MXPA01006290A

MXPA01006290A - Piruvato carboxilasa a partir de corynebacterium glutamicum.

Info

Publication number: MXPA01006290A
Application number: MXPA01006290A
Authority: MX
Inventors: Anthony J Sinskey
Original assignee: Massachusetts Inst Technology
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2002-04-17
Also published as: JP2003503006A; KR20010112232A; AU2203399A; CN1336958A; WO2000039305A1; EP1147198A1; BR9816106A; CA2356446A1

Abstract

La presente invencion se refiere una enzima anaplerotica del Corynebacterium glutamicum que repone el oxaloacetato consumido durante la produccion de la lisina y el acido glutamico en fermentaciones industriales. En particular, se proporcionan las moleculas del acido nucleico aisladas que codifican la proteina de la piruvato carboxilasa. Tambien se proporcionan los polipeptidos de la piruvato carboxilasa.

Description

PIRUVATO CARBOXILASA A PARTIR DE CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La presente invención se refiere a una proteína de piruvato carboxilasa de corynebacterium glutamicum y a polinucleotidos que codifican esta proteína. Información antecedente La piruvato carboxilasa es una enzima anaplerotica importante que reemplaza el oxaloacetato consumido para la biosíntesis durante el crecimiento, ó la producción de la lisina y el ácido glutámico en fermentaciones industriales. El mecanismo de reacción en dos etapas catalizado-por la piruvato carboxilasa se muestra abajo: Mg2+acetil-CoA MgATP+HCO~3+ENZ-biotina ^ MgADP+Pi+ENZ-biotina-CO"2 (1) ENZ-biotin-CO~2+Piruvato - ENZ-biotina+oxaloacetato (2) En la reacción (1) el dominio de la carboxilasa de biotina dependiente del ATP carboxila un grupo prostético de la biotina enlazada a un residuo especifico de la lisina en el dominio de la proteína (BCCP) transportadora de biotin-carboxilo. La acetil-coenzima A activa la reacción (1) incrementando la proporción o velocidad de la escisión del ATP dependiente del bicarbonato. En la reacción (2), el Ref: 129957 dominio de BCCP dona el C02 al piruvato en la reacción catalizada por el dominio de la transcarboxilasa (Attwood, P. V., Int. J. Biochem. Cell. Biol.. 27-231-249 (1995)). Los genes de la piruvato carboxilasa han sido clonados y secuenciados de: Rhizobium etli (Dunn, M. F., et al., Bacteriol. 178:5960-5970 (1996)), Bacillus stearothermophilus (Kondo, H., et al., Gene 151:47-50 (1997). Bacillus Subtillis (Genbank No. de acceso Z97025) , Mycobacterium tuberculosis (Genbank No. de acceso Z83018), Methanobacterium thermoautotrophicum (Mukhopadhyay, B., J. Biol. Chem. 273:5155-5166 (1998). La actividad de la piruvato carboxilasa ha sido medida previamente en Brevibacterium lactofermentum (Tosaka, O., et al., Agrie. Biol. Chem. 43:1513-1519 (1979) y Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch, P. G., et al., Microbiology 143:1095-1103 (1997) . La investigación previa ha indicado que el rendimiento y la productividad de la familia del aspartato de los aminoácidos dependen crucialmente del flujo ó paso del carbono a través de la vía anaplerótica (Vallino, J. J. & Stephanopoulos, G., Biotechnol. Bioeng 41:633-646 (1993)). En la base de los equilibrios de los metabolitos, se puede mostrar que la proporción de la producción de la lisina es menor ó igual que la proporción de la síntesis del oxaloacetato vía la ruta anaplerótica. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee moléculas aisladas del ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene la secuencia de aminoácidos en la Figura 1(SEC ID NO: 2) ó la secuencia de aminoácidos codificada por el clon cósmido depositado en el hospedero bacteriano como el Deposito ATCC Numero . La secuencia de los nucleótidos determinada por la secuenciación del clon cósmido de la piruvato carboxilasa depositado, que se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:l), contiene una estructura de lectura abierta que codifica un polipéptido de 1140 residuos de aminoácidos que tiene un peso molecular deducido de aproximadamente 123.6 kDa. La secuencia de 1140 aminoácidos de la proteína de la piruvato carboxilasa predicha se muestra en la Figura 1 y en la SEC ID NO:2. Así, un aspecto de la invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene la secuencia completa del aminoácido en la SEC ID NO: 2 (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene la secuencia completa del aminoácido codificada por el clon de cósmido contenido en el Deposito ATCC No. ; y (c) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) ó (b) de arriba. Otras Modalidades adicionales de la invención incluyen moléculas del ácido nucleico aislado que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica, y más preferentemente al menos el 95%, 97%, 98% ó 99% idéntica, a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) , (b) ó (c) de arriba, ó un polinucleótido que se hibridiza bajo condiciones severas de hibridización a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica a una secuencia de nucleótidos en (a) , (b) ó (c) de arriba. El polinucleótido que se hibridiza, no se hibridiza bajo condiciones severas de hibridización a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste de solo los residuos de A ó de solo los residuos de T. La presente invención también se refiere a los vectores recombinantes que incluyen las moléculas aisladas del ácido nucleico de la presente invención y las células hospederas que contienen los vectores recombinantes, así como también a los métodos de hacer tales vectores y células hospederas y para usarlas para la producción de los polipéptidos ó péptidos de la piruvato carboxilasa por las técnicas recombinantes. La invención además provee un polinucleótido de piruvato carboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido de piruvato carboxilasa que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en la Figura 1 (SEC ID NO:2); y (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido de piruvato carboxilasa que tiene la secuencia completa de aminoácidos codificada por el clon cósmido contenida en el Depósito ATCC No. . Los polipéptidos de la presente invención también incluyen los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos el 90% de similaridad, más preferentemente al menos el 95% de similaridad con aquellos descritos en (a) ó (b) de arriba, así como también los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica, más preferentemente al menos 90% idéntica, y todavía más preferentemente el 95%, 97%, 98% ó 99% idéntica aquellas de arriba.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1D muestran el nucleótido (SEC ID N0:1) y las secuencias (SEC ID NO: 2) de aminoácidos deducidas de la proteína completa de piruvato carboxilasa determinada mediante la Secuenciación del clon del ADN contenido en el Depósito ATCC No. . La proteína tiene una secuencia de aproximadamente 1140 residuos de aminoácidos y un peso molecular deducido de aproximadamente 123.6 kDa. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee moléculas aisladas del ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que codifica la proteína de piruvato carboxilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO: 2) que se determinó secuenciando un cósmido clonado. La proteína de piruvato carboxilasa de la presente invención comparte homología en la secuencia con las proteínas de piruvato carboxilasa humana y de M. Tuberculosis . La secuencia del nucleótido mostrada en la Figura 1 (SEC ID N0:1) se obtiene secuenciando el cósmido III FIO que codifica un polipéptido de la piruvato carboxilasa, que se depositó el en la American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, y que se le dio el numero de acceso de Moléculas del Ácido Nucleico Al menos que de otra manera se indique, todas las secuencias de nucleótido determinadas secuenciando una molécula del ADN se determinaron aquí usando un secuenciador automatizado para el ADN (tal como el ABI Prism 377), y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas del ADN aquí determinadas se predijeron por la traducción de una secuencia de ADN determinada como arriba. Por lo tanto, como se conoce en la técnica para cualquier secuencia de ADN determinada por esta metodología automatizada, cualquier secuencia de nucleótidos aquí determinada puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por la automatización son típicamente aproximadamente al menos 90% idénticas, más típicamente aproximadamente al menos 95% a aproximadamente al menos el 99.9% idénticas a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de ADN secuenciada. La secuencia real puede ser más precisamente determinada por otras metodologías incluyendo los métodos de secuenciar manualmente al ADN bien conocida en la técnica. Como también se conoce en la técnica, una sola inserción ó eliminación en una secuencia de nucleótido determinada comparada con la secuencia real debe causar una desviación de la estructura en la traducción de la secuencia de nucleótidos de manera que la secuencia de aminoácidos prevista, codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente a la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de tal inserción ó eliminación. Al menos que de otra forma se indique, cada "secuencia de nucleótidos" aquí mostrada anteriormente se presenta como una secuencia de desoxiribonucleótidos (abreviado como A, G, C, y T) . Sin embargo, se pretende para la "secuencia de nucleótido" de una molécula de ácido nucleico ó polinucleótidos, para una molécula ó polinucleótido de ADN, una secuencia de desoxiribonucleotidos, y para una molécula ó polinucleótido de ARN, la secuencia correspondiente de ribonucleotidos (A, G, C, y U) donde cada desoxinucleótido de timidina (T) en la secuencia especificada de desoxinucleótidos es reemplazada por el ribonucleótido de uridina (U) . Por ejemplo, la referencia a una molécula de ARN que tiene la secuencia SEC ID N0:1 establecida anteriormente usando las abreviaciones del desoxiribonucleótido se pretende para indicar una molécula de ARN que tiene una secuencia en que cada desoxinucleótido A, G, ó C de SEC ID NO:l ha sido reemplazada por el ribonucleótido correspondiente A, G, ó C, y cada desoxinucleótido T ha sido reemplazado por el ribonucleótido U. Usando la información aquí provista, tales como la secuencia del nucleótido en la Figura 1, una molécula del ácido nucleico de la presente invención que codifica un polinucleótido de piruvato carboxilasa puede obtenerse usando procedimientos de clonación y selección, tales como aquellos para clonar ADNs usando ARNm como material de inicio. La proteína de piruvato carboxilasa mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO: 2) es aproximadamente 63% idéntica a la M. tuberculosis y 44% idéntica a la humana. Como podría apreciarse por alguno de experiencia ordinaria, debido a las posibilidades de errores de secuenciación discutidas arriba, así como también la variabilidad de los sitios de escisión para las guías en diferentes proteínas conocidas, el polipéptido real de piruvato carboxilasa codificado por el cósmido depositado comprende aproximadamente 1140 aminoácidos, pero puede estar en cualquier parte del rango de 1133-1147 aminoácidos. Como se indicó, las moléculas del ácido nucleico de la presente invención pueden estar en la forma del ARN, tale como ARNm, ó en la forma del ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genómico obtenido por la clonación ó producido sintéticamente. El ADN puede ser de doble hebra o de una sola hebra. El ADN ó ARN de una sola hebra puede ser la hebra codificante, también conocida como la hebra sentido o dirección 5' , ó este puede ser la hebra no codificante, también referido como la hebra anti-sentido o dirección 3' . Por molécula (s) "aislada" del ácido nucleico se pretende una molécula de ácido nucleico, ADN ó ARN, que ha sido removida de su ambiente natural. Por ejemplo, las moléculas recombinantes del ADN contenidas en un vector son consideradas aisladas para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de las moléculas del ADN aislado incluyen las moléculas de ADN recombinantes mantenidas en las células u hospederos heterólogos ó moléculas de ADN purificadas (parcialmente ó substancialmente) en solución. Las moléculas aisladas de ARN incluyen los transcriptos del ARN in vivo ó in vi tro de las moléculas del ADN de la presente invención. Las moléculas aisladas del ácido nucleico de acuerdo a la presente invención además incluyen tales moléculas producidas sintéticamente . Las moléculas aisladas del ácido nucleico de la presente invención incluyen las moléculas del ADN que comprenden una estructura de lectura abierta (ORF) con un codón de iniciación en las posiciones 199-201 de la secuencia del nucleótido mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l); las moléculas del ADN que comprenden la secuencia codificadora para la proteína de piruvato carboxilasa se muestra en la Figura 1 y la SEC ID NO: 2; y las moléculas del ADN que comprenden una secuencia substancialmente diferente de aquellas descritas arriba pero que, debido a la degeneración del código genético, aún codifican la proteína de piruvato carboxilasa. Por supuesto, el código genético es bien conocido en la técnica. Así, sería de rutina para alguien experto en la técnica generar las variantes descritas arriba. En otro aspecto, la invención provee las moléculas aisladas del ácido nucleico que codifican el polipéptido de piruvato carboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el clon cósmido depositado como el Deposito ATCC No. . Preferentemente, esta molécula de ácido nucleico codificará el polipéptido codificado por el clon depositado descrito arriba. La invención además provee una molécula aislada del ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótido mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) ó la secuencia de nucleótido del ADN de piruvato carboxilasa contenida en el clon depositado descrito arriba, ó una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una de las secuencias de arriba. En otro aspecto, la invención provee una molécula aislada de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que se hibridiza bajo condiciones severas de hibridización a una porción del polinucleótido en una molécula del ácido nucleico de la invención descrita arriba, por ejemplo, el clon cósmido contendido en el Depósito ATCC No. . Se pretende por "condiciones severas de hibridización", la incubación durante toda la noche a 42 °C en una solución que comprende: formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15mM) , fosfato de sodio 50mM (pH 7.6), 5x de solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20µg/ml de ADN del esperma de salmón cortado, desnaturalizado, seguida por el lavado de las filtros en O.lx SSC aproximadamente a 65°C. Por un polinucleótido que se hibridiza a una "porción" de un polinucleótido se indica un polinucleótido (ya sea el ADN ó ARN) que se hibridiza al menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt) , y más preferentemente al menos aproximadamente 20 nt, todavía más preferentemente al menos aproximadamente 30 nt, y aún más preferentemente aproximadamente 30-70 nt del polinucleótido de referencia. Estas son útiles como sondas y cebadores de diagnóstico. Por supuesto, los polinucleótidos que se hibridizan a una porción más grande que el polinucleótido de referencia (por ejemplo, el clon cósmido depositado) , por ejemplo, una porción 50-750 nt en longitud, ó aún a la longitud entera del polinucleótido de referencia, también son útiles como sondas de acuerdo a la presente invención, como son polinucleótidos correspondientes a la mayoría, sí no a todos, de la secuencia de nucleótido del ADN depositado ó la secuencia de nucleótido como se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:l). Por una porción de un polinucleótido de "alíñenos 20 nt en longitud", por ejemplo, se pretende indicar 20 ó más nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótido del polinucleótido de referencia, (por ejemplo, el ADN depositado ó la secuencia de nucleótido como se muestra en la Figura 1 (SEC ID NO:l)). Como se indicó, tales porciones son diagnósticamente útiles ya sea como una sonda de acuerdo a las técnicas convencionales de hibridización del ADN ó como cebadores para la amplificación de una secuencia objetivo por la reacción (PCR) de la cadena de la polimerasa, como se describió, por ejemplo, en Molecular Cloning, A labora tory Manual , 2da. edición, editado por Sambrook, J. , Fritsch, E. F. And Maniatis, T., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, la descripción completa del cual se incorporó aquí como referencia. Dado que se ha depositado un clon cósmido de piruvato carboxilasa ha sido depositado y su secuencia de nucleótidos ha sido determinada en la Figura 1 (SEC ID N0:1), la generación de polinucleótidos que se hibridizan a una porción de la molécula del ADN de piruvato carboxilasa sería rutina para alguien experto en la técnica. Por ejemplo, la escisión ó corte de la endonucleasa de restricción por sonicación del clon cósmido de piruvato carboxilasa, podría fácilmente ser usado para generar porciones del ADN de varios tamaños que son polinucleótidos que se hibridizan a una porción de molécula del ADN de piruvato carboxilasa. Alternativamente, los polinucleótidos hibridizadores de la presente invención pueden ser generados sintéticamente de acuerdo a las técnicas conocidas. Como se indicó, las moléculas del ácido nucleico de la presente invención que codifican el polipéptido de la proteína del piruvato carboxilasa pueden incluir, pero no están limitadas a aquellas que codifican la secuencia de aminoácido del polipéptido, por sí mismas; la secuencia codificadora para el polipéptido y las secuencias adicionales, tales como la secuencia de la proteína pre-, ó pro- ó prepro-; la secuencia codificadora del polipéptido, con ó sin las secuencias codificadoras adicionales antes mencionadas, junto con las secuencias no codificadoras, adicionales, incluyendo por ejemplo, pero no limitadas a las secuencias de los intrones y no codificadoras 5' y 3' , tales como las secuencias transcritas, no traducidas que juegan un papel en la transcripción, procesamiento del ARNm incluyendo las señales del empalme y de poliadenilación, por ejemplo - el enlace del ribosoma y la estabilidad del ARNm; una secuencia codificadora adicional que codifica para aminoácidos adicionales, tales como aquellas que proveen funcionalidades adicionales. Así, la secuencia que codifica al polipéptido puede ser fusionada a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica a un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado ó combinado. En ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora de aminoácido es un péptido de la hexa-histidina, tal como la etiqueta provista en una vector pQE (Qiagen, Inc) , entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Como se describió en Gentzet al et . , Proc . Na ti . Acad. Sci . , USA 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina se provee para la purificación conveniente de la proteína de fusión. La etiqueta "HA" es otro péptido útil para la purificación que corresponde a un epítope derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza, que ha sido descrita por Wilson et al . , Cell 37767 (1984). La presente invención además se refiere a las variantes de las moléculas del ácido nucleico de la presente invención, que codifica las porciones, análogos ó derivados de la proteína de piruvato carboxilasa. Las variantes pueden presentarse naturalmente, tal como una variante alélica natural. Por una "variante alélica" se pretende indicar una de las varias formas alternas de un gen que ocupa un lugar en un cromosoma de un organismo. Genes II . Lewin Ed. Las variantes que se presentan de manera no natural pueden ser producidas usando las técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Tales variantes incluyen aquellas producidas por las substituciones, eliminaciones ó adiciones de nucleótidos. Las substituciones, eliminaciones ó adiciones pueden involucrar uno ó más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en regiones codificadoras ó no codificadoras o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir substituciones, eliminaciones ó adiciones de aminoácido conservativas ó no conservativas. Especialmente preferidas entres estas están las substituciones, adiciones y eliminaciones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína de piruvato carboxilasa ó las porciones de la misma. También especialmente preferidas en esta consideración son las substituciones conservativas. También especialmente preferidas son las moléculas de aminoácido que codifican la proteína de piruvato carboxilasa que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:2). También preferidos son los mutantes ó variantes por medio de los cuales la piruvato carboxilasa preferentemente se expresa de 2 a 20 veces más alto que su expresión en C. Glutamicum así como también los mutantes de la inhibición de retroalimentación. Otras modalidades de la invención incluyen las moléculas aisladas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido al menos 90% idéntica, y más preferentemente al menos 95%, 97%, 98% ó 99% idéntica a (a) una secuencia de nucleótido que codifica el polipéptido de piruvato carboxilasa que tiene la secuencia completa de aminoácido en SEC ID NO: 2; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del piruvato carboxilasa que tiene la secuencia completa de aminoácidos codificada por el clon cósmido contenido en el Depósito ATCC No. ; ó (c) una secuencia complementaria de nucleótidos de cualquiera de las secuencias de nucleótido en (a) ó (b) . Por un polinucleótido que tiene una secuencia nucleótidos de al menos, por ejemplo, el 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótido de referencia que codifica un polipéptido de piruvato carboxilasa se pretende indicar que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polinucleótido puede incluir hasta mutaciones en cinco puntos por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótido de referencia que codifica el polipéptido de la piruvato carboxilasa. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica la secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia puede ser eliminado ó substituido con otro nucleótido, ó un numero de nucleótidos de hasta el 5% del total de nucleótidos en la secuencia de referencia pueden ser insertados dentro de la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' ó 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia ó en cualquier parte entre aquellas posiciones terminales, intercalados ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia ó en uno ó más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como una materia practica, sí cualquier molécula en particular de ácido nucleico es al menos el 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% idéntica a, por ejemplo, la secuencia de nucleótido mostrada en la Figura l o a las secuencia de nucleótidos del clon cósmido depositado, puede ser determinado convencionalmente usando programas de computo conocidos tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53771). El Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (Advances in Applied Ma thema tics 2:482-489 (1981)) para encontrar el mejor segmento de homología entre las dos secuencias. Cuando se usa Bestfit ó cualquier otro programa de alineación de la secuencia para determinar sí una secuencia en particular es, por ejemplo, el 95% idéntica a la secuencia de referencia de acuerdo a la presente invención, los parámetros son determinados, por supuesto, de manera que el porcentaje de identidad se calcule con la longitud total de la secuencia de nucleótido de referencia y que son permitidas separaciones en la homología de hasta el 5% del numero total de nucleótidos en la secuencia de referencia. La presente aplicación está dirigida a las moléculas del ácido nucleico al menos 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% idénticas a la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) ó a la secuencia de aminoácidos del ADN depositado, indistintamente de sí estos codifiquen un polipéptido que tiene la actividad de la piruvato carboxilasa. Esto es porque, aún cuando una molécula particular del ácido nucleico no codifica un polipéptido que tiene la actividad de la piruvato carboxilasa, alguien experto en la técnica conocería, no obstante, como usar la molécula del ácido nucleico, por ejemplo, como un sonda de hibridización ó cebador (PCR) de la reacción en cadena de la polimerasa . Sin embargo, son preferidas las moléculas del ácido nucleico que tienen secuencias al menos 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% idénticas a la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) ó a la secuencia de ácidos nucleicos del ADN depositado que, en efecto, codifica un polipéptido que tiene la actividad de la proteína de piruvato carboxilasa. Para "un polipéptido que tiene actividad de la piruvato carboxilasa" se pretende indicar que los polipéptidos exhiban una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la proteína de piruvato carboxilasa de la invención como cuantificó en un ensayo biológico en particular. Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, alguno de experiencia ordinaria en la técnica debe inmediatamente reconocer que un numero grande de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de al menos el 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% idéntica a la secuencia del ácido nucleico del ADN depositado ó a la secuencia del ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) codificará un polipéptido "que tiene actividad de la proteína de piruvato carboxilasa". En efecto, dado que las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican todas el mismo polipéptido, esto será claro para un experto en la técnica aún sin realizar el ensayo de comparación descrito arriba. Además debe reconocerse en la técnica que, para tales moléculas de ácido nucleico que no degeneran las variantes, un numero razonable también debe codificar un polipéptido que tiene actividad de la proteína de piruvato carboxilasa. Esto es porque el experto en la técnica esta completamente enterado de que las substituciones de aminoácidos son ya sea menos probables ó no probables de efectuar significativamente la función de la proteína (por ejemplo, reemplazando un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático) . Por ejemplo, la guía que concierne a como hacer fenotípicamente las substituciones silentes o silenciosas de los aminoácido esta provista en Bowie, J. U., et al . , "Deciphering the Message in Protein Secuences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que hay dos metodologías principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos al cambio. El primer método apoyado en el proceso de evolución, en que las mutaciones son ya sea aceptadas ó rechazadas por la selección natural. La segunda metodología usa la ingeniería genética para introducir los cambios de los aminoácidos en las posiciones especificas de un gen clonado y las selecciones ó separaciones para identificar las secuencias que mantienen funcionalidad. Como los autores declaran, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a substituciones de aminoácidos. Además los autores indican que los cambios en los aminoácidos son probables de ser permisivos a una cierta posición de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos de aminoácidos escondidos requieren de cadenas laterales no polares, mientras que pocas características de las cadenas laterales de la superficie son generalmente conservadas. Otras de tales substituciones fenotípicamente silenciosas ó silentes son descritas en Bowie, J. U., et al . , supra , y en las referencias aquí citadas. Vectores y células hospederas La presente invención también se refiere a los vectores que incluyen las moléculas aisladas de ADN de la presente invención, las células hospederas que son diseñadas por ingeniería genética con los vectores recombinantes, y la producción de los polipéptidos de la piruvato carboxilasa ó porciones de los mismos por las técnicas recombinantes. Las construcciones recombinantes pueden ser introducidas dentro de las células hospederas usando técnicas bien conocidas tales como la infección, transducción, transfección, transvección, conjugación, electroporación y transformación. El vector puede ser, por ejemplo, un Fago, plásmido, vector viral ó retroviral. Los polinucleótidos se pueden unir a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un hospedero. Generalmente, un vector plásmido se introduce en un precipitado, tal como el precipitado de fosfato de calcio, ó en un complejo con un lípido cargado. Sí el vector es un virus, este puede ser empacado in vi tro usando una línea de células empacadoras apropiadas y después introducido dentro de las células hospederas. Son preferidos los vectores que comprenden regiones de control cis-actuante al polinucleótido de interés. Los factores apropiados trans-actuantes pueden ser proporcionados por el hospedero, proporcionado por un vector complementario ó proporcionado por el vector mismo luego de la introducción dentro del hospedero. En ciertas modalidades preferidas en este respecto, los vectores proveen la expresión especifica, que pueden ser inducible y/ó específica del tipo de célula. Particularmente son preferidos entre tales vectores aquellos inducibles por los factores ambientales que son fácilmente manipulables, tales como la temperatura y los aditivos nutritivos . Los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen los vectores derivados de cromosomas, episomas, y derivados de un virus, por ejemplo, los vectores derivados de los plásmidos bacteriales, bacteriófago, episomas de levadura, elementos cromosomales de levadura, virus tales como el baculovirus, el virus papova, el virus vaccinia, adenovirus, el virus de la viruela de gallina, el virus de pseudorabia y los retrovirus, y los vectores derivados de las combinaciones de los mismos, tales como los cosmidos ó fagémidos. El inserto de ADN deberá ser operativamente enlazado a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores E. Coli la c, trp y ta c, los promotores tempranos y tardíos del SV40 y los promotores del LTRs retroviral, por nombrar algunos. Otros promotores adecuados deben ser conocidos por el experto en la técnica.-Las construcciones de expresión contendrán además sitios para la iniciación, terminación, de la transcripción y en la región transcrita un ribosoma vinculado al sitio para la traducción. La porción codificadora de los transcriptos maduros expresados por construcciones deben incluir una codón iniciador de la traducción (AUG ó GUG) en el inicio y un codón de terminación apropiadamente posicionados en el extremo del polipéptido que va a ser traducido. Como se indicó, los vectores de expresión deben preferentemente incluir al menos un marcador seleccionable. Tales marcadores incluyen la resistencia a la reductasa de dihidrofolato ó a la neomicina para el cultivo de las células eucarióticas y los genes de resistencia de la tetraciclina, ampicilina, cloramfenicol ó canamicina para cultivar en E . Coli y otras bacterias. Los ejemplos representativos de los hospederos apropiados incluyen las células bacteriales, tales como E . Coli , C. Gl utami cum , Streptomyces y células de Sa lmoella typhimuri um; células fúngicas, tales como las células de levadura. El medio y las condiciones de cultivo apropiadas para las células hospederas descritas arriba son conocidas en la técnica. Entre los vectores preferidos para su uso en las bacterias pA2 , pQE70, pQE60, y pQE-9, disponibles de Qiagen; Los vectores pBS, los vectores Phagescript, los vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl Y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL, disponibles de Pharmacia. Otros vectores adecuados deben ser fácilmente apreciables al experto en la técnica. Entre los promotores bacterianos conocidos para su uso en la presente invención se incluyen los promotores de E. Coli lacl y lacZ, los promotores T3 y T7, el promotor gpt , los promotores lambda PR y PL y el promotor trp . Los promotores eucarióticos adecuados incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor timidina cinasa de HSV, los promotores temprano y tardíos de SV40, los promotores del LTRs retroviral, tales como aquellos del virus del sarcoma Rous (RSV) , y los promotores de la metallotioneina, tales como el promotor de la metallotioneina-I del ratón. La introducción de la construcción dentro de la célula hospedera puede ser efectuada por la transfección del fosfato de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la transfección catiónica mediada por lípidos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Tales métodos son descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como Davis et al . , "Basic Methods in Molecular Biology", (1986) . La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por los eucariotes superiores puede ser incrementada insertando una secuencia mejoradora dentro del vector. Los mejoradores son elementos cis-accionantes del ADN, usualmente aproximadamente de 10 a 300 bp que actúan para incrementar la actividad de la transcripción de un promotor en una tipo de célula hospedera dado. Los ejemplos de mejoradores incluyen el mejorador SV40, que esta localizado en el costado retrasado del origen de la replicación en 100 a 270 bp, el mejorador del promotor temprano de citomegalovirus, el mejorador de polioma en el costado retrasado o tardío del origen del replicación y los mejoradores de adenovirus. Para la secreción de la proteína traducida en el lumen del retículo endoplásmico, dentro del espacio periplásmico ó dentro del ambiente extracelular, las señales de secreción apropiadas pueden ser incorporadas dentro del polipéptido. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido ó pueden ser señales heterólogas. El polipéptido puede ser expresado en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solo las señales de secreción, sino también las regiones funcionales heterólogas adicionales. Así, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cambiados, puede ser añadida a N-terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedero, durante la purificación, ó durante el manejo y almacenamiento subsecuente. También, las proporciones del péptido pueden ser añadidas al polipéptido para facilitar la purificación.

La proteína de piruvato carboxilasa puede ser recuperada y purificada de los cultivos de la célula recombinante mediante los métodos bien conocidos incluyendo el sulfato de amonio ó la precipitación con etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico ó catiónico, cromatografía con fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofobica, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Más preferentemente, se emplea la cromatografía liquida de alto rendimiento ("HPLC") para la purificación. Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados naturalmente, productos de procedimientos sintéticos químicos, y los productos producidos por las técnicas recombinantes de un hospedero procariótico ó eucariótico, incluyendo, por ejemplo, bacterias, levadura, plantas superiores, células de insectos y mamíferos. Dependiendo del hospedero empleado en un proceso de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados ó pueden ser no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención puede también incluir un residuo inicial de metionina modificado, en algunos casos como un resultado de los procesos mediados por el hospedero.

Polipéptidos y péptidos de piruvato carboxilasa La invención además provee un polipéptido aislado de la piruvato carboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el ADN depositado, ó la secuencia de aminoácidos en la Figura 1 (SEC ID N0:2), ó un péptido ó un polipéptido que comprende una porción de los polipéptidos de arriba. Los términos "péptido" y "oligopéptido" son considerados sinónimos (como se reconoce comúnmente) y cada término puede ser usado de forma intercambiable como el contexto lo requiera para indicar una cadena de al menos aminoácidos acoplados por enlaces peptidicos. La palabra "polipéptido" aquí se usó para las cadenas que contienen más de 10 residuos de aminoácidos. Todas las formulas ó secuencias del oligopéptido y polipéptido aquí se escribieron de izquierda a derecha y en la dirección del amino terminal al carboxilo terminal. Debe reconocerse en la_ técnica que algunas secuencias de aminoácidos de polipéptido de la piruvato carboxilasa puede variar sin efecto significante en la estructura ó función de la proteína. Sí tales diferencias en la secuencia son contempladas, podría recordarse que estas son áreas criticas ó cruciales de la proteína que determinan la actividad. En general, es posible reemplazar los residuos que forman la estructura terciaria, asegurándose que los residuos usados realicen una función similar. En otros ejemplos, el tipo de residuo puede ser completamente no importante sí la alteración ocurre en una región no critica de la proteína. Así, la invención además incluye las variaciones del polipéptido de la piruvato carboxilasa que muestra una actividad substancial ó que incluyen las regiones de la proteína de la piruvato carboxilasa tal como las porciones de la proteína discutidas abajo. Tales mutaciones incluyen la eliminaciones, inserciones, inversiones, repeticiones, y substituciones de tipo (por ejemplo, substituir un residuo-hidrofilico por otro, pero, como una regla, no un residuo fuertemente hidrofílico por un residuo fuertemente hidrofobico) . Los cambios pequeños ó tales substituciones "neutrales" de aminoácidos deben generalmente tener un efecto pequeño en la actividad, seen Son los reemplazos vistos típicamente como substituciones conservativas, uno por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e lie; el intercambio de los residuos de hidroxilo Ser y Thr, el intercambio de los residuos ácidos Asp y Glu, la substitución entre los residuos de amida Asn y Gln, el intercambio de los residuos básicos de Lys y Arg y los reemplazos entre los residuos aromáticos Phe, Tyr. Como se indicó en detalle arriba, la guía adicional que concierne a que cambios de amino ácidos pueden ser probablemente fenotípicamente silenciosos ó silentes (por ejemplo, no es probable que tengan un efecto nocivo significante en una función) pueden ser encontrados en Bowie, J. U. et al . , "Deciphering the Message in Protein SECuences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, " Science 247:1306-1310 (1990) . Los polipéptidos de la presente invención son preferentemente provistos en una forma aislada, y preferentemente son substancialmente purificados. Una versión producida recombinantemente del polipéptido de la piruvato carboxilasa puede ser substancialmente purificada por el método de una etapa descrito en Smith and Jonson, Gene 67:31-40 (1988) . Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido codificado por el ADN depositado, el polipéptido de la SEC ID NO: 2, así como también los polipéptidos que tienen al menos el 90% de similaridad, más preferentemente al menos el 95% de similaridad, y todavía más preferentemente el 97%, 98% ó 99% de similaridad con aquellos descritos arriba. Otros polipéptidos de la presente invención incluyen los polipéptidos al menos 70% idénticos, más preferentemente al menos 90% ó 95% idénticos, todavía más preferentemente al menos 97%, 98% ó 99% idénticos al polipéptido codificado por el ADN depositado, al polipéptido de la SEC ID NO: 2, y también incluyen las porciones de tales polipéptidos con al menos 30 aminoácidos y más preferentemente al menos 50 aminoácidos. Por "% de similaridad" para dos polipéptidos se pretende indicar una escala de similaridad producida por la comparación de las secuencias de los aminoácidos de dos polipéptidos usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison. WI53711) y la configuración predeterminada para determinar la similaridad. El Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981) para encontrar el mejor segmento de similaridad entre las dos secuencias. Por un polipéptido que tienen una secuencia de aminoácido al menos, por ejemplo, el 95% "idéntica" a una secuencia de referencia de los aminoácidos de un polipéptido de la piruvato carboxilasa se pretende indicar que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de los aminoácidos de referencia del polipéptido de la piruvato carboxilasa. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de al menos el 95% idéntica a la secuencia de referencia de los aminoácidos, hasta el 5% de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia pueden ser eliminados ó substituidos con otros aminoácidos, ó un numero de aminoácidos de hasta el 5% de los residuos totales del aminoácido en la secuencia de referencia pueden ser insertados dentro de la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden ocurrir en las posiciones terminales amino ó carboxi de la secuencia de referencia del aminoácido ó en cualquier otro lugar entre aquellas posiciones terminales, intercaladas ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia ó en uno ó más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Como una materia practica, si cualquier polipéptido en particular es al menos el 90%, 95%, 97%, 98% ó 99% idéntico a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO: 2) ó a la secuencia de aminoácidos codificada por el clon cósmido depositado, puede ser determinado convencionalmente usando los programas de computo conocidos tales como el programa de Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 for Unís, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison. WI53711) . Cuando se usa el Bestfit ó cualquier otro programa de alineación de secuencia para determinar si una secuencia en particular es, por ejemplo, el 95% idéntica a una secuencia de referencia de acuerdo a la presente invención, los parámetros son determinados, por supuesto, de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud total de la secuencia de referencia de aminoácidos y que se desvían en la homología hasta el 5% del numero total de residuos del aminoácido en la secuencia de referencia. Herramientas genéticas para la manipulación del Corynebacterium Para hacer los cambios genéticos necesarios para el diseño metabólico en el Corynßjbac eriuí??, los investigadores necesitan ser capaces de identificar y clonar los genes que están involucrados en la vía objetivo. Estos también necesitan métodos para alterar estos genes que afectan la regulación ó el nivel de expresión de las enzimas que estos codifican, y para subsecuentemente reintroducir los genes alterados dentro del Corynebacterium para vigilar sus efectos en la biosíntesis de los aminoácidos. Por lo tanto, los ingenieros metabólicos deben tener a su disposición un ensayo de plásmidos que pueda se replicado en tanto la Corynebacteri um como en otras, hospederos más fácilmente manipulados, tales como el E . coli . También es requerida una colección de marcadores seleccionables que codifican, por ejemplo, la resistencia antibiótica, los promotores transcripcionales bien caracterizados que permiten la regulación de los genes alterados, y sistemas de transformación ó conjugación eficientes que permitan a los plásmidos ser insertados dentro de la cepa de Coryneba cteri um de objetivo. Plásmidos. Varios diferentes plásmidos han sido aislados y desarrollados por la introducción y la expresión de los genes en el Corynebacteri um (Sonnen, H., et al . , Gene 107: 69-14 (1991). La mayoría de estos se identificaron originalmente como plásmidos crípticos, pequeños (3-5 kbp) a partir del C. gl utamicum , C. call unae, y C. la ctofermen tum . Estos caen dentro de cuatro grupos de compatibilidad, ejemplificados por los plásmidos pCCI, pCLl, pHM1519, y pGAl . Los vectores de transferencia, plásmidos que son capaces de replicarse en tanto el Coryneba cteri um como el E . coli , han sido desarrollados a partir de los plásmidos crípticos mediante la incorporación de los elementos de los plásmidos de E. coli conocidos (particularmente el origen ColEl de la replicación de pBR322 ó pUC18), así como también los marcadores de resistencia antibiótica. Una quinta clase de plásmidos que es muy útil para la manipulación del Corynebacterium esta basada en pNG2, como un plásmido originalmente aislado del Coryneba cteri um diphtheriae (Serwold-Davis, T. M. , et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 84:4964-4968 (1987)). Este plásmido y sus derivados se. replican eficientemente en muchas especies de corinebacteria, así como también en E. coli . Dado que el origen único de la replicación en el pNG2 (un elemento de solo 1.8 kbp) funciona tanto en el hospedero Gram-positivo como en el Gram-negativo, no hay necesidad de añadir un elemento adicional de tipo ColEl a este. Como un resultado, los derivados del pNG2 (por ejemplo, pEP2) son mucho menores que los otros vectores de transferencia de Coryneba cteri um y son por lo tanto más fácilmente manipulados. Marcadores seleccionables. Varios genes que confieren la resistencia antibiótica han probado ser útiles para la selección del plásmido y en otros trabajos del ADN recombinante en la corinebacteria. Estos incluyen la resistencia de la canamicina determinante del 7n903, un marcador de ' resistencia a la higromicina aislado del Streptomyces hygroscopicus , un gen de resistencia a la tetraciclina del Streptococcus faecalis , un gen de resistencia a la bleomicina de Tn5, y un marcador de resistencia al cloramfenicol del Streptomyces acrimycini . El gen de ß-lactamasa que se emplea en muchos plásmidos de E. coli tales como el pBR322 no confiere la resistencia a la ampicilina en el Coryneba cteri um . Sistemas de transformación. Varios métodos han sido diseñados para introducir el ADN extraño dentro del Coryneba cteri um . Los métodos más recientes son empleados rutinariamente basados en los protocolos que han sido exitosos para otras especies Gram-positivas involucrando la incubación de los esferoplastos en presencia del ADN y el polietilen glicol (Yoshihama, M. et al . , J. Bacteriol . 162:591-597 (1985)). Estos métodos, aunque útiles son generalmente ineficientes, a menudo produciendo menos del 105 transformantes por miligramo de ADN. La electroporación de los esferoplastos del Corynebacteri um han probado ser un medio mucho más eficiente y confiable de transformación. Los esferoplastos son generados por el crecimiento de las células en el medio rico que contiene glicina y/ó concentraciones bajas de otros inhibidores de la biosíntesis de la pared de la célula, tales como la hidracida del ácido isonicotínico (isoniazida) , ampicilina, penicilina G, ó Tween-80. Los esferoplastos después son lavados en amortiguadores de sal inferior que contiene glicerol, se concentraron, y se mezclaron con el ADN antes de ser sometidos a la electroporación. Eficiencias tan altas como el 107 de transformantes por microgramo del ADN plásmido han sido reportadas con este protocolo. Un tercer método para transferir el ADN dentro de la corinebacteria involucra la transconjugación. Este método toma ventajas de la promiscuidad de las cepas del E. coli que transportan los derivados del RP4 plásmido. En el E. coli , RP4 codifica muchas funciones que median la transferencia conjugal de los plásmidos de la cepa hospedera a otras cepas receptoras del E . coli , ó aún a otras especies. Estas " funciones tra" median la formación del pilus y la transferencia del plásmido. El RP4 también transporta un origen de transferencia, ori T, un elemento de cis-accionamiento que se reconoce por el aparato de transferencia que permite al plásmido ser conducido a través del pilus y dentro de la cepa receptora. A partir de este sistema Simón et al . , (Bio/Technology 1:784-791 (1985)) ha desarrollado una herramienta de transconjugación útil que permite la transferencia de los plásmidos a partir del E. coli al Corynejac eriuffl. Estos relocalizan las funciones tra a partir del RP4 dentro del cromosoma del E . coli en una cepa llamada S17-1. Los plásmidos que transportan el RP4 ori T pueden ser movilizados del S17-1 dentro de otros receptores muy efectivamente. Aunque este método ha probado ser útil para introducir los plásmidos de replicación dentro del Corynejbacterium, este ha probado ser aún más útil para generar las disrupciones del gen. Esto se logró introduciendo un marcador seleccionable dentro de un clon del gen del Corynebacterium que sobresale para la disrupción. Este constructo después se enlaza dentro de un plásmido de E . coli que transporta el RP4 otiT pero que carece de un origen para soportar la replicación en el Coryneba cterium . El S17-1 que transporta este plásmido después se incuba con la cepa receptora y la mezcla después es transferida al medio selectivo. Puesto que el plásmido que se introdujo es incapaz de replicarse en la corinebacteria, los transconjugados que expresan el marcador seleccionable son más probables que experimentar una recombinación transversal dentro del ADN genómico. Cepas Deficientes en Restricción.

Independientemente del sistema de transformación usado, hay un precedente claro en la literatura que las corinebacterias son capaces de reconocer el ADN derivado del E . coli como extraño ó ajeno y más a menudo degradará a este. Esta capacidad ha sido atribuida al sistema de restricción y modificación del Coryneba cteri um . Para superar este sistema, algunos protocolos de transformación y transconjugación demandan calentar brevemente la cepa receptora antes de la transformación. El tratamiento con calor probablemente inactiva las enzimas responsables del sistema de restricción, permitiendo al ADN introducido establecerse antes de que las enzimas sean devueltas. Otra estrategia para mejorar la eficiencia de la transferencia del ADN ha sido aislar los mutantes del Corynebacterium que son deficientes en el sistema de restricción. Estas cepas incorporarán a los plásmidos que habían sido propagados en E. Coli con casi la misma eficiencia que los plásmidos que habían sido propagados en el Corynebacterium . En una estrategia alterna usada para evadir el sistema de restricción en el Corynebacterium, Leblon y colaboradores (Reyes, O., et al . , Gene 107:61-68 (1991)) desarrollaron un sistema de "integrones" para la disrupción del gen. Los integrones son moléculas de ADN que tienen las mismas propiedades de restricción/modificación que el ADN hospedero de objetivo, el ADN transportador que es homologo a una porción del genoma hospedero (es decir, una región del genoma que esta rota) , y son incapaces de replicarse en las células hospederas. Un gen clonado del Coryneba cterium es primero interrumpido con un marcador seleccionable en un plásmido que es propagado en una cepa del Corynebacteri um . Este constructo después es extirpado del plásmido de la corinebacteria y se auto-liga para formar una molécula circular sin replicación. Este "integron" es entonces electroporado dentro del hospedero restrictivo. La modificación del ADN permite a los integrones eludir el sistema de restricción del hospedero, y la recombinación dentro del genoma hospedero que permite la expresión del marcador seleccionable. Promotores. Los promotores transcripcionales confiables son requeridos para la expresión eficiente de los genes extraños en el Corynejacterium. Para ciertos experimentos también hay una necesidad por aquellos promotores regulados cuya actividad pueda ser inducida bajo severas condiciones de cultivo. Los promotores tales como los promotores fda , thrC, y hom derivados de los genes del Coryneba cterium han probado ser útiles para la expresión del gen heterologo. Los promotores inducibles del E . coli , tales como el Piac, Y Ptre* que son inducidos por isopropiltiogalactopiranosida (IPTG) cuando se presenta el represor la c ( lacl) ; PtzP, que responde al ácido acrílico de indol inductor cuando se presenta el represor trp ( trpR) ; y lambda Pi, que se reprime en presencia del represor lambda sensible a la temperatura (cI857), todos han sido usados para modular la expresión del gen en el Coryneba cteri um . Identificación del gen. Con todas estas herramientas en su lugar, todavía permanece el reto de identificar los genes relevantes del Corynejbacterium. En el E . coli , algunos de los recursos que han sido usados para aislar los genes son el Fago, los elementos transposables, los mapas genéticos del cromosoma del E . coli para los experimentos de la transducción y la transconjugación, y más recientemente, los mapas completos físicos y de la secuencia del cromosoma. Hasta ahora, El método más exitoso para identificar y recuperar los genes del Corynebacterium ha sido el uso del ADN genómico del Corynebacterium para completar los auxótrofos conocidos del E. coli . En este ejercicio, las bibliotecas de los plásmidos que transportan los fragmentos del genoma del Corynebacteri um son introducidos dentro de las cepas del E. coli que son deficientes en una enzima ó función en particular. Los transformantes que ya no demuestran una gran auxotrofía (por ejemplo, la deficiencia de la homoserina) son probables de transportar el gen complementario del Corynebacterium . Esta estrategia está dirigida a aislar numerosos genes del Coryneba cteri um, incluyendo varios de las vías responsables de la síntesis del derivado del aspartato y de los aminoácidos aromáticos, el metabolismo intermediario, y otros procesos celulares. Una limitación de esta estrategia es que no todos los genes del Corynebacteri um deben ser expresados en el hospedero del E. coli . Así, aunque un gen puede ser representado en la biblioteca del plásmido, este puede ser incapaz de complementar la mutación del E . coli y por lo tanto podría no ser recuperado durante la selección. Al superar esta limitación, un numero de genes han sido identificados con una estrategia similar en que una biblioteca del plásmido del Corynebacteri um tipo silvestre ó natural se usó para directamente complementar las mutaciones en otras cepas del Corynebacterium . Aunque esta estrategia evita la preocupación de la expresión del gen de insuficiencia en el hospedero auxotrófico, su utilidad está limitada por la pobre eficiencia en la transformación del plásmido en los auxótrofos. Aún otros genes han sido identificados mediante la hibridización con las sondas del ácido nucleico basándose en los genes homólogos de otras especies, y la amplificación directa de los genes usando la reacción en cadena de la polimerasa y el degenerar los cebadores oligonucléotidos . Elementos transponibles . Los elementos transponi bles son herramientas extremadamente poderosas en la identificación de un gen porque estos combinan la mutagénesis con la recuperación del gen. Las diferentes técnicas de la mutagénesis clásicas, generan mutaciones puntuales ó pequeñas eliminaciones dentro de un gen, por esa razón se "etiqueta" el gen alterado con una identificación sencilla. Se han encontrado un numero de elementos transpo nibles para transponerse en el Coryneba cteri um . Los transposones encontrados en los plásmidos pTPIO de C. xerosis y pNG2 del C. diphtheriae han mostrado transponerse en C. gl utami cum y confieren la resistencia a la eritromicina. Un grupo de Mitsubishi Chemical Company en Japón desarrolló una serie de transposones artificiales a partir de una secuencia de inserción, IS31831, que descubrieron en el C. glutamicum (Vertes, A. A., et al . , Mol . Gen . Genet . 245:397-405 (1995)). Después de insertar un marcador seleccionable entre las repeticiones invertidas de IS31831, estos investigadores fueron capaces de introducir el transposon resultante dentro de las cepas del C. glutamicum en el plásmido del E. coli (incapaz de replicarse en el Corynebacteri um) vía la electroporación. Encontraron que el marcador seleccionable se insertó dentro del genoma de la célula objetivo a una frecuencia de aproximadamente 4 x 104 mutantes/µg de ADN. El uso de tales transposones para generar los auxótrofos de Corynebacteri um ha llevado al aislamiento de varios genes responsables para la biosíntesis de los aminoácidos, así como también otras funciones en la corinebacteria . Fago de transducción . El Fago han sido usado en otros sistemas para hacer mapas en los lugares genéticos y para aislar genes. En 1976 en Ajinomoto Co . en Japón se examinaron 150 cepas de cepas caracterizadas y no caracterizadas de la bacteria corineforme que produce el ácido glutámico para identificar el Fago que puede ser útil para la transducción (Mornose, H., et al . , Gen . Appl . Microbiol . Rev. 16:243-252 (1995)). De 24 diferentes Fagos aislados recuperados de esta criba o selección, solo tres son capaces de transducir un marcador trp a partir de un donante trp+ a un recipiente trp' con cualquier frecuencia apreciable, aunque incluso esta eficiencia era solo 10" ó menor. Estos investigadores fueron capaces de mejorar ligeramente la eficiencia de la transducción mediante la inclusión de monofosfato de adesina cíclico 4mM (cAMP) ó cloruro de magnesio 1.2 M. Varios diferentes investigadores intentaron desarrollar métodos de transducción confiables aislando la corinefagos de las fuentes tales como las fermentaciones industriales contaminadas, suelos, y desechos de animales. Aunque muchos Fagos han sido aislados y caracterizados, pocos han sido asociados con la transducción, y existe aún una oportunidad de desarrollar un sistema de alta eficiencia, confiable para uso general con la bacteria que produce el ácido glutámico. EJEMPLOS Los siguientes de protocolos y detalles experimentos en están referidos en los ejemplos que siguen. Cepas bacterianas y plásmidos C. gl utami cum 21253 ( hom' , sobreproductor de la lisina) se usó para la preparación del ADN cromosómico. Escheri chia coli DH5 ( hsdR~ , recA' ) (hanahan, D. , J. Mol . Biol . 166:557-580 (1983)) se usó para las transformaciones.

El plásmido pCR2.1 TOPO (invitrogen) se usó para clonar los productos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El plásmido pRR850 se construyó en este estudio y comprende un fragmento de PCR 850-bp clonado en el plásmido pCR2.1 TOPO. Medio y Condiciones del Cultivo Las cepas de E. coli crecieron en un medio de Luria-Bertani (LB) a 37°C (Sambrook, J. , et al . , Molecular cloning: a labora tory manual , 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Harbor, NY (1989)). C. Glutamicum creció en el medio de LB a 30°C. Donde se notó, que la ampicilina se usó en las siguientes concentraciones: 100 µg/ml en placas y 50 µg/ml en el cultivo del liquido. Manipulaciones del ADN El ADN genómico se aisló del C. Gl utamicum como se describió por Tomioka et al . (Tomioka, N., et al . , Mol . Gen . Genet . 184:349-363 (1981)). Los fragmentos del PCR se clonaron dentro del vector pCR2.1 TOPO siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ADN de cósmido y plásmido se prepararon usando las columnas de giro Qiaprep y el ADN se extrajo de los geles de la agarosa con el equipo Qiaex (Qiagen) . Para una preparación de alta pureza a gran escala del ADN del cósmido para secuenciar, se usó el equipo Promega Wizard (Promega). Se usaron técnicas estándares para la transformación del E. Coli y la electroforesis con gel de agarosa (Sambrook, J. et al . , Molecular cloning: a labora tory manual , 2nd edn., Cold Harbor, NY (1989)). Las enzimas de restricción se compraron de Boehringer Mannheim ó New England Biolabs. Biblioteca del cósmido La biblioteca del cósmido usada se construyó clonando el ADN cromosómico del C. Glutamicum dentro del vector Supéreos (Stratagene) . La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR se realizó usando el equipo de centro del PCR de Boehringer Mannheim siguiendo las instrucciones del fabricante. Cuando la PCR se realizó en ADN cromosómico de Coryneba cteri um, se usó aproximadamente 1 µg de ADN en cada reacción. El cebador delantero usado es 5'GTCTTCATCGAGATGAATCCGCG3'_ y el cebador inverso usado es 5'CGCAGCGCCACATCGTAAGTAAGTCGC3' para la reacción PCR. Análisis de la mancha de puntos Las manchas de puntos que contienen el ADN a partir de los cósmidos identificados en este estudio y la sonda se prepararon como un control positivo usando el aparato de minipliegue S&S (Schleicher & Schüll). Un fragmento del 850-bp que codifican una porción del gen de piruvato carboxilato de Corynejbacterium se usó como la sonda. La sonda se etiquetó con digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim) en una reacción de etiquetado del ADN cebado aleatoriamente como se describió por el fabricante. La hibridización, el lavado y la detección con el colorímetro de las manchas de punto se efectuaron con el sistema Genius de Boehringer siguiendo los protocolos en su guía del usuario para filtrar la hibridización. La hibridización inicial con los 291 cósmidos se llevó a cabo a 65°C durante la noche y el lavado se realizó a la temperatura de hibridización. Para los 17 cósmidos que se usaron en la segunda criba o selección, la hibridización se llevó a cabo a 65°C, pero solo por 8 horas, y se disminuyo el tiempo de exposición de la película. La detección de las proteínas que contienen la biotina por el manchado Western Los extractos de las células a partir del C. glutamicum se prepararon como se describió por Jetten and Sinskey (Jetten, M. S. M., & Sinskey, A. J. , FEMS Mi crobiol . Let t , 111:183-188 (1993)). Las proteínas en los extractos de la célula se separaron en el dodecil sulfato de sodio (SDS) / geles de poliacrilamida al 7.5% en una aparato de mini gel BioRad y se electromancharon sobre nitro-celulosa, usando el aparto de mini transmanchado BioRad descrito por Towbin et al . , (Towbin, H., et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 76:4350-4354 (1979)). Las proteínas biotiniladas se detectaron usando fosfatasa alcalina conjugada con avidina de Biorad y sal de 5-bromo-4-cloro-3-indoilfosfato-p-toludina / cloruro de tetrazolio nitroazul de Schleicher Schüll. Secuenciación del ADN La secuenciación automatizada del ADN se realizó mediante la instalación de MIT Biopolímers empleando un secuenciador de ADN ABI Prism 377. Análisis de la secuencia Se usó el programa ADN trider Versión 1.0 (Institut de Recherche Fondamentale . Francia) para invertir, complementar y traducir la secuencia del ADN, y encontrar estructuras de lectura abierta en la secuencia. El programa BLAST ((Altschul, S. F. Et al . , J. Mol . Biol . . 215:403-410 (1990)) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) se empleó para comparar la proteína y las secuencias del ADN. La homología investigada en las proteínas se completó usando el conjunto de programas MACAW (NCBI) . Los cebadores PCR se diseñaron con la ayuda del conjunto de programas Primer Primer de Biosoft International. Se usó la herramienta del computo pI/MW en el servidor de biología molecular ExPasy (University of Geneva) para predecir la masa molecular y el pl de las secuencias deducida de los aminoácidos . Ejemplo 1 : El manchado Western para detectar las enzimas biotiniladas Dado que la piruvato carboxilato se conoce que contiene biotina, se usó el manchado Western para detectar la producción de las proteínas biotiniladas por C. Glutamicum . Dos proteínas biotiniladas se detectaron en los extractos preparados de las células que se hicieron crecer en el medio LB, (datos no mostrados) consistentes con los reportes previos. Una banda, localizada en aproximadamente 80 kDa, ha sido identificada como el dominio del transportador de la biotin-carboxilo (BCCP) de la acetil-CoA carboxilasa (Jager, W. Et al . , Arch . Microbiol . 166:76-82 (1996) ) . La segunda banda, a 129 kDa, se cree que es la enzima piruvato carboxilasa, puesto que estas proteínas están en el rango de 113-130 kDa (Attwood, P. V. Int . J. Biochem . Cell . Biol . 27:231-2349 (1995)).

Ejemplo 2: PCR y la clonación El gen de la piruvato carboxilasa de C. Glutamicum se clonó en base de la homología de las regiones altamente conservadas en los genes previamente clonados. Los genes de la piruvato carboxilasa a partir de trece organismos se examinaron y se diseñaron los cebadores correspondientes una sub-porción del enlace del ATP conservado en la piruvato carboxilasa y la región cercana a la porción de enlace del piruvato (Tabla 1) . Donde los aminoácidos fueron diferentes a los cebadores, se diseñaron en base a M. Tuberculosis debido a su relación cercana a C. Gl utami cum . Un fragmento de 850-bp se amplificó a partir del ADN genómico de C. Glutamicum usando el PCR y se clonó en el vector pCR2.1 TOPO de Invitrogen al plásmido pRR850 del constructo. Los cebadores también se diseñaron basados en el sitio de enlace con la biotina conservada y el sitio de enlace con el piruvato (los datos no se muestran). Ejemplo 3 : Aislamiento de un cósmido que contiene el gen de piruvato carboxilasa de C. Glutamicum. El fragmento de 850 pares de bases que contiene una porción del gen de piruvasa carboxilato de C. Gl utami cum se usó para sondear una biblioteca genómica de C. gl utamicum . En la primera ronda de selección, 17 de los 291 cósmidos en un manchado de punto aparecieron positivos. Una segunda ronda de selección se realizó sobre estos 17 cósmidos, usando la misma sonda pero en condiciones más severas, produciendo cuatro cósmidos con una señal positiva. Para confirmar que estos cósmidos ciertamente contengan el gen de la piruva to carboxilasa , se realizó la PCR usando los cuatro cósmidos como plantillas y los mismos cebadores se usaron para hacer la sonda. Un fragmento de 850-bp se amplificó a partir de todos los cuatro cósmidos positivos, se diseñaron IIIF10, IIE9, IIIG7 y IIIB7.

Organismo Región A Región B conservada conservada Caenorhabdi tis elegans YFIEVNAR ATFDVSM Aedes aegypti YFIEVNAR ATFDVAL Mycobacterium tuberculosis VFIEMNPR ATYDVAL Bacill us stearothermophilus YFIEVNPR ATFDVAY Pichia pastoris YFIEINPR ATFDVSM Mus musculus YFIEVÑSR ATFDVAM Ra ttus norvegicus YFIEVNSR ATFDVAM Saccharomyces cerevisiae 1 YFIEINPR ATFDVAM Saccharomyces cerevisiae 2 YFIEINPR ATFDVAM Rhizabium etli YFIEVNPR ATFDVSM Homo sapiens YFIEVNSR ATFDVAM Schizosaccharomyces pombe YFIEINPR ATFDVSM La Tabla 1. Las secuencias de la piruvato carboxilasa de 13 organismos (obtenidos de GenBank) se alinearon usando el conjunto de programas MACAW. Dos regiones altamente conservadas se seleccionaron y los cebadores oligonucleótidos se diseñaron en base a la secuencia del ADN del Mycobacteri um tuberculosis correspondientes a estas regiones. El cebador delantero se basó en la secuencia del ADN correspondiente a la región A conservada y el cebador inverso se basó en la secuencia de ADN correspondiente a la región B conservada. Ejemplo 4 : La estrategia de la secuenciación El inserto de 850-bp del plásmido pRR850 se secuenció usando los cebadores M13 delantero y M13 inverso. En base de esta secuencia, los cebadores Begrevl y Endforl se diseñaron y usaron para hacer la secuenciación hacia afuera desde el inicio y el final de la porción de 850-bp del gen de la piruvato de carboxilasa. El cósmido III FIO se usó como la plantilla o patrón de la secuenciación. El secuenciado se continuó mediante el diseño de los nuevos cebadores (Tabla 2) y se "caminó" a través del gen. Ejemplo 5: Análisis de la secuencia Se secuenció el 3637 bp del cósmido III FIO. Se identificó una estructura de lectura abierta 3420, bp, la cual se predijo para codificar una proteína de 1140 aminoácidos. La proteína deducida es 63% idéntica a la piruvato carboxilasa de M. tuberculosis y 44% idéntica a la piruvato carboxilasa humana, y el gen pe de C. gl utamicum se nombró en base a esta homología. La proteína deducida tiene un pl predicho de 5.4 y una masa molecular de 123.6 kDa, que es similar a la masa molecular subunitaria de 120 kDa estimada por la electroforesis con SDS/gel de poliacrilamida. En la dirección 5' de la metionina de inicio aparece estar un sitio AAGGAA de enlace al ribosoma de consenso. El sitio de inicio tranduccional predicho, basado en la homología a la secuencia de M. tuberculosis, es un codón GTG, como se ha observado en otras secuencias bacterianas (Stryer, L., Biochemis try, 3rd ed., Freeman, NY (1998); Keilhauer, C, et al . , Ba cteriol 75:5595-5603 (1993)). La secuencia del ADN ha sido presentada al GenBank y se le ha asignado al numero de acceso AF038548. El segmento amino-terminal de la piruvato carboxilasa de C. gl utami cum que contiene el hexapéptido GGGGRG, que corresponde o se aparea a la secuencia GGGG(R/K)G que se encontró en todas las proteínas que enlazan a la biotina y se considera que es un sitio que enlaza al ATP (Fry, D. C. et al., Proc. Nati. Acad. Scí. USA. 83:907-911 (1986); Post, L. E. et al., J. Biol. Chem. 265:7742-7747 (1990)). Se conservó una segunda región propuesta por estar involucrada en el enlace del ATP y está presente en las carboxilasa dependientes de la biotina y carbamifosfato sintetasa (Lim, F., et al., J. Biol.. Chem. 263:11493-11497 (1988)) en la secuencia del C. glutamicum. La proteína de piruvato carboxilasa del C. glutamicum predicha también contiene una porción de enlace al piruvato putativo, FLFEDPWDR, que se conservó en los dominios de la transcarboxilasa de la piruvato carboxilasa de Mycobacterium, Rhizobium y humana (Dunn, M. F. et al., J. Bacteriol. 178:5960-5670 (1996)). Los estudios de fluorescencia de triptofano con la transcarboxilasa muestran que el residuo Trp presente en esta porción esta involucrado en el enlace del piruvato (Kumer, G. K. et al., Biochemistry 27:5978-5983 (1988)). El segmento carboxi-terminal de la enzima contiene un sitio de enlace con la biotina putativa, AMKM, que es idéntica a aquellas encontradas en otras piruvato carboxilasas así como también los dominios de la proteína (BCCP) que transporta a la biotin-carboxilo de las otras enzimas dependientes de la biotina.

Nombre del ceb ador Secuencia del cebador (5' -3') Begrevl TTCACCAGGTCCACCTGG Endforl CGTCGCAAAGCTGACTCC Begrev2 GATGCTTCTGTTGCTAATTTGC Endfor2 GGCCATTAAGGATATGGCTG Begrev3 GCGGTGGAATGATCCCCGA Endfor3 ACCGCACTGGGCCTTGCG Endfor4 TCGCCGCTTCGGCAACAC Tabla 2. Las secuencias del ADN de los cebadores usados para obtener la secuencia del gen de la piruvato carboxilasa en el cósmido IIIF10 Estudios previos han mostrado que la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) no es la enzima anaplerotica principal para el C. gl utami cum, dado que su ausencia no afecta la producción de la lisina (Gubler, M. , et al . , Appl . Microbiol . Biotechnol . 40:857-863 (1994); Peters-Wendisch, P. G., et al . , Microbiol . Let t . 112:269-274 (1993)). Además, un numero de estudios han indicado la presencia de una enzima que carboxila al piruvato, empleando los experimentos de etiquetado con 13C y los análisis con RMN y GC-MS (Park, S. M. et al . , Applied Microbiol . Biotechnol . 47:430-440 (1997b); Peters-Wendisch, P. G. et al . , Arch .

Microbiol . 165:387-396 (1996)), ó ensayos enzimáticos con los extractos libres de la célula (Tosaka, 0., Agrie . Biol . , Chem . 43:1513-1519 (1979)) y las células permeables (Peters- Wendisch. P. G. et al . , Microbiol . 143:1095-1103 (1997)). Se 5 detectó una actividad muy baja de carboxilación del piruvato en los extractos libres de la célula, pero esta actividad no estuvo desacoplada a un antecedente de un ATP muy alto. Es altamente probable que la activada medida es debido a las enzimas gluconeogénicas reversibles, tales como el oxaloacetato descarboxilasa y la enzima málica. La presencia de la piruvato carboxilasa en C. gl utami cum hace altamente improbable que las enzimas gluconeogenicas mencionadas arriba puedan servir a las necesidades anapleróticas de esta cepa . 15 La secuencia de aminoácidos deducida del gen de la piruvato carboxilasa del C. gl utami cum tiene una significante similaridad a las secuencias de la piruvato carboxilasa de un grupo diverso de organismos. Esta contiene una dominio de la biotina carboxilasa en su región N- 20 terminal, un dominio BCCP en su región C-terminal, y un dominio en la transcarboxilasa con un sitio de enlace especifico para el piruvato en su región central. La proteína de piruvato carboxilasa del C. glutamicum muestra -. ...^ArntAsí-AB*!**-;**** una fuerte homología entre la piruvato carboxilasa de M. tuberculosis y de humano (Wexler, I. D. et al., Kbiochim. Biophys. Acta 1227:46-52 (1994)). Hay precedentes que han encontrado que el C. glutamicum contiene más de una enzima para realizar la función anaplerótica de regenerar el oxaloacetato. Pseudomonas citronellolis , Pseudomonas fluorscens , Azotobacter vinelandii y Thiobacillus novellus contienen tanto ppc como piruvato carboxilasa (O'Brien, R. W. et al., Biol.. Chem. 252:1257-1263 (1977); Scrutton, M. C. and Taylor, B. L. Arch. Biochem. Biophys. 164:641-654 (1974); Milrad de Forchetti, S. R. , & Cazullo, J. J. , J. Gen. Microbiol. 93:75-81 (1976); Charles, A. M., & Willer, D. W., Can. J. Microbiol. 30:532-539 (1984)). Zea mays contiene tres isozimas de ppc (Toh, H., et al., Plant Cell Environ. 17: .31-43 (1994)) y Saccharomyces cerevisiae contiene dos isozimas de la piruvato carboxilasa (Brewster, N. K. et al., Arch, Biochem, Biophys. 311:62-71 (1994)), cada una es regulada diferentemente. Con el descubrimiento presente de la existencia de un gen de la piruvato carboxilasa en el C. glutamicum, el numero de enzimas que pueden interconvertir el fosfoenolpiruvato (PEP), oxaloacetato y piruvato en esta cepa aumenta a seis. No ha sido previamente reportada esta presencia de todas las seis enzimas en un organismo. La P.

Ci tronellolis contiene un conjunto de cinco enzimas que se interconvierten a oxaloacetato, PEP y el piruvato, a saber piruvato quinasa, PEP sintetasa, PEP carboxilasa, oxaloacetato descarboxilasa y la piruvato carboxilasa (O'Brien, R. W. et al . , J. Biol . . Chem . 252:1257-1263 (1977)). La Azotobacter contiene todas las enzimas de arriba excepto la PEP sintetasa (Scrutton, M. C. & Taylor, B. L., Arch . Biochem . Biophys . 164:641-654 (1974)). La presencia en C. gl utamicum de las seis enzimas metabólicamente referidas sugiere que la regulación de estas enzimas a través de los efectores es importante. El estudio bioquímico y genético de todas las seis enzimas en coordinación con otras actividades en la dirección 3' puede dirigir a la elucidación de los procedimientos exactos necesarios para maximizar la producción de los metabolitos primarios por el organismo industrialmente importante. Ejemplo 6. La construcción de un mutante de la piruvato carboxilasa La estructura de lectura entera se amplificó del nucleótido 180 al nucleótido 3630 del ADN de la piruvato carboxilasa usando PCR. Los cebadores oligonucléotidos usados para la PCR se diseñaron para remover el sitio de Salí dentro de la secuencia codificadora por la mutagénesis silenciosa ó silente e introducir los sitios EcoRV y Salí en la dirección 5' y en la dirección 3' , respectivamente, de la estructura de lectura abierta. El producto de PCR se digirió con EcoRV y Salí y se clonó dentro del vector pBluescript. El plásmido resultante es el pPCBluescript . Para obtener una disrupción de pyc transportada por el plásmido, se construyó un derivado del pPCBluescript en el cual la porción media del gen del pyc se eliminó y se reemplazó con el gen tsr, que codifica la resistencia al antibiótico tiostreptona . El elemento RP4 mob después se insertó dentro del plásmido, produciendo pAL20. Este plásmido puede ser transferido conjugadamente dentro del Coryneba cterium, pero este después es incapaz de replicarse porque este solo tiene un origen ColEl de replicación. El pAL240 se transfirió del E . col i S17-1 hacia el C. gl utami cum vía la transconjugación, y los transconjugandos se seleccionaron en un medio que contiene tiostreptona y ácido nalidixico. Después que se confirmó el fenotipo de la resistencia al fármaco de cada transconjugado, los transconjugados se probaron para su habilidad al crecimiento en diferentes fuentes de carbón. Debido a que el pAL240 no puede replicarse en C. glutamicum, las únicas células que sobreviven pueden ser aquellas cuyos genomas han experimentado una recombinación con el plásmido. Varios candidatos se identificaron con el conjunto correcto de fenotipos: estos son resistentes a la tiostreptona y al ácido nalidixico, el adecuado crecimiento en las placas mínimas que contienen la glucosa ó el acetato como la única fuente de carbón, y crecimiento deficiente ó sin crecimiento en las placas mínimas que contiene el lactato como la única fuente del carbón. La hibridización Southern y los ensayos basados en PCR son usados para confirmar si solo hay una copia del gen de la piruvato carboxilasa en el genoma y que este está roto con el marcador de resistencia a la tiostreptona. Se examinaron la producción de la lisina y la producción de las proteínas biotiniladas por esta cepa, y la cepa Apyc como un control negativo en los ensayos de la actividad como una cepa hospedera para las pruebas de complementación. Ejemplo 7: Desarrollo de una cepa de sobreexpresión Con el propósito de probar la hipótesis que los niveles incrementados de la piruvato carboxilasa llevará a la producción incrementada de la lisina, es necesario construir cepas en las que la expresión del gen de la piruvato carboxilasa este bajo control de un promotor inducible . El vector pAPE12, que tiene el origen NG2 de replicación y un sitio de clonación múltiple en la dirección 3' del promotor tre controlado por IPTG, se usó como un vector de expresión en C. gl utamicum . Un derivado del pAPE12 se construyó el cual contiene el gen de la piruvato carboxilasa en la dirección 3' del Ptre. El gen de pyc se extirpó del pPCBluescript usando Salí y Xbal y se ligó al pAPE12 que se había escindido con las mismas enzimas, formando pLW305. El gen de la piruvato carboxilasa presente en pPCBluescript (y por lo tanto en pLW305) tiene el codón de inicio GTG tipo silvestre ó natural, y el sitio de restricción del Salí presente cerca del extremo 5' del gen de tipo silvestre ó natural eliminado por la introducción de una mutación silenciosa ó silente de una base durante la amplificación del gen de la piruvato carboxilasa. El pLW305 y el pAPE12 se electroporaron con varios antecedentes o fondos genéticos de Corynebacteri um . Debido a que el gen de la piruvato carboxilasa en el pLW305 tiene una codón de inicio GTG y porta algún ADN de intervención entre el promotor y el codón de inicio, un plásmido de sobreexpresión de la piruvato carboxilasa, pXLl, se diseñó que eliminará aquellos defectos. El extremo 5' del gen se amplificó del pLW305 con los cebadores oligonucléotidos que simultáneamente cambian el codon de inicio GTG a ATG e introducen un sitio de restricción BspLUll-1, que es compatible con Ncol . El producto PCR después se cortó con BspLUll-1 y Afel , y se enlazó con un segmento principal de 7.5 kb obtenido por la digestión parcial del pLW305 con el Ncol seguido del corte completo con el Afel. Dos conjuntos independientes de ligaciones y transformaciones produjeron los clones pXLl putativos. Ejemplo 8: Resultados de la fermentación Se ha mostrado que el nivel de la actividad de la piruvato carboxilasa varia enormemente con la fuente de carbón usada cuando el gen se expresa de su promotor C. glutamicum natural. Por lo tanto, se examinó la producción de la piruvato carboxilasa en cepas que crecen en estas fuentes de carbón. Las cepas ?RRL B-11474, ?RRL B-11474 (pLW305), y ?RRL B-11474 Apyc candidato 35 se cultivaron en matraces con un medio mínimo para ?RRL B-11474 con dos diferentes fuentes de carbón: la glucosa ó lactato. Los resultados sobre el crecimiento y la producción de aminoácidos se presentan abajo .

El NRRL B-11474 y el pLW305 muestran el mismo comportamiento en la glucosa. Ambas cepas producen la misma cantidad de biomasa y lisina. En el lactato las cepas también tienen una producción similar de lisina. El NRRL B- 11474 (pLW305) consumió todo el lactato en el medio (17 g/1) mientras que el tipo silvestre ó natural del NRRL B-11474 consumió 40% menos que el lactato durante el mismo periodo de tiempo. El NRRL B-11474 se calculó que consume lactato a una velocidad de 0.37 g de lactato/ hora, mientras que la cepa del NRRL B-11474 (pLW305) consumió este substrato a una velocidad de 0.65 g de lactato/ hora. El NRRL B-11474 Apyc no creció en el lactato, lo que es consistente con el fenotipo esperado. Su crecimiento en la glucosa es muy bajo y la cepa no produjo lisina.

Estudios cinéticos condujeron a caracterizar además el comportamiento de estas cepas. Ej mplo 9: La visualización de las proteínas biotiniladas La piruvato carboxilasa contiene biotina. Por lo tanto podría ser posible detectar la acumulación de esta enzima vigilando la apariencia de los productos biotinilados-en las células. Ejemplo 10: Geles electroforéicos Para detectar las proteínas biotiniladas en los geles electroforeticos, se usó una estreptavidina comercialmente disponible enlazada a la fosfatasa alcalina.

Los lisados de la proteína cruda de los cultivos inducidos y no inducidos de E . coli DH5a Ó NRRL B-11474 hospedaron al pAPE12 ó pLW305 y separaron las proteínas en geles electroforeticos de desnaturalización en 7.5% de poliacrilamida en duplicado. Un gel de cada par se manchó con Azul Brillante Coomassie para visualizar todas las proteínas y asegurar que los niveles iguales de proteína sean cargados en cada carril. Los otros geles son tratados con el reactivo de estreptavidina-fosfatasa alcalina, que enlaza a las proteínas biotiniladas. La localización de estas proteínas después puede ser visualizada abasteciendo fosfatasa alcalina con un substrato colorimétrico, 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) . Como se reportó por otros, se detectaron dos proteínas mayores biotiniladas. La especie de peso molecular más alto (aproximadamente 120 kDa) han mostrado ser la piruvato carboxilasa, y la especie de menor peso molecular (aproximadamente 60 kDa) es la subunidad biotinilada del acetil-CoA carboxilasa. Todas las publicaciones mencionadas anteriormente aquí son incorporadas en su totalidad como referencia. Mientras la invención anterior ha sido descrita en algún detalle para los propósitos de claridad y entendimiento, debe apreciarse bien por alguien experto en la técnica a partir de la lectura de esta divulgación que varios cambios en forma y detalle se pueden hacer sin desviarse del ámbito verdadero de la invención y las reivindicaciones anexadas.

Se hace constar que a la fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito lo anterior como precede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1.- Una molécula aislada de ácido nucleico, caracterizada porque que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos en SEC ID NO: 2, (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos completa, codificada por el clon cósmido contenido en ATCC Deposito No. ; y (c) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos en (a) ó (b) .
2.- La molécula del ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos completa en la SEC ID NO:l.
3.- La molécula del ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos en la SEC ID NO:l que codifica al polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene la secuencia de aminoácidos en SEC ID NO: 2.
4.- La molécula del ácido nucleico de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleótido tiene la secuencia de nucleótidos que codifica al polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene la secuencia de aminoácidos completa, codificada por al clon cósmido contenido en ATCC Deposito No. .
5.- Una molécula del ácido nucleico aislada, que comprende un polinucleótido que se hibridiza bajo condiciones severas de hibridización a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica a una secuencia de nucleótidos en (a), (b) ó (c) de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleótido que se hibridiza no se hibridiza bajo condiciones severas de hibridización a un polinucleótido que tiene una secuencia que consiste de solo los residuos de A ó de solo los residuos de T.
6.- La molécula del ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleótido es el ADN.
7.- La molécula del ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho polinucleótido es ARN.
8.- Un método para preparar un vector recombinante, caracterizado porque comprende insertar una molécula del ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 dentro de un vector .
9. - Un vector recombinante caracterizado porque es producido por el método de la reivindicación 8.
10.- Un método para preparar una célula hospedera recombinante, caracterizado porque comprende introducir el vector recombinante de la reivindicación 9 dentro de la célula hospedera.
11.- Una célula hospedera recombinante caracterizada porque es producida por el método de la reivindicación 10.
12.- Un método recombinante para producir un polipéptido de la piruvato carboxilasa, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera recombinante de la reivindicación 11 bajo condiciones tales que dicho polipéptido se exprese y recuperar dicho polipéptido.
13.- El método de la reivindicación 12, caracterizado porque dicha piruvato carboxilasa se expresa de 2 a 20 veces más alta que su expresión en Corynebacterium gl utamicum .
14.- Un polipéptido aislado de la piruvato carboxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo caracterizado porque consite de: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene la secuencia completa de aminoácidos en la SEC ID NO: 2, (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la piruvato carboxilasa que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon cósmido contenido en ATCC Depósito No. .
15.- Un método para preparar aminoácidos, caracterizado porque comprende expresar la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1 y recuperar dichos aminoácidos .
16.- El método de la reivindicación 15,. caracterizado porque dicho aminoácido es la lisina.
17.- El método de la reivindicación 15, caracterizado porque la piruvato carboxilasa se expresa de 2 a 20 veces más alto que en el Corynebacterium gl utamicum . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere una enzima anaplerótica del Corynebacteri um gl utami cum que repone el oxaloacetato consumido durante la producción de la lisina y el ácido glutámico en fermentaciones industriales. En particular, se proporcionan las moléculas del ácido nucleico aisladas que codifican la proteína de la piruvato carboxilasa. También se proporcionan los polipéptidos de la piruvato carboxilasa.