MXPA01011045A - Sistema sustituto basado en celulas y metodo para evaluar la actividad de la proteasa ns3 de virus de la hepatitis c. - Google Patents
Sistema sustituto basado en celulas y metodo para evaluar la actividad de la proteasa ns3 de virus de la hepatitis c.Info
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Abstract
La presente invencion se refiere al desarrollo de un sistema de ensayo o evaluacion basado en celulas que tiene sensibilidad mejorada para la actividad de proteasa NS3 de HCV cuando se compara a ensayos conocidos, que es util para seleccionar compuestos de prueba capaces de modular (particularmente inhibir) la actividad de proteasa NS3 de HCV. Este sistema proporciona una primera construccion que comprende un dominio transactivador unido con direccion hacia abajo (31) de los dominios NS3-5 de HCV bajo el control de un sistema promotor viral no citopatico. Una segunda construccion es tambien proporcionada, la cual comprende un gen reportero bajo el control de un operador sensible al enlace del transactivador. Los dominios NS3-5 codifican para la poliproteina NS3 que comprende: la proteasa NS3, seguida por el cofactor NS4A, las proteinas NS4B y NS5A (incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de las mismas), terminado por la proteina NS5B (incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de la misma) suficiente para constituir un sitio de escision NSSA/5B. El transactivador, cuando es expresado y liberado de la poliproteina inicia la transcripcion y la expresion del gen reportero que es mensurable.
Description
SISTEMA SUSTITUTO BASADO EN CÉLULAS Y MÉTODO PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD DE LA PROTEASA NS3 DE VIRUS DE LA HEPATITIS C
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un sistema de cultivo de células de mamífero y a un método para la evaluación de la actividad de la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C (HCV) y la inhibición de la misma. Más particularmente, esta invención se refiere a una molécula recombinante, a un sistema de evaluación de células de mamífero huésped, transfectadas, y a un método para medir la actividad de la proteasa NS3 y la inhibición de la misma, por compuestos anti-HCV candidatos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El virus de la hepatitis C (HCV) es el agente etiológico principal de la post-transfusión y de la hepatitis no A No B adquirida en la comunidad, mundialmente. Se estima que arriba de 100 millones de personas alrededor del mundo están infectadas por el virus. Un alto porcentaje de portadores se llegan a infectar crónicamente y muchos progresan a la enfermedad hepática crónica, también llamada hepatitis C crónica. Este grupo
Ref. 133005 está a su vez en alto riesgo para la enfermedad hepática seria tal como la cirrosis hepática, el carcinoma hepatocelular y la enfermedad hepática terminal que conduce a la muerte. El mecanismo mediante el cual el HCV establece la persistencia viral y provoca una alta tasa de enfermedad hepática crónica no ha sido todavía perfectamente elucidado. No se sabe cómo interactúa el HCV con y evade el sistema inmune del huésped. Además, los papeles de las respuestas inmunes celular y humoral en la protección contra la infección por el HCV y la enfermedad, no han sido todavía establecidos. Diversos estudios clínicos han sido conducidos con la meta de identificar los compuestos farmacéuticos capaces de tratar de manera efectiva la infección por el HCV en pacientes afectados con la hepatitis C crónica. Estos estudios han involucrado el uso de interferón alfa, solo o en combinación con otros agentes antivirales tales como la ribavirina. Tales estudios han mostrado que un número sustancial de los participantes no responden a estas terapias, y de aquellos que sí responden favorablemente, una gran proporción se encontró que recaen después de la terminación del tratamiento. A la fecha no existen compuestos antivirales ampliamente efectivos para el tratamiento de la infección por el HCV.
El HCV es un virus de .ARN de hebra positiva envuelta, en la familia Flaviviridae . El genoma del .ARN del HCV de una sola hebra es de aproximadamente 9500 nucleótidos de longitud y tiene una estructura de lectura abierta simple (ORF) que codifica para una poliproteína grande simple de aproximadamente 3000 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteína es escindida en sitios múltiples por las proteasas celulares y virales para producir proteínas estructurales y no estructurales (NS) . Las proteínas estructurales (C, El, E2 y E2-p7) comprenden polipéptidos que constituyen la partícula viral. Las proteínas no estructurales (NS2, NS3 , NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) codifican para enzimas o factores accesorios que catalizan y regulan la replicación del genoma de ARN del HCV. El procesamiento de las proteínas estructurales es catalizado por las proteasas de la célula huésped. La generación de las proteínas no estructurales maduras es catalizada por dos proteasas viralmente codificadas. La primera es la etaloproteasa NS2-3 dependiente del zinc, la cual auto-cataliza la liberación de la proteína NS3 a partir de la poliproteína. La NS3 liberada contiene un dominio de proteasa de serina en el extremo N y cataliza las escisiones restantes a partir de la poliproteína. La proteína NS4A liberada tiene al menos dos papeles. Primeramente, la formación de un complejo estable con la proteína NS3 y ayudar en la localización membranal del complejo NS3/NS4A (Kim et al., 1999) y en segundo lugar, actuar como un cofactor para la actividad de la proteasa NS3. Este complejo asociado a la membrana, cataliza a su vez la escisión de los sitios restantes sobre la poliproteína, efectuando de este modo la liberación de NS4B, NS5A y NS5B. El segmento C-terminal de la proteína NS3 también alberga la trifosfatasa de nucleósido y la actividad de helicasa de ARN. La NS5B es una ARN-polimerasa dependiente del ARN que está involucrada en la replicación del HCV. Los 180 aminoácidos N-terminales de la proteína NS3 es una proteasa de serina similar a la tripsina que media como un primer paso la auto-escisión de NS3/4A. El complejo NS3/4A asociado a la membrana escinde además las uniones NS4A/4B, NS4B/5A y NS5A/NS5B para liberar las enzimas virales consideradas esenciales para la replicación viral. La formación del complejo de NS3/NS4A es un paso importante en el procesamiento secuencial corriente abajo (3') de la poliproteína. La proteína NS3 es la proteína HCV más completamente caracterizada. Los parámetros cinéticos para la escisión de todos los sitios de procesamiento han sido descritos. Los dominios de la proteasa N-terminal y de la helicasa C-terminal han sido independientemente cristalizados y existen los modelos tridimensionales de alta resolución para estas estructuras. La actividad de la proteasa NS3 es un objetivo atractivo para el descubrimiento de fármacos. Los estudios enzimáticos han mostrado que los péptidos basados en el producto N-terminal del sitio de escisión NS5A/5B son inhibidores competitivos de la enzima. Estos péptidos han servido como un punto inicial útil en los esfuerzos de la química medicinal para diseñar racionalmente los inhibidores de la proteasa NS3 como compuestos anti-HCV clínicamente efectivos. Debido a la alta incidencia del HCV y las consecuencias de las infecciones por HCV, se ha vuelto importante el encontrar compuestos terapéuticos contra el HCV. Para ese fin, los esfuerzos para descubrir los compuestos contra HCV han necesitado el desarrollo de sistemas de evaluación para seleccionar y clasificar los compuestos anti-HCV. A la fecha, un sistema conveniente de replicación de cultivo celular para el virus HCV no es disponible. Esta deficiencia ha restringido la mayor parte de la selección del inhibidor de HCV para los ensayos enzimáticos in vi tro y el ensayo basado en células, sustituto, indirecto (Lohmann et al. (1999)). Esto ha limitado severamente la evaluación de los compuestos anti-HCV potenciales en el cultivo celular. Hirowatari et al. (1995)' describe la cotransfección de un primer plásmido que contiene el dominio NS2/NS3 fusionado al sitio de escisión NS5A/NS5B (sustrato para NS3) y el transactivador Tax 1, y un segundo plásmido que contiene un gen reportero cuya expresión es dependiente de la transactivación de Tax 1. El sitio NS5A/5B es escindido por la actividad de la proteasa NS2 o NS3, expresada, mediante lo cual se libera Tax 1 para transactivar el gen reportero sobre el segundo plásmido. De este modo, la cantidad del gen reportero expresado es una medida de la actividad proteolítica de NS2 o NS3. Uno de los inconvenientes es que este sistema no distingue entre las actividades de la metaloproteasa NS2 y la actividad de proteasa NS3. Además, este sistema no permite la medición de la actividad de proteasa de la proteína NS3 cuando se forma en complejo con el dominio NS4A, un complejo que mejora la especificidad de la proteasa. Este ensayo tampoco permite a alguien medir la actividad de proteasa en un sistema que es más parecido al contexto natural del procesamiento de la poliproteína. Finalmente, un inconveniente adicional radica en el hecho de que este sistema es semi-cuantitativo, por lo tanto no adecuado para la selección cuantitativa de alto rendimiento.
Overton, H. et al. (1995) enseñan una actividad de NS3 del HCV, expresada por el baculovirus, en células de insecto. Se describen una serie construcciones de baculovirus diseñadas para expresar la actividad de la proteasa NS3 y diferentes sustratos. Las construcciones que codifican para NS2/NS3 parcial y NS3/NS4A/NS4B son transfectadas dentro de una línea de células de insecto. Las construcciones virales adicionales que codifican para NS3 hasta NS5A y NS5A/5B son transfectadas solas o conjuntamente con una de las construcciones anteriores. Los productos expresados y escindidos son visualizados inmunológicamente por el análisis de Western. Algunas de las deficiencias en este sistema se refieren al uso de un insecto en vez de una línea de células de mamífero, así como el requerimiento para la infección viral, un evento que puede además perturbar las funciones normales de la célula. Este sistema también emplea el sistema de expresión de la polimerasa T7, un sistema que no es necesario para el sistema de la presente invención. Además, el método para la detección de los productos de escisión es prolongado, difícil de cuantificar con precisión y no disponible para la producción a gran escala. Song et al., (1996) describen un sistema de ensayo de proteasa que utiliza una proteína de fusión lexA-GAL4 en levadura. Los autores describen la inserción de la proteasa NS3 y un sitio de escisión entre el dominio de enlace y el lexA-ADN y el dominio de activación transcripcional de GAL4. La escisión de ese sitio por la proteasa NS3 hace a GAL4 transcripcionalmente inactivo, lo que conduce a la incapacidad de la levadura transformada para sintetizar la ß-galactosidasa. Este sistema carece de NS4A y no reproduce el procesamiento en el contexto de la poliproteína HCV. Cho, Y.G. et al. (197) enseñan un ensayo que utiliza el sistema de replicación viral sindbis. Esta construcción de virus híbrida codifica para la región de la proteasa NS3/NS4A de HCV, enlazada a las proteínas de núcleo SIN por la secuencia de escisión de NS4A/NS4B. El ensamblaje de las partículas virales en una línea celular de mamífero es dependiente del procesamiento del sitio de escisión NS4A/4B. Un inconveniente mayor de este sistema radica en que la actividad de la proteasa HCV produce virus quimérico que induce cambios morfológicos citopáticos en las células. La medición del cambio de pH en el medio constituye una forma semi-cuantitativa de medir estos cambios de la mejor forma. Un inconveniente adicional en este sistema es que la proteína de núcleo sindbis contiene un sitio de escisión de proteasa de serina, natural, similar al sitio NS3 haciendo de este modo a este sistema de uso limitado para la selección de los inhibidores de proteasa, potenciales. Cho, Y.G. et al. (1998), enseñan un vector de expresión que codifica para la región NS3/NS4A y el sitio de escisión NS4A/4B fusionado al gen SEAP (fosfatasa alcalina secretada) , transfectado dentro de una línea celular de mamífero. La escisión del sitio NS4A/4B por la proteasa NS3 libera la proteína SEAP hacia el medio. La cantidad de proteína SEAP en el medio es una medida de la actividad de la proteasa NS3. Un inconveniente de este sistema yace en el hecho de que la molécula reportera está directamente fusionada a la proteína del sustrato y puede por lo tanto afectar la conformación natural de las proteínas complejas virales (NS3/NS4A) . Un inconveniente mayor adicional radica en el hecho de que la cantidad de proteína reportera secretada está en proporción directa a la cantidad de proteína expresada y escindida en el sistema
(1 molécula de sustrato escindida = 1 molécula reportera secretada) . Ya que la poliproteína HCV es un sistema que es expresado a niveles muy bajos (incluso en su contexto natural) , la señal observada es demasiado baja para ser llevada a cabo a una escala de selección grande. El documento WO 98/00548, describe los virus híbridos que comprenden un picornavirus, preferentemente poliovirus, el dominio de la proteasa NS3 del HCV y un sitio objetivo de la proteasa NS3, simple. Estos virus quiméricos son manipulados mediante ingeniería genética tal que la actividad de procesamiento proteolítico de la NS3 de HCV es esencial para la viabilidad viral y para la proliferación del mismo. Varios híbridos, cada uno teniendo un diferente sitio de escisión de NS3 (NS5A/NS5B, NS4A/NS4B o NS4B/NS5A) son mostrados. La viabilidad es medida por el título viral utilizando el ensayo en placa sobre células HeLa en monocapa. Una vez más este sistema no proporciona medios cuantificables para seleccionar grandes números de inhibidores potenciales de una manera con alto rendimiento y no proporciona la selección de la actividad de proteasa de NS3 en el contexto natural del segmento de poliproteína. La Patente de los Estados Unidos No. 5,861,267 por Vértex describe un método para evaluar la proteasa NS3 de HCV que utiliza la expresión de la región NS3/NS4A y el sitio de escisión NS4A/NS4B fusionado al reportero Il-lß secretado (interleucina-lß) . La escisión en el sitio NS4A/4B por la proteasa NS3 libera IL-lß hacia el medio, lo cual permite una medición directa de la actividad de proteasa NS3. Este sistema examina la inhibición de la escisión de NS3 en un sitio de escisión adyacente al complejo NS3/NS4A, una situación que no representa o que no replica las condiciones auténticas de los sitios múltiples del procesamiento de poliproteína presente en las células infectadas. Además, este sistema proporciona un sistema reportero donde la señal medida está en proporción directa a la cantidad de proteína expresada en el sistema y la cantidad de proteína escindida, una vez más dando origen a una señal demasiado baja para llevar a cabo a una escala de selección grande. El documento WO 00/08469 por Agouron describe un sistema adicional que comprende una construcción de proteasa-reportero que consiste de la metaloproteasa NS2, la proteasa NS3, el cofactor NS4A y diferentes variaciones de NS4B y 5A truncados, que preceden el sitio de escisión NS5A/5B. Este sistema no obstante, no describe la importancia de tener una poliproteína completa para optimizar la actividad/especificidad de la proteasa NS3. Además, este sistema requiere la infección por un vector del virus de la vaccinia, un factor que mitiga la integridad de la célula huésped y puede afectar el mecanismo de la escisión de la proteasa cis o trans durante los eventos de procesamiento de la poliproteína en el ensayo. Un inconveniente adicional de utilizar la expresión de vaccinia yace en el hecho de que las células en el ensayo se vuelven necróticas después de aproximadamente 24 horas, con lo cual se limita el uso de este ensayo a ensayos cinéticos a más largo plazo. El documento WO 00/12727 por Vértex describe un sistema que tiene una proteína de fusión que comprende un dominio de enlace al ligando, un dominio de enlace al ADN que puede enlazarse a un elemento de respuesta al ligando, que provoca que el dominio de activación de VP16 regule la expresión de un gen reportero. Un sitio de escisión NS5A/5B es insertado dentro de la proteína de fusión y modula la expresión del gen reportero después de la escisión por la proteasa NS3/4A que es expresada a partir de una construcción separada. Una vez más, este sistema no describe la importancia de tener una poliproteína completa para optimizar la actividad/especificidad de la proteasa NS3. Se ha vuelto por lo tanto importante el desarrollar un ensayo o evaluación para la seleccionar grandes números de compuestos anti-HCV, con la capacidad para elevar la escala hasta un sistema de alto rendimiento. La presente invención proporciona por lo tanto un ensayo que es fácil de realizar, confiable, sensible y reproducible a gran escala. Es por lo tanto el propósito de esta invención proporcionar un sistema y un ensayo basados en células que tengan sensibilidad mejorada para medir la inhibición de la actividad de la proteasa NS3 de HCV, siendo diseñado este ensayo para probar concurrentemente la actividad de la proteasa en una construcción que reproduce tanto como sea posible los eventos de procesamiento de la poliproteína NS3 que ocurre en las células infectadas en el curso de la enfermedad HCV.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
De este modo, la presente invención se refiere al desarrollo de un sistema de ensayo basado en células, que tiene sensibilidad mejorada para la actividad de la proteasa NS3 de HCV cuando se compara a los ensayos conocidos, y que es útil para seleccionar los compuestos de prueba capaces de modular (particularmente inhibir) la actividad de la proteasa NS3 de HSV. Esta invención proporciona una primera construcción que comprende un dominio transactivador unido corriente abajo (3') de los dominios NS3-5 de HCV bajo el control de un sistema promotor viral no citopático. Una segunda construcción es también proporcionada, la cual comprende un gen reportero bajo el control de un operador sensible al enlace del transactivador. El dominio NS3-5 codifica para la poliproteína NS3 que comprende: la proteasa NS3 , seguida por el cofactor NS4A, las proteínas NS4B y NS5A (incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de las mismas) , terminada por la proteína NS5B (incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de la misma) suficiente para constituir un sitio de escisión NS5A/5B. El transactivador, cuando es expresado y liberado de la poliproteína inicia la transcripción y la expresión del gen reportero que es mensurable. Las ventajas de este sistema son muchas incluyendo el hecho de que, el dominio del cofactor NS4A, cuando es expresado, permanece incrustado en la membrana del retículo endoplásmico mediante lo cual se ancla la proteasa NS3 cuando se forman complejos con NS4A y reduciendo la señal antecedente (al prevenir la translocación no específica) cuando ninguno de los sitios de escisión corriente abajo (3') de la poliproteína es procesado. Las ventajas de este sistema también radican en varios niveles de amplificación de la señal medida. El solicitante cree que un primer nivel de amplificación yace en el hecho de que la poliproteína reproduce sensiblemente la conformación nativa de la poliproteína y los eventos de procesamiento naturales que ocurren durante la infección humana. Esto aumenta la actividad de la escisión de la proteasa NS3 así como su especificidad. La translocación de la señal hacia el núcleo y la expresión del reportero es por lo tanto más específica y el ruido antecedente reducido a un mínimo aceptable para los ensayos de selección de alto rendimiento . El uso de un sistema transactivador también proporciona un segundo nivel de amplificación que incrementa además la salida de la señal. Finalmente, este sistema transactivador, siendo sensible a la presencia de antibiótico, proporciona un control negativo "integral" interno que permite la medición del ruido antecedente inherente del ensayo, con lo cual se asegura la especificidad del ensayo y de los compuestos de prueba. De este modo, la presente invención proporciona un ensayo basado en células que tiene la habilidad para medir la inhibición de la proteasa NS3 en un sistema que imita estrechamente el procesamiento de las proteínas no estructurales de HCV en un contexto que reproduce sustancialmente el proceso de infección natural. El sistema basado en células de mamífero de la presente invención es altamente sensible, demostrando la proporción incrementada de señal/ruido cuando se compara a otros ensayos conocidos. Por lo tanto, el ensayo utilizando este sistema puede ser fácilmente elevado de escala hasta un sistema de selección de alto rendimiento. Por lo tanto, de acuerdo con una primera modalidad de la presente invención, se proporciona un sistema sustituto basado en células, para evaluar la actividad de la proteasa de la proteasa NS3 del virus de la Hepatitis C, que comprende: a) una primera molécula de .ADN quimérico que comprende : i) un sistema de expresión no citopático capaz de inducir la expresión de la primera quimera después de la transfección en una célula de mamífero; y ii) una molécula de ADN recombinante de HCV operablemente enlazada al sistema de expresión; la molécula de ADN de HCV que codifica para la poliproteína NS3-5 que comprende : un dominio activo de la proteasa NS3 , un dominio de NS4A suficiente para permitir la incrustación en la membrana ER después de la traducción y que actúa como cofactor para la actividad de la proteasa NS3, los dominios NS4B y NS5A, incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de los mismos, y - la proteína NS5B que incluye cualquier derivado, variante o fragmento de la misma, suficiente para proporcionar un sitio de escisión de NS5A/5B para la proteasa NS3 ; iii) y un dominio transactivador fusionado corriente abajo (3') de la molécula de ADN de HCV, el dominio transactivador que codifica para una molécula transactivadora capaz de iniciar la expresión de un gen reportero; b) y una segunda molécula de ADN quimérico que codifica para el gen reportero unido conjuntamente a un operón que responde a la molécula transactivadora; con lo cual la expresión de la primera molécula recombinante conduce a la producción de una poliproteína de fusión anclada al retículo endoplásmico de la célula de mamífero, la proteína anclada es capaz de ser escindida por la proteasa, con lo cual se permite la translocación del dominio transactivador para inducir la expresión del gen reportero como un medio para evaluar la actividad de la proteasa. En una segunda modalidad, la invención abarca las moléculas de .ADN recombinantes útiles en este sistema y cualquier fragmento, variante y derivado de las mismas. En una tercera modalidad, la invención abarca las proteínas recombinantes producidas a partir de las moléculas de ADN recombinantes de la invención. En una cuarta modalidad, la invención también abarca los vectores que comprenden cualquiera de aquellas moléculas de ADN recombinantes.
En una quinta modalidad, la presente invención abarca las células huésped eucarióticas transfectadas con estos vectores. En una sexta modalidad, la invención abarca un método para evaluar la actividad de la proteasa NS3 mediante el uso de las moléculas recombinantes y las células huésped transfectadas de la invención, siendo también útil este método para identificar los inhibidores potenciales de las mismas. Otros objetivos, ventajas y características de la presente invención se volverán más aparentes después de la lectura de la siguiente restricción no restrictiva de las modalidades preferidas, con referencia a los dibujos anexos, que son ejemplares y no deben ser interpretados como limitantes del alcance de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra un panorama esquemático de un ensayo basado en dos plásmidos, en el cual la actividad de la proteasa NS3 es mediadora de la actividad de luciferasa. El esquema muestra la poliproteína del precursor no estructural de HCV, recombinante counida a un dominio transactivador de tetraciclina (tTA) vía el sitio de escisión del objetivo 5A/5B. En un paso de procesamiento inicial, NS4A es escindido "en posición cis" por NS3, formando un complejo como se muestra por los círculos traslapados de NS3/NS4A. Este complejo, que está en asociación con la membrana del retículo endoplásmico (ER) , cataliza la escisión de los sitios objetivo corriente abajo (3') (4A/4B, 4B/5A y 5A/5B) con lo cual se libera el dominio tTA de la molécula recombinante. Una vez liberado el dominio tTA migra al núcleo y transactiva la expresión del gen reportero, en este caso, la luciferasa. De este modo, la actividad de la proteasa NS3 y el dominio (3') del sitio de escisión NS3/4A es esencial para la expresión de la luciferasa. El panel intermedio muestra que la transactivación de la luciferasa no ocurre en ausencia del dominio tTA liberado. Los posibles mecanismos para la no liberación de tTA pueden ser: falta de actividad de proteasa NS3 (por mutación como lo es en este caso) , o bloqueo en los sitios de escisión 3' objetivo. El panel inferior muestra que la transactivación de la luciferasa no ocurre en presencia de la tetraciclina. Aunque la poliproteína NS3 es escindida y el dominio tTA es translocado al núcleo, la tetraciclina se enlaza al tTA y previene el enlace de ADN y la expresión del gen reportero, con lo cual se proporciona un control interno confiable, para medir la actividad antecedente de la luciferasa.
La Figura 2 muestra el esquema de tres diferentes familias de quimeras que comprenden diferentes porciones de la poliproteína HCV fusionada al transactivador de la tetraciclina (tTA) con sus respectivos controles. El ADN que codifica para el segmento HCV de estas quimeras fue clonado como un fragmento Xbal dentro de los sitios Nhel y Xbal de pUHD15-l para generar las quimeras tTA. La Figura 2A muestra la primera quimera en la primera familia (construcción A) , en la cual la molécula recombinante comprende la proteína NS3 de longitud completa de HCV (incluyendo los dominios de proteasa y de helicasa) , NS4A de longitud completa (incluyendo los últimos seis aminoácidos designados como P6 a Pl) , los primeros seis aminoácidos de NS4B designados como Pl ' a P6' fusionados a la proteína tTA. Los aminoácidos P6 a Pl y Pl' a P6 ' desplazan el sitio de escisión 4A/4B como se muestra por la flecha oscura. La Figura 2B muestra la segunda quimera en la primera familia (construcción B) , que es la misma molécula recombinante que en 2A con la excepción de que la proteína
S3 es mutada en el aminoácido 1165 de serina a alanina
(S1165A) . Esta construcción sirve como un control, ya que la mutación evita completamente la actividad de la proteasa
NS3.
La Figura 2C muestra la tercera quimera en la primera familia (construcción C) , que es la misma quimera que en 2A, con la excepción de que los dos aminoácidos designados Pl y Pl' que flanquean el sitio de escisión NS4A/4B están alterados desde la cisteína y alanina hasta la arginina y prolina, respectivamente. Estos cambios evitan la escisión en este sitio. Esta construcción sirve como un control para el sitio de escisión. La Figura 2D muestra la primera quimera en la segunda familia (construcción D) , en la cual la construcción es la misma como la quimera en 2A pero donde la secuencia de aminoácidos (P6-P6') que desplaza el sitio de escisión NS4A/NS4B es reemplazada con la secuencia de aminoácidos (P6-P6') que define el sitio de escisión NS5A/NS5B. La Figura 2E muestra la segunda quimera en la segunda familia (construcción E) , que es la misma construcción que en 2D con la excepción de que la proteasa NS3 es inactivada por la mutación del aminoácido serina a alanina (S1165A) . Esta construcción sirve como un control para la segunda quimera . La Figura 2F muestra la tercera quimera en la segunda familia (construcción F) , que es la misma construcción que en 2D con la excepción que los dos aminoácidos designados Pl y Pl' que flanquean el sitio de escisión NS5A/5B están alterados de cisteína y serina a arginina y prolina, respectivamente. Estos cambios evitan la escisión en este sitio. Esta construcción sirve como un control para el sitio de escisión 5A/5B. La Figura 2G muestra la primera quimera en la tercera familia (construcción G) , en la cual la molécula recombinante comprende: la región entre la proteína NS3 de longitud completa, las proteínas NS4A, NS4B y NS5A de longitud completa, y una proteína NS5B parcial (consistente de los primeros seis aminoácidos designados Pl' a P6'), fusionada a la proteína tTA. La NS5A de longitud completa y los aminoácidos Pl' a P6' de 5B desplazan el sitio de escisión objetivo 5A/5B como se muestra por la flecha oscura. La Figura 2H muestra la segunda quimera en la tercera familia (construcción H) , que es la misma molécula recombinante que en 2G con la excepción de que la proteasa NS3 es inactivada por la mutación del aminoácido serina a alanina (S1165A) . Esta construcción sirve como un control negativo para la actividad de la proteasa NS3. La Figura 21 muestra la tercera quimera en la tercera familia (construcción I) , la cual es la misma molécula recombinante que en 2G con la excepción de que los dos aminoácidos designados Pl y Pl' que flanquean el sitio de escisión NS5A/5B están alterados de cisteína y serina a arginina y prolina, respectivamente. Estos cambios evitan la escisión en este sitio. Esta construcción sirve como un control para el sitio de escisión objetivo 5A/5B. La Figura 3 muestra los resultados de los análisis de manchado o transferencia de Western. Las quimeras descritas en las figuras 2A, 2B y 2C insertadas dentro del plásmido de expresión pCR3.1 mediante la amplificación por PCR y la clonación de TA (Invitrogen, CA, EUA) , son transitoriamente transfectadas dentro de la línea de células de riñon embrionario humano 293 con el virus de la vaccinia T7 recombinante (wT7-3) que alberga la .ARN-polimerasa T7. Las células transfectadas e infectadas fueron desarrolladas y la proteína celular extraída, sometida a electroforesis, transferida y sondeada. La Figura 3A muestra los resultados cuando la transferencia o mancha es sondeada con un anticuerpo policlonal para la proteína NS3. Las bandas A, B y C corresponden a las construcciones descritas en 2A, 2B y 2C, respectivamente, la banda "-" denota un control de células pseudotransfectadas 293. Las bandas A y C demuestran la presencia de la proteína NS3 madura (NS3), mientras que la banda B que representa la construcción con la mutación S1165A, demuestra la presencia de NS3 pre-procesada (pre) pero no parece tener ninguna proteína NS3 madura.
La Figura 3B muestra los resultados cuando la mancha o transferencia es enviada con un anticuerpo policlonal para NS4A. La Banda A demuestra la presencia de la proteína NS4A madura (NS4A) , la banda B que representa la construcción 2B con la mutación S1165A no parece tener ninguna proteína NS4A madura, similarmente la banda C que representa la construcción C con el sitio de escisión mutado no parece tener la proteína NS4A madura. Con el fin de visualizar la proteína NS4A madura que consiste de 54 aminoácidos, los extractos celulares fueron resueltos sobre el gen de Tricina de SDS-PAGE al 16.5% transferido a una membrana y sondeado con un anticuerpo policlonal NS4A. La banda resultante es mostrada en el panel inferior. La figura 4 muestra los resultados de los análisis de manchado o transferencia de Western. Las quimeras descritas en las Figuras 2D, 2E y 2F insertadas dentro del plásmido de expresión pCR3.1 mediante clonación de TA directa de los productos de PCR, son transitoriamente transfectados en la línea de células huésped de mamífero 293 junto con el virus de la vaccinia T7 recombinante (vvT7-3) que alberga la ARN-polimerasa T7. Las células transfectadas son desarrolladas y la proteína celular es extraída, sometida a electroforesis, transferida y sondeada. Los resultados muestran la mancha sondeada con un anticuerpo policlonal para la proteína NS3. Las bandas D, E y F, corresponden a las construcciones descritas en 2D, 2E y 2F, respectivamente, la banda "-" denota un control de células 293 pseudotransfectadas . Las bandas D y F demuestran la presencia de la proteína NS3 madura (NS3) , mientras que la Banda E que representa la construcción con la mutación S1165A demuestra la presencia de NS3 pre-procesada (pre) pero no parece tener ninguna proteína NS3 madura . La Figura 5 muestra los resultados de los análisis de manchado o transferencia de Western. Las quimeras descritas en las figuras 2G, 2H y 21 insertadas dentro del plásmido de expresión pCR3.1 por clonación directa de TA de los productos de PCR, son transitoriamente transfectadas dentro de la línea 293 de células huésped de mamífero junto con el virus de la vaccinia T7 recombinante (wT7-3) que albera la ARN-polimerasa T7. Las células transfectadas son desarrolladas y la proteína celular es extraída, sometida a electroforesis, transferida y sondeada . La Figura 5A muestra los resultados de la mancha sondeada con un anticuerpo policlonal para la proteína NS3. Las bandas G, H e l, corresponden a las construcciones descritas en 2G, 2H y 21, respectivamente, la banda "-" denota un control de las células 293 pseudotransfectadas . Las bandas G e l demuestran la presencia de la proteína NS3 madura (NS3) , mientras que la banda H que representa la construcción con la mutación S1165A no parece tener ninguna proteína NS3 madura. La Figura 5B muestra los resultados del manchado o transferencia de Western sondeado con un anticuerpo policlonal para la proteína NS4A. Las bandas G, H e I, corresponden a las construcciones descritas en 2G, 2H y 21, respectivamente, la banda "-" denota una de las células 293 pseudotransfectadas . Las bandas G e l demuestran la presencia de la proteína NS4A madura (NS4A) , mientras que la banda H que representa la construcción con la mutación S1165A no parece tener ninguna proteína NS4A madura. La Figura 5C muestra los resultados del manchado
0 transferencia de Western sondeado con un anticuerpo policlonal para la proteína NS5A. Las bandas G, H e l, corresponden a las construcciones descritas en G, H e l, respectivamente, la banda "-" denota una de las células 293 pseudotransfectadas . La banda G demuestra la presencia de la proteína NS5A madura (NS5A) , mientras que la banda H que representa la construcción con la mutación S1165A no parece tener ninguna proteína NS5A madura. Similarmente, la banda
1 que representa la construcción I con el sitio de escisión NS5A/5B mutado no parece tener la proteína NS5A madura y la proteína de fusión NSTA-tTa no procesada es detectada como un producto de aproximadamente 90 kDa.
La Figura 6 muestra los resultados del ensayo de luciferasa realizado sobre los extractos de células 293 cotransfectadas con una de las construcciones A a I y el plásmido reportero pUHC13-3. La actividad de luciferasa es una medida de las cuentas fotónicas por segundo. Las designaciones A a I corresponden a las construcciones descritas en la Figura 2a a 21, respectivamente. Los controles B, E y H son defectuosos en el sitio activo de la proteasa mientras que los controles C, F e I tienen un sito de escisión defectuoso. Los resultados de este ensayo indican que la actividad de la luciferasa es dependiente de una proteasa NS3 activa y un sitio de escisión funcional. Los resultados indican además que la construcción G demuestra mayor actividad de luciferasa que las construcciones A o D. Estos valores son un promedio de dos experimentos . La Figura 7 muestra la proporción de la actividad de la luciferasa producida por las construcciones A, D y G sobre sus respectivos mutantes B, E y H utilizando los valores mostrados en la Figura 6. Los resultados muestran que la proporción de G/H es aproximadamente 9 y 2 veces mayor que A/B y D/E, respectivamente. La construcción G, con el tramo más largo de la región no estructural de HCV que comprende NS3 , NS4A, NS4B y NS5A de longitud completa, y NS5B parcial, produce la mayor respuesta a la luciferasa dependiente de NS3. Los resultados son un promedio de n experimentos . La figura 8 muestra el efecto de la tetraciclina sobre el transactivador transcripcional que responde a la tetraciclina. La expresión del gen reportero de la luciferasa es controlada por el procesamiento de NS3 de un transactivador transcripcional que responde a la tetraciclina. El ensayo de luciferasa realizado sobre los extractos de las células 293 cotransfectadas con la construcción G o H, o el plásmido control positivo que produce tTA (pUHD15-l) , y el plásmido pUHC13-3 que contiene el reportero de la luciferasa. Las barras oscuras y claras indican la ausencia y presencia de tetraciclina, respectivamente. Nótese que la construcción G produce una señal controlada por la tetraciclina; la inactivación de la actividad de la proteasa NS3 (en la construcción H) suprime esta señal . La Figura 9 muestra los resultados del ensayo de luciferasa realizado sobre extractos de la línea de células de hígado WRL68 cotransfectadas con una de las construcciones A a I y el plásmido reportero pUHC13-3. la actividad de luciferasa es una medida de las cuentas fotónicas por segundo. Los controles B, E y H son defectuosos en el sitio activo de la proteasa. Los controles C, F e I tienen un sitio de escisión defectuoso y de este modo no tienen un sitio de escisión de proteasa NS3 funcional (escindible) . Los resultados de este ensayo indican que la actividad de la luciferasa es dependiente de una proteasa NS3 activa y de un sitio de escisión funcional . Los resultados indican además que la construcción G demuestra mayor actividad de luciferasa que las construcciones A o D. La Figura 10 muestra la proporción de la actividad de la luciferasa producida por las construcciones A, D y G con sus respectivos mutantes de sitio activo B, E y H. El ensayo de luciferasa realizado sobre los extractos de la línea de células de hígado WRL68 cotransfectadas con una de las construcciones A, B, D, E, G o H, y el plásmido reportero pUHC13-3. La actividad de la luciferasa es una medida de las cuentas fotónicas por segundo. Los resultados muestran que la proporción de G/H es aproximadamente 5 y 3.5 veces mayor que la proporción A/B y D/E, respectivamente. La construcción G, con el tramo más largo de la región no estructural de HCV que comprende NS3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B de longitud parcial o completa también parece producir la más alta respuesta de la luciferasa dependiente de NS3 en la línea celular WRL68. La Figura 11 muestra los resultados de la optimización de la cantidad del ADN plasmídico para transformar la línea celular 293. Cantidades diferentes de ADN de la construcción G o la construcción H del control NS3 defectuoso, correspondiente, fueron cotransfectadas con una cantidad constante de pUHC 13-3 (0.2 µg) . Las células a una confluencia de 50% en placas de 6 pozos fueron utilizadas. Los resultados indican que una cantidad de .ADN plasmídico que codifica para NS3 aproximadamente 3 veces mayor (0.6 µg) que pUHC 13-3 (0.2 µg) produce la señal de luciferasa dependiente de NS3, óptima, en las células 293. La Figura 12 muestra los resultados de la optimización de la cantidad del ADN plasmídico para transformar la línea de células de hígado WRL 68. Diferentes cantidades de ADN de la construcción G o la construcción H control de NS3 defectuosa, correspondiente, fueron cotransfectadas con una cantidad constante de pUHC 13-3 (0.2 µg) . Los resultados indican que una cantidad aproximadamente 2.5 veces mayor (0.5 µg) que pUHC 13-3 (0.2 µg) produce la señal de luciferasa óptima dependiente de NS3 en la línea de células de hígado WRL68. La Figura 13 muestra que la proteína NS3 expresada a partir de la construcción I puede romper la poliproteína no estructural HCV en posición "trans" en las células 293. El experimento involucró la cotransfección del reportero pUHC 13-3 con una de las construcciones G, H o I . Las construcciones H e l fueron también simultáneamente cotransfectadas junto con el plásmido reportero pUHC 13-3. La transfección únicamente de la construcción G con el reportero da como resultado una señal de actividad de luciferasa fuerte, mientras que la transfección de la construcción H con el reportero (mutante del sitio activo de la proteasa NS3) o la construcción I con el reportero (el mutante del sitio de escisión) da como resultado actividad de luciferasa débil. La cotransfección triple con las construcciones H e l junto con el plásmido reportero restaura la señal de actividad de la luciferasa. La proteína NS3 funcional expresada a partir de la construcción I puede procesar el sitio de escisión no modificado expresado a partir de la construcción H, con lo cual se libera el transactivador de tetraciclina para iniciar la expresión de la luciferasa del operón de tetraciclina. Las diferentes cantidades del ADN plasmídico utilizadas en las transfecciones son como se indican. La Figura 14 muestra los resultados de un experimento similar como en la figura 13 utilizando la línea de células de hígado WRL68. Similarmente, los resultados indican que la proteína NS3 producida a partir de la construcción I puede romper la poliproteína no estructural de HCV en posición "trans" en células WRL68. Como se indica, diferentes cantidades del ADN plasmídico son utilizadas en la transfección.
La Figura 15-cuadros oscuros: muestran el % de inhibición de la actividad de la proteasa NS3 de HCV en la transactivación de tTA de la expresión de SEAP en células huésped cotransfectadas con la construcción G y el plásmido reportero pUHC13-3 que expresa la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) . Cuadros claros: muestran el % de inhibición de la actividad de tTA conrol (independiente de NS3 de HCV) en la transactivación de SEAP en células huésped cotransfectadas con los plásmidos control pUHD15-l y pUHC13-3. Las células fueron desarrolladas post-transfección en presencia de diversas concentraciones del inhibidor A. La actividad SEAP fue medida y los valores de EC5o y TC50 fueron determinados .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS
Definiciones
A no ser que se defina de otro modo, los términos científicos y tecnológicos y la nomenclatura utilizada en la presente tuvieron el mismo significado que es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. En general, los procedimientos para el cultivo celular, la infección, los métodos de biología molecular y similares, son métodos comunes utilizados en la técnica. Tales técnicas estándares pueden ser encontradas en los manuales de referencia tales como por ejemplo Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1994). Las secuencias nucleotídicas son presentadas en la presente por hebra simple, en la dirección 5' a 3', de izquierda a derecha, utilizado los símbolos de nucleótido de una sola letra, como se utilizan comúnmente en la técnica, y de acuerdo con las recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUB de la IUPAC (1972) . La presente descripción se refiere a un número de términos tecnológicos de ADN recombinante (ADNr) rutinariamente utilizados. No obstante, las definiciones de los ejemplos seleccionados de tales términos de ADNr son proporcionadas para claridad y consistencia. El término "ADN recombinante" , "molécula de ácido nucleico recombinante" o "plásmido recombinante" como son conocidos en la técnica se refieren a una molécula de ADN que resulta de la unión de los segmentos de ADN. Esto es a menudo denominado como manipulación por ingeniería genética. El término "segmento o molécula o secuencia de ADN", es utilizado en la presente para referirse a las moléculas comprendidas de los desoxirribonucleótidos adenina (A) , guanina (G) , timina (T) y/o citosina (C) .
Estos segmentos, moléculas o secuencias pueden ser encontrados en la naturaleza o pueden ser sintéticamente derivados. Cuando se leen de acuerdo con el código genético, estas secuencias pueden codificar para un tramo lineal o una secuencia de aminoácidos que pueden ser denominadas como un polipéptido, proteína, fragmento de proteína y similares. Como se utiliza en la presente, el término "gen" es bien conocido en la técnica y se refiere a una secuencia de ácido nucleico que define una proteína o polipéptido simple. El polipéptido puede ser codificado por una secuencia de longitud completa o cualquier porción de la secuencia de codificación, siempre y cuando sea conservada la actividad funcional de la proteína. Un "gen estructural" define una secuencia de ADN que es transcrita en ARN y traducida a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos específica, con lo cual da origen a un polipéptido o proteína específica. "Proteínas estructurales" define las proteínas de HCV incorporadas dentro de las partículas virales a saber, el núcleo "C", El, E2 y E2-p7. Las "proteínas no estructurales", definen las proteínas de HCV que no están comprendidas en las partículas virales, a saber NS2, NS3 , NS4A, NS5A, y NS5B.
"Endonucleasa de restricción o enzima de restricción" es una enzima que tiene la capacidad para reconocer una secuencia base específica (usualmente 4, 5 ó 6 pares de bases de longitud) en una molécula de .ADN, y romper la molécula de ADN en cada sitio donde aparezca esta secuencia. Un ejemplo de tal enzima es EcoRI, la cual reconoce la secuencia base G^AATTC y rompe una molécula de ADN en este sitio de reconocimiento. "Fragmentos de restricción" son moléculas de ADN producidas mediante la digestión del ADN con una endonucleasa de restricción. Cualquier genoma dado o segmento de ADN puede ser digerido por una endonucleasa de restricción particular en al menos dos moléculas discretas de fragmentos de restricción. "Electroforesis en gel de agarosa" es un método analítico para fraccionar moléculas de .ADN de doble hebra con base en el tamaño del ADN. El método está basado en el hecho de que las moléculas de ADN migran a través de un gel como a través de un tamiz, mediante lo cual la molécula de ADN más pequeña tiene la mayor movilidad y viaja lo más lejos a través del gel. Las características del tamizado del gel retardan las moléculas de ADN más grandes tal que éstas tienen la menor movilidad. El ADN fraccionado puede ser visualizado mediante tinción del gel utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tales como hibridación de ácido nucleico o mediante marcación de las moléculas de ADN fraccionado con un marcador detectable. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica, los métodos específicos pueden ser encontrados en Ausubel et al. (supra) . "Oligonucleótido u oligómero" es una molécula comprendida de dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferentemente más de tres. El tamaño exacto de la molécula dependerá de muchos factores,- los cuales a su vez dependerán de la función o uso final del oligonucleótido. Un oligonucleótido puede ser derivado sintéticamente, mediante clonación o mediante amplificación. "Amplificación de la secuencia" es un método para generar cantidades grandes de una secuencia objetivo. En general, uno o más cebadores de amplificación son recocidos a una secuencia de ácido nucleico. Utilizando enzimas apropiadas, las secuencias encontradas adyacentes a, o entre los cebadores son amplificadas. Un método de amplificación utilizado en la presente es la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . "Cebador de amplificación" se refiere a un oligonucleótido capaz de recocerse a una región de ADN adyacente a una secuencia objetivo y servir como el cebador de inicio para la síntesis del ADN bajo condiciones adecuadas bien conocidas en la técnica. El producto de extensión del cebador sintetizado es complementario a la secuencia objetivo. El término "dominio" o "región" se refiere a una secuencia de aminoácidos específica que define ya sea una función o estructura específica dentro de una proteína. Como un ejemplo en la presente, está el dominio de la proteasa NS3 comprendido dentro de la poliproteína no estructural de HCV. El término "gen reportero" se refiere a una secuencia nucleotídica que codifica para una "proteína reportera" . La proteína reportera proporciona un medio detectable para evaluar la expresión del gen. El gen reportero está comprendido dentro de un "plásmido reportero". Algunos ejemplos útiles de gen reportero para el propósito de esta invención son: la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) , la luciferasa, la cloranfenicol-amino-transferasa (CAT) , la ß-galactosidasa, la proteína fluorescente verde (GFP), etc. El término "sistema reportero" se refiere a la combinación de dos o más reporteros. Un ejemplo limitante de un sistema reportero útil para fines de la presente solicitud, es un primer reportero que es un activador genético tal como tTA el cual dirige la expresión de un segundo reportero, tal como la luciferasa o la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) . Los términos "activador" y "operón" se refieren a un sistema en el cual una molécula "activadora" se enlaza al operador comprendido en un operón para estimular la expresión del "operón". Los ejemplos de tales sistemas son: el transactivador de tetraciclina (tTA) , el transactivador tat del VIH-1, el transactivador GAL 4, NF?ß( etc. El término "molécula quimérica" o "quimera" como se utiliza en la presente, se refiere a al menos dos dominios de ácido nucleico que no están unidos por naturaleza. Los ejemplos no limitantes de tales quimeras de acuerdo a la presente invención incluyen la construcción del dominio NS3-4A-4B-5A-5B-tTA de HCV. Tales quimeras, cuando son expresadas dan origen a las "proteínas de fusión" . El término "proteína de fusión" como se define en la presente, se refiere a al menos dos segmentos polipeptídicos que no están unidos entre sí por naturaleza. Los ejemplos no limitantes de tales "proteínas de fusión" de acuerdo a la presente invención incluyen las partes de la poliproteína HCV counida con una proteína que tiene capacidades de reportero directas o indirectas tales como tTA y SEAP.
Los términos "plásmido" , "vector" o "construcción de .ADN" son comúnmente conocidos en la técnica y se refieren a cualquier elemento genético, incluyendo, pero no limitados a, el ADN plasmídico, el ADN fago, el ADN viral y similares, los cuales pueden incorporar las secuencias oligonucleotídicas o las secuencias de la presente invención, y sirven como vehículo de ADN dentro del cual puede ser clonado el ADN de la presente invención. Numerosos tipos de vectores existen y son bien conocidos en la técnica. La terminología "vector de expresión" define un vector como se describe anteriormente pero diseñado para hacer posible la expresión de una secuencia insertada después de la transformación o transfección dentro de un huésped o anfitrión. El gen clonado (secuencia insertada) es usualmente colocado bajo el control de las secuencias de los elementos de control, tales como las secuencias promotoras . Tales secuencias de control de expresión variarán dependiendo de si el vector está diseñado para expresar el gen operablemente enlazado en un huésped procariótico o eucariótico o ambos (vectores lanzadera) y pueden además contener elementos transcripcionales tales como los elementos aumentadores, las secuencias de terminación, los elementos de especificidad de tejido, y/o los sitios de inicio y terminación de la traducción.
El término sistema de expresión "no citopático" define un sistema que no induce cambios citopáticos en el sistema celular en el cual éste es expresado. Este sistema de expresión no requiere la coinfección con un virus y no provoca expresión de los componentes virales no-HCV que eventualmente podrían conducir a la patología celular y a la muerte celular. Los ejemplos de promotores no citopáticos son: el sistema promotor de CMV, el sistema promotor temprano SV40 o el sistema promotor LTR del RSV (Virus del Sarcoma de Rous) . Por "sistema de expresión eucariótico" se entiende la combinación de un vector de expresión apropiado y una línea celular eucariótica que puede ser utilizada para expresar un gen de interés. Los vectores plasmídicos que contienen el gen deseado pueden también ser utilizados. En todos los casos, el vector contendrá los elementos de control apropiados (promotores) para expresar el gen en el tipo celular de interés. Los tipos celulares eucarióticos típicamente utilizados son levadura (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Piechia pastoris) transfectados con un vector plasmídico; y las células de mamífero transfectadas con vectores de .ADN para la expresión transitoria o constitutiva. Una línea celular preferida útil para fines de esta invención es derivada del tejido hepático.
Una célula huésped o célula indicadora ha sido "transfectada" por el ADN exógeno o heterólogo (por ejemplo una construcción de ADN) cuando tal ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN de transfección puede o no están integrado (covalentemente enlazado) dentro del ADN cromosómico que constituye el genoma de la célula. En procariotes, levaduras, y células de mamífero por ejemplo, el ADN de transfección/transformación puede ser mantenido sobre un elemento episomal tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, un ejemplo de una célula, establemente transfectada es una en la cual el ADN de transfección se ha llegado a integrar dentro de un cromosoma y es heredado por las células hijas a través de replicación cromosómica. Esta estabilidad es demostrada por la habilidad de la célula eucariótica para establecer líneas celulares o clones comprendidos de una población de células hijas que contienen el ADN de transfección. Los métodos de transfección son bien conocidos en la técnica
(Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1994). Las secuencias nucleotídicas y los polipéptidos útiles para practicar la invención incluyen sin estar limitados a éstos, mutantes, homólogos, subtipos, cuasi-especies, alelos, y similares. Se entiende que en general, las secuencias de la presente invención codifican para una poliproteína. Será claro para una persona de experiencia en la técnica que la poliproteína de la presente invención y cualquier variante, derivado o fragmento de la misma, es auto-procesado a una proteasa activa. Como se utiliza en la presente, la designación "variante" denota en el contexto de esta invención, una secuencia ya sea de un ácido nucleico o de aminoácido, una molécula que conserva una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialmente similar a aquella de la secuencia original. Esta variante puede ser proveniente de la misma o de alguna especie diferente y puede ser una variante natural o ser preparada sintéticamente. Tales variantes incluyen las secuencias de aminoácidos que tienen sustituciones, supresiones, o adiciones de uno o más aminoácidos, con la condición de que se conserve la actividad biológica de la proteína. Lo mismo aplica para las variantes de las secuencias de ácido nucleico que pueden tener sustituciones, supresiones o adiciones de uno o más nucleótidos, con la condición de que la actividad biológica de la secuencia sea en general mantenida. El término "derivado" se pretende que incluye cualquiera de las variantes anteriormente descritas cuando comprende la porción química adicional que no es normalmente una parte de estas moléculas. Estas porciones químicas pueden tener propósitos diversos incluyendo, el mejoramiento de la solubilidad de una molécula, la absorción, la vida media biológica, la disminución de la toxicidad y la eliminación o disminución de los efectos colaterales indeseables. Además, estas porciones pueden ser utilizadas para fines de marcación, unión, o éstas pueden estar comprendidas en uno o varios productos de fusión. Diferentes porciones capaces de mediar los efectos anteriormente descritos pueden ser encontradas en Remington ' s The Science and Practice of Pharmacy (1995) . Las metodologías para el acoplamiento de tales porciones a una molécula son bien conocidas en la técnica. El término "fragmento" se refiere a cualquier segmento de una secuencia identificada de ADN, ARN o aminoácidos y/o a cualquier segmento de cualquiera de las variantes o derivados descritos en la presente anteriormente, que conservan sustancialmente su actividad biológica (funcional o estructural) como es requerido por la presente invención. Los términos "variante", "derivado" y "fragmento" de la presente invención se refieren en la presente a las moléculas de proteínas o de ácidos nucleicos que puede ser aisladas/purificadas, sintetizadas químicamente o producidas a través de tecnología de ADN recombinante. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica. Como es ejemplificado en la presente más adelante, las secuencias nucleotídicas y los polipéptidos utilizados en la presente invención pueden ser modificados, por ejemplo mediante mutagénesis in vi tro . Por ejemplo, como se define en la presente invención, un fragmento deseado de la proteína NS3 debe conservar su actividad de proteasa. Un fragmento deseado de la proteína NS4A podría conservar su actividad de cofactor de proteasa (actividad funcional) y también conservar su porción hidrofóbica que permita la incrustación en la membrana del retículo endoplásmico
(actividad estructural) . Un fragmento deseado de la proteína NS4B podría conservar su actividad estructural en cuanto a que podría también permitir el procesamiento de la poliproteína tan estrechamente como sea posible a la poliproteína nativa. Un fragmento deseado de la proteína NS5A podría conservar su actividad estructural para permitir el procesamiento de la poliproteína tan estrechamente como sea posible a la nativa, mientras que también conserve su actividad funcional para proporcionar un sitio de escisión NS5A/5B funcional. Un fragmento deseado de la proteína NS5B tendría que ser suficiente para conservar un sitio de escisión NS5A/5B funcional. Por ejemplo, los primeros 6 aminoácidos de la proteína NS5B son suficientes para este propósito. Tal actividad funcional o estructural para cada dominio respectivo puede ser fácilmente evaluada por el experto en la técnica sin experimentación indebida. El término "sitio de escisión" como se utiliza en la presente se refiere a un polipéptido capaz de ser escindido en posición "cis" o " trans" por la proteasa NS3 de HCV. El término "sitio de escisión objetivo" o "sitio objetivo" como se utiliza en la presente, se refiere a un sitio de escisión corriente abajo (3') sobre el sitio de escisión NS3/4A. Al menos un sitio objetivo de la proteasa NS3 debe ser escindido con el fin de obtener la translocación del transactivador, la expresión del gen reportero y lograr la medición del producto del gen reportero. El sitio de escisión NS3/4A no es considerado en la presente un sitio "objetivo" debido a que su escisión por sí mismo no liberará el producto de gen reportero. El término "sitio de escisión funcional" como se utiliza en la presente significa un sitio de escisión del polipéptido precursor que ha sido modificado (mediante mutación o cualesquiera otros medios químicos) pero permanece todavía escindible por la proteasa NS3. Los ejemplos no limitantes de tal modificación incluyen la sustitución conservadora del codón de ácido nucleico o el aminoácido .
m m? Modalidades preferidas
Ensayo basado en células
Por lo tanto, de acuerdo con una primera modalidad de la presente invención, se proporciona un sistema sustituto basado en células para evaluar la actividad de proteasa de la proteasa NS3 del virus de la Hepatitis C, que comprende: a) una primera molécula de ADN quimérico que comprende : i) un sistema de expresión no citopático capaz de inducir la expresión de la primera quimera después de la transfección en una célula de mamífero; y ii) una molécula de ADN recombinante de HCV operablemente enlazada al sistema de expresión; la molécula de ADN de HCV que codifica para la poliproteína NS3-5 que comprende : un dominio de proteasa NS3 activo, - un dominio NS4A suficiente para permitir la incrustación en la membrana del retículo endoplásmico después de la traducción y que actúa como cofactor para la actividad de la proteasa NS3 , los dominios NS4B y NS5A que incluyen cualquier derivado, variante o fragmento de los mismos; y una proteína NS5B incluye cualquier derivado, variante o fragmento de la misma, suficiente para proporcionar un sitio de escisión NS5A/5B para la proteasa NS3; iii) y un dominio transactivador fusionado corriente abajo (3') de la molécula de ADN de HCV, el dominio transactivador que codifica para una molécula transactivadora capaz de iniciar la expresión de un gen reportero; b) y una segunda molécula de .ADN quimérico que codifica para el gen reportero counido a un operón que responde a la molécula transactivadora con esto la expresión de la primera molécula recombinante conduce a la producción de una poliproteína de fusión anclada al retículo endoplásmico de la célula de mamífero, dicha proteína anclada es capaz de ser escindida por la proteasa, mediante lo cual se permite la translocación del dominio transactivador para inducir la expresión del gen reportero como un medio para evaluar la actividad de la proteasa. En un aspecto preferido de la primera modalidad, la molécula quimérica abarca una secuencia nucleotídica capaz de expresar la poliproteína HCV que tiene el dominio NS3, variantes, derivados o fragmentos del mismo suficientes para proporcionar una proteasa activa una vez traducida. Ésta comprende una proteína NS3 truncada para excluir el dominio de helicasa, o una proteína NS3 donde el dominio de helicasa está inactivado. El dominio NS4A necesario para la presente invención requiere que la proteína NS4A traducida, las variantes, derivados o fragmentos de la misma, sean suficientes para permitir la incrustación de la poliproteína en la membrana del retículo endoplásmico después de la traducción, y actuar como un cofactor para la actividad de la proteasa NS3. El dominio NS4B necesario para la presente invención requiere que la proteína traducida sea de suficiente longitud para permitir la orientación estructural correcta de la proteasa NS3 en vista del sitio de escisión objetivo NS5A/5B. Las variantes, derivados o fragmentos de la proteína NS4B pueden por lo tanto ser mutados en sus sitios de escisión (4A/4B o 4B/5A) , o mutados para eliminar su actividad biológica nativa sin comprometer su efecto de orientación sobre la poliproteína. El dominio NS5A necesario para la presente invención requiere que la proteína traducida sea de suficiente longitud para permitir la orientación estructural correcta de la proteasa NS3 en vista del sitio de escisión objetivo NS5A/5B. Las variantes, derivados o fragmentos de la proteína NS5A pueden por lo tato ser mutados en su sitio de escisión corriente arriba (5') (4B/5A) , o mutados para eliminar su respectiva actividad biológica sin comprometer su efecto de orientación sobre la poliproteína y el sitio de escisión NS5A/5B. Finalmente, el sitio de escisión NS5A/5B necesario para la presente invención debe ser funcional, por ejemplo reconocido y escindido por la proteasa NS3. Tal sitio de escisión objetivo, funcional incluye derivados, variantes o fragmentos de los mismos, siempre y cuando éste sea capaz de ser escindido por la proteasa NS3. Una modalidad preferida del sitio de escisión NS5A/B abarca aquél de los primeros 6 aminoácidos del dominio NS5B. En un aspecto alternativo de esta primera modalidad, se proporciona una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3 de longitud completa. Alternativamente, se proporciona una secuencia nucleotídica parcial que codifica para una poliproteína parcial que comprende variantes de los dominios necesarios como se define anteriormente. Alternativamente, la molécula quimérica abarca la secuencia nucleotídica capaz de expresar el derivado, la variante o fragmento de la poliproteína precursora, que comprende todos los sitios de escisión funcionales: NS3/4A;
4A/4B; 4B/5A; y 5A/5B. Alternativamente, al menos el NS5A/5B es un sitio de escisión funcional mientras que los otros sitios de escisión pueden haber sido modificados para volverse no funcionales. De acuerdo con un aspecto específico de esta primera modalidad, el sistema promotor no citopático comprende el promotor CMV, el sistema promotor temprano SV40 o el sistema promotor LTR del RSV (virus del Sarcoma de Rous) . De acuerdo con un aspecto específico de esta primera modalidad, el sistema reportero comprende un dominio transactivador unido a la primera molécula de ácido nucleico recombinante mediante la cual el transactivador, cuando es escindido de la proteína de fusión expresada, migra hacia el núcleo para, a su vez, activar la expresión de un gen reportero del cual el producto puede ser medido como un medio para la evaluación de la actividad de la proteasa NS3. La fusión de un dominio transactivador proporciona un nivel de amplificación para incrementar la sensibilidad del ensayo. De acuerdo con este aspecto particular, la activación del sistema del gen reportero por el transactivador puede ser específicamente inhibida como un medio para asegurar que la escisión de la poliproteína precursora sea específica (control negativo integral) . Un aspecto particular de este tipo comprende un sistema adaptado del método de Gossen M, y Bujard, H. (1992) , que describe el diseño y uso potencial de un transactivador controlado por tetraciclina en una línea celular de mamífero. En este método, el represor tet está fusionado al dominio de activación de la proteína 16 del virus del herpes simple (VP16) con lo cual se genera un transactivador dependiente de tetraciclina (tTA) . Este tTA inicia la transcripción/expresión de un gen reportero bajo el control de un promotor viral/operón tet combinado. El producto del gen reportero es una indicación de la activación del gen y de la expresión de la proteína. Todavía más, en un aspecto preferido del sistema reportero, el transactivador puede estar localizado en cualquier sitio sobre la molécula quimérica o la proteína de fusión, siempre y cuando éste esté con dirección hacia debajo de los sitios de escisión objetivo y sea por lo tanto liberado después de la escisión. Más preferentemente, el transactivador está localizado en el extremo 3' de la molécula recombinante. Los ejemplos no limitantes del transactivador incluyen el transactivador de tetraciclina (tTA), NFKB, tat del VIH-1 y GAL-4. Más preferentemente, el transactivador es tTA. Los ejemplos no limitantes de la molécula reportera incluyen: la fosfatasa alcalina secretada, la ß-galactosidasa, la luciferasa, la cloranfenicol -aminotransferasa y la proteína fluorescente verde. Preferentemente, la molécula reportera es SEAP o luciferasa. Más preferentemente, la molécula reportera es SEAP . En un aspecto preferido, el sistema reportero es una combinación de tTa y luciferasa; o una combinación de tTA y SEAP. Más preferentemente, el sistema reportero es una combinación de tTA y SEAP. Un aspecto de la presente invención es que diferentes permutaciones de un transactivador y un sistema reportero pueden ser combinados utilizando metodologías bien conocidas en la técnica, y todas éstas están dentro del alcance de esta invención. Ya que existen diferentes moléculas reporteras útiles para fines de esta invención, la detección del producto del gen reportero corresponde en consecuencia con el uso de los métodos conocidos. Por ejemplo, la luciferasa puede ser medida mediante una reacción quimioluminiscente utilizando la coenzima A como un sustrato de luciferasa (sistema de ensayo de luciferasa (Luciferase Assay System de Promega, NI, EUA)) y SEAP puede ser medido por una reacción quimioluminiscente que incorpora el sustrato CSPD y un aumentador (Tropix, Inc., MA, EUA) .
Proteínas y moléculas de ADN recombinante
En una segunda modalidad, la invención abarca las moléculas de ADN recombinante útiles en este ensayo, y cualquier fragmento, variante y derivado de las mismas. De acuerdo con un aspecto específico de esta segunda modalidad de esta invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico como se define en la SEQ ID NO. 1. En una tercera modalidad, la invención abarca las proteínas recombinantes producidas a partir de las moléculas de ADN recombinante de la invención. De acuerdo con un aspecto específico de esta segunda modalidad, se proporciona una secuencia de aminoácidos como se define en la SEQ ID NO. 2. De acuerdo con la modalidad anteriormente establecida de la secuencia de aminoácidos y de nucleótidos, todas las variantes, derivados y fragmentos de la misma que son funcionalmente equivalentes a las secuencias en la presente, están dentro del alcance de esta invención.
Vectores
En una cuarta modalidad, la invención también abarca vectores que comprenden cualquiera de aquellas moléculas de ADN recombinantes. Es un aspecto particular de esta cuarta modalidad que la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO. 1 pueda ser insertada dentro de un plásmido de expresión para la transfección dentro de una célula de mamífero huésped. En un aspecto preferido de la cuarta modalidad, los diferentes plásmidos, vectores o virus útiles para el propósito de esta invención, incluyen los plásmidos de expresión de mamífero, vectores o virus que son capaces de transformar una célula huésped de mamífero estable o transitoriamente. Éstos son bien conocidos y están dentro del alcance de esta invención. Más preferentemente, los plásmidos se seleccionan del grupo que consiste de: el plásmido basado en el promotor CMV, pUHD15-l que alberga el gen tTA y el plásmido pUHC13-3 de la luciferasa controlable por tTA o el plásmido reportero SEAP. En un aspecto más preferido de esta cuarta modalidad, el ácido nucleico de la SEQ ID NO. 1 es insertado dentro del plásmido pHUD15-l.
Transfección
La transfección de los vectores anteriormente mencionados en las células huésped puede ser llevada a cabo simultáneamente (co-transfección) o sustancialmente. Como una alternativa, la transfección del sistema reportero puede ser llevada a cabo primeramente, con el fin de obtener transfectantes estables, que son posteriormente utilizados por una segunda transfección del vector que contiene el dominio de HCV, para obtener dobles transfectantes (transitorios o estables) útiles para la presente invención.
Células huésped
En una quinta modalidad, la presente abarca las células huésped eucarióticas transfectadas con estos vectores . Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto específico de esta quinta modalidad, se proporciona una célula huésped transfectada con un plásmido de expresión que comprende la molécula quimérica como se define anteriormente . Más particularmente, se proporciona una línea de células de mamífero transfectada con la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO. 1. En un aspecto preferido de la quinta modalidad, la célula huésped es una célula de mamífero que es transformada estable o transitoriamente. Los ejemplos no limitantes de células huésped de mamífero y las líneas celulares incluyen hepatocitos primarios, líneas de células hepáticas, fibroblastos, linfocitos, células de riñon, etc. Más preferentemente, se proporciona una línea celular humana transitoriamente transfectada con la molécula quimérica. Aún más preferentemente, la línea celular humana es una línea de células de hígado o de riñon. Más preferentemente, la célula huésped puede ser seleccionada del grupo que consiste de: las células 293, Huh-7, WRL68, HepG2, y Chang.
Método para la identificación de los inhibidores
En una sexta modalidad, la invención abarca un método para evaluar la actividad de la proteasa NS3 mediante el uso de las moléculas recombinantes y las células huésped transfectadas de la invención. En un aspecto particular de esta sexta modalidad, se proporciona un método para seleccionar el inhibidor anti-HCV mediante el uso del sistema como se define anteriormente. De acuerdo con un aspecto específico de esta sexta modalidad, se proporciona un método para evaluar la actividad de la proteasa NS3 de HCV, que comprende los pasos de: a) incubar primeramente las células huésped transfectadas como se describe anteriormente bajo condiciones que provocan que la poliproteína NS3-5 de HCV y el producto del gen reportero sean expresados; y b) medir la cantidad de producto génico expresado. De acuerdo con un aspecto específico adicional de esta sexta modalidad, se proporciona un método para identificar un compuesto como inhibidor de la proteasa NS3 de HCV que comprende los pasos de: a, b) evaluar la actividad de la proteasa en ausencia del compuesto mediante el método como se define anteriormente; y c) evaluar la actividad de dicha proteasa en presencia del compuesto mediante el método como se describe anteriormente, en donde el compuesto es agregado a las células huésped después de la primera incubación, y las células huésped son además incubadas antes de evaluar dicha actividad; y d) comparar los resultados del paso c) con los resultados del paso b) . Los ensayos y métodos de la presente invención son conducidos bajo condiciones para el desarrollo de células de mamífero que son bien conocidos para una persona de experiencia en la técnica, por ejemplo, el pH fisiológico, concentraciones salinas utilizando amortiguadores tales como PBS, temperaturas entre 30°C a 42°C, medios de cultivo de células apropiados y la provisión de suficiente tiempo para el desarrollo celular. En un aspecto preferido del método de esta invención, las células huésped transfectadas son incubadas por un tiempo suficiente para permitir la expresión y el procesamiento de la secuencia de aminoácidos precursora codificada, y para la expresión de la molécula reportera. Más específicamente, las células son incubadas por al menos una hora y lo más específicamente por al menos 18 horas, y la cantidad del producto de gen reportero se compara a un estándar. En la presente, un estándar se prefiere ya sea a las células huésped que no han sido transfectadas o a las células huésped transfectadas con un vehículo (un vector o plásmido que no posee la molécula de ácido nucleico recombinante que codifica para la secuencia precursora de aminoácidos) . En un aspecto preferido de la presente modalidad, las células huésped transfectadas son además incubadas en presencia o ausencia de uno o varios compuestos de prueba por aproximadamente 30 horas, más particularmente por aproximadamente 20 horas y lo más particularmente por aproximadamente 10 horas, y la cantidad del producto del gen reportero es comparada.
EJEMPLOS
Materiales
Todas las enzimas de restricción fueron adquiridas de Pharmacia Biotech Inc. (Québec, Canadá). Las reacciones en cadena de polimerasa fueron realizadas con la polimerasa ID-proof obtenida de ID Labs (ON, Canadá) utilizando las instrucciones del fabricante. La fosfatasa alcalina termoestable fue obtenida de Gibco-BRL (MD, EUA) . Las reacciones de ligadura fueron realizadas utilizando la ADN-ligasa T4 obtenida de Pharmacia Biotech. Inc. (Québec, Canadá) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las quimeras HCV-tTA fueron construidas utilizando el vector pUHD15-l que codifica para el gen tTA expresado por el promotor de CMV (Display Systems Biotechnology, Inc., CA, EUA) , la secuencia nucleotídica que codifica para las proteínas HCV insertadas utilizando los sitios de restricción Xbal. El plásmido reportero de la luciferasa, pUHC13-3 fue también obtenido de Display Systems
Biotechnology. El plásmido pCR3.1 fue obtenido de
Invitrogen y el virus de la vaccinia recombinante que expresa la ARN-polimerasa T7 fue obtenido de Bernard Moss
(NIH, MD, EUA) . El ADNc viral Ib de HCV fue generado mediante RT-PCR de una muestra de suero humano infectada con el virus, utilizando los cebadores derivados de la secuencia Ib de HCV, de J4/83 de HCV (Genebank número de acceso: D13558) y los cebadores utilizados para la amplificación del extremo 3' fueron derivados de Genebank, número de acceso D36922. Este ADNc de HCV fue secuenciado (secuencia parcial en la SEQ ID NO. 1) y sirvió como una plantilla en las reacciones de amplificación de los segmentos de HCV específicos utilizados en la construcción de las moléculas recombinantes mostradas en las Figuras 2A a 21. Fueron empleados métodos estándares para todas las reacciones de amplificación, la digestión con enzima de restricción, la mutagénesis de oligonucleótido dirigida al sitio, la clonación, el aislamiento del ADN plasmídico, el cultivo celular, las transfecciones y los análisis de manchado de Western (Sambrook et al., 1989) . Los productos de amplificación generados con los pares cebadores descritos anteriormente en la presente fueron digeridos con las enzimas de restricción Nhel y Xbal, y clonados dentro del plásmido pUHD15-l restringido con Xbal, transformado dentro de E. coli . Los transformantes fueron seleccionados para la direccionalidad por análisis de enzimas de restricción. Las quimeras HCV-tTA intra-estructurales, seleccionadas, son mostradas en las Figuras 2A a 21. Cada una de estas quimeras HCV-tTA fueron adicionalmente subclonadas dentro del plásmido pCR3.1 mediante clonación con TA (Invitrogen, California, EUA) , con lo cual se colocan las quimeras HCV-tTA bajo el control de un promotor T7.
Ejemplo 1: RT-PCR de HCV IB y Secuenciamiento del Producto Amplificado
La muestra de suero humano que posee el ARN de HCV Ib fue transcrita inversamente y amplificada utilizando 12 cebadores en sentido y antisentido que abarcan la secuencia de ADNc de HCV Ib (HCV J4/83; número de acceso D13558) . La secuencia del extremo 3' fue amplificada utilizado los cebadores derivados del HCV (número de acceso D63922) descritos por Kolykhalov et al. (1996). Las reacciones de RT-PCR generaron 4 fragmentos traslapados que cubren el HCV-Ib completo. Los fragmentos fueron ensamblados a través de la digestión en los sitios únicos de enzima de restricción y ligados formando el .ADNc de HCV, de longitud completa. Este ADNc resultante fue secuenciado en su totalidad y utilizado como una plantilla en todas las reacciones de amplificación, los productos de amplificación fueron utilizados en la construcción de las quimeras descritas en esta solicitud. La región de poliproteína fusionada al tTa es mostrada en la SEQ ID NO. 1 y la secuencia traducida de aminoácidos en la SEQ ID NO. 2.
Ejemplo 2: Amplificación de los Fragmentos de HCV Utilizados en la Construcción de las Quimeras
El cebador delantero GGCGCTAGCGCGCCCATCACGGCCTAC
(SEQ ID NO. 3) complementario al extremo 5' del gen NS3 contiene un sitio Nhel que fue utilizado en todas las reacciones de la amplificación. Todos los cebadores inversos complementarios al extremo 3', utilizados en la presente contienen un sitio Xbal. El cebador inverso
GGCTCTAGAGTAAGGGAGGTGT GAGGC (SEQ ID NO. 4) fue utilizado para amplificar las secuencias - para las quimeras A y B e incluye el sitio de escisión Pl' a P6' de NS4B. El cebador inverso
GGCTCTAGAGTAAGGGAGGTGTGAGGGGCGCTCTTCC (SEQ ID NO. 5) fue utilizado para amplificar la secuencia de HCV para la quimera C y corresponde al sitio de escisión Pl' a P6 ' de NS4B en el cual son introducidas las sustituciones en .los residuos Pl-Pl' de NS4A/NS4B. Los dos cebadores inversos traslapados, GCAGCAGACGACGTCCTCGAATTCCCGGTAG AG GAC (SEQ ID NO. 6) y GGCTCTAGACCATGTGTAGGACATCGAGCAGCAGACGACGTCCTC (SEQ ID NO. 7) fueron utilizados para amplificar las secuencias de HCV para las quimeras D y E, en las cuales el sitio de escisión NS4A/NS4B de los respectivos clones A y B es reemplazado con el sitio de escisión NS5A/NS5B. Los dos cebadores inversos traslapados, GCAGCAGACGACGTCCTCGAATTCCCGGTAGAGGAC (SEQ ID NO. 6) y GGCTCTAGACCATGTGTAGGACATAGGCCTGCAGACGACGTCCTC (SEQ ID NO. 8) fueron utilizados para amplificar la secuencia de HCV para la quimera F, y corresponden al sitio de escisión Pl' a P6' de NS5B en el cual son introducidas las sustituciones de los residuos Pl-Pl' de NS5A/NS5B. La secuencia de HCV para la quimera G fue generada mediante la amplificación del ADNc del HCV, de longitud completa con los cebadores de la SEQ ID NO. 3 y la SEQ ID NO. 7. Esto produjo una secuencia que abarca el codón NS3 a NS5B-P6' de HCV, inclusive. Similarmente, la secuencia de HCV para la quimera I fue generada mediante amplificación de la plantilla de ADNc de HCV, de longitud completa, con los cebadores de la SEQ ID NO. 3 y la SEQ ID NO. 8. Esto produjo una secuencia que abarca el codón
NS3 a NS5B-P6' de HCV, inclusive, y contiene una sustitución del sitio de escisión Pl-Pl' . Los clones B, E y H fueron amplificados utilizando una plantilla de ADNc de HCV modificada por mutagénesis dirigida al sitio con el oligonucleótido CCCCCGGGTGCACACAGCTGCCCGGAAGATGCCCACAACGGCCCCGAAGGGCAGAGCAG TGGGCCACCCGCAGAGCC (SEQ ID NO. 9) el cual introduce una mutación de serina a alanina en el residuo 1165, produciendo un mutante del sitio activo NS3. Las regiones no estructurales de la poliproteína de HCV incluida en las construcciones A a I, son procesadas por la escisión de la proteasa NS3 en la cual la especificidad es determinada por la secuencia de aminoácidos que abarca las uniones de cada una de las proteínas. Esta preferencia de sitio de escisión fue previamente reproducida in vi tro con los sustratos peptídicos y la proteasa NS3 purificada (revisada en Kwong et al. , 1998) . En la presente solicitud es examinada la escisión in vivo. La expresión de la poliproteína en una variedad de sistemas de expresión heterólogos y la apariencia de las proteínas de HCV mutantes es verificada periódicamente a través de un examen indirecto de los productos procesados mediante análisis de manchado de Western. En un esfuerzo para proporcionar el ensayo basado en el reportero, de alto rendimiento, óptimo, para la actividad de la proteasa NS3, diferentes construcciones de la poliproteína HCV fusionados a un activador/reportero mostrados en la Figura 2A a 21, fueron evaluados .
Tres diferentes familias de las fusiones HCV-tTA fueron construidas y la eficiencia de la escisión in vivo fue examinada. Los resultados demuestran que la eficiencia de la escisión con NS3 no es solamente determinada por la secuencia que abarca el sitio de escisión, sino también por el contexto posicional del sitio con respecto a las otras porciones o dominios en la poliproteína de HCV. Las tres familias de fusiones de HCV-tTA que son utilizadas para demostrar este hallazgo son: los clones A, B, y C que abarcan NS3 a NS4A tienen el activador tTA fusionado al sexto aminoácido del NS4B, tal que la escisión del tTA imita el procesamiento de la proteína NS4B; Los clones D, E y F son similares a (i) excepto que el segmento de 12 aminoácidos que abarca la unión NS4A/NS4B (DEMEEC4?SHLPY) fue cambiada a la secuencia que abarca la unión NS5A/NS5B (EDWCC^SMSYTW) , esta variante coloca el tTa en el contexto NS4B y alberga todavía un sitio de escisión más eficiente (NS5A/NS5B) ; y los clones G, H e I incluyen la región no estructural de HCV que comienza en el extremo amino de NS3 y termina en el sexto aminoácido de NS5B, fusionado al tTA tal que la escisión del tTA imita el procesamiento de la proteína NS5B en su contexto posicional. Las variantes (clones B, E y H) , que contienen una mutación de sitio activo de proteasa NS3 (serina 1165 a alanina, el residuo de aminoácido está en la 1165a posición desde el inicio de la poliproteína de HCV) , son utilizadas como controles para demostrar que la escisión de tTA es dependiente de una proteasa NS3 activa. Las variantes (clones C, F, I) , que contienen el sitio de escisión Pl-Pl' mutado a una porción de diaminoácido R-P, son utilizadas como controles para demostrar que el procesamiento de tTA es exclusivamente dependiente de un sitio de secuencia de escisión NS3 funcional en la unión manipulada mediante ingeniería genética, con el activador tTA.
Ejemplo 3: Visualización de las Fusiones HCV-tTA en las
Células Infectadas con el Virus de la Vaccinia T7/Transfectadas (vvT7-3)
Ya que la expresión de la proteasa NS3 de HCV con el promotor de CMV fue demasiado baja para la visualización mediante análisis de Western, se verificó la actividad de la proteasa en cada una de las quimeras por la expresión de las proteínas de fusión en células 293 utilizando el sistema de expresión del virus de la vaccinia T7 (wT7-3) (Elroy-Stein, O. y Moss, B., 1998). Las células se desarrollaron a 60% de confluencia en placas de 6 pozos en DMEM-10% de FBS, y fueron infectadas con wT7-3 (moi 10-15) y transfectadas con 5 µg de las construcciones A, B y C de HCV-tTA de pCR3.1, utilizando el método de fosfato de calcio. Dieciocho horas después de la transfección, las células fueron cosechadas y las proteínas provenientes del lisado de células completas se resolvieron mediante SDS-PAGE, se transfirieron electroforéticamente a una membrana y la membrana se sondeó con los anticuerpos policlonales específicos de HCV. El plásmido pCR3.1 que contiene las quimeras A, B, C, D, E, F, G, H o I fue transfectado dentro de las células 293 infectadas con wT7 y el procesamiento de la proteína HCV fue examinado mediante el análisis de manchado de Western utilizando el antisuero policlonal específico de HCV. Se muestra que la quimera A produce las bandas reactivas de proteína NS3 y NS4A maduras (Figuras 3A y 3B, bandas A, respectivamente) . Ya que la proteína NS4A comprende únicamente 54 aminoácidos, fue necesario correr un gel bajo condiciones que permiten la detección de una molécula de peso molecular pequeño (panel inferior de la Figura 3B) . La quimera B, la cual codifica para la mutación S1165A inactiva, de NS3, no procesa el precursor de poliproteína como es mostrado por la ausencia de las bandas reactivas de NS3 y NS4A (Figuras 3A y 3B, bandas B, respectivamente) . La quimera C, que tiene una mutación en el sitio de escisión NS4A7NS4B, produce una banda reactiva correspondiente a la NS3 madura (Figura 3A, bandas C) pero no la banda reactiva de NS4A madura. La falta de escisión en el sitio de escisión NS4A-tTA (Figura 3B, bandas C) es confirmada por la detección de la fusión NS4A-tTA en el manchado de Western anti-NS4A. En las quimeras D, E y F, el sitio de escisión NS4A/4B fue reemplazado con el sitio de escisión NS5A/5B. La expresión de las células huésped transfectadas que contienen la quimera D producen una banda reactiva correspondiente a la proteína NS3 madura (Figura 4, bandas D) . La quimera E, que posee la mutación S1165A no tiene banda reactiva de NS3 aparente (Figura 4, bandas E) , demostrando que el precursor • de poliproteína no está procesado. La quimera F, que contiene una proteasa NS3 activa, produce NS3 madura pero tiene una mutación en el sitio de escisión que presumiblemente bloquea la escisión en el sitio de escisión NS4A-tTA (Figura 4, bandas F) . El antisuero anti-NS4A disponible, reconoce un epítope en el extremo C de la proteína NS4A. Las quimeras D, E y F han tenido este segmento modificado para proporcionar el sitio de escisión NS5A/NS5B. Por lo tanto, los análisis de manchado de Western utilizando el antisuero anti-NS4A como una sonda para estas quimeras no pudieron detectar el NS4A modificado. Las quimeras G, H e I, contienen la mayor parte de la proteína de HCV. La expresión de los trasfectantes que contienen la quimera G dio como resultado la poliproteína precursora procesada a las proteínas maduras esperadas, NS3, NS4A y NS5A. Éstas fueron visualizadas mediante análisis de Western sondeado con los antisueros respectivos (Figuras 5A, 5B, y 5C, bandas G, respectivamente) . La quimera H, que posee la mutación S1165A, NS3 de inactivación, no procesa el precursor de poliproteína y falla en producir cualquiera de las proteínas maduras (Figuras 5, bandas H) . La quimera I, que posee una mutación de sitio de escisión NS5A/5B, produce proteínas mutantes NS3 y NS4A (Figuras 5A y 5B, bandas I) y falla en romper el sitio de escisión NS5A/tTA (Figura 5C, bandas I) .
Ejemplo 4: Ensayo de Luciferasa
Las tres familias (clones A, D y G) de las quimeras de HCV-tTA, y su sitio activo y las variantes mutantes del sitio de escisión, fueron cada una cotransfectadas con el reportero pUHC13-3 dentro de las células 293 para determinar el grado de expresión de la luciferasa dependiente de NS3 (Figura 6) . Las células en pozos de 35 mm fueron cotransfectadas con cada una de las construcciones descritas en las Figuras 2A a 21 y el plásmido reportero fue pUHC13-3 utilizando el método de fosfato de calcio. Las células fueron cosechadas 48 horas después de la transfección y lavadas dos veces en solución salina amortiguada con fosfato. Las células cosechadas fueron lisadas en 200 µl de amortiguador de lisis (Tris-fosfato 25 mM pH 7.8, DTT 2mM, ácido 1, 2-diaminociclohexan-N,N,N' ,N' -tetraacético 2 mM, 10% de glicerol y 1% de Tritón X-100) y centrifugadas por 5 minutos a 12000 g. Una alícuota de 10 µl de sobrenadante fue mezclada con 50 µl del reactivo de ensayo de luciferasa (Promega) en una placa de 96 pozos y la cantidad de luz producida se midió utilizando un luminómetro Digene o un contador de scintilación top-count de Packard. La quimera A produjo aproximadamente 1' 200, 000 cps de la actividad de luciferasa, esta señal es 2 a 3 veces más alta que la luciferasa (500,000 cps) producida por la quimera B (proteasa NS3 inactiva) y la quimera C (mutación del sitio de escisión) . La familia de fusión HC-tTA representada por la quimera D produjo aproximadamente 1' 300, 000 cps de la actividad de luciferasa en células 293. La dependencia a NS3 de esta señal es puesta de manifiesto por la cantidad significativamente menor de luciferasa (100,000-300,000 cps) producida por la quimera E (proteasa NS3 inactiva) y la quimera F (mutación del sitio de escisión) . La fusión HCV-tTA más larga representada por la quimera G produjo la señal de luciferasa más alta (aproximadamente 2 '200, 000 cps) . La dependencia a NS3 de esta señal es reforzada por la baja cantidad de luciferasa (100,000-300,000 cps) producida por las quimeras H (proteasa NS3 inactiva) y la quimera I (mutación del sitio de escisión) . La señal de luciferasa dependiente de NS3 producida en las células 293 transfectadas, puede ser expresada como una proporción de la señal obtenida a partir del mutante de tipo silvestre/sitio activo (Figura 7) . La proporción de A/B, D/E y G/H produce un aumento de 3 , 15.4 y 28.1 veces la activación de la luciferasa, respectivamente . Estos resultados muestran que la construcción G que tiene todos los dominios de la poliproteína NS3-5 de HCV (incluyendo la región desde NS3 hasta el sexto aminoácido de NS5B) que contiene el sitio de escisión NS5A/NS5B precedido por su contexto "natural", produjo la más alta activación de la luciferasa.
Ejemplo 5: Validación del Control Interno de Tetracicline
La tTA madura expresada a partir de las quimeras de HCV-tTA funciona de una manera controlable por la tetraciclina. Por ejemplo, la Figura 8 demuestra que los usados provenientes de células cotransfectadas con la quimera G expresada a partir de pUD15-l y el reportero pUCH13-3 muestran actividad de luciferasa sensible a la tetraciclina. Las células que expresan la quimera G en ausencia de la tetraciclina producen arriba de 2 '000, 000 cps de la actividad de luciferasa. En presencia de tetraciclina, la actividad del activador tTA maduro es inhibida dando como resultado 40,000 cps de actividad de luciferasa. En ausencia de tetraciclina, la cantidad de luciferasa producida por los transfectantes de la quimera G, es del mismo orden de magnitud que la cantidad de luciferasa producida a partir del control pUHD15-l. Además, la cotransfección de la quimera H y pUHC13-3, demuestra que la activación de tTA de la luciferasa requiere una proteasa NS3 activa. Los transfectantes de la quimera H que codifican para una proteasa inactiva fallan en producir la tTA madura, dando como resultado únicamente 90,000 cps de actividad de luciferasa.
Ejemplo 6: Ensayo de Luciferasa en Células de Hígado Transfectadas (WRL68)
Ya que HCV se encuentra en las células de hígado, fue importante verificar que este ensayo funcione igualmente bien en células de hígado. Por lo tanto, la activación de luciferasa fue examinada en la línea celular de hígado WRL68 para cada una de las quimeras (Figura 9) . La activación de esta línea celular se encontró que es dependiente de NS3 y la eficiencia en la expresión de activación de la luciferasa en diferentes quimeras (Figura 10) es análoga a la eficiencia de activación de las quimeras en las células 293.
Ejemplo 7: Optimización de Activación de Luciferasa con Relación a la Cantidad de ADN
Un aspecto crítico de los experimentos de cotransfección es la cantidad de ADN plasmídico introducido dentro de las células. Este sistema de dos componentes requirió la optimización de las cantidades relativas del plásmido HCV-tTA y el plásmido reportero de luciferasa. Un intervalo de 0.1 a 1 µg del plásmido G de HCV-tTA fue cotransfectado dentro de las células 293 (a 50% de confluencia en placas de 6 pozos) con 0.2 µg del plásmido reportero de luciferasa pUHC13-3 (Figura 11) . La activación óptima de luciferasa en estos transfectantes fue lograda con 0.4 a 0.7 µg del plásmido HCV-tTA. Similarmente, la activación óptima de la luciferasa se observó con 0.4 a 0.7 µg de la quimera G de HCV-tTA en las células WRL68 (Figura 12) .
Ejemplo 8: Actividad de Transescisión de NS3
La proteasa NS3 producida a partir de la poliproteína de longitud completa puede romper la unión NS5A/5B en posición trans (Tomei et al., 1993; Bartenschlager et al., 1994; Lin et al., 1994). La utilidad de las quimeras HCV-tTA fue utilizada para demostrar la actividad de escisión trans de NS3. La Figura 13 revela que la quimera G puede activar la expresión de la luciferasa para generar aproximadamente 2 '000, 000 cps. Las quimeras H e l que contienen una proteasa inactiva y una mutación de sitio de escisión en la unión tTA, respectivamente, activan significativamente menos luciferasa (ver Figura 5) . Una transfección triple de la quimera H, I y el reportero pUHC13-3 dentro de las células 293 restaura la actividad de luciferasa (aproximadamente 2 '000, 000 de cps) demostrando que la proteasa NS3 activa expresada a partir de la quimera I puede romper la unión NS5A/5B "nativa" (no modificada) codificada en la quimera H. Una transfección triple similar de la línea celular de hígado WRL68 restauró parcialmente la actividad de luciferasa (Figura 14) .
Ejemplo 9: Ensayo SEAP (Sistema de Alto Rendimiento)
Las células de hígado, Huh-7 desarrolladas en medio CHO-SFMII (GIBCO BRL) suplementado con 10% de suero fetal de ternera fueron cotransfectadas con la quimera G y un plásmido reportero SEAP de pUHC13-3 (pUHC13-3 modificado) utilizando el FuGene6 de Boehringer Mannheim
(Mannheim, Alemania) . El plásmido del reportero pUHC13-3 fue modificado mediante el reemplazo de la luciferasa con SEAP. Después de una incubación de 5 horas, las células fueron lavadas, tripsinizadas y sembradas en placa a 80,000 células por pozo en una placa de cultivo de 96 pozos que contenía diferentes concentraciones del compuesto, e incubadas por 24 horas. La cantidad de SEAP secretado hacia el medio fue medido con el sustrato Phospha-light (Tropix Inc., MA, EUA).
Ejemplo 10: Validación con un Inhibidor de NS3 Específico
El ensayo descrito en la presente fue validado con un compuesto que mostró inhibir la proteasa NS3 a una IC50 de 40 nM por el ensayo enzimático descrito en WO 00/09543. La Figura 15 muestra que la cantidad de SEAP medido, secretado, es reducida de una manera dependiente de la dosis. Este resultado muestra además que este compuesto es permeable a las células y conserva su eficacia de inhibición en un ensayo basado en células. La EC50 de este compuesto como se determinó en el ensayo de la presente invención es 75 nM. Incrementando la concentración del compuesto dio como resultado una disminución dependiente de la dosis en la cantidad de SEAP secretada, correspondiente a una inhibición incrementada en la escisión en uno o más sitios por la actividad de la proteasa NS3. Además, en el experimento control (Figura 15, cuadros claros) el compuesto no inhibió significativamente la actividad de tTA control a concentraciones por debajo de 1 µM. Este compuesto valida la utilidad y especificidad del ensayo de la presente invención. Un resultado sorprendente y ventajoso de esta invención, es que la molécula quimérica de HCV que abarca todos los sitios de escisión de la poliproteína NS3 nativa hasta aproximadamente el 6° aminoácido de NS5B, es la construcción más efectiva para fines de evaluar la actividad de la proteasa NS3 de HCV en una célula de mamífero. Esta quimera imita el procesamiento de la región no estructural HCV de longitud completa que forma el complejo heterodimérico de la proteasa NS3-NS4A con lo cual se mejora la actividad de la proteasa NS3. La actividad mejorada de esta molécula recombinante ha proporcionado la base para un nuevo sistema para evaluar la actividad de la proteasa NS3 que es más específica y sensible que otros ensayos conocidos. Además, este nuevo sistema mejorado es útil en el establecimiento de un sistema de ensayo para seleccionar los inhibidores de la actividad de la proteasa que pueden ser elevados de escala hasta un sistema de selección de alto rendimiento.
Discusión
Como se observará en las Figuras 7 y 8, el Solicitante ha reproducido construcciones representativas de la técnica anterior (construcciones A y D) y ha intentado sin resultados óptimos utilizar este sistema en un ensayo de alto rendimiento. La señal obtenida y la proporción de señal/ruido no fueron óptimas para permitir la automatización del ensayo.
Una manera de mejorar la sensibilidad del ensayo ha sido el proporcionar una construcción que reproduce sustancialmente la conformación auténtica de la poliproteína NS3-5 madura, con lo cual se imita la actividad de la proteasa NS3 en su contexto nativo. Sorprendentemente, en comparación a sistemas de la técnica anterior, la construcción de la presente invención proporciona un incremento en la proporción de señal/ruido de 2 a 6 veces más alto. El Solicitante ha desarrollado por lo tanto un nuevo y mejorado sistema basado en células y un ensayo para medir la actividad de proteasa de una manera confiable y reproducible. Después de llevar a cabo los experimentos de las Figuras 7 y 9, el Solicitante encontró con sorpresa que los sitios de escisión adicionales sobre el sustrato de proteasa mejoran la señal obtenida. Esto es sorprendente en cuanto a que únicamente una molécula transactivadora es liberada si el sustrato es escindido en uno, dos o en tres sitios. El hecho de que la señal se incremente es inesperado y favorable para este sistema. Más específicamente, las Figuras 7 y 9 muestran el incremento en la señal obtenida cuando se utiliza la construcción A (1 sitio de escisión, descrito en la técnica anterior) versus la construcción D (un sitio de escisión más) versus la construcción G (poliproteína nativa) . El Solicitante no pudo haber predicho que la construcción G pudiera haber proporcionado un incremento en la actividad suficientemente alta y suficientemente reproducible para establecer un ensayo de alto rendimiento. Las Figuras 8 y 10 muestran que dependiendo de la línea celular utilizada, cada sitio de escisión adicional proporciona entre dos a seis veces más señal sin incremento de la señal antecedente, indicando que por la adición de los sitios de escisión adicionales se imparte una actividad incrementada al sistema sobre y por arriba de lo que podría haber sido esperado, que no fue previsto ni sugerido por la técnica anterior. Además del incremento en la actividad, parece existir un incremento en la especificidad de las escisiones secuenciales por la proteasa NS3. Una teoría que ha surgido recientemente, con base en los estudios estructurales in vi tro de las proteasas NS3 de HCV, es que la maquinaría catalítica de la proteasa NS3 es estabilizada por sustratos específicos que contribuyen a la activación de la enzima a través de un mecanismo de ajuste inducido
(Barbato et al., 2000, EMBO J. , 19, 1195-1206). Las reivindicaciones para esta invención de que un ensayo basado en células in vivo que incorpora sustratos múltiples, como se presentan en el contexto de una poliproteína, da como resultado una proteasa NS3 con más alta actividad específica basada en las células, proporcionan apoyo biológico para esta teoría. También, el nivel de expresión de la poliproteína es tan bajo con los sistemas de expresión no citopáticos, tal como el promotor de CMV, que no se puede visualizar la proteína expresada (a no ser que se utilice el sistema de expresión del virus de la vaccinia) . Es por lo tanto mucho más sorprendente que tal nivel bajo de expresión conduzca a tal detección buena de la luciferasa o SEAP.
Referencias:
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LISTADO DE SECUENCIAS :
<110> BOEHRINGER INGELHEIM (CANADÁ) LTD . <120> Sistema sustituto basado en células y método para evaluar la actividad de la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C
<130> secuencia <140> <141> <150> 60/132 , 360 <151> 1999-05-04 <160> 9 <170> Patentln Ver . 2 . 1 <210> 1 <211> 5211 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> , <223> Descripción de la Secuencia Artificial: secuencia de ADNc parcial de HCV (NS3-5B') fusionada al transactivador tTA <400> 1 atgtctagcg cgcccatcac ggcctactcc caacagacac ggggcctact tggttgcatc 60 atcaccagcc tcacaggccg ggacaagaac caggtcgagg gggaggttca agtggtttcc 120 accgcaacac aatctttcct ggcgacctgc gtcaacggcg tgtgttggac tgtcttccat 180 ggcgccggct caaagacctt ggccggcccc aaaggcccga tcacccagat gtacactaat 240 gtggaccagg acctcgtcgg ctggcaggcg ccccctgggg cgcgctccat gacaccatgc 300 acctgcggca gctcggacct ctatttggtc acgagacatg ccgacgtcat tccggtgcgc 360 cggcggggcg acagtagggg gagcctgctc tcccccaggc ctgtctccta cttgaagggc 420 tcttcgggtg gcccactgct ctgcccttcg gggcacgctg tgggcatctt ccgggctgct 480 gtgtgcaccc ggggggttgc aaaagcggtg gacttcatac ctgttgagtc tatggaaact 540 actatgcggt ctccggtctt cacagacaac tcatcccccc cagccgtacc gcagacattc 600 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<210> 2 <211> 1736 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> , t
<223> Descripción de la Secuencia Artificiáis región de poliprotema HCV (NS3-5B') fusionada al transactivador tTA <400> 2 Met Ser Ser Ala Pro He Thr Ala Tyr Seir Gln Gln Thr Arg Gly Leu 1 5 10 15 Leu Gly Cys He He Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val 20 25 30 Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala 35 40 45 Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Phe His Gly Ala Gly Ser 50 55 60 Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro He Thr Gln Met Tyr Thr Asn 65 70 75 80 Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser 85 90 95 Met Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg 100 105 110 His Ala Asp Val He Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 115 120 125 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly 130 135 140 Pro Leu Leu Cys Pro Ser Gly His Ala Val Gly He Phe Arg Ala Ala 145 150 155 160 Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe He Pro Val Glu 165 170 175
5 Ser Met Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser 180 185 190
Pro Pro Ala Val Pro Gln Thr Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro 195 200 205 10 Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln 210 215 220 Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly 15 225 230 235 240
Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala Arg Gly Thr Asp Pro Asn He Arg 245 250 255
20 Thr Gly Val Arg Thr He Thr Thr Gly Ala Pro He Thr Tyr Ser Thr 260 265 270
Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp 275 280 285 25 He He Met Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr He Leu 290 295 300 Gly He Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu 30 305 310 315 320
Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His 325 330 335
35 Pro Asn He Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu He Pro Phe 340 345 350 Tyr Gly Lys Ala He Pro He Glu Val He Lys Gly Gly Arg His Leu 355 360 365 40 He Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu 370 375 380 Ser Gly Leu Gly Leu Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val 45 385 390 395 400
Ser Val He Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala 405 410 415
50 Leu Met Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val He Asp Cys Asn 420 425 430 Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr 435 440 445 55 He Glu Thr Thr Thr Val Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Ser Gln Arg 450 455 460 Arg Gly Arg Thr Gly Arg Gly Arg Arg Gly He Tyr Arg Phe Val Thr 60 465 470 475 480 Pro Gly Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu 485 490 495
Cys Tyr Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr 500 505 510
Thr Val Arg Leu Arg Ala Tyr Leu Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys 515 520 525 Gln Asp His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His 530 535 540 He Asp Ala His Phe Leu Ser Gln Thr Lys Gln Ala Gly Asp Asn Phe 545 550 555 560
Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala 565 570 575
Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu He Arg Leu Lys 580 585 590 Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val 595 600 605 Gln Asn Glu He Thr Leu Thr His Pro Val Thr Lys Tyr He Met Thr 610 615 620 Cys Met Ser Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val 625 630 635 640
Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser 645 650 655
Val Val He Val Gly Arg He He Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Val 660 665 670 Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 675 680 685 Ala Ser His Leu Pro Tyr He Glu Gln Gly Met Gln Leu Ala Glu Gln 690 695 700 Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala 705 710 715 720
Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr 725 730 735
Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe He Ser Gly He Gln Tyr Leu 740 745 750 Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala He Ala Ser Leu Met 755 760 765 Ala Phe Thr Ala Ser He Thr Ser Pro Leu Thr Thr Gln Asn Thr Leu 770 775 780 Leu Phe Asn He Leu Gly Gly Trp Val Ala Ala Gln Leu Ala Ala Pro 785 790 795 800
Gly Ala Ala Ser Ala Phe Val Gly Ala Gly He Val Gly Ala Ala Val 805 810 815 Gly Ser He Gly Leu Gly Lys Val Leu Val Asp He Leu Ala Gly Tyr 820 825 830 5 Gly Ala Gly Val Ala Gly Ala Leu Val Ala Phe Lys He Met Ser Gly 835 840 845 Glu Val Pro Ser Thr Glu Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala He Leu 850 855 860 10 Ser Pro Gly Ala Leu Val Val Gly Val Val Cys Ala Ala He Leu Arg 865 870 875 880 Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu 15 885 890 895 He Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val 900 905 910 20 Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Gln He Leu Ser Gly Leu 915 920 925 Thr He Thr Gln Leu Leu Lys Arg Leu His Gln Trp He Asn Glu Asp 930 935 940 25 Cys Ser Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp 945 950 955 960 He Cys Thr Val Leu Ala Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu 30 965 970 975 Leu Pro Arg Leu Pro Gly Val Pro Phe Leu Ser Cys Gln Arg Gly Tyr 980 985 990 35 Lys Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly He Met His Thr Thr Cys Pro Cys 995 1000 1005 Gly Ala Gln He Thr Gly His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg He Val 1010 1015 1020 40 Gly Pro Arg Thr Cys Ser Asn Thr Trp His Gly Thr Phe Pro He Asn 1025 1030 1035 1040 Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Thr 45 1045 1050 1055 Arg Ala Leu Trp Arg Val Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg 1060 1065 1070 50 Val Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly Met Thr Thr Asp Asn Val Lys 1075 1080 1085 Cys Pro Cys Gln Val Pro Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly 1090 1095 1100 55 Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Val Cys Arg Pro Leu Leu Arg Glu 1105 1110 1115 1120 Glu Val Val Phe Gln Val Gly Leu Asn Gln Tyr Leu Val Gly Ser Gln 60 1125 1130 1135
^y Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu 1140 1145 1150
Thr Asp Pro Ser His He Thr Ala Glu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala 1155 1160 1165 Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser 1170 1175 1180 Ala Pro Ser Leu Lys Ala Thr Cys Thr Thr His His Asp Ser Pro Asp 1185 USO 1195 1200
Ala Asp Leu He Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly 1205 1210 1215
Asn He Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val He Leu Asp Ser 1220 1225 1230
Phe Asp Ser Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu He Ser Val Glu 1235 1240 1245 Ala Glu He Leu Arg Arg Ser Lys Lys Phe Pro Pro Ala Met Pro He 1250 1255 1260 Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Asp 1265 1270 1275 1280
Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Thr 1285 1290 1295
Lys Ala Pro Pro He Pro Pro Pro Arg Arg Lys Lye Thr Val Val Leu 1300 1305 1310 Thr Glu Ser Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ser Lys Thr 1315 1320 1325 Phe Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ala Val Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala 1330 1335 1340 Pro Pro Asp Gln Ala Ser Asp Asp Gly Asp Lys Glu Ser Asp Val Glu 1345 1350 1355 1360
Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp 1365 1370 1375
Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu Glu Ala Gly Glu Asp 1380 1385 1390 Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Ser Arg Leu Asp Lys Ser 1395 1400 1405 Lys Val He Asn Ser Ala Leu Glu Leu Leu Asn Asp Val Gly He Glu 1410 1415 1420 Gly Leu Thr Thr Arg Lys Leu Ala Gln Lys Leu Gly Val Glu Gln Pro 1425 1430 1435 1440
Thr Leu Tyr Trp His Val Lys Asn Lys Arg Ala Leu Leu Asp Ala Leu 1445 1450 1455
Ala He Glu Met Leu Asp Arg His His Thr His Phe Cys Pro Leu Glu 1460 1465 1470 Gly Glu Ser Trp Gln Asp Phe Leu Arg Asn Asn Ala Lys Ser Phe Arg 1475 1480 1485 Cys Ala Leu Leu Ser His Arg Asp Gly Ala Lys Val His Leu Gly Thr 1490 1495 1500 Arg Pro Thr Glu Lys Gln Tyr Glu Thr Leu Glu Asn Gln Leu Ala Phe 1505 1510 1515 1520 Leu Cys Gln Gln Gly Phe Ser Leu Glu Asn Ala Leu Tyr Ala Leu Ser 1525 1530 1535 Ala Val Gly His Phe Thr Leu Gly Cys Val Leu Glu Asp Gln Glu His 1540 1545 1550 Gln Val Ala Lys Glu Glu Arg Glu Thr Pro Thr Thr Asp Ser Met Pro 1555 1560 1565 Pro Leu Leu Arg Gln Ala He Glu Leu Phe Asp His Gln Gly Ala Glu 1570 1575 1580 Pro Ala Phe Leu Phe Gly Leu Glu Leu He He Cys Gly Leu Glu Lys 1585 1590 1595 1600 Gln Leu Lys Cys Glu Ser Gly Ser Ala Tyr Ser Arg Ala Arg Thr Lys 1605 1610 1615 Asn Asn Tyr Gly Ser Thr He Glu Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Asp 1620 1625 1630 Asp Ala Pro Glu Glu Ala Gly Leu Ala Ala Pro Arg Leu Ser Phe Leu 1635 1640 1645 Pro Ala Gly His Thr Arg Arg Leu Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val 1650 1655 1660 Ser Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala 1665 1670 1675 1680 His Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly 1685 1690 1695 Asp Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly 1700 1705 1710 Ala Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala 1715 1720 1725 Leu Gly He Asp Glu Tyr Gly Gly 1730 1735
<210> 3 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador delantero complementario al extremo 5* del gen NS3 de HCV
. . . L.
<400> 3 ggcgctagcg cgcccatcac ggcctac 7
<210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> A <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador inverso complementario del extremo 3* del dominio de NS4A incluyendo el sitio de escisión NS4A/4B <400> 4 ggctctagag taagggaggt gtgaggc 27
<210> 5 <211> 37 <212> ADN <213> secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador inverso complementario del extremo 3* del dominio de NS4A incluyendo el sitio de escisión NS4A/4B mutado <400> 5 ggctctagag taagggaggt gtgaggggcg ctcttcc 37
<210> 6 <211> 36 <212> ADN <213> secuencia Artificial <220> . <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador inverso complementario del extremo 3* de NS4A incluyendo los últimos 6 codones de NS5A <400> 6 gcagcagacg acgtcctcga attcccggta gaggac 36
<210> 7 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artif icial <220> , <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador inverso iomplementario al sitio de escisión NS5A/5B <400> 7 ggctctagac catgtgtagg acatcgagca gcagacgacg tcctc 45 <210> 8 <211> 45 <212> ADN <213> s?eüBHei Artificial <220> , <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador inverso complementario al sitio de escisión 5A/5B mutado <400> 8 ggctctagac catgtgtagg acataggcct gcagacgacg tcctc 45
<210> 9 <211> 77 <212> ADN <213> secuencia Artifial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: cebador inverso para el mutante S1165A de NS3 <400> 9 cccccgggtg cacacagctg cccggaagat gcccacaacg gccccgaagg gcagagcagt 60 gggccacccg cagagcc 7
Se hace constar que con relación a esta fecha, el me or método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (37)
1. Un sistema sustituto basado en células para evaluar la actividad de proteasa de la proteasa NS3 del virus de la hepatitis C, caracterizado porque comprende: a) una primera molécula quimérica de ADN que comprende : i) un sistema de expresión no citopático capaz de inducir la expresión de la primera quimera después de la transfección en una célula de mamífero; y ii) una molécula de ADN recombinante de HCV operablemente enlazada al sistema de expresión; la molécula de ADN de HCV codifica para una poliproteína NS3-5 comprende : un dominio de proteasa de NS3 activo, un dominio NS4A suficiente para permitir la incrustación en la membrana del retículo endoplásmico después de la traducción, y que actúa como cofactor para la actividad de la proteasa NS3, los dominios NS4B y NS5A, incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de los mismos, y la proteína NS5B incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de la misma, suficiente para proporcionar un sitio de escisión NS5A/5B para dicha proteasa NS3 ; iii) y un dominio transactivador fusionado con dirección hacia abajo (3') de la molécula de .ADN de HCV, el dominio transactivador que codifica para una molécula transactivadora capaz de iniciar la expresión de un gen reportero; b) y una segunda molécula quimérica de .ADN que codifica para el gen reportero counido a un operón que responde a la molécula transactivadora; con lo cual la expresión de la primera molécula recombinante conduce a la producción de una poliproteína de fusión anclada al retículo endoplásmico de la célula de mamífero, la proteína anclada es capaz de ser escindida por la proteasa, con lo cual se permite la translocación del dominio transactivador para inducir la expresión del gen reportero como un medio para evaluar la actividad de la proteasa .
2. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la poliproteína NS3-5 comprende un dominio NS3 , variantes, derivados o fragmentos del mismo, suficientes para proporcionar una proteasa activa una vez traducido.
3. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína NS3 es truncada para excluir el dominio de helicasa o una proteína S3 donde el dominio de helicasa está inactivado.
4. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio NS4B requiere que la proteína traducida sea de suficiente longitud para permitir la orientación estructural correcta de la proteasa NS3 en vista del sitio de escisión objetivo NS5A/5B.
5. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el dominio NS5A requiere que la proteína traducida sea de suficiente longitud para permitir la orientación estructural correcta de la proteasa NS3 en vista del sitio de escisión objetivo NS5A/5B.
6. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica que codifica para la poliproteína NS3 de longitud completa de HCV.
7. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica parcial que codifica para una poliproteína parcial que comprende variantes de los dominios necesarios corro se definen de conformidad con la reivindicación 1.
8. Un sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico es como se define en la SEQ ID NO. 1.
9. Un sistema de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para una poliproteína de la SEQ ID NO. 2.
10. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula quimérica abarca la secuencia nucleotídica capaz de expresar derivados, variantes o fragmentos de la poliproteína precursora que comprende todos los sitios de escisión funcionales seleccionados del grupo que consiste de NS3/4A, 4A/4B, 4B/5A, y 5A/5B.
11. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos el NS5A/5B es un sitio de escisión funcional, mientras que uno o más de los sitios de escisión NS3/4A; 4A/4B; o 4B/5A son no funcionales.
12. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema promotor no citopático se selecciona del grupo que consiste de: el promotor de CMV, el sistema promotor temprano del SV40 o el sistema promotor LTR del RSV (virus del Sarcoma de Rous) .
13. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema reportero comprende un dominio transactivador counido a la primera molécula de ácido nucleico recombinante, mediante la cual el transactivador, cuando es escindido de la proteína de fusión, migra hacia el núcleo para activar la expresión de un gen reportero del cual el producto puede ser medido como un medio para evaluar la actividad de la proteasa NS3.
14. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el transactivador se selecciona del grupo que consiste de: el transactivador de tetraciclina (tTA) , NFKB, tat del VIH-1 y GAL-4.
15. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el transactivador es tTA.
16. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la molécula reportera se selecciona del grupo que consiste de: la fosfatasa alcalina secretada, la ß-galactosidasa, la luciferasa, cloranfenicol-aminotransferasa y proteína fluorescente verde.
17. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la molécula reportera es SEAP o luciferasa.
18. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la molécula reportera es SEAP.
19. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema reportero es una combinación de tTA y luciferasa; o una combinación de tTA y SEAP.
20. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el sistema reportero es una combinación de tTA y SEAP.
21. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el transactivador o el gen reportero está localizado con dirección hacia abajo (3') de los sitios de escisión objetivo y con esto se liberan después de la escisión.
22. Un sistema sustituto basado en células de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el transactivador o reportero está localizado en el extremo 3' de la molécula recombinante.
23. Una molécula de .ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque incluye todas las variantes, derivados y fragmentos de la misma .
24. Una molécula de .ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque es como se define en la SEQ ID NO. 1.
25. Una proteína recombinante, caracterizada porque es producida a partir de la molécula recombinante de ADN de conformidad con la reivindicación 23.
26. Un plásmido de expresión para la transfección dentro de una célula huésped de mamífero, caracterizado el plásmido porque comprende la primera molécula quimérica de ADN de conformidad con la reivindicación 1.
27. Una célula huésped eucariótica, caracterizada porque es cotransfectada con el plásmido de expresión de conformidad con la reivindicación 26, y un plásmido de expresión adicional que comprende la segunda molécula quimérica de ADN de conformidad con la reivindicación 1.
28. Una línea de células de mamífero, caracterizada porque es transfectada con el plásmido de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO. 1.
29. Una línea celular de mamífero de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de: hepatocitos primarios, líneas celulares de hígado, fibroblastos, 5 linfocitos, células de riñon.
30. Una línea celular de mamífero de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque selecciona del grupo que consiste de: las células hepáticas 293, Huh- 7, WRL68, HepG2 y Chang. 10
31. Un método para evaluar la actividad de la proteasa NS3, caracterizado porque comprende los pasos de: a) incubar primeramente las células huésped transfectadas como se describen de conformidad con la reivindicación 27, bajo condiciones que provocan que sean 15 expresados la poliproteína de la proteasa de HCV y el producto del gen reportero; y b) la medición de la cantidad del producto génico expresado.
32. Un método de conformidad con la 20 reivindicación 31, caracterizado porque en el paso a) las células son incubadas por al menos una hora.
33. Un método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque las células son incubadas por aproximadamente 18 horas.
34. Un método para identificar los inhibidores potenciales de la actividad de proteasa NS3 del HCV, que comprende el método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende además los pasos de: c) evaluar la actividad de la proteasa en presencia del inhibidor potencial mediante el método de conformidad con la reivindicación 31, en donde el compuesto es agregado a las células huésped después del paso a) y las células huésped incubadas adicionalmente antes de evaluar dicha actividad en el paso b) ; y d) la comparación de los resultados del paso b) con los resultados del paso c) .
35. Un método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque las células huésped transfectadas son además incubadas en presencia o ausencia de un inhibidor potencial por aproximadamente 30 horas.
36. Un método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque las células son incubadas por aproximadamente 20 horas.
37. Un método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque las células son incubadas por aproximadamente 10 horas. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al desarrollo de un sistema de ensayo o evaluación basado en células que tiene sensibilidad mejorada para la actividad de proteasa NS3 de HCV cuando se compara a ensayos conocidos, que es útil para seleccionar compuestos de prueba capaces de modular (particularmente inhibir) la actividad de proteasa NS3 de HCV. Este sistema proporciona una primera construcción que comprende un dominio transactivador unido con dirección hacia abajo (3') de los dominios NS3-5 de HCV bajo el control de un sistema promotor viral no citopático. Una segunda construcción es también proporcionada, la cual comprende un gen reportero bajo el control de un operador sensible al enlace del transactivador. Los dominios NS3-5 codifican para la poliproteína NS3 que comprende: la proteasa NS3 , seguida por el cofactor NS4A, las proteínas NS4B y NS5A (incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de las mismas) , terminado por la proteína NS5B (incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de la misma) suficiente para constituir un sitio de escisión NS5A/5B. El transactivador, cuando es expresado y liberado de la poliproteína inicia la transcripción y la expresión del gen reportero que es mensurable. SISTEMA SUSTITUTO BASADO EN CÉLULAS Y MÉTODO PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD DE LA PROTEASA NS3 DE VIRUS DE LA HEPATITIS C RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al desarrollo de un sistema de ensayo o evaluación basado en células que tiene sensibilidad mejorada para la actividad de proteasa NS3 de HCV cuando se compara a ensayos conocidos, que es útil para seleccionar compuestos de prueba capaces de modular (particularmente inhibir) la actividad de proteasa NS3 de HCV. Este sistema proporciona una primera construcción que comprende un dominio transactivador unido con dirección hacia abajo (3') de los dominios NS3-5 de HCV bajo el control de un sistema promotor viral no citopático. Una segunda construcción es también proporcionada, la cual comprende un gen reportero bajo el control de un operador sensible al enlace del transactivador. Los dominios NS3-5 codifican para la poliproteína NS3 que comprende: la proteasa NS3, seguida por el cofactor NS4A, las proteínas NS4B y NS5A (incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de las mismas) , terminado por la proteína NS5B (incluyendo cualquier derivado, variante o fragmento de la misma) suficiente para constituir un sitio de escisión NS5A/5B. El transactivador, cuando es expresado y liberado de la poliproteína inicia la transcripción y la expresión del gen reportero que es mensurable.
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