MXPA00011348A

MXPA00011348A - Metodos para la remocion de material amiloide utilizando anticuerpos anti-amiloide.

Info

Publication number: MXPA00011348A
Application number: MXPA00011348A
Authority: MX
Inventors: Alan Solomon
Original assignee: Univ Tennesse Res Corp
Priority date: 1998-05-21
Filing date: 1999-05-21
Publication date: 2003-04-22
Also published as: IL139095A0; DE69942274D1; RU2004107695A; DK1078005T3; HK1035542A1; WO1999060024A9; JP2002515235A; JP2010159284A; CA2325600A1; NZ507727A; ZA200007811B; EP1078005A1; WO1999060024A1; EP1078005B1; ATE465178T1; KR100701580B1; CN1344275A; KR20010052374A; AU4007599A; ES2345746T3

Abstract

Los metodos y los peptidos de inmunoglobulina relacionan y fragmentos de estos se describen porque intensifican la respuesta inmune mediada por celulas, de un paciente, hacia los depositos de fibrillas amiloides. Estos metodos explotan el efecto opsonizante de los anticuerpos dirigidos hacia el material amiloide o sus partes que lo componen.

Description

MÉTODOS PARA LA REMOCIÓN DE MATERIAL AMILOIDE UTILIZANDO ANTICUERPOS ANTI-AMILOIDE Campo de la Invención La presente invención generalmente se relaciona a métodos para tratar enfermedades relacionadas con el material amiloide . Específicamente, la presente invención proporciona métodos terapéuticos relacionados a los anticuerpos para efectuar la remoción de fibrillas amiloides mediante el sistema inmunofagocitico propio del paciente .

.Antecedentes de la Invención La amiloidosis se refiere a la deposición patológica de proteínas en forma de fibrillas congofilicas, verde birrefrigentes, cuando se tiñen con rojo Congo, ya sea que estén dispersas o en forma de amiloidomas localizados. Estos depósitos son sintomáticos de diversas enfermedades, por ejemplo la Enfermedad de Alzheimer, el material amiloide asociado a la inflamación, diabetes tipo II, encefalopatía espongiforme bovina (BDE) , Ref: 124264 enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD) , el scrapie y la amiloidosis primaria. Por lo general, la amiloidosis se categoriza en tres grupos: amiloidosis sistémica primaria, amiloidosis localizada primaria, y amiloidosis heterógena. Las amiloidosis sistémicas primarias incluyen: condiciones crónicas inflamatorias (por ejemplo, tuberculosis, osteomielitis, etc.); condiciones no infecciosas tales como la artritis reumatoide juvenil, espondilitis anquilosante y enfermedad de Crohn, etc.; Fiebre Mediterránea doméstica, discrasia de las células plasmáticas (amiloidosis primaria) y diversas polineuropatias domésticas y cardiomiopatias. Las principales amiloidosis localizadas incluyen: diálisis crónica, usualmente para mayores de 8 años, enfermedad de Alzheimer, Síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditaria (Neerlandés) , y hemorragia cerebral no traumática de los mayores. La amiloidosis heterógena incluye: polineuropatia doméstica (Iowa), amiloidosis doméstica (Finlandés) hemorragia cerebral hereditaria (Islandés), CJD, carcinoma medular de la tiroides, material amiloide atrial, y diabetes mellitus (insuloma) .

Otras amiloidosis incluyen aquellas a las que se hace referencia en Louis W. Heck, ?,The A yloid Diseases" en Cecil's Textbook of Medicine 1504-ß (W. B. Saunders & ™ Co., Filadelfia, PA; 1996). 5 Las encefalopatías espongiformes transmisibles que causan CJD y la enfermedad de Gertsmann-Strássler- Scheinker (GSS) se describen por B. Chesebro et al . f *Transmissible Spongiform Encephalopathies : A Brief Introduction" en FIELD' S VIROLOGY 2845-49 (3a Edición; ™10 Raven Publishers, Filadelfia, PA; 1996) y en D. C.

Gajdusek, 'Infectious amyloids: Subacute Spongiform Encephalopathies as Trasmissible Cerebral Amyloidoses" 2851-2900 en FIELD'S VIROLOGY (1996) . Muchas de estas enfermedades posiblemente están mediadas por priones, una 15 proteina infecciosa. Ver S. B. Prusiner, *Prions" en FIELDS VIROLOGY 2901-50 (1996) y las referencias que se fl) contienen ahi. Las formas heredadas de las amiloidosis como se describen en Online Mendelian Inheritance in Man ( OMIM ) www. ncbi . nlm. nih . gov/htbin-post/Qmim/dispmim? Cada una de 20 las anteriores se incorporan en la presente para su referencia.

Rara vez, los pacientes con amiloidosis clínicamente probada logran una remoción completa de forma espontánea, tal vez debido a que las fibrillas amiloides en si, no son inmunogénicas. Se han investigado diversas terapias para la amiloidosis, tales como la quimioterapia en altas dosis, esteroides, doxorubicina yodada y terapia de reemplazo de células germinales. Sin embargo, solamente en un tipo de enfermedad amiloidea, la amiloidosis Mediterránea Doméstica, se ha demostrado que el tratamiento con fármacos (con colchicina) es efectivo. Se conoce el uso de anticuerpos monoclonales (mAbs) para inducir o modular la remoción inmunológica de una entidad de otra forma desconocida. Los mAbs se han utilizado exitosamente para tratar el linfoma que no es de Hodgkins y por ejemplo, el cáncer de mama, . Anteriormente, una diversidad de estudios han caracterizado los anticuerpos que se aglutinan a las proteínas amiloides o las fibrillas amiloides. Ver, por ejemplo, las Patentes de E. U. A. Nos. 5,714,471; 5,693,478; 5,688,651; 5,652,092; 5,593,846; 5,536,640; 5,385,915; 5,348,963; 5,270,165; 5,262,332; 5,262,303; 5,164,295; y 4,782,014. Además, diversas publicaciones sugieren que los anticuerpos anti-amiloideos pueden ser útiles para estudiar la progresión de la beta-amiloidosis y para diversas opciones terapéuticas. Ver, por ejemplo, ^ Bellottii et al . , Scand. J. Immunol .. (1992) 36(4): 607- 5 615; Bellotti et al . , Ren . Fail . (1193) 15(3): 365-371; Walker et al . , J. Neuropa thol . Exp . Neurol . (1994) 53(4): 377-383; y Bickel et al . , Bi oconj ug. Chem . (1994) 5(2): 119-125. Sin embargo, no se ha demostrado que algún anticuerpo terapéutico frene o invierta la deposición de ^^ 10 fibrillas amiloideas en un paciente. Por lo tanto, existe una necesidad para un método para tratar la amiloidosis al utilizar las formulaciones con anticuerpos que contengan anticuerpos que se aglutinan a las fibrillas amiloides . 15 Breve Descripción de la Invención f0 Los inventores actuales han descubierto nuevos métodos para tratar las enfermedades relacionadas al material amiloide y sus condiciones. Estos métodos 20 explotan el efecto opsonizante de los mAbs que se dirigen hacia los constituyentes proteicos del material amiloide.

La presente invención incluye un método para someter a tratamiento a un paciente que tiene una enfermedad asociada al depósito de material amiloide que comprende • el paso de administrarle al paciente una dosis 5 terapéuticamente efectiva de por lo menos un polipéptido de inmunoglobulina, o fragmentos de este, junto con un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el polipéptido de inmunoglobulina o el fragmento de este, puede ser sustancialmente un polipéptido de tt ^^ 10 inmunoglobulina purificado que se aglutina a una fibrilla amiloide humana, en donde la aglutinación del polipéptido opsoniza la fibrilla amiloide. En particular, la presente invención se relaciona al uso de cualquiera de, o una combinación de, tres 15 anticuerpos monoclonales que se discuten a- continuación.

Estos anticuerpos por lo general tienen propiedades anti- amiloides aglutinantes y proporcionan un reactivo opsonizante extrínseco que activa el mecanismo celular inmune de depuración propio del paciente. 20 Breve Descripción de las Figuras Figuras ÍA y IB. Las Figuras ÍA y IB son fotografías reproducidas de un ratón Balb/c justo después de una inyección de material amiloide (ÍA) y 14 dias después de 5 la inyección (IB) . el sitio de la inyección se rasura para ilustrar mejora la 'joroba" causada por la inyección del material amiloide. Figuras 2A-2B. Las Figuras 2A y 2B son fotografías reproducidas de neutrófilos humanos (núcleos tt ^^ 10 multilobulados) que se • adhieren a un material amiloide humano opsonizado in vi tro . Figuras 3A-3D . Las Figuras 3A-3D son fotografías reproducidas de muestras de tejido repleto de material amiloide e inmunohistoquimicamente teñidos (amplificación 15 20X) . La Figura 3A es una muestra de tejido en un paciente con amiloidosis l teñida con rojo Congo; los • depósitos de material amiloide, que se observan bajo luz polarizada, aparecen como partículas azul verdosas. La Figura 3B es una muestra de tejido teñida con fosfatasa 20 alcalina luego de marcarse con mAb anti-Kl (57-18-H12). La Figura 3C es una muestra de tejido teñida como en la Figura 3B, pero con mAb anti-icIV (11-1F4) . La Figura 3D es una muestra de tejida como en la Figura 3B, pero con mAb anti-?VIII (31-8c7) . Figura 4. La Figura 4 es una fotografía reproducida que muestra un ?4mAb fluoresceinado (FITC) aglutinado al material amiloide humano implantado en un ratón Balb/c. El mAb se inyecta en el muslo del ratón. -El amiloidoma se extirpa 72 horas después de la inyección y se observa utilizando un microscopio de epifluorescencia (ampliación 20X) .

Métodos para llevar a cabo la Invención Descripción General de la Invención La presente invención utiliza un polipéptido de inmunoglobulina para modular e intensificar la degradación y remoción de depósitos indeseados de fibrillas amiloides en un hospedero o paciente. Se visualiza que la invención se utilice, por ejemplo, para tratar humanos que sufren de una determinada condición caracterizada por una deposición indeseada de fibrillas amiloides. Sin pretender estar atado por ningún mecanismo particular de acción, se cree que la administración de péptidos e inmunoglobulina según la presente invención, opsonizan las fibrillas amiloides depositadas en un paciente que sufre de amiloidosis, y por lo tanto, asiste en su remoción del paciente por medio del sistema inmune # propio del paciente. Se cree que por si solo, el sistema 5 inmune del paciente es incapaz de remover las fibrillas amiloides en condiciones moduladas por las fibrillas amiloides sin una intervención terapéutica, presumiblemente debido a que las fibrillas amiloides en si, son relativamente no inmunogénicas. ^ 10 Para tratar a un paciente con amiloidosis, una dosis terapéuticamente efectiva del polipéptido de inmunoglobulina o fragmento de este según la presente invención se administra conjuntamente con un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Se cree que durante 15 la aglutinación o adhesión de estos polipéptidos de inmunoglobulina a los depósitos indeseados de fibrillas amiloides, los últimos se opsonizan. Las administraciones únicas o múltiples de las composiciones de la presente invención pueden llevarse a 20 cabo en dosis y mediante protocolos de administración conocidos por aquellos diestros en la técnica para la administración de otros productos terapéuticos de anticuerpos. Estos parámetros se pueden seleccionar y/u optimizar por el médico que trata al paciente en particular. De preferencia, una dosis terapéuticamente efectiva de una formulación farmacéutica de la invención debe de suministrarse en una cantidad suficiente del polipéptido de inmunoglobulina anti-amiloide para inhibir sustancialmente la deposición indeseada de fibrillas amiloides o para inhibir sustancialmente la velocidad de cualquier deposición indeseada de fibrillas amiloides. Más preferiblemente, las formulaciones deben reducir la carga general de las fibrillas amiloides depositadas en un paciente. Además, la administración de estas formulaciones debe comenzar poco después del diagnóstico de la amiloidosis y continuar hasta que los síntomas sean sustancialmente abatidos y durante un periodo después. En casos bien establecidos de enfermedad, se pueden requerir dosis de carga seguidas por dosis de mantenimiento.

Definiciones Los términos "péptido", "polipéptido" o 'proteina" se utilizan de forma intercambiable en la presente invención. El término 'identidad sustancial", cuando se refiere a los polipéptidos, indica que el polipéptido o proteina en cuestión es por lo menos un 30% idéntico a una proteina entera que ocurre naturalmente o a una porción de esta, usualmente por lo menos un 70% idéntica, y de preferencia por lo menos un 95% idéntica. Como se utiliza en la presente, los términos 'aislado", 'sustancialmente puro" y 'sustancialmente homogéneo" se utilizan de manera intercambiable y describen una proteina que se ha separado de sus componentes que generalmente la acompañan. Una proteina sustancialmente purificada típicamente comprende más de aproximadamente un 85% a 90% de una muestra de proteina pura, normalmente en más del 95% y preferiblemente en más del 99%. La pureza u homogeneidad de la proteina se puede indicar por una diversidad de formas que se conocen en la técnica, tal como electroforesis en gel de poliacrilamida y una muestra de proteina, seguido de una visualización de una sola banda de polipéptidos en un gel de poliacrilamida luego de teñirse. Para ciertos propósitos se necesita de una alta resolución y HPLC o un medio similar de purificación.

Las proteínas se pueden purificar hasta ser sustancialmente homogéneas mediante técnicas convencionales que se conocen bien en la técnica, que incluyen la precipitación selectiva con las sustancias que son el sulfato de amonio, cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación, y otros. Ver, por ejemplo, Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag: Nueva York (1982), que se incorpora en la presente para su referencia. Los métodos de purificación de anticuerpos se conocen bien en la técnica. Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1988), 288-318, que se incorporan aqui para su referencia, describe, por ejemplo, la purificación para utilizar la precipitación por sulfato de amonio, ácido caprilico, DEAE, cromatografía con hidroxiapatita, cromatografía mediante filtración en gel, perlillas globulares de proteina A, e inmunoafinidad. Los ácidos nucleicos, como se utilizan en la presente, pueden ser de ADN o ARN. Cuando se refiere a los ácidos nucleicos, el término "identidad sustancial" indica que las secuencias de dos ácidos nucleicos, o porciones designadas de estos, cuando se alinean y comparan de manera óptima, son idénticos, con las inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos, en • por lo menos aproximadamente un 80? de los nucleótidos, 5 normalmente en por lo menos aproximadamente un 90% hasta 95%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 98% al 99.5% de los nucleótidos. Alternativamente, existe una identidad sustancial de la secuencia de ácidos nucleicos cuando un segmento de tt "^ 10 ácidos nucleicos se hibrida bajo condiciones selectivas de hibridación, a un complemento de otra cadena de ácidos nucleicos . El término 'sustancialmente complementario" significa de manera similar, que un ácido nucleico se 15 hibrida selectivamente a, o es idéntico a, otro ácido nucleico. De manera tipica, la hibridación selectiva, ^ ocurre cuando hay aproximadamente por lo menos un 55% de identidad sobre un tramo de por lo menos 14-25 nucleótidos, de preferencia, por lo menos de 20 aproximadamente un 65% de identidad, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 75% de identidad, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente un 90% de identidad. Ver M. Kanehisa Nucleic Acid Res. 12: 203 (1984), que se incorpora en la presente para su referencia. Las condiciones rigurosas de hibridación típicamente 5 incluyen concentraciones salinas de menos de aproximadamente 1M, más usualmente menos de aproximadamente 500 mM y preferiblemente menos de aproximadamente 200mM. Típicamente las condiciones de temperatura son mayores a 22°C, típicamente mayores de tt ^^ 10 aproximadamente 30°C y de preferencia en exceso de aproximadamente 37°C. Ya que otros factores pueden afectar de manera dramática las condiciones rigurosas de hibridación, que incluyen la composición base de un tamaño de las cadenas complementarias, la presencia 'de 15 solventes orgánicos y la magnitud de la incompatibilidad de las bases y la condición del parámetro son más importantes que la cuantificación absoluta de cualquiera por sí sola. Los términos "aislados" o "parcialmente puros" 20 cuando se refiere a los ácidos nucleicos, se refiere a aquellos ácidos purificados fuera de otros componentes celulares o de otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas convencionales, que incluyen el tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCl, cromatografía en columna, y otras que se conocen bien en la técnica. Ver, F, Ausubel, et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1987), que se incorpora en la presente para su referencia. Un ácido nucleico se "liga de manera operable" cuando se coloca en una relación con funcionalidad con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o intensificador está ligado de manera operable a una secuencia codificadora, si afecta la transcripción de la secuencia. Generalmente, el estar ligado de manera operable, significa que las secuencias de ácidos nucleicos que están ligadas son continuas y, son necesarias para unir dos regiones codificadoras de proteínas, son contiguas y, dentro del marco de lectura. Las técnicas para la manipulación de los ácidos nucleicos, tales como la subclonación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos en vectores de expresión, sondas de marcado, hibridación de ADN, y así, generalmente se describen, por ejemplo, en Sambrook et al . , (1989) Molecular Cloninq: A Laboratory Manual (2a ed.), Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, o Ausubel et al . , ed. (1987) op. cit., ambos de los cuales se incorporan en la presente para su 5 referencia. Los 'vectores de expresión", "vectores de clonación", o 'vectores" comúnmente son plásmidos y otras moléculas de ácidos nucleicos que son capaces de replicarse en la célula hospedera de elección. Los tt ^ 10 vectores de expresión pueden replicarse autónomamente, o pueden replicarse al implantarse en un genoma de la célula hospedera, mediante métodos que se conocen bien en la técnica. Los vectores que se replican de forma autónoma tienen un origen de replicación o una secuencia 15 autónoma de replicación ('ARS") que es funcional en las células hospederas de elección. Comúnmente, es deseable para un vector, que se pueda usar en más de una célula hospedera, por ejemplo, en E . col i para clonar y estructurar una célula de mamífero para la expresión. 20 Las líneas de células de mamíferos normalmente se utilizan como células hospederas para la expresión de los polipéptidos derivados de eucariontes. La propagación de células de mamífero en cultivos es conocida per se. Ver, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, ed. (1973), que se incorpora en la presente para su referencia. La mayoría de las células hospederas también pueden incluir tales organismos como bacterias (por ejemplo, E. coli o B. subtilis) , levaduras, hongos filamentosos, células vegetales, o células de insectos, entre otras. La 'transformación" se refiere a la interrupción de vectores que contienen los ácidos nucleicos de interés directamente en células hospederas mediante métodos que se conocen bien. Los métodos de transformación, que varían dependen del tipo de célula hospedera, que incluyen la electroforación; transfección empleando el cloruro de calcio, fosfato de calcio de cloruro de rubidio, DE.AE-dextrán, y otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; infección (cuando el vector es un agente infeccioso); y otros métodos. Ver generalmente, Sambrook et al . , (1989) op. cit. La referencia a las células a las cuales se han introducido los ácidos nucleicos descritos con anterioridad también pueden influir en la dependencia de esas células.

Como se utiliza en la presente, un 'polipéptido de inmunoglobulina" se refiere a moléculas que se derivan de la inmunoglobulina natural (por ejemplo, anticuerpos) que tienen una actividad inmunorreactiva específica en contra de un objetivo en particular, por ejemplo, en contra de las fibrillas amiloides. Típicamente los anticuerpos son tetrámeros de polipéptidos de inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" también se refiere a una proteína que consiste en uno o más polipéptidos sustancialmente codificados mediante los genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina que incluyen aquellos que codifican para las cadenas ligeras, pueden ser de los tipos kappa o lambda, de aquellos que codifican para las cadenas pesadas. Los tipos de cadenas pesadas son alfa, gamma, delta, épsilon y mu. Las porciones carboxiterminales de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina son regiones constantes, mientras que las porciones aminoterminales codifican para la miríada de genes de regiones variables de la inmunoglobulina. Las regiones variables de una inmunoglobulina son las porciones que proporcionan la especificidad del reconocimiento antigénico. En particular, la especificidad reside en las regiones determinantes de complementariedad ('CDR"), también conocidas como regiones hipervariables de las inmunoglobulinas. Las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de formas de fragmentos que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab, F(ab''), F(ab')2, SvFv y otros fragmentos, así como homo cadenas (por ejemplo, Huston et al . , Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 85: 5879-5883 (1988) y Bird et al . , Science" 242: 423-426 (1988), que se incorporan aquí para su referencia) . (Ver, generalmente, Hood et al . , " Immunology" , Benjamín, N. Y. 2a ed. (1984), y Hunkapiller y Hood, Nature, 323: 15-16 (1986), que se incorporan aquí para su referencia) . También se pueden utilizar los anticuerpos de una sola cadena, en los cuales los genes para una cadena pesada y una cadena ligera se combinan en una sola secuencia codificadora. El polipéptido de inmunoglobulina también abarca una cadena truncada de inmunoglobulina, por ejemplo, una cadena que contiene menos dominios constantes de región que en el polipeptido natural. Estos polipéptidos truncados se pueden producir mediante métodos convencionales tales como al producir un codón finalizador en la secuencia génica en dirección 5' de las secuencias de dominio a ser suprimidas. Los polipéptidos truncados, luego se pueden ensamblar en anticuerpos truncados. Los anticuerpos, como se utilizan en la presente, también incluyen anticuerpos biespecíficos que se pueden producir tal como en los métodos descritos en las siguientes referencias: Glennie et .al : , J. Immunol., 139: 2367-2375 (1987); Segal et ai.,Biol?gic Therapy of Cáncer Therapy of Cáncer Updates 2(4): 1-12 (1992); y Shalaby et al . , J. Exp. Med, 175: 217-225 (1992). Los "anticuerpos monoclonales" se pueden obtener mediante diversas técnicas que son familiares para aquellos diestros en la técnica. En breve, 'se inmortalizan las células del bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, comúnmente mediante la fusión con una célula del mieloma (ver, Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)). Los métodos alternativos de in ortalización incluyen la transformación con los virus de Epstein Barr, oncogenes, o retrovirus, u otros métodos que se conocen bien de la técnica. A las colonias que se originan de células inmortalizadas individuales se les someten a un proceso de detección para la producción de anticuerpos de la especificidad deseada y afinidad para el antígeno, y el producto de los anticuerpos • monoclonados que se produce por estas células se puede 5 intensificar mediante diversas técnicas, que incluyen la inyección en la cavidad peritoneal de un hospedero vertebrado. Las inmunoglobulinas monoespecíficas y biespecíficas también se pueden producir mediante técnicas ^ (tt 10 recombinantes en células hospederas procarióticas y eucarióticas . Los anticuerpos "quiméricos" se codifican por los genes de inmunoglobulina que han sido manipulados genéticamente para que los genes de cadenas ligeras y 15 pesadas estén compuestos de segmentos de genes de inmunoglobulina que pertenecen a diferentes especies. Por • ejemplo, los segmentos variables (V) de los genes de un anticuerpo monoclonal de ratón pueden unirse a los segmentos constantes (C) de humano. 'Este anticuerpo 20 quimérico es probable que sea menos antigénico a un humano que los anticuerpos con regiones constantes de ratón así como a las regiones variables de ratón.

Como se utiliza en la presente, el término anticuerpo quimérico también se refiere a un anticuerpo que incluye una inmunoglobulina que tiene una estructura parecida a la de humano y en el cual cualquier región constante que está presente tiene por lo menos aproximadamente un 85%-90d y de preferencia aproximadamente 95% de identidad de secuencia de polipéptidos de una región constante de inmunoglobulina humana, con una inmunoglobulina denominada 'humanizada" (ver, por ejemplo, Publicación del' PCT WO 90/07861, que se incorpora en la presente para su referencia) . Por lo tanto, todas las partes de esta inmunoglobulina "humanizada", excepto posiblemente las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) , son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de una o más secuencias naturales de inmunoglobulina humana. Cuando es necesario, los residuos de la estructura también se pueden reemplazar con aquellos dentro o a través de especies, especialmente si se sabe que ciertos residuos de las estructuras afectan las estructuras de los CDR. Un anticuerpo quimérico también puede contener regiones constantes o variables truncadas.

El término 'región estructural" como_ se utiliza en la presente, se refiere a aquellas porciones de regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina que se conservan relativamente (es decir, que sean otras 5 que los CDR) entre diferentes inmunoglobulinas en una sola especie, como se define por Kabat et al . , (1987); Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 4a Ed., U. S. Dept. Health and Human Services, que se incorpora en la presente para su referencia. Como se indica en la tt ^^ 10 presente, una 'región estructural similar a la del humano" es una región estructural que en cada cadena existente comprende por lo menos aproximadamente 70 o más residuos de aminoácidos, típicamente de 75 a 85 o más residuos, idénticos a aquellos de una inmunoglobulina de 15 humano . La secuencia de ADN de las regiones constantes de ^ humano se pueden aislar en conformidad con los procedimientos que se conocen bien a partir de una diversidad de células humanas, pero de preferencia de 20 células-B inmortales. Las regiones variables o los CDR para producir las inmunoglobulinas quiméricas de la presente invención pueden derivarse similarmente de anticuerpos monoclonales capaces de aglutinarse a un material amiloide tipo humano, , y se producen en cualquier modelo conveniente de mamífero, que incluye a • los ratones, ratas, conejos, líneas celulares de humano, 5 o a otros vertebrados capaces de producir anticuerpos mediante métodos que se conocen bien. Las regiones variables o los CDR pueden producirse de manera sintética, mediante métodos convencionales de recombinación, que incluyen la reacción en cadena de la ^ 10 polimerasa ('PCR") o mediante bibliotecas para el despliegue de fagos. Para los métodos del despliegue de fagos, ver, por ejemplo, McCafferty et al . ,Nature 348: 552-554 (1990); Clackson et al . , Nature 352: 624-628 y Marks et al . , Biotechnology 11: 145-149 (1993). Se pueden 15 emplear los sistemas procarióticos adecuados tales como las bacterias, levaduras y fagos. Las células adecuadas de origen para las secuencias de ADN y las células hospederas para la expresión de la inmunoglobulina y su secreción se pueden obtener de una 20 diversidad de fuentes, tal como de la Colección Americana de Tipos de Cultivo ("Catálogo de Líneas Celulares e Hibridomas", 5a edición (1985) Rockville, Maryland, U.S.A., que se incorpora aquí para su referencia) . Además de las inmunoglobulinas quiméricas y 'humanizadas" que específicamente se describen en la 5 presente, otras inmunoglobulinas codificadas sustancialmente idénticas se pueden designar fácilmente y fabricarse al utilizar diversas técnicas de ADN recombinante que se conocen bien por aquellos diestros en la técnica.' En general, las modificaciones de los genes tt ^ 10 pueden lograrse fácilmente mediante una diversidad de técnicas que se conocen bien, tales como la PCR y la mutagénesis dirigida de secuencia (ver Gillman y Smith, Gene 8: 81-97 (1979) y S. Roberts et al . ,Nature 328: 731- 734 (1987), ambos de los cuales se incorporan en la 15 presente para su referencia) . Alternativamente, se pueden producir los fragmentos de polipéptido que poseen solamente una fracción de la estructura principal de la inmunoglobulina. Por ejemplo, puede ser deseable producir fragmentos de polipéptidos de 20 inmunoglobulina que poseen una o más actividades de la inmunoglobulina, además de, o diferente al, reconocimiento antigénico (por ejemplo, la fijación del complemento) . Los genes de inmunoglobulina, en su conjunto o en parte, también se pueden combinar con regiones funcionales de otros genes (por ejemplo, enzimas), o con otras moléculas tales como toxinas, porciones con especificidad hacia el objetivo y porciones marcadoras para producir proteínas de fusión (por ejemplo, 'inmunotoxinas") que tienen propiedades novedosas. En estos casos de fusión génica, se encuentran presentes dos componentes dentro de la misma cadena de polipéptidos. Alternativamente, la inmunoglobulina o el fragmento de esta, se puede enlazar químicamente a la toxina o al marcador mediante cualquiera de una diversidad 'de procedimientos químicos que se conocen bien. Por ejemplo, cuando el marcador o el agente citotóxico es una proteína y el segundo componente es una inmunoglobulina intacta, la unión puede ser por medio de ligadores heterobifuncionales entrecruzados, por ejemplo, el SPDP, carbodiimida, glutaraldehido, o lo que se parezca. Los marcadores adecuados incluyen, por ejemplo, los radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, partículas magnéticas. Ver, para los ejemplos de Patentes que muestran el uso de estos marcadores, los Nos. de las Patentes de E. U. A. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241, de los cuales todos se incorporan aquí para su referencia. Las inmunotoxinas, que incluyen moléculas monocatenarias, también se pueden producir mediante procesos recombinantes. La producción de diversas inmunotoxinas se conoce bien en la técnica, y los métodos se pueden encontrar, por ejemplo en "Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates: Aiming the Magic Bullet" , Thorpe et al . , Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine, Academic Press, pp. 168-190 (1982); E. Vitetta, Science (1987) 238: 1098-1104; y G. Winter y C. Milstein, Nature (1991) 349: 293-299; de los cuales todos se incorporan en la presente para su referencia. Las técnicas adicionales para preparar las inmunoglobulinas y los fragmentos de inmunoglobulina se describen en V.S. Malik et al . , Antibody Techniques (Academic Press, 1994); C.A.K. Borrebaek, Antibody Engineering: Breakthroughs in Molecular Biology (Oxford University Press, 1995); y P. J. Delves et al . , Antibody Production: Essential Techniques (John Wiley & Sons, 1997) , que se incorpora en la presente para su referencia . El término Opsonizar", como se utiliza en la presente, se refiere a la aglutinación de un polipéptido de inmunoglobulina en un objetivo especifico en particular, particularmente los epítopos que se encuentran en los depósitos de fibrillas amiloides, de manera tal, que el anticuerpo y los objetivos específicos, conjuntamente, se reconocen como 'extraños" por el sistema inmune celular del hospedero. En otras palabras, la aglutinación de la inmunoglobulina de la presente invención intensifica la fagocitosis de las fibrillas amiloides. Se entiende que el término 'amiloidosis" , como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier condición que se caracteriza por la presencia de material amiloide. Este material puede estar en forma de un amiloidoma o depósitos amiloides más dispersos o sus fibrillas.

Composiciones Farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas para el tratamiento terapéutico según la presente invención se pretenden para la administración parenteral, oral, o local. De preferencia, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente, o intramuscularmente . Ya que la barrera sanguínea del cerebro es impermeable a la IgG, (ver U. Bickel et al . , 1994 Bioconjug. Chem. 5: 119-25), el suministro de anticuerpos para superar la barrera sanquínea del cerebro (BBB) se puede lograr mediante un suministro liposómico o miscelar del anticuerpo en el sitio deseado.

Alternativamente, los agentes de esta invención se pueden administrar directamente en el fluido cerebroespinal (ver por ejemplo L. C. Walker et a l . , 1994 J. Neuropathol . Exp. Neurol. 53: 377-83). Para otros mecanismos de suministro, referirse a P.M. Friden, 1996 Patente de E. U. A. No. 5,527,527 y W. M. Pardridge, 1991 Patente de E. U. A. No. 5,004,697. Todos los documentos anteriores se incorporan en la presente para su referencia.

Por lo tanto, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden una solución del polipéptido anti-amiloide de inmunoglobulina • disuelto o suspendido en un portador farmacéuticamente 5 aceptable, de preferencia un portador acuoso. Una diversidad de portadores acuosos se pueden utilizar, por ejemplo, agua, agua amortiguada, solución salina al 0.4%, glicina al 0.3%, ácido hialurónico y lo que se parezca. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante ^ 10 técnicas convencionales de esterilización y que se conocen bien, o pueden esterilizarse mediante filtración. Las soluciones acuosas resultantes pueden empacarse para su uso como tal o liofilizarse, la preparación liofilizada se combina con una solución estéril antes de 15 su administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes para el ajuste del pH y agentes amortiguadores, agentes del ajuste de la 20 tonicidad, agentes humectantes y lo que se parezca, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. La concentración de polipéptidos de inmunoglobulina anti-amiloide de la invención en las formulaciones 5 farmacéuticas, puede variar ampliamente, es decir, desde menos del 1%, normalmente en 0, a menos de aproximadamente 10-15% hasta un 50^ o más por peso, y se selecciona principalmente por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., en conformidad con el particular modo tt 10 seleccionado de administración. Sin una experimentación indebida, alguien de destreza ordinaria en la técnica puede determinar la cantidad del polipéptido de inmunoglobulma que ha de ser efectivo para opsonizar adecuadamente un amiloidoma. Las 15 cantidades efectivas para este uso dependen de, por ejemplo, la naturaleza de la composición anti-amiloide del polipéptido de inmunoglobulma, la manera de administración, la etapa y severidad de la enfermedad a ser tratada, el peso y el estado general de salud del 20 paciente, y el juicio del médico que la prescribe. Por lo general puede utilizarse una sola dosis típica de 0.5 mg/kg. Debe tenerse en cuenta que el polipéptido de inmunoglobulina anti-amiloide y las composiciones de péptidos derivadas de éstas, se pueden emplear en estados / serios de la enfermedad, esto es, en situaciones que • amenazan la vida o que potencialmente amenazan la vida. 5 En estos casos, es posible y puede ser deseable por el médico que lleva el tratamiento, el administrar un exceso sustancial de estas composiciones. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales humanos anti-amiloideos o los anticuerpos monoclonales receptores anti-amiloideos 10 sustancialmente humanos de la invención, se prefieren aún más, bajo estas circunstancias. El tratamiento a humanos con amiloidoma, según la presente invención, también puede aplicarse en animales susceptibles a la amiloidosis, tales como en vacas- o 15 pollos. Por lo tanto, las referencias a pacientes humanos en la presente, también aplica a pacientes no humanos . Los polipéptidos de inmunoglobulina, como se definen en la presente, de preferencia son mAb anti-amiloides que 20 se dirigen a un amiloidoma o componentes o precursores de esta. Los mAb pueden dirigirse en contra de los dominios de la región variable de IgLC o, de preferencia, en contra de los subconjuntos ?l, ?4, ?8 del IgLC, o combinaciones de estos. La administración en humanos de los polipéptidos de inmunoglobulina que son sustancialmente no humanos pueden producir respuestas 5 anti-anticuerpos . Por lo tanto, puede ser deseable preparar los polipéptidos de inmunoglobulina anti-IgLC de la presente invención los cuales son sustancialmente humanos. Mediante el término 'sustancialmente humanos" se da a entender un anticuerpo o fragmento aglutinante de tt 10 este que comprende secuencias de aminoácidos que son por lo menos aproximadamente 50% de origen humano, por lo menos 70 a 80%, y aproximadamente 95 a 99% o más de humano que es lo que más se prefiere, particularmente para las administraciones repetidas durante un periodo 15 prolongado de tiempo como puede ser necesario para tratar los casos establecidos de amiloidosis. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano significa que incluye anticuerpos de origen completamente humano así como aquellos que son sustancialmente humanos, a menos que el 20 contexto indique de otra forma. Los anticuerpos monoclonales también pueden elevarse en contra de fibrillas amiloides sintéticas. La cadena ligera recombinante, y los péptidos de región variable se aislan y purifican in vi tro utilizando técnicas convencionales. Las fibrillas sintéticas luego se separan • de los péptidos utilizando técnicas como aquellas que se 5 describen por Wall et al., ' In vi tro Immunoglobulin Light Chain Fibrillogenesis" , METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 309 (en prensa) . Los anticuerpos luego se dirigen en contra de las fibrillas sintéticas al utilizar técnicas convencionales de inmunización, típicamente en ratones o # 10 conejos. Las líneas celulares monoclonales que segregan anticuerpos anti-fibrillas se producen al utilizar técnicas convencionales de hibridoma. Los polipéptidos de inmunoglobulina anti-amiloide de la invención se pueden preparar mediante una variedad de 15 técnicas que se conocen bien. Por ejemplo, se pueden preparar mediante la inmunización de un animal con material amiloide humano purificado o parcialmente purificado. Los animales inmunizados pueden ser de cualquiera de una variedad de especies que son capaces de 20 reconocer de manera inmunológica los epitopos característicos del dominio extracelular del material amiloide tipo humano, como el murino, lagomorfo, equino, etc. Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden preparar al inmortalizar las células que 5 comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos de inmunoglobulina o porciones de esta, que se aglutinan específicamente a las características antigénicas determinantes del dominio extracelular del material amiloide de tipo humano. El ^ 10 proceso de inmortalización se puede llevar a cabo mediante técnicas de fusión del hibridoma, mediante la transformación viral de los linfocitos conductores de anticuerpos, mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante técnicas que combinan la fusión celular, 15 transformación viral y/o métodos de ADN recombinante. Los inmunógenos para elevar los anticuerpos monoclonales • incluyen las fibrillas amiloides sintéticas como se describen, por ejemplo por, A. Lomakin et al . , 1997 Proc. Nat'l Acad. Sci, USA 94: 7942-7, que se incorpora aquí 20 para su referencia. Ya que la generación de anticuerpos monoclonales humanos anti-amiloides puede ser difícil mediante técnicas convencionales de inmortalización, es deseable primero hacer anticuerpos no humanos y luego transferir por medio de técnicas de ADN recombinante las regiones aglutinantes del antígeno de los anticuerpos no humanos, por ejemplo, el Fab, regiones determinantes de la complementariedad (CDR) o regiones hipervariables, en las regiones constantes de humano (Fc) o las regiones estructurales como sea apropiado, para producir moléculas sustancialmente humanas. Estos métodos, generalmente se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, la publicación de PCT de E. U. A. 4,816,397 WO 90/07861, y las publicaciones EP 173494 y 239400, en donde cada una se incorpora en la presente para su referencia. Sin embargo, los anticuerpos completamente humanos se pueden producir en animales transgénicos . Los genes de inmunoglobulina humana deseados o los segmentos génicos se pueden aislar, por ejemplo mediante PCR de células B de humano, el ADN se puede clonar en vectores apropiados para la expresión en células eucariontes y el ADN clonado se puede introducir en animales para producir animales transgénicos. Los animales adecuados para la producción de transgénicos que^ expresan para la inmunoglobulina humana incluyen ratones, ratas, conejos y cerdos con los roedores de transgénicos que expresan para las inmunoglobulinas humanas deben de preferencia tener uno o más de sus loci endógenos de inmunoglobulina inactivos o 'con sus características atenuadas" para facilitar la identificación y aislamiento de los anticuerpos humanos (ver por ejemplo, Lonberg, et al., Nature 368: 856-859 (1994) ) . Los anticuerpos quiméricos resultantes o los polipéptidos quiméricos de inmunoglobulina que se aglutinan al material amiloide humano están también dentro del alcance de la presente invención. Un típico anticuerpo terapéutico quimérico es una proteína híbrida que consiste de un dominio variable (V) o un dominio de aglutinación del antígeno de una inmunoglobulina de ratón específica para una determinante antigénica del material amiloide humano, y el dominio constante (C) o el efector de una inmunoglobulina humana, aunque los dominios de otras especies de mamíferos se pueden utilizar tanto para los dominios variables como para los constantes. Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo quimérico" también se refiere a los anticuerpos codificados por genes de inmunoglobulina en donde solamente los CDR se transfieren de la inmunoglobulina que reconoce específicamente las determinantes antigénicas, el resto del gen de la inmunoglobulina se deriva de un gen humano de inmunoglobulina (o de otro mamífero, según se desea) como se discute anteriormente, este tipo de anticuerpo quimérico se refiere como anticuerpo "humanizado" (en el caso de que se utilice un gen humano de inmunoglobulina) . También se consideran los anticuerpos recombinantes de humano que no contienen secuencias de otras especies. Las regiones hipervariables de los dominios variables de los polipéptidos de inmunoglobulina amiloide comprenden un aspecto relacionado de la invención. Las regiones hipervariables, o CDR, en unión con las regiones estructurales (aquellas porciones de regiones variables de cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina que están relativamente conservadas entre diferentes inmunoglobulinas en una sola especie) , permite que los polipéptidos de inmunoglobulina anti-amiloide reconozcan, y por lo tanto, se aglutinen al material amiloide humano. Las regiones hipervariables se pueden clonar y secuenciar. Una vez que se identifican, estas regiones que confieren un reconocimiento específico del material amiloide humano no pueden clonarse en un vector para la expresión en un hospedero como parte de otra molécula de inmunoglobulina o a manera de una proteína de fusión, por ejemplo, una molécula portadora con funciones para intensificar la inmunogenicidad del idiotipo clonado. Los polipéptidos de inmunoglobulina anti-amiloide de la presente invención, generalmente se utilizan intactos o como fragmentos inmunogénicos, tales como los fragmentos Fv, Fab, F(ab')2. Los fragmentos se pueden obtener de anticuerpos mediante técnicas convencionales, tal como por medio de la digestión proteolítica del anticuerpo a utilizarse, por ejemplo, pepsina, papaína u otras enzimas proteolíticas, o mediante técnicas de ADN recombinante en donde un gen o una porción de este, se codifica para el fragmento deseado y se clona o se sintetiza, y se expresa en una diversidad de hospederos. Aquellos diestros en la técnica se darán cuenta que los anticuerpos * anti-idiotipo" se pueden producir al utilizar una inmunoglobulina específica a manera de un inmunógeno en conformidad con las técnicas convencionales. Por ejemplo, la infección o inmunización con una fibrilla amiloide o un fragmento de esta, induce una inmunoglobulina neutralizante, la cual tiene en su sitio de combinación de la región variable de Fab, una imagen del material amiloide que es única para esa inmunoglobulina en particular, es decir, un idiotipo. La inmunización con esta inmunoglobulina anti-amiloide induce un anticuerpo anti-idiotipo, el cual tiene una conformación en su sitio de combinación que imita la estructura del antígeno amiloideo original. Estos anticuerpos anti-idiotipo, por lo tanto, se pueden utilizar en lugar del antígeno amiloide. Ver, por ejemplo, Nisonoff (1991) J. Immunol. 147: 2429-2438, que se incorpora en la presente para su referencia. Los siguientes ejemplos de trabajo señalan de manera específica las modalidades preferidas de la presente invención, y no deben de interpretarse como limitantes de ninguna forma del resto de la descripción. Otras configuraciones genéricas serán aparentes por aquellos diestros en la técnica.

Ejemplo 1 Determinación no Asistida de IgLC de Material Amiloide de Humano en un Hospedero Murino El IgLC del material amiloide de humano se extrae y purifica a partir de órganos infectados que se obtienen mediante una autopsia. Los primeros experimentos involucran el transplantar 50-200 mg de este material amiloide en un ratón Balb/c. La masa amiloide, o 'amiloidoma" se prepara en PBS estéril mediante un tratamiento por sonido en series, y pasos de titulación a fin de producir una suspensión fina de fibrillas completas de amiloide con las moléculas accesorias que se encuentran in vi vo . Este procedimiento se lleva a cabo para permitir que el material amiloide pueda inyectarse en el ratón mediante una aguja hipodérmica de calibre ancho . El material amiloide, equivalente al 10% del peso corporal del animal, se inyecta en ratones (bajo anestesia) entre la escápula, lo que resulta en una gran masa que es visible (ver Figura 1 A) . el ratón requiere de 15-18 días para lograr la remoción completa del amiloidoma (ver Figura IB) , luego de lo cual el animal parece sano y vive durante un periodo de vida normal. La remoción del amiloidoma se determinó subjetivamente • mediante el experimentador; simplemente al palpar el 5 sitio de inyección, un amiloidoma, tal como un chícharo duro, se puede sentir fácilmente bajo la piel.

Ejemplo 2 • 10 Implicación tanto de la Inmunidad Celular como de la Mediada por Anticuerpos, en la Remoción de los ..Amiloidomas La implicación de los anticuerpos anti-amiloides en la remoción de los amiloidomas se demuestra mediante un 15 proceso de detección del suero de un ratón que ha sido previamente inyectado con un material amiloide, en desafío de una muestra del material inyectado. Esto se hace mediante un análisis de transferencia Western al utilizar diluciones adecuadas del suero de ratón como el 20 anticuerpo principal. Se muestra que hay anticuerpos para cada componente de la matriz amiloide, es decir, cada banda en el gel se tiñe por el suero de ratón, incluso en una dilución de suero de 10,000 veces (datos no se muestran) . La implicación de un componente celular se muestra mediante las valoraciones de aglutinación de los 5 neutrófilos (ver Figuras 2 A y 2B) y al utilizar cepas de ratones mutantes con sus características atenuadas (datos no se muestran) . Las Figuras 2 A y 2B muestran a los neutrófilos humanos que se adhieren a un material amiloide humano luego de que el material amiloide se tt 10 somete a tratamiento con los mAb de ratón de IgLC antihumano. Esto muestra que el mAb de ratón puede aglutinarse al material amiloide humano sin atraer a los neutrófilos humanos. Los estudios de las cepas de ratones mutantes 15 desprovistos de sus características, además apoyan el hallazgo de una implicación de anticuerpos en la remoción del material amiloide. Primero, los ratones sci d/sci d, los cuales carecen de linfocitos B y T, son incapaces de remover un amiloidoma inyectado incluso luego de tres 20 meses (no se muestran datos) . Segundo, los animales desprovistos de CD18, son incapaces de remover el amiloidoma tan rápido como los animales normales. Los animales desprovistos de CD18 son un 97% deficientes en CD18, una integrina de superficie celular que se halla en las líneas de granulocitos/macrófagos . Aunque estas células no pueden dejar la circulación, los animales son competentes en sus células B y T y por lo tanto, pueden mostrar una respuesta de anticuerpos. Tercero, los ratones desnudos, los cuales no tienen leucocitos, son incapaces de remover el amiloidoma. Además, el material amiloide que había sido incubado con un suero reactivo en el material amiloide de otro ratón, cuando se implanta en el segundo ratón, se retira dentro de 4 días. En este experimento, un ratón Balb/c se inyecta con 50 mg de material amiloide HIG y se deja durante una semana, luego de lo cual se sangra mediante el corte de la vena cauda. La sangre se centrifuga a 1,500 rpm y las células se retiran mediante aspiración. El plasma se almacena a 4°C hasta que se utiliza. Otra preparación del material amiloide HIG (100 mg) se hace al suspenderse en PBS estéril, al cual se le agrega 1 ml del plasma del ratón previo. Luego esta preparación se inyecta en un segundo ratón (Balb/c) y el material amiloide se retira en 4 días. Por lo tanto, se concluye que el proceso puede acelerarse al opsonizar el material antes de la inyección.

• Ejemplo 3 5 Detección Mediante ELISA, de los Subconjuntos IgLC Se lleva a cabo un estudio sistemático al utilizar técnicas de ELISA para detectar un gran número de muestras de material amiloide extraídas de un humano al 10 utilizar mAb dirigidos contra los subconjuntos IgLC (?l, ?2, ?3, ?4, ?5, ?6, ?l, ?2, ?3, ?4 , K y ? libres y K y ? totales) . De manera interesante, se observa que la mayoría de las veces, los materiales amiloides dieron resultados positivos con los mAb específicos para su 15 propio subtipo, el total de los anticuerpos K o ? y un mAb ?l (57-18H12) , ?4(ll-lF4) y ?8(31-8C7). Se observa que los últimos tres reactivos reaccionan de una manera no especifica de subgrupo, es decir, ?l reacciona con los materiales amiloides que comprenden IgLC y que no sean 20 ?l; y los otros dos mAb exhiben la misma cualidad. Esto demuestra que el epítopo que es reconocido por estos anticuerpos puede ser una característica general de las fibrillas de amiloide, lo que indica la posibilidad de un epítopo compartido del material amiloide el cual puede dirigirse a un blanco de objetivo específico.

Ejemplo 4 Tinción Inmunoquímica Las muestras de tejido de pacientes con material amiloide se tiñen al utilizar técnicas inmunoquímicas convencionales y se observa un fenómeno similar de aglutinación. Las Figuras 3 A-3D muestran que el anti-?l que se aglutina al material amiloide ?l y de manera sorprendente, que el anti-?4 reacciona con el material amiloide ?l, lo que sugiere un epítopo de material amiloide el cual estos anticuerpos pueden reconocer. Además, el anti-?4 reacciona con el material amiloide que contiene ? (no se ilustra) . Este es un ejemplo de una reacción de isotipo cruzado. Sin embargo, los resultados de ELISA y la inmunoquímica no siempre son consistentes. Probablemente esto es debido a la diferencia inherente de lo que se está viendo, es decir, ELISA es una valoración de aglutinación en fase líquida que utiliza un material amiloide purificado y extraído, mientras que la inmunoquímica se lleva a cabo en secciones de tejido fijo en un portaobjetos. Las muestras de las células del hibridoma que 5 segregan anticuerpos monoclonales anti-?l ( 57-18-H12 (ATCC Acc. No.PTA-104) ) , anti-?4 (11-1F4(ATCC Acc. No.PTA-105)) y anti-?8 (31-8c7(ATCC Acc. No.PTQ-103)) se depositan en la Colección Americana de Tipos de Cultivo (ATCC) el 21 de mayo de 1999 en conformidad con el Tratado 'de • 10 Budapest.

Ejemplo 5 Estudios in vivo de los Subgrupos Anti-IgLC 15 0.1 mg de uno de los tres anticuerpos -- ?l , ?4 y ?8, que se identifican anteriormente, se inyecta en el muslo de un ratón en el cual se ha introducido un material amiloide en forma de un amiloidoma como se describe anteriormente. Los reactivos ?l y ?2 resultan en 20 la remoción completa por el hospedero de la mayoría de los tipos de fibrillas amiloides que se analizan dentro del período de 7 días (tan poco como un período de 4 días para ciertas fuentes de material amiloide) . La Figura 4 muestra un ?4 mAb con fluorescencia que se aglutina al amiloidoma humano. El reactivo ?d, que es reactivo en ciertos casos, tanto en los estudios in vi tro (anterior) , incrementa la determinación de los amiloidomas hasta en un 10% en los experimentos in vi vo .

Ejemplo 6 Estudios in vivo de los Subgru'pos Anti-IgLC El material amiloide humano se aisla a partir de en paciente con una inflamación asociada, al material amiloide, AA y se prepara para inyección en ratones Balb/C mediante un tratamiento por sonido repetido, y una trituración a fin de permitir su inyección en el ratón (ver Ejemplo 1) . Inmediatamente después de la 'inyección de 100 mg de un extracto humano de material amiloide -AA, los ratones se someten a tratamiento con 100 µg de mAb ?4, mAb anti-AA, sin mAb, y un mAb testigo no específico (anti-? libre) . La determinación completa del material se observa durante 48 horas en los animales que han sido sometidos a tratamiento con el ?4 y el mAb anti-AA. A diferencia de esto, los animales testigos tienen una gran masa de material amiloide que permanece en el sitio de la • inyección. 5 Ejemplo 7 Producción de mAb .Anti-Fibrilla Amiloide Específico Las fibrillas amiloides sintéticas se preparan in F 10 vitro y se utilizan como un inmunógeno en ratones para producir una primera generación de mAb anti-fibrillas amiloides. En breve, se producen cadenas ligeras-?6 recombinantes y péptidos de región variable, que se aislan y purifican al utilizar un sistema de expresión 15 bacteriano y técnicas convencionales de purificación de proteínas. Las fibrillas sintéticas se preparan a partir • de estos péptidos mediante periodos prolongados de agitación en una solución como se describe, por ejemplo, en Wall et al., ' In vi tro Immunglobulin Light Chain 20 Fibrillogenesis," METHODS IN ENZIMOLOGY, Vol. 309 (en prensa) , lo cual se incorpora aquí para su referencia en su totalidad. Las fibrillas se concentran mediante centrifugación a 17,000 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las fibrillas concentradas luego se utilizan para inmunizar ratones Balb/c durante un período de varias semanas. Las líneas de células monoclonales que segregan anticuerpos anti-fibrillas se producen al utilizar técnicas convencionales de hibridoma. Los anticuerpos resultantes tienen una actividad anti-fibrillas demostrable, basándose en las valoraciones de ELISA; descritas en el Ejemplo 3. Estos anticuerpos reaccionan con 99% de todos los extractos humanos de IgLC de material amiloide que se analizan hasta la fecha sin distinción de la naturaleza del isotipo o subgrupo de la proteína precursora cuando se analiza mediante ELISA. De manera similar, los anticuerpos reaccionan en un formato de ELISA con el material amiloide-AA aislado de un murino y fibrillas sintéticas compuestas de un péptido derivado de la proteína Aß[Aß (25-35)] de Alzheimer. Debe entenderse que la discusión y ejemplos anteriores meramente presentan una descripción detallada de ciertas modalidades preferidas. Por lo tanto debe ser aparente por aquellos de destreza ordinaria en la técnica que diversas modificaciones y equivalentes se pueden hacer sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las referencias, articulos y Patentes que se identifican anteriormente en su totalidad, se incorporan en la presente para su referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 5 1. El uso de : a) una dosis terapéuticamente efectiva de por lo menos un polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de este, • en donde el polipéptido de inmunoglobulina o el 10 fragmento de este, se aglutina a cualquier fibrilla amiloide; y b) un portador farmacéuticamente aceptable; para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de deposición de 15 material amiloide en un paciente humano.
2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de inmunoglobulina o el fragmento de este se dirige en contra de una cadena 20 ligera de inmunoglobulina.
3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la aglutinación del polipéptido de inmunoglobulina o del fragmento de este opsoniza la fibrilla amiloide.
4. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de inmunoglobulina o fragmento de esta, es un anticuerpo monoclonal.
5. El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.
6. El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico.
7. El uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado.
8. El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo marcado .
9. El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se selecciona a partir del grupo que consiste de ?l (57-18H12), ?4(ll-lF4) y ?8(31-8C7), y combinaciones de estos .
10. Un polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de esta, caracterizado porque se aglutina a una fibrilla amiloide y es efectiva para intensificar la respuesta inmune celular de un paciente para retirar los depósitos de fibrillas amiloides asociados a enfermedad.
11. El polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de esta, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de esta, es un anticuerpo monoclonal o un fragmento de esta.
12. La inmunoglobulina o el fragmento de esta, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo • humanizado .
13. El polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de esta, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico. • 10
14. El polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de esta, de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. 15
15. El polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de esta, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo marcado. 20
16. El polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de esta, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se selecciona a partir del grupo que consiste de ?l(57- 18H12), ?4(ll-lF4) y ?8(31-8C7), y combinaciones de • estos . 5
17. El anticuerpo monoclonal o fragmentos de esta, de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado . 10
18. El polipéptido de inmunoglobulina o un fragmento de esta, de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polipéptido de inmunoglobulina o fragmento de esta, se ha hecho para estar dirigirse 15 contra las fibrillas amiloides sintéticas.
19. Una composición farmacéutica que comprende el péptido de inmunoglobulina o el fragmento de esta, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-17. 20
20. Una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido, caracterizado porque comprende por lo menos una región hipervariable del polipéptido de inmunoglobulina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-17. • 5
21. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con la o reivindicación 20.
22. Un método para producir un polipéptido de 10 inmunoglobulina, caracterizado porque comprende el paso de cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 21. 15 20