MXPA01009875A - Metodo de produccion microbiologica para alfa-l-aspartil-l-fenilalanina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con un metodo microbiologico nuevo para la produccion de alfa-L-aspartil-L-fenilalanina (Asp-Phe) a partir de los sustratos acido L-aspartico (L- Asp) y L-fenilalanina (L-Phe), en donde los sustratos se ponen en contacto, en presencia de ATP, con una dipeptido sintetasa no ribosomica que comprende dos modulos minimos conectados por un dominio de condensacion en donde los modulos N-resp. C-terminal reconocen L-Asp y L-Phe, respectivamente, y este ultimo modulo se une covalentemente en su extremo N terminal al dominio de condensacion, y en donde cada uno de estos modulos minimos esta compuesto de un dominio de adenilacion y un dominio de tiolacion que contiene el cofactor 4'-fosfopanteneinilo y se recupera la Asp-Phe formada; la presente invencion tambien se relaciona con fragmentos novedosos de ADN o combinacion de fragmentos de ADN que codifican para una Asp-Phe dipeptido sintetasa nueva, microorganismos que contienen tales fragmentos de ADN asi como Asp-Phe dipeptido sintetasas nuevas mismas.

Description

MÉTODO DE PRODUCCIÓN MICROBIOLOGÍA PARA a-L- ASPARTIL-L-FENILALANINA CAMPO DE LA INVENCIÓN • 5 La presente invención se relaciona con un método microbiológico nuevo para la producción de a-L-aspartil-L- fenilalanina (Asp-Phe) a partir de los sustratos ácido L-aspártico (L- Asp) y L-fenilalanina (L-Phe). La presente invención también se 10 relaciona con fragmentos de ADN novedosos o combinación de • fragmentos de ADN que codifican para una nueva Asp-Phe dipéptido sintetasa, microorganismos que contiene tales fragmentos de ADN así como nuevas Asp-Phe dipéptido sintetasas mismas. 15 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La a-L-aspartil-L-fenilalanina (a continuación denominada también como Asp-Phe) es un dipéptido importante utilizado, por ejemplo, para la producción del a-L-aspartil-L- 20 fenilalanina metiléster (a continuación denominado como APM). APM se sabe que es un edulcorante artificial de alta intensidad, que tiene un dulzor el cual es aproximadamente 200x tan potente como el dulzor de sacarosa. La forma ß de APM, así como los estereoisómeros de APM en donde uno o ambos aminoácidos están en la configuración D, no tienen propiedades edulcorantes. Se utiliza APM para el endulzado de diversos materiales comestibles. Existen diversos métodos de producción de APM; las • 5 actuales rutas se pueden dividir en químicas y bioquímicas/microbiológicas (en particular enzimáticas). En las maneras de producir APM mediante la utilización de técnicas de síntesis peptídicas conocidas se han desarrollado procesos tediosos y costosos con el fin de obtener un acoplamiento selectivo a-L,L 10 que involucra protección y desprotección intensa de los grupos de la cadena a-amino, carboxilo y la cadena lateral. Por otra parte, las rutas fermentativas en general son baratas e intrínsecamente muestran enantioselectividad y regioselectividad. Por lo tanto, las rutas fermentativas se han considerado como alternativas 15 promisorias para las rutas de síntesis químicas y bioquímicas mencionadas antes. Como se puede ver de EP-A-0036258, hasta ahora se ha considerado no adecuado producir el dipéptido Asp-Phe • en un microorganismo como parte de los procesos de producción de proteína propios del microorganismo; teóricamente, tal producción 20 se puede llevar a cabo al insertar en el ADN de un microorganismo las secuencias de bases nucleotídicas GAC o GAT (que se sabe son los codones para L-Asp) y TTT o TTC (que se sabe es el codón para L-Phe), precedidas y seguidas por codones de procesamiento o terminación apropiados en el marco de lectura correcto, y bajo el control apropiado. Por lo tanto, se ha intentado en EP-A-0036258 llegar a la síntesis de Asp-Phe indirectamente a través de la producción previa de segmentos de proteína de la fórmula (Asp-Phe)n en donde n es un número grande; esto se ha realizado al insertar en un vehículo de clonación un fragmento de ADN sintetizado que codifica para tal proteína poli(Asp-Phe). Sin embargo, tal ruta fermentativa ribosómica aún es tediosa y económicamente poco atractiva. Los inconvenientes principales se basan en la recuperación del dipéptido Asp-Phe del polipéptido. Se pueden adquirir inconvenientes similares a un método, como se describe por Choi, S.-Y et al. en J. Microbiol. Biotechnol., 2, 1992, p.1 -6, en donde se sintetiza un polipéptido que comprende los segmentos de la secuencia tripeptídica Asp-Phe-Lys. Por lo tanto, aún existe la necesidad de encontrar una ruta fermentativa directa para Asp-Phe. La fermentación directa de Asp-Phe es desconocida hasta ahora.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE ASP-PHE • 5 Sorprendentemente, los inventores ahora han encontrado un método microbiológico nuevo y alternativo promisorio para la producción de a-L-aspartil-L-fenilalanina (Asp-Phe) a partir de los sustratos ácido L-aspártico (L-Asp) y L-fenilalanina (L-Phe), en donde los sustratos se ponen en contacto, en presencia de una 10 cantidad efectiva de adenosina-trifosfato (ATP), con una dipéptido • sintetasa no ribosómica que comprende dos módulos mínimos conectados por un dominio de condensación en donde el módulo N- terminal de estos módulos reconoce al ácido L-aspártico y el módulo C terminal de estos módulos reconoce la L-fenilalanina y se une 15 covalentemente en su extremo L-terminal al dominio de condensación, y en donde cada uno de estos módulos mínimos está constituido de un dominio de adenilación y un cofactor 4'- • fosfopanteteinilo que contiene un dominio de tiolación y en donde se recupera la a-L-aspartil-L-fenilalanina (Asp-Phe) formada. 20 Este método nuevo por lo tanto proporciona un proceso microbiológico para fermentación directa de Asp-Phe, el cual en una etapa de metilación subsecuente se puede convertir en el edulcorante intenso aspartame. La producción de Asp-Phe por fermentación directa hasta ahora era desconocida, pues esta es una síntesis no ribosómica de este dipéptido. Los inventores por lo tanto han proporcionado un método microbiológico directo para producir el dipéptido Asp-Phe sin necesidad de ninguna etapa de protección y de desprotección. Las dipéptido sintetasas no ribosómicas novedosas, las cuales, de acuerdo con la presente invención, se pueden utilizar para la producción de Asp-Phe, también están indicadas en lo siguiente como Asp-Phe dipéptido sintetasas o como Asp-Phe sintetasas. Se sabe (por ejemplo a partir de P. Zuber et al., en "Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria", Sonenshein et al. (Eds.), Am. Soc. Microbiol., Washington, DC, 1993, p. 897-916) que los microorganismos pueden producir péptidos bioactivos mediante mecanismos ribosómicos y no ribosómicos. Los péptidos bioactivos conocidos hasta ahora para ser sintetizados de manera no ribosómica se producen por numerosas bacterias y hongos del suelo. Estos péptidos bioactivos pueden variar de 2 a 48 residuos, y son estructuralmente diversos. Pueden mostrar un espectro amplio de propiedades biológicas que incluyen actividades antimicrobiana, antiviral o antitumoral, o actividades inmunosupresoras o inhibidoras de enzima. Como tal, estos péptidos bioactivos sintetizados de manera no ribosómica forman una clase de metabolitos secundarios peptídicos los cuales han encontrado un uso ampliamente diseminado en medicina, agricultura y en investigación biológica. Hasta ahora se han encontrado más de 300 residuos diferentes y que se han incorporado en estos metabolitos secundarios peptídicos. Sin embargo, hasta ahora no se ha identificado un solo péptido que no se forme ribosómicamente y que tenga (como parte de su secuencia peptídica) el dipéptido Asp-Phe en el mismo, ni el dipéptido Asp-Phe en si mismo se ha identificado como un producto sintetizado de manera no ribosómica. De acuerdo con la presente invención, ahora se puede producir de manera no ribosómica Asp-Phe, y se pueden utilizar las Asp-Phe sintetasas no ribosómicas novedosas para la síntesis de Asp-Phe. En lo siguiente, en la parte de la especificación que se relaciona con fragmentos de ADN que codifican para las Asp-Phe sintetasas novedosas, se dilucidará con mayor detalle la manera en que se pueden obtener estas Asp-Phe sintetasas novedosas y como se han vuelto disponibles en el contexto de la presente invención. Para una mejor comprensión de la presente invención, en primer lugar, sin embargo, se presentan ciertos antecedentes generales respecto a la síntesis peptídica no ribosómica. En la síntesis no ribosómica de péptidos conocida hasta ahora, generalmente se involucra un mecanismo de tioplantilla portadora múltiple (T. Stein et al., J. Biol.. Chem. 271 , 1996, p.15428-15435). De acuerdo con este modelo, la formación del enlace peptídico se lleva a cabo en complejos multienzimáticos los cuales se denominan péptido sintetasas y los cuales comprenden una secuencia de módulo de reconocimiento de aminoácidos. En las péptido sintetasas, se llevan a cabo una serie de reacciones • 5 enzimáticas las cuales finalmente llevan a la formación de un péptido mediante acumulación secuencial de aminoácidos, en un orden determinado previamente por el orden de los módulos que reconocen a los aminoácidos análogos,, en el péptido. Esta serie de reacciones enzimáticas incluye esquemáticamente: 10 1 . reconocimiento de los aminoácidos que constituyen el sustrato; 2. activación de los aminoácidos sustrato reconocidos a sus aminoacil-adenilatos (esto es, el aminoacil adenosina-monofosfato; aa-AMP) a costa de Mg2+-ATP (adenilación); 15 3. unión de los aminoacil-adenilatos en forma de sus tioésteres más estables al grupo cisteamina de los cofactores 4'- fosfopanteteinilo (4'-PP) unidos a enzima (tiolación). El ATP • consumido en la reacción de adenilación de esta manera se libera en la forma de monofosfato (AMP); 20 4. dependiendo del péptido que se sintetiza de manera no ribosómica, los sustratos activados con tiol se pueden modificar (por ejemplo por epimerización o N-metilación); 5. formación del producto peptídico por integración paulatina de N a C de los aminoácidos del sustrato tioesterificado (modificado, según sea el caso) en el péptido en crecimiento; 6. liberación del péptido formado de manera no ribosómica de la 5 plantilla. Suponiendo que este esquema general también es correcto para la síntesis no ribosómica novedosa de Asp-Phe de acuerdo con la presente invención, esto significa que está síntesis involucra las etapas subsecuentes de (i) reconocimiento de L-Asp y 10 L-Phe, (ii) formación de un L-Asp aciladenilato y un L-Phe- • aciladenilato, (iii) unión de los mismos al grupo cisteamina del cofactor 4'-PP en los dominios de tiolación respectivos, (iv) formación del dipéptido Asp-Phe por transferencia del grupo carboxilo activado por tioéster de L-Asp al grupo amino de L-Phe, 15 mientras que el producto de condensación permanece unido covalentemente en el complejo multienzimático vía el cofactor 4'-PP en el dominio de tiolación del módulo que reconoce Phe y (v) • liberación de Asp-Phe formado. De acuerdo con la presente invención, los sustratos L- 20 Asp y L-Phe se ponen en contacto con una Asp-Phe dipéptido sintetasa no ribosómica, en presencia de una cantidad efectiva de ATP. Una cantidad efectiva de ATP en la presente significa una cantidad de ATP la cual asegura que se lleva a cabo la formación del dipéptido a una velocidad adecuada. Habitualmente, tal velocidad será de por lo menos un recambio por minuto, es decir, un número de recambio (kcat) de 1 por minuto; preferiblemente kcat es de por lo menos 10 por minuto. Para permitir habilitar un proceso 5 económicamente activo, el ATP consumido por la reacción de síntesis de péptido preferiblemente se regenera. El contacto de los sustratos L-Asp y L-Phe con la Asp- Phe dipéptido sintetasa no ribosómica se puede llevar a cabo de cualquier manera adecuada; por ejemplo -si la Asp-Phe dipéptido 10 sintetasa está presente en un microorganismo-, se pueden alimentar • L-Asp y L-Phe en el medio de cultivo que contiene el microorganismo. Alternativamente, los microorganismos se pueden utilizar los cuales sean capaces de sobreproducción de L-Asp y/o L- Phe (por ejemplo a partir de glucosa) con la alimentación por 15 separado al microorganismo del aminoácido (L-Asp o L-Phe) el cual no se produce por el microorganismo. Todos estos métodos se pueden denominar métodos in vivo. Se puede regenerar ATP in vivo » en el microorganismo productor de Asp-Phe. El contacto de los sustratos L-Asp y L-Phe con la Asp- 20 Phe dipéptido sintetasa no ribosómica también se puede realizar mediante la utilización de la sintetasa en su forma aislada, esto es, mediante un método in vitro. En tales métodos in vitro, la regeneración de ATP debe tenerse precaución de realizarla por separado. Esto se puede realizar al aplicar un sistema de regeneración de ATP. Los sistemas de regeneración de ATP están disponibles fácilmente para las personas expertas en la técnica. Los estudios químicos de proteínas y los progresos recientes en la clonación y secuenciado de genes que codifican para péptido sintetasas de origen bacteriano y micótico se han vuelto claro que las péptido sintetasas conocidas tienen una estructura altamente conservada y ordenada constituida de lo que se denominan módulos. Estos módulos se han definido como unidades semiautónomas dentro de las péptido sintetasas que pueden transportar toda la información necesaria para reconocimiento, activación y modificación de un sustrato. Aunque los módulos en principio pueden actuar independientemente, se establece la suposición en general de que deben trabajar de manera concertada, en un modo de acción basado en plantilla para obtener la elongación del péptido. En general, los módulos de las péptido sintetasas, cada módulo es de aproximadamente 1000-1400 aminoácidos de longitud (es decir, módulos que tienen pesos moleculares en el intervalo de 120-160 kDa) en si mismos están constituidos como un arreglo lineal de dominios conservados que representan específicamente las actividades de la enzima involucrada en el reconocimiento del sustrato, activación (y opcionalmente, según sea el caso, modificación) y condensación (es decir, formación del enlace peptídico). Dos de tales dominios distintos, los dominios de adenilación y tiolación (dominio A y dominio T) juntos forman la parte más pequeña de un módulo que retiene todas las actividades catalíticas para activación específica y unión covalente del sustrato aminoácido. Stachelhaus et al., han designado este fragmento de núcleo de los módulos como "módulo mínimo" (T. Stachelhaus et al. , J. Biol.. Chem. 270, 1995, p.6163-6169). El término "módulo mínimo" como se utiliza aquí, por lo tanto, de acuerdo con tal definición, se refiere a tal fragmento de núcleo combinado de los módulos que consiste de un dominio de adenilación y un dominio de tiolación. Algunos motivos de núcleo altamente conservados de adenilación y dominios de tiolación, como se sabe existen en las péptido sintetasas, se incluyen en la cuadro 1 , junto con algunos motivos de núcleo altamente conservados de condensación y dominios de tioesterasa (los cuales se tratarán con mayor detalle en partes posteriores de esta especificación). El denominado "dominio de adenilación" (dominio A, aproximadamente 550 aminoácidos) es una región esencial de cada módulo. Se ha demostrado que el dominio A presenta sitios de reconocimiento de sustrato y de unión de ATP y por lo tanto es responsable únicamente para la activación del aminoácido reconocido en su aciladenilato a través de hidrólisis por ATP (T. Stachelhaus et al., J. Biol.. Chem. 270, 1995, p.6163-6169). Cuadro 1 . Motivos de núcleo altamente conservados de dominios catalíticos de péptido sintetasas conocidas Fuente: M. Marahiel et al., Chem. Rev. 97, 1997, p.2651 -2673 Muy recientemente se ha reportado la primera estructura tridimensional de un dominio de adenilación de una péptido sintetasa (PheA de GrsA) (E. Conti et al. , Embo j. 16, 1997, p. 4174- 4183). Esta estructura muestra que casi la totalidad de los motivos de núcleo altamente conservados están colocados alrededor del sitio activo en donde se unen los sustratos. Los residuos principales 5 involucrados en la construcción del receptáculo de unión de sustrato también se pueden asignar; se han encontrado que se localizan entre los motivos de núcleo A3 y A6 y no están altamente conservados. El dominio A de un módulo es muy importante para 10 determinar la especificidad del módulo. "Especificidad" de un • módulo significa que el módulo tiene cierta preferencia para reconocer un aminoácido sobre otros aminoácidos o sobre otro aminoácido. Por supuesto, también la concentración de cada aminoácido individual cerca del módulo puede jugar un papel. Por 15 ejemplo, si la concentración del aminoácido específico es mucho más alta que la de la (mayor parte de) los otros aminoácidos, los requerimientos por especificidad puede ser un poco menos # estrictos. El denominado "dominio de tiolación" (dominio T, 20 aproximadamente 100 aminoácidos; también denominado proteína portadora peptidilo (PCP)) es un dominio que se localiza directamente corriente abajo del dominio de adenilación. Forma una parte integral de las péptido sintetasas, y es el sitio de unión del cofactor 4'-PP y acilación del sustrato. Dentro del dominio T, 4'-PP se une covalentemente a la cadena lateral de un residuo serina que no varía y el cual se localiza dentro del motivo de núcleo de tiolación altamente conservado (véase el cuadro 1 ). Si el dominio T • 5 en un módulo de la péptido sintetasa no transporta su cofactor 4'- PP, no se puede llevar a cabo la unión covalente del sustrato aminoacilo y la elongación de la cadena será imposible. Se ha encontrado que las péptido sintetasas conocidas hasta ahora, cada dominio T se convierte de la forma apo inactiva a 10 la forma holo activa por transferencia de la porción 4'-PP de la • coenzima A (CoA) a la cadena lateral del residuo serina mencionado antes. Este cebado-post-traduccional de cada dominio T es mediado por miembros específicos de péptido sintetasa de una superfamilia de enzima descubierta recientemente, las 4'-fosfopanteteinil 15 transferasas. Utilizan CoA como un sustrato común, y parecen adquirir especificidad a través de las interacciones proteína- proteína. # La Asp-Phe dipéptido sintetasa como se utiliza en el método de la presente invención comprende dos módulos mínimos, 20 respectivamente un módulo mínimo en su lado N-terminal que reconoce L-Asp y otro módulo mínimo en su lado C terminal que reconoce L-Phe. El término "módulo mínimo" se utiliza en el mismo significado que se proporciona hasta ahora por Stachelhaus et al., J. Biol.. Chem. 270, 1995, p.6163-6169. Cada uno de estos módulos mínimos está constituido de un dominio de adenilación (dominio A) y un dominio de tiolación 5 (dominio T). Además, los dos módulos mínimos de las Asp-Phe dipéptido sintetasas de acuerdo con la invención se conectan por lo que se denomina un dominio de condensación, el cual necesita estar unido covalentemente a la cadena polipeptídica del módulo 10 Phe, específicamente a la parte N terminal del mismo. Sin embargo, • el dominio de condensación no necesita estar unido covalentemente a ambos módulos mínimos (es decir, a los módulos que reconocen respectivamente L-Asp y L-Phe), debido a que no hay un requerimiento de que estos dos módulos mínimos se localicen en 15 una cadena polipeptídica única. Por lo tanto, el término "conectado" significa que el dominio de condensación asegura que ambos módulos mínimos pueden operar de manera concertada. » En las péptido sintetasas conocidas, el dominio de condensación se produce como una región conservada 20 moderadamente. El dominio de condensación (región conservada) habitualmente consiste de aproximadamente 400 residuos aminoácidos y se sabe que está involucrada en la catálisis de la formación del péptido no ribosómico. Uno de los motivos de núcleo conservados contiene el residuo histidina catalíticamente activo. Véase T. Stachelhaus et al., J. Biol. Chem. 273, 1998, p.22773- 22781 . El Asp-Phe formado se puede recuperar del medio de • 5 reacción por cualquier método disponible para una persona experta en la técnica. Se prefiere que el dominio de condensación de la dipéptido sintetasa se conecte a ambos módulos mínimos de manera tal que también se una covalentemente al módulo que 10 reconoce L-Asp. En tal caso, el dominio de condensación no solo se • une covalentemente al extremo N-terminal del módulo que reconoce L-Phe, sino también al extremo C terminal del módulo que reconoce L-Asp, y que forma parte de una sola cadena polipeptídica que comprende los módulos de reconocimiento L-Asp y L-Phe. 15 Una característica diferenciadora de la síntesis peptídica no ribosómica es el hecho de que el péptido que se forma en la plantilla se une covalentemente al dominio T del módulo C terminal como un intermediario peptidilo-(4'-PP)-dominio T. La liberación del péptido de este intermediario se supone que se lleva a cabo ya sea 20 por ataque intermolecular por agua, lo que resulta en hidrólisis neta, o por captura intramolecular por un grupo hidroxilo o amino de la cadena peptídica misma, lo que da lugar a un producto peptídico cíclico y de la péptido sintetasa en forma holo. La primera ruta de terminación proporciona un péptido lineal con un grupo carboxílico C terminal libre (como sería el caso para la síntesis de Asp-Phe de acuerdo con la presente invención). Debido a que Asp-Phe está presente en una forma intermedia unida a la plantilla de la Asp-Phe dipéptido sintetasa, es ventajoso tomar medidas adicionales para mejorar la liberación de Asp-Phe de la plantilla. Por lo tanto, se prefiere particularmente que también este presente un factor de liberación para el Asp-Phe que se forme sobre la dipéptido sintetasa. El término "factor de liberación", como se utiliza aquí, está diseñado para comprender cualquier medio, ya sea parte de la síntesis o presente en combinación con la misma, el cual mejore la liberación de la sintetasa de la Asp-Phe que se forma en la sintetasa. Todos los módulos bacterianos conocidos y algunos módulos micóticos de péptido sintetasa que incorporan el último aminoácido en la cadena del péptido en crecimiento muestran una región con una función similar a tioesterasa. Estas regiones de aproximadamente 250 aminoácidos se localizan en el extremo C terminal de los módulos que reconocen el aminoácido. Estas regiones similares a tioesterasa son regiones integradas las cuales muestran homología con proteínas similares a tioesterasa y por lo tanto también se denominan como un dominio tioesterasa (dominio TE (integrado)). Todos estos dominios TE integrados contienen un residuo serina como sitio activo, el cual en parte es el núcleo motivo GxSxG (véase el cuadro 1 ). Trabajo reciente ha dado fundamento para la tarea de que estos dominios TE integrados están involucrados en la terminación de la elongación de la cadena y la liberación del producto. Por ejemplo, la supresión del dominio TE completo de la surfactina cintasa lleva a una reducción en 97% de la producción de surfactina in vivo (Schneider A., et al., Arch. Microbiol., 169, 1998, p.404-410). Además, se ha demostrado que la sustitución del dominio TE integrado de la parte C terminal del módulo 7 de la surfactina cintasa a los extremos C terminales de los módulos 4 y 5, resulta en la formación de los lipotetrapéptidos y pentapéptidos correspondientes. También en este estudio la remoción del dominio TE integrado lleva a una reducción casi completa de la síntesis del péptido (Ferra F de, et al. , J. Biol. Chem., 272, 1997, p.25304-25309). En una modalidad particularmente preferida de la invención, el factor de liberación por lo tanto es una proteína la cual muestra funciones similares a tioesterasa y forma un dominio integrado de la dipéptido sintetasa en la parte C terminal de la misma.

Además, se prefiere que la Asp-Phe dipéptido sintetasa, antes de la producción de Asp-Phe, experimente optimización para su función mediante la utilización de una o más actividades modificadores post-traduccionales. Esto es útil para obtener la • 5 síntesis no ribosómica más eficiente de Asp-Phe. El término "actividades de modificación post- traduccional" para síntesis no ribosómica eficiente de Asp-Phe, como se utiliza en la presente, se pretende que comprenda cualquier actividad la cual modifique a la dipéptido sintetasa 10 después de su formación por lo que afecta de manera positiva su • función de síntesis de Asp-Phe. En particular, la producción de Asp-Phe, de acuerdo con la presente invención, la actividad de modificación post-traduccional utilizada es una 4'-fosfopanteteinil (4'-PP) transferasa. La 4'-PP 15 transferasa proporciona la conversión efectiva de la apo-enzima a holo-enzima de la péptido sintetasa y mediante carga del cofactor 4'-PP a las cadenas laterales serina en el motivo de núcleo de los • dominios T, y por lo tanto incrementa el rendimiento de Asp-Phe en la producción del mismo. La conversión efectiva de la apo enzima a 20 la holo enzima se proporciona si cada uno de ambos dominios T de la Asp-Phe dipéptido sintetasa por lo menos 10% de la apo enzima se convierte a la forma holo.

Se prefiere particularmente que en la producción de Asp-Phe de acuerdo con la invención también una proteína no integrada con actividad similar a tioesterasa tipo II esté presente junto con la dipéptido sintetasa. Con el significado en la presente de • 5 proteínas que tienen actividad similar a tioesterasa tipo II están proteínas con fuertes similitudes de secuencia con las ácido graso tioesterasas tipo I I de origen vertebrado. Tal proteína no integrada con actividad similar a tioesterasa tipo II es diferente de la tioesterasa integrada (dominio TE). Investigaciones recientes 10 (Schneider et al., Arch. Microbiol. (1998), 169, 404-410) han • demostrado que la supresión de un gen que codifica para tal proteína no integrada con actividad similar a tioesterasa tipo II del operon de surfactina cintasa lleva a una reducción de 84% en la producción de péptido. Se sugiere que la proteína no integrada con 15 actividad similar a tioesterasa tipo II incrementa la producción de péptidos no ribosómicos, posiblemente por reactivación a través de liberación de módulos mal cargados que están bloqueados con el #• grupo aminoacilo incorrecto o un grupo acilo no deseado en el cofactor 4'-PP. 20 Los genes que codifican para las proteínas no integradas con actividad similar a tioesterasa tipo I I se pueden colocar en el extremo 5' o 3' del operon que codifica para péptido sintetasa. Estas proteínas tienen masas moleculares de 25-29 kDa, son de aproximadamente 220-340 residuos aminoácidos de longitud y transportan la secuencia GxSxG la cual se supone forma el sitio activo. Se hace notar que en casi la totalidad de los operones de codificación para péptido sintetasa procarióticos conocidos hasta • 5 ahora, se han detectado tales genes distintivos. En la producción de Asp-Phe de acuerdo con la presente invención, la Asp-Phe dipéptido sintetasa prefepblemente está presente en material celular vivo de un microorganismo y se alimenta al fermentador glucosa, L-Asp y/o L-Phe, y el Asp-Phe que 10 se forma después se recupera. Como se utiliza en este contexto, el • término "glucosa" se pretende que cubra la glucosa en cualquier otra fuente de energía necesaria para la regeneración de ATP en el material celular vivo y para el mantenimiento de energía necesario para tal material celular vivo. Además, la glucosa (u otra fuente de 15 energía) se utiliza como material inicial para la producción de cualquier L-Asp y/o L-Phe que se produzca en la célula viva en el curso del proceso de la invención. • Por supuesto, una persona experta en la técnica tendrá conocimiento de que la alimentación de glucosa, L-Asp y/o L-Phe se 20 realiza bajo condiciones apropiadas de temperatura y pH , que incluyen según se requiere la presencia de una fuente de nitrógeno apropiada, sales, elementos en trazas y otros factores de crecimiento orgánicos tales como vitaminas y aminoácidos, etc. , al fermentador u otro tipo de reactor (enzima) el cual se utiliza para la producción de Asp-Phe. La Asp-Phe formada se recupera. Tal recuperación se puede llevar a cabo durante el proceso o al final del mismo. • 5 El material celular vivo puede estar presente en cualquier forma apropiada tal como este disponible para una persona experta en la técnica. Por ejemplo, se pueden utilizar células completas como tales o en forma inmovilizada. El microorganismo puede ser cualquier clase de microorganismo en 10 donde Asp-Phe dipéptido sintetasa, de acuerdo con la invención, se • puede expresar establemente. Los microorganismos adecuados son, por ejemplo, microorganismos los cuales: (a) son productores de péptidos vía síntesis no ribosómica, por ejemplo, bacterias tales como especies de Streptomyces, especies 15 de Bacillus, especies de Atinomyces, especies de Micrococcus, especies de Nocardia o especies micóticas tales como especies de Tolypocladium, especies de Fusarium, especies de Penicillium, • especies de Aspergillus y especies de Cochliobolus; o (b) son capaces de producir aminoácidos, en particular L- 20 Asp y/o L-Phe, preferiblemente a escala industrial, por ejemplo especies de Escherichia, por ejemplo E. coli y especies de Corynebacterium, por ejemplo C. glutamicum, Los microorganismos se pueden hacer crecer, bajo condiciones las cuales se pueden encontrar fácilmente por una persona experta en la técnica, en un fermentador y la producción de Asp-Phe después se puede llevar a cabo en el mismo o en otro 5 fermentador. Como se significa en la presente, el fermentador puede ser cualquier tipo de fermentador u otros tipos de reactores (enzimas) conocidos por los expertos en la técnica. En el método para la producción de Asp-Phe de acuerdo con la presente invención, se prefiere que el microorganismo 10 primero crezca en un fermentador para alcanzar una densidad • celular determinada previamente antes de que se active la expresión de la Asp-Phe dipéptido sintetasa y se alimente la glucosa, L-Asp y/o L-Phe para la síntesis del dipéptido Asp-Phe. Una persona experta en la técnica puede determinar 15 fácilmente el crecimiento del microorganismo, por ejemplo al medir su densidad óptica (D.O.) y encontrar el nivel más apropiado de densidad celular. Para evitar cualquier efecto negativo sobre el » crecimiento del microorganismo, la fase de crecimiento y la fase de producción de Asp-Phe sintetasa preferiblemente están 20 desacopladas. Tal desacoplamiento se puede llevar a cabo al expresar el gen para la Asp-Phe sintetasa a partir de un promotor estrechamente regulable e ¡nducible. La expresión del Asp-Phe dipéptido sintetasa preferiblemente se activa por adición de un componente químico específico (inductor) o al cambiar las condiciones físicas, por ejemplo la temperatura, el pH o la presión de oxígeno disuelto, después de que se ha alcanzado un nivel predeterminado de densidad celular. Se supone que la expresión se • 5 activa en comparación con un estado no inducido, si el nivel de expresión de la Asp-Phe dipéptido sintetasa se incrementa en por lo menos un factor de 10. Después, también se inicia la alimentación de sustratos, etc., en cantidades que se requieran, y se inicia la producción de 10 Asp-Phe. De manera más preferible, el microorganismo es un microorganismo productor de L-fenilalanina y, además de las cantidades requeridas de sales y elementos en traza, etc., únicamente se alimenta glucosa y L-Asp. Los microorganismos 15 productos de L-Phe son bien conocidos. Por ejemplo, se han utilizado E. coli y especies de Corynebacterium para la producción de L-Phe. Mediante la expresión de una Asp-Phe dipéptido sintetasa • en tales microorganismos, la disponibilidad de L-Phe en el microorganismo se proporciona para, y únicamente glucosa, una 20 fuente de nitrógeno apropiada, factores de crecimiento orgánicos, sales y elementos en trazas, etc., así como L-Asp. que se puede suministrar según se requiera.

En particular, el microorganismo utilizado es una especie de Escherichia o de Bacillus. Se obtienen mejores resultados si el microorganismo utilizado es una cepa con actividad reducida de proteasa para Asp- • 5 Phe o que carece de tal actividad hacia Asp-Phe. Mediante la utilización de tales cepas se evita la degradación de Asp-Phe formado. Cualquier cepa adecuada la cual carezca de actividad de proteasa (ya sea naturalmente o debido a que la actividad de la proteasa se ha disminuido sustancialmente o se ha removido 10 completamente) se puede utilizar. • Además, si la síntesis de Asp-Phe se produce en un microorganismo se pueden tomar además medidas adicionales para mejorar la permeación de la Asp-Phe formada al medio de reacción fuera del microorganismo y recuperar Asp-Phe del mismo después 15 de la separación del microorganismo del medio de reacción. Similarmente, se pueden tomar medidas adicionales para mejorar la captación de glucosa y/o L-Asp y/o L-Phe. • En una modalidad incluso más preferida de la invención, el microorganismo usado también contiene un sistema de 20 exportación adecuado para el Asp-Phe que se forma y/o uno o más sistemas de captación adecuados para glucosa y/o L-Asp y/o L-Phe. Utilizando un sistema de exportación adecuado se asegurará obtener una secreción más eficiente de la Asp-Phe que se forme. La secreción significa aquí la secreción de Asp-Phe que se forme en el microorganismo dentro del ambiente extracelular. La secreción eficiente de Asp-Phe es importante para mejorar el rendimiento de recuperación de Asp-Phe y para mantener la actividad de Asp-Phe • 5 dipéptido sintetasa a un nivel adecuado así como para evitar la degradación intracelular de Asp-Phe. Además, el procesamiento corriente abajo para Asp-Phe secretada es más fácil. Similarmente, la presencia de uno o varios sistemas de captación adecuados mejorarán la eficiencia de acoplamiento de 10 Asp-Phe. • En los párrafos siguientes se han descrito método de síntesis no ribosómica in vivo para Asp-Phe. Todos están caracterizados porque se utiliza material celular vivo y la regeneración de ATP se lleva a cabo en este material celular. La 15 presente invención también se puede llevar a cabo in vitro. Como se utiliza en la presente, los sistemas in vitro están caracterizados porque la Asp-Phe dipéptido sintetasa no está presente en el • material celular vivo; sin embargo, puede estar presente en cualquier otro ambiente, por ejemplo en células permeabilizadas, 20 extracto libre de células o como una dipéptido sintetasa aislada. En tal caso, la regeneración de ATP no se lleva a cabo en material celular vivo utilizado para la síntesis de Asp-Phe y deben de tomarse medidas especiales para suministrar ATP en una cantidad efectiva. En una modalidad preferida de la invención, la producción de Asp-Phe se lleva a cabo in vitro en un reactor • 5 enzimático, mientras se suministra ATP, y se ha alimentado L-Asp y/o L-Phe, y se recupera el Asp-Phe que se forma. Para mejorar la factibilidad económica del proceso se prefiere particularmente incrementar el rendimiento de Asp-Phe por mol de ATP suministrada para la síntesis de Asp-Phe. Esto se 10 puede llevar a cabo mediante regeneración de ATP in situ a partir • del AMP que se forma del ATP en las reacciones consecutivas de adenilación y tiolación. Por lo tanto, en un módulo preferido de la invención, el suministro de ATP se proporciona en parte por un sistema 15 regenerador de ATP ¡n situ. Se conocen por los expertos en la técnica diversos sistemas de regeneración de ATP (los cuales en la literatura • también son preferidos como sistemas de generación de ATP). Como sistemas de regeneración de ATP para sistemas celulares 20 completos (por ejemplo sistemas de glicólisis de levadura) o enzimas regeneradoras de ATP aisladas, por ejemplo adenilato cinasa combinada con acetato cinasa, se pueden utilizar. Un sistema de regeneración de ATP muy elegante se ha descrito por T.

Fujio et al. (Biosci., Biotechnol., Biochem. 61 , 1997, p.840-845). Ellos han demostrado el uso de células permeabilizadas de Corynebacterium ammoniagenes para la regeneración de ATP a partir del monofosfato correspondiente (AMP) acoplado a una • 5 reacción que requiere ATP en células de E.coli permeabilizadas. De esta manera elegante (barata) se puede suministrar glucosa como una fuente de energía en vez de la mayor parte del ATP. Por lo tanto, el sistema regenerador de ATP preferiblemente está presente en un microorganismo 10 permeabilizado. Este microorganismo permeabilizado presente en el • reactor (enzima) utilizado asegura que siempre estará presente y disponible una cantidad efectiva de adenosina-trifosfato (ATP) durante la producción de Asp-Phe de acuerdo con la presente invención. 15 Fragmentos de ADN que codifican para una Asp-Phe dipéptido sintetasa. etc. La presente invención también se relaciona con • fragmentos de ADN novedosos que codifican para Asp-Phe dipéptido sintetasa. Estos fragmentos de ADN novedosos o 20 combinación de fragmentos de ADN codifican para una Asp-Phe dipéptido sintetasa no ribosómica, sintetasa la cual comprende dos módulos mínimos conectados por un dominio de condensación en donde el módulo N terminal de estos módulos reconoce ácido L- aspártico, y el módulo C terminal de estos módulos reconocer L- fenilalanina y se une covalentemente en su extremo N-terminal al dominio de condensación, en donde cada uno de estos módulos mínimos está compuesto de un dominio de adenilación y un cofactor • 5 4'-fosfopanteteinilo que contiene un dominio de tiolación. El término "fragmento de ADN o combinación de fragmentos de ADN", como se utiliza en la presente, se entiende que tiene su significado más amplio posible. Primero que nada, el término se relaciona con el material biológico compuesto (uno o más 10 fragmentos de ADN) como se menciona aquí en lo anterior y que • codifican para los módulos mínimos para Asp y Phe en el orden correcto y para el dominio de condensación, cada secuencia codificante está rodeada por secuencia de control de transcripción y traducción (por ejemplo promotores, terminadores de transcripción) 15 y similares los cuales pueden ser adecuados para la expresión de la actividad de síntesis del dipéptido Asp-Phe. Las secuencias de control pueden ser homologas o heterólogas, y el o los promotores • presentes en el ADN pueden ser constitutivos o inducibles. El término "fragmento de ADN" como se utiliza en la 20 presente se entiende que además codifica, además de codificar para los módulos mínimos de Asp-Phe así como para el dominio de condensación, para las actividades de los otros dominios, por ejemplo los dominios TE. Además, estos fragmentos pueden codificar para actividades las cuales no se localizan en el polipéptido de Asp-Phe dipéptido sintetasa mismo, tales como las proteínas similares a tioesterasa tipo II no integradas, y otras actividades que cooperan de manera concertada con los módulos 5 mínimos de Asp y Phe. El término "fragmento de ADN" como se utiliza en la presente, también se entiende que comprende estructuras de genes que comprenden fragmentos de ADN como se describe aquí en lo anterior. De manera más precisa se entiende que una estructura de 10 gen es un gen y cualquier otra secuencia nucleotídica la cual • transporta fragmentos de ADN de acuerdo con la invención. Las secuencias nucleotídicas apropiadas pueden ser, por ejemplo, plásmidos, vectores, cromosomas o fagos. Las estructuras de genes pueden existir ya sea como "parte de" un vector de replicación de 15 manera autónoma en situación única o de copias múltiples, o se puede integrar en el cromosoma en una situación única o de copias múltiples. » Se entiende que la estructura del gen también es una combinación de los portadores del gen mencionados antes, tales 20 como vectores, cromosomas y fagos, en los cuales se distribuyen los fragmentos de ADN de acuerdo con la invención. Por ejemplo, el fragmento de ADN que codifica para la Asp-Phe dipéptido sintetasa se puede introducir en la célula en un vector y el fragmento de ADN que codifica para la proteína similar a tioesterasa tipo II no integrada se puede insertar en el cromosoma. Además, un fragmento de ADN adicional se puede introducir, por ejemplo, dentro de la célula utilizando un fago. Estos ejemplos no se pretende que excluyan otras combinaciones de distribuciones del fragmento de ADN de la invención. Los fragmentos de ADN de acuerdo con la invención se pueden introducir en el microorganismo con un número de copias suficientemente alto, por ejemplo hasta 50 copias. Una discusión detallada de la Asp-Phe dipéptido sintetasa y los dos módulos mínimos comprendidos en la misma ya se ha proporcionado de antemano en las partes precedentes de esta solicitud de patente. La construcción de los fragmentos de ADN de acuerdo con la presente invención no es evidente por si misma, aunque los términos "módulo", "dominios", etc., de manera directa pueden sugerir que se sabe mucho acerca de los límites funcionales de los mismos. Tal información detallada la cual puede permitir un diseño razonado de péptido sintetasas (mutantes, no naturales), sin embargo, aún no está disponible. No obstante, recientemente se han descrito en la literatura diversas técnicas para la construcción de péptido sintetasas mutantes. Los métodos para construcción de péptido sintetasas mutantes descritos en la literatura son: De Ferra et al. (J. Biol..Chem., 272, 1997, p.25304- 25309) ha descrito un método para producir péptidos truncados de una secuencia predicha por sustitución del dominio TE integral de cierta surfactina sintetasa del módulo C terminal al extremo C • 5 terminal de módulos internos diferentes. Sin embargo, esta técnica sola no es adecuada para la construcción de un módulo para Asp- Phe dipéptido sintetasa debido a el orden natural de los dos módulos consecutivos de Asp-Phe no se sabe que existe en la naturaleza (ni en el extremo N o C terminal de ninguna sintetasa 10 natural, ni en una secuencia interna de cualquier sintetasa que se • presente de manera natural). Otra técnica in vivo descrita para someter a ingeniería las péptido sintetasas es la que se denomina alteración programada dentro de la estructura primaria de un producto peptídico. La base 15 para este método es la sustitución de un módulo por otro a nivel genético. Esta técnica se ha descrito en general por A. Schneider et al., Mol. Gen. Genet., 257, 1998, p.308-318). De esta manera, los • módulos mínimos que activan aminoácidos se pueden intercambiar con éxito in vivo entre las péptido sintetasas multimodulares de 20 origen heterólogo y se pueden obtener microorganismos los cuales en realidad producen péptidos no ribosómicos con estructura primaria diferente de los péptidos producidos sin tal alteración. tá técnica se aplicara para la construcción de una Asp-Phe dipéptido sintetasa, en principio estarían disponibles dos opciones, cada una comenzando de una dipéptido sintetasa, específicamente que tiene una secuencia de dos módulos que comprende cualquiera 5 de (i) Asp y XXX, este último representa cualquier otro aminoácido diferente de Phe, o bien (ii) YYY y Phe, lo anterior representa cualquier otro aminoácido diferente de Asp. En aquellos dipéptido sintetasas, el ADN que codifica para el módulo XXX se debe sustituir por ADN que codifique para el módulo Phe, o el ADN que 10 codifique para el módulo YYY por ADN que codifique para el módulo • Asp. Otros métodos para construcción de las péptido sintetasas se han descrito en EP-A-0637630. En tal solicitud de patente se sugiere un método por el cual, después de alteración de 15 la especificidad de sustrato por sustitución de (parte) de los módulos, también se pueden suprimir módulos o se pueden insertar dentro de la cadena sintetasa. La "especificidad" de un módulo » significa que el módulo tiene cierta preferencia en reconocer un aminoácido sobre otros aminoácidos o sobre otro aminoácido. 20 Es una característica definitoria de los métodos de ingeniería de peptidasa anteriores que los fenómenos de recombinación homólogos se utilizan para llevar a cabo los cambios que se desean en el ADN genómico en el microorganismo productor del péptido nativo. Debido a que los fenómenos de recombinación homologa se llevan a cabo en el microorganismo productor de péptido nativo, estos métodos pueden tener la ventaja de que la totalidad de las enzimas hospedadoras nativas y los elementos • 5 reguladores relevantes están presentes en principio. Sin embargo, la recombinación homologa mediante el uso de productos de péptidos no ribosómicos nativos adolece de varios inconvenientes graves. El más grave de estos inconvenientes es que con frecuencia es tedioso y técnicamente difícil, 10 especialmente cuando se aplica a microorganismos de crecimiento • lento con sistemas de transformación poco desarrollados o los cuales carecen de otras herramientas genéticas. Otros inconvenientes son que los microorganismos productores de péptidos no ribosómicos nativos con frecuencia no tienen un 15 antecedente de uso inocuo a escala industrial, no son organismos de producción para L-Phe y/o L-Asp y tienen características de fermentación desconocidas. Además, todos estos métodos resultan en células que tienen únicamente una sola copia de un fragmento de ADN que codifica para la péptido sintetasa deseada. Por lo tanto, 20 ninguno de estos métodos de ingeniería in vivo son adecuados para la preparación de la Asp-Phe dipéptido sintetasa novedosa de acuerdo con la invención y el uso de la misma para la producción industrial de Asp-Phe.

Los presentes inventores han encontrado que la Asp- Phe dipéptido sintetasa se puede obtener fácilmente por uso de técnicas de ingeniería in vitro. Hasta ahora, no se ha descrito técnicas de ingeniería in vitro para la construcción de péptido • 5 sintetasas. Los protocolos detallados para la construcción de Asp- Phe dipéptido sintetasas de acuerdo con la invención se puede encontrar en la parte experimental de esta solicitud. El fragmento de ADN que codifica para Asp-Phe dipéptido sintetasa se puede construir in vitro a partir de un 10 fragmento de ADN (o de secuencias parciales para tales fragmentos • que codifican para tales sintetasas como se presentan en las péptido sintetasas que existen de manera natural) Asp-XXX o YYY- Phe (en donde XXX e YYY tienen el significado como se describe en lo anterior) dipéptido sintetasa. Esto se lleva a cabo a partir de un 15 fragmento de ADN que codifica para una péptido sintetasa dimodular Asp-Leu (Leu = leucina) el cual se obtiene de el gen para surfactina sintetasa A de Bacillus subtilis ATCC 21332 (srfA-B) por » el método de PCR. El fragmento de ADN que codifica para el módulo mínimo Leu del mismo después se sustituye por un 20 fragmento de ADN (que se obtiene por el método de PCR) del gen para tirocidina A sintetasa de Bacillus brevis ATCC 8185 que codifica para el módulo mínimo Phe (fycA). Después se agrega un dominio TE integral al extremo C terminal del fragmento de ADN que codifica para Asp-Phe por sustitución del dominio de tiolación del módulo Phe por un fragmento de PCR que codifica para la tiolación de srA-C y el dominio TE. Esta construcción se realiza de manera tal que el ADN que codifica para el dominio TE adicional se fusiona • 5 en marco con el gen que codifica para la Asp-Phe sintetasa. Como resultado, el dominio TE forma una parte integrada de la sintetasa Asp-Phe producida. En la parte experimental de esta solicitud , este dominio TE que contiene Asp-Phe sintetasa se denominará como Asp-Phe-TE. 10 Después de la construcción, los fragmentos de ADN • codificantes se introducen dentro de un microorganismo hospedador adecuado. Los microorganismos hospedadores adecuados son, por ejemplo, E. coli y especies de Bacillus. Después de cultivo de estos microorganismos bajo condiciones ¡nductoras, las células se lisan y 15 las sintetasas producidas se purifican por IMAC (cromatografía de afinidad en metal inmovilizada). Las preparaciones de enzima purificada se utilizan para diferentes experimentos para demostrar • la formación de Asp-Phe- Fraamentos preferidos de ADN. Los siguientes 20 aspectos preferidos de los fragmentos de ADN que codifican para Asp-Phe dipéptido sintetasa de acuerdo con la invención corresponden cercanamente a los aspectos discutidos en las partes previas de esta especificación respecto a los métodos preferidos para la producción de Asp-Phe. Para los fragmentos de ADN que codifican para Asp-Phe dipéptido sintetasa de acuerdo con la invención, se prefiere 5 especialmente que el dominio de condensación en la dipéptido sintetasa codificada se conecte a ambos módulos mínimos de manera tal que también se una covalentemente al módulo que reconoce ácido L-aspártico. En particular, se prefiere que el fragmento de ADN o una 10 combinación de fragmentos de ADN que codifican para la dipéptido • sintetasa también codifiquen para un factor de liberación para el Asp-Phe formado en esa dipéptido sintetasa. El término "factor de liberación" se utiliza con el mismo significado que se ha utilizado en la parte previa de la especificación. 15 En una modalidad de la presente invención preferida más particularmente, el fragmento de ADN o la combinación de fragmentos de ADN que codifican para Asp-Phe dipéptido sintetasa # también codifican para una proteína la cual también muestra funciones similares a tioesterasa y forma un dominio integrado de la 20 dipéptido sintetasa en la parte C terminal del mismo. Para una explicación en los términos "dominio integrado", etc., se hace referencia a las partes anteriores de la presente solicitud.

Además, el fragmento de ADN que codifica para sintetasa a la combinación de fragmentos de ADN preferiblemente también expresan una o más actividades modificadoras post- traduccionales para una síntesis no ribosómica eficiente de Asp-Phe • 5 en la sintetasa. Los términos "actividades modificadores post- traduccionales", etc., se utilizan con el mismo significado que han sido usadas en la parte previa de la especificación. En particular, la actividad modificadora post-traduccional expresada por el fragmento de ADN o la combinación de fragmentos 10 de ADN es una actividad de 4'-fosfopanteteinil (4'-PP) transferasa.

• La formación de esta actividad proporciona la conversión efectiva de apo enzima a holo enzima. La conversión efectiva de apo enzima a holo enzima, etc., ya se ha explicado antes en la parte anterior de la especificación. 15 Se prefiere particularmente que el fragmento de ADN o la combinación de fragmentos de ADN también codifiquen para una proteína no integrada con actividad similar a tioesterasa tipo II . El • término "proteína no integrada con actividad similar a tioesterasa tipo II" se utiliza con el mismo significado que se ha utilizado en la 20 parte previa de la especificación. Microorganismos. La invención se relaciona además con microorganismos que contienen un fragmento de ADN o una combinación de fragmentos de ADN de acuerdo con la invención, y en particular con tales microorganismos los cuales son capaces de producir L-Asp y/o L-Phe. En particular, el microorganismo es una Escherichia coli o una especie de Bacillus. Asp-Phe dipéptido sintetasas. La presente invención • 5 finalmente también se relaciona con Asp-Phe dipéptido sintetasas novedosas. Los términos de expresiones utilizadas en lo siguiente con respecto a la Asp-Phe dipéptido sintetasa tienen todos el mismo significado al explicar en la presente en lo anterior. Las Asp-Phe dipéptido sintetasas no ribosómicas de 10 acuerdo con la presente invención están caracterizadas porque • comprenden dos módulos mínimos conectados por un dominio de condensación en donde el módulo N terminal de estos módulos es reconocer el ácido L-aspártico y el módulo C terminal de estos módulos es reconocer L-fenilalanina y su unión covalente en el 15 extremo N terminal del dominio de condensación, y en donde cada uno de estos módulos mínimos está constituido de un dominio de adenilación y un cofactor 4'-fosfopanteteinilo que contiene un • dominio de tiolación. En particular, el dominio de condensación en las 20 dipéptido sintetasas se conecta a ambos módulos mínimos de manera tal que también se une covalentemente al módulo que reconoce ácido L-aspártico.

Preferiblemente, la Asp-Phe dipéptido sintetasa también comprende un factor de liberación para el Asp-Phe formado en esa dipéptido sintetasa. De manera más preferible, el factor de liberación es una • 5 proteína la cual muestra funciones similares a tioesterasa y forma un dominio integrado de la dipéptido sintetasa en su parte C terminal. La invención a continuación se aclarará adicionalmente en la parte experimental, pero de ninguna manera se restringe a los 10 experimentos que se muestran. Los aminoácidos utilizados son • todos L-aminoácidos enantioméricamente puros. PARTE EXPERIMENTAL Procedimientos generales. Las técnicas de clonación molecular estándar tales como aislamiento de ADN, electroforesis 15 en gel, modificación de restricción enzimática de ácidos nucleicos, transformación de E. coli, etc., se realizan como se describe por Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning" a laboratory manual", » Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York and Innis et al., 1990, "PCR protocols, a guide to methods and 20 applications" Academic Press, San Diego. Los oligodesoxinucleótidos sintéticos se obtienen de MWG-Biotech AG, D-Ebersberg. El análisis de la secuencia de ADN se realiza en un analizador genético Applied Biosystems ABI 310, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las reacciones de secuenciado se llevan a cabo por el método de terminación de cadena con terminadores didesoxi etiquetados con colorante a partir del equipo de secuenciado de ciclo de PRISM ready Reaction DyeDeoxy • 5 Terminator con polimerasa FS AmpliTaq (Applied Biosystems). Construcción del plásmido pasp-leu-His . Un fragmento de 4934 pb que comprende las regiones del locus srfB del ADN cromosómico de Bacillus subtilis ATCC 21322 se amplifica (por PCR) utilizando los siguientes iniciadores: 10 5' TAA GCA TGC TGC TTT CAT CTG CAG AAA C (5' asp-leu-Sph\ - • srfB2 y 3' AAT GGA TCC TTC GGC ACG CTC TAC (3' asp-Leu-BamH\- srfS3). Se confirma el tamaño correcto del fragmento 15 amplificado por electroforesis en gel de agarosa. Se digieren 20 µg del fragmento con 1 unidad de enzimas Bam \ISph\ (37°C, 16 h) para generar sitios de restricción terminales. Se digieren 10 µg del plásmido pQE70 (proporcionado 20 por Qiagen, D-Hilden) con las mismas enzimas y se incuba subsecuentemente durante 1 hora con 1 unidad de fosfatasa alcalina (37°C). Se confirma la digestión completa al transformar 1 µl del ADN plasmídico linealizado en células competentes de E. coli de XL1 blue. Los dos fragmentos subsecuentemente se ligan en 10 µl de reacción de ligación en una relación de vector/inserción de 1 :3 con 1 unidad de enzima T4-DNA-ligasa (16°C, 16 h). Se utiliza 1 µl de mezcla de ligación para transformar 40 • 5 µl de células competentes de E. coli XL1 blue (Stratagene, D- Heidelberg) por electroporación. Los transformantes se seleccionan en placas de agar 2x YT que contienen 100 µg/ml de ampicilina. El análisis de 48 transformantes resistentes a ampicilina revela que 4 de ellos tienen insertado un fragmento de aproximadamente 5000 10 pb. Se confirma la inserción correcta utilizando análisis por • digestión por enzima de restricción y secuenciado terminal de la inserción. Se utiliza una clona correcta, designada pasp-leu-Hisß para investigaciones adicionales. Construcción del plásmido paso-phe-HiSñ. El plásmido 15 pasp-leu-Hisß se construye del plásmido pasp-leu-Hisß como sigue. Un fragmento de ADN cromosómico de 1894 pb del ADN de Bacillus brevis ATCC 8185 se amplifica (por PCR) utilizando los • siguientes iniciadores: 5' ATT TGG TCA CCA ATC TCA TCG ACÁ A (5' SsfEII-TycA-NLID), 20 y 5' ATA GGA TCC TGT ATT CGT AAA GTT TTT C (3'-PheAT-BamHl). Se confirma el tamaño correcto del fragmento utilizando electroforesis en gel de agarosa.

El fragmento se digiere con 1 unidad de enzima BamH y se incuba a 30°C durante 4 horas. Subsecuentemente se agrega 1 unidad de enzima SsfEII y se incuba durante otras 4 horas a 60°C. 5 El plásmido pasp-leu-Hisß se digiere de la misma manera y se incuba subscuentemente durante 1 hora con una unidad de fosfatasa alcalina. La porción de vector (aproximadamente 6.5 kb) se separa de otros fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa y se vuelve a purificar. Se 10 confirma la digestión completa como en lo anterior con • mineralizado. Los dos fragmentos se ligan en una relación equimolar durante 5 horas a 16°C utilizando 1 unidad de enzima T4- ,+. ligasa. Se utiliza 1 p ? de la mezcla de ligación para electroporación de células competentes E. coli XL1 blue. Los transformantes se 15 seleccionan en agar 2x YT que contiene 100 µg/ml de ampicilina. El análisis de los transformantes muestra que 1 de 90 clonas tiene insertado un fragmento de aproximadamente 2000 pb. Se confirma • la inserción correcta utilizando análisis por digestión de enzima de restricción y secuenciado terminal de la inserción. 20 La clona correcta se designa pasp-phe-Hisß. En contraste con el gen que codifica para la péptido sintetasa en el plásmido pasp-leu-Hise, el gen que codifica para la péptido sintetasa en el plásmido pasp-phe-Hisß es un gen híbrido que se obtiene al cambiar el fragmento de ADN que codifica para el segundo (Leu) módulo mínimo (dominio A y T), para un fragmento de ADN que codifica para un módulo mínimo Phe. Construcción del plásmido paso-ohe-TE-His Se • 5 construye el plásmido pasp-phe-TE-Hisß a partir del plásmido pasp- Un fragmento de ADN cromosómico de 910 pb de ADN de Bacillus subtilis atcc 21332 se amplifica (por PCR) utilizando los siguientes iniciadores: 10 5' ATA ATC GAT AAT CGC ACÁ AAT ATG GTC (5' TE-s/ C1 -C/al) y • 3' ATA AGA TCT AAC AAC CGT TAC GGT TTG TGT (3* int TE- srfC1 -8o7ll). Se confirma el tamaño correcto del fragmento utilizando electroforesis en gel de agarosa. 15 El fragmento se digiere con 1 unidad de enzima CLAI durante 4 horas a 37°C antes de ajustar las condiciones de amortiguador y digerir con 1 unidad de enzima ßg/ll (4 horas, 37°C).

» El plásmido pasp-phe-Hisß se digiere con la enzima CLAI (4 h, 37°C) y subsecuentemente con BamHl (4 h, 37°C) antes de 20 que el plásmido linealizado se incube durante 1 hora con 1 unidad de fosfatasa alcalina. La porción de vector (aproximadamente 8 kb) se separa de otros fragmentos de ADN por electroforesis en gel de agarosa y se vuelve a purificar.

El control de la digestión completa, ligación, electroporación y selección de transformantes se establece como se describe en lo anterior. Dos de los transformantes analizados se muestra que • 5 contienen el fragmento de ADN deseado. Se confirma la inserción correcta del fragmento de 900 pb por análisis de enzima de restricción y secuenciado terminal de la inserción. Una clona correcta se designa pasp-phe-TE-Hisß s. En contraste con el gen que codifica para la péptido sintetasa en el 10 plásmido pasp-phe-HiSe, el gen que codifica para la péptido • sintetasa en el plásmido pasp-phe-TE-Hise contiene un segundo sitio de fusión que se localiza entre el ADN que codifica para el dominio de adenilación y el dominio de tiolación del segundo módulo mínimo (Phe). Los dominios T-TE C terminales recuerdan a la parte 15 C terminal nativa de la surfactina sintetasa srfC. Expresión de la péptido sintetasas asp-leu-Hiss. asp- phe-HiSñ v asp-phe-TE-Hisfi. Se transforman 1 µl de cada plásmido » construido en células competentes E. coli BL21 /pgsp. Se obtiene una cepa BL21 1 DE3 de Stratagene, D-Heidelberg. El plásmido 20 pgsp, el cual se basa en el plásmido prep.4 (obtenido de Qiagen, D- Hilden), contiene el gen gsp (el gen 4'-PP transferasa del operon de biosíntesis de gramicidina S de Bacillus brevis ATCC 9999) bajo el control del promotor T7.

Los transformantes se seleccionan en placas de agar 2x YT que contienen 100 µg/ml de ampicilina y 25 Dg/ml de canamicina. Se utilizan varias colonias para inocular 4 ml de medio líquido 2x YT (que contiene además MgCI2 10 mM) y se incuba a 5 37°C durante 16 horas. Estos cultivos de 4 ml subsecuentemente se utilizan para inocular 400 ml del mismo medio. Las células se hacen crecer a 30°C en un agitador en baño de agua (250 rpm). Después de 3-4 horas, las células alcanzan una densidad óptica de 0.7 (DOßoopm) y se inducen por la adición de IPTG 200 µM. Las células 10 se incuban durante 1.5 horas adicionales antes de cosecharse. • Se confirma la expresión de las proteínas recombinantes por SDS-PAGE comparando las muestras de proteína tomadas en el momento de inducción y 1.5 horas después. En los extractos de células crudos de BL21/pgsp/pasp- 15 leu-Hisß y BL21 /pgsp/pasp-phe-Hisß se confirma la expresión de una proteína inducible de aproximadamente 180 kDa. A partir de los extractos de célula cruda de y BL21 pgsp/pasp-phe-TE-HiSß se • puede mostrar la expresión de una proteína inducible de aproximadamente 200 kDa. 20 A partir de cultivos que expresan las proteínas recombinantes correctas, se preparan concentrados en glicerol y se almacenan a -80°C.

Purificación de las proteínas recombinantes Asp-Leu- HÍSR. Asp-Leu-HÍSR v Asp-Phe-TE-Hiss.. Cultivos de 800 ml de y BL2Mpgsp/pasp-phe-Hisß BL2Mpgsp/pasp-phe-His6 y B 2Mpgsp/pasp-phe-TE-Hisß se tratan como se describen en • 5 "expresión de las péptido sintetasas..." y se centrifugan a 5000 rpm durante 5 minutos y se resuspenden en 30 ml/l de cultivo en amortiguador A (HEPES 50 mM, NaCI 300 mM, pH 8.0). Las suspensiones celulares se utilizan directamente o se almacenan a - 20°C hasta su uso. Se establece la lisis celular utilizando dos 10 pasajes en prensa French a una presión de trabajo de 12000 psi.

• Directamente después de la lisis celular se agrega PMSF a una concentración final de 1 mM. Después de centrifugación de los lisados de células a 10,000 rpm durante 30 minutos, el sobrenadante se combina con 1 % (v/v) de amortiguador 15 B (HEPES 50 mM, NaCI 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8.0). Las soluciones de proteína se aplican en una columna de Ni2+-NTA- agarosa (Qiagen, D-Hilden) equilibrada previamente con 1 % (v/v) de amortiguador B. La velocidad de flujo es de 0.75 ml/min. Después las proteínas que no están etiquetadas con Hisß se hacen pasar a 20 través de la columna, y se lavan con 1 % de amortiguador B durante otros 10 min antes de que se aplique un gradiente lineal (30 min a 30% de B, 10 min adicionales a 100% de B). La totalidad de las tres proteínas eluyen a una concentración de aproximadamente 5% de amortiguador B (imidazol 15 mM) y se recolectan como fracciones de 2 ml. Las fracciones que contienen las proteínas recombinantes se detectan utilizando el reactivo Bradford, por • 5 absorción a 595 nm. Estas fracciones se acumulan y dializan contra un amortiguador que contiene HEPES 50 mM, NaCI 100 mM, MgC 10 mM y DTE 5 mM durante 16 horas. Después de dialización se determina nuevamente las concentraciones de proteína. Hasta el uso posterior, las proteínas se almacenan a 10 -20°C después de adición de glicerol a 10% (v/v). • A partir de 1 I de cultivo se pueden obtener aproximadamente 5 mg de cada proteína recombinante pura. Se estima el grado de purificación el cual es de 95%, por SDS-PAGE. Análisis de actividad enzimática 15 Reacción de intercambio A TPP-PPÜ La especificidad de activación de aminoácido se determina indirectamente por incorporación de 32PP¡ marcado en ATP durante la reacción inversa » (Lee, S.G. & Lipmann, F.; Tyrocidine synthetase system; Methods Enzymol. 43, 1975, p.585-602). Para este propósito, se incuban 20 20 pmol de cada enzima con 1 mM de aminoácido, ATP 1 mM, PP¡ 0.1 mM, HEPES 50 mM, NaCI 100 mM y MgCI2 10 mM y 32PP¡ 2 mCi a 37°C en un volumen total de 100 µl. Las reacciones se suspenden después de 10 min al agregar 500 µl de una solución que contiene NaPPi 100 mM, ácido perclórico 560 mM y 1 ,2% (p/v) de carbón activado. La mezcla se centrífuga a 13,000 rpm durante 1 min. El sedimento se lava y resuspende dos veces con 1 ml de H20. La incorporación de ATP etiquetado (adsorbido al carbón activado) se detecta al medir la radioactividad del precipitado. Se demuestra que Asp-Leu-Hisß activa Asp y leu exclusivamente. Los valores de KM para Asp y ATP se determinan que son de 3.5 mM y 0.9 mM, respectivamente. Los valores KM para Leu y ATP se detecta que son 0.3 mM y 0.6 mM, respectivamente. Se demuestra que Asp-Phe-His6 y Asp-Phe-TE-His6 activan tanto Phe como Asp. El valor de KM para Phe se determina que es de aproximadamente 50 µM. Se encuentra que los patrones de activación de aminoácidos de Asp-Phe-His6 y Has-Phe-TE-Hisß son idénticos. Unión covalente de aminoácidos a la Asp-Phe-dioéotido sintetasa .La cuantificación de la formación de holo enzima se determina al medir la cantidad de Asp etiquetado.Leu y Phe que puede unirse covalentemente a un equivalente de proteínas purificadas Asp-Leu-Hisß, Asp-Phe-Hisß y Has-Phe-TE-Hisß. (Lee, S.G.; véase antes). Se incuban 50 pmol de cada enzima con ATP 2 mM, HEPES 50 mM, NaCI 100 mM, MgCI2 10 mM y 100 pmol de aminoácido marcado con 14C (Asp y Leu o Asp y Phe, respectivamente) a 37°C. Después de 30 min, la reacción se suspende por la adición de 1 ml de TCA 10% y 5 mg/ml de BSA y subsecuentemente se almacena a 0°C durante otros 30 min. Los precipitados de proteína se recolectan por centrifugación (30 min a • 5 13,000 rpm) y se lavan dos veces con TCA 10%. Los precipitados lavados se disuelven en ácido perfórmico 50% y se utilizan para medir la incorporación de aminoácido marcado. Se puede marcar Asp-Leu-Hisß con Asp y Leu en un grado de aproximadamente 20-25%. Se pueden marcar Asp-Phe- 10 His6 y Asp-Phe-TE-Hisß con Asp en un grado de únicamente 10- • 15%. La incorporación de Phe alcanza una concentración de aproximadamente 50%. Prueba indirecta de formación de los dipéptidos Asp-Leu v Asp-Phe: La unión covalente de los aminoácidos constituyentes 15 para las dipéptido sintetasas se muestra por experimentos cinéticos utilizando Asp marcado radioactivamente. En un primer ensayo, se incuba Asp-Leu-His6 0.85 µM con ATP 2 mM, Asp 2.8 µM (1 C, 56 * nCi) en un amortiguador (HEPES 50 mM, MgCI2 10 mM, NaCI 100 mM, pH 8.0). a 37°C. A intervalos de tiempo regulares las muestras 20 se toman y se tratan según se indica en los párrafos previos; se mide la radioactiva (de Asp unida covalentemente a la enzima) en cada muestra. Después de 4 minutos, la cantidad de Asp marcada incorporada comienza a nivelarse hasta alcanzar un máximo algunos minutos después si no se ha agregado un segundo aminoácido. Sin embargo, si se agrega Leu 1.5 µM después de 4 minutos, se observa un incremento adicional fuerte, aunque temporal, de radioactividad, el cual disminuye de manera súbita • 5 después de aproximadamente 5 minutos a un nivel por debajo del máximo observado cuando no se agrega un segundo aminoácido. En otro experimento, se incuba Asp-Phe-Hisß 0.5 µM de la misma manera que Asp-Leu-Hisß anterior. En este caso, la adición de Phe 0.1 mM después de aproximadamente 5 minutos 10 resulta en un incremento temporal similar de Asp radioactivo unido • covalentemente, como se describe en lo anterior. Sin embargo, la adición de Leu en vez de Phe no lleva a tal incremento temporal. Esto muestra claramente que la formación de unión peptídica se lleva a cabo en cada una de estas péptido sintetasas. 15 Además, los resultados muestran que los péptidos formados en las péptido sintetasas se liberan de las mismas. Prueba directa de formación del dipéptido Asp-Phe: La * formación del dipéptido Asp-Phe se demuestra por una serie de experimentos, utilizando diferentes técnicas analíticas, 20 específicamente cromatografía en capa delgada CCD) con detección radioactiva, cromatografía líquida de alta resolución y espectroscopia de masas.

En un primer conjunto de experimentos (método para determinar Asp-Phe liberado de la dipéptido sintetasa (100 pmoles de Asp-Phe-Hisß se incuban en un volumen total de 200 µl con 1 mM de ATP, Phe 1 mM y Asp marcado 14C 1.25 µM en un amortiguador 5 (HEPES 50 mM, MgCI2 20 mM, pH 8) durante 6 horas a 37°C. Los experimentos control llevados a cabo se realizan omitiendo uno de ATP, Phe o enzima. En un conjunto análogo adicional de experimentos, la misma cantidad de enzima se incuba bajo condiciones idénticas con 10 Asp 1 mM y Phe marcado 14C 1.25 µM (en vez de Phe y Asp • marcado con 14C). Además, se llevan a cabo también los blancos apropiados. Para terminar las reacciones, se agregan 100 µl de n- butanol para precipitar la enzima la cual después se remueve. Las 15 soluciones transparentes remanentes se evaporan y se reabastecen hasta un volumen de 20 µl con 10 vol% de metanol en agua. Un volumen apropiado de cada una de estas muestras se aplica a una * placa de CCD de sílice, la cual después se revela utilizando una solución de butanol/ácido acético/acetato de etilo/agua 1 : 1 :1 :1 20 (v/v/v/v) como el eluyente. Después de elusión, la placa se seca y se coloca una película de rayos X en la parte superior de la misma durante 2 a 5 días para exposición. Finalmente, la película se procesa para mostrar puntos de compuestos marcados radioactivamente. Únicamente si están presentes Asp, Phe, ATP y la enzima en la mezcla de reacción, se puede detectar un punto que • 5 tenga el mismo factor de retención (Rf) que Asp-Phe. En un segundo conjunto de experimentos (métodos para determinar la dipéptido sintetasa que une Asp-Phe), se incuba 1 nmol de Asp-Phe-Hisß en un volumen total de 600 µl con 1 mM de ATP, Asp 1 mM y Phe marcado con 14C 1 µM en un amortiguador 10 (HEPES 50 mM, MgCI2 20 mM, pH 8) a 37°C. • Las reacciones se detienen después de 10, 20 y 30 minutos, respectivamente, por la adición de 300 µl de ácido tricloroacético acuoso (TCA) 20%, (peso) y las mezclas se enfrían a 4°C. Todas las etapas adicionales se llevan a cabo a 4°C. 15 La proteína precipitada se recolecta por centrifugación, se lava una vez con 500 µl de TCA acuoso 10% y después con 1 ml de una mezcla 3: 1 (v/v) de éter dietílico y etanol, y finalmente con 1 ml de éter dietílico. Después, el sedimento se seca durante 15 minutos a 37°C, antes de resuspenderse en 200 µl de 100 mM de 20 una solución acuosa de hidróxido de potasio bajo agitación vigorosa. La mezcla después se trata durante 0.5 horas a 70°C para liberar cualquier dipéptido unido a tioéster de la enzima. Para separar la forma de dipéptido liberada de la proteína, la solución se vuelve a reabastecer hasta 1 ml con metanol. Esta solución se centrífuga durante 30 minutos a 4°C y el sobrenadante se evapora in vacuo durante 3 horas a temperatura ambiente. El sedimento que se obtiene finalmente se resuspende en 25 µl de metanol acuoso • 5 10%. El análisis después se realiza por CCD con detección radioactiva como se describe en el conjunto previo de experimentos. Se puede observar un punto claro del dipéptido Asp-Phe en cada una de las tres muestras. La intensidad de estos puntos se 10 incrementa notablemente para las muestras tomadas a los 10, 20 y • 30 minutos, respectivamente. Esto muestra que la formación del dipéptido Asp-Phe en realidad se lleva a cabo en la dipéptido sintetasa. En un experimento final, se confirma también la 15 formación de Asp-Phe al comparar los tiempos de retención de CLAR y los espectros de masa del dipéptido que se forma. En un volumen total de 200 µl se incuban 50 pmol de Asp-Phe-TE-Hisß con # 1 mM de ATP, 1 mM de Asp y 0.5 mM de Phe en un amortiguador (HEPES 50 mM, MgCI2 20 mM, pH 8) durante 6 horas a 37°C. Para 20 terminar las reacciones, se agregan 100 µl de n-butanol para que precipite la enzima la cual después se remueve. La solución transparente remanente después se evapora in vacuo durante 3 horas y se reabastece hasta un volumen de 20 µl con 10 vol% de metanol en agua. Para un análisis adicional, este volumen se diluye 10x (nuevamente con 10 vol% de metanol en agua) y las porciones del mismo después se someten a CLAR seguido por detección fotométrica (como se muestra después) y a análisis de LC-MS por ionización de electroaspersión. Las muestras de referencia de Asp-Phe sintetizadas químicamente se utilizan para comparación. Para la CLAR con detección fotométrica se inyecta una porción de 50 µl de la muestra diluida 10x en una columna Criromsep Inertsil 5 ODS-3 (250 x 3 mm; tamaño de partícula, . 5 µ). Se utilizan los eluyentes A (amortiguador de H3BO3 acuoso 0.05 M, pH = 3.0) y B (acetonitrilo; Merck, grado CLAR) en un gradiente (t = 0 min: 98% de A, 2% de B, t = 35 min; 10% de A, 90% de B) y un flujo de 1.2 ml/min, a 40°C. La detección se realiza fotométricamente (a 210 nm y 257 nm, con cuantificación a 210 nm). En el cromatograma de CLAR resultante para la muestra experimental se encuentra un pico a los 6.59 minutos el cual está exactamente en el mismo tiempo de retención que para el compuesto de referencia Asp-Phe. Además, el espectro UV registrado para el pico Asp-Phe a partir de la muestra se observa idéntico (respecto a la extinción versus longitud de onda en la región de 200 a 380 nm) a uno registrado para un compuesto de referencia de Asp-Phe. La cantidad de Asp-Phe en la muestra se calcula que es de 16.1 mg/l. Para el análisis por LC-MS de ionización por • 5 electroaspersión, se inyecta en la columna una porción de 4 µl de la muestra experimental diluida 10x (véase antes). Se utiliza una columna Nucleosil 120-3 C18 de fase inversa (Macherey & Nagel, 250 x 4 mm). Los eluyentes son eluyente A (semi-agua que contiene 0.05% de ácido fórmico) y B (metanol grado CLAR que contiene 10 0.05% de ácido fórmico). Se utiliza un gradiente de eluyentes A y B • como sigue: t = 0; 10% de B; t = 25 min; 60% de B; t = 30 min; 100% de B; t = 34 min: 100% de B como un flujo de 0.4 ml/min a temperatura ambiente. La detección se realiza por corriente iónica total (TIC) utilizando ionización de electroaspersión en el modo de 15 ion positivo como técnica de ionización. El intervalo de exploración es de 120-300 amu con un tiempo de residencia de 1 mseg. El tiempo de retención para Asp-Phe es de 23.7 minutos (tanto para la •• muestra como para el compuesto de referencia). La espectroscopia de masas confirma el mismo peso molecular (280 g/mol) para Asp- 20 Phe de la muestra y el compuesto de referencia, y también se observan patrones de fragmentación idénticos. De acuerdo con esta técnica, la cantidad de Asp-Phe en la muestra se calcula que es aproximadamente 20 mg/l.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Holland Sweetener Company V.O.F. 5 <120> Método de producción microbiológica de a-L-aspartil-L- fenilalanina <130> 4024ep 10 <140> 99203518.8 • <141> 1999-10-27 <160> 47 15 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 » <211 > 6 <212> PRT 20 <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 1 5 Leu Thr Tyr Xaa Glu Leu 1 5 <210> 2 <21 1 > 6 10 <212> PRT • <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de 15 consenso <400> 2 ^p Leu Ser Tyr Xaa Glu Leu 1 5 20 <210> <21 1 > 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 3 Leu Lys Ala Gly Xaa Ala Tyr Leu Val Pro Leu Asp 1 5 10 <210> <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 4 Leu Lys Ala Gly Xaa Ala Tyr Leu Leu Pro Leu Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial • 5 <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso 10 <400> 5 • Leu Lys Ala Gly Xaa Ala Tyr Leu Val Pro Me Asp 1 5 10 <210> 6 15 <21 1 > 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial » <220> 20 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 6 Leu Lys Ala Gly Xaa Ala Tyr Leu Leu Pro Me Asp 1 5 10 <210> 7 • 5 <21 1 > 16 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 7 Leu Ala Tyr Xaa Xaa Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Xaa Pro Lys Gly 15 1 5 10 15 <210> 8 » <21 1 > 16 <212> PRT 20 <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 8 • 5 Leu Ala Tyr Xaa Xaa Tyr Thr Ser Gly Thr Thr Gly Xaa Pro Lys Gly 1 5 10 15 <210> 9 <21 1 > 4 10 <212> PRT • <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de 15 consenso <400> 9 Phe Asp Xaa Ser 1 20 <210> 10 <21 1 > <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de 5 consenso <400> 10 Asn Xaa Tyr Gly Pro Thr Glu 1 5 10 • <210> 1 1 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia artificial 15 <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de » consenso 20 <400> 1 1 Gly Glu Leu Xaa He Xaa Gly Xaa Gly Val Ala Arg Gly Tyr Leu 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Secuencia artificial • 5 <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso 10 <400> 12 • Gly Glu Leu Xaa Me Xaa Gly Xaa Gly Leu Ala Arg Gly Tyr Leu 1 5 10 15 <210> 13 15 <21 1 > 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial • <220> 20 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 13 Tyr Arg Thr Gly Asp Leu 1 5 <210> 14 • 5 <21 1 > 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de • consenso <400> 14 Tyr Lys Thr Gly Asp Leu 15 1 5 <210> 15 * <21 1 > 20 <212> PRT 20 <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 15 • 5 Gly Arg Xaa Asp Xaa Gln Val Lys He Arg Gly Xaa Arg He Glu Leu 1 5 10 15 Gly Glu Me Glu 20 10 • <210> 16 <21 1 > 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial 15 <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de • consenso 20 <400> 16 Leu Pro Xaa Tyr Met Me Pro 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia artificial • <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso 10 <400> 1 7 • Leu Pro Xaa Tyr Met Val Pro <210> 18 15 <21 1 > 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial • <220> 20 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 18 Asn Gly Lys Val Asp Arg 1 5 <210> 19 5 <21 1 > 6 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de • consenso <400> 19 Asn Gly Lys Leu Asp Arg 15 1 5 <210> 20 » <21 1 > 12 <212> PRT 20 <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso <400> 20 • 5 Asp Xaa Phe Phe Xaa Xaa Leu Gly Gly His Ser Leu 1 5 10 <210> 21 10 <21 1 > 12 • <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> 15 <223> Descripción de la secuencia artificial: Secuencia de consenso # 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Claims (25)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN
2. REIVINDICACIONES • 5 1. Un método para la producción microbiológica de a- L-aspartil-L-fenilalanina (Asp-Phe) a partir de los sustratos ácido L- aspártico (L-Asp) y L-fenilalanina (L-Phe), caracterizado porque los sustratos se ponen en contacto, en presencia de una cantidad efectiva de adenosina-trifosfato (ATP), con una dipéptido sintetasa 10 no ribosómica que comprende dos módulos mínimos conectados por • un dominio de condensación en donde el módulo N-terminal de estos módulos reconoce al ácido L-aspártico y el módulo C terminal de estos módulos reconoce la L-fenilalanina y se une covalentemente en su extremo N-terminal al dominio de 15 condensación, y en donde cada uno de estos módulos mínimos está constituido de un dominio de adenilación y un cofactor 4'- fosfopanteteinilo que contiene un dominio de tiolación y la a-L- • aspartil-L-fenilalanina (Asp-Phe) formada se recupera. 2. El método para la producción de Asp-Phe, de 20 conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el dominio de condensación en la dipéptido sintetasa se conecta a ambos módulos mínimos de manera tal que también se puede unir covalentemente al módulo que reconoce ácido L-aspártico.
3. 3. El método para la producción de Asp-Phe, de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque además está presente un factor de liberación similar a tioesterasa para la Asp-Phe formada en la dipéptido sintetasa. • 5
4. 4. El método para la producción de Asp-Phe, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque el factor de liberación similar a tioesterasa forma un dominio integrado de la dipéptido sintetasa en la parte C terminal de la misma. 10
5. 5. El método para la producción de Asp-Phe, de • conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque también está presente una proteína no integrada con actividad similar a tioesterasa tipo II, junto con la dipéptido sintetasa. 15
6. 6. El método para la producción de Asp-Phe, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la dipéptido sintetasa está presente » en material celular vivo de un microorganismo, y en donde se alimentan al fermentador glucosa, L-Asp y/o L-Phe, y se recupera 20 Asp-Phe formado.
7. 7. El método para la producción de Asp-Phe, de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el microorganismo se hace crecer primero en un fermentador para alcanzar una densidad celular determinada previamente, antes de que se active la expresión de la Asp-Phe dipéptido sintetasa y se inicie la alimentación de glucosa, L-Asp y/o L-Phe para la síntesis del dipéptido Asp-Phe. • 5
8. 8. El método para la producción de Asp-Phe, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el microorganismo es un microorganismo productor de L-fenilalanina y se suministra como alimentación únicamente glucosa y L-Asp.
9. 9. El método para la producción de Asp-Phe, de 10 conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el • microorganismo es una especie de Escherichia o Bacillus.
10. 10. El método para la producción de Asp-Phe, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado además porque el microorganismo utilizado es una 15 cepa con actividad reducida de proteasa para Asp-Phe o que carece de tal actividad hacia Asp-Phe.
11. 11. El método para la producción de Asp-Phe, de • conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque la producción de Asp-Phe se lleva a 20 cabo in vitro en un reactor de enzima, mientras se suministra ATP, y se alimenta L-Asp y/o L-Phe, y se recupera la Asp-Phe formada.
12. 12. El método para la producción de Asp-Phe, de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el suministro de ATP se proporciona en parte por un sistema de regeneración de ATP in situ.
13. 13. El método para la producción de Asp-Phe, de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque 5 el sistema regenerador de ATP está presente en un microorganismo permeabilizado.
14. 14. Un fragmento de ADN o una combinación de fragmentos de ADN que codifican para una Asp-Phe dipéptido sintetasa no ribosómica, sintetasa la cual comprende dos módulos 10 mínimos conectados por un dominio de condensación en donde el • módulo N-terminal de estos módulos reconoce al ácido L-aspártico y el módulo C terminal de estos módulos reconoce la L-fenilalanina y se une covalentemente en su extremo N-terminal al dominio de condensación, y en donde cada uno de estos módulos mínimos está
15. 15 constituido de un dominio de adenilación y un dominio de tiolación que contiene cofactor 4'-fosfopanteteinilo. 15. El fragmento de ADN que codifica para una Asp- • Phe dipéptido sintetasa, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el dominio de condensación en la 20 dipéptido sintetasa codificada se conecta a ambos módulos mínimos de manera tal que también se une covalentemente al módulo que reconoce ácido L-aspártico.
16. 16. El fragmento de ADN, de conformidad con la reivindicación 14 o 15, o una combinación de fragmentos de ADN, de conformidad con la reivindicación 14, caracterizados además porque el fragmento de ADN o la combinación de fragmentos de 5 ADN que codifican para la dipéptido sintetasa también codifican para un factor de liberación similar a tioesterasa para la Asp-Phe formada en esa dipéptido sintetasa.
17. 17. Un fragmento de ADN o una combinación de fragmentos de ADN, de conformidad con la reivindicación 16, 10 caracterizados además porque el factor de liberación similar a • tioesterasa forma un dominio integrado de la dipéptido sintetasa en la parte C terminal del mismo.
18. 18. El fragmento de ADN, o una combinación de fragmentos de ADN, de conformidad con cualquiera de las 15 reivindicaciones 14 a 17, caracterizados además porque también codifican para una proteína no integrada con actividad similar a tioesterasa tipo II. *
19. 19. Un microorganismo recombinante, caracterizado porque contiene un fragmento de ADN o una combinación de 20 fragmentos de ADN, como se reclaman en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18.
20. 20. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el microorganismo es capaz de producir L-Asp y/o L-Phe.
21. 21. El microorganismo de conformidad con la • 5 reivindicación 20, caracterizado además porque el microorganismo es una Escherichia coli o una especie de Bacillus.
22. 22. Una Asp-Phe dipéptido sintetasa, caracterizada porque comprende dos módulos mínimos conectados por un dominio de condensación en donde el módulo N-terminal de estos módulos 10 reconoce al ácido L-aspártico y el módulo C terminal de estos • módulos reconoce la L-fenilalanina y se une covalentemente en su extremo N-terminal al dominio de condensación, y en donde cada uno de estos módulos mínimos está constituido de un dominio de adenilación y un cofactor 4'-fosfopanteteinilo que contiene un 15 dominio de tiolación.
23. 23. La Asp-Phe dipéptido sintetasa, de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada además porque el dominio de condensación en la dipéptido sintetasa se conecta a ambos módulos mínimos de manera tal que también se une covalentemente al 20 módulo que reconoce ácido L-aspártico.
24. 24. La Asp-Phe dipéptido sintetasa, de conformidad con la reivindicación 22 o 23, caracterizada además porque la dipéptido sintetasa también comprende un factor de liberación similar a tioesterasa para la Asp-Phe formada sobre esa dipéptido sintetasa.
25. 25. La Asp-Phe dipéptido sintetasa, de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el factor de ^F 5 liberación similar a tioesterasa forma un dominio integrado de la dipéptido sintetasa en su parte C terminal. •