ENSAYES DE ENLACE USANDO RESONANCIA ÓPTICA DE PARTÍCULAS COLOIDALES
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada a la patente norteamericana no. 5,939,021 titulada "Ensayo de Enlace Homogéneo" publicada el 17 de agosto de 1999. 1. ampo dg la Invención La presente invención se refiere al campo de la detección del enlace de ligantes y más específicamente a instrumentos de alta velocidad para la exploración automática de gran número de compuestos potencialmente terapéuticos al medir su afinidad de enlace relativa para varios receptores biológicos . 2. Descri ción dg la Técnica Relacionada Los métodos de ingeniería genética han sido exitosos en identificar la secuencia genética de receptores superficiales celulares relacionados con las enfermedades y expresar artificialmente esos receptores en una cantidad substancial y en forma purificada. Esos receptores también pueden aislarse a partir de preparaciones celulares. Las técnicas de química combinatoria proporcionan síntesis rápida de compuestos de bajo peso molecular que son parejas de enlace potenciales para los receptores aislados o identificados. Una vez creados, esas amplias bibliotecas de compuestos deben ser exploradas para buscar la afinidad de
enlace relativa al receptor objeto. La maquinaria de alta velocidad se ha vuelto esencial para el tipo de pruebas o exploraciones que han. de lograrse en una forma reducida en tiempo. El método tradicional de exploración ha sido el de etiquetar cada compuesto, por ejemplo con una fracción radioactiva, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente y luego determinar el enlace del compuesto etiquetado al receptor de interés . Para este propósito el receptor generalmente se inmoviliza y el compuesto etiquetado se deja en contacto con el receptor. Después de un período de tiempo el compuesto no ligado se retira por lavado y los receptores inmovilizados se analizan en busca de la presencia de la etiqueta ligada. Existen dos problemas en este método . Primero el lavado tiende a romper enlaces débiles que pueden ser importantes para detectar compuestos con algo de actividad pero no la ideal . En segundo lugar la tarea de etiquetar una biblioteca completa de tal vez cientos de miles de compuestos presenta un límite practico al número de compuestos que pueden examinarse . Cada compuesto presenta un problema único que deber resolverse para el etiquetado y no todos pueden ser etiquetados con la misma etiqueta. Finalmente, la presencia de la etiqueta puede modificar la afinidad entre el compuesto y el receptor.
Por lo tanto, seria altamente deseable tener un instrumento y un método que elimine el etiquetado y permita el análisis cuantitativo de la afinidad de enlace entre un compuesto y un receptor. Esto retiraría un límite fundamental a la exploración a alta velocidad de bibliotecas muy grandes de compuestos . La presente invención logra este objetivo al proporcionar un instrumento y un método que detecta un cambio en las características ópticas del soporte solido al cual el receptor ha sido unido cuando el receptor está ocupado por medio de un compuesto ligante no etiquetado. El soporte solido es un tipo especifico de partícula coloidal con un diámetro menor a 100 nm. Este pequeño tamaño significa que la cinética de enlace para la reacción son similares a la solución de la cinética de fase. El instrumento automáticamente mezcla el compuesto y la suspensión coloidal de receptores, incuba la mezcla, luego lee el resultado a una velocidad de miles de pruebas por hora. En una solicitud relacionada (también publicada como WO 98/33070), ahora patente norteamericana no. 5,939,021, los presentes inventores descubrieron que la resonancia óptica podría usarse para detectar la reticulación de las partículas y las reacciones de enlace químicas en las cuales las reacciones de enlace provocan el
enlace de dos partículas ópticamente resonantes. En esa invención se usan partículas sencillas a monitorear los cambios de extinción en una banda óptica y enumera partículas dimeras (por ejemplo partículas unidad por medio de una reacción de enlace químico) al monitorear los cambios de extinción en una segunda banda óptica que aparece a medida que los dimeros se forman. La extinción por lo tanto se usa para medir la dimerización de las partículas provocada por una reacción de enlace . La presente invención no depende de la reticulación de las partículas . Como se muestra a continuación, la presente invención detecta directamente el enlace de un ligante sin etiquetar a una partícula. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención utiliza un tipo especial de partículas ópticamente sensibles, sub-micrométricas, cuya superficie está pre-recubierta con una monocapa de receptor molecular especifico que puede enlazarse con ligantes de fase de solución (en esta invención, "receptor" se refiere a una molécula inmovilizada sobre la partícula que es capaz de ligar otras partículas que están libres en la solución. Además en esta invención las molécula se solución libre se llaman "ligantes) . La propia partícula es un transductor que registra directamente en enlace del ligante al receptor y crea una señal óptica que indica este ligado. La propia
partícula es el sensor de enlace, eliminando asi la necesidad de etiquetar al ligante. Las propiedades de transducción de señales de las partículas usadas en la invención dependen de que exista una dispersión óptica de luz y una resonancia de absorbción con una longitud de onda de resonancia especifica ?R . De tal forma que una resonancia está presente en las partículas pequeñas que tengan un índice de refracción complejo en donde la parte real n(?) del índice tiende a 0 mientras que la parte imaginaria (?) se aproxima a 2 simultáneamente a una longitud de onda especifica ?a . En esta invención una partícula pequeña es una menor a aproximadamente un décimo de la longitud de onda de la luz incidente) . Se conoce a partir de teorías detalladas sobre la dispersión de la luz, que cuando se cumple con la anterior condición de resonancia, tanto la dispersión como la absorción de la luz son substancialmente mayores a lo predicho por medio de la teoría de Rayleigh de la dispersión simple de la luz en la cual se asume que n y k son constantes y no son funciones de ? (Bohrens y Huffman) . La presente invención demuestra el resultado sorprendente adicional de que la intensidad de la dispersión y absorbción de luz de pequeñas partículas a la longitud de onda de resonancia cambia cuando los ligantes se unen a receptores inmovilizados sobre esas partículas
resonantes, y las partículas recubiertas de receptor que son más sensible sirven para el ligado al ligante. Normalmente expresiones de dispersión y absorbción de luz de pequeñas partículas con índices de refracción constantes son funciones simples de la longitud de onda. Hablando generalmente, tanto la absorción como la dispersión de la luz son mayores para longitudes de onda cortas (por ejemplo luz ultravioleta) y menores para longitudes de onda largas (por ejemplo luz rojas e infrarroja) . Esta dependencia de la longitud de onda es monotónica, lo que significa que existe un avance continuo de absorción y dispersión intensas en longitudes de onda cortas a absorción y dispersión menos intensas en longitudes de onda largas . Excepciones de este comportamiento se presentan para partículas con un índice de refracción complejo que tiene una fuerte dependencia de la longitud de onda. Si el índice de refracción de las partículas varia con la longitud de onda de tal forma que se cumplen simultáneamente las dos condiciones ; 1) n(?) tiende a 0 y 2) k(?) se aproxima a x 2 simultáneamente a una longitud de onda especifica ?? , entonces la dispersión y absorbción de luz aumenta dramáticamente en un ancho de banda angosto alrededor de ?R. Esta desviación se llama resonancia. La resonancia es delicada y puede ser perturbada por el deposito de agentes químicos sobre la superficie de la
partícula. Cuando una capa de receptores se recubre sobre la partícula, la resonancia se altera, pero es un aspecto sorprendente e importante de la presente invención que cuando los ligantes se unen a la capa receptora, existe otra perturbación de la resonancia que fácilmente puede ser detectada ópticamente . La señal óptica relacionada a esta invención se detecta por fotometría ya sea de absorbción o de dispersión de luz . La resonancia óptica aumenta el nivel de dispersión y absorción de luz en un factor de cuando menos diez por encima de los niveles normales de dispersión de luz a la longitud de onda de resonancia ?t. Esto permite la detección óptica de partículas que son pequeñas en el orden de 100 Á (10 nm) a concentraciones bajas. Esas partículas pequeñas ventajosamente se difunden virtualmente tan rápido como macromoleculas en solución. Ese movimiento de partículas rápido unido a la separación entre partículas que es del orden de micrometros (µm) significa que la reacción de enlace de superficie del receptor de ligante ocurre a casi las velocidades máximas. Esas reacciones a base de partículas deben contrastarse con las reacciones de enlace que ocurren sobre superficies planas tales como cunado los receptores se inmovilizan en la superficie de los micro-pozos. Allí el ligante debe difundirse sobre distancias de aproximadamente un milímetro (1000 µm) o más
para llegar al receptor. Estas ultimas reacciones son lentas e impiden el rendimiento alto deseado de un sistema automático para el control de las reacciones de enlace. Las reacciones de enlace y la transducción de señales de la presente invención ocurren en una única etapa rápida. Esto permite que el ensayo de enlace sea automatizado fácilmente y se realice con tasas de rendimiento del sistema tales que grandes colecciones de ligantes y receptores pueden evaluarse por su afinidad de enlace en períodos de tiempo relativamente cortos por medio de maquinas que funcionan continuamente y ee aprovechan de la baja complejidad de los mecanismos de mane o de fluido . BREVE DESCRIPClÓn DE LOS DIBUJOS La figura 1 representa un esquema de la detección de dispersión y absorción de luz . La figura 2 muestra un diagrama esquemático de la estabilización de fuente de luz usada en la presente invenció . La figura 3 ilustra el uso de imágenes ópticas para minimizar la luz dispersada en el fondo. La figura 4 es una gráfica paramétrica de k vs . n de plata que muestra el efecto de la resonancia sobre la extinción de la luz . La figura 5 es una gráfica que muestra el efecto
del diámetro de las partículas sobre la resonancia óptica. La figura 6 es una gráfica que muestra el efecto sobre la resonancia óptica del recubrimiento de partículas resonantes con proteínas . La figura 7 es una gráfica que muestra el efecto sobre la resonancia óptica del enlace de ligantes no etiquetados sobre las partículas resonantes . DESCRIPCIÓn DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La siguiente descripción se provee para permitir que cualquier persona experta en la técnica haga uso de la invención y determina las mejores maneras contempladas por el inventor para realizar su invención. Sin embargo varias modificaciones permanecerán evidentes para los expertos en la técnica ya que los principios generales de la presente invención han sido específicamente definidos aquí para proporcionar un método y un dispositivo para detectar el enlace de ligantes no etiquetados a partículas coloidales ópticamente resonantes . Refiriéndonos a la figura 1, existe un recipiente
para los elementos líquidos de la mezcla de reacción que incluye una ventana 12 para dejar entrar la luz desde una fuente luminosa 14 y un segundo grupo de ventanas 16,18 a través de las cuales la luz transmitida y dispersada respectivamente, puede pasar a un detector o grupo de
detectores 22,24. En una modalidad el recipiente es un pozo en una charola de titulación de múltiples pozos y en una modalidad alternativa el recipiente es una cubeta tal como la empleada en los espectrofotómetros ópticos . Una modalidad del dispositivo usa una esfera integrante 26 para integrar la luz dispersada que s una muestra a través de un puerto de la esfera 25. Otros puertos permiten la iluminación del recipiente de muestra 10 y las mediciones de la luz transmitida por medio del detector de transmisión 22. La medición de la transmisión de luz puede realizarse la comparar una señal muestra con una señal de referencia. La señal muestra se obtiene al medir la luz transmitida a través de una muestra a o cerca de la longitud de onda de resonancia, ?R. La señal de referencia se deriva de dos maneras . Ya sea que sale de la luz transmitida a través de la muestra a longitudes de onda fuera de la banda de resonancia en ?E o de luz transmitida a través de otro pozo que contiene partículas en la misma concentración que la mezcla de reacción pero sin ligante (por ejemplo una mezcla de control) . Lo más común es que se use algún tipo de divisor óptico o alternativamente un separador de haz óptico para derivar la muestra y los haces de referencia de una sola fuente luminosa. Estos métodos son importantes cuando la mezcla de reacción contiene componentes con color que podrá hacer que la señal de
resonancia relativamente pequeña fuera difícil de detectar sin el método de haz doble. Como se muestra en la figura 2, la fuente luminosa 14 usada para esas mediciones está mejor estabilizada. Un fuente de luz particularmente útil es provista por un diodo emisor de luz (LED) 14' que puede ser modulado eléctricamente de forma directa por medio de un modulo de potencia de fuente luminosa 42 en respuesta a la señal de retroalimentacíón desde un detector 44 que monitorea la luz en ?s que no ha pasado a través del pozo de reacción. La figura 3 es un arreglo óptico útil para evitar las señales de fondo indeseadas. Un lente 32 forma la imagen del interior del liquido 52 de la cámara de reacción 10 en la superficie de un detector óptico 22. De esta manera las paredes 54 del recipiente 10, que tienden a dispersar la luz y producir un fondo indeseado, son desenfocadas y la luz de fondo de las partes puede reducirse con paros de campo /o una abertura 34. En este ejemplo se prepararon partículas resonantes a partir de coloides de plata, tales como los que pueden ser obtenidos por British Biocell, International, Cardiff, U.K. Las pequeñas partículas de plata presentan una resonancia óptica en la región violeta del espectro. La figura 4A muestra una gráfica de n(?) y k(?) que ilustra que n(?) tiende a 0 y k(?) tiende a x2 en ?R=390 nm
(figura 4B) cuando las partículas están al vacío. Cunado las partículas están sumergidas en agua, la resonancia se perturba y se desplaza a una longitud de onda más larga cercana a 400 nm. Este comportamiento resonante no se observa en material macroscópico, se observa solo en las partículas pequeñas de plata en donde los límites de la partícula se separan por distancias que son pequeñas en comparación a la longitud de onda de la luz incidente. La longitud de onda de resonancia también es una función del diámetro de partícula. La figura 5 muestra una serie de espectros de transmisión de luz de las suspensión de las partículas de varios diámetros tomados cerca de la longitud de onda de resonancia. Puede observarse que para partículas con un diámetro de 20.1 nm, la absorbción de la muestra aumenta dramáticamente, la absorción de la muestra aumenta dramáticamente sobre una banda angosta cercana a 400 nm. La resonancia se desplaza hacia longitudes de onda más largas a medida que aumenta el diámetro de las partículas, y la resonancia presenta picos menos agudos y más dispersados en una banda de longitud de onda más amplia. Por ejemplo, con partículas de 76.8 nm de diámetro, la longitud de onda resonante se ha movido a aproximadamente 460 nm y la resonancia es de aproximadamente un tercio as fuere que para las partículas de 20.1 nm.
Las partículas de plata se recubrieron con la proteína ligante es reptavinida (PM 65,000). El recubrimiento se realizo por medio de adsorbción pasiva a la temperatura ambiente. Con el propósito de recubrir las proteínas se diluyó primero una solución acuosa de partículas de plata coloidales con amortiguador Tris/HCl, pH 9.0 hasta una absorbencia óptica a la longitud de onda pico de 1.1 unidades de absorbencia, logrando una concentración final de amortiguador de 200 mM Tris/HCl. Se agregó estreptavinina a una concentración de 0. Iµg/ml y se incubó durante 20 minutos a la temperatura ambiente. Las mediciones espectrométricas se realizaron antes de la adición de la proteína y 20 minutos después de la adición de la proteína. Con el propósito de realizar las lecturas de absorbción ambas muestras se diluyeron 1:10 con 200 mM de amortiguador Tris/HCl, pH 9.0. La figura 9 muestra ,1a resonancia de absorbción de partículas 62 antes y después del recubrimiento de proteína 64. La estreptavidina perturba la resonancia al desplazar el pico de absorbción muy ligeramente a una longitud de onda más larga y reduce el máximo de absorbcion. Cunado las partículas recubiertas con estreptavidina se pudieron en contacto posteriormente con una solución de biotina, el pico de resonancia se observo que se reducida con el tiempo. LA figura 7 es un espectro
de absorbción 68 tomado cinco minutos después de que las partículas recubiertas con estreptavidina se pudieron en contacto con una alícuota de una solución que contenía 10 ng/ml de biotina (PM 100) . La reacción se enlace se completo esencialmente en cinco minutos . El curso de tiempo del enlace de biotina puede medirse directamente en la mezcla de reacción. Esto se compara con un espectro de absorbción 66 de las partículas antes de la adición de biotina (esta muestra fue pre-diluida con una alícuota de amortiguador igual a la ultima adición de biotina para corregir los efectos de la dilución) . La reducción en el pico de absorbción de resonancia cinco minutos después del enlace es una función de la concentraron de biotina como se muestra en la siguiente tabla.
Las partículas recubiertas con estrepatavidina se examinaron en su especificidad al ponerlas en contacto con otras moléculas pequeñas que no se ligan a estreptavidina. En todos los casos, el cambio de absorbencia fue menor a 0.001 unidades de absorbencia hasta en concentraciones de 10 microgramos/ml . En una segunda prueba, la fase de solución rodamina de hapteno se uso con un anticuerpo anti-rodamina de murina inmovilizado sobre las partículas de plata. Las observaciones de una reducción similar en la absorbencia óptica durante un tiempo similar se repitieron, indicando que las diferencias de peso molecular y tamaño entre estreptavidina y la inmunoglobulina de ratón no afectan significantemente el resultado del experimento. Otros métodos paras inmovilizar las biomoléculas en la superficie de la plata o de otras partículas coloidales resonante son posibles . Grandes números de moléculas orgánicas bifuncionales o polifuncionales con grupos reactivos para unir las biomoléculas a las superficie solidas son bien conocidas para aquellos expertos en la técnica. Esos grupos reactivos incluyen aldehidos, isocianatos, isotiocianato, y esteres de succinimidilo entre otros . Además de la simple absorbción pueden usarse monocapas auto-ensamblantes para proporcionar grupos
funcionales en una superficie metálica que son útiles para inmovilizar a os receptores . Los receptores que se aislan de las células también pueden inmovilizarse junto con os fragmentos de la membrana celular en la cual están embebidos los receptores . Un instrumento real en base a los principios de la presente invención incluiría algún tipo de estudios de manejo de muestras y sistema de procesamiento de datos
(computadora) así como los espectrómetros descritos antes. Por ejemplo en un examen de una biblioteca química en busca de una nueva medicina terapéutica, una alícuota de cada compuesto que se va estudiar puede colocarse en un pozo de una placa tituladora de múltiples pozos. Un sistema de indicación automático moverá la placa para hacer avanzar cada pozo hacia el rayo de análisis de un espectrofotómetro como se define antes . A medida que el pozo avanza en la posición de análisis un sistema de pipeta automático suministra una alicuota de partículas coloidales en el pozo. La partículas tienen en sus superficies el receptor con el medicamento candidato con el cual debe interactuar. El sistema de pipeta o algún otro dispositivo automático asegura que las partículas y el compuesto de prueba se mezclen profundamente. El espectofotómetro entonces mide cualquier cambio en el pino resonante como indicación del ligado. Preferentemente esas medidas tienen lugar durante
algunos minutos de tal forma que el curso de tiempo del enlace puede determinarse, la computadora recibe esos datos y calcula los resultados para cada compuesto candidato. El dispositivo entonces se mueve al siguiente pozo. Si se mide el ligado durante un período de cinco minutos, pueden analizarse 2 compuestos muestra durante una hora, si el período de prueba es más corto, puede estudiarse un número mayor. Un instrumento puede ser precargado con docenas de placas de tal forma que el análisis avance día y noche sin la intervención humana. Los instrumentos son pequeños y bastante económicos de tal forma que una pluralidad de instrumentos pueden operar en paralelo para estudiar miles de compuestos candidatos en un período de 24 horas . Es claro que son posibles muchas variaciones a las pruebas. Al incluir un ligante conocido para le receptor se puede estudiar la competencia o inhibición del compuesto de prueba . Debe entenderse que dentro del alcance de las reivindicaciones anexas la invención puede ponerse en practica en otra forma a la descrita específicamente aquí.