MXPA01009514A - Antagonistas recombinantes de interleucina-18 utiles en el tratamiento de trastornos mediados por interleucina-18 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a mAbs, de IL-18 quiméricos, humanizados y otros, derivados de mAbs neutralizantes de alta afinidad, composiciones farmacéuticas que los contienen, métodos de tratamiento y diagnósticos.

Description

ANTAGONISTAS RECOMBIN ANTES DE INTERLEUCINA-18 ÚTILES EN EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS MEDIADOS POR INTERLEUCINA- 18 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente al campo de anticuerpos y anticuerpos alterados, útiles en el tratamiento y diagnóstico de condiciones mediadas por IL-18, y más específicamente para mAbs, Fabs, anticuerpos humanizados y quiméricos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La interleucina-18 de humano es una citosina recientemente identificada que se sintetiza como una proteína precursora de 193 aminoácidos biológicamente inactiva (Ushio et al., J. Immunol. 156: 4274, 1996). La escisión de la proteína precursora, por ejemplo, para caspasa-1 o capasa-4, libera la proteína madura de 156 aminoácidos (Gu et al., Science 275: 206, 1997; Ghayur et al., Nature 386: 619, 1997), que exhibe actividades biológicas que incluyen la coestimulación de la proliferación de células T, el mejoramiento de citotoxicidad de las células NK, la inducción de producción de IFN-? por células T y células NK, y la potenciación de la diferenciación de célula T ayudadora de tipo 1 (Th1 ) (Okamura et al., Nature 378:88, 1995; Ushio et al., J. Immunol. 156: 4274, 1996; Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26:1647, 1996; Kohno et al., J. Immunol. 158:1541 , 1997; Zhang et al., Infect. Immunol. 65:3594, 1997; Robinson et al., Immunitv 7:571 , 1997). Además, IL- 18 es un inductor eficaz de mediadores proinflamatorios de monocito de humano, incluyendo IL-8, factor de necrosis tumoral -a (TNF-a), y prostaglandina E2 (PGE2) (Ushio, S. et al., J. Immunol. 156:4274-4279, 1996; Puren, A.J. et al., J. Clin. Invest. 10:711-721 , 1997; Podolin et al.. J. Immunol. submitted, 1999). La proteína relacionada con el receptor IL-1 clonada anteriormente (IL-1 Rrp) (Parnet et al., J. Biol. Chem. 271 :3967, 1996) se identificó recientemente como una subunidad del receptor de IL-18 (Kd=18 nM) (Torigoe et al., J. Biol. Chem. 272:25737, 1997). Una segunda subunidad del receptor de IL-18 exhibe homología a la proteína accesoria del receptor de IL-1 , que ha sido nombrada AcPL (por semejante a proteína accesoria). Se requiere la expresión de ambas IL-1Rrp y AcPL para la activación de NF-?B y JNK inducida por IL-18 (Born et al., J. Biol. Chem. 273:29445, 1998). Además para señales de NF-?B y JNK, IL-18 a través de cinasa asociada al receptor de IL-1 (IRAK), p56lck (LCK), y proteincinasa activada por mitógeno MAPK (Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26:1647,1996; Matsumoto et al., Biophvs Biochem. Res. Comm. 234:454, 1997; Tsuji-Takayama et al., Biochem. Biophvs. Res. Comm. 237:126. 1997). Las células Th1 , que producen citosinas proinflamatorias tales como IFN-?, IL-2 y TNF-ß (Mosmann et al., J. Immunol. 136:2348, 1986), han estado implicadas en la mediación de muchas enfermedades autoinmunes, incluyendo esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide (RA), diabetes o tipo 1 insulinodependiente (IDDM), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), y psoriasis (Mosmann and Sad, Immunol. Today 17: 138, 1996). Así, el antagonismo de la citosina promotora de Th1 tal como IL-18 se esperará que inhiba el desarrollo de la enfermedad. MAbs específico de IL-18 puede utilizarse como un antagonista. Se ha demostrado la función del IL-18 en el desarrollo de las enfermedades autoinmunes. Por consiguiente, se ha demostrado que la expresión de IL-18 se ha incrementado significativamente en el páncreas y bazo del ratón diabético no obeso (NOD) inmediatamente antes del inicio de la enfermedad (Rothe et al., J. Clin. Invest. 99:469. 1997). De manera similar, los niveles de IL-18 han mostrado ser notoriamente elevados en el fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide. (Kawashima et al., Arthritis and Rheumatism 39:598, 1996). Además, se ha demostrado que la administración de IL-18 incrementa la severidad clínica de la encefalomielitis alérgica experimental de murino (EAE), una enfermedad autoinmune mediada por Th1 que es un modelo para la esclerosis múltiple. Además, se ha mostrado que neutralizar el antisuero de IL-18 anti rata previene el desarrollo de EAE en ratas hembra Lewis (Wildbaum et al., J. Immunol. 161 :6368, 1998). Por consiguiente, la IL-18 es un objetivo deseable para el desarrollo de un terapéutico novel para autoinmunidad.

Taniguchi et al., J. Immunol. Methods 206:107, describe seis mAbs de rata y siete mAbs de murino de anti IL-18 de humano, que se unen a cuatro sitios antigénicos distintos. Uno de los mAbs (#125-21-1), de murino y seis mAbs de rata inhiben la producción de IFN-? inducida por IL-18 por las células KG-1 , con el mAbs de rata exhibiendo actividades neutralizantes 10 veces menos que #125-2H. Como se demostró por medio del análisis Western blot, tres de los mAbs de murino, pero ninguno de los mAbs de rata, son fuertemente reactivos con la IL-18 de humano unida a la membrana. Además, se describe un ensayo inmunoabsorbente unido a la enzima (ELISA) para detectar IL-18 de humano, utilizando #125-2H y un mAbs de rata. El límite de la detección de este ELISA es 10 pg/ml. La solicitud de patente europea EP 0 712 931 describe dos mAbs de IL-18, H1 (lgG1 ) y H2 (IgM). Como se demostró por el análisis Western blot, ambos mAbs reaccionan con IL-18 de humano unida a la membrana, pero no con IL-12 de humano unida a la membrana. H1 se utiliza en un protocolo de cromatografía de inmunoafinidad para purificar IL-18 de humano, y en un ELISA para medir IL-18 de humano. H2 se utiliza en el radioinmunoensayo para medir IL-18 de humano. Neutralizar los anticuerpos de IL-18 puede ser potencialmente útil en el alivio de enfermedades autoinmunes y síntomas relacionados en el hombre. Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un antagonista de IL-18 de alta afinidad, tal como un anticuerpo monoclonal neutralizante para la interleucina-18 de humano que reduciría la proliferación y la diferenciación de Th1 y de esta manera enfermedades autoinmunes y síntomas relacionados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención provee anticuerpos monoclonales neutralizantes de roedores (por ejemplo rata y murino) específicos para interleucina-18 de humano y que tiene una afinidad de unión caracterizada por una constante de disociación igual o menor a aproximadamente 3.9 x 10"11M como se describe en la descripción detallada. Ejemplos de dichos anticuerpos monoclonales son los anticuerpos monoclonales de rata 2C10 y los anticuerpos monoclonales de rata y murino tal como 14B7 y 13G9. En otro aspecto de la invención son hibridomas tales como 19522C10(2)F2(1 )A1 , 195214B7(1 )H10 y 187413G9(3)F12. En un aspecto relacionado, la presente invención provee fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 neutralizantes de los mismos específicos para interleucina-18 de humano producida por la deleción de la región Fc de los anticuerpos monoclonales neutralizantes de roedor en la presente invención. En otro aspecto relacionado, la presente invención provee un anticuerpo alterado específico para interleucina-18 de humano que comprende regiones determinantes complementarias (CDRs) derivadas de un anticuerpo monoclonal neutralizante no humano (mAb) caracterizado por una constante de disociación igual o menor a aproximadamente 3.9 x 10"11M para interleucina-18 de humano y moléculas de ácido nucleico que codifican la misma. Cuando el anticuerpo alterado es un anticuerpo humanizado, las secuencias que codifican las regiones determinantes complementarias (CDRs) de una inmunoglobulina no humana se insertan en una primera porción de inmunoglobulina en la que al menos una, y de preferencia todas las regiones determinantes complementarias (CDRs) de la primera porción de inmunoglobulina se reemplazan por CDRs de un anticuerpo monoclonal no humano. De preferencia la primera porción de inmunoglobulina también se enlaza operativamente con una segunda porción de inmunoglobulina que comprende toda o una parte de la cadena constante de inmunoglobulina. En un aspecto relacionado, la presente invención provee CDRs derivas de anticuerpos monoclonales neutralizantes no humanos (mAbs) caracterizadas por una constante de disociación igual o menos a aproximadamente 3.9 x 10"11M para interleucina-18 de humano, y moléculas de ácido nucleico que codifican dichas CDRs. En otro aspecto más, se provee un anticuerpo quimérico que contiene regiones constantes de la cadena ligera y pesada de humano y regiones variables de la cadena ligera y pesada de anticuerpos monoclonales neutralizantes no humanos caracterizadas por una constante de disociación igual o menor a aproximadamente 3.9 x 10"11M para interleucina-18 de humano.

En otro aspecto más, la presente invención provee una composición farmacéutica que contiene uno (o más), de los anticuerpos alterados descritos anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, la presente invención provee un método para tratar condiciones en humanos asociados con el exceso de producción de Th1 , por ejemplo, enfermedades autoinmunes, administrando a dicho humano una cantidad efectiva de la composición farmacéuticamente de la invención. En otro aspecto más, la presente invención provee métodos para, y componentes útiles en, la producción recombinante de anticuerpos alterados (anticuerpos diseñados, fragmentos CDRs, Fab o F(ab)2 o análogos de los mismos) que se derivan de anticuerpos monoclonales neutralizantes no humanos (mAbs) caracterizada por una constante de disociación igual o menor a 3.9 x 10"11M para IL-18 de humano. Estos componentes incluyen secuencias de ácido nucleico aisladas que se codifican igual, plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico bajo el control de secuencias regulatorias seleccionadas que son capaces de dirigir la expresión de los mismos en células hospederas (de preferencia de mamíferos) transfectadas con los plásmidos recombinantes. El método de producción involucra el cultivo de una línea de célula hospedera transfectada de la presente invención bajo condiciones de tal forma que el anticuerpo alterado, de preferencia un anticuerpo humanizado, se exprese en dichas células y aisle el producto expresado en las mismas.

En otro aspecto de la invención existe un método para diagnosticar condiciones asociadas con el exceso de producción de Th1 en un humano que comprende obtener una muestra de fluido biológico de un paciente y permitir que los anticuerpos y anticuerpos alterados de la presente invención entren en contacto con dicha muestra bajo condiciones tales como un complejo de IL-18/anticuerpo (monoclonal o alterado) que se forma y detecta la presencia o ausencia de dicho complejo de IL-18/anticuerpo. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describirán además en la descripción detallada y las modalidades preferidas de la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 [SEQ ID NOS: 1 y 2] ilustra la región variable de la cadena ligera para el anticuerpo de rata 2C10. La figura 1 incluye los datos de la secuencia para ambas hebras. Las áreas encerradas indican las CDR's [SEQ ID NOS: 3-8]. El área resaltada indica la secuencia del iniciador degenerado. La figura 2 [SEQ ID NOS: 9 y 10] ilustra la región variable de la cadena pesada para el anticuerpo de rata 2C10. La figura 2 incluye datos de la secuencia para ambas hebras. Las áreas encerradas indican la CDR's [SEQ ID NOS: 11-16]. El área resaltada indica la secuencia del iniciador degenerado.

La figura 3 [SEQ ID NOS: 17 y 18] ilustra la región variable de la cadena ligera para anticuerpo de murino 13G9. La figura 3 incluye los datos de secuencia para ambas hebras. Las áreas encerradas indican la CDR's [SEQ ID NOS: 19-24]. El área resaltada indica la secuencia del iniciador degenerado. La figura 4 [SEQ ID NOS: 25 y 26] ilustra la región de variable de la cadena pesada para el anticuerpo de murino 13G9. La figura 4 incluye los datos de secuencia para ambas hebras. Las áreas encerradas indican la CDR's [SEQ ID NOS: 27-32]. El área resaltada indica la secuencia del iniciador degenerado. La figura 5 [SEQ ID NOS: 33 y 34] ilustra la región de variable de la cadena ligera para anticuerpos de rata 14B7. La figura 5 incluye los datos de secuencia para ambas hebras. Las áreas cerradas indican las CDR's [SEQ ID NOS: 35-40]. El área resaltada indica la secuencia del iniciador degenerado. La figura 6 [SEQ ID NOS: 41 y 42] ilustra la región de variable de la cadena pesada para anticuerpo de ratas 14B7. La figura 6 incluye datos para ambas hebras. Las áreas encerradas indican las CDR's [SEQ ID NOS: 43-48]. El área resaltada indica la secuencia del iniciador degenerado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee una variedad de anticuerpos, anticuerpos relacionados y fragmentos de los mismos, que se caracterizan por el carácter específico de la unión de IL-18 de humano, actividad neutralizante, y alta afinidad para IL-18 de humano como se ejemplificó en anticuerpos monoclonales de rata 2C10, anticuerpos monoclonales de murino 13G9 y anticuerpo monoclonal de rata 14B7. Los anticuerpos de la presente invención se prepararon por técnicas convencionales de hibridoma para generar nuevos anticuerpos neutralizantes. Estos productos son útiles en las composiciones terapéuticas y farmacéuticas para tratar trastornos mediados por IL-18, por ejemplo enfermedades autoinmunes, que incluyen esclerosis múltiple (MS), artritis reumatoide (RA), diabetes o tipo 1 insulinodependiente (IBD), enfermedad inflamatoria del intestino (Mosmann and Sad, Immunol. Today 17:138, 1996). Estos productos también son útiles en el diagnostico de las condiciones mediadas por IL-18 por la medición de (por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima ELISA)) de niveles de IL-18 de endógenos en humanos o ex vivo liberados por IL-18 de células activadas.

I. Definiciones "Anticuerpo alterado" se refiere a una proteína codificada por una región de codificación de inmunoglobulina alterada, que puede obtenerse por la expresión en una célula hospedera seleccionada. Dichos anticuerpos alterados son anticuerpos diseñados (por ejemplo anticuerpos humanizados o quiméricos) o fragmentos de anticuerpos sin toda la región o una parte de la región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, Fv, Fab, o F(ab)2 y similares. "Región codificadora de inmunoglobulina alterada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica anticuerpos alterados de la invención. Cuando el anticuerpo alterado es un anticuerpo humanizado o injertado-CDR, las secuencias que codifican las regiones determinantes complementarias (CDRs) de una inmunoglobulina no humana se insertan en una primera porción de inmunoglobulina que comprende una secuencia de marco variable humana. De manera opcional, la primera porción de inmunoglobulina se enlaza operativamente a una segunda porción de inmunoglobulina. "Primera porción de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un marco humano o una región variable de inmunoglobulina de humano en la que las regiones codificadoras de CDR o nativas (que ocurren naturalmente) se reemplazan por regiones codificadoras de CDR de un anticuerpo donador. La región variable de humano puede ser una cadena pesada de ¡nmunoglobulina, una cadena ligera, (o ambas cadenas), un análogo o fragmentos adicionales en la misma. Dichas regiones de CDR localizadas dentro de la región variable de anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden determinarse por los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., Departamento Estadounidense de Servicios Humanos y de Salud, Institutos Nacionales de Salud(1987)) describe las reglas para localizar CDRs. Además, se conocen programas de computadora que son útiles para identificar marcos/regiones de CDR. "Neutralizante" se refiere a un anticuerpo que inhibe la actividad de IL-18 para prevenir la unión de IL-18 de humano a su receptor específico o por inhibición de la señalización de IL-18 a través de su receptor, deberá ocurrir la unión. Un mAb se neutraliza si es 90% efectivo, de preferencia 95% efectivo y más preferiblemente 100% efectivo en la inhibición de actividad de IL-18 como se midió en la prueba de neutralización de IL-18, ver ejemplo 1 y cuadro 1. El término "alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una afinidad de unión caracterizada por Kd igual o menor a 3.9 x 10"11 M para IL-18 de humano como se determinó por el análisis de biosensor óptico (ver ejemplo 2 y cuadra l ). Por "carácter específico de unión para IL-18 de humano" significa una afinidad superior para IL-18 de humano que la afinidad para murino u otra IL-18. "Segunda porción de inmunoglobulina" se refiere a otra secuencia de nucleótido que codifica una proteína o péptido a la cual se fusiona la primera porción de inmunoglobulina en el marco o por medio de una secuencia enlazadora convencional opcional (es decir enlazado operativamente). De preferencia ésta es un gen de inmunoglobulina. La segunda porción de inmunoglobulina puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica toda la región constante para la misma (es decir homologa, el primero y segundo anticuerpos alterados se derivan del mismo origen) o un anticuerpo adicional de interés (es decir heterólogo). Este puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina o cadena ligera (o ambas cadenas como parte de un polipéptido individual). Las segundas porciones de inmunoglobulina no están limitadas a una clase o isótipo de inmunoglobulina en particular. Además, la segunda porción de inmunoglobulina puede comprender parte de una región constante de inmunoglobulina, tal como se encuentra en un Fab, o F(ab)2 (es decir una parte discreta de una región constante de humano apropiada o región de marco). Dicha segunda porción de inmunoglobulina también comprende una secuencia que codifica una proteína de membrana integral expuesta en la superficie externa de una célula hospedera, por ejemplo como parte de una genoteca de exhibición de fago, o una secuencia que codifica una proteína para detección de diagnóstico o analítica como por ejemplo peroxidasa de rábano, ß-galactosidasa, etc. Los términos Fv, Fc, Fd, Fab, o F(ab)2 se utilizan con sus significados estándar (ver por ejemplo Harlow et al., Antibodies A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1998)). Como se utiliza en la presente, un "anticuerpo diseñado" describe un tipo de anticuerpo alterado, es decir, un anticuerpo sintético de longitud total (por ejemplo un anticuerpo humanizado o quimérico opuesto a un fragmento de anticuerpo) en el que una porción de dominios variables de cadena ligera y/o pesada de una anticuerpo aceptor seleccionado se reemplaza por partes análogas de uno o más anticuerpos donadores que tienen un carácter específico para el epítope seleccionado. Por ejemplo, dichas moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera no modificada (o cadena ligera quimérica), o viceversa. Los anticuerpos diseñados también pueden caracterizarse por la alteración de una secuencia de ácido nucleico que codifica las regiones de marco de dominio variables ligeras y/o pesadas de anticuerpo aceptor con el fin de retener el carácter específico de unión de anticuerpo donador. Estos anticuerpos pueden comprender el reemplazo de una o más CDRs (de preferencia todas) del anticuerpo aceptor con CDRs de un anticuerpo donador descrito en la presente. "Anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo diseñado que contiene regiones variables que ocurren naturalmente (cadena ligera o cadena pesada) derivada de un anticuerpo donador en asociación con regiones constantes de cadena pesada y ligera derivadas de un anticuerpo aceptor. "Anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpos diseñados que tienen sus CDRs derivadas de una inmunoglobulina de donador no humano, las partes derivadas de inmunoglobulina restantes en la molécula se derivan de una (o más) inmunoglobulinas de humano. Además, los residuos de soporte del marco pueden alterarse para conservar la afinidad de unión (ver por ejemplo Queen et al., Proc. Nati Acad Sci USA. 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technoloqy. 9:421 (1991)). El término "anticuerpo donador" se refiere a un anticuerpo (monoclonal, o recombinante) que contribuye a las secuencias del ácido nucleico de sus regiones variables, CDRs, u otros fragmentos funcionales o análogos de los mismos a una primera porción de inmunoglobulina, para que provea la región codificadora de inmunoglobulina alterada y dé como resultado un anticuerpo alterado expresado con el carácter específico antigénico y una actividad neutralizante característica del anticuerpo donador. Un anticuerpo donador adecuado para usarse en esta invención es un anticuerpo monoclonal neutralizado no humano (es decir ratas) designada como 2C10. El anticuerpo 2C10 se define como un anticuerpo neutralizante específico de IL-18 de humano (es decir no reconoce a IL-18 de murino) de alta afinidad de isótopos lgG-?.? que tiene un ADN de cadena ligera variable y secuencias de aminoácidos de SEQ ID Nos: 1 y 2 y respectivamente, el ADN de cadena pesada variable y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nos: 9 y 19 sobre una región constante de IgG de murino adecuada. El término "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal o recombinante) heterólogo al anticuerpo donador, que contribuye con todas (o alguna porción pero de preferencia todas) de las secuencias de ácido nucleico codificando sus regiones de marco de cadena ligera y/o pesada y/o sus regiones constantes de cadena ligera y/o pesada para la primera porción de inmunoglobulina. De preferencia un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor. "CDRs" se definen como las secuencias de aminoácidos de región determinante complementaria de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de cadenas ligeras y pesada de inmunoglobulina. Ver por ejemplo Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunoloqical Interest, 4th Ed., Departamento Estadounidense de Servicios Humanos y de Salud, Institutos Nacionales de Salud(1987). Existen tres CDRs de cadena pesada y tres de cadena ligera (o regiones de CDR) en la porción variable de una inmunoglobulina. De esta forma, "CDRs" se utiliza en la presente para hacer referencia a las tres CDRs de cadena pesada, o a las tres CDRs de cadena ligera (o ambas, si es apropiado). Las CDRs proveen la mayoría de los residuos de contacto para la unión del anticuerpo con el antígeno o epítope. Las CDRs de interés en esta invención se derivan de las secuencias de cadena ligera y pesada variable del anticuerpo donador, e incluye análogos de las CDRs que ocurren naturalmente, cuyos análogos también comparten o retienen el mismo carácter específico de unión de antígeno y/o habilidad neutralizante como el anticuerpo donador del cual se derivan. Compartir el carácter específico de unión de antígeno o habilidad neutralizante significa, por ejemplo, que a pesar de que mAb 2C10 puede caracterizarse por un cierto nivel de afinidad, una CDR codificada por una secuencia de ácido nucleico de 2C10 en un ambiente estructural apropiado puede tener una afinidad superior o inferior. Sin embargo, se espera que CDRs de 2C10 en dichos ambientes reconocerán el mismo epítope(s) como 2C10. Las CDRs de cadena ligera de 2C10 a modo de ejemplo incluyen: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 7; y las CDRs de cadena pesada de 2C10 a modo de ejemplo incluyen: SEQ ID NO: 11 ; SEQ ID NO: 13; y SEQ ID NO: 15. Un "fragmento funcional" es una secuencia de variable de cadena ligera o pesada parcial (por ejemplo deleciones menores del amino o carboxi terminal de la región variable de inmunoglobulina) que retiene el mismo carácter específico de unión de antígeno y/o habilidad neutralizante como el anticuerpo del cual se deriva el fragmento. Un "análogo" es una secuencia de aminoácido modificada por al menos un aminoácido, en donde dicha modificación puede ser química o una sustitución o un reordenamiento de algunos aminoácidos (es decir no más de 10), cuya modificación permite que la secuencia de aminoácidos retenga las características biológicas, por ejemplo el carácter específico del antígeno y alta afinidad, de la secuencia no modificada. Por ejemplo, las mutaciones (silenciosas) puede construirse, mediante sustituciones, cuando ciertos sitios de restricción de endonucleasa se crean dentro o alrededor de las regiones codificadoras de CDR. Los análogos también pueden surgir como variaciones alélicas. Una "variación o modificación alélica" es una alteración en la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de péptido o aminoácido de la invención. Dichas variaciones o modificaciones pueden ser debido a la degeneración en el código genético o puede ser diseñado intencionalmente para proveer características deseadas. Estas variaciones o modificaciones pueden o no resultar en alteraciones en cualquier secuencia de aminoácidos codificada. El término "agentes efectores" se refiere a moléculas portadoras de no-proteína a las cuales los anticuerpos alterados, y/o cadenas ligeras o pesadas sintéticas o naturales del anticuerpo donador u otros fragmentos del anticuerpo donador pueden estar asociadas por medios convencionales. Dichos vehículos de no-proteína pueden incluir vehículos convencionales utilizados en el campo de diagnóstico, por ejemplo poliestireno u otras esferas plásticas, polisacáridos, por ejemplo como los que se utilizan en el sistema BIAcore [Pharmacia], u otras sustancias de no-proteína útiles en el campo en la medicina y seguras para la administración en humanos y animales. Otros agentes efectores pueden incluir un macrociclo, para quelatar un átomo de metal pesado, o radiosótopos. Dichos agentes efectores pueden también ser útiles para incrementar la media vida de los anticuerpos alterados, por ejemplo polietilenglicol.

II. Anticuerpos monoclonales de IL-18 alta afinidad Para utilizarse en la construcción de los anticuerpos, los anticuerpos alterados y fragmentos de esta invención, pueden emplearse especies no humanas (por ejemplo bovina, ovina, monos, pollos, roedores (por ejemplo murino y ratas), etc.), para generar una inmunoglobulina deseable durante la manifestación con IL-18 de humano nativa o un epítope de péptido de la misma. Se emplea técnicas convencionales de hibridoma para proveer una línea de células de hibridomas que secretan un mAb no humano para IL-18. Dichos hibridomas se tamizan para unión utilizando IL-18 revestido para cajas de 96 pozos, como se describe en la sección de ejemplo, o alternativamente con IL-18 biotinilada unido a una caja cubierta con estreptavidina. Un mAb neutralizante de alta afinidad a modo de ejemplo de esta invención es el mAb 2C10, un anticuerpo de rata que puede utilizarse para el desarrollo de un anticuerpo humanizado o quimérico, descrito con más detalle en los ejemplos que se encuentran a continuación. El mAb 2C10 se caracteriza por un carácter específico de unión de antígeno para IL-18 de humano de aproximadamente Kd 3.9 x 10"11 M. Este mAB se caracteriza por ser un isótopo lgG?.«. Otro anticuerpo donador deseable es el mAb 13G9 de murino.

Este mAb se caracteriza por ser un isótopo lgG?.?. El mAb tiene una constante de disociación para IL-18 de aproximadamente 12 x 10"9M.

Aún, otro anticuerpo donador deseable es el mAb de rata, 14B7. Este mAb se caracteriza por tener una constante de disociación para IL-18 aproximadamente 1.5 x 10"10M. 14B7 también se caracteriza por ser un isótopo IgGi K. Esta invención no se limita al uso de 13G9, 2C10, 14B7, o sus secuencias hipervariables (es decir CDR). Cualquier otro anticuefo de IL-18 de alta afinidad apropiado caracterizado por una constante de disociación igual o menor a aproximadamente 3.9x10"11M para IL-18 de humano y CDRs de anti-IL-18 correspondientes pueden ser sustituidas por esos. Siempre que en la siguiente descripción el anticuerpo donador se identifique como 13G9, 2C10, 14B7, esta designación se lleva a cabo únicamente para ilustración y simplicidad de la descripción. lll. Fragmentos de anticuerpo La presente invención también incluye el uso de fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 derivados de mAbs dirigidos contra IL-18 de humano. Estos fragmentos son útiles como agentes protectores in vivo contra IL-18 y condiciones mediadas por Th1 o in vitro como parte de un diagnostico de IL-18. Un fragmento Fab contiene toda la cadena ligera y porción amino terminal de la cadena pesada; y un fragmento F(ab')2 es el fragmento formado por dos fragmentos Fab unidos por enlaces de disulfuro. mAbs 13G9, 2C10, 14B7, y otros anticuerpos de unión de IL-18 de alta afinidad similares, proveen fuentes de fragmentos de Fab y fragmentos de F(ab')2 que pueden obtenerse por medios convencionales, por ejemplo escisión del mAb con las enzimas proteolíticas apropiadas, papaína y/o pepsina, o por métodos recombinantes. Estos fragmentos de Fab y F(ab')2 son útiles por si mismos como agentes de diagnóstico o profilácticos o terapéuticos como donadores de secuencias que incluyen las regiones variables y las secuencias de CDR útiles en la formación de anticuerpos humanizados o recombinantes como se describe en la presente. Los fragmentos de Fab y F(ab')2 pueden construirse mediante una genoteca de combinación de fago (ver por ejemplo Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994)) o mediante el cambio de la cadena de inmunoglobulina (ver por ejemplo Marks et al., Bio/Technoloqy, 10:779-783 (1992), que se incorporan ambas en la presente por referencia en su totalidad) en donde la inmunoglobulina de Fd o VH de un anticuerpo seleccionado (por ejemplo 13G9) se permite asociar con un repertorio de inmunoglobulina de cadena ligera, VL (o V«), para formar Fabs nuevos. De forma contraria, la inmunoglobulina de cadena ligera de un anticuerpo seleccionado puede permitir asociarse con un repertorio de ¡nmunoglobulina de cadena pesada, VH (o Fd), para formar Fabs nuevos.

IV. Secuencias de nucleótido y aminoácido de anti-IL-18 de interés El mAb 2C10 u otros anticuerpos descritos anteriormente pueden contribuir con las secuencias, tales como las secuencias de péptido de cadena ligera y/o pesada variables, secuencias de marco, secuencias de CDR, fragmentos funcionales, y análogos de los mismos, y secuencias de ácido nucleico que los codifican, útiles para diseñar y obtener varios anticuerpos alterados que se caracterizan por el carácter especifico de la unión de antígeno del anticuerpo donador. Como un ejemplo, la presente invención provee secuencias de cadena pesada variable y de cadena ligera variable de mAb 2C10 de IL-18 y secuencias derivadas de las mismas. Las secuencias de ácido nucleico de esta invención, o fragmentos de los mismos, modifican las secuencias de péptido de cadena pesada y cadena ligera variable son útiles para la introducción mutagénica de cambios específicos dentro de las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDRs o regiones de marco, y para la incorporación de la secuencia de aminoácidos de fusión o modificada resultante en un plásmido para expresión. Tomando en cuenta la degeneración del código genético, puede construirse varias secuencias de codificación que codifican las secuencias de aminoácidos de cadena ligera o pesada variable, y secuencias de CDR de esta invención así como fragmentos funcionales y análogos de los mismos que comparten el carácter específico de antígenos del anticuerpo donador. Las secuencias de ácido nucleico aisladas de esta invención, o fragmentos de las mismas, que codifican las secuencias de péptido de cadena variable o CDRs pueden utilizarse para producir anticuerpos alterados, por ejemplo anticuerpos humanizados o quiméricos, u otros anticuerpos diseñados de esta invención cuando se combinan operativamente con una segunda porción de inmunoglobulina. Se debe notar que además para las porciones de codificación de secuencias de ácido nucleico aisladas del anticuerpo alterado y anticuerpos descritos en la presente, se abarcan otras secuencias de ácido nucleico con la presente invención, tales como aquellas complementarias a las secuencias de codificación de CDR nativas o complementarias a las regiones de marco de humano modificadas que rodean las regiones de codificación de CDR. Las secuencias de ADN útiles incluyen aquellas secuencias que se hibridizan bajo condiciones de hibridación severas [ver, T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratorv Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389]. Un ejemplo de una condición de hibridación severa es la hibridación en 4XSSC a 65°C, seguida por un lavado en OJXSSC a 65°C durante una hora. De manera alternativa, una condición de hibridación severa a modo de ejemplo es en 50% de formamida, 4XSSC a 42°C. De preferencia, esta hibridación de secuencias de ADN son de al menos 18 nucleótidos de longitud, es decir aproximadamente el tamaño de una CDR.

V. Moléculas de inmunoglobulina alteradas y anticuerpos alterados Las moléculas de inmunoglobulinas alteradas pueden codificar anticuerpos alterados que incluyen anticuerpos diseñados tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Una región de codificación de inmunoglobulina alterada contiene regiones de codificación de CDR que codifican péptidos que tienen el carácter específico de antígeno de un anticuerpo de IL-18, de preferencia un anticuerpo de alta afinidad tal como los provistos por la presente invención, insertados en una primera porción de inmunoglobulina (un marco de humano o una región variable de inmunoglobulina de humano). De preferencia, la primera porción de inmunoglobulina se enlaza operativamente a una segunda porción de inmunoglobulina. La segunda porción de inmunoglobulina se define anteriormente, y puede incluir una secuencia que codifica una segunda región de anticuerpo de interés, por ejemplo una región Fc. Las segundas porciones de inmunoglobulina también pueden incluir secuencias que codifican otra inmunoglobulina a la cual se fusiona la región constante de cadena ligera o pesada en un marco o por medios de una secuencia enlazadora. Los anticuerpos diseñados dirigidos contra fragmentos funcionales o análogos de IL-18 pueden diseñarse para producir una unión mejorada con el mismo anticuerpo. La segunda porción de inmunoglobulina también puede asociarse con agentes efectores como se define anteriormente, incluyendo moléculas de vehículo de no proteína, a los cuales la segunda porción de inmunoglobulina puede enlazarse operativamente por medios convencionales. La fusión o enlace entre las segundas porciones de inmunoglobulina, por ejemplo secuencias de anticuerpos, y agentes efectores puede ser por cualquier medio adecuado, por ejemplo por uniones iónicas o covalentes convencionales, fusiones de proteína o entrelazadores heterobifuncionales, por ejemplo, carbodiímida, glutaraldehído, y similares. Dichas técnicas son bien conocidas y se describen fácilmente en textos convencionales de bioquímica y química. Además, las secuencias de enlazador convencionales que se proveen simplemente para una cantidad deseada de espacio entre la segunda porción de inmunoglobulina y el agente efector puede construirse en la región codificadora de inmunoglobulina alterada. El diseño de dichos enlazadores es bien conocido por los expertos en la técnica. Además, las secuencias de señal para las moléculas de la invención pueden modificarse para una expresión mejorada. Un anticuerpo alterado a modo de ejemplo contiene una secuencia de proteína o péptido de cadena ligera y/o pesada variable que tiene un carácter específico de antígeno de mAb 2C10, por ejemplo las cadenas de VH y V . Aún otro anticuerpo alterado deseable de esta invención se caracteriza por las secuencias de aminoácido que contienen al menos, y de preferencia todas las CDRs de la región variable de la cadena ligera y/o pesada de la molécula de anticuerpo de rata 2C10 con las secuencias restantes que se derivan de un origen humano, o un fragmento funcional o análogo del mismo. En otra modalidad adicional, el anticuerpo diseñado de la invención puede unirse a éste en un agente adicional, por ejemplo, el procedimiento de tecnología de ADN recombinante puede utilizarse para producir un anticuerpo diseñado de la invención en el que el fragmento Fc o dominio de CH2 CH3 de una molécula de anticuerpo completa ha sido reemplazada por una enzima u otra molécula detectable (es decir un efector de polipéptido o molécula reportera). La segunda porción de inmunoglobulina puede también enlazarse operativamente a un fragmento, proteína o péptído de inmunoglobulina de la misma heteróloga a la secuencia que contiene CDR, por ejemplo, que tiene el carácter específico de antígeno de rata 2C10. La proteína resultante puede exhibir tanto un carácter específico de antígeno de IL-18 como características de no inmunoglobulina después de la expresión. Dicha característica de porción de fusión puede ser, por ejemplo, una característica funcional tal como otro dominio de receptor o unión, o una característica terapéutica si la porción de fusión es pos sí misma una característica antigénica adicional o proteína terapéutica. Otra proteína deseable de esta invención puede comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas ligeras y pesadas de longitud total, o cualquier fragmento discreto del mismo, tal como fragmentos de Fab or F(ab')2, un dímero de cadena pesada, o cualquier fragmento recombinante mínimo del mismo tal como un Fv o un anticuerpo de cadena individual (SCA) o cualquier otra molécula con el mismo carácter específico que el del mAb donador seleccionado, por ejemplo mAB 2C10. Dicha proteína puede utilizarse en la forma de un anticuerpo alterado, o puede utilizarse en su forma no fusionada.

Siempre que la segunda porción de inmunoglobulina se derive de un anticuerpo diferente al anticuerpo donador, por ejemplo, cualquier isótopo o clase de marco de inmunoglobulina o regiones constantes, resulta un anticuerpo diseñado. Los anticuerpos diseñados pueden comprender regiones constantes de inmunoglobulina (Ig) y regiones de marco variable de un origen, por ejemplo, el anticuerpo aceptor, y una o más (de preferencia todas) CDRs del anticuerpo donador, por ejemplo en anticuerpo anti-IL-18 descrito en la presente. Además, las alteraciones, como por ejemplo, deleciones, sustituciones, o adiciones de la región de marco de dominio variable ligera y/o pesada de mAb aceptor en los niveles de ácido nucleico o aminoácidos, o las regiones de CDR donadoras pueden crearse con el fin de retener el carácter específico de unión de antígeno del anticuerpo donador. Dichos anticuerpos diseñados se diseñan para emplear una (o ambas) de las cadenas ligeras y/o pesadas variables de mAb de IL-18 (opcionalmente modificadas como se describe) o una o más de las CDRs de cadena ligera o pesada más adelante identificadas. Se espera que los anticuerpos diseñados sean neutralizantes, es decir, bloqueen en forma deseable la unión al receptor de la proteína de IL-18 y también bloqueen o prevengan la proliferación de células dependientes de IL-18. Dichos anticuerpos diseñados pueden incluir un anticuerpo humanizado que contiene las regiones de marco de una inmunoglobulina de humano seleccionada o subtipo, o un anticuerpo quimérico que contiene las regiones constantes de cadena ligera y pesada de humano fusionadas a los fragmentos funcionales de anticuerpo de IL-18. Un anticuerpo aceptor de humano (u otro animal) adecuado puede seleccionarse de una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT® datábase, la base de datos Los Alamos, y la base de datos Swiss Protein, por homología a las secuencias de ácido nucleico y nucleótido el anticuerpo donador. Un anticuerpo de humano caracterizado por una homología de las regiones de marco del anticuerpo donador, (o una base de aminoácido) puede ser adecuado para proveer una región constante de cadena pesada y/o una región de marco de variable de cadena pesada para inserción de CDRs donadoras. De manera similar, puede seleccionarse un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar regiones de marco variable o constante de cadena ligera. Se debe notar que las cadenas ligera y pesada del anticuerpo aceptor no se requieren para originarse desde el mismo anticuerpo aceptor. De manera deseable las regiones constantes y de marco heterólogas se seleccionan de isotipos y clases de inmunoglobulina de humano, tal como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA, y IgE. Sin embargo, un anticuerpo aceptor no necesita comprender únicamente secuencias de proteína de inmunoglobulina de humano. Por ejemplo un gen puede construirse en el cual se fusiona una parte de codificación de secuencia de ADN de una cadena de inmunoglobulina de humano con una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácido de no inmunoglobulina tal como una molécula reportera o efector de polipéptido.

Un ejemplo de un anticuerpo humanizado particularmente deseable contendría CDRs 2C10 insertadas sobre las regiones de marco de una secuencia de humano seleccionada. Para neutralizar anticuerpos humanizados, una, dos o de preferencia tres CDRs de las regiones variables de cadena ligera y/o cadena pesada de anticuerpo de IL-18 se insertan en las regiones de marco de las secuencias de anticuerpo de humano seleccionadas, reemplazando las CDRs nativas del último anticuerpo. De preferencia, en un anticuerpo humanizado, se han diseñado los dominios variables en ambas cadenas ligera y pesada de humano por uno o más reemplazos de CDR. Es posible utilizar las seis CDRs, o varias combinaciones de menos de seis CDRs. De preferencia se reemplazan las seis CDRs. Es posible reemplazar las CDRs únicamente en la cadena pesada de humano, utilizando como cadena ligera la cadena ligera no modificada de anticuerpo aceptor de humano. Aún alternativamente, una cadena ligera compatible puede seleccionarse de otro anticuerpo de humano para recurrir a las bases de datos de anticuerpos convencionales. El residuo del anticuerpo diseñado puede derivarse de cualquier inmunoglobulina de humano aceptora adecuada. El anticuerpo humanizado diseñado de preferencia tiene el marco de un anticuerpo de humano natural o un fragmento del mismo, y posee la combinación de propiedades requeridas para uso terapéutico efectivo, por ejemplo, tratamiento de enfermedades inflamatorias mediadas por IL-18 en humano, o para usos diagnósticos.

Como otro ejemplo, un anticuerpo diseñado puede contener CDRs de la región de cadena ligera variable de 2C10 y CDRs de la región de cadena pesada variable de 13G9. El anticuerpo humanizado resultante debe caracterizarse por el mismo carácter específico de unión de antígeno y alta afinidad de mAb 2C10. Se entenderá por los expertos en la técnica que un anticuerpo diseñado puede además modificarse por cambios en los aminoácidos de dominio variables sin afectar necesariamente el carácter específico y alta afinidad del anticuerpo donador (es decir un análogo). Se anticipa que los aminoácidos de cadena ligera y pesada pueden sustituirse por otros aminoácidos ya sea en los marcos de dominio variable o CDRs o ambas. Además, la región constante puede ser alterada para mejorar o disminuir las características selectivas de las moléculas de la presente invención. Por ejemplo, la dimerización, enlace a receptores Fc, o la capacidad para enlazar y activar un complemento (véase por ejemplo Angal et al., Mol. Imminol 30:105-108 (1993). Xu et al., J. Biol. Chem, 269:3469-3474 (1994), Winter et al., EP 307, 434-B). Una anticuerpo alterado que es un anticuerpo quimérico difiere de los anticuerpos humanizados antes descritos al proveer a todo el anticuerpo donador no humano regiones variables de cadena pesada y cadena ligera, que incluyen regiones del marco, en asociación con regiones constantes de inmunoglobulina humana para ambas cadenas. Se anticipa que los anticuerpos quiméricos que retienen una secuencia no humana adicional con respecto a los anticuerpos humanizados de esta invención pueden provocar una respuesta inmune considerable en los humanos. Estos anticuerpos podrían ser útiles en la prevención y tratamiento de trastornos mediados por IL-18, como se discute a continuación.

VI. Producción de anticuerpos alterados y anticuerpos diseñados Preferiblemente, las secuencias variables de cadena ligera y/o pesada y las CDRs del mAb 2C10 u otros mAbs, donadores adecuados, y sus secuencias de codificación de ácido nucleico, se utilizan en la construcción de anticuerpos alterados, preferiblemente anticuerpos humanizados, de esta invención mediante el procedimiento siguiente. Las mismas técnicas o similares también pueden utilizarse para generar otros anticuerpos de esta invención. Un hibridoma que produce un mAb, donador seleccionado, por ejemplo el anticuerpo de rata 2C10, se clona convencionalmente, y el ADN de sus regiones variables de cadena pesada y ligera obtenido mediante las técnicas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook ef al., (Molecular Cloninq (A Laboratorv Manual). 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Las regiones variables pesada y ligera de dos series que contienen por lo menos las regiones de codificación de CDR y las porciones de las regiones del marco del dominio variable ligera y/o pesada del mAb aceptor necesarias para retener el carácter específico de enlace del mAb donador, así como las partes derivadas de inmunoglobulina restantes de la cadena de anticuerpos derivada de una inmunoglobulina humana pueden obtenerse utilizando iniciadores polinucleótidos y transcriptasa inversa. Las regiones de codificación de CDR se identifican utilizando una base de datos conocida y mediante la comparación con otros anticuerpos. Un anticuerpo quimérico de rata/humano puede preparase y someterse a prueba de su capacidad de enlace. Este anticuerpo quimérico contiene todas las regiones vH y VL de anticuerpo donador no humano, en relación con las regiones constantes Ig humanas para ambas cadenas. Un anticuerpo humanizado puede ser derivado del anticuerpo quimérico, o preferiblemente, hecho sintéticamente insertando las regiones de codificación de CDR del mAb donador de las cadenas pesadas y ligera adecuadamente dentro del marco de cadena pesada y ligera seleccionado. Alternativamente, un anticuerpo humanizado de la invención puede preparase utilizando técnicas de mutagénesis estándar. De este modo, el anticuerpo humanizado resultante contiene regiones del marco humano y regiones de codificación de CDR del mAb donante. Puede haber una manipulación posterior de los residuos del marco. El anticuerpo humanizado resultante puede estar expresado en células hospederas recombinantes, por ejemplo, COS, CHO o células de mieloma. Otros anticuerpos humanizados pueden preparase utilizando esta técnica en otros anticuerpos no humanos, de gran afinidad, neutralizantes, específicos de IL-18.

Un vector de expresión convencional o plásmido recombinante puede producirse colocando estas secuencias codificantes para el anticuerpo alterado en relación operativa con secuencias de control reguladoras convencionales capaces de controlar la replicación y expresión en, y/o secreción de, una célula hospedera. Las secuencias reguladoras que incluyen secuencias promotoras, por ejemplo, promotor CMV, y secuencias de señal, que pueden estar derivadas de otros anticuerpos conocidos. De manera similar, puede producirse un segundo vector de expresión teniendo una secuencia de ADN que codifique una cadena ligera o pesada de anticuerpo complementario. Preferiblemente este segundo vector de expresión es idéntico al primero excepto en lo que concierne a las secuencias de codificación y marcadores seleccionables, para asegurar en la medida de lo posible que cada cadena de polipéptidos sea expresada funcionalmente. Alternativamente, las secuencias codificantes de cadena pesada y ligera para el anticuerpo alterado pueden residir en un solo vector. Una célula hospedera seleccionada es cotransfectada mediante técnicas convencionales con los vectores primero y segundo (o transfectadas simplemente por un solo vector (para crear la célula hospedera transfectada de la invención que comprende las cadenas ligera y pesada recombinantes sintéticas. La célula transfectada se cultiva mediante las técnicas convencionales para producir el anticuerpo diseñado de la invención. El anticuerpo humanizado que incluye la relación de ambas cadenas ligeras y/o pesadas recombinantes se tamiza del cultivo con la prueba adecuada, como ELISA o RÍA. Técnicas convencionales similares pueden utilizarse para construir otros anticuerpos alterados y moléculas de esta invención. Los vectores adecuados para los pasos de clonación y subclonación empleados en los métodos y construcción de las composiciones de esta invención pueden ser seleccionados por un experto en la técnica. Por ejemplo, pueden utilizarse las series de pUC convencionales de vectores de clonación. Un vector utilizado es pUC, que está comercialmente disponible de proveedores, como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Adicionalmente, cualquier vector que sea capaz de replicarse fácilmente, que tenga una abundancia de puntos de clonación y genes seleccionables (por ejemplo, resistencia antibiótica) y sea manipulado fácilmente pude utilizarse para la clonación. De este modo, la selección del vector de clonación no es un factor limitante en esta invención. De manera similar, los vectores utilizados para la expresión de los anticuerpos diseñados de acuerdo con esta invención pueden ser seleccionados por un experto en la técnica de cualquier vector convencional. Los vectores también contienen secuencias reguladoras seleccionadas (como promotores CMV) que dirigen la replicación y expresión de las secuencias de ADN heterólogas en células hospederas seleccionadas. Estos vectores contienen las secuencias de ADN antes descritas que codifican el anticuerpo diseñado o región de codificación de inmunoglobulina alterada. Además, los vectores pueden incluir las secuencias de inmunoglobulina seleccionadas, modificadas por la inserción de puntos de restricción convenientes para la fácil manipulación. Los vectores de expresión también pueden estar caracterizados por genes adecuados para amplificar la expresión de las secuencias de ADN heterólogas, por ejemplo, el gen de dihidrofolata reductasa de mamífero (DHFR). Otras secuencias de vector preferibles incluyen una secuencia de señal poly A, como la de la hormona de crecimiento de bobinos (BGH) y la secuencia promotora de betaglocina (betaglopro). El vector de expresión útil en la presente puede ser sintetizado mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Los componentes de estos vectores, por ejemplo réplicas, genes de selección, mejoradores, promotores, secuencias de señal y similares, pueden obtenerse de fuentes comerciales o naturales o sintetizados por procedimientos conocidos para utilizarse al dirigir la expresión y/o secreción del producto del ADN recombinante en un hospedero seleccionado. Otros vectores de expresión adecuados de los cuales se conocen varios tipos en la técnica de expresión de mamíferos, bacterias, insectos, levaduras y hongos también pueden seleccionarse para este propósito. La presente invención también abarca una línea de células transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias de codificación de los anticuerpos diseñados o sus moléculas de inmunoglobulinas alteradas. Las células hospederas útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de clonación también son convencionales. Sin embargo, muy convenientemente, las células de varias cadenas de E. coli se utilizan para la replicación de los vectores de clonación y otros pasos en la construcción de anticuerpos alterados de esta invención. Las células hospederas adecuadas o líneas de células para la expresión del anticuerpo diseñado o anticuerpo alterado de la invención son preferiblemente células de mamíferos como CHO, COS, una célula de fibroblasto (por ejemplo, 3T3), y células mieloides, y muy preferiblemente una célula mieloide o CHO. Pueden utilizarse células humanas, permitiendo así a la molécula ser modificada con patrones de glicosilación humana. Alternativamente, otras líneas de células eucarióticas pueden ser utilizadas. La selección de células hospederas de mamífero adecuadas y métodos para la transformación, cultivo, amplificación tamización y producción y purificación del producto son conocidas en la técnica. Véase por ejemplo, Sambrook ef al antes citado. Las células bacterianas pueden ser útiles como células hospederas adecuadas para la expresión de los Fabs recombinantes de la presente invención (véase por ejemplo, Plückthun, A., Immunol. Rev. 130:151-188 (1992)). Sin embargo, debido a la tendencia de las proteínas expresadas en las células bacterianas a estar en forma no plegada o inadecuadamente plegada o en una forma glucosilada, cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana tendría que ser tamizado para la retención de su capacidad de enlace con antígeno. Si la molécula expresada por la célula bacteriana se produce en una forma plegada adecuada, esa célula bacteriana sería un hospedero conveniente. Por ejemplo, varias cadenas de E. coli utilizadas para expresión son bien conocidas como células hospederas en el campo de la biotecnología. Varias cadenas de B. Subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares pueden ser utilizados también en este método. Cuando es conveniente, las cadenas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células hospederas, así como células de insectos, por ejemplo Drosophila y Lepidoptera y sistemas de expresión viral. Véase por ejemplo, Miller et al., Genetic Enqineering. 8:227-298, Plenum Press (1986) y las referencias ahí citadas. Los métodos generales por los cuales los vectores de la invención pueden ser construidos, los métodos de transfección requeridos para producir las células hospederas de la invención, y los métodos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo alterado de la invención de dicha célula hospedera son todas técnicas convencionales. Igualmente, una vez producidos, los anticuerpos alterados de la invención pueden ser purificados del contenido del cultivo celular de acuerdo con los procedimientos estándar de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columna de afinidad, cromatografía por columna, electroforesis de gel y similares. Estas técnicas están dentro del campo de la técnica y no limitan esta invención. Otro método de expresión de los anticuerpos humanizados puede utilizar expresión en un animal transgénico, como el que se describe en la patente de E.U.A. No. 4,873,316. Este se refiere a un sistema de expresión que utiliza el promotor de caseína del animal que cuando se incorpora transgénicamente a un mamífero permite a la hembra producir la proteína recombinante deseada en su leche. Una vez expresado por el método deseado, al anticuerpo diseñado se examina su actividad in vitro mediante el uso de una prueba adecuada. Actualmente se utilizan formatos de prueba ELISA convencionales para examinar el enlace cualitativo y cuantitativo del anticuerpo diseñado a la IL-18. Adicionalmente, pueden utilizarse otras pruebas in vitro para verificar la eficacia de la neutralización antes de los estudios clínicos humanos posteriores realizados para evaluar la persistencia del anticuerpo diseñado en el cuerpo a pesar de los mecanismos de limpieza usuales. Siguiendo los procedimientos generales descritos para preparar anticuerpos humanizados, un experto en la técnica puede también construir anticuerpos humanizados de otros anticuerpos de IL-18 donadores, secuencias de región variables y péptidos de CDR descritos en la presente. Los anticuerpos diseñados pueden ser producidos con marcos de región variable potencialmente reconocidos como "propios" por receptores del anticuerpo diseñado. Modificaciones menores a los marcos de región variable pueden incrementarse para lograr grandes incrementos en el enlace antígeno sin una inmunogenicidad aumentada considerable para el recipiente. Estos anticuerpos diseñados pueden tratar efectivamente a un humano de las condiciones mediadas por IL-18. Estos anticuerpos también pueden ser útiles para el diagnóstico de estas condiciones.

Vil. Usos terapéuticos/profilácticos Esta invención también se refiere a un método para tratar humanos que experimentan síntomas relacionados con el sistema autoinmune, como MS, que comprende administrar una dosis efectiva de anticuerpos incluyendo uno o más de los anticuerpos diseñados o anticuerpos alterados descritos en la presente, o sus fragmentos. La respuesta terapéutica inducida por el uso de las moléculas de esta invención es producida por el enlace a la IL-18 humana y el bloqueo posterior de la estimulación Th1. De este modo, las moléculas de la presente invención, cuando se encuentran en preparaciones y formulaciones adecuadas para uso terapéutico, son muy convenientes para las personas que experimentan enfermedades autoinmunes, tales como, mas no limitadas a MS, RA, IDDM, IBD y psoriasis. Los anticuerpos alterados, anticuerpos y sus fragmentos de esta invención también pueden ser útiles junto con otros anticuerpos, particularmente mAbs humanos reactivos con otros marcadores (epítopes) responsables de la condición contra la cual el anticuerpo diseñado de la invención está dirigido. Los agentes terapéuticos de esta invención se cree que son convenientes para el tratamiento de condiciones autoinmunes de aproximadamente 2 días a 6 meses o como sea necesario. Por ejemplo, los tratamientos más largos pueden ser convenientes cuando se trata MS o similares. La dosis y duración del tratamiento se relaciona con la duración relativa de las moléculas de la presente invención en la circulación humana, y puede ser ajustada por un experto en la técnica dependiendo de la condición que se está tratando y la salud general del paciente. El modo de administración del agente terapéutico de la invención puede ser cualquier vía adecuada que administre el agente al hospedero. Los anticuerpos alterados, anticuerpos, anticuerpos diseñados y sus fragmentos, y composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, subcutánea, intramuscular, intravenosa o intranasal. Los agentes terapéuticos de la invención pueden ser preparados como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad efectiva del anticuerpo diseñado (por ejemplo humanizado) de la invención como un ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. En el agente profiláctico de la invención, se prefiere una suspensión acuosa o solución que contiene el anticuerpo diseñado, preferiblemente regulada a un pH fisiológico, en una forma lista para inyectarse. Las composiciones para administración parenteral comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo diseñado de la invención o su mezcla disuelta en un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente un portador acuoso. Una variedad de portadores acuosos puede utilizarse, por ejemplo, 0.04% de solución salina, 0.3% de glicina, y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materia en partículas. Estas soluciones pueden esterilizarse mediante las técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas como los agentes de ajuste de pH y de regulación de pH, etc. La concentración del anticuerpo de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar bastante, es decir, de menos de aproximadamente 0.5%, generalmente a por lo menos 1 % hasta un 15 ó 20% en peso y se seleccionará principalmente basándose en los volúmenes fluidos, viscosidades, etc., de acuerdo con el modo de administración particular seleccionado. De este modo una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular puede prepararse para contener 1 mL de agua estéril regulada en su pH, y entre aproximadamente 1 mg a cerca de 100 mg, por ejemplo de aproximadamente 50 mg a cerca de 30 mg o muy preferiblemente, de aproximadamente 5 mg a cerca de 25 mg de un anticuerpo diseñado de la invención. De manera similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa puede hacerse con un contenido de hasta 250 ml de solución de Ringer estéril, y aproximadamente 1 a cerca de 30 y preferiblemente 5 mg a cerca de 25 mg de un anticuerpo diseñado de la invención. Los métodos actuales para preparar composiciones administrables parenteralmente son bien conocidos o serán evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Se prefiere que el agente terapéutico de la invención, cuando se encuentra en una preparación farmacéutica, esté presente en formas de dosis unitaria. La dosis adecuada terapéuticamente efectiva puede ser determinada fácilmente por los expertos en la técnica. Para tratar efectivamente un trastorno inflamatorio en un humano u otro animal, una dosis de aproximadamente OJ mg a cerca de 20 mg por 70 kg de peso corporal de una proteína o un anticuerpo de esta invención deben administrarse parenteralmente, preferiblemente i.v. o i.m (intramuscularmente). Esta dosis puede, si es necesario, repetirse a intervalos de tiempo adecuados seleccionados por un médico durante la enfermedad. Los anticuerpos alterados y anticuerpos diseñados de esta invención también pueden ser utilizados en regímenes de diagnóstico, así como para la determinación de los trastornos mediados por IL-18 o seguimiento del progreso del tratamiento de estos trastornos. Como reactivos de diagnóstico, estos anticuerpos alterados pueden etiquetarse convencionalmente para utilizarse en formatos de prueba ELISA y otros formatos de prueba convencionales para la medición de los niveles de IL-18 en suero, plasma u otro tejido adecuado, o la liberación por las células humanas de cultivo. La naturaleza de la prueba en la cual los anticuerpos alterados se utilizan es convencional y no limitan esta descripción. De este modo, una modalidad de la presente invención se refiere a un método para ayudar al diagnóstico de enfermedades autoinmunes y otras condiciones relacionadas con la producción excesiva de células T Thl en un paciente que comprende los pasos de determinar la cantidad de IL-18 humana en una muestra (plasma o tejido) obtenida de dicho paciente y comparar la cantidad determinada con la cantidad media de IL-18 humana en la población normal, con lo cual la presencia de una cantidad considerablemente elevada de IL-18 en la muestra del paciente es una indicación de enfermedad autoinmune y otras condiciones relacionadas con la producción excesiva de células T Thl. Los anticuerpos, anticuerpos alterados o sus fragmentos descritos en la presente pueden ser liofilizados para almacenarse y reconstituidos en un portador adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser efectiva con las inmunoglobulinas convencionales y pueden emplearse las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Los siguientes ejemplos ilustran varios aspectos de esta invención incluyendo la construcción de anticuerpos diseñados ejemplares y su expresión en vectores y células hospederas adecuados, y no pretenden ser limitativos del alcance de esta invención. Todos los aminoácidos se identifican por los códigos convencionales de tres letras o de una sola letra. Todas las enzimas de plásmidos y otros reactivos y materiales de restricción se obtuvieron de fuentes comerciales a menos que se indique de otra forma. Toda la legación general de clonación y otra metodología de ADN recombinante se realizó en T. Maniatis ef al., antes citado, o su segunda edición (1989), eds. Sambrook et al., por el mismo editor ("Sambrook ef al.").

EJEMPLO 1 Producción de Mabs para IL-18 A. Generación de anticuerpo monoclonal Se inmunizaron ratones (híbridos F1 de Balb/c y C57BL/6) o ratas (Sprague Dawley) con 30 µg de IL-18 recombinante en adyuvante y 4 semanas más tarde con 30 µg de IL-18 en adyuvante. Sobre la base de un buen título de anticuerpo en suero para IL-18, los animales recibieron otra inmunización de 10 a 30 µg de IL-18 (en solución salina). Tres días después de la inmunización final se realizó una esplenectomía. Las células de bazo de ratón o rata se utilizaron para preparar hibridomas mediante procedimientos estándar (Zola, H. Ed., Monoclonal Antibodies, CRC Press Inc. 1987). Los hibridomas positivos se clonaron mediante el método de dilución limitante.

B. Purificación de Mabs Se purificaron los Mabs por cromatografía ProsepA (Bio Processing. Consett. UK) respectivamente utilizando las instrucciones del fabricante. Los Mabs tuvieron una pureza de >95% mediante SDS-PAGE.

C. Isotipificación de Mabs Todos los Mabs de rata y ratón se isotipificaron mediante equipos comercialmente disponibles (Zymed, Amersham) y se observó que fueron de kappa IgGI.

EJEMPLO 2 Pruebas A. Biotinilación de IL-18 Se sometió a biotinilación la IL-18 utilizando un equipo comprado de Molecular Probes Inc. utilizando una relación de 10:1 de reactivo de biotinilación. La biotinilación no tuvo efecto en la actividad biológica de la IL-18.

B. Prueba de tamización de hibridoma Se recubrieron cajas de 96 pozos con streptavidina (2ug/ml, 100ul/cavidad en PBS) mediante incubación toda la noche a 4°C. Después la solución fue aspirada y se bloquearon puntos de enlace no específicos con 250µl/cavidad de 1 % de albúmina de suero bovino (BSA) en regulador de pH TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCI, 0.02% Kathon, pH 7.4) de 5 a 60 minutos a temperatura ambiente. Después de éste y cada uno de los pasos siguientes, la placa se lavó 4 veces en regulador de pH de lavado (10 mM Tris, 150 mM NaCI, 0.05% Tween 20, 0.02% Kathon, pH 7.4). A cada cavidad, se agregaron 100 µL de biotina IL-18 (100ng/ml)en regulador de pH de prueba (0.5% BSA, 0.05% de gamaglobulina bovina, 0.01 % Tween 40, 20µM de un compuesto dietilentriaminopentaacético en regulador de pH TBS) y las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en una incubadora de agitación. A cada cavidad se agregaron 50µl de medio de hibridoma y 50µl de regulador de pH de prueba y se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente en una incubadora de agitación. A cada cavidad se agregaron 100ul 0.5µg/ml Eu3+ anticuerpo anti-ratón o anti-rata etiquetados en regulador de pH de prueba. Finalmente se agregaron 200 µl/cavidad de mejorador (Wallac) y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y se midió la fluorescencia resuelta con el tiempo. Los hibridomas que tuvieron cuentas >100K se expandieron en placas de 24 cavidades.

C. Inmunoensavo Para determinar el carácter específico de los Mabs anti-IL-18 generada se recubrieron cajas de 96 pozos, se bloquearon y se incubaron con IL-18 de biotina como antes. Todas las incubaciones siguientes analizaron en una incubadora de agitación a temperatura ambiente. Después de lavar las cavidades se agregaron 50 µl de IL-18 (3 µg/ml) o regulador de pH de prueba y 50 µl del mAb y se incubó durante 60 minutos. Después de lavar las cavidades se agregaron 100 ul 0.5µg/ml Eu3+ anticuerpo etiquetado de antiratón o anti-rata en regulador de pH de prueba durante 60 minutos, se lavaron las cavidades y después se agregaron 100 µl/cavidad de mejorador (Wallac) y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente y se midió la fluorescencia resuelta con el tiempo. Todos los hibridomas positivos mostraron desplazamiento de enlace con IL-18. 4 D. Prueba de neutralización Se aisló PBMC de donadores sanos mediante gradiente Ficol-Paque (Pharmacia) y se cultivaron en cajas de 96 pozos en 10% de medio de FBS DMEM/F12 con 1 µg/ml de ConA (Sigma) en presencia de IL-18 (5ng/ml) y/o Mabs. Después de 18 horas de cultivo a 37°C, se removió un medio de 25 µl de 5% de CO2 en aire, 90% de humedad y se midió la concentración de interferón gama (IFNg) por inmunoensayo. Los resultados, obtenidos de un promedio de tres experimentos, se suman en el cuadro 1.

E. Mediciones de afinidad de anticuerpo monoclonal La afinidad de los Mabs purificados se midió en el biosensor óptico BIAcore (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Suecia) utilizando una velocidad de flujo de 30ul/min. Los datos cinéticos se evaluaron utilizando relaciones descritas anteriormente (Karlsson et al, J. Immonol. Meth., 145:229-240 (1991 ) y que están incorporadas como referencia en su totalidad. El mAb (diluido en regulador de pH HBS, 10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 0.01 % Tween-20.pH 7.4) se inyectó en un IgG Fc anti-ratón de conejo o superficie de IgG Fc anti-rata de chivo, seguido por flujo de regulador de pH y se registró el RU. Después se inyectó IL-18 (diluida en regulador de Ph HBS) durante 180 segundos seguido por un flujo de regulador de pH durante 500 segundos y se registró el RU. La superficie del chip sensor se regeneró medíante una inyección de 0J M de ácido fosfórico. Se calcularon las velocidades aceptables (Kass) y velocidades no aceptables (Kdiss) de enlace utilizando un programa de computación BIAcore y juntas rindieron una constante de equilibrio calculada (KD) de 12x10"9 M para el mAb 13G9, 3.9x10" 11 M para el mAb 2C10 y 1.5x10"10 M para el mAb 14B7. Véase cuadro 1.

F. Análisis epítope de anticuerpo monoclonal El análisis epítope de los Mabs purificados se midió en el BIAcore. Utilizando una velocidad de flujo de 10µl/min, el primer Mab (diluido en regulador de pH HBS) se inyectó en un IgG Fc anti-ratón de conejo o superficie de IgG anti-rata de chivo, seguido por una infección de IL-18, por 240 segundos, una inyección de Mabs de bloqueo por 48 segundos y una inyección del segundo Mab por 240.segundos. La superficie se regeneró por una inyección de OJ N de ácido fosfórico y el RU se registró después de cada inyección. Se observó que los Mabs 13G9m 2C10 y 14B7 tuvieron epítopes similares o traslapantes.

CUADRO 1 Afinidad y actividad de neutralización de mAbs reactivos con IL-18 humana mAb Kd (pM)a Neutralización IC50 (nM) 2C10 (rata) 39 0J 14B7 (rata) 150 0.2 13G9 (ratón) 12000 3.0 Determinado por análisis de biosensor óptico (BIAcore) (25°C) inhibidor de producción gama de IFN (en nM) de PBMC en respuesta a 5ng/ml de IL-18 humana CUADRO 3 SECUENCIAS CDR Clonación de gen y análisis de secuencia Los genes pesados y ligeros variables se clonaron de células de hibridoma utilizando métodos biológicos moleculares estándar descritos brevemente como se muestra a continuación. El ARN total se aisló de las células de hibridoma utilizando reactivo TRIzol (Life Technologies Cat # 15596-026) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ARN se transcribió de manera inversa con un equipo RT-PCR por las instrucciones del fabricante (Boehringer Mannheim Cat. No. 1483-188) utilizando un oligonucleótido poli-dT para cebadura. Después de la síntesis de ADNc de primera hebra, las regiones V pesadas y ligeras se amplificaron por PCR utilizando los iniciadores específicos de región constante 3' e iniciadores 5' degenerados. La secuencias de iniciadores 5' degenerado fueron diseñadas para codificar las secuencias aminoácidas N terminales determinadas anteriormente de las regiones de cadena pesada o ligera variables. Se obtuvieron secuencias de toda la longitud de clones múltiples de cada amplificación PCR y se alinearon para proveer un consenso. De acuerdo con esto, las primeras 17 bases de la secuencia de ADN para las cadenas pesada y ligera son generadas por el iniciador PCR, sin embargo la secuencia de proteína traducida es nativa. Las secuencias nucleótidas y aminoácidas deducidas para los anticuerpos de hibridoma 2D10, 13G9, y 14B7 se muestran en las figuras 1 a 6. En cada caso los CDR y las secuencias de nucleótidos que las codifican están encajonadas. Las secuencias de iniciadores degenerados están en negritas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Holmes, Stephen D. Ho, Yen Sen Taylor, Alexander A del-Meguid, Sherin S. <120> Antagonistas recombinantes de interleucina-18 útiles en el tratamiento de trastornos mediados por interleucina-18 <130> P50897 <140> 60/125,299 <141> 1999-03-19 <160> 48 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 324 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (324) <223> Región V de cadena ligera <400> 1 gac att caá atg acc cag tet cea gct tec ctg tet gea tet ctg gga 48 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa act gtc tec ate gaa tgt ctg gea agt gag gac ata tac act tat 96 Glu Thr Val Ser He Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp He Tyr Thr Tyr 20 25 30 tta acá tgg tat cag cag aaa cea ggg aaa tet ect caá ctc ctg ate 144 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu He 35 40 45 tat ggt gea aat aag ttg caá gat ggg gtc cea tea cgg tte agt ggc 192 Tyr Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggc acá cag tat tet ctc aag ate age ggc ata caá ect 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys He Ser Gly He Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat gaa ggg gat tat tte tgt cta cag ggt tec aag ttt ccg ctc 288 Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu 85 90 95 aeg tte ggt tet ggg acc aag ctg gag ate aaa cgg 324 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 2 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Ser He Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp He Tyr Thr Tyr 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu He 35 40 45 Tyr Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys He Ser Gly He Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105 <210> 3 <211> 33 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (33) <223> CDR I de cadena ligera VK2C10 <400> 3 ctg gea agt gag gac ata tac act tat tta acá 33 Leu Ala Ser Glu Asp He Tyr Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4 Leu Ala Ser Glu Asp He Tyr Thr Tyr Leu Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (21) <223> CDR II de cadena ligera VK2C10 <400> 5 ggt gea aat aag ttg caá gat 21 Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 6 Gly Ala Asn Lys Leu Gln Asp 1 5 <210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (27) <223> CDR III de cadena ligera VK2C10 <400> 7 cta cag ggt tec aag ttt ccg ctc aeg 27 Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 8 Leu Gln Gly Ser Lys Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 9 <211> 378 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (378) <223> Región V de cadena pesada <400> 9 gag gtc cag cta cag cag tet ggg gct gag ctt gtg aga ect ggg acc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 tet gtg aag tta tet tgc aaa gtt tet ggc gaa ata agt acá gga tac 96 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Val Ser Gly Glu He Ser Thr Gly Tyr 20 25 30 tat tte cae ttt gtg agg cga agg ect gga cag ggt ctg gaa tgg ata 144 Tyr Phe His Phe Val Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 gga agg att gat ect gag gat gat agt act aaa tat gct gag agg tte 192 Gly Arg He Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe 50 55 60 aaa gac agg gcg aeg ctc act gea caá acá tec tec aac acá gcc tac 240 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Gln Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg aac ctc age age ctg acc tet gag gac act gea act tat ttt tgt 288 Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 acc acá tgg cgg ata tac cga gat agt tet ggc cgc ccc tte tat gtt 336 Thr Thr Trp Arg He Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val 100 105 110 atg gat gcc tgg ggt caá gga gct tea gtc act gtc tec tea 378 Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 O <210> 10 <211> 126 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 10 10 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 . 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Val Ser Gly Glu He Ser Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Phe His Phe Val Arg Arg Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 -|5 Gly Arg He Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Gln Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 2r Thr Thr Trp Arg He Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val 100 105 110 Met Asp Ala Trp Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 11 <211> 15 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (15) <223> CDR I de cadena pesada VH2C10 <400> 11 gga tac tat tte cae 15 Gly Tyr Tyr Phe His <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 12 Gly Tyr Tyr Phe His 1 5 <210> 13 <211> 51 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (51) <223> CDR II de cadena pesada VH2C10 <400> 13 agg att gat ect gag gat gat agt act aaa tat gct gag agg tte aaa 48 Arg He Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe Lys 1 5 10 15 gac 51 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400 > 14 Arg He Asp Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Arg Phe Lys 1 5 10 15 <210 > 15 <211> 51 <212 > ADN <213 > Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (51) <223> CDR III de cadena pesada VH2C10 <400> 15 tgg cgg ata tac cga gat agt tet ggc cgc ccc tte tat gtt atg gat 48 Trp Arg He Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val Met Asp 1 5 10 15 gcc 51 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 16 Trp Arg He Tyr Arg Asp Ser Ser Gly Arg Pro Phe Tyr Val Met Asp 1 5 10 15 <210> 17 <211> 342 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221 > CDS <222 > ( 1 ) . . . ( 342 ) <223> Región V de cadena ligera <400> 17 gac gtt gtt atg act caá act ect ctc tec ctg ect gtc agt ctt gga 48 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 gat caá gcc tec ate tet tgc aga tet agt cag age ctt gta cae agt 96 Asp Gln Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 aat gga aac acc tat tta cat tgg tac ctg cag aag cea ggc cag tet 144 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 cea aag ctc ctg ate tac aaa gtt tec aac cga ttt tet ggg gtc cea 192 Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac agg tte agt ggc agt gga tea ggt acá gat tte acá ctc aag ate 240 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 age aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tte tgc tet caá agt 288 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 acá cat gtt ect ccg tac aeg tte gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata 336 Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He 100 105 110 aaa cgg 342 Lys Arg <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 acá cat gtt ect ccg tac aeg tte gga ggg ggg acc aag ctg gaa ata 336 Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He 100 105 110 aaa cgg 342 Lys Arg <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He 100 105 110 Lys Arg <210> 19 <211> 48 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) ... (48) <223> CDR I de cadena ligera VK13G9 <400> 19 aga tet agt cag age ctt gta cae agt aat gga aac acc tat tta cat 48 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 5 10 15 <210> 21 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) ... (21) <223> CDR II de cadena ligera VK13G9 <400> 21 aaa gtt tec aac cga ttt tet 21 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 23 <211> 30 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) ... (30) <223> CDR III de cadena ligera CK13G9 <400> 23 tet caá agt acá cat gtt ect ccg tac aeg 30 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Tyr Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 369 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) ... (369) <223> Región V de cadena pesada <400> 25 caá gtt act ctt aag gag tet ggc ect ggg ata ttg aag ccc tea cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly He Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tet tte tet ggg ttt tet ctg age act tet 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt att gcc tgg gtt cgt cag ect tea ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly He Ala Trp Val Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gea gac att tgg tgg gat gat aat aag tat tat aat cea tec 192 Trp Leu Ala Asp He Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 ctg gag age cag ctc acá ate tec aag gat acc tec aga aac cag gta 240 Leu Glu Ser Gln Leu Thr He Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 tte ctc aeg ate acc agt gtg gac act gea gat tet gcc act tat tac 288 Phe Leu Thr He Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cgt cat cat tac gac ggt agt age ctc ctg ect atg gac tac 336 Cys Ala Arg His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr 100 105 110 tgg ggt caá gga acc tea gtc acc gtc tec tea 369 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly He Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly He Ala Trp Val Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp He Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Glu Ser Gln Leu Thr He Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Thr He Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 21 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) ... (21) <223> CDR I de cadena pesada VH13G9 <400> 27 act tet ggt atg ggt att gcc 21 Thr Ser Gly Met Gly He Ala 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Thr Ser Gly Met Gly He Ala 1 5 <210> 29 <211> 48 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) ... (48) <223> CDR II de cadena pesada VH13G9 <400> 29 gac att tgg tgg gat gat aat aag tat tat aat cea tec ctg gag age 48 Asp He Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser 1 5 10 15 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400 > 30 Asp He Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Ser 1 5 10 15 <210> 31 <211> 39 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1) ... (39) <223> CDR III de cadena pesada VH13G9 <400> 31 cat cat tac gac ggt agt age ctc ctg ect atg gac tac 39 His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 His His Tyr Asp Gly Ser Ser Leu Leu Pro Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 33 <211> 324 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (324) <223> Región V de cadena ligera <400> 33 gat att caá atg aeg cag tet cea gct tec ctg tet gea tet ctg gga 48 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa act gtc tec ate gaa tgt cta gea agt gag gac ata tac agt tat 96 Glu Thr Val Ser He Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp He Tyr Ser Tyr 20 25 30 tta gea tgg tat caá cag aag cea ggg aaa tet ect cag ctc ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu He 35 40 45 tat gcc acá aaa agg ttg caá gat ggg gtc cea tea cgg tte agt ggc 192 Tyr Ala Thr Lys Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tet ggc acá cag tat tet ctc aaa ata age gac atg caá ect 240 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys He Ser Asp Met Gln Pro 65 70 75 80 gaa gat gaa ggg gat tat tte tgt cta cag aat tec aag ttt ccg gtc 288 Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Asn Ser Lys Phe Pro Val 85 90 95 aeg tte ggt tet ggg acc aag ctg gag ate aaa cgg 324 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105 <210> 34 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 34 Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Ser He Glu Cys Leu Ala Ser Glu Asp He Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu He 35 40 45 Tyr Ala Thr Lys Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys He Ser Asp Met Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Asn Ser Lys Phe Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg 100 105 <210> 35 <211> 33 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (33) <223> CDR I de cadena ligera VK14B7 <400> 35 cta gea agt gag gac ata tac agt tat tta gea 33 Leu Ala Ser Glu Asp He Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 36 Leu Ala Ser Glu Asp He Tyr Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (21) <223> CDR II de cadena ligera <400> 37 gcc acá aaa agg ttg caá gat 21 Ala Thr Lys Arg Leu Gln Asp <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 38 Ala Thr Lys Arg Leu Gln Asp 1 5 <210> 39 <211> 27 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (27) <223> CDR III de cadena ligera VK14B7 <400> 39 cta cag aat tec aag ttt ccg gtc aeg 27 Leu Gln Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 40 Leu Gln Asn Ser Lys Phe Pro Val Thr <210> 41 <211> 368 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221 > CDS <222 > ( 1 ) . . . ( 368 ) <223> Región V de cadena pesada <400> 41 gag gtt cag ctt cag cag tet ggg gct gag ctt gtg aga ect ggg acc 48 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 tet gtg aag ttt tet tgc aaa gtt tet ggc gat acc ect acá acá tac 96 Ser Val Lys Phe Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Pro Thr Thr Tyr 20 25 30 tac gtg cae ttt gtg aga caá agg ect gga cag ggt ctg gaa tgg ata 144 Tyr Val His Phe Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 gga agg att gat ect gag gat act agt act aaa tat gct gag aag tte 192 Gly Arg He Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 aga aat aag gcg acá tte act gea gat cea tec tec aac acá gcc tac 240 Arg Asn Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Pro Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 cta aac ctc age age ctg acc ect gag gac act gea acc tat ttt tgt 288 Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 acc ata atg cgg tac cat agt acc tat agg gtc tat gtt atg gat tte 336 Thr He Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe 100 105 110 tgg ggt caá gga act gea gtc act gtc tec tc 368 Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser 115 120 <210> 42 <211> 122 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 42 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Phe Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Pro Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Val His Phe Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp He 35 40 45 Gly Arg He Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Asn Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Pro Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Asn Leu Ser Ser Leu Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr He Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser 115 120 <210> 43 <211> 15 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (15) <223> CDR I de cadena pesada VH14B7 <400> 43 acá tac tac gtg cae 15 Thr Tyr Tyr Val His 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 44 Thr Tyr Tyr Val His <210> 45 <211> 51 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (51) <223> CDR II de cadena pesada VH14B7 <400> 45 agg att gat ect gag gat act agt act aaa tat gct gag aag tte aga ' 48 Arg He Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Arg 1 5 10 15 aat 51 <210> 46 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 46 Arg He Asp Pro Glu Asp Thr Ser Thr Lys Tyr Ala Glu Lys Phe Arg 1 5 10 15 <210> 47 <211> 42 <212> ADN <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1) ... (42) <223> CDR III de cadena pesada VH14B7 <400> 47 atg cgg tac cat agt acc tat agg gtc tat gtt atg gat tte 42 Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 48 Met Arg Tyr His Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Val Met Asp Phe 10

Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo monoclonal neutralizador de roedor específico para interleucina-18 humana y que tiene una afinidad de enlace caracterizada por un antiasociación constante igual o menor de aproximadamente 3.9 x 10"11 M.

2.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es un anticuerpo monoclonal de rata.

3.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es un anticuerpo monoclonal de murino.

4.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 2, que comprende la secuencia de aminoácido de cadena ligera de SEQ ID NO: 1 , y la secuencia de aminoácido de cadena pesada de SEQ ID NO: 9.

5.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 3, que comprende la secuencia de aminoácido de cadena ligera de SEQ ID NO: 17 y la secuencia de aminoácido de cadena pesada de SEQ ID NO: 25.

6.- Él anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende la secuencia de aminoácido de cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y la secuencia de aminoácido de cadena pesada SEQ ID NO: 41.

7.- El anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque tiene las características de identificación de 2C10, 14B7 ó 13G9.

8.- Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 4.

9.- Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 5.

10.- Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 6.

11.- Un hibridoma que tiene las características de identificación de la línea celular 19522C10(2)F2(1 )A1 , 195214B7(1 )H10 y 18413G9(3)F12

12.- Un fragmento Fab neutralizador de su fragmento F(ab')2, producido al borrar la región Fc del anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1.

13.- Un anticuerpo alterado que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, caracterizado porque las regiones del marco de las cadenas pesada y ligera se derivan de por lo menos una anticuerpo seleccionado y las secuencias aminoácidas de las regiones que determinan la complementaridad de cadena se derivan del anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1.

14.- Una región determinante complementaria de cadena ligera de inmunoglobulína (CDR), cuya secuencia aminoácida se selecciona del grupo que consiste de: (a) SEQ ID NO: 3 (b) SEQ ID NO: 5 (c) SEQ ID NO: 7 (d) SEQ ID NO: 19 (e) SEQ ID NO: 21 (f) SEQ ID NO: 23 (g) SEQ ID NO: 35 (h) SEQ ID NO: 37 (i) SEQ ID NO: 39

15.- Una región determinante complementaria de cadena pesada de inmunoglobulina (CDR), cuya secuencia aminoácida se selecciona del grupo que consiste de: (a) SEQ ID NO: 11 (b) SEQ ID NO: 13 (c) SEQ ID NO: 14 (d) SEQ ID NO: 27 (e) SEQ ID NO: 29 (f) SEQ ID NO: 31 (g) SEQ ID NO: 43 (h) SEQ ID NO: 45 (i) SEQ ID NO: 47

16.- Una molécula de ácido nucleico que codifica la región determinante complementaria de inmunoglobulina (CDR) de conformidad con la reivindicación 14.

17.- Una molécula de ácido nucleico que codifica la región determinante complementaría de inmunoglobulina (CDR) de conformidad con la reivindicación 15.

18.- Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 y un portador farmacéuticamente aceptable.

19.- El uso del anticuerpo alterado como el que se reclama en la reivindicación 13 para la fabricación de un medicamento para tratar condiciones relacionadas con enfermedad autoinmune en humano.

20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19 en donde la enfermedad es esclerosis múltiple.

21.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19 en donde la enfermedad es artritis reumatoide tipo 1 o diabetes dependiente de insulina.

22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19 en donde la enfermedad es enfermedad inflamatoria del intestino.

23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19 en donde la enfermedad es psoriasis.

24.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ácido nucleico que codifica el anticuerpo alterado de conformidad con la reivindicación 13; (b) una secuencia de ácido nucleico complementaria a (c) un fragmento o análogo de (a) o (b), que codifica una proteína caracterizado porque tiene un carácter específico para interleucina-18 humana; caracterizado porque la secuencia contiene opcionalmente un punto de restricción.

25.- Un método para determinar la presencia o ausencia de IL-18 humana en un humano que comprende obtener una muestra de fluido biológico de un paciente y permitir al anticuerpo monoclonal de conformidad con la reivindicación 1 entrar en contacto con dicha muestra bajo condiciones tales que pueda formarse un complejo de anticuerpo monoclonal/IL-18 y detectar la presencia o ausencia del complejo de anticuerpo monoclonal/IL-18.

26.- Un método para ayudar en el diagnóstico de enfermedad autoinmune relacionado con los pasos de determinar la cantidad de IL-18 humana en una muestra de un paciente de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 25 y compararla con la cantidad media de IL-18 humana en la población normal, con lo cual la presencia de una cantidad considerablemente elevada de IL-18 humana en el paciente es una indicación de enfermedad autoinmune.