr Glu Ala Ala 180 185 190 Ala Leu Val Glu Ala He Asn Asn Ala Lys Ser Val Thr Leu Phe Cys 195 200 205 Gly Ala Gly Val Lys Asn Ala Arg Ala Gln Val Leu Glu Leu Ala Glu 210 215 220 Lys He Lys Ser Pro He Gly His Ala Leu Gly Gly Lys Gln Tyr He 225 230 235 240 Gln His Glu Asn Pro Phe Glu Val Gly Met Ser Gly Leu Leu Gly Tyr 245 250 255 Gly Ala Cys Val .Asp Ala Ser Asn Glu Ala Asp Leu Leu He Leu Leu 260 265 270 Gly Thr Asp Phe Pro Tyr Ser Asp Phe Leu Pro Lys Asp Asn Val Ala 275 280 285 Gln Val Asp He Asn Gly Ala His He Gly Arg Arg Thr Thr Val Lys 290 295 300 Tyr Pro Val Thr Gly Asp Val Ala Ala Thr He Glu Asn He Leu Pro 305 310 315 320 His Val Lys Glu Lys Thr Asp Arg Ser Phe Leu Asp Arg Met Leu Lys 325 330 335 Ala His Glu Arg Lys Leu Ser Ser Val Val Glu Thr Tyr Thr His Asn 340. 345 350 Val Glu Lys His Val Pro He His Pro Glu Tyr Val Ala Ser He Leu 355 , 360 365 '* ., Asn Glu Leu Ala ^Asj^ Lys Asp Ala Val Phe Thr Val Asp Thr Gly Met 370 *fr 375 380 V Cys Asn Val Trp His Ala Arg Tyr He Glu Asn Pro Glu Gly Thr Arg 385 390 395 400 Asp Phe Val Gly Ser Phe Arg His Gly Thr Met Ala Asn Ala Leu Pro 405 410 415 His Ala He Gly Ala Gln Ser Val Asp Arg Asn Arg Gln Val He Ala 420 425 430 Met Cys Gly Asp Gly Gly Leu Gly Met Leu Leu Gly Glu Leu Leu Thr 435 440 445 Val Lys Leu His Gln Leu Pro Leu Lys Ala Val Val Phe Asn Asn Ser 450 " 455 460 Ser Leu Gly Met Val Lys Leu Glu Met Leu Val Glu Gly Gln Pro Glu 465 470 475 480 Phe Gly Thr Asp His Glu Glu Val Asn Phe Ala Glu He Ala Ala Ala 485 490 495 Ala Gly He Lys Ser Val Arg He Thr Asp Pro Lys Lys Val Arg Glu 500 505 510 Gln Leu Ala Glu Ala Leu Ala Tyr Pro Gly Pro Val Leu He Asp He 515 520 525 Val Thr Asp Pro Asn Ala Leu Ser He Pro Pro Thr He Thr Trp Glu 530 535 540 Gln Val Met Gly Phe Ser Lys Ala Ala Thr Arg Thr Val Phe Gly Gly 545 550 555 560 Gly Val Gly Ala Met He Asp Leu Ala Arg Ser Asn He Arg Asn He 565 , 570 575 Pro Thr Pro <210> 6 <211> 875 <212> ADN <213> Corynebacterium glutamicum <400> 6 tgcgagatgg tgaatggtgg tgagcagggt gaacgcattt tgcatcacgc gattcagtcc 60 accatggcgg gtaaaggtgt gtcggtggta gtgattcctg gtgatatcgc taaggaagac 120 gcaggtgacg gtacttattc caattccact atttcttctg gcactcctgt ggtgttcccg 180 gatcctactg aggctgcagc gctggtggag gcgattaaca acgctaagtc tgtcactttg 240 ttctgcggtg cgggcgtgaa gaatgctcgc gcgcaggtgt tggagttggc ggagaagatt 300 aaatcaccga tcgggcatgc gctgggtggt aagcagtaca tccagcatga gaatccgttt 360 gaggtcggca tgtetggcct gcttggttac ggcgcctgcg tggatgcgtc caatgaggcg 420 gatctgctga ttctattggg tacggatttc ccttattetg atttccttce taaagacaac 480 gttgcccagg tggatatcaa cggt'gcgcac attggtcgac gtaccacggt gaagtatccg 540 gtgaccggtg atgttgctgc aacaatcgaa aatattttgc ctcatgtgaa ggaaaaaaca 600 gatcgttcct tccttgatcg gatgctcaag gcacacgagc gtaagttgag ctcggtggta 660 gagacgtaca cacataacgt cgagaagcat gtgcctattc accctgaata cgttgcctct 720 attttgaacg agctggcgga taaggatgcg gtgtttactg tggataccgg catgtgcaat 780 gtgtggcatg cgaggtacat cgagaatccg gagggaacgc gcgactttgt gggttcattc 840 cgccacggca cgatggctaa tgcgttgcct catgc 875

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un proceso para la preparación de L-aminoácidos por fermentación de la bacteria corineforme, caracterizado porque comprende, llevar a cabo los siguientes pasos: a) fermentación de la bacteria que produce L- aminoácidos en la cual al menos, se amplifica el gen zwf, b) concentración de L-aminoácido en el medio o en las células de la bacteria y > c) aislamiento del L-aminoácido producido.

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se emplea la bacteria en la cual los genes adicionales de la trayectoria de la biosíntesis del L-aminoácido deseado son adicionalmente amplificados, en particular sobre-expresado.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se usa la bacteria corineforme la cual prepara L-treonina, L-lisina o L-triptofano.

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque se usa la bacteria corineforme la cual prepara L-lisina. 5. Un proceso de preparación fermentativa de L-lisina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque en los microorganismos corineformes en los cuáles en particular ya se produce L-lisina, uno o más genes se seleccionan del grupo que consiste de 5.1 el gen dapA el cual es codificado por di idrodipicolinato sintasa, 5.2 el gen lysC el cual es codificado por una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación, 5.3 el gen gap el cual es codificado por 3-fosfato deshidrogenasa de gl'icerolaldehido, 5.4 el gen pyc el cual es codificado por piruvato carboxilasa, 5.5 el gen tkt el cual es codificado por transquetolasa

5.6 el gen gnd el cual es codificado por 6-fosfato deshidrogenasa de glucosa, 5.7 el gen lysE el cual es codificado por la exportación de lisina, 5.8 el gen zwal, 5.9 el gen eno el cual es codificado por enolasa, es o son amplificados o sobre-expresados al mismo tiempo. 6. Proceso para la preparación fermentativa L-treonina de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque en los microorganismos corineformes los cuales en particular ya producen L-treonina, uno o más genes se seleccionan del grupo' que consiste de 6.1 el gen hom el cual es codificado por homoserina deshidrogenasa, o el alelo homdr el cual es codificado por una homoserina deshidrogenasa de w retroalimentación resistente", 6.2 el gen gap el cual es codificado por 3-fosfato deshidrogenasa de glicerolaldehido, 6.3 el " gen pyc el cual es codificado por piruvato carboxilasa, 6.4 el gen mqo el cual es codificado por malato : oxireductasa de quinona, 6.5 el gen tkt el cual es codificado por transquetolasa,

6.6 el gen zwf el cual es codificado por el 6-fosfato deshidrogenasa de glucosa, 6.7 el gen thrE el cual es codificado por la exportación de treonina/ 6.8 el gen zwal, 6.9 el gen eno el cual es codificado por enolasa es o son amplificados, en particular sobre expresados, al mismo tiempo. 7. El proceso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado para la preparación de L-aminoácidos, en particular L-lisina o L-treonina, bacteria en la cual uno o más genes se seleccionan" del grupo que consiste de, 7.1 el gen pck el cual es codificado por piruvato carboxicinasa de fosfoenol, 7.2 el gen pgi el cual es codificado por 6-fosfato isomerasa de glucosa, 7.3 el gen poxB el cual es codificado por piruvato oxidasa,

7.4 el gen zwa2, es o están atenuados al mismo tiempo, son fermentados.

8. El proceso de conformidad con las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque para lograr la amplificación, el número de copias de los genes o secuencias de nucleótidos se incrementa por la transformación de los microorganismos con vectores plásmidos los cuales llevan estos genes o secuencias de nucleótidos.

9. El vector plásmido pEC-T18mob2 depositado bajo la designación DSM13244 en E. coli K-l2 DH5a, mostrado en la figura 2.

10. Un microorganismo corineforme, en particular del género Corynebacterium, caracterizado porque se transforma por la introducción del vector plásmido de conformidad con la reivindicación 9, el cual adicionalmente contiene el gen zwf.