MXPA01008176A - Vacuna contra el paludismo. - Google Patents

Abstract

La presente invenci6n se relaciona contra una vacuna contra el paludismo que comprende un polipeptido que tiene la secuencia de aminoacidos de la parte C terminal de la proteina del circumesporozoito de una especie de Plasmodium en la cual el polipeptido y uno o mas partes de residuos cisteina estan oxidados, y opcionalmente un portador o adyuvante o microcapsulas biodegradables adecuadas, para uso en humanos.

Description

VACUNA CONTRA EL PALUDISMO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una vacuna contra el paludismo. La invención se relaciona además con polipéptidos gue son capaces de inducir una respuesta inmunmológica y protectora contra el paludismo en un sujeto, y el uso de la misma en profilaxis. El paludismo es una enfermedad generada por parásitos transmitida durante la alimentación con sangre de mosguitos infectados los cuales inoculan esporozoitos en el huésped mamífero. En cuestión de minutos, los esporozoitos invaden los hepatocitos y se desarrollan en merozoitos intracelularmente por esquizogonia asexual . Los merozoitos después invaden a los eritrocitos, lo que produce los diversos síntomas asociados con la enfermedad. El ciclo de vida se completa cuando los gametocitos son ingeridos durante la alimentación con sangre de los mosquitos vectores . La inmunidad protectora contra el paludismo se puede obtener al inmuniza ratones y humanos con esporozoitos atenuados por irradiación. Esta inmunidad es el resultado del efecto de anticuerpos neutralizantes los cuales reconocen esporozoitos libres en la corriente sanguínea y de las células T o linfocitos T CD4+ y CD8+, los cuales evitan el desarrollo REF: 131854 Í-á*? de las formas hepáticas del parásito. Los experimentos realizados en ratones deficientes en células B han demostrado que, pese a la ausencia de anticuerpos contra los esporozoitos, se induce protección por inmunización con esporozoitos 5 irradiados . Esto sugiere gue las células T son específicas para las proteínas presentes en la etapa hepática intracelular y que juegan un papel predominante en la protección. Por lo tanto, uno de los objetivos en la investigación en la búsqueda de una vacuna contra el paludismo es imitar la respuesta inmune 10 protectora inducida por inyección de esporozoitos irradiados. En la investigación que ha llevado a la presente invención, se ha encontrado que la administración de un polipéptido de 69 aminoácidos (PbCS 242-310) que abarca la región C terminal de la proteína de los circumsesporozoitos de 15 Plasmodium berghei. el cual se ha generado utilizando síntesis peptídica en fase sólida induce, en ratones BALB/c (H-2d) , después de dos inyecciones subcutáneas, en presencia de adyuvante incompleto de Freund (IFA) , en la base de la cola (i) títulos altos de anticuerpos antipeptídicos los cuales también 20 reconocen a las proteínas CS nativas de P. berghei. (ii) células T citolíticas específicas para el antígeno Kd del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) del péptido restringido PbCS 245-253, y (iii) protección parcial, dependiente de CD8+, contra paludismo inducido por 25 esporozoitos. Las mismas frecuencias del péptido PbCS 245-253 ^4ff^-^m** -*~~ de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos se encuentran por IFN-? ELISPOT en los nodulos linfáticos drenados de mamíferos inmunizados con el péptido CTL óptimo corto 245-253 o con el polipéptido 242-310, lo que indica que el polipéptido más grande se puede procesar y presentar in vivo en el contexto del MHC Clase I tan eficientemente como los péptidos CTL cortos. De manera interesante se observan incluso más altos de actividad CTL y protección cuando los cuatro residuos cisteína presentes en el péptido C terminal se oxidan completamente. Estos hallazgos subrayan la importancia potencial de la naturaleza química del fragmento C terminal en la activación del sistema inmune y la protección concomitante. Y de manera más general, puesto que se estimulan facetas múltiples del sistema inmune por los polipéptidos sintéticos grandes, esto puede proporcionar una alternativa útil para la vacunación con fragmentos de proteína recombinante o con péptidos cortos . En base en este hallazgo, la presente invención proporciona vacunas contra el paludismo, en particular para uso en humanos, que comprenden un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la parte C terminal de la proteína de circumsesporozoito de una especie de Plasmodium. polipéptido el cual comprende por lo menos cuatro cisteínas terminales a partir de las cuales por lo menos un par está oxidado, la vacuna comprende opcionalmente un portador o adyuvante o microesferas no degradables, o cualquiera de los tres, adecuados . Las microcápsulas biodegradables son esferas de aproximadamente 1 a 10 µm y son portadores o adyuvantes muy adecuados par la vacuna de la invención. Específicamente, la vacuna de la invención se basa en la proteína de circumsesporozoito de Plasmodium faleiparum, de manera más especifica de Plasmodium faleiparum NF54. Preferiblemente, el polipéptido en la vacuna consiste de por lo menos 42 aminoácidos consecutivos derivados de la parte C terminal de la proteína del circumsesporozoito. De manera más particular, la invención se relaciona con vacunas en las cuales el polipéptido comprende por lo menos los aminoácidos 342 a 383 de Plasmodium faleiparum, incluso de manera más particular los aminoácidos 342 a 383 de la cepa NF-54 de Plasmodium faleiparum. Preferiblemente, las cuatro cisteínas presentes en el polipéptido derivado de la parte C terminal de la proteína del circumsesporozoito de Plasmodium faleiparum están oxidadas . Se ha encontrado que la vacuna de la invención es en particular útil cuando el adyuvante es un adyuvante de MontanideMR. MontanideMR ISA (Seppic, Paris, Francia,- ISA = adyuvante incompleto Sépico) , que son un grupo de adyuvantes pasados en aceite/tensoactivo en los cuales se combinan diferentes tensoactivos ya sea con aceite mineral no metabolizable, un aceite metabolizable, o una mezcla de los dos. Se preparan como uso como una emulsión con solución acuosa de antígeno. Los diversos grupos ISA de Montanide de adyuvantes de utilizan como emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua o emulsiones de agua en aceite en agua. Los diferentes adyuvantes acomodan diferentes relaciones de fase acuosa/fase oleosa, debido a la diversidad de combinaciones de tensoactivo y aceite. Se afirma que el funcionamiento de estos adyuvantes es similar al del adyuvante incompleto de Freund (IFA) para producción de anticuerpos,- sin embargo, la respuesta inflamatoria habitualmente es menor. La invención se relaciona además con polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de la parte C terminal de la proteína de circumsesporozoito de una especie de Plasmodium, polipéptidos los cuales comprenden por lo menos 42 aminoácidos consecutivos C terminales de los cuales se oxidan una o más paredes de cisteína. En una modalidad particular de la invención, el péptido comprende los aminoácidos 342 a 383 de Plasmodium faleiparum. cepa NF-54. Se prefiere que todos los residuos de cisteína presentes en el polipéptido estén oxidados. Además, la invención se relaciona con un polipéptido tal para uso en una vacuna contra el paludismo y para uso de tal polipéptido para la preparación de una vacuna contra el paludismo.

La presente invención se dilucida adicionalmente en los ejemplos que siguen y los cuales de ninguna manera se pretende que sean limitantes de la invención. En los ejemplos se hace referencia a las figuras anexas las cuales muestran: Figura 1: Especificidad de los cultivos en volumen de CTL obtenidos de bazo de ratones inmunizados dos veces con 50 µg de péptido PbCS 242-310 en IFA. La especificidad se determina 7 días después de estimulación in vitro con el péptido indicado en un ensayo estándar de liberación de cromo en presencia de las células objetivos solas (símbolos blancos) , o pulsados con el péptido correspondiente (símbolos negros) ; Figura 2 : Especificidad de cultivos de volumen de CTL de células de bazo aisladas de ratones inmunizados dos veces con péptido PbCS 242-310 en IFA. La especificidad se determina 7 días después de estimulación in vitro con el péptido indicado en un ensayo de liberación de cromo estándar con células L transfectadas con Kd, Dd o Ld y pulsadas con el péptido específico.

Figura 3 : Determinación de células T específicas para el péptido PbCS 245-253 por IFN-? ELISPOT en células de nodulo linfático (LN) . Se inmuniza a los ratones con diversas preparaciones de antígeno en IFA en la base de la cola en el día 0 y 3-4 semanas después. El panel A muestra el péptido PbCS 242-310 o los péptidos P30/PbCS 245-253; el panel B muestra PbCS 242-310 reducido u oxidado. Se extirpan los nodulos linfáticos drenados inguinales o periaórticos de dos ratones por grupo, 10-20 días después de la segunda inyección y las células que se obtienen se acumulan. Se determina la presencia de células T específicas directamente por ELISPOT en presencia de células P815 irradiadas pulsadas o no con el péptido PbCS 245-253. Los ratones inmunizados con IFA únicamente se utilizan como controles. Los resultados son representativos de tres experimentos realizados y se expresan como la diferencia de las manchas obtenidas cuando las células se incuban con o sin el péptido PbCS 245-252; Figura 4: Anticuerpos específicos Pf CS 282-383 evaluados un mes después de la primera inmunización. Como en la figura 2, se evalúa la presencia de Pf CS 282-383 de anticuerpos específicos por ELISA en voluntarios inmunizados en presencia de MontanideMR ISA-720 (panel superior) o alúmina (panel inferior) , a las dos dosis de péptidos (100 ó 300 µg, símbolos negros o blancos, respectivamente) .

Figura 5: Evolución de proliferación de linfocitos a Pf es 282-383 en voluntarios inmunizados con 100 µg de péptido en presencia de MontanideMR ISA-720. Se prueban los linfocitos de sangre periférica (PBL) de 4 voluntarios (números 1, 4, 6 y 11) antes (mes 0) y después (meses 1-8) de las inmunizaciones en un cultivo de 6 días con Pf CS 282-383 a diversas concentraciones (30.0.04 µg/ml) . Los datos se muestran como el índice de estimulación (S.I.) promedio más alto de 5 cultivos por duplicado. Los cultivos control (TT y PHA) proporcionan S.I. satisfactorios. Las flechas indican el tiempo de las inyecciones, * no probado.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Elevación de la respuesta inmune contra un polipéptido derivado de circumsesporozoito en un modelo murino MATERIALES Y MÉTODOS 1. Síntesis de péptidos y análisis Todos los péptidos utilizados en este ejemplo se sintetizan químicamente utilizando guímica F-moc en fase sólida, como se describe por Atherton et al. (Peptides synthesis, Part 2. Bioorcr. Chem. 8:350-351 (1979). Las sustancias químicas y solventes utilizados para la síntesis se adquieren de Bachem Feinchemikallien (Buddendorf , Suiza) , Novabiochem (L ufelfingen, Suiza) y Fluka (Buchs, Suiza) . 5 El péptido de 9 unidades PbCS 245-253 corresponde a un epitopo CTL identificado (Romero et al, Nature 341:323-326 (1989)) . El polipéptido PbCS 242-310 cubre la región C terminal de la proteína de circumsesporozoito de la cepa ANKA de Plasmodium berghei (Lanar, Mol. Bioch. Paras. 39:151-153 10 (1990)) y se obtiene como se describe previamente con detalle para el análogo de Plasmodium faleiparum. (Roggero et al., Mol . Immunol . 32:1301-1309 (1995)). Brevemente, se prepara el polipéptido en una resina de alcohol p-alcoxibencílico (resina de Wang) con un grado de sustitución de 0.4 mmol/g. Se utiliza 15 un exceso de 10 veces de derivados de aminoácidos F-moc y un tiempo de acoplamiento de 30 min. El polipéptido crudo se purifica por una combinación con cromatografía por exclusión de tamaño (Sephadex 025, Pharmacia, Suecia) y RP-CLAR (W-Potex 5 C4, 250 x 10 mm, Phenomenex, Rancho Palos Verdes, EUA 20 utilizando un gradiente 10-50% de CH3CN en TFA 0.1%/H2O en 40 min con una velocidad de flujo de 3 ml/min) . Los péptidos de 20 unidades B11-B17 (tabla 1) los cuales se superponen por 10 residuos y abarcan la secuencia PbCS 233-312 se purifican por cromatografía de exclusión de 25 tamaño. El grado de pureza de todos los péptidos se analiza por RP-CLAR (columna analítica C18) . Se determina la composición de aminoácidos de los péptidos purificados de acuerdo con Knecht y Chang (Anal. Chem. 58:2375-2379 (1986) y se confirma el peso molecular por espectrometría de masas en un monitor de masas LDI 1700 (Linear Scientific Inc., Reno, NV, EUA) o un equipo Voyager-DE (PerSeptive Byosystem, Framingham, MA, EUA) . 2. Reducción y oxidación de PbCS 242-310 Se obtiene la forma reducida de PbSC 242-310 al tratar el polipéptido purificado por CLAR con un exceso 100 molar de DTT durante 36 h a 37°C. Después de la eliminación del exceso de DTT por cromatografía de exclusión de tamaño, se disuelve una porción del material en CH3CO ONH4 0.1 M, pH 8.0, y se deja que se oxide al aire durante 10 días. La reducción u oxidación completa del péptido se confirma tanto por reacción de Ellman o como por adición de un exceso 1000 molar de N-etilmaleimida (NEM) a una alícuota de la solución del péptido. En este último caso, después de la incubación a 4°C durante 1 h, no se detecta un incremento en el PM del polipéptido por espectrometría de masas para la forma oxidada mientras que la forma reducida presenta un incremento en el PM que corresponde a la adición de cuatro moléculas de NEM. 3. Inmunización Se adquieren ratones BALB/c hembra de cuatro a cinco semanas de edad de Harían (Zeist, NL) . Se inyecta a los ratones subcutáneamente en la base de la cola con 50 µg de polipéptido reducido u oxidado disuelto en PBS y emulsificado en adyuvante incompleto de Freund (IFA) . Para el péptido corto PbCS 245-253, se inyectan 4 µg en combinación con 100 µg del péptido P30 auxiliar universal (Renggli et al., Immunol . Let . 46:199-205 (1995) . Los animales reciben una dosis de refuerzo de inmunógeno después de 2-3 semanas. De siete a diez días después del refuerzo con el péptido, se sangra a los ratones para determinar la producción de anticuerpos específicos. Subsecuentemente, los animales son sacrificados para ensayos de proliferación, CTL o ELISPOT, o bien se exponen a mosquitos que portan esporozoitos . 3. Exposición parasitaria Se producen esporozoitos de Plasmodium berghei (cepa ANKA; clona 1, Dr. Walliner, Edinburgo o clona Dr. P.H. Lambert, WHO Ginebra) por transmisión cíclica a mosquitos criados en laboratorio de Anopheles gambiae o A. stephensi. Se anestesia a los ratones y se exponen a los mosquitos infectados. Los ratones se exponen individualmente a un número determinado previamente de piquetes necesarios para obtener una infección completa en ratones BALB/C pariados por edad, no expuestos. Después de la exposición del parásito, se verifica regularmente la parasitemia desde el día 5 hasta el día 14 por frotis de sangre teñidos con Giemsa. Se considera a los ratones como protegidos cuando no se detectan parásitos 14 días después de la exposición. 5. Disminución de células T in vivo Se utilizan hibridomas H35 (CD8 específico de rata IgG2b) (Golstein et al., Immunol . Rev. 68:5-42 (1982)) y GK1.5 (CD4-específico de rata IgG2b) (Dyalynas et al., J . Immunol . 131:2445-2451 (1983)) como una fuente de anticuerpos. La exposición se realiza en el día 0. Se inyectan l mg de anticuerpos específicos para CD4 en los días -3, -2 y -1 (mismo protocolo para las Ig de rata control). Se inyecta 0.5 mg de anticuerpos específicos CD8 en los días -2 y +2. La supresión es de >95% durante el tiempo necesario para el desarrollo completo de las etapas hepáticas de P. berahei (Meis et al . , Am. J. Trop. Med. Hyg. 37:506-10 (1987)). La supresión se verifica por análisis FACS (Becton Dickinson) o linfocitos de sangre periférica (PBL) o células esplénicas utilizando marcado con FITC específico de CD4 (Ref. 1300 024, Boehringer Mannheim, Alemania) y marcado con PE específico de CD8 (Ref. 1271 237, Boehringer Mannheim, Alemania). 6. Ensayo ELISPOT Se recubren durante la noche placas ELISPOT de nitrocelulosa en una cámara húmeda a 4°C con una solución de PBS que contiene 100 µg/ml de anticuerpo específico para IFN-? OIE703B2 (Slade and Langhorne. Immunobiology 179, 353, (1989)). Se realiza una etapa de saturación al agregar DMEM que contiene FCS 10% durante 2 horas a 37°C. Las células inmunes aisladas de los nodulos linfáticos drenados de ratones inmunizados después se cocultivan en placas con 100,000 células P815 irradiadas/pozo pulsadas o no con el péptido corto PbCS 245-253, 24 horas a 37°C. Las células después se remueven y se agrega un segundo anticuerpo biotinado específico para IFN-? (ANI) (Slade and Langhorne, Immunobiology 179, 353 (1989)) (l µg/ml en PBS-BSA 1%) durante 2 horas a 37°C. Después del lavado, se agrega conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina diluido en PBS-FCS 5% durante 1 hora a 37°C y la presencia de complejos inmunes se muestra por la adición de sustrato BCIP/NBT.

RESULTADOS 1. Respuesta Inmunológica a péptido C terminal PbCS 242-310 reducido completamente Se inmuniza completamente ratones BALB/c con péptido PbCS 242-310 en IFA. Se determina la presencia de anticuerpos específicos de péptido 7-10 días después de la segunda inyección. Se detecta un título alto de anticuerpos específicos de péptidos (1:300,000) por ELISA y la reactividad cruzada con la proteína CS nativa (1:25,000) se demuestra por ensayos IFAT en esporozoitos secados al aire de P. berghei. El reconocimiento es específico puesto que se inhibe por la adición del péptido convertidor PbCS 242-310. Para determinar la respuesta CTL, el bazo y las células inmunes de LN se reestimulan in vitro con el epitopo de CTL bien conocido, PbCS 245-253, el péptido PbCS 242-310 y los péptidos superpuestos B11-B17 que cubren la totalidad de la secuencia C terminal . Se detectan niveles altos de citotoxicidad en bazos y nodulos linfáticos de ratones inmunizados reestimulados con los péptidos 245-253 y 243-262, mientras que los niveles menores se inducen por los péptidos 233-252 y 242-310 (figura 1, tabla 1) .

Tabla i Péptidos utilizados en el estudio La actividad citotóxica es equivalente a la que se obtiene en ratones inmunizados con el péptido nonamérico óptimo PbCS 245-253, determinado por los números que forman puntos IFN-? (figura ÍA) . Se confirma la restricción Kd de la respuesta de CTL utilizando células L transfectadas que expresan moléculas de MHC clase I Kd, Dd o Ld (figura 2) . 2. Inmunización con el péptido PbCS 242-310 en IFA sue confiere protección dependiente de CD8+ a ratones BALB/c expuestos a mosquitos que presentan el parásito Se inmuniza a ratones BALB/C dos veces subcutáneamente en la base de la cola con 50 µg de péptido PbCS 242-310 en IFA y se envían para una exposición de parásitos 7-10 días después del refuerzo con péptido. Se obtiene un nivel importante de protección específica en ratones inmunizados con el péptido PbCS 242-310 (tabla 2, experimento A) .

Tabla 2 Para caracterizar los mecanismos de protección, se lleva a cabo in vivo supresión de células T. Claramente, la supresión de células T CD4+ no modifica significativamente la protección observada. En contraste, la supresión de células T CD8+ por anticuerpos específicos para CD8 que coinciden en isotipo evita la protección in vivo inducida por péptido, puesto que se observa un nivel de protección de línea de base (tabla, experimento A) . 3. Propiedades inmunológicas del péptido C terminal PbCS 242-310 El péptido C terminal completamente reducido se permite que experimente oxidación completa por exposición al aire en una solución acuosa a pH 8.0 durante 10 días a temperatura ambiente. Las propiedades inmunológicas de esta preparación después se comparan con el material completamente reducido en términos de respuesta CTL y capacidad protectora. Aunque no hay diferencia cualitativa en los títulos de anticuerpo y proliferación de células T, el número de IFN-? ELISPOT obtenido con el material oxidado en tres experimentos diferentes es consistentemente mayor que el observado para el péptido completamente reducido (figura 3B) . De manera similar, el grado de protección que se obtiene con el material oxidado es consistentemente mayor que el observado con la molécula reducida (tabla 2, experimentos B, C) . En este ejemplo, la inyección de un polipéptido sintético grande que cubre la región C terminal de la proteína CS confiere protección, dependiente de CD8+, contra Plasmodium berghei . De manera interesante, la respuesta de CTL contra el péptido PbCS 245-253 es inducida en ambos casos en un grado similar en ratones inmunizados. De hecho, las frecuencias de CTL determinadas por ELISPOT son similares en ratones inmunizados ya sea con el péptido CTL PbCS 245-253 corto o el péptido PbCS 242-310 grande. Puesto que se sabe que no se observa protección ante la inyección del epitopo CTL, los presentes experimentos indican que las células T auxiliares específicas de parásitos y los anticuerpos específicos para el péptido PbCS 242-310 y la proteína CS nativa también juegan un papel en la inmunidad antiparasitaria. Se sabe que las células T auxiliares y los anticuerpos pueden proporcionar independientemente protección contra etapas exoeritrocíticas de paludismo. Este experimento muestra que los anticuerpos específicos de péptido también tiene la capacidad de reconocer la proteína nativa en esporozoitos de P. berghei y, por lo tanto se supone que pueden neutralizar esporozoitos in vivo . Esto lleva a una reducción en el número de hepatocitos infectados y a protección, mediada por células T CD8+ como un resultado de la modificación del equilibrio entre las etapas hepáticas y las células T CD8+ en favor de estas últimas. Además de generar anticuerpos, la inyección del péptido PbCS 242-310 también induce proliferación de células Thl (datos no mostrados) , aunque la protección no parece depender de células T CD4+. Aquí, las células T CD4+ pueden jugar un papel crucial en el inicio de una respuesta inmune específica de péptidos al proporcionar ayuda a células CTL o B específicas. Los presentes resultados demuestran que los polipéptidos grandes son inmunógenos eficientes cuando se inyectan en IFA. Aquí, la inmunización con el péptido PbCS 242-310 no solo genera un espectro amplio de respuestas inmunes sino que también proporciona protección dependiente de CD8+ contra infección inducida por esporozoito. En particular y de manera inesperada, el material oxidado induce un número más alto de precursores CTL y lleva a un mejor grado de protección contra una exposición por esporozoitos. Los datos de este experimento muestran el fundamento para utilizar el fragmento terminal CS oxidado de P. faleiparum en un ensayo humano fase I que se esta llevando a cabo. El ¡4-ai IJ.J resultado obtenido muestra que una proliferación de células T, de anticuerpos y respuestas de CTL similares también se obtienen en humanos (véase ejemplo 2) .

EJEMPLO 2 Respuesta inmunes en humanos contra el fragmento oxidado C terminal de la proteína de circumsesporozoito de Plasmodium faleiparum l . Introducción El péptido sintético Pf CS 282-383 que corresponde al extremo C terminal de la proteína de circumsesporozoito de Plasmodium faleiparum cepa NF-54 ha sido evaluado como una vacuna potencial contra el paludismo,- este estudio se inicia siguiendo los estudios preclínicos siguientes que indican su capacidad para inducir anticuerpos, proliferación de linfocitos y linfocitos T citotóxicos (CTL) , así como para proteger contra infección por paludismo en diversos modelos animales. La evaluación se ha diseñado como un ensayo clínico fase I no aleatorizado, abierto, con el objetivo de establecer la seguridad del péptido, cuando se inyecta en presencia de adyuvantes . 2. Características del péptido El péptido se sintetiza, purifica y se coloca en botellas de manera estéril en frascos de vidrio apropiadamente para las dosis de prueba. La calidad de la preparación satisface los criterios de un producto GLP para uso humano. 3. Resultados Como se observa en las figuras 4 y 5, se obtienen las respuestas de anticuerpos y la proliferación de células T después de inmunización de voluntarios no expuestos, con 100 µg de antígeno en MontanideMR ISA-720. De manera similar, se observa la producción de IFN-? dependiente de CD8 después de la inmunización (tabla 3) . La tabla 3 resume los resultados de un experimento en el cual se evalúa la respuesta específica de CD8 para los epitopos HLA-A* 0201 de Pf CS NF54 (334-342) antes de la inmunización, 2 ó 3 meses después de la segunda, y 3 meses después de la tercera inmunización. Específicamente, se enumeran las células productoras de IFN-? por ELISPOT utilizando métodos diferentes de cuenta de puntos en paralelo, lectores visual y 2 diferentes lectores ELISPOT (AID 1.2 y BioSys) . En base en el método de conteo, se obtienen diferentes resultados. ÍSaai-at ... la . . . . a j. *-m?, ,t*?,tm .. »-" ~ * - * - *** *»** -* A Tabla 3 Respuesta específica de CD8 en voluntarios HLA-A* 0201 antes y después de la segunda y tercera inmunización valor medio para 8 voluntarios HLA-A* 0201 e intervalo de respuestas en muy sensibles ** los 8 voluntarios se determinaron como muy sensibles o no insensibles cuando los métodos de conteo proporcionaron respuestas totalmente positivas o negativas, respectivamente, y como sensibles intermedios cuando no concordaron. *** análisis con células congeladas,- todos los demás puntos en el tiempo, el análisis se realiza con células frescas .

En conclusión, los presentes ejemplos proporcionan evidencia de que los polipéptidos sintéticos grandes representan una alternativa valiosa para la producción de vacunas capaces de estimular facetas múltiples del sistema inmune . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

B3a.

Claims (17)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una vacuna contra el paludismo, en particular para uso en humanos, caracterizada porque comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la parte C terminal de la proteína de Circumsesporozoito de una especie de Plasmodium, el polipéptido el cual comprende por lo menos las cuatro cisteínas terminales a partir de las cuales está oxidado por lo menos un par, la vacuna comprende adicionalmente y de manera opcional un portador, adyuvante y microesferas biodegradables, adecuadas.

2. La vacuna, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de circumsesporozoito es de Plasmodium faleiparum.

3. La vacuna, de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la proteína de circumsesporozoito Plasmodium faleiparum cepa NF54.

4. La vacuna, de conformidad con las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el polipéptido consiste de por lo menos 42 aminoácidos consecutivos derivados de la parte C terminal de la proteína de circumsesporozoito.

5. La vacuna, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el polipéptido comprende los aminoácidos de la parte C terminal 342 a 383 de Plasmodium faleiparum NF54.

6. Una vacuna, como se indica en las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque todas las cisteínas están oxidadas.

7. La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el adyuvante es MontanideMR.

8. La vacuna de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, para uso en la profilaxis de paludismo.

9. El uso de una vacuna, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7, en la profilaxis de paludismo.

10. Un polipéptido para uso en una vacuna contra el paludismo, el polipéptido el cual tiene la secuencia de aminoácidos de la parte C terminal de la proteína de circumsesporozoitos de una especie de Plasmodium, polipéptido caracterizado porque ccri retrle .las cuatro cisteínas terminales a partir de las cuales por lo menos un par está oxidado.

11. El polipéptido, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína de circumsesporozoito es de Plasmodium faleiparum.

12. Un polipéptido, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína de circumsesporozoito es de Plasmodium faleiparum cepa NF54.

13 . Un polipéptido de conformidad con las reiviix?Lsacicp?S 10 a 12, polipéptido caracterizado porque acnsiste de per lo menos 42 aminoácidos consecutivos derivados de la parte C terminal de la proteína de circumsesporozoitos.

14 . Un polipéptido, de conformidad con las reiviitíLcecicnss 10 a 13, paLip?ptidD caracterizado porque emprende les aminoácidos de la parte C terminal 342 a 383 de Plasmodium faleiparum NF54.

15. El polipéptido de conformidad con las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque todas las cisteínas están oxidadas.

16. El polipéptido, de conformidad con las reivindicaciones 10 a 15, para uso en una vacuna contra el paludismo.

17. El uso de uno o más péptidos, de conformidad con las reivindicaciones 10 a 15, para la preparación de una vacuna contra el paludismo.