MXPA01001445A - Metodo para recuperar proteinas a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas. - Google Patents

Metodo para recuperar proteinas a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas.

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Abstract

Un metodo para extraer proteinas del espacio la intercelular de plantas, se proporcionan. El metodo es aplicable a un aislamiento a gran escala de muchas proteinas activas de interes sintetizadas por celulas de plantas. El metodo puede utilizarse comercialmente para recuperar proteinas producidas de manera recombinante a partir de huespedes de plantas, de esta manera haciendo factible el uso a gran escala de plantas como fuentes para la produccion de proteina recombinante.

Description

MÉTODO PARA RECUPERAR PROTEÍNAS A PARTIR DEL FLUIDO INTERSTICIAL DE TEJIDOS DE PLANTAS Campo de la Invención La presente invención se refiere en general al campo de producción y purificación de proteínas. Más específicamente, la presente invención - se refiere a un método para aislar cantidades a escala comercial de proteínas activas altamente concentradas a partir del material intercelular de plantas por un proceso de vacío y centrifugación que no destruye el material de plantas, permitiendo extracción secundaria de proteínas del material de plantas. Antecedentes de la Invención Hay muchos ejemplos de proteínas valiosas que son útiles en aplicaciones farmacéuticas e industriales . A menudo, estas moléculas se requieren en grandes cantidades y en formulaciones parcial o altamente purific-adas para mantener la calidad y desempeño del producto. Las plantas son fuentes económicas de proteínas, incluyendo proteínas recombinantes. Muchos han propuesto la conveniencia de producir proteínas en grandes cantidades en plantas. Sin embargo, los problemas asociados con la extracción y procesamiento de productos a partir de tejidos de plantas homogeneizados así como la purificación y recuperación del producto de proteína recombinante se ha reconocido como substancial. Austin y colaboradores. Annals New York Academy of Science, 721:234-244 (1994) . Esos problemas representan impedimentos substanciales a producción exitosa de proteína recombinante en plantas en una escala grande y comercialmente valiosa. Células de plantas se considera que sintetizan proteínas en las membranas del retículo endoplásmico y transporta las proteínas sintetizadas a la superficie de la célula en vesículas secretorias formadas en el aparato de Golgi . Una discusión del tópico se proporciona por Jones y colaboradores, New Phytology, 111.567-597 (1989) . Investigación significante se ha dedicado a elucidar los mecanismos específicos relacionados a secreción de proteínas, para diversas proteínas particulares en tejidos de plantas específicos o en cultivos celulares. Ejemplos de estos esfuerzos se presentan por Herbers y colaboradores, Biotechnology (Biotecnología) 13.: 63 66 (1995). The Plant Cell (la célula de plantas) 2.:51-59 (1990) , Melchers y colaboradores, Plant Molecular Biology (Biología Molecular de Plantas) 21:583-593 (1993) y Sato y colaboradores, Biochemical and Research Communications (Comunicaciones de Investigación y Bioquímicas) 211 (3) : 909-913 (1995). En el caso de proteínas no secretadas en el espacio intercelular o apoplasma de células de plantas, debe utilizarse un mecanismo para lisar la pared de las células de plantas a fin de liberar y capturar la proteína de interés. Las células de plantas deben exponerse a muy altas fuerzas de cizalla a fin de romper las paredes celulares y lisar las membranas celulares para liberar los contenidos intracelulares. Proteínas de interés, ya sea producidas de manera recombinante o producidas de manera natural por la planta objetivo, de esta manera se exponen a un ambiente químico hostil y se someten particularmente a daño oxidativo y proteolítico debido a la exposición del producto a enzimas y pequeñas moléculas que se compartamentalizaron antes de homogeneización del tejido. Además, la mayoría de las otras proteínas celulares en total se mezclan con las proteínas de interés creando problemas formidables de purificación si este procedimiento de lisis celular se realiza. A fin de utilizar la capacidad biosintética de las plantas para una producción confiable de proteínas, sería conveniente un proceso para obtener proteínas específicas que pueden secretarse al espacio intercelular (apoplasma) de los tejidos de las plantas. Este procedimiento haría prescindible la necesidad de homogeneización. Si este procedimiento se realiza, la fracción de material de plantas que contiene una o más proteínas de interés, puede obtenerse sin homogeneización.
Por lo tanto, este procedimiento permite que se enriquezca el extrato de planta para la proteína particular de interés, y la proteína se protege de algo de degradación química y enzimática. Ya que proteínas y productos valiosos de interés se dividen o secretan en los espacios intersticiales, la presión del vacío facilita la introducción de medio de infiltración al espacio intersticial. Similarmente, diversas fuerzas pueden aplicarse para retirar el fluido retenido. La fuerza centrifuga de lOOOxG es efectiva. Utilizando la gravedad, el fluido retenido puede recolectarse en una trampa al vacío. Con o sin infiltración de vacío de un amortiguador, la enzima puede recuperarse al liberar el tejido, descongelar y aplicar un proceso físico para recuperar el fluido. Sin embargo, este procedimiento resulta en una lisis celular incrementada indeseable. Plantas modificadas genéticamente son una fuente confiable para la producción de proteínas recombinantes . Debido a que el producto biológico se acumula bajo condiciones de crecimiento no estériles y la producción puede ajustarse en escala a las cantidades deseadas en una forma relativamente económica, es factible explotar una fuente diluida aunque enriquecida tal como la fracción de fluido intersticial como una fuente para cosechar proteínas de interés a una escala industrial. Una variedad de proteína de interés pueden cosecharse de fuentes de plantas recombinantes, sin embargo enzimas, citosinas y anticuerpos de calidad farmacéutica altamente activos son productos particularmente valiosos que pueden desarrollarse por este proceso . COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención caracteriza un método para extraer proteínas activas altamente concentradas del espacio intercelular de las plantas. El espacio intercelular consiste de una matriz de fluido, proteína y carbohidratos de pared celular. El método es aplicable al aislamiento a escala comercial grande de proteínas, deseadas de las células de plantas ya sea que estas proteínas sean de origen natural o se produzcan por tecnología recombinante. El proceso de vacío y centrifugación como se explica a continuación, permite extracción de la proteína del fluido intersticial de la planta sin destruir el material de planta, permitiendo mayor extracción de la proteína deseada del material de planta. En un amplio aspecto, el método comprende infiltrar hojas de plantas con una solución amortiguadora al someter el follaje de la planta sumergida a un ambiente substancialmente de vacío, retirar el líquido en exceso del follaje de la planta después de exponer el follaje al ambiente de vacío substancial y centrifugar el follaje para obtener el fluido intersticial . Como resultado de este procedimiento, pueden retirarse grandes cantidades de proteínas deseables del espacio intercelular de las plantas, de esta manera haciendo factible el aislar proteínas de origen natural del follaje de la planta y haciendo posible el producir recombinantemente las proteínas deseadas en plantas y recuperar lo mismo en cantidades comercialmente valiosas sin homogeneizar el follaje de planta o de otra forma lisar de manera significante las propias células de plantas. El material se refiere como un fluido intersticial, a continuación "IF", extracto IF. En una modalidad, las hojas de planta objetivo se disectan completamente o substancialmente por la costilla media (substancialmente en mitades) exponiéndolas a la solución amortiguadora. En otra modalidad preferida, las hojas y la solución amortiguadora se someten a presión de vacío de aproximadamente 200 hasta 700 mm de Hg, aún más preferiblemente, las hojas y la solución amortiguadora se someten a presión de vacío de aproximadamente 400 hasta 760 mm de Hg. De manera óptima, las hojas y solución amortiguadora se someten a una presión de vacío de hasta aproximadamente 760 mm de Hg. Todavía en otras modalidades preferidas, las hojas se someten a una centrifugación de baja velocidad que tiene un rango de fuerza G de aproximadamente 50 a 5000 x G o menos después de que se retira la solución amortiguadora en exceso. Más preferiblemente, las hojas se someten a centrifugación que tienen una fuerza G de aproximadamente 2000 x G. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 vista general del proceso de extracción IF; La Figura 2 infiltración de recipiente por lotes. La Figura 3 infiltración con vacío continuo. La Figura 4 mapa de plásmido de TT01A 103L. La Figura 5 secuencia de ADNc viral del plásmido TT01A 103L. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención caracteriza un método para extraer, proteínas del espacio intercelular de plantas . El método es aplicable al aislamiento a gran escala comercial de proteínas altamente concentradas y activas que se desean de células de plantas, ya sea que estas proteínas sean de origen natural o se produzcan por tecnología recombinante, incluyendo el uso de vectores virales de plantas o el uso de plantas transgénicas. El proceso de vacío y centrifugación de la presente invención_ permite extracción de proteína del espacio intercelular sin destruir el material de planta, de esta manera permitiendo adicional extracción secundaria de proteínas deseadas del material de planta. Estas proteínas derivadas del proceso de extracción secundario ya pueden ser las mismas o diferentes que aquellas proteínas purificadas del fluido IF. El método en general comprende la etapa de infiltrar follaje de planta con una solución amortiguadora al someter el follaje de planta sumergido a un ambiente de vacío substancial, retirar el líquido en exceso del follaje de planta después de exposición del follaje a el ambiente substancial de vacío y centrifugar el follaje. Como resultado de este procedimiento, grandes cantidades de proteínas deseadas pueden retirarse del espacio intercelular de las plantas, haciendo de esta manera factible el aislar proteínas tanto de origen natural como producidas de manera recombinante, del follaje de planta en cantidades a escala comercial sin homogeneizar las células de plantas, permitiendo extracción secundaria de proteína deseada del material celular de plantas. Se ha realizado trabajo en el área de desarrollar vectores convenientes para expresar ADN extraño en huéspedes de plantas. Ahlquist, la Patente de los E.U.A. No. 4,885,248 y la Patente de los E.U.A. No. 5,173,410 describen trabajo preliminar realizado para diseñar vectores de transferencia que pueden ser útiles para transferir material genético extraño en un huésped de planta con el propósito de expresión ahí . Aspectos adicionales de virus de ARN híbridos y vectores de transformación de ARN se describen por Ahlquist y otros, en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,466,788, 5,602,242, 5,627,060 y 5,500,360, todas las cuales aquí se incorporan por referencia. Donson y colaboradores en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,316,931 y 5,589,367 aquí incorporadas por referencia, demuestra por primera vez vectores virales de plantas adecuados para la expresión sistémica de material genético extraño en plantas. Donson y colaboradores, describe vectores virales de plantas que tiene promotores sub-genómicos heterólogos para la expresión sistémica estable de genes extraños. Por tanto, el uso de plantas para producir proteínas recombinantes a una escala comercial ahora es posible. La presente solicitud resuelve un problema de extraer estas proteínas de interés del fluido intersticial del follaje de planta. La secreción de proteínas en plantas es un proceso fundamental que aún no se entiende completamente. Se conoce que las proteínas secretadas se sintetizan en las membranas del retículo endoplásmido burdo y transportan a la superficie de la célula por vesículas secretorias formadas en el aparato de Golgi . Aún más, se conoce que un péptido de señal se requiere para translocación de las proteínas secretadas a través del retículo endoplásmico. Proteínas que se transportan al lumen del retículo endoplásmico pueden luego secretarse al espacio intersticial siempre que no se clasifiquen o separen por la célula a otro compartimiento tal como la vacuola. Conforme se incrementa el conocimiento respecto a este proceso, puede ser posible el diseñar proteínas recombinantes que se pretendan específicamente para secreción en el espacio intersticial de células de plantas en las que se producen. Si un porcentaje significante (aproximadamente 10% o mayor) del producto total se secreta, entonces puede ser preferible el aislar proteínas de interés del espacio intercelular de las plantas. De otra forma, debe emplearse un mecanismo para lisar la pared celular de la planta a fin de liberar y capturar la proteína de interés . Deben exponerse células de plantas a muy altas fuerzas de cizalla a fin de romper las paredes de las células y lisar membranas celulares para liberar los contenidos intercelulares. Proteínas de interés, ya sea que se produzcan de manera recombinante o se produzcan en forma natural por la planta objeto, de esta manera se exponen a un ambiente químico hostil y se someten particularmente a daño oxidativo y proteolítico que a menudo se cataliza enzimáticamente. Además, la mayoría de las otras proteínas celulares en total se mezclan con la proteína de interés creando problemas formidables de purificación si este procedimiento de lisis celular se realiza. Extractos de fluidos intercelulares previamente se han preparado a partir de follaje infiltrado con vacío para una variedad de propósitos experimentales. Estos extractos están constituidos por proteínas, tanto nativas como no nativas así como otras moléculas. En Klement, Z. (1965) Phytopathological Notes (Notas Fi topatológicas) : 1033-1034, las propiedades promotoras de crecimiento del extracto se documentaron utilizando una especie bacterial patogénica de plantas. Utilizando enzimas marcadoras para los compartimientos IF y citosólico de la célula de la hoja de la planta, Rathmell y Sequera (1974), Plant Physiol . 5_3: 317-318 confirmaron el enriquecimiento de una fracción de proteína específicamente secretada y notaron la utilidad de estos extractos en estudios de investigación básica que se refieren a las investigaciones bioquímicas y fisiológicas. Parent y Asselin (1984) Can . J. Bot . £2:564-569, caracterizan una cantidad de proteínas que se indujeron por esfuerzo de patógeno y secretaron en IF (proteínas PR o relacionadas a patogénesis) y el método se aplicó para localizar actividades enzimáticas y proteínas a compartimientos sub celulares. Van den Blucke y colaboradores. (1989) PNAS 86 : 2673-2677 ; Heitz y colaboradores (1991) Plant Physiol . ¿2=651-656. Regalado y Ricardo (1996) Plant Physiol . 110.: 227-232 notaron que proteínas IF específicas parecen ser expresadas en forma constitutiva . Dependiendo de la composición y tratamiento de amortiguador, puede haber diversos componentes adicionales en extractos IF incluyendo por ejemplo componentes que se originan del retículo endoplásmico liso y rugoso, el aparato de Golgi, el núcleo, la vacuola, la transmembrana de plasma, el fitosol, mitocondria, cloroplastos, peroxisomas, cualesquiera membranas y organelos asociados. En plantas modificadas genéticamente, métodos de extracción IF así como otros métodos, se han empleado para demostrar la localización sub-celular de una porción del producto recombinante. Sijomns y colaboradores. (1990) Bio/Technology (Bio /Tecnología) 8 : 217-221; Firek y colaboradores. (1993) Plant Molecular Biology (Biología Molecular de Plantas) 23. : 861-870; Voss y colaboradores (1995) Molecular Breeding (Cría Molecular) 1:39-50; De ilde y colaboradores. (1996) Plant Science (Ciencia de Plantas) 114 : 233-241. Extractos IF se han empleado como material de partida para purificar pequeñas cantidades de proteínas derivadas de patógenos de plantas o de plantas para caracterización bioquímica. Melchersy colaboradores, (1993) Plant Molecular Biology (Biología Molecular de Plantas) 21:583-593; Sato y colaboradores (1995) BBRC 211:909-913 ; Kinai y colaboradores. (1995) Plant Cell (Células de plantas) 2=677-688; Liu y colaboradores. (1996) Plant Science (Ciencia de Plantas) 121:123-131; Maggio y colaboradores. (1996) Plant Molecular Biology Repórter (Reportero de Biología Molecular de Plantas) 14.-249-259. Por lo tanto, hay necesidad por aislar un material extraído que tiene superior actividad específica del material activo, (U actividad/mg de proteína) y por lo tanto esto proporciona un proceso de enriquecimiento de componentes IF a escala comercial. No se aprecia en la técnica previa que los extractos IF puedan utilizarse en general, materiales de partida para la purificación a gran escala de productos bioquímicos altamente activos y potentes que puedan por ejemplo tener aplicaciones como una fuente de materiales terapéuticos humanos. A menudo, otros métodos de purificación se buscan incluso cuando el producto se muestra secretado (Herbers y colaboradores. 1995, arriba) .
La falla en desarrollar el método IF es como una fuente comercialmente factible de productos de proteínas recombinantes, se debe a una combinación de los siguientes factores: (1) una caracterización incompleta de los extractos, es decir una determinación de que porcentaje de la proteína recombinante total puede obtenerse por métodos IF a que nivel de enriquecimiento, (2) falla por otros para demostrar actividad conveniente de un producto en una forma altamente purificada y (3) una carencia de descripción de equipo a escala industrial para procesar cantidades razonables de biomasa para este propósito. La presente invención involucra un proceso de vacío y centrifugación para proporcionar extracción de proteínas a escala comercial, a partir de plantas. Como resultado de la presente invención, grandes cantidades de proteínas activas de interés pueden retirarse del espacio intercelular de las plantas y concentrarse para adicional purificación, de esta manera haciendo posible el aislar proteínas de origen natural y producidas de manera recombinante a partir de follaje de plantas en cantidades comercialmente valiosas. Este proceso tiene la ventaja adicional en que el tejido de planta resultante después de la extracción IF no se destruye y puede ser utilizado para recuperación de otros componentes valiosos por otros medios . El follaje puede cosecharse en cualquier forma que sea conveniente. En una modalidad preferida, las hojas de planta objetivo se retiran de la planta y se disectan completamente o substancialmente a lo largo paralelo a la vena media, substancialmente en mitades, antes de exponerlas a una solución amortiguadora tal que los extremos de numerosas venas laterales grandes se expongan. Una vez que se cortan las hojas, pueden exponerse a una solución amortiguadora. Una solución amortiguadora Tris o EDTA rutinaria es conveniente, aunque aquéllos con destreza en la especialidad apreciarán que cualquier amortiguador puede ser más o menos apropiado para una planta o proteína determinada de interés. En algunos casos, puede ser aceptable agua o incluso preferirse como una solución. No se contempla que la naturaleza de la solución amortiguadora, específico pH o temperaturas, sean cruciales para las modalidades dentro del alcance de la invención. Sin embargo, en general se recomienda que se mantengan condiciones que evitan oxidación, precipitación, proteólisis o desnaturación de una o más proteínas de interés. De esta manera, el pH, temperatura y otras de estas variables habrán de verificarse y alterarse según se requiera. Una vez qué" las hojas de la planta se han colocado en una solución amortiguadora, se someten a un ambiente de vacío substancial. Se considera que la presión del vacío expedita el impregnado de la solución amortiguadora por la hoja. En algunas modalidades, la presión de vacío puede ser aproximadamente 200 a 700 mm de Hg. Más preferiblemente, las hojas y la solución amortiguadora se someten a una presión de vacío de aproximadamente 400 a 760 mm de Hg. La cantidad de presión de vacío puede variarse dentro del alcance de- la invención. También, la duración puede variarse dentro del alcance de la invención, sin embargo la exposición a un ambiente de vacío por duraciones de alrededor de unos cuantos segundos a 10 minutos han demostrado ser especialmente efectivas. En algunas modalidades de la invención, las hojas en la solución amortiguadora se exponen a un ambiente de vacío repetidamente. Se considera que una a tres exposiciones separadas pueden ser especialmente efectivas. Sin embargo, el número de exposiciones, la duración de exposición y cantidad de fuerza del vacío pueden ajustarse de acuerdo con las preferencias del practicante y para capturar las modalidades más eficientes del método como se aplica a plantas y proteínas específicas de interés . Adicionalmente, una persona con destreza en la especialidad puede preveer que moléculas o productos de interés diferentes a péptidos y proteínas pueden recuperarse del fluido intersticial utilizando los métodos descritos generalmente en la presente invención. Por ejemplo, los métodos descritos en la presente invención pueden utilizarse para recuperar líquidos, carbohidratos, lipoproteínas, azúcares, polisacáridos, ácidos grasos, ácidos nucleicos y polinucleótidos. El tejido de plantas luego se retira de la solución amortiguadora. Puede o no ser sometido a una etapa de desecado para retirar el amortiguador según dicte la necesidad o la conveniencia. Las hojas luego pueden colocarse en cualquier disposición geométrica conveniente para centrifugación. En modalidades preferidas, las hojas se transfieren de la centrífuga mediante un rotor de centrífuga con canasta de descarga continua. Cuando un rotor de centrífuga con canasta de descarga continua se utiliza, se realiza un centrifugado inicial para mover la biomasa a la pared del rotor y luego se realiza el centrifugado a toda la velocidad. En modalidades especialmente preferidas, se contempla que un gran volumen de hojas se someterá simultáneamente a los dispositivos de vacío y centrifugado. De esta manera, se anticipa que bombas de vacío comercialmente disponibles grandes y centrífugas de canasta tales como aquellas elaboradas por HeineMR, KetnaMR o SandbornMR se utilizarán en el método presente. Se prefiere en especial el armar las hojas en bolsas para una centrífuga de canastas. Las hojas luego pueden someterse a centrifugación después de que la solución amortiguadora en exceso se retira substancialmente. En modalidades preferidas, se contempla que es apropiada centrifugación a baja velocidad. Por centrifugación a baja velocidad se entiende aproximadamente 5000 x G o menos. Por el procedimiento de centrifugación, el fluido intersticial se retira de la planta. El fluido intersticial puede recolectarse en cualquier dispositivo de recolección conveniente, por ejemplo un tanque, o dirigido a equipo de purificación adicional, por ejemplo cromatografía y ultra filtración. Una vez que se recolecta el fluido intersticial de las hojas de las plantas, la o las proteínas de interés pueden concentrarse y purificarse de acuerdo con cualesquiera procedimientos de purificación convenientes. Estos procedimientos pueden incluir aunque no están limitados a precipitación de proteínas, cromatografía de lecho expandido, ultra filtración, cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía de interacción hidrofóbica, HPLC, FPLC y cromatografía de afinidad. Una discusión general de algunas técnicas de purificación de proteínas se proporciona por Jervis y colaboradores, Journal of Biotechnology (Revista de Biotecnología) 11:161-198 (1989), las enseñanzas de lo cual aquí se incorporan por referencia. Se contempla que el método de la presente invención es útil con cualquiera y todos los tejidos de plantas (tales como hojas, raíces, brotes, tallos, flores, frutas, embriones, plántulas) que pueden tratarse como sólidos saturados después de infiltración de vacío. Por ejemplo, esto puede incluir embriones y plántulas en germinación. Sin embargo, plantas que poseen hojas substancialmente simétricas con una costilla media pueden ser especialmente útiles en el presente método debido a que el fluido intersticial puede obtenerse más fácilmente de estas hojas como resultado de la morfología altamente conveniente. En modalidades especialmente preferidas, la planta empleada es tabaco, ya que el tabaco ha demostrado ser especialmente útil para producir proteínas recombinantes de interés a gran escala. Sin embargo, no se pretende que la presente invención se limite a cualquier especie o tejidos de planta particular. Las siguientes definiciones se proporcionan simplemente para aclarar la presente invención: Por "ambiente de vacío" se entiende cualquier ambiente independientemente de los confines que definen el mismo e independientemente del mecanismo que produce el mismo, en donde presión atmosférica se ha reducido substancialmente de la observada bajo condiciones normales al nivel de mar . Por "proteína de interés" se entiende cualquier proteína o péptido completo o su fragmento ya sea de origen natural en una célula o producida ahí por métodos recombinantes . El método se pretende que abarque secuencias de amino ácidos que se glicosilan así como aquellas que no se glicosilan. El -±-érmino también se pretende que abarque secuencias que sean de origen natural o de tipo silvestre y aquellas que se han modificado o mutado, incluyendo modificación para incluir una secuencia de péptido de señalización que provoca que la proteína se dirija a un compartimiento específico dentro de las células. El término también se pretende que abarque fusiones de proteínas. Por "fluido intersticial" se pretende el extracto obtenido de toda el área de una planta no abarcada por plasmalema, es decir la membrana de superficie celular. El término se pretende que incluya todo el fluido, materiales, área o espacio de la planta que no es intracelular (en donde intracelular se define como sinónimo con interior celular) incluyendo moléculas que puedan liberarse del plasmalema por este tratamiento sin lisis celular significante. Sinónimos para este término pueden ser exoplasma o apoplasma o fluido intercelular o fluido extra celular. El fluido intersticial se abrevia en la presente invención como IF. EJEMPLOS DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la presente invención. Estos ejemplos se pretenden simplemente ilustrativos de la presente invención y no habrán de considerarse como limitantes. Estos experimentos demuestran que una porción significante de la proteína total en la hoja puede recuperarse simplemente de la fracción intersticial mientras que se enriquece por pureza. Estos experimentos demuestran adicionalmente que los métodos son útiles para aislamiento de productos altamente activos en una escala muy grande. Aquellos con destreza en la especialidad pueden optimizar el proceso para numerosas variables específicas para cada proteína tales como la composición de amortiguador y la temperatura, etc. EJEMPLO 1 Extracción de proteína a-Tricosantina o¡-Tricosantina (a-TCS) es una enzima inactivante de ribosoma eucariótico que escinde un enlace N-glicosídico en ARNr 28S. a-TCS, así como otras proteínas inactivadoras de ribosoma y conjugados se evalúan como terapéuticos para muerte dirigida de células. En trabajo previo se demuestra que plantas transfectadas con un vector viral ARN de propiedad, producen a-TCS recombinante a 2% de la proteína de hoja soluble total con alta fidelidad (Kumagai y colaboradores PNAS 90 :427-430 (1993)) . Hojas de las plantas transfectadas con el vector TB2 (ATCC Deposito No. 75280) se retiraron en el pecíolo y ranuraron la costilla media en dos mitades iguales. Para obtener un homogeneizado celular total, un grupo de medias hojas se muele en la presencia de cuatro volúmenes de amortiguador de extracción detergente (100 mM de fosfato de potasio, pH 6.5 mM EDTA, 10 mM, a-mercaptoetanol y 0.5% peso/volumen de taurocolato de sodio) con un mortero y mano de almirez de congelar el tejido en nitrógeno líquido. Para recuperar el fluido intersticial (IF) , se infiltró el mismo amortiguador de extracción de jenzima en el grupo opuesto de medias hojas al sumergir el tejido y bombear un vacío moderado (500 mm de Hg) . Después de drenar el amortiguador en exceso, las medias hojas no separadas se enrollaron ligeramente en película barrera (parafilm) colocaron en tubos desechables y el fluido intersticial (IF) se recolecta por centrifugación con baja velocidad (1,000 x G) por un periodo de 5 a 15 minutos. El peso de amortiguador recubierto del tejido de hoja infiltrado, se registra y varia de aproximadamente la mitad a igual del peso original de la hoja. Expresión de a-TCS en extractos IF se confirma por análisis Western y niveles se cuantificaron utilizando un trazo en densitómetro de un gel teñido con Coomassie. Proteína total se determina por el método descrito por Bradford. Bradford, Anal . Biochem 72:248 1976 Los siguientes datos presentados como Tabla 1, demuestran que a-TCS recombinante, ilustrado en el trabajo previo retiene actividad enzimática completa, puede extraerse exitosamente de fluido intersticial de hojas de planta utilizando el presente método. El método IF resulta en recuperación de 9% del total de a-TCS de la hoja a un enriquecimiento de 6 veces respecto a un extracto obtenido por homogeneización (H) . Los resultados de producción de a-TCS pueden mejorarse al optimizar la post-inoculación de tiempo con el vector viral y minimizar la contaminación de proteína de revestimiento viral en la - fracción intersticial . Tabla 1 IF = extracción con fluido intersticial H = Extracción con homogeneización ND = No determinado EJEMPLO 2 Extracción de proteína Amilasa Amilasa (AMY) es una enzima industrial importante empleada para degradar el almidón. Hojas de plantas transfectadas con el vector TT01A 103L se retiraron del pecíolo y ranuraron por la costilla media en dos mitades iguales. El mapa de plásmido de TT01A 103L se ilustra en la Figura 4. La secuencia de ADNc viral del plásmido TT01A 103L se ilustra en la Figura 5 NO. DE SEC ID: 1. Para obtener un homogeneizado celular total, un grupo de medias hojas se muele en la presencia de cuatro volúmenes de amortiguador de extracción detergente (100 mm de fosfato de potasio pH 6.5 , 5 mM EDTA, 10 mM a-mercaptoetanol y 0.5% de peso/volumen de taurocolato de sodio) con mortero y mano almirez después de congelar el tejido en nitrógeno líquido. Para recuperar el fluido intersticial (IF) , el mismo amortiguador de extracción de enzima se infiltra en el grupo opuesto de medias hojas al sumergir el tejido y bombear un vacío moderado (500 mm de Hg) . Después de descargar el amortiguador en exceso, las medias hojas no separadas o íntegras se enrollaron ligeramente en parafilm colocaron en tubos desechables y el fluido intersticial (IF) se recolecta por centrifugación a baja velocidad (1,000 x G por aproximadamente 15 minutos) . El peso de amortiguador recuperado del tejido de hoja infiltrado se registra y varía de aproximadamente la mitad a igual del peso original de la hoja. Expresión de AMY en extractos IF se duantifica utilizando reactivos y protocolo de ensayo de enzimas comercialmente disponibles. El total de proteínas se determina por el método descrito en Bradford, Anal .
Biochem 22:248 1976. El ensayo de enzima AMY se describe en el procedimiento Sigma No. 577. Los siguientes datos presentados como Tabla 2 demuestran que la AMY recombinante activo puede extraerse exitosamente del fluido intersticial de hojas de plantas utilizando el presente método. El método IF resulta en una recuperación de 34% de la actividad total de AMY de la hoja a un enriquecimiento de 27 veces respecto a un extracto obtenido por homogeneización (H) . Los resultados de producción de AMY pueden mejorarse al optimizar la postinoculación con tiempo con el vector viral y minimizar la proteína de revestimiento viral contaminante de la fracción intercelular. EJEMPLO 3 Extracción de proteína Glucocerebrosidasa Glucocerebrosidasa (GCB) ya sea derivada de tej ido de placenta humano o una forma recombinante de células de ovario de hámster fino (CHO) , actualmente se emplea como un tratamiento efectivo pero costoso del desorden de almacenamiento metabólico heredable conocido como enfermedad de Gaucher. Se combina un promotor dual de virus de mosaico de coliflor (35S) , un mejorador de traducción del virus de ataque del ataque del tabaco (Tobacco Etch) y una región de poliadenilación del gen nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens con el ADNc GCB humano nativo para crear el plásmido pBSG638. Estos elementos de expresión se emplean ampliamente para proporcionar la expresión constitutiva más alta posible de genes codificados nucleares en plantas. Usando un método de transformación medida por Agrobacterium standard, regeneramos 93 transformantes resistentes de canamicina independientes de discos de hojas de cuatro cultivos de trabajo diferentes (la generación TO) . El manchado o tinción Western de extractos totales de proteína, detectó agente de reacción cruzada en 36 de estos individuos TO con anticuerpo desarrollado contra glucocerebrosidasa humana. La especificidad de la enzima recombinante expresada por plantas se confirma por hidrólisis de la glucosilceramida radio etiquetada 14C. De acuerdo con estos resultados de expresión, los transformantes rGCB positivos estuvieron en el rango en grupos de actividad moderada (A), baja (B) y despreciable (C) . También encontramos condiciones para inhibir en forma preferencial la actividad de enzima rGCB en la presencia de glucosidasas de planta utilizando el substrato suicida conduritol B-epóxido (CBE) . La actividad total de glucosidasa y la actividad rGCB se midieron por hidrólisis del substrato fluorescente 4-metilumbelliferil glucopiranósido (4-MUG) con y sin CBE. Hojas de plantas transgénicas se retiraron en el pecíolo y disectaron por la costilla media en dos mitades iguales para hacer un material de hoja de tamaño conveniente para el equipo empleado. Para obtener un homogeneizado celular total, un grupo de medias hojas se muele en la presencia de 4 volúmenes de amortiguador de extracción detergente (100 mM de fosfato de potasio, pH 6.5 mM EDTA, a-mercaptoetanol y 0.5% peso/volumen de taurocolato de sodio) con mortero y mano de almirez después de congelar el tejido en nitrógeno líquido. Una persona con destreza ordinaria en la especialidad puede fácilmente preveer un amortiguador en donde el EDTA se substituye con otros queladores tales como EGTA y citrato. Una persona con destreza ordinaria en la especialidad fácilmente puede preveer una solución amortiguadora en donde a-mercaptoetanol se substituye por otros antioxidantes incluyendo ascorbato, metabisulfito de sodio y ditiotreitol . Una persona con destreza ordinaria en la especialidad fácilmente puede preveer que una solución amortiguadora puede substituir el taurocolato de sodio con otros detergentes incluyendo: FDS, TritonMR (T-octil-fenoxi polietoxi etanol) TweenMR (polioxietilen sorbitán) , fosfolípidos, sales biliarias, dioxicolato de sodio y lauril sulfato de sodio) . Para recuperar el fluido intersticial (IF) , el mismo amortiguador de extracción de enzima se infiltra en el grupo opuesto de medias hojas al sumergir el tejido y bombear un vacío moderado (500 mm de Hg) . Después de descargar el exceso de amortiguador, las medias hojas enteras se enrollaron suavemente en parafilm, colocaron en tubos desechables y el fluido intersticial se recolecta por centrifugación a baja velocidad (1000 x G) por aproximadamente 15 minutos. El peso de amortiguador recuperado del tejido de hoja infiltrado se registra y varía de aproximadamente la mitad a igual el peso original de la hoja. Utilizando el substrato suicida, conduritol ß-epóxido (CBE) , la inhibición de la actividad de glucocerebrosidasa recombinante (GCBr) en la presencia de glucosidasas de plantas, se logró. La--actividad de enzima se mide a 37°C en una mezcla de reacción que contiene 5 mM de metilumbelliferil ß-D glucósido, 0.1 M fosfato de potasio, 0.15% de Triton-XlOO, 0.125% de taurocolato de sodio, 0.1% de albúmina de suero bovino, pH 5.9 con y sin CBE. La actividad total de glucosidasa y la actividad de rGCB se midieron por hidrólisis del substrato fluorescente 4 -metilumbelliferil glucopiranósido. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima requerida para catalizar la hidrólisis de 1 nmol de substrato por hora. El total de proteínas se determina utilizando el ensayo Bio-Rad Protein AssayMR con base en el método de Bradford (Bradford, M. , Anal. Biochem . 22:248; 1976).
Tabla 2 IF = extracción de fluido intersticial ?L = Extracción por homogeneización ND = No determinado Los siguientes datos presentados como Tabla 3 demuestran que el GCB recombinante activo puede extraerse exitosamente del fluido intersticial de hojas de plantas utilizando el presente método. El método IF resulta en una recuperación de 22% de la actividad total GCB de la hoja a un enriquecimiento de 18 veces respecto a un extracto que se obtiene por homogeneización. EJEMPLO 4 Extracción de Interferona Avícola tipo II (gamma) Interferona avícola (pollos) de tipo II (gamma) se ha expresado y la enzima activa extraída del espacio intersticial de Nicotiana benthamiana y Nicotiana tabacum.
La interferona pudo extraerse eficientemente de plantas que se desarrollan en el campo o en invernadero utilizando ya sea cantidades gram (extracción a escala de laboratorio) o kg (extracción a escala piloto) de tejidos de planta. N. bentamiana o N. tabacum, de crecimiento activo se inocularon con cualquiera de transcripciones infecciosas o virion de una construcción de planta recombinante como se describe por Donson y colaboradores arriba que aloja el gen gamma interferona de gallina. La interferona avícola se extrae de hojas sistémicamente infectadas 10 días a 3 semanas después de inoculación. EJEMPLO 4a Para extracciones a escala de laboratorio, hojas infectadas sistémicamente (3 a 80 gramos) se desprendieron de la planta en la base de la hoja, pesaron y colocaron en un matraz de tamaño apropiado. El material de hoja se cubrió completamente con una solución amortiguadora (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, amortiguador que contiene 5 mM MgCl2 y 2 mM EDTA) . Las hojas sumergidas se cubrieron con un tarro de vacío Nalgene y se aplicó vacío (720 mm de Hg) y se mantuvo por dos minutos y luego liberó rápidamente. Esta infiltración de vacío luego se repitió para un total de dos ciclos. Siguiendo las infiltraciones de vacío, las hojas se retiraron del matraz y amortiguador superficial se retiró de la superficie de las hojas al teñir entre papel absorbente. Se colocaron hojas en una botella o un frasco de 250 ml , que contiene una malla sostenida que permite la separación y recuperación de IF del material de hojas. El fluido intersticial (IF) se recupera de las hojas infiltradas con vacío por centrifugación (3,000 x G, 15 minutos) . EJEMPLO 4b Para extracciones a escala piloto, hojas infectadas sistémicamente de plantas desarrolladas en campo, se desprendieron de los tallos a mano y pesaron. 5 Kg de hojas se colocaron en bolsas de malla poliéster (Filtra-SpecMR, 12-2-1053), y bolsas de 2 x 5 kg de hojas se colocaron en una canasta de metal . La canasta de metal que contiene material de hojas se coloca en un tanque de vacío MuellerMR de 200 L que contiene aproximadamente 50 litros de solución amortiguada (100 mM Tris-HCl, pH 7.5 amortiguador) , que contienen 5 mm de MgCl2 y 2 mM de EDTA) . Una placa de acero inoxidable de 31.78 kg (70 Ib) se coloca sobre las hojas/bolsas para asegurar completa inmersión. Se bombeó vacío a 68.58 cm (27") de Hg y se mantiene por un minuto y luego rápidamente se libera. Esta infiltración de vacío luego se repite por un total de dos ciclos. Siguiendo las infiltraciones de vacío, las hojas y la canasta se retiran del tanque de vacío. Las bolsas que contienen las hojas infiltradas con vacío se dejó que drenaran por gravedad del amortiguador de superficie por aproximadamente 10 minutos, antes de centrifugación. El fluido intersticial (IF) se recupera de las hojas infiltradas con vacío por centrifugación (1,800 x G, 30 minutos) utilizando una centrífuga de canasta HeineMR (dimensiones de cuenco, diámetro 71.12 cm (28.0") por 41.9 (16.5")) . El IF recolectado se filtra a través de un filtro de calcetín RosedaleMR de 25 µm, y luego a través de un filtro de cartucho Campbell WaterfilterMR de 5 µm y luego almacena a 4°C, antes de análisis. Tabla 3 IF = extracción de fluido intersticial H = Extracción por homogeneización ND = No determinado La cantidad de proteína interferona en un extracto IF se determina por procedimientos de inmuno tinción cuantitativo utilizando anti sueros específicos a interferona avícola tipo II e interferona tipo II producida con E. coli en cantidades conocidas como standard. Con base en inmuno tinción cuantitativa, y purificación parcial, se estima la actividad específica de interferona en N. Bentamiana IF en o cerca de 107 U/mg que es esencialmente igual a interferona aislada de fuentes nativas. Actividad biológica se determina por el ensayo de liberación de óxido nitroso (NO) como se describe por I-owenthal, J.W., Digby, M.R. y York, J. J. Production of Interferon-y by Chicken T Cells (producción de interferona-y por células T de gallinas) , J". Interferon and Cytokine Res . (1995) 1 15:933-938. La especificidad de la actividad se determina por pre-incubación de fluido IF con un anti cuerpo neutralizante seguido al medir la actividad en el ensayo de liberación N. Tabla 4 Invernadero : Tabla 5 Campo : :Rendimiento de proteína interferona se estima por inmuno tinción cuantitativo. 2Actividad de interferona se determina por el ensayo de liberación de NO como se describe por Lowenthal y colaboradores arriba. * No determinado ** Estimados de actividad contienen algo de falta de especificidad (actividad no neutralizada por anticuerpo específico) en ensayo de liberación de NO. EJEMPLO 5 Extracción de proteína scFv N. Benthamiana de crecimiento activo se inoculan con transcripciones infecciosas de una construcción de planta recombinante como se describe por Donson y colaboradores arriba, alojando la proteína scFv 38C13 de limfoma de ratón 38C13. La proteína scFv 38C13 de ratón se extrae de hojas infectadas sistémicamente 11 a 14 días posteriores a inoculación.
Hojas infectadas sistémicamente (3-80 gramos) se desprendieron de la planta en la base de la hoja, pesaron y colocaron en un matraz de tamaño apropiado. El material de hojas se cubre completamente con una solución amortiguadora (100 mM Tris-HCl, pH 7.5 amortiguador que contiene 10 mM MgCl2 y 2 mM EDTA) . Las hojas sumergidas se cubrieron con un tarro de vacío Nalgene y se bombeó vacío a 700 mM de Hg y mantiene por dos minutos y luego libera rápidamente. Esta infiltración con vacío luego se repite por un total de dos ciclos. Siguiendo las infiltraciones de vacío, las hojas se retiraron del matraz y amortiguador superficial se retira de la superficie de las hojas por tinción entre papel absorbente. El fluido intersticial (IF) se recupera de las hojas infiltradas con vacío por centrifugación (3,000 x G, 15 minutos) . Se centrifugaron hojas en una botella de 250 ml, que contienen una malla sostenida, que permite la separación y recuperación del IF del material de hojas. El fluido IF que contiene la proteína scFv se filtra a través de una membrana de 0.2 µm y almacena a -80°C. El producto y la purificación de proteína 38C13 scFv del fluido IF de plantas, se determina por análisis Western utilizando S1C5, un anticuerpo anti-idiotipo monoclonal que reconoce proteína y IgM 38C 13 nativa. El anticuerpo S1C5 reaccionó en forma cruzada con una proteína de 30 KD del tamaño esperado de 38C 13 scFv y una proteína de 60 KD, que es el tamaño correcto para armar espontáneamente el dímero scFv. No se observó reactividad cruzada con proteínas de planta en extractos IF preparados a partir de plantas infectadas con control. La cantidad de proteína scFv 38C 13 producida por plantas recuperadas de extractos IF se mide por ELISA S1C5. Extractos de hoja IF se determina que contienen 20-60 µg de proteína scFv 38C13/ml de fluido IF o 11-30 µg de proteína scFv 38C13/g de peso fresco. Ya que las condiciones de ELISA favorecen reconocimiento anti-idiotipo en solución, se concluye que la fracción principal de scFv 38C13 aislado de fluido IF de planta es soluble y adecuadamente doblada . EJEMPLO 6 Extracción de inmunoglobulina secretoria de tabaco transgénico Hojas de N. tabacum que expresa SigA-G (15 grams) , (Science, 268:716, 1995), se desprenden de la planta en la base de la hoja, pesan y colocan en un matraz de tamaño apropiado. El material —de hoja se cubre completamente con una solución amortiguadora ya sea de 100 mM Tns-HCl pH 7.5 amortiguador que contiene 10 mM MgC12, 2 mM EDTA y 14.3 mM 2 -mercaptoetanol o fosfato de potasio 100 mM, pH6.0, 5 mM EDTA, 10.0 mM 2 -mercaptoetanol y 0.5% de ácido taurocólico) . Las hojas sumergidas se cubrieron con un tarro de vacío NalgeneMR y se aplicó un vacío a 750 mm de Hg y mantiene por un minuto y luego libera rápidamente. Siguiendo las infiltraciones con vacío, las hojas se retiraron del matraz y amortiguador superficial se retira de la superficie de las hojas al teñir entre papel absorbente. El fluido intersticial (IF) se recupera de las hojas infiltradas con vacío por centrifugación (1500 x G, 15 minutos) . Se centrifugaron hojas en una botella de 250 ml , que contienen una malla sostenida que permite la separación y recuperación del IF del material de hojas. Inmunotinción de proteínas de los extractos IF se prepara bajo condiciones de reducción. Ig se detecta en inmunotinción utilizando IgA anti ratón cabra conjugado a peroxidasa de rábano. Aproximadamente 10% de IgA presente en la planta se detecta en los extractos IF. No hubo diferencia visible en la cantidad de Ig en las fracciones IF que se producen utilizando los diferentes amortiguadores anteriormente descritos. No hubo reactividad cruzada con proteínas de planta en extractos IF que se preparan a partir de plantas de control no se observó. EJEMPLO 7 Purificación a escala piloto de glucocerebrosidasa a partir del fluido intercelular de tabaco. Tejido de hoja MD609 (1 a 2 kilogramos) de tabaco transgenico que expresa las glucocerebrosidasa de enzima glisosomal se cosecha; la vena media se retira y el tejido se pesa. El tejido se sumerge con dos a cuatro volúmenes de amortiguador (0.1 M KP04 de amortiguador, pH 6.0 , 5 mM EDTA, 0.5% de ácido taurocólico, 10 mM 2 -mercaptoetanol) utilizando un recipiente de infiltración que permite varios kilogramos de tejido de hojas a la vez. Una placa de metal perforada se coloca sobre el tejido para pesar el tejido y se aplica un vacío de 620-695 mm de Hg por 1 a 2 minutos x 3. El vacío se libera entre aplicaciones subsecuentes. Se gira tejido y el vacío se vuelve a aplicar para lograr infiltración completa. Múltiples aplicaciones del vacío sin aislamiento del fluido intersticial constituyen un solo procedimiento de infiltración. Una indicación de infiltración completa es un obscurecimiento distinto en color del lado inferior del tejido de las hojas. Se descarga el exceso de amortiguador en el tejido. Fluido intersticial se libera del tejido al centrifugar el tejido en un rotor de canastas 25.4 x 10.8 cm (10 x 4.25"), InterTest Equipment Services, San José, CA/Biosource Design 25-0611000) a 4200 RPM (2500 x G) por 10 minutos. El fluido intersticial se recolecta por aspiración (IF-1) . En forma alterna, el tejido de hojas puede ser re-infiltrado al colocar las hojas de nuevo en el recipiente de infiltración en el mismo amortiguador empleado anteriormente y se repite el proceso (IF-2) . La segunda infiltración no requiere tantos ciclos de infiltración con vacío y liberación del vacío. Adicionalmente, el amortiguador puede descargarse del recipiente de infiltración (amortiguador agotado) y reunirse con las primeras y segundas fracciones IF. En forma colectiva, IF-1, IF-2 y el amortiguador agotado constituyen el conjunto de IF. El volumen de fluido intersticial recolectado del tejido de hojas infiltradas fue entre 50 - 100% del tejido de hojas en peso dependiendo del número de infiltraciones realizadas . GCB recombinante se purifica al cargar el IF diluido (corriente de alimentación) directamente en una columna Pharmacia Streamline 25MP que contiene la resina Phenyl Streamline" Cromatografías de lecho expandido permite capturar, aclarar y concentrar la proteína en una etapa sin necesidad por las etapas de centrifugación y/o microfiltración. La columna se equilibra y lava hasta que la señal UV en la grabadora regresara a línea base con 25 mM de citrato, 20% de etilen glicol, pH 5.0; enzima ligada se eluye con 25 mM citrato, 70% de etilen glicol. El material eluido se purifica adicionalmente en una resina de intercambio de cationes, SP Big BeadsMR (Pharmacia) , equilibrada en 25 mM de citrato, 75 mM NaCl, pH 5.0. GCB se eluye ya sea con un gradiente escalonado de 25 mM citrato, 0.5 M NaCl, 10% de etilen glicol. pH 5.0 o un gradiente lineal de 75 mM - 0.4 M NaCl en 25 mM de citrato, pH 5.0. Todas las etapas de cromatografía se llevan a cabo a temperatura ambiente . Utilizando el substrato suicida, conduritol ß-epóxido (CBE) , se logró la inhibición de la actividad glucocerebrosidasa recombinante (rGCB) en la presencia de glucosidasas de planta. La actividad enzimática se mide a 37°C en una mezcla de reacción que contiene 5 mM de metilumbelliferil ß-D glucósido, 0.1 M fosfato de potasio, 0.15% de Triton-XlOO, 0.125% de taurocolato de sodio, 0.1% de albúmina de suero bovino, pH 5.9 con y sin CBE. La actividad total de glucosidasa y la actividad rGCB se midieron por hidrólisis del substrato fluorescente 4-metilumbelliferil glucopiranósido. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima requerida para catalizar la hidrólisis de 1 nmol de substrato por hora. El total de proteínas se determina utilizando el ensayo de proteína Bio-Rad Assay"R con base en el método de Bradford (Bradford, M., Anal. Biochem. 22.:248; 1976). Típicamente, de 1 kilogramo de hojas en donde IF-1 solo se recolecta, se obtuvieron 4,000,000 de unidades de GCB a gravedad específica de 20,000. Las unidades/kg se incrementaron a 6,000,000 con una actividad específica inferior de 10,000 cuando se recolectó el conjunto de (IF-1, IF-2 y amortiguador agotado) . La Tabla 6 a continuación contiene datos que son representativos de varios experimentos. EJEMPLO 8 Ultrafiltración/concentración de fluido intercelular a partir de tabaco crue expresa glucocerebrosidasa. Se cosecharon 2.3 kilogramos de tejido de hoja MD609 de tabaco transgénico que expresa la enzima lisosomal glucocerebrosidasa, la vena media se retiró y el tejido se pesó. El tejido se sumergió con dos a cuatro volúmenes de amortiguador (amortiguador KP04 0.1 M, pH 6.0, 5 mM EDTA, 0.5% de ácido taurocólico, 10 mM 2-mercaptoetanol) en un recipiente de infiltración que aloja varios kilogramos de tejido de hojas a la vez. Una placa de metal perforada se coloca sobre el tejido para aplastar el tejido. Una bomba se aplica a 620-695 mm de Hg por 1 a 2 minutos x 3. El vacío se libera entre aplicaciones subsecuentes. Se gira el tejido y el vacío se vuelve a aplicar para lograr infiltración completa. Amortiguador en exceso en el tejido se descarga. El fluido intersticial se libera del tejido al centrifugar el tejido en un rotor de canasta 25.4 x 10.8 cm (10 x 4.25") InterTest Equipment Services, San José, CA/Biosource Design 25-0611000) a 4200 RPM (2500 x G) por 10 minutos. El fluido intersticial se recolecta por aspiración (IF-1) . El tejido de hojas se re-infiltra al colocar las hojas de nuevo en el recipiente de infiltración en el mismo amortiguador empleado anteriormente y el proceso se repite (IF-2) . El amortiguador se descarga del recipiente de infiltración (amortiguador agotado) y reúne con las fracciones primera y segunda de IF. Colectivamente IF-1, IF-2 y amortiguador agotado constituyen el conjunto IF. El conjunto IF se filtra a través de Miracloth y luego concentra seis veces al pasar el conjunto IF a través de una membrana espiral de .09 m2 (1 pie cuadrado) (30K corte de peso molecular) utilizando un concentrador Amicon RA 2000MR equipado con una bomba LP-1. Tabla 6 Proceso IF a escala laboratorio piloto GCB IF = Fluido intersticial Utilizando el substrato suicida, conduritol ß-epóxido (CBE) , se logra la inhibición de la actividad de glucocerebrosidasa recombinante (rGCB) en la presencia de glucosidasas de plantas. La actividad de enzima se mide a 37°C en una mezcla de reacción que contiene 5 mM de metilumbelliferil ß-D glucósido, 0.1 M fosfato de potasio, 0.15% de Triton-XlOO, 0.125% de taurocolato de sodio, 0.1% de albúmina de suero bovino, pH 5.9 con y sin CBE. Actividad de glucosidasa total y actividad rGCB se midieron por hidrólisis del substrato fluorescente 4-metilumbelliferil glucopiranósido. Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima requerida para catalizar la hidrólisis de 1 nmol de substrato por hora. El total de proteínas se determina utilizando el ensayo de Bio-Rad Protein Assay™ con base en el método de Bradford (Bradford, M. , Anal. Biochem. 22.:248; 1976) . Ver tabla 7 a continuación . EJEMPLO 9 Purificación a escala piloto de glucocerebrosidasa a partir de fluido intercelular de tabaco desarrollado en campo. 100 kg de tejido de hojas de MD609 de tabaco transgénico que expresan la enzima lisosomal glucocerebrosidasa se cosechan del campo cada día por un periodo de dos semanas. El tejido se desprende de los tallos a mano y pesa. 5 kg de hoja se colocaron en bolsas poliéster (Filtra-SpecMR, 12-2-10S3) y cuatro por cinco kg bolsas de hojas se colocaron en una canasta de metal. La canasta de metal que contiene un material de hoja se coloca en un tanque de vacío Mueller de 200 litros que contiene aproximadamente 100 litros de solución de amortiguador (amortiguador KP04 0.1, pH 6.0, 5 mM EDTA, 0.5% de ácido taurocolico, 100 mM 2 -mercaptoetanol) . Una placa de acero inoxidable de 31.78 kg (70 libras) se coloca sobre las hojas/bolsas para asegurar completa inmersión. Se aplica vacío a 695 mm de Hg, mantiene por un minuto y luego rápidamente se libera. Esta infiltración con vacío se repite por un total de dos ciclos. Múltiples aplicaciones de vacío sin aislar el fluido intersticial constituyen un solo procedimiento de infiltración. - Una indicación de infiltración completa es un obscurecimiento distinto en color del lado inferior del tejido de hoja. Siguiendo las infiltraciones de vacío, las hojas y canastas se retiraron del tanque de vacío. Se dejó que las bolsas que contienen las hojas infiltradas con vacío descargaran por gravedad el amortiguador de superficie por aproximadamente 10 minutos, antes de centrifugación. El fluido intersticial (IF) se recupera de las hojas infiltradas con vacío por centrifugación (1,800 x G, 30 minutos) utilizando una centrífuga de canasta HeineMR (dimensiones de cuenco 71.12 cm (28.0") de diámetro x 41.9 cm (16.5")). Tabla 7 Experimento GCB UF IF = fluido intersticial IF recolectado se pasa a través de un filtro de cartucho de 50 µ y luego se almacena a 4°C, hasta que todos los 100 kg de tejido se infiltraron. Este proceso se repitió con el siguiente juego de 4 bolsas de 5 kg (total 5 ciclos x 20 kg) hasta que todo el tejido se infiltrara. Se agregó adicional amortiguador durante cada ciclo de infiltración para sumergir completamente el tejido. En forma alterna, el tejido de hojas puede re-infiltrarse al colocar las hojas de nuevo en el recipiente de infiltración en el mismo amortiguador empleado anteriormente y el proceso se repite (IF-2) . Adicionalmente, el amortiguador puede descargarse del recipiente de infiltración (amortiguador agotado) y puede reunirse con las fracciones IF primer y segunda. En forma colectiva, IF- 1, IF-2 y amortiguador agotado constituye el conjunto IF. El volumen de fluido intersticial recolectado del tejido de hojas infiltrado fue entre 42-170% del tejido de hojas por peso dependiendo del número de infiltraciones llevadas a cabo. GCB recombinante se purifica al cargar el fluido intersticial diluido (corriente de alimentación) directamente en una columna Pharmacia Streamline 200MR que contiene resina Phenyl StreamlineMR . Cromatografía de lecho expandido nos permite capturar, aclarar y concentrar nuestra proteína en una etapa sin necesidad por las etapas de centrifugación y/o microfiltración. La columna se equilibra y lavó hasta que la señal de UV en la grabadora regresara a línea base con 25 mM de citrato, 20% de etilen glicol, pH 5.0; la enzima ligada se eluye con 25 M de citrato, 70% de etilen glicol. El material eluido fue filtrado en estéril al pasar el material eluido a través de una cápsula Sartoclean GFMR 0.8 um, .09 m2 (1 pie cuadrado) seguido por un filtro estéril Sartobran PMR 0.2 um, 0.9 m2 (1 pie cuadrado) y (Sartorius, Corp.) y almacena a 4°C hasta la siguiente etapa de cromatografía. El material eluido de 4 a 5 días de corridas de cromatografía de Phenyl StreamlineMR, se reúne en conjunto y purifica adicionalmente en una resina de intercambio catiónico, SP Big BeadsMR (Pharmacia), equilibrada en 25 mM de citrato, 75 mM NaCl , pH 5.0. GCB se eluye con un gradiente escalonado de 25 mM citrato, 0.4 M NaCl, 10% etilen glicol, pH 5.0. Todas las etapas de cromatografía se llevaron a cabo a temperatura ambiente. El material eluido fue filtrado en estéril al pasar el material eluido a través de una cápsula de Sartoclean GFMR 0.8 um, 0.9 metros cuadrados (un pie cuadrado) seguido por un filtro estéril Sartobran PMR 0.2 µm, 0.9 metros cuadrados (un pie cuadrado) y (Sartorius, Corp.) Y se almacena a 4°C. Utilizando el substrato suicida, conduritol ß-epóxido (CBE) , se logra la inhibición de la actividad de glucocerebrosidasa recombinante (rGCB) en la presencia de glucosidasas de plantas. La actividad de enzima se mide a 37°C en una mezcla de reacción que contiene 5 mM de metilumbelliferil ß-D glucósido, 0.1 M fosfato de potasio, 0.15% de Triton-XlOO, 0.125% de taurocolato de sodio, 0.1% de albúmina de suero bovino, pH 5.9 con y sin CBE. Actividad de glucosidasa total y actividad rGCB se midieron por hidrólisis del substrato fluorescente 4-metilumbelliferil glucopiranósido. Total de proteínas se determina utilizando el ensayo de Bio-Rad Protein Assay con base en el método de Bradford (Bradford, M., Anal. Biochem. 22:248; 1976) . Típicamente a partir de un kilogramo de tabaco cultivado en campo, que expresa GCB, en donde IF-1 solo se recolecta, se obtienen 2,745/kg de GCB a una actividad específica La unidad/kg se incrementa a 755,000 con actividad específica de 3,400 cuando el conjunto IF se colecta (IF-1, IF-2 y amortiguador agotado) .
La Tabla 8 a continuación contiene datos que son representativos de una semana de experimentos. EJEMPLO 10 Experimento de te ido trozado Se lleva a cabo un experimento en donde 100 kg de tejido de hojas MD609 de tabaco transgénico que expresa la enzima lisosomal glucocerebrosidasa, se cosechan desprendiendo de los tallos a mano, pesan y trozan en pequeñas piezas para incrementar el área superficial para infiltración de amortiguador. 5 kg de hojas se colocaron en bolsas de poliéster [Filtra-SpecMR, 12-2-10531 y cuatro bolsas de 5 kg de hojas se colocaron en una canasta de metal . La canasta de metal que contiene el material de hojas se coloca en un tanque de vacío MuellerMR de 200 L que contiene aproximadamente 100 litros de solución amortiguada (0.1 amortiguador KP04, pH 6.0,5 mM EDTA, 0.5% de ácido taurocólico, 10 mM 2 -mercaptoetanol) . Una placa de acero inoxidable de 31.78 kg (70 libras) se coloca sobre las hojas/bolsas para asegurar completa inmersión. Se aplica un vacío de 695 mm de Hg mantienen por un minuto y luego rápidamente se libera. Esta infiltración de vacío luego se repite por un total de dos ciclos. Siguiendo las infiltraciones de vacío, las hojas y la canasta se retiran del tanque de vacío. Las bolsas que contienen las hojas infiltradas con vacío se deja que drenen por gravedad del amortiguador de superficie por aproximadamente 10 minutos, antes de centrifugación. El fluido intersticial (IF) se recupera de las hojas infiltradas con vacío por centrifugación (1,800 x G, 30 minutos) utilizando una centrífuga de canasta HeineMR (dimensiones de cuenco, diámetro 71.12 por 41.9 cm (28.0 16.5")). El IF recolectado se pasa a través de un filtro de cartucho de 50 µm, y luego se almacena 4°C, hasta que se infiltraran todos los 100 kg de tejido. Este proceso se repite con el siguiente juego de 4 bolsas de 5 kg (cinco ciclos por 20 ciclos de kg total) hasta que todo el tejido se infiltrara. Amortiguador adicional se agrega durante cada ciclo de infiltración para sumergir completamente el tejido. A fin de evaluar que tanta enzima se recupera en el fluido intersticial, el tejido del cual se aisla el fluido intersticial luego se homogeneiza en un mezclado Waring"R con cuatro volúmenes del mismo amortiguador de infiltración como con anterioridad, centrífuga y el sobre nadante se ensaya para actividad de enzimas . GCB recombinante se purifica al cargar el fluido intersticial diluido (corriente de alimentación) directamente en una columna Pharmacia Streamline 200MR que contiene resinas Phenyl StreamlineMR. La columna se equilibra y lava hasta que la señal UV en la grabadora regresara a la línea base con 25 mM de citrato, 20% de etilen glicol, pH 5.0 y luego eluye con 25 mM de citrato, 70% etilen glicol. Todas las etapas de cromatografía se llevaron a cabo a temperatura ambiente. La Tabla 9 a continuación contiene datos de los experimentos de trozos.
Tabla 8 Prueba en campo GCB a escala piloto-P.SL 10 10 10 10 15 10 10 10 EJEMPLO 11 Purificación a Escala Piloto de Alfa Galactosidasa a Partir del Fluido Intercelular de Nicotiana Bentamiana Plantas de Nicotiana Bentamiana de crecimiento activo, se inocularon con transcripciones infecciosas de una construcción viral de planta recombinante que contiene el gen alfa galactosidasa de enzima lisosomal, en donde el gen a-galactosidasa contiene una modificación de terminal carboxi a la secuencia nucleótido para- permitir secreción al espacio intersticial. Tejido de hojas infectadas sistémicamente (1-2 kg) se cosecha de Nicotiana Bentamiana que expresa a-galactosidasa 14 días después de inoculación. El tejido se pesó y sumergió con dos a cuatro volúmenes de amortiguador (amortiguador bis tris propano 25 mM, pH 6.0, 5 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 10 mM 2 -mercaptoetanol) en un recipiente de infiltración que puede alojar varios kilogramos de tejido de hojas a la vez. Una placa de metal perforada se coloca sobre el tejido para aplastar con peso el tejido. Se aplica un vacío a 620-695 mm de Hg por 30 segundos y luego se libera rápidamente. EL tejido se gira y el vacío reaplica para lograr infiltración completa que se confirma por un obscurecimiento distinto en color del lado inferior del tejido de la hoja. Exceso de amortiguador en este giro se descarga. El fluido intersticial se libera del tejido al centrifugar el tejido en un rotor de canasta (25.4 x 10.8 cm (10 x 4.25") de profundidad, InterTest Equipment Services, San José, CA/Biosource Design 25-0611000) a 4200 RPM (2100 x G) por 10 a 15 minutos. El fluido intersticial se recolecta por aspiración. En algunos casos, solo se cosechó tejido de hojas infectadas. En forma alterna, los pecíolos y vastagos se han cosechado junto con el tejido de hojas para infiltración. La vena media no se retira del tejido antes de infiltración.
Tabla 9 Trozos de prueba de campo GCB 10 10 ND = No determinado 73. Se purifica alfa galactosidasa al cargar el diluido intercelular (corriente de alimentación) directamente sobre una columna Pharmacia Streamline 25MR que contiene resina Butyl StreamlineMR. Cromatografía de lecho expandido permite la captura, aclaración y concentración de la proteína en una etapa sin necesidad por etapas de centrifugación y/o microfiltración. La columna se equilibra y lava hasta que la señal UV en la grabadora regresara a la línea base con 25 mM de bis tris propano, pH 6.0 20% (NH4)2S04 y luego se eluye con 25 mM de bis tris propano, pH 6.0. El material eluido se purifica adicionalmente en hidroxiapatita equilibrada con amortiguador 1 mM NaP04, 5% glicerol, pH 6.0 y eluye con cualquiera de un amortiguador NaP04 1-250 mM, 5% glicerol, pH 6.0 gradiente lineal o un gradiente por etapas. Todas las etapas de cromatografía se llevaron a cabo a temperatura ambiente. La actividad de alfa galactosidasa se mide por hidrólisis del substrato fluorescente 4 -metilumbelliferil a-D galactopiranósido. La actividad de enzima se mide a 37°C en una mezcla de reacción que contiene 5 mM de metilumbelliferil ß-D piranósido, 0.1 M fosfato de potasio, 0.15% de Triton-XlOO, taurocolato de sodio 0.125%, 0.1% de albúmina de suero bovino, pH 5.9. El total de proteínas se determina utilizando el Bio-Rad Protein AssayMR con base en el método de Bradford (Bradford, M. Anal. Biochem. 72 : 248 ; 1976) . De 1 kg de hojas, típicamente se obtienen entre 140,000,000 a 160,000,000 de unidades de alfa galactosidasa a una actividad específica de 300,000 unidades después de un solo procedimiento de infiltración (IF-1) . La tabla 10 a continuación contiene datos que son representativos de varios experimentos.
Tabla 10 Alfa gal escala piloto 10' 15 ?o- 15 IF =extracción de fluido intersticial EJEMPLO 12 20 2 -mercaptoetanol) . Una placa de acero inoxidable de 31.78 fluido intersticial constituye un _ procedimiento de infiltración sencillo. Una indicación de infiltración completa es un obscurecimiento distinto en color del lado inferior del tejido de hoja. Siguiendo las infiltraciones de vacío, las hojas y canastas se retiran del tanque de vacío. Las bolsas que contienen las hojas infiltradas con vacío se deja que descarguen por gravedad el amortiguador de superficie por aproximadamente 10 minutos, antes de centrifugación. El fluido intersticial (IF) se recupera de las hojas infiltradas con vacío por centrifugación (1,800 x G, 30 minutos) utilizando una centrifuga de canasta HeineMR (dimensiones de cuenco, 71.12 cm (28.0") de diámetro por 41.9 cm (16.5")) . IF recolectado existe a través de un filtro de cartucho 50 µ y luego se almacena a 4°C, hasta que todos los 100 kg de tejido se infiltran. Este procedimiento se repite con el siguiente juego de cuatro bolsas de 5 kg (cinco ciclos por 20 kg en total) hasta todo el tejido se infiltrara. Se agregó amortiguador adicional durante cada ciclo de infiltración para sumergir completamente el tejido. GCB recombinante se purifica al cargar el diluido intercelular (corriente de alimentación) directamente en una columna Pharmacia Streamline 200MR que contiene resinas r Phenyl StreamlineMR. Cromatografía de lecho expandido permite la captura, aclaración y concentración de la proteína en una etapa sin necesidad por las etapas de centrifugación y/o microfiltración. La columna se equilibra y lava hasta que la señal UV en la grabadora regresara a línea base con 25 mM citrato, 20% etilen glicol, pH 5.0; la enzima ligada se eluye con 25 mM citrato, 70% etilen glicol. El material eluido fue filtrado en estéril al pasar el material eluido a través de una cápsula Sartoclean GFMR 0.8 µm, 0.9 metro cuadrado (un pie cuadrado) seguido por un filtro estéril Sartobran PMR 0.2 µm 0.9 metro cuadrado (un pie cuadrado) (Sartorius, Corp.) y almacena a 4°C hasta la siguiente etapa de cromatografía. El material eluido de 4 a 5 días de corridas de cromatografía con Phenyl StreamlineMR se recolecta y purifica adicionalmente en una resina de intercambio de cationes, SP Big BeadsHR (Pharmacia) , equilibrada en 25 mM de citrato, 75 mM NaCl, pH 5.0. GCB se eluye con un gradiente escalonado de 25 mM citrato, 0.4 M NaCl, 10% etilen glicol, pH 5.0. Todas las etapas de cromatografía se llevaron a cabo a temperatura ambiente. El material eluido fue filtrado en estéril al pasar el material eluido a través de una cápsula Sartoclean GFMR 0.8 µm, 0.9 metro cuadrado (un pie cuadrado) seguido por un filtro estéril Sartobran PMR 0.2 µm, 0.9 metro cuadrado (un pie cuadrado) (Sartorius, Corp.) y almacena a 4°C. Utilizando el substrato suicida, conduritol ß-epoxide (CBE) , se logra la inhibición de la actividad de glucocerebrosidasa recombinante (GCBr) en la presencia de glucosidasas de plantas. Se mide la actividad enzimática a 37°C en una mezcla de reacción que contiene 5 mM de metilumbelliferil ß-D glucósido, 0.1 M fosfato de potasio, 0.15% de Triton-XlOO, 0.125% de taurocolato de sodio, 0.1% de albúmina de suero bovino, pH 5.9 con y sin CBE. La actividad total de glucosidasa y la actividad rGCB se midieron por hidrólisis del substrato fluorescente 4 -metilumbelliferil glucopiranósido. El total de proteínas se determina utilizando el Bio-Rad Protein Assay^" con base en el método de Bradford (Bradford, M. Anal . Biochem. 72:248; 1976) . La cantidad que queda de virus presente en el tejido de hojas extraído con IF se determina utilizando métodos de precipitación de polietilen glicol y homogeneización. Además, la cantidad de virus presente en el fluido intersticial recolectado se determina por precipitación de polietilen glicol directa. Rendimientos finales de virus de muestras precipitadas se determinan espectrofotométricamente por absorbancia a 260 nm (ver tabla 11) .
Tabla 11 La Tabla 12 contiene los datos de recuperación de GCB a partir de tejido de planta transfectada TMV.
Tabla 12 Recuperación de GCB a partir de plantas transfectadas con TMB. 3,0 10 Este ejemplo demuestra la capacidad por extraer dos productos diferentes del mismo tejido de hoja con base en procedimientos de extracción que tienen como objetivo específicamente productos localizados en el apoplasto y citosol . Mientras que la invención de esta solicitud de patente se describe por referencia a los detalles de modalidades preferidas de la invención, habrá de entenderse que esta descripción se pretende en un sentido ilustrativo más que limitante. Se contempla que se ocurrirán fácilmente a aquellos con destreza en la especialidad modificaciones dentro del espíritu de la invención y el alcance de las reivindicaciones anexas. Además se entiende que la presente invención aplica a todas las proteínas producidas o capaces de producirse de manera recombinante en plantas, y claramente no se limita a aquellas proteínas específicamente aquí descritas. EJEMPLO 13 Centrifugación a gran escala de fracciones IF El siguiente Ejemplo ilustra un procedimiento ajustado en escala para la producción del extracto IF utilizando un método por lotes discontinuo que producirá una corriente constante de extracto IF para procesamiento corriente abajo. Este procedimiento consiste de los siguientes elementos: 1. Cosecha de hojas enteras automatizada 2. Infiltración continua a gran escala 3. Centrifugación en canasta a gran escala Cuando menos hay dos diseños de cosechador de hojas íntegras a escala completa disponibles. Uno ácido desarrollado por R.J. Reynolds Company y se ha empleado en su instalación Avoca en North Carolina. El otro cosechador se ha desarrollado por la University of Kentucky, Agricultural Engineering Department y se ha demostrado por tres temporadas en el condado de Daviess en Kentucky en campos de tabaco comerciales. Estos cosechadores han mostrado la capacidad por cortar 'plantas intactas, desprender hojas integras y separar las hojas y tejido de tallo a velocidades de más de varios acres por hora. Las hojas luego se transportarán a la instalación de extracción, en remolques. Las hojas luego se descargarán por transportador mecánico y alimentador de banda de peso continuo al sistema de infiltración con vacío. Se han diseñado dos sistemas. El sistema 1 (Figura 1) es un tanque a granel. Este tanque se construye para vacío íntegro y es girable a bajas (menos de cincuenta) rpm, de manera tal que todas las hojas se sumerjan en el medio de infiltración. Se crea un vacío por bombas de vacío mecánicas convencionales o por un expulsor de vapor a un vacío igual a 53.34 cm (21") de presión de columna de agua. Del vacío luego se libera provocando infiltración al tejido. El recipiente luego se descarga a un tanque secundario para re-utilización del amortiguador y el tejido de hojas se descarga del recipiente mediante un tornillo de Arquímides o tornillo sin fin en el fondo del tanque a una compuerta de descarga y sobre un transportador. Este transportador envía las hojas a la centrífuga de canasta mediante una banda de pesado. La banda de pesado asegura que una cantidad medida de material se agrega a la centrífuga por cada ciclo de centrifugación. El sistema 2 es un sistema de infiltración con vacío continuo. Este sistema consiste de un gran tubo cilindrico que tiene un transportador de tornillo sin fin interno (Figura 2) . El cilindro se coloca a un ángulo. El cilindro se llena parcialmente con el fluido de infiltración. El cilindro se suministra al vacío por bombas de vacío convencionales o un expulsor de vapor a aproximadamente 53.34 cm (21") de presión de columna de agua. Se agrega tejido de hojas a través de una válvula rotatoria que mantiene el vacío conforme se agrega el tejido. El tejido de hojas luego se sumerge por un periodo de tiempo en el amortiguador conforme viaja hacia arriba en el tubo, transportado por el tornillo sin fin. Las hojas infiltradas se descargan en el extremo elevado del tornillo sin fin a través de otra válvula rotatoria. En este punto, se libera el vacío. Este tipo de recipiente a presión, equipado con válvulas rotatorias y aspa de transporte de tornillo sin fin es adaptado a partir de un diseño de recipiente a presión por Christian Engineering (San Francisco) que se utiliza para cocción continua de arroz y otros materiales utilizando presión de vapor. Una vez descargadas, las hojas se transportan a la centrífuga de canasta a través de un transportador equipado con una banda de pesado. La banda de pesado funciona como se estableció anteriormente para asegurar la carga adecuada de material por cada ciclo de la centrífuga de canasta. La centrífuga de canasta es una modificación de un * diseño básico Sanborn (UPE) para la industria de vegetales para deshidratar productos verdes de ensalada después de lavar. La centrífuga es un diseño de canasta con un husillo de tipo cono en el interior de la canasta. La canasta es un diseño de dos piezas que logra la separación de la placa de fondo del cilindro mediante un pistón hidráulico. La centrífuga se carga a muy baja velocidad (es decir bajas RPM o baja fuerza G) mediante un transportador que se coloca sobre el centro de la canasta equipado con el husillo de cono. Conforme el material cae del transportador, se desvía por el cono uniformemente sobre el lado de la canasta perforada. Cuando la carga de las hojas se completa, el tornillo sin fin se detiene y la canasta se acelera a 2000-2500 x G por aproximadamente 5-60 minutos. El fluido IF se recupera de la centrífuga. Al final de la centrifugación, la canasta se desacelera a bajas rpm. El fondo de la canasta se separa de los lados (cilindro) por la acción del pistón hidráulico. El tejido de hojas se descarga a un transportador, el fondo de la centrífuga se cierra y el ciclo se repite. Este diseño requiere que un rotor e impulsor se diseñen que puedan calificar para la superior fuerza G. Típicamente, las máquinas tipo Sanbom solo están calificadas para 600 a 800 G. Sin embargo está dentro de los parámetros de ingeniería normales el construir esta máquina actualizada para esta aplicación única.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. - Un método para recuperación a gran escala de una proteína de interés concentrada y activa, a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora; (b) someter el tejido de planta y solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido mediante una centrífuga de canasta para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial . 2.- Método para recuperación a gran escala de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta, que es una hoja entera o media hoja, con una solución amortiguadora; (b) someter el tejido de- planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína se concentra mediante ultrafiltración.- 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína se concentra mediante cromatografía de lecho expandido. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tejido de planta se elige del grupo que consiste de: hojas, vastagos o tallos, brotes, flores, frutas y raíces. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porgue además comprende la etapa de disectar la hoja de planta substancialmente sobre la costilla media antes de infiltración de la hoja de planta con una solución amortiguadora. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución amortiguadora se elige del grupo que consiste de: citrato, fosfato y tris. 8. - Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora seleccionada del grupo que consiste de: citrato, fosfato y tris; (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el- tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial, en donde la solución amortiguadora además contiene detergente seleccionado del grupo que consiste de taurocolato de sodio, SDS, t-octilfenoxipolietoxietanol, esteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán, fosfolípidos, sales biliares, deoxicolato de sodio y lauril sulfato de sodio. 9. - Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora seleccionada del grupo que consiste de: citrato, fosfato y tris; (b) someter el tejido de planta y solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés a partir del fluido intersticial, en donde la solución amortiguadora además contiene queladores seleccionados del grupo que consiste de EDTA, EGTA y citrato . 10.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la solución amortiguadora contiene antioxidante seleccionado del grupo que consiste de: a-mercapto etanol, ascorbato, metabisulfito de sodio y ditiotreitol . 11.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las hojas de plantas y solución amortiguadora se someten a una presión de vacío de aproximadamente 200 hasta 760 mm de „Hg. 12. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la presión de vacío es aproximadamente 400 a 760 mm de Hg. 13. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la presión de vacío es aproximadamente 740 a 760 mm de Hg. 14. - El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la presión de vacío es aproximadamente 760 mm de Hg. 15. - El método de conformidad con la reivindicación "1, caracterizado porque el centrifugado se realiza en un rango de fuerza G de 50-5,000 x G. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el centrifugado se '1 conduce a un rango de fuerza G de aproximadamente 2,000 x G. "1.1 . - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de interés se produce en la planta por un vector viral de planta recombinante. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de interés se produce por una planta transgénica. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de interés se produce naturalmente en la planta. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa de descargar o teñir el exceso de amortiguador del tejido antes de centrifugar. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa de transferir el tejido de la solución amortiguadora a una centrífuga mediante un proceso por lotes discontinuo. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa de purificar substancialmente una proteína de interés del tejido que queda después de que el fluido intersticial se ha retirado por centrifugación. 23. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína se deriva de componentes celulares seleccionados del grupo que consiste de: la trasmembrana de plasma, peroxisomas, membranas asociadas, otros organelos, el núcleo, el aparato de Golgi, citosol, retículo endoplásmico rugoso y liso, mitocondria, vacuola y cloroplastos. 24. - Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial, en donde la proteína de interés es una proteína de inactivación de ribosoma. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína de interés es una enzima lisosomal humana. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína de interés es una enzima industrial. 27.- Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial, en donde la proteína de interés es citocina. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de interés es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. 29.- Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial; en donde la proteína de interés es a-galactosidasa o una isozima de a-galactosidasa. 30.- Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial; en donde la proteína de interés es glucocerebrosidasa o una isozima de glucocerebrosidasa . 31.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína de interés también comprende un péptido de señalización para dirigir la proteína a un compartimiento específico dentro de una célula. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque más de un tipo de proteína puede ser purificado simultáneamente. 33.- Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial; en donde el tejido de planta se infiltra con la solución amortiguadora por un suministro discontinuo de la solución amortiguadora al tejido de planta mediante un tanque de infiltración con vacío, rotatorio. 34.- Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés del fluido intersticial; en donde la infiltración es una infiltración continua mediante un recipiente cilindrico a presión que contiene un tornillo sin fin interno con una entrada rotatoria y una válvula de descarga rotatoria. 35.- Método para la recuperación de una proteína de interés concentrada y activa a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, caracterizado porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la proteína de interés a partir del fluido intersticial; en donde la centrífuga de canasta es capaz de acelerarse para recuperar el fluido intersticial a aproximadamente 2000-2500 x G y el material de hojas se descarga a través de un diseño de rotor dividido. 36.- Método para recuperación a gran escala de una biomolécula concentrada de interés seleccionada del grupo que consiste de: lípidos, carbohidratos, lipoproteínas, polisacáridos, azúcares, ácidos grasos, ácidos nucleicos y polinucleótidos el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido mediante una centrífuga de canasta para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la biomolécula de interés del fluido intersticial. 37.- Método para recuperación a gran escala de una biomolécula concentrada de interés seleccionada del grupo que consiste de: lípidos, carbohidratos, lipoproteínas, polisacáridos, azúcares, ácidos grasos, ácidos nucleicos y polinucleótidos, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta, que es una hoja entera o media hoja, con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la concentrar la biomolécula de interés del fluido intersticial. 38.- Método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la biomolécula de interés se concentra mediante ultrafiltración. 39.- Método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la biomolécula de interés se concentra mediante cromatografía de lecho expandido. 40.- Método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el tejido de planta se elige del grupo que consiste de: hojas, tallos, brotes, flores, frutos y raíces. 41.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque además comprende la etapa de disectar la hoja de planta substancialmente sobre la costilla media antes de infiltración de la hoja de planta con una solución amortiguadora. 42. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la solución amortiguadora se elige del grupo que consiste de: citrato, fosfato y tris. 43. - Método para recuperación de una biomolécula concentrada de interés, seleccionada del grupo que consiste de: lípidos, carbohidratos, lipoproteínas, polisacáridos, azúcares, ácidos grasos, ácidos nucleicos y polinucleótidos, a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora seleccionada del grupo que consiste de: citrato, fosfato y tris; (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la biomolécula de interés del fluido intersticial; en donde la solución amortiguadora además contiene detergente seleccionado del grupo que consiste de taurocolato de sodio, SBS, t-octílfenoxipolietoxietanol, esteres de ácido graso de polioxietilensorbitan, fosfolipidos, sales biliares, deoxicolato de sodio y lauril sulfato de sodio. 44.- Método para recuperación de una biomolécula concentrada de interés seleccionada del grupo que consiste de: lípidos, carbohidratos, lipoproteínas, polisacáridos, azúcares, ácidos grasos, ácidos nucleicos y polinucleótidos, a partir del fluido intersticial de tejidos de plantas, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora seleccionada del grupo que consiste de: citrato, fosfato y tris; (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la biomolécula de interés del fluido intersticial; en donde la solución amortiguadora además contiene queladores seleccionados del grupo que consiste de EDTA, EGTA y citrato. 45.- El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la solución amortiguadora contiene antioxidantes seleccionados del grupo que consiste de: a-mercapto etanol, ascorbato, metabisulfito de sodio y ditiotreitol . 46.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque las hojas de plantas y la solución amortiguadora se someten a una presión de vacío de aproximadamente 200 hasta 760 mm de Hg. 47.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la presión de vacío es aproximadamente 400 a 760 mm de Hg. 48.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la presión de vacío es aproximadamente 740 a 760 mm de Hg. 49.- El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la presión de vacío es aproximadamente 760 mm de Hg. 50.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el centrifugado se realiza a un rango de fuerza G de 50-5,000 x G. 51.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el centrifugado se conduce a un rango de fuerza G de aproximadamente 2,000 x G. 52.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la biomolécula de interés se produce en la planta por un vector viral de planta recombinante . 53. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la biomolécula de interés se produce por una planta transgénica. 54. - El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la biomolécula de interés se produce naturalmente en la planta. 55.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque además comprende la etapa de descargar o teñir el exceso de amortiguador del tejido antes de centrifugar. 56.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque además comprende la etapa de transferir el tejido de la solución amortiguadora a la centrifuga mediante un proceso por lotes discontinuo. 57.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque además comprende la etapa de purificar substancialmente una biomolécula de interés del tej ido que queda después de que el fluido intersticial se ha retirado por centrifugación. 58.- El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la biomolécula de interés se deriva de componentes celulares seleccionados del grupo que consiste de: la transmembrana de plasma, peroxisomas, membranas asociadas, otros organelos, el núcleo, el aparato de Golgi, el citosol, el retículo endoplástico rugoso y liso, los mitocondrios, la vacuola y el cloroplasto. 59.- Método para recuperar una biomolécula concentrada de interés seleccionada del grupo que consiste de: lípidos, carbohidratos, lipoproteínas, polisacáridos, azúcares, ácidos grasos, ácidos nucleicos y polinucleótidos, del fluido intersticial de tejidos de plantas, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la biomolécula de interés del fluido intersticial; en donde el tejido de planta se infiltra con la solución amortiguadora por un suministro discontinuo de la solución amortiguadora al tejido de planta mediante un tanque de infiltración con * vacío rotatorio. ~ 60.- Método para recuperar una biomolécula de interés concentrada seleccionada del grupo que consiste de: lípidos, carbohidratos, lipoproteínas, polisacáridos, azúcares, ácidos grasos, ácidos nucleicos y polinucleótidos, del fluido intersticial de tejidos de plantas, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tej ido ~~de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la biomolécula de interés del fluido intersticial; en donde la infiltración es una infiltración continua mediante un recipiente a presión cilindrico que contiene un tornillo sin fin interno con una entrada rotatoria y una válvula de descarga rotatoria. 61.- Método para recuperación de una biomolécula concentrada de interés seleccionada del grupo que consiste de: lípidos, carbohidratos, lipoproteínas, polisacáridos, azúcares, ácidos grasos, ácidos nucleicos y polinucleótidos, del fluido intersticial de tejidos de plantas, el método se caracteriza porque comprende las etapas de: (a) infiltrar un tejido de planta con una solución amortiguadora, (b) someter el tejido de planta y la solución amortiguadora a un ambiente de vacío substancial; (c) retirar el tejido de la solución amortiguadora; (d) centrifugar el tejido mediante una centrífuga de canasta para retirar el fluido intersticial; y (e) concentrar la biomolécula de interés del fluido intersticial; en donde la centrífuga de canasta es capaz de acelerarse para recuperar el fluido intersticial a aproximadamente 2000-2500 x G y el material de hoja se descarga a través de un diseño de rotor dividido. - , . 104 RESUMEN DE LA INVENCIÓN Un método para extraer proteínas del espacio intercelular de plantas, se proporcionan. El método es aplicable a un aislamiento a gran escala de muchas proteínas activas de interés sintetizadas por células de plantas. El método puede utilizarse comercialmente para recuperar proteínas producidas de manera recombinante a partir de huéspedes de plantas, de esta manera haciendo factible el uso a gran escala de plantas como fuentes para la producción de proteína recombinante. l wi=-
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