MX2014015985A - Composiciones y metodos para tratar enfermedades. - Google Patents

Composiciones y metodos para tratar enfermedades.

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Barry John Byrne
Darin J Falk
Christina Pacak
Lara Robert Deruisseau
Cathryn Mah
David D Fuller
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Abstract

La presente invención provee composiciones y métodos de uso pertenecientes al suministro mediado por rAAV de moléculas terapéuticamente eficaces para el tratamiento de enfermedades como la enfermedad de Pompe; estas composiciones, en combinación con varias vías y métodos de administración, resultan en la expresión dirigida de moléculas terapéuticas en órganos, tejidos y células específicas.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA TRATAR ENFERMEDADES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de EE. UU. No. de serie 13/527,350, presentada el 19 de junio de 2012; que es una continuación en parte de la solicitud de EE. UU. No. de serie 12/305,869, presentada el 12 de abril de 2010; que es una solicitud de fase nacional §371 de la solicitud internacional No. PCT/US2008/054911, presentada el 25 de febrero de 2008, que reclama el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. No. 60/891,369, presentada el 23 de febrero de 2007, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
DECLARACIÓN CON RESPECTO A INVESTIGACIÓN O DESARROLLO PATROCINADO FEDERALMENTE La invención fue realizada con apoyo de gobierno de EE. UU. bajo las subvenciones Nos. HL59412 y NIH 5F32HL095282-03 concedidas por el Heart, Lung and Blood Institute de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. El gobierno de EE. UU. tiene ciertos derechos sobre esta invención.
CAMPO DE LA INVENCIÓN En terminos generales, la invención se refiere al campo de la biología molecular, terapia de genes y medicina. En una modalidad, la invención provee un tratamiento basado en terapia de gen para enfermedades neuromusculares y de almacenamiento lisosomal.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Pompe es tanto un trastorno lisosomal como de almacenamiento de glucógeno que se origina de la deficiencia de la a-glucosidasa ácida (GAA). La GAA normalmente es activa en el lisosoma en donde degrada el exceso de glucógeno escindiendo los enlaces a-1,4 y a-1,6 glucosídicos. Sin una actividad de GAA adecuada, se acumulan en todas las células cantidades masivas de glucógeno. A pesar de la acumulación sistémica de glucógeno lisosomal en la enfermedad de Pompe, la disfunción del músculo esquelético y cardiaco tradicionalmente se ha considerado como la base principal de la debilidad muscular en este trastorno.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee vectores de rAAV para el suministro de genes terapéuticos a varios tejidos, órganos y células, que incluyen músculo esqueletico, el corazón y el SNC, para la restauración de la integridad de la unión neuromuscular, y/o para el tratamiento de enfermedades neuromusculares y enfermedades de almacenamiento de glucógeno. Convenientemente, los vectores de rAAV de la presente invención proveen la expresión sostenida a largo plazo del gen terapéutico de interés en un sujeto.
En algunas modalidades, la presente invención provee el tratamiento de enfermedades neuromusculares que incluyen, sin limitación, enfermedad de Pompe, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo 1a, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth, y miastenia grave.
En una modalidad, se describen aquí composiciones y métodos para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, enfermedades de almacenamiento de glucógeno, como la de Pompe).
A menos que se defina de otra forma, todos los términos téenicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica al cual pertenece esta invención.
En una modalidad, un método descrito en la presente incluye administrar a un sujeto mamífero que tiene una deficiencia de alfa-glucosidasa, una composición que incluye por lo menos un virión de rAAV que incluye un polinucleótido que codifica alfa-glucosidasa ácida, el polinucleótido interpuesto entre una primera repetición terminal invertida de AAV y una segunda repetición terminal invertida de AAV, en donde la administración de la composición resulta en un aumento de la función motoneuronal en el sujeto mamífero. El sujeto mamífero puede tener la enfermedad de Pompe. La composición se puede administrar por vía intravenosa, intratecal o intramuscular. En una modalidad, el virión de rAAV, por lo menos uno, puede incluir proteínas de la cápside del serotipo 1, 8, 9 y/o rh10. La composición se puede administrar al diafragma del sujeto mamífero y viajar a por lo menos una neurona motora por medio de transporte retrógrado, o se puede administrar directamente al sistema nervioso central.
Otro metodo descrito en la presente incluye administrar a un sujeto mamífero que tiene la enfermedad de Pompe una composición que incluye por lo menos un vector viral que codifica alfa-glucosidasa ácida, en donde la administración de la composición resulta en un aumento de la función neuromotora en el sujeto mamífero y en el tratamiento de la enfermedad de Pompe. El vector viral, por lo menos uno, puede ser un vector de rAAV. La composición se puede administrar por vía intratecal, intravenosa, intramuscular o parenteral. En una modalidad, el vector de rAAV puede estar dentro de un virión de rAAV que incluye las proteínas de la cápside del serotipo 1 , 8, 9 y/o rh10.
La composición se puede administrar al diafragma del sujeto mamífero y viajar por lo menos a una neurona motora por medio de transporte retrógrado, o se puede administrar al sistema nervioso central.
Aunque se pueden usar composiciones y métodos similares o equivalentes a los que se describen en la presente para practicar o probar la presente invención, más abajo se describen composiciones y metodos adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes mencionadas en la presente se incorporan aquí como referencia en su totalidad. En caso de conflicto predominará la presente especificación incluyendo las definiciones. Las modalidades particulares que se exponen más abajo son únicamente ilustrativas y no se consideran limitativas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La invención se puntualiza particularmente en las reivindicaciones anexas. Las ventajas anteriores de esta invención y otras más se pueden entender mejor haciendo referencia a la siguiente descripción, tomada en conjunto con los dibujos acompañantes, en los cuales: Las figuras 1A, 1B y 1C son fotografías escaneadas de tejidos de corazón teñidos, y la figura 1D es una gráfica que muestra que el suministro intravenoso de rAAV2/9 resulta en un alto grado de transducción del corazón. Ratones recién nacidos C57BL6/129SvJ de un día de edad (n = 5) recibieron 1 c 1011 vg de los pseudotipos de rAAV AAV2/1, AAV2/8 y AAV2/9 que llevan la construcción CMV-/acZ, mediante la ruta de suministro anteriormente descrita de la vena temporal. Cuatro semanas después de la inyección se hizo el ensayo de detección de la enzima b-galactosidasa para cuantificar el grado de expresión de lacZ. Las figuras 1A, 1B y 1C muestran criosecciones X-Gal-teñidas de los corazones que fueron inyectados con AAV2/1 (figura 1 A), AAV2/8 (figura 1B), y AAV2/9 (figura 1C). La figura 1D muestra los niveles de la enzima b-galactosidasa en los corazones (n= 5).
Las figuras 2A y 2B son gráficas que muestran el análisis de biodistribución de expresión de los niveles de la enzima b-galactosidasa, detectados en varios especímenes después del suministro de las construcciones rAAV2/8-CM V-lacZ o rAAV2/9-CMV-/acZ La figura 2A muestra la biodistribución a través de los tejidos musculares en comparación con el miocardio. Ht indica corazón; Di, diafragma; Qu, cuádriceps; So, soleo; ED, extensor largo de los dedos; TA, tibial anterior. La figura 2B muestra la biodistribución de expresión en el músculo no esquelético. Br indica cerebro; Lu, pulmón; Sm, intestino delgado; Ki, riñón; Spl, bazo.
Las figuras 3A, 3B y 3C son gráficas que muestran un ensayo del transcurso de tiempo después del suministro de CMV-/acZ mediado por rAAV2/9. Figura 3A: Después del suministro del transgen usando rAAV2/9, el grado de expresión alcanzó una meseta en el músculo esquelético 4 semanas después de la administración, y siguió aumentando en el corazón durante las 8 semanas del experimento. La figura 3B muestra que los genomas de vector por célula también siguieron aumentando en el tejido cardíaco, pero no en el músculo esquelético, durante el experimento. La figura 3C muestra que los transcritos de ARN también aumentaron en el tejido cardíaco durante el experimento (n= 4 por punto de tiempo).
La figura 4A es una gráfica que muestra el análisis del grado de expresión de b-galactosidasa del corazón y músculo esqueletico (4 semanas' después de la administración) de ratones a los que se inyectó 1 c 1011 vg de rAAV2/9-CMV-/acZ, como recién nacidos de 1 día de edad. La figura 4B es una gráfica que muestra el análisis del grado de expresión de b-galactosidasa del corazón y músculo esquelético (4 semanas' después de la administración) de ratones a los que se inyectó 1 c 1011 vg de rAAV2/9-CMV-/acZ a través de la vena yugular a los 3 meses de edad (n = 3). La figura 5A es una gráfica que muestra la actividad de GAA en especímenes de tejido de los corazones de macacos Rhesus a los que se inyectó al momento de nacer rAAV2/1-CMV-hGaa o rAAV2/9-CMV-hGaa por vía intravenosa. El eje Y muestra la actividad total de GAA menos la actividad de fondo de controles que no fueron inyectados, por genoma de vector suministrado. La figura 5B es una gráfica que muestra el perfil de biodistribución de genoma de vector entre el tejido de corazón y de músculo esquelético de macacos Rhesus a los que se inyectó al momento de nacer rAAV2/9-CMV-hGaa por vía intravenosa. Todos los datos son a los 6 meses' después de la administración del vector.
Las figuras 6A, 6B y 6C son gráficas que muestran los resultados de la ventilación minuto (mL/min) en la línea de base y durante 10 minutos de hípercapnia en ratones de control y GAA7 de 6 meses (figura 6A), 12 meses (figura 6B) y >21 meses (figura 6C). MEDIA ± SEM; * = GAA7 diferente del control,† = macho diferente de hembra.
La figura 7A es una gráfica que muestra los resultados de la ventilación minuto en la línea de base y la respuesta media a la hipercapnia en ratones de control, GAA 7 y de GAA específica de músculo. Los ratones de GAA específica de músculo se mantienen sobre el fondo de GAA7 , pero expresan GAA solo en el músculo esquelético. La figura 7B es una gráfica que muestra los resultados de la función contráctil del diafragma de ratones de control, GAA7 y de GAA específica de músculo a los 12 meses de edad.
La figura 8 es una gráfica que muestra que el flujo inspiratorio medio provee un estimado del impulso neural para respirar. Flujo inspiratorio medio de línea de base en ratones de control y GAA7 de 6 meses, 12 meses y >21 meses. MEDIA + SEM; * = diferente del control; sin diferencias de edad o género.
La figura 9A es una gráfica y la figura 9B es una tinción histológica que muestran los resultados de la cuantificación de glucógeno en los segmentos de la médula espinal C3-C5 (figura 9A) en ratones de control y GAA7 de 6 meses, 12 meses y >21 meses. El grupo motor del nervio frénico está dentro de los segmentos espinales cervicales C3-C5. Detección histológica de glucógeno (figura 9B) con tinción de ácido periódico de Schiff. Las neuronas motoras del nervio frénico (flechas) se identificaron por medio del rastreador neuronal retrógrado Fluoro-Gold® aplicado al diafragma.
La figura 10A es una gráfica que muestra los resultados de una amplitud pico de 30 s del promedio de tiempo de movimiento de ratones de control y GAA . Los valores de PaCO2 son similares. La figura 10B es un neurograma que muestra los resultados de un neurograma del nervio frénico en bruto (panel superior) y promedio de tiempo en movimiento (panel inferior) de un ratón de control y GAA_/ ventilado mecánicamente con valores de PaCO2 similares. La escala, ganancia de amplificador, ajustes de filtro y configuraciones de registro fueron idénticas en las dos preparaciones.
La figura 11 es una gráfica que muestra que la inyección intravenosa de rAAV2/1 produce depuración de glucógeno en el tejido de diafragma afectado. Un año después de la inyección, el tejido de diafragma de los ratones Gaa' a los que se administró rAAV2/1 -CMV-GAA por vía intravenosa y ratones Gaa' de control igualados en edad, estaba fijo y teñido con ácido periódico-Schiff (PAS) mediante los métodos estándares (Richard Alien, Kalamazoo, MI). Se tomaron fotografías usando una cámara Olympus y un microscopio óptico Zeiss, y un sistema de registro digital MagnaFire®. Amplificación c 400.
Las figuras 12A, 12B, 12C y 12D son una serie de gráficas que muestran que el suministro sistémico de rAAV2/1-CMV-hGAA confiere ventilación mejorada en respuesta a la hipercapnia seis meses después del tratamiento. La ventilación de los especímenes Gaa1 (n = 6) y Gaa1 no tratados igualados en edad y C57BL6/129SvJ (n = 10), se evaluó usando pletismografía barométrica de todo el cuerpo. * = p £ 0.05 Las figuras 13A, 13B, 13C y 13D son una serie de gráficas que muestran que el suministro sistémico de rAAV2/1-CMV-hGAA mejora la ventilación en respuesta a hipercapnia doce meses' después del tratamiento. La ventilación de los especímenes Gaa1 (n = 12) y Gaa1 no tratados igualados en edad y C57BL6/129SvJ (n = 10), se evaluó usando pletismografía barometrica de todo el cuerpo. * = p < 0.05 La figuras 14A, 14B, 14C y 14D son una serie de gráficas que muestran que la función ventilatoria mejora significativamente en los ratones tratados con AAV2/1. La función ventilatoria se ensayó por medio de pletismografía barométrica de todo el cuerpo, en estado despierto, no restringido. Las gráficas muestran la respuesta de ventilación minuto a la hipercapnia durante el periodo de 10 minutos.
Las figuras 15A, 15B, 15C y 15D son una serie de gráficas que muestran que la función ventilatoria mejora significativamente en los ratones tratados con AAV2/1. Las gráficas muestran la respuesta de flujo inspiratorio pico a la hipercapnia durante el periodo de 10 minutos.
La figura 16 es una ilustración esquemática de la amplitud de una explosión frénica completa-híbrida. La amplitud de explosión frénica medida en voltios describe la magnitud del nervio frénico con cada respiración. El voltaje más bajo en los animales GAA indica una función defectuosa de la neurona motora del nervio frénico. Esta figura muestra la restauración de la salida frénica después del suministro de AAV-GAA al diafragma.
Las figuras 17A, 17B, 17C, 17D, 17E, 17F y 17G son una gráfica (figura 17A) y una serie de fotografías (figuras 17B a 17G) de motoneuronas del nervio frénico que ilustran el contenido de glucógeno de la médula espinal cervical (C3-C5). Cuantificación bioquímica de glucógeno (pg de glucógeno /mg peso húmedo) de la médula espinal en ratones de control y Gaa7 a los 6, 12 y >21 meses de edad (figura 17A). * = Gaa diferente del control, p < 0.01 , † = 6 meses diferente de >21 meses, p < 0.01. Grupos de múltiples neuronas motoras múltiples exhiben tinción positiva de glucógeno en la medula espinal cervical del ratón Gaa (figura 17E) contra el control (figura 17B). Las neuronas motoras del nervio frénico se marcaron con Fluoro-Gold® en ratones de control (figura 17C) y Gaa/_ (figura 17F). La neurona motora del nervio frénico Gaa~A marcada exhibe una tinción más intensa de glucógeno (figura 17G) en comparación con la neurona motora del nervio frénico de control (figura 17D).
La figura 18A y la figura 18B son un par de gráficas que muestran la declinación dependiente de la edad de la ventilación minuto. Ratones de control y GAA-deficientes fueron evaluados para determinar VeA/CO2 (figura 18A) y ventilación minuto (figura 18B) a los 6, 12 y >21 meses. Los ratones GAA-KO tienen 1/2 de la Ve/V C02 y ventilación minuto normal en comparación con los controles.
Las figuras 19A, 19B y 19C ilustran la respuesta de ventilación minuto a la hipercapnia. Ventilación minuto de la respuesta de 60 minutos (21% 02, N2 equilibrado) y 10 minutos a la hipercapnia (7% C02, 02 equilibrado) para ratones de control y Gaa de 6 meses (figura 19A), 12 meses (figura 19B) y >21 meses (figura 19C) de edad. *=control diferente de Gaav, p<0.01.
La figura 20A y la figura 20B son un par de gráficas, y la figura 20C es una serie de trazos que muestran ratones de hGaa específica de músculo. Mediciones de frecuencia de fuerza de ratones B6/129 (n = 3), Gaa A (n = 3) y de hGaa específica de músculo (n = 6) (figura 20A). † = GaaA diferente de los ratones de control y de hGaa específica de músculo. Ventilación minuta en la línea de base y la respuesta media a la hipercapnia de ratones B6/129, Gaa1 y de hGaa específica de músculo (n = 8/grupo) (figura 20B). * = diferente del control, ¥ = todos los grupos diferentes de entre sí. Todos los valores se consideraron significativos a p<0.01. En la figura 20C se proveen trazos de flujo de aire representativos de ratones no anestesiados durante respiración en calma (línea de base) y con provocación respiratoria (hipercapnia). La escalación es identica en todos los paneles. La calibración del flujo de aire es en mL/s.
La figura 21 A es una gráfica y la figura 21 B es una serie de trazos que muestran la amplitud de explosión inspiratoria del nervio frénico. Amplitud media de explosión inspiratoria del nervio frénico de treinta segundos de ratones de control, GaaA y de hGaa específica de músculo con valores similares de PaC02 arterial (mostrados en la gráfica). * = diferente del control, p < 0.01. Se muestra la amplitud del nervio frénico en bruto (trazos superiores) y trazo integrado rectificado (trazos inferiores) de ratones de control representativos, GaaA y MTP (la escalación es idéntica en cada panel).
La figura 22 es una fotografía de un gel de agarosa que muestra que el ADN genómico aislado del diafragma contiene el gen de control después del suministro del vector.
La figura 23 es una fotografía de un gel que muestra ADN genómico aislado del núcleo frenico.
La figura 24 es una gráfica que muestra que la ventilación mejora 4 semanas después de la inyección de AAV-CMV-GAA (2.52 c 1010 partículas).
La figura 25 muestra copias del genoma del vector en el tibial anterior (TA) y médula espinal lumbar después de inyección intramuscular directa de copias del genoma de AAV2/9-GAA en animales Gaa1. Brevemente, animales Gaa7 recibieron una sola inyección de los vectores AAV2/9-DES-GAA o AAV2/9-CMV-GAA en el músculo tibial anterior. Las copias del genoma del vector se determinaron en el tibial anterior y la médula espinal lumbar 28 días después de la inyección. Las dos construcciones mostraron una transducción eficiente del músculo esquelético y transporte retrógrado del transgen terapéutico. Las figuras 26A a 26C muestran las copias del genoma del vector y la actividad de la enzima GAA en animales de Pompe después de una sola inyección de AAV2/9-hGAA en el músculo tibial anterior. Se muestran las copias de Vg en el tibial anterior (figura 26A) y la médula espinal lumbar (figura 26B) un mes después de la inyección. Los datos de PCR indican suficiente transducción retrógrada de los vectores de AAV en la médula espinal. En la figura 26C, el grado de actividad de GAA en el sitio de la inyección (TA) resulta en un aumento significativo del nivel enzimático en ratones Gaa -/-.
La figura 27 muestra la tinción de la unión neuromuscular (NMJ) después de una sola inyección de AAV2/9-DES-hGAA en el tibial anterior. La inmunotinción de la NMJ muestra que el suministro mediado por rAAV2/9 de hGAA resulta en la reversión de la patología de la enfermedad de Pompe y restauración de la NMJ en animales Gaa /_ tratados.
Las figuras 28A y 28B muestran la transducción del grupo de neuronas motoras del nervio frénico después de inyección intraespinal directa de construcciones de reportero de AAV en la región C3-C5 de ratón. Figura 28A: Detección positiva de construcciones de reportero AAV (*) en el sitio de la inyección en preparaciones fijas intactas de cerebro y médula espinal. Figura 28B: Detección epifluorescente transversal de AAV-GFP que demuestra la transducción del grupo de neuronas motoras del nervio frénico.
Las figuras 29A, 29B muestran detección inmunohistoquímica de la expresión de la proteína GAA en el grupo de neuronas motoras del nervio frénico después de inyección intraespinal directa de AAV-GAA en la región C3-C5 del ratón. La detección de AAV-GAA en el grupo de motoneuronas del nervio frénico se muestra a una amplificación baja (Figura 29A) y alta (Figura 29B). La tinción de color pardo oscuro es positiva para la detección de proteína GAA.
La figura 30 muestra la inyección intratorácica de colorante de infrarrojo en el ratón. La imagen indica detección positiva del colorante a través de la superficie del diafragma.
La figura 31 muestra la actividad motoneuronal del diafragma y el nervio frénico durante condiciones hipercápnicas después de la inyección intrato rácica de los vectores de AAV. Los animales Gaa/_ no tratados muestran un EMG (diafragma) y amplitud de explosión (nervio frenico) débiles y despuntados en comparación con los animales tratados con AAV2/9-CMV-GAA y AAV2/9-DES-GAA.
La figura 32 muestra la detección del reportero-AAV en la médula espinal cervical y torácica. La tinción inmunohistoquímica anti-GFP detecta la tinción positiva de la neurona motora frénica (izquierda) y costal (derecha) demostrando que la administración ¡ntratorácica de AAB2/9 resulta en transducción retrógrada.
Las figuras 33A a 33C muestran el EMG del diafragma (figura 33A), las copias de los vectores del genoma de AAV (figura 33B), y el mejoramiento de la propagación de la señal del nervio frénico (figura 33C) después de la administración ¡ntratorácica de los vectores rAAV2/9-CMV-GAA o rAAV2/9-DES-GAA en animales Gaa^.
Las figuras 34A a 34I muestran la corrección de los síntomas patológicos de los animales Gaa_/ después de la administración intravenosa de los vectores AAV2/9-CMV-GAA o AAV2/9-DES-GAA. La figura 34A muestra la fracción de expulsión tres meses después de la inyección. Los animales tratados con AAV-DES exhiben un mejoramiento significativo en la fracción de expulsión. Media y SEM (n = 6). La figura 34B muestra que todos los tratamientos resultaron en un aumento significativo del peso corporal uno y tres meses después de la inyección. La figura 34C muestra intervalos de PR un mes y tres meses después del tratamiento. La figura 34D muestra el mejoramiento de la función cardíaca despues de la inyección intravenosa. La figura 34E muestra la actividad enzimática de GAA en el corazón después de la administración intravenosa. La figura 34F muestra que las mediciones de fuerza-frecuencia in vitro del diafragma de animales tratados con AAV2/9-CMV y AAV2/9-DES-GAA exhiben un aumento de la fuerza titánica máxima. Media y SEM (n = 6). *valor P < 0.05 en comparación con los ratones no tratados. El tratamiento con AAV2/9-GAA resulta en mejoramiento de la función contráctil a frecuencias por arriba de 60 Hz. La figura 34G muestra la actividad de la enzima GAA en el músculo respiratorio. La figura 34H muestra las copias del genoma del vector en el corazón, diafragma y médula espinal después de la administración intravenosa de los vectores AAV2/9-CMV y AAV2/9-DES-GAA. La figura 34I muestra el grado de expresión de GAA después de la administración intravenosa de los vectores AAV2/9-CMV y AAV2/9-DES-GAA.
La figura 35 es una representación esquemática de los virus AAV y HSV. Los genomas de tipo silvestre y recombinante se muestran con los elementos genéticos mayores.
La figura 36 ilustra la producción de AAV mediante el método de coinfección de HSV usando células adherentes. 1) y 2) generación de reservas de rHSV; 3) coinfección con rHSV; 4) cosecha y recuperación de rAAV.
Las figuras 37A, 37B muestran la purificación racionalizada de rAAV2/9 por precipitación por ml y cromatografía en columna. (Figura 37A) PAGE teñido con plata de lisado crudo (carril 1), lisado crudo despues de microfluidización (carril 2), sobrenadante retentivo de AAV2/9 después de precipitación por p¡ (carril 3); (Figura 37B) PAGE teñido con plata de las fracciones que contienen rAAV2/9 purificado por ml (carriles 2 a 7) después de IEC en SP Sepharose y concentración.
Las figuras 38A, 38B son una evaluación de secciones transversales del nervio ciático de ratones Gaa ^ de tipo silvestre. Los ratones Gaa /_ exhiben morfometría irregular y un aumento de la cantidad de la matriz extracelular.
La figura 39 muestra la sección longitudinal del nervio teñida con H-E. La comparación de los ratones de tipo silvestre y Gaa_/ revela un aumento de la tinción nuclear, lo que indica diferenciación y proliferación de las células de Schwann.
Las figuras 40A, 40B es una evaluación de la integridad de la unión neuromuscular del soleo en ratones de tipo silvestre y Gaa . (Figura 40A) Secciones longitudinales del músculo soleo. Es de notar los cambios marcados en Gaa 7 en donde es evidente la disociación de la unión neuromuscular. (Figura 40B) Unión neuromuscular del montaje completo del diafragma del ratón. Unión neuromuscular intacta típica (flecha) y unión neuromuscular atípica (*) en el diafragma Gaa . Alfa-bungarotoxina (rojo) y neurofilamento H (verde).
La figura 41 muestra un análisis morfométrico de la NMJ del diafragma. Los receptores de acetilcolina (AcR) de Gaa_/ son significativamente más grandes en comparación con el tipo silvestre. Es de notar la apariencia focal evidente y no congruente de la marcación de a-bungarotoxina en los especímenes Gaa7.
Las figuras 42A, 42B muestran secciones transversales del nervio ciático de ratones de tipo silvestre y Gaa7. Los ratones Gaa7 exhiben morfometría axonal irregular y un aumento de la matriz extracelular.
Las figuras 43A, 43B muestran la pérdida de sinaptotagmina en la NMJ. Los animales Gaa7 (Figura 43B) exhiben una profunda pérdida de la expresión de sinaptotagmina en comparación con el tipo silvestre (Figura 43A). Magenta-NFH.
La figura 44 muestra un diseño experimental de la expresión mediada por rAAV de GAA en animales.
La figura 45 muestra una disminución del tamaño de los receptores de acetilcolina en la extremidad del ratón Gaa7 al que se inyectó AAV2/9-DESMIN-GAA. Los animales Gaa7 muestran un aumento significativo del tamaño del AChR, mientras que una disminución del tamaño de AChR después del tratamiento con AAV2/9-DESMIN-GAA provee efectos terapéuticos positivos contra la patología de la NMJ. En un ratón Gaa7 de 23 meses de edad, dos meses después de la inyección de los vectores AAV2/9-DESMIN-GAA directamente en el músculo tibial anterior derecho, se midió el tamaño del receptor de acetilcolina (AChR) en la extremidad inyectada y la extremidad contralateral.
La figura 46 muestra que los animales Gaa7 exhiben una perdida de la integridad de NMJ en comparación con los animales de tipo silvestre (WT). La normalización de la unión parece ocurrir 1 mes después de la administración de AAV9-GAA (panel derecho).
La Figura 47 muestra la marcación axonal (Gap43) en animales G aaA tratados con AAV2/9-GAA.
La figura 48 muestra la ventilación de ratones Gaa después del suministro intraespinal de AAV-GAA. Los animales tratados con vector (líriea de trazos) exhibieron parámetros de ventilación mejorados durante la línea de base (paneles izquierdos) y la provocación respiratoria hipercápnica (paneles derechos).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee vectores de rAAV para suministrar genes terapéuticos a varios tejidos, órganos y células que incluyen músculo esquelético, el corazón y el SNC, para la restauración de la integridad de la unión neuromuscular, y/o para el tratamiento de enfermedades neuromusculares. Convenientemente, los vectores de rAAV de la presente invención proveen la expresión sostenida a largo plazo del gen terapéutico de interés en un sujeto.
En una modalidad, la presente invención provee un virión de virus adenoasociado (AAV) recombinante, que comprende un vector de rAAV que comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo (también referida como un transgen o un gen terapéutico), y el vector de AAV está encapsulado por una cápside viral.
En una modalidad específica, el virión rAAV comprende un vector rAAV que comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo (también referido como un transgen o gen terapéutico) que codifica una proteína o polipéptido de interés, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo está enlazada operativamente con elementos de control (por ejemplo, promotor, incrementador) capaces de dirigir la expresión in vivo o in vitro de la proteína o polipéptido de interés, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo está flanqueada en cada extremo con una repetición terminal invertida de AAV, y en donde el vector rAAV está encapsulado por una cápside viral. En una modalidad preferida, la presente invención se refiere a vectores rAAV pseudotipificados. En algunas modalidades, la presente invención se refiere a vectores rAAV2/x que comprenden el genoma de vector de AAV2 y las cápsides de AAVx (por ejemplo, AAV1 , AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 o AAVrhIO). En modalidades preferidas, la presente invención se refiere a los vectores rAAV2/1 (también referido en las figuras como rAAV1), rAAV2/5, rAAV2/8 (también referido en las figuras como rAAV8), y rAAV2/9 (también referido en las figuras como rAAV9).
En una modalidad, el vector rAAV comprende un promotor de citomegalovirus (CMV). En otra modalidad, el vector rAAV comprende un promotor de desmina (DES). En una modalidad especifica, el vector rAAV comprende elementos reguladores para expresión específica de tejido del transgen, tales como por ejemplo el factor incrementador específico de miocito 2 (MEF2) y el elemento incrementador de myoD.
En otra modalidad, la presente invención provee un método de tratamiento de una enfermedad neuromuscular, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz de una composición que comprende un vector rAAV de la presente invención.
En una modalidad específica, la presente invención provee un método para restaurar la integridad de la unión neuromuscular y/o para mejorar el deterioro de la integridad de unión neuromuscular en un sujeto, en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición que comprende un vector rAAV de la presente invención. En algunas modalidades, el deterioro de la integridad neuromuscular es causado por enfermedad o lesión neuromuscular.
En otra modalidad, la presente invención provee un método de tratamiento de una enfermedad mediante el suministro de un gen terapéutico a las células de interés, en donde el método comprende introducir a una célula una cantidad eficaz de una composición que comprende un vector rAAV de la presente invención.
En algunas modalidades, el vector rAAV de la presente invención se administra mediante inyección intravenosa, intramuscular, intratorácica, intratecal, intracisternal o intraesternal. En algurias modalidades, los vectores rAAV se administran al músculo esquelético, diafragma, células costales y/o células del músculo cardiaco de un sujeto. En algunas modalidades, los vectores rAAV se suministran a las células neuronales del sistema nervioso periférico y/o central por medio de transporte directo o retrógrado.
En algunas modalidades, la presente invención provee el tratamiento de enfermedades neuromusculares que incluyen, sin limitación, enfermedad de Pompe, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo 1a, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth, y miastenia grave.
En una modalidad, el vector rAAV comprende un gen terapéutico que codifica GAA, y el vector rAAV es suministrado al sistema nervioso central (por ejemplo, la médula espinal y el cerebro) para reducir la acumulación de glucógeno en el sistema nervioso central en un sujeto con enfermedad de Pompe.
En otra modalidad, la presente invención provee el tratamiento de una enfermedad neuromuscular que no es la enfermedad de Pompe. En otra modalidad, la presente invención mejora la integridad deteriorada de la unión neuromuscular en un sujeto que no tiene la enfermedad de Pompe. . El modelo animal de la enfermedad de Pompe se usa como un ejemplo para ilustrar que los vectores rAAV de la presente invención resultan en el suministro eficaz del gen terapéutico que codifica GAA en las células, tejidos y órganos de interés. El modelo de animal de la enfermedad de Pompe también se usa como un ejemplo para ilustrar que los vectores rAAV de la presente invención resultan en un mejoramiento de la integridad de la unión neuromuscular. El experto en la materia, en vista de estos ejemplos, reconocería fácilmente que los vectores rAAV de la presente invención también se pueden usar para suministrar otros genes terapéuticos a las células, tejidos y órganos de interés (por ejemplo, las células neuronales), suministrando así un tratamiento de las enfermedades neuromusculares y/o mejorando la integridad de la unión neuromuscular en un sujeto que no tiene la enfermedad de Pompe.
En algunas modalidades se describen aquí composiciones y métodos que incluyen viriones rAAV que tienen vectores rAAV que expresan GAA para el tratamiento de un sujeto mamífero que tiene una deficiencia en GAA. En una modalidad, las composiciones que comprenden los serotipos de rAAV (por ejemplo, los serotipos 1-10, o derivados de los mismos) que expresan moléculas terapéuticas, en combinación con una vía de administración intravenosa, resultan en serotipos de rAAV que pueden atravesar más fácilmente la vasculatura y se transducen eficientemente en un tipo de tejido particular (por ejemplo, tejido cardiaco, tejido de diafragma, tejido del sistema nervioso central).
En otra modalidad, el AAV se modifica para incluir ligandos que son específicos de célula y/o tejido, de modo que las composiciones se administran sistémicamente y la absorción hacia los objetivos es dirigida y específica.
Cuando se toman en consideración las características deseables en un vehículo para el suministro de un gen en un mamífero, el parvovirus no patógeno rAAV (4.7 kb) surge como una elección atractiva, principalmente debido a su tamaño pequeño y su capacidad probada para persistir durante largos periodos en celulas infectadas. El rAAV es un virus de ADN de una sola cadena que requiere un auxiliador, tal como virus de herpes o adenovirus, para replicarse. Con los descubrimientos recientes de serotipos adicionales de rAAV se ha hecho posible seleccionar aquellos con los tropismos más ventajosos para hacer blanco y/o evadir tejidos a voluntad para aplicaciones específicas. El sistema de suministro de gen óptimo para cualquier aplicación terapéutica combinará una vía de suministro físico clínicamente conveniente con el serotipo de rAAV que tenga la afinidad natural más alta por un tejido de interés buscado específicamente.
En una modalidad típica, una composición incluye un virión rAAV que tiene un vector rAAV que codifica GAA, que mejora la función del nervio frénico en un sujeto mamífero que tiene una deficiencia de GAA (por ejemplo, la enfermedad de Pompe). El virión rAAV puede ser transducido directamente en el sistema nervioso central, o puede ser transducido en otros tipos de tejido (por ejemplo, el diafragma) y transportado al sistema nervioso central mediante transporte retrógrado. Al mejorar la actividad del nervio frénico en un sujeto mamífero (por ejemplo, un humano) que tiene una deficiencia de GAA, se pueden corregir los déficits respiratorios resultantes (por ejemplo, la ventilación reducida, función cardiaca reducida, etc.).
En otra modalidad, la administración de rAAV se realiza mediante administración intravenosa (por ejemplo, suministro sistémico). En una modalidad típica se usa suministro sistémico, ya que este tiene un impacto sobre los aspectos cardiaco, muscular y respiratorio de la enfermedad.
Otros ejemplos de moléculas terapéuticas diferentes para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomal (LSDs) incluyen, sin limitación: enfermedad de Hurler: a-L-iduronidasa; enfermedad de Hunter: iduronato sulfatasa; síndrome de San Filippo: N-sulfatasa de heparán; Morquio A: galactosa 6-sulfatasa; Morquio B: b-galactosídasa ácida; enfermedad de Sly: b-glucoronidasa; enfermedad de célula I: N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa; enfermedad de Schindler: a-N-acetilgalactosaminidasa (a-galactosidasa B); enfermedad de Wolman: lipasa ácida; éster de colesterol: lipasa ácida; enfermedad de almacenamiento; enfermedad de Farber: ceramidasa ácida lisosomal; enfermedad de Niemann-Pick: esfingomielinasa ácida; enfermedad de Gaucher: b-glucosidasa (glucocerebrosidasa); enfermedad de Krabbe: galactosilceramidasa; enfermedad de Fabry: a-galactosidasa A; gangliosidosis GM1: b-galactosidasa ácida; galactosialidosis: b-galactosidasa y neuraminidasa; enfermedad de Tay-Sach: hexosaminidasa A; enfermedad de Sandhoff: hexosaminidasa A y B; ceroide neuronal: palmitoil proteína tioesterasa (PPT); ceroide neuronal: tripeptidil aminopeptidasa 11 (TPP-I). Moléculas de ácido nucleico heterólogas o transgenes que codifican las moleculas terapéuticas de interés se pueden insertar en los vectores rAAV de la invención para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosomal.
La enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo II (GSD II; enfermedad de Pompe; deficiencia de maltasa ácida) es causada por deficiencia de la enzima lisosomal a-glucosidasa ácida (maltasa ácida). Se distinguen tres formas clínicas: infantil, juvenil y de adulto. La GSD II infantil tiene su inicio brevemente después del nacimiento y se presenta con debilidad progresiva muscular y falla cardiaca. Esta variante clínica es fatal dentro de los primeros dos años de vida. Los síntomas en pacientes adultos y juveniles ocurren tardíamente en la vida, y están implicados principalmente los músculos esqueléticos y las neuronas. Finalmente los pacientes mueren debido a insuficiencia respiratoria. Excepcionalmente los pacientes pueden sobrevivir durante más de seis décadas. Existe una buena correlación entre la severidad de la enfermedad y la actividad residual de a-glucosidasa ácida, siendo la actividad de 10-20% la normal en las formas de inicio tardío y menor de 2% en las formas de inicio temprano de la enfermedad.
La enfermedad de Pompe es un error innato del metabolismo con deficiencia de la enzima degradadora de glucógeno lisosomal a-glucosidasa ácida (GAA), que finalmente resulta en la acumulación de glucógeno en todos los tejidos, especialmente el músculo estriado. Históricamente, la debilidad muscular se ha considerado como el principal contribuyente de la deficiencia respiratoria en la población de pacientes, aunque no se han investigado otros mecanismos. Para evaluar adicionalmente los mecanismos que contribuyen a la insuficiencia respiratoria, se usó un modelo de animal de la enfermedad de Pompe, el modelo de ratón * GaaA. La ventilación se cuantificó en ratones GaaA y de control durante respiración tranquila e hipercapnia. Todas las variables de ventilación fueron atenuadas en los ratones GaaA a los 6, 12 y >21 meses de edad, y fueron acompañadas por una elevación del contenido de glucógeno de la médula espinal cervical (C3-C5). Los ratones transgénicos que sólo expresan Gaa en el músculo esquelético tuvieron una ventilación minuto similar a los GaaA, aunque la función del músculo diafragmático fue normal, demostrando que un mecanismo diferente de la disfunción muscular estaba contribuyendo al deterioro de la ventilación. La amplitud de explosión inspiratoria del nervio frénico eferente (mV) fue más baja en los ratones GaaA (5.2 ± 1.2 mV) en comparación con los controles (49.7 ± 13.9 mV) con niveles similares de PaC02 (53.1 ± 1.2 contra 52.2 ± 1.4 mm Hg). Los datos indican que el control neural de ventilación es deficiente en la enfermedad de Pompe y apoyan las siguientes conclusiones: 1) los ratones GaaA recapitulan los déficits respiratorios clínicos de GSDII, 2) la acumulación de glucógeno espinal puede deteriorar la salida motora, y 3) el control neural respiratorio puede estar deteriorado en GSDII.
Las formas infantiles de Pompe tienen un rápido desarrollo de cardiomiopatía y exhiben miopatía y neuropatía, llevando a la muerte normalmente durante el primer año de vida. Usando tinción con el reactivo de ácido periódico de Schiff (PAS) para evaluar secciones de diafragma en los ratones, se examina la progresión del depósito de glucógeno en los animales Gaa_/\ A los 12 meses de edad son evidentes depósitos de glucógeno extendidos y difusos en las secciones de diafragma de los animales Gaa /_. No sólo hay una declinación de las propiedades contráctiles del diafragma en los animales Gaa_/ , sino que también hay un empeoramiento progresivo de la función contráctil con la edad. Mediciones de la frecuencia de fuerza in vitro ¡lustran una pérdida progresiva de la función contráctil en los ratones Gaa /_ a los 3, 6 y 12 meses de edad. La deficiencia de GAA lleva a depuración ineficiente de glucógeno, llevando a una interrupción de la morfología y función celular. Las biopsias de los pacientes de Pompe también muestran vacuolización, acumulación de glucógeno lisosomal y debilidad muscular respiratoria consecuente.
Además, el efecto de la acumulación de glucógeno dentro del sistema nervioso central y su efecto sobre la función del músculo esquelético se han descubierto recientemente. Los presentes inventores han detectado deposición sustancial de glucógeno dentro de la médula espinal del ratón Gaa y\ Específicamente, la tinción de PAS muestra el grado y localización de glucógeno en la neurona motora en secciones transversales de la médula espinal. La neurona motora parece estar hinchada en algunos casos y varía en el grado a través de la sección. Los registros del nervio frénico en animales de tipo silvestre y Gaa /_ exhiben discrepancias obvias en el grado de amplitud de explosión tras la provocación hipercápnica. Los inventores también descubrieron que un ratón de GAA específica de músculo (GAA expresada en músculo esquelético pero no en el SNC) todavía muestran déficit respiratorio funcional durante las mediciones de pletismografía. Los resultados indican disfunción respiratoria mediada por el SNC en los animales Gaav y en los pacientes de Pompe.
Una característica notable de la enfermedad de Pompe que ocurre en el modelo de animal es una cifosis severa como resultado de la miopatía esquelética drástica. Los animales Gaa /_ desarrollan cifosis severa aproximadamente a los 9-12 meses de edad. El desarrollo de neutropenia en los individuos afectados por Pompe ha sido descrito y esto es evidente en el modelo de animal, en donde la debilidad muscular afecta finalmente la ingestión de nutrientes. Los ratones Gaa /_ tratados con AAV-CMV-GAA no desarrollan cifosis. Con la conservación de la masa y la fuerza del músculo esquelético, los animales tratados son capaces de mantener una ingestión nutricional adecuada y por lo tanto funcionan de manera similar a los ratones de tipo silvestre.
El modelo de ratón Gaa_/ muestra la patología progresiva asociada con el almacenamiento de glucógeno en el SNC y el músculo esquelético. Los presentes inventores han reportado la función específica de la contribución de SNC a la disfunción respiratoria en el modelo murino de enfermedad de Pompe. En otros trastornos neuromusculares ocurren adaptaciones en la NMJ y neurona motora como resultado de anormalidades en el SNC o músculo esquelético. Se reporta que la fatiga es evidente en los pacientes de Pompe de inicio tardío, y puede ser causada por deficiencias que son de base neural pero en su mayoría permanecen centradas alrededor de los defectos del músculo esqueletico.
De acuerdo con la presente invención, fueron cosechados nervios ciáticos de animales de tipo silvestre o Gaa y de 18 meses de edad. Como se muestran en las figuras 38A y 38B, las secciones transversales de nervio de los animales Gaa_/ parecen variar en cantidad y grosor de mielina; el diámetro de los axones, y muestran un aumento en la cantidad de matriz extracelular. Además, las secciones longitudinales del nervio ciático de los animales Gaa7 exhiben un aumento de la tinción nuclear, indicando desdiferenciación y proliferación de las células de Schwann (figura 39). Los patrones de tinción de las muestras de nervio ciático en la enfermedad de Pompe también se observan en enfermedades neuromusculares tradicionales, tales como esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo 1a, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth, y miastenia grave.
La fatiga presente en pacientes con enfermedades neuromusculares se podría deber al deterioro en el acoplamiento de E-C y otros mecanismos. Tras la comparación de la unión neuromuscular en secciones longitudinales del soleo y preparaciones de diafragma de montaje completo (figuras 40A y 40B), los presentes inventores notaron cambios abruptos en la asociación de la unión neuromuscular. La incorporación de preparaciones de diafragma de montaje completo provee una representación a profundidad del estado general de las uniones neuromusculares. Las preparaciones de diafragma de los animales Gaa_/ exhiben una distorsión avanzada y clara de las uniones en comparación con el diafragma de tipo silvestre.
La enfermedad de Gaucher es un trastorno de almacenamiento lisosomal recesivo autosómico caracterizado por una deficiencia en una enzima lisosomal, la glucocerebrosidasa (“GCR”), que hidroliza el glicolípido glucocerebrósido. En la enfermedad de Gaucher, la deficiencia en la enzima degradativa ocasiona que el glicolípido glucocerebrósido, que surge principalmente de la degradación de glucoesfiongolípidos de las membranas de los leucocitos y eritrocitos senescentes, se acumule en grandes cantidades en el lisosoma de celulas fagocíticas, principalmente en el hígado, bazo y médula ósea. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad incluyen esplenomegalia, hepatomegalía, trastornos esqueléticos, trombocitopenia y anemia. Por ejemplo, véase la Patente de EE. UU. No.6,451,600.
La enfermedad de Tay-Sachs es un trastorno hereditario fatal del metabolismo de los lípidos caracterizado especialmente en el tejido del SNC debido a la deficiencia de la isozima A (ácida) de b-hexosaminidasa. Las mutaciones en el gen HEXA, que codifica la subunidad a de b--hexosamínidasa, causan la deficiencia en la isozima A. La enfermedad de Tay-Sachs es un prototipo de un grupo de trastornos, la gangliosidosis GM2, caracterizada por degradación defectuosa del gangliósido GM2. El gangliósido GM2 (gangliósido monosialilado 2) se acumula en las neuronas empezando en el feto. La gangliosidosis GM1 es causada por una deficiencia de b-galactosidasa, lo que resulta en almacenamiento lisosomal del gangliósido GM1 (gangliósido monosialilado 1). La enfermedad de Sandhoff resulta de una deficiencia de las isozimas tanto A como B (básica) de b-hexosaminidasa. Las mutaciones en el gen HEXB, que codifica la subunidad b de b-hexosaminidasa, ocasionan la deficiencia de la isozima B.
Otra LSD resulta de una deficiencia genetica de la enzima lisosomal de escisión de carbohidrato, a-L-iduronidasa, que ocasiona mucopolisacaridosis 1 (MPS 1) (E. F. Neufeld and J. Muenzer, 1989; patente de EE. UU. No. 6,426,208). Véase también "The mucopolysaccharidoses" en The Metabolic Basis of Inherited Disease (C. R. Scriver, A. L. Beaudet, W. S. Sly y D. Valle, Eds.), p. 1565-1587, McGraw-Hill, New York. En una forma severa, la MPS 1 es conocida comúnmente como el síndrome de Hurler y está asociada con problemas múltiples tales como retardo mental, nubosidad de la córnea, rasgos faciales engrosados, enfermedad cardiaca, enfermedad respiratoria, agrandamiento del hígado y el bazo, hernias y rigidez de articulaciones. Los pacientes que padecen el síndrome de Hurler mueren usualmente antes de los 10 años de edad. En una forma intermedia conocida como el síndrome de Hurler-Scheíe, la función mental generalmente no está afectada severamente, pero los problemas físicos pueden llevar a la muerte en la adolescencia o en los veinte años. El síndrome de Scheie es la forma más leve de MPS 1 y generalmente es compatible con una duración de vida normal, pero la rigidez de articulaciones, nubosidad corneal y enfermedad de válvula cardiaca causan problemas significativos.
La enfermedad de Fabry es una enfermedad de almacenamiento lisosomal heredada ligada al cromosoma X, caracterizada por síntomas tales como deterioro renal severo, angioqueratomas y anormalidades cardiovasculares que incluyen agrandamiento ventricular e insuficiencia de la válvula mitral (patente de EE. UU. No. 6,395,884). La enfermedad también afecta el sistema nervioso periférico, causando episodios de dolor agónico quemante en las extremidades. La enfermedad de Fabry es causada por una deficiencia en la enzima a-galactosidasa A (a-gal A), que resulta en un bloqueo del catabolismo de los glicoesfingolípidos neutros, y acumulación del substrato de la enzima, ceramida trihexósido, dentro de las células y en la corriente sanguínea. Debido al patrón de herencia ligada al cromosoma X de la enfermedad, esencialmente todos los pacientes de la enfermedad de Fabry son hombres. Aunque se han observado algunos heterocigotos hembras afectados severamente, los heterocigotos hembras generalmente son asintomáticos o tienen síntomas relativamente leves limitados principalmente a una opacidad de la córnea característica. Una variante atípica de la enfermedad de Fabry, que exhibe baja actividad residual de a-gal, y síntomas muy leves o aparentemente ningún otro síntoma característico de la enfermedad de Fabry, se correlacionan con hipertrofia ventricular izquierda y enfermedad cardiaca. Se ha especulado que la reducción en a-gal A puede ser la causa de tales anormalidades cardiacas.
La enfermedad de la celula I es una enfermedad fatal de almacenamiento lisosomal causada por la ausencia de residuos de manosa-6-fosfato en las enzimas lisosomales. La N-acetilglucosamina-1-fosfo-transferasa es necesaria para la generación de la señal M6P en proenzimas lisosomales.
Las LSDs que afectan el sistema nervioso central requieren que la enzima de reemplazo atraviese la BHE. Para lograr esto, la fuente de la enzima de reemplazo se puede colocar dentro del cerebro del sujeto, evitando así la BHE. De esta manera, las células progenitoras gliales son vehículos de suministro terapéutico ideales debido a su capacidad excepcional de multiplicarse, migrar y diferenciarse en los subtipos oligodendrocito y astrocito. De esta manera, las LSDs que afectan el sistema nervioso central pueden ser tratadas en una variedad de formas que incluyen codificar genéticamente células progenitoras gliales para secretar proenzimas lisosomales, por ejemplo, proenzimas lisosomales, y suministrar las células a los tejidos dañados y/o reemplazar las células defectuosas.
En otra modalidad, las composiciones de la presente invención se usan para tratar trastornos neurológicos. Un “trastorno neurológico” se refiere a cualquier enfermedad del sistema nervioso central (SNC) o sistema nervioso periférico (SNP) que está asociada con defectos neuronales o de célula glial que incluyen sin limitación pérdida neuronal, degeneración neuronal, desmielinización neuronal, gliosis (es decir, astrogliosis), o acumulación neuronal o extraneuronal de proteínas aberrantes o toxinas (por ejemplo, b-amiloide, o a-sinucleína). El trastorno neurológico puede ser crónico o agudo.
Los trastornos neurológicos ejemplares incluyen, sin limitación, la enfermedad de Gaucher y otras LSDs que incluyen enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Pompe, y las mucopolisacaridosis; enfermedad de Parkinson; enfermedad de Alzheimer; esclerosis lateral amiotrófica (ALS); esclerosis múltiple (MS); enfermedad de Huntington; ataxia de Fredrich; deterioro cognitivo leve; y trastornos del movimiento (que incluyen ataxia, parálisis cerebral, coreoatetosis, distonia, síndrome de Tourette, kernicterus); trastornos de temblores, leucodistrofias (que incluyen adrenoleucodistrofia, leucodistrofia metacromática, enfermedad de Canavan, enfermedad de Alexander, enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher); lipofucsinosis ceroides neuronales; ataxia telangectasia; y síndrome de Rett. Este término también incluye eventos cerebrovasculares tales como apoplejía y ataques isquémicos.
El término “sujeto” usado en la presente describe un organismo, que incluye mamíferos tales como primates. Las especies de mamíferos que se pueden beneficiar de los presentes métodos incluyen, sin limitación, simios, chimpancés, orangutanes, humanos, monos; y otros animales tales como perros, gatos, caballos, reses, cerdos, ovejas, cabras, pollos, ratones, ratas, conejillos de indias y hámsteres. Típicamente el sujeto es un humano.
En algunas modalidades, los sujetos con un “trastorno neurológico” incluyen sujetos en riesgo de desarrollar un trastorno, enfermedad o afección neurológica, y/o sujetos ya diagnosticados con un trastorno, enfermedad o afección neurológica.
La inyección de un vector rAAV (tal como rAAV2/9) que comprende una molecula de ácido nucleico que codifica GAA puede resultar en una disminución del tamaño del AChR en animales Gaa7 ; por lo tanto, el suministro de GAA mediado por rAAV se puede usar para restaurar o incrementar la transmisión neuromuscular entre el nervio frénico y el diafragma. En una modalidad, además de la administración de un vector de AAV (tal como, AAV2/9) que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica GAA, también se pueden coadministrar uno o más inhibidores de acetilcolinesterasa (ACI), separadamente o simultáneamente, para mejorar la liberación de neurotransmisor en sujetos con la enfermedad de Pompe.
Se conocen en la téenica varios inhibidores de acetilcolinesterasa (ACI), que incluyen sin limitación tetrahidroaminoacridina, donepezil, galantamina, rivastigmina tacrina, metrifonato e huperzina A (véase la publicación de la solicitud de patente de EE. UU. No. 2013/0131110).
Moléculas terapéuticas Ácidos nucleicos para modular la expresión de GAA: Como un ejemplo, se usa GAA para ilustrar la invención. Sin embargo, dependiendo de las enfermedades, la molécula terapéutica puede ser sustituida (véase más abajo). La transferencia de una proteína GAA funcional a una célula o animal se logra usando un ácido nucleico que incluye un polinucleótido que codifica la proteína GAA funcional interpuesta entre dos ITRs de AAV. La secuencia de polinucleótido que codifica GAA puede tomar muchas formas diferentes. Por ejemplo, la secuencia puede ser una secuencia de nucleótidos nativa de GAA de mamífero, tal como una de las secuencias codificantes de GAA de ratón o humano depositadas en el Genbank con los números de registro NM_008064, NM_000152, X55080, X55079, M34425 y M34424. La secuencia de nucleótidos codificante de GAA también puede ser una secuencia codificante no nativa que, como resultado de la redundancia o de la generación del código genético, codifica el mismo polipéptido que la secuencia de nucleótidos nativa de GAA de mamífero. Otras secuencias de nucleótidos codificantes de GAA dentro de la invención son las que codifican fragmentos, análogos y derivados de una proteína GAA nativa. Estas variantes pueden ser por ejemplo una variante alélica natural de un ácido nucleico nativo codificante de GAA, un homólogo de un ácido nucleico codificante de GAA nativo, o una variante no natural de ácido nucleico codificante de GAA nativo. Estas variantes tienen una secuencia de nucleótidos que difiere del ácido nucleico codificante de GAA nativo en una o más bases. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de estas variantes puede presentar una supresión, adición o sustitución de uno o más nucleótidos de un ácido nucleico codificante de GAA nativo. Las inserciones de ácido nucleico por lo general son de aproximadamente 1 a 10 nucleótidos contiguos, y las supresiones por lo general son de aproximadamente 1 a 30 nucleótidos contiguos. En la mayoría de las aplicaciones de la invención, el polinucleótido que codifica una GAA mantiene sustancialmente la capacidad de convertir fenilalanina en tirosina.
La secuencia de nucleótidos codificante de GAA también puede ser una que codifica una proteína de fusión de GAA. Esta secuencia se puede hacer ligando un primer polinucleótido que codifica una proteína GAA fusionada en marco con un segundo polinucleótido que codifica otra proteína (por ejemplo, una que codifica una marca detectable). Los polinucleótidos que codifican estas proteínas de fusión son útiles para visualizar la expresión del polinucleótido en una célula.
Para facilitar la expresión a largo plazo, el polinucleótido que codifica GAA está interpuesto entre repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV (por ejemplo, la primera y segunda ITRs de AAV). Las ITRs de AAV se encuentran en ambos extremos de un genoma AAV de tipo silvestre, y sirven como el origen e iniciador de la replicación del ADN. Las ITRs se requieren en cis para la replicación del ADN de AAV, y también para el rescate, o corte, de los plásmidos procarióticos. Las secuencias ITR de AÁV que están contenidas dentro del ácido nucleico se pueden derivar de cualquier serotípo de AAV (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) o se pueden derivar de más de un serotipo. Para usarse en un vector, la primera y segunda ITR deben incluir por lo menos las porciones mínimas de una ITR de tipo silvestre o modificada por ingeniería que son necesarias para empaquetamiento y replicación.
Además de las ITRs de AAV y el polinucleótido que codifica GAA, los ácidos nucleicos de la invención también pueden incluir una o más secuencias de control de expresión enlazadas operativamente al polinucleótido que codifica GAA. Se conocen muchas de estas secuencias. Las incluidas en los ácidos nucleicos de la invención se pueden seleccionar basándose en su función conocida en otras aplicaciones. Los ejemplos de secuencias de control de expresión incluyen promotores, aislantes, silenciadores, elementos de respuesta, intrones, incrementadores, sitios de iniciación, señales de terminación y colas de pA.
Para obtener las cantidades apropiadas de GAA, se puede utilizar cualquiera de varios promotores adecuados para usarse en la célula hospedera seleccionada. Por ejemplo, se pueden usar promotores constitutivos de fuerzas diferentes. Los vectores y plásmidos de expresión de acuerdo con la presente invención pueden incluir uno o más promotores constitutivos, tales como promotores virales o promotores de genes de mamífero que generalmente son activos para promover la transcripción. Los ejemplos de promotores virales constitutivos incluyen los promotores del virus de herpes simple (HSV), timidina cinasa (TK), virus de sarcoma de Rous (RSV), virus de simio 40 (SV40), virus del tumor mamario de ratón (MMTV), Ad E1A y citomegalovirus (CMV). Los ejemplos de promotores de mamífero constitutivos incluyen varios promotores del gen housekeeping, como es ejemplificado por el promotor de b-actina. Como se describe en los ejemplos más abajo, el promotor de b-actina (CB) de pollo ha mostrado ser un promotor constitutivo particularmente útil para expresar GAA.
Para usarse con los ácidos nucleicos de la Invención tambien se pueden contemplar promotores inducibles y/o elementos reguladores. Los ejemplos de promotores inducibles adecuados incluyen los de genes tales como los genes de citocromo P450, genes de proteína de choque de calor, genes de metalotioneína, y genes inducibles por hormona, tales como el promotor del gen de estrógeno. Otro ejemplo de un promotor inducible es el promotor tetVP16, que es sensible a la tetracielina.
Los promotores útiles de acuerdo con la presente invención también incluyen, sin limitación, promotores específicos de neurona, tales como el promotor de sinapsina 1 (SYN); promotores de creatina cinasa de músculo (MCK); promotores de citomegalovirus (CMV); y promotores de desmina (DES). En una modalidad, la expresión mediada por AAV de ácidos nucleicos heterólogos (tales como GAA humano) se puede lograr en las neuronas mediante un promotor de sinapsina o en músculos esqueléticos mediante un promotor MCK.
Los promotores y/o elementos reguladores específicos de tejido son útiles en algunas modalidades de la invención. Los ejemplos de estos promotores que pueden usarse con los vectores de expresión de la invención incluyen: (1) creatina cinasa, miogenina, cadena pesada de alfa-miosina, péptido de cerebro y natriurético humano, específico para células de músculo, y (2) promotores de albúmina, alfa-1 -antitripsina, proteína del núcleo del virus de la hepatitis B, específicos para células de hígado.
La invención también incluye métodos y composiciones de los mismos que se pueden usar para corregir o disminuir un defecto de gen causado por una proteína de múltiples subunidades. En algunas situaciones se puede usar un transgen diferente para codificar cada subunidad de la proteína. Esto puede ser conveniente cuando el tamaño del ADN que codifica la subunidad de proteína es grande, por ejemplo, para una inmunoglobulina o el receptor del factor de crecimiento derivado de plaqueta. Para que la celula produzca la proteína de múltiples subunidades, una célula sería infectada con rAAV que expresa cada una de las diferentes subunidades.
Alternativamente, las diferentes subunidades de una proteína pueden ser codificadas por el mismo transgen. En este caso, un solo transgen incluiría el ADN que codifica cada una de las subunidades, con el ADN de cada subunidad separado por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). El uso de IRES permite la creación de ARNm multigénicos o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de esquivar el modelo de exploración de ribosoma de la traducción dependiente de la tapa 5’-metilada y empezar la traducción en sitios internos. Por ejemplo, se han descrito los elementos IRES de la hepatitis C y miembros de la familia de picornavirus (por ejemplo, poliomelitis y encefalomiocarditis), y también un IRES de un ARNm de mamífero. Los elementos IRES se pueden enlazar a marcos de lectura abiertos heterólogos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ríbosomas para traducción eficiente. De esta manera, pueden ser expresados eficientemente muchos genes usando un solo promotor/incrementador para transcribir un solo mensaje. Esto es particularmente útil cuando el tamaño del ADN que codifica cada una de las subunidades es suficientemente pequeño para que el total del ADN que codifica las subunidades y las IRES no sea mayor que el tamaño máximo del inserto de ADN que puede abarcar el virus. Por ejemplo, para rAAV, el tamaño del inserto no puede ser mayor de aproximadamente 4.8 kilobases; sin embargo, para un adenovirus que carece de todas sus funciones auxiliadoras, el tamaño del inserto es de aproximadamente 28 kilobases.
Los productos de gen útiles incluyen hormonas y factores de crecimiento y diferenciación que incluyen, sin limitación, insulina, glucagón, hormona de crecimiento (GH), hormona paratioridea (PTH), calcitonina, factor de liberación de la hormona de crecimiento (GRF), hormona estimuladora de tiroides (TSH), hormona adrenocorticotrópica (ACTH), prolactina, melatonina, vasopresina, b-endorfina, met-encefalina, leu-encefalina, factor de liberación de prolactina, factor de inhibición de prolactina, hormona liberadora de corticotropina, hormona liberadora de tirotropina (TRH), hormona estimulante del folículo (FSH), hormona luteinizante (LH), gonadotropina coriónica (CG), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), angiopoyetinas, angiostatina, endostatina, factor estimulante de colonia de granulocitos (GCSF), eritropoyetina (EPO), factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF), factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), bFGF2, factor de crecimiento de fibroblasto ácido (aFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento transformante a (TGFa), factor de crecimiento derivado de plaqueta (PDGF), factores de crecimiento similares a insulina I y II (IGF-I e IGF-II), y cualquiera de la superfamilia del factor de crecimiento transformante b (TGF ), que comprende TGF , activinas, inhibinas, o cualquiera de las proteínas morfogenicas de hueso (BMP), BMPs 1 15, cualquiera de la familia de factores de crecimiento de factor de diferenciación de herregulina/neurregulina/ARIA/neu (NDF), factor de crecimiento de nervio (NGF), factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), neurotrofinas NT-3, NT-4/5 y NT-6, factor neurotrófico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado de línea de célula glial (GDNF), neurtuin, persefin, agrin, cualquiera de la familia de semaforinas/colapsinas, netrin-1 y netrin-2, factor de crecimiento de hepatocito (HGF), efrinas, noggin, erizo Sonic, y tirosina hidroxilasa.
Otros productos de gen útiles incluyen proteínas que regulan el sistema inmune que incluyen, sin limitación, citocinas y linfocinas tales como trombopoyetina (TPO), interleucinas (IL) IL-1 a, IL-1 b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 e IL-17, proteína quimioatrayente de monocito (MCP-1), factor inhibitorio de leucemia (LIF), factor estimulante de colonia de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonia de monocitos (M-CSF), ligando Fas, factores de necrosis de tumor a y b (TNFa y TNRb), interferones (IFN) IFN-a, IFN-b, factor de célula madre, ligando flk-2/flt3. Los productos de gen producidos por el sistema inmune también están abarcados por esta invención. Estos incluyen, sin limitación, las inmunoglobulinas IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, inmunoglobulinas quiméricas, anticuerpos humanizados, anticuerpos de una sola cadena, receptores de células T, receptores de células T quiméricos, receptores de células T de una sola cadena, moléculas de MHC de clase I y clase II, y también moléculas de MHC modificadas por ingeniería que incluyen las moléculas MHC de una sola cadena Los productos de gen útiles también incluyen proteínas reguladoras del complemento, tales como la proteína de cofactor de membrana (MCP), factor de aceleración de decaimiento (DAF), CR1 , CR2 y CD59.
Otros productos de gen útiles incluyen cualquiera de los receptores para las hormonas, factores de crecimiento, citocinas, linfocinas, proteínas reguladoras y proteínas del sistema inmune. Los ejemplos de estos receptores incluyen flt-1 , flk-1 , TIE-2; la familia trk de receptores tales como TrkA, MuSK, Eph, receptor de PDGF, receptor de EGF, HER2, receptor de insulina, receptor de IGF-1 , la familia FGF de receptores, los receptores de TGFp, los receptores de interleucina, los receptores de interferón, receptores de serotonina, receptores a-adrenérgicos, receptores b-adrenérgicos, el receptor de GDNF, receptor de neurotrofina p75, entre otros. La invención ab arca receptores de proteínas de matriz extracelular, tales como integrinas, contra-receptores de proteínas enlazadas a transmembrana, tales como moléculas de adhesión intercelular (ICAM-1 , ICAM-2, ICAM-3 e ICAM-4), moléculas de adhesión celular vascular (VCAM), y las selectinas selectina E, selectina P y selectina L. La invención abarca receptores para la regulación del colesterol que incluyen el receptor de LDL, receptor de HDL, receptor de VLDL y el receptor de barredor. La invención abarca los ligandos de apolipoproteína para estos receptores, que incluyen ApoAl, ApoAIV y ApoE. La invención también abarca productos de gen tales como la superfamilia de receptores de hormona esteroide, que incluyen receptores de glucocorticoide y receptores de estrógeno, receptores de vitamina D y otros receptores nucleares. Además, los productos de gen útiles incluyen péptidos antimicrobianos tales como defensinas y magininas, factores de transcripción tales como jun, fos, max, mad, factor de respuesta del suero (SFR), AP-1, AP-2, myb, MRG1, CREM, Alx4, FREAC1, NF-kB, miembros de la familia de cierre de leucina, proteínas de dedo de zinc C2H4 que incluyen Zif268, EGR1, EGR2, proteínas de dedo de zinc C6, que incluyen los receptores de glucocorticoide y estrógeno, proteínas de dominio POU, ejemplificadas por Pit 1, proteínas de homeodominío, que incluyen HOX-1, proteínas básicas de hélice-lazo-hélice, que incluyen myc, MyoD y miogenina, proteínas que contienen la caja ETS, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, proteínas de unión de la caja CCAAT, factor de regulación de interferón 1 (IRF-1), proteína de tumor de Wilms, proteína de unión de ETS, STAT, proteínas de unión de la caja GATA, por ejemplo, GATA-3, y la familia de proteínas de hélice con alas.
Otros productos de gen útiles incluyen carbamoil sintetasa 1, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, arginosuccinato Nasa, arginasa, fumarilacetoacetato hidrolasa, fenilalanina hidroxilasa, alfa-1 antitripsina, glucosa-6-fosfatasa, porfobilinógeno desaminasa, factor Vil, factor VIII, factor IX, factor II, factor V, factor X, factor XII, factor XI, factor de von Willebrand, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y reductasa, hemooxigenasa, enzima convertidora de angiotensina, endotelina-1, péptido natriurético auricular, pro-urocinasa, urocinasa, activador de plasminógeno, cofactor de heparina II, proteina activada C (factor v Leiden), proteína C, antritrombina, cistation beta-sintasa, cetoácido descarboxilasa de cadena ramificada, albúmina, isovaleril-CoA deshidrogenasa, propionil CoA carboxilasa, metil malonil CoA mutasa, glutaril CoA deshidrogenasa, insulina, beta-glucosidasa, piruvato carboxilasa, fosforilasa hepática, fosforilasa cinasa, glicina descarboxilasa (también referida como proteína P), proteína H, proteína T, proteína de la enfermedad de Menkes, supresores de tumor (por ejemplo, p53), regulador de transmembrana de fibrosis quística (CFTR), el producto del gen de la enfermedad de Wilson PWD, Cu/Zn superóxido dismutasa, aminoácido aromático descarboxilasa, tirosina hidroxilasa, acetilcolina sintetasa, prohormona convertasas, inhibidores de proteasa, lactasa, lipasa, tripsina, enzimas gastrointestinales que incluyen quimotripsina y pepsina, adenosina desaminasa, anti-tripsina a1 , inhibidor de metaloproteinasas de tejido (TIMP), GLUT-1 , GLUT-2, trehalosa fosfato sintasa, hexocinasas I, II y III, glucocinasa, cualquiera de las cadenas individuales o tipos de colágeno, elastina, fibronectina, tromboespondina, vitronectina y tenascina, y genes suicidas tales como timidina cinasa y citosina desaminasa. Otras proteínas útiles incluyen las que están implicadas en los trastornos de almacenamiento lisosomal, que incluyen b-glucosidasa ácida, a-galactosidasa a, a-1-iduronidasa, iduroato sulfatasa, a-glucosidasa ácida lisosomal, esfingomielinasa, hexosaminidasa A, hexomimidasas A y B, arilsulfatasa A, lipasa acida, ceramidasa ácida, galactosilceramidasa, a-fucosidasa, a-, b-manosidosis, aspartilglucosaminidasa, neuramidasa, galactosilceramidasa, heparan-N-sulfatasa, N-acetil-a-glucosaminidasa, acetil-CoA: a-glucosaminida N-acetiltransferasa, N-acetilglucosamina-6-sulfato sulfatasa, N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa, arilsulfatasa B, b-glucuronidasa y hexosaminidasas A y B.
Otros transgenes útiles incluyen polipéptidos no naturales, tales como polipéptidos quiméricos o híbridos, o polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos no natural que contiene inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácido. Por ejemplo, las inmunoglobulinas modificadas por ingeniería de una sola cadena podrían ser útiles en algunos pacientes inmunocomprometidos. Otras proteínas útiles incluyen receptores truncados que carecen de su dominio de transmembrana y citoplásmico. Estos receptores truncados se pueden usar para antagonizar la función de sus ligandos respectivos uniéndose a ellos sin señalización concomitante por el receptor. Otros tipos de secuencias de gen no naturales incluyen moléculas de sentido y antisentido y ácidos nucleicos catalíticos, tales como ribozimas, que se pueden usar para modular la expresión de un gen.
Vectores virales Las composiciones descritas en la presente (por ejemplo, composiciones que incluyen un vector viral que codifica GAA) se pueden administrar a un sujeto mamífero mediante cualquier teenica adecuada. Se proveen varias técnicas que usan vectores virales para la introducción de un gen GAA en las células de acuerdo con las composiciones y métodos descritos en la presente. Los virus son vehículos evolucionados naturalmente que suministran eficientemente sus genes a las células hospederas y por lo tanto son sistemas de vector convenientes para el suministro de genes terapéuticos. Los vectores virales preferidos exhiben baja toxicidad en la célula hospedera y producen cantidades terapéuticas de la proteína GAA (por ejemplo, de manera específica de tejido). Los métodos y protocolos de vectores virales son revisados por Kay et al., Nature Medicine, 7:33-40, 2001.
Aunque los experimentos descritos más abajo incluyen rAAV, se puede usar cualquier vector viral adecuado. Muchos vectores virales son conocidos para el suministro de genes a un sujeto mamífero, y a continuación se da una lista no exhaustiva de ejemplos. Los métodos para usar adenovirus recombinantes como vectores de terapia de genes se exponen por ejemplo en W.C. Russell, J. Gen. Viro!., 81 :2573-2604, 2000; y Bramson et al., Curr. Opin. Biotechnol., 6:590-595, 1995. Métodos de uso de vectores de virus de herpes simple se exponen por ejemplo en Cotter y Robertson, Curr. Opin. Mol. Ther. 1 :633-644, 1999. También se pueden usar vectores lentivirales defectuosos de replicación, incluso VIH. Los métodos para usar vectores lentivirales se exponen por ejemplo en Vigna y Naldini, J. Gene Med., 5:308-316, 2000 y Miyoshi et al., J. Viro!., 72:8150-8157, 1998. También se pueden usar vectores retrovirales que incluyen vectores basados en el virus de leucemia murina. Los métodos para usar vectores basados en retrovirus se exponen por ejemplo en Hu y Pathak, Pharmacol. Rev. 52:493-511 , 2000, y Fong et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. , 17:1-60, 2000. Otros vectores virales que pueden ser de utilidad incluyen alfavirus, que incluyen el virus del bosque Semliki y virus Sindbis. Se pueden usar vectores virales híbridos para suministrar un gen gaa a un tejido objetivo (por ejemplo, músculo, sistema nervioso central). Las téenicas estándares para la construcción de vectores híbridos son muy conocidas para los expertos en la materia. Estas técnicas se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Coid Spring Harbor, NY), o cualquier cantidad de materiales de laboratorio que exponen la tecnología de ADN recombinante.
Vectores y viriones de rAAV En algunas modalidades, los ácidos nucleicos de las composiciones y métodos descritos en la presente se incorporan en vectores y/o viriones rAAV para facilitar su introducción a una célula. Los vectores rAAV útiles en la invención son construcciones de ácido nucleico recombinante que incluyen (1) una secuencia heteróloga por expresar (por ejemplo, un polinucleótido que codifica una proteína GAA), y (2) secuencias virales que facilitan la integración y expresión de los genes heterólogos. Las secuencias virales pueden incluir las secuencias de AAV que se requieren en cis para replicación y empaquetamiento (por ejemplo, ITRs funcionales) del ADN en un virión. En aplicaciones típicas, el gen heterólogo codifica GAA, que es útil para corregir una deficiencia de GAA en una célula. Estos vectores de rAAV también pueden contener genes marcadores o reporteros. Los vectores rAAV útiles tienen uno o más de los genes WT de AAV suprimidos total o parcialmente, pero retienen secuencias ITR de flanqueo funcionales. Las ITR de AAV pueden ser de cualquier serotipo adecuado para una aplicación particular (por ejemplo, derivadas del serotipo 2). Los métodos para usar los vectores rAAV se exponen por ejemplo en Tal, J. Biomed. Sci., 7:279-291, 2000; y Monahan y Samulski, Gene Delivery, 7:24-30, 2000.
Los ácidos nucleicos y vectores de la invención generalmente se incorporan en un virión de rAAV para facilitar la introducción del ácido nucleico o vector en una célula. Las proteínas de la cápside de AAV componen la porción exterior diferente de ácido nucleico del virión y son codificadas por el gen cap de AAV. El gen cap codifica tres proteínas de cubierta viral, VP1, VP2 y VP3, que son requeridas para el ensamble del virión. La construcción de viriones de rAAV se ha descrito. Véanse por ejemplo las patentes de EE. UU. Nos. 5,173,414, 5,139,941 , 5,863,541 , y 5,869,305, 6,057,152, 6,376,237; Rabinowitz et al., J. Virol., 76:791-801 , 2002; y Bowles et al., J. Virol., 77:423-432, 2003.
Los viriones de rAAV útiles en la invención incluyen los derivados de varios serotipos de AAV que incluyen 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9. Para dirigirlos a las células de músculo, los viriones de rAAV que incluyen por lo menos una proteína de cápside del serotipo 1 pueden ser particularmente útiles, ya que los experimentos reportados en la presente muestran que inducen una expresión celular significativamente más alta de GAA que los viriones rAAV que solo tienen cápsides del serotipo 2. Los viriones de rAAV que incluyen por lo menos una proteína de cápside del serotipo 6 también pueden ser útiles, ya que las proteínas de cápside del serotipo 6 son estructuralmente similares a las proteínas de cápside del serotipo 1 , y por lo tanto se espera que también resulten en alta expresión de GAA en las células de músculo. El serotipo 9 de rAAV también se ha encontrado que es un transductor eficiente en las células de músculo. La construcción y uso de vectores de AAV y proteínas de AAV de diferentes serotipos se expone en Chao et al., Mol. Ther. 2:619-623, 2000; Davidson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97:3428-3432, 2000; Xiao et al., J. Viro!. 72:2224-2232, 1998; Halbert et al., J. Viro!. 74:1524-1532, 2000; Halbert et al, J. Virol. 75:6615-6624, 2001; y Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081 , 2001.
También son útiles en la invención los rAAV pseudotipificados.
Los vectores pseudotipificados de la invención incluyen vectores de AAV de un serotipo dado (por ejemplo, AAV2) pseudotipificados con un gen de cápside derivado de un serotipo diferente del serotipo dado (por ejemplo, AAV1 , AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, etc.). Por ejemplo, un vector pseudotipificado representativo de la invención es un vector rAAV2 que codifica GAA pseudotipificada con un gen de cápside derivado de AAV de un serotipo diferente (por ejemplo, AAV1 , AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9). En una modalidad, se observó que el suministro del transgen LacZ usando la vía de administración i.v. y la cápside de pseudotipo rAAV2/9 resulta en un grado de expresión aproximadamente 200 veces más alto en el tejido cardiaco que una dosis identica con rAAV2/1. Experimentos adicionales indicaron que el suministro i.v. de un transgen usando rAAV2/9 en ratones adultos también resulta en transducción en el tejido cardiaco. Las téenicas que incluyen la construcción y uso de viriones de rAAV pseudotipificados son conocidas y se describen en Duan et al., J. Viro!., 75:7662-7671 , 2001 ; Halbert et al., J. Viroi, 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002; y Auricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001.
Los viriones de AAV que tienen mutaciones dentro de la cápside del virión se pueden usar para infectar tipos particulares de célula más eficientemente que los viriones de cápside no mutados. Por ejemplo, los mutantes AAV adecuados pueden tener mutaciones de inserción de ligando para facilitar el direccionamiento de AAV a tipos de células específicos. La construcción y caracterización de mutantes de cápside de AAV, incluso mutantes de inserción, mutantes de cribado de alanina, y mutantes de etiqueta de epítopo, se describen en Wu et al., J. Viro!., 74:8635-45, 2000. Otros viriones de rAAV que se pueden usar en los métodos de la invención incluyen los híbridos de cápside que son generados por reproducción molecular de virus, así como por barajado del exón. Véase Soong et al., Nat. Genet., 25:436-439, 2000; y Kolman y Stemmer, Nat. Biotechnoi, 19:423-428, 2001.
Modulación de los niveles de GAA en una celula Los ácidos nucleicos, vectores y viriones anteriormente descritos se pueden usar para modular los niveles de GAA en una célula. El método incluye el paso de administrar a la célula una composición que incluye un ácido nucleico que incluye un polinucleótido que codifica GAA, interpuesto entre dos ITRs de AAV. La célula puede ser de cualquier animal al que se le pueda administrar un ácido nucleico de la invención. Las células de mamífero (por ejemplo, seres humanos, perros, gatos, cerdos, ovejas, ratones, ratas, conejos, reses, cabras, etc.) de un sujeto con una deficiencia en GAA son las células objetivo típicas para usarse en la invención.
En algunas modalidades la célula es una célula de miocardio, por ejemplo, un miocardiocito. En otras modalidades, la célula es una neurona (por ejemplo, del nervio motor frénico).
Aumento de la función motoneuronal (por ejemplo, neurona del nervio frénico) en un mamífero Los vectores de rAAV, composiciones y métodos descritos en la presente se pueden usar para aumentar la actividad del nervio frénico en un mamífero que tiene la enfermedad de Pompe y/o niveles insuficientes de GAA. Por ejemplo, se puede administrar rAAV que codifica GAA al sistema nervioso central (por ejemplo, las neuronas). En otro ejemplo, el transporte retrógrado de un vector rAAV que codifica GAA del diafragma (u otro músculo) al nervio frénico u otra neurona motora, puede resultar en la corrección bioquímica y fisiológica de la enfermedad de Pompe. Estos mismos principios se pueden aplicar a otras enfermedades neurodegenerativas.
Aumento de la actividad de GAA en un sujeto Los ácidos nucleicos, vectores y viriones descritos anteriormente se pueden usar para modular los niveles de GAA funcional en un sujeto mamífero. El método incluye el paso de proveer un sujeto animal y administrarle al sujeto animal una composición que incluye un ácido nucleico que incluye un polinucleótido que codifica GAA, interpuesto entre dos ITRs de AAV. El sujeto puede ser cualquier animal al que se le pueda administrar un ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, los sujetos adecuados son los mamíferos (por ejemplo, seres humanos, perros, gatos, cerdos, ovejas, ratones, ratas, conejos, reses, cabras, etc.). Los métodos y composiciones de la invención son particularmente aplicables a los sujetos animales deficientes en GAA.
Las composiciones anteriormente descritas se pueden administrar a animales que incluyen los seres humanos en cualquier formulación adecuada mediante cualquier método adecuado. Por ejemplo, los viriones (es decir, las partículas) de rAAV se pueden introducir directamente a un animal, incluso por inyección intravenosa (i.v.), inyección intraperitoneal (i.p.), o inyección in situ en el tejido objetivo (por ejemplo, el músculo). Por ejemplo, se puede usar una jeringa y aguja convencional para inyectar una suspensión del virión de rAAV a un animal. Dependiendo de la vía de administración deseada, la inyección puede ser in situ (es decir, en un tejido particular o sitio sobre un tejido), i.m., i.v. , i.p., o mediante otra vía parenteral. La administración parenteral de viriones por inyección se puede realizar, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de dosis múltiples, con un conservador añadido. Las composiciones pueden asumir tales formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como de suspensión, estabilización y/o agentes dispersantes. Alternativamente, los viriones de rAAV pueden estar en forma de polvo (por ejemplo, liofilizado) para su reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua esteril libre de pirógenos, antes del uso.
Para facilitar el suministro de los viriones de rAAv a un animal, los viriones de la invención se pueden mezclar con un vehículo o excipiente. Los vehículos y excipientes que se podrían usar incluyen solución salina (especialmente solución salina esterilizada libre de pirógenos), soluciones amortiguadoras salinas (por ejemplo, amortiguador de citrato, amortiguador de fosfato, amortiguador de acetato y amortiguador de bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina de suero), EDTA, cloruro de sodio, líposomas, manitol, sorbitol y glícerol. Los vehículos y excipientes grado USP son particularmente útiles para el suministro de viriones a los sujetos humanos. Los métodos para preparar estas formulaciones son muy conocidos y se pueden encontrar por ejemplo en "Remington’s Pharmaceutical Sciences".
Además de las formulaciones antes descritas, los viriones también se pueden formular como una preparación de depósito. Estas formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implante (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o por inyección i.m. De esta manera, por ejemplo, los viriones se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable), o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles.
Similarmente, los vectores de rAAV se pueden administrar a un sujeto animal usando una variedad de métodos. Los vectores de rAAV se pueden introducir directamente en un animal por administración intraperitoneal (inyección i.p.), y también administración parenteral (por ejemplo, inyección i.v., inyección i.m. e inyección in situ en el tejido objetivo). Los métodos y formulaciones para administración parenteral anteriormente descritos para los viriones de rAAv se pueden usar para administrar los vectores de rAAV.
El suministro ex vivo de células transducidas con viriones de rAAV también se provee dentro de la invención. Se puede usar suministro de gen ex vivo para transplantar células hospederas transducidas con rAAV de vuelta al hospedero. Slmilarmente, se puede usar terapia de célula madre ex vivo (por ejemplo, célula madre mesenquimal) para transplantar células hospederas transducidas con el vector rAAV de vuelta al hospedero. Un protocolo ex vivo adecuado puede incluir varios pasos. Un segmento de tejido objetivo (por ejemplo, tejido de músculo, hígado) se puede cosechar del hospedero y los viriones de rAAV se pueden usar para transducir un ácido nucleico que codifica GAA en las celulas del hospedero. Estas células modificadas genéticamente se pueden transplantar entonces de vuelta al hospedero. Varios enfoques se pueden usar para la reintroducción de las células al hospedero, que incluyen inyección intravenosa, inyección intraperitoneal, o inyección in situ en el tejido objetivo. La microencapsulación de las células transducidas o infectadas con rAAV modificado ex vivo es otra téenica que se puede usar dentro de la invención. De acuerdo con la invención se puede usar trasplante de célula antologa o alogeneica.
Dosis eficaces Las composiciones anteriormente descritas se administran típicamente a un mamífero en una cantidad eficaz, esto es, una cantidad capaz de producir un resultado deseado en un sujeto tratado (por ejemplo, aumentar la actividad de GAA WT en el sujeto). Esta cantidad terapéuticamente eficaz puede ser determinada como se describe más abajo.
La toxicidad y eficacia terapéutica de las composiciones utilizadas en los métodos de la invención pueden ser determinadas mediante procedimientos farmacéuticos estándares, usando ya sea células en cultivo o animales experimentales para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede ser expresada como la relación DL5o/DE5o. Las composiciones que exhiben índices terapéuticos grandes son preferidas. Aunque se pueden usar las que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado para diseñar un sistema de suministro que minimice el daño potencial de estos efectos secundarios. La dosis de las composiciones descritas en la presente generalmente está dentro de una escala que incluye una DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de esta escala dependiendo de la forma de dosis utilizada y la vía de administración utilizada.
Como es muy conocido en la ciencia médica y veterinaria, la dosis para cualquier animal depende de muchos factores que incluyen la talla, área de superficie corporal y edad del sujeto, la composición particular por administrar, el tiempo y vía de administración, la salud general, y otros fármacos administrados concurrentemente. Es de esperar que una dosis apropiada para administración intravenosa de partículas estaría en la escala de aproximadamente 1012-1015 partículas. Para un humano de 70 kg, actualmente se considera que una dosis apropiada es una inyección de 1 a 10 mL (por ejemplo, 5 mL) de 1012-1015 partículas.
Las modalidades de las composiciones y métodos de la invención se ilustran en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proveen con fines ilustrativos y no se consideran limitaciones del alcance de las composiciones y métodos de la invención.
EJEMPLOS Materiales v metodos Producción del virus Los vectores de AAV recombinantes fueron generados, purificados y titulados en el Laboratorio Powell Gene Therapy Center Vector Core de la University of Florida, como se describe anteriormente (Zolotukhin, S, et al., Methods, 28:158-167, 2002).
Invecciones intravenosas Todos los procedimientos con animales se hicieron de acuerdo con las guías del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la University of Florida (ratones) o la University of California (UC) Davis IACUC (monos; véase más abajo). A ratones cachorros de un día de edad se les inyectó, a través de la vena temporal superficial como se describe previamente (Sands MS, et al., Lab. Anim. Sci., 49:328-330, 1999). Brevemente, los ratones se sometieron a anestesia por hipotermia inducida. Se usó una jeringa de tuberculina calibre 29.5 para suministrar el vector en un volumen total de 35 mL directamente en la vena temporal izquierda. A ratones adultos de dos meses de edad se les inyectó a través de la vena yugular. Primero se anestesiaron los ratones usando una mezcla de 1.5% de ¡soflurano y 02 (1 a 2 L). Se hizo una incisión de 0.5 cm para exponer la vena yugular. Después se usó una aguja y jeringa estériles de calibre 29 para suministrar el virus en un volumen de 150 m!_. Se obtuvo hemostatis; la piel se aproximó y se sostuvo firmemente con Vetbond (3M, St. Paul, Minn).
Detección de b-qalactosidasa Los lisados de tejido se analizaron para determinar la actividad de la enzima b-galactosidasa usando el sistema de ensayo de gen reportero de quimioluminiscencia Galacto-Star (Tropix Inc, Bedford, Mass). Las concentraciones de proteína de los lisados de tejido se determinaron usando el kit de ensayo de proteína Bio-Rad DC (Hercules, Calif).
Análisis de ECG Se adquirieron trazos de ECG usando electrodos de aguja subcutáneos estándares (MLA1203, 1.5 mm Pin 5; AD Instruments) en el hombro derecho, extremidad anterior derecha, extremidad anterior izquierda, extremidad trasera izquierda y cola, y un instrumento Power Laboratory Dual BioAmp. Se analizaron cinco minutos de trazos de ECG de cada animal usando el software Chart® de ADInstrument.
Estudios en primates no humanos Se realizaron estudios con monos en el Center for Fetal Monkey Gene Transferfor Heart, Lung, and Blood Diseases, localizado en el California National Primate Research Center (UC Davis). Monos Rhesus en estado de embarazo (n = 6) se monitorearon durante el embarazo por medio de ultrasonido, y los recien nacidos se liberaron por sección cesárea a término usando las téenicas establecidas. En el transcurso de una hora del nacimiento los recién nacidos se les inyectó por vía intravenosa el vector (« 1 ml_) a través de un vaso periférico. Los infantes recibieron rAAV2/1-CMV-hGaa (n = 3) o rAAV2/9-CMV-hGaa (n = 3). Los infantes se criaron en un criadero y se monitorearon por 6 meses, y después se les sometió a eutanasia con una sobredosis de pentobarbital y se hicieron cosechas de tejido completo (uno por grupo) usando los métodos establecidos. Especímenes de anímales de control de una edad comparable estuvieron disponibles a través del centro Fetal Monkey Gene Transfer. La actividad de GAA se midió en los tejidos cosechados 6 meses después de la inyección y la actividad de fondo de los controles no inyectados se sustrajo para producir los resultados de la figura 5A. El ADN genómico (ADNg) se extrajo de los tejidos de acuerdo con el protocolo del fabricante (Qiagen: kit de tejido DNeasy). Las concentraciones de ADN resultantes del procedimiento de extracción se determinaron usando un Eppendorf Biophotometer (modelo 6131 ; Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Se usó un microgramo de ADNg extraído en todas las PCRs cuantitativas de acuerdo con un protocolo usado anteriormente (Song, S, et al., Mol Ther., 6:329-335, 2002) y las condiciones de reacción (recomendadas por Perkin-Elmer/Applied Biosystems) incluyeron 50 ciclos de 94.8°C por 40 segundos, 37.8°C por 2 minutos, 55.8°C por 4 minutos, y 68.8°C por 30 segundos. Se diseñaron pares de iniciadores para el promotor de CMV como se describe (Donsante A, et al., Gene Ther., 8:1343-1346, 2001) y se establecieron curvas patrón de las concentraciones añadidas de un ADN plasmídico que contiene el mismo promotor. Las muestras de ADN se analizaron por triplicado. El tercer duplicado se suplemento con CBATDNA a una relación de 100 copias/pg de ADNg. Si por lo menos 40 copias del ADN añadido eran detectadas, la muestra de ADN se consideró aceptable para reportar las copias de ADN del vector.
EJEMPLO 1 El virus adenoasociado recombinante produce transducción cardiaca preferencial in vivo.
El rAAV2/1 se comparó directamente con dos serotipos menos caracterizados (rAAV2/8 y rAAV2/9) en su capacidad para transducir el miocardio in vivo. Estos vectores recombinantes o pseudotipificados se crean insertando un transgen de interes flanqueado por las repeticiones terminales invertidas (ITRs) de AAV2 en la cápside de otro serotipo. Se suministraron 1 x 1011 genomas de vector (vg) de cada uno de los 3 serotipos diferentes (rAAV2/1 , rAAV2/8, o rAAV2/9) que llevan la construcción CMV-lacZ (lacZ citoplásmico) por la vía venosa sistémica a ratones de 1 día de edad (5 recién nacidos por grupo), en un volumen de inyección de 35 mL (figuras 1A a 1 D). Los corazones de los ratones inyectados se cosecharon 4 semanas después de la inyección y se realizó tinción con 5-bromo-4-cloro-3-indolil- -D-galactósido (X-gal) sobre criosecciones congeladas para visualizar la magnitud de la biodistribución de la expresión de b-galactosidasa a través del miocardio (figuras 1A a 1C). Además, la actividad de b-galactosidasa se determinó para cuantificar la expresión de LacZ (figura 1D). La téenica de PCR cuantitativa de verde SYBR también se realizó en estos corazones para comparar las cantidades relativas de los genomas de vector presentes. Se encontró que estaban presentes 0.19, 16.12 y 76.95 vg por célula diploide en los corazones de los ratones inyectados con rAAV2/1, rAAV2/8 y rAAV2/9, respectivamente.
Los cálculos de los genomas de vector por célula se determinaron como se describió anteriormente (Wei JF, et al., Gene Ther., 1:261-268, 1994).
Los resultados muestran que, de los serotipos comparados en este trabajo, el suministro venoso sistémico de AAV2/9 resulta en una distribución amplia y uniforme del vector y producto de transgen en el miocardio sin administración cardiaca selectiva. El grado de expresión del gen se mostró que resulta en un grado de expresión 200 veces mayor que el observado para rAAV2/1. El rAAV2/8 provee una transducción excepcional de miocardio en cantidades »20 veces mayores que las obtenidas usando rAAV2/1; sin embargo, también hay una transducción significativa de hepatocitos con este serotipo. Las criosecciones teñidas con X-Gal demostraron que tanto rAAV2/8 como rAAV2/9 proveen una distribución amplia y uniforme de expresión del transgen por todo el corazón. En contraste, los corazones inyectados con rAAV2/1 mostraron una expresión general mucho menor. Adicionalmente, se hizo inmunohistoquímica con un anticuerpo de troponina cardiaca (Santa Cruz Biotechnology) y se encontró que las células que expresan b-galactosidasa eran cardiomiocitos.
También, los estudios demostraron que el rAAV2/9 se transduce en los cardiomiocitos más eficientemente que en los mioblastos in i /¡tro. El ensayo de detección de enzima b-galactosidasa se hizo entonces en otros tejidos de estos mismos animales para caracterizar la biodistribución de la expresión de lacZ. Se encontró que tanto rAAV2/8 como rAAV2/9 son susceptibles de transducción en el músculo esquelético a cierto grado (figura 2A). En general, rAAV2/8 tiene la capacidad de proveer una biodistribución general amplia y uniforme de expresión a través del músculo además del corazón, mientras que la expresión del transgen suministrado por rAAV2/9 es mucho mayor en el corazón que en cualquier otro tejido.
El ensayo de b-galactosidasa también se realizó sobre muestras de tejido no cardiacas de músculo no esquelético de estos ratones (figura 2B). Estos resultados mostraron que mientras que rAAV2/8 y rAAV2/9 son capaces de transducirse en tejidos tales como el cerebro, pulmón y riñón, hay una menor transducción en el bazo e intestino delgado.
Una vez que se estableció que rAAV2/9 exhibió la afinidad natural más alta por el miocardio, se caracterizó adicionalmente la actividad de rAAV2/9 in vivo. El promotor de CMV se escogió para estos estudios porque este casete de expresión era de tamaño y perfil de expresión apropiados en el tejido de interés objetivo. Se hizo PCR cuantitativa con verde SYBR sobre especímenes de tejido de corazón, hígado y cuádriceps de ratones a los que se inyectó rAAV2/9, para comparar las cantidades relativas de genomas de vector presentes en estos tejidos. Estos resultados mostraron que hubo « 76.95 vg/celula (genomas de vector por célula diploide) en el miocardio y 2.89 vg/célula y 11.47 vg/célula presente en el hígado y cuádriceps, respectivamente. La implicación clínica de estos hallazgos es que incluso cuando se usa una cápside de AAV, que exhibe una afinidad natural alta por un tejido específico, el uso de un promotor específico de tejido será crítico para asegurar finalmente la expresión del transgen restringida al área de interés.
Se hicieron estudios adicionales para evaluar un ensayo del curso de tiempo de la expresión de rAAV2/9-CM M-íacZ en músculo cardiaco y esquelético. A ratones recién nacidos de un día de edad se les inyectó 5 x 1010 vg, y los músculos cardiaco y esquelético se cosecharon 1 , 7, 14, 28 y 56 días después de la inyección (figura 3A). Los resultados muestran que el inicio de la expresión de transgen en ambos tejidos ocurrió entre 1 y 7 días después de la administración del vector. La cantidad de expresión en el músculo esquelético aumentó gradualmente durante los primeros 28 días, después se estabilizó y mantuvo un nivel constante por lo menos 56 días. La cantidad de expresión del transgen en el tejido cardiaco fue consistentemente más alta que en el músculo esquelético y siguió aumentando establemente durante todo el experimento (56 días).
Después se realizó PCR cuantitativa con verde SYBR en estos tejidos para determinar si el aumento de la expresión del transgen en el tejido cardiaco era atribuidle a un aumento en la estabilidad de la proteína b-galactosidasa en el tejido cardiaco, en comparación con el tejido de músculo esqueletico (figura 3B). El número de copias del genoma del vector aumentó en el tejido cardiaco pero no en el tejido de músculo esquelético. Adicionalmente se aisló ARN de estos tejidos y se encontró que el número de transcritos de ARN también aumentó durante el experimento (figura 3C).
El receptor celular para AAV9 no se conoce actualmente; sin embargo, la transducción cardiaca preferencial garantiza una evaluación ulterior de ligandos cardiacos que son enlazados por AAV. Los datos sugieren que la cápside de AAV9 pueden no ser absorbida por otros tejidos tan fácilmente como los serotipos previamente estudiados, debido a su incapacidad para unirse a un receptor más ubicuo localizado en todo el cuerpo, tal como el receptor de proteoglicano de sulfato de heparina. Por lo tanto, la cápside de AAV9 podría requerir más tiempo para alcanzar el tejido cardiaco. Una explicación adicional del aumento en la concentración del genoma del vector durante el experimento es que puede haber un retraso en la síntesis de doble cadena del transgen suministrado en el corazón, que podría explicar potencialmente una duplicación de los genomas del vector.
Después se hizo un estudio en ratones adultos para determinar si el comportamiento de rAAV2/9 que se observó en los recién nacidos es similar en animales adultos. Se administró rAAV2/9-CMV-lacZ (1x1011 vg) a ratones de 3 meses de edad usando una vía de suministro intravenoso a través de la vena yugular (figura 4B). Los tejidos se cosecharon 4 semanas después de la inyección y se determinó el grado de expresión del transgen para el músculo tanto cardiaco como esquelético. Los resultados muestran que el rAAV2/9 se transduce en el músculo cardiaco y esquelético en ratones adultos, aunque en comparación con la misma dosis administrada a los recién nacidos, el grado de expresión fue mucho menor (figura 4A). El grado de expresión suministrado por rAAV2/9 en los adultos fue comparable al observado después del suministro intravenoso de la misma dosis de rAAV2/1-CMV-lacZ a los recién nacidos. Es de esperar una transducción general de rAAV2/9 más baja en adultos en comparación con la misma dosis en recién nacidos, debido a la dosis reducida por kilogramo de peso corporal. Estos datos demuestran, sin embargo, que se observa un perfil de biodistribución similar si el rAAV2/9 se suministra por vía intravenosa a los adultos o recién nacidos, y provee más evidencia de que el rAAV2/9 se transduce preferencialmente en el tejido cardiaco.
Se usó un modelo de cardiomiopatía heredada para evaluar una aproximación de transferencia de gen para esta afección. La enfermedad de Pompe es una forma de distrofia muscular y miopatía metabólica causada por mutaciones en el gen de b-glucosidasa ácida (Gaa). Una cantidad insuficiente de la enzima GAA produce la acumulación de glucógeno en los lisosomas y consecuentemente disfunción celular. En pacientes humanos hay una correlación directa entre la cantidad de GAA producida y la severidad de la enfermedad. Sin tratamiento, típicamente ocurre falla cardiorrespiratoria en los pacientes de inicio temprano en el primer año de vida.
Para demostrar la capacidad del pseudotipo rAAV2/9 para suministrar un transgen terapéutico para corregir y/o prevenir el inicio de un fenotipo de enfermedad, el modelo de ratón Gaa7 se trató con rAAV2/9-CMV-hGaa (Gaa humano). Debido a los resultados del gen marcador rAAV2/9, era de esperar que una dosis terapéutica más baja de la que es típicamente necesaria fuera suficiente para proveer una corrección en un modelo de cardiomiopatía de ratón. Por lo tanto, se administraron dosis por recién nacido de 4 x 105 o 4 x 108 vg de rAAV2/9-CMV-hGaa a los ratones GaaA a 1 día de edad usando la vía de suministro intravenoso. Tres meses después de la inyección se hicieron ECGs en cada grupo de dosis de los ratones Gaa/_ tratados y no inyectados de igual edad y controles sanos de tipo silvestre (B6/129).
De manera similar a la forma humana de esta enfermedad, los ECGs del ratón GaaA no tratado exhiben un intervalo PR reducido en comparación con los controles sanos B6/129 (PR = 33.41 ± 1.35 ms, o 26% más cortos que el tipo silvestre [PR = 44.95 ± 1.58 s]). Los ratones que fueron tratados con la dosis baja (4 x 105 vg) de rAAV2/9-CMV-hGaa exhibieron un intervalo PR de 36.76 ± 1.12 ms, o sólo 18% más cortos que los controles de tipo silvestre de igual edad (P = 0.062). El grupo de dosis tratado con 4 x 108 vg exhibió un intervalo PR de 39.38 + 2.42 ms, o sólo 12% más corto que los controles B6/129 de igual edad (P = 0.058). Esencialmente, a estas dosis bajas, se observó un intervalo PR alargado que puede aumentar conforme avanza el tiempo.
Aunque el ratón es un modelo generalmente bien aceptado para estudios de terapia de genes, el comportamiento de las diversas cápsides de AAV en los humanos puede ser muy diferente. Por lo tanto, actualmente se realizan experimentos a largo plazo en primates no humanos para evaluar la expresión con el tiempo en un modelo de animal más filogeneticamente similar a los humanos. Los resultados de este estudio en marcha muestran que 6 meses después del suministro intravenoso a través de un vaso periférico (en el nacimiento) de rAAV2/9-CMV-hGaa o rAAV2/1-CMV-hGaa a macacos Rhesus infantes, el perfil de expresión entre los serotipos es similar al que se observó en los ratones con rAAV2/9, produciendo? 4 veces más expresión de GAA que rAAV2/1 (figura 5A). El perfil de biodistribución del genoma del vector observado en estos tejidos de primate no humano también fue similar al encontrado en el tejido de ratón (figura 5B) con rAAV2/9, demostrando una preferencia notable por el tejido cardiaco sobre el músculo esquelético. Tanto para la expresión como para el análisis del genoma del vector de especímenes de corazón de primate no humano, los números se promediaron entre corazón derecho e izquierdo, incluso las aurículas y ventrículos. La biodistribución de expresión y los genomas de vector parecieron ser uniformes en todo el corazón.
EJEMPLO 2 La cápside de AAV9 se transduce preferencialmente en tejido cardiaco y demuestra un comportamiento único ¡n vivo Desarrollo de un enfogue de terapia de gen para ei tratamiento de cardiomiopatías heredadas Evaluando los perfiles de expresión en tejidos de todo el cuerpo despues de la administración intravenosa (i.v.) del virus a adultos, ratones recién nacidos y primates no humanos, se determinó que (de los evaluados) el serotipo de AAV óptimo para la transducción en tejido cardiaco es AAV2/9. Por medio de MRI, ECG y análisis de tejido, se demostró que el suministro i.v. de 410 vg de AAV2/9, que lleva un transgen terapéutico, puede aliviar el fenotipo cardiaco en un modelo de ratón de la enfermedad de Pompe, un trastorno de almacenamiento de glucógeno. A los 3 meses de edad, el análisis de ECG mostró un mejoramiento en el intervalo de PR, y la evaluación de MRI demostró un mayor gasto cardiaco en comparación con los controles no tratados. Seis meses después de la administración estos mejoramientos continuaron y las tinciones de PAS de los especímenes de corazón mostraron una depuración exitosa del glucógeno. La afinidad natural alta de AAV2/9 por el tejido cardiaco sugiere que éste se une preferentemente a un receptor que es predominante en los cardiomiocitos. Los estudios han revelado una característica interesante que es única para esta cápside entre los previamente estudiados. Se administraron 510 vg de AAV2/9-CM V-LacZ a ratones de 1 dia de edad, y el corazón y los músculos se cosecharon en un periodo de hasta 56 dias para cuantificar la expresión. Aunque la expresión de beta-gal se estabilizó en el tejido de músculo esquelético, siguió aumentando en el corazón. El análisis de vg reveló el mismo fenómeno. Los datos sugieren que las cápsides de AAV9 pueden seguir liberándose de los tejidos con el tiempo y requieren más tiempo para alcanzar el corazón después del suministro i.v.
El suministro de gen mediado por rAAV2/9 de g-qlucosidasa ácida corrige el fenotipo cardiaco en un modelo de ratón de enfermedad de Pompe La enfermedad de Pompe es una forma de distrofia muscular y miopatía metabólica causada por mutaciones en el gen de alfa-glucosidasa ácida (GAA). Una cantidad insuficiente de GAA produce la acumulación de glucógeno en los lisosomas y consecuentemente disfunción celular. En pacientes humanos hay una correlación directa entre la cantidad de GAA producida y la severidad de la enfermedad. Sin tratamiento, típicamente ocurre falla cardiorrespiratoria en los pacientes de inicio temprano en el primer año de vida.
Se describe aquí un estudio de caracterización del fenotipo cardiaco en el modelo de ratón GAA-knockout ( gaa -/-) en varias edades mediante análisis de los trazos de ECG, datos de MRI y uso de la tinción de ácido periódico de Shift (PAS) para evaluar visualmente el contenido de glucógeno en secciones de tejido. Por medio de análisis de ECG se observó un intervalo PR reducido a los 3 meses de edad ( gaa-l - 33.41 ± 1.35 ms, control 44.95 ± 1.58 ms), imitando el fenotipo de conducción observado en la población de Pompe humana. A las 2 semanas de edad se pueden observar cantidades anormales de glucógeno en los lisosomas de las células cardiacas como lo muestra la tinción de PAS. El análisis de MRI muestra una disminución del volumen sistólico (SV) ( gaa-l - 36.13 ± 1.19 mL, control 51.84 ± 3.59 pL) y una disminución del gasto cardiaco (CO) ( gaa-l - 7.95 ± 0.26 mL/min, control 11.40 ± 0.79 mL/min) a los 3 meses, y un aumento significativo de la masa de miocardio (gaa-l- 181.99 + 10.7 mg, control 140.79 ± 5.12 mg) a los 12 meses de edad.
Este modelo de disfunción cardiaca se usa para desarrollar una téenica de suministro cardiaco de gen que se puede aplicar a muchas cardiomiopatías heredadas genéticamente. Previamente se mostró que el suministro i.v. de vectores virales AAV2 recombinantes pseudotipificados con cápsides virales del serotipo 1 (rAAV2/1), que llevan la construcción CMV-hGAA, a recién nacidos Gaa-l- de 1 día de edad, restaura la actividad de GAA en varios tejidos cuando se observa 12 meses después de la administración. Más recientemente, se encontró que el suministro del transgen LacZ usando la vía de administración i.v. y la cápside del pseudotipo rAAV2/9, resulta en un grado de expresión aproximadamente 200 veces más alto en el tejido cardiaco que una dosis idéntica con rAAV2/1. Experimentos adicionales indicaron que el suministro i.v. de un transgen usando rAAV2/9 en ratones adultos también resulta en transducción en el tejido cardiaco.
El serotipo de rAAV óptimo para transducción cardiaca (rAAV2/9) ahora se ha combinado con la vía de administración i.v. , clínicamente relevante, para suministrar el gen GAA humano (hGAA) a ratones Gaa-/-. Los recien nacidos tratados con rAAV2/9-CMV-hGAA a una escala de dosis (4 c 105 vg, 4 c 108 vg y 4 c 1010vg) usando esta estrategia, han demostrado corrección sostenida, evaluada por análisis de ECG (39.38 ± 2.42 ms). Las tinciones de PAS en secciones de tejido congelado y también el análisis de MNR sobre tejidos liofilizados han mostrado menos acumulación de glucógeno en el tejido cardiaco de ratones gaa-l- tratados como recién nacidos, en comparación con los controles no tratados. El análisis de MRI no invasivo ha mostrado un aumento en SV y CO. Los ratones Gaa-l- adultos también se han tratado usando la vía de suministro i.v. y actualmente se evalúan para revertir los efectos de la enfermedad de Pompe en ratones que ya han empezado a presentar el fenotipo cardiaco.
La vía de suministro sistémico, el uso del promotor de CMV y el hecho de que GAA sea una enzima secretada, todo ello promueve la expresión y corrección en todo el cuerpo. Se ha observado actividad de GAA en varios otros tejidos de ratones tratados que incluyen músculo esquelético e hígado. En conclusión, estos estudios han demostrado la capacidad de rAAV2/9 para ser administrado sistémicamente usando una vía de suministro i.v. relativamente no invasiva, trascender la vasculatura, transducirse en tejidos por todo el cuerpo y finalmente impedir la presentación de los fenotipos cardiacos de la enfermedad de Pompe.
EJEMPLO 3 MRI para la caracterización y evaluación de la terapia de gen en modelos murinos de distrofia muscular Se realizan estudios para establecer qué combinación de serotipo de virus adenoasociado (AAV), promotor y vía de suministro es la más ventajosa para el suministro de un gen cardiaco. Se realizan estudios para caracterizar no invasivamente los corazones en modelos de ratón de las diversas formas de distrofia muscular que pueden ser tratadas. Los ejemplos de modelos de varias formas de distrofia muscular incluyen: un modelo de distrofia muscular de cinturas; alfa-sarcoglicano knockout (ASG-/-), un modelo de la distrofia miotónica de tipo 1 (MDNL1-/-) en el cual el exón 3 de MBNL ha sido suprimido, y el modelo de ratón MDX para distrofia muscular de Duchenne que carece de distrofina.
En estudios de caracterización iniciales, el tejido cardiaco de estos modelos se cosechó a una variedad de edades y se encontró que las manifestaciones de la enfermedad aumentan con la edad en todos los casos. La localización y tamaño de las lesiones distróficas en las etapas iniciales del desarrollo pueden ser identificados y determinados debido a su capacidad para captar y secuestrar el colorante fluorescente Colorante Azul de Evans (EBD), debido a la permeabilidad anormal del tejido muscular deteriorado.
También fue demostrada la capacidad para identificar no invasivamente y monitorear la progresión del desarrollo de lesión distrófica en el músculo esquelético usando téenicas de resonancia magnética de 1H. Para reconocer las lesiones en las etapas tardías del desarrollo sobre criosecciones, se utilizó la tinción de tricromo. Esto marca la presencia de colágeno que se infiltra en lesiones distróficas más avanzadas conforme experimentan fibrosis.
La MR cardiaca provee imágenes de alta resolución que ofrecen información estructural y también funcional global y regional. En los ratones MDX más viejos (6-52 semanas), el corazón muestra lesiones focales de infiltración de células inflamatorias, daño de miocito y fibrosis localizada generalmente en el ventrículo o septo. También se encontró que los corazones MDX más viejos (de > 48 semanas) exhiben regiones de mayor intensidad de la señal de MR. Las regiones híper intensas se correlacionan con regiones de daño de miocito, determinado histológicamente usando acumulación de EBD, H y E, y tinción de tricromo. La MR cardiaca también se puede usar para monitorear la función del miocito. Realizando MRI cardiaca sobre estos modelos en varias edades se obtuvieron imágenes que han permitido la identificación de la presentación de cardiomiopatía dilatada, defectos de contractilidad y arritmias. Además de las mediciones y técnicas estándares de imagen cardiaca, se han establecido protocolos de marcación cardiaca para permitir la identificación de áreas de defectos de contractilidad localizados. Esto puede ser beneficioso para modelos de ratón que pueden exhibir disfunción regional debido a áreas de tejido necrótico en todo el corazón.
Al terminar estos estudios de caracterización, un siguiente paso incluye proveer terapia de gen a estos ratones y prevención de las manifestaciones de estas enfermedades. Los animales tratados se evalúan entonces periódicamente de forma no invasiva usando los protocolos de MRI establecidos para demostrar finalmente la corrección funcional en modelos murinos de cardiomiopatía.
EJEMPLO 4 Los deficits neurales contribuyen a la insuficiencia respiratoria en la enfermedad de Pompe Los objetivos principales fueron determinar si los ratones GAA tienen un patrón alterado de respiración, de forma similar a las dificultades de ventilación observadas en la población de pacientes, y si los déficits de ventilación en GSD II son mediados por un componente central.
Pletismografía: Se usó pletismografía barométrica para medir la ventilación minuto (MV) y tiempo inspiratorio (T¡) en ratones GAA/_ y controles de igual edad (raza B6/129). Después de un periodo de aclimatación (30 minutos) y línea de base (60 min; F ¡CO2 = 21%, FjC02 = 0%), los ratones se expusieron a provocación hipercápnica (10 min, F¡CC>2 = 6.5%) para estimular la salida motora respiratoria.
Maestreo de sangre: Ratones de control (B6/129) y GAA-/- se anestesiaron, y se extrajeron ~100 mI_ de sangre de la cola en un cartucho desechadle G8+ y se lcyó con una máquina l-Stat portátil (Heska Corp.)· Detección de glucógeno: El glucógeno se cuantificó usando una modificación del metodo de hidrólisis ácida. Se realizó tinción de ácido periódico de Schiff para detección histológica de glucógeno; se tiñó con Fluoro-Gold® (4%) los diafragmas de ratón, 48 horas antes de sacrificarlos para la detección de motoneuronas frénicas.
Mediciones de frecuencia de fuerza in vitro: La longitud óptima para la tensión tetánica isométrica se determinó para cada tira de diafragma, seguido por aumento progresivo de la frecuencia de estimulación. La fuerza generada se normalizó a la longitud y peso de la tira de diafragma.
Neurofisiología: El nervio frénico derecho se aisló, y la actividad eléctrica se registró en los ratones anestesiados (uretano i.v., 1.0-1.6 g/kg), ventilados mecánicamente, paralizados y vagotomizados con un electrodo de tungsteno bipolar.
Resultados y resumen: Las figuras 6A a 6C son gráficas que muestran los resultados de la ventilación minuto (mL/min) en la línea de base y durante 10 minutos de hipercapnia en ratones de control y GAA/_ de 6 meses (figura 6A), 12 meses (figura 6B) y >21 meses (figura 6C).
En resumen, los resultados muestran: Los ratones GAA/_ tienen un patrón alterado de respiración en comparación con los ratones de control de igual edad (figura 7A).
La deficiencia de GAA en el sistema nervioso resulta en déficit de ventilación como lo muestra la ventilación minuto atenuada en los ratones de GAA específica de músculo (que tienen diafragma con funcionamiento normal) (figura 7B).
El flujo inspiratorio medio atenuado sugiere que el impulso para respirar en los ratones GAA A puede estar disminuido (figura 8).
La acumulación de glucógeno en la medula espinal de ratones GAA_/ se observa empezando a los 6 meses de edad (figura 9A y figura 9B).
La salida frénica inspiratoria eferente se reduce en los especímenes GAA_/ en comparación con el control (figura 10A y figura 10B).
Conclusión: Los déficits de ventilación en los ratones GAAA son similares a la población de pacientes. El flujo inspiratorio medio, la cuantificación de glucógeno, el patrón de respiración del ratón de GAA específica de músculo y los datos del neurograma frénico, son consistentes con la hipótesis de que estas dificultades de ventilación reflejan tanto un componente muscular como neural en GSD II.
EJEMPLO 5 Corrección fisiológica de la enfermedad de Pompe usando los vectores rAAV2/1 Materiales v métodos El plásmido AAV2 recombinante p43.2-GAA (Fraites, T.J., Jr. et al., Mol. Ther. 5:571 -578, 2002) ha sido descrito previamente. Se produjeron partículas de AAV recombínantes basadas en el serotipo 1 usando p43.2-GAA, y fueron generados, purificados y titulados en el Powell Gene Therapy Center Vector Core Lab de la University of Florida como se describió anteriormente(Zolotukhin, S. et al., Methods, 28:158-167, 2002).
Todos los estudios de animal se realizaron de acuerdo con las guías del Comite Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la University of Florida. El modelo de ratón de la enfermedad de Pompe (GaaA) usado en este estudio se ha descrito anteriormente y fue generado mediante una interrupción dirigida del exón 6 del gen Gaa (Raben, N. et al., J. Biol. Chem., 273:19086-19092, 1998). A ratones GaaA de un día de edad se les administraron 5 c 1010 partículas (volumen total de 30 pL) de rAAV2/1-CMV-GAA, por vía intravenosa a través de la vena temporal superficial, como se describió anteriormente (Sands, M.S. y Barker, J.E., Lab. Anim. Sci., 49:328-330, 1999).
Diez, 24 y 52 semanas después de la inyección, los homogenatos de tejido se evaluaron para determinar la actividad de la enzima GAA. Brevemente, los lisados se analizaron para determinar la actividad de GAA midiendo la escisión del substrato sintético 4-metilumbeliferil-a-D-glucósido (Sigma M9766, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) después de incubación por 1 h a 37°C. La escisión exitosa produjo un producto fluorescente que emite a 448 nm, medida con una lectora de fluorescencia de microplaca FLx800 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). La concentración de proteína se midió usando el kit de ensayo de proteína DC de Bio-Rad (Bio- Rad, Hercules, CA). Los datos se representan como porcentaje de los niveles normales de GAA en cada tejido después de sustracción de los niveles en tejido de los especímenes Gaa/_ no tratados. La detección de anticuerpos anti-GAA se realizó por medio de ELISA.
Segmentos de diafragma tratado y no tratado se fijaron durante la noche en glutaraldehído al 2% en PBS, se incrustaron en Epon 812® (Shell), se seccionaron y se tiñeron con ácido periódico-Schiff (PAS) mediante los métodos estándares.
Los ratones se anestesiaron con una mezcla de isoflurano de 1.5-2% y 1 L/min de oxígeno, después se pusieron en posición supina sobre una almohadilla de calentamiento. Los cables de ECG se colocaron subcutáneamente en el hombro derecho, extremidad anterior derecha, extremidad anterior izquierda, extremidad trasera izquierda y la cola. Los trazos del ECG se adquirieron durante cinco minutos por animal usando la unidad PowerLab ADInstruments y el software de adquisición Chart (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO). Los intervalos pico de todos los trazos se promediaron para cada animal y después se promediaron dentro de cada grupo experimental.
Evaluación de la masa cardiaca La MRI cardiaca se realizó en un espectrómetro 4.7 T Bruker Avance (Bruker BioSpin Corporation, Billerica, MA) en las instalaciones de Advanced Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy (AMRIS) de la University of Florida (AMRIS). Los animales se anestesiaron usando isoflurano al 1.5% (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) y 1 L/min de oxígeno. Los animales se pusieron boca abajo sobre una espiral de superficie de transmisión y recepción de cuadratura construida en el laboratorio, con el corazón colocado tan cerca del centro de la espiral como fue posible. Las imágenes se adquirieron usando temporización cardiaca, y se dispararon en el pico de la onda R-R (SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY). El corazón se visualizó adquiriendo rebanadas individuales de eje corto a lo largo del ventrículo izquierdo. Las imágenes se adquirieron usando una secuencia de eco de gradiente (GRE) (matriz = 256 c 128, TE = 2.4 ms, FOV = 4 cm c 3 cm, 7-8 rebanadas, grosor = 1 mm). El TR efectivo (tiempo de repetición de impulso) fue gobernado por la frecuencia cardiaca del animal, que se observó para mantener la consistencia, y la anestesia se ajustó consecuentemente. El intervalo R-R fue típicamente de 250 ms.
Las imágenes se procesaron usando CAAS MRV para ratones (Pie Medical Imaging, Maastricht, Países Bajos). Los contornos se dibujaron para el epicardio y el endocardio para cada rebanada a lo largo del ventrículo izquierdo tanto, en la diástole final como la sístole final. Los resultados se exportaron y se analizaron y se calculó la masa miocárdica diastólica final.
Se usaron relaciones de fuerza isométrica-frecuencia para evaluar la fuerza contráctil del diafragma. El diafragma se aisló, con las costillas y tendón central adheridos, y se puso en solución de Krebs-Henseleit equilibrada con una mezcla de gas 95% 02 /5% CO2 sobre hielo. Se usó una sola tira de músculo, cortada del diafragma costal ventral paralelo a las fibras del tejido conectivo para determinar las relaciones fuerza-frecuencia. Abrazaderas Plexiglás® se sujetan a la tira del diafragma sujetando la costilla y el tendón central. La tira de músculo se suspende verticalmente en un baño de tejido encamisado con agua (Radnoti, Monrovia, CA) que contiene una solución de Krebs-Henseleit equilibrada con una mezcla de gas 95% 02 /5% CO2 mantenida a 37°C, pH 7.4, y equilibrada por 15 min. Para medir las propiedades contráctiles isometricas, la abrazadera sujetada al tendón central se conecta a un transductor de fuerza (modelo FT03, Grass Instruments, West Warwick, Rl). Las salidas del transductor se amplifican y diferencian mediante amplificadores operaciones y se someten a conversión A/D usando un sistema de adquisición de datos basado en computadora (Polyview, Grass Instruments). Para determinar la longitud óptima de tira de músculo (Lo) para la tensión tetánica isométrica, el músculo es estimulado por campo (modelo S48, Grass Instruments) a lo largo de toda su longitud usando electrodos de alambre de platino. Se evocan contracciones de arrastre individuales, seguido por aumentos paso a paso en la longitud de músculo, hasta obtener la tensión de arrastre isométrica máxima. Todas las propiedades contráctiles se miden isométricamente a Lo. La fuerza tetánica isométrica pico se mide a 10, 20, 40, 80, 100, 150 y 200 Hz. Se usan trenes simples de 500 ms, con un periodo de recuperación de cuatro minutos entre los trenes para prevenir la fatiga. Se usan calibradores para medir L0 antes de retirar el músculo del aparato. El tejido de músculo se diseca entonces de la costilla y tendón central, se seca con papel, secante y se pesa. El área de sección transversal del múscplo (CSA) se determina usando la ecuación CSA (cm2) = [masa de tira de músculo (g) /longitud de la fibra L0 (cm) c 1.056 (g/cm3)], en donde 1.056 g/cm3 es la densidad de músculo asumida. La CSA calculada se usa para normalizar la tensión isometrica, que es expresada como N/cm2.
La función respiratoria se evaluó usando pletismografía barométrica de todo el cuerpo. Ratones C57BL6/129SvJ, Gaa_/ y Gaa /_ tratados con rAAV2/1 , no anestesiados y no restringidos, se pusieron en una cámara transparente Plexiglás® (Buxco, Inc., Wilmington, NC). El flujo de aire de la cámara, la presión, la temperatura y la humedad se monitorean continuamente, y los parámetros tales como frecuencia, ventilación minuto, volumen corriente y flujo inspiratorio pico se miden y analizan usando el método de Drorbaugh y Fenn, y se registran usando el software BioSystem XA (Buxco, Inc.) (Drorbaugh, J.E. and Fenn, W.O., Pediatrics, 16:81-87, 1955) Se toman mediciones de la línea de base bajo condiciones de normoxia (F1O2: 0.21 , F|CO2: 0.00) durante un periodo de una hora, seguido por una exposición de diez minutos a la hipercapnia (F|02: 0.21, F|C02: 0.07).
Resultados La función cardiaca y respiratoria de los animales tratados con rAAV2/1 se examinó. De forma similar a la población de pacientes de Pompe, las mediciones de electrocardiograma (ECG) (intervalo P-R) fueron reducidas significativamente en el modelo de ratón. En los ratones tratados con rAAV2/1 , se observó un mejoramiento significativo de la conductancia cardiaca con intervalos P-R prolongados de 39.34 ± 1.6 ms, en comparación con los controles no tratados (35.58 ± 0.57 ms) (p < 0.05). Además, usando imaginología de resonancia magnetica (MRI) cardiaca, se notó una disminución notable de la masa ventricular izquierda cardiaca de 181.99 ± 10.70 mg en los controles de igual edad no tratados, a 141.97 ± 19.15 mg en los ratones tratados con rAAV2/1. Además, los ratones exhibieron una mayor fuerza contráctil del diafragma a aproximadamente 90% de las fuerzas pico del tipo silvestre, con ventilación significativamente mejorada correspondiente (particularmente en frecuencia, ventilación minuto y flujo inspiratorio pico), medida usando pletismografía barométrica de todo el cuerpo. Estos resultados demuestran que, además de la corrección bioquímica e histológica, los vectores rAAV2/1 pueden mediar corrección fisiológica sostenida tanto de la función cardiaca como respiratoria en un modelo de cardiomiopatía fatal y distrofia muscular.
El suministro sistémico de rAAV2/1 puede resultar en restauración sostenida de la actividad enzimática de GAA cardiaca v diafraqmática en los ratones Gaa-/ Se inyectaron 5 x 1010 partículas de rAAV2/1-CMV-hGAA a ratones GaaA de un día de edad a través de la vena temporal superficial. Se recolectaron muestras de suero en serie para determinar la formación de anticuerpos anti-hGAA, y los tejidos cardiaco y de diafragma se analizaron para determinar la actividad de la enzima GAA 10, 24 y 52 semanas despues de la inyección. Se detectó una respuesta inmune humoral transitoria con la presencia de anticuerpos anti-hGAA circulantes. Los títulos de anticuerpo fueron más altos once semanas después de la inyección, con un promedio de 16.08 ± 4.66 veces arriba de los niveles de fondo. Después de quince semanas, los títulos de anticuerpo cayeron significativamente a 4.72 ± 1.28 veces arriba del fondo, y se redujeron adicionalmente a los niveles de fondo 31 semanas después del tratamiento. Valores de actividad pico de la enzima GAA fueron detectados a las 24 semanas con 4223±1323% y 138.18±59.7% de la actividad normal (Gaa+/+) en el corazón y diafragma, respectivamente, disminuyendo a 593.79±197.35% y 39.81±17.43% de lo normal, respectivamente, un año después de la inyección.
La terapia mediada por AAV2/1 recombinante puede corregir las anormalidades de masa y conductancia cardiaca en ratones Gaa /-.
Los resultados arriba descritos demuestran que el suministro de los vectores rAAV2/1-CMV-hGAA resulta en la corrección bioquímica e histológica sostenida del fenotipo cardiaco de la enfermedad de Pompe, como es evidente por los niveles suprafisiológicos de actividad de la enzima GAA, y la depuración concomitante de glucógeno, determinada por tinción con el reactivo de ácido periódico-Schiff. La espectroscopia de resonancia magnética de protones (1H-MRS) de extractos ácido perclórico de tejidos cardiacos apoya adicionalmente estos hallazgos. Como se muestra en la figura 11 , en un ratón GaaA de 1 año de edad podría ser detectado un pico de glucógeno pronunciado. Se observó una reducción promedio de 70% del contenido de glucógeno en los corazones de los ratones Gaav~ de 1 año de edad tratados con rAAV2/1-CMV-hGAA, como recién nacidos, en comparación con los ratones no tratados.
Los efectos fisiológicos de la terapia mediada por rAAV2/1 sobre la función cardiaca se examinaron. Un intervalo P-R reducido es característico en los electrocardiogramas de pacientes con la enfermedad de Pompe. Al año de edad, los ratones GaaA exhiben un intervalo P-R significativamente reducido. Como se muestra en el cuadro 1 , los ratones Gaa7 de un año de edad a los que se administró rAAV2/1-CMV-hGAA como recién nacidos, mostraron una conductancia cardiaca significativamente mejorada con un intervalo P-R prolongado de 39.32 ± 1.6 ms, en comparación con los controles (35.58 ± 0.57 ms) (p<0.05). Además de la conductancia cardiaca aberrante, tanto la población de pacientes como el modelo de ratón de la enfermedad de Pompe también exhiben hipertrofia cardiaca pronunciada. Usando imaginología de resonancia magnética (MRI), estudios previos han mostrado que la masa cardiaca puede ser cuantificada con precisión, no invasivamente, en los modelos de ratón. Se usó MRI para evaluar la masa ventricular izquierda (LV) en el modelo GaaA. Al año de edad, los ratones Gaa1 tienen una masa de LV significativamente mayor (181.99 ± 10.7 mg) en comparación con los ratones Gaa+/+ de tipo silvestre de igual edad (C57BL6/129SvJ) (140.79 + 5.12 mg). Como se muestra en el cuadro 1 , los ratones Gaa1 tratados con rAAV2/1 tienen masas de LV similares a los ratones de tipo silvestre al año de edad (141.97 ± 19.15 mg). Aunque la masa de LV reducida en los ratones tratados con rAAV2/1 no fue estadísticamente muy significativo (p=0.06), la tendencia de la masa de LV más pequeña se piensa que es real y probablemente sería significativa con una población de muestra más grande.
CUADRO 1 La inyección intravenosa de rAAV2/1 reduce la masa cardiaca y alarga el intervalo P-R Masa ventricular (mg) Intervalo P-R (ms) Gaa 1 año de edad 181.99 ± 10.70 35.58 ± 0.57 BL6/129 1 año de edad 140.79 ± 5.12 45.13 ± 1.16 1 año de edad tratado con 141.97 ± 19.15** 39.34 ± 1.60* AAV2/1 Un año despues de la inyección, los ratones tratados con rAAV2/1 (n=7) y también los ratones Gaa1 (n=7) y C57 (n=5) de control de la misma edad, no tratados, se sometieron a electrocardiografía e imaginología de resonancia magnética.
La contractilidad del diafragma y la función ventilatoria mejoran significativamente después de la administración de los vectores rAAV2/1.
Como la insuficiencia respiratoria se manifiesta como una de las complicaciones clínicas más predominantes de la enfermedad de Pompe, se examinaron los efectos de la terapia de gen mediada por rAAV2/1 en ratones Gaa 1 (Kishnani, P.S. et al., Genet. Med., 8:267-288, 2006; Hagemans, M.L. et al, Neurology, 66:581-583, 2006; Mellies, U. et ai, Neurology, 64:1465-1467, 2005). La tinción de PAS del diafragma de ratones Gaa1 de un año de edad a los que se administró por vía intravenosa rAAV2/1-CMV-hGAA, mostró una reducción significativa de la cantidad de glucógeno acumulado, correspondiente con el nivel terapeutico de la expresión de GAA. El músculo del diafragma se aisló y se evaluó para determinar la generación de fuerza isométrica. La fuerza contráctil del diafragma generada por los ratones tratados con rAAV2/1 mejoró significativamente en comparación con los controles no tratados de igual edad, e incluso animales más jóvenes no tratados de 3 meses de edad. A la frecuencia de estimulación máxima (200 Hz), la fuerza generada por los diafragmas de los ratones tratados con rAAV2/1 fue de 21.98 ± 0.77 N/cm2, mientras que los diafragmas del ratón Gaa 1 de un año de edad generaron un promedio de 13.95 ± 1.15 N/cm2.
Para medir la ventilación se usó pletismografía barométrica de todo el cuerpo. La pletismografía permite la medición simultánea de múltiples parámetros de ventilación que incluyen la frecuencia (respiraciones/min), volumen corriente (mL/respiración), ventilación minuto (mL/min), y flujo inspiratorio pico (mL/s) en ratones no restringidos no anestesiados (DeLorme, M.P. y Moss, O.R., J. Pharmacol. Toxico!. Methods, 47:1-10, 2002). Los ratones se sometieron a 90 min de aire normóxico, seguido por una exposición de diez minutos a condiciones hipercápnicas (7% de CO2). Los niveles elevados de CO2 aumentan el impulso para respirar y permiten una evaluación de una escala extendida de capacidades respiratorias. La pletismografia se realizó a los 6 y 12 meses de edad. Los ratones Gaa 1 no tratados mostraron una capacidad ventilatoria notablemente disminuida a los 6 y 12 meses de edad, como lo muestra la frecuencia, volumen corriente, ventilación minuto y flujo inspiratorio pico significativamente reducidos (p<0.01) en respuesta a la hipercapnia. Inversamente, a los 6 meses, los ratones Gaa1 tratados con rAAV2/1 tuvieron una ventilación significativamente mejorada en todos los parámetros medidos en respuesta a la hipercapnia (figuras 12A a 12D), y un año despues del tratamiento, la frecuencia, ventilación minuto y flujo inspiratorio pico fueron significativamente más altos que los controles no tratados de igual edad (p<0.05) (figuras 13A a 13D).
Los experimentos descritos en la presente demuestran que además de la corrección bioquímica del fenotipo de la enfermedad, la administración de un vector rAAV2/1 terapéutico también puede llevar a una corrección funcional. El tratamiento con un vector rAAV2/1 terapéutico resultó en un mejoramiento significativo de la función cardiaca, como lo indica un intervalo P-R alargado en los electrocardiogramas de los animales tratados.
Estos experimentos también demuestran que un promedio de aproximadamente 39% de actividad normal de GAA puede resultar en depuración de glucógeno en el diafragma, el músculo principal implicado en la ventilación, así como también un mejoramiento notable de la capacidad contráctil del diafragma. Además, se observó un mejoramiento significativo de la función ventiiatoria bajo condiciones de hipercapnia. De manera similar a la función cardiaca, aunque se nota un mejoramiento notable en la función ventiiatoria, la corrección es sólo parcial. No se observó una diferencia significativa en la ventilación entre los animales tratados y los controles no tratados respectivos durante la exposición a las condiciones normóxicas.
Los experimentos realizados en el modelo de ratón Gaa 1 sugieren que la actividad de la motoneurona del nervio frénico en los ratones Gaa 1 es atenuada, y demuestran que una sola administración intravenosa de un vector rAAV2/1 terapéutico produce una corrección sostenida del fenotipo cardiorrespiratorio en un modelo de ratón de distrofia muscular metabólica.
EJEMPLO 6 Suministro mediado por qel de los vectores rAAV2/1 para corregir la función ventiiatoria en ratones de Pompe con formas progresivas de la enfermedad Se caracterizaron las consecuencias de un método mediado por gel del suministro de vectores virales de AAV2 recombinante terapéutico pseudotipificados con cápsides virales del serotipo 1 (rAAV2/1) en ratones Gaa 1 tratados a los 3, 9 y 21 meses de edad. En ratones tratados a los 3 meses de edad, se observó un mejoramiento significativo en la fuerza contráctil del diafragma a los 6 meses que se sostiene hasta un año de edad, en comparación con los controles no tratados de igual edad. Similarmente se observó fuerza contráctil significativamente mejorada en los ratones tratados a los 9 y 21 meses de edad, 3 meses despues del tratamiento (p<0.05). La ventilación bajo condiciones normóxicas (la relación de volumen corriente /tiempo inspiratorio, la relación de ventilación minuto a CO2 espirado, y el flujo inspiratorio pico) mejoró en los ratones tratados a los 3 meses de edad y analizados a los 6 meses (p < 0.05), pero no se sostuvo al año de edad, en comparación con los controles no tratados de igual edad. En todos los ratones tratados con gel de rAAV2/1 (tratados a los 3, 9 y 21 meses de edad), la ventilación minuto y el flujo inspiratorio pico mejoró significativamente bajo condiciones hipercápnicas. Estos resultados demuestran que en el suministro mediado por gel de vectores rAAV2/1, puede mediar un mejoramiento fisiológico significativo de la función ventilatoria en un modelo de distrofia muscular.
Materiales v métodos Empaquetamiento v purificación de los vectores AAV2/1 recombinantes El plásmido de AAV2 recombinante p43.2-GAA se había descrito anteriormente. Se produjeron partículas de AAV recombinante basadas en el serotipo 1 usando p43.2-GA4 , y fueron generadas, purificadas y tituladas en el Laboratorio Powell Gene Therapy Center Vector Core Lab. de la University of Florida.
Suministro in vivo Todos los estudios de animal se realizaron de acuerdo con las guías del Comite Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de la University of Florida. A ratones Gaa1 de 3, 9 y 21 meses de edad se les administraron 1 x 1011 partículas de rAAV2/1-CMV-GA4 directamente en el diafragma en una matriz de gel como se describe anteriormente (véase el número de solicitud de patente de EU. UU. 11/055,497, presentada el 10 de febrero de 2005).
Evaluación histológica de depuración de glucógeno Segmentos de diafragma tratado y no tratado se fijaron durante la noche en glutaraldehído al 2% en PBS, se incrustaron en Epon 812® (Shell), se seccionaron y se tiñeron con PAS mediante los métodos estándares.
Evaluación de la fuerza contráctil del diafragma Se usaron relaciones de fuerza isométrica-frecuencia para evaluar la fuerza contráctil del diafragma. El diafragma se aisló, con las costillas y tendón central adheridos, y se puso en solución de Krebs-Henseleit equilibrada con una mezcla de gas 95% 02 /5% CO2 sobre hielo. Se usó una sola tira de músculo, cortada del diafragma costal ventral paralelo a las fibras del tejido conectivo para determinar las relaciones fuerza-frecuencia. Abrazaderas Plexiglás® se sujetan a la tira del diafragma sujetando la costilla y el tendón central. La tira de músculo se suspende verticalmente en un baño de tejido encamisado con agua (Radnoti, Monrovia, CA) que contiene una solución de Krebs-Henseleit equilibrada con una mezcla de gas 95% 02 /5% CO2, mantenida a 37°C, pH 7.4, y equilibrada por 15 min. Para medir las propiedades contráctiles isometricas, la abrazadera sujetada al tendón central se conecta a un transductor de fuerza (modelo FT03, Grass Instruments, West Warwick, Rl). Las salidas del transductor se amplifican y diferencian mediante amplificadores operaciones y se someten a conversión A/D usando un sistema de adquisición de datos basado en computadora (Polyview, Grass Instruments). Para determinar la longitud óptima de tira de músculo (L0) para la tensión tetánica isométrica, el músculo es estimulado por campo (modelo S48, Grass Instruments) a lo largo de toda su longitud usando electrodos de alambre de platino. Se evocan contracciones de arrastre individuales, seguido por aumentos paso a paso en la longitud de músculo, hasta obtener la tensión de arrastre isométrica máxima. Todas las propiedades contráctiles se miden isométricamente a Lo. La fuerza tetánica isométrica pico se mide a 10, 20, 40, 80, 100, 150 y 200 Hz. Se usan trenes simples de 500 ms, con un periodo de recuperación de cuatro minutos entre los trenes para prevenir la fatiga. Se usan calibradores para medir L0 antes de retirar el músculo del aparato. El tejido de músculo se diseca entonces de la costilla y tendón central, se seca con papel secante y se pesa. El área de sección transversal (CSA) del músculo se determina usando la ecuación: CSA (cm2) = [masa de tira de músculo (g) /longitud de la fibra L0 (cm) x 1.056 (g/cm3)], en donde 1.056 g/cm3 es la densidad de músculo asumida. La CSA calculada se usa para normalizar la tensión isométrica, que es expresada como N/cm2.
Evaluación de la función ventilatoria La función respiratoria se evaluó usando pletismografia barométrica de todo el cuerpo. Ratones C57BL6/129SvJ (n = 10), Gaa 1 (n = 10), y Gaa1 tratados con rAAV2/1 (n = 8) no anestesiados, no restringidos, se ponen en una cámara Plexiglás® transparente (Buxco, Inc., Wilmington, NC). El flujo de aire de la cámara, la presión, la temperatura y la humedad se monitorean continuamente, y los parámetros tales como frecuencia, ventilación minuto, volumen corriente y flujo inspiratorio pico se miden y analizan usando el método de Drorbaugh y Fenn, y se registran usando el software BioSystem XA (Buxco, Inc.). Se toman mediciones de la línea de base bajo condiciones de normoxia (F1O2: 0.21, F1CO2: 0.00) durante un periodo de una hora, seguido por una exposición de diez minutos a la hipercapnia (F|02: 0.93, F|CO2: 0.07).
Registros del nervio frénico eferente Los ratones se anestesiaron con isoflurano al 2-3%, se canalizaron por la tráquea y se conectaron a un ventilador (Modelo SAR-830/AP, CWE, Incorporated). Los puntos de ajuste del ventilador se manipularon para producir presiones parciales de C02 arterial entre 45 y 55 mm Hg. Se implantó un cateter yugular (diámetro externo 0.033; tubería RenaPulse™ , Braintree Scientific) y se usó para cambiar la anestesia de los ratones de isoflurano a uretano (1.0-1.6 g/kg). Se insertó un catéter arterial de carótida (catéter de carótida de ratón, Braintree Scientific) para poder hacer mediciones de la presión sanguínea (Ohmeda P10-EZ) y extraer muestras de 0.15 ml_ para medir la P02 y PCO2 arterial (analizador de gas sanguíneo portátil l-Stat). Los ratones se vagotomizaron bilateralmente y se paralizaron (bromuro de pancuronio; 2.5 mg/kg, i.v.). El nervio frénico derecho se aisló y se puso en un electrodo de alambre de tungsteno bipolar. Las actividades eléctricas del nervio se amplificaron (2000x) y se filtraron (100-10,000 Hz; Modelo BMA 400, CWE, Incorporated). Al monitorear la actividad inspiratoria espontánea en el neurograma frénico, la señal amplificada fue rectificada en toda la onda y suavizada con una constante de tiempo de 100 ms, se digitalizó y se registró en una computadora usando el software Spike2 (Cambridge Electronic Design; Cambridge, Reino Unido). Los ajustes de ganancia del amplificador y los métodos de procesamiento de señal fueron idénticos en todos los animales experimentales. Los 30 segundos antes de cada extracción de sangre se analizaron para determinar la amplitud media de explosión inspiratoria frénica de estos registros digitalizados.
Resultados El suministro de rAAV2/1 mediado por qel puede resultar en transducción eficiente en el diafragma y depuración del glucógeno acumulado El análisis histológico de los diafragmas transducidos de los ratones a los que se administraron 1 c 1011 partículas de rAAV que codifica b-galactosidasa ( lacZ) inducida por el promotor de CMV mostró que la administración de rAAV2/1 no solo produce transducción uniforme a traves de la superficie del diafragma sobre el cual se aplicó el vector, sino que el vector rAAV2/1 podría transducirse en todo el grosor del tejido de diafragma. En comparación, los vectores rAAV2 pudieron transducirse solo en las primeras capas de células.
Se administraron 1 x 1011 partículas de rAAV2/1-CMV-GAA a los diafragmas de ratones Gaa1 adultos de tres, nueve y 21 meses de edad usando el método de gel. La actividad de la enzima GAA se analizó tres meses después del tratamiento en cada grupo de edad, y en una cohorte adicional de ratones tratados a los tres meses de edad, la actividad de GAA diafragmática se analizó nueves meses después del tratamiento. Se observó un promedio de 84.97±38.53% de la actividad normal de GAA en los diafragmas tratados. No se observó diferencia significativa en la actividad de GAA con respecto a la edad en el momento del tratamiento, o con el tiempo postratamiento como en el caso de los ratones tratados a los tres meses de edad y analizados a los 6 meses y 1 año de edad, respectivamente. La tinción con ácido periódico-Schiff (PAS) del tejido de diafragma también reveló una reducción de la cantidad de glucógeno almacenado en el tejido en todos los grupos de edad tratados.
La contractilidad del diafragma mejora significativamente despues de la administración de los vectores rAAV2/1 De manera similar a la población de pacientes de Pompe, los ratones Gaa1 tienen un debilitamiento progresivo de la fuerza contráctil del diafragma que se correlaciona con la duración de la enfermedad. Las relaciones de fuerza isométrica-frecuencia del músculo de diafragma aislado de ratones Gaa1 no tratados (n=3 para cada grupo) muestran una disminución significativa de la fuerza contráctil con la edad, desde los 3 meses de edad hasta los 2 años de edad. Después de la administración de rAAV2/1-CMV-hGAA a los diafragmas de ratones Gaa 1 , se observó un mejoramiento significativo en la fuerza contráctil del músculo del diafragma en comparación con los controles no tratados de igual edad. Para los animales que fueron tratados a los 3 meses de edad, la fuerza contráctil del diafragma mejorada significativamente a los 6 meses (fuerza pico de 24.83±3.31 N/cm2) se sostuvo hasta 1 año de edad (21.59 ± 1.59 N/cm2), en comparación con los controles no tratados de igual edad (fuerza pico de 16.53 ± 0.74 y 13.94 ± 1.15 N/cm2 a 6 meses y 1 año, respectivamente). En los ratones tratados a los 9 meses (fuerza pico de 21.28 ± 1.49) y 21 meses (fuerza pico de 17.21 ± 0.29) de edad, se observó todavía un mejoramiento significativo en la función contráctil de los diafragmas tratados, 3 meses después del tratamiento, en comparación con los controles no tratados de igual edad (fuerza pico de 12.71 ± 0.94 a los 2 años de edad).
La función ventilatoria mejora despues de la administración de los vectores rAAV2/1 a ratones adultos de Pompe Usando pletismografía barométrica, se midieron simultáneamente múltiples características de la ventilación en ratones no restringidos conscientes. En este estudio, la ventilación se midió bajo condiciones de normoxia (niveles normales de oxígeno del aire de respiración; F 02: 0.21 , F CO2: 0.00) y, para evaluar la extensión de la capacidad ventilatoria, bajo condiciones de hipercapnia (niveles más altos de los normales de dióxido de carbono; F|02: 0.93, F|C02: 0.07).
Bajo condiciones de normoxia, la ventilación (la relación de volumen corriente /tiempo inspiratorio (Vr/Ti; mL/s) (2.2 + 0.1 contra 1.79 ± 0.16), la relación de ventilación minuto (mL/min) a C02 espirado (VE/VC02) (18.65 ± 0.73 contra 13.3 ± 0.74), y el flujo inspiratorio pico (mL/s) (4.11 + 0.17 contra 3.21 ± 0.29)), todos mejoraron (p < 0.05) en los ratones tratados a los 3 meses de edad y analizados a los 6 meses, en comparación con los controles no tratados de igual edad. La corrección de la función ventilatoria en condiciones normóxicas no se sostuvo, sin embargo, ya que ninguno de los parámetros mejoró significativamente a un año de edad (9 meses después de tratamiento). Los animales que se trataron a los 9 meses y 21 meses de edad tampoco mostraron ventilación normóxica mejorada tres meses despues del tratamiento. Inversamente, la provocación respiratoria hipercápnica resultó en una función ventilatoria mejorada en todos los grupos tratados. Como se muestra en las figuras 14A a 14D y en las figuras 15A a 15D, en los animales tratados a los 3 meses y analizados a los 6 meses y 1 año de edad, y también en los animales tratados a los nueve meses y 21 meses de edad, la ventilación minuto (figuras 14A a 14D) y el flujo inspiratorio pico (figuras 15A a 15D) aumentaron significativamente sobre los animales de control no tratados de igual edad.
Aumento de la actividad del nervio frénico después del suministro de rAAV2/1 mediado por qel al diafragma de ratón Gaa-/ Fue de interés examinar la actividad del nervio frénico en un animal al que se administró rAAV2/1 en el músculo del diafragma. Como se muestra en la figura 16, la amplitud de explosión frénica inspiratoria en un ratón Gaa1 de 2 años de edad al que se administró rAAV2/1-CMV-hGAA mediante el método de gel a los 21 meses de edad, fue mayor que la de un animal de control no tratado de igual edad, sugiriendo una posible corrección de los déficits neurales potenciales en la enfermedad de Pompe.
Debido a la naturaleza física del diafragma de ratón (tamaño y grosor) se usó un método de suministro de vector basado en gel. El vector rAAV2/1 se pudo extender a través del grosor del diafragma, mientras que el vector rAAV2 solo se pudo transducir en las primeras capas de células. La diseminación del vector se puede atribuir a la cápside que confiere infección diferencial a traves de los receptores celulares y/o tráfico a través del tejido mediante el proceso de transcitosis.
En este estudio, la administración directa del vector rAAB2/1 al diafragma resultó en un aumento de la actividad del nervio frénico en el animal tratado en comparación con un control no tratado. Tomados juntos, estos resultados indican que la corrección fisiológica de la función del diafragma puede ser mediada por terapia génica basada en rAAV2/1, y que incluso los animales más viejos de 21 meses de edad (nótese que la esperanza de vida promedio de un ratón C57BL de tipo silvestre es de aproximadamente 2 años de edad) se puede beneficiar del tratamiento con terapia génica.
EJEMPLO 7 Los defectos neurales contribuyen a la insuficiencia respiratoria en un modelo de ratón de la enfermedad de Pompe La disfunción respiratoria es una marca distintiva de la enfermedad de Pompe y la debilidad muscular es considerada como la causa subyacente, aunque hasta ahora no se ha explorado la posibilidad de una contribución neural asociada. En los experimentos descritos en la presente se examinaron los aspectos conductuales y neurofisiológicos de la respiración en un modelo de animal de la enfermedad de Pompe -el ratón Gaav- en una segunda línea transgénica (MTP) que expresa GAA solo en el músculo esquelético. El contenido de glucógeno se elevó significativamente en la médula espinal cervical del ratón GaaA, incluso en motoneuronas frénicas marcadas de forma retrógrada. La ventilación, evaluada mediante pletismografía barométrica, fue atenuada durante respiración tranquila y provocación hipercápnica en los ratones Gaa A (6 a >21 meses de edad) contra los controles de tipo silvestre. Los ratones MTP tuvieron propiedades contráctiles del diafragma normales; sin embargo, los ratones MTP tuvieron una ventilación similar a los ratones GaaA durante la respiración tranquila. Los registros neurofisiológicos indicaron que las amplitudes de la explosión inspiratoria del nervio frénico eferente fueron sustancialmente más bajas en los ratones GaaA y MTP en comparación con los controles. Se concluyó que la salida neural al diafragma es deficiente en los ratones GaaA, y las terapias dirigidas solo al músculo pueden ser ineficaces en la enfermedad de Pompe.
Métodos Animales Los ratones GaaA y de hGAA específica de músculo (MTP) se han descrito anteriormente (Raben et al., Hum. Mol. Genet., 10:2039-2047, 2001 ; Raben et al., J. Biol. Chem., 273:19086-19092, 1998). En todos los experimentos se usaron ratones C57BI/6 X 129X1/SvJ contemporáneos de igual género. Los ratones se alojaron en una instalación específica de animales libres de patógeno de la University of Florida. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la University of Florida aprobó todos los procedimientos realizados en los animales.
Pletismografia barometrica La pletismografia barométrica para cuantificar la ventilación (Buxco Inc., Wilmington, NC) se ha descrito anteriormente y se adaptó para ratones. La ventilación se caracterizó en ratones machos y hembras. Los ratones se separaron por género solo cuando se detectaron diferencias significativas entre machos y hembras. Los datos de un subgrupo de los animales usados en estos experimentos se han reportado como controles para una intervención de terapia de gen.
Hemoglobina, hematocrito, y niveles de glucosa y sodio en la sangre Se extrajo sangre venosa de la cola de ratones anestesiados (isoflurano al 2%, el resto 02) directamente en un cartucho para análisis de gas sanguíneo disponible comercialmente (l-stat, Heska Corporation; Ft. Collins, CO).
Marcación retrógrada de motoneuronas frénicas El trazador retrógrado neuronal Fluoro-Gold® (4%, Fluorochrome, LLC, Denver, CO) se aplicó a la superficie peritoneal del diafragma (~75 pL) usando un pincel de artista pequeño. Se tuvo cuidado de aplicar el trazador moderadamente solo al diafragma para minimizar la fuga al hígado y tejidos circundantes. Cuarenta y ocho horas después de la aplicación del Fluoro-Gold®, se extirpó la médula espinal cervical (C3-C5), se incrustó en parafina y se seccionó en el plano transversal a 10 pm.. Las motoneuronas frénicas marcadas con Fluoro-Gold® se identificaron por microscopía de fluorescencia.
Estadística El significado estadístico de este proyecto se determinó a priori a p<0.01. Los datos de ventilación se analizaron usando un análisis de covarianza (ANCOVA) trifactorial. No se usaron relaciones de volumen : peso corporal, ya que las relaciones de masa corporal pueden introducir sesgo y este método no tiene el efecto deseado de quitar la influencia de la masa corporal sobre los datos. Usando el método de ANCOVA, el peso corporal se analiza como un covariado para todos los datos de volumen respiratorio, lo que elimina con más precisión la influencia del peso corporal sobre los datos. Para las medidas de la línea de base se usaron como factores el género, raza y edad, mientras que los datos hipercápnicos se analizaron usando como factores el género, raza y tiempo (minutos 1-10 de hipercapnia). La hemoglobina, hematocrito, glucosa y sodio (ratones anestesiados) se analizaron usando la prueba t de Student. La cuantificación de glucógeno se analizó usando un ANOVA bifactorial y la prueba t con corrección de Bonferroni para mediciones post-hoc. La función contráctil del músculo del diafragma se analizó usando ANOVA bifactorial con mediciones repetidas. La amplitud de la explosión inspiratoria frénica, la frecuencia respiratoria y la velocidad de aumento de la explosión frénica se extrajeron del neurograma frénico. Estas variables y la PaCO2 arterial se analizaron con ANOVA monofactorial y prueba de LSD de Fischer para análisis post-hoc. Todos los datos se presentan como la MEDIA ± SEM.
El muestreo de la sangre arterial, la cuantificación de glucógeno, la detección histológica de glucógeno en motoneuronas, las propiedades contráctiles del diafragma in vitro, y los registros del nervio frénico eferente, se hicieron como se describió (Martineau, L, y Ducharme, M.B., Contemp. Top. Lab. Anim. Sci., 37(5):67-72, 1998; Lo et al., J. Appl. Physiol., 28:234-236, 1970; Guth, L, y Watson, P.K., Exp. Neurol., 22:590-602, 1968; Staib et al., Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 282(3):R583-90, 2002; Doperalski, N.J. y Fuller, D.D., Exp. Neurol., 200(1):74-81 , 2006).
Resultados Características generales de los ratones Gaa-/ Los ratones GaaA pesaron significativamente menos que sus controles de tipo silvestre a todas las edades. No se observaron diferencias de género relacionadas con la edad, y los machos pesaron significativamente más que las hembras a todas las edades.
Cuantificación de glucógeno y tinción de PAS de la médula espinal cervical El contenido de glucógeno se elevó a todas las edades en las médulas espinales cervicales (C3-C5) de los ratones GaaA, y las diferencias fueron más pronunciadas a >21 meses en comparación con 6 meses (figura 17A). Estos datos se confirmaron en una serie de experimentos independientes en los que se determinaron los niveles de glucógeno en múltiples niveles del eje neural.
La histoquímica correlativa también demostró un producto de reacción de glucógeno significativo en los cuerpos de las células neuronales del ratón GaaA por toda la materia gris de la médula espinal cervical, que fue especialmente predominante en las neuronas motoras (figura 17E, figura 17F y figura 17G). Las neuronas motoras de la médula espinal cervical ventral marcadas de forma retrógrada con Fluoro-Gold® exhibieron gotitas de PAS prominentes (glucógeno positivo) en todo el citoplasma del cuerpo celular (figura 17G). Neuronas comparables de secciones teñidas con PAS de especímenes de control mostraron neuronas virtualmente sin inclusiones PAS-positivas (figura 17B, figura 17C y figura 17D).
Ventilación Los ratones GaaA parecieron ser hipoventilados basándose en la relación de ventilación minuto /CO2 expirado, lo que normaliza la ventilación minuto a la producción metabólica de C02. Esta medida estaba atenuada en la línea de base en ratones GaaA en comparación con los controles de tipo silvestre. La ventilación minuto (no normalizada), la frecuencia de respiración, el volumen corriente, el flujo ¡nspiratorio pico, el flujo espiratorio pico y la relación de volumen corriente /tiempo ¡nspiratorio, también disminuyeron en los ratones Gaa en comparación con los controles en todas las edades estudiadas (cuadro 2, figuras 18A, 18B). Las únicas diferencias de edad detectadas fueron menor frecuencia a >21 meses (contra 6 meses) y volumen corriente elevado a >21 meses (contra 6 meses). No se detectó interacción de raza por edad en los análisis.
CUADRO 2 Características de ventilación de línea de base Valores de línea de base a los 60 minutos (21% O2, el resto N2) para la frecuencia, volumen corriente (TV), ventilación minuto (MV), flujo inspiratorio pico (PIF), flujo espiratorio pico (PEF) y relación de volumen corriente : tiempo inspiratorio (TV/Ti) de ratones de control y GaaA.
* = Gaa -/- diferente del control (p < 0.01). € = >21 meses diferente de los 6 meses (p < 0.01).
Se usó provocación hipercápnica como estímulo respiratorio para probar la capacidad para aumentar la ventilación en los ratones GaaA. La respuesta hipercápnica fue más baja en los ratones GaaA en comparación con los controles a cada edad para la ventilación minuto (figura 18A y figura 18B), y también la frecuencia, volumen corriente, flujo inspiratorio pico, flujo espiratorio pico, y la relación de volumen corriente /tiempo inspiratorio. Se detectaron diferencias de género solo en el grupo de 6 meses de edad, por lo cual las hembras tuvieron una respuesta a la hipercapnia diferente en todas las variables respiratorias probadas.
Muestreo de sangre Tanto la hemoglobina (Hb) como el hematocrito (Hct) estuvieron elevados en los ratones GaaA (cuadro 3), muy probablemente para compensar la insuficiente presión parcial arterial de 02 (Pa02; véase más abajo). Además, los niveles de glucosa y sodio no variaron entre los ratones de control y GaaA, sugiriendo que las diferencias de Hb y Hct medidos no reflejan diferencias en el volumen de plasma. Los ratones GaaA tuvieron Pa02 más baja en comparación con los controles (cuadro 3), apoyando el concepto de que estos ratones estaban hipoventilados.
CUADRO 3 Características de la sangre de ratones Gaa A y de control de 12 meses Hemoglobina Hematocrito Sodio Glucosa Pa02 (%) (mmol/L) CONTROL: 13.5 ± 0.3 39.8 ± 0.9 144.5 ± 0.8 180.4 ± 16.3 98.5 ± 1.9 GaaA: 15.3 ± 0.4* 45.0 ± 1.1* 143.4 ± 0.9 176.8 ± 11.4 83.3 ± 2.7* 2.7* Valores de hemoglobina, hematocrito, sodio y glucosa de ratones de control y Gaa a los 12 meses de edad (n = 9 /grupo) Presión parcial arterial de 02 de ratones de control y Gaa /_ a los 12 meses de edad (n = 6 /grupo). * = GaaA diferente del control (p<0.01).
Ratones de hGAA específica de músculo Enseguida se cuantificó la función respiratoria en animales transgenicos con corrección específica de músculo de la actividad de GAA (ratones ;TP). Para obtener primero un índice de la función del músculo del diafragma se midieron las propiedades contráctiles in vitro de ratones B6/129, GaaA y MTP. Los ratones de control y MTP tuvieron fuerzas similares, mientras que los ratones GaaA produjeron fuerzas significativamente menores. Estos datos confirman que los niveles de glucógeno normales en el músculo de diafragma de MTP (MTP contra B6/129; 1.7 ± 1.3 contra 1.4 ± 0.2 pg/mg peso húmedo) corresponden al músculo de diafragma que es funcionalmente similar a los ratones B6/129.
A pesar del músculo de diafragma funcional aparentemente normal (figura 19C), el patrón de respiración estaba alterado en los ratones MTP. La ventilación minuto durante la línea de base fue similar en los ratones MTP y GaaA y en ambos estaba significativamente reducida en comparación con los ratones B6/129 (figuras 19A a 19C). Además, la respuesta a la hipercapnia fue atenuada en los ratones MTP, aunque mostraron una mayor respuesta que los ratones Gaa (figura 19B). Se generaron (figura 19C) trazos de flujo de aire representativos de los ratones B6/129, Gaa y MTP (figura 20C).
Actividad frenica eferente Para determinar si la ventilación comprometida observada en los especímenes Gaa y MTP estaba asociada con la salida motora frénica reducida, los presentes inventores midieron la actividad del nervio frénico eferente en ratones GaaA, MTP y de control. A niveles similares de PCO2 arterial (véase la lcyenda de la figura 20A), los ratones GaaA y MTP tuvieron amplitudes de explosión inspiratoria del nervio frénico significativamente más bajas (figuras 20A y 20B). Los registros de neurograma de los ratones Gaa y MTP también revelaron explosiones menos frecuentes y una pendiente atenuada de la explosión inspiratoria integrada (es decir, "velocidad de elevación" más lenta, cuadro 4).
CUADRO 4 Características de la neurofisiología frenica Velocidad de elevación Frecuencia Amplitud (mV/s) (respiraciones/min) (mV) Control: 346 ± 86 167 ± 14 52.8 ± 14.1 Gaa': 44 + 15* 107 ± 14* 6.6 ± 1.7* MTP: 101 ± 27* 124 ± 17* 11.8 ± 1.8* Velocidad de elevación de la explosión frénica (mV/s), frecuencia de la explosión frénica (respiraciones neurales/s) y amplitud de la explosión frénica (mV) de ratones de control (n=8), GaaA (n=8) y MTP (n=6) de 12 meses de edad. *=diferente del control (p<0.01) Este estudio de un modelo murino de la enfermedad de Pompe ha revelado varias observaciones relativas a la deficiencia de GAA y la implicación respiratoria concomitante. En primer lugar, la ventilación está reducida en los ratones GaaA, como lo revela la pletismografía barométrica. En segundo lugar, el glucógeno de la médula espinal cervical está elevado en los ratones GaaA, y la tinción de PAS identificó inclusiones de glucógeno prominentes en las motoneuronas cervicales, incluso en motoneuronas frénicas identificadas indirectamente por rastreo de Fluoro-Gold®. En tercer lugar, los ratones GaaA tienen una salida frénica atenuada con respecto a los controles de tipo silvestre. Por último, los ratones MTP también exhiben deterioro de la respiración y rasgos de neurograma frénico similares a los observados en los ratones GaaA, a pesar de la función contráctil aparentemente normal del diafragma (figuras 21 A y 21 B). Estas son las primeras líneas formales de evidencia que sugieren que la debilidad respiratoria en el ratón Gaa7, y por extrapolación en los pacientes con la enfermedad de Pompe, puede ser el resultado de una combinación de déficits tanto neurales como musculares.
El exceso de glucógeno dentro de la médula espinal (incluso motoneuronas frénicas) permite la cuantlficación de la amplitud de explosión frénica inspiratoria entre los ratones de control y Gaa7 en los experimentos descritos en la presente. Se midió la actividad del nervio frénico, que es la salida motora final del sistema respiratorio. Los mecanismos responsables.de la salida reducida en los ratones Gaa7 podrían originarse desde áreas más allá de las motoneuronas frénicas, que incluyen entradas respiratorias más altas (neurales) y/o deterioro de aferentes quimiosensores debido a niveles de Pa02 crónicamente atenuados y los niveles de PaCC>2 hipotéticamente elevados. Sin embargo, se debe notar que durante condiciones de impulso respiratorio más alto (PaCÜ2 ~90 mm Hg), los dos grupos fueron capaces de aumentar la amplitud de la explosión inspiratoria frénica, pero los ratones Gaa A siguieron teniendo una salida más baja (control: 68.7 mv ± 20.0, Gaa y : 14.0 mv ±4.8). El producto final de la actividad del nervio frénico fue alterado en los ratones Gaa7, demostrando así un déficit neural del control respiratorio.
Para determinar que la disfunción muscular no fuera el único contribuyente a los déficits de ventilación debido a la deficiencia de GAA, se usó un ratón doblemente transgénico que expresa hGAA solo en el músculo esquelético (mantenido sobre el fondo Gaa ). Puesto que estos ratones tienen propiedades contráctiles de músculo normales, se supuso que cualquier diferencia en la ventilación entre MTP y razas de control reflejaría disparidad en el control neural de los músculos respiratorios. Consistentemente con este postulado, la ventilación fue similar entre ratones MTP y GaaA durante respiración tranquila. Cuando se estimuló el impulso respiratorio con hipercapnia, la respuesta ventilatoria de los ratones MTP fue todavía menor que los controles pero elevada en comparación con los ratones Gaa/_. De esta manera, los componentes muscular y neural contribuyen a los déficits de ventilación bajo condiciones de impulso respiratorio elevado.
EJEMPLO 8 El AAV administrado al músculo es susceptible de ser transportado al cuerpo del nervio motor a través de la sinapsis con la fibra muscular Haciendo referencia a la figura 22, la figura 23 y la figura 24, el AAV administrado al músculo es susceptible de ser transportado al cuerpo del nervio motor a través de la sinapsis con la fibra muscular. En experimentos en donde unos ratones recibieron una inyección intratorácica de AAV-CMV-LacZ (2.18 c 1011 partículas) (figura 22), el ADN genómico del diafragma contiene el gen de control después del suministro del vector. En experimentos en donde unos ratones recibieron una inyección intratorácica de AAV-CMV-LacZ (2.18 x 1011 partículas) (figura 23), el ADN genómico fue aislado del núcleo frénico. La figura 24 muestra que la ventilación mejora 4 semanas despues de la inyección con AAV-CMV-GAA (2.52 c 1010 partículas).
EJEMPLO 9 Restauración de la integridad de la unión neuromuscular con los vectores rAAV2/9 Al desarrollar terapias para las distrofias musculares, existe el reto único de lograr una corrección extendida simultánea de todos los tejidos afectados.
Este ejemplo muestra que el vector rAAV2/9, que codifica hGAA, produce el transporte retrógrado del transgen (GAA humana) a las neuronas motoras, y también transducción eficaz en el músculo esquelético, SNC y tejido cardiaco (figura 25). Además, la administración de los vectores rAAV2/9-GAA restaura la integridad de la unión neuromuscular y revierte la patología axonal de la enfermedad de Pompe. La restauración de los niveles adecuados de GAA en las neuronas motoras provee un mejoramiento significativo de los parámetros ventilatorios de los animales de Pompe.
(A) Invección intramuscular o intraespinal directa Brevemente, ratones con la enfermedad de Pompe (Gaa/) de un año de edad se distribuyeron aleatoriamente en los siguientes grupos: no tratados (Gaa^), AAV2/9-CMV-hGAA, o AAV2/9-DES-hGAA. Los animales tratados con AAV2/9 recibieron una sola inyección intramuscular de 1 x 1011 vg de los vectores en el músculo tibial anterior derecho. Un mes después de la inyección, el músculo tibial anterior y la médula espinal lumbar se analizaron para determinar el número de copias del genoma del vector y la actividad de GAA.
Como se muestra en las figuras 26A a 26C, se detectaron altos niveles de genomas del vector en el músculo tibial anterior (AAV2/9-DES-hGAA 1.5x105 ± 3.1x104 vg/ug ADN; AAV2/9-CMV-hGAA 8.4x104± 1.7x104 vg/ug ADN) y médula espinal lumbar (AAV2/9-DES-hGAA 1.5x103 ± 1.7x102 vg/ug ADN; AAV2/9-CMV-hGAA 2.5x103± 1.3x103 vg/ug ADN), indicando una transducción eficiente en el músculo esquelético y transporte retrógrado de los vectores AAV2/9. La actividad de GAA en los lisados del músculo tibial anterior fue 2396% y 1770% superior al tipo silvestre en los animales AAV2/9-DES-hGAA y AAV2/9-CMV-hGAA, respectivamente (p<0.05). La evaluación inmunohistoquímica de las uniones neuromusculares en el músculo tibial anterior reveló restauración de su integridad en los animales tratados con AAV2/9 (figura 27).
En este experimento, la expresión específica de tejido del transgen (GAA) se compara entre el promotor CMV tradicional y el promotor de desmina (DES) más restringido a tejido. Brevemente, la construcción de desmina humana descrita en los experimentos (AAV2/9-DES) contiene tanto un factor incrementador específico de miocito 2 (MEF2) como un elemento incrementador de MyoD. El análisis de tejidos humanos reveló la expresión de desmina en el cerebelo, endometrio, músculo esquelético, células neuronales del ventrículo lateral y el corazón. Esto es ventajoso para las construcciones de AAV ya que el promotor de desmina sirve como un promotor no viral y restringido a tejido, en comparación con el promotor CMV tradicional (viral, expresión celular ubicua). Además, los perfiles de expresión de la médula espinal también muestran que es expresada la desmina, haciéndola un promotor favorable para el manejo de transgenes terapéuticos con los vectores AAV.
Los ensayos de la actividad enzimática de GAA 28 días después de la inyección demuestran niveles de enzima y copias del genoma del vector significativos en el TA y la médula espinal lumbar (figura 25). La administración directa de AAV2/9 al músculo esquelético resulta en la transducción eficiente del músculo inyectado y exhibe transducción retrógrada de las neuronas motoras lumbares como es evidente por las copias de genoma del vector en la región de la médula espinal lumbar, y también la restauración de la integridad de la unión neuromuscular (NMJ) en los animales GaaA. Los resultados también muestran que el suministro intramuscular de los vectores rAAV transduce los tejidos del SNC y músculo esquelético, y por lo tanto se pueden usar para tratar los componentes de SNC y músculo esquelético de la enfermedad de Pompe.
Materiales y métodos Empaquetamiento v purificación del vector AAV2/9 recombinante Se produjeron partículas de AAV recombinante basadas en el serotipo 9 usando p43.2-GAA, y fueron generadas, purificadas y tituladas en el Laboratorio Powell Gene Therapy Center Vector Core Lab. de la University of Florida.
Animales experimentales El modelo de animal GAA-knockout del exón 6, que representa el fenotipo cardiaco y de músculo esquelético asociado con la enfermedad de Pompe, se usó para examinar la eficiencia de transducción de la terapia de GAA mediada por AAV2/9 (AAV2/9-GAA) y la especificidad de la construcción del vector.
A ratones Gaa y7129SvE (Gaa /_) se les inyectaron 20pl de solución de Ringer lactada o 1 x 1011vg de rAAV2/9-CMV-GAA o rAAV2/9-DES-GAA diluido en solución de Ringer lactada (c.s.p. 20mI).
Unión neuromuscular de montaje completo Los músculos esqueléticos se disecaron e incubaron en a-bungarotoxina (marcada con TRUC) por 10 minutos. Se lavaron y se fijaron en paraformaldehído al 4%. Los tejidos se bloquearon en BSA al 4% (Tritón X al 1%) y se incubaron con NFH. Se realizaron anticuerpos secundarios (Alexa 488) dirigidos contra NFH, y los tejidos se montaron para microscopía subsecuente.
Nervios ciáticos Los nervios ciáticos se aislaron y se colocaron en cajas para fijación de OCT. Se cortaron secciones de 5 micrómetros y se sometieron a incubación con Ab primario y secundario con NFH, MBP, SMI-32 o visualización con H y E.
Extracción de ADN qenómico y PCR en tiempo real Se usó PCR para medir la distribución de los genomas de AAV despues de la inyección intramuscular en el TA y médula espinal lumbar. El ADN se aisló usando el kit DNAeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los iniciadores y sondas se diseñaron para la región poli-A de SV40 del vector AAV.
Ensayo de actividad de GAA Los tejidos se cosecharon, se congelaron inmediatamente y se guardaron a -80 °C. Los homogenatos se centrifugaron a 14,000 rpm por 10 min a 4 °C. El sobrenadante resultante se ensayó para determinar la actividad de GAA, midiendo la escisión de 4-metilumbeliferil-a-D-glucopiranósido después de incubación por 1 hora a 37 °C. La concentración de proteína se midió usando el kit de ensayo de proteína Bio-Rad DC según las instrucciones del fabricante. Los datos se expresan con respecto a los valores medidos de niveles de GAA en tejido no tratado (% sobre el tipo silvestre).
(B) Administración ¡ntraespinal directa Para transducir directamente la región de la columna cervical y el grupo de neuronas motoras del nervio frénico, vectores rAAV-GAA se administraron en la región C3-C5 de la médula espinal de los ratones Gaa1 mediante inyección ¡ntraespinal directa.
Como se muestra en las figuras 28A y 28B, la inyección directa de las construcciones reporteras de rAAV2/9 en la región C3-C5 de ratón resultó en la transducción de grupo de neuronas motoras del nervio frénico. El suministro del transgen terapéutico (GAA) en los animales Gaa 1 mejoró significativamente la función respiratoria, y la expresión de GAA en el grupo de neuronas motoras del nervio frénico se confirmó mediante detección inmunohistoquímica (figuras 29A, 29B). La observación de un aumento de la función respiratoria fue el resultado de la transducción en el SNC sola, ya que no fueron detectadas copias de genoma del vector en el diafragma. Los resultados también muestran que la acumulación de glucógeno en el SNC deteriora la función del músculo esquelético.
(C) Administración intratorácica directa Con la observación de que la expresión de GAA en el SNC mejora enormemente la función del músculo respiratorio, se hicieron experimentos para hacer blanco tanto en el músculo respiratorio (por ejemplo, diafragma y costal) como en el SNC (regiones cervical y torácica) (figura 30). En estos experimentos, el AAV2/9-CMV-GAA se comparó con AAV2/9-DES- GAA para examinar la eficiencia retrógrada del promotor DES en el SNC.
Brevemente, los animales Gaa /_ recibieron una sola inyección de los vectores AAV2/9-CMV-GAA o AAV2/9-DES-GAA. La administración de AAV2/9-DES-GAA resultó en una eficiencia de transducción similar o superior de los tejidos objetivo en comparación con AAV2/9-CMV-GAA, y resultó en mejoramiento de la función cardíaca y respiratoria.
La inyección intratorácica en los animales Gaa /_ resultó en la detección de genomas del vector en el diafragma y en la región C3-C5 de la médula espinal (región motoneuronal frénica). Los resultados muestran que ocurre un fenómeno de transporte retrógrado con el uso de los vectores AAV2/9.
Para determinar las implicaciones fisiológicas de la transducción tanto en el músculo respiratorio como el SNC, los animales Gaa/_ recibieron una sola inyección intratorácica de AAV2/9-CMV-GAA o AAV2/9-DES-GAA, y se sometieron a mediciones neurofisiológicas 6 meses después de la inyección. La medición directa in situ del nervio frénico reveló un efecto terapéutico evidente por la evidencia del aumento de la amplitud de explosión durante las condiciones hipercápnicas y la actividad EMG del diafragma (figura 31).
Además, se realizaron experimentos para determinar si el transporte retrógrado es evidente en el grupo de neuronas motoras frénicas, lo que tiene un impacto significativo sobre la función respiratoria apropiada. Una de las marcas distintivas de la enfermedad de Pompe es la insuficiencia respiratoria. Aunque tradicionalmente se piensa que la insuficiencia respiratoria es el resultado de la debilidad del músculo respiratorio, los presentes inventores descubrieron que la insuficiencia respiratoria podría originarse de un deterioro de la activación del nervio frenico debido a la acumulación de glucógeno.
Para visualizar directamente la transducción retrógrada mediada por AAV en el grupo de neuronas motoras del nervio frénico, los vectores AAV2/9-GFP se inyectaron a animales Gaa_/ mediante inyecciones intratorácicas. Un mes después de la inyección, los animales se perfundieron y la médula espinal entera se fijó para análisis inmunohistoquímico de sección transversal para la detección y localización de la expresión de GFP.
Como se muestra en la figura 32, se detectó tinción positiva de GFP en las regiones C3-C5 y T2-T5 de la médula espinal. El recuadro en cada área es indicativo de la tinción positiva para el grupo motor frénico (izquierda) y costal (derecha), respectivamente. Las figuras 33A a 33C muestran que la administración de rAAV-CMV-GAA y rAAV-DES-GAA mejora la propagación de la señal del nervio frénico.
(D) Administración intravenosa La administración intravenosa de los vectores rAAV-GAA provee un tratamiento de la enfermedad de Pompe, que incluye la corrección de la disfunción del músculo cardiaco y respiratorio. Brevemente, 4x108 vg de los vectores rAAV2/9-CMV-hGAA se administraron a ratones Gaa_/ de un día de edad mediante inyección intravenosa (i.v.). La evaluación de las mediciones cardíacas (por ejemplo, intervalo P-R, salida cardíaca y fracción de expulsión) reveló un mejoramiento significativo en los ratones Gaa /_ tratados, en comparación con los animales no tratados, a 6 meses despues de la inyección. Adicionalmente, como resultado de la actividad de GAA restaurada, la. deposición de glucógeno se redujo notablemente en los tejidos cardíaco y de diafragma de los animales tratados.
En otro experimento, ratones Gaa 7 de tres meses de edad recibieron una sola inyección intravenosa de 1x1011 vg (~5x106 vg/kg) de AAV2/9-(CMV o DES)-GAA. Se hicieron mediciones funcionales cardiacas y del diafragma 3 meses después del tratamiento (6 meses de edad) en paralelo con ratones Gaa /_ y 129SVe de tipo silvestre (WT) de igual edad no tratados. Los animales tratados con DES-GAA mostraron un mejoramiento marcado en la función cardíaca con valores similares a los de WT (figura 34A) y reducción de la masa ventricular izquierda. Se midió la función contráctil de tiras de diafragma de los especímenes Gaa 7 , AAV2/9-CMV, AAV2/9-DES y WT, y los resultados mostraron una función mejorada en los grupos tratados con AAV2/9/-CMV-GAA y AAV2/9-DES-GAA (figura 34F). Los resultados también muestran que la GAA inducida por DES es más eficaz en los animales tratados sistémicamente.
EJEMPLO 10 Producción de los vectores rAAV usando un sistema a base de HSV Un obstáculo mayor para el uso de rAAV en aplicaciones de terapia genica es la falta de capacidad para generar un rendimiento alto del vector con título alto y pureza alta. La fabricación de cantidades en la escala de 1x1014 a 1x1015 genomas de vector usando los sistemas de producción basados en transfección sigue siendo engorrosa, tardada y costosa.
Este ejemplo se refiere a la producción de una cantidad grande de vectores de rAAV (por ejemplo, rAAV2/9-hGAA) usando una plataforma de producción basada en el sistema del virus de herpes simple (HSV) de tipo I. El sistema actual utiliza dos HSV recombinantes: uno que lleva el rep y cap de AAV, o "auxiliador", y el otro que lleva el genoma de AAV recombinante que contiene el casete de expresión del transgen. La producción de AAV se inicia tras la coinfección de células con los dos HSV recombinantes y la cosecha ocurre típicamente dentro de 52 horas. Las células productoras (HEK293 o BHK21) se pueden desarrollar sobre un soporte adherente (matraz o fábrica de células) o en suspensión en una teenología de tipo Wave Bioreactor.
Un reto adicional para el uso de rAAV en aplicaciones de terapia génica es la falta de un método de purificación racionalizado eficiente de alta recuperación para los vectores de AAV (por ejemplo, AAV2/9). Este ejemplo también provee un protocolo racionalizado para purificar partículas de rAAV9 de extractos crudos de célula, que se puede aplicar a protocolos de producción de gran escala.
Se requiere el establecimiento de una plataforma escalable y flexible basada en el sistema HSV para generar cantidades suficientes de vectores rAAV altamente puros y concentrados (por ejemplo rAAV2/9-GAA). Soluciones de reserva del vector rAAV9 preparadas usando el sistema HSV o el protocolo de cotransfección estándar en celulas 293, se comparan sobre la base de los siguientes parámetros: i) la pureza bioquímica de la preparación (es decir, la ausencia de proteínas contaminantes); ii) la relación de partículas infecciosas a físicas; iii) la relación de las proteínas de cápside VP1:VP2:VP3; y iv) la relación de partículas llenas contra vacías.
La implementación del método de producción escalable a base del sistema HSV y un protocolo de purificación racionalizado para AAV9, permiten la preparación de grandes cantidades de vectores rAAV altamente puros y potentes (por ejemplo, rAAV2/9-GAA) de manera rápida y económica. Los vectores rAAV (por ejemplo, rAAV2/9-GAA) fabricados usando el sistema HSV se caracterizan sobre la base de su pureza y potencia biológica comparables o superiores a los vectores preparados en las células HEK293 usando el método de transfección.
La figura 35 es una representación esquemática de las construcciones de vector del sistema de producción basado en HSV. La figura 36 muestra la purificación racionalizada de vectores rAAV por precipitación por ml y cromatografía en columna. Las figuras 37A y 37B muestra la producción de AAV mediante el método de coinfección de HSV usando celulas adherentes.
Preparación de HSV-AAV-hGAA y HSV-AAV/rep2cap9 auxiliador.
Se modifican por ingeniería dos HSV-AAV-hGAAs recombinantes (HSV-hGAA y HSV-coGAA) por medio de recombinación homologa en el locus de timidina cinasa {tk) del vector rHSV-1 defectuoso de replicación, ICP27-suprimido (infectado con la proteína celular 27). AAV-DES-hGAA contiene el ORF de GAA en dirección 3' del promotor de desmina y acotado por repeticiones terminales (ITRs) de AAV del serotipo 2. El AAV-DES-cohGAA contiene una versión codón-optimizada del ORF de GAA humana para expresión superior en células eucariotas (GeneArt, Invitrogen).
El auxiliador HSV-AAV9 se genera insertando la secuencia generada por PCR de AAV2 rep, y AAV9 cap del plásmido pRep2Cap9 (obtenido del Dr. Jim Wilson, UPenn) Los virus recombinantes se criban y aíslan por medio de ensayo en placa y se amplifican adicionalmente por propagación clonal sobre células V27, células derivadas de Vero que suministran ICP27.
Métodos para generar rHSV Los virus HSV se recuperan del sobrenadante celular y se filtran adicionalmente y se concentran antes de su titulación. Se realizan producciones de rAAV a escala pequeña y grande en HEK293 desarrolladas en matraces {1225 o fábrica de células) o en células BHK adaptadas en suspensión en cultivos agitados (hasta 1L o aproximadamente 1 x 109 células). Las células se coinfectan con rHSV-hGAA (o rHSV-cohGAA) y rHSV-rep2/cap9 WVBs a las MOIs apropiadas. Las células se cosechan aproximadamente 52 horas después de la infección. El AAV9 se purifica usando el presente método de purificación estándar usando ciclos de congelación-descongelación y gradiente de yodixanol, seguido por concentración usando el dispositivo de centrifugación Apollo. Las soluciones de reserva se analizan para determinar el título de genoma del vector mediante Q-PCR y la pureza mediante SDS-PAGE con tinción de plata.
Un método de purificación alternativo para producción a escala media (>1x109 células) involucra la preparación de lisados celulares crudos por microfluidización y purificación de las partículas de AAV9 por precipitación por ml y cromatografía en columna. Durante el Proceso y Desarrollo, los métodos arriba descritos y pequeños lotes de AAV9 preparados en HEK293 mediante transfección convencional con CaP04 se evalúan con respecto a rendimiento/célula, relación de vacíos/llenos, pureza, y relación de partículas a unidades infecciosas.
La escalación del formato basado en suspensión es necesaria para la producción de rAAV9 a gran escala. Brevemente, células sBHK se desarrollan en cultivos agitados (1 L y más) o biorreactor desechable de tipo Wave de 10L y más (Wave™, GE Healthcare), y se coinfectan con rHSV-hGAA y rHSV-rep2/cap9 WVBs. Las ventajas del sistema de suspensión de BHK es una mayor densidad celular (hasta 2 x 109 celulas /L) y entrada de HSV (o MOI) más baja, lo que típicamente resulta en un aumento neto del rendimiento de rAAV. Después de aproximadamente 52 h, las células y el sobrenadante se lisan in situ y se clarifican por filtración en profundo y filtración absoluta. Después, el lisado clarificado se concentra y se formula en un amortiguador apropiado por medio de filtración de flujo tangencial (TFF) antes de purificación ulterior.
Progreso de la purificación de los vectores AAV9.
Los inventores han desarrollado un protocolo de purificación de AAV (por ejemplo, AAV9) novedoso basado en precipitación por punto isoeléctrico (pl). El protocolo de purificación es aplicable a lisados crudos a escala más grande (>1 x 109 células). Usando condiciones establecidas empíricamente, la mayoría de las proteínas de los lisados celulares crudos generados de las células HEK293 transfectadas, se precipitan selectivamente mientras que se retienen más de 95% del rAAV9 en solución. Después, un rAAV9 prepurificado se somete a una cromatografía de intercambio iónico en 5 mL de SP Sepharose (HiTrap SP HP, GE Healthcare), y las fracciones del pico eluido se centrifugan a través de un filtro de corte de 150 kD Apollo. Las partículas de peso molecular alto de AAV9 son retenidas y concentradas, mientras que son eliminadas las proteínas de tamaño menor presentes después de la cromatografía SP. Este protocolo racionalizado resulta en un vector altamente purificado y es retenido casi el 80% del virus originalmente presente en el Usado crudo.
Ensayos de control de calidad Se evalúa la identidad, pureza, título de genoma de vector y título de infecciosidad de las preparaciones de rAAV9. La identidad bioquímica y la pureza se determinan usando la téenica de electroforesis en gel de poliacrilamida. Las proteínas VP1 , 2 y 3 de la cápside de AAV se visualizan mediante tinción de plata o azul de Coomassie en presencia de los controles apropiados. La cantidad de impurezas se cuantifica por medio de imaginología en gel usando el software Quantity-One (Bio-Rad). Los títulos de genoma de vector se determinan usando el protocolo de PCR cuantitativa (Q-PCR) en tiempo real establecida, que utiliza iniciadores para la secuencia de señal de poliadenilación de SV40 específica para el genoma del vector. El ensayo de título infeccioso se realiza coinfectando células C12 (células HeLa que expresan Rep y Cap de AAV2) con preparaciones de rAAV9 y adenovirus de tipo silvestre. Las células infectadas, subsecuentemente, se atrapan sobre filtros de nitrocelulosa y se sondean para detectar el transgen (ADNc de GAA), y solo las células que se han infectado productivamente con rAAV producen una mancha visible en la película. La relación entre cápsides llenas y vacías se determina por medio de microscopía electrónica.
EJEMPLO 11 Tratamiento de la patología de la unión neuromuscular con los vectores rAAV2/9 En los pacientes con la enfermedad de Pompe no hay contacto entre el nervio y los receptores de acetilcolina, indicando la presencia de patología de la unión neuromuscular (NMJ). Como se muestra en la figura 41, los animales GaaA tienen una mala adaptación en la unión neuromuscular y en los nervios perifericos. Hay un aumento de la matriz extracelular y pérdida axonal en el nervio ciático de los ratones de Pompe (figuras 42A y 42B). También se examinó la NMJ en los diafragmas de animales de tipo silvestre y GaaA de nueve meses de edad. En los animales de Pompe hay un aumento significativo del tamaño del receptor de acetilcolina del diafragma en comparación con los animales de tipo silvestre (figura 41). También son evidentes alteraciones mayores en la membrana presináptica en el diafragma de los ratones GaaA . La sinaptotagmina se marca para identificar la grieta presináptica en las NMJs (figuras 43A y 43B). Hay una sorprendente pérdida de la expresión de sinaptotagmina en los animales de Pompe.
A los animales G aaA se les inyecta vectores AAV2/9 que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica GaaA (1 x 1011 vg) o vehículo (véase en la figura 44 el diseño experimental). El tratamiento de los animales GaaA con vectores AAV2/9-GAA atenúa la patogénesis de NMJ en modelos específicos de tejido de la expresión de Gaa.
En un ratón G aaA de 23 meses de edad, dos meses después de la inyección de los vectores AAV2/9-DESMIN-GAA directamente en el músculo tibial anterior derecho, se midió el tamaño del receptor de acetilcolina (AChR) en la extremidad inyectada y la extremidad contralateral (figura 45). Los resultados muestran una disminución del tamaño de los receptores de acetilcolina en la extremidad del ratón G aaA al que se inyectó AAV2/9-DESMIN-GAA. Los animales GaaA muestran un aumento significativo del tamaño del AChR, mientras que una disminución del tamaño de AChR después del tratamiento con AAV2/9-DESMIN-GAA provee efectos terapéuticos positivos contra la patología de la NMJ. Los resultados muestran que el tratamiento con AAV2/9-GAA se puede usar para restaurar o incrementar la transmisión neuromuscular entre el nervio frénico y el diafragma. Además del tratamiento con AAV-GAA, también se pueden administrar inhibidores de acetilcolinesterasa (ACI) para mejorar la liberación de neurotransmisor en los sujetos con la enfermedad de Pompe.
Además, para determinar la eficacia retrógrada de AAV2/9 y el potencial de reorganización de la NMJ, los vectores AAV2/9DES-GAA se inyectan directamente en el tibial anterior (TA) de los especímenes G aa a través de la vía intramuscular. La figura 46 muestra la pérdida de la integridad pre- y post-sináptica de NMJ en los animales afectados (G aaA) en comparación con el tipo silvestre. La figura 46 muestra también la reorganización de la NMJ en un animal de Pompe después de la administración intramuscular de AAV2/9-DES-GAA. El seccionamiento longitudinal del nervio ciático correspondiente de AAV2/9-GAA revela una señal aumentada en la marcación de proteína 43 (Gap43) asociada al crecimiento (figura 47) La Gap43 se ha asociado con la regeneración axonal, potenciación a largo plazo, y es un componente crucial de la terminal presináptica. Los efectos positivos del tratamiento son mediados por un número alto de copias del genoma del vector y expresión de GAA en el sitio de la inyección (TA) y en la médula espinal lumbar.
Como se muestra en la figura 48, se realizan inyecciones intraespinales (C3-C5) de AA2/5V-GAA en animales G aaA para hacer blanco en el grupo de neuronas motoras del nervio frénico. Los animales tratados con el vector muestran niveles altos de GAA en el sitio de la inyección, reducción de glucógeno y función respiratoria mejorada a valores cercanos a los de tipo silvestre (figura 48).
Otras modalidades Cualquier mejora puede hacerse en parte o la totalidad de las composiciones y pasos del método. Todas las referencias, incluyendo las publicaciones, solicitudes de patentes y patentes, aquí citados se incorporan por referencia. El uso de cualquiera y todos los ejemplos o lenguaje ejemplar (por ejemplo, “tal como”) provisto en la presente, está previsto meramente para esclarecer la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos de que se indique lo contrario. Ninguna afirmación de la presente en cuanto a la naturaleza o los beneficios de la invención o de las modalidades preferidas tiene por objeto ser limitativa, y las reivindicaciones no deberían ser consideradas como limitadas por tales afirmaciones. Más generalmente, ningún lenguaje en la especificación se debe considerar como si indicara que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención. Esta invención incluye todas las modificaciones y los equivalentes de la materia objeto citada en las reivindicaciones anexas a la presente según sea permitido por la Lcy aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos es abarcada por la invención, a menos que se indique lo contrario en la presente o de otra manera se contradiga claramente por el contexto.

Claims (40)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una composición que comprende un vector rAAV 2/9, para usarse en el tratamiento de integridad deteriorada de la unión neuromuscular en un sujeto, en donde el vector rAAV2/9 comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo enlazada operativamente a un promotor, y en donde la composición está adaptada para ser administrable mediante inyección intramuscular, intratorácica, intraespinal, intracisternal, ¡ntratecal o intravenosa.
2.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo codifica la a-glucosidasa ácida (GAA).
3.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de desmina (DES), un promotor de sinapsina I (SYN), o un promotor de creatina cinasa de músculo (MCK).
4.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene deterioro neuromuscular causado por una enfermedad neuromuscular.
5.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene deterioro neuromuscular causado por una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en la enfermedad de Pompe, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo 1a, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth y miastenia grave.
6.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 1, en donde el sujeto es un humano.
7.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 2, en donde la composición está adaptada para ser -administrable con un inhibidor de acetilcolinesterasa (ACI).
8.- Una composición que comprende un vector rAAV 2/9, para usarse en el tratamiento de una enfermedad neuromuscular en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento, en donde el vector rAAV2/9 comprende Una molecula de ácido nucleico heterólogo enlazada operativamente a un promotor, y en donde la composición está adaptada para ser administrable mediante inyección intramuscular, intratorácica, intraespinal, intratecal, intracisternal, o intravenosa.
9 - La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 8, en donde la enfermedad neuromuscular se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Pompe, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo la, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth y miastenia grave.
10.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 9, en donde la enfermedad neuromuscular es la enfermedad de Pompe.
11.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 8, en donde la molecula de ácido nucleico heterólogo codifica la a-glucosidasa ácida (GAA).
12.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 8, en donde el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de desmina (DES), un promotor de sinapsina I (SYN), o un promotor de creatina cinasa de músculo (MCK).
13.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 8, en donde el sujeto es un humano.
14.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 11, en donde la composición está adaptada para ser administrable con un inhibidor de acetilcolinesterasa (ACI).
15.- Una composición que comprende un vector rAAV, para usarse en el tratamiento de integridad deteriorada de la unión neuromuscular y/o para el tratamiento de una enfermedad neuromuscular en un sujeto, y en donde el vector rAAV comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo enlazada operativamente a un promotor, en donde el sujeto tiene integridad deteriorada de la unión neuromuscular y/o una enfermedad neuromuscular, y el sujeto no tiene la enfermedad de Pompe.
16.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 15, en donde el vector rAAV se selecciona de un vector rAAV2/1 , rAAV2/8, o rAAV2/9.
17.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 15, en donde la composición está adaptada para ser administrable mediante inyección intramuscular, intratorácica, intraespinal, intracisternal o intravenosa.
18.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 15, en donde el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de desmina (DES), un promotor de sinapsina I (SYN), o un promotor de creatina cinasa de músculo (MCK).
19.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 15, en donde el sujeto tiene una enfermedad neuromuscular seleccionada del grupo que consiste en esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo la, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth y miastenia grave.
20.- La composición para usarse de conformidad con la reivindicación 15, en donde el sujeto es un humano.
21.- El uso de una composición que comprende un vector rAAV 2/9, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de integridad deteriorada de la unión neuromuscular en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento, en donde el vector rAAV2/9 comprende una molecula de ácido nucleico heterólogo enlazada operativamente a un promotor, y en donde la composición está adaptada para ser administrable mediante inyección intramuscular, intratorácica, intraespinal, intracisternal, intratecal o intravenosa.
22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde la molecula de ácido nucleico heterólogo codifica la a-glucosidasa ácida (GAA).
23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de desmina (DES), un promotor de sinapsina I (SYN), o un promotor de creatina cinasa de músculo (MCK).
24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el sujeto tiene deterioro neuromuscular causado por una enfermedad neuromuscular.
25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el sujeto tiene deterioro neuromuscular causado por una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en la enfermedad de Pompe, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo la, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth y miastenia grave.
26.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el sujeto es un humano.
27.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 22, en donde el medicamento está adaptado para ser administrable con un inhibidor de acetilcolinesterasa (ACI).
28.- El uso de una composición que comprende un vector rAAV 2/9, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad neuromuscular en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento, en donde el vector rAAV2/9 comprende una molecula de ácido nucleico heterólogo enlazada operativamente a un promotor, y en donde la composición está adaptada para ser administrable mediante inyección intramuscular, intratorácica, intraespinal, intratecal, intracisternal, o intravenosa.
29.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde la enfermedad neuromuscular se selecciona del grupo que consiste en la enfermedad de Pompe, esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo la, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth y miastenia grave.
30.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde la enfermedad neuromuscular es la enfermedad de Pompe.
31.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde la molécula de ácido nucleico heterólogo codifica la a-glucosidasa ácida (GAA).
32.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de desmina (DES), un promotor de sinapsina I (SYN), o un promotor de creatina cinasa de músculo (MCK).
33.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 28, en donde el sujeto es un humano.
34.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 31 , en donde el medicamento está adaptado para ser administrable con un inhibidor de acetilcolinesterasa (ACI).
35.- El uso de una composición que comprende un vector rAAV, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de integridad deteriorada de la unión neuromuscular y/o para el tratamiento de una enfermedad neuromuscular en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento, en donde el vector rAAV comprende una molécula de ácido nucleico heterólogo enlazada operativamente a un promotor, y en donde el sujeto tiene integridad deteriorada de la unión neuromuscular y/o una enfermedad neuromuscular, y el sujeto no tiene la enfermedad de Pompe.
36.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en donde el vector rAAV se selecciona de un vector rAAV2/1 , rAAV2/8, o rAAV2/9.
37.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en donde la composición está adaptada para ser administrable mediante inyección intramuscular, intratorácica, intraespinal, ¡ntracisternal o intravenosa.
38.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en donde el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de desmina (DES), un promotor de sinapsina I (SYN), o un promotor de creatina cinasa de músculo (MCK).
39.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en donde el sujeto tiene una enfermedad neuromuscular seleccionada del grupo que consiste en esclerosis lateral amiotrófica, atrofia muscular espinal, esclerosis múltiple, enfermedad de almacenamiento de glucógeno de tipo la, distrofia muscular de cinturas, síndrome de Barth y miastenia grave.
40.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 35, en donde el sujeto es un humano.
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