MX2014010150A - Material no viable derivado de probioticos para la prevencion y tratamiento de infecciones. - Google Patents

Abstract

Una composición comprende un sobrenadante de cultivo de una fase de crecimiento exponencial tardía de un proceso de cultivo por lotes para un probiótico tal como LGG, para uso en el tratamiento o prevención de infección por un patógeno tal como C. sakazakii.

Description

MATERIAL NO VIABLE DERIVADO DE PROBIOTICOS PARA LA PREVENCION Y TRATAMIENTO DE INFECCIONES Campo de la Invención La descripción se refiere a un método de recolección de materiales biológicamente activos no viables de una cepa bacteriana probiótica, especialmente de Lactobacillus rhamnosus Goldin Gorbach (LGG) . En particular, la descripción se refiere a un proceso para la preparación de un material activo derivado de probióticos contra infección bacteriana, el material probiótico se puede obtener por el método de recolección descrito, y a productos dietéticos o nutricionales , incluyendo el material derivado de probióticos .

Antecedentes de la Invención Cronobacter sakazakii (Cronobacter sakazakii , anteriormente conocido como Enterobacter sakazakii) es un patógeno oportunista que se ha asociado con brotes de infección en infantes, especialmente en unidades de cuidados intensivos neonatales. En infantes puede causar bacteriemia, meningitis y enterocolitis necrotizante (NEC) . La tasa de mortalidad infantil debido a la infección por este organismo ha sido informada que es del 40-80%. Como consecuencia de la invasión bacteriana al cerebro, las infecciones con frecuencia conducen a retrasos en el desarrollo y la función Ref. 250155 cognitiva deteriorada. Hasta 20% de los neonatos que sobreviven desarrollan complicaciones neurológicas graves.

Por lo tanto es un deseo proporcionar una composición que tenga un efecto protector contra o pueda tratar la infección de patógenos como C. sakazakii. La presente descripción proporciona una composición que tiene un efecto sobre la invasión de patógenos tales como C. sakazakii en el cerebro y en mortalidad en un modelo de rata neonatal. Se ha encontrado que el sobrenadante de un cultivo de LGG reduce la invasión de C. sakazakii en el cerebro y en el hígado e inhibe incluso completamente C. sakazakii relacionado con mortalidad de crías de rata.

En este contexto, han sido probados diversos compuestos por sus propiedades inhibidoras en adherencia a la bacteria C. sakazakii o crecimiento in vitro. Por ejemplo, oligosacáridos prebióticos se han mostrado que inhiben la adherencia de C. sakazakii a las células epiteliales en un cultivo celular (Quintero et al., Curr Microbiol. 62 (5) : 1448-54) . Se han descrito péptidos antimicrobianos derivados de caseína generada por Lactobacillus acidophilus para ejercer la actividad antibacteriana contra C. sakazakii y E. coli en un ensayo de difusión (Hayes et al, 2006 Appl Environ Microbiol, vol 72 no3 ; 2260-2264). Collado et al (2008 FEMS Microbiol Lett 285 58-64) probaron cepas de probióticos para contrarrestar la adhesión de C. sakazakii a moco humano aislado (LGG no se incluyó en este estudio) . Sacárido de ácido urónico se ha utilizado para inhibir el crecimiento de C. sakazakii en medio de cultivo (WO2009/148312) . En resumen, muchos de estos compuestos tienen características y composiciones muy diferentes en comparación con el material sobrenadante de LGG. Además, todas estas sustancias se han probado in vitro y se han centrado en aspectos seleccionados que contribuyen al desarrollo de la infección, tales como la inhibición de crecimiento bacteriano en medio de cultivo o inhibición de adherencia bacteriana a las células epiteliales. Aunque aspectos como la adhesión y crecimiento bacteriano pueden contribuir al desarrollo de la infección, estos ensayos in vitro no son estrictamente predictivos para los efectos sobre parámetros corriente abajo sistémicos de infección y puntos finales clínicos in vivo. Excepto para L. bulgaricus (especificado a continuación) , las sustancias enumeradas anteriormente no han sido probadas in vivo todavía y por lo tanto, no se ha demostrado hasta ahora que los efectos protectores sugeridos podrían alcanzarse in vivo.

Con respecto a los probióticos o sobrenadantes de los mismos, éstos se han mostrado que impiden la adherencia de los patógenos (incluyendo C. sakazakii) a las células epiteliales o mucosas de los humanos in vitro o para inhibir el crecimiento de patógenos in vitro. Por ejemplo, Sherman et al. (Infect. Immun. 2005 5183-5188) han mostrado que los probióticos reducen cambios inducidos por EHEC y ETEC en células epiteliales T84 in vitro, pero que los sobrenadantes de cultivo y las bacterias tindalizadas (sometidas a un tratamiento térmico o irradiación gamma) no tuvieron ningún efecto correspondiente. Hudeault et al (Appl . Environ. Microbiol 1997 513-518) han demostrado que tanto Lactobacillus GG (LGG) y su sobrenadante de cultivo gastado reducen la invasión de Salmonella typhimurium in vitro, aunque en menor medida. Solamente microorganismos LGG vivos se probaron en el modelo de ratón de infección por S. typhimurium correspondiente in vivo. De Keersmaecker et al. (FEMS Microbiol Lett 2006 259 89-96) caracteriza la actividad antimicrobiana de sobrenadante LGG contra Salmonella typhimurium in vitro. El documento EP1384483 describe que los ratones infectados con Trichinella spiralis tratada con Bifidobacterium lactis tenían un recuento de gusanos menor que los ratones tratados con el medio de cultivo MRS . Por otra parte, otras cepas probióticas, como por ejemplo, L. acidophilus tuvieron efectos diferenciales y se incrementaron o no afectaron la carga de gusanos. Es importante destacar que los resultados de los estudios con otros patógenos no se pueden traducir automáticamente a C. sakazakii puesto que los mecanismos patogénicos difieren significativamente. Más específicamente, C. sakazakii puede invadir en el cerebro y causar daño cerebral, lo cual no es el caso para la mayoría de las infecciones gastrointestinales comunes.

Para centrarse más en el papel de los probióticos y los sobrenadantes de los mismos, los probióticos se definen actualmente en la técnica como microorganismos vivos que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio de salud al hospedero. Sin embargo, la naturaleza viva de los probióticos plantea desafíos cuando se incorporan en productos nutricionales . Estos desafíos pueden diferir en orden de magnitud dependiendo de, entre otras cosas, el tipo de cepa de probiótico utilizado, el estado de salud del individuo que recibe el producto, o ambos. También desde un punto de vista la tecnología de proceso, hay que superar considerables obstáculos cuando se incorporan microorganismos vivos en los productos. Esto particularmente juega un papel si se fueran a incorporar probióticos en productos de larga duración, por ejemplo, productos en polvo, tales como formulas infantiles. Además, los desafíos aumentan con la creciente complejidad de las matrices de productos nutricionales.

Por otra parte, especialmente en el caso de productos dietéticos para infantes y niños, existe una demanda importante para proporcionar los efectos beneficiosos de los probióticos. Además, para garantizar la estabilidad y la vitalidad de bacterias viables en los productos alimenticios que se ponen a disposición a través de los canales de venta al por menor u hospitales y expuestos a temperaturas ambiente es particularmente difícil. El uso de productos bacterianos, a través de la aplicación de los sobrenadantes de cultivo a este respecto sería proporcionar ventajas considerables.

Como se mencionó anteriormente, muchos estudios que demuestran un efecto beneficioso solamente incluyen cultivos in vitro o ensayos que no se pueden predecir directamente en los resultados in vivo. Además, los sobrenadantes de cultivo de los probióticos no ejercen necesariamente los mismos efectos beneficiosos que las células bacterianas viables probióticas puesto que los mecanismos subyacentes se pueden diferir considerablemente. Por ejemplo, el estudio por Sherman et al. (Infect. Immun. 2005 5183-5188) mostró que los probióticos reducen cambios inducidos por EHEC y ETEC en las células epiteliales T84 in vitro, pero que los sobrenadantes de cultivo y las bacterias tinalizadas no tuvieron ningún efecto correspondiente. Además, incluso las cepas bacterianas estrechamente relacionadas pueden variar en sus características, lo que resulta en diferentes propiedades de los probióticos, así como cepas patógenas. Un hallazgo relacionado con una cepa probiótica seleccionada no puede ser traducido directamente para que sea un beneficio de otra cepa probiótica. Esto fue demostrado por Gueimonde et al (Food Res. Internat . 39 2006 467-471), lo que demuestra que la capacidad de inhibir la adhesión de los patógenos (incluyendo E. sakazakii) varía mucho entre los lactobacilos y entre los agentes patógenos y que hay una necesidad de una evaluación caso por caso con el fin de seleccionar las cepas con la capacidad de inhibir patógenos específicos. Además, Gross et al (Beneficial Microbes 2010 1(1), 61-66) ilustraron la cepa de especificidad de las características de probióticos y mostraron que diferentes cepas de probióticos del mismo género pueden diferir en propiedades de probióticos. Por lo tanto, no se puede concluir de los estudios que utilizan determinadas cepas de probióticos y bacterias viables en lugar de sobrenadante que los mismos efectos se pueden esperar para otras cepas de probióticos y sobrenadante derivado .

Con respecto a los efectos de LGG específicamente (sobrenadante) y la adhesión de patógenos a las células epiteliales o el crecimiento de bacterias, hay evidencia que se contradice hasta el momento. Silva et al. (Antimicrobial Agents Chemotherapy Vol 31, No 8, 1987, 1231-1233) han demostrado actividad inhibidora de sobrenadante LGG contra una variedad de especies bacterianas, en las que C. sakazakii no fue mencionada para ser incluida. En contraste, en un estudio por Johnson-Henry et al. (Infect. Immun. 2008 Vol 76, n° 4, 1340/48), sobrenadante LGG no afectó el crecimiento de E. coli 0157 :H7 in vitro. uas-Madiedo et al. (J. Food Protec. Vol 69, No 8, 2006, 2011-2015) han informado que fracciones de exopolisacáridos (EPS) de la superficie celular de diferentes bacterias probióticas incluyendo LGG incluso aumentaron la adhesión de patógenos tales como C. sakazakii a moco intestinal humano in vitro. Finalmente, Roselli et al. (Br. J. Nutr 2006 95 1177-1184) demostró que el sobrenadante LGG redujo la adhesión de E. coli a células Caco-2 y la migración de neutrofilos inducida por ETEC, pero no afectó la viabilidad de E. coli. Por lo tanto, los efectos del sobrenadante de LGG preparado específicamente en resultados relacionados con C. sakazakii in vivo no podían ser previstos por la literatura actual.

La única referencia a un estudio que utiliza lactobacilos probióticos contra efectos relacionados con C. sakazakii in vivo de los que tenemos conocimiento se ha descrito por Hunter et al. (Infect. Immun. 2009 1031/43). Estos autores han demostrado que Lactobacillus bulgaricus evita la lesión de células del epitelio intestinal causada por C. sakazakii inducida por óxido nítrico en un modelo NEC de rata recién nacida. El estudio mostró que el pretratamiento con organismos probióticos L. bulgaricus antes de la infección con C. sakazakii preserva la integridad de los enterocitos tanto in vitro como in vivo. Sin embargo, el tratamiento de L . bulgaricus junto con C. sakazakii no era protector. Aunque este estudio indica algunos efectos prometedores de células bacterianas L. bulgaricus viables contra la infección de C. sakazakii en relación con lesión de células intestinales epiteliales en un modelo de NEC, los resultados se refieren a una cepa probiótica diferente (L. bulgaricus en lugar de LGG) , material diferente (microorganismos probióticos viables en lugar de sobrenadante) y parámetros de estudio diferentes (lesión de células epiteliales intestinales en lugar de invasión en órganos extra-intestinales como el cerebro) en comparación con la presente descripción.

En resumen, los resultados de estudios previos de bacterias probióticas en la inhibición de patógenos varían en gran medida. En algunos estudios, los microorganismos vivos ejercen un efecto beneficioso, pero se ha demostrado que este efecto no siempre puede ser reproducido por los sobrenadantes de medio de cultivo. La mayoría de la evidencia con respecto a la adherencia de C. sakazalii e inhibición de crecimiento se basa en datos in vitro que no pueden ser extrapolados a los efectos in vivo. Los resultados limitados de solamente un estudio in vivo que se ha publicado hasta la fecha demuestran efectos protectores de los probióticos viables sobre la integridad de enterocitos después de la infección por C. sakazakii en un modelo de rata NEC, pero protección contra la invasión de C. sakazakii en el cerebro no se ha demostrado anteriormente. Por lo tanto, sigue habiendo una gran necesidad de identificar una composición que reduzca o inhiba la invasión de patógenos tales como C. sakazakii , a otros órganos tales como el cerebro y/o reduce o inhibe la mortalidad causada por patógenos como C. sakazakii sin tener que agregar microorganismos probióticos viables.

Sumario de la Invención La presente descripción proporciona una composición que comprende un sobrenadante de cultivo de una fase de crecimiento exponencial tardía de un proceso de cultivo por lotes de probiótico, para uso en el tratamiento o prevención de infecciones por patógenos. En ciertas modalidades, el probiótico es LGG, y el patógeno es C. sakazakii.

En otros aspectos, la descripción proporciona un producto dietético que comprende una composición de probiótico no viable que se puede obtener de un sobrenadante de cultivo de una fase de crecimiento exponencial tardía de un proceso de cultivo por lotes de LGG, así como el uso de la composición anterior como un aditivo en un producto nutricional, para su uso en el tratamiento o prevención de infección por C. sakazakii.

En otro aspecto, la descripción proporciona un método de tratamiento o prevención de la infección por patógenos en un sujeto, el método comprende la administración al sujeto de una cantidad eficaz de una composición que comprende un material probiótico viable que se puede obtener de un sobrenadante de cultivo a partir de una fase de crecimiento exponencial tardía de un proceso de cultivo por lotes de probiótico .

Descripción Detallada de la Invención En una primera modalidad, la descripción se refiere a una composición que comprende un sobrenadante de cultivo de una fase de crecimiento exponencial tardía de un proceso de cultivo por lotes de probiótico, para uso en el tratamiento o prevención de infección por patógenos.

En algunas modalidades, la presente descripción se basa en la idea de que a partir de cultivo por lotes de un probiótico tal como LGG un sobrenadante de cultivo (que también puede ser referido como "medio gastado" ) puede ser recolectado que posee protección contra la infección por un patógeno como C. sakazakii , en especial en la invasión de C. sakazaltii a órganos como el cerebro; además, el medio gastado tiene un efecto sobre la mortalidad relacionada con patógenos .

Sin desear ser limitado por la teoría, se cree que esta actividad se puede atribuir a la mezcla de los componentes (incluyendo materiales proteínicos, y posiblemente incluyendo materiales (exo) polisacáridos) como se encuentra liberado en el medio de cultivo en una etapa tardía de la fase exponencial (o "log") de cultivo por lotes del probiótico. Se hará referencia de la composición en lo sucesivo como "sobrenadante de cultivo de la descripción." Lactobacillus rhamnosus GG (Lactobacillus G.G. , cepa ATCC 53103) es una bacteria que se ha aislado de los intestinos de un sujeto humano sano. Es ampliamente reconocido como un probiótico, y por lo tanto se ha sugerido para su incorporación en muchos productos nutricionales, tales como productos lácteos, suplementos nutricionales, fórmulas infantiles, y similares. Se describe en la patente Estadounidense No. 5,032,399 por Gorbach, et al., que se incorpora aquí en su totalidad, por referencia a la misma. LGG no es resistente a la mayoría de los antibióticos, estables en presencia de ácido y bilis, y se une con avidez a las células de la mucosa del tracto intestinal humano. Persiste durante 1-3 días en la mayoría de las personas y un máximo de 7 días en el 30% de los sujetos. Además de su capacidad de colonización, LGG afecta también beneficiosamente las respuestas inmunitarias de las mucosas. LGG se deposita con la Autoridad Depositaría de Colección de Cultivos Tipo Americana con el número de acceso ATCC 53103.

La presente descripción y modalidades de la misma proporcionan un sobrenadante de cultivo que es activo contra la infección por C. sakazakii ; Más particularmente, en ciertas modalidades, se presenta una fermentación directa apropiada y método de recolección con el fin de obtener del LGG un material probiótico no viable que soporta la actividad contra la invasión y mortalidad de C. sakazakii .

Las etapas reconocidas en cultivo por lotes de bacterias son conocidas por la persona experimentada en la técnica. Estas son las fases "lag", las "log" ("logarítmicas" y "exponenciales") , las "estacionarias" y la "muerte" (o "disminución logarítmica"). En todas las fases en las que las bacterias vivas están presentes, las bacterias metabolizan los nutrientes de los medios, y secretan (ejercen, liberan) materiales en el medio de cultivo. La composición del material secretado en un punto dado en el tiempo de las etapas de crecimiento no es generalmente predecible.

En una modalidad preferida, una composición de acuerdo con la descripción y/o modalidades de la misma se puede obtener mediante un proceso que comprende los pasos de (a) someter un probiótico tal como LGG al cultivo en un medio de cultivo apropiado, utilizando un proceso por lotes, (b) cosechar el sobrenadante de cultivo a una fase de crecimiento exponencial tardía de la etapa de cultivo, cuya fase se define con referencia a la segunda mitad del tiempo entre la fase de latencia y la fase estacionaria del proceso de cultivo por lotes; (c) opcionalmente eliminar componentes de bajo peso molecular a partir del sobrenadante con el fin de retener componentes de peso molecular por arriba de 5-6 kiloDaltons (kDa) ; (d) eliminar el contenido de líquido del sobrenadante de cultivo con el fin de obtener la composición.

En la presente descripción y modalidades de la misma, los materiales secretados se cosechan de una fase exponencial tardía. La fase exponencial tardía ocurre en el tiempo después de la fase exponencial media (que es el tiempo medio de la duración de la fase exponencial, de ahí la referencia a la fase exponencial tardía como que es la segunda mitad del tiempo entre la fase de latencia y la fase estacionaria) . En particular, el término "fase exponencial tardía" se utiliza aquí con referencia a la parte del último cuarto del tiempo entre la fase de latencia y la fase estacionaria del proceso de cultivo por lotes de LGG. En una modalidad preferida de la presente descripción y modalidades de la misma, la recolección del sobrenadante del cultivo está en un punto en el tiempo de 75% a 85% de la duración de la fase exponencial, y lo más preferiblemente es de aproximadamente 5/6 del tiempo transcurrido en la fase exponencial.

El término "cultivo" o "cultivar" se refiere a la propagación de microorganismos, en este caso LGG, sobre o en un medio apropiado. Tal medio de cultivo puede ser de una variedad de tipos, y es particularmente un caldo líquido, como es habitual en la técnica previa. Un caldo preferido, por ejemplo, es caldo MRS utilizado como general para el cultivo de lactobacilos . El caldo MRS generalmente comprende polisorbato, acetato, magnesio y manganeso, que son conocidos por actuar como factores de crecimiento especiales para lactobacilos, así como una base rica en nutrientes. Una composición típica comprende (cantidades en g/litro) : peptona de caseína 10.0; extracto de carne 8.0; extracto de levadura 4.0; D(+) -glucosa 20.0; fosfato de hidrógeno dipotásico 2.0; Tween" 80 1.0; citrato de triamonio 2.0; acetato de sodio 5.0; sulfato de magnesio 0.2, sulfato de manganeso 0.04.

Un uso preferido del sobrenadante de cultivo de la descripción y/o modalidades de la misma es en la fórmula infantil. La recolección de productos bacterianos secretados provoca un problema que los medios de cultivo no pueden fácilmente ser privados de componentes no deseados. Esto se refiere específicamente a los productos nutricionales para los sujetos relativamente vulnerables, tales como fórmula infantil o nutrición clínica. Este problema no es incurrido si los componentes específicos de un sobrenadante de cultivo son primero aislados, purificados, y después aplicados en un producto nutricional . Sin embargo, se desea hacer uso de un sobrenadante de cultivo más completo. Esto serviría para proporcionar una composición que refleja mejor la acción natural del probiótico (en este caso LGG) . Uno no puede, sin embargo, sólo utilizar el mismo sobrenadante de cultivo como base para materiales probióticos no viables para ser utilizados específicamente en fórmulas infantiles y similares .

Con el fin de que la descripción sea de uso completo en el presente documento, se quiere garantizar que la composición recolectada del cultivo LGG no contiene componentes (como puede presentar en el medio de cultivo) que no se desean, o generalmente aceptados, en tal fórmula. Con referencia al polisorbato regularmente presente en caldo MRS, medios para el cultivo de bacterias pueden incluir un tensioactivo no iónico emulsionante, por ejemplo sobre la base de sorbitán polietoxilado y ácido oleico (típicamente disponible como polisorbatos Tween®, tal como Tween® 80) . Mientras que estos tensioactivos se encuentran frecuentemente en los productos alimenticios, por ejemplo, helados, y generalmente reconocidos como seguros, no están en todas las jurisdicciones que se consideran convenientes, o incluso aceptable para su uso en productos nutricionales para sujetos relativamente vulnerables, tales como fórmula infantil o nutrición clínica.

La presente descripción por lo tanto, en una modalidad preferida de la descripción y/o modalidades de la misma, también se refiere al uso de medios de cultivo en los que los polisorbatos mencionados anteriormente pueden ser evitados. Para este fin, un medio de cultivo preferido de la descripción es desprovista de polisorbatos tales como Tween 80. En una modalidad preferida de la descripción y/o modalidades de la misma el medio de cultivo puede comprender un ingrediente oleoso seleccionado del grupo que consiste de ácido oleico, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de colza, aceite de girasol y mezclas de los mismos. Se entenderá que el beneficio completo del ingrediente oleoso se alcanza si la presencia de un tensioactivo de polisorbato se evita esencialmente o totalmente.

Lo más preferiblemente, para el uso de la presente descripción, un medio MRS carece de polisorbatos . También comprende preferiblemente medios, además de uno o más de los aceites anteriores, peptona (típicamente 0-10 g/1, especialmente 0.1-10 g/1), extracto de carne (típicamente 0-8 g/1, especialmente 0.1-8 g/1), extracto de levadura (típicamente 4-50 g/1), D(+) glucosa (típicamente 20-70 g/1) , hidrógeno fosfato de dipotasio (típicamente 2-4 g/1) , acetato de sodio trihidratado (típicamente 4-5 g/1), citrato de triamonio (típicamente 2-4 g/1) , sulfato de magnesio heptahidratado (típicamente 0.2-0.4 g/1) y/o sulfato de manganeso tetrahidratado (típicamente 0.05-0.08 g/D · El cultivo se realiza generalmente a una temperatura de 20°C a 45°C, preferiblemente a 35°C a 40° C, y lo más preferiblemente a 37°C.

Preferiblemente, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma tiene un pH neutro, tal como un pH de entre pH 5 y pH 7, preferiblemente pH 6. Es también deseable que la composición de la descripción y/o modalidades de la misma no contengan componentes de peso por debajo de 5-6 kDa . Cabe señalar que algunas de las pruebas día técnica previa como se indicó anteriormente han mostrado que los sobrenadantes sólo ejercen un efecto cuando el pH fue de alrededor de 4, y no se observó efecto cuando el pH era neutro. Correspondientemente, esta actividad antimicrobiana en la técnica previa se ha asociado con la presencia de ácido láctico.

El punto de tiempo preferido durante el cultivo para recolectar el sobrenadante del cultivo, en este caso, en la fase exponencial tardía mencionada anteriormente, se puede determinar, por ejemplo, sobre la base de OD600nm y la concentración de glucosa. OD600 se refiere a la densidad óptica a 600 nm, que es una medición de densidad conocida que se correlaciona directamente con la concentración bacteriana en el medio de cultivo.

Además de lo anterior, debe señalarse que el cultivo por lotes de lactobacilos , incluyendo LGG, es de conocimiento general común disponible para una persona experimentada en la técnica. Estos métodos por lo tanto no requieren mayor aclaración aquí.

Preferiblemente, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma es producida por la fermentación a gran escala (por ejemplo, en un termentador de más de 100 L, preferiblemente aproximadamente 200 L o más) .

La composición de la descripción y/o modalidades de la misma puede ser recolectada por cualquier técnica conocida para la separación de sobrenadante de cultivo de un cultivo bacteriano. Tales técnicas son bien conocidas en la técnica previa e incluyen, por ejemplo, centrifugación, filtración, sedimentación y similares.

El sobrenadante de la presente descripción y modalidades de la misma se puede utilizar inmediatamente o almacenar para su uso futuro. En este último caso, el sobrenadante generalmente será refrigerado, congelado o liofilizado. El sobrenadante puede ser concentrado o diluido, si se desea.

En cuanto a las sustancias químicas, se cree que la composición del sobrenadante de cultivo de la descripción y/o modalidades de la misma es una mezcla de una pluralidad de aminoácidos, oligo y polipéptidos , y proteínas, de diversos pesos moleculares. Se cree además que la composición comprende estructuras de polisacáridos y/o nucleótidos .

Se hace hincapié, como diferente día técnica previa, que la descripción y/o modalidades de la misma se refieren preferiblemente a la totalidad, en este caso, sobrenadante de cultivo no fraccionado. La elección juiciosa de la cosecha en la fase exponencial tardía mencionada anteriormente, y la retención de prácticamente todos los componentes del sobrenadante, se cree que contribuyen a los sorprendentes resultados obtenidos con la misma, particularmente en vista de la actividad preventiva contra la infección por C. sakazakii y más particularmente en vista de tal actividad en los infantes y recién nacidos, y durante la administración perinatal de las mujeres embarazadas, respectivamente, en periodo de lactancia.

El sobrenadante del cultivo total de la presente descripción y modalidades del mismo se define más específicamente como que excluye sustancialmente componentes de bajo peso molecular, generalmente por debajo de 6 kDa, o incluso por debajo de 5 kDa. Esto se relaciona con el hecho de que la composición preferiblemente no incluye ácido láctico y/o sales de lactato. El sobrenadante preferido de la descripción y/o modalidades del mismo por lo tanto tiene un peso molecular de más de 5 kDa o, en algunas modalidades, mayor que 6 kDa. Esto normalmente implica filtración o cromatografía de columna. De hecho, el retenido de esta filtración representa un intervalo de peso molecular de más de 6 kDa (en otras palabras, los componentes de debajo de 6 kDa son filtrados) .

La composición del sobrenadante de la descripción y/o modalidades de la misma generalmente no sólo es proteínica, sino que también comprende polisacáridos , particularmente exopolisacáridos (polímeros de alto peso molecular compuestos de residuos de azúcar como el producido por LGG) . Sin desear estar limitado por la teoría, los presentes inventores creen que la proporción entre las cantidades de materiales proteínicos y las cantidades de materiales de carbohidratos como las recolectadas de la fase exponencial tardía como se discutió anteriormente, contribuye a la naturaleza protectora del sobrenadante contra la infección de C. sakazakii en comparación con composiciones como las recolectadas de otras etapas, por ejemplo, la fase exponencial media o la fase estacionaria.

El sobrenadante del cultivo de la presente descripción y modalidades de la misma, recogido de acuerdo con la descripción se puede utilizar de diversas maneras, con el fin de beneficiarse de la actividad contra C. sakazakii encontrado. Tal uso implicará generalmente alguna forma de administración de la composición de la descripción y/o modalidades de la misma a un sujeto en necesidad del mismo. A este respecto, el sobrenadante del cultivo se puede utilizar como tal, por ejemplo, incorporado en cápsulas para la administración oral, o en una composición nutricional líquida tal como una bebida, o puede ser procesado antes de su uso posterior. Se prefiere el último.

Tal procesamiento implica generalmente la separación de los compuestos de la fase continua generalmente líquida del sobrenadante. Esto se realiza preferiblemente por un método de secado, tal como secado por pulverización o secado por congelación ( liofilización) . Se prefiere el secado por pulverización. En una modalidad preferida del método de secado por pulverización, se agregará un material portador antes de secado por pulverización, por ejemplo, maltodextrina DE29.

La composición de la descripción y/o modalidades de la misma se ha encontrado que posee actividad protectora contra la infección por C. sakazakii , en este caso, actividad preventiva y/o terapéutica. La infección con C. sakazakii puede conducir a la adherencia de las bacterias a las células epiteliales, pérdida de la arquitectura de las vellosidades, apoptosis de células epiteliales, invasión de patógenos a otros órganos extra- intestinales , la interferencia con el sistema inmune del hospedero, bacteriemia, meningitis, retrasos en el desarrollo, retraso mental, hidrocefalia, enterocolitis necrotizante (NEC) y/o la muerte. El sobrenadante del cultivo de la presente descripción o modalidades de la misma puede tener un impacto en cualquiera de estos efectos, preferiblemente, tiene un impacto en por lo menos uno de estos efectos seleccionados del grupo que consiste en la adhesión de las bacterias a las células epiteliales, la pérdida de la arquitectura de las vellosidades, la apoptosis de células epiteliales, la invasión de patógenos a otros órganos extra- intestinales , la interferencia con el sistema inmune, bacteriemia, meningitis, retrasos en el desarrollo, retraso mental, hidrocefalia, enterocolitis necrotizante (NEC) y/o la muerte y/o combinaciones de los mismos, más preferiblemente en por lo menos dos de estos efectos, y más preferiblemente en por lo menos tres de estos efectos, y lo más preferiblemente en por lo menos 4 o más de estos efectos. En una modalidad preferida, el sobrenadante de cultivo de la presente descripción o modalidades del mismo tiene un impacto en por lo menos uno de los efectos seleccionados del grupo que consiste en la adhesión de las bacterias a las células epiteliales, apoptosis de células epiteliales, la invasión de patógenos a otros órganos extra- intestinales , bacteriemia, meningitis, enterocolitis necrotizante (NEC) y/o la muerte y/o combinaciones de los mismos .

Con el fin de que la composición de la descripción ejerza su efecto anti C. sakazakii beneficioso, deber ser digerido por un sujeto, preferiblemente un sujeto humano. Particularmente, en una modalidad preferida, el sujeto es una mujer embarazada, una mujer en periodo de lactancia, un recién nacido, un lactante o un niño. Como se mencionó anteriormente, las ventajas de utilizar un material que podría considerarse un "probiótico no viable", se beneficiaron de la mayor parte de productos dietéticos para infantes. El término "infante" significa un ser humano postnatal de menos de aproximadamente 1 año de edad.

Se entenderá que la digestión por un sujeto requerirá la administración oral de la composición de la descripción. La forma de administración de la composición de acuerdo con la descripción no es crítica. En algunas modalidades, la composición se administra a un sujeto a través de tabletas, pildoras, encapsulados , comprimidos, cápsulas de gel, cápsulas, gotas de aceite, o bolsitas. En otra modalidad, la composición está encapsulada en un azúcar, grasa o polisacárido .

En todavía otra modalidad, se agrega la composición a un producto alimenticio o bebida y es consumido. El producto alimenticio o bebida puede ser producto nutricional para niños, tal como una fórmula de continuación, leche de crecimiento, bebida, leche, yogurt, jugo de frutas, bebidas a base de fruta, tableta masticable, galleta, galleta salada, o una leche en polvo. En otras modalidades, el producto puede ser producto nutricional de un infante, tal como una fórmula infantil o un fortificante de leche humana.

La composición de la descripción, si se agrega en una forma de dosificación separada o por medio de un producto nutricional, se administrará generalmente en una cantidad eficaz en el tratamiento o la prevención de infección por patógenos. La cantidad eficaz es preferiblemente equivalente a lxlO4 hasta aproximadamente lxlO12 equivalentes celulares de bacterias probióticas vivas por kg de peso corporal por día, y más preferiblemente 108-109 células equivalentes por kg de peso corporal por día. El cálculo anterior a equivalentes celulares está bien dentro del ámbito del conocimiento de la persona experimentada en la técnica.

Si la composición de la descripción y modalidades de la misma se administra a través de una fórmula infantil, la fórmula infantil puede ser nutricionalmente completa y contiene tipos y cantidades apropiados de lípidos, carbohidratos, proteínas, vitaminas y minerales. La cantidad de lípidos o grasas puede variar típicamente desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 7 g/100 kcal . Fuentes de lípidos pueden ser cualquiera de los conocidos o utilizados en la técnica previa, por ejemplo, aceites vegetales tales como aceite de palma, aceite de soja, oleína de palma, aceite de coco, aceite de triglicérido de cadena media, aceite de girasol alto oleico, aceite de cártamo alto oleico, y similares. La cantidad de proteína puede variar típicamente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 5 g/100 kcal. Las fuentes de proteínas pueden ser cualquiera de las conocidas o utilizadas en la técnica previa, por ejemplo, leche sin grasa, proteína de suero, caseína, proteína de soja, proteína (parcial o completamente) hidrolizada, aminoácidos, y similares. La cantidad de carbohidratos puede variar típicamente desde aproximadamente 8 hasta aproximadamente 12 g/100 kcal . Las fuentes de carbohidratos pueden ser cualquiera conocida o utilizada en la técnica previa, por ejemplo, lactosa, glucosa, sólidos de jarabe de maíz, maltodextrinas , sacarosa, almidón, sólidos de jarabe de arroz, y similares.

De manera conveniente, se pueden utilizar productos nutricionales para prenatales, prematuros, infantiles y lactantes disponibles en el comercio. Por ejemplo, Expecta® Enfamil®, Fórmula prematura Enfamil®, Lactofree®, Nutramigen®, Gentlease®, Pregestimil® , ProSobee®, Enfakid®, Enfaschool®, Enfagrow®, Kindercal® (disponible en Mead Johnson Nutrition Company, Glenview, Illinois, USA) pueden ser suplementados con niveles apropiados de la composición de la descripción y utilizados en la práctica del método de la descripción.

En una modalidad, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se pueden combinar con uno o más probióticos viables. Cualquier probiótico viable conocido en la técnica previa puede ser aceptable en esta modalidad siempre que alcance el resultado deseado.

Si un probiótico viable se administra en combinación con la composición de la descripción, la cantidad de probiótico viable puede corresponder a entre aproximadamente lxlO4 y lxlO12 unidades formadoras de colonias (ufe) por kg de peso corporal por día. En otra modalidad, los probióticos viables pueden comprender entre aproximadamente lxlO6 y lxlO12 ufe por kg de peso corporal por día. En aún otra modalidad, los probióticos viables pueden comprender aproximadamente lxlO9 ufe por kg de peso corporal por día. En aún una modalidad adicional, los probióticos viables pueden comprender aproximadamente lxlO10 ufe por kg de peso corporal por día.

En otra modalidad, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se pueden combinar con uno o más prebióticos. Un "prebiótico" significa un ingrediente alimenticio no digerible que estimula el crecimiento y/o actividad de las bacterias en el tracto digestivo en formas reivindicadas que son beneficiosas para la salud. Cualquier prebiótico conocido en la técnica previa será aceptable en esta modalidad siempre que alcance el resultado deseado. Los prebióticos útiles en la presente descripción pueden incluir lactulosa, glucooligosacáridos , inulina, polidextrosa, galactooligosacáridos , fructooligosacáridos , isomaltooligosacáridos , oligosacáridos de soja, lactosacarosa, xilooligosacáridos , y gentiooligosacáridos .

En aún otra modalidad de la presente descripción y modalidades de la misma, la fórmula infantil puede contener otros agentes activos tales como ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LCPUFAs) . LCPUFAs apropiados incluyen, pero no se limitan a ácido [alfa] -linoleico, ácido [gamma] -linoleico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido eicosapentanoico (EPA) , ácido araquidónico (ARA) y/o ácido docosahexaenoico (DHA) . En una modalidad, la composición de la descripción se administra en combinación con DHA. En otra modalidad, la composición de la descripción se administra en combinación con ARA. En aún otra modalidad, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se administra en combinación con DHA y ARA. Las fórmulas infantiles disponibles en el comercio que contiene DHA, ARA, o una combinación de los mismos pueden ser suplementadas con la composición de la descripción y se utiliza en la presente descripción. Por ejemplo, Enfamil® LIPIL®, que contiene niveles eficaces de DHA y ARA, está disponible en el comercio y puede ser suplementada con la composición de la descripción y utilizada en la presente descripción. Si se incluye, la cantidad eficaz de ARA en una modalidad de la presente descripción es típicamente desde aproximadamente 5 mg por kg de peso corporal por día hasta aproximadamente 150 mg por kg de peso corporal por día. En una modalidad de esta descripción y modalidades de la misma la cantidad varía desde aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal por día hasta aproximadamente 120 mg por kg de peso corporal por día. En otra modalidad, la cantidad varía desde aproximadamente 15 mg por kg de peso corporal por día hasta aproximadamente 90 mg por kg de peso corporal por día. En aún otra modalidad, la cantidad varía desde aproximadamente 20 mg por kg de peso corporal por día hasta aproximadamente 60 mg por kg de peso corporal por día. Si se utiliza una fórmula para infantes, la cantidad de DHA en la fórmula infantil puede variar desde aproximadamente 5 mg/100 kcal hasta aproximadamente 80 mg/100 kcal. En una modalidad de la presente descripción, el DHA varía desde aproximadamente 10 mg/100 kcal hasta aproximadamente 50 mg/100 kcal; y en otra modalidad, desde aproximadamente 15 mg/100 kcal hasta aproximadamente 20 mg/100 kcal. En una modalidad particular de la presente descripción, la cantidad de DHA es aproximadamente 17 mg/100 kcal. Si se utiliza una fórmula infantil, la cantidad de ARA en la fórmula infantil puede variar desde aproximadamente 10 mg/100 kcal hasta aproximadamente 100 mg/100 kcal. En una modalidad de la presente descripción, la cantidad de ARA varía desde aproximadamente 15 mg/100 kcal hasta aproximadamente 70 mg/100 kcal. En otra modalidad, la cantidad de ARA varía desde aproximadamente 20 mg/100 kcal hasta aproximadamente 40 mg/100 kcal. En una modalidad particular de la presente descripción, la cantidad de ARA es aproximadamente 34 mg/100 kcal.

Si se utiliza una fórmula infantil, la fórmula para lactantes puede ser suplementada con aceites que contienen DHA y ARA utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica previa. Por ejemplo, DHA y ARA pueden agregarse a la fórmula reemplazando una cantidad equivalente de un aceite, tal como aceite de girasol alto oleico, normalmente presente, en la fórmula. Como otro ejemplo, los aceites que contienen DHA y ARA pueden agregarse a la fórmula reemplazando una cantidad equivalente del resto de la mezcla total de grasa normalmente presente en la fórmula sin DHA y ARA. Si se utiliza, la fuente de DHA y ARA puede ser cualquier fuente conocida en la técnica previa tal como aceite marino, aceite de pescado, aceite unicelular, lípidos de yema de huevo, lípidos de cerebro, y similares. En algunas modalidades, el DHA y el ARA se obtienen a partir del aceite artek unicelular, DHASCO®, o variaciones de los mismos. El DHA y el ARA pueden estar en forma natural, siempre que el resto de la fuente de LCPUFA no resulte en ningún efecto perjudicial sustancial sobre el infante. Alternativamente, el DHA y el ARA se pueden utilizar en forma refinada. En una modalidad de la presente descripción, las fuentes de DHA y ARA son los aceites unicelulares como es enseñado en las Patentes Estadounidenses Números 5,374,567; 5,550,156; y 5,397,591, cuyas descripciones se incorporan aquí en su totalidad por referencia. Sin embargo, la presente descripción no se limita a sólo estos aceites.

En una modalidad, una fuente de LCPUFA que contiene EPA se utiliza en combinación con por lo menos una composición de la descripción. En otra modalidad, una fuente de LCPUFA que está sustancialmente libre de EPA se utiliza en combinación con por lo menos una composición de la descripción. Por ejemplo, en una modalidad de la presente descripción, una fórmula infantil que contiene menos de aproximadamente 16 mg de EPA/100 kcal es complementada con la composición de la descripción. En otra modalidad, una fórmula infantil que contiene menos de aproximadamente 10 mg de EPA/100 kcal se suplementa con la composición de la descripción. En aún otra modalidad, una fórmula infantil que contiene menos de aproximadamente 5 mg de EPA/100 kcal se suplementa con la composición de la descripción .

Otra modalidad de la descripción y/o modalidades de la misma incluye una fórmula infantil suplementada con la composición de la descripción que está libre de incluso cantidades traza de la EPA. Se cree que la provisión de una combinación de la composición de la descripción con DHA y/o ARA proporciona efectos complementarios o sinérgicos con respecto a las propiedades de protección contra la infección por C. sakazakii de formulaciones que contienen estos agentes .

En una modalidad preferida adicional de la presente descripción y modalidades de la misma, el producto dietético de la descripción comprende uno o más materiales bioactivos normalmente presentes en la leche materna humana, tales como proteínas o polisacáridos . Preferiblemente, el producto dietético de la descripción comprende lactoferrina .

En otro aspecto de la descripción de la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se utiliza con el fin de reducir, inhibir, mejorar y/o tratar infección de C. sakazakii.

En una modalidad preferida de la descripción y/o modalidades de la misma la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se utiliza con el fin de reducir, inhibir y/o mejorar por lo menos una condición seleccionada del grupo que consiste de adherencia de las bacterias a las células epiteliales, pérdida de la arquitectura de las vellosidades, apoptosis de células epiteliales, invasión de patógenos a otros órganos extraintestinales , interferencia con el sistema inmune del hospedero, bacteriemia, meningitis, retrasos en el desarrollo, retraso mental, hidrocefalia, enterocolitis necrotizante (NEC) y/o la muerte y/o combinaciones de los mismos, preferiblemente por lo menos dos condiciones, más preferiblemente por lo menos 3 o más condiciones.

Preferiblemente, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se utiliza con el fin de reducir, inhibir y/o mejorar la invasión a órganos tales como el cerebro, hígado, bazo, ciego, epitelio intestinal, mesenterio, líquido cef lorraquídeo, sangre, preferiblemente invasión al cerebro, hígado, bazo, más preferiblemente invasión al cerebro. En una modalidad preferida, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se utiliza con el fin de reducir, inhibir y/o mejorar el retraso mental debido a la infección por C. sakazakii. De la descripción y/o modalidades. En una modalidad preferida de la descripción y/o modalidades de la misma la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se utiliza con el fin de reducir, inhibir y/o mejorar la tasa de mortalidad de la infección por C. sakazakii .

Otro aspecto de la descripción se refiere al uso de una composición de acuerdo con la descripción y / o modalidades de la misma en la prevención de la infección por C. sakazakii. La composición de la presente descripción y modalidades de la misma es muy apropiada para ser utilizado profilácticamente.

Preferiblemente, se utiliza la composición de la 4 descripción y/o modalidades de la misma para prevenir la invasión de órganos tales como hígado, bazo y/o cerebro relacionados con infección por C. sakazakii .

Preferiblemente, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se utiliza para prevenir bacteriemia de una infección por C. sakazakii.

Preferiblemente, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se usa para prevenir la meningitis causada por una infección por C. sakazakii.

Preferiblemente, la composición de la descripción y/o modalidades de la misma se utiliza para prevenir la enterocolitis necrotizante (NEC) causada por una infección por C. sakazakii.

Sin embargo, otro aspecto de la descripción se refiere a al tratamiento de infección por C. sakazakii usando la composición de la descripción y/o modalidades de la misma. Preferiblemente, la descripción y/o modalidades de la misma se refieren al tratamiento de la invasión de órganos tales como hígado, bazo y/o cerebro relacionada con la infección por C. sakazakii.

Preferiblemente, la descripción y / o modalidades de la misma se refieren al tratamiento de la bacteriemia de una infección por C. sakazakii.

Preferiblemente, la descripción y/o modalidades de la misma se relacionan con el tratamiento de la meningitis causada por una infección por C. sakazakii .

Preferiblemente, la descripción y/o modalidades de la misma se refieren al tratamiento de la enterocolitis necrotizante (NEC) causada por una infección por C. sakazakii. Con referencia a los inconvenientes de uso de probióticos vivos o viables mencionados anteriormente, la presente descripción es de particular beneficio en la sustitución de tales probióticos en productos que sirven para prevenir, reducir, mejorar o tratar infección por C. sakazakii y/o síntomas de la misma. Para este fin, la composición se administra preferiblemente a través de un producto dietético o nutricional, más preferiblemente una fórmula o composición nutricional para prenatales, infantes o niños, un alimento médico, o un alimento para propósitos médicos específicos (en este caso, un alimento etiquetado para un propósito médico definido) , más preferiblemente una fórmula infantil, o nutrición perinatal para mujeres embarazadas o en periodo de lactancia, como se discutió sustancialmente anteriormente. Además, la descripción también permite proporcionar probióticos en una forma mejorada. Para los materiales derivados de probióticos no viables de acuerdo con la descripción se pueden producir de una manera estandarizada y reproducible en un entorno industrial, evitando los problemas que son inherentes a probióticos vivos. Además, en virtud de la naturaleza no viable y en particular cuando se proporciona como un polvo seco, pueden ser incorporados adecuadamente y dosificados en composiciones nutricionales para la prevención o el tratamiento de infección por C. sakazakii.

La descripción se ilustrará a continuación con referencia a los siguientes ejemplos, no limitativos.

Materiales y métodos Animales. Ratones CD-1 embarazados con tiempo se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) en el día de gestación (DG) 17. Los animales fueron mantenidos en una sala de animales con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h:12 h. Las madres fueron alojadas individualmente y se les permitió dar a luz de forma natural en GD 19 o 20. Ratones neonatales fueron separados por sexo y asignados aleatoriamente a madres adoptivas. Comida para roedores y agua potable estaban disponibles ad libitum.

Preparación de LGG, sobrenadante LGG, C. sakazakii y cultivos. El probiótico LGG (suministrado por Mead Johnson Nutrition) se activa a través de tres transferencias sucesivas en caldo de Man, Rogosa y Sharpe (MRS) (Oxoid, LTD, Basingstoke, Inglaterra) y se incubó a 37°C durante 24 hrs . Las células se aislaron mediante centrifugación (8,000 xg a 4°C durante 15 minutos) , se lavaron dos veces con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , y se resuspendieron en vehículo a una concentración de 106 UFC/ml de LGG. Sobrenadante LGG se preparó a partir de un proceso de fermentación por lotes.

El medio de cultivo siguiente (un caldo MRS adaptado) fue utilizado (Tabla 1) .

Tabla 1 LGG se hizo crecer a un pH constante de 6 por adición de 33% de NaOH a 37°C con una velocidad de agitación de 50 rpm, el espacio de cabeza se lavó abundantemente con N2. En la fase de crecimiento exponencial tardía, las células bacterianas se separaron del medio por centrifugación a 14000 x g y 4°C durante 15 min, el sedimento celular fue desechado y el medio gastado se almacenó a -20°C. Este material se desaló y se liofilizó y, antes de su uso en el experimento animal, se reconstituyó para ser probado en el modelo de infección por C. sakazakii animal (en lo sucesivo referido como sobrenadante LGG) .

Para la preparación de LGG viable, la concentración de la dosis se determinó midiendo la densidad óptica (DO) del cultivo y comparando con una curva estándar desarrollada a través de diluciones seriadas del cultivo. A continuación, la dosis se confirmó mediante siembra en placas de LGG en agar de soja tríptico (TSA) (Oxoid) durante 24 horas, y calculando CFU/ml. Una dosis de 105 UFC/LGG día o una dosis correspondiente de sobrenadante de LGG fue utilizada para tratamiento y se administró junto con vehículo. Los cultivos concentrados de C. sakazakii (cepa 3290) congelados en perlas de cerámica a -80°C se cultivaron hasta concentraciones de prueba en caldo de soja tríptico (TSB) (Oxoid, 3 LTD, Basingstoke, Inglaterra) . El cultivo C. sakazakii se preparó y la dosis se confirmó como se describió para LGG, excepto que las células se activaron a través de 2 transferencias sucesivas en TSB.

Tratamiento de ratones Los métodos de tratamiento para este estudio se han descrito anteriormente (Richardson, A.N., S. Lambert and M.A. Smith 2009. "Neonatal mice as models for Cronobacter sakazakii infection in infants" J Food Prot 174; 72(11): 2363-2367") . En resumen, las crías fueron tratadas con sobrenadante LGG y LGG en la fórmula infantil reconstituida en polvo (RPIF) en los primeros cuatro días de vida consecutivos (PND) 1 a 4, y con C. sakazakii en PND 2 a través de una sonda nasogástrica utilizando una aguja de alimentación de animal de acero inoxidable 24 x 1" (25.4 mm) W/l-l¼ (Popper & Sons, Inc., New Hyde Park, NY) unida a una jeringa de 1 mi . RPIF se mezcló con agua desionizada estéril para la reconstitución, según las instrucciones del fabricante. Antes de distribución a las crías, saborizante de vainilla (The Kroger Co., Cincinnati, O.H.) se aplicó sobre la nariz (hocico) de cada madre para enmascarar los olores de los animales y crear confusión olfativa. Esto se hizo para aumentar la aceptación de las crías de las madres adoptivas. Diluciones seriadas de fórmula infantil en polvo reconstituida inoculadas con varias concentraciones de cepa 3290 de C. sakazakii fueron preparadas. Cada cría recibe un volumen de 0.1 mi de RPIF con dosis de C. sakazakii confirmadas de 107, 108, y 1011 UFC/dosis o el control del vehículo. Se observaron neonatos para la morbilidad o la mortalidad dos veces al día durante el período después del tratamiento. Todas las crías viables en el día después del tratamiento (PTD) 7 fueron sacrificadas. Los datos de mortalidad se presentan como la mortalidad total (Tabla 3A) a lo largo de todo el período de estudio y como mortalidad ajustada (Tabla 3B) contando sólo aquellas muertes que ocurren 24 horas después del último tratamiento por sonda. La mortalidad ajustada se calculó para eliminar cualquier muerte que podría haber estado relacionada con la técnica por sonda o el estrés de las exposiciones por sonda repetidas.

Cultivo de C. sakazakii de muestras de tejido Hígado, ciego, y cerebro se recolectaron de cada ratón neonatal y se almacenaron en una bolsa de filtro de empaque Whirl (Nasco, Fort Atkinson, WI) en hielo para cultivo.

Caldo de enriquecimiento de Enterobacter (EE) (Oxoid) se agregó a la muestra en una proporción de 10 mi de EE a 1 g de muestra. Las muestras se sembraron en estrías sobre placas de agar de glucosa de bilis roja violeta (VRBG) por duplicado para el crecimiento selectivo de Enterobacter ssp, y después se incubaron a 37°C durante 24 hrs . Los crecimientos fueron subcultivados en placas de TSA y se incubaron durante 48 horas a 25°C. RapID ONE Identification System (Remel, Inc., Lenexa, KS, USA) se utilizó para la confirmación bioquímica positiva de aislamiento de C. sakazaii.

Análisis Estadístico Los análisis estadísticos para datos de infectividad y mortalidad por C. sakazaii y se realizaron utilizando SAS versión 9.1 (SAS Institute, Cary, N.C.) y Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, W.A.). Diferencias significativas (P =0.05) en los valores que comparan las edades de los animales tratados se determinaron mediante la prueba de Scheffe y prueba t de Excel. Una forma de análisis de pruebas de varianza (A OVA) se realizaron utilizando la prueba de Dunnett y la prueba t de Excel para determinar las diferencias significativas entre los grupos de tratamiento y el grupo de control (P = 0.05) para cada edad del ratón.

Resultados Para obtener un número suficiente de animales para el análisis estadístico, los datos siguientes son los resultados combinados de tres experimentos independientes . La Tabla 2A muestra el porcentaje de animales de los que C. sakazaii se aisló de cualquier tejido. El número de tejidos invadidos por C. sakazaii se reduce significativamente por aproximadamente una mitad cuando los recién nacidos recibieron cotratamientos , ya sea con sobrenadante LGG o LGG (Tabla 2A) . La concentración de C. sakazakii administrada a animales individuales en los tres experimentos se encontró en el intervalo de 108-1012 CFU/ml. Sin embargo, el número de tejidos invadidos y tipos de tejidos invadidos no fue dependiente de la dosis, y está de acuerdo con nuestro trabajo anterior. C. sakazakii no fue aislado de cualquiera de cualquiera sobrenadante LGG o grupos de control RPIF. Aunque el peso medio de sacrificio varió desde 5.39-6.22 g, no se encontró ninguna diferencia significativa.

Tabla 2A. Porcentaje de animales con por lo menos una muestra de tejido invadido y pesos promedio después de la exposición a C. sakazakii con o sin sobrenadante LGG o LGG.

* Las dosis de C. sakazakii representan una combinación de tres experimentos independientes llevados a cabo con concentraciones de C. sakazakii en 10 , 10 , o 1012 CFU/ml .

** Los grupos de tratamiento con la misma letra no son estadísticamente diferentes, (p = 0.05).

Cuando se examinan los tej idos individuales de los animales tratados con C. sakazakii sólo, el cerebro tiende a tener C. sakazakii aislado de un mayor porcentaje de animales que ya sea hígado o bazo. El cotratamiento con sobrenadante LGG o LGG redujo la invasión en el cerebro en aproximadamente un 50% (Tabla 2B) . Debido a que el cerebro es un tejido objetivo de C. sakazakii en seres humanos, esto podría ser un hallazgo importante para el desarrollo de terapias y/o la prevención de efectos adversos para el cerebro. Aunque el índice de invasión general del hígado fue solamente 15%, es de destacar que en los animales que recibieron LGG como cotratamiento, nunca se aisló C. sakazakii de los tejidos hepáticos en cualquier experimento y cotratamiento con sobrenadante LGG redujo el aislamiento de C. sakazakii del hígado en aproximadamente una mitad (Tabla 2B) . Considerando que ambos tratamientos con sobrenadante LGG y LGG redujeron significativamente el aislamiento de C. sakazakii de los tejidos del cerebro e hígado, solamente el tratamiento de LGG redujo significativamente C. sakazakii en la invasión a los tejidos del bazo (Tabla 2B) .

Tabla 2B. Porcentaje de animales de los que C. sakazakii fue aislado de los tejidos del cerebro, hígado o bazo después de la exposición a C. sakazakii con o sin sobrenadante LGG o LGG.

Los grupos de tratamiento con la misma letra no son estadísticamente diferentes (p < 0.05) .

Los registros se mantienen de todas las crías que mueren antes de la hora prevista de sacrificio. La Tabla 3 muestra los resultados de mortalidad combinados de tres experimentos. Para cualquier grupo que recibe C. sakazakii , el índice de mortalidad global fue del 30% (Tabla 3A) .

Tabla 3. Mortalidad de neonatos CD-1 después del tratamiento con C. sakazakii con o sin sobrenadante LGG o LGG . * Tabla 3A: Mortalidad total Tabla 3B: Mortalidad ajustada Los grupos de tratamiento con la misma letra no son estadísticamente diferentes (p = 0.05).

Esto fue en contraste con los dos grupos de control del vehículo que no recibieron C. sakazakii que tenían aproximadamente índice de mortalidad de 7%. Cuando los datos se ajustaron de acuerdo con nuestra definición de muertes relacionadas con C. sakazakii (contando sólo aquellas muertes que se producen 24 horas o más después del tratamiento por sonda) , la mortalidad se redujo en aproximadamente un tercio en los grupos C. sakazakii y C. sakazakii más LGG (Tabla 3B) . La mortalidad se redujo a 0% para el grupo que recibió C. sakazakii y sobrenadante LGG (Tabla 3B) . Los grupos control de sobrenadante LGG y RPIF tenían solamente una muerte de un total de 112 animales.

Discusión Los probióticos han mostrado proporcionar una protección contra los patógenos. Corr et al (2007 Bacteriocin production as a mechanism for the antiinfective activity of Lactobacillus salivarius U CC118. Proc Nati Acad Sci USA 104 (18) : 7617. ) encontró la producción de una bacteriocina, un péptido antibacteriano producido por Lactobacillus salivarius , como un mecanismo potencial contra histeria monocytogenes . Mientras que los estudios anteriores han mostrado que los probióticos pueden impedir la adhesión de C. sakazakii a las células intestinales in vitro, ningún trabajo previo se ha centrado en el potencial de LGG para prevenir o reducir la invasión por C. sakazakii in vivo en ratones neonatales. Sin embargo, Lactobacillus bulgaricus ha mostrado ser protector en un modelo NEC de rata neonatal, en la que las crías fueron expuestas a E sakazakii (Hunter, C. J., M. Williams, et al. 2009. Lactobacillus bulgaricus prevents intestinal epithelial cell injury caused by Enterobacter sakazaku -induced nitrie oxide both in vitro and in the newborn rat model of necrotizing enterocolitis. Infect Inunun 77(3) : 1031) . En el estudio actual, un efecto protector fue proporcionado por la administración de LGG y sobrenadante derivado de LGG antes y después de la exposición a C. sakazakii proporcionando evidencia adicional de que los probióticos pueden prevenir la invasión de C. sakazakii. LGG y sobrenadante de LGG reducen consistentemente el aislamiento de C. sakazakii en tejido de ratón neonatal.

La suplementación con sobrenadante viable o LLG redujo el porcentaje de animales con tejidos invadidos por C. sakazakii. No se encontró ninguna relación dependiente de la dosis entre C. sakazakii y su índice de invasión; sin embargo, el índice de invasión se redujo en animales tratados con LGG y sobrenadante de LGG. C. sakazakii se encontró con mayor frecuencia en el tej ido cerebral de los animales tratados .

La reducción de la invasión de tejido cerebral en los grupos que recibieron tanto C. sakazakii y LGG así como sobrenadante de LGG es importante, porque la meningitis es la principal causa de morbilidad y mortalidad en las infecciones por C. sakazakii . En general, el porcentaje total de animales con tejidos invadidos por C. sakazakii se redujo en los grupos que recibieron tanto C. sakazakii y LGG así como sobrenadante de LGG. El estudio actual indica que LGG, y/o su sobrenadante, limita el grado de invasión por C. sakazakii en ratones neonatales.

Es interesante que los grupos que recibieron C. sakazakii y C. sakazakii con LGG tenían una tasa de mortalidad ajustada similar (17% y 13%, respectivamente) y fue significativamente mayor que C. sakazakii con sobrenadante de LGG (Tabla 3) . Hemos observado que el LGG era mucho más viscoso que el sobrenadante de LGG, y esto podría ser un factor contribuyente que debe ser abordado en un estudio futuro. La baja tasa de mortalidad en los grupos de control del vehículo sugiere que la mayoría de las muertes en grupos tratados con C. sakazakii eran, de hecho, el resultado de la exposición a C. sakazakii.

CONCLUSIONES El probiótico LGG y sus factores secretados recogidos durante el proceso fermentativo (sobrenadante de LGG) redujo la invasión global de C. sakazakii en ratones neonatales por vía oral expuestos a RPIF con dosis variables de C. sakazakii. De los tejidos examinados, el cerebro fue más f ecuentemente invadido por C. sakazakii , pero también recibió la mayor protección del tratamiento con LGG o sobrenadante de LGG. Para el cerebro, tanto LGG y sobrenadante de LGG fueron igualmente protectores contra invasión de C. sakazakii. El sobrenadante de LGG fue más eficaz en la protección de los ratones neonatales de la muerte relacionada con el C. sakazakii.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición que comprende un sobrenadante de cultivo de una fase de crecimiento exponencial tardía de un proceso de cultivo por lotes de probiótico, para usarse en el tratamiento o prevención de la infección por un patógeno.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el probiótico es LGG .

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el patógeno es C. sakazakii.

4. Una composición para usarse en el tratamiento o la prevención de la infección por patógenos de conformidad con la reivindicación 1, que se puede obtener por un proceso que comprende los pasos de (a) someter un probiótico a cultivo en un medio de cultivo apropiado, utilizando un proceso por lotes; (b) recolectar el sobrenadante de cultivo en una fase de crecimiento exponencial tardía del paso de cultivo, cuya fase es definida con referencia a la segunda mitad del tiempo entre la fase de latencia y la fase estacionaria del proceso de cultivo por lotes; (c) opcionalmente eliminar componentes de bajo peso molecular del sobrenadante con el fin de retener componentes de peso molecular superior a 5 kDa; (d) eliminar contenido líquido del sobrenadante de cultivo con el fin de obtener la composición.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el probiótico es LGG y el patógeno es C. sakazakii.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la fase exponencial tardía se define con referencia a la cuarta parte tardía del tiempo entre la fase de latencia y la fase estacionaria del proceso de cultivo por lotes.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el lote de cultivo se lleva a cabo en un medio de cultivo desprovisto de polisorbatos.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el medio contiene un ingrediente seleccionado del grupo que consiste de ácido oleico, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de colza, aceite de girasol, y mezclas de los mismos.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el lote de cultivo se lleva a cabo a un pH de 5-7.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una fórmula prenatal, infantil o para niños o la composición o suplemento nutricional, un alimento médico, o un alimento para fines médicos específicos.