MX2013012564A - Metodos para el tratamiento del cancer y enfermedades inflamatorias utilizando cereblon como predictor. - Google Patents

Metodos para el tratamiento del cancer y enfermedades inflamatorias utilizando cereblon como predictor.

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Abstract

Se describen los usos de la proteína cereblon como predictor de la sensibilidad clínica para el cáncer, enfermedades inflamatorias y la respuesta del paciente al tratamiento farmacológico.

Description

MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE CÁNCER Y ENFERMEDADES INFLAMATORIAS UTILIZANDO CEREBLON COMO PREDICTOR La presente solicitud reclama prioridad ante la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 61/481,066, presentada el 29 de abril de 2011; 61/511,986, presentada el 26 de julio de 2011; y 61/579,600, presentada el 22 de diciembre de 2011; la totalidad de cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. 1. CAMPO En la presente se proporcionan los usos de la proteína cereblon como predictor de la sensibilidad clínica frente a cáncer y enfermedades inflamatorias y la respuesta de los pacientes frente al tratamiento farmacológico. 2. ANTECEDENTE 2.1 Patobiología del cáncer El cáncer se caracteriza principalmente por un aumento en el número de células anormales derivadas de un tejido normal determinado, la invasión de los tejidos contiguos por estas células anormales o la propagación de las células malignas a través del sistema linfático y la sangre hasta los ganglios linfáticos regionales y a sitios distantes (metástasis). Los datos clínicos y estudios de biología molecular indican que el cáncer es un proceso de múltiples pasos que comienza con cambios preneoplásicos menores, los cuales pueden, bajo ciertas condiciones, progresar a neoplasia. La lesión neoplásica puede evolucionar en forma clonal y desarrollar una capacidad creciente para invasión, crecimiento, metástasis y heterogeneidad, especialmente en condiciones en las que las células neoplásicas escapan de la vigilancia del sistema inmunológico del hospedero. Roitt, I., Brostoff, J and Rale, D., Immunology, 17.1-17.12 (3rd ed., Mosby, St. Louis, Mo., 1993).
Existe una enorme variedad de cánceres los cuales están descritos con detalle en la literatura médica. Los ejemplos pueden ser cánceres del pulmón, colon, recto, próstata, mama, cerebro, sangre e intestino. La incidencia del cáncer sigue en aumento a medida que la población general envejece, a medida que se desarrollan nuevos cánceres y a medida que crecen las poblaciones susceptibles (p. ej., las personas infectadas con AIDS (SIDA) o las que se exponen excesivamente a la luz solar). Sin embargo, son limitadas las opciones de tratamiento de cáncer. Por ejemplo, en el caso de cánceres de sangre (p. ej., mieloma múltiple), están disponibles pocas opciones de tratamiento, especialmente cuando falla la quimioterapia tradicional y no es una opción el trasplante de médula ósea. Por tanto existe una enorme demanda de nuevos métodos y composiciones que puedan utilizarse para tratar a los pacientes con cáncer. Muchos tipos de cánceres están asociados con la formación de nuevos vasos sanguíneos, un proceso conocido como angiogénesis. Se han dilucidado diversos mecanismos implicados en la angiogénesis inducida por tumor. El más directo de estos mecanismos es la secreción de citocinas con propiedades angiogénicas en las células tu orales. Los ejemplos de estas citocinas pueden ser el factor de crecimiento fibroblástico básico (a,b-FGF), angiogenina, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y TNF-a. De otro modo, las células tumorales pueden liberar péptidos angiogénicos mediante la producción de proteasas y la ruptura subsiguiente de la matriz extracelular donde se almacenan algunas citocinas (p. ej., b-FGF). La angiogénesis también puede ser inducida de manera indirecta mediante el reclutamiento de células inflamatorias (particularmente macrófagos) y su liberación subsecuente de citocinas angiogénicas (p. ej., TNF-a, b-FGF).
El término linfoma se refiere a cánceres que se originan en el sistema linfático. El linfoma se caracteriza por neoplasmas malignos de linfocitos- linfocitos B y linfocitos T (es decir, células B y células T). El linfoma generalmente comienza en los ganglios linfáticos y/o colecciones de tejido linfático en órganos como puede ser, más no se limita a, el estómago o intestinos. El linfoma puede involucrar la médula y la sangre en algunos casos. El linfoma puede propagarse de un sitio a otras partes del cuerpo. El tratamiento de las diferentes formas de linfoma está descrito, por ejemplo, en la Patente U.S. No.7,468,363, la totalidad de la cual se incorpora en la presente para referencia. Tales linfornas pueden ser, más no se limitan a, linfoma de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, linfoma de células B cutáneas, linfoma de células B activadas, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma del centro folicular, linfoma transformado, linfoma linfocítico de diferenciación intermedia, linfoma linfocítico intermedio (ILL), linfoma linfocítico pobremente diferenciado difuso (PDL), linfoma centrocítico, linfoma de células hendidas, pequeño, difuso (DSCCL), linfoma de células T periféricas (PTCL), linfoma de células T cutáneas y linfoma de la zona del manto y linfoma folicular de grado bajo.
El linfoma no Hodgkin (NHL) es el quinto cáncer más común para varones y mujeres en Estados Unidos, con un estimado de 63,190 nuevos casos y 18,660 muertes en 2007. Jemal A, et al., CA Cáncer J Clin 2007; 57(1):43—66. La probabilidad de desarrollar NHL aumenta con la edad y la incidencia de NHL en los adultos mayores a estado aumentando de manera estable en la última década, causando interés con la tendencia de envejecimiento de la población de Estados Unidos. Id. Clarke C A, et al., Cáncer 2002; 94(7):2015-2023. El linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) representa aproximadamente una tercera parte de los linfornas no Hodgkin. Si bien algunos pacientes DLBCL se curan con quimioterapia tradicional, el resto muere a causa de la enfermedad. Los fármacos anti-cáncer provocan una depleción rápida y persistente de los linfocitos, posiblemente por la inducción directa de la apoptosis en células T y B maduras. Véase K. Stahnke. et al, Blood 2001, 98:3066-3073. Se ha demostrado que el recuento absoluto de linfocitos (ALC) es un factor pronóstico del linfoma no Hodgkin folicular y resultados recientes han sugerido que el ALC en la diagnosis es un factor pronóstico importante en linfoma difuso de células B grandes.
Los linfomas difusos de células B grandes, (DLBCL) pueden ser dividido en distintos subtipos moleculares de acuerdo con sus patrones de perfilado génico: DLBCL tipo células B del centro germinal (GCB-DLBCL), DLBCL tipo células B activadas (ABC-DLBCL), y linfoma de células B mediastinales primarias (PMBL) o de tipo no clasificado. Estos subtipos se caracterizan por diferencias en la supervivencia, respuesta a la quimioterapia y dependencia de la vía de señalización, particularmente la vía de NF-KB. Véase D. Kim et al, Journal of Clinical Oncology, 2007 ASCO Annual Meeting Proceedings Parte I. Vol 25, No. 18S (suplemento 20 de junio), 2007: 8082. Véase Bea S, et al, Blood 2005; 106: 3183-90; Ngo V.N. et al, Nature 2011; 470: 115-9. Tales diferencias han motivado la búsqueda de estrategias de tratamiento más efectivas y específicas del subtipo en DLBCL.
El término leucemia se refiere a neoplasmas malignos de los tejidos que forman la sangre. Diversas formas de leucemias están descritas, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 7,393,862 y la Solicitud de Patente provisional U.S. No. 60/380,842, presentada el 17 de mayo de 2002, las totalidades de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Aunque se ha reportado que existen virus que causan diversas formas de leucemia en animales, las causas de leucemia en humanos se desconocen en gran medida. The Merck Manual , 944-952 (17a ed.1999). La transformación a malignidad por lo regular sucede en una célula individual mediante dos o más pasos con proliferación subsecuente y expansión clonal. En algunas leucemias se han identificado translocaciones cromosómicas específicas con morfología de células leucémicas consistentes y características clínicas especiales (p. ej., las translocaciones de los cromosomas 9 y 22 en leucemia mielocítica crónica, y de los cromosomas 15 y 17 en leucemia promielocítica aguda). Las leucemias agudas son poblaciones de células predominantemente no diferencias y las leucemias crónicas son formas de células más maduras.
Las leucemias agudas se dividen en los tipos linfoblástico (ALL) y no linfoblástico (ANLL). The Merck Manual , 946-949 (17a ed. 1999). Estos además se pueden dividir por su aspecto morfológico y citoquímico de acuerdo con la clasificación Francesa-Norteamericana-Británica (FAB) o de acuerdo con su tipo y grado de diferenciación. Es muy útil el uso de anticuerpos monoclonales específicos de células B y T y para evaluar la expresión del antígeno mieloide. La ALL es principalmente una enfermedad de la niñez que se establece mediante hallazgos de laboratorio y exámenes de médula ósea. La ANLL, también conocida como leucemia mielógena aguda o leucemia mieloide aguda (AML), se presenta en todas las edades y es la leucemia aguda más común entre los adultos; es la forma normalmente asociada con irradiación como agente causal.
Las leucemias crónicas están descritas como linfocíticas (CLL) o mielocíticas (CML). The Merck Manual , 949-952 (17a ed. 1999). La CLL se caracteriza por la presencia de linfocitos maduros en sangre, médula ósea y órganos linfoides. La característica principal de la CLL es la linfocitosis absoluta, sostenida (> 5,000/pL) y un aumento de los linfocitos en la médula ósea. La mayoría de los pacientes CLL también tienen expansión clonal de los linfocitos con características de células B. la CLL es una enfermedad de la edad madura o vejez. En la CML, la característica principal es la predominancia de células granulocíticas de todos los estadios de diferenciación en la sangre, médula ósea, hígado, bazo y otros órganos. En el paciente sintomático en la diagnosis, la cuenta total de células sanguíneas blancas (WBC) normalmente es alrededor de 200,000/pL, pero puede alcanzar 1,000,000/pL. Es relativamente sencillo diagnosticar la CML por la presencia del cromosoma Philadelphia.
Se sabe muy bien que las células estromales de médula ósea respaldan la progresión de la enfermedad CLL y la resistencia a la quimioterapia. El rompimiento de las interacciones entre las células CLL y las células estro ales es otra diana de la quimioterapia de CLL.
Además de la categorización de agudo y crónico, los neoplasmas también se clasifican con base en las células que dan origen a tal trastorno en precursor o periférico. Véase p. ej., la Publicación de la Patente U.S. No. 2008/0051379, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Los neoplasmas precursores pueden ser los ALL y linfomas linfoblásticos y se presentan en los linfocitos antes de que estos se hayan diferenciado en una célula T o B. Los neoplasmas periféricos son aquellos que se presentan en los linfocitos que se han diferenciado en células T o B. Dichos neoplasmas periféricos pueden ser, más no se limitan a, CLL de células B, leucemia prolinfocítico de células B, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de células B de la zona marginal extraganglionar de tejido linfoide asociado con la mucosa, linfoma de la zona marginal ganglionar, linfoma de la zona marginal esplénica, leucemia de células pilosas, plasmacitoma, linfoma difuso de células B grandes y linfoma de Burkitt. En aproximadamente 95% de los casos de CLL, la expansión clonal es de un linaje de células B. véase Cáncer: Principies & Practice of Oncology (3a Edición) (1989) (pp. 1843-1847). En menos del 5% de los casos de CLL, las células tumorales tienen un fenotipo de células T. No obstante, estas clasificaciones, el daño patológico de la hematopoyesis normal es la característica de todas las leucemias.
Mieloma múltiple (MM) es un cáncer de células plasmáticas en la médula ósea. Por lo regular, las células plasmáticas producen anticuerpos y desempeñan una función importante en la función inmunitaria. Sin embargo, el crecimiento no controlado de estas células da lugar a dolor y fracturas de huesos, anemia, infecciones y otras complicaciones. El mieloma múltiple es la segunda malignidad hematológica más común, aunque las causas exactas del mieloma múltiple siguen siendo desconocidas. El mieloma múltiple ocasiona altos niveles de proteínas en la sangre, orina y órganos, que incluyen, más no se limitan a, proteína M y otras inmunoglobulinas (anticuerpos), albúmina y beta-2-microglobulina. La proteína M, abreviatura para proteína monoclonal, también conocida como paraproteína, es una proteína particularmente anormal producida por las células plasmáticas de mieloma y puede encontrarse en la sangre u orina de casi todos los pacientes con mieloma múltiple.
Los síntomas esqueléticos, incluido el dolor de huesos, están entre los síntomas clínicos más significativos de mieloma múltiple. Las células plasmáticas malignas liberan factores estimuladores de los osteoclastos (como pueden ser IL-1, IL-b y TNF) los cuales hacen que el calcio sea lixiviado de los huesos ocasionando lesiones líticas; hipercalcemia es otro síntoma. Los factores estimuladores de osteoclastos, también conocidos como citocinas, pueden prevenir la apoptosis o muerte de las células de mieloma. Cincuenta por ciento de los pacientes tienen, en el diagnóstico, lesiones esqueletales relacionadas con mieloma, detectables por métodos radiológicos. Otros síntomas clínicos comunes para mieloma múltiple pueden ser polineuropatía, anemia, hiperviscosidad, infecciones e insuficiencia renal.
Células estromales de médula ósea son bien conocidos para sustentar la progresión de la enfermedad de mieloma múltiple y la resistencia a la quimioterapia. La interrupción de las interacciones entre células de mieloma múltiple y células estromales es una diana diana adicional de tratamiento de mieloma múltiple.
El síndrome mielodisplásico (MDS) se refiere a un diverso grupo de trastornos de células hematopoyéticas.
El MDS se caracteriza por una médula ósea con morfología y maduración alterada (dismielopoyesis), citopenias de sangre periférica y riesgo variable de progreso a leucemia aguda resultante de la producción ineficaz de células sanguíneas. Véase The Merck Manual 953 (17a ed. 1999) and List et al, 1990, J Clin. Oncol.8:1424. El tratamiento de MDS con compuestos inmunomoduladores está descrito en la publicación de patente U.S. No. 2004/0220144, la totalidad de la cual se incorpora en este medio para referencia. Los tumores sólidos son masas anormales de tejido que pueden, pero por lo regular no contienen quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos (no cáncer), o malignos (cáncer). Los diferentes tipos de tumores sólidos se nombran por el tipo de células que los forman. Los ejemplos de los tipos de tumores sólidos pueden ser, más no se limitan a melanoma maligno, carcinoma de la corteza suprarrenal, carcinoma mamario, cáncer de células renales, carcinoma de páncreas, carcinoma pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) y carcinoma de [lacuna] primario desconocido. Los fármacos que se administran comúnmente a los pacientes con diversos tipos o estadios de tumores sólidos pueden ser, más no se limitan a, Celebrex, etopósido, ciclofosfamida, docetaxel, apecitabina, IFN, tamoxifeno, IL-2, GM-CSF o una combinación de estos.
Aunque los pacientes que consiguen una remisión completa después de tratamiento inicial tienen una buena oportunidad de cura, menos de 10% de aquellos que no responden o que recaen logran una curación o una respuesta que dura más de 3 años. Véase Cerny T, et al., Ann Oncol 2002; 13 Suppl 4:211-216. Se sabe que rituximab depleta las células B hospederas normales. Véase M. Aklilu et al., Annals of Oncology 15: 1109-1114, 2004. Los efectos inmunológicos a largo plazo de la depletación de las células B con rituximab, y las características de la combinación de células B reconstituyentes en los pacientes de linfoma no están bien definidos, a pesar del amplio uso de este tratamiento. Véase Jennifer H. Anolik et al., Clinical Immunology, vol.122, emisión 2, Febrero 2007, páginas 139-145.
El abordaje para pacientes con la enfermedad recidivante o refractaria depende en gran medida de los tratamientos experimentales seguidos por el trasplante de células madre, el cual puede no ser apropiado para pacientes con un estatus de desempeño deficiente o en edad avanzada. Por tanto, existe una gran demanda de nuevos métodos que puedan utilizarse para tratar a pacientes con NHL.
El vínculo entre cáncer y el metabolismo celular alterado ha sido bien establecido, véase Cairns, R.A., et al. Nature Rev. , 2011, 11: 85-95. La comprensión del metabolismo de las células tumorales y los cambios genéticos asociados de éste pueden conducir a la identificación de mejores métodos para el tratamiento de cáncer. Id. Por ejemplo, la supervivencia y proliferación de células tumorales a través del metabolismo incrementado de la glucosa ha sido vinculado con la vía de PIK3, con ello mutaciones en los genes supresores de tumor, como puede ser el metabolismo de células tumorales activado por PTEN. Id. AKTl (a.k.a., PKB) estimula el metabolismo de la glucosa asociado con el crecimiento de células tumorales por diversas interacciones con PFKFB3, ENTPD5, mTOR y TSC2 (a.k.a., tuberin). Id.
Los factores de transcripción HIF1 y HIF2 son responsables en gran medida de la respuesta celular a las condiciones de poco oxígeno muchas veces asociadas con tumores. Id. Una vez activado, HIFl promueve la capacidad de las células tumores para llevar a cabo la glicólisis. Id. Así pues, la inhibición de HIFl puede ralentizar o revertir el metabolismo de las células tumorales. La activación del HIFl ha sido vinculada con PI3K, las proteínas supresoras de tumor como puede ser VHL, succinato deshidrogenasa (SDH) y fumarato hidratasa. Id. El factor de transcripción oncogénico MYC también ha sido vinculado con el metabolismo de las células tumorales, específicamente con la glicolisis. Id. El factor MYC también promueve la proliferación celular por las vías metabólicas de glutamina. Id.
La proteína cinasa activada por AMP (AMPK) funciona como un punto de verificación metabólica el cual deben superar las células tumorales para proliferar. Id. Se han identificado diversas mutaciones que suprimen la señalización de AMPK en células tumorales. Véase Shackelford, D.B. & Shaw, R.J., Nature Rev. Cáncer, 2009, 9: 563-575. La molécula STKll ha sido identificada como un gen supresor de tumor relacionado con la función de AMPK. Véase Cairns, R.A., et al. Nature Rev. , 2011, 11:85-95.
El factor de transcripción p53, un supresor de tumor, también tiene una función importante en la regulación del metabolismo celular. Id. La pérdida de p53 en las células tumorales puede ser un contribuidor importante para los cambios en el metabolismo de las células tumorales hacia la vía glicolítica. Id. El factor de transcripción OCTl, otra diana potencial para quimioterapéutica, puede cooperar con p53 en la regulación del metabolismo de las células tumorales. Id.
La piruvato cinasa tipo M2 (PKM2) promueve cambios en el metabolismo celular lo cual confiere ventajas metabólicas para las células cancerosas dando apoyo a la proliferación celular. Id. Por ejemplo, se ha encontrado que las células de cáncer pulmonar que expresan PKM2 sobre PKMl tienen una ventaja como esta. Id. En la práctica clínica se ha identificado a PKM2 como sobreexpresado en diversos tipos de cáncer. Id. Así pues, PKM2 puede ser un biomarcador útil para la detección temprana de tumores.
Las mutaciones en las isocitrato deshidrogenasas IDHl e IDH2 han sido vinculadas con la tumorigénesis, específicamente, en glioblastoma y leucemia mieloide aguda. Véase Mardis, E.R. et al., N. Engl . J. Med, 2009, 361: 1058-1066; Parsons, D.W. et al, Science, 2008, 321: 1807-1812.
La incidencia de cáncer sigue sin asenso a medida que la población general envejece, a medida que se presentan nuevos cánceres y a medida que crecen las poblaciones susceptibles (p. ej., personas infectadas con AIDS, los adultos mayores o las personas excesivamente expuestas a la luz solar). Por tanto, existe una enorme demanda de nuevos métodos, tratamientos y composiciones que puedan utilizarse para tratar a pacientes con cáncer, como puede ser, más no se limita a, aquellos, NHL, mieloma múltiple, AML, leucemias y tumores sólidos.
Algunas otras enfermedades y trastornos también están asociados con, o se caracterizan por, angiogénesis no deseada. Por ejemplo, la angiogénesis aumentada o no regulada ha sido implicada en diversas enfermedades y estados médicos como pueden ser, más no se limitan a, enfermedades neovasculares oculares, enfermedades neovasculares coroidales, enfermedades neovasculares de la retina, rubeósis (neovascularización del ángulo), enfermedades virales, enfermedades genéticas, enfermedades inflamatorias, enfermedades alérgicas, fibrosis, artritis y enfermedades autoinmunes. Los ejemplos de tales enfermedades y estados pueden ser, más no se limitan a: retinopatía diabética; retinopatia de la premadurez; rechazo de injerto córneo; glaucoma neovascular; fibroplasia retrolental; y vitreoretinopatía proliferativa.
Por consiguiente, los compuestos que puedan controlar y/o inhibir la angiogénesis no deseada o inhibir la producción de ciertas citocinas, como puede ser TNF-a, pueden ser útiles en el tratamiento y prevención de diversas enfermedades y estados. 2.2 Enfermedades inflamatorias La inflamación desempeña una función fundamental en las defensas del hospedero y en la progresión de enfermedades en las que interviene el sistema inmunológico. La respuesta inflamatoria se inicia en respuesta a lesión (p. ej., trauma, isquemia y partículas extrañas) y la infección (p. ej., infección bacteriana o viral) mediante una cascada compleja de acontecimientos que incluyen mediadores químicos (p. ej., citocinas y prostaglandinas) y células inflamatorias (p. ej ., leucocitos). La respuesta inflamatoria se caracteriza por aumento en el flujo de la sangre, aumento de la permeabilidad capilar y la afluencia de células fagocíticas. Estos acontecimientos dan origen a la inflamación, enrojecimiento, calentamiento (patrones de calor alterados), y formación de pus en el lugar de la lesión o la infección.
Las citocinas y prostaglandinas controlan la respuesta inflamatoria, y son liberadas en una cascada ordenada y auto-limitante hacia la sangre o los tejidos afectados. Esta liberación de citocinas y prostaglandinas aumenta el flujo sanguíneo hacia el área de la lesión o infección, y puede dar lugar a enrojecimiento y calor. Algunas de estas sustancias químicas ocasionan un derrame de líquido hacia los tejidos, produciendo inflamación. Este proceso protector puede estimular a los nervios y ocasionar dolor. Estos cambios, cuando ocurren durante un tiempo limitado en el área pertinente, trabajan en beneficio del cuerpo.
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) es una citocina que es liberada principalmente por los fagocitos mononucleares en respuesta a los inmunoestimuladores. El TNF-a es capaz de incrementar la mayor parte de los procesos celulares como la diferenciación, reclutamiento, proliferación y degradación proteolítica. A niveles bajos, el TNF-a confiere protección contra agentes infecciosos, tumores y daño del tejido. No obstante TNF-a también tiene una función en múltiples enfermedades. Cuando se administra a mamíferos o humanos, el TNF-a ocasiona o agrava la inflamación, fiebre, los efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulación y respuestas en fase aguda semejantes a las que se observan durante las infecciones agudas y los estados de shock. La producción aumentada o no regulada de TNF-a ha sido implicada en diversas enfermedades y estados médicos, por ejemplo, cánceres, como puede ser los tumores sólidos y los tumores portados por la sangre; enfermedad cardiaca, como puede ser la insuficiencia cardiaca congestiva; y enfermedades virales, genéticas, inflamatorias, alérgicas y autoinmunes.
El 3',5'-monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) también desempeña una función en múltiples enfermedades y estados, como pueden ser, más no limitados a asma e inflamación, y otros estados (Lowe and Cheng, Drugs of the Future, 17(9), 799-807, 1992). Se ha demostrado que la elevación de cAMP en los leucocitos inflamatorios inhibe su activación y la liberación subsecuente de mediadores inflamatorios, como puede ser TNF-a y NF-KB. los niveles incrementados de cAMP también da origen a la relajación del músculo liso de las vías respiratorias.
Una interacción bien equilibrada y delicada entre elementos inmunitarios humorales y celulares en la respuesta inflamatoria permite la eliminación de agentes dañinos y el inicio de la reparación del tejido dañado. Cuando se interrumpe esta interacción perfectamente equilibrada, la respuesta inflamatoria puede dar lugar a un daño considerable al tejido normal y puede ser más perjudicial que el insulto original que inició la reacción. En estos casos de respuestas inflamatorias descontroladas, es necesaria la intervención clínica para impedir daño de tejido y disfunción del órgano. Enfermedades tales como psoriasis, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriásica, enfermedad de Crohn, asma, alergias o enfermedad inflamatoria del intestino, se caracterizan por inflamación crónica.
Enfermedades inflamatorias como artritis, estados artríticos relacionados (p. ej., osteoartritis, artritis reumatoide y artritis psoriásica) , enfermedad inflamatoria del intestino (p. ej., enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), sepsis, psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis por contacto y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas también son padecimientos prevalecientes y problemáticos. La producción intensificada o no regulada de TNF-a desempeña una función importante en la respuesta inflamatoria, y la administración de sus antagonistas bloquea las respuestas crónicas y agudas en modelos animales de la enfermedad inflamatoria.
La artritis es una enfermedad autoinmune, sistémica, que puede referirse a un grupo de estados que implican daño a las articulaciones del cuerpo. Existen aproximadamente 100 diferentes formas de artritis. La forma más común es osteoartritis (enfermedad degenerativa de las articulaciones) y otras formas de artritis son artritis reumatoide, artritis psoriásica y enfermedades autoinmunitarias relacionadas como lupus y gota. La artritis reumatoide se caracteriza por inflamación crónica de las articulaciones. Tanto el tejido y líquido sinovial son invadidos por células inflamatorias las cuales conducen a la producción de citocinas. Las células T y los monocitos que infiltran las articulaciones presentan una activación aumentada de los marcadores de la respuesta inmunitaria Tipo 1 y 2. La artritis psoriásica es un estado artrítico inflamatorio crónico que afecta la piel, las articulaciones, los sitios de inserción de tendones, ligamentos y la fascia. Gladman, Curren t Opinión in Rheumatology, "Current concepts in psoriatic arthritis", 2002, 14:361-366, and Ruddy et al, Rheumatology, vol.2., capítulo 71, página 1071, 6a ed., 2001. La artritis psoriásica es asociada comúnmente con psoriasis. Id. Aproximadamente 7% de pacientes con psoriasis presenta artritis psoriásica. The Merck Manual, 448 (17a ed., 1999). La artritis psoriásica puede aparecer con diferentes patrones clínicos. Existen cinco patrones generales de artritis psoriásica: artritis de las articulaciones interfalangeas distales, artritis destructiva, poliartritis simétrica indistinguible de la artritis reumatoide, oligoartritis asimétrica y espondiloartropatía. Ruddy et al., página 1073. Parece ser que la psoriasis precede el inicio de la artritis psoriásica en 60-80% de los pacientes. En ocasiones, la artritis y psoriasis aparecen al mismo tiempo. Erupciones cutáneas pueden ser precedidas por la artropatía.
La psoriasis es una enfermedad autoinmune sistémica y crónica que aparece sobre la piel. Existen cinco tipos de psoriasis: en placa, en gotas, inversa, pustular y eritrodérmica. La forma más común, psoriasis en placa, se observa comúnmente como tonos rojos y blancos de parches escamosos que aparecen sobre la primera capa superficial de la epidermis. Algunos pacientes, no obstante, no tienen síntomas dermatológicos. En la psoriasis en placa, la piel se acumula rápidamente en estos sitios, lo cual le da a esta un aspecto blanco plateado. Las placas frecuentemente se observan sobre la piel de los codos y rodillas, pero pueden afectar cualquier área, como puede ser el cuero cabelludo, las palmas de las manos y las plantas de los pies y los genitales. Contrario a eczema, la psoriasis se encuentra con mayor probabilidad sobre el lado externo de la articulación. El padecimiento es un estado crónico recurrente que varía en intensidad de parches localizados menores hasta cobertura completa del cuerpo. Con mucha frecuencia se afectan las uñas de los dedos y las uñas de los dedos de los pies (distrofia psoriásica de las uñas) y puede observarse como un síntoma aislado. La psoriasis también puede provocar inflamación de las articulaciones, la cual se conoce como artritis psoriásica. En la psoriasis, una hipótesis es que las células T se vuelven activas, migran la dermis y activan la liberación de citocinas, en particular TNF-a, lo cual ocasiona inflamación y la proliferación rápida de los queratinocitos. 2.3 Compuestos Se han hecho diversos estudios con el objetivo de proporcionar compuestos que puedan ser utilizados de manera segura y eficaz para tratar enfermedades asociadas con la producción anormal de TNF-a. Véase, p. ej., Marriott, J.B., et al, Exper t Opin. Biol . Ther., 2001, 1(4): 1-8; G.W. Muller, et al., J Med Chem. , 1996, 39(17): 3238-3240; and G.W. Muller, et al, Bioorg & Med Chem Lett . , 1998, 8: 2669-2674. Algunos estudios se han dirigido a un grupo de compuestos seleccionados por su capacidad para inhibir potentemente la producción de TNF-a a través de las LPS estimuladas por PBMC. L.G. Corral, et al., Ann . Rheum. Dis . , 1999, 58:(Supl I) 1107-1113. Estos compuestos muestran no solo inhibición potente de TNF-a sino también inhibición notable de la producción de ILip e IL12 por los monocitos inducida por LPS. La producción de IL6 inducida por LPS también es inhibida por tales compuestos, aunque en forma parcial. Estos compuestos son estimuladores potentes de la producción de ILlO inducida por LPS. Id.
Los compuestos útiles en los métodos que se proporcionan en la presente pueden ser, más no se limitan ?, las 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)ftalimidas sustituidas y 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos como está descrito en las Patentes U.S. Nos. 6,281,230 y ?,316,471, ambas para G.W. Muller, et al. Todavía otros compuestos específicos que se describen en la presente pertenecen a una clase de isoindol-imidas descritos en las Patentes U.S. Nos. 6,395,754, 6,555,554, 7,091,353, la publicación de Patente U.S. No. 2004/0029832, y la Publicación Internacional No. WO 98/54170, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia. El uso de talidomida, lenalidomida y pomalidomida ha mostrado respuestas notables en pacientes con mieloma múltiple, linfoma y otras enfermedades hematológicas como el síndrome mielodisplásico. Véase Galustian C, et al, Exper t Opin Pharmacother . , 2009, 10: 125-133. Estos fármacos muestran un amplio espectro de actividad, incluso propiedades anti-angiogénicas, modulación de las citocinas proinflamatorias, la co-estimulación de las células T, toxicidad aumentada de las células NK, efectos anti-tumorales directos y modulación de la diferenciación de las células madre.
Por ejemplo, talidomida y lenalidomida han surgido como opciones importantes para el tratamiento de mieloma múltiple en pacientes recién diagnosticados, en pacientes con la enfermedad avanzada que han fracasado en quimioterapia o trasplantes, y en pacientes con mieloma múltiple resistente o refractario. Lenalidomida en combinación con dexametasona ha sido aprobado para el tratamiento de pacientes con mieloma múltiple que han recibido al menos un tratamiento previo.
Pomalidomida también puede ser administrado en combinación con dexametasona. La Publicación de Patente U.S. No. 2004/0029832 Al, la descripción de la cual se incorpora en la presente en su totalidad, describe el tratamiento de mieloma múltiple.
Otro compuesto que se proporciona en la presente es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin- 2,6-diona ("Compuesto B "), el cual tiene la siguiente estructura : o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste.
El compuesto B puede ser preparado de acuerdo con los métodos que se describen en los Ejemplos que se proporcionan en la presente o como se describe en la Patente U.S. No. 7,635,700, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. El compuesto también puede ser sintetizado de acuerdo con otros métodos evidentes para los expertos en la téenica con base en la enseñanza que se indica en la presente. En ciertas modalidades, el Compuesto B es una forma cristalina descrita en la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 61/451,806, presentada el 11 de marzo de 2011, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En algunas modalidades, en los métodos que se proporcionan en la presente se utiliza la sal clorhidrato del Compuesto B. Los métodos para tratar, prevenir y/o manejar cánceres y otras enfermedades utilizando el Compuesto B están descritos en la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 61/451,995, presentada el 11 de marzo de 2011, la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. 2.4 Cereblon La proteína Cereblon (CRBN) es una proteína de 442 aminoácidos conservada de plantas a humanos. En humanos, el gen CRBN ha sido identificado como un gen candidato de un retraso mental no sindrómico, recesivo, autosómico (ARNSMR). Véase Higgins, J.J. et al, Neurology, 2004, 63: 1927-1931. El gen CRBN fue inicialmente caracterizado como una proteína novedosa que contenía RGS que interactuaba con la proteína del canal de potasio activada con calcio (SL01) en el cerebro de rata, y después se demostró que interactúa con un canal de cloruro dependiente del voltaje (CIC-2) en la retina con AMPK7 y DDB1. Véase Jo, S. et al., J. Neurochem, 2005, 94:1212-1224; Hohberger B. et al, FEBS Lett, 2009, 583:633-637; Angers S. et al, Nature, 2006, 443:590-593. DDB1 originalmente fue identificado como una proteína de reparación de la escisión de nucleótidos que se asocia con la proteína de unión al DNA 2 (DDB2) dañada. Su actividad defectuosa ocasiona el defecto en la reparación en pacientes con el grupo de complementación de xeroderma pigmentoso E (XPE). Parece ser que DDBl funciona como un componente de numerosos complejos distintos de DCX (DDB1-CUL4-X-box) E3 ubiquitina-proteína ligasa que intervienen en la ubiquitinación y degradación proteosómica subsiguiente de las proteínas diana. También se ha identificado a CRBN como una diana para el desarrollo de compuestos terapéuticos para enfermedades de la corteza cerebral. Véase WO 2010/137547 Al.
La proteína cereblon recientemente ha sido identificada como una diana molecular clave que se une a talidomida para provocar defectos de nacimiento. Véase Ito, T. et al, Science, 2010, 327: 1345-1350. Se encontró que DDBl interactúa con CRBN y, de este modo, fue asociado indirectamente con talidomida. Además, talidomida fue capaz de inhibir 1 auto-ubiquitinación de CRBN in vi tro, sugiriendo que talidomida es un inhibidor de la E3 ubiquitina-ligasa. Id. Es importante señalar que esta actividad fue inhibida por talidomida en células tipo nativo, pero no en células con sitios de unión de CRBN mutados que impiden la unión de talidomida. Id. El sitio de unión de talidomida fue mapeado a una región de 104 aminoácidos en el extremo C-terminal altamente conservados en CRBN. Id. Cada una de las mutaciones puntuales de CRBN, Y384A y W386A eran defectuosas para la unión de talidomida, teniendo el mutante puntual doble la más baja actividad de unión a talidomida. Id. En modelos animales de pez cebra y embriones de pollo se confirmó un vinculo entre CRBN y el efecto teratogénico de talidomida. Id.
Todavía debe establecerse si para los efectos benéficos de talidomida y otros fármacos es necesaria la unión a CRBN, el complejo CRBN E3 ubiquitina-ligasa o uno o más sustratos de CRBN. La comprensión de estas interacciones con talidomida y otras dianas farmacológicas permitirá hacer la definición de los mecanismos moleculares de la eficacia y/o toxicidad y puede dar lugar a obtener fármacos con mejores perfiles de eficacia y toxicidad. 2.5 Métodos para tratar cáncer El tratamiento contra cáncer actual puede involucrar cirugía, quimioterapia, terapia hormonal y/o tratamiento de radiación para erradicar las células neoplásicas en un paciente (véase, por ejemplo, Stockdale, 1998, Medicine, vol. 3, Rubenstein and Federman, eds., Capítulo 12, Sección IV). En fechas recientes, el tratamiento contra cáncer también puede involucrar terapia biológica o inmunoterapia. Todos estos abordajes pueden presentar desventajas importantes para el paciente. La cirugía, por ejemplo, puede estar contraindicada debido a la salud de un paciente o puede ser inaceptable para un paciente. Además, es muy probable que la cirugía no remueva completamente el tejido neoplásico. La terapia de radiación es solo eficaz cuando el tejido neoplásico muestra una mayor sensibilidad a la radiación que el tejido normal. La terapia de radiación también puede desencadenar muchas veces efectos colaterales serios. La terapia hormonal se da en raras ocasiones como un solo compuesto. Aunque la terapia hormonal puede ser eficaz, muchas veces se utiliza para prevenir o retardar la recurrencia del cáncer después de que otros tratamientos han removido la mayor parte de las células cancerosas. Ciertos tratamientos biológicos y otros son limitados y pueden producir efectos colaterales como rash o inflamación, síntomas tipo influenza, incluso fiebre, escalofrío y fatiga, problemas de las vías digestivas o reacciones alérgicas.
Con respecto a la quimioterapia, existe una variedad de compuestos quimioterapéuticos disponibles para el tratamiento de cáncer. Algunos compuestos quimioterapéuticos contra cáncer actúan inhibiendo la síntesis del DNA, en forma directa o indirecta inhibiendo la biosíntesis de los precursores de trifosfato desoxirribonucleótido para impedir la replicación del DNA y la división celular concomitante. Gilman et al., Goodman and Gilman ' s : The Pharmacological Basis of Therapeutics , 10a Ed. (McGraw Hill, New York).
A pesar de la disponibilidad de una serie de compuestos quimioterapéuticos, la quimioterapia presenta múltiples desventajas. Stockdale, Medicine, vol . 3, Rubenstein and Federman, eds., ch.12, sección 10, 1998. Casi todos los compuestos quimioterapéuticos son tóxicos y la quimioterapia ocasiona efectos colaterales significativos y muchas veces peligrosos como náusea severa, depresión de la médula ósea e inmunosupresión. Además, aún con la administración de combinaciones de compuestos quimioterapéuticos, muchas células tumorales son resistentes o presentan resistencia a los compuestos quimioterapéuticos. De hecho, aquellas células resistentes a los compuestos quimioterapéuticos específicos que se utilizan en el protocolo de tratamiento muchas veces demuestran ser resistentes a otros fármacos, aún si aquellos compuestos actúan por mecanismos diferentes a los de los fármacos que se utilizan en el tratamiento específico. A este fenómeno se le conoce como resistencia a múltiples fármacos. Debido a la resistencia al fármaco, muchos cánceres son refractarios a los protocolos de tratamiento quimioterapéutico normales.
Otras enfermedades o estados asociados con, o caracterizados por angiogénesis no deseada, también son difíciles de tratar. Sin embargo, algunos compuestos como protamina, hepaina [sic] y esteroides han sido propuestos como útiles para el tratamiento de ciertas enfermedades específicas asociadas con, o caracterizadas por, angiogénesis no deseada. Taylor et al, Nature 297:307 (1982); Folkman et al, Science 221:719 (1983); y las Patentes U.S. Nos. 5,001,116 y 4,994,443. El uso de talidomida y algunos derivados de talidomida con base en sus múltiples actividades también ha sido propuesto para el tratamiento de tales enfermedades y estados. Patentes U.S. Nos. 5,593,990, 5,629,327, 5,712,291, 6,071,948 y 6,114,355 para D'Amato.
Todavía, existe una necesidad significativa de métodos seguros y eficaces para tratar, prevenir y manejar cáncer y otras enfermedades que son refractarias a los tratamientos normalizados como cirugía, terapia de radiación, quimioterapia y terapia hormonal, que disminuyen o eviten al mismo tiempo las toxicidades y/o efectos secundarios asociados con las terapias tradicionales. 2.6 Métodos de tratamiento de las enfermedades inflamatorias Los tratamientos actuales para las enfermedades y trastornos inflamatorios involucran los medicamentos sintomáticos y compuestos in unosupresores para controlar los síntomas. Por ejemplo, los fármacos anti inflamatorios no esteroides (NSAID) como aspirina, ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, tolmetina, sulindaco, meclofenamato sodio, piroxicam, flurbiprofeno, diclofenaco, oxaprozina, nabumetona, etodolaco y ketoprofeno tienen efectos analgésicos y anti inflamatorios. Sin embargo, se considera que los NSAID no son capaces de alterar el progreso de la enfermedad. (Tierncy et al. (eds), Curren t Medical Diagnosis & Treatment, 37 ed., Appleton & Lange (1998), p 793). Más aún, los NSAID con mucha frecuencia causan efectos secundarios gastrointestinales, afectan la vía intestinal inferior ocasionando perforación o agravando la enfermedad inflamatoria del intestino, producen toxicidad renal y prolongan el tiempo de sangrado. Los corticosteroides son otra clase de fármacos que se utilizan comúnmente para controlar los síntomas inflamatorios. Los corticosteroides, al igual que los NSAID, no alteran el progreso natural de la enfermedad, y de este modo, las manifestaciones clínicas de la enfermedad activa comúnmente reaparecen cuando se interrumpe la administración del fármaco. El problema serio de las reacciones no deseadas resultantes del tratamiento prolongado con corticosteroides (p. ej., osteoporosis, riesgo aumentado de infecciones, apetito aumentado, hipertensión, edema, úlceras pépticas, psicosis) limita en gran medida su uso durante largo tiempo.
Las dosis bajas de los compuestos inmunosupresores como los compuestos citotóxicos pueden utilizarse para el tratamiento de los trastornos inflamatorios. Por ejemplo, algunos tratamientos de psoriasis y artritis se basan en fármacos anti-reumáticos modificadores de la enfermedad (los DMARD, como puede ser ciclosporina A y metotrexato), compuestos anti-inflamatorios (inhibidores de TNF-a como etanercept), y analgésicos.
Se están buscando continuamente nuevos tratamientos para los padecimientos inflamatorios y autoinmunes. En particular. Se está buscando continuamente cualquier nuevo tratamiento que disminuya la dosis y/o la frecuencia de la administración de los compuestos que actualmente se utilizan, o que sea capaz de hacer más eficaz un tratamiento actualmente utilizado. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En la presente se proporcionan los usos de la proteína cereblon (CRBN) como un predictor de la sensibilidad clínica frente a cáncer y enfermedades inflamatorias, y de la respuesta de un paciente al tratamiento con los compuestos que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, los compuestos que se proporcionan en la presente se unen directamente a CRBN- DDBl.
También se proporcionan en la presente los métodos para el tratamiento o manejo de cáncer y enfermedades inflamatorias utilizando CRBN como factor predictivo o pronóstico para los compuestos que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, en la presente se proporcionan los métodos para explorar o identificar a pacientes con cáncer, p. ej., pacientes con mieloma múltiple, DLBCL, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica y/o MDS, para el tratamiento con talidomida, lenalidomida y/o pomalidomida, utilizando los niveles de CRBN como factor de predicción o pronóstico. En algunas modalidades, en la presente se proporcionan los métodos para seleccionar a pacientes que tengan una mayor tasa de respuesta al tratamiento con talidomida, lenalidomida y/o pomalidomida, utilizando como factor de predicción o pronóstico los niveles de CRBN.
En una modalidad, en la presente se proporciona un método para predecir la respuesta de un paciente frente al tratamiento de cáncer o una enfermedad inflamatoria con talidomida, lenalidomida y/o pomalidomida, el método consiste en obtener material biológico del paciente y medir la presencia o ausencia de CRBN.
En una modalidad, el mRNA o la proteína se purifican a partir del tumor, y la presencia o ausencia de un biomarcador se mide por análisis de la expresión génica o de la proteína. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de un biomarcador se mide por análisis PCR en tiempo real, cuantitativa (QRT-PCR), microarreglo , citometría de flujo o in unofluorescencia. En otras modalidades, la presencia o ausencia de un biomarcador se mide utilizando las metodologías basadas en el ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA) u otros métodos semejantes conocidos en la téenica. Los biomarcadores asociados con linfomas no Hodgkin están descritos, por ejemplo, en la Publicación de la Patente U.S. No. 2011/0223157, la totalidad de la cual se incorpora para la referencia en su totalidad.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para predecir la respuesta de un paciente al tratamiento en un paciente de cáncer, el método consiste en obtener células cancerosas del paciente, cultivar las células en presencia o ausencia de un compuesto que se proporciona en la presente, purificar la proteína o RNA de las células cultivadas, y medir la presencia o ausencia de un biomarcador mediante, p. ej., el análisis de la expresión de la proteína o gen. La expresión vigilada puede ser, por ejemplo, la expresión del mRNA o la expresión de la proteína. En una modalidad, el paciente de cáncer es un paciente de linfoma, leucemia, mieloma múltiple, tumor sólido, linfoma no Hodgkin, DLBCL, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para vigilar la respuesta de un tumor frente a un tratamiento con compuesto (p. ej., fármaco) en un paciente de cáncer. El método consiste en obtener una muestra biológica del paciente, medir la expresión de un biomarcador en la muestra biológica, administrar uno o más compuestos (p. ej., fármacos) al paciente, después obtener una segunda muestra biológica del paciente, medir la expresión del biomarcador en la segunda muestra biológica y comparar los niveles de expresión, donde un nivel aumentado de la expresión del biomarcador después del tratamiento indica la probabilidad de una respuesta eficaz del tumor. En una modalidad, el paciente de cáncer es un paciente de linfoma, leucemia, mieloma múltiple, tumor sólido, linfoma no Hodgkin, DLBCL, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma.
En una modalidad, un nivel disminuido de la expresión del biomarcador después de tratamiento indica la probabilidad de una respuesta eficaz del tumor. La expresión del biomarcador vigilada puede ser, por ejemplo, la expresión de mRNA o la expresión de proteína. La expresión en la muestra tratada puede aumentar, por ejemplo, en aproximadamente 1.5X, 2.0X, 3X, 5X o más. En una modalidad, el tumor es un linfoma, leucemia, mieloma múltiple, tumor sólido, linfoma no Hodgkin, DLBCL o melanoma.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para predecir la sensibilidad al tratamiento con un compuesto (p. ej., fármaco) en un paciente de cáncer, específicamente, un paciente de mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin (p. ej., DLBCL). El método consiste en obtener una muestra biológica del paciente, como una opción aislar o purificar el mRNA de la muestra biológica, amplificar los transcritos de mRNA, p. e ., por RT-PCR, donde un mayor nivel basal de un biomarcador específico indica una mayor probabilidad que el cáncer será sensible al tratamiento con un compuesto (p. ej., fármaco). En ciertas modalidades, el biomarcador es un gen o proteína asociada con mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin (p. ej., DLBCL). En una modalidad, los genes se seleccionan del grupo que consiste en DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FASl, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y NFKB.
En una modalidad, la identificación de un paciente que tenga linfoma, leucemia, mieloma múltiple, tumor sólido, linfoma no Hodgkin, DLBCL, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma sensible al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y/o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)- piperidin-2,6-diona, consiste en identificar un gen o proteína asociada con CRBN. En una modalidad, el gen o proteína asociada con CRBN se selecciona del grupo que consiste en DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y NFKB.
En una modalidad, la identificación de un paciente que tenga linfoma, leucemia, mielo a múltiple, tumor sólido, linfoma no Hodgkin, DLBCL o melanoma sensible al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y/o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona consiste en medir el nivel de la actividad de CRBN en el paciente. En otra modalidad, medir el nivel de la actividad de CRBN en el paciente consiste en medir DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y/o NFKB en las células obtenidas del paciente.
En todavía otras modalidades, en la presente se proporcionan los métodos para predecir la sensibilidad al tratamiento de un compuesto (p. ej., fármaco) en un paciente que tenga una enfermedad o trastorno seleccionado de lupus eritematoso sistémico, vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, Myasthenia Grave, síndrome de Sjogren, 2 síndrome anti-fosfolípidos , artritis reumatoide y estados fibróticos como esclerosis sistémica. El método consiste en obtener una muestra biológica del paciente, como una opción aislar o purificar el mRNA de la muestra biológica, amplificar los transcritos de RNA por, p. ej., RT-PCR, donde un mayor nivel basal de un biomarcador específico indica una mayor probabilidad que la enfermedad o trastorno será sensible al tratamiento con un compuesto (p. ej., fármaco). En ciertas modalidades, el biomarcador es un gen o proteina seleccionado del grupo que consiste en DDB1, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH , AMPK, IRF4 y NFKB.
En una modalidad, la identificación de un paciente que tenga lupus eritematoso sistémico, Vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, Myasthenia grave, Síndrome de Sjogren, síndrome anti-fosfolípidos, artritis reumatoide o esclerosis sistémica y sensible al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y/o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, consiste en identificar un gen o proteína asociada con CRBN. En una modalidad, el gen o proteína asociada con CRBN se selecciona del grupo que consiste en DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y NFKB.
En una modalidad, la identificación de un paciente que tenga lupus eritematoso sistémico, vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, Myasthenia grave, Síndrome de Sjogren, síndrome anti-fosfolípidos, artritis reumatoide o esclerosis sistémica sensible al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y/o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona consiste en medir el nivel de la actividad de CRBN en el paciente. En otra modalidad, medir el nivel de actividad de CRBN en el paciente consiste en medir DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FASl, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y/o NFKB en las células obtenidas del paciente.
En una modalidad, el compuesto es talidomida.
En otra modalidad, el compuesto es lenalidomida.
En otra modalidad, el compuesto es pomalidomida.
En otra modalidad, el compuesto es 3- ( 5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il ) -piperidin-2 , 6-diona, o un enantiómero de éste, o una sal, polimorfo, solvato o hidrato aceptado para uso farmacéutico de éste.
También en la presente se proporcionan los kits o equipes útiles para predecir la probabilidad de un tratamiento eficaz contra linfoma, leucemia, mieloma múltiple, a tumor sólido, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma o para vigilar la eficacia de un tratamiento con uno o más compuestos (p. ej., fármacos). El kit consiste en un soporte, y un medio para detectar la expresión de proteína de al menos un biomarcador en una muestra biológica. Tal puede emplear, por ejemplo, una varilla de nivel, una membrana, un chip, un disco, una tira reactiva, un filtro, una microesfera, un portaobjetos, una placa de múltiples pozos, o una fibra óptica. El soporte sólido del kit puede ser, por ejemplo, un plástico, Silicon [sic], un metal, una resina, vidrio, una membrana, una partícula, un precipitado, un gel, un polímero, una hoja, una esfera, un polisacárido, un capilar, una película, una placa o un portaobjetos. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, un cultivo de células, una línea celular, un tejido, un tejido oral, tejido gastrointestinal, un órgano, un organelo, un fluido biológico, una muestra de sangre, una muestra de orina, o una muestra de piel. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una biopsia de ganglio linfático, una biopsia de médula ósea o una muestra de células tumorales de sangre periférica.
En otra modalidad, el kit consiste en un soporte sólido, ácidos nucleicos que hagan contacto con el soporte, donde los ácido nucleicos sean complementarios a al menos 20, 50, 100, 200, 350, o más bases del mRNA, y un medio para detectar la expresión del mRNA en la muestra biológica.
En ciertas modalidades, los kits que se proporcionan en la presente emplean medios para detectar la expresión de un biomarcador por análisis PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR), microarreglo , citometría de flujo o inmunofluorescencia . En otras modalidades, la expresión del biomarcador se mide por metodologías basadas en ELISA u otros métodos semejantes conocidos en la téenica.
En todavía otras modalidades, los kits que se proporcionan en la presente son útiles para predecir la probabilidad de un tratamiento efectivo de una enfermedad o trastorno seleccionado de lupus eritematoso sistémico, Vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, Myasthenia grave, síndrome de Sjogren, síndrome anti-fosfolípidos, artritis reumatoide y estados fibróticos como esclerosis sistémica. Además de los métodos que se describen en lo anterior, se administra un compuesto que se proporciona en la presente combinado con un tratamiento utilizado tradicionalmente para tratar, prevenir o manejar una enfermedad o trastorno descrito en la presente. Los ejemplos de tales terapias tradicionales pueden ser, más no se limitan a, cirugía, quimioterapia, terapia de radiación, terapia hormonal, terapia biológica e inmunoterapia.
También se proporcionan en la presente las composiciones farmacéuticas, las formas farmacéuticas unitarias individuales, las pautas de dosificación y los kits que contienen un compuesto que se proporciona en la presente o una sal, solvato, hidrato, estereoisómero, clatrato aceptado para uso farmacéutico o profármaco de éste, y un segundo compuesto activo o adicional. Los segundos compuestos activos pueden ser combinaciones específicas, o "cocteles" de fármacos. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A y IB: Confirmación del silenciamiento génico de CRBN mediante los siRNA en células de mieloma múltiple H929 y U266.
Figuras 2A - 2C: Silenciamiento génico del arresto de G1 abrogado por CRBN inducido por lenalidomida ("Len"), pomalidomida ("Pom") y el Compuesto B.
Figura 3A: Silenciamiento del gen CRBN en células U266B1 confirmado por RT-PCR.
Figura 3B: El silenciamiento del gen CRBN abroga el efecto de lenalidomida y pomalidomida en el ciclo celular de células U266.
Figuras 3C y 3D: Silenciamiento de CRBN impide el aumento de p21WAF1 en células U266 tratadas con lenalidomida y pomalidomida, detectado por RT-PCR y análisis western blot.
Figuras 4A - 4D: El silenciamiento de CRBN anula el efecto farmacológico sobre la fosforilación de pRb e IRF- 4 en células H929.
Figuras 5A - 5C: Ciclo celular y perfiles de la expresión génica en células U266B1 transfectadas con el siRNA de CRBN.
Figuras 6A - 6D: El silenciamiento de DDBl afectó solo parcialmente el retardo del ciclo celular inducido por lenalidomida y po alidomida en células U266.
Figuras 7A y 7B: Lenalidomida y pomalidomida disminuyen la poliubiquitinación ligada a K48 total pero no la ubiquitinación ligada a K-63 en células H929 .
Figura 8: Ubiquitinación con regulación ascendente 1 hora, sin MG132.
Figura 9: Ubiquitinación con regulación ascendente 4 horas, sin MG132.
Figura 10: Ubiquitinación con regulación ascendente 1 hora, MG132.
Figura 11: Ubiquitinación con regulación ascendente 4 horas, MG132.
Figuras 12A - 12D: Efecto del silenciamiento de CRBN sobre los niveles de TNFa e IL-2 en células T.
Figuras 13A - 13C: Efecto de CUL4A y el silenciamiento del CUL4A sobre los niveles de TNFa e IL-2 en células T.
Figura 14: Actividad antiproliferativa de lenalidomida frente a la expresión de CRBN en células DLBCL.
Figura 15A: Mapa del clon CRBN_034.
Figura 15B: Mapa del clon DDB1_004.
Figura 16A: Actividad antiproliferativa de lenalidomida en células del mieloma sensibles a CRBN.
Figura 16B: Actividad antiproliferativa de pomalidomida en células de mieloma sensibles a CRBN.
Figura 16C: Actividad antiproliferativa del Compuesto B en células de mieloma sensibles a CRBN.
Figura 17 : Péptidos regulados por lenalidomida ("Len") y pomalidomida ("Pom") sin MG132 en experimentos de ubiquitinación de 1 hora.
Figura 18: Péptidos regulados por lenalidomida ("Len") y pomalidomida ("Pom") con MG132 en experimentos de ubiquitinación de 1 hora.
Figura 19 : Péptidos regulados por lenalidomida ("Len") y pomalidomida ("Pom") con MG132 en experimentos de ubiquitinación de 4 horas.
Figura 20: Péptidos regulados por lenalidomida ("Len") y pomalidomida ("Pom") con MG132 en experimentos de ubiquitinación de 4 horas.
Figura 21: Tabla de los péptidos comunes entre lenalidomida ("Len") y pomalidomida ("Pom") en experimentos de ubiquitinación.
Figura 22: Tabla de aciertos comunes en múltiples experimentos de ubiquitinación con lenalidomida ("Len") y pomalidomida ("Pom").
Figura 23: Datos de Ubiscan para lenalidomida ("Len" o "Rev"), pomalidomida ("Pom"), y el Compuesto B.
Figura 24A: Genes firma de ABC-DLBCL.
Figura 24B: Actividad de NF-kB y actividad de IRF4 en células DLBCL.
Figura 24C: "Puntuaciones ABC" de las líneas de células DLBCL.
Figura 25: Lenalidomida inhibe la proliferación de células ABC-DLBCL in vi tro.
Figura 26: El tratamiento con lenalidomida también indujo apoptosis de las líneas de células sensibles como OCI-LylO.
Figures 27A - 27C: Efecto de Lenalidomida sobre la expresión de IRF4 en líneas de células ABC-DLBCL.
Figura 28: Análisis de la mutación del dominio 1 tipo coiled-coil de CARD 11 en las líneas de células DLBCL.
Figuras 29A - 29C: Lenalidomida inhibe la activación del complejo CARD ll-Bcl-10-MALT 1 en líneas de células DLBCL sensibles.
Figuras 30A - 30C: Lenalidomida inhibe la actividad de NF-kB en células ABC-DLBCL.
Figuras 31A - 3ID: Alteración de la expresión de IRF4 en células ABC-DLBCL afecta la sensibilidad celular frente a lenalidomida.
Figuras 32A - 32D: La regulación descendente de IRF4, NF-kB y proliferación por lenalidomida requiere la presencia de cereblon.
Figuras 33A- 33B: Lenalidomida inhibe el crecimiento de tumor en el modelo de xenoinjerto de ratón con OCI-LylO ABC-DLBCL.
Figuras 34A - 34B: "Puntuaciones ABC" y niveles básales de IRF4/CRBN correlacionan la sensibilidad de las células DLBCL a lenalidomida.
Figura 35: Alineamiento entre las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de los anticuerpos CGN-6-1-11 (superior; ID SEC NO: 5) y CGN-6-4-5 (inferior; ID SEC NO: 8).
Figuras 36: Alineamiento entre las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de los anticuerpos CGN-6-1-11 (superior; ID SEC NO: 7) y CGN-6-4-5 (inferior; ID SEC NO: 11).
Figuras 37A y 37B: Análisis inmunofluorescente confocal de células DF15 (panel izquierdo) y células DF15R (panel derecho) utilizando 1 mg/mL de anticuerpo CGN-6-4-5 (verde) (A) o la mezcla de anticuerpos CGN-6-4-5/péptido bloqueador de CRBN (relación 1:5 en exceso) (B). Tinción nuclear realizada con Dapi (azul).
Figura 38: Análisis Inmunoabsorbente con células de mieloma que contienen CRBN (DF15) endógeno, células DF15R sin CRBN y células HEK293 que expresan CRBN con etiqueta flag, recombinante.
Figura 39A y 39B: Unión de talidomida y otros compuestos a CRBN 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos que se proporcionan en la presente se basan, en parte, en el descubrimiento que cereblon se asocia con las actividades anti-proliferativas de ciertos fármacos, como pueden ser los compuestos que se proporcionan en la presente. En algunas modalidades, Cereblon (CRBN) puede ser utilizado como un biomarcador para indicar la eficacia o progreso de un tratamiento de una enfermedad con un compuesto que se proporciona en la presente.
Sin apegarse a alguna teoría particular, la unión de CRBN puede contribuir a o incluso ser necesaria para las actividades anti-proliferativas u otras de ciertos compuestos, como pueden ser los compuestos que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, los compuestos que se proporcionan en la presente se unen directamente a CRBN-DDBl y/o el complejo CRBN E3 ubiquitina-ligasa. Las mutaciones en CRBN podrían estar asociadas con la resistencia a los compuestos que se proporcionan en la presente.
Por ejemplo, los niveles de CRBN fueron significativamente menores en la línea de células resistentes a pomalidomida DF15R y en las células resistentes a lenalidomida, H929 R10-1, H929 R10-2, H929 R10-3, H929 R10-4 y MMl/R en comparación con las líneas parentales compatibles. Más aún, se encontró una mutación interesante en el gen CRBN de una de las líneas de mieloma que había adquirido resistencia a lenalidomida mientras en la línea parental el gen CRBN era tipo nativo. Esta mutación se mapeó para el dominio de unión DDBl en CRBN. Así pues, en ciertas modalidades, la sensibilidad de una célula cancerosa, p. ej., una célula de mieloma, o un paciente que tenga cáncer, frente al tratamiento con un compuesto que se proporciona en la presente está relacionada con la expresión de CRBN.
En el linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) recidivante o refractario, las respuestas más altas fueron observadas en el subtipo tipo células B activadas (ABC) en comparación con el subtipo tipo células B del centro germinal. Como lo dispuesto en el presente documento utilizando las líneas de células DLBCL, se demostró que el tratamiento con lenalidomida suprimió preferoncialmente la proliferación de células ABC-DLBCL in vi tro y retardó el crecimiento del tumor en un modelo de xenoinjerto de tumor humano, con un efecto mínimo sobre las células no ABC-DLBCL. Este efecto tumoricida fue asociado con la regulación negativa del factor regulador del interferon 4 (IRF4), característico de las células ABC-DLBCL.
La inhibición de IRF4 por lenalidomida ocasionó una regulación negativa de la activación de NF-kB dependiente del receptor de células B (BCR). Aunque el siR A específico de IRF4 imitaba los efectos de la lenalidomida disminuyendo la activación de NF-kB, la sobreexpresión de IRF4 aumentó la activación de NF-kB y confirió resistencia frente a lenalidomida. Además, la regulación negativa de IRF4 inducida por lenalidomida requirió de la expresión de CRBN. Sin apegarse a alguna teoría específica, estos datos muestran que lenalidomida puede tener actividad antitumoral directa contra células DLBCL, preferencialmente contra células ABC-DLBCL, bloqueando la expresión de IRF4 y la vía de la señalización de BCR-NF-KB en una forma dependiente de CRBN.
Se ha propuesto que la proteína CRBN funciona como un receptor de sustrato para los complejos Cul4-E3-ligasa mediante su interacción con DDBl. Como se menciona en la presente, se ha investigado si la ubiquitinación in vivo está asociada con respuestas farmacológicas en células de mieloma múltiple. En células H929, los compuestos que se proporcionan en la presente disminuyen la poliubiquitinación total ligad a K48 pero no la ubiquitinación ligada a K-63 después de un tratamiento durante 30 minutos. En la actualidad, se ha documentado que casi dos docenas de proteínas han de ser degradadas por Cul4-DDBl ligasa 2. Diversos estudios han demostrado ubiquitinación dependiente de Cul4/DDB1 de las histonas core o nucleares, las proteínas para la reparación del DNA, reguladores del ciclo celular y moléculas de las vías de señalización clave. La señalización de mTORCl requiere la función proteosómica y la implicación de CUL4-DDB1 ubiquitina E3 ligasa. Utilizando la teenología CST Ubiscan, 162 péptidos de ubiquitina únicos fueron identificados -los cuales eran significativamente modulados por los compuestos que se proporcionan en la presente después de tratamientos cortos (1-4 h). Las proteínas correspondientes participan en la función del nucleasoma y cromatina, el montaje del DNA de la proteína y la histona H2A. Está en investigación la importancia de esta modificación temprana en el modo de acción de los compuestos que se proporcionan en la presente, y la relación con las actividades de CRBN y CUL4/DDB1.
En la presente se proporcionan los métodos para el tratamiento o manejo de cáncer y enfermedades inflamatorias utilizando CRBN como un factor predictivo o pronóstico para los compuestos que se proporcionan en la presente. En ciertas modalidades, en la presente se proporcionan los métodos para explorar o identificar a pacientes con cáncer, p. ej., a pacientes de linfoma, leucemia, mieloma múltiple, tumor sólido, linfoma no Hodgkin, DLBCL, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma, para el tratamiento con talidomida, lenalidomida y/o pomalidomida, utilizando los niveles de CRBN como un factor de predicción o pronóstico. En algunas modalidades, en la presente se proporcionan los métodos para seleccionar a pacientes que tengan una mayor tasa de respuesta frente al tratamiento con talidomida, lenalidomida y/o pomalidomida, empleando los niveles de CRBN como un factor de predicción o pronóstico.
En una modalidad, en la presente se proporciona un método para predecir la respuesta de un paciente frente al tratamiento de cáncer o una enfermedad inflamatoria con talidomida, lenalidomida y/o pomalidomida, el método consisten en obtener material biológico del paciente y medir la presencia o ausencia de CRBN.
En una modalidad, el mRNA o proteína se purifica del tumor y se mide la presencia o ausencia del biomarcador mediante el análisis de la expresión del gen o proteína. En ciertas modalidades, la presencia o ausencia de un biomarcador se mide por PCR en tiempo real, cuantitativa (QRT-PCR), microarreglo , citometría de flujo o inmunofluorescencia. En otras modalidades, la presencia o ausencia del biomarcador se mide por metodologías basadas en el ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA) u otros métodos semejantes conocidos en la téenica.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para predecir la sensibilidad a un tratamiento con un compuesto (p. ej., fármaco) en un paciente de cáncer, como puede ser un paciente de mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin. El método consiste en obtener una muestra biológica del paciente, como una opción aislar o purificar mRNA de la muestra biológica, amplificar los transcritos de mRNA por, p. ej., RT-PCR, donde un nivel basal mayor de un biomarcador específica indica una mayor probabilidad que el cáncer será sensible al tratamiento con un compuesto (p. ej., fármaco). En ciertas modalidades, el biomarcador es un gen o proteína asociada con mieloma múltiple o linfoma no Hodgkin (p. ej., DLBCL). En una modalidad, los genes se seleccionan del grupo que consiste en: DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y NFKB.
En una modalidad, la identificación de un paciente que tenga linfoma, leucemia, mieloma múltiple, un tumor sólido, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma sensible al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y/o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, consiste en identificar un gen o proteína asociada con CRBN. En una modalidad, el gen o proteína asociada con CRBN se selecciona del grupo que consiste en DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y NFKB.
En una modalidad, la identificación de un paciente que tenga linfoma, leucemia, mielo a múltiple, tumor sólido, linfoma no Hodgkin, DLBCL, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, MDS o melanoma sensible al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y/o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona consiste en medir el nivel de la actividad de CRBN en el paciente. En otra modalidad, medir el nivel de la actividad de CRBN en el paciente consiste en medir DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y/o NFKB en las células obtenidas del paciente.
En una modalidad, el compuesto es talidomida.
En otra modalidad, el compuesto es lenalidomida.
En otra modalidad, el compuesto es pomalidomida.
En otra modalidad, el compuesto es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, o un enantiómero de éste, o una sal, polimorfo, solvato o hidrato aceptado para uso farmacéutico de éste.
En una modalidad, el cáncer es mieloma múltiple.
En otra modalidad, el cáncer es linfoma no Hodgkin. En una modalidad, el linfoma no Hodgkin es del fenotipo de células B activadas.
En otra modalidad, el cáncer es linfoma difuso de células B grandes. En una modalidad, el linfoma difuso de células B grandes es del fenotipo de células B activadas.
En otra modalidad, el cáncer es linfoma de células del manto.
En otra modalidad, el cáncer es linfoma folicular.
En otra modalidad, el cáncer es leucemia mieloide aguda.
En otra modalidad, el cáncer es leucemia linfocítica crónica.
En otra modalidad el cáncer es síndrome mielodisplásico.
En otra modalidad, el cáncer es melanoma.
En todavía otras modalidades, en la presente se proporcionan los métodos para predecir la sensibilidad frente a un tratamiento con un compuesto (p. ej., fármaco) en un paciente que tenga una enfermedad o trastorno seleccionado de lupus eritematoso sistémico, vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, Myasthenia grave, síndrome de Sjogren, síndrome anti-fosfolípidos, artritis reumatoide y estados fibróticos como esclerosis sistémica. El método consiste en obtener una muestra biológica del paciente, como una opción aislar o purificar mRNA de la muestra biológica, amplificar los transcritos de mRNA por, p. ej., RT-PCR, donde un mayor nivel basal de un biomarcador específico indica una mayor probabilidad que la enfermedad o trastorno será sensible al tratamiento con un compuesto (p. ej., fármaco). En ciertas modalidades, el biomarcador es un gen o proteína seleccionada del grupo que consiste en DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y NFKB.
En una modalidad, la identificación del paciente que tenga una enfermedad o trastorno seleccionado de lupus eritematoso sistémico, vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, Myasthenia grave, Síndrome de Sjogren, síndrome anti-fosfolípidos, artritis reumatoide o esclerosis sistémica sensible al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y/o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona consiste en la identificación de un gen o proteína asociada con CRBN. En una modalidad, el gen o proteína asociada con CRBN se selecciona del grupo que consiste en DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 y NFKB.
En una modalidad, la identificación de un paciente que tenga lupus eritematoso sistémico, vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, Myasthenia grave, Síndrome de Sjogren, síndrome anti-fosfolípidos, artritis reumatoide o esclerosis sistémica sensible al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida y/o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona consiste en medir el nivel de actividad de CRBN en el paciente. En otra modalidad, medir el nivel de actividad de CRBN en el paciente consiste en medir DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, CBR-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMRK, IRF4 y/o NFKB en las células obtenidas del paciente.
En una modalidad, el compuesto es talidomida.
En otra modalidad, el compuesto es lenalidomida.
En otra modalidad, el compuesto es pomalidomida.
En otra modalidad, el compuesto es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, o un enantiómero de éste, o una sal, polimorfo, solvato o hidrato aceptado para uso farmacéutico de éste.
También se proporcionan en la presente los kits útiles para predecir la probabilidad de un tratamiento eficaz contra linfoma, leucemia, mieloma múltiple, tumor sólido, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de células del manto, linfoma folicular, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, síndrome mielodisplásico o melanoma o para vigilar la eficacia de un tratamiento con uno o más compuestos (p. ej., fármacos). El kit consiste en un soporte sólido, un medio para detectar la expresión de proteínas de al menos un biomarcador en una muestra biológica. Tal kit puede emplear, por ejemplo, una varilla de nivel, una membrana, un chip, un disco, una tira reactiva, un filtro, una microesfera, un portaobjetos, una placa de múltiples pozos o una fibra óptica. El soporte sólido del kit puede ser, por ejemplo, un plástico, Silicon [sic], un metal, una resina, vidrio, una membrana, una partícula, un precipitado, un gel, un polímero, una hoja, una esfera, un polisacárido, un capilar, una película, una placa o un portaobjetos. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, un cultivo celular, una línea celular, un tejido oral, tejido gastrointestinal, un órgano, un organelo, un fluido biológico, una muestra de sangre, una muestra de orina o una muestra de piel. La muestra biológica puede ser, por ejemplo, una biopsia de ganglio linfático, una biopsia de médula ósea o una muestra de células tumorales de sangre periférica. En otra modalidad, el kit contiene un soporte sólido, ácidos nucleicos en contacto con el soporte, donde los ácidos nucleicos son complementarios a al menos 20, 50, 100, 200, 350 o más bases del mRNA, y un medio para detectar la expresión del mRNA en una muestra biológica.
En ciertas modalidades, los kits que se proporcionan en la presente emplean medios para detectar la expresión de un biomarcador y PCR en tiempo real, cuantitativa (QRT-PCR), microarreglo, citometría de flujo o inmunofluorescencia. En otras modalidades, la expresión del biomarcador es medida por metodologías a base de ELISA u otros métodos semejantes conocidos en la téenica.
En todavía otras modalidades, los kits que se proporcionan en la presente son útiles para predecir la probabilidad de un tratamiento eficaz de una enfermedad o trastorno seleccionado de lupus eritematoso sistémico, vasculitis inducida por ANCA, glomerulonefritis, granulomatosis de Wegener aguda, Myasthenia grave, Síndrome de Sjogren, síndrome anti-fosfolípidos, artritis reumatoide y estados fibróticos como esclerosis sistémica.
En la presente se proporciona un método para seleccionar un grupo de pacientes de cáncer con base en el nivel de expresión de CRBN, o los niveles de expresión de DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FASl, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 o NFKB en las células cancerosas, con el propósito de predecir la respuesta clínica, vigilar la respuesta clínica o vigilar el cumplimiento del paciente a la dosificación con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2- metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,b-diona, un estereoisómero de este, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste; en donde los pacientes de cáncer son seleccionados a partir de los pacientes de mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, melanoma y tumor sólido.
En una modalidad, los pacientes de cáncer son pacientes de mieloma múltiple.
En una modalidad, los pacientes de cáncer son pacientes de linfoma no Hodgkin. En una modalidad, el linfoma no Hodgkin es del fenotipo de células B activadas.
En una modalidad, los pacientes de cáncer son pacientes de linfoma difuso de células B grandes. En una modalidad, el linfoma difuso de células B grandes, es del fenotipo de células B activadas.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de DDBl en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de DDB2 en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de GSK3B en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de CUL4A en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de CUL4B en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de XBP-1 en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de FASl en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de RANBP6 en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de DUS3L en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de PHGDH en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de AMPK en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de IRF4 en el cáncer.
En una modalidad, el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de NFKB en el cáncer.
También se proporciona en la presente un método para identificar o vigilar la resistencia de un paciente de mieloma múltiple frente al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-guinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, con base en la presencia o aparición de mutaciones dentro de un gen CRBN.
En una modalidad, la mutación con [sic] el gen CRBN es un polimorfismo de nucleótido simple en la región codificadora c.745C>CA causante de .un cambio de aminoácido 249D>YD en la proteína dentro del dominio de unión DDBl de CRBN.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para seleccionar un grupo de pacientes sensibles al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste; con base en el nivel de la expresión de CRBN, o los niveles de expresión de DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 o NFKB dentro de la células T, células B o células plasmáticas del paciente, con el propósito de predecir la respuesta clínica, vigilar la respuesta clínica o vigilar el cumplimiento del paciente a la dosificación con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de este, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste.
También se proporciona en la presente un anticuerpo contra CRBN aislado, por ejemplo, "CRBN70," tal y como se prepara de acuerdo con el Ejemplo 6.20 o 6.21 más adelante. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal de conejo. En otras modalidades, el anticuerpo es anticuerpo monoclonal de conejo.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un anticuerpo aislado el cual se une inmunoespecífreamente al epítope que tiene una secuencia de aminoácidos EEFHGRTLHDDDC (SEQ ID: 1). En otra modalidad, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente al epítope que tiene una secuencia de aminoácidos EEFHGRTLHDDDC (SEQ ID: 1), en donde el péptido está acoplado a Hemocianina del molusco llamado Lapa californiana (KLH). En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal de conejo. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de conejo. En ciertas modalidades, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente al péptido 65-76 (ID SEC NO: 1) de CRBN humano (ID SEC NO: 12).
En ciertas modalidades, en la presente se proporciona un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CRBN y consiste en una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 5. En otra modalidad, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente a CRBN y consiste en una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 7. En algunas modalidades, el anticuerpo consiste en una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 5 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 7. En ciertas modalidades, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente a CRBN y consiste en una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 9. En otras modalidades, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente a CRBN y consiste en una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 11. En algunas modalidades, el anticuerpo consiste en una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 9 y una cadena ligera que tiene la secuencia de secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 11. En ciertas modalidades, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente al péptido 65-76 (ID SEC NO: 1) de CRBN humano (ID SEC NO: 12).
También se proporciona en la presente un método para utilizar un anticuerpo anti CRBN (p. ej., un anticuerpo o policlonal de conejo CRBN70, o un anticuerpo policlonal o monoclonal de conejo que se une al péptido 65-76 (ID SEC NO: 1) del CRBN humano (ID SEC NO: 12) para medir los niveles de expresión de CRBN en las células tumorales u hospederas del paciente, para predecir la respuesta clínica, vigilar la respuesta clínica, vigilar el cumplimiento del paciente a la dosificación, o vigilar el desarrollo de resistencia al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste. En una modalidad, el anticuerpo contra CRBN se une inmunoespecíficamente al epítope que tiene la secuencia de aminoácidos EEFHGRTLHDDD (ID SEC NO: 1). En una modalidad, el anticuerpo contra CRBN se une específicamente a EEFHGRTLHDDD (ID SEC NO: 1), el cual está acoplado a la hemocianina del molusco llamado Lapa californiana (KLH). En una modalidad, el anticuerpo contra CRBN es un anticuerpo policlonal, como puede ser un anticuerpo policlonal de conejo. En otra modalidad, el anticuerpo contra CRBN es un anticuerpo monoclonal, como puede ser un anticuerpo monoclonal de conejo. 5.1 Definiciones Cuando se utiliza en la presente, y a menos que se especifique de otro modo, los términos "tratar", "tratamiento" se refiere a una acción que ocurre cuando un paciente está sufriendo un cáncer específico, el cual disminuye la gravedad de cáncer, o retarda o alenta la progresión del cáncer.
El término "sensibilidad" y "sensible" cuando se hace referencia al tratamiento con el compuesto es un término relativo que se refiere al grado de eficacia del compuesto para aminorar o disminuir el progreso de un tumor o la enfermedad que se está tratando. Por ejemplo, el término "sensibilidad aumentada" cuando se utiliza haciendo referencia al tratamiento de una célula o tumor en relación con un compuesto para aumentar de, al menos un 5%, o más la eficacia del tratamiento del tumor.
Cuando se utiliza en la presente, y a menos que se indique de otro modo, el término "cantidad terapéutica eficaz" de un compuesto es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de un cáncer, o para retardar o llevar al mínimo uno o más síntomas asociados con la presencia del cáncer. Una cantidad terapéutica eficaz de un compuesto significa una cantidad del compuesto terapéutico, solo o combinado con otros tratamientos, la cual proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de cáncer. El término "cantidad terapéutica eficaz" puede comprender una cantidad que mejore el tratamiento general, reduzca o evite los síntomas o las causas de cáncer, o mejore la eficacia terapéutica de otro compuesto terapéutico.
Cuando se utiliza en la presente, una "respuesta efectiva del paciente" se refiere a cualquier aumento del beneficio terapéutico para el paciente. Una "respuesta efectiva del tumor del paciente" puede ser, por ejemplo, una disminución de 5%, 10%, 25%, 50% o 100% en la velocidad de progreso del tumor. Una "respuesta efectiva del tumor del paciente" puede ser, por ejemplo, una disminución de 5%, 10%, 25%, 50% o 100% de los síntomas físicos de un cáncer. Una "respuesta efectiva del tumor del paciente" también puede ser, por ejemplo, un aumento de 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200% o más en la respuesta del paciente, como se mide por cualquiera de los medios adecuados, como puede ser expresión génica, recuento de células, resultados del ensayo, etcétera.
El término "probabilidad" generalmente se refiere a un aumento en la probabilidad de un episodio. El término "probabilidad" cuando se utiliza haciendo referencia a la efectividad de una respuesta del tumor del paciente generalmente considera una probabilidad aumentada de que la velocidad de progreso del tumor o crecimiento de células del tumor disminuirán. El término "probabilidad" cuando se utiliza en referencia a la efectividad de una respuesta del tumor del paciente también puede generalmente significar el aumento de los indicadores, como puede ser mRNA o la expresión de proteínas, que puede evidenciar un aumento en el progreso en el tratamiento del tumor.
El término "predecir" generalmente significa determinar o decir por anticipado. Cuando se utiliza para "predecir" la efectividad de un tratamiento de cáncer, por ejemplo, el término "predecir" puede significar que la probabilidad del resultado del tratamiento de cáncer se puede determinar al inicio, antes de que haya comenzado el tratamiento, o antes de que el periodo de tratamiento haya progresado considerablemente.
El término "vigilar", cuando se utiliza en la presente, se refiere en general a la vigilancia, supervisión, regulación, observación, rastreo o vigilancia de una actividad. Por ejemplo, el término "vigilar la eficacia de un compuesto" se refiere a rastrear la eficacia en el tratamiento de cáncer en un paciente o en un cultivo de células de tumor. Del mismo modo, el término "vigilar", cuando se utiliza en relación con el cumplimiento por parte del paciente, ya sea en forma individual o en un ensayo clínico, se refiere al seguimiento o la confirmación de que el paciente está realmente siguiendo la pauta de tratamiento como se indicó. La vigilancia puede realizarse, por ejemplo, siguiendo la expresión de mRNA o biomarcadores de proteína. Una mejoría en el cáncer o enfermedad relacionada con cáncer puede ser caracterizada como una respuesta completa o parcial. "Respuesta completa" se refiere a la ausencia de enfermedad clínicamente detectable con normalización de cualquier estudio radiológico previamente anormal, médula ósea, y fluido cerebroespinal (CSF) o mediciones de proteína monoclonal anormal. "Respuesta parcial" se refiere a al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90% de disminución en toda la carga tumoral medible (es decir, el número de células malignas presentes en el individuo, o el granel medido de masas de tumor o la cantidad de proteína monoclonal anormal) en ausencia de nuevas lesiones. El término "tratamiento" contempla una respuesta completa y una respuesta parcial.
"Tumor" cuando se utiliza en la presente y a menos que se especifique de otro modo, se refiere a todo el crecimiento y proliferación celular neoplásico, ya sea maligno o benigno y todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos. "Neoplásico", cuando se utiliza en la presente, se refiere a cualquier forma de crecimiento celular desregulado o no regulado, ya sea maligno o benigno, resultante en crecimiento de tejido anormal. Así, "células neoplásicas" incluye células malignas y benignas que tengan crecimiento desregulado o no regulado.
Los términos "cáncer" y "canceroso", se refieren a o describen el estado fisiológico en mamíferos que es normalmente caracterizado por crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, más no se limitan a, tumores transmitidos por la sangre (p. ej., mieloma múltiple, linfoma y leucemia), y tumores sólidos.
El término "refractario o resistente" se refiere a una circunstancia en donde los pacientes, aún después de un tratamiento intenso, tienen células residuales de cáncer (p. e ., leucemia o células de linfoma) en su sistema linfático, sangre y/o tejidos que forman la sangre (p. ej., médula).
Cuando se utiliza en la presente, los términos "polipéptido" y "proteína", utilizada de manera indistinta en la presente, se refiere a un polímero de aminoácidos de tres o más aminoácidos en un arreglo en serie, unidos a través de enlaces peptídicos. El término "polipéptido" incluye proteínas, fragmentos de proteína, análogos de proteína, oligopéptidos y similares. El término polipéptido cuando se utiliza en la presente puede también hacer referencia a un péptido. Los aminoácidos que constituyen el polipéptido pueden ser de origen natural o pueden ser sintéticos. El polipéptido puede ser purificado a partir de una muestra biológica.
El término "anticuerpo" se utiliza en la presente en el sentido más amplio y cubre anticuerpos completamente ensamblados, fragmentos de anticuerpos que conservan la capacidad para unirse específicamente al antígeno (p. ej., Fab, F(ab')2, Fv, y otros fragmentos), anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, quimeras de anticuerpo, anticuerpos híbridos, anticuerpos biespecí fíeos, anticuerpos humanizados y similares. El término "anticuerpo" cubre anticuerpos policlonales y monoclonales. El término "anticuerpo" e "inmunoglobulina" o "Ig" puede ser utilizado indistintamente en la presente. Los términos "anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN", "anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un epítope CRBN", "anticuerpos CRBN", "anticuerpos anti-CRBN" y términos semeje antes también se utilizan de manera indistinta en la presente y se refieren a anticuerpos y fragmentos de éstos, que se unen específicamente a un polipéptido CRBN, como puede ser un antígeno o epítope CRBN (p. ej., EEFHGRTLHDDD (ID SEC NO: 1) O péptidos 65-76 CRBN humanos (ID SEC NO: 12)). Los anticuerpos, incluidos ambos anticuerpos modificados (es decir, anticuerpos que contienen un dominio constante igG modificado (p. ej., igGl) y anticuerpos no modificados (es decir, anticuerpos que no contienen un dominio constante IgG modificado (p. ej., igGl) que se une específicamente a un polipéptido CRBN. Un anticuerpo o fragmento de éste que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN puede ser de reacción cruzada con los antígenos relacionados. En ciertas modalidades, un anticuerpo o fragmento de éste que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN no tiene una reacción cruzada con otros antígenos . Un anticuerpo o fragmento de éste que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN se puede identificar, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore, u otras téenicas conocidas por los expertos en la materia. Un anticuerpo o un fragmento de estos se une específicamente a un antígeno CRBN cuando se une a un antígeno CRBN con alta afinidad a cualquier antígeno con reactividad cruzada como se determina utilizando técnicas experimentales, como puede ser radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoabsorbentes de enzimas ligadas (ELISA). Normalmente una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal o ruido de fondo y más normalmente más de 10 veces el fondo véase, p. ej., Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology, Segunda edición, Raven Press, New York en las páginas 332-336 para consultar una discusión con respecto a la especificidad de anticuerpos.
Los anticuerpos que se proporcionan en la presente incluyen, más no se limitan a, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos de forma recombinante, anticuerpos multiespecíficos (incluidos anticuerpos bi-específicos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, intracuerpos, Fvs monocatenarios (scFv) (p. ej ., incluidos monoespecíficos, biespecífíeos, etc.), anticuerpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab"), Fvs con enlace disulfuro (sdFv), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión al epítope de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos que se proporcionan en la presente incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones con actividad inmunológica de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, dominios de unión al antígeno o moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se unen inmunoespecíficamente al antígeno CRBN (p. ej., una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo anti-CRBN). Los anticuerpos que se proporcionan en la presente pueden ser de cualquier tipo (p. ej., IgG, igE, IgM, IgD, igA e IgY), cualquier clase (p. ej., IgGl, IgG2, IgG3, lgG4, IgAl e IgA2), o cualquier subclase (p. ej., IgG2a e IgG2b) de la molécula de inmunoglobulina. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CRBN son completamente humanos, como pueden ser los anticuerpos CRBN monoclonales completamente humanos. En ciertas modalidades, los anticuerpos que se proporcionan en la presente son anticuerpos IgG, o una clase (p. ej., IgGl o IgG4 humano) o subclase de estos.
El término "dominio de unión al antigeno", "región de unión al antígeno", "fragmento de unión al antígeno" y términos semejantes se refieren a que la porción de un anticuerpo que contiene residuos aminoácido interactúan con un antígeno y confieren al agente de unión su especificidad y afinidad para el antígeno (p. ej., la CDR). La región de unión al antígeno se puede obtener de cualquier especie animal, como pueden ser roedores (p. ej., conejo, rata o hámster) y humanos. En algunas modalidades, la región de unión al antígeno será de origen humano.
El término "región constante" o "dominio constante" de un anticuerpo se refiere a una porción carboxi terminal de la cadena ligera y pesada que no está directamente implicada en la unión del anticuerpo al antígeno pero presenta diversas funciones efectoras, como puede ser interacción con el receptor Fe. Los términos se refieren a la porción de una molécula de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos más conservada respecto a la otra porción de la inmunoglobulina, el dominio variable, que contiene el sitio de unión al antígeno. El dominio constante contiene los dominios CHl, CH2 y CH3 de la cadena pesada y el dominio CL de la cadena ligera.
El término "epítope" cuando se utiliza en la presente se refiere a una región localizada en la superficie de un antígeno, como puede ser un polipéptido CRBN o fragmento polipéptido CRBN, que es capaz de estar unido a una o más regiones de unión al antígeno de un anticuerpo, y que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, como puede ser un mamífero (p. ej., un humano), que es capaz de provocar una respuesta inmune. Un epítope que tiene actividad inmunogénica es una porción de un polipépido que provoca una respuesta de anticuerpo en un animal. Un epítope que tiene actividad antigénicas es un porción de un polipéptido al cual se une inmunoespecíficamente un anticuerpo como se determina por cualquier método conocido en la téenica, por ejemplo, por los inmunoensayos que se describen en la presente. Los epítopes antigénicos no tienen que ser necesariamente inmunogénicos. Los epítopes normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen características estructurales tridimensionales así como características de carga específicas. Una región de un polipéptido que contribuye a un epítope puede ser aminoácidos contiguos del polipéptido o el epítope puede reunirse con dos más regiones no contiguas del polipéptido. El epítope puede o no ser una característica de superficie tridimensional del antígeno. Un epítope ejemplar de CRBN proporcionado en la presente es EEFHGRTLHDDD (ID SEC NO: 1) o péptido 65-60 de CRBN (ID SEC NO: 13).
Los términos "anticuerpo completamente humano" o "anticuerpo humano" se utilizan de manera indistinta en la presente y se refieren a un anticuerpo que contiene una región variable humana y, en algunas modalidades, una región constante humana. En modalidades específicas, el término se refiere a un anticuerpo que contiene una región variable y una región constante de origen humano. Anticuerpos anti-CRBN "completamente humanos", en ciertas modalidades, también puede abarcar anticuerpos que se unen a polipéptidos CRBN y son codificados por secuencias de ácido nucleico las cuales son variantes somáticas de origen natural de la secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una modalidad específica, los anticuerpos anti-CRBN que se proporcionan en la presente son anticuerpos completamente humanos. El término "anticuerpo completamente humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variable y constante correspondientes a las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana como se describe por Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios humanos de EUA, Publicación N1H No. 91-3242, 1991. Los métodos ejemplares para producir anticuerpos completamente humanos se proporciona, p. ej., en los Ejemplos de la presente, pero puede utilizarse cualquier método conocido en la téenica.
La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como puede ser anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transíectado en una célula hospedera, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humano combinatoria, recombinante, anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón o vaca) que es transgénico y/o transcromosomal para genes de inmunoglobulina humana (véase, p. ej., Taylor, L. D. et al. (1992) Nucí . Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de DNA. Tales anticuerpos humanos recombinantes pueden tener regiones variable y constante derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Véase Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Imunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios humanos de EUA, N1H No. 91-3242. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes están sometidos mutagénesis in vi tro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y de este modo las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras se derivan de y se relacionan con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de anticuerpos humanos de la línea germinal in vivo.
El término "cadena pesada" cuando se utiliza en la presente en referencia a cualquier anticuerpo se refiere a cinco tipos distintos, denominados alfa (OÍ), delta (d), épsilon (e), gamma (g) y mu (m), con base en la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. Estos distintos tipos de cadenas pesadas son bien conocidas en la téenica y dan lugar a cinco clases de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluidas cuatro subclases de IgG, a saber, IgGl, IgGl, lgG3 e IgG4. En algunas modalidades la cadena pesada es una cadena pesada humana.
Los términos "numeración Kabat" y términos semejantes son reconocidos en la técnica y se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácidos en las regiones variables de la cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o una porción de unión al antígeno de este. Kabat et al. (1971) Ann . any Acad. Sci . 190:382-391 and, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Imunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios humanos de EUA, Publicación N1H No.91-3242. Para la región variable de la cadena pesada, la región hipervariable normalmente abarca desde las posiciones de aminoácidos 31 a 35 para CDRl, posiciones de aminoácidos 50 a 65 para CDR2, posiciones de aminoácidos 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de la cadena ligera, la región hipervariable abarca dese las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDRl, posiciones de aminoácidos 50 a 56 para CDR.2, y posiciones de aminoácidos 89 a 97 para CDR3. Otros esquemas de numeración se entenderán fácilmente por los expertos en la téenica.
El término "cadena ligera" cuando se utiliza en referencia a un anticuerpo se refiere a dos tipos distintos, denominados kappa (K) O larnbda (l) con base en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera son bien conocidas en la técnica. En ciertas modalidades, la cadena ligera es una cadena ligera humana.
El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos homogéneos o prácticamente homogéneos, y cada anticuerpo monoclonal reconocerá normalmente un epítope individual en el antígeno. En algunas modalidades, un "anticuerpo monoclonal", cuando se utiliza en la presente, es un anticuerpo producido por un solo hibridoma u otra célula, en donde el anticuerpo se une inmunoespecificamente a solo un epítope CRBN como se determina, p. ej., por ELISA u otro ensayo de unión al antígeno o de unión competitiva conocido en la técnica o en los Ejemplos que se proporcionan en la presente. El término "monoclonal" no se limita a ningún método particular para preparar el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se proporcionan en la presente pueden prepararse por el método de hibridoma como se describe en Kohler et al; Nature, 256:495 (1975) o pueden ser aislados de bibliotecas de fagos utilizando las téenicas que se describen en la presente, por ejemplo. Otros métodos para la preparación de líneas de células clónales y de anticuerpos monoclonales expresadas de este modo son bien conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a Ed., Ausubel et al, eds., John Wilcy and Sons, New York. Otros métodos ejemplares para producir otros anticuerpos monoclonales se proporcionan en los Ejemplos de la presente.
"Anticuerpos policlonales " cuando se utiliza en la presente se refiere a una población de anticuerpos generada en una respuesta inmunogénica a una proteína que tiene muchos epítopes y de este modo incluye una variedad de anticuerpos diferentes dirigidos al mismo y al mismo y/o epítopes diferentes dentro de la proteína. Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos en la técnica. Véase, p. ej., Capítulo 11 en: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a Ed., Ausubel et al, eds., John Wiley and Sons, New York.
Los términos "cereblon" o "CRBN" y términos semejantes se refieren a los polipéptidos ( "polipéptidos, " "péptidos" y "proteínas" se utilizan indistintamente en la presente) contienen la secuencia de aminoácidos de cualquier CRBN, como puede ser una proteína CRBN humana (p. ej., CRBN humana isoforma 1, No. de acceso GenBank NP 057386 (ID SEC NO: 12); o CRBN humana isoformas 2, No. de acceso GenBank NP 001166953 (ID SEC NO: 13), cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad), y polipéptidos relacionados, incluso variantes SNP de estos. Los polipéptidos CRBN relacionados incluyen variantes alélicas (p. ej., variantes SNP); variantes de empalme; fragmentos; derivados; variantes de sustitución, deleción e inserción; polipéptidos de fusión; y homólogos interespecies, los cuales, en ciertas modalidades, retienen la actividad CRBN y/o son suficientes para genera una respuesta inmune anti-CRBN.
El término "antígeno CRBN" se refiere a aquella porción de un polipéptido CRBN al cual se une un anticuerpo de manera inmunoespecífica. Un antígeno CRBN también se refiere a un análogo o derivado de un polipéptido CRBN o fragmento de éste al cual se une de manera inmunoespecífica un anticuerpo. Una región localizada sobre la superficie de un antigeno CRBN que es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria es un "epítope" CRBN. Una región de un polipéptido CRBN que contribuye a un epítope pueden ser aminoácidos contiguos del polipéptido o el epítope puede surgir de dos o más regiones no contiguas del polipéptido. El epítope puede o no ser una característica de superficie tridimensional del antígeno. En ciertas modalidades, el epítope CRBN es EEFHGRTLHDDD (ID SEC NO: 1) O el péptido 65-76 del CRBN humano (ID SEC NO: 12). El término "región variable" o "dominio variable" se refiere a una porción de las cadenas ligera y pesada, por lo regular de alrededor de de 120 a 130 en el extremo amino-terminal de la cadena pesada y aproximadamente 100 a 110 aminoácidos en la cadena ligera, la cual difiere ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo específico para su antígeno particular. La variabilidad en la secuencia se concentra en aquellas regiones denominadas regiones determinadoras de la complementariedad (CDR) mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable se denominan regiones de entramado (FR). La CDR de las cadenas ligera y pesada son principalmente responsables de la interacción del anticuerpo con e antígeno. La numeración de las posiciones de los aminoácidos utilizada en la presente es de acuerdo con el índice de la UE, véase en Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EUA, Publicación N1H No. 91-3242. En algunas modalidades, la región variable es una región variable humana.
El término "expresado" o "expresión" cuando se utiliza en la presente se refiere a la transcripción de un gen para dar una molécula de ácido nucleico RNA al menos complementario en parte a una región de una de las dos hembras de ácido nucleico del gen. El término "expresado" o "expresión", cuando se utilza en la presente, también se refiere a la traducción de la molécula de RNA para dar una proteína, un polipéptido o una parte de ésta.
Un mRNA que es "regulado hacia arriba" generalmente se incrementa luego de un tratamiento o estado determinado. Un mRNA que es "regulado hacia abajo" generalmente se refiere a una disminución en el nivel de expresión del mRNA en respuesta a un determinado tratamiento o estado. En algunas situaciones, el nivel de mRNA puede permanecer sin cambio luego de un determinado tratamiento o estado.
Un mRNA de una muestra de un paciente puede ser "regulada hacia arriba " cuando es tratada con un fármaco, en comparación con un testigo no tratado. Esta regulación hacia arriba puedes ser, por ejemplo, un aumento de aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1,000%, 5,000% o más del nivel del RNA del testigo comparativo.
De otro modo, un mRNA puede ser "regulado hacia abajo", o expresado a un nivel inferior, en respuesta a la administración de ciertos compuestos u otros agentes. Un mRNA regulado hacia abajo puede estar, por ejemplo, presente a un nivel de aproximadamente 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 1% o menos respecto a nivel de mRNA ·del testigo comparativo .
Del mismo modo, el nivel de un biomarcador polipéptido o proteína de una muestra de un paciente puede estar aumentado cuando se trata con un fármaco, en comparación con un testigo no tratado. Este aumento puede ser de alrededor de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 100%, 200%, 300%, 500%, 1,000%, 5,000% o más del nivel de proteína de un testigo comparativo.
En otra versión, el nivel de un biomarcador proteina puede estar disminuido en respuesta a la administración de ciertos compuestos u otros agentes. Esta disminución puede estar, por ejemplo, presente a un nivel de alrededor de 99%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 1% o menos del nivel de la proteína testigo comparativo.
Los términos "determinar", "medir", "evaluar", "valorar" y "ensayar" cuando se utiliza en la presente generalmente se refieren a cualquier forma de medición e incluye determinar si un elemento está presente o no. Estos términos incluyen las determinaciones cuantitativas y/o cualitativas. La valoración puede ser relativa o absoluta. "Valorar la presencia de" puede incluir determinar la cantidad de algo presente, así como determinar si está presente o ausente.
Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido " se utilizan de manera indistinta en la presente para describir un polímero de cualquier longitud compuesto de nucleótidos, p. ej ., desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o compuestos producidos por métodos sintéticos, los cuales pueden hibridar con ácidos nucleicos naturales en una forma específica de la secuencia análoga a la de dos ácidos nucleicos naturales, p. ej ., pueden participar en interacciones de apareamiento de bases Watson-Crick . Cuando se utiliza en la presente, en el contexto de una secuencia de polinucleótido , el término "bases" (o "base") es sinónimo con "nucleótidos " (o "nucleótido "), es decir, la subunidad monomérica de un polinucleótido. Los términos "nucleósido" y "nucleótido" están destinadas a incluir aquellas porciones que no contienen solo las bases purina y pirimidina conocidas, sino también otras bases heterocíclicas que hayan sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas, ribosas alquiladas u otros heterociclos. Además, los términos "nucleósido" y "nucleótido" incluyen aquellas porciones que contienen no solo los azúcares ribosa y desoxirribosa tradicionales, sino también otros azúcares. Los nucleósidos o nucleótidos modificados también incluyen modificaciones en la porción azúcar, p. ej., en donde uno o más de los grupos hidroxilo son sustituidos con átomos de halógeno o grupos alifáticos, o son funcionalizados como éteres, aminas o similares. "Análogos" se refiere a las moléculas que tienen características estructurales que son reconocidas en la literatura como miméticos, derivados, que tienen estructuras análogas u otros términos semejantes, e incluyen, por ejemplo, polinucleótidos que incorporan nucleótidos no naturales, miméticos nucleótidos como pueden ser los nucleósidos 2' modificados, ácidos nucleicos de péptido, nucleósido fosfonatos oligoméricos y cualquier polinucleótido que tenga grupos sustituyentes adicionados, como pueden ser grupos protectores o porciones ligadoras.
El término "complementario" se refiere a la unión específica entre polinucleótidos, con base en las secuencias de los polinucleótidos. Cuando se utiliza en la presente, un primer polinucleótido y un segundo polinucleótido son complementarios si estos se unen entre sí en un ensayo de hibridación en condiciones restrictivas, p. ej., si estos producen un determinado nivel o nivel detectable de la señal en un ensayo de hibridación. Partes de los polinucleótidos son complementarias entre sí si estas siguen las reglas de apareamiento de bases tradicionales, p. ej., A se aparea con T (o con U) y los G se aparea con C, aunque pueden estar presentes regiones pequeñas (p. ej., de menos de aproximadamente 3 bases) de secuencia mal apareada, con inserción o con deleción.
Identidad de la secuencia o identidad en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico, se refiere a los residuos en las dos secuencias los cuales son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima a lo largo de una ventana de comparación especificada, y pueden tomar en cuenta adiciones, deleciones y sustituciones.
El término "identidad considerable " o "homólogo" en sus diferentes formas gramaticales y en el contexto de los polinucleótidos , generalmente significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene una identidad deseada, por ejemplo, al menos 60% de identidad, preferentemente al menos 70% de identidad de la secuencia, más preferentemente al menos 80%, todavía más preferentemente al menos 90% e incluso más preferentemente al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia. Otra indicación de que las secuencias de nucleótido son considerablemente idénticas es si dos moléculas hibridan entre sí en condiciones restrictivas.
Los términos "aislado" y "purificado" se refiere al aislamiento de una sustancia (como puede ser mRNA, anticuerpo o proteína) para que la sustancia comprenda una porción considerable de una muestra en la cual reside, es decir, más grande que la normalmente encontrada de la sustancia en su estado natural o no aislado. Por lo regular, una porción considerable de la muestra comprende, p. ej., mayor del 1%, mayor del 2%, mayor del 5%, mayor del 10%, mayor del 20%, mayor del 50% o más, normalmente hasta aproximadamente 90%-100% de la muestra. Por ejemplo, una muestra de mRNA aislado por lo regular puede comprender al menos aproximadamente 1% de mRNA total. Las téenicas para purificar polinucleótidos son bien conocidas en la materia e incluye, por ejemplo, electroforesis en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, citometría de flujo y sedimentación de acuerdo con la densidad.
El término "muestra" cuando se utiliza en la presente se refiere a un material o mezcla de materiales, normalmente, aunque no necesariamente, en forma líquida, conteniendo uno o más componentes que interesen "Muestra biológica" cuando se utiliza en la presente, se refiere a una muestra obtenida de un individuo biológico, que incluye la muestra de tejido o fluido biológico obtenida, alcanzada ó recolectada in vivo o in si tu . Una muestra biológica también incluye muestras de una región de un individuo biológico que contenga células o tejidos precancerosos o cancerosos. Tales muestras pueden ser, más no se limitan a, órganos, tejidos, fracciones y células aisladas de un mamífero. Las muestras biológicas ejemplares pueden ser, más no se limitan a, lisado celular, un cultivo de células, una línea de células, un tejido, tejido oral, tejido gastrointestinal, un órgano, un organelo, un fluido biológico, una muestra de sangre, una muestra de orina, una muestra de piel y similares. Las muestras biológicas preferidas pueden ser, más no se limitan a, sangre entera, sangre parcialmente purificada, orina, células PBMC, biopsias de tejido y similares.
El término "agente de captura", cuando se utiliza en la presente se refiere a un agente que se une a un mRNA o proteína a través de una interacción que sea suficiente para permitir al agente y unirse y concentrar el mRNA o proteína a partir de una mezcla homogénea.
El término "sonda" cuando se utiliza en la presente se refiere a un agente de captura que es dirigido a una secuencia específica de un biomarcador mRNA diana. Por consiguiente, cada sonda de una serie de sonda tiene un biomarcador mRNA diana respectivo. Un dúplex sonda/ mRNA diana es una estructura que se forma mediante la hibridación de una sonda a su biomarcador mRNA diana.
El término "ácido nucleico" o "sonda de oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que puede unirse a un ácido nucleico diana de secuencia complementaria, como pueden ser los biomarcadores mRNA que se proporcionan en la presente, a través de uno o más tipos de enlaces químicos, por lo regular del apareamiento de bases complementarias, normalmente a través de la formación de enlaces hidrógeno. Cuando se utiliza en la presente, una sonda puede contener bases naturales (p. ej., A, G, C, o T) o modificadas (7-deazaguanosina, inosina, etc.). Además, las bases de una sonda pueden estar unidas mediante un enlace diferente de un enlace fosfodiéster, a condición de que no interfiera con la hibridación. Los expertos en la téenica entenderán que las sondas pueden unirse a las secuencias diana carentes de complementariedad completa con la secuencia de la sonda dependiendo del rigor de las de condiciones de hibridación. Preferentemente las sondas se marcan directamente con isótopos, por ejemplo, con cromóforos, lumíforos, cromógenos, o se marcan indirectamente con biotina a la cual puede unirse después un complejo estreptavidina. Cuando se ensaya la presencia o ausencia de la sonda, es posible detectar la presencia o ausencia de un biomarcador mRNA diana que interese.
El término " condiciones restrictivas del ensayo" se refiere a las condiciones que sean compatibles para producir pares de unión de los ácidos nucleicos, p. ej., sondas y los mRNA diana, de complementariedad suficiente para obtener el nivel deseado de especificidad en el ensayo siendo al mismo tiempo generalmente incompatible con la formación de los pares de unión entre los miembros de unión de complementariedad insuficiente para obtener la especificidad deseada. El término condiciones restrictivas del ensayo, generalmente se refiere a la combinación de las condiciones para la hibridación y para el lavado.
Una "etiqueta" o una "porción detectable " con referencia a un ácido nucleico, se refiere a una composición que, cuando se liga con un ácido nucleico, hace que el ácido nucleico sea detectable, por ejemplo, por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Las etiquetas ejemplares pueden ser, más no se limitan a isótopos radioactivos, perlas magnéticas, perlas metálicas, partículas coloidales, tintes fluorescentes, enzimas, biotina, digoxigenina, haptenos y similares. Un "ácido nucleico o sonda de oligonucleótido etiquetados" generalmente es aquella que está unida, en forma covalente, a través de un ligador o un enlace químico, o en forma no covalente, mediante enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, atracciones electrostáticas, interacciones hidrofóbicas o enlaces de hidrógeno, a una etiqueta para que se pueda detectar la presencia del ácido nucleico o sonda detectando la presencia del enlace de la etiqueta al ácido nucleico o sonda.
Los términos " reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR", cuando se utiliza en la presente, generalmente se refiere a un procedimiento mediante el cual se amplifican cantidades pequeñas de un ácido nucleico, R A y/o DNA, como está descrito, por ejemplo, en la Patente U.S. No.4,683,195 para Mullís. En general, es necesario tener disponible información de las secuencias de los extremos de la región que interese o más allá, para que se puedan diseñar cebadores oligonucleótidos; estos cebadores serán idénticos o semejantes en secuencia a hebras contrarias de la plantilla que se va a amplificar. Los nucleótidos del extremo 5' terminal de los dos cebadores pueden coincidir con los extremos del material amplificado. La PCR se puede utilizar para amplificar secuencias específicas de RNA, secuencias específicas de DNA a partir del DNA genómico total, y el cDNA puede ser transcrito a partir del RNA celular total, secuencias de bacteriófago o plasmídicas, etc. Véase en general Mullís et al., Coid Spring Harbor Sy p. Quant. Biol, 51 : 263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).
El término "número de ciclo" o "CT" cuando se utiliza en la presente haciendo referencia a los métodos PCR, se refiere al número del ciclo de la PCR en el cual el nivel de fluorescencia rebasa un determinado nivel umbral establecido. La medición del CT puede utilizarse, por ejemplo, para aproximarse a los niveles de mRNA de una muestra original. La medición del CT muchas veces se utiliza en términos de "dCT" o la puntuación de la "diferencia en el CT", cuando el CT de un ácido nucleico se resta del CT de otro ácido nucleico.
Cuando se utiliza en la presente, y a menos que se indique de otro modo el término "ópticamente puro" significa que una composición contiene un isómero óptico de un compuesto y está considerablemente libre del otro isómero de ese compuesto. Por ejemplo, una composición ópticamente pura de un compuesto que tenga un centro quiral estará considerablemente libre del anantiómero contrario del compuesto. Una composición ópticamente pura de un compuesto que tenga dos centros quirales estará considerablemente libre de los demás diasterómeros del compuesto. Un compuesto ópticamente puro común contiene más de aproximadamente 80% en peso de un enantiómero del el compuesto y menos de 20% en peso de los demás enantiómeros del compuesto, más preferentemente más de aproximadamente 90% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 10% en peso de los demás enantiómeros del compuesto, aún más preferentemente más de aproximadamente 95% en eso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 5% en peso de los demás enantiómeros del compuesto, más preferentemente más de aproximadamente 97% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 3% en peso de los demás enantiómeros del compuesto, y más preferentemente más de aproximadamente 99% en peso de un enantiómero del compuesto y menos de aproximadamente 1% en peso de los demás enantiómeros del compuesto.
Cuando se utiliza en la presente, a menos que se especifique de otro modo, el término "sal aceptada para uso farmacéutico" abarca sales de adición no tóxicas y básicas del compuesto al que se hace referencia. Las sales de adición ácida no tóxicas aceptables incluyen aquellas derivadas de ácidos orgánicos e inorgánicos o bases conocidas en la téenica, las cuales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido metansulfónico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido málico, ácido maleico, ácido sórbico, ácido aconítico, ácido salicílico, ácido ftálico, ácido ebólico, ácido enántico y similares.
Los compuestos que son de naturaleza ácida son capaces de formar sales con las diferentes bases aceptadas para uso farmacéutico. Las bases que se pueden utilizar para prepara sales de adición básica aceptadas para uso farmacéutico de dichos compuestos ácidos son aquellas que forman sales de adición básica no tóxicas, es decir, sales que contienen cationes aceptadas para uso farmacológico como pueden ser, más no se limitan a, sales de metales alcalinos o de metales alcalinotérreos y en particular las sales de calcio, magnesio, sodio o potasio. Las bases orgánicas apropiadas pueden ser, más no se limitan a N,N-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumaina (N-metilglucamina), lisina y procaína.
Cuando se utiliza en la presente y a menos que se indique de otro modo, el término "solvato" significa un compuesto que se proporciona en la presente o una sal de éste, que además incluye una cantidad estequiométrica o no estequiométrica de un solvente unido mediante fuerzas intermoleculares no covalentes. En donde el solvente es agua, el solvato es un hidrato.
Cuando se utiliza en la presente y a menos que se indique de otro modo, el término "estereoméricamente puro" significa una composición que consiste en un estereoisómero de un compuesto y está prácticamente libre de otro estereoisómero de ese compuesto. Por ejemplo, una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral estará prácticamente libre del enantiómero contrario del compuesto. Una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene dos centros quirales estará prácticamente libre de otros diaestereómeros del compuesto. Un compuesto estereoméricamente puro contiene más de aproximadamente el 80% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente el 20% en peso de otros estereoisómeros del compuesto, más preferentemente más de aproximadamente 90% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente 10% en peso de los otros estereoisómeros del compuesto, incluso más preferentemente más de aproximadamente 95% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos de aproximadamente 5% en peso del otro estereoisómero del compuesto, y más preferentemente mayor de aproximadamente 97% en peso de un estereoisómero del compuesto y menos que aproximadamente 3% en peso del otro estereoisómero del compuesto. Cuando se utiliza en la presente y a menos que se indique de otro modo, el término "estereoméricamente enriquecido" significa una composición que comprende más de aproximadamente 60% en peso de un estereoisómero de un compuesto, preferentemente más de aproximadamente 70% en peso, más preferentemente más de aproximadamente 80% en peso de un estereoisómero de un compuesto. Cuando se utiliza en la presente y a menos que se indique de otro modo, el término "enantioméricamente puro" significa una composición estereoméricamente pura de un compuesto que tiene un centro quiral. Del mismo modo, el término "estereoméricamente enriquecido" significa una composición estereoméricamente enriquecida de un compuesto que tiene un centro quiral.
Cuando se utiliza en la presente, y a menos que se indique de otro modo, el término "co-cristal" significa un forma cristalina que contiene más de un compuesto en una retícula de cristal. Los co-cristales pueden ser complejos moleculares cristalinos de dos o más compuestos no volátiles unidos entre sí en una retícula cristalina mediante interacciones no iónicas. Cuando se utiliza en la presente, el término co-cristales incluye co-cristales farmacéuticos en donde los complejos moleculares cristalinos contienen un compuesto terapéutico y uno o más compuesto (s) no volátil (es) adicional (es) (mencionados en la presente como contra-molécula(s)). Una contramolécula en un co-cristal farmacéutico por lo regular es una molécula aceptada para uso farmacéutico, no tóxica, como puede ser, por ejemplo, aditivos para alimentos, preservadores, excipientes farmacéuticos u otros API (ingrediente farmacéutico activo). En algunas modalidades, los co-cristales farmacéuticos mejoran ciertas propiedades fisicoquímicas de los productos farmacéuticos (p. ej., solubilidad, velocidad de disolución, biodisponibilidad y/o estabilidad), sin comprometer la integridad estructural química de ingrediente farmacéutico activo (API). Véase, p. ej., Jones et al., "Pharmaceutical Cocrystals: An Emerging Approach to Physical Property Enhancement, " MRS Bulletin, 2006, 31, 875-879; Trask, "An OverView of Pharmaceutical Cocrystals as Intellectual Property, " Molecular Pharmaceutics, 2007, 4(3), 301-309; Schultheiss & Newman, "Pharmaceutical Cocrystals and Their Physicochemical Properties," Crystal Growth & Design, 2009, 9(6), 2950-2967; Shan & Zaworotko, "The Role of Cocrystals in Pharmaceutical Science," Drug Discovery Today, 2008, 13(9/10), 440-446; and Vishweshwar et al, "Pharmaceutical Co-Crystals, " J. Pharm. Sci, 2006, 95(3), 499-516.
Un marcador biológico o "biomarcador " es una sustancia cuya detección indica un estado biológico específico, como puede ser, por ejemplo, la presencia de cáncer. En algunas modalidades, los biomarcadores pueden ser determinados en forma individual, o diversos biomarcadores pueden ser medidos al mismo tiempo.
En algunas modalidades, un "biomarcador" indica un cambio en el nivel de la expresión de mRNA que puede correlacionarse con el riesgo o progresión de una enfermedad, o con la susceptibilidad de la enfermedad a un determinado tratamiento. En algunas modalidades, el biomarcador es un ácido nucleico, como puede ser un mRNA o cDNA.
En modalidades adicionales, un "biomarcador" indica un cambio en el nivel de la expresión del polipéptido o proteína, el cual puede correlacionarse con el riesgo, susceptibilidad al tratamiento o progresión de una enfermedad. En algunas modalidades, el biomarcador puede ser un polipéptido o proteína o un fragmento de ésta. El nivel relativo de las proteínas específicas se puede determinar empleando los métodos conocidos en la téenica. Por ejemplo, es posible utilizar métodos basados en anticuerpos, como una inmunoabsorción, un ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA), u otros métodos.
Debe señalarse que si existe una diferencia entre una estructura representada y un nombre dado a esa estructura, debe considerarse con mayor peso la estructura representada. Además si la estereoquímica de una estructura o parte de una estructura no está indicada con, por ejemplo, líneas negritas o punteadas, la estructura o parte de la estructura debe ser interpretada comprendiendo todos los esteroisómeros de ésta.
La práctica de las modalidades que se proporcionan en la presente empleará, a menos que se indique otra cosa, las técnicas regulares de la biología molecular microbiología e inmunología, las cuales están dentro de las habilidades de quienes trabajan la técnica. Tales técnicas están explicadas completamente en la literatura.
Los ejemplos de los textos parcialmente apropiados para consulta pueden ser los siguientes: Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (2d ed.); D.N Glover, ed. (1985) DNA Cloning, Volúmenes I y II; M.J. Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; B.D.
Hames & SJ. Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984) Transcription and Translation; R.I. Freshncy, ed. (1986) Animal Cell Culture; Imobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Imunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres); Scopes (1987) Protein Purification: Principies and Practice (2a ed.; Springer Verlag, N.Y.); and D.M. Weir and C. C. Blackwell, eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV. 5.2 Criterios de valoración en ensayos clínicos El término "supervivencia global" se define como el tiempo desde la aleatorización hasta la muerte por cualquier causa, y se mide en la población con intención de tratar. La supervivencia global debe ser evaluada en estudios comparativos de asignación aleatoria. La demostración de una mejoría con significación estadística en la supervivencia global se puede considerar de importancia clínica si es aceptable el perfil de toxicidad y a menudo tiene el respaldo de la aprobación de fármaco novedoso.
Diversos criterios de valoración se basan en evaluaciones del tumor. Estos criterios de valoración incluyen la sobrevida libre de la enfermedad (DFS), tasa de respuesta objetiva (ORR), tiempo para la progresión (TTP), sobrevida libre de progresión (PFS) y tiempo para falla del tratamiento (TTF). La recopilación y análisis de los datos acerca de estos criterios de valoración dependientes del tiempo se basan en evaluaciones, cálculos y estimados indirectos, (p. ej., las mediciones del tumor).
En general, "sobrevida libre de la enfermedad" (DFS) se define como el tiempo desde la asignación aleatoria hasta la recurrencia de cáncer o muerte por cualquier causa. Aunque la sobrevida global es un criterio de valoración convencional para la mayoría de los parámetros adyuvantes, la DFS puede ser un criterio de valoración importante en situaciones donde la supervivencia puede ser prolongada, haciendo impráctico un criterio de valoración de la supervivencia. La DFS puede ser un sustituto para el beneficio clínico o puede proporcionar evidencia directa del beneficio clínico. Esta determinación se basa en la magnitud del efecto, su relación riesgo-beneficio y el entorno de la enfermedad. La definición de DFS puede ser complicada, en particular cuando se observan muertes sin documentación previa de la progresión de cáncer. Estos episodios pueden ser calificados como recurrencias de la enfermedad o como episodios censurados. Aunque todos los métodos para el análisis estadístico de muertes tienen algunas limitaciones, la consideración de todas las muertes (muertes por todas las causas) como recurrencias puede minimizar el sesgo. La DFS puede ser sobreestimada utilizando esta definición, especialmente en pacientes que mueren después de un periodo largo sin observación. Se puede introducir el sesgo si la frecuencia de las visitas de seguimiento a largo plazo es disímil entre los brazos del estudio o si no son aleatorias las deserciones por la toxicidad.
"Tasa de respuesta objetiva" (ORR) se define como la proporción de pacientes con reducción de cáncer de una cantidad previamente definida y durante un tiempo mínimo. La duración de la respuesta normalmente se mide desde el momento de la respuesta inicial hasta la progresión documentada de cáncer. En general, la FDA ha definido ORR como la suma de las respuestas parciales más las respuestas completas. Cuando se define de esta manera, la ORR es una medida directa de la actividad antitumoral del fármaco, la cual puede ser evaluada en un estudio de un solo brazo. Si están disponibles, se deben utilizar criterios normalizados para averiguar la respuesta. Se han considerado apropiados diversos criterios de respuesta (p. ej., los criterios RECIST) (Therasse et al, (2000) J. Nati. Cáncer Inst, 92: 205-16). La significación de la ORR es evaluada por su magnitud y duración, y el porcentaje de respuestas completas (evidencia no detectable de cáncer).
"Tiempo para progresión" (TTP) y "sobrevida libre de progresión" (PFS) han servido como criterios de valoración primarios para la aprobación de fármacos. El TTP se define como el tiempo desde la asignación aleatoria hasta la progresión objetiva de cáncer; TTP no incluye muertes. PFS se define como el tiempo desde la asignación aleatoria hasta la progresión objetiva de cáncer o muerte. En comparación con TTP, PFS es el criterio de valoración regulativo preferido. La PFS incluye muertes y de este modo puede ser un mejor correlato para la supervivencia global. La PFS supone que las muertes de los pacientes están relacionadas aleatoriamente con la progresión de cáncer. Sin embargo, en casos donde la mayor parte de las muertes no están relacionadas con el cáncer, el TTP puede ser un criterio de valoración aceptable.
Como criterio de valoración para respaldar la aprobación del fármaco, la PFS puede reflejar el crecimiento del cáncer y puede ser evaluada antes de la determinación de un beneficio de sobrevida. Su determinación no es confundida por tratamientos subsecuentes. Para un determinado tamaño de muestra, la magnitud del efecto sobre la PFS puede ser más grande que el efecto sobre la supervivencia global. Sin embargo, puede ser difícil la validación formal de la PFS como un sustituto para la supervivencia por la multitud de malignidades diferentes que existen. Algunas veces los datos son insuficientes para permitir hacer una evaluación robusta de la correlación entre los efectos sobre la supervivencia y la PFS. Los ensayos de cáncer muchas veces son pequeños y los beneficios de supervivencia demostrados de los fármacos existentes generalmente son modestos. La función de la PFS como criterio de valoración para respaldar la aprobación de licenciamiento varía en diferentes entornos del cáncer. Si una mejoría en la PFS representa un beneficio clínico directo o un sustituto para el beneficio clínico depende de la magnitud del efecto y la relación riesgo-beneficio del nuevo tratamiento en comparación con los tratamientos disponibles .
"Tiempo para falla del tratamiento" (TTF) se define como un criterio de valoración compuesto que mide el tiempo desde la asignación aleatoria hasta la descontinuación del tratamiento por cualquier motivo, incluido la progresión de la enfermedad, toxicidad del tratamiento y muerte. El TTF no es recomendado como criterio de valoración regulativo para la aprobación de un fármaco. El TTF no distingue adecuadamente la eficacia de estas variables adicionales. Un criterio de valoración regulativo debe distinguir claramente la eficacia del fármaco respecto a su toxicidad, el retiro del paciente o el médico o intolerancia del paciente. 5.3 Segundos compuestos activos Los compuestos que se proporcionan en la presente se pueden combinar con otros compuestos farmacológicamente activos ("segundos compuestos activos") en los métodos y composiciones que se proporcionan en la presente. Se piensa que ciertas combinaciones trabajan sinérgicamente en el tratamiento de tipos de cáncer particulares, y ciertas enfermedades y estados asociados con o caracterizados por angiogénesis no deseada y/o inflamación. Los compuestos que se proporcionan en la presente también pueden trabajar para aliviar efectos adversos asociados con ciertos segundos compuestos activos, y algunos segundos compuestos activos pueden utilizarse para aliviar efectos adversos asociados con los compuestos que se proporcionan en la presente.
Uno o más segundos ingredientes o compuestos activos se pueden utilizar en los métodos y composiciones que se proporcionan en la presente con los compuestos que se proporcionan en la presente. Los segundos compuestos activos pueden ser moléculas grandes (p. ej., proteínas) o moléculas pequeñas (p. ej., moléculas sintéticas inorgánicas, organometálicas u orgánicas).
Los ejemplos de compuestos activos moléculas grandes incluyen, más no se limitan a, factores de crecimiento he atopoyético, citocinas y anticuerpos monoclonales y policlonales. En ciertas modalidades, los compuestos activos moléculas grandes son moléculas biológicas, como puede ser las proteínas de origen natural o fabricadas artificialmente. Las proteínas que son particularmente útiles en esta descripción incluyen proteínas que estimulan la supervivencia y/o proliferación de células precursoras hematopoyéticas y células poyéticas inmunológicamente activas in vi tro o in vivo. Otras estimulan la división y diferenciación de progenitores eritroides comprometidos en células in vi tro o in vivo.
Las proteínas particulares incluyen, más no se limitan a: interleucinas, como puede ser IL-2 (incluida IL-II ("rIL2") recombinante y canarypox IL-2), IL-10, IL-12 e IL-18; interferones, como puede ser interferon alfa-2a, interferon alfa-2b, interferon alfa-nl, interferon alfa-n3, interferon beta-I a, e interferon gamma-I b; GM-CF y GM-CSF; y EPO.
Las proteínas particulares que pueden utilizarse en los métodos y composiciones de la descripción incluyen, más no se limitan a: filgrastim, el cual es comercializado en Estados Unidos con la marca comercial NEUPOGEN® (Amgen, Thousand Oaks, CA); sargramostim, el cual es comercializado en Estados Unidos con la marca comercial LEUKINE® (Immunex, Seattle, WA) ; y EPO recombinante, el cual es comercializado en Estados Unidos con la marca comercial EPGEN® (Amgen, Thousand Oaks, CA). Las formas recombinante y mutada de GM-CSF se pueden preparar como se describe en las Patentes U.S. Nos. 5,391,485; 5,393,870; y 5,229,496; la descripción de cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. Las formas recombinante y mutada de G-CSF se pueden preparar como se describe en las Patentes U.S. Nos. 4,810,643; 4,999,291; 5,528,823; y 5,580,755; las descripciones de cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.
Esta descripción abarca el uso de proteínas nativas, de origen natural y recombinantes. La descripción además abarca mutantes y derivados (p. ej., formas modificadas) de proteínas de origen natural que presentan, in vivo, al menos algo de la actividad farmacológica de las proteínas sobre las cuales se basan. Los ejemplos de mutantes incluyen, más no se limitan a, proteínas que tienen uno o más residuos aminoácido que difieren de los residuos correspondientes en las formas de origen natural de las proteínas. También abarcadas por el término "mutantes" están las proteínas que carecen de porciones carbohidrato normalmente presentes en sus formas de origen natural (p. ej., formas no glicosiladas). Los ejemplos de derivados incluyen, más no se limitan a, derivados pegilados y proteínas de fusión, como puede ser proteínas formadas mediante la fusión de IgGl o lgG3 a la proteína o porción activa de la proteína de interés. Véase, p. ej., Penichet, M.L. and Morrison, S.L., J. Inmuno 1. Methods 248:91-101 (2001).
Los anticuerpos que pueden ser utilizados en combinación con el compuesto de la Fórmula I que se proporcionan en la presente incluyen anticuerpos monoclonales y policlonales . Los ejemplos de los anticuerpos incluyen, más no se limitan a, trastuzumab (HERCEPTIN®), rituximab (RITUXAN®), bevacizumab (AVASTIN™), pertuzumab (OMNITARG™), tositumomab (BEXXAR®), edrecolomab (PANOREX®), panitumümab y G250. El compuesto de la Fórmula I que se proporciona en la presente también se puede combinar con o utilizar en combinación con anticuerpos anti-TNF-a.
Los compuestos activos moléculas grandes pueden ser administrados en la forma de vacunas anti-cáncer. Por ejemplo, pueden utilizarse vacunas que secretan o causan la secreción de, citocinas como puede ser IL-2, SCF, CXC14 (factor de plaquetas 4), G-CSF y GM-CSF en los métodos, composiciones farmacéuticas y kits de la descripción. Véase, p. ej., Emens, L.A., et al., Curr. Opinión Mol . Ther. 3(1):77-84 (2001).
Los segundos compuestos activos que son moléculas pequeñas también se pueden utilizar para aliviar efectos adversos asociados con la administración del compuesto de la Fórmula I que se proporciona en la presente. Sin embargo, igual que algunas moléculas grandes, mucho se piensa que son capaces de proporcionar un efecto sinérgico cuando se administran con (p. ej., antes, después o al mismo tiempo) el compuesto de la Fórmula I. Los ejemplos de segundos compuestos activos moléculas pequeñas incluyen, más no se limitan a, compuestos anti cáncer, antibióticos, agentes inmunosupresores y esteroides.
Los ejemplos de compuestos anti-cáncer incluyen, más no se limitan a: abraxane; ace-11; acivicina; aclarubicina; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleukina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; batimastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; desmesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfano; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetímero; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol; celecoxib (inhibidor de COX-2); clorambucilo; cirolemicina; cisplatino; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; clorhidrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diazicuona; docetaxel; doxorubicina; clorhidrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; estramustina fosfato sódico; etanidazol; etopósido; etoposide fosfato; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fludarabina fosfato; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; herceptina; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; iproplatino; irinotecán; clorhidrato de irinotecán; acetato de lanreótido; lapatinib; letrozol; acetato de leuprólido; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalán; menogarilo; ercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; etoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; itogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisuran; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perf osfamida; pipobroman; piposulfan; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina; clorhidrato de procabazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; romidepsina; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtraceno; esparfosato sódico; esparsomicina; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; tratamientos con células madre como puede ser PDA-001; estreptonigrina; estreptozocina; eulofenur; talisomicina; tecogalano sódico; taxotere; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina y clorhidrato de zorubicina.
Otros medicamentos anti-cáncer incluyen, más no se limitan a: 20-epi-1,25 dihidroxivitamina D3 ; 5- etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleuguina; antagonistas de ALL-TK; ambamustina; amidox; amifosfina; ácido aminolevulínico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína morfogénica anti-dorsalizante 1; antiandrógeno, carcinoma prostático; antiestrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores de genes de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido apurínico; ara (CDP)DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas BCR/ABL; benzoclorinas; benzoíles taurosporina; derivados de betalactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; sulfoximina de butionina; calcipotriol; calfostina C; derivados de camptotecina; apecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CAR 700; inhibidor derivado del cartílago; carzelesina; inhibidores de la caseína quinasa (ICOS); castanospermina; cceeccrrooppiinnaa BB;; cceettrroorreelliixx;; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatam; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolitico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidemnina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil; diazicuona; didemnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; doxorubicina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; etopósido-fosfato; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretidina; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorubicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutatión; hepsulfam; heregulina; bisacetamida de hexametileno; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imatinib (p. ej ., Gleevec®), imiquimod; péptidos inmunoestimulantes ; inhibidor del receptor del factor de crecimiento 1 de tipo insulínico; agonistas del interferón; interferones; interleuquinas; iobenguano; yododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrón; jasplaquinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarin-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinán; leptolstatina; letrozol; factor inhibidor de leucemia; interferón alfa leucocítico; leuprolida + estrógeno + progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido de disacárido lipófilo; compuestos de platino lipófilos; lisoclinamida 7; lobaplatina; lobricina; lometrexol; lonidamida; losoxantrona; loxoribina; lurtotecan; texafirina de lutecio; lisofilina; péptidos U ticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de la metaloproteinasa de la matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; mitotoxina de factor de crecimiento de fibroblastos-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; Erbitux, gonadotrofina coriónica humana; lípido monofosforil A + pared celular de miobacterium sk; mopidamol; agente anticanceroso de mostaza; micaperóxido B; extracto de la pared celular de Mycobacteria; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona + pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorubicina; ácido neridrónico; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante de nitróxido; nitrulina; oblimersen (Genasense®); 06-bencilguanina; octreotida; oquicenona; oligonucleótidos; onapristona; ondansetrón; oracina; inductor de citoquina oral; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; paclitaxel; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoílrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato de pentosán sódico; pentostatina; pentrozol; perflubrón; perfosfamida; alcohol de perililo; fenazinomicina; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetin A; placetin B; inhibidor del activador de plasminógeno; complejo platino-triamina; porfímero sódico; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores de proteosoma; modulador inmune basado en la proteína A; inhibidor de la proteína quinasa C; inhibidores de la proteína quinasa C, microalgal; inhibidores de proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de purin nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de polioxietileno hemoglobina piridoxilado; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de la farnesil proteína transferasa ras; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rohituquina; romurtida; roquinimex; rubiginona Bl; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de la senescencia; oligonucleótidos antisentido; inhibidores de la transducción de señal; sizofirán; sobuzoxano; borocaptato sódico; fenilacetato , sódico; solverol; proteína de unión a somatomedina; somermina; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; talimustina; metiodida de tamoxifen; tauromustina; tazaroteno; tecogalan sódico; tegafur; telurapirilium; inhibidores de telomerasa; te oporfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido ; tetrazomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinán; hormona estimulante tiroidea; etiletiopurpurina estañosa; tirazapamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; inhibidores de la traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetrón; turosterida; inhibidores de tirosina quinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de uroquinasa; vapreotida; variolina B; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb y zinostatina estimalamer.
Los segundos compuestos activos específicos incluyen, más no se limitan a, oblimersen (Genasense®), remicade, docetaxel, celecoxib, melfalán, dexametasona (Decadron®), esteroides, gemcitabina, cisplatino, temozolomida, etopósido, ciclofosfamida, temodar, carboplatino, procarbazina, gliadel, tamoxifeno, topotecan, metotrexato, Arisa®, taxol, taxotere, fluorouracilo, leucovorina, irinotecan, xeloda, CPT-11, interferon alfa, interferon alfa pegilado (p. ej., PEG INTRON-A), capecitabina, cisplatino, tiotepa, fludarabina, carboplatino, daunorrubicina liposomal, citarabina, doxetaxol, pacilitaxel, vinblastina, IL-2, GM-CSF, dacarbazina, vinorelbina, ácido zoledrónico, palmitronato, biaxin, busulfán, prednisona, bisfosfonato, trióxido de arsénico, vincristina, doxorubicina (DOXIL®), paclitaxel, ganciclovir, adriamicina, fosfato sódico de estramustina (EMCYT®), sulindaco y etopósido. 5.4 Métodos de tratamiento y prevención En una modalidad, en la presente se proporciona un método para tratar y prevenir cáncer, el cual consiste en administrar a un paciente un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para manejar cáncer, el cual consiste en administrar a un paciente un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste.
También se proporcionan en la presente métodos para tratar a pacientes que hayan sido anteriormente tratados contra cáncer pero que no hayan respondido a las terapias normales, así como aquellos que no hayan sido tratados anteriormente. La invención también comprende los métodos para tratar a pacientes independientemente de la edad del paciente, aunque algunas enfermedades o trastornos son más comunes en ciertos grupos etéreos. La invención además comprende los métodos de tratamiento a pacientes que hayan sido sometidos a cirugía en un intento para tratar la enfermedad o estado en cuestión, así como aquellos que no han sido sometidos. Debido a que los pacientes con cáncer tienen manifestaciones clínicas heterogéneas y resultados clínicos variables, el tratamiento que se da a un paciente puede variar, dependiendo de su prognosis. El clínico experto podrá determinar fácilmente sin experimentación indebida los compuestos secundarios específicos, los tipos de cirugía y los tipos de tratamiento normal no basado en fármacos que puedan utilizarse eficazmente para tratar a un paciente con cáncer.
En todavía otra modalidad, en la presente se proporciona un método para tratar, manejar o prevenir enfermedades y trastornos diferentes de cáncer que están asociados con o caracterizados por angiogénesis no deseada, el cual consiste en administrar a un paciente un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste.
Cuando se utiliza en la presente, el término "cáncer" incluye, más no se limita a, tumores sólidos y tumores portados en la sangre. El término "cáncer" se refiere a la enfermedad de los tejidos de la piel, órganos, sangre y vasos, e incluye, más no se limita a cánceres de la vejiga, hueso, sangre, cerebro, mama, útero, tórax, colon, endometrio, esófago, ojo, cabeza, riñón, hígado, ganglios linfáticos, pulmón, boca, cuello, ovarios, páncreas, próstata, recto, estómago, testículos, garganta y cuello uterino. Los cánceres específicos pueden ser, más no se limitan a, malignidad avanzada, amiloidosis, neuroblastoma, meningioma, hemangiopericitoma, metástasis cerebral múltiple, glioblastoma multiforme, glioblastoma, glioma del tronco cerebral, tumor cerebral maligno de mal pronóstico, glioma maligno, glioma maligno recurrente, astrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, tumor neuroendócrino, adenocarcinoma rectal, cáncer colorrectal de Dukes C & D, carcinoma colorectal no resecable, carcinoma hepatocelular metastásico, sarcoma de Kaposi, leucemia mieloide aguda por cariotipo, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células T cutáneas, linfoma de células B cutáneas, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular de grado bajo, melanoma maligno, mesotelioma maligno, síndrome de mesotelioma maligno con derrame pleural, carcinoma peritoneal, carcinoma seroso papilar, sarcoma ginecológico, sarcoma de tejido blando, escleroderma, vasculitis cutánea, histiocitosis de células de Langerhans, leiomiosarcoma, fibrodisplasia osificante progresiva, cáncer de próstata refractario a hormona, sarcoma de tejido blando de alto riesgo, resecado, carcinoma hepatocelular no resecable, macroglobulinemia de Waldenstrom, mieloma quiescente, mieloma indolente, cáncer de los tubos de Falopio, cáncer de próstata independiente de andrógenos, cáncer de próstata no metastásico, estadio IV, dependiente de andrógenos, cáncer de próstata insensible a hormonas, cáncer de próstata insensible a quimioterapia, carcinoma papilar tiroideo, carcinoma folicular tiroideo, carcinoma medular tiroideo y leiomioma.
En ciertas modalidades, el cáncer es un tumor portado en la sangre. En ciertas modalidades, el tumor portado en la sangre es metastásico. En ciertas modalidades, el tumor portado en la sangre es resistente a fármacos. En ciertas modalidades, el cáncer es mieloma o linfoma.
En ciertas modalidades, el cáncer es un tumor sólido. En ciertas modalidades, el tumor sólido es metastásico. En ciertas modalidades, el tumor sólido resistente a fármacos. En ciertas modalidades, el tumor sólido es carcinoma hepatocelular, cáncer de próstata, cáncer de ovario o glioblastoma.
Cuando se utiliza en la presente para referirse a enfermedades y estados diferentes de cáncer, los términos "enfermedades o trastornos asociados con o caracterizados por angiogénesis no deseada", "enfermedades o trastornos asociados con angiogénesis no deseada" y "enfermedades o trastornos caracterizados por angiogénesis no deseada" se refieren a enfermedades, trastornos y estados que son causados, interviene o está presente angiogénesis no deseada o no controlada, como puede ser, más no se limita a, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades genéticas, enfermedades alérgicas, enfermedades bacterianas, enfermedades oculares neovasculares, enfermedades coroidales neovasculares y enfermedades neovasculares de la retina.
Los ejemplos de dichas enfermedades o trastornos asociados con angiogénesis no deseada pueden ser, más no se limitan a, retinopatia diabética, retinopatía de la premadurez, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, vitreoretinopatía proliferativa, tracoma, miopía, fosos ópticos, queratoconjuntivitis epidémica, queratitis atópica, queratitis límbica superior, pterigio queratitis seca, sjogrens, aené rosácea, filectenulosis, sífilis, degeneración lipídica, úlcera bacteriana, úlcera micótica, infección de Herpes simple, infección de Herpes zoster, infección por protozoarios, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis, trauma, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Steven's Johnson, queratotomía radial perifigoide, anemia de células falciformes, sarcoide, pseudoxantoma elástico, enfermedad de Paget, oclusión venosa, oclusión arterial, enfermedad obstructiva de las carótidas, uveítis crónica, vitritis crónica, enfermedad de Lyme, enfermedad de Eales, enfermedad de Behcet, retinitis, coroiditis, histoplasmosis ocular presunta, enfermedad de Best, enfermedad de Stargart, pars plana, desprendimiento de retina crónica, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, rubeósis, sarcodosis, esclerosis, soriatis, psoriasis, colangitis esclerosante primaria, proctitis, cirrosis biliar primaria, fibrosis pulmonar idiopática y hepatitis alcohólica.
En ciertas modalidades, una cantidad terapéutica o profiláctica eficaz del compuesto es desde aproximadamente 0.005 hasta aproximadamente 1,000 mg por día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 500 mg por día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 250 mg por día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 100 mg por día, desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 mg por día, desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 100 mg por día, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg por día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 50 mg por día, desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 50 mg por día, desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 50 mg por día, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mg por día, desde aproximadamente 0.02 hasta aproximadamente 25 mg por día o desde aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 10 mg por día.
En ciertas modalidades, la cantidad terapéutica o profiláctica eficaz es aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, o aproximadamente 150 mg por día.
En una modalidad, el intervalo de dosis diaria recomendada del compuesto para los estados que se describen en la presente se encuentran dentro del intervalo desde aproximadamente 0.5 mg hasta aproximadamente 50 mg por día, preferentemente dado como una sola dosis una vez al día, o en dosis divididas a lo largo del día. En algunas modalidades, las dosis abarcan desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 50 mg por día. En otras modalidades, as dosis abarcan desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 5 mg por día. Las dosis específicas por día incluyen 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 mg por día. En otras modalidades, las dosis específicas por día incluyen 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 o 4 mg por día.
En una modalidad específica, la dosis de inicio recomendada puede ser 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 50 mg por día. En otra modalidad, la dosis de inicio recomendada puede ser 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 o 4 mg por día. La dosis puede ser aumentada a 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 mg/día. En una modalidad específica, el compuesto puede ser administrado en una cantidad de aproximadamente 25 mg/día a los pacientes con cáncer. En una modalidad particular, el compuesto puede ser administrado en una cantidad de aproximadamente 10 mg/día a pacientes con cáncer.
En ciertas modalidades, la cantidad terapéutica o profiláctica eficaz es desde 0.001 hasta aproximadamente 100 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 50 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 25 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 10 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 9 mg/kg/día, 0.01 hasta aproximadamente 8 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 7 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 6 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 5 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 4 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 3 mg/kg/día, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 2 mg/kg/día, o desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1 mg/kg/día.
La dosis administrada también puede expresarse en unidades diferentes de mg/kg/día. Por ejemplo, las dosis para administración parenteral se pueden expresar como mg/m2/día. Un experto en la téenica fácilmente sabrá cómo convertir las dosis de mg/kg/día a mg/m2/día para determinada altura o peso de un individuo, o ambos (véase, www.fda.gov/cder/cancer/animalframe.htm). Por ejemplo, una dosis de 1 mg/kg/día para un humano de 65 kg es aproximadamente igual a 38 mg/m2/día.
En ciertas modalidades, la cantidad del compuesto que se administra es suficiente para proporcionar la concentración en plasma del compuesto en el estado estacionario abarcando desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 500 mM, aproximadamente 0.002 hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 0.005 hasta aproximadamente 100 mM, aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 0.02 hasta aproximadamente 25 mM, desde aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 20 mM, desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 20 mM, desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 20 mM, o desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 mM.
En otras modalidades, la cantidad del compuesto que se administra es suficiente para proporcionar una concentración en plasma del compuesto en el estado estacionario, abarcando desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 nM, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 100 nM, aproximadamente 10 hasta aproximadamente 50 nM o desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 100 nM.
Cuando se utiliza en la presente, el término "concentración en plasma en el estado estacionario" es la concentración alcanzada después de un periodo de la administración de un compuesto que se proporciona en la presente, p. ej., el compuesto de Fórmula I, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste. Una vez que se alcanza el estado estacionario, hay picos menores o valles en la curva de la concentración en plasma dependiente del tiempo, del compuesto.
En ciertas modalidades, la cantidad del compuesto administrada es suficiente para obtener una concentración máxima en plasma (concentración pico) del compuesto, abarcando desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 500 mM, aproximadamente 0.002 hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 0.005 hasta aproximadamente 100 mM, aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 0.02 hasta aproximadamente 25 mM, desde aproximadamente 0.05 hasta aproximadamente 20 mM, desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 20 mM, desde aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 20 mM, o desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 mM.
En ciertas modalidades, la cantidad del compuesto que se administra es suficiente para proporcionar una concentración mínima en plasma (concentración valle) del compuesto, que abarca desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 500 mM, aproximadamente 0.002 hasta aproximadamente 200 mM, aproximadamente 0.005 hasta aproximadamente 100 mM, aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 50 mM, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mM, aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 25 mM, desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 20 mM, desde aproximadamente 0.02 hasta aproximadamente 20 mM, desde aproximadamente 0.02 hasta aproximadamente 20 mM, o desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 20 mM.
En ciertas modalidades, la cantidad del compuesto que se administra es suficiente para proporcionar un área bajo la curva (AUC) del compuesto, que abarca desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 100,000 ng*h/mL, desde aproximadamente 1,000 hasta aproximadamente 50,000 ng*h/mL, desde aproximadamente 5,000 hasta aproximadamente 25,000 ng*h/mL, o desde aproximadamente 5,000 hasta aproximadamente 10,000 ng*h/mL.
En ciertas modalidades, el paciente que va a ser tratado con uno de los métodos que se proporcionan en la presente no ha sido tratado con tratamiento anticáncer antes de la administración del fármaco. En ciertas modalidades, el paciente que va a ser tratado con uno de los métodos que se proporcionan en la presente ha sido tratado con tratamiento contra cáncer antes de la administración del fármaco. En ciertas modalidades, el paciente que va a ser tratado con uno de los métodos que se proporcionan en la presente ha desarrollado resistencia al fármaco para el tratamiento contra cáncer. Los métodos que se proporcionan en la presente comprenden tratar a un paciente independientemente de la edad del paciente, aunque algunas enfermedades o trastornos son más comunes en ciertos grupos etáreos. Además se proporciona en la presente un método para tratar un paciente que haya sido sometido a cirugía en un intento por tratar la enfermedad o estado en cuestión, así como a uno que no haya sido sometido a cirugía. Debido a que los individuos con cáncer presentan manifestaciones clínicas heterogéneas y resultados clínicos variables, el tratamiento dado a un individuo específico puede variar, dependiendo de su prognosis. El clínico experto podrá determinar fácilmente sin experimentación indebida los compuestos secundarios específicos, tipos de cirugía y tipos de tratamiento normal no basado en fármacos que pueda utilizarse eficazmente para tratar a un individuo con cáncer.
Dependiendo de la enfermedad que va a ser tratada y el estado del individuo, el compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se puede administrar por vía oral, parenteral (p. ej ., intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, CIV, inyección intracisternal o infusión, inyección subcutánea o implante), inhalación, nasal, vaginal, rectal, sublingual o tópica (p. ej., transdérmica o local). El compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se puede formular, solo o juntos en una unidad farmacéutica apropiada con los excipientes, portadores, adyuvantes y vehículos aceptados para uso farmacéutico y apropiados para cada vía de administración.
En una modalidad, el compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra por vía oral. En otra modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra por vía parenteral. En todavía otra modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra por vía intravenosa.
El compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, puede ser entregado como una dosis única como puede ser, p. ej., una inyección en bolo única, o tabletas o píldoras orales; o durante un tiempo, como puede ser, p. ej., infusión continua durante un tiempo o dosis en bolo divididas durante un tiempo. El compuesto puede ser administrado en dosis repetidas si es necesario, por ejemplo, hasta que el paciente experimente una enfermedad estable o regresión, o hasta que el paciente experimente progreso de la enfermedad o toxicidad inaceptable. Por ejemplo, enfermedad estable para tumores sólidos generalmente significa que el diámetro perpendicular de las lesiones medibles no ha aumentado un 25% o más respecto a la última medición.
Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) Guidelines, Journal of the National Cáncer Institute 92(3): 205-216 (2000). Enfermedad estable o falta de ésta se determina por métodos conocidos en la téenica, como puede ser la evaluación de los síntomas del paciente, examen físico, visualización del tumor que haya sido captado utilizando rayos X, CAT, PET o MRI y otras modalidades de evaluación comúnmente aceptadas.
El compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, puede ser administrado una vez al día (QD), o dividido en múltiples dosis diarias, como puede ser dos veces al día (BID), tres veces al día (TID) y cuatro veces al día (QID). Además, la administración puede ser continua (es decir, diario durante los días consecutivos o cada día), intermitente, p. ej., en ciclos (es decir, incluye días, semanas o meses de descanso sin fármaco). Cuando se utiliza en la presente, el término "diario" está destinado para entender que un compuesto terapéutico se administra una vez o más de una vez cada día, por ejemplo, durante un periodo de tiempo. El término "continuo" está destinado para entender que un compuesto terapéutico será administrado diario durante un periodo ininterrumpido de al menos 10 días hasta 52 semanas. El término "intermitente" o "intermitentemente" cuando se utiliza en la presente, está destinado para entender interrumpir y comenzar en intervalos regulares o irregulares. Por ejemplo, administración intermitente de un compuesto es la administración durante uno a seis días por semana, administración en ciclos (p. ej ., administración diaria durante dos a ocho semanas consecutivas, luego un periodo de descanso sin administración durante hasta una semana), o administración en días alternos. El término "ciclado" cuando se utiliza en la presente está destinado para entender que un compuesto terapéutico se administra diario o continuamente pero con un periodo de descanso.
En algunas modalidades, la frecuencia de la administración es en el intervalo de aproximadamente una dosis diaria a aproximadamente una dosis mensual. En ciertas modalidades, la administración es una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, una vez cada tercer día, dos veces a la semana, una vez cada semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, o una vez cada cuatro semanas. En una modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co- cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra una vez al día. En otra modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra dos veces al día. En todavía otra modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrató, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra tres veces al día. En todavía otra modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra cuatro veces al día.
En ciertas modalidades, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra una vez por día desde un día hasta seis meses, desde una semana hasta tres meses, desde una semana hasta cuatro semanas, desde una semana hasta tres semanas, o desde una semana hasta dos semanas. En ciertas modalidades, el compuesto, o una sal o solvato aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra una vez por día durante una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas. En una modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra una veza por día durante una semana. En otra modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra una vez por día durante dos semanas. En todavía otra modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra una vez por día durante tres semanas. En todavía otra modalidad, el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra una vez por día durante cuatro semanas. 5.5 Tratamiento combinado con un segundo compuesto activo Un compuesto proporcionado en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, puede también ser combinado o utilizarse en combinación con otros compuestos terapéuticos útiles en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad descrita en la presente.
En una modalidad, en la presente se proporciona un método para tratar, prevenir o manejar un cáncer, que consiste en administrar a un paciente un compuesto proporcionado en la presente o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste; o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste; en combinación con uno o más segundos compuestos activos, y como una opción, en combinación con terapia de radiación, transfusiones de sangre o cirugía. Los ejemplos de los segundos compuestos activos están descritos en la presente (véase, p. ej., sección 5.3).
Cuando se utiliza en la presente, el término "en combinación" incluye el uso de más de una terapia (p. ej., uno o más compuestos profilácticos y/o terapéuticos). Sin embargo, el uso del término "en combinación" no limita el orden en la que se administran las terapias (p. ej., compuestos profilácticos y/o terapéuticos) a un paciente con una enfermedad o trastorno. Una primera terapia (p. ej., un compuesto profiláctico o terapéutico, como puede ser un compuesto proporcionado en la presente, un compuesto que se proporciona en la presente o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste) se puede administrar antes (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas), en forma concomitante con, o subsecuente a (p. ej., 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas) de la administración de una segunda terapia (p. ej., un compuesto profiláctico o terapéutico) al individuo. También está considerada una triple terapia.
La administración del compuesto o uno o más segundos compuestos activos a un paciente puede suceder al mismo tiempo o en sucesión mediante la misma o diferentes vías de administración. La idoneidad de una vía de administración específica que se emplee para un compuesto activo particular dependerá del propio compuesto activo (p. ej., si puede ser administrado por vía oral sin descomponerse antes de ingresar en el torrente sanguíneo) y el cáncer que se esté siendo tratado.
La vía de administración del compuesto es independiente de la vía de administración de una segunda terapia. En una modalidad, el compuesto se administra por vía oral. En otra modalidad, el compuesto se administra por vía intravenosa. Así pues, de acuerdo con estas modalidades, el compuesto se administra por vía oral o intravenosa, y la segunda terapia puede ser administrada por vía oral, parenteral, intraperitoneal , intravenosa, intraarterial , transdérmica, sublingual, intramuscular, rectal, transbucal, intranasal, liposomal, por inhalación, vaginal, intraocular, por entrega local por catéter o estent, por vía subcutánea, intraadiposa, intraarticular , intratecal, o en una forma farmacéutica de liberación lenta. En una modalidad, el compuesto y una segunda terapia se administran por el mismo modo de administración, por vía oral o por IV. En otra modalidad, el compuesto se administra por un modo de administración, p. ej., por IV, mientras que el segundo compuesto (un compuesto contra cáncer) se administra por otro modo de administración, p. ej., por vía oral.
En una modalidad, el segundo compuesto activo se administra por vía intravenosa o subcutánea y una vez o dos veces al día en una cantidad desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 mg, desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 500 mg, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 350 mg, o desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 mg. La cantidad específica del segundo compuesto activo dependerá del compuesto específico que se utilice, el tipo de enfermedad que se esté tratando o manejando, la gravedad y estadio de la enfermedad y la cantidad de fármaco que se proporciona en la presente y cualquier compuesto activo adicional optativo que se administre en forma concurrente al paciente. En ciertas modalidades, el segundo compuesto activo es oblimersen (GENASENSE®) , GM-CSF, G-CSF, SCF, EPO, taxotere, irinotecan, dacarbazina, ácido transretinóico, topotecan, pentoxifilina, ciprofloxacino, dexametasona, vincristina, doxorubicina, inhibidor de COX-2, IL2, IL8, IL18, IFN, Ara-C, vinorelbina o una combinación de estos .
En ciertas modalidades, los compuestos GM-CSF, G-CSF, SCF o EPO se administran por vía subcutánea durante aproximadamente cinco días en un ciclo de cuatro o seis semanas en una cantidad que abarca desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 750 mg/m2/día, desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 500 mg/m2/día, desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 250 mg/m2/día, o desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 200 mg/m2/día. En ciertas modalidades, GM-CSF puede ser administrado en una cantidad desde aproximadamente 60 hasta aproximadamente 500 mcg/m2 por vía intravenosa durante 2 horas o desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 12 mcg/m2/día por vía subcutánea. En ciertas modalidades, G-CSF puede ser administrado por vía subcutánea en una cantidad de aproximadamente 1 mcg/kg/día al principio y se puede ajustar dependiendo de la elevación del recuento total de granulocitos. La dosis de mantenimiento de G-CSF puede ser administrada en una cantidad de aproximadamente 300 (en pacientes más pequeños) o 480 mcg por vía subcutánea. En ciertas modalidades, EPO puede ser administrado por vía subcutánea en una cantidad de 10,000 unidades 3 veces por semana.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con melfalano y dexametasona a pacientes con amiloidosis. En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, p. ej., el compuesto de Fórmula I, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, y esteroides pueden administrarse a pacientes con amiloidosis.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con gemcitabina y cisplatino a pacientes con cáncer de vejiga de células transicionales localmente avanzado o metastásico.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con un segundo compuesto activo como sigue: temozolomida a pacientes pediátricos con tumores cerebrales recidivantes o progresivos o neuroblastoma recurrente; celecoxib, etopósido y ciclofosfamida para cáncer del CNS recidivante o progresivo; temodar a pacientes con meningioma recurrente o progresivo, meningioma maligno, hemangiopericitoma, metástasis de cerebro múltiples, tumores de cerebro recidivantes o glioblastoma multiforme recién diagnosticado; irinotecan a pacientes con glioblastoma recurrente; carboplatino a pacientes pediátricos con glioma del tallo cerebral; procarbazina a pacientes pediátricos con gliomas malignos progresivos; ciclofosfamida a pacientes con tumores cerebrales malignos de pronóstico malo, glioblastoma multiforme recién diagnosticado o recurrente; Gliadel® para gliomas malignos recurrentes de alto grado; temozolomida y tamoxifeno para astrocitoma anaplásico; o topotecan para gliomas, glioblastoma, astrocitoma anaplásico u oligodendroglioma anaplásico.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con metotrexato, ciclofosfamida, taxano, abraxano, lapatinib, herceptin, inhibidores de aromatasa, moduladores selectivos de estrógenos, antagonistas del receptor de estrógenos y/o PLX3397 (Plexxikon) a pacientes con cáncer mamario metastásico.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con temozolomida a pacientes con tumores neuroendócrinos.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con gemcitabina a pacientes con cáncer de cabeza o cuello recurrente o metastásico.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con gemcitabina a pacientes con cáncer pancreático.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con cáncer de colon en combinación con ARISA®, avastatina, taxol y/o taxotere.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con capecitabina y/o PLX4032 (Plexxikon) a pacientes con cáncer colorectal refractario o pacientes que fracasan el tratamiento de primera línea o tienen desempeño pobre en adenocarcinoma de colon o rectal.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con fluorouracilo, leucovorin e irinotecan a pacientes con cáncer colorectal Dukes C & D o a pacientes que hayan sido tratados anteriormente para cáncer colorectal metastásico.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con cáncer colorectal refractario en combinación con capecitabina, xeloda y/o CPT-11.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con capecitabina e irinotecan a pacientes con cáncer colorectal refractario o a pacientes con carcinoma colorectal no resecable o metastásico.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra solo o en combinación con ínterferon alfa o capecitabina a pacientes con carcinoma hepatocelular no resecable o metastásico; o con cisplatino y tiotepa a pacientes con cáncer hepático primario metastásico.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con interferon alfa pegildo a pacientes con sarcoma de Raposi.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con fludarabina, carboplatino y/o topotecan a pacientes con leucemia mielógena aguda refractaria o recidivante o de alto riesgo.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co- cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administras en combinación con daunorubicina liposomal, topotecan y/o citarabina a pacientes con leucemia mieloide aguda por cariotipo, desfavorable.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con gemcitabina, abraxano, erlotinib, geftinib y/o irinotecan a pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con carboplatino e irinotecan a pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co- cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra con doxetaxol a pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas que hayan sido anteriormente tratados con carbo/VP 16 y radioterapia.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con carboplatino y/o taxotere, o en combinación con carboplatin, pacilitaxel y/o radioterapia torácica a pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con taxotere a pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas en estadio IIIB o IV.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con oblimersen (Genasense®) a pacientes con cáncer pulmonar de células pequeñas.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, p. ej., el compuesto de Fórmula I, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con ABT-737 (Abbott Laboratories) y/u obatoclax (GX15-070) a pacientes con linfoma y otros cánceres de la sangre.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra solo o en combinación con un segundo compuesto activo como vinblastina o fludarabina a pacientes con diversos tipos de linfoma, incluso, más no se limita a, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma de células T cutáneas, linfoma de células B cutáneas, linfoma difuso de células B grandes o linfoma folicular recidivante o refractario de grado bajo.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con taxotere, IL-2, IFN, GM-CSF, PLX4032 (Plexxikon) y/o dacarbazina a pacientes con los diferentes tipos o estadios de melanoma.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra solo o en combinación con vinorelbina a pacientes con mesotelioma maligno, o cáncer pulmonar de células no pequeñas en estadio IIIB con implantes pleurales o síndrome de mesotelioma maligno con derrame pleural.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co- cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con diferentes tipos o estadios de mieloma múltiple en combinación con dexametasona, ácido zoledrónico, palmitronato, GM-CSF, biaxin, vinblastina, melflano, busulfno, ciclofosfamida, IFN, palmidronato, prednisona, bisfosfonato, celecoxib, trióxido de arsénico, INTRON-A PEG, vincristina o una combinación de estos.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con mieloma múltiple recidivante o refractario en combinación con doxorubicina (Doxil®), vincristina y/o dexametasona (Decadron®).
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con diferentes tipos o estadios de cáncer ovárico como puede ser carcinoma peritoneal, carcinoma de papilas serosas, cáncer de ovario refractario o cáncer de ovario recurrente, en combinación con taxol, carboplatino, doxorubicina, gemcitabina, cisplatino, xeloda, paclitaxel, dexametasona o una combinación de estos.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantió ero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con diferentes tipos o estadios de cáncer prostático, en combinación con xeloda, 5 FU/LV, gemcitabina, irinotecan más gemcitabina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona, GM-CSF, celecoxib, taxotere, ganciclovir, paclitaxel, adriamicina, docetaxel, estramustina, Emcyt, denderon o una combinación de estos.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con diferentes tipos o estadios de cáncer de células renales, en combinación con capecitabina, IFN, tamoxifeno, IL-2, GM-CSF, Celebrex®, o una combinación de estos.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con diferentes tipos o estadios de cáncer ginecológico, de útero o sarcoma de tejido blando en combinación con IFN, inhibidor de COX-2 como puede ser Celebrex®, y/o sulindaco.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con diferentes tipos o estadios de tumores sólidos en combinación con celebrex, etopósido, ciclofosfamida, docetaxel, apecitabina, IFN, tamoxifeno, IL-2, GM-CSF o una combinación de estos.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con escleroderma o vasculitis cutáneo en combinación con celebrex, etopósido, ciclofosfamida, docetaxel, capecitabina, IFN, tamoxifeno, IL-2, GM-CSF o una combinación de estos.
También comprendido en la presente es un método para aumentar la dosificación de un fármaco o compuesto anti cáncer que pueda ser administrado de manera segura y eficaz a un paciente, el cual consiste en administrar al paciente (p. ej., un humano) [lacuna] o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste. Los pacientes que pueden beneficiarse con este método son aquellos que probablemente sufran de un efecto adverso asociado con los fármacos anti-cáncer para tratar un cáncer específico de la piel, tejido subcutáneo, ganglios linfáticos, cerebro, pulmón, hígado, hueso, intestino, colon, corazón, páncreas, glándula suprarrenal, riñón, próstata, mama, colorectal o combinaciones de estos. La administración de un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, alivia o disminuye los efectos adversos que sean de tal gravedad que podrían limitar la cantidad del fármaco anti-cáncer.
En una modalidad, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra por vía oral y diario en una cantidad que abarca desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 150 mg, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 mg, o desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 25 mg, antes, durante o después de la presencia del efecto adverso asociado con la administración de un fármaco anti-cáncer a un paciente. En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra en combinación con compuestos específicos como heparina, aspirina, Coumadina, o G-CSF para evitar los efectos adversos que son asociados con fármacos anticáncer, como puede ser, más no se limita a neutropenia o trombocitopenia.
En una modalidad, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, se administra a pacientes con enfermedades y trastornos asociados con o caracterizados por, angiogénesis no deseada en combinación con compuestos activos adicionales que pueden ser, más no sel imitan a, fármacos anti-cáncer, anti-inf lamatorios, antihistaminas, antibióticas, y esferoides.
En otra modalidad, comprendido en la presente es un método para tratar, prevenir y/o manejar cáncer, el cual consiste en administrar el compuesto, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, junto con (p. ej., antes, durante o después) terapia tradicional que puede ser, más no se limita a, cirugía, inmunoterapia, terapia biológica, terapia de radiación u otra terapia no basada en fármacos actualmente utilizada para tratar, prevenir o manejar cáncer. El uso combinado del compuesto que se proporciona en la presente y la terapia tradicional puede proporcionar una pauta de tratamiento única que sea inesperadamente eficaz en ciertos pacientes. Sin limitarse por la teoría, se considera que el compuesto de la Fórmula I puede proporcionar efectos aditivos o sinérgicos cuando se da al mismo tiempo con terapia tradicional.
Como se analiza en otra parte de la presente, comprendido en la presente es un método para reducir, tratar y/o prevenir los efectos adversos o no deseados asociados con el tratamiento tradicional que puede ser, más no se limita a, cirugía, quimioterapia, terapia de radiación, terapia hormonal, terapia biológica e inmunoterapia. Un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, y otro compuesto activo pueden ser administrados a un paciente antes, durante o después de la presencia del efecto asociado con el tratamiento tradicional.
En una modalidad, el compuesto puede ser administrado en una cantidad que abarca desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 150 mg, desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 25 mg, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 mg, o aproximadamente 0.5 hasta aproximadamente 4 mg por vía oral y diario, solo o en combinación con un segundo compuesto activo descrito en la presente (véase, p. ej., sección 4.3), antes, durante o después del uso de tratamiento tradicional.
En ciertas modalidades, un compuesto que se proporciona en la presente, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste, y doxetaxol se administran a los pacientes con cáncer pulmonar de células no pequeñas quienes fueron anteriormente tratados con carbo/VP 16 y radioterapia. 5.6 Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas se pueden utilizar en la preparación de formas de dosificación unitaria, individuales. Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación que se proporcionan en la presente comprenden un compuesto, o una sal aceptada para uso farmacéutico, solvato, hidrato, estereoisómero, caltrato o profármaco del mismo. Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación que se proporcionan en la presente además pueden comprender uno o más excipientes.
Las composiciones farmacéuticas y las formas de dosificación que se proporcionan en la presente también pueden comprender uno o más ingredientes activos adicionales. En la presente se describen ejemplos de segundos ingredientes activos o adicionales, opcionales.
Las formas de dosificación unitaria, individuales, son adecuadas para la administración oral, por mucosa (por ejemplo, nasal, sublingual, vaginal, bucal, o rectal), parenteral (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, inyección en bolo, intramuscular o intraarterial), tópica (por ejemplo, gotas para los ojos u otras preparaciones oftálmicas), transdérmica o transcutánea a un paciente. Ejemplos de formas de dosificación incluyen, pero no se limitan a: tabletas, caplets; cápsulas, tal como cápsulas de gelatina suave, elástica; cachets, trociscos; pastillas en forma de rombo; dispersantes, supositorios; polvos; aerosoles (por ejemplo, pulverizadores nasales o inhaladores); geles; formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración oral o por mucosa a un paciente, incluyendo suspensiones (por ejemplo, suspensiones líquidas acuosas o no acuosas, emulsiones agua en aceite, o emulsiones líquidas agua en aceite), soluciones y elíxires; formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración parenteral a un paciente; gotas oftálmicas u otras preparaciones oftálmicas adecuadas para la administración tópica; y sólidos estériles (por ejemplo, sólidos cristalinos o amorfos) que pueden reconstituirse para proporcionar formas de dosificación líquidas adecuadas para la administración parenteral a un paciente .
La composición, forma y tipo de formas de dosificación que se proporcionan en la presente, comúnmente variarán dependiendo de su uso. Por ejemplo, una forma de dosificación utilizada en el tratamiento agudo de una enfermedad, puede contener grandes cantidades de uno o más de los ingredientes activos que la componen, en comparación con una forma de dosificación utilizada en un tratamiento crónico de la misma enfermedad. Del mismo modo, una forma de dosificación parenteral puede contener cantidades más pequeñas de uno o más de los ingredientes activos que la componen, en comparación con una forma de dosificación oral utilizada para tratar la misma enfermedad. Estas y otras formas en las cuales se proporcionan formas de dosificación específicas en la presente, variarán de una a otra, serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la téenica. Véase, por ejemplo, Remington ’s Pharmaceutical Sciences , 18th ed. , Mack Publishing, Easton PA (1990).
Las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación comunes contienen uno o más excipientes. Los excipientes adecuados son bien conocidos por aquellos expertos en la téenica de la farmacia, y en la presente se proporcionan ejemplos no limitantes de excipientes adecuados. Si un excipiente particular es adecuado para la incorporación en una composición farmacéutica o forma de dosificación, depende de una variedad de factores bien conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitado a, la forma en la cual la forma de dosificación se administrará a un paciente. Por ejemplo, formas de dosificación oral como tabletas, pueden contener excipientes no adecuados para el uso en formas de dosificación parenteral. La idoneidad de un excipiente particular también puede depender de los ingredientes activos específicos en la forma de dosificación. Por ejemplo, la descomposición de algunos ingredientes activos puede acelerarse mediante algunos excipientes como lactosa, o cuando se exponen a agua. Los ingredientes activos que comprenden aminas primarias o secundarias particularmente son susceptibles a dicha descomposición acelerada. Por consiguiente, se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que contienen poca, o ninguna, lactosa u otros mono- o di- sacáridos. El término "libre de lactosa", como se utiliza en la presente, significa que la cantidad de lactosa presente, si existe, es insuficiente para incrementar sustancialmente la velocidad de degradación de un ingrediente activo.
Las composiciones libres de lactosa que se proporcionan en la presente pueden comprender excipientes que son bien conocidos en la téenica y que se enlistan, por ejemplo, en la Farmacopea de los Estados Unidos de América (USP) 25-NF20 (2002). En general, las composiciones libres de lactosa comprenden ingredientes activos, un aglutinante/material de carga, y un lubricante en cantidades farmacéuticamente compatibles y farmacéuticamente aceptables. En una modalidad, las formas de dosificación libre de lactosa comprenden ingredientes activos, celulosa microcristalina, almidón pre-gelatinizado y estearato de magnesio.
También se proporcionan en la presente, composiciones farmacéuticas anhidras y formas de dosificación que comprenden ingredientes activos, ya que el agua puede facilitar la degradación de algunos compuestos. Por ejemplo, la adición de agua (por ejemplo, 5%) es ampliamente aceptada en las téenicas farmacéuticas como un medio para simular el almacenamiento a largo plazo con el objetivo de determinar las características tales como tiempo de conservación o la estabilidad de formulaciones con el tiempo. Véase, por ejemplo, Jens T. Carstensen, Drug Stabili ty: Principies & Practice, 2d. Ed., Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp.379-80. En efecto, el agua y el calor aceleran la descomposición de algunos compuestos. Así, el efecto de agua en una formulación puede ser de gran importancia dado que la humectación y/o la humedad comúnmente se encuentran durante la fabricación, manejo, empaque, almacenamiento, embarque y uso de formulaciones.
Las composiciones farmacéuticas anhidras se pueden preparar utilizando ingredientes que sean anhidros o que contengan poca humedad y en condiciones de poca humectación o baja humedad. Las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que comprenden lactosa y cuando menos un ingrediente activo que comprende una amina primaria o secundaria de preferencia son anhidros si se espera un contacto sustancial con humectación y/o humedad durante la fabricación, empaque y/o almacenamiento.
Una composición farmacéutica anhidra debe prepararse y almacenarse de modo que se mantenga su naturaleza anhidra. En consecuencia, las composiciones anhidras de preferencia se empacan utilizando materiales conocidos para impedir la exposición al agua, de modo que pueden incluirse en kits de formulación adecuados. Ejemplos de empacado adecuado incluyen, pero no se limitan a, foils herméticamente sellados, plásticos, envases de dosis unitaria (por ejemplo, viales), envases blíster y paquetes en tiras.
También se proporcionan en la presente composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que comprenden uno o más compuestos que reducen la velocidad por la cual se descompondrá un ingrediente activo. Dichos compuestos, que se denominan en la presente como "estabilizadores", incluyen, pero no se limitan a, antioxidantes como ácido ascórbico, soluciones amortiguadoras de pH o soluciones amortiguadoras de sal. 5.7 Formas de dosificación oral Las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para la administración oral se pueden presentar como formas de dosificación discretas, tal como, pero no limitado a, tabletas (por ejemplo, tabletas masticables), caplets, cápsulas y líquidos (por ejemplo, jarabes saborizados). Dichas formas de dosificación contienen cantidades predeterminadas de ingredientes activos, y pueden prepararse mediante métodos de farmacia bien conocidos por aquellos expertos en la téenica. Véase, en general, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing, Easton PA (1990).
Las formas orales de dosificación comunes se preparan combinando los ingredientes activos en una mezcla íntima con cuando menos un excipiente de acuerdo con las técnicas de composición farmacéutica convencionales. Los excipientes pueden tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para la administración. Por ejemplo, excipientes adecuados para el uso en formas de dosificación oral liquida o en aerosol incluyen, pero no se limitan a, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservadores y agentes colorantes. Ejemplos de excipientes adecuados para el uso en formas de dosificación oral, sólida (por ejemplo, polvos, tabletas, cápsulas y caplets) incluyen, pero no se limitan a, almidones, azúcares, celulosa micro cristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes y agentes desintegradores.
Debido a su facilidad de administración, las tabletas y cápsulas representan las formas de dosificación unitaria oral más ventajosa, en cuyo caso se emplean excipientes sólidos. Si se desea, las tabletas se pueden recubrir mediante téenicas acuosas o no acuosas normalizadas. Dichas formas de dosificación se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos de farmacia. En general, las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación se preparan mezclando uniforme e íntimamente los ingredientes activos con portadores líquidos, portadores sólidos finamente divididos o ambos, y después conformando el producto en la presentación deseada si es necesario.
Por ejemplo, una tableta puede prepararse mediante compresión o moldeado. Las tabletas comprimidas pueden prepararse en una máquina adecuada, comprimiendo los ingredientes activos en una forma de flujo libre, tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un excipiente. Las tabletas moldeadas se pueden hacer moldeando una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte, en una máquina adecuada.
Ejemplos de excipientes que se pueden utilizar en formas de dosificación oral que se proporcionan en la presente incluyen, pero no se limitan a, aglutinantes, materiales de carga, desintegradores y lubricantes. Los aglutinantes adecuados para el uso en composiciones farmacéuticas y formas de dosificación incluyen, pero no se limitan a, almidón de maíz, almidón de papa, u otros almidones, gelatina, gomas sintética o natural tales como acacia, alginato de sodio, ácido algínico, otros alginatos, tragacanto en polvo, goma guar, celulosa y sus derivados (por ejemplo, etil celulosa, acetato de celulosa, calcio carboximetil celulosa, carboximetil celulosa de sodio), polivinil pirrolidona, metil celulosa, almidón pregelatinizado, hidroxipropil metil celulosa, (por ejemplo, Nos.2208, 2906, 2910), celulosa microcristalina y mezclas de los mismos.
Las formas adecuadas de celulosa microcristalina incluyen, pero no se limitan a, los materiales comercializados como AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103 AVICEL RC-581, AVICEL-PH-105 (disponibles en la Corporación FMC, American Viseóse División, Avicel Sales, Marcus Hook, PA), y mezclas de los mismos. Un aglutinante específico es una mezcla de celulosa microcristalina y carboximetil celulosa de sodio que se vende como AVICEL RC-581. Anhidros adecuados o excipientes o aditivos de baja humectación incluyen AVICEL-PH-103™ y Starch 1500 LM.
Ejemplos de material de carga adecuado para el uso en las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación descritas en la presente incluyen, pero no se limitan a talco, carbonato de calcio (por ejemplo, gránulos o polvo), celulosa microcristalina, celulosa en polvo, dextratos, caolín, manitol, ácido silícico, sorbitol, almidón, almidón pregelatinizado y mezclas de los mismos. El aglutinante o material de carga en composiciones farmacéuticas de la invención comúnmente se presenta en, desde aproximadamente 50 a aproximadamente 99 por ciento en peso, de la composición farmacéutica o forma de dosificación.
Los desintegradores se utilizan en composiciones para proporcionar tabletas que se desintegren cuando se exponen a un ambiente acuoso. Las tabletas que contienen demasiado desintegrador se pueden desintegrar durante el almacenamiento, mientras que aquellas que contienen muy poco, podrían no desintegrarse a una velocidad deseada o bajo las condiciones deseadas. Así, una cantidad suficiente de desintegrador, que no sea ni demasiado ni muy poco para modificar perjudicialmente la liberación de los ingredientes activos, debería utilizarse para formar formas orales de dosificación, sólidas. La cantidad de desintegrador utilizado varía con base en el tipo de formulación, y es rápidamente discernible para aquellos expertos en la téenica. Las composiciones farmacéuticas comunes comprenden desde aproximadamente 0.5 a aproximadamente 15 por ciento en peso de desintegrador, de preferencia desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 por ciento en peso de desintegrador.
Los desintegradores que se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas y formas de dosificación incluyen, pero no se limitan a, agar agar, ácido alginico, carbonato de calcio, celulosa microcristalina, croscamelosa de sodio, crospovidona, polacrilina de potasio, almidón glicolato de sodio, almidón de papa o tapioca, otros almidones, almidón pregelatinizado, otros almidones, arcillas, otras alginas, otras celulosas, gomas y mezclas de los mismos.
Los lubricantes que se pueden utilizar en composiciones farmacéuticas y formas de dosificación incluyen, pero no se limitan a, estearato de calcio, estearato de magnesio, aceite mineral, aceite mineral ligero, glicerina, sorbitol, manitol, polietilenglicol, otros glicoles, ácido esteárico, lauril sulfato de sodio, talco, aceite vegetal hidrogenado (por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya), estearato de cinc, oleato de etilo, laurato de etilo, agar y mezclas de los mismos. Lubricantes adicionales incluyen, por ejemplo, un gel de sílice siloide (AEROSIL200, fabricado por W.R. Grace Co. de Baltimore, MD) , un aerosol coagulado de sílice sintético (comercializado por Degussa Co. de Piano, TX), CAB-O-SIL (un producto de dióxido de silicio pirógeno vendido por Cabot Co. de Boston, MA), y mezclas de los mismos. Si se utilizan, los lubricantes comúnmente se utilizan en una cantidad menor gue aproximadamente 1 por ciento en peso de las composiciones farmacéuticas o formas de dosificación en las que se incorporan.
En una modalidad de la invención, una forma de dosificación oral, sólida, comprende un compuesto que se proporciona en la presente, lactosa anhidra, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, ácido esteárico, sílice anhidro coloidal y gelatina. 5.8 Formas de dosificación de liberación retardada Los ingredientes activos pueden administrarse a través de medios de liberación controlada o por dispositivos de suministro que son bien conocidos por aquellos expertos ordinarios en la téenica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos de América Nos.: 3,845,770; 3,916,899; 3,536,809; 3,598,123; y 4,008,719, 5,674,533, 5,059,595, 5,591,767, 5,120,548, 5,073,543, 5,639,476, 5,354,556, y 5,733,566, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. Dichas formas de dosificación se pueden utilizar para proporcionar liberación controlada o lenta de uno o más ingredientes activos utilizando, por ejemplo, hidropropilmetil celulosa, otras matrices poliméricas, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos, recubrimientos multicapa, micropartículas, liposomas, microesferas, o una combinación de las mismas para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables. Las formulaciones de liberación controlada adecuadas, bien conocidas por aquellos expertos ordinarios en la técnica, incluyendo aquellas descritas en la presente, pueden seleccionarse fácilmente para usarse con los ingredientes activos que se proporcionan en la presente. De esta forma, se proporciona en la presente formas de dosificación unitaria, individuales, adecuadas para la administración oral, tales como, pero no limitado a, tabletas, cápsulas, cápsulas de gel y caplets que se adaptan para la liberación controlada.
Todos los productos farmacéuticos de liberación controlada tienen el objetivo común de mejorar el tratamiento farmacológico respecto al alcanzado por las contrapartes de liberación no controlada. Idealmente, el uso de una preparación de liberación controlada óptimamente diseñada para el tratamiento médico se caracteriza por un mínimo de sustancia activa que se emplea para curar o controlar la condición en una cantidad mínima de tiempo. Las ventajas de las formulaciones de liberación controlada incluyen actividad prolongada del medicamento, frecuencia de dosificación reducida y un aumento del cumplimiento del paciente. Además, las formulaciones de liberación controlada se pueden utilizar para influir en el tiempo de inicio de la acción o de otras características, tal como los niveles del fármaco en la sangre, y por lo tanto, que puede afectar la existencia de efectos secundarios (por ejemplo, adversos).
La mayoría de las formulaciones de liberación controlada se diseñan para liberar inicialmente una cantidad de medicamento (ingrediente activo) que rápidamente produce el efecto terapéutico deseado, y la liberación gradual continua de otras cantidades de medicamento para mantener este nivel de efecto terapéutico o profiláctico durante un periodo de tiempo prolongado. Con el fin de mantener este nivel constante de medicamento en el cuerpo, el medicamento debe ser liberado desde la forma de dosificación a una velocidad que remplace la cantidad de medicamento que se metaboliza y excreta del cuerpo. La liberación controlada de un ingrediente activo puede ser estimulada mediante varias condiciones incluyendo, pero no limitado a, el pH, temperatura, enzimas, agua u otras condiciones o compuestos fisiológicos. 5.9 Formas de dosificación parenteral Las formas de dosificación parenteral se pueden administrar a los pacientes por varias rutas incluyendo, pero no limitado a, subcutánea, intravenosa (incluyendo inyección en bolo), intramuscular e intraarterial . Debido a que su administración comúnmente evita las defensas naturales de los pacientes contra los contaminantes, las formas de dosificación parenteral de preferencia son estériles o capaces de esterilizarse antes de la administración a un paciente. Ejemplos de formas de dosificación parenteral incluyen, pero no se limitan a, soluciones listas para la inyección, productos secos listos para disolverse o formarse en suspensión en un vehículo farmacéuticamente aceptable para la inyección, suspensiones listas para la inyección y emulsiones.
Los vehículos adecuados que se pueden utilizar para proporcionar formas de dosificación parenteral son bien conocidos por aquellos expertos en la téenica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: agua para inyección USP; vehículos acuosos tal como, pero no limitado a, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, e inyección de Ringer con lactato; los vehículos miscibles en agua tales como, pero no limitados a, alcohol etílico, polietilenglicol y polipropilenglicol y vehículos no acuosos tales como, pero no limitado a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, oleato de etilo, miristato de isopropilo, y benzoato de bencilo.
Los compuestos que incrementan la solubilidad de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente, también se pueden incorporar a las formas de dosificación parenteral que se proporcionan en la misma. Por ejemplo, ciclodextrina y sus derivados se pueden utilizar para aumentar la solubilidad de un compuesto y sus derivados. Véase , por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de América No. 5,134,127, la cual se incorpora en la presente como referencia. 5.10 Formas de dosificación tópica y por mucosa Las formas de dosificación tópica y por mucosa que se proporcionan en la presente incluyen, pero no se limitan a, pulverizadores, aerosoles, soluciones, emulsiones, suspensiones, gotas oftálmicas u otras preparaciones oftálmicas, u otras formas conocidas por aquellos expertos en la téenica. Véase, por ejemplo, Remington ’s Phar aceutical Sciences, 16a y 18a eds., Mack Publishing, Easton PA (1980 & 1990); y Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4a ed., Lea & Febiger, Philadelphia (1985). Las formas de dosificación adecuadas para el tratamiento de tejidos de mucosas dentro de la cavidad oral pueden formularse como enjuagues bucales o geles orales.
Excipientes adecuados (por ejemplo, portadores y diluyentes) y otros materiales que pueden utilizarse para proporcionar formas de dosificación tópica y por mucosa son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica farmacéutica, y dependen del tejido en particular al cual se aplicará una composición farmacéutica o dosis dada.
Con ese hecho en mente, los excipientes tópicos incluyen, pero no se limitan a, agua, acetona, etanol, etilenglicol, propilenglicol, butano-1,3-diol, miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, aceite mineral, y mezclas de los mismos para formar soluciones, emulsiones o geles, que no son tóxicos y son farmacéuticamente aceptables. Los hidratantes o humectantes también se pueden añadir a composiciones farmacéuticas y formas de dosificación si se desea. Ejemplos de dichos ingredientes adicionales son bien conocidos en la téenica. Véase, por ejemplo, Remington ’s Pharmaceutical Sciences , 16 - y 18a eds., Mack Publishing, Easton PA (1980 & 1990).
El pH de una composición farmacéutica o forma de dosificación también se puede ajustar para mejorar el suministro de uno o más ingredientes activos. De forma similar, la polaridad de un portador disolvente, su fuerza iónica, o tonicidad se puede ajustar para mejorar el suministro. Los compuestos tales como estearatos solamente pueden añadirse a composiciones farmacéuticas o formas de dosificación para alterar ventajosamente el valor hidrófilo o hipófilo de uno o más ingredientes activos a fin de mejorar el suministro. A este respecto, los estearatos pueden servir como un vehículo de lípidos para la formulación, como un agente emulsionante o tensoactivo, y como un agente que mejora el suministro o para mejorar la penetración. Diferentes sales, hidratos o solvatos de los ingredientes activos se pueden utilizar para ajustar adicionalmente las propiedades de la composición resultante. 5.11 Kits En una modalidad, los ingredientes activos que se proporcionan en la presente no se administran a un paciente en el mismo momento o por la misma vía de administración. En otra modalidad, se proporcionan kits los cuales pueden simplificar la administración de cantidades apropiadas de ingredientes activos a un paciente.
En una modalidad un kit que se proporciona en la presente consiste en un compuesto que se proporciona en la presente o una sal, solvato o hidrato aceptado para uso farmacéutico de éste. Los kits además pueden comprender compuestos activos, que incluyen pero no se limitan a los descritos en la presente.
Los kits que se proporcionan en la presente además pueden consistir en los dispositivos que se utilizan para administrar los ingredientes activos. Los ejemplos de tales dispositivos incluyen, más no se limitan a, jeringas, goteros, bolsas de goteo, parches e inhaladores.
Los kits además pueden comprender células o sangre para el trasplante así como vehículos aceptados para uso farmacéutico que se puede utilizar para administrar uno o más ingredientes activos. Por ejemplo, si se proporciona un ingrediente activo en una forma sólida que se debe reconstituir para la administración parenteral, el kit puede comprender un envase sellado de un vehículo adecuado en el cual se puede disolver el ingrediente activo para formar una solución estéril libre de partículas que es adecuada para la administración parenteral. Ejemplos de vehículos aceptados para uso farmacéutico incluyen, mas no se limitan a: agua para inyección USP, vehículos acuosos tales como, pero no se limitan a, inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa, inyección de dextrosa y cloruro de sodio e inyección de Ringer con lactato; vehículos miscibles en agua tales como, pero no se limitan a, alcohol etílico, polietilenglicol , y polipropilen glicol; y vehículos no acuosos tales como, pero no se limitan a, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuate, aceite de ajonjolí, oleato de etilo, miristato de isopropilo y benzoato de bencilo. 5.12 Anticuerpos Los anticuerpos que se unen inmunoespecíticamente a CRBN (anticuerpos contra CRBN) que se proporcionan en la presente pueden ser, más no se limitan a, anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos producidos por métodos recombinantes, anticuerpos multiespecíticos (incluso anticuerpos bi-especíticos), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, intracuerpos, Fvs monocatenario (scFv) (p. ej., incluye monoespecífico, biespecífico, etc.), anticuerpos camelizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs con enlaces disulfuro (sdFv), anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión al antígeno o de unión al epítope de cualquiera de los anteriores.
En particular, los anticuerpos que se proporcionan en la presente incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones con actividad inmunológica de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN. Las moléculas de inmunoglobulina que se proporcionan en la presente pueden ser de cualquier tipo (p. ej., igG, igE, igM, igD, IgA e IgY), clase (p. ej., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. En una modalidad específica, un anticuerpo que se proporciona en la presente es un anticuerpo IgG, y, en ciertas modalidades, un IgGl o IgG4.
También se proporciona en la presente un anticuerpo anti CRBN aislado, por ejemplo, "CRBN70", tal y como se prepara de acuerdo con el Ejemplo 6.20 o 6.21 más adelante. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal de conejo. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de conejo.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un anticuerpo aislado que se une inmunoespecíficamente el epítope que tenga una secuencia de aminoácidos EEFHGRTLHDDDC (SEQ ID: 1). En otra modalidad, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente al epítope que tenga una secuencia de aminoácidos EEFHGRTLHDDDC (SEQ ID: 1), en donde el péptido se acopla a hemocianina del molusco llamado Lapa californiana (KLH). En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal de conejo. En otras modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de conejo. En ciertas modalidades, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente al péptido 65-76 (ID SEC NO: 1) de CRBN humano (ID SEC NO: 12).
En ciertas modalidades, en la presente se proporciona un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CRBN y contiene un cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 5, O el dominio VH, VH CDRl, VH CDR2 y/o VH CDR3 de éste. En otra modalidad, el anticuerpo se une inmunoespecíficamente a CRBN y comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 7, o el dominio VL, VL CDRl, VL CDR2 y/o VL CDR3 de éste. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una cadena pesada que tenga la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 5, o el dominio VH, VH CDRl, VH CDR2 y/o VH CDR3 de éste; y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 7, o el dominio VL, VL CDRl, VL CDR2, y/o VL CDR3 de éste. En ciertas modalidades, el anticuerpo se une in unoespecíticamente a CRBN y comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 9, o el dominio VH, VH CDRl, VH CDR2 y/o VH CDR3 de éste. En otra modalidad, el anticuerpo se une inmunoespecífreamente a CRBN y comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 11, o el dominio VL, VL CDRl, VL CDR2 y/o VL CDR3 de éste. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 9, o el dominio VH, VH CDRl, VH CDR2 y/o VH CDR3 de éste; y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 11, o el dominio VL, VL CDRl, VL CDR2 y/o VL CDR3 de éste. En ciertas modalidades, el anticuerpo se une inmunoespecíticamente al péptido 65-76 (ID SEC NO: 1) de CRBN humano (ID SEC NO: 12).
Cualquiera de los anticuerpos contra CRBN proporcionados en la presente puede utilizarse en cualquiera de los métodos que se proporcionan en la presente.
Las variantes y derivados de los anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un epítope. Los fragmentos ejemplares incluyen fragmentos Fab (un fragmento de anticuerpo que contiene el dominio de unión al antígeno y consiste en una cadena ligera y parte de una cadena pesada unidas por un puente disulfuro); Fab' (un fragmento de anticuerpo que contiene un solo dominio de unión al antígeno que comprende un Fab y una parte adicional de la cadena pesada a través de la región bisagra); F(ab')2 (dos moléculas Fab' unidas por enlaces disulfuro intercatenarios en las regiones bisagra de las cadenas pesadas; las moléculas Fab' pueden estar dirigidas hacia el mismo epítope o diferente); un Fab biespecífico (una molécula Fab que tiene dos dominios de unión al antígeno, cada uno de los cuales puede estar dirigido a un epítope diferente) ; una cadena Fab monocatenaria que contenga una región variable, también conocido como un sFv (la región determinativa de unión al antígeno, variable, de una sola cadena ligera y pesada de un anticuerpo ligadas entre sí por una cadena de 10-25 aminoácidos); un Fv con enlaces disulfuro o dsFv (la región determinativa de unión al antígeno, variable, de una sola cadena ligera y pesada de un anticuerpo ligadas entre sí por un enlace disulfuro); un dominio VH camelizado (la región determinativa de unión al antígeno, variable, de una sola cadena pesada de un anticuerpo en la cual algunos aminoácidos en la interfaz VH son aquellos que se encuentran en la cadena pesada de los anticuerpos de camello naturales); un sFv biespecífico (una molécula sFv o una dsFv que tenga dos dominios de unión al antígeno, cada uno de los cuales puede estar dirigido a un epitope diferente); un diacuerpo (un sFv dimerizado formado cuando el dominio VH de un primer sFv se ensambla con el dominio VL de un segundo fragmento sFv y el dominio VL del primer fragmento sFv se ensambla con el dominio VH del segundo fragmento sFv; las dos regiones de unión al antigeno del diacuerpo pueden estar dirigidas hacia los mismos epítopes o diferentes); y un triacuerpo (un fragmento sFv trimerizado, formado en una forma semejante a un diacuerpo, pero en el cual tres dominios de unión al antigeno son creados en un solo complejo; los tres dominios de unión al antígeno pueden estar dirigidos hacia los mismos epítopes o diferentes). Los derivados de anticuerpos también incluyen una o más secuencias CDR de un sitio de combinación del anticuerpo. Las secuencias CDR pueden estar unidas entre sí sobre un andamio cuando están presentes dos o más secuencias CDR. En ciertas modalidades, el anticuerpo contra CRBN contiene un Fv monocatenario ("scFv"). El fragmento scFvs son fragmentos de anticuerpos que contienen los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. En general, el polipéptido scFv además contiene un ligador polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al fragmento scFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para hacer una revisión de los fragmentos scFvs véase Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
En la presente se proporcionan los anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a un epítope CRBN, los anticuerpos que contienen los derivados de las cadenas VH y VL que se describen en la presente que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN o a un epítope CRBN. Para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de la invención es posible utilizar las téenicas normalizadas conocidas para los expertos en la materia como pueden ser, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR las cuales dan lugar a sustituciones de aminoácidos. Preferentemente, los derivados incluyen sustituciones de menos de 25 aminoácidos, sustituciones de menos de 20 aminoácidos, sustituciones de menos de 15 aminoácidos, sustituciones de menos de 10 aminoácidos, sustituciones de menos de 5 aminoácidos, sustituciones de menos de 4 aminoácidos, sustituciones de menos de 3 aminoácidos o sustituciones de menos de 2 aminoácidos respecto a la molécula original. En una modalidad preferida, los derivados que tienen sustituciones conservadoras de aminoácidos se preparan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la cual el residuo de aminoácido es sustituido con un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral con una carga semejante. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con carga semejante han sido identificadas en la téenica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisterna), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, Valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación beta (p. ej., treonina, valina isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). En otra versión, las mutaciones pueden ser introducidas en forma aleatoria a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, como puede ser por mutagénesis por saturación, y los imitantes resultantes pueden ser explorados para determinar su actividad biológica con el fin de identificar a mutantes que conserven actividad. Después de la mutagénesis, se puede expresar la proteína codificada y se puede determinar la actividad de la proteína.
En otra modalidad, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un epítope CRBN contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%), al menos 95%, o al menos 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de CGN-6-1-11 OR CGN-6-1-11, o un fragmento de unión al antígeno de éstas, como puede ser un dominio VH, dominio VL, cadena VH o cadena VL. En una modalidad, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un epítope CRBN contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos representada en las ID SEC NOS: 5, 7, 9 u 11.
En una modalidad específica, un anticuerpo que se une in unoespecíficamente a un antígeno CRBN contiene una secuencia de aminoácidos de una cadena VH y/o una secuencia de aminoácidos de una cadena VL codificada por una secuencia de nucleótidos que híbrida a: (1) el complemento de una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las cadenas VH y/o VL representada por las ID SEC NOS: 5 o 9 (cadena H) y/o las ID SEC NOS: 7 u 11 (cadena L) en condiciones restrictivas (p. ej ., hibridación a DNA unido al filtro en 6x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 452C seguido por uno o más lavados en 0.2xSSC/0.1% SDS a aproximadamente 50-65aC) en condiciones altamente restrictivas (p. ej., hibridación al ácido nucleico unido al filtro en 6xSSC a aproximadamente 45eC seguido por uno o más lavados en 0.1xSSC/0.2% SDS a aproximadamente 682C), o en otras condiciones de hibridación restrictivas las cuales son conocidas para los expertos en la téenica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wilcy & Sons, Inc., New York en las páginas 6.3.1-6.3.6 y 2.10.3).
Los anticuerpos contra CRBN pueden ser de cualquier origen animal como aves y mamíferos (p. ej., humano, murino, burro, oveja, conejo, cabra, cobayo, camello, caballo o pollo). En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CRBN son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Cuando se utiliza en la presente, anticuerpos "humanos" incluye anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluye anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de ratones que expresan anticuerpos de genes humanos.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CRBN son anticuerpos completamente humanos, como pueden ser los anticuerpos completamente humanos que se unen inmunoespecíficamente a un polipéptido CRBN, un fragmento de polipéptido CRBN o un epítope CRBN. Tales anticuerpos completamente humanos serían ventajosos sobre los anticuerpos completamente de ratón (u otros anticuerpos de especie no humana completos o parciales), anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos para llevar al mínimo la presencia de efectos colaterales no deseados o no necesitados, como pueden ser las respuesta inmunológicas dirigidas hacia anticuerpos no completamente humanos (p. ej., anticuerpos contra CRBN obtenidos de otras especies) cuando se administran a un individuo.
Los anticuerpos anti-CRBN que se proporcionan en la presente pueden ser monoespecíficos, biespecíficos , triespecíficos o de multiespecificidad más grande. Los anticuerpos multiespecificos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido CRBN o pueden ser específicos para un polipéptido CRBN así como para un epítope heterólogo, como puede ser un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. En ciertas modalidades, los anticuerpos que se proporcionan en la presente son monoespecíficos para un determinado epítope de un polipéptido CRBN y no se unen inmunoespecíficamente a otros epítopes.
En ciertas modalidades, en la presente se proporcionan anticuerpos contra CRBN que se unen inmunoespecíficamente a un epítope CRBN (p. ej ., EEFHGRTLHDDD (ID SEC NO: 1) o al péptido 65-76 de CRBN humano (ID SEC NO: 12)) o un antígeno CRBN, así como los métodos para utilizarlos.
Se pueden utilizar las téenicas normalizadas conocidas por los expertos en la técnica para introducir mutaciones en la frecuencia de nucleótidos que codifican un anticuerpo anti-CRBN proporcionado en la presente, que incluye, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis en las que interviene la PCR, las cuales dan lugar a las sustituciones de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la cual el residuo de aminoácido es sustituido con un residuo de aminoácido que tenga una cadena lateral con un cambio semejante. Las familias de los residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cambios semejantes han sido identificadas en la téenica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (p. ej., lisina, arginina, histidina, cadenas laterales ácidas (p. ej., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (p. ej., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (p. ej., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales con ramificaciones beta (p. ej., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (p. ej., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). De otra manera, las mutaciones pueden ser introducidas al azar a lo largo de toda o parte de la secuencia codificadora, como puede ser por mutagénesis por saturación, y las mutaciones resultantes pueden ser exploradas para determinar la actividad biológica para identificar mutantes que conserven la actividad. Luego de la mutagénesis, la proteína codificada puede ser expresada y se puede determinar la actividad de la proteína.
En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo anti CRBN humano, completamente humano, como puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano. Los anticuerpos completamente humanos pueden ser producidos por cualquier método conocido en la téenica. Los métodos ejemplares incluyen inmunización con un antígeno CRBN (cualquier polipéptido CRBN que pueda desencadenar una respuesta inmunológica, y como una opción, conjugarse a un portador) de animales transgénicos (p. ej., ratones) que sea capaz de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena; véase, p. ej., Jakobovits et al., (1993) Proc. Nati. Acad. Sci ., 90:2551; Jakobovits et al., (1993) Nature, 362:255 258 (1993); Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol., 7:33. Otros métodos para producir anticuerpos anti-CRBN se pueden encontrar en los ejemplos que se proporcionan más adelante.
De otro modo, los anticuerpos completamente humanos pueden ser generados a través de la exploración in vi tro de fagos presentadores de bibliotecas de anticuerpos; véase p. ej., Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991), incorporadas en la presente para referencia. Se han descrito diversos fagos presentadores de bibliotecas de anticuerpos y pueden ser preparados fácilmente por un experto en la téenica. Las bibliotecas pueden contener una diversidad de secuencias de anticuerpos humanos, como pueden ser los fragmentos Fab, Fv y scFv humanos, que pueden ser exploradas contra una diana apropiada.
Los anticuerpos anti-CRBN incluyen anticuerpos que estén químicamente modificados, es decir, por unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, pero no como limitación, los derivados de anticuerpo incluyen anticuerpos que han sido químicamente modificados, p. ej ., por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivación por grupos protectores/bloqueadores conocidos, desdoblamiento proteolítico, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas se pueden llevar a cabo por las técnicas conocidas como pueden ser, más no se limitan a, el desdoblamiento químico específico, acetilación, formulación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc.
Además el anticuerpo puede contener uno o más aminoácidos no tradicionales.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CRBN que se unen inmunoespecífreamente a un antígeno CRBN contienen una región de entramado conocida para los expertos en la téenica (p. ej., un fragmento humano o no humano). La región de entramado puede, por ejemplo, ser regiones de entramado naturales o consenso. En algunas modalidades, la región de entramado de un anticuerpo anti-CRBN es humana (véase, p. ej., Chothia et al, 1998, J. Mol. Biol. 278:457-479 para ver el listado de las regiones de entramado humanas, la cual se incorpora para referencia en su totalidad). Véase también Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (Departamento de Salud y Servicios humanos de EUA, Washington, D.C.) 5a ed.
En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CRBN proporcionados en la presente son anticuerpos quiméricos o humanizados. En algunas modalidades, los anticuerpos que se proporcionan en la presente contienen regiones de entramado humanas con uno o más sustituciones de aminoácidos en uno, dos o tres o más de los residuos siguientes: (a) residuos de entramado raros que difieren entre el entramado del anticuerpo murino (es decir, el entramado del anticuerpo donador) y el entramado del anticuerpo humano (es decir, el entramado del anticuerpo aceptor); (b) residuos de la zona Venier cuando difieren entre el entramado del anticuerpo donador y el entramado del anticuerpo aceptor; (c) residuos de empaque intercatenarios en la interfaz VH/VL que difieren entre el entramado del anticuerpo donador y el entramado del anticuerpo aceptor; (d) residuos canónicos los cuales difieren entre las secuencias del entramado del anticuerpo donador y del entramado del anticuerpo aceptor, particularmente las regiones de entramado críticas para la definición de la clase canónica de los bucles CDR del anticuerpo murino; (e) residuos que estén adyacentes a una CDR; (g) residuos capaces de interactuar con el antígeno; (h) residuos capaces de interactuar con la CDR; y (i) residuos de contacto entre el dominio VH y el dominio VL. En ciertas modalidades, los anticuerpos que se unen inmunoespecí ficamente a un antígeno CRBN contienen las regiones del entramado humano con una o más sustituciones de aminoácido en uno, dos, tres o más de los residuos antes identificados son anticuerpos anti CRBN antagonistas.
En otras modalidades, se proporcionan proteínas de fusión que contienen un anticuerpo anti-CRBN que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN y un polipéptido heterólogo. 5.13 Uso de diagnóstico de anticuerpos Los anticuerpos etiquetados con CRBN que se proporcionan en la presente y derivados y análogos de estos, que se unen inmunoespecíticamente a un antígeno CRBN pueden utilizarse para propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar o vigilar los niveles de expresión de CRBN de una enfermedad mediada por CRBN en un paciente.
En algunas modalidades, en la presente se proporcionan los métodos para utilizar un anticuerpo CRBN para medir los niveles de expresión de CRBN en el tumor o células hospederas del paciente, para predecir la respuesta clínica a la terapia con talidomida, lenalidomida , pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il) -piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste. También se proporcionan en la presente los métodos para utilizar un anticuerpo CRBN que se proporciona en la presente para medir los niveles de expresión de CRBN en el tumor o células hospederas del paciente, para vigilar la respuesta clínica a la terapia con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il )-piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste. También se proporcionan en la presente los métodos para utilizar un anticuerpo CRBN que se proporciona en la presente para medir los niveles de expresión de CRBN en el tumor o células hospederas del paciente, para vigilar el cumplimiento del paciente con la dosificación de una terapia con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3 -il)-piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste. También en la presente se proporcionan los métodos para utilizar un anticuerpo CRBN que se proporciona en la presente para medir los niveles de expresión de CRBN en el tumor o células hospederas del paciente, para vigilar el desarrollo de la resistencia a la terapia con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo- 4H-quinazolin-3 -il ) -piperidin-2 , 6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste.
En la presente se proporcionan los ensayos para diagnóstico de una enfermedad mediada por CRBN que consisten en: (a) ensayo para el nivel de un antígeno CRBN en células o una muestra de tejido de un individuo utilizando uno o más anticuerpos de la invención que se unen inmunoespecíficamente al antigeno CRBN; y (b) comparar el nivel del antígeno CRBN con un nivel testigo, p. ej., niveles en muestras de tejido normal, por lo que un aumento en el nivel de antígeno CRBN sometido a ensayo en comparación con el nivel testigo del antígeno CRBN es indicativo de una enfermedad mediada por CRBN.
Los anticuerpos que se proporcionan en la presente pueden ser utilizados en los ensayos de niveles de antígeno CRBN en una muestra biológica utilizando métodos inmunohistológicos clásicos como se describe en la presente o se conoce por aquellos expertos en la téenica (p. ej., véase Jalkanen et ah, 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; y Jalkanen et ah, 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096). Otros métodos con base en anticuerpos útiles para detectar expresión génica de proteínas incluyen inmunoensayos, como puede ser el ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA) y el radioinmunensayo (RIA). Las etiquetas de ensayo de anticuerpos adecuados se conocen en la téenica e incluyen etiquetas de enzimas, como puede ser, glucosa oxidasa; radioisótopos, como yodo (125l, 121l), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (121In), y tecnecio (99Tc); etiquetas luminiscentes, como luminol; y etiquetas fluorescentes, como fluoresceína y rodamina, y biotina.
En la presente se proporcionan los métodos para la detección de CRBN en un paciente. En una modalidad, el método consiste en: a) la administración (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) a un individuo de una cantidad eficaz de un anticuerpo etiquetado que se une inmunoespecíficamente a un antígeno CRBN; b) esperar durante un intervalo de tiempo después de la administración para permitir al anticuerpo etiquetado concentrarse preferencialmente en sitios en el individuo en donde se expresa el antígeno CRBN (y para la molécula marcada no unida sea eliminada al nivel del fondo); c) determinar el nivel de fondo; y d) detectar el anticuerpo marcado en el individuo, de modo que la detección del anticuerpo marcado por encima del nivel de fondo indique que el individuo tiene la expresión de CRBN aumentada. El nivel de fondo puede ser determinado mediante diversos métodos que incluyen, comparar la cantidad de la molécula etiquetada detectada con un valor patrón previamente determinado para un sistema particular.
Se entenderá en la téenica que el tamaño del individuo y el sistema de imágenes utilizado determinarán la cantidad de la porción de imágenes para producir imágenes de diagnóstico. En el caso de una porción radioisótopo, para un individuo humano, la cantidad de radioactividad inyectada normalmente estará en el intervalo desde aproximadamente 5 a 20 milicuries de 99Tc. El anticuerpo marcado se acumulará entonces preferentemente en la ubicación de las células que contienen la proteína específica. Las imágenes del tumor in vivo se describen en S.W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments. " (Capítulo 13 en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cáncer, S.W. Burchiel and B.A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
Dependiendo de diferentes variables, incluido el tipo de marcado utilizado y el modo de administración, el intervalo de tiempo después de la administración para permitir que el anticuerpo marcado preferentemente se concentre en sitios del individuo y para que el anticuerpo marcado no unido sea eliminado al nivel de fondo es de 6 a 48 horas o 6 a 24 horas o 6 a 12 horas. En otra modalidad el intervalo de tiempo después de la administración es 5 a 20 días o 5 a 10 días. La presencia de la molécula marcada puede ser detectada en el individuo utilizando métodos conocidos en la téenica para la exploración in vivo. Estos métodos dependen del tipo de etiqueta utilizada. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar el método apropiado para detectar una etiqueta o marcado particular. Los métodos y dispositivos que pueden utilizarse en los métodos de diagnóstico de la invención incluyen, más no se limitan a, tomografía computarizada (CT), exploración de cuerpo entero como puede ser la tomografía por emisión de positrones (PET), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) y sonografía.
En una modalidad específica, la molécula se etiqueta con un radioisótopo y se detecta en el paciente utilizando un instrumento quirúrgico sensible a la radiación (Thurston et al., Patente U.S. No.5,441,050). En otra modalidad, la molécula se etiqueta con un compuesto fluorescente y se detecta en el paciente utilizando un instrumento de exploración sensible a fluorescencia. En otra modalidad, la molécula se etiqueta con un metal emisor de positrones y se detecta en el paciente utilizando tomografía por emisión de positrones. En todavía otra modalidad, la molécula se etiqueta con una etiqueta paramagnética y se detecta en un paciente utilizando formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). 6. EJEMPLOS Ciertas modalidades de la invención se ilustran mediante los siguientes ejemplos no limitativos. 6.1 Preparación de 3-(4-amino-1-oxo-l,3- dihidro-isoindol-2-il)-piperidin-2,6-diona (lenalidomida) 2-bromometil -3 -ni tr obenzoato de metilo Una mezcla en agitación de 2-metil-3-nitrobenzoato de metilo (14.0 g, 71.7 m ol) y N-bromosuccinimida (15.3 g, 86.1 mmol) en tetracloruro de carbono (200 mL) se calentó a reflujo suave durante 15 horas mientras que una bombilla de 100W situada a 2 cm de distancia brillaba en el matraz. La mezcla fue filtrada y el sólido fue lavado con cloruro de metileno (50 mL). El filtrado fue lavado con agua (2x100 mL), salmuera (100 mL) y se secó. El disolvente fue eliminado en vacío y el residuo fue purificado por cromatografía instantánea (hexano/acetato de etilo, 8/2) para producir 19 g (96%) del producto como un sólido amarillo: pf (punto de fusión) 70.0-71.5SC; XH NMR (CDCl3) d 8.12-8.09 (dd, J=1.3 y 7.8 Hz, 1H), 7.97- 7.94 (dd, J=1.3 y 8.2 Hz, 1H), 7.54 (t, J=8.0 Hz, 1H). 5.15 (s, 2H), 4.00 (s, 3H),- 13C NMR (CDC13) d 165.85, 150.58, 134.68, 132.38, 129.08, 127.80, 53.06, 22.69; HPLC, Water Nove-Pak/C 18, 3.9x150 mm, 4 mieras, 1 mL/min, 240 nm, 40/60 CH3CN/0.1%H3P04 (ac) 7.27 min (98.92%); Anal. Cale, para C9H8N04Br: C, 39.44; H, 2.94; N, 5.11; Br, 29.15. Encontrado: C, 39.46; H, 3.00; N, 5.00; Br, 29.11. t-butil N- ( l-oxo-4-ni troisoindolin-2-il ) -L- glutamina Trietilamina (2.9 g, 28.6 mmol) fue adicionada gota a gota a una mezcla en agitación de 2-bromometil-3-nitrobenzoato de metilo (3.5 g, 13.0 mmol) y áster t-butílico de L-glutamina clorhidrato (3.1 g, 13.0 mmol) en tetrahidrofurano (90 mL). La mezcla fue calentada a reflujo durante 24 horas. A la mezcla enfriada se adicionó cloruro de metileno (150 mL) y la mezcla fue lavada con agua (2 x 40 mL), salmuera (40 mL) y se secó.
El disolvente fue eliminado en vacio y el residuo fue purificado por cromatografía instantánea (3% CH3OH en cloruro de etileno) para producir 2.84 g (60%) del producto crudo el cual fue utilizado directamente en la siguiente reacción: 1H NMR (CDCl3) d 8.40(d, J=8.1 Hz, 1H), 8.15(d, J=7.5 Hz, 1H), 7.71(t, J=7.8 Hz, 1H), 5.83(s, 1H), 5.61(s, 1H), 5.12(d, J=19.4 Hz, 1H), 5.04-4.98(m, 1H), 4.92(d, J=19.4 Hz, 1H), 2.49-2.22(m, 4H). 1.46(s, 9H); HPLC, Waters Nova-Pak C18, 3.9x150 mm, 4 mieras, 1 mL/min, 240 nm, 25/75 CH3CN/0.1% H3PO4 (ac) 6.75 in (99.94%).
N- (l-oxo-4-nitroisoindolin-2-il) -L-glutamina Se burbujeó cloruro de hidrógeno gaseoso en una solución en agitación a 52C de t-butil N-(l-oxo-4-nitro-isoindolin-2-il)-L-glutamina (3.6 g, 9.9 mmol) en cloruro de metileno (60 mL) durante 1 hora. La mezcla fue luego agitada a temperatura ambiente durante otra hora. Se adicionó éter (40 mL) y la mezcla resultante fue agitada durante 30 minutos. La lechada fue filtrada, lavada con éter y secada para producir 3.3 g del producto: XH NMR (DMSO-de) d 8.45(d, J=8.1 Hz, 1H), 8.15(d, J=7.5 Hz, 1H), 7.83(t, J=7.9 Hz. 1H), 7.24(s, 1H), 6.76(s, 1H), 4.93(s, 2H), 4.84-4.78(dd, J=4.8amd 10.4 Hz, 1H), 2.34-2.10(m, 4H); 13C NMR (DMSO-d6) d 173.03, 171.88, 165.96, 143.35, 137.49, 134.77, 130.10, 129.61 , 126.95, 53.65, 48.13, 31.50, 24.69; Anal. Cale, para C13H13N3O6: C, 50.82; H, 4.26; N, 13.68. Encontrado: C, 50.53; H.4.37; N, 13.22.
(S) -3- ( l-oxo-4-nitroisoindolin-2-il ) piperidin- 2, 6-diona Una mezcla de suspensión agitada de N-(l-oxo-4-nitroisoindolin-2-il)-L-glutamina (3.2 g, 10.5 mmol) en cloruro de metileno anhidro (150 mL) fue enfriada a -402C con isopropanol/hielo seco. Se adicionó cloruro de tionilo (0.82 mL, 11.3 mmol) gota a gota a la mezcla enfriada seguido por piridina (0.9 g.11.3 mmol). Después de 30 min, se adicionó trietilamina (1.2 g, 11.5 mmol) y la mezcla fue agitada entre -30 a -402C durante 3 horas. La mezcla fue vaciada en agua de hielo (200 mL) y la capa acuosa fue extraída con cloruro de metileno (40 mL). La solución de cloruro de metileno fue lavada con agua (2 x 60 mL), salmuera (60 mL) y se secó. El disolvente fue eliminado en vacío y el residuo sólido fue suspendido con acetato de etilo (20 L) para obtener 2.2 g (75%) del producto como un sólido blanco: pf 2852C; NMR (DMSO-d6) d: 1.04(s, 1H), 8.49-8.45(dd, J=0.8 y 8.2 Hz, 1H), 8.21- 8.17(dd, J=7.3 Hz, 1H), 7.84(t, J=7.6 Hz, 1H), 5.23- 5.15(dd, J=4.9 y 13.0 Hz, 1H), 4.96(dd, J=19.3 y 32.4 Hz, 2H), 3.00-2.85(m, 1H), 2.64-2.49(m, 2H), 2.08-1.98(m, 1H) ; 13C NMR (DMSO-d6) d 172.79, 170.69, 165.93, 143.33, 137.40, 134.68, 130.15, 129.60, 127.02, 51.82, 48.43, 31.16. 22.23; HPLC, Waters Nove-Pak/C 18, 3.9x150 mm, 4 mieras, 1 mL/min, 240 nm, 20/80 CH3CN/0.1%H3P04 (ac) 3.67 min(100%) ; Anal. cale para Ci3HnN305: C, 53.98; H, 3.83; N, 14.53. Encontrado: C, 53.92; H, 3.70; N, 14.10. 3- (4-amino-l-ox:o-l , 3-dihidro-isoindol-2-il) - piperidin-2 , 6-diona Una mezcla de (S)-3-(l-oxo-4-nitroisoindolin-2-il)piperidin-2,6-diona (1.0 g, 3.5 ol) y 10% Pd/C (0.3 g) en metanol (600 mL) fue hidrogenada en un aparato Parr-Shaker a 50 psi de hidrógeno durante 5 horas. La mezcla fue filtrada a través de Celite y el filtrado fue concentrado en vacío. El sólido fue suspendido en acetato de etilo caliente durante 30 min, se filtró y secó para producir 0.46 g (51%) del producto como un sólido blanco: pf 235.5-2392C; 3H NMR (DMSO-d6) d 11.01 (s, 1H).7.19 (t, J=7.6 Hz, 1H). 6.90(d. J=7.3 Hz, 1H), 6.78(d, J=7.8 Hz, 1H), 5.42(s, 2H). 5.12 (dd. J=5.1 y 13.1 Hz, lH), 4.17 (dd, J=17.0 y 28.8 Hz, 2H), 2.92-2.85 (m, 1H).2.64-2.49 (m, 1H). 2.34-2.27 (m, lH), 2.06-1.99 (m, 1H); 13C NMR (DMSO-ds) d 172.85, 171.19, 168.84, 143.58, 132.22. 128.79, 125.56, 116.37, 1 10.39, 51.48, 45.49, 31.20, 22.74; HPLC. Waters Nova-Pak/C 18, 3.9x150 mm, 4 mieras, 1 mL/min, 240 nm, 10/90 CH3CN/0.1%H3R04 (ac) 0.96 min (100%); Análisis quiral, Daicel Chiral Pak AD, 40/60 Hexano/IPA, 6.60 min (99.42%); Anal. cale, para C13H13N3O3: C, 60.23; H, 5.05; N, 16.21. Encontrado: C, 59.96; H. 4.98; N, 15.84. 3-(4-Amino-1-oxo-l,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidin-2,6-diona también puede ser preparada por los métodos conocidos en la téenica, por ejemplo, como se proporciona en Drugs of the Future, 2003, 28(5): 425-431, la totalidad del cual se incorpora para referencia. 6.2 Preparación de 4-amino-2- (2,6- dioxopiperidin-3-il)-1H-isoindol-1,3-diona (po alidomida) La preparación de 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-lH-isoindol-1,3-diona se describe, por ejemplo, en las Patentes U.S. Nos. 7,812,169 y 7,709,502, la totalidad de cada una se incorpora para referencia.
En una solución en agitación de carboxibenciloxi-L-glutamina (2.8 g, 10 mmoles) en 40 mL de THF anhidro, se adicionó 1,1-carbonildiimidazol (1.92 g, 12 mmoles). La mezcla de reacción fue calentada a reflujo durante 18 horas. El THF fue evaporado y el producto fue disuelto en cloroformo. La capa de cloroformo fue lavada con agua y salmuera sobre CaSO4 anhidro, se filtró y evaporó para obtener un sólido blanco. El producto sólido fue cristalizado a partir de etil éter para obtener 2.4 gramos de polvo cristalino (90%). (De otro modo, carboxibenciloxi-L-glutamina puede ser cielado para tratamiento con S0Cl2 en N,N-dimetilformamida de -702C a 0aC durante 1 hora para formar el producto). La mezcla de reacción fue diluida con CHCl3 y se lavó con 5% de Na2CO3, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró y evaporó para obtener 2.5 g (rendimiento de 90%) S(—)—(3— benciloxicarbonilamino)-glutarimida). 1H NMR (CDCl3) d 8.2 (1H, s amplio), 7.4 (5H, s, aromático), 5.8 (1H, d), 5.15 (2H, s), 4.4 (1H, dd, J=4.5, 3), 2.95-2.4 (3H, m), 1.86 (1H, d, t, J=ll.5, 6.5). p.f.122-1242C (lit.122-1242C).
En una solución de S(—)—(2— benciloxicarbonilamino)glutarimida (1.2 g, 4.6 mmoles) en 15 mL de ácido acético glacial, 8 mL de solución al 30% de HBr/ácido acético fue calentada a 202C. La temperatura de la mezcla de reacción fue elevada a TA (temperatura ambiente) y se agitó durante 1 hora. Polvo sólido blanco de S-(-)-2-amino-glutarimida HBr empezó a aparecer en la mezcla de reacción. El sólido fue filtrado y lavado con 5 mL de ácido acético glacial y luego con éter para obtener 1.8 g (80%) de producto. El análisis en polarímetro del producto mostró (-) rotación, [a]25D (c=l, agua) = -37.52 y confirmó el producto como S-(-)-2-amino-glutarimida. H NMR en DMSO-D6 confirmó el producto como 2-amino-L-glutarimida HBr.
En una solución de (4.18 g, 20 mmoles de S—(—)—2— amino-glutari ida HBr en 50 mL de DMF anhidro, se adicionaron 3.8 g (20 mmoles) de anhídrido 3-nitroftálico. Después de adicionar 100 mL de ácido acético (glacial), la mezcla de reacción fue calentada a aproximadamente 702C hasta aproximadamente 80aC durante alrededor de 24 horas. Después de eso, los disolventes fueron evaporados en vacío para producir un sólido blanquizco. En la adición de 10 mL de alcohol etílico al sólido, se formó un producto polvo blanquizco. El producto fue separado y lavado con 20 mL de alcohol etílico. XH NMR (DMSO-D6) d 11.25 (1H, s amplio), 8.35 (1H, d, J=7.2), 8.25 (1H, d, J=7.0), 8.15 (1H, t, J=8.0), 5.2 (1H, dd, J=5.5, 7.2), 3.00-2.85 (1H, m), 2.65-2.4 (2H, m), 2.15-2.05 (1H, m). p.f.: 228-2292C (lit.228.5-229.52C). 4-Nitro-talidomida (1 g, 3.3 mmoles) fue disuelta en 50 mL de una mezcla de dioxano/metanol 4:1 y se hidrogenó en un hidrogenador Parr a 40 psi de hidrógeno en presencia de un catalizador Pd/C 5% durante aproximadamente 4 horas. Después de filtrar la mezcla de reacción a través de un agente de filtración Celite, los disolventes fueron evaporados en vacío para producir un polvo amarillo. El producto fue recristalizado a partir de acetato de etilo/dioxano para producir 800 mg (85% de pureza) de S(-)-4-amino-talidomida. 1H NMR en DMSO-D6: 11.10 (1H, s amplio), 7.45 (1H, t, J=7.5), 7.05 (1H, d, J=5.2), 6.95 (1H, d, J=5.2), 6.5 (2H, s amplio), 5.05 (1H, dd, J=5.0, 13.42),2.95-2.80 (1H, m), 2.65-2.5 (2H, m), 2.05-1.95 (1H, m). p.f. 318 .2-319.5eC. La configuración absoluta fue determinada comparando la rotación específica de [a]25D de (R)- y (S)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1H-isoindol-l,3-diona con los compuestos análogos R(+)- y S(-)-talidomida. Al análisis en polarímetro del producto mostró rotación (-), [a]25D (C=0.5, dioxano) = -27.702 y confirmó el producto como S(-)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-lH-isoindol-l,3-diona.
Los dos enantiómeros se resolvieron por columna HPLC quiral Welk-01 (10 mm x 750 mm) y eluyeron con una mezcla CH3CN/MeOH/H20 1:1:5. El tiempo de retención para el enantiómero S(-) fue 33.74 minutos y para el enantiómero R(+)35.62 minutos a una velocidad de flujo de 2 mL/min a 240 nm, respectivamente. 6.3 Preparación de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo- 4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona (Compuesto B) A una solución de hidróxido de potasio (16.1 g, 286 mmol) en agua (500 mL), se adicionó 3-nitroftalimida (25.0 g, 130 mmol) en porción a 02C. La suspensión fue agitada a 02C durante 3 h, y luego se calentó a 30aC durante 3 h. A la solución, se adicionó HCl (100 mL, 6N). La suspensión resultante fue enfriada a 0SC durante 1 h. La suspensión fue filtrada y lavada con agua fría (2 x 10 mL) para obtener ácido 3-nitro-ftálico como un sólido blanco (24.6 g, 90% de rendimiento): 1H NMR (DMS0-d6) d 7.69 (brs, 1H, NHH), 7.74 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar), 7.92 (dd, J= 1 , 8 Hz, 1H, Ar), 8.13 (dd, J = 1 , 8 Hz, 1H, Ar), 8.15 (brs, 1H, NHH), 13.59 (s, l[Eta], OH); 13C NMR (DMSO-de) d 125.33, 129.15, 130.25, 132.54, 136.72, 147.03, 165.90, 167.31.
A una mezcla de de ácido 3-nitro-ftalámico (24.6 g, 1 17 mmol) e hidróxido de potasio (6.56 g, 117 mmol) en agua (118 mL), se adicionó un mezcla de bromo (6 mL), hidróxido de potasio (13.2 g, 234 mmol) en agua (240 mL) a 02C, seguido por la adición de una solución de hidróxido de potasio (19.8 g, 351 mmol) en agua (350 mL). Después de 5 minutos a 0aC, la mezcla fue calentada en un baño de aceite a 100SC durante 1 h. La solución de reacción fue enfriada a temperatura ambiente, y luego, en un baño de agua de hielo durante 30 minutos. A la mezcla, se adicionó gota a gota una solución de HCl (240 L, 2N) a 0SC, y la mezcla resultante fue mantenida durante 1 h. La suspensión fue filtrada y lavada con agua (5 mL) para obtener ácido 2-amino-6-nitro-benzóico como sólido amarillo (15.6 g, 73% de rendimiento): HPLC: Waters Symmetry Ci8, 5 mm, 3.9 x 150 mm, 1 mL/min, 240 nm, CH3CN/0.1% H3P04, gradiente de 5% hasta 95% durante 5 min, 5.83 min (85%); 1H NMR (DMSO-d6) d 6.90 (dd, J = 1, 8 Hz, 1H, Ar), 7.01 (dd, J= 1 , 9 Hz, 1H, Ar), 7.31 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar), 8.5-9.5 (brs, 3H, OH, NH2); 13C NMR (DMSO-d6) d 105.58, 1 10.14, 120.07, 131.74, 149.80, 151.36, 166.30; LCMS: MH = 183.
Una mezcla de ácido 2-amino-6-nitro-benzóico (1.5 g, 8.2 mmol) en anhídrido acético (15 mL) fue calentada a 200aC durante 30 minutos en un horno de microondas. La mezcla fue filtrada y lavada con acetato de etilo (20 mL). El filtrado fue concentrado en vacío. El sólido fue agitado en éter (20 mL) durante 2 h. La suspensión fue filtrada y lavada con éter (20 mL) para obtener 2-metil-5-nitro-benzo [d][1,3]oxazin-4-ona como un sólido café claro (1.4 g, 85% de rendimiento): HPLC: Waters Symmetry Cíe, 5 mm, 3.9 x 150 m , 1 mL/min, 240 nm, CH3CN/0.1% H3PO4, gradiente de 5% hasta 95% durante 5 min, 5.36 min (92%); XH NMR (DMSO-d6) d 2.42 (s, 3H, C[3/4]), 7.79 (dd, J = 1, 8 Hz, 1H, Ar), 7.93 (dd, J = 1, 8 Hz, 1H, Ar), 8.06 (t, J= 8 Hz, 1H, Ar); 13C NMR (DMSO-d6) d 20.87, 107.79, 121.54, 128.87, 137.19, 147.12, 148.46, 155.18, 161.78; LCMS: MH = 207.
Dos viales cada uno con una suspensión de 5-nitro-2-metil-benzo[d][1,3]oxazin-4-ona (0.60 g, 2.91 mmol) y 3-amino-piperidin-2,6-diona cloruro de hidrógeno (0.48 g, 2.91 mmol) en piridina (15 mL) fueron calentados a 170eC durante 10 minutos en un horno de microondas. La suspensión fue filtrada y lavada con piridina (5 mL). El filtrado fue concentrado en vacío. La mezcla resultante fue agitada en HCl (30 mL, 1N), acetato de etilo (15 mL) y éter (15 mL) durante 2 h. La suspensión fue filtrada y lavada con agua (30 L) y acetato de etilo (30 mL) para dar un sólido café oscuro, el cual fue agitado con metanol (50 mL) a temperatura ambiente durante la noche. La suspensión fue filtrada y lavada con metanol para dar 3-(2-metil-5-nitro-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin- 2,6-diona como un sólido negro (490 mg, 27% de rendimiento). El sólido fue utilizado en el siguiente sin otra purificación.
Una mezcla de 3-(2-metil-5-nitro-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona (250 mg) y Pd(OH)2 sobre carbono (110 mg) en DMF (40 L) fue agitada con hidrógeno (50 psi) durante 12 h. La suspensión fue filtrada a través de una almohadilla de Celite y se lavó con DMF (10 mL). El filtrado fue concentrado en vacio y el aceite resultante fue purificado por cromatografía instantánea en columna (gel de sílice, metanol/cloruro de metileno) para dar 3- (5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona como un sólido blanco (156 mg, 69% de rendimiento): HPLC: Waters Symmetry Cía, 5 mm, 3.9 x 150 mm, 1 mL/min, 240 n , 10/90 CH3CN/0.1% H3PO4, 3.52 min (99.9%); pf: 293-295aC; XE NMR (DMSO-de) d 2.10-2.17 (m, 1H, CHH), 2.53 (s, 3H, CH3), 2.59-2.69 (m, 2H, CH2), 2.76-2.89 (m, 1H, CHH), 5.14 (dd, J = 6, 11 Hz, 1H, NCH), 6.56 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar), 6.59 (d, J = 8 Hz, 1H, Ar), 7.02 (s, 2H, NH2), 7.36 (t, J = 8 Hz, 1H, Ar), 10.98 (s, 1H, NH); 13C NMR (DMSO-d6) d 20.98, 23.14, 30.52, 55.92, 104.15, 110.48, 111.37, 134.92, 148.17, 150.55, 153.62, 162.59, 169.65, 172.57; LCMS: MH = 287; Anal. Cale, para C14H14N4O3 + 0.3 H2O: C, 57.65; H, 5.05; N, 19.21. Encontrado: C, 57.50; H, 4.73; N, 19.00. 6.4 Identificación de las dianas directas del compuesto Para identificar la diana directa de talidomida y otros fármacos relacionados, desarrollamos una téenica de purificación por afinidad. Un compuesto testigo ("Compuesto A") acoplado a Affigel-10 (10 pmol del fármaco por mg de Affigel) se utilizó para los experimentos de purificación por afinidad.
Compuesto A (TNF IC50 = 622 nM; Jurkat IL-2 EC2oo=3.47 mM) Se aislaron proteínas a partir de lisados de células T Jurkat mediante la unión al compuesto A-Affigel seguido por elución utilizando compuesto A libre. Las bandas teñidas con azul de Coomassie fueron escindidas y enviadas a la instalación de Microquímica de Harvard para el análisis de las secuencias. Las proteínas fueron digeridas por métodos proteolíticos y analizadas por HPLC de fase inversa, microcapilar-espectrometría de masa en cascada por nanoelectropulverización en un espectrómetro de masas con trampa de iones cuadrupolar LCQ DECA de Finnigan. Los espectros MS/MS fueron correlacionados con las secuencias conocidas utilizando el algoritmo Sequest y otros programas, después las secuencias de péptidos fueron revisadas por un científico para determinar el consenso con las proteínas conocidas y los resultados fueron confirmados manualmente para revisar la fidelidad.
Resumen del los resul tados : la proteína DDBl (proteína de unión implicadas con el daño al DNA 1 (XPCE, humana) fue purificada por afinidad a partir de extractos Jurkat utilizando perlas con el compuesto A inmovilizado. La proteína DDBl fue altamente representada en las fracciones eluidas (108 péptidos) en comparación con, por ejemplo la segunda proteína más representada la enzima ramificadora de Glicógeno (55 péptidos). La proteína DDBl interactuó directamente con CRBN y pudo haber sido extraída en virtud de su unión al CRBN. 6.5 Los siRNAs de CRBN silenciaron la proteína CRBN en líneas de células de mieloma múltiple sensibles La función de cereblon (CRBN) en el mecanismo de acción (MOA) de lenalidomida se confirmó utilizando experimentos de silencia iento génico en dos líneas de células de mieloma múltiple sensibles a lenalidomida, H929 y U266B1. Se encontró que la regulación descendente de CRBN deroga la interrupción del ciclo celular inducida por fármacos, la activación de los supresores de tumor, la inhibición de los oncogenes y los cambios globales en los perfiles de la expresión génica y la ubiquitinación. 10 diferentes siRNAs individuales y combinados contra CRBN fueron evaluados en células H929 y U266B1. Se utilizó la RT-PCR para probar la eficiencia del silenciamiento génico después de la transfección de 24 y 48 horas. Los resultados mostraron que los CRBN-siRNA-1, CRBN-siRNA-7, CRBN-siRNA-9, CRBN-siRNA-10 y CRBN-siRNA-11 disminuyeron significativamente la expresión del mRNA de CRBN en comparación con otros siRNA y el siRNA imitación (Tabla 1).
Tabla 1: Efecto de los siRNA de los CRBN sobre la expresión génica de CRBN % inhibición del mRNA de CRBN respecto a los niveles de mRNA en el testigo imitación Conc de siRNA siRNA 10 nM 25 nM 50 nM siRNAs de Invitrogen GC bajo testigo negativo 88 / 100 85.5 / 77,5 85/77 CRBN-7 22 / 25 14/17,5 16.5/17 CRBN-8 47,5/61 29.5/41 33/37.5 CRBN-9 67,5 / 66.4 61.5/52 42/37 siRNAs de Dharmacon pool Smart testigo negativo 87/78 72.5/84 98.5/88.5 pool Smart CRBN 28 / 34,5 19.3 / 28,5 18/17 CRBN-9 55/40 28.5/33 17.5/23 CRBN-10 23/35 20.5 / 29 20 / 22.5 J-021086-11 22/27 20/17 16.3/15.3 J-021086-12 55/53 37/39 21/25 6.6 Silene¿amiento génico de CRBN deroga el efecto anti-proliferativo de los fármacos en células de mieloxna múltiple Los fármacos como lenalidomida y pomalidomida tienen actividad anti-proliferativa directa contra células de MM induciendo la interrupción del ciclo celular en la fase Gl, seguido por una disminución de la viabilidad. Para estudiar la función de CRBN en las actividades anti-proliferativas de lenalidomida y otros fármacos, células H929 y U266B1, dos líneas de mielo a sensibles, fueron transíectadas con siRNAs para CRBN siRNAs testigo durante 24, 48, 72 y 96 horas. Las células fueron tratadas 24 h después de la transfección con DMSO (0.1%), pomalidomida (1 mM) y lenalidomida (10 mM) durante 1, 2, 3 días para valuar el efecto del compuesto sobre la proteína CRBN, la expresión de mRNA y el efecto sobre el ciclo celular y la proliferación. Los ensayos RT-PCR y Western blot mostraron que los siRNA de CRBN silenciaron el CRBN. La regulación descendente de CRBN fue confirmada por análisis RT-PCR y Western blot utilizando el anticuerpo CRBN70 (Figura 1). El tratamiento con lenalidomida y pomalidomida no afectó significativamente la expresión de mRNA ni de la proteína de CRBN.
Lenalidomida y pomalidomida indujeron un retraso de la progresión del ciclo celular, medido como la disminución del número de células en la fase S, de 40% y 50% respectivamente, en células transíectadas con el siRNA testigo imitación y el testigo negativo (promedio de inhibición de 3 días de tratamiento) (Figuras 2A y 2B). El silenciamiento génico de CRBN derogó notablemente el retraso inducido por lenalidomida y pomalidomida en la progresión del ciclo celular de las células U266B1. Id. El efecto de CRBN en células H929 también fue evaluado. Células H929 fueron transíectadas con siRNA imitación, testigo negativo y CRBN-siRNA-7 durante 24, 48, 72 y 96 h. Las células fueron tratadas 24 h después de la transfección con DMSO (0.1%), pomalidomida (1 mM) , lenalidomida (10 mM) o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona ("Compuesto B") durante 1, 2, 3 días y se investigó el efecto sobre el ciclo celular y la proliferación celular. Lenalidomida, pomalidomida y el Compuesto B indujeron un retraso de la progresión del ciclo celular, medido como la disminución del número de células en la fase S, en las células transfectadas con siRNA imitación testigo y testigo negativo después de 72 h de tratamiento (Figura 2C). El silenciamiento génico de CRBN derogó notablemente el retraso inducido por fármacos inmunomoduldores en la progresión del ciclo celular de células H929 (Figura 2C) desde 50 hasta 4% para lenalidomida, desde 70 hasta 15% para pomalidomida, y desde 65 hasta 22% para el Compuesto B. 6.7 El silenciamlento génico de CRBN derogó el efecto de los fármacos sobre el ciclo celular, la supresión de tumor y las proteínas apoptósicas Para además investigar los efectos de CRBN sobre la interrupción del ciclo celular inducida por fármacos utilizamos análisis RT-PCR y Western blot para medir los niveles de los reguladores importantes del ciclo celular y de la apoptosis. Células U266B1 fueron transfectadas con siRNA imitación, testigo negativo, CRBN-siRNA-7 y CRBN-siRNA-ll durante 24, 48, 72 y 96 h (Figura 3A). Las células fueron tratadas 24 h después de la transfección con DMSO (0.1%), pomalidomida (1 mM) y lenalidomida (10 mM) durante 1, 2, 3 días y se evaluó el efecto sobre los niveles de mRNA y proteína del inhibidor de cinasa dependiente de ciclina (CDK) p2iWAF1. Se ha demostrado que la interrupción del ciclo celular inducida por lenalidomida y pomalidomida depende de la regulación ascendente de p21WAF_1 en células U2669. Nuestros resultados mostraron que p21 fue regulado hacia arriba por lenalidomida y pomalidomida en células transfectadas con siRNA imitación testigo y testigo negativo (Figura 3C) indicando una disminución de las células en la fase S resultante de la interrupción de la fase G1 inducida por lenalidomida y pomalidomida (Figura 3B). No obstante, el silenciamiento génico de CRBN impide la inducción de P2]_WAF- indicando la derogación satisfactoria de la interrupción de Gl y la renovación de la progresión en la fase S (Figura 3C y 3D).
En células H929, la interrupción del ciclo celular en la fase Gl inducida por fármacos coincide con la disminución del supresor de tumor, pRb, la fosforilación y el factor de supervivencia del oncogen y mieloma IRF4.
El análisis Western blot mostró que lenalidomida, pomalidomida y el Compuesto B disminuyeron la fosforilación de pRB (Figuras 4A y 4B) y el nivel total de la proteina IRF4 (Figuras 4C y 4D). El efecto de los fármacos fue reducido por el silenciamiento de CRBN, sugiriendo que la inhibición del progreso del ciclo celular con los fármacos requiere de la proteína CRBN. 6.8 El silenciamiento génico de CRBN inhibe los efectos de lenalidomida y pomalidomida sobre la expresión génica El perfil de la expresión génica utilizando teenología de microarreglos identificó a 759 o 609 genes diferencialmente modulados en células U266B1 transíectadas con siRNA testigo negativo, tratadas con pomalidomida (1 mM) o lenalidomida (10 mM) en comparación con testigo tratadas con DMSO (± 1.7 veces; P<0.05 ANOVA valor p) (Figuras 5A y 5B).
Las clases representativas y significativas del proyecto Gene Ontology (GO) de genes regulados hacia abajo en pomalidomida incluyen: ciclo celular (87 genes; P = 5.2E-56), mitosis (43 genes; P = 1.2E-39), citoesqueleto (58 genes; P = 2.6E-16) y respuesta al estímulo de daño del DNA (36 genes; P = 1.8E-21). Las clases representativas y significativas del proyecto Gene Ontology (GO) de los genes regulados hacia arriba incluyen: procesamiento y presentación del antígeno (12 genes; P = 2.8E-17), respuesta inmunitaria (35 genes; P = 5.70E-14) y muerte celular (50 genes; P = 1.7E-10).
Las clases representativas y significativas del proyecto Gene Ontology (GO) de genes regulados hacia arriba en lenalidomida incluyen: procesamiento y presentación del antígeno (11 genes; P = 1.9E-16), respuesta inmunitaria (37 genes; P = 3.9E-13) y muerte celular (55 genes; P = 1.0E-10) (Tablas 4 y 5). Los efectos de lenalidomida y pomalidomida sobre el ciclo celular y el perfil de la expresión génica en células U266 fueron derogados por el silenciamiento de CRBN utilizando 4 diferentes siRNAs (Figuras 5A-5C). 6.9 Los niveles de CRBN se disminuyen en células de ieloma múltiple resistentes a lenalidomida o pomalidomida Aunque el desarrollo de tratamientos basados en lenalidomida ha mejorado significativamente las respuestas clínicas, la mayoría de los pacientes de mieloma múltiple finalmente recaen o se vuelven refractarios a sus pautas terapéuticas. Las líneas de células de mieloma múltiple resistentes a los efectos anti-proliferativos de lenalidomida han sido desarrolladas para evaluar los mecanismos potenciales responsables de la resistencia frene a lenalidomida.
Debido a la importancia de CRBN para la respuesta anti-proliferativa de lenalidomida, pomalidomida y otros inmunomoduladores, los niveles de proteína CRBN fueron comparados en pares compatibles de líneas sensibles parenterales con células con resistencia adquirida frente a lenalidomida o pomalidomida. Acorde con el requisito de la presencia de CRBN para la actividad anti-proliferativa de lenalidomida y pomalidomida, los niveles de la proteína CRBN fueron significativamente menores en la línea de células resistentes a pomalidomida DF15R y en las células resistentes a lenalidomida, H929 R10-1, H929 R10-2, H929 R10-3, H929 R10-4 y MMl/R en comparación con las líneas parenterales concordantes (Tabla 2).
Tabla 2. Relación de la diferencia del nivel de la proteína CRBN entre células resistentes a lenalidomida o pomalidomida y las células parenterales concordantes La relación de la proteína CRBN disminuyó respecto a las líneas parenterales concordantes H929 R10-1 0.503989 H929 R10-2 0295482 H929 R10-3 0.459599 mn R10-4 0-659341 MM1/R 0.172249 6.10 Secuenciación del DNA genómico de CRBN, DDBl y GSK3 a partir de las líneas de células humanas y células primarias Los genes diana CRBN, DDBl y GSK3B fueron secuenciados a partir de una variedad de líneas de células humanas y células primarias. La secuenciación del gen CRBN identificó mutaciones en las líneas de células humanas resistentes a lenalidomida las cuales fueron ausentes en las células parenterales.
El enriquecimiento de las secuencias, la secuenciación NexGen y el análisis de los datos produjeron los resultados que se muestran en las Tablas 3-6 siguientes. Cada tabla presenta las líneas de células de las cuales estuvieron los datos. Los nucleótidos de referencia se refieren al nucleótido tipo nativo en esa posición. "Cobertura" se refiere al número total de lecturas en esa posición. La puntuación global de la mutación ("puntuación") se basa en el concepto de las puntuaciones Phred con un valor máximo de 30, es decir, la probabilidad que las mutaciones cali sea errónea es 1/1000; 20, 1/100; y 10, 1/10. Sin embargo, una puntuación no necesariamente significa que la mutación sea más que probablemente una mutación falsa. Una puntuación baja implica solamente que la mutación no puede ser denominada una mutación verdadera con certeza absoluta. "Mutación Cali" denota el cambio de nucleótidos. Por ejemplo, T > TG indica un cambio heterocigoto desde T de referencia a T y G. T > G indica un cambio homocigoto de T de referencia a G. El término "c" se refiere a la secuencia codificadora, mientras que "IVS" se refiere a una variante de intrón. La columna "cambio de aminoácido" utiliza una notación semejante a la columna "Mutación Cali".
Resul tados En el análisis de las secuencias a gran escala de 27 líneas celulares, se encontraron más mutaciones intrónicas que mutaciones exónicas. La línea de células de mieloma múltiple, ANBL-6, mostró una mutación en CRBN de la línea resistente a lenalidomida que no fue observada en el tipo nativo. La línea ANBL-6.wt fue tratada solamente con DMSO y la secuencia codificadora de CRBN coincidió exactamente con la referencia. No obstante, en la línea ANBL-6.R10R que tiene resistencia a 10 mM de lenalidomida, un SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) en la región codificadora c.745C>CA ocasionó un cambio de aminoácido 249D>YD en la proteína. Este cambio de aminoácido fue mapeado al dominio de unión de DDBl de CRBN.
Una mutación silenciosa encontrada en la región codificadora de CRBN de HepG2 y JeKo-1 fue c.735A>AG heterocigota con KMS-12-BM como c.735A>G homocigoto. La línea celular, OPM2, tuvo una mutación silenciosa diferente en la región codificadora de CRBN, C.1209C>CT. A partir de estos SNP no hubo cambios de aminoácido.
Los resultados de la secuenciación para DDBl descubrió un SNP en la región codificadora c.909T>TA el cual dio lugar a un cambio del aminoácido 303E>ED en ambas líneas de células ANBL-6.wt y ANBL-6.R10R. En la línea de células Jurkat se encontró un SNP diferente, con una mutación c.2143C>CT en la región codificadora DDBl que cambió la secuencia del aminoácido 715V>VI.
Una mutación silenciosa encontrada en la región codificadora DDBl de las líneas de células ANBL-6.wt, ANBL-6.R10R, y SH-SY5Y en la región codificadora C.153G>GA no cambió la secuencia de los dos aminoácidos. Una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donador sano también tuvo una mutación silenciosa en la región codificadora c.2265G>GA de DDBl que no cambió la secuencia de los aminoácidos. En la muestra de las PMBC se encontró una mutación GSK3p. La mutación en la región codificadora c.H 87C>CT dio lugar a un cambio del aminoácido 396R>RQ. Esta mutación no mapeó para el dominio cinasa. Otras mutaciones se encuentran en la Tabla 11. La mayoría de estas tienen poca cobertura. Esto podría deberse a los cebadores que se dirigen a estas regiones y/o a un error de la secuenciación.
Aunque se encontró que ninguna de las mutaciones consistentes en CRBN, DDBl y GSK3-p se correlación con la resistencia frente a lenalidomida o pomalidomida en estas líneas de células MM, las mutaciones esporádicas tales como la mutación 249D>YD de CRBN observada en las células MM ANBL-6 resistentes a lenalidomida ejemplifica el tipo de polimorfismo que podría presentarse en tales genes en el entorno clínico, y la cual podría constituir un mecanismo de resistencia. Son necesarios otros estudios para confirmar o refutar esta hipótesis.
Tabla 3 Mutaciones de CRBN a = mutación silenciosa; b = región necesaria para la interacción de DDBl Tabla 4 Mutaciones DDBl a = mutación silenciosa Tabla 5 Mutaciones de 6XK3b Tabla 6 Otras mutaciones 6.11 Estudio de la relación entre los fármacos y el sistema ubiquitina-proteasoma Para estudiar el efecto de los fármacos inmunomoduladores sobre los niveles globales de la ubiquitinación se emplearon anticuerpos específicos para las cadenas poli-ubiquitina. Células H929 fueron tratadas con lenalidomida (1 mM), pomalidomida (1 mM) o inhibidor de proteasoma MG132. Después de 30 minutos las células fueron procesadas para inmunofluorescencia. Los niveles globales de la poliubiquitinación ligada a K63 fueron cuantificados por Cellomics. Como se muestra en las Figuras 7A y 7B, los fármacos inmunomoduladores disminuyeron la poliubiquitinación total ligada a K48 pero no la ubiquitinación ligada a K-63 en células H929. 6.12 Estudio del efecto de los fármacos sobre los cambios globales de la ubiquinación y abundancia de proteína Los efectos de lenalidomida y pomalidomida sobre la ubiquinación de proteínas fueron investigados utilizando teenología de CST Ubiscan. Las muestras tratadas fueron enviadas a Cell Signaling Technology para el enriquecimiento de los péptidos ubiquinados y la cuantificación por LC/MS/MS (cromatografía líquida/espectrometría de masa/espectrometría de masa). Se utilizó la intensidad original para este análisis con el fin de identificar a los péptidos que son regulados significativamente por los fármacos, o los fármacos con el inhibidor de proteasoma MG132. El análisis mostró que en comparación con MG132, los efectos de lenalidomida y pomalidomida sobre los péptidos ubiquitinados son pequeños. En el combo MG132, se observan más péptidos ubiquinados (en comparación con sus testigos). 162 péptidos ubiquitinados únicos fueron regulados significativamente hacia arriba por lenalidomida y pomalidomida solamente, o con MG132 a la 1 hora o 4 horas. Estos péptidos corresponden a 176 proteínas únicas. Los pocos principales grupos son: nucleosoma, cromatina, el ensamble del complejo proteína-DNA, Histona H2A. Entre las 176 proteínas, encontramos cinco proteínas que pertenecen a la categoría de "actividad de ubiquitina-proteína ligasa", estas son MDM2, HERC2, UBE2D3 (solo por pomalidomida), UBE2N (solo lenalidomida), UBE2M (ambas). Los resultados para los aciertos categorizados por las condiciones se presentan en las Figuras 8 y 9 (sin MG132) y en las Figuras 10 y 11 (con MG132). 6.13 Efecto del sileneiamiento de CRBN sobre TNFa e IL-2 inducidos por fármacos en células T primarias En estos estudios, las células T humanas fueron aisladas de la sangre y tratadas con 1 mg/mL de PHA-L a 37aC. Después de la estimulación durante 24 h las células T fueron sometidas a transfección de siRNA con los siRNAs indicados. Se analizaron las eficiencias del silenciamiento génico por qRT-PCR después de las transfecciones de 24 h y las células transíectadas restantes fueron sembradas en placas de 96 pozos previamente unidas con OKT3 y tratadas con DMSO o 1 y 10 mM de talidomida, lenalidomida, pomalidomida y ftalimida por duplicado a 37SC durante 48 horas. Después de las 48 horas, los sobrenadantes fueron recolectados y analizados para determinar la producción de TNFa e IL-2 por el ensayo ELISA (Figuras 12A-12D). Estos datos indican que el silenciamiento génico de siRNA de CRBN deroga la producción de TNFa e IL-2 inducida por fármacos en células T humanas primarias estimuladas con anticuerpo contra CD3. 6.14 El silenciamiento génico de Cul4A y Cul4B juntos deroga parcialmente la producción de TNFa e IL-2 inducida por lenalidomida, po alidomida o el Compuesto B en células T Se midió la eficiencia del silenciamiento génico de Cul4A antes del tratamiento farmacológico. La expresión del gen Cul4A fue silenciada un 82% y 76% mediante el siRNA-1 de Cul4A y el siRNA de Cul4A + Cul4B, respectivamente (Figura 13A). La expresión del gen Cul4B fue suprimida un 70% y 63% con el siRNA de Cul4B y Cul4A + Cul4B, respectivamente. El silenciamiento génico individual de Cul4A o Cul4B no tuvo efecto sobre la producción de TNF-a o IL-2 de las células T inducida por 10 mM de lenalidomida, pomalidomida o Compuesto B (Figuras 13B y C). No obstante, el silenciamiento doble de Cul4A y Cul4B juntos dio lugar a una reversión significativa pero parcial de la elevación inducida por los compuestos de la producción de TNF-a debido a lenalidomida, pomalidomida y el Compuesto B (Figura 13B). Hubo una tendencia de una reversión de la producción de IL-2 cuando se silenció Cul4A y Cul4B (Figura 13C). Estos datos sugieren que la coestimulación de las células T en las que interviene lenalidomida, pomalidomida y el Compuesto B depende de la expresión de Cul4A y Cul4B, y que estas proteínas dan un servicio de funciones redundantes en las células T. 6.15 Expresión de CRBN y sensibilidad a lenalidomida en células de linfoxna En líneas de células de linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) se estudió la actividad antiproliferativa de lenalidomida contra la expresión basal de CRBN. Las siguientes líneas celulares DLBCL fueron evaluadas para determinar la sensibilidad a lenalidomida: OCl-LylO-NCI, U2932, OCI-Ly-3, DB, RIVA, TMD8 , Toledo, OCI-Ly-19, Pfeiffer, WSU-DLCL2, Karpas-1106P y SU-DHL-4. Los resultados se presentan en la Figura 14. 6.16 Preparación del complejo CRBN-DDBl Se diseñaron cebadores para clonar CRBN en pBV-ZZ-HT-LIC y pBV-notag-LlC. Se prepararon dos cebadores, "CRBN_For " y CRBN_Rev. " CRBN_For: GTGCCGCGTGGCTCCATGATGGCCGGCGAAGGAGATCA CRBN_Rev: GCTTCCTTTCGGGCTTATTACAAGCAAAGTATTACTT Se utilizaron los cebadores para amplificar el gen CRBN a partir de una biblioteca de cDNA. El producto fue purificado en gel y tratado con T4 DNA polimerasa en presencia de TTP solamente para hacer que los extremos monocatenarios fueran compatibles para la clonación independiente de la ligación. El DNA de CRBN fue luego hibridado a pBV-zz-HT-LlC para crear CRBN_034 (Figura 15 Para DDBl, se prepararon dos cebadores, "DDBl_For" y "DDBl_Rev. " DDBl_For: TCGGGCGCGGCTCTCGGTCCGAAAAGGATGTCGTACAACTACGTGGTAAC (ID SEC NO: 2) DDBl_Rev: GCTTCCTTTCGGGCTTATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAATGGATCCGAGTTAGC TCCT (ID SEC NO: 3) La molécula DDBl_Rev adiciona un StrepTag en los extremos C-terminales de DDBl. El gen DDBl fue amplificado a partir de una biblioteca de cDNA, fue purificado en gel y tratado con T4 polimerasa en presencia de TTP. El gen DDBl fue luego hibridado a pBV-notag-LIC para crear el plásmido DDBl_004 (Figura 15B).
Expresión de los constructos en baculovirus y puri ficación Los constructos fueron analizados para determinar la expresión en células de insecto. Los plásmidos recombinantes pBV-HT-LIC y pBV-GST-LIC fueron transformados en DHlOBac para producir bácmidos. La integridad de la recombinación fue seguida mediante una pantalla azul-blanco y PCR. Los bácmidos recombinantes fueron utilizados para transfectar 9 x 105 células adherentes Sf9 por pozo en medio Grace libre de suero. Después de la transfección, se adicionó medio Grace fresco que contenía antibióticos y glutamina.
Se siguió la infección por la observación de las monocapas celulares bajo el microscopio. Después de 5 a 7 días, los sobrenadantes fueron cosechados (virus PI) y los sedimentos fueron analizados para determinar la expresión de la proteína recombinante. La amplificación del virus fue en placas de 24 pozos profundos con 4 mL de 2 x 106 células Sf9/mL por pozo. Se retiraron alícuotas para valorar la cinética de la expresión de las proteínas. Después de 4 días, las placas fueron centrifugadas, se guardó el sobrenadante (virus P2) y los sedimentos fueron analizados por purificación en escala minimétrica de las proteínas etiquetadas. Los virus fueron finalmente amplificados en 750 mL de medio Grace que contenía antibióticos y glutamina y los sobrenadantes fueron guardados como virus P3. Los sedimentos fueron guardados y purificados utilizando el purificador AKATxpress o el purificador AKTA de Amersham Biosciences.
Purí fi cación Las pastas celulares que contenían CRBN-DDB1 fueron U sadas en una solución amortiguadora que contenía Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 500 mM, Imidazol 20 mM, 10% de Glicerol y DTT 2 itiM e inhibidores de proteasa. El U sado fue luego aclarado por centrifugación. Las proteínas etiquetadas fueron luego purificadas de los sobrenadantes utilizando el purificador AKTA Express de Amersham Biosciences. Para el paso de purificación por afinidad se utilizaron columnas HisTrap HP de 5 mL mientras que para los pasos de cromatografía por exclusión de tamaño se utilizó una columna Sephacryl S-200 HR de 16 m X 60 cm. Después de cargar la columna, la columna fue lavada con 20 volúmenes de solución amortiguadora para lisis, luego 10 volúmenes de columna de Tris 50 mM pH 8.0, NaCl 1000 M, Imidazol 40 mM, 10% Glicerol y DTT 2 mM. La elución de las proteínas unidas se hizo con solución amortiguadora para lisis que contenía imidazol 500 mM. Las proteínas eluidas fueron directamente inyectadas en la columna de filtración en gel equilibrada en Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 200 mM, 5% de Glicerol, y DTT 2 mM. Las fracciones fueron analizadas por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS 4-20%.
Las fracciones que contenían CRBN y DDBl fueron combinadas y digeridas con trombina para eliminar la etiqueta ZZ-HT del CRBN. La digestión se llevó a cabo a 42C durante 5-6 horas con 1:2000 (peso/peso) de trombina y CRBN-DDBl. La proteína CRBN-DDBl desdoblada fue diluida en Tris 25 mM pH 8.0, 5% de Glicerol y DTT 2 mM, y cargada en una columna MonoQ de 8 mL (Amersham-Pharmacia) equilibrada en Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 75 mM, 5% de Glicerol y DTT 2 mM. Después de la carga la columna fue lavada con 2 volúmenes de Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 75 mM, 5% Glicerol y DTT 2 mM, y las proteínas unidas fueron eluidas con un gradiente de desde 75 mM hasta 400 mM en Tris 25 M H 8.0, 5% Glicerol y DTT 2 mM.
Se hizo una filtración final en gel para pulir el complejo CRBN-DDBl. La fracción combinada de la columna MonoQ fue cargada sobre una columna de filtración en gel S200HR de 140 mL y fue procesada en Tris 25 mM pH 8.0, NaCl 200 mM, 5% de Glicerol y DTT 2 mM. Las fracciones fueron analizadas y las fracciones positivas fueron combinadas y concentradas a aproximadamente 15 mg/mL. Las alícuotas fueron guardadas a -809C. 6.17 Experimentos de ubiquitinación con la estrategia Ubiscan Los resultados de los experimentos de ubiquitinación de 1 hora y 4 horas se presentan en las Figuras 17-22, los cuales demuestran que ciertos péptidos son regulados por lenalidomida y/o pomalidomid . Las tablas de la Figura 23 muestran los resultados de los datos de Ubiscan para lenalidomida, pomalidomida y el Compuesto B. Las proteínas Ub de IKZF3, RPL19, PCMl y NEDD8 estaban comúnmente aumentadas en abundancia por Rev y Pom en células U266 y por el Compuesto B en las células T. las proteínas GNB2L1 y HNRNPR estaban comúnmente disminuidas en abundancia por Rev y Pom en células U266 y el Compuesto B en células T.
El tratamiento de las células T con el Compuesto B dio lugar a una mayor abundancia de dos péptidos ubiquinados (contra el testigo DMSO), SECTMl y ZC3H15.
Las proteínas en común con lenalidomida, pomalidomida y el Compuesto B: IKZF3, RPL19, PCMl, NEDD8, GNB2L1, y HNRNPR.
Tabla 7 Aciertos finales de Ubiscan para lenalidomida y pomalidomida (1 h) . .
. Tabla 8 Aciertos finales de Ubiscan para lenalidomida y pomalidomida (MG 1 h) Tabla 9 Aciertos finales de Ubiscan para lenalidomida y pomalidomida (4 h) . 20 4035 FASN DGLLENQTPEFFQDVCKPK 23 4181 HMOXI K * AAL EQ DL AF WY G PR 25 4347 NANS QLLPCEMACNEK*LGK 27 4938 GNB3 GQQKATV 28 4938 H2AFZ GQQK*TV 29 4968 METI IGEATKAPDGTVEQIGHILVSWLPR 31 5672 ANP32E K.L ELS DN 1 ISGGL E V L A EK *C PN LT Y L N LSGN K. 32 5676 CDC25C SLNQYPALYYPELY1LK*GGYR 33 5732 PPPICB AK* Y QYGGLNSG PVTPPR 35 6543 CHEK1 M#CGTLPYVAPELLIC*R 36 6546 CS K.I Al LFL1DFGLAK*K 37 6546 CSNK.1A1L LFUDFGLAK 38 6563 1RAK1 GTLAYLPEBYIK*TGR 40 6843 PRKAG2 KK*DVSSPGGSGGK*K*NASQK* 1 6858 CPSF3L VNC YMflPANG ETVTLPTSPSI PVGISLC LI.K*R 42 7344 RARS SDGGYTYDTSDLAAIK*QR 43 7672 C7orf42 QSNPEFCPEKAVALAEA 44 7717 CPNEI SEVIK'NNLNPTWK 46 8137 MUP88 IYSLREPQTPTNVIILSEAEEESLVLNK*GR 47 8331 TCÍRGI QEENK.*AGLLDLPDASVNGWSSDEEK 48 8723 FAFI K»SPM#\MPENAENECDALLQFTAEFS$R 49 8734 FUBP3 1TGDAFK*VQQAR 54 9253 PSMC3 LAGPQLVQM#FIGDGAK*LVR 55 9526 TSG101 ASÜSAVSDK*LR 56 9794 EEFIAI AAGAGK*VTK 57 9794 CEFIAL3 AAGAGK*VTK 58 9933 EIF2SI ADI EVAC Y G YEG I DA VK* EAL R _ Tabla 10 Aciertos finales de Ubiscan para lenalidomida y pomalidomida (MG 4 h) . . . 6.18 Eficacia de lenalidomida en el subtipo DLBCL tipo células B activadas depende de la expresión de IRF4 y CRBN Ensayo de proliferación celular La proliferación celular fue evaluada utilizando el ensayo de incorporación de timidina marcada con 3H. En resumen, células DLBCL con crecimiento logarítmico fueron cultivadas en placas de cultivo de 96 pozos en medio completo con la concentración indicada de lenalidomida o el testigo DMSO. Luego de la incubación a 37SC durante 5 días, se adicionó a cada pozo 1 pCi de timidina marcada con 3H (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ) durante las 5 horas finales de la incubación. Las células fueron luego cosechadas en placas filtrantes UniFilter GF/C (PerkinElmer, Waltham, MA) utilizando un cosechador de células (Tomtec, Hamden, CT) y se permitió que las placas se secaran durante la noche. La incorporación de timidina marcada con 3H de cada pozo luego se midió utilizando un instrumento TopCount NXT Microplate Scintillation y Luminescence Counter (Packard Bioscience, Meriden, CT). Se calculó el porcentaje de inhibición de la proliferación celular y se normalizó respecto al testigo DMSO.
Análisis de la expresión de las proteínas Las células fueron tratadas con los compuestos experimentales o con DMSO al 0.1% durante los tiempos indicados. Luego de la incubación, las células fueron recolectadas, sedimentadas por centrifugación e inmediatamente lisadas en 0.1 mL de solución amortiguadora para lisis que contenía Tris-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 10 mM, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0.5% de SDS, DTT 1 mM, Na3V041 mM, coctel de inhibidor de proteasa plus Complete (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), luego procesadas con Qiashredder™ (Qiagen, Valencia, CA) durante 1 minuto y congeladas en hielo seco. Las muestras fueron diluidas con 6x de solución amortiguadora para muestras SDS y luego hervidas durante 5 min. Aproximadamente 30 mL de esta mezcla fue cargada por franja en un gel Criterion Precast 4-12% Tris-HCl (Bio-Rad, Hercules, CA), sometidos a electroforesis y transferidos a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA). Las membranas fueron bloqueadas durante 1 hora a temperatura ambiente utilizando una solución amortiguadora para bloqueo (LI-COR Biosciences, Lincoln, Nebraska), luego fueron incubadas durante la noche a 42C con anticuerpos contra BCL-10, IRF4, CRBN o b-actina. Las membranas fueron lavadas e incubadas con anticuerpos secundarios iRDye Secondary Antibodies (1:30,000) durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la detección de las señales se siguió un protocolo normalizado utilizando el sistema Odysscy® Infrared Imaging System y el programa informático (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).
Ensayos de la actividad de NF-KB Células DLBCL en crecimiento logarítmico fueron tratadas con los compuestos experimentales como se indica. Los extractos nucleares fueron preparados utilizando un kit Nuclear Extract (Active Motif, Carlsbad, CA) y se determinó la concentración de proteína mediante el ensayo del ácido bicinconínico (Thermo Scientific, Rockford, IL). Se hizo la detección de la actividad de NF-B utilizando un ensayo in unoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA), colorimétrico a base de oligonucleótidos, sensible, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Active Motif). En resumen, los extractos nucleares de las células DLBCL fueron hibridados a placas de 96 pozos recubiertas con oligonucleóticos DNA tipo nativo que contenían una sola copia de la secuencia de unión consenso de NF-kB. La proteína NF-kB unida fue luego detectada con anticuerpos específicos para las subunidades p50, p65 (Reí A) o p70. Se adicionó un anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano y las placas fueron luego leídas por espectrofotometría a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm. La actividad de NF-kB fue calculada con base en la densidad óptica 450/655 nm.
Para el ensayo de gen reportero luciferasa impulsado por NF-kB, las células fueron transíectadas con el plásmido pGL4.32 [luc2P/NF-KB-RE/Hygro] (Promega, Madison, WI) utilizando el kit Nucleofector V y el programa 013 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Amaxa Biosystems, Gaithersburg, MD). Después de 24 horas de transíección, las células fueron tratadas con los compuestos experimentales durante 2 días y se prepararon lisados utilizando el sistema de ensayo Dual-Glo® Luciferase Assay System (Promega). Las actividades luciferasa de cada muestra fueron medidas utilizando un sistema TopCount NXT Microplate Scintillation and Luminescence Counter (Packard Bioscience).
Análisis PCR por transcriptasa inversa, cuantitativo , en tiempo real Después de 48 horas del tratamiento de las células se purificó el RNA total con los kits RNeasy® Mini Kits utilizando el sistema QiaCube™ (Qiagen Inc., Valencia, CA). La reacción RT-PCR cuantitativa en tiempo real con 25-100 ng del RNA total se hizo utilizando el kit de transcripción inversa y las sondas para PCR Taqman® específicas para los genes que interesan de acuerdo con los métodos normalizados (Applied Biosystems Inc.). La cantidad de producto fue normalizada para gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa como el gen housekeeping endógeno. Se calculó la relación de incremento de la expresión génica utilizando el método Ct comparativo ~ Electroporación para la sobreexpresión y silenciamiento de IRF4 Para silenciar IRF4, las células fueron transfectadas con Silencer® Select siRNA (RNA ínterferente pequeño, Applied Biosystems) dirigido contra IRF4, CRBN o Silencer® Select Negative Control siRNAs para una concentración final de 0.2-1 mM utilizando el kit Nucleofector® Kit V para la transfección. Para la sobreexpresión de IRF4, las células fueron transfectadas con los plásmidos de expresión citomegalovirus (CMV)-IRF4 o-proteína verde fluorescente (GFP) (OriGene Technologies, Rockville, MD) durante 24 h utilizando el kit Cell Line Nucleofector kit V como se menciona en lo anterior. Después de 24 horas de transfección, las células fueron tratadas con lenalidomida durante 2 días antes de realizar el ensayo de luciferasa, el análisis de la expresión génica por RT-PCR y el análisis Western blot .
Modelo de xenoinjerto de tumor humano Ratones hembras (6-12 semanas de nacidas) con inmunodeficiencia severa combinada (SCID) CB17 fueron obtenidas de Charles River Laboratory (Wilmington, MA) y mantenidas en jaulas con microaislador en condiciones estériles. Un total de 10 x 106 células DLBCL OCI-LylO en Matrigel al 100% (Becton Dickinson, San José, CA) fueron inyectadas por vía subcutánea en el costado derecho de los ratones.
Los ratones fueron vigilados 2 o 3 veces por semana para buscar la presencia de tumores. Una vez que los tumores llegaron a un tamaño promedio de 100-150 mg, 10 ratones para cada grupo fueron tratados con vehículo (carboximetil celulosa al 0.5%: Tween 80 al 0.25% en agua deionizada) o las dosis indicadas de lenalidomida (qd x 28, p.o.) o el testigo positivo vincristina (q4d x 4, i.v.). Los ratones fueron vigilados diario para determinar el estado de salud así como el crecimiento del tumor. Los tumores de todos los ratones fueron medidos con un medidor digital y se calcularon los volúmenes con la siguiente fórmula: volumen de tumor (mm3) = longitud (mm) x amplitud (mm)2. Los ratones fueron sacrificados cuando el tamaño del tumor superó 1000 mm3.
Análisis estadístico Se hicieron análisis para las comparaciones de múltiples grupos con un análisis de varianza de un sentido, seguido por la prueba posterior de Dunnett y los análisis de la correlación se llevaron a cabo utilizando la prueba de Pearson del valor p de dos colas utilizando el programa GraphPad Prism® versión 5.01 (San Diego, CA). En todos los análisis se consideró significativo un valor P < 0.05.
Resultados 6.18.1 Las células DLBCL ABC son más sensibles a lenalido ida que las células DLBCL no ABC Con el fin de definir el lugar de lenalidomida para el tratamiento de DLBCL en poblaciones específicas de pacientes y para comprender el mecanismo molecular de la eficacia, en este estudio se recopiló un panel de líneas de células DLBCL. Los subtipos de las líneas celulares DLBCL fueron confirmados con base en la información de la literatura (Lenz G, et al., Proc Nati Acad Sci USA 2008; 105: 13520-5) y el análisis molecular, incluso la actividad intracelular de NF-kB O la expresión de IRF4, así como el perfilado de la expresión génica de los genes firma importantes de las células B activadas. Véase las Figuras 24A-24C. Se encontró que la proliferación de las líneas de las células DLBCL estaba inhibida en diferentes grados por el tratamiento con lenalidomida en un intervalo de concentraciones de 0.01-100 mM. Lenalidomida tuvo efectos mínimos sobre la proliferación de las células PBML (leucocitos mononucleares de sangre periférica) y DLBCL GCB, pero inhibió significativamente la proliferación de las líneas de células DLBCL ABC, con excepción de OCI-Ly3. Véase la Figura 24. El tratamiento con lenalidomida también indujo apoptosis de las líneas de células sensibles como OCI-Ly 10. Véase la Figura 26. 6.18.2 Lenalidomida reduce la expresión de IRF4 en células DLBCL ABC Para comprender el mecanismo molecular de lenalidomida sobre las células ABC-DLBCL, se investigaron los efectos de lenalidomida sobre la expresión de IRF4 en estas células. El tratamiento con lenalidomida durante 1-3 días produjo una regulación significativa hacia abajo en los niveles de la proteína IRF4 en líneas de células sensibles como U2932 y OCI-Ly 10, pero no en las líneas de células no sensibles OCI-Ly3. Véase las Figuras 27A-C. La disminución de la expresión de IRF4 inducida por lenalidomida ocurrió tan pronto como a 1 día del tratamiento farmacológico, con cinética semejante a la de los inhibidores (zVRPR-fmk y LY-333,531, respectivamente) de MALTl y PKC3, dos enzimas importantes implicadas en la activación de NF-kB luego de la vinculación del BCR (receptor de linfocitos B) en las células B. En las células 0CI-Ly3, ni lenalidomida ni el inhibidor de RKOb tuvieron algún efecto apreciable sobre los niveles de IRF4 durante los tratamientos de 1-3 días. No obstante, el inhibidor de MALTl suprimió la expresión de IRF4 en células OCI-Ly3, con una inhibición completa observada después de 2-3 días de tratamiento. En general, estos datos sugieren que la inhibición de la expresión de IRF4 mediada por lenalidomida puede ser un mecanismo importante y parece estar relacionado con la sensibilidad de las células frente al fármaco. 6.18.3 Lenalidomida reduce la actividad del complejo CARD11-BCL-10-MALTl de células DLBCL ABC Nuestros datos de la secuenciación de DNA confirmaron los informes anteriores (Lenz, G., et al, Science 2008, 319: 1676-9) que la línea de DLBCL ABC OCI-Ly3 no sensible a lenalidomida tiene una mutación puntual única en CARD11 dentro de los exones que codifican el dominio coiled-coil (hélice enrollada), mientras que las ni líneas de DLBCL ABC OCI-LylO sensibles a lenalidomida, U2932, TMD8 y Riva no la tienen. Véase la Figura 28. Esta mutación ha sido documentada como causante de una formación constitutiva y activación del complejo CARDll-BCL-10-MALT1 (CBM) de la vía de señalización del BCR, dando origen a la sobreactivación de NF-kB en células de linfoma. Véase Lenz, G., et al, Science 2008, 319: 1676-9; Thome, M. et al, Coid Spring Harb Perspect Biol.2010; 2: a003004. Para investigar la implicación potencial del complejo CBM en la inhibición de IRF4 inducida por lenalidomida en estas células, se examinó el efecto de lenalidomida sobre la actividad del complejo midiendo la actividad enzimática de MALTl paracaspasa. La proteína MALTl es activada luego de la asociación con BCL-10 y CARDll para formar el complejo CBM activo y luego desdobla su ligando, como puede ser BCL-10. Véase las Figuras 29A-C.
Similar al efecto del inhibidor específico de MALTl y del inhibidor de PKCP, lenalidomida inhibió el desdoblamiento de BCL-10 inducido por MALTl en una forma dependiente de la concentración en las líneas de células DLBCL ABC sensibles OCI-LylO y U2932. Estudios cinéticos revelaron que si bien los inhibidores de MALTl y RK b afectaron el desdoblamiento de BCL-10 durante 1 día de tratamiento, la inhibición significativa del desdoblamiento de BCL-10 con lenalidomida ocurrió después de 2 días de tratamiento. Véase las Figuras 29A y 29B. A diferencia del inhibidor de MALTl, ni el inhibidor de RKGb ni lenalidomida tuvieron algún efecto en el desdoblamiento de BCL-10 en células OCI-Ly3, tal vez debido a la mutación de CARDll la cual ocasionó sobreactivación del complejo CBM. Véase la Figura 29C. Estos datos sugieren que lenalidomida, al igual que el inhibidor de Rkub, puede bloquear de manera significativa la formación/activación del complejo CBM u otros acontecimientos corriente arriba en células DLBCL ABC sensibles. 6.18.4 Lenalidomida reduce la actividad de NF-KB de las células DLBCL ABC pero no de las células DLBCL del subtipo no ABC El efecto de lenalidomida sobre la actividad de NF-KB en diferentes células DLBCL se examinó midiendo el nivel de las proteínas de la subunidad NF-kB que se unen a las secuencias consenso y la actividad luciferasa impulsada por NF-kB. Como se esperaba, la proteína NF-KB en las células DLBCL ABC demostró unión aumentada del DNA de NF-kB en comparación con las células DLBCL no ABC. Véase la Figura 24B. Un ensayo de luciferasa impulsado por NF-KB demostró que lenalidomida inhibió la actividad transcripcional de NF-kB en un 32-56% en las líneas de células DLBCL ABC sensibles a lenalidomida OCI-LylO y U2932 después del tratamiento farmacológico de 2 días. Véase la Figura 30A. Lenalidomida también inhibió parcialmente la unión de DNA por las subunidades de NF-KB Reí A/p65, p50 y c-rel/p70 en una forma dependiente de la concentración en diversas líneas de células DLBCL ABC, aunque el efecto no fue tan potente como el inhibidor de IKKa/b testigo CC-415501. Véase las Figuras 30B y 30C. Por el contrario, lenalidomida no tuvo efecto sobre la unión del DNA de NF-kB en las líneas DLBCL GCB ni en células mononucleares de sangre periférica normales. La línea de DLBCL ABC 0CI-Ly3 no sensible a lenalidomida que contenía la mutación CARDll mostró inhibición de NF-KB significaiva solo por el inhibidor de IKKa/b, y no por lenalidomida. Véase las Figuras 30B y 30C. Estos datos sugieren que lenalidomida inhibe la señalización de NF-KB en el complejo CBM o acontecimientos corriente arriba en células DLBCL ABC sensibles. 6.18.5 La alteración de la eg resión de IRF4 en células DLBCL ABC sensibles confiere resistencia frente a lenalidomida Se investigó la función de dependencia de la expresión de IRF4 en la transducción de la señal BCR-NF- kB y los efectos subsecuentes del tratamiento de lenalidomida sobre IRF4. Células DLBCL ABC sensibles a lenalidomida fueron transfectadas con siRNA específico de IRF4 o un plásmido de expresión a base de IRF4-CMV para modular la expresión de IRF4. Cuando las células U2932 o OCI-LylO fueron transfectadas con siRNA para IRF4 con el fin de silenciar la expresión de IRF4, la actividad transcripcional de NF-kB se disminuyó un 36-53%. Véase la Figura 31A. Así pues, el siRNA de IRF4 imitó los efectos de lenalidomida sobre NF-kB en estas células. La adición de lenalidomida a las células transfectadas con siRNA para IRF4 dio origen a una regulación aún más negativa de la actividad transcripcional de NF-KB.
Contrario a la transfección del siRNA de IRF4, la sobreexpresión de IRF4 en estas células durante 24 h aumentó significativamente la actividad de NF-kB de 3.6-7.9 veces. Véase la Figura 31B. Más aún, la sobreexpresión de IRF4 disminuyó los niveles de expresión de proteína BCL-10 del componente CBM. Véase la Figura 31C. Además, la sobreexpresión de IRF4 antagonizó el efecto de lenalidomida y del inhibidor de PKCP pero no del inhibidor IKK sobre la expresión de luciferasa impulsada por NF-kB en células U2932 y OCI-LylO. Véase la Figura 3ID. Por tanto, el efecto de realimentación positiva de IRF4 sobre la vía de BCR-NF-KB pareció ser en un punto situado entre PKCP e IKK. 6.18.6 Se necesita Cereblon para el efecto de lenalidomida sobre células DLBCL ABC Se ha demostrado que Cereblon es un mediador principal de la teratogenicidad de talidomida. Debido a su función crucial en las actividades anti-mieloma e inmunomoduladoras de lenalidomida y pomalidomida, se investigó la función de cereblon en la sensibilidad de las DLBCL frente a lenalidomida. En células DLBCL ABC, el silenciamiento de CRBN con siRNA confirió resistencia frente a lenalidomida tal y como se demostró por la derogación de los efectos inhibidores de lenalidomida sobre la expresión de IRF4, el desdoblamiento de BCL-10, la actividad de NF-kB y la proliferación de estas células, mientras que permaneció sin afectarse la actividad de los inhibidores para PKC e IKK. Véase las Figuras 32A-32D. Estos datos indican que los efectos antitumorales de lenalidomida sobre las células DLBCL ABC requieren de la presencia de cereblon. 6.18.7 Lenalidomida regula en forma negativa la señalización de IRF4/NF-KB en el modelo de xenoinjerto de ratón OCI-LylO Para confirmar la importancia de la inhibición mediada por lenalidomida de la señalización de NF-KB/IRF4 in vivo en células DLBCL ABC, se estableció un modelo de xenoinjerto OCI-LylO subuctáneo. Lenalidomida administrada a una dosis de 3-30 mg/kg (po, qdx28) disminuyó significativamente el tamaño del tumor en este modelo (p<0.01). Véase la Figura 33A. Con base en el peso de los ratones a lo largo del estudio no se observó toxicidad evidente de lenalidomida. En comparación con el grupo testigo vehículo, el tratamiento con lenalidomida durante 7 días disminuyó la expresión de IRF4 y el desdoblamiento de BCL-10 en un 15-35% (p<0.05). Véase la Figura 33B. Estos datos demuestran que lenalidomida puede reducir la expresión de IRF4 in vivo y retarda el crecimiento del tumor en un modelo de células DLBCL ABC, respaldando el valor potencial de lenalidomida como terapéutica en el tratamiento de DLBCL ABC en estudios clínicos. 6.18.8 Los niveles básales de mRNA para IRF4 y CRBN y las "puntuaciones ABC” de las células DLBCL se correlacionan con la sensibilidad frente a lenalidomida Ya que múltiples estudios han demostrado mayor sensibilidad de las células DLBCL ABC frente a lenalidomida contra los subtipos no ABC, se estudiaron biomarcadores potenciales predictivos para una respuesta terapéutica a lenalidomida. Los datos combinados de estudios in vi tro de once líneas celulares DLBCL de diferentes subtipos mostraron que la sensibilidad de los subtipos DLBCL a lenalidomida se correlacionó altamente con el nivel basal de la expresión de mRNA para IRF4 y CRBN. Además, la "puntuación ABC" global, calculada con base en los niveles básales de los genes firma de las células DLBCL ABC propuestos por Staudt, et al. (Ann. Rev. Med., 2002, 53: 303-18), se correlacionó con la actividad de lenalidomida y además confirma la sensibilidad única de este subtipo. Véase las Figuras 34A y 25. Las líneas de células DLBCL ABC sensibles a lenalidomida tendieron a expresar mayores niveles de las proteínas CRBN e.IRF4 en comparación con las líneas de células DLBCL GCB. véase la Figura 34B. Es interesante señalar que, la línea de células DLBCL ABC 0CI-Ly3 resistente a lenalidomida estuvo desprovista de la expresión de la proteína CRBN. Estos datos respaldan la eficacia preferencial de lenalidomida en células DLBCL ABC observada en los estudios clínicos y sugieren que la "puntuación ABC" o la propia expresión de IRF4 o CRBN, pueden servir como biomarcadores potenciales para la predicción de la eficacia de lenalidomida. 6.19 Anticuerpo CRBN70 policlonal El anticuerpo CRBN70 policlonal de conejo fue generado inoculando a los conejos con la secuencia peptídica de CRBN EEFHGRTLHDDD (ID SEC: 1), en donde la cisterna del extremo C-terminal EEFHGRTLHDDDC (subrayado) además se utiliza para acoplar el péptido a la hemocianina del molusco llamado Lapa californiana (KLH).
El péptido representado en la ID SEC NO : 1 utilizado para preparar el anticuerpo corresponde a. los aminoácidos 65-76 (en negritas ) de la isoforma 1 de CRBN (NP 057386 ) (ID SEC NO : 12 ) : 1 raagegdqqda ahnmgnhlpl lpaeseeede mevedqdske akkpaiinfd tslptahtyl 61 ga meafhgr tlhdddscqv ipvlpqvmrai lipgqtlpiq líhpqovsmv rnliqkdttf 121 avlaysnvqe reaqfgttae lyayreeqcif gieivkvkai grqrfltvlel c qadgiqqa 181 kvqilpacvl pst»sayqle slnkcqifps fcpvaredqcs ykwwqkyqkr kfhcanltsu 241 prwlysiyda etlmdrikfcq lro«denikd dslpsnpidf ayrvaacipi ddvlriqilk 301 igsalqrlrc ldimnkcta lcckqcqete Ittkneifsl slcgpraaayv nphgyvhetl 361 tvykaeninl iqrpstéhs fpgyawtvaq ckicaebigw kftatkkdras pqkfwgltrs 421 allptipdte delapdkvil el Debe señalarse que la isoforma 2 de CRBN (No . de acceso GenBank NP 001166953 ; ID SEC NO : 13 ) utiliza un sitio de corte y empalme en marco alternativo que da como resultado la eliminación de la alanina (subrayado) , pero no tiene otros cambios : 1 iiiagegdqqda ahnregnhlpl Ipeseeedea «avedqdskea kkpniinfdt slptshtylg 61 admeefhgrt Ihelddscqvi pvlpqvmil ipgqtlplql fhpqovsravr nliqkrtfa 121 viaysnver saqfgttaei yayreeqdfg ieivkvkalg rqrfkvlelr tqsdgiqqak !8i vqilpecyl straoavqlea Inkcqifpsk pvsredqcsy kwwqkyqkrk fhcanltawp 241 rwlyslyciae tlredrifckql rewdenlkdd slpsnpidfs yrvaaclpld dvlriqllki 301 gsaiqrlrce Idimnkctsl cckqcqetei tttaieifsls icgpmeayvr»phgyvhetlt 361 vyfeaenlnll grpsteswf pgyawtvaqc KAcashigwK fcatkkdragp qkfKgltrsa 421 llptipdted eispdkvllc 1 El anticuerpo policlonal CRBN70 fue purificado. El anticuerpo purificado luego fue titulado por ensayo ELISA indirecto contra el péptido o proteína unida a una fase sólida para medir la reactividad de los anticuerpos después de la elución y la cantidad del anticuerpo que permanece en el suero (el caudal).
El "título" del eluyente indica la concentración mínima a la cual el anticuerpo CRBN70 puede detectar eficazmente el antígeno CRBN. El título del "caudal" representa la reactividad de los anticuerpos que quedan en el suero después de que han sido pasados a través de la columna. 6.20 Secuencias de VH y VL de los anticuerpos anti-CRBN Los conejos fueron cebados con la secuencia de aminoácidos 65-76 (ID SEC NO: 1) de CRBN humano (ID SEC NO: 12), y se retiró el bazo para subtipificar la IgG y la creación de los anticuerpos monoclonales.
Las cadenas pesada y ligera de la IgG de dos clones de hibridoma CGN-6 fueron secuenciadas por Epitomics. Los dos clones fueron CGN-6-1-11 y CGN-6-4-5.
Breve descripción de los metodos de clonación molecular de IgG RabMAb: El RNA mensajero (mRNA) de las células del hibridoma se aisló utilizando el kit TURBOCAPTURE (Qiagen: Catálogo #72232) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante, y luego se sometió a transcriptasa inversa en cDNA utilizando el cebador oligo-dT. La región variable de la cadena pesada (VH) fue amplificada por PCR utilizando los cebadores patentados OYZ64-2 y OYZvh3. Toda la cadena ligera (LC) fue amplificada por PCR utilizando los cebadores patentados OYZ62 y 0YZ71. Los productos de la PCR fueron resueltos en gel de agarosa al 1% seguido por la purificación utilizando el kit de purificación en gel Qiagen (Qiagen: Catálogo #28704), y los fragmentos de DNA purificados fueron sometidos a secuenciación.
CGN-6-1-11- Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada (ID SEC NO: 4): ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCACTGTCAGTCAGTGGAGGAGTCCGG GGGTCGCCSGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGTACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTTACTATGGAG TGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGeGAAOGGGCTAGAATACATCGGATACATfTATAGTGAJAGTGATAAGACATAC TACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATUTGAAAATCACCAGTGCGAC AAYCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGYACTCCGCTTGCTAGTTATAGCATCl'GGGGCCCAGGCACCC TGGTCACCGTCTCCTTAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGC TCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCT CACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGA CCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCC TCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGfCTGTCtTTCATCTTCCCCCCAAAACC CAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGtGGIGGACG’ÍGAGCCAGGATGACCCCGAGG TGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGC ACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCA CAACPAGGCACTCCCGGCCCCCAICGAGAAAACCACTCCAAAGCCAGGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACA CCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCC GACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACXACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGA CGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCG TGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA CGN-6-1-11- Secuencia proteínica de la cadena pesada ( ID SEC NO : 5 ) : ME1G L RWLL L VAVLKGVHCQS VEESGG.RLV PGT PLT LTCT V SGFS LS Y YGVS WVROA PG KGLEYIGyiYSDSDKTYYSTWaKGRFTISKTSTCVDtKITSPTIEDTATyFCARGTPLAS YS 1 WG PGTLVTVS LGQ PKAPSVF PLAPCCG DTPSS TVTLGC LVKGY LPE-PVY VTWSSGTL TÍIGVRTFPSVRQSSGI YSLSSWSVTSSSÍJFVTCNVAHPATNTKVDKTVAP TCSKPTCP PPELLGGPSVr ! SRf PE^CVWDVSODOPBVOFTWY1H SQVRIARPP LREQ FWSTlRWSTLPIAHODWLRCKEFIiCKVHNiCALPAPlEKTIgKARGOPLEPKVYT MGPPREELSSR$VSLTCMINGFYPSDlSVES¾EK! «ítAEDí3YKTT»AVLDSDí5$YrLYSKL SVPT S EWQ&GDV FYCSVMHE ALHHH YTQKS 1 SRS PGK ~ CGN-6-1-11- Secuencia de nucleótidos de la cadena ligera CIGGCATCTGGGGTCCCCCCGCGGYSCAAAGGCASTGGATYTGGGACACAGTTCACJITCACCATTAGCGACCTGGA GTGTGACGATGCTGCCTTITACTACTGTGCACGCGGTTATT&YGGTAATATYITTTTTTTCGGCGGAGGGACCGAGG TGGTGGTCAAAGGTGATCCAGTTGCACCTACTCTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAftCA GTCACCATC6TGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACC5GGGAGGTGGATGGCACCACCCAAAC AACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAAT'CTGCAGATTG'i'ACCTACÍACC'i'CAGCAGCACTCTGACACTGA CCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTC AATAGGGGTGACTGTTAG CGN-6-1-11- Secuencia proteínica de la cadena ligera (ID SEC NO: 7): MDTRP.PTQi. GLLLLWLPGA’FFAQVT.TOTF SVSAAVGGTVTINCQASQSVYKNJSY SWF QQKreQ? KLLi $KM$íW 'KGSGFGTQ^ BCDDAA~YyCAGS*YGM FFFGGGTEW'/KGDPVAPIVI.IFPPAAD VATGTV? I VCVANKY F'PDVTVTWBVDGTTQT TG I E tí S KT PQNSADCT Yíl LS STLTLT STQYN S ttKEYTCKVTQGTTSWQS FNRGDC - CGN-6-4-5- Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada ( ID SEC NO : 8 ) : ATGGAGACTGGGCTGCQCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGG GGCTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGftC !TCACCTGCACRCTCTCYGGATTCTCCCTCAGIAGGTATGGAG TGAGCTGGGTCCGCCAeSCTCCAGGGAAGGGGCTSGAACACAICGtA ACAfTfAfAGTGATCCTGG ATCACATPC TACGCG.HCC'tGG6C<iAAAGtCCG.¾’l'YC.¾CCATCTCCAAAACC7CSYCGACCACS6fGííATTTí3AA.¾A' GACCA6TCC GACA^-TCGAGGACACCGCCACCTAYfTCTGfOCCAGAGSTAC CCGC ltJCfAOTTA!FACCACCTGSGGCCCAGGCA CCCTSGTCACCATC CCTTAGGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACtrGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCC AG-CTtCACGGfGACtCTGGGCrGtCTGGTC AGCGtACCTCCCGGAGCCAGTGAtCGTGACttGGAACTCGGGCAC CCTCACatATGGGGTACGCACCTttCCGYCCGTCCGeCAGtCCTCAGGCCTCTACiCGCTGAfiCAGCGiGGTGAGCG TGACCTCAAGCAGCCSGCCCGTCACCTGCAACGTSGCCCACCCAGCCACCAACíiCCAAAGTGGACAAGACCGYTGCG CCC TCGACATGCAGC&AGCCCACGTGCCCACOCCt TGAAC TCCTGGGGGGACCCTtTCTCTTCATCt TCCCCCCAAA ACCC¾AGGACACCCK:ATGA?CTCftCGCACCCCCSA£GfCACATGCGTGGTCGfGGACG GACCCAGGATGACCCCG AGGXGCAGYTCACATGGTMATAAftCAACGAGCMGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAAC AGCACGATCCGCGT<36TC¾6CACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCHAGGAGTTCAAGTGC;4AAGT CCACAACAAGGCACfCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCfCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCYGGAGCCGAAGGTCT ACiiCCftTGGGCCCICCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCAIGATCASCGGCTTCTACCCT tCCGACATCTCGGYGGAGYGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGtGCTGGACAG CGACCG TCCTACr TCCTCTACAGC AAGCYC CAG T0CCC ACGAGTGAGTGCCAGCGGGGCGAOGTC TYCACCTSC T CCGTSAT6CACGAGGCCTT6CACAACCACTACACGCRGAAGTCCATCTCCC6CTCTCCGGG7AAATGA CGN- 6 -4 - 5 - Secuencia proteínica de la cadena pesada ( 450 aminoácidos ) ( ID SEC NO : 9 ) : METGLRviLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRlVfPGTPLTLTCYVSGFSLSRYGVSWROAPG KGliEHIGYIYSDJPGMTFYATWAKGRFTISKTSSXIVDLKMTSPXIBPTAlYFCARGTPtA SYST GPGTLVTISI^QFKÍ PSVFPLA^CGDTPS5IVrL CLVKGYLPEPVr/TWNSGT LTNGVRTFPSVROSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHtATtrrKVOKWAPSTCSKPTC PPPELLGGPSVFIFPPKPKMLMISRTPEVfCWVDVSQDDPlNQFTWYlNNIiOVMARP PLREQQFNSTI RWST P1 AKQDM RGKEFKCKVHWKALPAPI EKTI SKARGOPkSPKVY TMG P PREELS SRS VSLTCM I NGFY PSD1S VEWEKNGKAEDN YKTTPAVLDS DGS FLY S LSVPTSEWORGDVFTCSWlliEA1HNHYTQKSISRSPGK- CGN-6-4-5- Secuencia de nucleótidos de la cadena ligera GACCCAGACTCCAGCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGTCCAGTGAGAATATTT ATAAGAACAACTACTTATCCTGGT7TCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATCAGGCATCCACT CTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACGaTTCAGTCTCACCATCAGCGACCTGGA GTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTGCAGGCGGTTATAGTGGTAATATTTTTACTTTCGGCGGAGGGACCGAGG TGGTGGTCAAAGGTGATCCAGWGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACA GTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACYTTCCCGATGTCACCGYCACCfGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAAC AAC5GGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGGAGCACTCTGACACTGA CCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCIGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTC AATAGGGGTGACTGTTAG CGN-6-4-5- Secuencia proteínica de la cadena ligera (ID SEC NO: 11): MDTRAPTQÍ»LG:LLLL¾I,PGAT FAQVLTQT PAS VS AAVGGTVT XMCOG S EH I YKHN Y LSSÍF OQKKslQPPKlLIYQASTJ ASGVPSRfKGSGSGTRFStTISDIiECDDAATYYCAGGYSGUl GT FGGGT EVW KGD PVA PTVL I F PPAADQVATGTVT I VCVAN K Y G PDVTVT WEV DGT TQT TGlENS TPQHSADCY LSSTLTMST YMSHKEYXO YQGTISl^/QSFNRGDC- Los alineamientos de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos CGN6-1-11 y CGN6-4-5 se encuentran en las Figuras 35 (cadenas pesadas) y 36 (cadenas ligeras). 6.21 Inmunoabsorción e inmunofluorescencia con el anticuerpo monoclonal anti-CRBN, CGN-6-4-5 El anticuerpo CGN-6-4-5 monoclonal de conejo reconoce específicamente la proteína CRBN humana de 51 kDa de longitud completa en ensayos de inmunoabsorción desnaturalizantes.
I uaunofluorescencia microscópica con focal : El anticuerpo CGN-6-4-5 fue diluido 1:1000. La tinción celular ejemplar de las células DF15 y DF15R se muestra en la Figura 37. En particular, las Figuras 37A y 37B representan el análisis inmunofluorescente confocal de las células DF15 (panel izquierdo) y DF15R (panel derecho) utilizando 1 yg/mL de anticuerpo CGN-6-4-5 (verde) (A) o la mezcla anticuerpo CGN-6-4-5 / péptido bloqueador CRBN (relación en exceso 1:5) (B). No se hizo tinción nuclear con Dapi (azul).
Inmunoabsorci ón El anticuerpo CGN-6-4-5 fue diluido 1:10,000 en solución amortiguadora PBS con 0.1% de Tween. Una inmunoabsorción ejemplar con células de mieloma que contenían CRBN endógeno (DF15), DF15R sin CRBN y células HEK293 que expresan CRBN etiquetado con flag, recombinante se muestra en la Figura 38. La neutralización del péptido se hizo combinando el anticuerpo con un exceso cinco veces (en peso) del péptido bloqueador en 500 yL de PBS e incubando con rotación constante a temperatura ambiente durante 2 horas. 6.22 Talidomida, lenalidomida y pomalidomida se unen a CRBN a través de la porción glutarimida La unión de ftalimida y glutarimida a CRBN se investigó con el fin de elucidar el mecanismo de unión a CRBN de talidomida, lenalidomida, pomalidomida y los compuestos con estructura semejante. Glutarimida se unió a CRBN, mientras que ftalimida no se unió. Así pues, estos resultados respaldan la hipótesis que talidomida, lenalidomida y pomalidomida se unen a CRBN a través de la porción glutarimida. Véase la Figura 39A. 6.23 La unión a CRBN de meti1-pomalidomida es enantiose1ectiva La unión de S-metil-pomalidomida y R-metil-pomalidomida se investigó con el fin de determinear si la unión a CRBN es enantioselectiva. S-metil-pomalidomida tuvo mayor afinidad para CRBN en comparación con R-metil-pomalidomida. Véase la Figura 39B.
S-metil-pomalidomida R-metil -pomalidomida Los ejemplos establecidos en lo anterior se presentan para dar a los expertos en la téenica una descripción y divulgación completa de cómo hacer y utilizar las modalidades reclamadas, y no están destinados a limitar el alcance de lo que se describe en la presente. Las modificaciones que son obvias para las personas expertas en la téenica están destinadas a entrar dentro del alcance de las siguientes cláusulas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en este documento como referencia como si cada publicación, patente o solicitud de patente estuviera específica e individualmente indicada como incorporada en la presente para referencia.

Claims (31)

REIVINDICACIONES
1. Un métodos para seleccionar un grupo de pacientes con cáncer con base en el nivel de expresión de CRBN, o los niveles de expresión de DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 o NFKB dentro del cáncer, con el propósito de predecir la respuesta clínica, vigilar la respuesta clínica o vigilar el cumplimiento del paciente a la dosificación por talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste; en donde los pacientes de cáncer son pacientes de mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, elanoma or tumor sólido.
2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque los pacientes de cáncer son pacientes de mieloma múltiple.
3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque los pacientes de cáncer son pacientes de linfoma no Hodgkin.
4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de DDBl en el cáncer.
5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de DDB2 en el cáncer.
6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de GSK3B en el cáncer.
7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de CUL4A en el cáncer.
8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de CUL4B en el cáncer.
9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de XBP-1 en el cáncer.
10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de FAS1 en el cáncer.
11. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de RANBP6 en el cáncer.
12. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de DUS3L en el cáncer.
13. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de PHGDH en el cáncer.
14. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de AMPK en el cáncer.
15. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de IRF4 en el cáncer.
16. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el método de seleccionar un grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de la expresión de NFKB en el cáncer.
17. Un método para identificar o vigilar la resistencia del paciente de mielo a múltiple al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, con base en la presencia o aparición de mutaciones dentro de un gen CRBN.
18. El método de la reivindicación 17, caracterizado porque la mutación con el gen CRBN es un polimorfismo de un solo nucleótido en la región codificadora c.745C>CA ocasionando un cambio de aminoácido 249D>YD en la proteína dentro del dominio de unión DDBl de CRBN.
19. Un método para seleccionar un grupo de pacientes de cáncer que responda al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste; con base en el nivel de expresión de CRBN, o los niveles de expresión de DDBl, DDB2, GSK3B, CUL4A, CUL4B, XBP-1, FAS1, RANBP6, DUS3L, PHGDH, AMPK, IRF4 o NFKB dentro de las células T, células B o células plasmáticas del paciente, con el propósito de predecir la respuesta clínica, vigilar la respuesta clínica o vigilar el cumplimiento del paciente a la dosificación con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, un estereoisómero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste.
20. El método de la reivindicación 19, caracterizado porque los pacientes de cáncer son pacientes de mieloma múltiple, linfoma no Hodgkin, linfoma de células B grandes, difusas, melanoma o tumor sólido.
21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque los pacientes de cáncer son pacientes de mieloma múltiple.
22. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque los pacientes de cáncer son pacientes de linfoma difuso de células B grandes.
23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque el linfoma difuso de células B grandes es del subtipo tipo células B activadas.
24. El método de la reivindicación 21, caracterizado porque el método de seleccionar el grupo de pacientes de cáncer se basa en el nivel de expresión de CRBN o IRF4 dentro de las células T, células B o células plasmáticas del paciente.
25. Un anticuerpo aislado que se une inmunoespecíficamente a un epítope en CRBN, en donde el epítope tiene la secuencia de aminoácidos ID SEC NO: 1.
26. El anticuerpo aislado de la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo es policlonal.
27. Un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CRBN, en donde el anticuerpo contiene: una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 5 o 9.
28. Un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a CRBN, en donde el anticuerpo contiene una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 7 u 11.
29. Un anticuerpo aislado que tiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 5 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 7.
30. Un anticuerpo aislado, que contiene una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 9 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos representada en la ID SEC NO: 11.
31. Un método para utilizar el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25 para medir los niveles de expresión de CRBN en las células tumorales u hospederas del paciente, para predecir la respuesta clínica, para vigilar la respuesta clínica, para vigilar el cumplimiento del paciente a la dosificación, o para vigilar el desarrollo de resistencia al tratamiento con talidomida, lenalidomida, pomalidomida o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidin-2,6-diona, un estereoisó ero de éste, o una sal, solvato, hidrato, co-cristal, clatrato o polimorfo aceptado para uso farmacéutico de éste.
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