MX2013012345A

MX2013012345A - Alfa glucosidasa acida modificada con procesamiento acelerado.

Info

Publication number: MX2013012345A
Application number: MX2013012345A
Authority: MX
Inventors: William M Canfield; Rodney J Moreland; Mariko Kudo
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2015-05-07
Also published as: AU2012245280A1; US20140186326A1; SG194486A1; IL228871A0; TN2013000427A1; ECSP13013036A; KR20140037082A; CN103797115A; GT201300252A; EP2699676A1; CL2013003010A1; SG10201605874TA; NI201300110A; JP2017035091A; JP2014513952A; CR20130555A; MA35125B1; RU2013151875A; PE20140617A1; CO6811810A2

Abstract

Se proporciona un polipéptido de alfa-glucosidasa ácida humana modificada, así como métodos para producir y usar la alfa-glucosidasa ácida humana modificada para tratar una glucogenosis.

Description

ALFA GLUCOSIDASA ACIDA MODIFICADA CON PROCESAMIENTO ACELERADO Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense No. 61/478,336, presentada el 22 de abril de 2011 , que se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad .

Campo de la Invención Esta descripción se refiere en general a la alfa-glucosidasa ácida humana modificada y su uso en el tratamiento de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno.

La enfermedad de Pompe, también conocida como enfermedad de almacenamiento de glucógeno (GSD por sus siglas en inglés) tipo I I y la deficiencia de maltasa ácida, es una miopatía metabólica autosómica recesiva provocada por una deficiencia de la enzima lisosómica alfa-glucosidasa ácida (GAA por sus siglas en inglés). GAA es una exo-1 ,4 y 1 ,6-a-glucosidasa que hidroliza glucógeno hasta glucosa en el lisosoma. La deficiencia de GAA conduce a la acumulación de glucógeno en los lisosomas y provoca un daño progresivo en el músculo respiratorio, cardiaco, y esquelético. La enfermedad varía desde una evolución infantil progresiva rápida que normalmente es mortal a los 1 -2 años de edad hasta una evolución progresiva más lenta y heterogénea que provoca una morbilidad significativa y una mortalidad temprana en niños y adultos. Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 3: 3389-3420 (2001 , McGraw-Hill); Van der Ploeg y Reuser, Lancet 372: 1342-1351 (2008).

Las etapas implicadas en la biosíntesis, transporte selectivo, y procesamiento lisosómico de GAA son complejas. El producto de traducción primario de GAA humana es un polipeptido de 952 aminoácidos que contiene siete sitios consenso de N-glicosilación. Moreland et al. , J. Biol. Chem. 280: 6780-6791 (2005). Los A/-glicanos en GAA incluyen glicanos de tipo complejo y de alto contenido en mañosa, algunos de los cuales están modificados con mañosa 6-fosfato. GAA se transporta selectivamente al lisosoma por medio del receptor de mañosa 6-fosfato independiente de cationes. En el lisosoma, la enzima experimenta un procesamiento adicional mediante proteasas y glicosidasas, lo que da como resultado un péptido maduro con capacidad para una eliminación incrementada de glucógeno.

La Figura 1 muestra un esquema de la ruta de procesamiento de GAA. Moreland et al. , 2005. En general, GAA experimenta hasta cuatro sucesos de escisión durante el procesamiento. Primero, el producto de traducción de GAA primario se escinde alrededor del aminoácido 57 para formar un precursor con un peso molecular aparente de 100 a 1 10 kDa. A continuación, el precursor de 100 a 1 10 kDa se escinde alrededor de los aminoácidos 1 13 y 122 para formar una porción de 3.9 kDa (aa 78-1 13) y una porción de 95 kDa (aa 122-952) . El polipeptido de 95 kDa se puede escindir después alrededor de los aminoácidos 781 y 792 para producir fragmentos de 76 kDa (aa 122-781 ) y 19.4 kDa (aa 792-952). La especie de 76 kDa 5 permanece asociada a los polipéptidos de 19.4 y 3.9 kDa. Una escisión proteolítica adicional convierte la especie de 76 kDa en una especie de 70 kDa (aa 204-781 ) que permanece asociada a los polipéptidos de 19.4, 10.4, y 3.9 kDa.

La terapia humana actual para tratar la enfermedad de ío Pompe implica la administración de GAA humana recombinante (por ejemplo, MYOZYME™). Aunque la GAA humana recombinante reduce de manera eficaz la acumulación de glucógeno en los pacientes, no se procesa completamente hasta la forma de 70 kDa tras la administración. Debido a que la afinidad de GAA por 15 el glucógeno se puede incrementar de manera significativa como resultado del procesamiento con proteasas (Moreland et al. , 2005; Wisselaar et al. , J. Biol. Chem. 268: 2223-2231 (1993)), el incremento de la velocidad de procesamiento de GAA humana recombinante podría proporcionar una eficacia terapéutica 0 mejorada de GAA, lo que incluye dosis inferiores y/o una administración menos frecuente de la terapia con GAA.

Por lo tanto, en el presente documento se describen polipéptidos de GAA modificada que se procesan más rápidamente que la GAA humana sin modificar. 5 Ciertas modalidades incluyen una alfa-glucosidasa ácida humana o un fragmento catalíticamente activo de la misma que tiene una modificación en o cerca de un sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. En ciertas modalidades, se proporciona un polipeptido que comprende una alfa-glucosidasa ácida humana (GAA) o un fragmento catalíticamente activo de la misma que tiene una modificación en o cerca de un sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. El fragmento catalíticamente activo se puede seleccionar de un fragmento de 70 kDa, 76 kDa, 82 kDa, 95 kDa o cualquier otro fragmento catalíticamente activo. En ciertas modalidades, el polipéptido comprende además una secuencia de selección del receptor. En ciertas modalidades, la secuencia de selección del receptor es una secuencia de IGF2.

En ciertos casos, la modificación da como resultado una hidrofobicidad incrementada en o cerca de un sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. En ciertos casos, el polipéptido está modificado en uno o más aminoácidos que corresponden a las posiciones 195-209 de SEC I D No. : 1 . En modalidades adicionales, la modificación está en uno o más aminoácidos que corresponden a las posiciones de aminoácidos 200-204 de SEC I D No. : 1 . En ciertas modalidades, la modificación está en el aminoácido que corresponde a la posición 201 de SEC I D No. : 1 . En modalidades adicionales, la modificación es la sustitución de uno o más aminoácidos con un aminoácido más hidrófobo. En otras modalidades, la modificación es la inserción de uno o más aminoácidos hidrófobos. En otras modalidades adicionales, el aminoácido hidrófobo se selecciona de leucina y tirosina.

En ciertas modalidades, el polipeptido tiene al menos un 80% de identidad respecto de al menos 500 aminoácidos de SEC 5 ID No. : 1 . En ciertos casos, el polipéptido tiene al menos un 90% de identidad respecto de al menos 500 aminoácidos de SEC I D No. : 1 . En otros casos, el polipéptido tiene al menos un 95% de identidad respecto de al menos 500 aminoácidos de SEC ID No. : 1 . ío En ciertas modalidades, el polipéptido exhibe un procesamiento más rápido con proteasas lisosómicas en comparación con una alfa-glucosidasa ácida humana sin modificar. En ciertas modalidades, al menos un 50% del polipéptido se procesa proteolíticamente hasta una forma de 70 ís kDa en 20 horas desde la administración. En otras modalidades, sustancialmente todo el polipéptido se procesa proteolíticamente hasta una forma de 70 kDa forma en 55 horas desde la administración.

Ciertas modalidades incluyen polipéptidos conjugados a un 0 oligosacárido que comprende al menos una manosa-6-fosfato.

En ciertas modalidades, se proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido de GAA modificada. En modalidades adicionales, se proporciona una célula huésped transfectada de manera estable con el ácido nucleico. En modalidades 5 adicionales, la célula huésped es capaz de secretar la GAA modificada.

En ciertas modalidades, se proporciona un metodo para reducir o prevenir la acumulación de glucógeno en un tejido, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido como se describe en el presente documento a un paciente que lo necesita. En modalidades adicionales, el paciente tiene una glucogenosis. En modalidades adicionales, la glucogenosis es la enfermedad de Pompe.

En otras modalidades, se proporciona un método para tratar una glucogenosis, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una GAA modificada a un paciente que lo necesita. En modalidades adicionales, la glucogenosis es la enfermedad de Pompe. En otras modalidades, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende una GAA modificada como se describe en el presente documento para el uso en el tratamiento de una glucogenosis. En ciertas modalidades, el polipéptido se liofiliza.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1 es un diagrama que muestra un modelo para la maduración de GAA humana nativa.

Figura 2 muestra una SDS-PAGE de GAA recombinante (carril 1 ), GAA placentaria humana (carril 2), y GAA de testículo bovino (carril 3).

Figura 3A muestra una alineación de GAA humana desde los aminoácidos 197 a 206 con GAAs de ratón, hámster, bovina, y de codorniz. Figura 3B muestra los resultados de una transferencia de Western que compara diferentes GAAs procesadas. El carril 1 muestra la GAA humana purificada de placenta. Los carriles 2 y 3 son GAAs de control purificadas de 5 celulas 293T transfectadas con construcciones de GAA humana de tipo natural. Los carriles 4-7 son GAAs modificadas purificadas de células 293T transfectadas con construcciones de GAA humana en las que la histidina del aminoácido 201 se cambió a los aminoácidos siguientes: arginina (carril 4), leucina (carril 5), ío tirosina (carril 6), y lisina (carril 7).

Figura 4 muestra la biosíntesis de rhGAA(H201 L) y rhGAA (WT) en células CHO transfectadas de manera estable.

Figura 5 muestra la absorción de fibroblastos de Pompe y el procesamiento de rhGAA (WT) y rhGAA (H201 L). 15 Figura 6 muestra los resultados de transferencias de Western analizadas con anticuerpo monoclonal anti-GAA 183-200 (Figura 6A) y GAA1 (Figura 6B).

Figura 7 es un esquema de un modelo de procesamiento para rhGAA(H201 L). 0 Descripción de las Modalidades Para ayudar a entender la presente descripción, primero se definen ciertos términos. Se proporcionan definiciones adicionales a lo largo de la solicitud.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sitio 5 de procesamiento de 70 kDa N-terminal" se refiere al sitio de reconocimiento para las enzimas proteolíticas que escinden GAA en la posición que corresponde a los aminoácidos 200 a 204 de SEC I D No. : 1 (GAA humana nativa).

Como se usa en el presente documento, la expresión "GAA modificada" se refiere a GAA humana y las variantes de GAA que tienen al menos un aminoácido en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal que difiere del aminoácido hallado en la GAA humana nativa. La GAA modificada tambien se denomina en la descripción "GAA humana modificada". La expresión "GAA modificada" incluye los polipéptidos de GAA de longitud completa que contienen secuencias señal, así como los polipéptidos de GAA parcialmente procesados como se secretan de las células.

Como se usan en el presente documento, las formas singulares "un", "uno/una", y "el/la" incluyen las referencias plurales, a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. Así, por ejemplo, la referencia a un método que contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos. El término "o" se usa en general en el sentido que incluye "y/o", a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera.

A lo largo de la especificación, los tamaños de las proteínas y polipéptidos se proporcionan en unidades de "kDa". Un experto en la téenica reconocerá que estos tamaños se basan en el peso molecular aparente de los polipéptidos en ensayos de electroforesis tales como SDS-PAGE (ver, por ejemplo, Moreland et al. , 2005). Los pesos moleculares exactos dependerán del estado de glicosilación y otros parámetros tales como la asociación con otros polipeptidos, y se pueden determinar mediante diversos métodos que son muy conocidos para los expertos en la téenica.

Todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de que las publicaciones y patentes o solicitudes de patente incorporadas como referencia contradigan la invención contenida en la especificación, la especificación reemplazará cualquier material contradictorio.

I. Alfa-glucosidasa ácida (GAA) Como se describió anteriormente, la GAA es una enzima lisosómica implicada en la eliminación del glucógeno. El término GAA comprende tanto las formas de longitud completa como las de tipo natural de la proteína, así como otras variantes catalíticamente activas. La GAA catalíticamente activa y las variantes de GAA conservarán al menos la actividad catalítica hacia el glucógeno. Los expertos en la técnica conocen numerosas variantes de GAA humana nativa, que incluyen las que se han truncado, fusionado o conjugado con otros polipéptidos, alterado en sus secuencias de aminoácidos, o alterado de manera recombinante o qu ímicamente. Por ejemplo, se sabe que se pueden eliminar al menos 77 aminoácidos N-terminales de GAA humana nativa (SEC I D No. : 1 ) sin que pierda actividad . Moreland et al . , 2005. Además, se han descrito conjugados y proteínas de fusión. En ciertas modalidades, una GAA o fragmento catalíticamente activo de GAA se puede conjugar o fusionar a una secuencia de selección del receptor. En ciertos casos, la secuencia de selección del receptor puede ser reconocida por un receptor celular. Por ejemplo, una GAA truncada se puede fusionar a un dominio IGF2 como se describió en la Patente Estadounidense 7,785,856, que se incorpora como referencia en su totalidad. GAA también se ha alterado para añadir restos sintéticos, restos de carbohidratos y/o niveles incrementados de manosa-6-fosfato. Por ejemplo, se describen enzimas lisosómicas con restos de carbohidratos modificados que contienen niveles incrementados de manosa-6-fosfato en la Patente Estadounidense 7,001 ,994; 7,723,296; 7,786,277; la Publicación de Patente Estadounidense 2010/0173385; y la Publicación PCT 2010/075010, que se incorporan como referencia en su totalidad .

En ciertas modalidades, las GAAs descritas en el presente documento tienen al menos un 80, 90, 95, o 99% de identidad respecto de una GAA humana o una variante de GAA. En ciertos casos, la GAA tiene al menos un 80, 90, 95, o 99% de identidad respecto de al menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, o 900 aminoácidos de SEC ID No.: 1 .

Se puede usar cualquiera de las GAAs humanas catalíticamente activas descritas en esta sección como secuencia base para una GAA modificada descrita en el presente documento. Un experto en la teenica reconocerá qué variantes de GAA son adecuadas para el uso en la invención. Cuando una secuencia base de GAA tiene una longitud o un patrón de glicosilación diferentes en comparación con la GAA humana nativa, los polipéptidos procesados tendrán tamaños que varían en consecuencia.

II. GAA Modificada En diversas modalidades, se proporciona un polipéptido que comprende una GAA humana modificada que está modificado en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. La región "cerca" del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal incluye hasta 5 aminoácidos antes o después del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. En ciertas modalidades, la región en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal incluye los aminoácidos que corresponden a las posiciones 195-209 de SEC ID No.: 1 .

Las GAAs modificadas descritas en el presente documento se procesan más rápidamente que la GAA sin modificar. En ciertas modalidades, la GAA modificada tiene una hidrofobicidad incrementada en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. En ciertas modalidades, la GAA modificada tiene una velocidad más rápida de procesamiento proteolítico respecto de una forma madura de 70 kDa. En ciertas modalidades, y dependiendo de la secuencia de inicio, la GAA modificada se procesa hasta una variante de la forma madura de 70 kDa. La GAA modificada se puede procesar de forma que el polipeptido maduro permanece asociado con fragmentos polipeptídicos adicionales. En ciertas modalidades, la GAA modificada se procesa por medio de la misma ruta que la GAA sin modificar. En otras modalidades, la GAA modificada se procesa por medio de intermedios diferentes en comparación con una GAA sin modificar. Por ejemplo, una GAA de longitud completa modificada se puede procesar por medio de intermedios de 76 kDa o 82 kDa, o ambos. La GAA modificada puede ser reconocida por las mismas proteasas que una GAA sin modificar, y puede ser procesada en el mismo orden o en un orden diferente.

En ciertas modalidades, la GAA se modifica para incrementar su hidrofobicidad en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal sustituyendo al menos un aminoácido con un aminoácido más hidrófobo. En ciertas modalidades, la sustitución se puede hacer dentro de los 5 aminoácidos antes o después del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. En ciertos ejemplos, la sustitución de aminoácidos se puede hacer en un aminoácido que corresponde a la posición 195 a 209 de SEC ID No. : 1 . En otros casos, la sustitución de aminoácidos se puede hacer en un aminoácido que corresponde a la posición 200 a 204 de SEC I D No. : 1 . En modalidades adicionales, la GAA humana modificada contiene un aminoácido hidrófobo en la posición que corresponde a la posición del aminoácido 201 de SEC I D No.: 1 . En ciertas modalidades, la GAA se modifica insertando uno o más aminoácidos hidrófobos en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. Las modificaciones adicionales incluyen la deleción de uno o más aminoácidos en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal.

En ciertas modalidades, se proporciona una GAA humana modificada que contiene un aminoácido hidrófobo (natural o sintetico) en más de una posición en el sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal, o dentro de 5 aminoácidos del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal. En una modalidad, uno de los aminoácidos modificados está en la posición que corresponde al aminoácido 201 de SEC I D No. : 1 .

En diversas modalidades, el aminoácido hidrófobo se selecciona de valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, tirosina, cisteína o alanina. En modalidades adicionales, el aminoácido hidrófobo es leucina o tirosina. En ciertas modalidades, la GAA humana modificada contiene un aminoácido sintético o no natural que exhibe propiedades hidrófobas. En general, el aminoácido sustituido es más hidrófobo que el aminoácido de tipo natural, y así incrementa la hidrofobicidad en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal.

En una modalidad ejemplar, la GAA modificada tiene una leucina en la posición que corresponde al aminoácido 201 de SEC ID No. : 1 . En otra modalidad , la GAA modificada tiene una tirosina en la posición que corresponde al aminoácido 201 de SEC ID No. : 1 .

En ciertas modalidades, se proporcionan GAAs humanas modificadas que tienen al menos un 80, 90, 95, o 99% de homología respecto de al menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, o 900 aminoácidos de SEC ID No. : 1 , y en donde la GAA humana modificada tiene al menos un aminoácido en el sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal sustituido con un aminoácido más hidrófobo.

En ciertas modalidades, al menos un 50% de la GAA humana modificada se procesa hasta una forma de 70 kDa en el lisosoma en 20, 30, o 40 horas. En modalidades adicionales, sustancialmente toda la GAA humana modificada se procesa hasta una forma de 70 kDa en el lisosoma en 55, 65, o 75 horas.

En ciertas modalidades, se puede identificar una GAA humana modificada de la invención por su procesamiento proteolítico más rápido hasta una forma de 70 kDa madura, o una variante correspondiente de la misma. En otras modalidades, se puede identificar una GAA humana modificada como se describe en el presente documento por la producción de un polipeptido intermedio de 82 kDa que no se produce durante el procesamiento proteolítico de la GAA humana nativa. En modalidades adicionales, se puede identificar una GAA humana modificada por la ausencia de un polipéptido intermedio de 76 kDa que se produce durante el procesamiento proteolítico de la GAA humana sin modificar.

III. Producción de GAA Modificada En diversas modalidades, se puede producir un polipeptido de GAA modificada de acuerdo con métodos conocidos para un experto en la téenica. Por ejemplo, un polipéptido de GAA modificada se puede expresar y secretar a partir de líneas celulares transfectadas de manera estable con ácidos nucleicos que codifican una GAA modificada. Las líneas celulares adecuadas incluyen fibroblastos, células de ovario de hámster chino (CHO por sus siglas en inglés), células 293T, o células vegetales, entre otras reconocidas por los expertos en la técnica. Las líneas celulares ejemplares y los métodos de producción se describen en las Patentes Estadounidense Nos. 7,351 ,410 y 7, 138,262; y en la Publicación de Patente Estadounidense No. 2010/0196345, que se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad. En ciertas modalidades, se inserta un ácido nucleico que codifica una GAA modificada en un plásmido o vector que contiene ios promotores y las secuencias reguladoras adecuadas para la expresión a partir de una línea celular. Los promotores útiles para producir GAA modificada en líneas celulares de mamífero incluyen los promotores de rpS21 y beta-actina (ver, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 7,423, 135), entre muchos otros reconocidos por los expertos en la técnica. En ciertas modalidades, la GAA modificada se altera adicionalmente para incrementar o disminuir los niveles de glicosilación o de mañosa 6-fosfato, por lo que se aumenta la secreción y/o transporte selectivo lisosómico.

IV. Composiciones Farmaceuticas En ciertas modalidades, la GAA modificada está presente en una composición farmacéutica que comprende al menos un aditivo como un relleno, agente de carga, disgregante, amortiguador, estabilizante, o excipiente. Las téenicas de formulación farmacéutica habituales son muy conocidas para las personas expertas en la técnica (ver, por ejemplo, 2005 Physicians’ Desk Reference® , Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed . , Gennado et al. , Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Filadelfia, PA, 2000). Los aditivos farmacéuticos adecuados incluyen , por ejemplo, manitol, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol, y similares. En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden contener también reactivos de amortiguamiento del pH y agentes humectantes o emulsionantes. En modalidades adicionales, las composiciones pueden contener conservantes o estabilizantes.

En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas que comprenden la GAA humana modificada pueden comprender además uno o más de lo siguiente: manitol, polisorbato 80, heptahidrato dibásico fosfato de sodio, y monohidrato monobásico fosfato de sodio. En otra modalidad , las composiciones farmaceuticas pueden contener Histidina 10 mM de pH 6.5 con hasta un 2% de glicina, hasta un 2% de manitol, y hasta un 0.01 % de polisorbato 80. Se pueden hallar composiciones farmacéuticas ejemplares adicionales en la Publicación PCT No. 2010/075010.

La formulación de composiciones farmacéuticas pueden variar dependiendo de la vía de administración deseada y de otros parámetros (ver, por ejemplo, Rowe et al. , Handbook of Pharmaceutical Excipiente, 4a ed., APhA Publications, 2003.) En ciertas modalidades, la composición de GAA modificada puede ser una masa o polvo liofilizado. La composición liofilizada se puede reconstituir para la administración mediante inyección intravenosa, por ejemplo con Agua Estéril para I nyección, USP. En otras modalidades, la composición puede ser una solución estéril, no pirógena.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden comprender GAA modificada como el único compuesto activo, o se pueden administrar en combinación con otro compuesto, composición , o material biológico. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede comprender también una o más moléculas pequeñas útiles para el tratamiento de la enfermedad de Pompe y/o un efecto secundario asociado a la enfermedad de Pompe o su tratamiento. En ciertas modalidades, la composición puede comprender miglustat y/o uno o más compuestos descritos, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente Estadounidense Nos. 2003/0050299, 2003/0153768; 2005/0222244; o 2005/0267094. En ciertas modalidades, la composición farmaceutica puede comprender también uno o más inmunosupresores, inhibidores de mTOR o inhibidores de la autofagia. Los ejemplos de inmunosupresores incluyen rapamicina y velcade. La rapamicina es también un inhibidor de mTOR.

V. Métodos Terapéuticos En algunas modalidades, se usa una GAA humana modificada para reducir o prevenir la acumulación de glucógeno en un tejido de un paciente. En otras modalidades, la GAA humana modificada se usa para tratar una glucogenosis. En modalidades adicionales, la glucogenosis es la enfermedad de Pompe. En las modalidades ejemplares, la GAA modificada se procesa posteriormente hasta GAA madura en el lisosoma tras la administración al paciente.

La GAA modificada descrita en el presente documento se puede administrar mediante cualquier sistema de administración adecuado y puede incluir, sin limitación, la administración parenteral (que incluye la inyección subcutánea, intravenosa, intracraneal, intramedular, intraarticular, intramuscular, intratecal, o intraperitoneal), transdérmica, u oral (por ejemplo, en cápsulas, suspensiones, o comprimidos). En una modalidad, la GAA modificada se administra mediante administración intravenosa.

En modalidades adicionales, se puede administrar un ácido nucleico que codifica una GAA modificada al paciente. El ácido nucleico se puede administrar mediante el uso de un vector adecuado para la terapia genica. Los ejemplos de métodos de terapia génica se describen, por ejemplo, en las Patentes Estadounidense Nos 5,952,516; 6,066,626; 6,071 ,890; y 6,287,857.

La administración a un paciente puede darse en una única dosis o en administraciones repetidas, y en cualquiera de una diversidad de formas de sales fisiológicamente aceptables, y/o con un vehículo y/o aditivo farmacéutico aceptable como parte de una composición farmacéutica.

Las composiciones de GAA modificada descritas en el presente documento se administran en cantidades terapéuticamente eficaces. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar con la edad del sujeto, el estado general, y el sexo, así como la gravedad de la afección médica en el sujeto. Un médico puede determinar la dosis y ajustarla, como sea necesario, para adecuarla a los efectos observados del tratamiento.

Las GAAs modificadas descritas en el presente documento se pueden administrar mediante infusión intravenosa en el ámbito de los pacientes ambulatorios, por ejemplo, cada 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más días, o, por ejemplo, mediante la administración semanal, bisemanal, mensual, o bimensual. La dosis terapéuticamente eficaz adecuada de un compuesto es seleccionada por el medico que aplica el tratamiento, y puede oscilar de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg , de aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg y de aproximadamente 20 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg. En algunas modalidades, la dosis terapéutica adecuada se selecciona, por ejemplo, de 0.1 , 0.25, 0.5, 0.75, 1 , 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, y 100 mg/kg. Además, se pueden hallar ejemplos de dosis específicas en el Physicians’ Desk Reference® .

En algunas modalidades, los métodos comprenden la administración de GAA humana modificada, por lo que se incrementa la eliminación de glucógeno en el sujeto, por ejemplo, en al menos un 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100% , respecto de la actividad endógena. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrar una GAA humana modificada, por lo que se incrementa la eliminación de glucógeno en el sujeto, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, o 1000 veces, respecto de la actividad endógena. La eliminación incrementada de glucógeno se puede determinar, por ejemplo, mediante una reducción de los síntomas clínicos o mediante un ensayo clínico o biológico adecuado, como un ensayo de almacenamiento de glucógeno en los lisosomas.

En ciertas modalidades, la eliminación incrementada de glucógeno tras el tratamiento de un paciente con una composición farmacéutica que comprende GAA humana modificada se puede determinar mediante la observación bioquímica (ver, por ejemplo, Zhu et al. , J. Biol. Chem. 279: 50336-50341 (2004)) o histológica de la acumulación lisosómica reducida de glucógeno, por ejemplo, en miocitos cardiacos, miocitos esqueleticos, o fibroblastos cutáneos. La actividad de GAA se puede ensayar también, por ejemplo, en una muestra de biopsia muscular, en fibroblastos cutáneos cultivados, en linfocitos, y en muestras de sangre seca. Los ensayos con muestras de sangre seca se describen, por ejemplo, en Umpathysivam et al. , Clin. Chem. 47: 1378-1383 (2001 ) y Li et al. , Clin. Chem. 50:1785-1796 (2004). El tratamiento de la enfermedad de Pompe se puede estudiar también, por ejemplo, mediante los niveles séricos de creatinina qumasa, mejoras en la función motora (por ejemplo, como se estudia mediante la Escala de Motricidad Infantil de Alberta), cambios en el índice de masa ventricular izquierda como se mide mediante ecocardiograma, y la actividad cardioeléctrica, como se mide mediante electrocardiograma. La administración de una composición farmacéutica que comprende GAA humana modificada también puede dar como resultado una reducción en uno o más síntomas de la enfermedad de Pompe como cardiomegalia, cardiomiopatía, somnolencia diurna, disnea de esfuerzo, retraso del crecimiento, dificultades de alimentación, "flacidez", anormalidades de la marcha, cefaleas, hipotonía, organomegalia (por ejemplo, agrandamiento del corazón , lengua, hígado), lordosis, pérdida del equilibrio, dolor lumbar, cefalea matutina, debilidad muscular, insuficiencia respiratoria, escápula alada, escoliosis, reflejos tendinosos profundos reducidos, apnea del sueño, susceptibilidad a las infecciones respiratorias, y vómitos.

En ciertas modalidades, los metodos comprenden la administración de composiciones farmacéuticas que comprenden la GAA humana modificada con una o más terapias adicionales. Una o más terapias adicionales se pueden administrar de manera concurrente (que incluye la administración concurrente en forma de una formulación combinada), antes de, o después de la administración de la GAA humana modificada. En ciertos casos, se puede administrar una terapia adicional entre dosis de GAA modificada. Por ejemplo, se puede usar una terapia con moléculas pequeñas para frenar la reacumulación de glucógeno, lo que permite dosis menos frecuentes de la GAA modificada.

En algunas modalidades, los métodos comprenden tratar a un sujeto con un antipirético, antihistamínico, y/o inmunosupresor (antes de, después de, o durante el tratamiento con una GAA humana modificada descrita anteriormente). En ciertas modalidades, se puede tratar a un sujeto con un antipirético, antihistamínico, y/o inmunosupresor antes del tratamiento con una GAA humana modificada para disminuir o prevenir las reacciones asociadas a la infusión . Por ejemplo, se puede pretratar a los sujetos con uno o más de acetaminofeno, azatioprina, ciclofosfamida, ciclosporina A, difenhidramina, metotrexato, micofenolato de mofetilo, esteroides orales, o rapamicina.

En algunas modalidades, los metodos comprenden tratar a un sujeto (antes, después, o durante el tratamiento con una GAA humana modificada) con una terapia con moléculas pequeñas y/o terapia génica, que incluye terapia con moléculas pequeñas y terapia génica dirigidas hacia el tratamiento de una glucogenosis. La terapia con moléculas pequeñas puede comprender la administración de miglustat y/o uno o más compuestos descritos, por ejemplo, en las Publicaciones de las Solicitudes de Patente Estadounidense Nos 2003/0050299, 2003/0153768; 2005/0222244; y 2005/0267094. La terapia génica se puede llevar a cabo como se describió, por ejemplo, en las Patentes Estadounidense Nos 5,952,516; 6,066,626; 6,071 ,890; y 6,287,857; y la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2003/0087868.

VI. Ejemplos Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar, y no para limitar, la presente descripción.

Ejemplo 1 : Materiales y Métodos A. Reactivos y materiales de ensayo Se obtuvo Concanavalina A, DEAE-Sepharose FF, y Superdex 200 de grado preparativo de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Se obtuvo a-metilglucósido, benzamidina, y a-D-glucósido de 4-metilumbeliferilo de Sigma- Aldrich (Saint Louis, MO). Otros productos químicos fueron de grados reactivos o mejores, y fueron de los proveedores habituales. Los geles de SDS-PAGE se obtuvieron de Invitrogen (San Diego, CA). Las botellas para agitación rotatoria se obtuvieron de Corning (Corning, NY). El medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y el suero bovino fetal (FBS) se obtuvieron de J RH Biosciences (Lenexa, KS). Se obtuvieron fibroblastos de Pompe (GM00248) de Coriell Cell Repositories (Camden, NJ).

B. Actividad de a-glucosidasa Acida y Ensayo de Proteínas La a-glucosidasa ácida se ensayó de manera fluorimetrica en una placa de microtitulación mediante el uso a-D-glucósido de 4-metilumbeliferilo como se describió previamente. Oude Elferink et al. , Eur. J. Biochem. 139: 489-495 (1984). La concentración de proteínas se estimó mediante la absorbencia a 280 nm suponiendo E1 % = 10 o mediante el uso del ensayo estandarizado Micro-BCA con albúmina de suero bovino. Smith et al. , Anal. Biochem. 150: 76-85 (1985).

C. Electroforesis en Gel de SDS-Poliacrilamida Se aplicaron muestras reducidas y sin reducir y marcadores de peso molecular (Amersham Pharmacia Biotech) a un gel de SDS-PAGE del 4-20% o 10% con Tris-Glicina. La electroforesis se llevó a cabo a 150 voltios durante 1 .5 horas, y las proteínas se visualizaron con azul de Coomassie o tinción de plata. Blum et al. , Electrophoresis 93-99 (1987).

D. Aislamiento de GAA recombinante y placentaria La producción y purificación de GAA recombinante y placentaria humana fue como se describió previamente. Martiniuk et al. , Archives of Biochem and Biophys. 231 : 454-460 (1984); 5 Mutsaers et al. , Biochimica et Biophysica Acta 91 1 : 244-251 (1987); Moreland et al. , (2005).

E. Anticuerpos y análisis de transferencia de Western Como se describió previamente (Moreland et al. , 2005), se inmunizaron conejos con peptidos sintetizados acoplados a KLH. ío La secuencia para cada péptido fue la siguiente: anti-GAA 57-74 (QQGASRPGPRDAQAHPGR (SEC I D No.: 2)), anti-GAA 78-94 (VPTQCDVPPNSRFDCA (SEC I D No. : 3)), y anti-GAA 183-200 (I KDPANRRYEVPLETPRV (SEC I D No. : 4)). Se generó un anticuerpo policlonal de cabra hacia GAA placentaria humana 15 purificada. El anticuerpo monoclonal GAA1 se describió previamente. Moreland et al. , 2005. Se llevaron a cabo transferencias de Western como se describió previamente. Moreland et al., 2005.

F. Absorción de rhGAA por los fibroblastos 20 Para cada punto de tiempo, se incubaron aproximadamente 5 x 105 fibroblastos de Pompe en DMEM más 10% de FBS con 250 nM de rhGAA(WT) o rhGAA(H201 L). A las 16 horas, las células se lavaron y se añadió medio fresco que no contenía GAA. En los puntos de tiempo designados, las células se retiraron y se lavaron 5 5 veces con solución salina amortiguada con fosfato y se almacenaron a -80°C. Despues del punto de tiempo final , todos los sedimentos celulares se descongelaron y se Usaron simultáneamente con un 0.25% de Tritón. Los restos celulares se sedimentaron, y se llevó a cabo un análisis de transferencia de Western con los sobrenadantes de cada punto de tiempo con anticuerpos anti-GAA.

G. Preparación de Construcciones de Expresión y Transfecciones Transitorias Se produjeron plásmidos de expresión para GAA recombinante con y sin sustitución o deleciones de aminoácidos en pcDNA6 (Invitrogen), mediante el uso de los procedimientos habituales. Se cultivaron células 293T de riñón humano en DMEM , complementado con un 10% de FBS bajo un 5% de CO2 a 37°C. Se mezclaron seis microgramos de cada plásmido con reactivo de transfección Fugene 6 (Roche) y se añadieron a 2.5 x 106 células en una placa de 10 cm. Después de 72 horas, las células adherentes se lavaron dos veces con PBS y se Usaron con PBS que contenía un 0.25% de T riton . Los restos celulares se precipitaron mediante centrifugación, y los sobrenadantes se almacenaron a -20°C.

H. Mareaje metabólico e Inmunoprecipitación Las líneas de células CHO estables que expresaban rhGAA(WT) o rhGAA(H201 L) se crearon tras el método descrito previamente. Qiu et al. , J. Biol. Chem. 278: 32744-32752 (2003). Se incubaron aproximadamente 5 x 106 células en una placa de 10 cm en DMEM que carecía de metionina y cisterna durante 30 minutos. Las celulas se marcaron mediante pulsos durante 2 horas con 150 pCi/ml (1 175 Ci/mmol de Tran35S-Label) en DMEM deficiente de metionina y cisteína. Después de lavar las células con DM EM dos veces y de tomar el punto de tiempo de 0 hora, las células se incubaron en DMEM sin marcador a 37°C. En cada punto de tiempo, las células se lavaron dos veces con PBS. Las placas se almacenaron a -20°C. Después del punto de tiempo final, las células se Usaron con PBS que contenía un 0.25% de Tritón (PBST). Los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación y se añadieron 60 mI de una suspensión espesa del 50% de Concanavalina A-Sepharose al sobrenadante. Después de 2 horas de incubación, las microesferas se lavaron 3 veces con PBST. La GAA marcada se eluyó con PBS que contenía a-metilglucósido 0.5M . La GAA presente en el eluyente se inmunoprecipitó después con anti-GAA de cabra purificado mediante afinidad acoplado a NHS-Sepharose. El inmunoprecipitado se lavó 3 veces con PBST, y se añadieron 40 mI de amortiguador de muestras de SDS 2x que contenía b-mercaptoetanol a las microesferas. Las muestras se llevaron a ebullición antes del análisis de transferencia de Western.

I. Abreviaturas Como se usa en el presente documento, "rhGAA" significa a-glucosidasa ácida humana recombinante. "CHO" significa ovario de hámster chino. "MSX" significa metionina sulfoximina. "ERT" significa terapia de sustitución enzimática.

Como se usa en el presente documento, "GAA (H201 R)" significa una GAA modificada que tiene una sustitución de aminoácidos en la posición 201 de histidina a arginina. "GAA (H201 L)" significa una GAA modificada que tiene una sustitución de aminoácidos en la posición 201 de histidina a leucina. "GAA (H201 Y)" significa una GAA modificada que tiene una sustitución de aminoácidos en la posición 201 de histidina a tirosina. "GAA (H201 K)" significa una GAA modificada que tiene una sustitución de aminoácidos en la posición 201 de histidina a sina.

Ejemplo 2: Comparación de GAA humana, bovina y de hámster Cuando se examinó mediante SDS-PAGE la GAA purificada de placenta, dos bandas que correspondían a los polipeptidos de 76 y 70 kDa tuvieron una abundancia aproximadamente igual (Figura 2). De forma similar, la rhGAA sobreexpresada en células de ovario de hámster chino (CHO) y purificada a partir de Usados celulares ha mostrado previamente bandas de 76 y 70 kDa. Moreland et al. , 2005. En contraste, la GAA de hámster purificada a partir de células CHO existe exclusivamente en forma de un polipéptido de 70 kDa. Para determinar si el predominio de la forma de 70 kDa fue exclusivo del hámster, se purificó GAA de testículo bovino y se caracterizó mediante SDS-PAGE teñida con plata reducida (4-20% de acrilamida), y también se demostró que contenía solamente el polipéptido de 70 kDa (Figura 2) .

Ejemplo 3: El aminoácido de la posición 201 de GAA afecta a la eficacia de la conversión de la forma de 76 a 70 kDa y determina el orden de las escisiones proteolíticas La alineación de las secuencias de GAA de mamífero en el sitio proteolítico entre los aminoácidos 197 y 206 (Figura 3A) demuestra que las secuencias retenidas están muy conservadas, pero las secuencias cortadas exhiben cierta variación. La GAA humana contiene una histidina en la posición 201 , mientras las GAA de hámster y bovina tienen los residuos hidrófobos leucina y tirosina, respectivamente. Para determinar si estas sustituciones de aminoácidos son responsables de las diferencias específicas de especie en el procesamiento, se construyeron plásmidos de expresión de GAA en los que se varió el aminoácido 201 . La histidina se sustituyó con leucina (H201 L), tirosina (H201 Y), arginina (H201 R) o sina (H201 K) . Las celulas renales embrionarias humanas (293T) se transfectaron con cada construcción, seguido de análisis de transferencia de Western con un anticuerpo monoclonal hacia GAA. El análisis de transferencia de Western de los Usados celulares indicó que cuando el aminoácido 201 de GAA se sustituyó con leucina o tirosina, la conversión de la forma de 76 a 70 kDa fue drásticamente más eficaz en comparación con la de tipo natural (Figura 3B, carriles 2-7). La sustitución de aminoácidos hidrófobos pareció provocar la formación de un nuevo intermedio de ~82 kDa, como se indica mediante el asterisco (Figura 3B). En el control con vector solamente (Figura 3, carril 8), se cargó nueve veces más Usado celular para visualizar la GAA endógena en comparación con los Usados de las celulas 293T transfectadas de manera transitoria.

Para caracterizar la velocidad de procesamiento de GAA de tipo natural en comparación con GAA(H201 L), se llevó a cabo un experimento de pulso y seguimiento. Se radiomarcaron líneas de células CHO estables que expresaban cada GAA durante 2 horas con Tran35S y se siguieron durante los tiempos indicados con medios que no contenían marcador (Figura 4) . rhGAA se purificó a partir de Usados celulares mediante Con A seguido de inmunoprecipitación como se describió en el Ejemplo 1 . El tiempo de 0 hora fue después del pulso de 2 horas. En el punto de tiempo de 55 horas, GAA(H201 L) se procesó completamente hasta la forma de 70 kDa, mientras muy poca cantidad de la GAA de tipo natural se procesó hasta la forma de 70 kDa después de 120 horas. Se observó una especie de 95 kDa en las células que expresaban la GAA de tipo natural, pero no estuvo presente en la H201 L. La identidad del intermedio de 95 kDa se ha caracterizado previamente (Moreland et al., 2005) y se representa en la Figura 1 .

Para determinar si rhGAA(H201 L) experimenta un procesamiento acelerado en los estudios de absorción, se purificó la forma secretada de rhGAA(H201 L) y rhGAA(WT) a partir de líneas de células CHO recombinantes estables. Los estudios de absorción se llevaron a cabo en fibroblastos de Pompe porque son deficientes de GAA (Figura 5). Como se describió en el Ejemplo 1 , los fibroblastos de Pompe deficientes de GAA (GM00248) se incubaron con 250 nM de rhGAA (WT) y rhGAA (H201 L). En los puntos de tiempo designados, los fibroblastos se recogieron y se congelaron a -80°C. Una transferencia de Western de SDS-PAGE reducida (7.5% de acrilamida) de los Usados celulares se analizó con un anticuerpo monoclonal hacia GAA humana (cuyo epítopo desconocido se halla en los aminoácidos 204-782). Tras la absorción de GAA, las formas de 95 kDa y 76 kDa fueron destacadas para rhGAA(WT) y no se observaron para rhGAA(H201 L) (Figura 5, carriles 5-13). La diferencia de procesamiento fue acompañada de nuevo por la aparición de un intermedio de ~82 kDa con GAA(H201 L).

Para caracterizar el intermedio de ~82 kDa, una transferencia de Western que contenía rhGAA, GAA placentaria, y rhGAA(H201 L) purificadas se analizó con un anticuerpo anti-GAA que reconoce los aminoácidos 183-200 (y así se une al fragmento de 10.4 kDa liberado de GAA completamente procesada) (Figura 6A). La rhGAA, GAA placentaria, y rhGAA(H201 L) madura se purificaron como se describió en el Ejemplo 1 . La especie de 76 kDa de placenta todavía contuvo los aminoácidos 183-200, como se indica mediante la unión del anticuerpo. En contraste, el intermedio de 82 kDa no contuvo estos aminoácidos, como se indica mediante la ausencia de unión del anticuerpo. Esto se debe a que la escisión del sitio de reconocimiento del anticuerpo ya había tenido lugar, como se demuestra mediante la banda de ~10 kDa en el carril 3. Un anticuerpo monoclonal distinto hacia GAA demostró la presencia del intermedio de 82 kDa en la muestra de rhGAA(H201 L) (Figura 6B).

Se puede concluir que el intermedio de 82 kDa es el 5 resultado de la proteólisis acelerada en el sitio de escisión entre los aminoácidos 200 a 204. La escisión tiene lugar antes de la escisión entre los aminoácidos 782 a 792. Como se muestra en la Figura 6A, el polipeptido de 82 kDa no contiene el fragmento de ~10 kDa de los aminoácidos 122-200. Estos resultados sugieren ío una ruta de procesamiento alternativa para rhGAA(H201 L) como se muestra en la Figura 7. El procesamiento de tipo natural frente a GAA(H201 L) se bifurca después del intermedio de 95 kDa. La GAA de tipo natural se escinde cerca del extremo carboxilo- terminal (entre los aminoácidos 781 -792) para proporcionar el 15 intermedio de 76 kDa, mientras GAA(H201 L) se escinde entre los aminoácidos 200-204 para proporcionar el intermedio de 82 kDa. Ambas rutas dan como resultado finalmente una GAA de 70 kDa madura.

Otras modalidades de la presente descripción serán 0 evidentes para los expertos en la téenica a partir de la consideración de la especificación y la práctica de las modalidades descritas en el presente documento. Se pretende que la especificación y los ejemplos se consideren únicamente ejemplares. 5

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un polipeptido que consiste en alfa-glucosidasa ácida humana o un fragmento catalíticamente activo de la misma que tiene una modificación en o cerca de un sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal.

2. Un polipéptido que comprende una alfa-glucosidasa ácida humana o un fragmento catalíticamente activo de la misma que tiene una modificación en o cerca de un sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 o 2, en donde la modificación es una hidrofobicidad incrementada en o cerca del sitio de procesamiento de 70 kDa N-terminal.

4. El polipéptido de la reivindicación 1 o 2, en donde la modificación es en uno o más aminoácidos que corresponden a las posiciones 195-209 de SEC I D No. : 1 .

5. El polipéptido de la reivindicación 4, en donde la modificación es en uno o más aminoácidos que corresponden a las posiciones 200-204 de SEC ID No. : 1 .

6. El polipéptido de la reivindicación 5, en donde la modificación es en el aminoácido que corresponde a la posición 201 de SEC ID No. : 1 .

7. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la modificación comprende a) la sustitución de uno o más aminoácidos con un aminoácido más hidrófobo, o b) la inserción de uno o más aminoácidos hidrófobos.

8. El polipeptido de la reivindicación 1 o 2, en donde el fragmento se selecciona de un fragmento de 70 kDa, 76 kDa, 82 5 kDa, 95 kDa, o cualquier otro fragmento catalíticamente activo de la alfa-glucosidasa ácida humana.

9. El polipéptido de la reivindicación 8, en donde el polipéptido comprende además una secuencia de selección del receptor. ío

10. El polipéptido de la reivindicación 9, en donde la secuencia de selección del receptor es IGF2.

1 1 . El polipéptido de la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido tiene al menos un 80% de identidad respecto de al menos 500 aminoácidos de SEC I D No. : 1 . 15

12. El polipéptido de la reivindicación 1 1 , en donde el polipéptido tiene al menos un 90% de identidad respecto de al menos 500 aminoácidos de SEC I D No. : 1 .

13. El polipéptido de la reivindicación 12, en donde el polipéptido tiene al menos un 95% de identidad respecto de al 0 menos 500 aminoácidos de SEC I D No. : 1 .

14. El polipéptido de la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido modificado exhibe un procesamiento más rápido con proteasas lisosómicas en comparación con la alfa-glucosidasa ácida humana sin modificar. 5

15. El polipéptido de la reivindicación 14, en donde al menos un 50% del polipeptido se procesa proteolíticamente hasta una forma de 70 kDa en 20 horas desde la administración .

16. El polipéptido de la reivindicación 15, en donde sustancialmente todo el polipéptido se procesa proteolíticamente 5 hasta una forma de 70 kDa en 55 horas desde la administración.

17. El polipéptido de la reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido está conjugado a un oligosacárido que comprende al menos una manosa-6-fosfato.

18. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido ío seleccionado de cualquiera de las reivindicaciones 1 -17.

19. Una célula huésped transfectada con el ácido nucleico de la reivindicación 18.

20. La célula huésped de la reivindicación 19, en donde la célula huésped es capaz de secretar el polipéptido codificado por 15 el ácido nucleico de la reivindicación 18.

21 . Un método para reducir o prevenir la acumulación de glucógeno en un tejido, que comprende administrar una cantidad eficaz de un polipéptido de la reivindicación 1 o 2 a un paciente que lo necesita. 0

22. El método de la reivindicación 21 , en donde el paciente tiene una glucogenosis.

23. El método de la reivindicación 22, en donde la glucogenosis es la enfermedad de Pompe.

24. Un método para tratar una glucogenosis, que 5 comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipeptido de la reivindicación 1 o 2 a un paciente que lo necesita.

25. El método de la reivindicación 24, en donde la glucogenosis es la enfermedad de Pompe. 5

26. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para el uso en el tratamiento de una glucogenosis.

27. La composición farmacéutica de la reivindicación 26, en donde el polipéptido está liofilizado. ío

28. El uso de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 -17 en la fabricación de un medicamento para reducir o prevenir la acumulación de glucógeno en un tejido.

29. El uso de la reivindicación 28, en donde la acumulación de glucógeno es debida a una glucogenosis. 15

30. El uso de la reivindicación 29, en donde la glucogenosis es la enfermedad de Pompe.