MXPA00002101A - Metodos y composiciones para terapias que utilizan genes que codifican proteinas secretadas como beta-interferon - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos y composiciones farmacéuticas para modificar las células de un receptor mamífero con ADN que codifica una proteína secretada, tal como el interferón humano in situ. Los métodos incluyen la formación de un sistema de expresión de la proteína secretada, in vivo o ex vivo, y la administración del sistema de expresión al receptor mamífero. Los métodos y el sistema de expresión sonútiles para el suministro sistémico y localizado de interferones in situ.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA TERAPIAS QUE UTILIZAN GENES QUE CODIFICAN PROTEÍNAS SECRETADAS COMO BETA- INTERFERÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con terapia génica. Más específicamente, la presente invención se relaciona con el suministro de ADN que codifica proteínas secretadas como las proteínas interferón en humanos y animales .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los interferones (también denominados "IFN" o " IFNs " ) son proteínas que tienen diversidad de actividades biológicas, algunas de las cuales son antivirales, inmunomoduladoras y antiproliferativas . Son polipéptidos de cadena simple, especie-específicos, relativamente pequeños producidos por células de mamíferos como respuesta a la exposición a una variedad de inductores como virus, polipéptidos, mitógenos y lo semejante. Los interferones protegen los tejidos y células animales contra el ataque viral y son un importante mecanismo de defensa del hospedero. En la mayoría de los casos, los interferones proporcionan mejor protección a los tejidos y células del tipo de los cuales ellos han sido producidos que a otros tipos de tejidos y células, lo que indica que el interferón P986 derivado de humano podría ser más eficaz para tratar enfermedades humanas que los interferones provenientes de otras especies. Existen varios tipos distintos de interferones humanos, clasificados en general como leucocito (interferón-alfa [a] ) , fibroblasto (interferón-beta [ß] ) e inmune (interferón-gamma [?] ) y un gran número de variantes de los mismos. Estudios generales de interferones se pueden encontrar en varios textos y monografías entre las que se incluyen: The Interferon System (W.E. Stewart, II, Springer-Verlag, N.Y. 1979); e Interferon Therapy (World Health Organization Technical Reports Series 676, World Health Organization, Geneva 1982), las cuales se consideran forman parte de la presente, como referencia. Los interferones tienen potencial en el tratamiento de un gran número de cánceres humanos ya que estas moléculas tienen actividad anti-cáncer que actúa en varios niveles. En primer lugar, las proteínas interferón pueden inhibir directamente la proliferación de células tumorales humanas. La actividad antiproliferativa es también sinergística con una diversidad de agentes quimioterapéuticos como cisplatino, 5FU y taxol. En segundo lugar, la actividad inmunomoduladora de las proteínas interferón puede conducir a la inducción de una respuesta inmunitaria anti-tu oral. Esta respuesta incluye activación de P986 células NK, estimulación de actividad macrofágica e inducción de expresión superficial del MHC (por las siglas en inglés de - major histocompatibility complex - complejo principal de histocompatibilidad) clase I que conduce a la inducción de actividad de linfocito T citotóxico antitumoral. Por otra parte, otros estudios indican además que la proteína IFN-ß podría tener actividad antiangiogénica. La angiogénesis, formación de nuevos vasos sanguíneos, es crítica para el crecimiento de tumores sólidos. Las evidencias indican que el IFN-ß podría inhibir la angiogénesis al inhibir la expresión de factores pro angiogénicos como bFGF y VEGF. Por último, las proteínas interferón podrían inhibir la actividad invasiva tumoral afectando la expresión de enzimas como colagenasa y elasatasa que son importantes en la remodelación tisular. También parece que los interferones tienen actividades antivirales que se basan en dos diferentes mecanismos. Por ejemplo, las proteínas interferón tipo I (a y ß) pueden inhibir directamente la replicación del virus de hepatitis B humana ("HBV") y el virus de hepatitis C ("HCV"), pero también pueden estimular una respuesta inmunitaria que ataca células infectadas con estos virus. Específicamente y a pesar de su valor terapéutico potencial, las proteínas interferón sólo han tenido un éxito clínico limitado contra la P986 hepatitis viral y los tumores sólidos. El IFN- ha sido aprobado para el tratamiento tanto de HBV como de HCV; sin embargo, la velocidad de respuesta en ambos casos es sólo de aproximadamente 20%. Mientras que las proteínas interferón han sido aprobadas para el tratamiento de algunos tipos de cáncer como linfornas, leucemias, melanoma y carcinoma celular renal, la mayoría de las pruebas clínicas en las que los interferones se usan solos o en combinación con agentes quimioterapéuticos convencionales para el tratamiento de tumores sólidos, no han tenido éxito. El método para administrar interferón es un factor importante en la aplicación clínica de este importante agente terapéutico. La administración sistémica de proteína interferón ya sea por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea ha sido la más frecuentemente utilizada con cierto éxito en el tratamiento de trastornos como leucemia de célula vellosa, Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) y el sarcoma de Kaposi relacionado. Se sabe, sin embargo, que las proteínas en forma purificada son especialmente susceptibles a la degradación. En particular, para interferón-beta, el (los) mecanismo (s) primario (s) de la degradación del interferón en solución son la agregación y la deamidación. Por lo tanto, la falta de estabilidad del interferón en soluciones y otros productos, ha limitado su utilidad.

P986 Además, después de la administración parenteral de la proteína interferón (intramuscular, subcutánea o intravenosa) la velocidad de depuración de la proteína interferón es muy rápida. Por lo tanto, la administración parenteral de la proteína podría no permitir la ubicación de suficiente interferón en el sitio activo (el tumor sólido o en el caso de la hepatitis, el hígado) . La cantidad de interferón que se puede administrar por vía parenteral a pacientes está limitada por los efectos secundarios observados a dosis altas de interferón. Claramente se necesita una terapia más eficaz .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta solicitud está dirigida a eliminar los problemas asociados con el suministro de una proteína secretada tipo proteína interferón como un agente terapéutico. La presente invención está dirigida a un método de terapia de interferón en la que se suministra más bien el gen que codifica la proteína secretada, que la proteína en sí . Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un método de terapia génica basado en el uso de células modificadas genéticamente y el uso de las misma para suministrar una proteína secretada como el interferón a un receptor mamífero. La presente invención satisface estos y otros objetos al proporcionar métodos para formar un sistema de expresión celular, el sistema de expresión producido por los mismos y las composiciones farmacéuticas que lo contienen. El sistema de expresión celular expresa un gen que codifica una o más proteínas secretadas y es útil como un vehículo para suministrar el producto génico a un receptor mamífero, in situ. En una modalidad preferida, el receptor mamífero es un humano. En una modalidad de la invención, se describe un sistema de expresión celular para expresar en una célula de un receptor mamífero in vivo, una proteína interferón que trata una condición. El sistema de expresión comprende una célula de la misma especie que el receptor mamífero y un vector de expresión contenido en la misma para expresar la proteína interferón. De preferencia, el receptor mamífero es un humano y el vector de expresión comprende un vector viral. En otra modalidad, el sistema de expresión comprende una pluralidad de células de la misma especie que el receptor mamífero y un vector de expresión contenido en las mismas para expresar la proteína secretada. El vector de expresión está contenido solamente dentro de una porción de la pluralidad de células. De preferencia, por lo menos 0.3% por número de células contienen el vector. La proteína secretada preferida es un interferón y los interferones más preferidos son interferón alfa, beta, gamma y consenso, siendo el beta interferón el más preferido. En otras modalidades, el sistema de expresión celular comprende una pluralidad de células cancerosas y por lo menos una porción de las células cancerosas contienen un vector adenoviral que tiene un polinucleótido aislado, que codifica en la expresión, un interferón. En este sistema de expresión celular, los vectores adenovirales se seleccionan del grupo que consiste de: (a) un vector adenoviral que tiene una eliminación y/o mutación en su gen El; (b) un vector adenoviral que tiene una eliminación y/o mutación en su gen E2a, el vector expresa interferón-beta humano; (c) un vector adenoviral que tiene una eliminación y/o mutación tanto en su gen El como en su gen E4; y (d) un vector adenoviral que tiene una eliminación de todos sus genes; el vector de expresión expresa interferón-beta humano. También está comprendida dentro de la invención, una composición farmacéutica para suministrar una proteína secretada a un sitio de un receptor mamífero. La composición comprende un vehículo y una pluralidad de células modificadas genéticamente de la misma especie que el receptor mamífero y por lo menos una porción de células contienen un vector de expresión para expresar una cantidad eficaz de la proteína secretada. La proteína secretada preferida es un interferón. La composición abarca composiciones tanto para suministro in vivo como ex vivo. Un método para elaborar una preparación farmacéutica de terapia génica ex vivo para un receptor mamífero es otra modalidad. El método incluye los pasos de: (a) formar una pluralidad de células de la misma especie que el receptor mamífero, (b) introducir un vector de expresión para expresar una proteína secretada en por lo menos una célula de la pluralidad para formar por lo menos una célula modificada genéticamente y (c) poner la por lo menos una célula modificada genéticamente en un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener una preparación farmacéutica que es adecuada para administración en un sitio del receptor mamífero. Otra modalidad de la invención es un método para terapia génica, que comprende modificar genéticamente por lo menos una célula de un receptor mamífero mediante los pasos de (a) introducir un vector de expresión para expresar un proteína secretada en por lo menos una célula para formar por lo menos una célula modificada genéticamente y (b) permitir que la célula modificada genéticamente entre en contacto con un sitio del receptor • mamífero. Este método podrá comprender además el paso de extraer del receptor mamífero por lo menos una célula antes del paso de introducir el vector de expresión. Todavía en otra modalidad, el paso de introducir el vector comprende introducir un vector a sólo una porción de la pluralidad de células. Un método de terapia génica ex vivo está abarcado en la invención e incluye los pasos de extraer de un sujeto una pluralidad de células; administrar un adenovirus recombinante a por lo menos una célula de la pluralidad de células, de manera que exista un exceso de células que no contienen el adenovirus. El adenovirus puede tener una eliminación en su gen El e incluye un polinucleótido aislado que codifica una proteína secretada. La pluralidad de células se vuelve a introducir en el sujeto. En un método de terapia génica in vivo, los pasos incluyen administrar un vector adenoviral que incluye un polinucleótido aislado que codifica para proteína beta (ß) -interferón humana, directamente en una célula de un sujeto sin que en primer lugar se extraiga la célula del sujeto. Los métodos in vivo y ex vivo permiten la administración tópica, intraocular, intranasal, intratraqueal, intrabronquial, intramuscular, subcutánea intravenosa, intramuscular e intraperitoneal . La presente invención tiene varias ventajas. La terapia génica de interferón podría permitir altas concentraciones locales de interferón con niveles sistémicos bajos. Esto podría tener como resultado mayor eficacia con efectos secundarios menores. También, los interferones suministrados mediante terapia génica estarían presentes a un nivel muy constante, a diferencia de la situación observada en la terapia de proteína interferón en la que los "incrementos" o picos muy elevados en concentración de proteína interferón (que podrían conducir a toxicidad) que se presentan después de la inyección de la proteína, son seguidos por niveles muy bajos en los que es probable que la concentración de interferón sea demasiado baja para ser eficaz. La conveniencia del paciente es también un factor crítico. Mientras que las inyecciones frecuentes de proteína interferón son necesarias, una sola administración o pocas administraciones no frecuentes, de un vector que exprese el gen interferón podrían proporcionar producción estable a largo plazo de la proteína. La terapia génica podría permitir el suministro de interferones de una manera controlada a un distinto órgano o tumor blanco u objetivo. Se puede establecer un sistema autócrino en el que la misma célula exprese, secrete y capte el interferón. De esta manera, se pueden lograr dosis locales muy elevadas. Estas dosis elevadas no pueden lograrse mediante la administración parenteral de proteína debido a problemas de toxicidad. Puesto que las proteínas interferón se secretan fuera de las células, toda célula en un tumor o en el hígado infectado por hepatitis no necesitan ser transducidas por el gen interferón. Aquellas células que no capten el gen serán afectadas por las células vecinas (el denominado "efecto circunstante") que tienen el gen y secretan la proteína interferón. Este es un hallazgo significativo y es probable que tenga efectos dramáticos en regímenes de tratamiento ya que no todas las células en una masa tumoral o en un órgano necesitan contener un vector de expresión. Por último, la administración parenteral de interferón ha mostrado que conduce a la generación de anticuerpos. Podría ser que esta respuesta de anticuerpos potencialmente neutralizadores pueda disminuirse después de la introducción del gen interferón en una región local distinta. Además de la expresión local, el interferón expresado será producido por las células humanas endógenas y por lo tanto, será más natural en su estructura y glucosilación y posiblemente, menos inmunogénico que la proteína interferón producida en bacterias, levaduras o células ováricas de hámster Chino y después purificadas e inyectadas por vía parenteral. Estos y otros aspectos de la invención así como diversas ventajas y utilidades serán más evidentes haciendo referencia a la descripción detallada de las modalidades preferidas y los dibujos adjuntos.

P986 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS O FIGURAS Figura 1. (A) Ya sea células sin infectar MDA-MB-468 (-o-) o infectadas con células H5 llOhlFNß a 0.01% (-?-), 0.03% (-•-), 0.1% (-V-) 0.3% (--D se inyectaron subcutáneamente en los i ares de un ratón descubierto y se gráfico la media del tamaño del tumor contra el tiempo posterior a la implantación de la célula tumoral (B) la gráfica Kaplan-Meir muestra el porcentaje de supervivencia de ratones durante el período de observación de 109 días. Células sin infectar (-o-); células infectadas H5.100hIFNß a 0.01% (-?-), 0.03% (-.-) , 0.1% (-V-) 0.3% (--) . p Figura 2. (A) Terapia génica ex vivo con beta interferón en: (1) células KM12L4A; (2) células Huh7 ; y (3) células ME180. La media del tamaño del tumor se gráfico contra el tiempo posterior a la implantación de la célula tumoral. A ratones se les implantaron células sin infectar (-•-) o células H5.110 IFNß infectadas a 1% (-•-) o 10% (-A-) . En aquellos grupos en los que se sacrificaron algunos ratones, el tamaño del tumor se presenta como el promedio con el último valor trasladado para los animales sacrificados. La interrupción de las gráficas reflejan la muerte o sacrificio de todos los animales en un grupo. (B) Porcentaje de supervivencia de ratones durante el período de observación de 70 días. Los paneles 1, 2 y 3 muestran los datos generados con ratones implantados P986 con células KM12L4A, células Huh7 y células ME180 respectivamente. Los símbolos representan ratones que fueron implantados con células sin infectar (--!-), células H5.110 IFNß infectadas a 1% (-•-) o 10% (-A-). Figura 3. Tratamiento directo in vivo de tumores MDA-MB-468. Los tumores se inyectaron con H5.110-?IFNß a 3 x 109 pfu i -®- ) , 1 x 109 pfu (-S-), 3 x 108 pfu (-o-), 1 x 108 pfu (-?-) y 3 x 107 pfu (-V-) respectivamente o con PBS (por las siglas en inglés de Phosphate Buffered Saline, solución salina amortiguada de fosfato) (--El-) o con H5.1102acZ a 3 x 109 pfu (-0-),l x 109 pfu (-A-),3 x 108 pfu (-X-) y 1 x 108 pfu (-p —) respectivamente. El tamaño de los tumores se midió durante un período de 14 días posteriores al tratamiento con la inyección. DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención se basa, en parte, en el desarrollo de un método de terapia génica ex vivo que usa una célula que (1) puede ser fácilmente extraída del paciente, (2) se puede modificar in vitro por introducción de material genético; (3) se puede implantar en forma conveniente en el receptor; (4) es no trombogénica; y (5) se puede implantar en el receptor en gran número. El método expuesto de terapia génica in vivo utiliza una célula que (1) está presente en el receptor y (2) se puede modificar in situ para expresar material genético aislado. La célula modificada genéticamente incluye elementos reguladores P986 para controlar la cantidad de material genético expresado . Las células modificadas genéticamente sobrevivirán y continuarán para producir el material expresado in situ por un período de tiempo necesario para que el material expresado tenga un efecto beneficioso (por ejemplo, terapéutico) , sin interferir con la función normal del tejido en el que se localizan las células . De preferencia, el material expresado es una proteína secretada (que se define abajo) . Con preferencia superlativa, la proteína secretada es un interferón. En efecto, aunque los interferones son los agentes terapéuticos que más se prefieren, se ha encontrado un principio general aplicado a la terapia génica con cualquier proteína secretada. Hemos encontrado que, debido al hecho de que las proteínas secretadas como los interferones son liberadas a partir de las células en las que se han expresado, toda célula en una masa tumoral o por ejemplo, en un hígado infectado con hepatitis no necesita ser transducida por el gen de "proteína secretada" . Aquellas células que no captan el gen serán afectadas por las células vecinas que tienen el gen y la proteína secretada (es decir, el denominado "efecto circunstante"). Aunque la terapia génica está descrita con polinucleótidos que codifican, en la expresión, para interferones, cualquier proteína P986 secretada (según se define abajo) tiene potencial en el método y composiciones de la presente. Todas las citas enunciadas en este documento las cuales se consideran forman parte de la presente, como referencia.

I . Definiciones : "Terapia génica" - un procedimiento en el que un fenotipo de enfermedad se corrige a través de la introducción de información genética en el organismo afectado . "terapia génica ex vivo" - un procedimiento en el cual se extraen células de un sujeto y se cultivan in vitro. Un polinucleótido como un gen funcional se introduce en las células in vitro, las células modificadas se expanden en el cultivo y después se reimplantan en el sujeto. "terapia génica in vivo" - un procedimiento en el que las células blanco u objetivo no se extraen del sujeto. Más bien, el polinucleótido transferido (por ejemplo, un gen que codifica, en la expresión, para un interferón) se introduce en las células del organismo receptor in situ, es decir, dentro del receptor. La terapia génica in vivo se ha investigado en varios modelos animales y publicaciones recientes han reportado la viabilidad de transferencia genética directa in situ a órganos y tejidos.

P986 "condición sensible a la terapia génica" abarca condiciones como enfermedades genéticas (es decir, una condición que es atribuible a uno o más defectos genéticos) , patologías adquiridas (es decir, condición patológica que no es atribuible a un defecto congénito) , cánceres y procesos profilácticos (es decir, prevención de una enfermedad o una condición médica indeseable) . "patología adquirida" - se refiere a una enfermedad o síndrome manifestado por un estado fisiológico, bioquímico, celular, estructural o biológico molecular anormal. "polinucleótido" - un polímero de unidades monoméricas de ácido nucleico, las unidades monoméricas son o bien ácidos ribonucleicos (ARN) , ácidos desoxiribonucleicos (AD?) o combinaciones de ambos. Las cuatro bases del AD? son adenina (A) , guanina (G) , citosina (C) y timina (T) , Las cuatro bases del AR? son A, G, C y uracilo (U) . "aislado" - cuando se aplica a secuencias de polinucleótidos de genes que codifican un interferón, se refiere a un polinucleótido AR? o AD?, porción de polinucleótido genómico, AD?c o polinucleótido sintético en los que, en virtud de su origen o manipulación: (i) no está asociado con todo el polinucleótido con el que se encuentra asociado en la naturaleza (por ejemplo, está presente en células P986 hospederas como una porción de un vector de expresión) ; o (ii) está enlazado a un ácido nucleico u otra fracción química distinta de aquella con la que se encuentra enlazado en la naturaleza; o (iii) no se presenta en la naturaleza. Con "aislado" se quiere decir además que una secuencia de polinucleótido: (i) se amplifica in vi tro, por ejemplo mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) ; (ii) se sintetiza químicamente; (iii) se produce de manera recombinante por clonación; o (iv) se purifica, por ejemplo, mediante desdoblamiento y separación en gel. De esta manera, un polinucleótido interferón "aislado" incluye, por ejemplo, un ácido nucleico que no se encuentra en forma natural que puede ser transcrito en ARN antisentido, así como un gen que codifica una proteína interferón que no está expresada o que se expresa a niveles biológicamente insignificantes en una célula que se encuentra en forma natural. Para ilustrar, un gen sintético o natural que codifica beta-interferón humano la se consideraría "aislado" con respecto a células cerebrales humanas ya que estas últimas no expresan naturalmente beta-interferón la. Aún otro ejemplo de un "polinucleótido aislado" es la introducción de sólo una parte de un gen interferón para crear un gen recombinante, por ejemplo, combinando un promotor inducible con un interferón endógeno codificador de secuencia a través de P986 recombinación homologa. "gen" - una secuencia de ADN (es decir un arreglo lineal de nucleótidos unidos entre sí por enlaces 3 ' -5 ' -pentosa fosfodiéster) que codifica a través de su ARNm una secuencia de aminoácidos de una proteína específica. "transcripción" - el proceso para producir ARNm a partir de un gen. "traducción" - el proceso para producir una proteína a partir de ARNm . "expresión" - el proceso experimentado por una secuencia de AD? o un gen para producir una proteína, combinando transcripción y traducción. "inhibir crecimiento" - en el sentido en el que se utiliza en la presente este término se refiere tanto a la inhibición del crecimiento de una célula blanco o objetivo (por ejemplo, tumor) como a la inhibición del fenotipo transformado (según se determina, por ejemplo, mediante cambios en morfología) . "aminoácido" - una unidad monomérica de un péptido, polipéptido o proteína. Existen veinte isómeros L- de aminoácidos. El término también incluye análogos de aminoácidos e isómeros D- de aminoácidos de proteína y sus análogos. "proteína" - cualquier polímero que consista básicamente de cualquiera de los 20 aminoácidos P986 proteicos, sin importar su tamaño. Aunque "polipéptido" con frecuencia se utiliza con referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" con frecuencia se utiliza para polipéptidos pequeños, en el campo técnico el uso de estos términos se traslapa y es variado. El término "proteína" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, a menos que se indique de otro modo. "proteína secretada" - una proteína que es transportada desde el interior de una célula al exterior de la misma; entre las proteínas secretadas existe un gran número de factores de crecimiento y proteínas inmunomoduladoras como los diversos interferón (0C,ß,?), interleucinas como IL-1, -2, -4, -8 y -12 y factores de crecimiento como GM-CSF, G-CSF. "fusión genética" - se refiere a un enlace covalente, co-lineal de dos o más proteínas mediante sus cadenas peptídicas individuales, a través de la expresión genética de una molécula de polinucleótido que codifica esas proteínas. "mutante" - cualquier cambio en la calidad o estructura del material genético de un organismo, en particular cualquier cambio (por ejemplo, eliminación, substitución, adición o modificación) en un gen interferón tipo nativo o cualquier cambio en una proteína interferón tipo nativo. "tipo nativo" - el polinucleótido o secuencia P986 de aminoácidos que se encuentra en forma natural en un gen interferón o proteína interferón, respectivamente, tal como existe in vivo. "condiciones de hibridación estándar" condiciones salinas y de temperatura substancialmente equivalentes a 0.5 X SSC hasta aproximadamente 5 X SSC y 65 grados C tanto para hibridación como para lavado. El término "condiciones de hibridación estándar" en el sentido en el que se utiliza en la presente, es por lo tanto una definición operativa y abarca una gamma de hibridaciones. Las condiciones de severidad mayores, podrían por ejemplo, incluir hibridizar con amortiguador tamiz en placa (polivinilpirrolidona 0.2%, Ficoll 400 0.2%; albúmina sérica bovina 0.2%; Tris-HCl 50 mM (pH 7.5); NaCl ÍM; pirofosfato de sodio 0.1%; SDS 1%); sufato de dextrano 10% y 100 ug/ml de ADN de esperma de salmón sonicada, desnaturalizada a 65 grados C por 12-20 horas y lavar con NaCl 75 mM/citrato de sodio 7.5 mM (0.5 x SSC) /SDS 1% a 65 grados C. Las condiciones de severidad menor podrían, por ejemplo, incluir hibridizar con amortiguador tamiz en placa, sulfato de dextrana 10% y 110 ug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado, desnaturalizado a 55 grados C por 12-20 horas y lavar con NaCl 300 mM/citrato de sodio 30mM (2.0 X SSC) /1% SDS a 55 grados C. "secuencia de control de expresión" - una secuencia de nucleótidos que controla y regula la P986 expresión de genes cuando se enlaza operativamente a esos genes . "operativamente enlazado" - una secuencia de polinucleótidos (ADN, ARN) se enlaza operativamente a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótido. El término "operativamente enlazado" implica que tiene una señal apropiada de inicio (por ejemplo, ATG) delante de la secuencia que se va a expresar y mantiene el marco de lectura correcto que permite la expresión de la secuencia de polinucleótido bajo el control de la secuencia de control de expresión y la producción del interferón deseado codificado por la secuencia del polinucleótido aislado. "vector de expresión" - un polinucleótido, más comúnmente un plásmido de AD? (pero que también incluye un virus) que permite la expresión de por lo menos un gen cuando el vector de expresión se introduce en una célula hospedero. El vector podrá tener o no la capacidad para replicarse en una célula. "tumor" - cualquier proliferación indeseable de células. Dicho crecimiento incluye tumores malignos o no malignos, sólidos o fluidos, carcinomas, mielomas, sarcomas, leucemias, linfornas y otras enfermedades cancerosas, neoplásicas o tumorigénicas. "célula genéticamente modificada" (también P986 denominada un "sistema de expresión celular") comprende una célula y un vector de expresión para expresar la proteína interferón. Para propósitos ex vivo, las células genéticamente modificadas son adecuadas para la administración a un receptor mamífero en el que ellas reemplazan o coexisten con las células endógenas del receptor. La presente invención también proporciona varios métodos para hacer y utilizar las células genéticamente modificadas descritas arriba. En particular, la invención proporciona un método para modificar genéticamente célula (s) de un receptor mamífero ex vivo y administrar las células genéticamente modificadas a un receptor mamífero. En una modalidad preferida para terapia génica ex vivo, las células son autólogas, es decir, células extraídas del receptor mamífero. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "extraídas" se refiere a una célula o una pluralidad de células que han sido extraídas de su ubicación in vivo en donde se encuentran en forma natural . Los métodos para extraer células de un paciente, así como los métodos para conservar las células aisladas en cultivos son conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en el campo técnico (Stylianou, E. et al., Kidnev Intl . 37:1563-1570 (1992); Hjelle, J.H., et al., Peritoneal Dialvsis Intl. 9:341-347 (1989); Heldin, P. Biochem. J.

P986 283:165-170 (1992); Di Paolo, N. , et al., Int. J. Art. Orq. 12:485-501 (1989); Di Paolo, N. et . al., Clinical Nephrol . 34:179-1848 (1990); Di Paolo, N. , et al., Nephron 57:323-331 (1991)). Todas las patentes, solicitudes y publicaciones mencionadas aquí en la Descripción Detallada de la Invención, tanto las anteriores como las siguientes, se consideran forman parte de la presente, como referencia.

II. Polinucleótidos Interfieren, Aislados Un "interferón" (también referido como "IFN") es un polipéptido de cadena simple, especie específico, pequeño, producido por células de mamífero como respuesta a la exposición a una diversidad de inductores como virus, polipéptidos, mitógenos y lo semejante. Los interferones más preferidos están en forma recombinante y son conocidos los métodos de ADN recombinante para producir proteínas incluyendo los diversos interferones y de ninguna manera pretenden limitar la invención. Ver por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 (Axel et al) y 4,470,461 (Kaufman) . Se han producido las formas recombinantes de interferón alfa, beta, gamma y consenso. La formas de interferón se pueden expresar a partir de células que contienen secuencias de polinucleótidos que codifican variantes como las mutantes de cisteína disminuida (por ejemplo, beta- P986 interferón) y mutantes disminuidas en metionina. Se podrán llevar a cabo otras modificaciones a través de los sistemas de procesamiento post-traduccional en la célula hospedera. La estructura química exacta de un interferón particular dependerá por lo tanto de varios factores y no significa que limite el alcance de la invención. Todas estas proteínas interferón incluidas en las formulaciones descritas en la presente conservarán su bioactividad cuando se pongan en condiciones de entorno adecuadas . Los polinucleótidos preferidos que podrán utilizarse en los métodos presentes de la invención se derivan de las secuencias genéticas de interferón tipo nativo de diversos vertebrados, de preferencia mamíferos y son obtenidas utilizando métodos que son muy conocidos para aquellos con experiencia ordinaria en el campo técnico. Ver, por ejemplo: Patente de los Estados Unidos 5,641,656 (otorgada el 24 de junio de 1997 : ADN que codifica pro-proteína interferón tipo I aviano e interferón tipo I aviano maduro) , Patente de los Estados Unidos 5,605,688 (25 de febrero de 1997 -Interferones tipo I recombinantes de perro y caballo) ; Patente de los Estados Unidos 5,554,513 (10 de septiembre de 1996; Secuencia de ADN que codifica para interferón-beta 2A humano) ; Patente de los Estados Unidos 5,541,312; 30 de julio de 1996 - ADN que codifica para polipéptido fibroblasto beta-2 interferón P986 humano); Patente de los Estados Unidos 5,231,176 (27 de julio de 1993, molécula de ADN que codifica un interferón leucocito humano) ; Patente de los Estados Unidos 5,071,761 (10 de diciembre de 1991, Secuencia de ADN que codifica para subsecuencias de interferones linfoblastoides humanos LyIFN-alfa-2 y LylFN-alfa-3 ) ; Patente de los Estados Unidos 4,970,161 (13 de noviembre de 1990, Secuencia de ADN que codifica para gamma-interferón humano) ; Patente de los Estados Unidos 4,738,931 (19 de abril de 1988, ADN que contiene gen beta interferón humano) ; Patente de los Estados Unidos 4,695,543 (22 de septiembre de 1987, gen alfa-interferón Gx-1 humano) y Patente de los Estados Unidos 4,456,748 (26 de junio de 1984, ADN que codifica subsecuencias de diferentes interferones leucocíticos que se encuentran en forma natural) . Según la presente invención, podrán utilizarse los miembros mutantes de la familia de genes interferón. Las mutaciones en las secuencias polinucleótidas de interferón tipo nativo se desarrollan empleando los métodos convencionales de mutagénesis dirigida, conocidos por aquellos con experiencia ordinaria en el campo técnico. El término "mutante" también quiere decir que abarca fusiones genéticas, de manera que las siguientes secuencias de interferón, que forman parte de la presente, como referencia, se considerarían todas como secuencias P986 "mutantes " . Patente de los Estados Unidos 5,273,889 (28 de diciembre de 1993, Construcción de ADN que comprende gen gamma-interferón enlazado a una secuencia que codifica una leucotoxina inmunogénica) ; Patente de los Estados Unidos 4,959,314 (25 de septiembre de 1990, Gen que tiene una secuencia de AD? que codifica una muteína sintética de una proteína nativa biológicamente activa); Patente de los Estados Unidos 4,929,554 (29 de mayo de 1990, AD? que codifica interferón inmune humano recombinante des-CYS-TYR-CYS) ; Patente de los Estados Unidos 4,914,033 (3 de abril de 1990, Molécula de AD? que codifica un beta interferón modificado que comprende un beta interferón) ; y Patente de los Estados Unxdos 4,569,908 (11 de febrero de 1986, AD? que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido interferón híbrido multiclase) . Además, los polinucleótidos aislados descritos en estas patentes se pueden modificar para proporcionar polinucleótidos funcionalmente equivalentes. Un polinucleótido es "funcionalmente equivalente" comparado con los de las secuencias anteriores si satisface por lo menos una de las condiciones siguientes : (a) : el "equivalente funcional" es un polinucleótido que se hibrida a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas bajo condiciones P986 2 de hibridación estándar y/o se degenera a cualquiera de las secuencias anteriormente mencionadas. Con preferencia superlativa, codifica un interferón mutante que tiene la actividad terapéutica de un interferón tipo nativo; (b) : el "equivalente funcional" es un polinucleótido que codifica en expresión para una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de los polinucleótidos de las secuencias de interferón anteriormente mencionadas. En resumen, el término "interferón" incluye, en forma no exclusiva, los agentes enunciados arriba así como sus equivalentes funcionales. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término equivalente funcional" se refiere, por lo tanto a una proteína interferón o un polinucleótido que codifica la proteína interferón que tiene el mismo efecto beneficioso o un efecto mejorado en el receptor mamífero que el interferón del cual se considera es un equivalente funcional. Como se apreciará por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica, una proteína funcionalmente equivalente se puede producir mediante técnicas recombinantes, por ejemplo, expresando un "ADN funcionalmente equivalente" . Por consiguiente, la presente invención abarca interferones codificados por ADNs que se encuentran en forma natural, así como por ADNs que no se encuentran en forma natural que P986 codifican la misma proteína que es codificada por el ADN que se encuentra en forma natural . Debido a la degeneración de las secuencias nucleótidas codificantes, se podrán utilizar otros polinucleótidos para codificar interferones. Éstos incluyen todas las secuencias anteriormente mencionadas o porciones de las mismas que están modificadas por la substitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácidos dentro de la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. Dichas secuencias modificadas se consideran como equivalentes de estas secuencias. Por ejemplo, Phe (F) es codificada por dos codones, TTC o TTT, Tyr (Y) es codificada por TAC o TAT y His es codificada por CAC o CAT. Por otro lado, Trp (W) es codificada por un sólo codón, TGG. Por consiguiente, se observará que para una secuencia de ADN dada que codifica un interferón particular habrá muchas secuencias degeneradas de ADN que lo codifiquen. Estas secuencias degeneradas de ADN están consideradas dentro del alcance de la invención. El interferón consenso también está incluido dentro de esta definición. En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "interferón consenso" es un polipéptido que no se encuentra en forma natural, que incluye predominantemente aquellos residuos de aminoácidos que son comunes a todas las secuencias subtipo de interferón humano que se P986 encuentran en forma natural y que incluyen, en una o más de las posiciones en las que no hay aminoácido común a todos los subtipos, un aminoácido que se encuentra predominantemente en esa posición y en ningún caso incluye algún residuo de aminoácido no existente en esa posición en por lo menos un subtipo natural. Las secuencias de interferón consenso abarcan secuencias consenso de cualquiera de los interferones anteriormente mencionados con tal que estos tengan secuencias subtipo. Los interferones consenso e emplificativos se dan a conocer en las Patentes de los Estados Unidos 4,695,623 y 4,897,471 (Amgen). Las secuencias de ADN que codifican interferón consenso se podrán sintetizar según se describe en estas patentes o por medio de otros métodos estándar. Los polipéptidos de interferón consenso son de preferencia los productos de expresión de secuencias de ADN fabricadas, transformadas o transfectadas en hospederos, tal como se describe en la presente. Es decir, el interferón consenso de preferencia es producido de manera recombinante. Dichos materiales se podrán purificar por los procedimientos que son muy conocidos en el campo técnico . Los interferones anteriormente mencionados y las condiciones susceptibles de la terapia de reemplazo genético son solamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. La P986 selección de un interferón adecuado para tratamiento de una condición conocida se considera que queda al alcance de las personas con experiencia ordinaria en el campo técnico sin excesiva experimentación.

III. Métodos para Introducir en las Células Secuencias de Polinucleótidos de Proteinas Secretadas El término "transformación" o "transformado" se refiere a cualquier modificación genética de células e incluye tanto "transfección" como "transducción". En el sentido en el que se utiliza en la presente, "transfección de células" se refiere a la adquisición hecha por una célula de nuevo material genético mediante la incorporación de ADN adicionado. Así, la transfección se refiere a la inserción de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) en una célula utilizando métodos físicos o químicos. Varias técnicas de transfección son conocidas por aquellos con experiencia ordinaria en el campo técnico, entre las que se incluyen: coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Ed. E.J. Murray, Humana Press (1991)); DEAE-dextrana (arriba); electroporación (arriba) ; transfección mediada por lipsoma catiónico (arriba) ; y bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, S.A., Nature 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato P986 de estroncio (Brash D.E. et al. Molec. Cell. Biol. 7:2031-2034 (1987). Cada uno de estos métodos está bien descrito en el campo técnico. En contraste, "transducción de células" se refiere al proceso de transferir ácido nucleico en una célula utilizando un virus ADN o ARN. Se podrán incorporar una o más secuencias de polinucleótidos aislados que codifican una o más proteínas interferón contenidas en el virus, en el cromosoma de la célula transducida. Alternativamente, una célula se transduce con un virus pero la célula no tendrá el polinucleótido incorporado en sus cromosomas aunque tendrá la capacidad de expresar interferón extracro osómicamente dentro de la célula. Según una modalidad, las células son transformadas (es decir, genéticamente modificadas) ex vivo. Las células se aislan a partir de un mamífero (de preferencia un humano) y se transforman (por ejemplo, se transducen o transfectan in vitro) con un vector que contiene un polinucleótido aislado como un gen recombinante operativamente enlazado a una o mas secuencias de control de expresión para expresar una proteína secretada recombinante (por ejemplo, un interferón) . Las células se administran entonces a un receptor mamífero para el suministro de la proteína in situ. De preferencia, el receptor mamífero es un humano y las células que se van a modificar son células P986 autólogas, es decir, las células son aisladas del receptor mamífero. Han sido reportados el aislamiento y cultivo de las células in vitro. Según otra modalidad, las células son transformadas o modificadas genéticamente de otro modo in vivo. Las células provenientes del receptor mamífero (de preferencia un humano) se transforman (es decir se traducen o se transfectan) in vivo con un vector que contiene polinucleótido aislado como un gen recombinante operativamente enlazado a una o más secuencias de control de expresión para expresar una proteína secretada (por ejemplo, interferón recombinante) y suministrar la proteína in situ. Los polinucleótidos aislados que codifican la proteína secretada (por ejemplo, ADNc que codifica una o más proteínas interferón terapéuticas) se introducen a la célula ex vivo o in vivo mediante métodos de transferencia génica, como transfección o transducción, para proporcionar una célula modificada genéticamente. Para alguien con experiencia ordinaria en el campo técnico son conocidos los diversos vectores de expresión (es decir, vehículos que facilitan el suministro del polinucleótido aislado en una célula blanco u objetivo) . Típicamente, el material genético introducido incluye un polinucleótido aislado como un gen interferón (normalmente en forma de ADNc que comprende P986 3 exones codificantes para el interferón) junto con un promotor para controlar la transcripción de un nuevo gen. El promotor en forma característica tiene una secuencia de nucleótido específica necesaria para iniciar la transcripción. Opcionalmente, el material genético podría incluir secuencias intrónicas que se eliminarán del transcrito maduro por escisión de ARN. Deberá estar presente una señal de poliadenilación en el extremo 3' del gen que se va a expresar. El material genético introducido también podrá incluir una apropiada secuencia "señal" de secreción para secretar el producto génico terapéutico (es decir, un interferón) a partir de la célula al ambiente extracelular . Opcionalmente, el material genético aislado incluye además secuencias adicionales (por ejemplo, intensificadoras) requeridas para obtener la actividad de transcripción genética deseada. Para el propósito de esta exposición un " intensificador " es simplemente cualquier secuencia de ADN no traducida que funciona contigua a la secuencia codificante (en cis) para cambiar el nivel de transcripción basal dictado por el promotor . De preferencia, el material genético aislado se introduce en el genoma celular inmediatamente corriente abajo del promotor de manera que el promotor y la secuencia codificante están operativamente P986 enlazados para permitir la transcripción de la secuencia codificante. Los vectores de expresión virales preferidos incluyen un elemento promotor exógeno para controlar la transcripción del gen interferón insertado. Dichos promotores exógenos incluyen tanto promotores constitutivos como inducibles . Los promotores constitutivos que se encuentran en forma natural controlan la expresión de proteínas que regulan las funciones celulares básicas. Como consecuencia, un gen bajo el control de un promotor constitutivo se expresa bajo todas las condiciones de crecimiento celular. Entre los promotores constitutivos ejemplificativos se incluyen los promotores para los siguientes genes que codifican ciertas funciones constitutivas o "domésticas": hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) . dihidrofolato reductasa (DHFR) (Scharfmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4626-4630 (1991)), adenosina deaminasa, fosfoglicerol cinasa (PGK) , piruvato cinasa, fosfoglicerol mutasa, el promotor ß-actina (Lai et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10006-10010 (1989)) y otros promotores constitutivos conocidos por los expertos en la técnica. Además, muchos promotores virales funcionan constitutivamente en células eucariotas. Éstos incluyen: los promotores tempranos y tardíos de SV40 P986 3 (Ver Bernoist and Chambón, Nature, 290:304 (1981)); las repeticiones de terminal larga (LTRs) del Virus de Leucemia Moloney y otros retrovirus (Ver Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, Harbor, NY (1985)); el promotor timidina cinasa del Virus Herpes Simplex (HSV) (Ver Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1441 (1981)); el promotor temprano (IEl) inmediato al citomegalovirus (Ver Karasuyama et al., J . Exp . Med . , 169:13 (1989)); el promotor del virus de sarcoma Rous (RSV) (Yamamoto et al., Cell, 22:787 (1980)); el promotor tardío mayor de adenovirus (Yamada et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3567 (1985)), entre muchos otros. Por consiguiente, cualquiera de los promotores constitutivos anteriormente mencionados se pueden utilizar para el control de transcripción en un inserto genético. (Ver también Sección B) . Si el suministro del gen interferón es a tejidos específicos, sería conveniente objetivizar la expresión de este gen. Por ejemplo, existen muchos promotores descritos en la literatura que solamente se expresan en ciertos tejidos. Los ejemplos incluyen promotores hepático-específicos del virus de hepatitis B (Sandig et al., Gene Therapy 3:1002-1009(1996) y el gen de albúmina (Pinkert et al., Genes and Development, 1:268-276 (1987); ver también Guo et al., Gene Therapy, 3:802-810 (1996) para otro promotor hepático- P986 específico. Además, existen muchos promotores descritos en la literatura que se expresan solamente en tumores específicos. Los ejemplos incluyen el promotor PSA (carcinoma de próstata) , promotor de antígeno carcinoembrionario (carcinoma de colon y pulmón) , promotor de ß-caseína (carcinoma mamario) , promotor de tirosinasa (melanoma) , promotor de calcineurina Aa (glioma, neuroblastoma) , promotor c-sis (osteosarcoma) y el promotor de a-fetoproteína (hepatoma) . Los genes que están bajo el control de promotores inducibles solamente se expresan, o en mayor grado, en presencia de una agente de inducción (por ejemplo, la transcripción bajo el control del promotor metalotioneína se aumenta mucho en presencia de ciertos iones metálicos) . Ver también el promotor inducible por glucocorticoides presente en la repetición de terminal larga del virus tumoral mamario de ratón (MMTV LTR) (Klessig et al., Mol. Cell. Biol. , 4: 1354 (1984)). Los promotores inducibles incluyen elementos sensibles (REs) que estimulan la transcripción cuando sus factores de inducción están unidos. Por ejemplo, hay REs para factores séricos, hormonas esteroideas, ácido retinoico y AMP cíclico. Los promotores que contienen un RE particular se pueden seleccionar para obtener una respuesta inducible y en algunos casos, el Re en sí se podrá unir a diferentes promotores, confiriendo por ello inducibilidad al gen recombinante.

P986 Así, seleccionando el promotor apropiado (constitutivo contra inducible; fuerte contra débil), es posible controlar tanto la existencia como el nivel de expresión de un interferón en la célula modificada genéticamente. Si el gen que codifica el interferón está bajo el control de un promotor inducible, el suministro del interferón in situ se dispara al exponer la célula genéticamente modificada in situ a condiciones que permitan la transcripción del interferón, por ejemplo, mediante inyección de inductores específicos de los promotores inducibles que controlan la transcripción del agente. Por ejemplo, la expresión in situ por las células modificadas genéticamente de proteína interferón codificada por un gen interferón bajo el control del promotor metalotioneina se refuerza al poner en contacto las células genéticamente modificadas con una solución que contiene los iones metálicos apropiados (es decir, que inducen) in situ. Recientemente, se han desarrollado sistemas muy sofisticados que permiten la regulación precisa de la expresión genética mediante pequeñas moléculas administradas exógenamente. Éstos incluyen, el sistema FK506/Rapamicina (Rivera et al., Nature Medicine 2(9) : 1028-1032, 1996); el sistema tetraciclina (Gossen et al., Science 268: 1766-1768, 1995), el sistema ecdisona (No et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA P986 93:3346-3351, 1996) y el sistema progesterona (Wang et al., Nature Biotechnolosv 15:239-243, 1997). Por consiguiente, la cantidad de interferón que se suministra in situ se regula al controlar factores como (1) la naturaleza del promotor utilizado para dirigir la transcripción del gen insertado, (es decir, si el promotor es constitutivo o inducible, fuerte o débil o específico para un tejido); (2) el número de copias de gen exógeno que se introducen a la célula; (3) el número de células transducidas/transfectadas administradas (es decir, implantadas) al paciente; (4) el tamaño de un implante (por ejemplo, injerto o sistema de expresión encapsulada) en métodos ex vivo; (5) el número de implantes en métodos ex vivo; (6) el número de células transducidas/transfectadas mediante administración in vivo; (7) la longitud de tiempo que las células transducidas/transfectadas se dejan en el lugar tanto en métodos ex vivo como in vivo; y (8) la velocidad de producción del interferón por la célula genéticamente modificada . Se considera que la selección y optimización de estos factores para el suministro de una dosis terapéuticamente eficaz de un interferón particular queda al alcance de alguien con experiencia ordinaria en la técnica sin una experimentación excesiva, tomando en cuenta los factores anteriormente mencionados y el P986 perfil clínico del paciente. Debido a que la proteína expresada por nuestros métodos de terapia génica es una proteína secretada, las células circundantes que no contienen el vector de terapia génica son afectadas (ver Ejemplos) . Como consecuencia, los métodos presentes normalmente no requieren el uso de un gen seleccionable. Sin embargo, además de al menos un promotor y al menos un polinucleótido aislado que codifique al interferón, el vector de expresión podrá incluir opcionalmente un gen de selección, por ejemplo, un gen resistente a neomicina, para facilitar la selección de las células que han sido transducidas o transfectadas con el vector de expresión. Alternativamente, las células son transfectadas con uno o más vectores de expresión, por lo menos un vector que contiene el gen (es) que codifica el interferón (es) , el otro vector contiene un gen de selección. Se considera que la selección de un adecuado promotor, intensificador, gen de selección y/o secuencia señal (descrita abajo) queda al alcance de alguien con experiencia ordinaria en la técnica sin una experimentación excesiva.

IV. Métodos para Preparar Vectores de Terapia Génica Específicos Se podrán utilizar cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para la inserción de secuencias P986 polinucleótidas en un vector. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y Ausubel et al., Current Protocole in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1992) . Los vectores convencionales consisten de señales de control transcripcional/traduccional apropiadas operativamente enlazadas a la secuencia de polinucleótidos para un interferón particular. También se podrán utilizar promotores/intensificadores para el control de la expresión de interferones. (Ver Sección III) . Los vectores de expresión compatibles con células hospederas de mamífero que se usan en terapia génica de células tumorales incluyen, por ejemplo, plásmidos; vectores retrovirales avíanos, de murino y humanos; vectores de adenovirus; vectores virales de herpes; parvovirus; y virus eruptivos no replicativos . En particular los virus recombinantes incapaces de replicación se pueden generar en líneas celulares empacadas que solamente producen virus incapaces de replicación. Ver Current Protocols in Molecular Biology: Secciones 9.10-9.14 (Ausubel et al., eds.), Greene Publishing Associates, 1989. Los vectores virales específicos que se usan en sistemas de transferencia genética están ahora bien establecidos. Ver por ejemplo: Madzak et al., J. Gen. Virol. , 73:1533-36 (1992) (papovavirus SV40): Berkner P986 et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol . , 158:39-61 (1992) (adenovirus); Moss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol . , 158:25-38 (1992) (virus vacuna); Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol . , 158:97-123 (1992) (virus adeno-asociado) ; Margulskee, Curr . To .

Microbiol. Immunol . , 158:67-93 (1992) (virus herpes simplex (HSV) y virus Epstein-Barr (HBV) ) ; Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol . , 158:1-24 (1992) (retrovirus); Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol., 4:749-754 (1984) (retrovirus); Miller et al., Nature, 357:455-450 (1992) (retrovirus); Anderson, Science, 256:808-813 (1992 ) (retrovirus) . Los vectores preferidos son virus ADN que incluyen adenovirus (de preferencia vectores a base de Ad-2 o Ad-5) , virus de herpes (de preferencia vectores basados en virus herpes simplex) y parvovirus (de preferencia vectores basados en parvovirus "defectuosos" o no autónomos, con mayor preferencia vectores basados en virus adeno-asociados, con preferencia superlativa vectores basados en AAV-2). Ver, por ejemplo, Ali, et al., Gene Therapy 1:367-384 (1994); Patente de los Estados Unidos 4,797,368 y 5,399,346 y la exposición abajo. La elección de un sistema de vector particular para transferir, por ejemplo, una secuencia de interferón dependerá de una diversidad de factores. Un importante factor es la naturaleza de la población P986 celular blanco. Aunque los vectores retrovirales han sido ampliamente estudiados y utilizados en varios aplicaciones de terapia génica, en general no son aptos para infectar células que no están divididas pero podrían ser útiles en terapia de cáncer puesto que solamente expresan e integran sus genes en células de réplica. Ellos son útiles para enfoques ex vivo y son atractivos en este aspecto debido a su integración estable en el genoma celular blanco. Los adenovirus son virus ADN eucariontes que se pueden modificar para suministrar eficazmente un transgén reportero o terapéutico a una variedad de tipos de células. Los tipos de adenovirus generales 2 y 5 (Ad2 y Ad5 , respectivamente), que causan enfermedad respiratoria en humanos, actualmente se desarrollan para terapia génica de Distrofia Muscular Duchenne (DMD) y Fibrosis Quística (CF) . Tanto el Ad2 como el Adn5 pertenecen a una subclase de adenovirus que no está asociada con malignidades en humanos. Los vectores de adenovirus son capaces de proporcionar niveles extremadamente elevados de suministro transgénico prácticamente a todo tipo de células, sin importar el estado mitótico. Se pueden generar fácilmente títulos elevados de virus recombinante (1011 unidades formadoras de placa/ml) en células 293 (una línea celular de complementación de riñon embrionario humano, transformado con adenovirus: ATCC CRL1573) y P986 almacenarse en congelación por períodos largos sin pérdidas considerables. La eficacia de este sistema para suministrar un transgén terapéutico in vivo que complementa un desequilibrio genético se ha demostrado en modelos animales de diferentes trastornos. Ver, Y. Watanabe, Atherosclerosis , 36:261-268 (1986); K. Tanza a et al., FEBS Letters, 118(1) :81-84 (1980); J.L. Golasten et al., New Encr1. J. Med. , 309 (11983): 288-296 (1983): S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest. , 92:883-893 (1993); y S. Ishibashi et al., J. Clin. Invest. , 93:1889-1893 (1994). En efecto, el adenovirus incapaz de replicación recombinante que codifica un ADNc para el regulador transmembrana de fibrosis quística (CFTR) ha sido aprobado para utilizarse en varios estudios clínicos de CF en humanos. Ver, por ejemplo, J. Wilson, Nature, 365:691-692 (Oct. 21, 1993) . Otro soporte a la seguridad de los adenovirus recombinantes para terapia génica es la amplia experiencia de vacunas de adenovirus vivos en poblaciones humanas. Los adenovirus humanos están constituidos por un genoma de ADN bicatenario, lineal de aproximadamente 36 kb, que está dividido en 100 unidades mapa (m.u.), cada una de las cuales es de 360 bp (pares de bases) de longitud. El ADN contiene repeticiones terminales invertidas (ITR) en cada extremo del genoma que se requieren para la replicación del ADN viral. Los P986 productos genéticos se organizan en regiones tempranas (de El a E4) y tardías (de Ll a L5) , con base en la expresión anterior o posterior a la iniciación de la síntesis de ADN viral. Ver, por ejemplo, Horwitz, Virology, 2nd edit., ed. B.N. Fields, Raven Press Ltd., New York (1990) . El genoma de adenovirus se somete a un programa bastante regulado durante su ciclo de vida viral normal. Ver, Y. Yang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:4407-4411 (1994). Los viriones son internalizados por la célula, entran al endosoma y de allí el virus entra al citoplasma y comienza a perder su cubierta proteica. El ADN virión se desplaza al núcleo, en donde mantiene su estructura lineal extracromosómica más bien que integrarla al cromosoma. Los genes tempranos inmediatos Ela y Elb, son expresados en el núcleo. Estos productos génicos tempranos regulan la transcripción adenoviral y se requieren para la replicación viral y la expresión de una diversidad de genes hospederos (que ceban la célula para la producción de virus) y son el centro de la activación en cascada de los genes tempranos retrasados (por ejemplo, E2 , E3 y E4) seguidos por los genes tardíos (por ejemplo, L1-L5) . La primera generación de virus incapaces de replicación, recombinantes que se han desarrollado para terapia génica contienen eliminaciones de toda la P986 región El y parte de la Elb. Este virus incapaz de replicación se desarrolla en células 293 que contienen una región El de adenovirus funcional que proporciona proteínas El trans, mediante lo cual se permite la replicación del adenovirus sin El. El virus resultante es capaz de infectar muchos tipos de células y puede expresar el gen introducido (siempre que porte un promotor) , pero no se puede replicar en una célula que no lleva el ADN de la región El. Los adenovirus recombinantes tienen la ventaja de tener una amplia gamma de hospederos, pueden infectar células inactivas o terminalmente diferenciadas como neuronas y parece básicamente no oncogénico. Parece que los adenovirus no se integran en el genoma del hospedero. Debido a ellos existen extracromosómicamente, el riesgo de mutagénesis insercional es muy reducido. Los adenovirus recombinantes producen títulos muy elevados, las partículas virales son moderadamente estables, los niveles de expresión son altos y se pueden infectar una amplia gamma de células. Los virus adeno-asociados (AAV) también se han empleado como vectores para terapia génica somática. El AAV es un virus ADN monocatenario (ss) pequeño, con una organización genómica simple (4.7 kb) que lo hace ideal como sustrato para ingeniería genética. Dos marcos de lectura abiertos codifican una serie de polipéptidos rep y cap. Los polipéptidos rep {rep78, P986 rep68, rp62 y rep O) están implicados en la replicación, rescate e integración del genoma AAV. Las proteínas cap (VP1, VP2 y VP3) formar el cápsido del virión. Bordeando los marcos de lectura abiertos rep y cap en los extremos 3 ' y 5 están las repeticiones terminales invertidas 145 bp (ITRs) , la primera 125 bp de la cuales tiene la capacidad de formar estructuras dúplex de forma Y- o T- . Tiene importancia para el desarrollo de los vectores AAV, que los dominios rep y cap completos se puedan escindir y substituir con un transgén terapéutico o reportero. Ver B.J. Cárter, en Handbook of Parvoviruses, ed. , P.Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990) . Se ha demostrado que los ITRs representan la secuencia mínima requerida para replicación, rescate, empaquetamiento e integración del genoma AAV. El ciclo vital del AAV es bifásico, compuesto tanto de episodios latentes como líticos. Durante la infección latente, los viriones AAV entran en una célula como un ADNss encapsidado y poco después se distribuyen en el núcleo en donde el ADN del AAV se integra establemente en un cromosoma del hospedero sin la aparente necesidad de división de la célula del hospedero. En ausencia de un virus auxiliar, el genoma AAV integrado permanece latente pero capaz de ser activado y rescatado. La fase lítica del ciclo vital comienza cuando una célula que hospeda un provirus AAV P986 se estimula con una infección secundaria mediante un herpesvirus o un adenovirus que codifica funciones auxiliares que son requeridas por AAV para ayudar en su escisión de la cromatina del hospedero (B.J. Cárter, arriba) . El ADN (ss) monocatenario padre infeccioso se expande a la forma de ADNs de replicación dúplex (RF) de una manera rep -dependiente. Los genomas AAV rescatados son empaquetados en forma cápsidos proteicos preformados (simetría icosaédrica de aproximadamente 20 nm de diámetro) y liberados como viriones infecciosos que han sido empaquetados ya sea como genomas ADNss + o - después de la lisis celular. Los AAV tienen potencial significativo en terapia génica. Las partículas virales son muy estables y los AAVs recombinantes (AAVr) tienen características "tipo fármaco" ya que los AAVr pueden purificarse por "pelletización" o por bandeado en gradiente de CsCl. Son estables y pueden liofilizarse para dar un polvo y rehidratarse para actividad total. Su ADN se integra establemente en cromosomas hospederos así que la expresión es a largo plazo. Su intervalo de hospederos es extenso y los AAV no ocasionan enfermedades conocidas de manera que los vectores recombinantes son no tóxicos. Se demostró que la expresión genética en un nivel elevado a partir de AAV en ratones persiste por al menos 1.5 años. Ver Xiao, Li and Samulski (1996) P986 Journal of Viroloqy 70, 8089-8108. Ya que no hubo evidencia de toxicidad viral o de una respuesta inmunitaria celular del hospedero, estas limitaciones han sido superadas . Kaplitt, Leone, Samulski, Xiao, Pfaff, O'Malley y During (1994) Nature Genetics 8, 148-153 describieron la expresión a largo plazo (hasta 4 meses) de tirosina hidroxilasa en el cerebro de rata después de inyección intracraneal directa utilizando un vector AAV. Ésta es una terapia potencial para el Mal de Parkinson en humanos. La expresión fue bastante eficaz y el virus fue seguro y estable. Fisher et al . (Nature Medicine (1997) 3, 306-312) reportaron expresión genética estable en ratones después de inyección muscular de AAV. Otra vez, el virus fue seguro. No se detectó respuesta inmunitaria celular o humoral contra el virus o el producto genético extraño. Kessier et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1996) 93, 14082-14087) demostró alto nivel de expresión del gen eritropoyetina (Epo) después de inyección intramuscular AAV en ratones . La proteína Epo demostró estar presente en la circulación y se reportó un aumento en la cuenta de eritrocitos, indicativo de potencial terapéutico. Otro trabajo de este grupo ha utilizado AAV que expresa el gen HSV tk como un tratamiento para el cáncer. Se ha descrito alto nivel P986 9 de expresión en tumores sólidos. Recientemente, el baculovirus recombinante, derivado principalmente del baculovirus virus de poliedrosis nuclear múltiple Au tographa californica (AcMNPV) , ha demostrado que es capaz de transducir células de mamífero in vitro. (Ver Hofmann, C, Sandig, V., Jennings, G. Rudolph, M. Schlag, P., and Strauss, M. (1995) , "Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors", Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92, 10099-10103; Boyce, F.M. and Bucher, N.L.R. (1996) "Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells", Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 2348-2352) . El baculovirus recombinante tiene varias ventajas potenciales para la terapia génica. Estas incluyen una capacidad muy grande para insertos de ADN, una ausencia de respuesta inmunitaria preexistente en humanos, ausencia de replicación en mamíferos, ausencia de toxicidad en mamíferos, ausencia de expresión de genes virales en células de mamífero debido a la insecto-especificidad de los promotores transcripcionales de baculovirus y potencialmente una ausencia de respuesta de linfocito T citotóxico dirigida contra estas proteínas virales.

P986 IV. Pruebas para Eficacia/Identificación de Interferones Los polinucleótidos de interferón se administran a una célula por medio de un vector de expresión. Por lo general, alguien prueba la eficacia de un vector de terapia génica dado en una condición y metabolismo celular particular analizando: (i) modificaciones en morfología celular; (ii) inhibición de proliferación celular; y (iii) actividades antivirales. La selección y optimización de un particular vector de expresión para expresar un producto génico de interferón específico en una célula aislada se lleva a cabo obteniendo el gen interferón, de preferencia con una o más regiones de control apropiadas (por ejemplo, promotores) ; preparando una construcción vectorial que comprende el vector en el cual se inserta el gen interferón; transfectando o transduciendo células cultivadas in vitro con la construcción vectorial; y determinando si el producto génico de interferón está presente en las células cultivadas. El efecto de transfección con polinucleótidos que codifican interferones podrá probarse in vitro utilizando cualquiera de varias líneas celulares tumorales humanas fácilmente disponibles. Dichas líneas celulares incluyen una línea celular de carcinoma humano de vejiga, 5637 (ATCC HTB9), una línea celular P986 de carcinoma de mama humano, MDA-MB-468 (ATTC HTB132) ; una línea celular de carcinoma de próstata humano, DU145 (ATCC HTB81) ; una línea celular de osteosarcoma humano, SA0S2 (ATCC HTB85); un fibrosarcoma humano metastásico a línea celular de cáncer de pulmón, Hs913T (ATCC HTB152); una línea celular de carcinoma cervical humano, HeLa (ATCC ECL 2) . Cada una de estas líneas celulares podrá ser transfectada con los polinucleótidos apropiados que codifican interferones y el efecto de la transfección en el crecimiento celular y en la morfología celular se podrá analizar utilizando procedimientos conocidos en el campo técnico como el ensayo de exclusión con Trypan azul para medir la viabilidad celular, recuento celular para medir la propagación con respecto al tiempo e incorporación de ti idina-tritiada para medir la replicación de ADN. El efecto de una proteína secretada en las células circundantes que no contienen un vector viral con los polinucleótidos apropiados que codifican la proteína, podrán analizarse fácilmente empleando los métodos descritos en el Ejemplo 3. Una vez introducidas en una célula blanco u objetivo, las secuencias de interferón se pueden identificar mediante los métodos convencionales como la hibridación de ácido nucleico utilizando sondas que comprenden secuencias que son homologas/complementarias a las secuencias de interferón mutante insertadas . La P986 transcripción de interferón se puede medir mediante reacción en cadena de transcriptasa inversa polimerasa. Alternativamente, la proteína interferón se mide en el medio acondicionado a la célula mediante ensayo antiviral convencional o ensayo ELISA. En otro enfoque, la(s) secuencia (s) podrán identificarse por la presencia o ausencia de una función génica "marcadora" (por ejemplo, actividad de timidina cinasa, resistencia a antibióticos y lo semejante) ocasionada por la introducción de un vector de expresión en la célula blanco. Por ejemplo, si un polinucleótido que codifica beta-interferón la se inserta en un vector que tiene un gen marcador seleccionable dominante como un gen de neomicina fosfotransferasa bajo control por separado de un promotor temprano SV40, la secuencia se puede identificar mediante la presencia de la función génica marcadora (resistencia a Geneticina) . Otros métodos para detectar el vector apropiado estarán fácilmente disponibles para las personas con experiencia ordinaria en el campo técnico.

V. Utilidades A. Interferón y Enfermedades Infecciosas Los interferones se han utilizado en el tratamiento de infecciones bacterianas, fúngicas y virales. Los virus de influenza y estomatitis vesicular (VSV) son particularmente sensibles a la inhibición por P986 medio de interferones y con frecuencia se utilizan en ensayos para medir la actividad del interferón y en investigaciones que exploran el mecanismo de la actividad antiviral del interferón. Otros virus que son patógenos para humanos y parecen ser sensibles a los interferones incluyen el virus de hepatitis B (HBV) , virus de hepatitis C (HCV) , virus de hepatitis D, papilomavirus humano, virus herpes simplex, virus herpes zoster, citomegalovirus (CMV) , rinovirus y virus de encefalomiocarditis . Entre los blancos más atractivos de enfermedades virales está la hepatitis. La hepatitis viral, una enfermedad del hígado ocasionada por varios virus, es un problema mayor de salud pública mundial. Se han aislado y clonado cinco distintos virus de hepatitis humana. Éstos son hepatitis A, B, C, D y E. Algunos casos de hepatitis viral aguda y crónica parecen estar asociados con virus de hepatitis distintos a los que ya se han caracterizado, como el virus de hepatitis G recientemente descubierto. Los virus con la más alta prevalencia son A, B y C. Además de ocasionar lesión hepática aguda y crónica e inflamación, la infección HBV y HCV puede conducir a carcinoma hepatocelular. Los interferones han demostrado cierto grado de eficacia in vivo contra HBV y HCV, así como hepatitis D y hepatitis A en cultivo celular.

P986 La hepatitis viral podría ser tratada mediante la introducción del gen interferón. El blanco preferido para el suministro de este gen son los hepatocitos en el hígado. Aunque es posible la terapia ex vivo (por ejemplo, explantando células hepáticas y a continuación la introducción de polinucleótidos que expresan interferón y después la transplantación de vuelta en el paciente) , el suministro del gen in vivo es particularmente preferible. Se realiza cirugía para inyectar el gen en la vena portal del hígado o se infunde el gen a través de un catéter en la arteria hepática. Idealmente, se utilizan prácticas menos invasivas como la inyección intravenosa. El gen interferón se pone bajo el control de un promotor transcripcional en un vector de expresión adecuado . El promotor transcripcional puede ser de origen celular o viral (CMV, SV40, RSV, etc.). Si se desea expresión genética específica de hígado, se prefiere un promotor celular hepatocito-específico como el promotor/intensificador de albúmina, el promotor al-antitripsina o un promotor/intensificador de HBV. Existen muchos promotores hepato-específicos descritos en la literatura (Ver arriba) . También es posible diseñar un vector en el que el gen interferón se exprese solamente en las células infectadas con hepatitis. Por ejemplo, la expresión del gen interferón podría ser inducida por el factor de P986 transcripción HBV HBx que sólo estará presente en hepatocitos infectados por HBV. Además, también se podrá utilizar un sistema "portador" . Éste podría ser un sistema de suministro no viral como liposomas catiónicos o conjugados proteína-ADN (los conjugados de ADN con asialoglicoproteínas se pueden suministrar preferencialmente al hígado por medio de la unión al receptor asialoglicoproteína en los hepatocitos) . Sin embargo, a la fecha, los sistemas de suministro de genes más eficaces son de origen viral. Se han utilizado los retrovirus recombinantes para suministrar genes a los hepatocitos humanos ex vivo . Los modelos animales indican que el adenovirus recombinante se puede localizar de manera muy eficaz en el hígado posteriormente a la administración intravenosa in vivo. Aproximadamente 98% de adenovirus inyectados intravenosamente se localizan en el hígado. Parece que el virus recombinante adeno-asociado (AAVr) también puede infectar al hígado después de la administración in vivo . Se podrían utilizar otros tipos de virus como alfa virus, lentivirus u otros virus de mamíferos. Recientemente, un virus que no es de mamífero, el baculovirus insecto-específico ha demostrado que es capaz de suministrar y expresar genes eficazmente en hepatocitos (Hofman et al., 1995; Boyce and Bucher, 1996, arriba) . A manera de ejemplo, se pueden utilizar P986 adenovirus recombinantes para suministrar el gen interferón in vivo . Los adenovirus incapaces de replicación han sido construidos por varios grupos. La primera generación de dichos virus son defectuosos debido a la eliminación de la región El. Este defecto se complementa en la línea celular 293 que expresa la región El de adenovirus. Es preferible utilizar un adenovirus recombinante que haya sido incapacitado más extensamente por la eliminación de genes El, E2a y/o E4. Todas estas funciones eliminadas pueden ser expresadas en la línea celular empaquetada. El gen interferón se coloca corriente abajo de cualquiera de varios promotores (por ejemplo: el promotor temprano inmediato CMV, el RSV LTR, el promotor de actina celular, el intensificador/promotor de albúmina u otro promotor hepato-específico) . Este cásete genético se coloca en un vector de adenovirus recombinante en lugar de uno de los genes eliminados, como el El para crear el vector de transferencia adenoviral. Los adenovirus recombinantes que tienen el gen interferón son generados mediante ligación directa o recombinación homologa y transfección posterior en células empaquetadas por los métodos estándar. Una reserva de virus recombinantes que tiene el gen interferón se purifica por placa varias veces después se expande mediante producción a gran escala en células empaquetadas. Los virus se pueden purificar mediante P986 bandeado en CsCl, cromatografía en columna u otros métodos y después titulados en las células de empaquetamiento. Los métodos para generar adenovirus defectuosos en El y E2a (Engelhardt et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:6196-6200, 1994) y adenovirus defectuosos en El y E4 (Gao et al., J. Virolo v, 70:8934-8943, 1996) se han descrito con detalle. Los métodos para generar adenovirus defectuosos en El se pueden encontrar en Graham, F.L. y L. Prevec, "Methods for Construction of Adenovirus Vectors", Mol. Biotech, 3:207-220 (1995) . Varias dosis de virus se probarían en estudios. La dosis de virus iniciaría probablemente a 107 unidades formadoras de placa (pfu) y llegaría hasta 1012 pfu (unidades formadoras de placa) . Si fuera necesario, el virus podría administrarse repetidamente (una vez cada uno o seis meses, por ejemplo) . Una respuesta inmunitaria humoral que resultara de la administración viral repetida podría limitar la eficacia de la administración repetida. En este caso, se podría administrar un agente inmunosupresor junto con el virus, por ejemplo, la ciclosporina o un anticuerpo dirigido contra el ligando CD40. El efecto de la terapia génica de interferón contra la hepatitis viral se puede probar en modelos animales (Ver Sección C) . Por ejemplo, en el caso del virus de la hepatitis B, están disponibles muchos P986 modelos. Estos incluyen marmota, pato, musaraña, rata y ratón. Están incluidos entre los modelos HBV de ratón los ratones que son transgénicos para HBV y replican establemente ADN HBV en sus hígados conduciendo a la producción constante de virus HBV en circulación. Para HCV, está disponible un modelo de chimpancé. El adenovirus que tiene un gen interferón podría administrarse directamente al hígado o por inyección intravenosa. La eficacia se determinaría monitoreando la replicación de ADN viral, partículas virales en circulación, enzimas hepáticas (ALTs) , patología del hígado e inflamación.

B . Cáncer Las proteínas interferón han demostrado que poseen actividad anti-oncogénica en muchas situaciones. Para revisiones, ver Wadler and Schwartz, Cáncer Research 50:3473-3486, 1990; Martin-Odegard, DN&P, 4:116-117, 1991; y Spiegel, Seminars in Oncoloqy 15(5):41-45, 1988. El tratamiento con alfa-interferón y beta-interferón ha demostrado cierta eficacia contra varios cánceres. La terapia génica podría hacerse sola o en combinación con cirugía convencional, radiación o quimioterapia. La siguiente lista de cánceres sensibles a la terapia génica es sólo una lista parcial y es probable que la terapia génica de interferón pudiera ser eficaz en varias situaciones de enfermedad que no P986 están incluidas en esta lista. Gliomas malignos son responsables del 60 a 80% de todos los tumores de cerebro primarios en adultos. Células de glioma humano se pueden implantar intracerebralmente en ratones inmunodeficientes (desnudos) para proporcionar un modelo de glioma. El tratamiento con proteína beta-interferón ha mostrado que aumenta la supervivencia en estos ratones. Un problema con algunos de las pruebas de proteína beta-interferón en glioma ha sido la elevada toxicidad posterior a la administración parenteral (intravenosa o intramuscular) de beta-interferón. El suministro localizado del gen beta-interferón en el cerebro, quizá al momento de la cirugía, podría dar por resultado la producción de beta-interferón a largo plazo en el cerebro sin los efectos secundarios observados después de la administración sistémica de proteína. Melanoma es un excelente blanco para la terapia génica de interferón. El pronóstico para el melanoma maligno metastásico es malo. La incidencia de enfermedad está aumentando dramáticamente y las quimioterapias convencionales son ineficaces. El melanoma parece ser un tumor tipo inmunogénico, ya que la respuesta del paciente podría depender de la respuesta inmunitaria del hospedero. Tanto las actividades antiproliferativas como las inmunomoduladoras del beta-interferón podrían ser P986 eficaces en esta situación. Hemos observado que la proteína beta-interferón tiene efectos antiproliferativos en células de melanoma maligno cultivadas . Hemanqioma es una proliferación de endotelio capilar que da como resultado la acumulación de células cebadas, fibroblastos y macrófagos y conduce a lesión del tejido. Aunque normalmente inofensivos, los hemangiomas pueden poner en peligro órganos vitales y causar muerte. La proteína alfa-interferón demostró que en lactantes induce regresión temprana de los hemangiomas resistentes a esteroides (Martin-Odegard, arriba) . Las proteínas interferón han demostrado ser eficaces en el tratamiento de leucemias , linf ornas y mielomas . La eficacia mostrada en estas enfermedades es contraria al hallazgo general de que, aunque está bien caracterizada la eficacia de las proteínas interferón en el tratamiento de cáncer in vitro, la eficacia in vivo es mucho menos común. Sin embargo, el alfa-interferón es eficaz contra la leucemia de célula vellosa, leucemia mieloide crónica, linfomas de célula T cutánea, linfoma de Hodgkin mieloma múltiple en estudios clínicos en humanos. La proteína beta-interferón inhibe el crecimiento de carcinoma celular renal en cultivo. El a-IFN ya ha sido aprobado para utilizarse en el tratamiento de carcinoma celular P986 renal . Cáncer colorrectal, es una causa importante de muertes relacionadas con cáncer en los Estados Unidos. Hay potentes efectos antiprolíferativos mediante proteínas a-IFN, ß-IFN y ?-IFN en células de carcinoma de colon humano cultivadas. El carcinoma de colon con frecuencia genera metástasis en el hígado con terribles consecuencias. Se podrían el adenovirus u otro tipo de sistemas de suministro trópico al hígado para suministrar el gen interferón al hígado para el tratamiento de estas metástasis. El carcinoma hepatocelular es un blanco atractivo debido a la alta eficiencia de suministro al hígado mediante el adenovirus. Se ha observado que la proteína ß-IFN inhibe de manera significativa la proliferación de células de hepatoma humano en cultivo. Las proteínas interferón han demostrado eficacia en el tratamiento de carcinoma pulmonar de célula no pequeña inoperable en algunos estudios clínicos, pero no en otros. Se ha encontrado que dos líneas celulares de cáncer pulmonar humano son sensibles a la inhibición del crecimiento mediante proteína beta-interferón (el beta fue más eficaz que el alfa) . En un estudio clínico, se observó toxicidad significativa relacionada con interferón después de la administración intravenosa de interferón. El suministro local de gen beta-interferón al pulmón (quizá mediante P986 suministro en aerosol de un vector de adenovirus recombinante) podría ser eficaz sin la toxicidad observada después del suministro sistémico de la proteína. Se ha observado, in vitro, la inhibición en proliferación de carcinoma pulmonar de célula pequeña utilizando proteína beta-interferón. La proteína alfa-interferón inhibe el crecimiento de xenoinjertos en cáncer de mama en ratón desnudo. El beta-interferón podría ser beneficioso contra el cáncer de mama debido no sólo a sus efectos antiproliferativos sino que también debido a su inducción de receptores de estrógeno y receptores de progesterona in vivo para sensibilizar carcinomas de mama al tamoxifeno anti estrógeno. Presento datos a partir de experimentos que utilizan terapia génica de ß-IFN en un modelo de carcinoma de mama humano en ratón (Ver Ejemplos 3 y 4) . Cáncer ovárico, es un posible blanco de enfermedad. La proteína beta-interferón parece ser menos activa que el alfa-interferón en la inhibición de la proliferación de células de cáncer ovárico cultivadas. La terapia, en este caso, podría hacerse mediante instalación del vector de terapia génica en el peritoneo ya que este tipo de tumor tiende a llenar la cavidad peritoneal. En resumen, las proteínas interferón han demostrado propiedades anti-oncogénicas en varias P98S situaciones, aunque los resultados clínicos del uso de proteína interferón no son uniformemente positivos. Las proteínas a-IFN y ß-IFN se han probado junto con quimioterapéuticos convencionales y han demostrado sinergia con estos fármacos en muchas indicaciones que incluyen células de cáncer cervical, células de carcinoma de laringe, células de leucemia, carcinomas celulares renales, adenocarcinoma de colon y mieloma. También se cree que los interferones poseen actividad anti-angiogénesis . Existe una correlación inversa entre niveles de ß-IFN locales y la capacidad angiogénica. Algunos datos indican que es necesario un nivel sostenido de proteína ß-interferón para la inhibición de angiogénesis. En ese caso, la terapia génica de interferón sería preferible a la terapia de proteína en la que los altos niveles de proteína interferón disminuyen muy rápido hasta niveles bajos o no detectables .

C. Modelos Animales para Terapia Génica Las personas que tienen experiencia ordinaria en el campo técnico tendrán conocimiento de los muchos modelos animales que se encuentran disponibles para terapia génica in vivo y ex vivo. El modelo de cáncer en roedor más comúnmente utilizado es el modelo de xenoinjerto tumoral humano en ratones desnudos (nu/nu/ . Las células de cáncer humano se propagan en cultivo y P986 se transfectan o infectan con un gen que codifica interferón operativamente enlazado a las secuencias de control de expresión apropiadas. Estas células son entonces inyectadas en un ratón desnudo. Típicamente, las células tumorales se inyectan subcutáneamente en el lomo del ratón conduciendo a la formación de una masa tumoral sólida (Ver Ejemplo 1) . Alternativamente, las células tumorales podrían inyectarse ortotópicamente en el órgano en el que ellas se encontrarían en forma natural (células de cáncer pulmonar se inyectarían en el pulmón; células de carcinoma de colon en el colon, etc.) . El crecimiento tumoral se puede seguir entonces midiendo el diámetro de la masa tumoral con respecto al tiempo (Ver Ejemplo 2) . Okada et al., (1996) Gene Therapy 3, 957-964 formaron gliomas experimentales en ratones mediante inyección estereotáctica intracraneal de células de glioma humano en el cerebro. Después de que se formaron tumores susceptibles de detectarse, un vector AAV que expresa el gen timidina cinasa del virus de herpes simplex (HSV tk) se inyectó directamente en el mismo lugar. La enzima HSV tk convierte el análogo de nucleósido no tóxico ganciclovir (GCV) en un metabolito tóxico. Después de terapia génica, el GCV se administró por via intraperitoneal. Los ratones que recibieron AAV-tk más GCV, pero no AAV control o AAV-tk sin GCV, mostraron una dramática reducción en el tamaño del P986 tumor. La terapia pareció ser segura y eficaz. También se han utilizado adenovirus recombinantes (AdV) en el tratamiento de tumores sólidos en modelos animales y en pruebas clínicas humanas previas. Muchos de estos estudios utilizaron modelos de xenoinjertos ratón desnudo/humano . Algunos ejemplos de estos experimentos en modelos se enuncian adelante. Clayman et al. (1995) Cáncer Research 55, 1-6 fijó un modelo de carcinoma de células escamosas de cuello y cabeza en ratones desnudos. Ellos encontraron que el adenovirus que expresa p53 tipo nativo impide la formación de estos tumores. Hirschowitz et al. (1995) Human Gene Therapy 6, 1055-1063 introdujo células de carcinoma de colon en ratones desnudos. Después de que los tumores se establecieron, ellos inyectaron estos tumores directamente con adenovirus que expresa el gen citosina deaminasa de E. coli (CD) entonces administraron 5-fluorocitosina (5FC) en forma sistémica (CD más 5FC es una combinación enzima/pro-fármaco similar a tk más GCV) . Ellos observaron una reducción de 4 a 5 veces el tamaño del tumor . Zhang et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:4513-4518 formaron tumores de mama humanos en ratones desnudos. Estos tumores se inyectan directamente con adenovirus que expresa alfa-interferón. Ellos observaron regresión del tumor en P986 100% de los animales. Ko et al. (1996) Human Gene Therapy 7:1683-1691 formaron tumores de próstata humanos en ratones desnudos y encontraron que la inyección intratumoral directa de adenovirus que expresa p53 tipo nativo inhibieron el crecimiento del tumor. Todos los ratones tratados permanecieron libres de tumor por lo menos 12 semanas después de la suspensión del tratamiento. Bischoff et al. (1996) Science 274:373-376 formaron carcinoma cervical humano y tumores glioblastoma en ratones desnudos. Ellos trataron estos ratones con adenovirus que tenía una eliminación del gen E1B. En ausencia de ElB, el adenovirus selectivamente extermina células tumorales deficientes en p53. Cuando se inyecta directamente en los tumores, este adenovirus ocasiona regresión del tumor en 60% de los animales . Ohwada et al. (1996) Human Gene Therapy 7, 1567-1576 inyectaron células de carcinoma de colon humano en el hígado de ratones desnudos para imitar metástasis de cáncer de colon en el hígado. Ellos inyectaron entonces adenovirus que expresa CD en el hígado cerca del tumor. El tratamiento sistémico con 5FC suprimió el crecimiento tumoral en estos animales. Los modelos de cáncer también se pueden establecer en ratones y ratas inmunocompetentes . Estos tumores se pueden establecer a partir de células P986 tumorales singénicas que se inyectan en los ratones. Alternativamente, los tumores pueden derivar de células endógenas. En estos casos, los tumores endógenos podrían ser debidos al tratamiento del animal con un carcinógeno o alternativamente, pueden formarse de manera espontánea debido a los antecedentes genéticos del ratón (por ejemplo, deficiente en p53) . Siguen algunos ejemplos. Elshami et al. (1996) Human Gene Therapy 7, 141-148 trataron mesotelioma endógeno en ratas inmunocompetentes con adenovirus que expresa el gen tk. El virus se inyectó en el espacio pleural y después se administró GCV sistémicamente. Ellos demostraron una dramática disminución en el peso del tumor y un aumento en el tiempo de supervivencia. Eastha et al (1996) Human Gene Therapy 7, 515-523 implantaron líneas celulares de tumor de próstata de ratón singénico por vía subcutánea en ratones inmunocompetentes. Ellos inyectaron directamente adenovirus tk en el tumor y trataron sistémicamente con GCV. Los autores reportaron disminución en el tamaño del tumor y vida prolongada. Bramson et al. (1996) Human Gene Therapy 7, 1995-2002 inyectaron adenovirus que expresa citocina IL-12 directamente en tumores de mama endógenos de ratón. Encontraron que 75% de los ratones tuvieron regresión de los tumores y 33% permanecieron libres P986 después de un largo período de tiempo. Riley et al. (1996) Nature Medicine 2, 1336-1341 inyectaron adenovirus que expresa el gen de retinoblastoma directamente en tumores melanotrópicos de pituitaria que surgieron espontáneamente en ratones Rb+/-. Encontraron disminución en la proliferación celular tumoral, disminución en el crecimiento del tumor y duración de vida prolongada en los animales tratados . Los vectores retrovirales son los primeros vectores utilizados en pruebas clínicas de terapia génica humana. Un reporte que es relevante para la presente solicitud es el de Roth et al. (1996) Nature Medicine 2 , 985-991. Ellos generaron retrovirus recombinantes que expresaban el gen p53 tipo nativo. Este virus se introdujo mediante inyección intratumoral directa utilizando una aguja insertada en un broncoscopio . De los nueve pacientes, tres mostraron regresión tumoral mientras que otros tres pacientes mostraron estabilización del crecimiento del tumor.

D. Otras Modalidades Las células genéticamente modificadas se administran, por ejemplo, por inyección intraperitoneal o implantando las células o un injerto o cápsula que contiene las células en un lugar del receptor compatible con las células. En el sentido en el que se P986 utiliza en la presente, "lugar compatible con las células" se refiere a una estructura, cavidad o fluido del receptor en el cual se pueden implantar la (las) célula(s) genéticamente modificada (s) , el injerto celular o el sistema de expresión celular encapsulado, sin disparar consecuencias fisiológicas adversas. Los lugares compatibles con las células que son representativos, incluyen por ejemplo, las cavidades peritoneal, pleural y pericardial así como un tumor sólido del cual se derivan las células o el órgano del cual se extirpó el tumor. Las células genéticamente modificadas se implantan en un lugar compatible con las células, solas o en combinación con otras células genéticamente modificadas. Así, la presente invención abarca un método para modificar el sistema de un receptor utilizando una mezcla de células genéticamente modificadas, de manera que una primera célula modificada expresa un primer interferón y una segunda célula modificada expresa un segundo interferón u otra proteína secretada. Se pueden adicionar otros tipos de células genéticamente modificadas (por ejemplo, hepatocitos, células de músculo liso, fibroblastos, células gliales, células endoteliales o queratinocitos), junto con las células genéticamente modificadas, para producir la expresión de un conjunto complejo de genes introducidos. Además, se puede P986 introducir más de un gen recombinante en cada célula genéticamente modificada en el mismo o en diferentes vectores, mediante lo cual se permite la expresión de varios interferones por una sola célula. La presente invención además abarca un injerto celular. El injerto comprende una pluralidad de las células genéticamente modificadas descritas arriba unidas a un soporte que es adecuado para implantación en un receptor mamífero. El soporte puede estar formado de un material natural o sintético. En otra modalidad, el injerto comprende un parche de peritoneo. Según esta modalidad, el soporte es la matriz que se encuentra en forma natural la que mantiene la pluralidad de células genéticamente modificadas juntas. Alternativamente, el injerto comprende una pluralidad de las células arriba descritas unidas a un substituto de la matriz que se encuentra en forma natural (por ejemplo, Gelfoam (Upjhon, Kalamazoo, Mich.), Dacron, Cortex®. Según otro aspecto de la invención, se proporciona un sistema de expresión celular encapsulado. El sistema encapsulado incluye una cápsula adecuada para implantación en un receptor mamífero y una pluralidad de las células mesoteliales genéticamente modificadas arriba descritas contenidas allí. La cápsula puede estar formada de un material sintético o de uno que se encuentre en forma natural. La formulación de dichas cápsulas es conocida para P986 alguien con experiencia ordinaria en el campo técnico. En contraste con las células que se implantan directamente en el receptor mamífero (es decir, implantadas de tal manera que las células genéticamente modificadas están en contacto físico directo con el lugar compatible con las células) , las células encapsuladas permanecen aisladas (es decir, no están en contacto físico directo con el lugar) después de la implantación. Así, el sistema encapsulado no está limitado a una cápsula que incluye células no inmortalizadas genéticamente modificadas, sino podrá contener células inmortalizadas genéticamente modificadas .

VI . Formulaciones En una modalidad preferida, la preparación de células genéticamente modificadas contiene una cantidad de células suficiente para suministrar al receptor in situ una dosis terapéuticamente eficaz de interferón. La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz de un interferón específico en condiciones conocidas, queda al alcance de alguien con experiencia ordinaria en la técnica sin necesidad de una experimentación excesiva. Así, para determinar la dosis eficaz, alguien con experiencia ordinaria consideraría el estado del paciente, la severidad del estado, así como los resultados de estudios clínicos del interferón P986 específico que se va a administrar. Si el gen o las células genéticamente modificadas no están todavía presentes en un vehículo farmacéuticamente aceptable ellas se colocan en un vehículo de ese tipo antes de la administración en el receptor. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, solución salina isotónica y otros amortiguadores que sean apropiados para el paciente y la terapia. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a uno o más ingredientes, naturales o sintéticos, con el cual se combina el polinucleótido aislado que codifica el interferón para facilitar su aplicación. Un vehículo adecuado incluye solución salina estéril, aunque otras soluciones estériles acuosas o no acuosas y suspensiones estériles que se sabe son farmacéuticamente aceptables, son conocidas por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. A este respecto el término "vehículo" abarca cualquier plásmido y vectores de expresión viral. Una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que es capaz de . mejorar o retrasar el avance del estado de enfermedad, degenerativo o dañado. Una cantidad eficaz puede determinarse con una base individual y en parte se basa en la consideración de los síntomas que se va a tratar y en los resultados que se buscan. Una cantidad eficaz puede ser determinada por alguien con P986 experiencia ordinaria en la técnica empleando dichos factores y utilizando no más que una experimentación de rutina . En métodos preferidos, una cantidad eficaz de secuencia de polinucleótido de interferón contenida dentro de su vector concomitante (es decir "vehículo") podrá ser administrada directamente a una célula blanco o tejido tumoral por medio de inyección directa con una aguja o mediante un catéter u otro tubo de suministro colocado en el cáncer o tumor o vaso sanguíneo que alimenta al tumor. La dosificación dependerá principalmente de factores como la condición que se va a tratar, el interferón seleccionado, la edad, peso y salud del sujeto y de esta manera podrá variar entre los sujetos. Si se emplea un vector de terapia génica viral, se cree que una cantidad eficaz para un sujeto humano está en el intervalo de aproximadamente entre 0.1 y 10 ml de solución salina que contiene entre aproximadamente 1 x 107 y 1 x 1012 unidades formadoras de placa (pfu) /ml de interferón que contiene los vectores de expresión virales. Como se comentó arriba, el gen IFN se podría administrar mediante inyección directa en tumores sólidos. Alternativamente, el suministro en los tumores se podría hacer mediante infusión en un vaso sanguíneo que alimenta al tumor. También es posible la administración parenteral del vector. Los P986 polinucleótidos que codifican el interferón podrán administrarse por vía tópica, intraocular, parenteral, intranasal, intratraqueal, intrabronquial, intramuscular, subcutánea y por otros medios. La administración parenteral incluirá intravenosa, intramuscular, intraperitoneal y subcutánea. Un enfoque más sofisticado podría ser la administración parenteral de un virus o conjugado químico que se localiza en un tipo de tumor distinto debido al tropismo natural o debido a la presencia de una molécula de superficie que se une a un receptor que solamente se encuentra en cierto tipo de tumores. Tal como se describe arriba, la presente invención proporciona métodos para formar un sistema de expresión celular que expresa un producto génico (por ejemplo, un interferón) en un receptor mamífero, el sistema de expresión producido por el mismo y las composiciones farmacéuticas que lo contienen. Los Ejemplos siguientes están dirigidos a demostrar la viabilidad de la terapia génica celular en un sistema de modelo animal .

Ejemplo 1: Modelo Animal Ejemplificativo Se lleva a cabo en forma conveniente la prueba in vivo de polinucleótidos que tienen la capacidad de expresar interferón en un modelo animal . Los tumores se forman en ratones desnudos inyectando en los ratones P986 líneas celulares tumorales humanas . Los ratones desnudos (cepa nu/nu) son inmunodeficientes y no rechazarán las células tumorales extrañas. Los tumores se forman en 1 a 2 semanas después de la inyección de células, aunque el tiempo exacto depende del número de células inyectadas y la tumorigenicidad de las líneas celulares. Los polinucleótidos que expresan interferón se introducen en las células tumorales mediante procedimientos de transfección convencionales en cultivo antes de la inyección en los ratones. Alternativamente, el polinucleótido apropiado se podría introducir en el tumor mediante transfección o transducción viral in vivo después de que los tumores se hayan formado en los ratones . Nada más como un ejemplo, las células utilizadas son o bien la línea celular de carcinoma de vejiga HTB9 (Huang et al., arriba) o la línea celular de retinoblastoma WERI-Rb27 (ambas Takahashi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:5257-5261, 1991. Para el suministro del polinucleótido aislado que codifica el interferón en cultivo, las células tumorales se transfectan (utilizando un procedimiento convencional como precipitación con fosfato de calcio, electroporación o transfección de lipofectamina) o se infectan directamente (utilizando un retrovirus, adenovirus, baculovirus o virus adeno-asociado) . En el caso de una infección viral eficaz en la que 100% de P986 las células han incorporado satisfactoriamente el polinucleótido, no se requiere selección de células. Además, se ha descubierto (Ejemplo 3) que solamente un pequeño porcentaje de células necesitan expresar el gen interferón, de manera que usualmente no se requerirá la selección del fármaco. Si la selección se lleva a cabo en el caso de transfecciones que no han sido tan eficaces como las infecciones virales descritas aquí, las células se transfectan con un vector de expresión que codifica tanto para un gen resistente a fármacos (como el neo gen que codifica resistencia a G418) como para un polinucleótido como el gen de interferón. Una transfección de control es un vector que codifica al gen resistente a fármacos, solo. Después de aproximadamente entre 2 y 3 semanas de selección en el medio que contiene el fármaco, las colonias de células se mezclan y se inyectan subcutáneamente en el costado de ratones hembra nu/nu (desnudos) en un número de células de aproximadamente 10s en un volumen de aproximadamente 100 ul . Las células infectadas con virus se inyectan directamente sin necesidad del paso de selección. Los ratones se mantienen posteriormente por al menos dos meses y se monitorea el tamaño del tumor semanalmente utilizando calibradores . Alternativamente, las células tumorales sin P986 infectar o sin transfectar se inyectan subcutáneamente en el costado de los ratones. Después de la formación del tumor, el ADN o el virus que contienen un polinucleótído que codifica un interferón se inyectan directamente a los tumores. Para este procedimiento son adecuados muchos virus, aunque los adenovirus recombinantes son los más eficaces y los retrovirus recombinantes tienen la ventaja de estar establemente integrados en el genoma de la célula. El ADN se puede introducir en las células mezclando el ADN con liposomas catiónicos e inyectando la mezcla. El ADN o los virus que no contienen el gen interferón se inyectan en tumores de otros ratones para que sirvan como control. El avance o reducción del tumor se monitorea con calibradores.

Ejemplo 2: Modelo de Carcinoma Pulmonar Ejemplificativo Como otro ejemplo, el tratamiento de carcinoma pulmonar de célula pequeña humano con polinucleótido aislado, encapsulado en liposoma, que codifica interferón se podría realizar in vivo introduciendo un polinucleótido que codifica interferón, en las células que necesitan dicho tratamiento, utilizando liposomas, en particular aerosoles de liposomas de partícula pequeña. Administrado por medio de aerosoles, el polinucleótido que codifica interferón es depositado P986 uniformemente en la superficie nasofaríngea, el árbol traqueobronquial y en el área pulmonar. Ver, Knight and Gilbert, Eur. J. Clin. Micro and Infect. Dis., 7:721-731 (1988) para estudio de aerosoles de liposomas. Para tratar cánceres pulmonares de esta manera, el polinucleótido que codifica interferón se purifica, por cualquier otro método conveniente. El polinucleótido que codifica interferón se mezcla con liposomas y se incorpora en ellos con alta eficiencia. Puesto que el suministro en aerosol es moderado y bien tolerado por los voluntarios y pacientes normales, los liposomas que contienen el polinucleótido que codifica interferón se administran para tratar pacientes que sufren de cánceres pulmonares en cualquier etapa. Los liposomas son suministrados mediante inhalación nasal o mediante un tubo endotraqueal conectado a un nebulizador a una dosis suficiente para inhibir el crecimiento del tumor. Los tratamientos de aerosolización se administran diariamente durante dos semanas, con repetición si fuera necesario. Los estudios in vivo utilizando carcinoma pulmonar de célula pequeña ortotópico se podrían llevar a cabo mediante tumor inyectado en el bronquio principal derecho de ratones desnudos (nu/nu) atímicos (aproximadamente 1.5 x 106 células por ratón) . Tres días después, los ratones comienzan un programa de tratamiento (diario durante tres días consecutivos) de P986 ser inoculados endobronquialmente con gen interferón encapsulado en liposomas y controles que carecen de las secuencias de gen interferón. Se da seguimiento a la formación del tumor y el tamaño en ambos tratamientos mediante medición con calibradores y se evalúa la supervivencia de los ratones .

Ejemplo 3. Terapia génica Ex Vivo con Gen beta- Interferón la En este Ejemplo, utilicé la línea celular de carcinoma de mama humano MBA-MD-468 (obtenido de American Type Culture Collection) . Las células o bien son sin infectar o infectadas con un adenovirus que expresa el gen beta-interferón la humano. En este caso, el adenovírus tiene eliminados los genes El y tiene una mutación sensible a la temperatura en el gen E2a. Los métodos para generar este adenovirus particular se pueden encontrar en Engelhardt et al., (1994), Gene Therapy 5: 1217-1229 (ver también abajo para detalles adicionales) . Brevemente, el gen beta-interferón la fue clonado previamente en el vector adenoviral pAdCMVlinkl de manera que la transcripción genética sería dirigida por el promotor CMV IE1, creando por ello un plásmido de transferencia de adenovirus. El gen fue insertado en este vector en lugar del gen El eliminado. Un adenovirus recombinante que tiene este gen interferón se genera por recombinación del plásmido de P986 transferencia y el genoma adenoviral en células 293. El virus es purificado en placa y titulado en ensayos en placa por métodos convencionales. Materiales y Métodos Cultivo Celular. Células de Carcinoma Humano MDA-MB-468, Huh7 , KM12LA4, ME180, HeLa, U87 y 293 se conservan como cultivos adherentes en medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene 10% de suero bovino, glutamina 2 mM, penicilina y estreptomicina, aminoácidos no esenciales y vitaminas. Generación de Adenovirus Purificados. Un vector de transferencia de adenovirus que codifica el gen ßlFN guiado por el promotor temprano del citomegalovirus, pAdCMV-huIFNß, se construye mediante ligación de un inserto de ADNc que codifica ßla-IFN en el plásmido pAdCMVlinkl (ver Engelhardt et al., 1994, arrija) . El plásmido pAdCMV-huIFNß es co-transferido en células 293 con ADN genómico purificado a partir del adenovirus sensible a temperatura H5tsl25. Los adenovirus recombinantes provenientes de placas individuales se usan para infectar células 293 a 39°C. y los sobrenadantes se analizan para la expresión del gen ß-IFN mediante ensayo ELISA. Se identifica y después se amplifica un adenovirus que lleva el ADNc de ß-IFN (H5.110 IFNß) . Del mismo modo, se hace un adenovirus de control E2A sensible a temperatura que codifica el marcador colorimétrico ß-galactosidasa P986 (H5. HOIacZ) . Las preparaciones de virus se hacen en células 293 y se purifican en gradiente de CsCl después de dos rondas de aislamiento en placa. Ellos mostraron ser negativos con respecto a la presencia de adenovirus tipo nativo. Células subconfluentes se infectan con H5. llO-hlFNß a una multiplicidad de infección (MOI) de 100 en 3 ml de medio conteniendo suero bovino al 2%. De quince a dieciocho horas más tarde, se recolectaron los sobrenadantes y se cuantificó la concentración de ß-IFN mediante prueba ELISA. Prueba ELISA. Placas de 96 cavidades se recubren durante toda la noche a 4°C con un anticuerpo anti-ß-IFN humano, B02 (Summit Pharmaceuticals Co . , Japón) . El anticuerpo se utiliza a 10 µg/ml en el amortiguador de recubrimiento que contiene 50mM Bicarbonato de sodio/carbonato, MgCl2 0.2mM y CaCl2 0.2mM (pH 9.6) . Después las placas se bloquean con caseína 1% en PBS (por las siglas en inglés de Phosphate Buffered Saline, solución salina amortiguada de fosfato) por 1 hora a temperatura ambiente, se añaden muestras de ß-IFN de patrones de proteína ß-IFN (AvonexMR, Biogen) , diluidas en caseína al 1% y Tween 20 al 0.05%. Las placas son entonces sucesivamente incubadas a temperatura ambiente por 1 hora con un suero de conejo anti-ß-IFN (dilución 1:2000), 1 hora con anticuerpo anti-conejo de asno conjugado con P986 peroxidasa de rábano (HRP) (Jackson Immuno Research, dilución 1:5000) y la solución sustrato (TMB 4.2 mM y acetato de sodio ácido cítrico 0.1 M pH 4.9) . Después de que la reacción se detuvo con H2S04 2N, se midió la absorbancia a 450 nm. Experimentos con Ratón. Se obtuvieron ratones hembra Balb/c nu/nu de 4 a 6 semanas de edad de las granjas Taconic (Boston, Massachusetts) . Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones para animales Biogen libres de patógenos por al menos 2 semanas antes del experimento. Para los experimentos ex vivo, las células infectadas y sin infectar se recolectaron con solución tripsina/EDTA y se lavaron 2 veces con PBS. Estas células se mezclaron justo antes de inyectarse a los ratones en las proporciones descritas abajo. Se implantan subcutáneamente un total de 2 x 106 células en 100 µl de PBS en el costado derecho. El tamaño del tumor se mide en longitud y ancho utilizando calibradores y se presenta como el diámetro promedio del tumor (mm) . Para los experimentos de inyección directa in vivo (Ejemplo 4), primero se implantan subcutáneamente 2 x 106 células tumorales en 100 µl de PBS en ratones desnudos . Cuando el tamaño del tumor alcanzó entre 5 y 5 mm de diámetro, 100 µl de PBS que contenía diversas dosis de adenovirus recombinantes se inyectan directamente en el centro del tumor en una sola P986 8 inyección. Los tumores se monitorean en longitud y ancho utilizando calibradores. El tamaño del tumor se calcula promediando la longitud y el ancho. La defunción animal se define por el sacrificio de ratones en los que el tumor comenzó a mostrar signos de sangrado o que llegó a 10% del total de peso corporal. La apoptosis se examinó utilizando el equipo In Si tu Apoptosis Detection Kit proporcionado por Oncor, Inc. (Catálogo # S7110-KIT) . Resultados. Evalué inicialmente la eficiencia de transducción y la expresión transgénica de los vectores de adenovirus . Las células de carcinoma de mama MDA-MB-468 se infectan con H5.1101acZ a multiplicidades de infección (MOI) crecientes. Después de tinción X-gal, estimé que a una MOI de 100, la eficiencia de transducción llegó a aproximadamente 100% en esas células (no se muestran datos). Así, las células de carcinoma de mama se infectan en cultivo en una proporción de 100 unidades formadoras de placa (pfu) por célula ya que nuestra experiencia con esas células de carcinoma indicaron que está fue la más baja proporción virus : célula que llevaría a la expresión del gen en toda célula en la población. Para el primer experimento, 18 horas después de la infección, se inyectan subcutáneamente 2 x 106 células en el costado de cada ratón desnudo. Cinco ratones se inyectaron con células sin infectar y cinco P986 ratones se inyectaron con células infectadas con adenovirus ß-IFN. En todos los ratones inyectados con células de control sin infectar surgieron tumores de tamaño significativo. No aparecieron tumores en ninguno de los ratones inyectados con células tratadas con adenovirus que expresa ß-IFN (H5.110i2lFNß : Tabla 1). Para descartar la posibilidad de que la exposición in vi tro de células tumorales a la proteína ß-IFN pudiera llevar a la pérdida de tumorigenicidad in vivo, traté células MDA-MB-468 con proteína ß-IFN a la concentración de proteína que fue detectada después de 18 horas de infección viral. Después de lavar perfectamente, se inyectaron a ratones desnudos, igual número de células tratadas o sin tratar o la mezcla que contenía 10% de células tratadas. Se observó desarrollo tumoral en los tres grupos de ratones (no se muestran datos) , indicando que el suministro ex vivo del gen ß-IFN, pero no el tratamiento con proteína in vi tro, es crítico para la inhibición de la formación del tumor. Para determinar si las células cancerosas que expresan el gen ß-IFN podrían llevar a la destrucción de las células no transducidas, se realizó el siguiente experimento. Las mismas células cancerosas ya sea sin infectar, infectadas con adenovirus que expresa el gen ß-IFN (H5. HO lFNß) o infectadas con el mismo tipo de adenovirus pero que expresa el gen lacZ (H5.1101acZ) que codifica la proteína reportera ß-galactosidasa de P98ff la que no se esperaría que tuviera algún efecto anticáncer y por lo tanto, es un control para cualquiera de los efectos por el adenovirus en sí. Todas las infecciones de adenovirus se hacen en una relación pfu: célula de 100. Por separado infecté células tumorales MDA-MB-468 con H5.110?lFNß o H5.1102acZ a una MOI de 100. A las 18 horas después de la infección, las células infectadas se recolectaron y una porción de ellas se mezcló con células sin infectar justo antes de inyectarse a los ratones. Ratones Balb/c desnudos se implantaron subcutáneamente con igual número de células infectadas, células sin infectar o una mezcla que contenía 10% de células infectadas que no se expusieron al virus. El crecimiento tumoral se monitoreó doce días más tarde. Mientras que todos los ratones implantados con células sin infectar desarrollaron tumores, no se observaron tumores en ratones que recibieron células 100% infectadas H5.11022lFNß o H5.1102acZ, lo que sugiere que la infección con cada virus puede suprimir la tumorigenicidad (Tabla 1) . Sin embargo, todos los ratones que recibieron células 10% infectadas con H5.110IacZ desarrollaron tumores, mientras que todos los ratones que recibieron células 10% infectadas con H5.110 IFNß fallaron para hacerlo. Por lo tanto, la infección con H5.1102acZ, aunque suficiente para suprimir la formación tumoral de las células ya infectadas, falló para bloquear la tumorigenicidad de las células co-inyectadas nativas y sin infectar. En contraste, la transducción por H5.110 IFNß en 10% de células fue suficiente para suprimir la tumorigenicidad de las células que habían sido transducidas por el virus así como aquellas que no habían sido transducidas. La inhibición en la formación del tumor por H5.110IacZ en la población 100% transducida podría deberse a algunos efectos tóxicos generales o a algunos efectos anti-tumorales de esta generación de adenovirus, pero debe observarse que las células transducídas tuvieron fueron capaces de replicación in vitro (datos no publicados) . Para establecer la cantidad de virus que contienen interferón necesaria para suprimir la tumorigenicidad, las células tumorales infectadas con H5.110i?IFNß y H5.1102acZ por separado, se mezclaron en varias proporciones con células sin infectar de manera que hubiera un exceso de células sin infectar en cada caso. Las mezclas son tales que las diferentes muestras consistían de 10%, 3%, 1%, 0.3% de células infectadas con adenovirus y el resto células sin infectar. Inmediatamente después de mezclar, las células se inyectan en ratones desnudos . Los resultados se muestran en la Tabla 1. Los diámetros del tumor miden en dos dimensiones a varios tiempos después de la inyección de las células. Cada dato en la Tabla 1 representa la desviación estándar promedio +/- de las P986 mediciones del diámetro lateral y longitudinal de cuatro ratones. Las mediciones se hacen en los días 12, 19, 26 y 33 después de la inyección de las células tumorales . Tabla 1 romedio de diámetro del tumor (en mm) El desarrollo del tumor se bloqueó completamente en ratones que recibieron tan poco como 1% de células transducidas H5.1102-IFNß (Tabla 1). En la primera semana después de la inyección de las células, se pudieron detectar tumores muy pequeños (éstos son palpables, pero no lo suficientemente grandes para ser medidos) en los ratones inyectados con 10, 3 y 1% de H5. HOiiIFNß . Sin embargo, todos estos tumores pequeños retrocedieron alrededor del día 9. Esto sugiere que algunas células sobrevivieron por un corto tiempo y expresaron el gen ß-IFN durante este período, conduciendo a la muerte de todo el tumor. En los varios experimentos llevados a cabo con esta línea celular en ratones desnudos, nunca se ha observado formación tumoral cuando 1% de células fueron transducidas con H5.110-IFNß y la supervivencia ha sido 100% (no se muestran datos) . Los ratones que recibieron 0.3% de células transducidas con H5.110-IFNß desarrollaron tumores, sin embargo, el tamaño de estos tumores fue significativamente más pequeño que los de los ratones de control y 2 de los 5 ratones en este grupo 0.3% tuvieron regresión completa por el día 33 (Tabla 1) . En contraste, los ratones que recibieron de 10% a 0.03% de células tratadas con H5.1101acZ desarrollan tumores con tamaños similares que el grupo sin infectar y no se observó regresión tumoral en cada uno de estos grupos de control (Tabla 1) .

P986 Claramente, la expresión de beta interferón humano (ß-IFNh) pareció bloquear la tumorigénesis en sólo un muy pequeño porcentaje de células en ratones desnudos. Posteriormente examiné la proporción más baja para células infectadas con H5.110. IFNß requeridas para afectar, pero no necesariamente bloquear, la formación tumoral y promover supervivencia en el ratón. Se implantaron igual número de células MDA-MB-468 que contenían 0.3%, 0.1%, 0.03%, 0.01% y 0% de células H5.110i-IFNß infectadas, en ratones desnudos y se monitoreó el crecimiento tumoral. Los ratones que recibieron 0.3% o 0.1% de células infectadas desarrollaron tumores mucho más pequeños en comparación con aquellos que recibieron solamente células sin infectar (Figura lA) . De los tumores que se formaron a 0.3 y 0.1% de transducción, 3 de 5 y 1 de 5 tumores, respectivamente, retrocedieron por completo. Se observó supervivencia prolongada significativa en los grupos de 0.3% y 0.1% de transducción. Mientras que la implantación de 0%, 0.01% o 0.03% de células infectadas tuvo como resultado la muerte de todos los animales en 75 días, 1 de 5 y 3 de 5 animales quedaron vivos sin tumor en los grupos 0.1% y 0.3%, respectivamente, al término de este experimento en el día 109 (Figura IB) . Es probable que sólo una pequeña porción (mayor a aproximadamente 0.3%, de preferencia mayor a aproximadamente 1.0%) de todas las células tumorales P986 necesitará ser transfectada o infectada para que tenga eficacia. Esto se distingue de los enfoques de terapia génica anti-cáncer como el suministro de supresores de tumor de tipo nativo (por ejemplo, p53) en la que cada célula en el tumor necesitará obtener el gen supresor del tumor. Así, el gen interferón demostró un potente efecto antiproliferativo in vivo después de infección in vi tro . Los controles indican que esto se debe al interferón más bien que al adenovirus . Terapia génica con ß-IFN ex vivo en otros tumores xenoinierto humanos También probé los efectos de transducción con H5.110?IFNß en otros tipos de células tumorales en el modelo de xenoinjerto humano ex vivo . Células de carcinoma de colon humano KM12L4A, células de carcinoma hepático humano Huh7 o células de carcinoma cervical humano ME180 fueron transducidas con H5. HOhlFNß . Igual número de células que contenían 10%, 1% o 0% de células transducidas se analizaron para detectar su habilidad para formar tumores en ratones desnudos . La inyección de células sin infectar de los tres tipos ocasiona la formación de tumores de crecimiento rápido en todos los ratones. En contraste, el suministro ex vivo de 10% de células H5.110iaIFNß a infectadas condujo o bien al no desarrollo tumoral o a retrasar la aparición o diminuir el crecimiento de los tumores en todos los animales P986 examinados (Figura 2A) . A diferencia de los resultados obtenidos con las células MDA-MB-468 en las que 1% de transducción por H5.110hIFNß impidió por completo la formación de tumor, el 1% de transducción en estos tres tipos de células dio por resultado la formación de tumores, aunque sus tamaños son menores que los controles sin infectar en cada punto de tiempo. Los ratones que recibieron 10% y 1% de células transducidas mostraron supervivencia prolongada en comparación con aquellos que recibieron células sin infectar (Figura 2B) . Así, el suministro de gen ß-IFN mediado por adenovirus ex vivo en varias células tumorales diferentes, tuvo como resultado la inhibición eficaz de tumorigenicidad y condujo a un tiempo aumentado de supervivencia del animal .

Ejemplo 4: Terapia génica In Vivo con Gen beta la- Interferón En lugar del enfoque ex vivo, se puede llevar a cabo la terapia génica in vivo directa. En la terapia génica in vivo, el gen se administra directamente al paciente. En este Ejemplo, el adenovirus que tiene el gen ß-IFN (H5. HOhlFNß) humano se inyecta directamente en tumores sólidos. Brevemente, 2 x 105 células de carcinoma de mama humano MBA-MD-468 se inyectan subcutáneamente en el costado de cincuenta ratones desnudos . Se forman tumores subcutáneos de P986 aproximadamente 5-6 mm de diámetro en los ratones desnudos 24 días después de la inyección subcutánea de células MDA-MB-468. En este momento, los tumores se trataron con PBS o los vectores H5.110JaIFNß H5.1102acZ a varias dosis virales que variaban entre 1 x 107 y 3 x 109 pfu/ratón, en una sola inyección intratumoral . Los datos que se muestran en la Figura 3 indicaron que en los primeros 14 días, el tratamiento de dosis simple con H5.110i?IFNß a 3 x 109, 1 x 109 o 10 x 108 pfu total ocasionaron regresión tumoral. La regresión tumoral completa se dio en 4 de 5 ratones en el grupo de tratamiento de 3 x 109 pfu y en 3 de 5 animales en el grupo de tratamiento de 1 x 109 pfu. En tumores inyectados con 1 x 109 pfu de H5.1102zIFNß se puede detectar una concentración local elevada de ß-IFN de aproximadamente 1500 Ul/ml mientras que solamente 37 Ul/ml de ß-IFN se detecta en el suero. Dosis menores de H5. HOialFNß entre las que se incluyen 1 x 108, 3 x 107 y 1 x 107 pfu tienen poco o ningún efecto (Figura 3 y datos no mostrados) ) , lo que indica que la respuesta anti-tumoral es dependiente de la dosis. La inyección de PBS o H5.1102acZ a dosis equivalentes no lleva a la regresión del tumor (Figura 3) . Cuando los tumores se monitorean durante un período de tiempo más largo, se observan crecimiento lento y regresión en algunos tumores individuales inyectados con H5.1102acZ a 3 x 109 pfu, lo que sugiere que el virus de control a esa dosis P986 podría causar ligera inhibición del crecimiento del tumor. El tratamiento con H5. HO lFNß a 3 x 109, 1 x 109 o 3 x 108 pfu aumenta significativamente la supervivencia con relación a ratones tratados con PBS o H5.1102acZ (no se muestran datos). También hemos probado inyecciones múltiples, con 5 inyecciones de 1 x 108 pfu de H5.110 zIFNß administradas cada tercer día en tumores MDA-MB-468 y HeLa establecidos dando como resultado crecimiento más lento y regresión de los dos tipos de tumores (no publicado) . También realizamos un experimento similar in vivo utilizando una línea celular de glioma humano U87. Estas células fueron muy sensibles a ß-IFN ya que se observó regresión completa del tumor en 4 de 4 ratones tratados con 1 x 109 puf H5.110 IFNß y 2 de 4 ratones tratados con 1 x 108 pfu (no se muestran datos) . Estos hallazgos demostraron que el suministro adenoviral directo y local in vivo del gen ß-IFN puede ejercer un efecto anti-tumoral eficaz. Cuatro días después de la inyección con 1 x 109 pfu de virus, los tumores MDA-MB-468 se recolectan para examen histológico. En ese momento, los tumores inyectados con H5.110-IFNß mostraron signos de regresión. Se realizó análisis histológico de los tumores MDA-MB-468 con tinción de hematoxilina-eosina . Se observaron más células apoptóticas en los tumores inyectados con H5.110hIFNß que en el tumor inyectado con H5.1102acZ. Confirmé la apoptosis mediante P986 detección con fluorescencia directa de ADN genómico fragmentado, marcado en el extremo. Se observaron muy pocas células mononucleares de infiltración en los tumores inyectados con H5.110 IFNß o H5.1102acZ, lo que indica que la respuesta celular inmunitaria pudiera no desempeñar un papel importante en la regresión del tumor H5.110hIFNß dirigida en este modelo. Tanto los experimentos ex vivo como in vivo mostrados arriba miden sólo el efecto antiproliferativo directo del interferón. Puesto que éstos son ratones inmunodeficientes, cualquier actividad inmunoestimuladora que tenga el interferón que pudiera estimular la destrucción del tumor no se presentará. También, puesto que los interferones no cruzan especie de humano a ratón, no se esperaría que el ß-IFN humano utilizado para inhibir las células cancerosas humanas en estos ratones inhibiera la angiogénesis ya que el ß-IFN humano no actúa en las células endoteliales vasculares de ratón. Por lo tanto, es posible que una actividad anti-cáncer aún más dramática se observe cuando los pacientes humanos se traten con adenovirus que tiene el ß-IFN humano. Esto podría ser modelado en primates no humanos inmuno competentes. Alternativamente, uno podría utilizar adenovirus que tiene el gen ß-IFN de murino en ratones inmunocompetentes que tengan tumores de origen murino. Muchos de estos modelos de tumor de ratón singénico P986 están disponibles. Los datos proporcionados aquí demuestran una notable habilidad de la terapia génica con ß-IFN para bloquear la formación de tumores de novo así como ocasionar regresión de tumores establecidos. Los experimentos de transducciones ex vivo confirmaron que la introducción de una potente proteína secretada en tan poco como 0.3% a 1.0% de células transducidas bloqueó el establecimiento de tumores MDA-MB-468. Se han probado una variedad de otras líneas celulares tumorales y mientras que hubo una variación en la potencia del efecto del ß-IFN, todo se pudo bloquear con 1 a 10% de células transducidas ß-IFN. Motivado por el relativamente pequeño porcentaje de células secretoras requeridas para impactar la formación del tumor, estimulé entonces tumores preformados con inyección intratumoral directa de adenovirus. Otra vez, el efecto del suministro del gen ß-IFN fue potente con inyecciones simples de virus dando por resultado ya sea regresión parcial del tumor o en algunos casos completa . En estos estudios, la regresión dramática de los tumores pareció ser principalmente el resultado de la actividad antiproliferativa directa o citotóxica del ß-IFN. Esta conclusión está respaldada por el hecho de que el gen ß-IFN utilizado en este estudio es de origen humano y el ß-IFN humano no reacciona considerablemente P986 en forma cruzada con las células de ratón hospederas. También, los ratones desnudos inmunodeficientes que se utilizaron carecen de linfocitos T, una célula efectora mayor en la inmunoestimulación inducida por IFN tipo 1 (Tough, D.F. et al., (1996), Science 272:1947-1950 y Rogge, L. et al., (1997) J. Exp. Med., 185:825-831). Además, en los tumores de regresión rápida posterior al suministro del gen ß-IFN, no se observó aumento evidente en la infiltración de células mononucleares. Estos hallazgos respaldan la noción de que la actividad antiproliferativa mediada por ß-IFN sola podría ser suficiente para ocasionar la regresión del tumor. Nuestros datos parecen ser consistentes con la correlación clínica observada previamente entre la sensibilidad in vivo de células malignas a la actividad antiproliferativa inducida por IFN y el efecto terapéutico in vivo (Einhorn and Grander (1996) J. Interferon Cytokine Res. 16:275-281). En resumen, se ha encontrado que la terapia génica de ß-IFN mediada por adenovirus ejerce un eficaz efecto anti-tumoral en modelos de ratones. El suministro ex vivo del gen ß-IFN a un pequeño porcentaje de células fue suficiente para bloquear la formación del tumor y el suministro del gen ß-IFN intratumoral directo en dosis simple conduce a la regresión de tumores establecidos. Sin que se quiera limitar a alguna teoría de acciones, este potente P986 efecto antitumoral, podría resultar del efecto autócrino y paracrino del ß-IFN. Este efecto antitumoral podría ser un factor crítico en pruebas en cáncer de terapia génica en las cuales es probable que el grado de suministro genético se limite y se requerirá un efecto circunstante significativo. Por lo tanto, la terapia génica con ß-IFN local proporcione una estrategia prometedora para el tratamiento de tumores en humanos.

Equiva1entes Debe entenderse que lo anterior es meramente una descripción detallada de ciertas modalidades preferidas. Por lo tanto debe ser evidente para aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer varias modificaciones y equivalentes sin desviarse del espíritu o alcance de la invención.

Claims (37)

1. REIVINDICACIONES ; 1. Un sistema de expresión celular para expresión in vivo de una proteína interferón en una célula de un receptor mamífero, el sistema de expresión que comprende : una célula de la misma especie que el receptor mamífero; y un vector de expresión contenido allí para expresar la proteína interferón, en donde el vector de expresión es útil para expresar la proteína interferón en una célula para terapia génica humana, en donde el receptor tiene una condición susceptible de tratarse mediante el suministro de la proteína interferón a un sitio del receptor.
2. 2. El sistema de expresión según la reivindicación 1, en donde el receptor mamífero es un humano .
3. 3. El sistema de expresión celular según la reivindicación 1, en donde el vector de expresión comprende un vector viral.
4. 4. Un sistema de expresión celular para expresar en una célula de un receptor mamífero in vivo, una proteína secretada para tratar una condición, el sistema de expresión comprende: una pluralidad de células de la misma especie que el receptor mamífero; y un vector de expresión contenido en las mismas para expresar la proteína P986 secretada, en donde el vector de expresión está contenido solamente en una porción de la pluralidad de células, el vector útil para expresar la proteína secretada para terapia génica humana, en donde la condición es susceptible de tratarse mediante suministro de la proteína secretada a un sitio del receptor.
5. 5. El sistema de expresión celular según la reivindicación 4, en donde la porción es una porción que es por lo menos 1% en número de la pluralidad.
6. 6. El sistema de expresión celular según la reivindicación 5, en donde la porción es una porción que es por lo menos 0.3% en número de la pluralidad.
7. 7. El sistema de expresión celular según la reivindicación 4, en donde la proteína secretada es un interferón.
8. 8. Un sistema de expresión celular que comprende una pluralidad de células cancerosas, por lo menos una porción de la pluralidad de células cancerosas que contiene un vector viral que tiene incorporado en él un polinucleótido aislado que codifica, en expresión, una proteína interferón.
9. 9. El sistema de expresión celular según la reivindicación 8, en donde la por lo menos una porción es al menos 0.3% en número de las células.
10. 10. El sistema de expresión celular según la reivindicación 8, en donde el vector viral es un vector adenoviral seleccionado del grupo de vectores adenovirales que consiste de: (a) un vector adenoviral que tiene una eliminación en su gen El; (b) un vector adenoviral que tiene una eliminación en su gen El y una eliminación o mutación en su gen E2a, el vector que expresa beta-interferón humano; (c) un vector adenoviral que tiene una eliminación tanto en su gen El como E4 y (d) un vector adenoviral que tiene una eliminación en todos sus genes, el vector que expresa beta-interferón humano.
11. 11. Una composición para suministro de una proteína secretada a un sitio de un receptor mamífero, que comprende : una pluralidad de células modificadas genéticamente de la misma especie que el receptor mamífero, por lo menos una porción de las células que contiene un vector de expresión para expresar una cantidad eficaz de la proteína secretada en las células para terapia génica humana.
12. 12. La composición según la reivindicación 11, en donde la por lo menos una porción es al menos 0.3% en número.
13. 13. La composición según la reivindicación 11, en donde la proteína secretada es un interferón.
14. 14. La composición según la reivindicación 11, en donde el vector de expresión comprende un vector viral . P986
15. 15. Un método para hacer una preparación farmacéutica de terapia génica ex vivo para administración en un receptor mamífero, el método que comprende los pasos de: (a) formar una pluralidad de células de la misma especie que el receptor mamífero, (b) introducir un vector de expresión para expresar una proteína secretada en por lo menos una célula de la pluralidad para formar por lo menos una célula modificada genéticamente y en donde el vector de expresión es útil para expresar la proteína secretada en las células para terapia génica humana; y (c) colocar la por lo menos una célula genéticamente modificada en un vehículo farmacéuticamente aceptable para obtener una preparación farmacéutica que es adecuada para administración en un sitio del receptor mamífero, en donde la proteína secretada es para tratar una condición que es susceptible de tratarse mediante el suministro de la proteína secretada a un sitio compatible con la célula.
16. 16. El método según la reivindicación 15, en donde el paso de introducir un vector de expresión en por lo menos una célula comprende introducir un vector de expresión en por lo menos 0.3% en número de la pluralidad de células.
17. 17. El método según la reivindicación 15, en donde la proteína secretada es un interferón. P986
18. 18. El método según la reivindicación 15, en donde el vector de expresión comprende un vector viral.
19. 19. El método según la reivindicación 18, en donde el vector viral es un vector adenoviral.
20. 20. Un método de terapia génica, que comprende modificar genéticamente por lo menos una célula de una receptor mamífero mediante los pasos de (a) introducir un vector de expresión para expresar una proteína secretada en por lo menos una célula para formar por lo menos una célula genéticamente modificada, en donde la célula es de la misma especie que el receptor mamífero y en donde el vector de expresión es útil para expresar la proteína secretada en la célula para terapia génica humana; y (b) dejar que la célula genéticamente modificada entre en contacto con un sitio del receptor mamífero, en donde el receptor mamífero tiene una condición que es susceptible de tratarse mediante el suministro de la proteína secretada al sitio o mediante la administración de la proteína secretada.
21. 21. El método según la reivindicación 20, que además comprende los pasos de extraer la por lo menos una célula del receptor mamífero antes del paso de introducir el vector de expresión.
22. 22. El método según la reivindicación 21, en donde el paso de extraer comprende extraer una pluralidad de células y el paso de introducir el vector P986 comprende introducir un vector a sólo una porción de la pluralidad de células .
23. 23. El método según la reivindicación 20, en donde la proteína secretada es un interferón.
24. 24. El método según la reivindicación 20, en donde el paso de introducir el vector de expresión comprende inyectar directamente el vector en la por lo menos una célula.
25. 25. El método según la reivindicación 20, en donde el paso de introducir comprende introducir el vector de expresión que incluye un promotor inducible para controlar la transcripción del interferón.
26. 26. El método según la reivindicación 20, en donde el vector de expresión comprende un vector viral.
27. 27. El método según la reivindicación 20, en donde el receptor mamífero es un humano.
28. 28. Un método de terapia génica ex vivo, que comprende los pasos de: extraer de un sujeto una pluralidad de células; administrar un adenovirus recombinante a por lo menos una célula de la pluralidad de células, de manera que exista un exceso de células que no contienen el adenovirus, en donde el adenovirus tiene una eliminación o mutación en su gen El, el adenovirus además comprende un polinucleótido aislado que codifica una proteína secretada; y P986 reintroducir la pluralidad de células en el sujeto .
29. 29. El método según la reivindicación 28, en donde por lo menos 10% en número de la pluralidad de células contiene el adenovirus recombinante.
30. 30. El método según la reivindicación 28, en donde por lo menos 3% en número de la pluralidad de células contiene el adenovirus recombinante.
31. 31. El método según la reivindicación 28, en donde por lo menos 1% en número de la pluralidad de células contiene el adenovirus recombinante.
32. 32. El método según la reivindicación 28, en donde por lo menos 0.3% en número de la pluralidad de células contiene el adenovirus recombinantes.
33. 33. El método según la reivindicación 28, en donde la proteína secretada es un interferón.
34. 34. Un método de terapia génica in vivo, que comprende administrar un vector viral que incluye un polinucleótido aislado que codifica para proteína beta-interferón humana directamente a una célula de un sujeto sin que primero se extraiga la célula del sujeto .
35. 35. El método según la reivindicación 34, en donde el paso de administrar comprende administrar por una vía seleccionada del grupo que consiste de administración tópica, administración intraocular, administración parenteral, administración intranasal, P986 administración intratraqueal, administración intrabronquial , administración intramuscular y administración subcutánea.
36. 36. El método según la reivindicación 35, en donde la administración parenteral incluye una vía seleccionada del grupo que consiste de administración intravenosa, administración intramuscular, administración intarperitoneal y administración subcutánea .
37. 37. El método según la reivindicación 34, en donde la célula es una célula tumoral . P986