MX2015005444A - Nuevos coadyuvantes y sistemas de administracion para mucosas. - Google Patents

Abstract

Coadyuvantes que comprenden quitosano reticulado con un aldehído o quitosano manosilado. Métodos para elaborarlos. Métodos para combinar o conectar los coadyuvantes con antígenos. Las combinaciones de coadyuvantes y antígenos pueden usarse en formulaciones de vacunas, y las formulaciones de vacunas pueden emplearse en métodos para vacunar los animales contra la fuente de los antígenos o para mejorar la respuesta inmune en ellos.

Description

NUEVOS COADYUVANTES Y SISTEMAS DE ADMINISTRACIÓN PARA MUCOSAS Referencia a solicitudes relacionadas Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/719713, presentada el 29 de Octubre de 2012, que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad.

Antecedentes y campo de la invención « Un coadyuvante es un agente farmacológico o inmunológico que modifica el efecto de otros agentes, tales como las drogas o las vacunas. Los coadyuvantes suelen incluirse en las vacunas tanto para potenciar la respuesta inmune del receptor ante un antígeno suministrado como para minimizar la cantidad que se inyecta del material extraño.

Los coadyuvantes en sí mismos no confieren inmunidad. Los coadyuvantes pueden actuar de diversas maneras en la presentación de los antígenos ante el sistema inmune. Los coadyuvantes pueden actuar como depósitos para los antígenos, de modo tal de presentarlos durante períodos de tiempo prolongados, con lo que puede maximizarse la respuesta inmune antes de que el cuerpo elimine los antígenos. Los ejemplos de los coadyuvantes que pueden actuar como depósitos abarcan emulsiones a base de aceites como el coadyuvante de Freund. Los coadyuvantes también pueden actuar como irritantes, de modo tal de estimular y ampliar la respuesta inmune en el cuerpo. A modo de ejemplo, las vacunas contra el tétanos, contra la difteria y contra la tos ferina contienen cantidades pequeñas de las toxinas que son producidas por cada una de las bacterias blanco, pero también contienen hidróxido de aluminio. Las sales de aluminio son coadyuvantes comunes en las vacunas que se comercializan en los Estados Unidos y han sido usadas durante más de 70 años.

El quitosano es un polisacárido lineal que está compuesto por D-glucosamina con enlaces b-(1-4) (la unidad desacetilada) y N-acetil-D-glucosamina (la unidad acetilada) distribuidas al azar. Se lo produce sometiendo el caparazón de los camarones y de otros crustáceos a un tratamiento con el álcali hidróxido de sodio. El quitosano ha sido empleado como vehículo tanto para las vacunas orales como para las vacunas subcutáneas con un cierto éxito. En la presente se proveen formulaciones coadyuvantes novedosas que están basadas en quitosano y que presentan un desempeño como coadyuvantes que es superior al que puede obtenerse con los coadyuvantes a base de alumbre tradicionales. En particular, los coadyuvantes basados en quitosano que se proveen en la presente fueron eficaces para estimular una respuesta mediada por la IgA.

Sumario de la invención En la presente se proveen coadyuvantes, formulaciones de vacunas que comprenden los coadyuvantes, métodos para elaborar los coadyuvantes y métodos para usar los coadyuvantes y las formulaciones de vacunas. En particular, puede reticularse quitosano y un antígeno mediante el uso de un aldehido. En un aspecto, se provee una composición que comprende entre 0,5% y 2% de quitosano reticulado con aldehido y un antígeno. La concentración final del aldehido en la composición de vacuna es inferior a 0,5%.

En otro aspecto, se provee una composición coadyuvante que comprende un hidrato de carbono unido al quitosano, de manera tal de formar una base de Schiff. El coadyuvante puede combinarse con un antígeno. El hidrato de carbono puede ser la mañosa.

En aun otro aspecto, se proveen formulaciones de vacunas. Las formulaciones de vacunas pueden incluir los coadyuvantes que se proveen en la presente y un antígeno. Los antígenos pueden ser del tipo de las proteínas o de los microbios, donde los microbios apropiados abarcan las bacterias, las levaduras, otros hongos, los parásitos y los virus eucariotas, y pueden estar atenuados, pueden ser recombinantes, pueden estar muertos o pueden haber sido inactivados de otro modo.

En aun otro aspecto, en la presente se proveen métodos para elaborar los coadyuvantes y las composiciones de vacunas. Se disuelve quitosano en una solución de ácido acético y se le agrega un antígeno al quitosano disuelto. Finalmente, el antígeno y el quitosano se combinan con un aldehido, de manera tal que la concentración final del aldehido sea de entre 0,02% y 0,5%. Puede agregarse Tris al coadyuvante para fraguar los aldehidos libres y obtener un coadyuvante más estable.g En un aspecto adicional, también se proveen métodos para mejorar la respuesta inmune de un sujeto ante un antígeno. Los métodos comprenden administrarle al sujeto una formulación de vacuna que comprende un antígeno y un coadyuvante a base de quitosano como los que se describen en la presente. El coadyuvante a base de quitosano puede ser quitosano reticulado con un aldehido o quitosano unido a un hidrato de carbono.

Descripción Breve de los dibujos La figura 1 es un gráfico en el que se representa la respuesta mediada por anticuerpos anti-p-galactosidasa del tipo de la IgG en pavos, después de una vacunación primaria y de refuerzo con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0,05).

La figura 2 es un gráfico en el que se representa la respuesta mediada por anticuerpos del tipo de la IgG contra Clostridium septicum en pavos, después de una vacunación primaria y de refuerzo con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0,05).

Las figuras 3A a 3B representan un conjunto de gráficos en los que se representa la respuesta mediada por anticuerpos del tipo de la IgG (figura 3A) o de la IgA (figura 3B) en pollos, en diversos puntos de tiempo después de una vacunación primaria y de refuerzo con formulaciones de vacunas contra la influenza aviar transportadas por Bacillus con los coadyuvantes indicados.

La figura 4 es un gráfico en el que se representa el nivel de los anticuerpos del tipo de la IgG contra Salmonella, después de una vacunación primaria y de refuerzo con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados, determinado con un ELISA competitivo. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p£0,05).

La figura 5 es un gráfico en el que se representa el nivel de los anticuerpos del tipo de la IgA contra Salmonella, después de una vacunación primaria y de refuerzo con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados, determinado con un ELISA competitivo. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p£0,05).

Las figuras 6A y 6B representan un conjunto de gráficos en los que se representa el nivel de los anticuerpos del tipo de la IgG (figura 6A) o de la IgA (figura 6B) contra Salmonella, después de una vacunación primaria y de refuerzo con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados, determinado con un ELISA competitivo. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0,05).

La figura 7 es un gráfico en el que se representa el porcentaje de recuperación de Salmonella en el hígado y en el bazo (L/S) o en las amígdalas cecales (CT) el día 22 después de una vacunación primaria (el día 3 después de la exposición). El protocolo de vacunación fue idéntico al que se empleó en la figura 6, y * representa p<0,05.

La figura 8 es un gráfico en el que se representa el nivel de los anticuerpos del tipo de la IgA contra Salmonella el día 22 después de una vacunación primaria y de refuerzo (el día 12) con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados, a través de las vías de administración indicadas, determinado con un ELISA competitivo. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0,05).

La figura 9 es un gráfico en el que se representa la respuesta inmune mediada por la IgG ante Salmonella en pollos, después de una vacunación con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados, determinada con un ELISA competitivo. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0,05).

La figura 10 es un gráfico en el que se representa la respuesta inmune mediada por la IgA ante Salmonella en pollos, después de una vacunación con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados, determinada con un ELISA competitivo. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0,05).

La figura 11 es un gráfico en el que se representa la respuesta inmune mediada por la IgG ante Bordetella avium en pavos, después de una única vacunación con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0,05).

La figura 12 es un gráfico en el que se representa la respuesta inmune mediada por la IgG ante Bordetella avium en pavos, después de una vacunación subcutánea con formulaciones de vacunas con los coadyuvantes indicados el día de la eclosión, que fue seguida por una administración de la misma combinación de vacunas y coadyuvantes a través del agua bebible el día 14. La respuesta fue analizada el día 21. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0,05).

Descripción detallada En la presente se proveen coadyuvantes que incluyen quitosano, formulaciones de vacunas que comprenden los coadyuvantes, métodos para elaborar los coadyuvantes y métodos para usar los coadyuvantes y las formulaciones de vacunas. En resumen, en la presente se describe un sistema coadyuvante novedoso que puede emplearse en métodos similares a los que pueden usarse con otros coadyuvantes, tales como los que suelen aplicarse por vía parenteral (por medio de una inyección). La molécula basal comprende quitosano, que es una forma desacetilada de la quitina, la cual constituye el exoesqueleto de numerosos animales invertebrados (tales como los camarones, los cangrejos o los insectos). Se considera que el quitosano es un compuesto generalmente reconocido como seguro (GRAS), y suele usárselo para estimular la pérdida de peso, para disminuir el colesterol, para combatir el insomnio y para mejorar la función renal. El quitosano también se emplea como coadyuvante en diversas vacunas para las mucosas (Jabbal-Gill et al., 2012), pero el quitosano que se describe en la presente es novedoso y funciona mejor que el quitosano tradicional, según se demuestra en los ejemplos.

Las combinaciones de quitosano y proteínas reticuladas con formaldehído y el quitosano unido a hidratos de carbono proveen coadyuvantes únicos para la administración oral o parenteral de antígenos a través de vacunas. El quitosano ha sido usado como vehículo tanto para las vacunas orales como para las vacunas subcutáneas. En algunas de las formulaciones, se une un antígeno a través de enlaces covalentes al quitosano por medio de un tratamiento con formaldehído. En otras, el sistema coadyuvante se mejora mediante la adición de un hidrato de carbono (la mañosa, la fucosa o la galactosa) que se une al quitosano, lo que posibilita la guía hacia los receptores de mañosa en las células presentadoras de antígenos, de modo tal de potenciar la respuesta inmune ante el complejo formado por el quitosano y el antígeno. Tanto las combinaciones de quitosano y proteínas reticuladas con formaldehído como los complejos formados por quitosano manosilado y proteínas dan como resultado una respuesta inmune robusta cuando se los administra por vía parenteral u oral (a través de otra mucosa), que es única para las vacunas inactivadas.

En un aspecto, se provee una composición coadyuvante que comprende un hidrato de carbono unido al quitosano para formar una base de Schiff. El coadyuvante puede combinarse con un antígeno. El hidrato de carbono puede ser la mañosa, la manobiosa, la glucosa, la galactosa o la fructosa. Pueden emplearse otros hidratos de carbono apropiados. Sin que se desee limitar la invención a una la teoría, se cree que la combinación del hidrato de carbono con el quitosano es útil para dirigir el quitosano a los receptores del hidrato de carbono en cuestión, que se encuentran en la superficie de las células presentadoras de antígenos.

La combinación de un hidrato de carbono y el quitosano que se emplea se elabora como se describe con mayor detalle en los ejemplos más adelante. El método empleado se basa en el descripto por Jayasree (Jayasree et al., 2011), y en él se hace reaccionar un hidrato de carbono que comprende un anillo abierto y que tiene un grupo carbonilo disponible con el grupo amino del quitosano, de manera tal de formar una base de Schiff. Esta base de Schiff puede estabilizarse por medio de una reducción con cianoborohidruro de sodio (NaCNBH4). Según puede observarse en la figura 6, donde se compara la forma reducida del quitosano (Man-C VI) con la forma no reducida (Man-C V2), se ha demostrado que esta reducción no es imprescindible para que tenga lugar una inmunopotenciación. La forma no reducida dio como resultado la mejor respuesta mediada por la IgA, aunque puede usarse cualquiera de las formas. Más aun, cuando se emplea una forma no reducida de quitosano manosilado, no es necesario agregar un producto químico tóxico (el NaCNBH4). En resumen, el hidrato de carbono, que apropiadamente es la mañosa (10 mM), se disuelve en acetato de sodio 0,1 M a un pH de 4,0, a una temperatura de 60°C durante 2 horas, y el quitosano (0,2-2%) se disuelve en ácido acético al 1,5%. Luego se combina la mañosa disuelta con el quitosano disuelto y se los incuba a temperatura ambiente para permitir que el grupo amino en el quitosano reaccione con el grupo carbonilo en el azúcar, de modo tal de producir una base de Schiff. No es necesario reducir la base de Schiff para que el coadyuvante pueda funcionar, y de hecho, en los ejemplos se demuestra que una base de Schiff no reducida es un coadyuvante superior (véase la figura 6). En otras formas de realización, la base de Schiff puede reducirse.

En otra forma de realización, puede reticularse el quitosano y un antígeno mediante el uso de un aldehido. En un aspecto, una composición comprende entre 0,5% y 2% de quitosano reticulado con un aldehido y un antígeno. Apropiadamente, la formulación de vacuna final contiene entre 0,5% y 1,5% de quitosano. El coadyuvante puede contener entre 0,5% y 3% de quitosano, apropiadamente contiene entre 0,5% y 2% de quitosano, más apropiadamente contiene entre 0,5% y 1,5% de quitosano, y aun más apropiadamente contiene entre 0,5% y 1,2% de quitosano. Apropiadamente, la concentración final del aldehido en la composición de vacuna es inferior a 0,5%. La concentración máxima de aldehido se basa en el nivel máximo de aldehidos residuales que se permite en las vacunas. Puede usarse un nivel más alto de un aldehido para reticular el quitosano, pero la formulación de vacuna final apropiadamente ha de contener menos de 0,5% del aldehido. En los ejemplos, se usa formaldehído como aldehido para reticular el quitosano. Pueden usarse otros aldehidos, tales como la formalina, el glutaraldehído, el acetaldehído, el propionaldehído o el butiraldehído. Los aldehidos reticulan los grupos amino del quitosano con los que se encuentran en otras moléculas de quitosano o en los antígenos.

En la presente también se proveen métodos para elaborar una formulación de vacuna que comprende quitosano reticulado con un aldehido y un antígeno. Los métodos comprenden disolver el quitosano en una solución de ácido acético. En estos métodos, como quitosano también puede usarse quitosano unido a un hidrato de carbono. Apropiadamente, el ácido acético se usa en una concentración final de 1,5% en agua o en 15 mi de ácido acético disuelto en 1 litro de agua. Apropiadamente, la cantidad de quitosano es de entre 0,5% y 2%, y más apropiadamente es de entre 0,5% y 1,5%. Se le agrega un antígeno al quitosano disuelto en el nivel apropiado. La cantidad de los antígenos que se usan en las formulaciones de vacunas y la forma en la que se los emplea pueden ser determinadas por aquellos versados en la téenica. Finalmente, el antígeno y el quitosano se combinan con el aldehido, de manera tal que la concentración final del aldehido sea de entre 0,02% y 0,5%. El aldehido es útil para reticular químicamente el quitosano con otras moléculas de quitosano, y también para reticular el quitosano con el antígeno. Puede agregarse Tris-HCl para fraguar los aldehidos libres. El Tris puede agregarse en una concentración final de 0,5 g/1.

Cualquier composición coadyuvante de acuerdo con la invención puede combinarse con moléculas potenciadoras, las cuales abarcan, sin limitaciones, la saponina, los receptores del tipo Toll, la subunidad B de una toxina bacteriana, las toxinas bacterianas, el toxoide del tétanos, los motivos CpG, los liposomas y el monofosforil lípido A. Convenientemente, las moléculas potenciadoras también pueden ser útiles para estimular el sistema inmune y para incrementar la respuesta inmune que se produce después de la administración de la formulación de la vacuna en un sujeto.

Las formulaciones de vacunas que se proveen comprenden coadyuvantes basados en quitosano como los que se describen en la presente y antígenos. Los antígenos abarcan todos los antígenos que se encuentran disponibles para aquellos versados en la téenica. En las vacunas, pueden usarse antígenos como las proteínas, los péptidos sintéticos, los péptidos conjugados con vehículos o los microbios. Los microbios abarcan las bacterias, las levaduras, los parásitos, los hongos, los virus, los helmintos y otros organismos causantes de enfermedades. Los microbios pueden tomar la forma de organismos vivos, muertos, atenuados, recombinantes o inactivados. Los ejemplos de los microbios abarcan, sin limitaciones, Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Clostridium, Micoplasma, Staphylococcus, Streptococcus , Bacillus, Influenza y Eimeria. Los microbios pueden inactivarse o matarse antes de usarlos por medio de un tratamiento con calor, con metanol o con otros fijadores, tales como el formaldehído u otros aldehidos. Los aldehidos pueden fraguarse mediante la adición posterior de Tris-HCl en una concentración final de 0,5 g/1. Los antígenos apropiados también pueden incluir antígenos peptídicos como la proteína M2e, la hemaglutinina, la neuraminidasa o las proteínas nucleares de Influenza, las proteínas TRAP o MPP de Eimeria, la sialidasa de Clostridium, la proteína SagA, la toxina alfa, la toxina NetB o la proteína transportadora del hierro. Pueden hallarse ejemplos de otros antígenos peptídicos en las Solicitudes de los EEUU N° 12/441851, 12/740631, 12/740608, 13/574504 y 13/702827, las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad. Los coadyuvantes a base de quitosano pueden emplearse para incrementar la respuesta inmune ante las vacunas ya disponibles, ante las vacunas que puedan ser desarrolladas en el futuro o ante las vacunas autógenas.

Hay dos mejoras significativas a nivel de la vacunación que están asociadas a este trabajo. En primer lugar, cuando se administra quitosano modificado de manera concurrente con una vacuna inactivada por vía parenteral, se observa una respuesta inmune que es superior a la que suele observarse con otros coadyuvantes, tales como el alumbre, con una reacción mínima en el sitio de la inyección. Numerosos coadyuvantes operan provocando una respuesta inflamatoria en el sitio de la inyección y/o dan como resultado una demora en la absorción desde el sitio de la inyección. Una de las desventajas de los coadyuvantes tradicionales es que suelen provocar alguna reacción o dolor, y en algunos casos incluso provocan lesiones persistentes, que se manifiestan como la degradación o el adelgazamiento de los animales productores de carne durante el carneado. Mediante el uso de quitosano modificado, pueden reducirse estas preocupaciones asociadas a otros coadyuvantes para vacunas. La elaboración del quitosano y su aplicación en vacunas comerciales resultan económicas.

Por otro lado, pueden generarse respuestas inmunes robustas cuando se presentan antígenos muertos de manera concurrente por vía oral, mediante el uso de una sonda o a través del agua bebible. Esto es muy importante para los animales domésticos, especialmente para las aves de corral, ya que el protocolo para someterlas a una inyección parenteral es muy laborioso y causa estrés, no solamente en las aves sino también en otros animales. Con la excepción de los procedimientos en las incubadoras, el uso de vacunas inactivadas en las aves de corral generalmente resulta demasiado costoso debido a la naturaleza de la administración. La posibilidad de administrar las vacunas por vía oral ofrece otras opciones para vacunar a los animales. Las vacunas vivas (que se conocen como vacunas vivas modificadas o vacunas atenuadas) tienen dos ventajas principales en el contexto de la administración en masa. En primer lugar, puede realizarse una administración en masa a traves del agua bebible o por medio de una atomización. En segundo lugar, estas vacunas vivas también generan inmunidad en la mucosa local (en las vías respiratorias y en el tracto intestinal, donde tienen lugar las infecciones de la mayoría de los patógenos). Por lo tanto, si bien tanto las vacunas muertas como las vacunas vivas pueden resultar útiles para conferir protección contra las enfermedades, las vacunas vivas de hecho han resultado históricamente más eficaces en el contexto de la prevención de las infecciones, y por lo tanto, son las preferidas.

Las vacunas muertas también tienen ventajas importantes, ya que pueden ser producidas rápidamente, con un riesgo muy bajo de provocar infecciones o enfermedades, y no pueden sufrir cambios genéticos que las conviertan nuevamente en las variantes progenitoras causantes de enfermedades, por lo que están asociadas a menos problemas de reglamentación. Por otro lado, hay una cantidad importante y creciente de enfermedades huérfanas que no son suficientemente comunes para que una compañía productora de vacunas desarrolle una vacuna regulada/permitida, y existen disposiciones en la legislación estadounidense (y de muchos otros países) para la producción de vacunas “autógenas”, específicamente a partir de los patógenos de interés, para lo cual se los mata y se los emplea en los rebaños (o las poblaciones animales o humanas) de origen. En los países en desarrollo, pueden producirse enfermedades huérfanas cuyo tratamiento con vacunas no resulta accesible o factible desde el punto de vista téenico, al menos de manera local o con una rapidez suficiente para hacer frente a los brotes. Los coadyuvantes que se proveen son accesibles, y su elaboración es sencilla desde el punto de vista tecnológico. Es posible combinarlos fácilmente con microbios muertos o inactivados para generar vacunas.

La teenología que se describe en la presente tiene diversas aplicaciones potenciales. La respuesta sistémica ante las vacunas muertas puede mejorarse mediante la incorporación de quitosano modificado como coadyuvante para la inyección. Algunas enfermedades pueden prevenirse por medio de la administración oral de vacunas muertas con la plataforma coadyuvante que se describe en la presente. Cuando se la administra por vía oral, esta plataforma coadyuvante puede resultar útil para estimular las respuestas sistémicas y/o en las mucosas: este abordaje ofrece muchas de las ventajas de las vacunas vivas pero no presenta los problemas asociados a las vacunas vivas que se describen en los antecedentes técnicos.

Los coadyuvantes y las formulaciones de vacunas que se describen en la presente pueden combinarse con otros vehículos farmacéuticamente aceptables. Un vehículo farmacéuticamente aceptable es cualquier vehículo que resulta apropiado para una administración in vivo. Los ejemplos de los vehículos farmacéuticamente aceptables que son apropiados para usarlos en las composiciones incluyen, sin limitaciones, el agua, las soluciones amortiguadas, las soluciones a base de glucosa y los fluidos a base de aceite o de cultivos de bacterias. Pueden incluirse otros componentes en las composiciones de manera apropiada, por ejemplo, excipientes como los estabilizadores, los conservantes, los diluyentes, los emulsionantes o los lubricantes. Los ejemplos de los vehículos o los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen los estabilizadores, tales como los hidratos de carbono (por ejemplo, el sorbitol, el manitol, el almidón, la sacarosa, la glucosa o el dextrano), las proteínas, tales como la albúmina o la caseína, los agentes que contienen proteínas, tales como el suero bovino o la leche descremada, y los amortiguadores (por ejemplo, los amortiguadores a base de fosfato). Especialmente cuando se agregan estabilizadores de este tipo a las composiciones, se obtienen composiciones que son apropiadas para una liofilización o para un secado por aspersión.

Las composiciones también pueden emulsionarse.

Las composiciones que se describen en la presente también pueden combinarse con otras composiciones farmacéuticas, y estas composiciones pueden administrarse en cualquier orden, de manera simultánea o como parte de una misma composición. Las dos composiciones pueden administrarse de manera tal que una sea administrada antes que la otra, con una diferencia de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 20 horas, 1 día, 2 días, 4 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o más en el momento de la administración.

Una cantidad eficaz o una cantidad eficaz para el uso terapéutico de las formulaciones de vacunas, tal como se las emplea en la presente, hacen referencia a una cantidad de las composiciones que, cuando se la administra en un sujeto para incrementar la respuesta inmune ante una enfermedad específica, efectivamente es útil para potenciar la respuesta inmune, lo que abarca tanto la respuesta inmune que es mediada por las células como la respuesta inmune que es mediada por los anticuerpos, y también para limitar la morbilidad o la mortalidad asociada a la infección o la exposición a la enfermedad. Apropiadamente, la respuesta inmune se potencia en un nivel tal que la administración es suficiente para efectuar el tratamiento o el bloqueo de la morbilidad o la mortalidad relacionada con la enfermedad. La cantidad eficaz para el uso terapéutico ha de variar en función de la vacuna, de la formulación o de la composición, de la enfermedad, de su gravedad, de la edad del sujeto, de su peso, de su condición física y de la respuesta en él. A modo de ejemplo, el nivel de los anticuerpos que se producen en respuesta a una vacunación puede incrementarse al doble, al triple, al cuádruple o más mediante la inclusión de un coadyuvante como los que se describen en la presente, en comparación con el resultado que podría obtenerse mediante la administración de un antígeno idéntico en ausencia del coadyuvante o con alumbre como coadyuvante. La respuesta inmune que se incrementa puede ser una respuesta mediada por la IgA o una respuesta mediada por la IgG. El coadyuvante también puede dar como resultado una disminución en la morbilidad o la mortalidad asociada a una infección subsiguiente. Según puede observarse en los ejemplos, el uso de los coadyuvantes que se describen en la presente en combinación con los antígenos puede dar como resultado una disminución en la frecuencia o la gravedad de las infecciones subsiguientes provocadas por el microbio ante el cual los antígenos estimulan una respuesta inmune, en comparación con el resultado que podría obtenerse con una vacunación con los antígenos solos o con una vacunación con los antígenos y un coadyuvante diferente. La gravedad de la infección puede determinarse sobre la base de la capacidad de un microorganismo de invadir los tejidos más allá del sitio en el que se lo ha introducido, de replicarse y/o persistir en el organismo con el correr del tiempo o de provocar morbilidad o mortalidad. Los animales vacunados pueden ser sometidos a una infección subsiguiente con un patógeno. En estos casos, el crecimiento del patógeno después de la exposición en los sujetos que han sido tratados con una vacuna como la que se ha descripto se reduce en un factor de al menos 1 logio, 2 logio o incluso 3 logio, en comparación con lo que podría observarse en los sujetos tratados con un control.

Las composiciones que se describen en la presente pueden administrarse por cualquier medio conocido por aquellos versados en la téenica, lo que abarca, sin limitaciones, la administración oral, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenosa, intramuscular, subcutánea, nasofaríngea o transmucosa. Como consecuencia, los compuestos pueden formularse como formulaciones ingeribles, atomizables o inyectables. A modo de ejemplo, la administración oral puede comprender la adición al agua bebible, la atomización sobre el alimento o la atomización sobre los propios animales (tales como los pollos o los pavos, que ingieren la vacuna atomizada cuando se acicalan las plumas). Los sujetos pueden tomar la forma de animales mamíferos, tales como los seres humanos, las vacas, los cerdos, los gatos, los perros u otros animales domésticos, o de animales no mamíferos, tales como las aves de corral, por ejemplo, los pollos o los pavos.

Ha de apreciarse que la dosis específica administrada y el cronograma de la administración (es decir, la vacunación primaria y de refuerzo) para cada caso se ajustarán en función de la formulación que se desee administrar, de la enfermedad que se desee tratar, del riesgo de exposición, de la condición en la que se encuentre el sujeto y de otros factores médicos relevantes que puedan alterar la respuesta del sujeto o la factibilidad de la administración en el sujeto. A modo de ejemplo, la dosis específica para un sujeto depende de la naturaleza del sujeto, de su edad, de su peso corporal, de su estado de salud en general, de su dieta, del cronograma de la administración, de su modalidad, de la velocidad de la excreción, de los medicamentos empleados en combinación y de la gravedad del trastorno que se desea combatir con la vacuna. La vacunación inicial y la vacunación de refuerzo pueden llevarse a cabo por medios diferentes. Por ejemplo, una vacunación inicial administrada por vía subcutánea puede reforzarse mediante la aplicación de un complejo compuesto por un antígeno y un coadyuvante en el agua bebible o en el alimento. El porcentaje en el que el quitosano está presente en las formulaciones de vacunas generalmente es de entre 0,2% y 2%, y apropiadamente es de entre 0,5% y 1,5%. La cantidad total que se administra del quitosano puede ser de entre 1 mg y 100 mg por vacunación, y apropiadamente es de 2, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 50, 75 ó 100 mg por vacunación. En los ejemplos, se emplearon dosis de quitosano de 2-5 mg. Cuando se realiza una combinación con un antígeno microbiano, el microbio puede ser incluido en una concentración de entre 1 x 106 y 1 x 109 microbios por dosis. En los ejemplos, se usaron entre 1 x 107 y 1 x 108 microbios por dosis. El antígeno puede incluirse en una cantidad de entre 10 mg y 10 mg por dosis. En los ejemplos, se emplearon 100 pg del antígeno por dosis.

Los siguientes ejemplos solamente tienen por objeto ilustrar la invención y no limitar su alcance ni el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias que se citan en la presente se incorporan a modo de referencia en su totalidad.

EJEMPLOS Ejemplo I. Respuesta inmune ante la b-galactosidasa despues de una vacunación primaria y de refuerzo En el primer experimento que se llevó a cabo para analizar una vacuna que contenía una combinación de quitosano y proteínas reticulada con formaldehído, se empleó la proteína tradicional b-galactosidasa (b-Gal) como modelo. Se sometieron pavos juveniles a una vacunación con la b-Gal según se detalla en la tabla 1 más adelante, con seis grupos de tratamiento y un grupo de control. En particular, los pavos juveniles fueron vacunados con solución salina o con la b-Gal, en una cantidad de 100 mg (0,25 mi) en solución salina, en alumbre al 15%, en quitosano reticulado con formaldehído al 1% (3 grupos) o en quitosano no reticulado con formaldehído al 1,5%, por medio de una inyección subcutánea parenteral el día de la eclosión. A todos los grupos se les aplicó una vacunación de refuerzo con la misma fórmula por vía subcutánea los días 14 y 25, con la excepción dos de los grupos que habían sido sometidos al tratamiento con quitosano al 1%: uno de ellos fue sometido a una vacunación de refuerzo con quitosano al 1% combinado con b-Gal por vía oral, mediante el uso de una sonda, mientras que el otro fue sometido a una vacunación de refuerzo con quitosano al 1% combinado con b-Gal por medio de una atomización (2 mi).

La respuesta inmune ante la b-galactosidasa se determinó sometiendo muestras del suero a un ELISA para la b-galactosidasa, y los resultados se representan en la figura 1. El nivel de la respuesta inmune se expresó con un control positivo como referencia, en función de la proporción entre las absorbancias determinadas por medio de un ELISA indirecto. Las proporciones entre las muestras y el control positivo (S/P) más elevadas son una indicación de una titulación superior de anticuerpos anti-b- galactosidasa. En el ELISA en el que se emplearon muestras del suero de los pavos que habían sido vacunados con solución salina, se observó una reactividad transversal escasa, mientras que como resultado de la vacunación con la b-Gal en solución salina, se observó un incremento numérico modesto en la reactividad. Cuando se empleó un coadyuvante comercial de uso habitual en la actualidad, que comprendía alumbre al 15%, se observó una buena respuesta inmune. Cuando se empleó el sistema de vacunas a base de quitosano inmunoestimulado reticulado con formaldehído que se describe en la presente (que se conoce en la presente como el quitosano al 1%), se produjo un incremento significativo en la respuesta inmune ante el antígeno que se usó como modelo, la b-Gal. El uso del quitosano solo, incluso en una concentración mayor, 1,5%, dio como resultado una respuesta inmune significativamente menor. Más aun, cuando el antígeno fue combinado con un coadyuvante que había sido tratado con quitosano y formaldehído al 1 % a través de una atomización o un tratamiento oral, se observó una respuesta comparable con la que se había obtenido como resultado de la administración subcutánea del coadyuvante convencional, compuesto por alumbre al 15%.

Tabla 1. Grupos de tratamiento Ejemplo II. Respuesta inmune ante Clostridium después de una vacunación con diversos coadyuvantes Se llevó a cabo un experimento similar al que se describió con anterioridad, en el cual, el día de la eclosión, se sometieron pavos juveniles a la administración subcutánea (en un volumen 0,25 mi) de 4 x 10 ufe de bacterias Clostridium septicum inactivadas por mi en alumbre o en quitosano reticulado con formalina, de modo tal que la dosis final por ave fuera de 1 x 108 ufe, por separado o en combinación con alumbre al 12% o con quitosano reticulado con formalina al 0,5%. Todas las aves fueron sometidas a una vacunación de refuerzo el día 14 con una vacuna idéntica y a través de la misma ruta. El nivel de la respuesta inmune resultante se determinó por medio de un ELISA indirecto y se expresó con un control positivo como referencia, en función de la proporción entre las absorbancias (S/P). Las proporciones S/P más elevadas son una indicación de la presencia de anticuerpos con una actividad superior contra Clostridium septicum.

En las aves que fueron sometidas al tratamiento con la vacuna sin el coadyuvante, se observó una respuesta mediada por anticuerpos que pudo ser detectada por medio del ELISA, con una proporción S/P de 0,16, según se representa en la figura 2. Este nivel de los anticuerpos no fue diferente desde el punto de vista estadístico del que se había obtenido al combinar Clostridium septicum con el coadyuvante a base de alumbre. Después de aplicar la vacunación de refuerzo (14 días después de la vacunación primaria), en los pavos que fueron vacunados con las bacterias Clostridium septicum inactivadas en combinación con el coadyuvante que comprendía quitosano reticulado con formalina al 0,5%, se observó un nivel de la IgG que dio como resultado una proporción S/P que fue aproximadamente el doble de la que se había observado como resultado de la administración de las bacterias Clostridium septicum inactivadas en ausencia de coadyuvantes, es decir, 0,4 y 0,16, respectivamente. Cuando se administraron las bacterias Clostridium septicum inactivadas en combinación con un coadyuvante a base de hidróxido de aluminio, se indujo un nivel de la IgG que file aproximadamente 30% menor que el que se obtuvo cuando se las administró en combinación con quitosano, con proporciones S/P de 0,27 y 0,4, respectivamente (véase la figura 2). Vale destacar que las lesiones en el sitio de la inyección después de 72 horas (o más tarde) fueron menos pronunciadas como resultado de la administración del quitosano, ya que el alumbre siempre produce inflamaciones y granulomas locales y suele dar como resultado un tejido cicatricial encapsulado.

Ejemplo III. Experimentos de vacunación contra la influenza aviar La influenza aviar es un problema importante para la salud pública y representa una amenaza económica grave para la industria avícola comercial en todo el mundo. En función de la información disponible, puede concluirse que las vacunas a base de Salmonella que comprenden vectores a partir de los cuales se expresa la proteína M2e en combinación con CD154 son eficaces contra la influenza aviar. Se analizaron construcciones novedosas que comprendieron Bacillus subtilis como vector y epitopes de la proteína M2e con diversas moléculas inmunoestimulantes. Los días 11, 15 y 21 después de la eclosión, se determinó el nivel de los anticuerpos del tipo de la IgG con especificidad por la proteína M2e en el suero y el nivel de los anticuerpos del tipo de la IgA con especificidad por la proteína M2e en las mucosas por medio de un ELISA. El día de la eclosión, los pollos fueron sometidos a una vacunación por vía oral, mediante el uso de una sonda, o por vía subcutánea, con un Bacillus salvaje (BSBB), con una vacuna contra la influenza aviar transportada con Bacillus (BSAI) como vacuna viva, con una vacuna contra la influenza aviar transportada con un Bacillus inactivado con formalina, con una vacuna contra la influenza aviar transportada con un Bacillus inactivado con formalina, que posteriormente fue liofilizada y reconstituida con solución salina, o con una vacuna contra la influenza aviar transportada con un Bacillus inactivado con formalina, que posteriormente fue reticulada con quitosano al 1 %. Cada una de las vacunas fue administrada en una dosis de 106 cfu/pollo, en 0,25 mi de solución salina. El 10o día después de la eclosión, a los pollos de dos de los grupos (los que habían sido tratados con la vacuna transportada con un Bacillus vivo o con la vacuna transportada con un Bacillus inactivado que posteriormente había sido liofilizada) se les aplicó una vacunación de refuerzo con el mismo tratamiento que se les había administrado el día 0, mientras que a los pollos de los grupos restantes no se les administró una segunda vacuna.

Los días 11, 15 y 21 después de la eclosión, se tomaron muestras de las aves de todos los grupos para analizar la IgG en el suero y la IgA en las mucosas y se llevó a cabo un ELISA para capturar los anticuerpos. Las placas se recubrieron con una proteína M2e que había sido conjugada con BSA (10 mg/ml), se bloquearon, se incubaron con muestras de suero de los pollos de cada uno de los grupos de tratamiento, que habían sido sometidas a una dilución de 1 :50 en FBS/PBS al 2% y a una incubación con un anticuerpo secundario conjugado con HRP en una dilución de 1:7500, y se revelaron con el sustrato TMB. Los resultados se expresan como la media de la proporción S/P: (media de la muestra - media del control negativo)/(media del control positivo - media del control negativo) ± el error estándar de la media (n = 20).

En comparación con el control, que había sido tratado con un Bacillus salvaje (BSBB), se observó un incremento significativo en la respuesta mediada por los anticuerpos del tipo de la IgG con especificidad por la proteína M2e en cada uno de los grupos vacunados y en cada uno de los puntos de tiempo que se analizaron. Sin embargo, no se observaron diferencias en la magnitud del incremento en la respuesta mediada por los anticuerpos del tipo de la IgG dentro de ninguno de los puntos de tiempo en los seis grupos vacunados (véase la figura 3A). La diferencia verdadera en la respuesta inmune resulta evidente cuando observa la respuesta mediada por los anticuerpos específicos del tipo de la IgA en las mucosas (véase la figura 3B). La administración de la vacuna contra la influenza aviar transportada con Bacillus en combinación con quitosano al 1% dio como resultado un incremento notable en la respuesta específica mediada por los anticuerpos del tipo de la IgA, tanto en comparación con el control como en comparación con los otros cinco grupos de tratamiento en los tres puntos de tiempo que se analizaron.

En resumen, por medio de los experimentos en los que se usó quitosano reticulado, fue posible comprobar que esta modificación en el quitosano dio como resultado un coadyuvante que presentó un desempeño superior al de los coadyuvantes basados en hidróxido de aluminio, tanto por vía parenteral como por vía oral (figuras 1 y 2). También se demostró que el quitosano tratado con formaldehído como agente de reticulación fue más eficaz que el quitosano sin formaldehído (figura 1). Cuando se llevó a cabo una aplicación por vía oral, el quitosano dio como resultado un incremento en la producción de la IgA (figura 3B) con relación a la producción de la IgG (figura 3A).

Ejemplo IV. Mejora del coadyuvante a base de quitosano El coadyuvante a base de quitosano fue sometido a una serie de experimentos que fueron diseñados para mejorarlo, en los cuales se le agregaron moléculas potencialmente útiles o se recurrió a estrategias de administración alternativas. Los compuestos inmunoestimulantes pueden dar como resultado una mejora a nivel de la respuesta cuando se los emplea en combinación con coadyuvantes, y esta posibilidad ya ha sido investigada (véanse las revisiones de Guy, 2007, y de Mutwiri et al., 2011). Los coadyuvantes potenciales pueden tomar la forma de saponinas, de diversos componentes de las bacterias, de compuestos que pueden interactuar con el sistema inmune innato, tales como los receptores del tipo Toll, de ácidos nucleicos, tales como los motivos CpG, de virus, que pueden administrarse a través de emulsiones en liposomas, o de combinaciones de cualquiera de estos componentes. Algunas de las moléculas inmunoestimulantes más prometedoras que pueden interactuar con el sistema inmune innato son el toxoide del tétanos (TT), la subunidad B de la enterotoxina lábil ante el calor (LTB) y la subunidad B de la toxina del cólera (CTB). Otros compuestos de los que se ha comprobado de manera empírica que resultan útiles para mejorar el sistema inmune debido a sus propiedades químicas innatas incluyen las saponinas y el monofosforil lípido A (MPLA). El uso de mañosa o de otros azúcares para poner en práctica el direccionamiento hacia los receptores correspondientes en los macrófagos también puede dar como resultado una mejora a nivel de la función inmune. Las combinaciones de diversos coadyuvantes pueden tener un efecto sinérgico en el contexto de la estimulación de la respuesta inmune, como es el caso de las combinaciones que comprenden IL-12 u otras citoquinas.

En el primer experimento para mejorar el coadyuvante, se empleó un coadyuvante a base de quitosano reticulado con formaldehído, que estuvo compuesto por un antígeno de interés combinado con quitosano reticulado con formaldehído al 0,5%, y con él se obtuvieron los resultados que se detallan en las figuras 1-3. Posteriormente, este sistema coadyuvante fue usado como control o como línea de referencia para la selección de las combinaciones de moléculas más útiles para mejorar la respuesta inmune. El inmunógeno que se analizó fue una bacteria Salmonella enteritidis que había sido cultivada a razón de 108 ufc/ml y que había sido inactivada con formaldehído. Para determinar si el coadyuvante a base de quitosano reticulado podía ser sometido a una mejora adicional, el inmunógeno analizado (las bacterias Salmonella inactivadas combinadas con quitosano a razón de 4 x 107 ufc/ml, con una dosis final de 1 x 107 ufe por ave) se mezcló en una proporción de 2:1 con quitosano reticulado normal o con quitosano reticulado mejorado con el toxoide del tétanos (TT) o con la subunidad B de la enterotoxina lábil ante el calor (LTB) o con quitosano manosilado, y se administró a través del agua bebible o el alimento. Los resultados se proveen en la figura 4.

El toxoide del tétanos puede resultar útil para mejorar la respuesta inmune y ha sido empleado ampliamente en el contexto del desarrollo de vacunas. Se ha demostrado que la enterotoxina lábil ante el calor de E. coli es una molécula inmunoestimulante potente, pero resulta muy tóxica y no es apropiada como coadyuvante. La enterotoxina lábil ante el calor consiste en de dos subunidades: un núcleo central LTA y cinco subunidades LTB (da Hora et al., 2011). Las subunidades LTB no son tóxicas y conservan propiedades que las toman potencialmente útiles como coadyuvantes para la respuesta inmune. Por lo tanto, las subunidades podrían ser usadas como coadyuvantes de manera segura. La mañosa y algunos otros hidratos de carbono (tales como la galactosa o la fucosa) son ligandos de los receptores que activan los macrófagos. El quitosano manosilado se preparó con un método similar que había sido descripto con anterioridad por Yalpani y Hall (1980 y 1985) y por Jayasree et al. (2011), aunque sin la adición de cinc. En resumen, se calentaron dos equivalentes molares de mañosa en un volumen de acetato de sodio 0,1 M a 60°C durante dos horas. A continuación, la solución se combinó con dos volúmenes de un equivalente molar de quitosano al 2% en ácido acético al 0,15% y se dejó reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente, de manera tal de obtener quitosano manosilado al 1,5%. Luego se combinaron bacterias Salmonella enteritidis inactivadas con el quitosano manosilado al 1,5% en una proporción de dos a uno. Las bases de Schiff que se formaron fueron sometidas posteriormente a una reducción con cianoborohidruro de sodio (NaCNBH4).

Según se indicó con anterioridad, además de las moléculas inmunopotenciadoras que se han descripto, se analizaron diversos sistemas de administración. El sistema que suele usarse en la industria de las aves de corral, que está basado en una administración a través del agua bebible, abarca la dilución de una parte de la droga o el producto químico deseado en 128 partes de agua. De esta manera, la fórmula original que se usó para analizar la utilidad del sistema para administrar el quitosano en las figuras 1-3 comprendió una dilución de 1:128 en el agua bebible. Al último grupo analizado se le administró una preparación que comprendió quitosano reticulado con formaldehído al 0,5% en combinación con bacterias Salmonella enteritidis inactivadas y encapsuladas (la fórmula original para el quitosano), que füe agregada por goteo a una solución de tripolifosfato (TPP), fue secada, fue triturada hasta obtener un polvo y fue combinada con el alimento en una proporción de 0,5% (peso/peso).

El día de la eclosión, se sometieron pollos de engorde a una vacunación de cebado que comprendió la administración subcutánea de 0,25 mi de las preparaciones que se describieron con anterioridad. Estos grupos fueron cebados de manera simultánea con el grupo que solamente fue tratado con quitosano. A los pollos se les administró una vacunación de refuerzo por vía oral, mediante el uso de una sonda, cuando alcanzaron una edad de 12 días, con la excepción de los pollos pertenecientes al grupo que había sido sometido al tratamiento a través del agua bebible o al grupo que había sido tratado con la solución de tripolifosfato, a los cuales se les administró la vacunación de refuerzo en una dilución de 1:128 en agua o en una proporción de 0,5% (peso/peso) en el alimento durante 8 horas, respectivamente. El día 22, se determinó nivel de los anticuerpos en el suero (en el caso de la IgG) o en la mucosa del ilion (en el caso de la IgA) con un conjunto de elementos apropiado para poner en práctica un ELISA competitivo (de Idexx). Un nivel absorbancia inferior o una proporción más baja entre una muestra y el control correspondiente fueron indicaciones de la presencia de un nivel más alto de anticuerpos que pudieron reconocer la flagelina de Salmonella enteritidis que se había aplicado como recubrimiento sobre las placas.

Según puede observarse en las figuras 1 y 2, el coadyuvante a base de quitosano fue superior al coadyuvante a base de alumbre en el contexto de la generación de una respuesta inmune robusta. En este caso, cada uno de los coadyuvantes a base de quitosano dio como resultado una respuesta robusta ante las bacterias Salmonella enteritidis inactivadas, que se tradujo en un nivel tanto de la IgG como de la IgA que fue significativamente más alto que el que se obtuvo cuando se administró el quitosano solo por vía subcutánea (figuras 4 y 5, respectivamente). En los grupos que fueron sometidos al tratamiento con el toxoide del tétanos o con el tripolifosfato en forma de polvo seco, fue posible observar una respuesta inmune significativamente más elevada que en el grupo que había sido cebado con un coadyuvante a base de quitosano por medio de una inyección subcutánea y que había sido sometido a una vacunación de refuerzo con el mismo coadyuvante por la misma vía (figuras 4 y 5). En los otros tres grupos, que fueron sometidos a una vacunación de refuerzo con quitosano combinado con la subunidad de la enterotoxina lábil ante el calor, con quitosano manosilado o con quitosano solo a través del agua bebible, se observó una producción de anticuerpos que fue consistentemente superior a la que se observó en el grupo al que se le administró quitosano solo por vía subcutánea (figuras 4 y 5).

En la siguiente serie de experimentos, los tres mejores grupos del experimento anterior (los que fueron sometidos a la vacunación de refuerzo con la subunidad de la enterotoxina lábil ante el calor, con quitosano en el agua bebible o con quitosano manosilado reducido) fueron sometidos a un análisis junto con un control negativo (que fue tratado con solución salina) y un control de referencia (que fue tratado con quitosano reticulado con formaldehído al 0,5%, del que se había demostrado que era superior al alumbre, que fue administrado por vía subcutánea como vacunación principal y de refuerzo). En este experimento, se agregaron otros tres grupos de tratamiento que se basaron en el control de referencia: se les aplicó un tratamiento con quitosano reticulado con formaldehído al 0,5% inmunopotenciado con la subunidad B de la toxina del cólera (CTB), con el lípido A de Salmonella (MPLA) o con una saponina. En este experimento también se agregó un grupo de tratamiento que fue similar al que fue sometido al tratamiento con quitosano manosilado, del que se había comprobado que podía ser un coadyuvante excelente en el experimento anterior: se lo sometió a un tratamiento con la variante manosilada del quitosano 1 (Man-C VI), pero sin una reducción con NaCNBH4 (Man-C V2).

En el ELISA competitivo en el que se analizó la flagelina de Salmonella enteritidis, se observó una vez más que las aves que fueron sometidas a un tratamiento subcutáneo con quitosano al 0,5% (C), tanto en el caso de la vacunación primaria como en el caso de la vacunación de refuerzo, presentaron un nivel de inmunoglobulinas más alto en el suero (figura 6A). En las aves que fueron vacunadas con quitosano al 0,5% en combinación con la subunidad B de la toxina del cólera (C + CTB), con la variante manosilada del quitosano 2 o con quitosano combinado con una saponina (C + saponina), se observó la mejor respuesta mediada por la IgG (figura 6A). La variante manosilada del quitosano 2 dio como resultado la mejor respuesta numérica mediada por la IgA (figura 6B). Estos tres grupos de tratamiento fueron significativamente diferentes del grupo de referencia (que había sido sometido a un tratamiento con quitosano reticulado con formaldehído al 0,5% administrado por vía subcutánea como vacunación principal y de refuerzo) (figura 6).

Por otra parte, el día 19, los pollos fueron expuestos a bacterias Salmonella vivas, a razón de 5 x 10 ufc/pollo. Tres días después de la exposición, se tomaron muestras de las aves para llevar a cabo un cultivo y analizar la presencia de Salmonella en la amígdala cecal (TC) y en el hígado/bazo (L/S). El quitosano combinado con la subunidad B de la toxina del cólera, las dos variantes manosiladas del quitosano, el quitosano administrado por sí solo a través del agua bebible y el quitosano combinado con una saponina dieron como resultado una disminución significativa en el nivel de Salmonella en el hígado/bazo (L/S), hasta el punto en el que el nivel fue inferior al límite de detección, en comparación con el control negativo (que había sido tratado con solución salina) (figura 7, p<0,05). El nivel de Salmonella en el intestino (CT) se redujo de manera significativa como resultado del tratamiento con cualquiera de las dos variantes manosiladas del quitosano o del quitosano al 0,5% por sí solo en una dilución de 1:128 en el agua bebible. La disminución significativa que se observó en los grupos que fueron sometidos al tratamiento con el quitosano manosilado es una indicación de que una guía directa hacia los macrófagos mediante el uso de un ligando para los receptores de mañosa es útil para incrementar la eficacia de los coadyuvantes a base de quitosano. También vale destacar que la formulación no reducida que comprendió la base de Schiff del quitosano manosilado fue tan eficaz como la que comprendió quitosano manosilado reducido con NaCNBH4, por lo que no es necesario agregar un producto químico potencialmente dañino. Otro resultado sorprendente fue que la vacunación de refuerzo basada en la administración de quitosano al 0,5% en una dilución de 1:128 en el agua bebible tuvo un desempeño en el contexto de la disminución de la colonización por parte de Salmonella que fue superior al de la vacunación exclusiva por vía parenteral (figura 7).

Ejemplo V. Ruta para la administración de la vacunación Se analizó la mejor combinación de rutas y coadyuvantes para la vacunación. El día de la eclosión, se sometieron pollos a un tratamiento con 0,25 mi de solución salina o de la vacuna combinada con la mezcla coadyuvante correspondiente, según se representa en la figura 8. Los coadyuvantes que se compararon incluyeron quitosano reticulado con formaldehído, quitosano manosilado reducido (Man-C VI) y quitosano manosilado no reducido (Man-C V2): cada uno de ellos fue combinado con un antígeno y fue administrado el día de la eclosión, ya sea por vía subcutánea o a través del agua bebible. Las aves fueron sometidas a una vacunación de refuerzo con una segunda administración de la misma combinación de antígenos y coadyuvantes, ya sea por vía subcutánea, a través del agua bebible o por vía oral, mediante el uso de una sonda. Cuando la vacunación se llevó a cabo a través del agua bebible, se recurrió a una dilución de 1:128. Cuando la vacunación se aplicó por vía oral, por medio de una sonda, se administró un volumen de 0,25 mi. La respuesta mediada por la IgA en las mucosas se analizó sobre la base de la presencia de la flagelina de Salmonella enteritidis, por medio de un ELISA competitivo (de Idexx), según se describió con anterioridad. Aunque los cinco últimos grupos de tratamiento en la figura 8 no fueron significativamente diferentes, el grupo que presentó el resultado numérico más bajo fue el que había sido sometido a una vacunación primaria con quitosano manosilado V2 por vía subcutánea y a una vacunación de refuerzo con el mismo coadyuvante en una dilución de 1:128 en el agua bebible. En este grupo, el nivel de la IgA en el ilion fúe significativamente más alto que en los grupos que habían sido sometidos a una vacunación primaria con quitosano al 0,5% por vía subcutánea y a una vacunación de refuerzo con el mismo coadyuvante por vía subcutánea o a través del agua bebible. No se observaron diferencias significativas entre la forma reducida y la forma no reducida del quitosano manosilado ni como resultado de la administración de la vacunación de refuerzo a través del agua bebible o por vía oral, mediante el uso de una sonda.

Ejemplo VI. Comparación con un coadyuvante a base de aceite mineral Luego se comparó y se combinó el quitosano manosilado con un coadyuvante a base de aceite mineral disponible en el ámbito comercial. Como antígeno, g se usaron bacterias Salmonella enteritidis que habían sido cultivadas a razón de 10 ufc/ml y que habían sido inactivadas con formaldehído. Las bacterias Salmonella se mezclaron con quitosano, con quitosano manosilado, con un coadyuvante a base de aceite mineral, con una combinación del quitosano y el coadyuvante a base de aceite mineral o con PBS, a razón de 4 X 107 ufc/ml, con una dosis final de 1 X 107 ufe por ave en una proporción de 2:1. El día de la eclosión, se sometieron pollos de engorde a una vacunación de cebado que comprendió la administración subcutánea de 0,25 mi de las preparaciones que se describieron con anterioridad. A los pollos se les administró una vacunación de refuerzo por vía oral, mediante el uso de una sonda, cuando alcanzaron una edad de 12 días. El día 22, se determinó nivel de los anticuerpos en el suero (en el caso de la IgG) o en la mucosa del ilion (en el caso de la IgA) con un conjunto de elementos apropiado para poner en práctica un ELISA competitivo (de Idexx), y los resultados se proveen en las figuras 9 y 10, respectivamente. Un nivel absorbancia inferior o una proporción más baja entre una muestra y el control correspondiente fueron indicaciones de la presencia de un nivel más alto de anticuerpos que pudieron reconocer la flagelina de Salmonella enteritidis que se había aplicado como recubrimiento sobre las placas. El protocolo de vacunación primaria y de refuerzo con quitosano manosilado producida dio como resultado un incremento significativo en el nivel de la IgG y de la IgA en comparación con los otros grupos.

Ejemplo VIL mediada por la IgG de una única administración Para analizar la respuesta inmune mediada por la IgG después de una única vacunación parenteral, el día de la eclosión, se sometieron pollos a una vacunación subcutánea con 2,5 x 108 ufc/pollo de bacterias Bordetella avium inactivadas combinadas con solución salina, con quitosano normal o con quitosano manosilado. Se tomaron muestras del suero el día 14 y se determinó la cantidad de IgG con especificidad por Bordetella por medio de un ELISA. Los resultados se proveen en la figura 11, donde se representa la proporción entre la absorbancia en las muestras que se tomaron de los grupos que fueron sometidos a los tratamientos indicados y la absorbancia en las muestras provenientes del grupo de control positivo. Una absorbancia más elevada es una indicación de una mayor cantidad de IgG específica. El quitosano manosilado combinado con el antígeno de Bordetella dio como resultado el nivel más alto de IgG.

Ejemplo VIII. Respuesta mediada por la IgG despues de una vacunación de refuerzo a través del agua bebible El objetivo fue analizar la respuesta inmune mediada por la IgG después de la administración subcutánea de bacterias Bordetella avium, seguida por una vacunación de refuerzo a través del agua bebible el día 14. El día de la eclosión, se sometieron pollos a una vacunación subcutánea con 2,5 x 108 ufc/pollo de bacterias Bordetella avium inactivadas combinadas con solución salina, con quitosano normal o con quitosano manosilado. El día 14, se aplicaron 7,8 x 106 ufc/ml de bacterias Bordetella avium inactivadas a través del agua bebible como vacunación de refuerzo. El día 21, 7 días después de aplicar la vacunación de refuerzo, se tomaron muestras del suero y se analizó la respuesta específica mediada por la IgG por medio de un ELISA. Los resultados se proveen en la figura 12, donde se representa la proporción entre la absorbancia en las muestras que se tomaron de los grupos que fueron sometidos a los tratamientos indicados y la absorbancia en las muestras provenientes del grupo de control positivo. Una absorbancia más elevada es una indicación de una mayor cantidad de IgG específica. El quitosano manosilado combinado con el antígeno de Bordetella dio como resultado un nivel de la IgG que fue significativamente más alto que el que se observó en el control o como resultado de la administración del quitosano no modificado.

Metodos para preparar los coadyuvantes Preparación de una vacuna basada en una combinación de quitosano y proteínas reticulada con formaldehído Una formulación de vacuna final compuesta por quitosano sin mañosa puede comprender una concentración final de quitosano que puede variar entre un mínimo de 0,5% y un máximo de 2%. El quitosano se disuelve en la concentración apropiada en una solución que contiene 15 mi de ácido acético glacial por 1 de agua desionizada (ácido acético al 1,5% en agua). En el caso de los cultivos en caldos, típicamente se combinan 2 volúmenes con un volumen de quitosano al 1,5% (con 0,5% de quitosano en la formulación de vacuna final). Los otros antígenos se diluyen en la menor medida posible, de modo tal de obtener una concentración final de quitosano de hasta 1,5%. Luego se agrega el formaldehído a la mezcla que contiene el quitosano disuelto y el antígeno, de modo tal que la concentración final del formaldehído sea de 0,2% o de 0,008 M. En los ejemplos anteriores, se empleó una solución de formaldehído al 37%. Puede agregarse Tris-HCl en una concentración final de 0,5 g/1.

Preparación del quitosano manosilado Se calientan dos equivalentes molares de mañosa en un volumen de acetato de sodio 0,1 M con un pH de 4,0 a 60°C durante dos horas. Luego se combina la solución con dos volúmenes de un equivalente molar de quitosano al 2% en ácido acético al 0,15% y se permite que la reacción proceda durante 10 minutos a temperatura ambiente, de manera tal de obtener una solución de quitosano manosilado al 1,5%. Esta puede ser mezclada con cultivos en caldos, para lo cual pueden combinarse 2 volúmenes de un cultivo con un volumen del quitosano manosilado al 1,5%. Los antígenos concentrados pueden ser diluidos en la menor medida posible o en la medida deseada. Puede agregarse Tris-HCl en una concentración final de 0,5 g/1.

Claims (29)

REIVINDICACIONES

1. Una composición coadyuvante que comprende un hidrato de carbono unido al quitosano, de manera tal de formar una base de Schiff.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, donde el hidrato de carbono se selecciona entre la mañosa, la manobiosa, la glucosa, la galactosa y la fructosa.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, donde el hidrato de carbono es la mañosa.

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la base de Schiff no se reduce.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la base de Schiff se reduce.

6. Una composición coadyuvante que comprende entre 0,5% y 2% de quitosano reticulado con un aldehido.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, donde el quitosano es reticulado con formaldehído.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7, que también comprende Tris-HCl para fraguar los aldehidos libres.

9. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que también comprende una molécula potenciadora.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, donde la molécula potenciadora es una saponina, un receptor del tipo Toll, la subunidad B de una toxina bacteriana, una toxina bacteriana, un motivo CpG, un liposoma o el monofosforil lípido A.

11. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, donde la molécula potenciadora es el toxoide del tétanos, la subunidad B de la toxina del cólera, la subunidad B de la enterotoxina lábil ante el calor o el tripolifosfato.

12. Una formulación de vacuna que comprende una composición coadyuvante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y un antígeno.

13. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, donde el antígeno es una proteína.

14. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 13, donde la proteína es la proteína M2e, la hemaglutinina, la neuraminidasa o las proteínas nucleares de Influenza, las proteínas TRAP o MPP de Eimeria, la sialidasa de Clostridium, la proteína SagA, la toxina alfa, la toxina NetB o la proteína transportadora del hierro.

15. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 12, donde el antígeno comprende un microbio.

16. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 15, donde el microbio es Salmonella, Escherichia, Shigella, Bordetella, Clostridium, Micoplasma, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Influenza o Eimeria.

17. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, donde el microbio está inactivado o muerto.

18. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 17, donde el microbio es exterminado con formaldehído, con glutaraldehído o con formalina.

19. Un método para elaborar una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende disolver el quitosano en una solución de ácido acético, agregarle un antígeno al quitosano disuelto y combinar el quitosano disuelto y el antígeno con un aldehido, de manera tal que la concentración final del aldehido sea de entre 0,02% y 0,5%.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, donde el antígeno es una proteína.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 19, donde el antígeno es una vacuna basada en un microbio.

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19- 21, que también comprende agregar Tris-HCl para fraguar los aldehidos libres.

23. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19- 22, donde el aldehido se agrega en una concentración final de 0,2%.

24. Un método para mejorar la respuesta inmune de un sujeto ante un antígeno, que comprende administrarle al sujeto una formulación de vacuna de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-18.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, donde la respuesta inmune incluye una respuesta mediada por anticuerpos que es superior a la que podría obtenerse como resultado de la administración de una vacuna sin un coadyuvante.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, con el cual se obtiene una respuesta mediada por anticuerpos del tipo de la IgA secretados que es superior a la que podría obtenerse como resultado de la administración de una vacuna sin un coadyuvante.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 26, donde la respuesta mediada por la IgA después de la administración de la vacuna es al menos el doble de la que podría observarse en el mismo sujeto después de la administración de un vector de control.

28. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24- 27, donde el sujeto es un mamífero o un ave.

29. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24- 28, donde la vía de administración es subcutánea u oral.