MXPA00001608A - Conversion microbiana de 2-metil-quinoxalina - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a procedimientos para la oxidación microbiana de la 2-metil-quinoxalina para dar elácido 2-quinoxalina-carboxílico que comprenden poner en contacto 2-metil-quinoxalina con un microorganismo, o un mutante apropiado seéste, e incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para proporcionar una cantidad de dichoácido 2-quinoxalina-carboxílico;los presentes procedimientos comprenden además opcionalmente el aislamiento y la purificación deácido 2-quinoxalina-carboxílico.

Description

CONVERSIÓN MICROBIANA PE 2-METIL-QUINOXAL1NA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevos procedimientos para preparar ácido 2-quinolina-carboxílico y se refiere, más específicamente, a la oxidación microbiana de la 2-metil-quinoxalina para formar el ácido 2-quinoxalina-carboxílico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se conocen en la técnica métodos para la oxidación microbiana de ciertos heterociclos aromáticos y, en particular, para la oxidación microbiana de grupos metilo existentes en ciertos heterociclos aromáticos, tales como, por ejemplo, los que se han descrito en los dos siguientes artículos: "Gene Order of the TOL Catabolic Plasmid Upper Pathway Operan and Oxidation of Both Toluene and Benzyl Alcohol by the xy/IA Product", por S. Harayama y colaboradores, J. Bacteriol. 167(2): 455-461 (1986) y "Enzymatic Oxidation of Methyl Groups on Aromatic Heterocycles: A Versatile Method for the Preparation of Heteroaromatic Carboxylic Acids", por A. Keiner, Angew. Chem. Edición Internacional en Inglés, 31 (6): 774-775 (1992).

La patente de los E.U.A. no. 4,859,592 describe un procedimiento microbiano para la producción de ácido picolínico, que se puede convertir seguidamente en productos de piridinas por medios químicos. La patente de los E.U.A. no. 5,104,798; 5,213,973; y 5,236,832 describen un procedimiento microbiano para la oxidación de grupos metilo en ciertos heterociclos aromáticos con anillos de 5 ó 6 miembros, para dar los correspondientes ácidos carboxílicos, que realiza una bacteria de la especie Pseudomonas usando tolueno, xileno o cimeno como inductor. Como se describe en ellas, es conocido en la técnica que la oxidación del grupo metilo del tolueno para dar ácido benzoico por la cepa Pseudomonas putída ATCC N° 33015 comprende tres operaciones catalizadas por tolueno-monooxigenasa, alcohol-deshidrogenasa y aldehído-deshidrogenasa, respectivamente. Como se ha descrito con anterioridad haciendo referencia al artículo antes mencionado de Harayama y colaboradores, el plásmido pWWO de TOL de P.putida mt-2 es un elemento extracromosomal transmisible que codifica todas las enzimas requeridas para el catabolismo oxidativo de varios hidrocarburos aromáticos, inclusive tolueno, m-xileno y p-xileno. Las bacterias que son portadoras de plásmidos de TOL p.ej. P. putida ATCC N° 33015, pueden convertir ciertos hidrocarburos aromáticos en sus correspondientes ácidos carboxílicos aromáticos; tanto el operón de xyl que codifica enzimas para la degradación de xileno como los genes que son responsables de la regulación del gen de xyl están situados en el plásmido pWWO de TOL. Los genes situados en el plásmido pWWO de TOL, que codifican las enzimas requeridas para las oxidaciones anteriores, deben ser inducidos a producir dichas enzimas. Por lo tanto, se aplica la descripción de dicha inducción en las antes mencionadas patentes de los E.U.A. no. 5,104,798; 5,213,973 y 5,236,832. Como se describe en un artículo de Gaucher y colaboradores en Dev. Ind. Microbio/., 22: 219-232 (1981), el hongo Penicillium gríseofulvum contiene tres enzimas para la conversión de m-cresol en ácido m-hidroxibenzoico; la m-cresol-metil-hidroxilasa, la m-hidroxibencil-alcohol-deshidrogenasa y la m-hidroxibenzaldehído-hidroxilasa. Reiterando, tal como es sabido en la técnica, ciertos hongos y bacterias contienen enzimas para la oxidación de grupos metilo existentes en ciertos anillos aromáticos para dar sus correspondientes ácidos carboxílicos. Mientras que es sabido que grupos metilo existentes en dichos anillos heteroaromáticos pueden ser oxidados para dar sus correspondientes ácidos carboxílicos usando microorganismos, como apreciarían los expertos en la técnica, los rendimientos químicos y ópticos de dichas oxidaciones microbianas varían generalmente de modo sustancial dependiendo, por ejemplo, del microorganismo particular escogido, la concentración del substrato, la estructura del substrato, y cuestiones similares. Se ha encontrado ahora que una gama de microorganismos, inclusive hongos y bacterias, oxidan sustancialmente a la 2-metil-quinoxalina para dar el ácido 2-quinoxalina-carboxílíco. Además, el presente procedimiento permite una apropiada recuperación del ácido 2-quinoxalina-carboxílico. La solicitud de patente provisional de los E.U.A. N° 60/073,801 (a la que seguidamente se denominará "la solicitud '801") presentada el 5 de Febrero de 1998, ahora solicitud PCT internacional no. PCT/IB99/00067 presentada el 18 de Enero de 1999, describe el uso del ácido 2-quinoxaIina-carboxílico como un compuesto intermedio en la síntesis de nuevos ácidos dihidroxi-hexanoicos que son útiles para tratar, p.ej., una inflamación y otros transtornos inmunitarios. El ácido 2-quinoxalina-carboxílico proporcionado por los nuevos procedimientos de la presente invención se puede usar para sintetizar dichos ácido dihidroxi-hexanoicos. Todos los documentos aquí citados, inclusive los precedentes, se incorporan por su referencia a la presente en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento microbiológico para preparar el ácido 2-quinoxalina-carboxílico a partir de la 2-metil-quinoxalina. Más particularmente, la presente invención se refiere a procedimientos microbiológicos para preparar el compuesto de fórmula I poniendo en contacto el compuesto de fórmula II con un microorganismo capaz de realizar la oxidación del grupo metilo del compuesto de fórmula II para dar el grupo carboxilo del compuesto de fórmula I, e incubando la mezcla resultante en condiciones apropiadas para proporcionar una cantidad del compuesto de fórmula I. Correspondientemente, la presente invención proporciona procedimientos para llevar a cabo la oxidación microbiana del compuesto de fórmula II, 2-metil-quinoxalina, que comprende: poner en contacto el compuesto de fórmula II con un microorganismo, o un mutante de éste que es conocido u obtenible por lo demás por los expertos en la tecnología relevante y que es capaz, a pesar de dicha mutación, de realizar la oxidación en cuestión (denominado seguidamente "un mutante apropiado de éster"), e incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para proporcionar una cantidad del compuesto de fórmula I, ácido 2-quinoxalina-carboxílico, en el que dicho microorganismo se selecciona entre el grupo que consta de Absidia glauca ATCC N° 22752, Absidia glauca ATCC N° 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC N° 24169, Absidi repens ATCC N° 14849, Absidia repens ATCC N° 74481 , Actinomucor elegans ATCC N° 6476, Alternaría sotaní ATCCN° 11078, Aspergillus tamaríi ATCC N° 16865, Coniophora puteana ATCC N° 12675 Cunninghamella echinulata ATTC N° 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC N° 8688b, Cunninghamella echinulata ATCC N° 8983, Cunninghamella echinulata ATCC N° 9244, Cunningamella echinulata ATCC N° 9245, Cunninghamella echinulata ATCC N° 10028b, Cunninghamella echinulata ATCC N° 26269, Cunninghamella echinulata ATCC N°36190, Cuninghamella echinulata ATCC N° 36112, Cunninghamella homothallica ATCC N° 16161, Cylindrocarpon destructans ATCC N° 66963, Diplodia gossypina ATCC N° 20575, Epicoccum neglectum ATCC N° 12723, Glomerella lagenaria ATCC N° 14724, Penicillium claviforme ATCC N° 10426, Penicillium duclauxii ATCC N° 10440, Penicillium glabrum ATCC N° 11080, Pseudocochliobolus ATCC N° 24155, Psedomonas putida ATCC N° 33015, Pseudomonas putida ATCC N° 202190, Rhodococcus rhodochrous ATCC H° 19067 y Thamnostylum piriforme ATCC N° 8686; y mutantes apropiados de éstos; con la condición de que cuando dicho microorganismo es dicho Pseudomonas putida ATCC N° 33015 o dicho Pseudomonas putida ATCC N° 202190, dicho Pseudomonas putida ATCC N° 33015 o dicho Pseudomonas putida ATCC N° 202190 es inducido por interacción con un inductor antes de dicha puesta en contacto de dicho Pseudomonas putida ATCC N°33015 o dicho Pseudomonas putida ATCC N° 202190 con dicha 2-metil-quinoxalina. Los procedimientos en cuestión comprenden además opcionalmente el aislamiento del deseado producto, ácido 2-quinoxalina-carboxílico, por cualquier método apropiado. Por ejemplo, la mezcla de reacción se puede extraer con un disolvente orgánico, preferiblemente, acetato de etilo, y luego el material extraído se puede cromatografiar. Alternativamente, el ácido 2-quinoxalina-carboxílico puede ser adsorbido a partir de la mezcla de reacción sobre una resina, preferiblemente una resina absorbente polimérica, eluido desde ésta usando n disolvente orgánico, preferiblemente acetato de etilo, y cristalizado a partir del material eluido usando un disolvente orgánico, o una combinación de disolventes orgánicos, preferiblemente acetato de etilo y metanol. Más aún, el ácido 2-quinoxalina-carboxílico producido por los presentes procedimientos puede ser tratado con una base apropiada, p.ej., hidróxido de sodio, dando como resultado la formación de una sal, p.ej., la sal de sodio, del ácido 2-quinoxalina-carboxílico. La sal de metal alcalino del ácido 2-quinoxalina-carboxílico se puede aislar luego a partir del medio de bioconversión mediante retirada de las células desde el medio por filtración o centrifugación, seguida por concentración del medio exento de células, p.ej., por evaporación. El microorganismo en cuestión es preferiblemente un microorganismo intacto.

En una realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo es un hongo, el hongo se selecciona entre el grupo que consta de los géneros Absidia, Aspergillus, Alternaría, Penicillium, Diplodia y Cunninghamella . En una realización particularmente preferida de la presente invención en la que el microorganismo es un hongo, el hongo es del género Absidia. En una realización especialmente preferida de la presente invención en la que el microorganismo es un hongo del género Absidia, el microorganismo es A. glauca ATCC N° 22752 o A. glauca ATCC N° 74480, o un mutante apropiado de éste, o, más aún, cualquier depósito de A. glauca ATCC N° 22752, o un mutante apropiado de éste, hecho para cumplir con los términos del tratado de Budapest. En otra realización especialmente preferida de la presente invención en la que el microorganismo es un hongo del género Absidia, el microorganismo es A. repens ATCC N° 14849 o A. repens ATCC N° 74481 , o un mutante apropiado de éste, o, más aún, cualquier depósito de A. repens ATCC N° 14849, o un mutante apropiado de éste hecho para cumplir con los términos del Tratado de Budapest. Una densidad celular preferida para los cultivos fúngicos de la presente invención es de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 g de peso en seco de células/l. En otra realización preferida de la presente invención, el microorganismo es una bacteria.

En una realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo es una bacteria, la bacteria se selecciona entre el grupo que consta de los géneros Pseudomonas y Rhodococcus. En una realización parcialmente preferida de la presente invención en la que el microorganismo es una bacteria, la bacteria es del género Pseudomonas. En una realización especialmente preferida de la presente invención en al que el microorganismo es una bacteria del género Pseudomonas, el microorganismo es P. putida ATCC N° 33015 o P. putida ATCC N° 202190, o un mutante apropiado de éste, o más aún, cualquier depósito de P. putida ATCC N° 33015, o un mutante apropiado de éste, hecho para cumplir con los términos del Tratado de Budapest. Una densidad celular preferida para los cultivos bacterianos de la presente invención es una densidad que proporciona una densidad óptica de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 a 650 nm. Como se debate anteriormente, en realizaciones de la presente invención en las que el microorganismo es P. putida ATCC N° 33015 o P. putida ATCC N° 202190, o un mutante apropiado de éste, el microorganismo, o un mutante apropiado de éste, se induce antes de o durante la puesta en contacto. Se prefiere que la puesta en contacto se realice después de la terminación de la inducción del microorganismo. Inductores preferidos incluyen p-xileno. Un inductor parcialmente preferido es p-xileno.

En una realización preferida de la presente invención, en la que el microorganismo es P. putida ATCC N° 33015 o P. putida ATCC N° 202190, o mutante apropiado de éste, y el microorganismo se cultiva en un medio de crecimiento dentro de un matraz, el inductor se añade a dicho medio antes de la puesta en contacto del microorganismo con 2-metil-quinoxalina y se incuba en dicho medio de crecimiento durante un periodo de tiempo suficientemente para la terminación sustancial de dicha inducción. Las células del microorganismo inducido se recogen centrifugando el contenido del matraz, retirando, p.ej., decantado, el medio de crecimiento agotado (y por lo tanto el inductor en cuestión), lavando el sedimento celular y volviendo a suspender el sedimento en un medio acuoso, tal como DPBS (Biowhittaker), antes de la puesta en contacto de dicha 2-metil-quinoxalina con dicho microorganismo. En otra realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo es P. putida ATCC N° 33015 o P. putida ATCC N° 202190, o un mutante apropiado de éste, y el microorganismo en cuestión se cultiva en un medio de crecimiento dentro de un fermentador, el inductor se añade continua o constantemente a dicho medio de crecimiento antes de la puesta en contacto en cuestión del microorganismo con 2-metil-quinoxalina y se incuba en dicho medio de crecimiento durante un periodo de tiempo superficie para la terminación sustancial de dicha inducción, y luego se interrumpe antes de la puesta en contacto de dicha 2-metil-quínoxalina con dicho microorganismo.

En una realización preferida adicionalmente de la presente invención la puesta en contacto en cuestión se consigue añadiendo 2-metil-quinoxalina a un medio de crecimiento que comprende el microorganismo en cuestión cuando el microorganismo es un hongo. En una realización preferida de la presente invención en la que la puesta en contacto en cuestión se consigue añadiendo 2-metil-quinoxalina a un medio de crecimiento que comprende el hongo en cuestión, el medio de crecimiento es un medio de materiales sólidos de maceración de maíz. Un preferido medio de materiales sólidos de maceración de maíz comprende de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 g/litro (I) de materiales sólidos de maceración de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, que tiene un pH de aproximadamente pH 4.85. Otro medio preferido de crecimiento comprende alrededor de 20 g/l de Pharmamedia® (Traders Protein) y alrededor de 20 g/l de dextrosa, que tiene un pH de aproximadamente pH 7.2. En todavía otra realización preferida de la presente invención, la puesta en contacto se realiza añadiendo el compuesto de Fórmula II adsorbido en una resina. Véase, por ejemplo, el artículo de J.T. Vicenzi y colaboradores, "Large-scale stereoselective enzimatic ketone reduction with in situ product removal via polimeric adsorbent resins", Enzyme and Microbial Techonology, 20: 494-499 (1997). En todavía otra realización preferida de la presente invención, la puesta en contacto se realiza añadiendo 2-metil-quinoxalina a un medio acuoso que comprende células lavadas del microorganismo.

En todavía otra realización preferida de la presente invención, el microorganismo se lava antes de la puesta en contacto del microorganismo con 2-metil-quinoxalina. En una realización preferida de la presente invención en la que el microorganismo se lava antes de la puesta en contacto del microorganismo con 2-metil-quinoxalina, el microorganismo lavado se inmoviliza antes de la puesta en contacto. En otra realización preferida de la presente invención, el microorganismo se hace crecer en un medio de materiales sólidos de maceración de maíz durante un periodo de tiempo de desde aproximadamente setenta y dos horas antes de la puesta en contacto que se realiza añadiendo 2-metil-quinoxalina a éste. Los procedimientos de la presente invención comprenden opcionalmente además el aislamiento o la separación de ácido 2-quinoxalina-carboxílico, que se realiza p.ej. por extracción con un disolvente orgánico, adsorción sobre una resina, cristalización, o como se debate anteriormente, cuando se proporciona la sal de metal un metal alcalino de ácido 2-quinoxalina-carboxílico, mediante concentración por evaporación de un medio exento de células, o similar. El presente invento incluye el uso de ácido 2-quinoxalina-carboxílico en las síntesis de los nuevos ácidos dihídroxí-hexanoicos descritos en la solicitud '801 antes mencionada siguiendo cualquiera de los métodos descritos en esa solicitud '801 o usando cualesquiera otros métodos apropiados para ello.

Los expertos en la técnica entenderán plenamente los términos aquí usados para describir la presente invención ; no obstante, los siguientes términos aquí usados son como se describen inmediatamente a continuación. El término "microorganismo intacto" significa que las células del microorganismo poseen sustancialmente sus integridades mecánicas, físicas y bioquímicas inherentes (y/o inducidas, según pueda ser el caso). El término "oxidación microbiana" significa la oxidación de la presente invención, como ha sido realizada por el microorganismo intacto, o por cualquier preparación de éste, y similares. El término "microorganismo" incluye cualquier microorganismo intacto o preparación apropiada de éste, incluye, por ejemplo, un microorganismo lavado hasta quedar exento de, p.ej., el medio de fermentación, el medio de crecimiento, el caldo de cultivo, y similares, según pueda ser el caso; y el microorganismo inmovilizado, p.ej., en una columna, fijado a glóbulos, y similares.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVECION A menos que se señale otra cosa distinta, a lo largo de la memoria descriptiva y de las reivindicaciones anejas: °C es grados Centígrados; % es tanto por ciento; ACN es acetonitrilo; DMSO es dimetil-sulfóxido; DPBS es solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco; EtOAc es acetato de etilo; EtOH es etanol; g es gramo(s); HPLC es cromatografía de líquido de alto rendimiento; I es litro(s); MeOH es metanol; mg es miligarmo(s); 10 min es minuto o minutos; mm es milímetro(s); mmol es mílimole(s); mi es mililítro(s); A77-xileno es meta-xileno; 15 N es (concentración) normal; nM es (concentración) nanomolar; PBS es solución salina tamponada con fosfato; p-xileno es para-xileno rpm es revoluciones por minuto; 20 TFA es ácido trifluoroacético; ß es microlitro(s); v/v es volumen por volumen; American National Can está domiciliada en Menasha, Wisconsin, EE.UU.; Becton Disckinson® Labware está domiciliada en Franklin Lakes, New Jersey, EE.UU.; Becton Dickinson® Microbiology Systems está domiciliada en Sparks, Maryland, EE.UU.; Biowhittaker® está domiciliada en Walkersville, Maryland, EE.UU.; Column Engineering®, Inc. está domiciliada en Ontario, California, EE.UU.; IEC® Centrifuge está domiciliada en Needham Heights Massachusetts, EE.UU.; Rohm y Haas® está domiciliada en Philadelphia, Pennsylvania, EE.UU.; y Traders Proteins® está domiciliada en Memphis, Tennessee, EE.UU: Además, ATCC es la American Type Culture Collection que está domiciliada en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, EE.UU. El cuadro 1 siguiente enumera los microorganismos aquí descritos y su(s) depositantes(s) (véase, www.ATCC.com). 1NRRL es Northern Regional Research Laboratories (Peoría, Illinois). 2 A. glauca, 22752, depositado dentro de los términos del Tratado de Budapest el 13 de Enero de 1999. 3 A. repens, 14849, depositado dentro de los términos del Tratado de Budapest del 13 de Enero de 1999. 4 P. putida, 33015, depositado dentro de los términos del Tratado de Budapest el 13 de Enero de 1999.

Como se ha debatido anteriormente, la presente invención se refiere a procedimientos microbiológicos para preparar el compuesto de fórmula I poniendo en contacto el compuesto de fórmula II con un microorganismo capaz de realizar la oxidación del grupo metilo de la fórmula II, 2-metil-quinoxalina, para dar el grupo carboxilo de la fórmula I, ácido 2-quinolina-carboxílico, e incubando la mezcla resultante en condiciones apropiadas para proporcionar el ácido 2-quinoxalina-carboxílico. Los procedimientos de la presente invención se llevan a cabo con facilidad. El microorganismo se cultiva, con inducción cuando es necesaria, p.ej., cuando el microorganismo es p.ej. P. putida ATCC N° 33015 o P. putida ATCC N° 202190, o un mutante apropiado de éste, y luego se pone en contacto con 2-metil-quinoxilina para oxidar el grupo metilo de 2-quinoxalina para dar el grupo -COOH de ácido 2-quinoxalina-carboxílico. Luego el ácido 2-quinoxalina-carboxílico se puede hacer reaccionar, p.ej., adicionalmente por métodos descritos en la solicitud '801 antes mencionada para proporcionar finalmente los nuevos ácidos dihidroxi-hexanoicos descritos en la solicitud '801 que son útiles para tratar una inflamación y otros trastornos inmunitarios. La actividad, los métodos para ensayar las actividades, las dosificaciones, las formas de dosificación, los métodos de administración y la información de antecedentes concernientes a los nuevos ácidos dihidroxi-hexanoicos descritos en la solicitud '801 se exponen en ésta. Como antes se ha señalado, cualquier microorganismo apropiado o un mutante apropiado de éste se puede usar en los procedimientos de la presente invención. Como comprenderán los expertos en la técnica a la vista de la presente divulgación, las condiciones de los procedimientos en cuestión se escogerían dependiendo, p.ej. de la clase del microorganismo y de la preparación particular de éste. Por ejemplo, el pH, la temperatura, las concentraciones de componentes, y similares, p.ej., del medio de fermentación y del disolvente orgánico, así como las concentraciones de 2-metil-quinoxalina y del inductor (cuando se emplea) se escogerán para proporcionar el resultado deseado particular usando el microorganismo seleccionado. Hongos preferidos incluyen los miembros del lo géneros Absidia, Actinomucor, Alternaría, Aspergillus, Coniophora, Cunninghamella, Cylindrocarpon, Diplodia, Epicoccum, Fusarium, Glomerella, Penicillium, Pseudocochliobolus, Thamnostylum y Verticillium, pero las especies de éstos no son particularmente limitativas, con la condición de que los microorganismos, o los mutantes de éstos, sean capaces de realizar la oxidación en cuestión.

Hongos particularmente preferidos pertenecen a los géneros Absidia, Alternaría, Aspergillus, Cunninghamella, Diplodia y Penicillium. Hongos especialmente preferidos pertenecen al género Absidia. Más particularmente, hongos preferidos incluyen A. glauca ATCC N° 22752, A. glauca ATCC N° 74480, A. pseudocylindrospora ATCC N° 24169, A. repens ATCC N° 14849, A. repens ATCC N° 74481 , A. elegans ATCC N° 6476, A. solani ATCC N° 11078, A. tamarii ATCC N° 16865, C. puteana ATCC N° 12675, C. echinulata ATCC N° 8688a. C. echinulata ATCC N° 8688b, C. echinulata ATCC N° 8983, C. echinulata ATCC N° 9244, C. echinulata ATCC N° 9245, C. echinulata ATCC N° 10028b, C. echinulata ATCC N° 26269, C. echinulata ATCC N° 36190, C. echinulata ATCC N° 36112, C. homothallica ATCC N° 16161 , C. destructans ATCC N° 66963, D. gossypina ATCC N° 20575, E. neglectum ATCC N° 12723, G. lagenaria ATCC N° 14724, P. claviforme ATCC N° 10426, P. duclauxii ATCC N° 10440, P. glabrum ATCC N° 11080, P. /t/pafo/s ATCC N° 24155 y T. piriforme ATCC N° 8686; y mutantes apropiados de éstos. Hongos más preferidos A. glauca ATCC N° 22752, A. glauca ATCC N° 74480, A repens ATCC N° 14849, A repens ATCC N° 74481 , A solani ATCC N° 11078, A tamarii ATCC N° 16865, C. echinulata ATCC N° 8983, D. gossypina ATCC N° 20575 y P. glabrum ATCC N° 11080; y mutantes apropiados de éstos.

Hongos particularmente preferidos incluyen A. glauca ATCC N° 22752, A glauca ATCC N° 74480, A. repens ATCC N° 14849 y A. repens ATCC N° 74481 ; y mutantes apropiados de éstos. Hongos especialmente preferidos incluyen A. repens ATCC N° 14849 y A. repens ATCC N° 74481 ; y mutantes apropiados de éstos. Las bacterias preferidas incluyen las que pertenecen a los géneros: Bacillus, Brevibacterium, Micrococcus, Pseudomonas y Rhodococcus, pero sus especies no son particularmente limitativas con la condición de que los microorganismos, o los mutantes de éstos, sean capaces de realizar la oxidación en cuestión. Bacterias particularmente preferidas incluyen las que pertenecen a los géneros Pseudomonas y Rhodococcus. Bacterias especialmente preferidas incluyen las que pertenecen al género Pseudomonas. Más particularmente, bacterias preferidas incluyen P. putida ATCC N° 33015, P. putida ATCC N° 202190 y R. rhodochrous ATCC N°; y mutantes apropiadas de éstas. Bacterias especialmente preferidas son P. putida ATCC N° 33015 o P. putida ATCC N° 202190; y mutantes apropiadas de éstas. Como se ha debatido anteriormente, la presente invención incluye el uso de cualesquiera mutantes apropiados de cualesquiera de los apropiados microorganismos. Además, un grupo de mutantes con propiedades más deseables, p.ej. capaces de oxidar mayores cantidades de sustrato, en comparación con la cepa prógenitora, se pueden usar también en el procedimiento en cuestión, y esta nuevas cepas se pueden producir usando métodos conocidos, inclusive, por ejemplo, técnicas clásicas de mutagénesis y selección, y métodos de recombinación inclusive, por ejemplo mutagénesis dirigida a un sitio. Los métodos de mutagénesis clásicos incluyen las mutagénesis químicas con N-metil-N'-nitroso-guanidina (Delic y colaboradores (1970), Mutat. Res. 9:167), ácido nitroso (Crueger y Crueger (1984), Biotechnologv: A. Textbook of Industrial Mícrobioloqy, página 15, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, EE.UU.) e irradiación con luz ultravioleta (Thrum (1984), en Biotechnoloqy of Industrial Antibiotics (Vandame, coordinador de edición), Marcel Dekker, Nueva York, páginas 373-374). Las técnicas de selección incluyen un simple reaislamiento de la cepa mediante la selección de una colonia aislada, selección de específicas morfologías de la colonia y selección en cuanto a resistencia a compuestos análogos a componentes conocidos o que se considera que están en la ruta de biosíntesis del compuesto de fórmula I (Crueger y Crueger (1984), Biotechnologv: A Textbook of industrial Microbiology, página 24-25, Sínauer Associates, Inc., Sunderland, MA, EE.UU.). Estas nuevas cepas se usan en los presentes procedimientos puesto que, por ejemplo, tienen propiedades mejoradas con relación a sus respectivas cepas progenitoras, p.ej. producen más cantidad de ácido 2-quinoxalina-carboxílico, exhiben menos actividad degradante intrínseca indeseada de 2-metil-quinoxalina y/o ácido 2-quinoxalina-carboxílico y de los compuestos intermedios que se pueden generar en el procedimiento de la presente invención dependiendo, por ejemplo, del microorganismo particular escogido. Además, cuando el mutante se usa puesto que se uso da como resultado más cantidad de ácido 2-quinoxalina-carboxílico, se necesita hacer crecer menos volumen del cultivo para obtener el material necesario con el fin de generar una cantidad de ácido 2-quinoxalina-carboxílico de acuerdo con el presente procedimiento que puede dar como resultado sustanciales ahorros de costos. Como se ha descrito anteriormente cualquier preparación apropiada del microorganismo se puede usar en los procedimientos de la presente invención tal como, por ejemplo, un microorganismo en un medio de crecimiento, un microorganismo lavado hasta quedar libre de p.ej., medio de fermentación, caldo de cultivo, y similares, o microorganismo inmovilizado, p.ej. en una columna, fijado a glóbulos, y similares. Los expertos en la tecnología comprenderán a partir de la descripción que aquí se proporciona cómo se ha de preparar un microorganismo intacto inmovilizado apropiado tal como se describe, por ejemplo, por Bauer y colaboradores en el artículo "Polyvinyl alcohol-immobilized whole-cell preparations for biotransformation of nitriles" publicado en Biotecnology Letters, 18(3): 343-348 (1996). Los preferidos microorganismos intactos serán los que oxidan sustancialmente la 2-metil-quinoxalina para dar el producto, específicamente el ácido 2-quinoxalina-carboxílico, al mismo tiempo que se deja al producto sustancialmente inalterado, por ejemplo libre de actividad intrínseca que pueda degradar o tener de otro modo un impacto negativo para el producto deseado en cualquier etapa de los procedimientos en cuestión. Los microorganismos apropiados para usarse en la oxidación microbiana en cuestión se pueden preparar por cualquier apropiado método conocido por los expertos en la tecnología relevante. Un ejemplo de un método apropiado para la preparación de un microorganismo a partir de un material de reserva adquirido comercialmente se proporciona seguidamente. Basándose en la presente divulgación que incluye los métodos proporcionados seguidamente, los expertos en la técnica comprenderán cómo modificar cualquier parte de estos métodos, por ejemplo, un método para poner en contacto el ácido 2-quinoxalina-carboxílico con el microorganismo; los componentes y las condiciones del medio de crecimiento, por ejemplo, la temperatura, el pH y similares; las concentraciones respectivas de la 2-metil-quinoxalina, del inductor (cuando se usa); o las condiciones de incubación; para conseguir el resultado deseado usando cualquier apropiado microorganismo. En realizaciones de la presente invención en las que el microorganismo es un hongo, un margen preferido de concentraciones de 2-metil-quinoxalina es el de aproximadamente 0.01 g/l a aproximadamente 2.5 g/l, y margen particularmente preferido es el de aproximadamente 0.1 g/l a aproximadamente 2.0 g/l. En realizaciones de la presente invención en las que el microorganismo es un hongo seleccionado entre el grupo que consta de A. repens ATCC N° 14849, A. repens ATCC N° 74481 , A glauca ATCC N° 22752, A glauca ATCC N° 74480 y mutantes apropiados de éstos, un margen preferido de concentraciones de 2-metil-quinoxalina es el de aproximadamente 0.1 g/l a aproximadamente 2.0 g/l. En realizaciones de la presente invención en las que el microorganismo es una bacteria, un margen preferido de concentraciones de 2-metil-quinoxalina es el de aproximadamente 0.01 g/l a aproximadamente 1.5 g/l y un margen particularmente preferido es el de aproximadamente 0.1 g/l a aproximadamente 1.0 g/l. En realizaciones de la presente invención en las que la bacteria se selecciona entre el grupo que consta de P. Putida ATCC N° 33015, P. Putida ATCC N° 202190 y mutantes apropiadas de éstas, un margen preferido de concentraciones de 2-metil-quinoxalina es el aproximadamente 0.1 g/l a aproximadamente 1.0 g/l. Además, y como se ha debatido anteriormente, una bacteria que lleva a un plásmido de TOL, por ejemplo, P. Putida ATCC N° 33015 o P. Putida ATCC N° 202190 en un medio dentro de un fermentador, el inductor, preferiblemente p-xileno, se añade en un caudal preferido de adición de aproximadamente 4.5 mmol/hora a aproximadamente 6.5 mmol/hora, y un caudal particularmente preferido de adición es el de aproximadamente 4.9 mmol/l/hora a aproximadamente 6.1 mm/l/hora. En realizaciones de la presente invención en las que P. Putida ATCC N° 33015 o P. Putida ATCC N° 202190 está en un medio dentro de un matraz, el inductor preferiblemente p-xileno, se añade continuamente en forma gaseosa al medio. Tal como comprenderían los expertos en la técnica a partir de la presente descripción y a partir de los artículos y las patentes que antes se mencionan (por ejemplo, la patente de los EE.UU. N° 5,236,832), la concentración del inductor se selecciona usualmente de manera tal que sea menor que la concentración inhibidora mínima de las enzimas responsables de la oxidación. Véase también la cita de Claus y Walker, J. Gen. Microbio/., 36: 107-122 (1964). Se puede usar en la presente invención cualquier método apropiado para poner en contacto el sustrato, 2-metil-quinoxalina, con el microorganismo. El sustrato se puede poner en contacto con el microorganismo en cualquier orden apropiado. Por ejemplo, se puede añadir 2-metil-quinoxalina a un medio, tal como un caldo de cultivo, que comprende el microorganismo, libre o inmovilizado, o alguna de sus combinaciones; o el medio puede comprender 2-metil-quinoxalina y el microorganismo se puede añadir luego a dicho medio; o la 2-metil-quinoxalina y el organismo se pueden añadir conjuntamente a dicho medio; o bien la 2-metil-quinoxalina o el microorganismo se puede añadir a un disolvente apropiado que comprenda el otro; o la 2-metil-quinoxalina se puede absorber en una resina; y similares. Los expertos en la técnica comprenderán a partir de la descripción que aquí se proporciona cómo se puede modificar cualquier parte de los procedimientos en cuestión, como así se desee.

Como se ha debatido anteriormente, es preferido en la presente invención que el microorganismo sea A. glauca ATCC N° 22752. Como se ha debatido también anteriormente, una muestra liofilizada de A. glauca ATCC N° 22752 se depositó en la colección ATCC dentro de los términos del Tratado de Budapest del 13 de Enero de 1999. A este cultivo nuevamente depositado se le dio el nuevo número de depósito de ATCC N° 74480. Por lo tanto, se prefiere también en la presente invención que el microorganismo sea A glauca ATCC N° 74480. Todas las restricciones en cuanto a la disponibilidad para el público del cultivo de microorganismo así depositado se eliminarán irrevocablemente cuando se conceda una patente a partir de la memoria descriptiva de la presente invención. Como también se ha descrito anteriormente, es especialmente preferido en la presente invención que el microorganismo sea A. repens ATCC N° 14849. Una muestra liofilizada de A repens ATCC N° 14849 fue depositada en la ATCC dentro de los términos del Tratado de Budapest del 13 de Enero de 1999. A este cultivo nuevamente depositado se le dio el nuevo número de depósito de ATCC N° 74481. Por lo tanto, se prefiere también en la presente invención que el microorganismo sea A. repens ATCC N° 74481. Todas las restricciones en cuanto a la disponibilidad para el público del cultivo de microorganismo así depositado se eliminarán irrevocablemente cuando se conceda una patente a partir de la memoria descriptiva de la presente invención.

Los cultivos del hongo A. repens ATCC N° 14849 (o A. repens ATCC N° 74481 , A glauca ATCC N° 22752, o A glauca ATCC N° 74480) se puede obtener a partir de la ATCC, y un ejemplo de un método apropiado para la preparación a partir de dicha reserva disponible se proporciona inmediatamente a continuación. Los cultivos de reserva se pueden preparar a partir de cultivos en arroz tal como, por ejemplo, se señala seguidamente: matraces Erlenmeyer (de 250 ml de capacidad) que contienen aproximadamente 50 g de arroz pardo y aproximadamente 20 ml de agua destilada se tratan en autoclave a aproximadamente 121°C durante aproximadamente 30 min, una suspensión de A. repens ATCC N° 14849 (o A. repens ATCC N° 74481 , A glauca ATCC N° 22752, o A glauca ATCC N° 74480), células vegetativas, o esporas, se prepara añadiendo o bien en parte alícuota de un cultivo líquido o un trapo procedente de un cultivo inclinado que ha crecido sobre un medio de agar a agua destilada estéril. Cada matraz con arroz se inocula con aproximadamente 5 ml de la suspensión de esporas o células y se incuba durante aproximadamente 10 días a aproximadamente 28°C, en cuyo momento la reserva de esporas se prepara lavando el cultivo de arroz con aproximadamente una solución al 0.5% de Tween 80 en agua destilada, decantando la suspensión de esporas fuera del arroz, y añadiendo de aproximadamente 10% a aproximadamente 20% de glicerol. La reserva de esporas se almacena a aproximadamente -70°C. Tal como podrán comprender los expertos en la tecnología para cualquier hongo seleccionado, y como se proporciona específicamente a continuación en esta memoria en los ejemplos para el preferido A. glauca ATCC N° 22752 o ATCC N° 74480 y el especialmente preferido A repens ATCC N° 14849 o ATCC N° 74481 , un método apropiado para preparar el hongo seleccionado es como sigue: el hongo se inocula a partir del cultivo de reserva de células vegetativas o esporas congeladas tal como se ha descrito anteriormente, dentro de un matraz o un tubo de vidrio con un cierre metálico que contiene un medio de crecimiento (que contiene una parte alícuota procedente de una solución estéril que incluye Tween 80, glicerol y agua destilada) cuya composición se describe seguidamente con mayor detalle. La fermentación se lleva a cabo a temperaturas que fluctúan entre aproximadamente 22°C y aproximadamente 32°C, y con preferencia a aproximadamente 29°C, con apropiado sacudimiento, preferiblemente desde alrededor de 200 rpm hasta alrededor de 220 rpm y, lo más preferiblemente, a alrededor de 210 rpm. Cuando así se desea, el pH del medio de crecimiento puede ser mantenido por el uso de tampones apropiados incorporados en el medio de fermentación y/o ajustados periódicamente por adición o bien de una base o de un ácido, como así se requiera. Un margen preferido del pH es el de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 7. Cualquier duración apropiada del crecimiento del microorganismo (es decir hongo o bacteria), puesta en contacto del microorganismo con 2-metil-quinoxalina, e incubación de 2-metil-quinoxalina con el microorganismo, se puede usar en la presente invención. Un crecimiento apropiado del microorganismo se puede conseguir, por ejemplo, en el transcurso de aproximadamente 24 horas, en cuyo período de tiempo se puede añadir al cultivo o bien (a) la 2-metil-quinoxalina propiamente dicha, (b) una parte alícuota apropiada de una solución de 2-metil-quinoxalina es un disolvente apropiado, por ejemplo, no afecta indeseablemente al crecimiento ni a la función del microorganismo, preferiblemente EtOH o (c) 2-metil-quinoxalina absorbida en una resina. Luego, la incubación se puede continuar durante, por ejemplo, un período de tiempo de aproximadamente dos a veinticuatro días, dependiendo, por ejemplo, del recipiente en el que se realiza la bioconversión, del medio y de las condiciones de incubación, por ejemplo, la temperatura, pH y agitación. El caldo de incubación se puede extraer luego usando cualquier método apropiado de extracción, por ejemplo, (a) en el que un disolvente apropiado tal como, por ejemplo, EtOAc, metil-isobutil-cetona, metil-etil-cetona, cloruro de metileno, y similares, preferiblemente, EtOAc, elimina los componentes orgánicos a partir del caldo de incubación o (b) por adsorción del producto, ácido 2-quinoxalina-carboxílico, sobre una resina apropiada, preferiblemente una resina adsorbente polimérica, más preferiblemente una resina seleccionada entre las de la marca comercial Amberlite® (Rohm and Haas), lo más preferiblemente XAD4 (de las resinas Amberlite). Después de extracción del caldo de incubación con un disolvente orgánico apropiado y de separación de las fases orgánica y acuosa, los compuestos que comprende el residuo orgánico se pueden determinar usando cualquier método apropiado, tal como, por ejemplo, cromatografía. Alternativamente, después de extracción del ácido 2-quinoxalina-carboxílíco a partir del caldo de incubación usando una resina, el caldo 2-quinoxalina-carboxílico se puede eluir a partir de éste usando un disolvente apropiado, preferiblemente EtOAc o MeOH, y luego cristalizar a partir, por ejemplo, del EtOAc, usando por ejemplo EtOAc y MeOH. Cualquier apropiado medio de crecimiento se puede usar en el procedimiento de la presente invención, y el apropiado medio de crecimiento contendrá una fuente o varias fuentes de carbono asimilable, nitrógeno asimilable y sales inorgánicas que contengan minerales esenciales. En general, muchos hidratos de carbono tales como, por ejemplo, glucosa, maltosa, mañosa, sacarosa, almidón, glicerol, jalea de mijo, melaza, soja y similares, se pueden usar como fuentes de carbono asimilable. Las fuentes de nitrógeno asimilable incluyen, por ejemplo, materiales tales como levadura e hidrolizados de levadura y caseína, levadura primaria, extractos de levadura, harina de semillas de algodón, materiales sólidos de soja, germen de trigo, extractos de carne, peptona, líquido de maceración de maíz, materiales sólidos de maceración de maíz, y sales de amonio. Los nutrientes de sales inorgánicas apropiadas para usarse en el medio de cultivo de la presente invención incluyen, por ejemplo, las sales acostumbradas que contienen sodio, hierro, magnesio, potasio, cobalto, fosfato, y similares. Más particularmente, los componentes de medios de crecimiento apropiados para usarse en la presente invención cuando el microorganismo es un hongo incluyen, por ejemplo, líquido de maceración de maíz, materiales sólidos de maceración de maíz, Pharmamedia® y un extracto de malta. El medio de líquido de maceración de maíz se prepara con aproximadamente 40 g/l de líquido de maceración de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajusta a aproximadamente pH 4.85 antes de la esterilización. El medio de materiales sólidos de maceración de maíz se prepara con aproximadamente 20 g/l hasta aproximadamente 40 g/l de materiales sólidos de maceración de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajusta a aproximadamente pH 4.85 antes de la esterilización. Otro medio apropiado para usarse en los procedimientos de la presente invención se prepara con aproximadamente 20 g/l de Pharmamedia® y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajusta a aproximadamente pH 7.2 antes de la esterilización. El medio de extracto de malta se prepara con aproximadamente 10 g/l de extracto de malta, aproximadamente 10 g/I de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de peptona, y aproximadamente 2 g/l de extracto de levadura, y se ajusta a aproximadamente pH 7 antes de la esterilización. Otro medio apropiado para usarse en los procedimientos de la presente invención se prepara con aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de harina de nutrisoja, aproximadamente 5 g/l de extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l de NaCI y aproximadamente 5 g/l de K2HP04, siendo ajustado el pH a alrededor de pH 7.0 con H2SO4 antes de la esterilización. Un medio de crecimiento particularmente preferido para los hongos apropiados para el presente procedimiento es el antes mencionado medio de materiales sólidos de maceración de maíz.

Tal como se debate anteriormente, es particularmente preferido en la presente invención que el microorganismo sea P. putida ATCC No. 33015. Como también se ha debatido anteriormente, una muestra liofilizada de P. putida ATCC No. 33015 se depositó en la ATCC dentro de los términos del Tratado de Budapest el 13 de Enero de 1999. A este cultivo nuevamente depositado se le dio el nuevo número de depósito de ATCC No. 202190. Por lo tanto, es también preferido en la presente invención que el microorganismo sea P. putida ATCC No. 202190. Todas las restricciones acerca de la disponibilidad para el público del cultivo de microorganismos así depositado se eliminarán irrevocablemente al concederse una patente a partir de la memoria descriptiva de la presente invención. Además, medios de crecimiento apropiados para usarse en la presente invención cuando el microorganismo es una bacteria incluyen cualesquiera medios conocidos, por ejemplo Caldo Nutriente (aproximadamente 32 g/l, de Becton Dickinson Microbiology Systems) y glicerol (aproximadamente 5 g/l). Como comprenderán los expertos en la técnica a partir de cualquier bacteria seleccionada, y como se proporciona específicamente a continuación en los ejemplos para P. putida ATCC No. 33015, un método apropiado para preparar la bacteria seleccionada es como sigue: la bacteria se inocula a partir de un cultivo de reserva congelado preparado tal como se conoce en la tecnología (una reserva con aproximadamente 17% de glicerol) dentro de un matraz o un tubo de vidrio con un cierre metálico o un fermentador que contiene un medio de crecimiento (el cual contiene una parte alícuota de una solución estéril que incluye Tween 80, glicerol y agua destilada) cuya composición se describe seguidamente con mayor detalle. La fermentación se lleva a cabo a temperaturas que fluctúan entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C, y preferiblemente a temperaturas que fluctúan entre aproximadamente 25°C y aproximadamente 32°C, con agitación apropiada, preferiblemente de aproximadamente 200 rpm a aproximadamente 220 rpm y, lo más preferiblemente, a aproximadamente 210 rpm. Cuando así se desea, el pH del medio de crecimiento se puede mantener por el uso de tampones apropiados incorporados en el medio de fermentación y/o se puede ajustar periódicamente por adición o bien de una base o de un ácido como así se requiera. Un inoculo preferido es de aproximadamente 1% a aproximadamente 20% v/v (de inoculo a medio). Un preferido margen del pH es el de aproximadamente pH 6 a aproximadamente pH 8. Deberá hacerse observar que no se pretende que la referencia a particulares tampones, medios, reactivos, condiciones de puesta en contacto o de cultivo, cantidad de sustrato, cantidad de inductor cuando se use, y similares, en cualquier parte de la presente memoria descriptiva sea limitativa, sino que deberá leerse para incluir todos los materiales relacionados que aquellas personas que posean experiencia ordinaria en la tecnología reconocerán como poseedores de interés o valor en el contexto particular en el que se presenta el presente debate. Por ejemplo, con frecuencia es posible reemplazar un sistema tamponador o medio de cultivo por otro, de manera tal que se use una manera diferente pero conocida para conseguir las mismas metas que aquellas a las que se dirige el uso de un método, material o composición que se sugiera. Además, deberá entenderse que la presente invención incluye el aumento a escala del procedimiento en cuestión para finalidades comerciales. La oxidación microbiana en cuestión comprende opcionalmente además el aislamiento del producto deseado, ácido 2-quinoxalina-carboxílico. El ácido 2-quinoxalina-carboxílíco se puede aislar como se ha descrito seguidamente a partir del medio en el que se realizó el nuevo procedimiento de oxidación microbiana y, más específicamente, a partir de cualesquiera compuestos intermedios que se puedan haber producido pero que no hayan sido convertidos completamente en el ácido 2-quinoxalina-carboxílico, dependiendo por ejemplo del microorganismo seleccionado y de las condiciones de incubación. Cualesquiera métodos apropiados para aislar y/o purificar cualesquiera de los compuestos intermedios o el producto deseado del procedimiento en cuestión, se pueden usar en la presente invención, incluyendo filtración, extracción, cristalización, cromatografía en columna, cromatografía de capa fina, cromatografía de líquido a baja presión preparativa, HPLC, adsorción a resinas, o cualquier apropiada combinación de tales métodos. Los ejemplos detallados que se proporcionan seguidamente muestran que una gama de microorganismos, específicamente, hongos y bacterias, oxidan a la 2-metil-quinoxalina para proporcionar el ácido 2-quinoxalina-carboxílico, que luego puede ser separado a partir de cualquier 2-metil-quinoxalina inalterada indeseada, o cualesquiera compuestos intermedios, y se puede hacer reaccionar ulteriormente de acuerdo con métodos bien conocidos en el sector de la técnica para proporcionar, por ejemplo los compuestos de la solicitud '801. Aunque la presente divulgación se dirige principalmente al uso de microorganismos intactos en los procedimientos en cuestión, los expertos en la técnica comprenderán que los procedimientos microbianos en cuestión se pueden conseguir mediante preparaciones apropiadas de ellos, por ejemplo preparaciones celulares trituradas y deshidratadas, materiales extraídos que comprenden las enzimas microbianas capaces de conseguir las oxidaciones en cuestión, o las enzimas propiamente dichas, conjuntamente con cualesquiera necesarios cofactores, y similares. La presente invención se ilustra por los siguientes ejemplos. No se pretende que las descripciones precedentes y siguientes de la presente invención y las diversas realizaciones sean limitativas de la invención, sino que en vez de ello sean ilustrativas de éste. Por lo tanto, se entenderá que la invención no está limitada a los detalles específicos de estos ejemplos.

EJEMPLO 1 Oxidación de 2-metil-quinoxalina en tubos de cultivo usando A. repens ATCC no. 14849 A. Bioconversión usando el hongo A repens ATCC no. 14849 Tres cultivos "de ensayo" (T1 , T2 y T3) se prepararon de la siguiente manera: aproximadamente 2.5 ml de un medio de crecimiento estéril (con aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de harina de nutrisoja, aproximadamente 5 g/l de un extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l de NaCI y aproximadamente 5 g/l de K2HP0 , siendo ajustado el pH a aproximadamente pH 7.0 con H2SO4 antes de la esterilización) se añadieron a cada uno de tres tubos de vidrio de 16 x 125 mm cada uno de los cuales tenía un cierre metálico (T1 , T2 y T3), seguido por la adición de esporas (aproximadamente 1 % v/v de un cultivo de reserva de esporas) de A. repens ATCC No. 14849 a T1 , T2 y T3. Los tres cultivos en tubos se incubaron a alrededor de 29°C, con agitación a aproximadamente 210 rpm. Después de aproximadamente 48 horas (para T1), 72 horas (para T2) o 96 horas (para T3), se añadieron a ios cultivos en tubos alrededor de 0.05 ml de una solución de reserva (con aproximadamente 50 mg/ml en aproximadamente 100% de EtOH, concentración final de aproximadamente 1 mg/ml) de 2-metil-quinoxalina. Después de incubación adicional a aproximadamente 29°C (véase el cuadro 2 siguiente) los caldos de fermentación de los cultivos en tubos se ajustaron a aproximadamente pH 2 con HCl 4 N. El contenido de cada cultivo en tubo se extrajo con un volumen igual de EtOAc (puro): el EtOAc se añadió, el cultivo en tubo se sometió a vórtice y luego se centrifugó a aproximadamente 2,000 rpm (IEC Centrifuge). La capa de EtOAc se retiró y la capa acuosa se extrajo una segunda vez. Los extractos orgánicos combinados se secaron, bajo nitrógeno, en un baño de agua a aproximadamente 50°C.

B. Rendimiento de ácido 2-quinoxalina-carboxílico determinado por HPLC de fase inversa Cada uno de los extractos, preparado como antes se describe, se volvió a suspender en aproximadamente un ml de una mezcla de ACN y agua (1 :9, v/v) y aproximadamente 20 µ\ de cada extracto resuspendido se analizaron por inyección sobre una columna para HPLC: columna para HPLC Inertsil® C8 (4.6 x 250 mm, Column Engineering, Inc.). Los compuestos contenidos dentro de cada extracto resuspendido inyectado se separaron ¡socráticamente a alrededor de 1.0 ml por minuto en una fase móvil (una mezcla de ACN y TFA acuoso al 0.05%, 1 :4, v/v). En estas condiciones, el ácido 2-quinoxalina-carboxílico se eluyó a aproximadamente 8.6 min y la 2-metil-quinoxalina se eluyó a alrededor de 15 mín. Los rendimientos de ácido 2-quinoxalina-carboxílico se determinaron a partir de dichos análisis por HPLC para varios conjuntos de condiciones experimentales (es decir T1 , T2 y T3), y estos rendimientos se presentan en el cuadro 2 siguiente: CUADRO 2 Como se ilustra por los datos para T1 , T2 y T3 del cuadro 2, el análisis por HPLC muestra que el procedimiento microbiano en cuestión da como resultado unos rendimientos de 56%, 76% y 79%, respectivamente, del deseado ácido 2-quinoxalina-carboxílico. Correspondientemente, la inclusión del microorganismo intacto, es decir A. repens ATCC N° 14949, da como resultado la oxidación de la 2-metil-quinoxalina para dar el ácido 2-quinoxalina-carboxílico, y permanece intacta una cantidad sustancial de ácido 2-quinoxalina-carboxíIíco.

EJEMPLO II Oxidación de 2 -metil-quinoxalina en cultivos en tubos usando A. repens ATCC N° 14849 en cuatro diferentes medios de crecimiento A. Preparación de cuatro diferentes medios de crecimiento El medio 1 se preparó con aproximadamente 40 g/l de líquido de maceración de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajustó a aproximadamente pH 4.85 antes de la esterilización.

El medio 2 se preparó con aproximadamente 40 g/l de materiales sólidos de maceración de maíz y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajustó a aproximadamente pH 4.85 antes de la esterilización. El medio 3 se preparó con aproximadamente 20 g/l de Pharmamedia® y aproximadamente 20 g/l de dextrosa, y se ajustó a aproximadamente pH 7.2 antes de la esterilización. El medio 4 se preparó con aproximadamente 10 g/l de extracto de malta, aproximadamente 10 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de peptona, y aproximadamente 2 g/l de extracto de levadura, y se ajustó a alrededor de pH 7 antes de la esterilización.

B. Bioconversión usando el hongo A repens ATCC N° 14849. Ocho cultivos de "ensayo" (T1a, T1 b, T2a, T2b,T3a, T3b, T4a y T4b), se prepararon de la siguiente manera: aproximadamente 2.5 ml de un medio de cultivo estéril (respectivamente el medio 1 , el medio 2, el medio 3 y el medio 4) se añadieron a cada uno de ocho tubos de vidrio de 16 x 125 mm cada uno de los cuales tenía un cierre metálico (T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a y T4b), seguido por la adición de esporas (aproximadamente 1 % v/v de cultivo de reserva de esporas) de A repens ATCC N° 14849 a todos los cultivos de tubos. Los ocho cultivos en tubos se incubaron a aproximadamente 29°C, con agitación a alrededor de 210 rpm. Después de o bien aproximadamente 48 horas para (T1a, T2a, T3a y T4a) o aproximadamente 72 horas para (T1b, T2b, T3b y T4b) se añadieron a los cultivos en tubos aproximadamente 0.05 ml de una solución original (aproximadamente 50 mg/ml en DMSO, concentración final de aproximadamente 1 mg/ml) de 2-metil-quinoxalina. Después de incubación adicional a aproximadamente 29° C durante 12 días, el caldo de fermentación de cada cultivo se extrajo y los extractos orgánicos combinados se secaron como se ha descrito en el ejemplo 1.

C. Rendimiento de ácido 2-quinoxalina-carboxílico como se determina por HPLC de fase inversa Cada uno de los extractos, preparados como antes se ha descrito, se trató seguidamente y se analizó mediante HPLC de fase inversa como se ha descrito en el ejemplo 1. Los rendimientos de ácido 2-quínoxalina-carboxílico se determinaron a partir de dicho análisis por HPLC para diversos conjuntos de condiciones experimentales (a saber, T1a, T1b, T2a, T2b, T3a, T3b, T4a y T4b), y estos rendimientos se presentan en el cuadro 3 siguiente.

CUADRO 3 Como se ilustra por los datos del cuadro 3, el análisis por HPLC muestra que el procedimiento microbiano en cuestión en el que el microorganismo es A. repens ATCC N° 14849 da como resultado la producción de ácido 2-quinoxalina-carboxílico en todos los medios ensayados. Los datos del cuadro 3 indican también que, de los cuatro medios ensayados, el medio 2 proporciona el más alto rendimiento en % del producto deseado, ácido 2-quinoxalina-carboxílico.

EJEMPLO lll Oxidación de 2-metil-quinoxalina en cultivos en matraz usando A. repens ATCC N° 14849 o A. glauca ATCN N° 22752 A. Bioconversión usando el hongo A. repens ATCC N° 14849 o el hongo A glauca ATCC N° 22752 Se prepararon cuatro cultivos de "ensayo" (T1a, T1b, T2a y T2b) de la siguiente manera: aproximadamente 25 ml de un medio de cultivo estéril (aproximadamente 20 g/l de dextrosa, aproximadamente 5 g/l de harina de nutrisoja, aproximadamente 5 g/l de un extracto de levadura, aproximadamente 5 g/l de NaCI y aproximadamente 5 g/l de K2HPO4, siendo ajustado el pH a aproximadamente pH 7.0 con H2S04 antes de la esterilización) se añadieron a cada uno de los cuatro matraces cónicos (300 ml), seguido por la adición de esporas (aproximadamente 1 % v/v de un cultivo de reserva de esporas) de o bien A repens ATCC N° 14849 (para T1a, T1b) o A. glauca ATCC N° 22752 (para T2a, T2b). Los cuatro cultivos en matraz se incubaron a aproximadamente 29°C, con agitación a aproximadamente 210 rpm. Inmediatamente después de la inoculación (para T2a), o después de aproximadamente 24 horas (para T2b), aproximadamente 0.5 ml de una solución de reserva (aproximadamente 50 mg/ml en aproximadamente 100% de EtOH, concentración final de aproximadamente 1 mg/ml de 2-metil-quínoxalina se añadieron a los cultivos en matraz de A. glauca ATCC N° 22752, y después de aproximadamente 48 horas (para T1a) o de 72 horas (para T1b), aproximadamente 0.5 ml de una solución de reserva (aproximadamente 50 mg/ml en aproximadamente 100% de EtOH, concentración final de aproximadamente 1 mg/ml) de 2-metil-quinoxalina se añadieron a los cultivos en matraz de A. repens ATCC N° 14849. Después de incubación adicional a aproximadamente 29°C durante 24 días (para T1a), durante 16 días (para T1 b), 25 días (para T2a) o 24 días (para T2b), los caldos de fermentación de los cultivos en matraz se ajustaron alrededor de pH 2 con HCl 4 N. El contenido de cada cultivo en matraz se extrajo con dos partes alícuotas de 25 ml de EtOAc, y el disolvente se eliminó desde los extractos de EtOAc combinados bajo presión reducida para proporcionar los productos brutos.

B. Rendimiento de ácido 2-quinoxalina-carboxílico como se determina por HPLC de fase inversa. Cada uno de los extractos, preparados como antes se ha descrito, se volvió a suspender en aproximadamente 5 ml de una mezcla de MeOH y ACN (3:2, v/v) y se diluyó a 1 :19 con agua para los análisis por HPLC: Estos análisis por HPLC se realizaron como se ha descrito para el ejemplo 1. Los rendimientos de ácido 2-quinoxalina-carboxílico se determinaron a partir de tales análisis por HPLC para varios conjuntos de condiciones experimentales (es decir T1a, T1 b, T2a y T2b), y estos rendimientos se proporcionan en el cuadro 4 siguiente.

CUADRO 4 Como se ilustra por los datos del cuatro 4, la inclusión del microorganismo intacto, es decir A. glauca ATCC N° 22752 o A. repens ATCC N° 14849, da como resultado la oxidación de la 2-metil-quinoxalina para dar el ácido 2-quinoxalina-carboxílico. El % del material de partida, es decir 2-metil-quinoxalina, que queda en T1a, T1b, T2a y T2b es de alrededor de 7%, 7%, 6% y 6%, respectivamente.

EJEMPLO IV Escrutinio en cuanto a la conversión microbiana de 2 -metil-quinoxalina en ácido 2-quinoxalina-carboxílico Células de diversos microorganismos se hicieron crecer en los tubos que contenían 2.5 ml del medio de dextrosa y harina de nutrisoja, como se describe en el ejemplo 1. Tubos individuales se inocularon con esporas o células vegetales (aproximadamente 1% v/v de cultivo de reserva de esporas o células vegetativas) de diversos microorganismos almacenados en forma de suspensiones en glicerol congeladas, y se incubaron a aproximadamente 29°C con agitación (210 rpm) en un agitador rotatorio. Después de aproximadamente 48 horas, se añadieron a cada tubo 0.05 ml de una solución de 10 mg/ml de 2-metil-quinoxalina en DMSO. Después de incubación durante aproximadamente 4 días, el contenido de cada tubo se extrajo, y los extractos individuales se analizaron por HPLC como se ha descrito en el ejemplo 1. Los rendimientos de ácido 2-quinoxalina-carboxíIico se determinaron por HPLC y los resultados se recopilan en el cuadro 5.

CUADRO 5 EJEMPLO V Oxidación de 2-metil-quinoxalina en cultivos en matraz usando P. putida ATCC N° 33015 Se hicieron crecer células P. putida ATCC N° 33015 en el medio (Caldo Nutriente (aproximadamente 32 g/l) y glicerol (aproximadamente 5 g/l)). Se incubaron seis matraces cónicos (de 300 ml de capacidad) que contenían aproximadamente 30 ml del medio con aproximadamente 0.10 ml de una suspensión en glicerol de células de P. putida ATCC N° 33015 previamente almacenadas a alrededor de -70°C. Después de haber añadido aproximadamente 2 ml de p-xileno contenido en un tubo de centrifuga de polipropileno cónico de 15 ml de capacidad (Falcon®, Becton Dickinson Labware) los matraces se cerraron herméticamente con Parafilm® (American National Can) y se agitaron (a alrededor de 225 rpm) en un agitador rotatorio durante alrededor de 18 horas a aproximadamente 29°C. Estos cultivos en matraz tenían una densidad de aproximadamente 1.9 medida a 650 nm. Las células se recogieron a partir de los seis matraces por centrifugación, se lavaron una vez con alrededor de 250 ml de DPBS, y se volvieron a suspender en aproximadamente 20 ml de PBS (Biowhittaker) en un matraz cónico de 300 ml de capacidad. La bioconversión se inició por adición de alrededor de 0.1 ml de una solución de aproximadamente 100 mg/ml de 2-metil-quinoxalina de DMSO, correspondiente a una concentración inicial de aproximadamente 0.5 mg/l. Se continuó la incubación durante alrededor de 4 días a aproximadamente 29°C con agitación a alrededor de 225 rpm. Las muestras del caldo de bioconversión se retiraron en diversos momentos y, después de haber eliminado las células por centrifugación y de haber diluido con MeOH como se requiera, se analizaron por HLPC. Aproximadamente 20 pl de cada una de estas muestras se analizaron por inyección sobre una columna Inertsil® HPLC C8 (4.6 x 250 mm). Cada columna se eluyó a alrededor de 1.0 ml/min con una fase móvil que constaba de una mezcla de ACN y TFA acuoso aproximadamente al 0.05% (1 :4, v/v). Los rendimientos de ácido 2-quinoxalina-carboxílico fueron respectivamente de 86%, 90% y 94% después de alrededor de 1 , 2 y 4 días de incubación, respectivamente.

EJEMMPLO VI Oxidación de 2-metil-quinoxalina en un cultivo en fermentador usando P putida ATCC N° 33015 Se hizo crecer P. putida ATCC N° 33015 en un fermentador con aproximadamente 10 I del medio 5. El fermentador se inoculó con seis cultivos de P. putida cada uno de los cuales se hizo crecer en un matraz cónico (de 300 ml de capacidad) que contenía aproximadamente 50 ml del medio 5.

Cada cultivo en matraz se inoculó con aproximadamente 175 pl de una reserva de esporas de P. putida ATCC N° 33015, se introdujo un tubo de centrifuga de polipropileno de 15 ml de capacidad, que contenía aproximadamente 2 ml de p-xileno y el matraz se cerró herméticamente con Parafilm®. Estos cultivos en matraz se incubaron a aproximadamente 29°C durante alrededor de 17 horas con agitación a alrededor de 210 rpm. Después de inoculación del fermentador con los 6 cultivos en matraz, se añadió p-xileno al fermentador en partes alícuotas de aproximadamente 2 ml aproximadamente 20 minutos durante 2 horas en total. Después de ello, se añadieron al fermentador partes alícuotas de aproximadamente 2.5 ml de p-xileno aproximadamente 20 minutos durante alrededor de 3.5 horas. Luego se interrumpió la adición del xileno y se añadió 2-metil-quinoxalina a aproximadamente las 5.25 horas (alrededor de 1.95 g) y aproximadamente las 7.75 horas (alrededor de 7.76 g) después de la inoculación. Se continuó la incubación durante alrededor de 22 horas después de la adición final de 2-metil-quinoxalina. Una muestra del medio de incubación se centrifugó para eliminar las células, se diluyó con MeOH y se analizó por HPLC usando el método descrito en el ejemplo V. Este análisis reveló un rendimiento de aproximadamente 81% de ácido 2-quinoxalina-carboxílico.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un procedimiento para la oxidación microbiana de 2-metil-quinoxalina para dar ácido 2-quinoxalina-carboxílico, que comprende poner en contacto dicha 2-metil-quinoxalina con un microorganismo e incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para proporcionar una cantidad de dicho ácido 2-quinoxaIina-carboxílico, en el que dicho microorganismo se selecciona entre el grupo que consta de: Absidia glauca ATCC N° 22752, Absidia glauca ATCC N° 74480, Absidia pseudocylindrospora ATCC N° 24169, Absidia repens ATCC N° 14849, Absidia repens ATCC N° 74481 , Actinomucor elegans ATCC N° 6476, Alternaría solani ATCC N° 11078, Aspergillus tamarii ATCC N° 16865, Coniophora puteana ATCC N° 12675, Cunninghamella echinulata ATCC N° 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC N° 8688b, Cunninghamella echinulata ATCC N° 8983, Cunninghamella echinulata ATCC N° 9244, Cunninghamella echinulata ATCC N° 9245, Cunninghamella echinulata ATCC N° 10028b, Cunninghamella echinulata ATCC N° 26269, Cunninghamella echinulata ATCC N° 36190, Cunninghamella echinulata ATCC N° 36112, Cunninghamella homothallica ATCC N° 16161 , Cylindrocarpon destructans ATCC N° 66963, Diplodia goosypina ATCC N° 20575, Epicoccum neglectum ATCC N° 12723, Glomerella lagenaria ATCC N° 14724, Pencillium claviforme ATCC N° 10426, Pencillium duclauxii ATCC N° 10440, Pencillium glabrum ATCC N° 11080, Pseudocochliobolus lunatus ATCC N° 24155, Pseudomonas putida ATCC N° 33015, Pseudomonas putida ATCC N° 202190, Rhodococcus rhodochorus ATCC N° 19067 y Thamnostylum piriforme ATCC N° 8686; y mutantes apropiados de éstos; con la condición de que cuando dicho microorganismo es dicho Pseudomonas putida ATCC N°. 33015 o dicho Pseudomonas putida ATCC N°. 202190, dicho Pseudomonas putida ATCC N°. 33015 o dicho Pseudomonas putida ATCC N°. 202190 es incluido por interacción con un inductor de dicha puesta en contacto de dicho Pseudomonas putida ATCC N°. 33015 o dicho Pseudomonas putida ATCC N°. 202190 con dicha 2-metil-quinoxalina. 2 - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende también asilar el ácido 2-quinoxalina-carboxílico. 3.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho aislamiento se lleva a cabo por extracción de dicha mezcla con un disolvente orgánico. 4.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicho disolvente orgánico es acetato de etilo. 5.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque comprende también someter dicha extracción a cromatografía. 6.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho aislamiento se lleva a cabo por adsorción de dicho ácido 2-quinoxalina-carboxílico adsorbido desde resina con un disolvente orgánico. 7.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha resina es una resina adsorbente polimérica. 8.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque dicho solvente orgánico es acetato de etilo o metanol. 9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende también cristalizar dicho ácido 2-quinoxalina-carboxílico eluido a partir de acetato de etilo. 10.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque comprende también cristalizar dicho ácido 2-quinoxalína-carboxílico eluido a partir de acetato de etilo y metanol. 11.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho microorganismo es un microorganismo intacto. 12.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho microorganismo comprende células lavadas de dicho microorganismo. 13.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende también inmovilizar dichas células lavadas. 14.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dichas células lavadas están en un disolvente acuoso. 15.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicha 2-metil-quinoxalina a dicho disolvente. 16.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicho microorganismo está en un medio de crecimiento. 17.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicha 2-metil-quinoxalina a dicho medio de crecimiento. 18.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho microorganismo se selecciona de dichos Absidia glauca ATCC N°. 22752, Absidia glauca ATCC N°. 74480, Absidia repens ATCC N°.14849, Absidia repens ATCC N°.74481 , Alternaría solani ATCC N°.11078, Aspergillus tamarii ATCC N°.16865, Cunninghamella echinulata ATCC N°. 8983 y Diplodia gossypina ATCC N°. 20575; y dichos mutantes de éstos. 19.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicho microorganismo se selecciona entre el grupo que consta de dichos Absidia glauca ATCC N°. 22752, Absidia glauca ATCC N°. 74480, Absidia repens ATCC N°.14849, Absidia repens ATCC N°.74481 , Alternaría solani ATCC N°.11078, Aspergillus tamarii ATCC N°.16865; y dichos mutantes de éstos. 20.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho microorganismo se selecciona entre el grupo que consta de dichos Absidia glauca ATCC N°. 22752, Absidia glauca ATCC N°. 74480, Absidia repens ATCC N°.14849, Absidia repens ATCC N°.74481 ; y dichos mutantes de éstos. 21.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicho microorganismo es Absidia repens ATCC N°.14849, Absidia repens ATCC N°.74481. 22.- Un procedimiento para la oxidación microbiana de la 2-metil-quinoxalina para dar el ácido 2-quinoxalina-carboxílíco, caracterizado además porque comprende poner en contacto dicha 2-metil-quínoxalina con un microorganismo e incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para proporcionar una cantidad de dicho ácido 2-qu¡noxalina-carboxílico„ caracterizado además porque dicho microorganismo es Absidia repens ATCC N°.14849, Absidia repens ATCC N°.74481 ; y mutantes apropiados de éstos. 23.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho microorganismo está en un medio de crecimiento. 24.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicha 2-metil-quinoxalina a dicho medio de crecimiento. 25.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho microorganismo es dicho Pseudomas putida ATCC N°. 33015 o dicho Pseudomas putida ATCC N°. 202190. 26.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicho inductor es p-xileno. 27.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho Pseudomas putida ATCC N°. 33015 o dicho Pseudomas putida ATCC N°. 202190 está en un medio de crecimiento. 28.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicho p-xileno es añadido a dicho medio de crecimiento. 29.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho medio de crecimiento está dentro de un matraz. 30.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende además la operación de recoger dicho microorganismo después de la terminación de dicha inducción. 31.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha recogida se realiza centrifugando en contenido de dicho matraz, decantando el fluido, lavando el sedimento celular y volviendo a suspender dicho sedimento en un tampón. 32.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado además porque dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicha 2-metil-quinoxalina a dicho tampón de después de dicha resuspensión. + 33.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque dicho medio de crecimiento está dentro de un fermentador. 34.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 33, en el que dicha adición de dicho p-xileno a dicho medio de crecimiento se interrumpe después de dicha inducción. 35.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque dicha puesta en contacto se realiza añadiendo dicha 2-metil-quinoxalina a dicho medio de crecimiento después de dicha interrupción de la adición de dicho p-xileno. 36.- Un procedimiento para la oxidación microbiana de la 2-metil-quinoxalina para dar el ácido 2-quinoxalina-carboxílíco, caracterizado además porque comprende poner en contacto 2-metil-quinoxalina con un microorganismo después de que las enzimas de dicho microorganismo sean inducidas por interacción con un inductor e incubar la mezcla resultante en condiciones suficientes para proporcionar una cantidad de dicho ácido 2-quinoxalina-carboxílíco, caracterizado además porque dicho microorganismo se selecciona entre el grupo que consta de Pseudomas putida ATCC N°. 33015 o dicho Pseudomas putida ATCC N°. 202190; o mutantes apropiados de éstos. 37.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque dicho inductor es p-xileno o m-xileno.