MX2013011675A - Metodo para tratar condiciones relacionadas con ifna. - Google Patents

Metodo para tratar condiciones relacionadas con ifna.

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Abstract

La presente invención se refiere a un producto inmunogénico que comprende IFNa acoplado a una molécula de proteína portadora que es capaz de inducir anticuerpos anti-IFNa in vivo, y su uso para tratar condiciones relacionadas con IFNa.

Description

MÉTODO PARA TRATAR CONDICIONES RELACIONADAS CON IFNa Campo de la Invención La presente invención se refiere a una vacuna inmunogénica y a su uso para tratar condiciones relacionadas con IFNa, tales como lupus eritematoso sistémico.
Antecedentes de la Invención La familia IFN tipo I incluye IFNa, IFN , IFN5, IFN1, IFNK, IFNT, e IFNGJ. Las formas más predominantes son IFNa, de la cual están descritas 13 proteínas íntimamente relacionadas en humanos, y el único IFN . A pesar del hecho de que diferentes formas de IFN tipo 1 pueden promover diferentes respuestas biológicas, todos los IFN tipo 1 están relacionados estructuralmente (sus genes carecen de intrones y está situados en el brazo corto del cromosoma 9) y su señal es a través de las mismas subunidades receptoras (Van Boxel-Dezaire y coautores, Immuníty, 2006; 25: 361-372).
El interés de la relación entre IFN tipo 1 y los trastornos autoinmunes en la actualidad es cada vez mayor, puesto que los signos de su inducción, la llamada firma de interferón, han sido informados recientemente en pacientes que sufren de enfermedades autoinmunes diferentes (Baccala y coautores, Immunol. Rev. 2005; 204: 9-26). De hecho, debido a sus efectos inmunomoduladores , el IFN tipo I parece estar involucrado en varias trayectorias patógenas de diversas condiciones autoinmunes.
El paradigma de la relevancia patógena de IFN tipo I en la autoinmunidad es el lupus eritematoso sistémico (SLE) . El SLE es una enfermedad crónica, caracterizada que involucra a varios órganos, debida a un daño paradójico de los órganos, provocado por autoanticuerpos dirigidos a los autoantigenos . La etiología del SLE es compleja, implicando factores tanto genéticos como ambientales. Se ha demostrado que el nivel de IFNa en el suero, cuando hay SLE, está correlacionado con la severidad de la enfermedad (Dalí' era y coautores, Ann Rheum Dis, 2005; 64: 1692-7).
El síndrome de Sjogren (SS) , conocido también como síndrome sicca, es una condición autoinmune sistémica, crónica, que afecta las glándulas exocrinas, en particular las glándulas salivales y lagrimales. También se ha observado actividad elevada de IFNa en el suero de pacientes que sufren de esta enfermedad. Finalmente, también se ha demostrado que otras condiciones, tales como la diabetes, la artritis reumatoide, escleroderma, vasculitis y la tiroiditis autoinmune están asociadas con niveles altos de IFNa.
Sedaghat y coautores sugirieron también, recientemente, que el tipo 1 de IFN puede tener qué ver en el agotamiento de células T de CD4+ en pacientes de VIH, ya que mostraron que el tipo 1 de IFN afectaba el estado constante de la dinámica de las células T de CD4+ normal, desviando el equilibrio hacia los efectores Thl que son células de vida corta, en lugar de las células T de memoria, de vida larga (Sedeghat y coautores, J. Virol, 2008 82(4): 1870-1883). Esto fue confirmado en Mandl y coautores, donde se sugiere disminuir la producción de IFNa por las células dendríticas plasmacitoides , para mejorar la activación inmune patológica (Mandl y coautores, Nat. Med. 2008).
Además, se ha informado que la administración de IFNa exacerba la enfermedad subyacente en pacientes con psoriasis, tiroiditis autoinmune y esclerosis múltiple, y que induce un síndrome similar a SLE en pacientes sin historia previa de enfermedad autoinmune.
Por lo tanto, existe la necesidad de un agente que inhiba la actividad de IFNa.
La inmunización pasiva con anticuerpos neutralizadores monoclonales está siendo probada actualmente en ensayos clínicos con rotalizumab y sifalimumab para el tratamiento de SLE. Sin embargo, dicha terapia presenta los inconvenientes de apuntar únicamente a una subserie de las 13 de IFNa y el uso de anticuerpos monoclonales administrados pasivamente puede estar limitado por la inducción de anticuerpos anti-fármaco . Los anticuerpos antifármaco pueden neutralizar o comprometer de otra manera el efecto clínico de los fármacos y también puede estar asociado con eventos adversos serios, relacionados con la reactividad cruzada con proteínas autólogas (De Groot y coautores, Trends. Immunol, 2007, 28 (11) ) .
La presente invención provee así un método para inhibir la actividad de IFNa in vivo administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de un producto inmunogénico que permite la inmunización activa que pueda romper la tolerancia de célula B inmunológica y generar títulos elevados de anticuerpos neutralizadores policlonales contra IFNa y su uso para tratar condiciones relacionadas con IFNa.
Sumario de la Invención Es un objetivo de la invención un producto inmunogénico que comprende IFN acoplado a una molécula de proteina portadora, para uso en la prevención o el tratamiento de una condición relacionada con IFNOÍ en un sujeto que tenga necesidad de ello; donde la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se va a administrar al sujeto es más de 30 mcg de producto inmunogénico por administración, de preferencia, por lo menos 60 mcg.
En una modalidad de la invención, la administración de la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico previene la ocurrencia de síntomas de una enfermedad enlazada con la sobreproducción de IFNa.
En otra modalidad de la invención, la administración de la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico previene la aparición de una enfermedad enlazada con la sobreproducción de IFNa.
En otra modalidad de la invención, las condiciones relacionadas con IFNa comprenden: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, escleroderma síndrome de Sjógren, vasculitis, VIH, diabetes tipo I, tiroiditis autoinmune y miositis.
En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se va a administrar al sujeto es de 35 mcg a 1000 mcg de producto inmunogénico por administración, de preferencia, de 60 mcg a 1000 mcg.
En otra modalidad de la invención se administra el producto inmunogénico al sujeto por lo menos dos veces por mes .
En otra modalidad de la invención el producto inmunogénico es administrado adicionalmente al sujeto por lo menos una vez cada tres meses.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico es administrado adicionalmente al sujeto cuando, en una muestra de suero obtenida del sujeto, es indetectable la cantidad de anticuerpos anti-IFNa.
En otra modalidad de la invención se inactiva fuertemente el producto inmunogénico, lo que significa que el producto muestra menos de 5 por ciento de actividad antiviral en las condiciones de la PRUEBA B.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico es capaz de neutralizar la actividad antiviral de IFNa en las condiciones de la PRUEBA C.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende por lo menos un subtipo de IFNa.
En otra modalidad de la invención, el subtipo de IFNa es IFNa 2b y la molécula de proteina portadora es KLH.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico es una vacuna, de preferencia, en la forma de una emulsión.
Otro objetivo de la invención es una forma de dosis unitaria que comprende más de 30 mcg de un producto inmunogénico que comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora como se. definió aquí más atrás.
Otro objetivo de la invención es un dispositivo médico que comprende más de 30 mcg de un producto inmunogénico que comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora como se definió aquí más atrás.
Otro objetivo de la invención es un estuche que comprende por lo menos un frasco que contiene más de 30 mcg, de preferencia por lo menos 60 mcg, de un producto inmunogénico que comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora, como se definió aquí más atrás, por lo menos un frasco que contiene adyuvante, y medios para poner en contacto el producto inmunogénico con el adyuvante, y para emulsificar la mezcla de la solución acuosa con el adyuvante.
En una modalidad, el estuche de la invención comprende : - por lo menos un frasco que contiene más de 30 mcg, de preferencia por lo menos 60 mcg, de un producto inmunogénico que comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora de acuerdo con la invención, y medios para solubilizar el producto inmunogénico, de preferencia en una solución acuosa; o - por lo menos un frasco que contiene una solución, de preferencia una solución acuosa, que comprende más de 30 mcg, de preferencia por lo menos 60 mcg, de un producto inmunogénico que comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora, de acuerdo con la invención; y - por lo menos un frasco que contiene adyuvante, y medios para poner en contacto la solución con el adyuvante y para emulsificar la mezcla de la solución con el adyuvante.
DEFINICIONES Cuando se usa aquí, el término "inferieron a" o "IFNa" se refiere a proteínas IFN alfa codificadas por medio de un . gen funcional del sitio del gen interferón alfa con 75 por ciento o más de identidad de secuencia con IFN alfa 1 (número Genbank NP_076918, o proteina codificada por el número Genbank NM_024013) . Los ejemplos de subtipos de IFN alfa humano incluyen: IFN alfa 1 (Número Genbank NP_076918), alfa 2a (número Genbank ITF_A) , alfa 2b (número Genbank AAP20099), alfa 4 (número Genbank NP_066546) , alfa 5 (número Genbank P01569) , alfa 6 (P05013), alfa 7 (número Genbank P01567), alfa 8 (número Genbank P32881), alfa 10 (número Genbank P01566) , alfa 14 (número Genbank P01570) , alfa 16 (número Genbank NP_002164) , alfa 17 (número Genbank P01571) y alfa 21 (número Genbank NP_002166) . Los ejemplos de subtipo de IFN de mamífero no humano pueden ser encontrados en Genbank como lo saben bien las personas expertas en la materia (para un compendio, ver Pestka y coautores, Immunological reviews 2004, 202: 8-32).
Cuando se usa aquí, el término "respuesta inmune" se refiere a la acción, por ejemplo, de linfocitos, células que presentan antígeno, células fagocíticas y macromoléculas producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas y complementos) .
Cuando se usa aquí, un anticuerpo que "inhibe la actividad biológica" o "neutraliza la actividad biológica" de IFNa está destinado a hacer referencia a un anticuerpo que inhibe la actividad de esa citoquina por lo menos en 10 por ciento, 20 por ciento, 30 por ciento, 40 por ciento, 50 por ciento, 60 por ciento, 70 por ciento u 80 por ciento o más, en comparación con el nivel de actividad de la citoquina en ausencia del anticuerpo, por ejemplo, usando un análisis funcional, tal como los descritos en los ejemplos.
Cuando se usa aquí, el término "molécula de proteina portadora" se refiere a una proteina o un péptido de por lo menos 15 aminoácidos de largo que, cuando está siendo asociado parcialmente de manera covalente con la molécula de IFNa para formar complejos hetero, permite que se presente un número grande de antigenos de IFNa a los linfocitos B.
Cuando se usa aquí, el término "sujeto" incluye cualquier humano o mamífero no humano, tal como primates, perros, gatos, caballos, ovejas, etc.
Cuando se usa aquí, el término "paciente" se refiere a un sujeto que está afectado por una condición relacionada con IFNa.
Cuando se usa aquí, el término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad suficiente para provocar un resultado clínico benéfico o deseado (por ejemplo, una mejora en la condición clínica) .
Cuando se usa aquí, el término "tratamiento" o "tratar" se refiere a una intervención clínica en un intento por alterar el curso natural de una enfermedad del sujeto o el paciente que se está tratando, y puede efectuarse ya sea para profilaxis o durante el curso de una patología clínica. Los efectos deseables incluyen, pero no están restringidos a ellos: prevenir la ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, aliviar los síntomas, suprimir, disminuir o inhibir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad; abatir la velocidad de avance de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de morbidez y provocar la remisión, mantener el estado de remisión o la prognosis mejorada.
Breve Descripción de las Figuras de la Invención La figura 1 muestra el porcentaje de muestras de suero de paciente inmunizado que exhiben actividad neutralizadora de IFNa durante el reporte intermedio.
La figura 2 muestra la evolución diferencial de los genes inducidos por IFN en pacientes tratados contra pacientes con placebo. De los 11 pacientes que exhiben niveles incrementados de expresión de gen inducida por IFN en la linea de base, 8 fueron tratados con el producto inmunogénico y 3 recibieron inyecciones de placebo. Los niveles de 250 genes inducidos por IFN que muestran los máximos niveles de sobreexpresion en pacientes de SLE, fueron evaluados usando microformaciones de alta densidad. Los resultados están ilustrados como la media de log2 (nivel de expresión a VI) - log2 (nivel de expresión a V6) . El valor p fue calculado usando una prueba t de Student.
La figura 3 muestra los títulos de los anticuerpos que se unen a IFN en pacientes tratados con firma de IFN positiva o negativa en la línea de base, contra pacientes que recibieron placebo. Los asteriscos indican valores p < 0.05.
La figura 4 muestra la evolución diferencial de genes inducidos por IFN en pacientes tratados con firma IFN positiva o negativa en la línea de base, contra pacientes de placebo, entre VIO y V0 o entre Vil y V0. Los resultados están ilustrados como la media de Delta Log (expresión de gen) . Los asteriscos indican valores p < 0.05.
La figura 5 muestra la evolución de los valores C3 en suero, en pacientes tratados con firma de IFN positiva, en la línea de base, y en pacientes que recibieron placebo. Los asteriscos indican valores p < 0.04.
Descripción Detallada De La Invención Si bien los reguladores de IFN ocurren naturalmente en el cuerpo, su capacidad para regular los niveles de citoquina en enfermedades tales como SLE y SS parece ser insuficiente. La finalidad de la inmunización terapéutica anti-IFNa de la invención es elevar los niveles de anticuerpo contra la citoquina, al mismo tiempo que incrementar su afinidad y neutralizar la actividad, lo que da por resultado la reducción del exceso de citoquina y la inhibición de sus efectos patógenos, sin interferir con otros procesos metabólicos y fisiológicos.
Es un objetivo de la presente invención un método para tratar una condición relacionada con IFNa en un sujeto que tenga necesidad de ello, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un producto inmunogénico que comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora; donde la cantidad terapéuticamente efectiva es mayor que 30 mcg ( g) de producto inmunogénico por administración.
En una modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva es por lo menos 60 mcg de producto inmunogénico por administración.
En una modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia, más de 60 mcg hasta 1000 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 750 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 500 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 450 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 400 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 350 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 300 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 250 mcg. En ora modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 200 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 150 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de más de 30 mcg, de preferencia más de 60 mcg a 100 mcg.
En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 1000 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 750 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 500 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 450 mcg. En otra modalidad dé la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 400 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 350 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 300 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 250 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 200 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 150 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 35 mcg a 100 mcg.
En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 1000 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 750 mc'g. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 500 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 450 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 400 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 50 mcg a 350 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 300 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 250 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 240 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 200 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 150 mcg. En otra modalidad de 1.a invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 120 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 100 mcg.
En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 mcg a 400 mcg.
En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 240 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es 60 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es 120 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es 240 mcg.
En una modalidad, la cantidad terapéuticamente efectiva corresponde a una cantidad de proteínas totales, determinada usando el análisis de proteína de Bradford, como se conoce bien en la técnica.
En una modalidad de la invención, se administra al sujeto gue se está tratando por lo menos dos veces por mes, una cantidad terapéuticamente efectiva de producto inmunogénico como se describió aquí antes.
En otra modalidad de la invención, se administra al sujeto que se está tratando dos veces por mes, una cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico como se describió aquí antes. En esta modalidad, se puede administrar al sujeto, una vez el día cero y la segunda vez entre el día 7 y el día 28. En otra modalidad, se puede administrar al sujeto una vez el día cero y la segunda vez entre el día 7 y el día 21. En una modalidad, se administra al sujeto una vez el día cero y la segunda vez el día 28.
En otra modalidad de la invención, se administra al sujeto que se está tratando tres veces en el mes, la cantidad terapéuticamente efectiva de producto inmunogénico como se describió aquí antes. En esta modalidad, se puede administrar al sujeto que se va a tratar una vez el día cero, la segunda vez entre di día 7 y el día 14 y la tercera vez entre el día 21 y el día 28. En una modalidad, se administra al sujeto una vez el día cero, la segunda vez el día 7 y la tercera vez el día 28.
En otra modalidad de la invención, se administra al sujeto que se está tratando cuatro veces en tres meses la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aquí antes. En esta modalidad, se puede administrar al sujeto que se está tratando una el día cero, la segunda vez entre el día 7 y el día 14; la tercera vez entre el día 21 el día 28 y la cuarta vez entre el día 77 y el día 84. En una modalidad, se administra el sujeto una vez el día cero, la segunda vez el día 7, la tercera vez el día 28 y la cuarta vez el día 84.
En otra modalidad de la invención se puede administrar adicionalmente al sujeto que se va a tratar una vez cada tres meses la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aquí antes.
En una modalidad de la invención, se administra al sujeto que se va a tratar tres veces en un mes, como se describió aquí antes, y luego se administra además una vez cada tres meses, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aquí antes.
En una modalidad de la invención, se administra al sujeto que se está tratando cuatro veces en tres meses, como se describió aquí antes, y luego se administra adicionalmente una vez cada tres meses la cantidad terapéuticamente efectiva el producto inmunogénico que se describió aquí antes .
En otra modalidad de la invención, se administra adicionalmente al sujeto que se está tratando una vez cada seis meses la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aquí antes.
En una modalidad de la invención, se administra al sujeto que se está tratando tres veces en un mes o cuatro veces en tres meses, como se describió aqui antes, y luego se administra adicionalmente una vez cada seis meses la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aqui antes.
En otra modalidad de la invención, se puede administrar adicionalmente al sujeto que se está tratando, una vez por año, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aqui antes.
En una modalidad de la invención se administra al sujeto que se está tratando tres veces en un mes o cuatro veces en tres meses, como se describió aqui antes, y luego se administra adicionalmente una vez por año la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aqui antes.
En otra modalidad de la invención, se puede administrar adicionalmente al sujeto que se está tratando una vez cada cinco años la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aqui antes.
En una modalidad de la invención, se administra al sujeto que se está tratando tres veces por mes o cuatro veces en tres meses, como se describió aqui antes, y luego se administra adicionalmente una vez cada cinco años, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aqui antes.
En otra modalidad de la invención se puede administrar adicionalmente al sujeto que se está tratando una vez cada 10 años, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aqui antes.
En una modalidad de la invención, se administra al sujeto que se está tratando tres veces en un mes o cuatro veces en tres meses, como se describió aqui antes, y luego se administra adicionalmente una vez cada 10 años, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aqui antes.
En otra modalidad de la invención se puede administrar adicionalmente al sujeto que se está tratando, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió antes aqui, cuando la cantidad de anticuerpos contra IFNa sea indetectable en una muestra de suero obtenida del sujeto.
En una modalidad de la invención, se administra al sujeto que se va a tratar tres veces en un mes o cuatro veces en tres meses, como se describió aqui antes, y luego se administra además la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se describió aqui antes, cuando la cantidad de anticuerpos contra IFNa sea indetectable en una muestra de suero obtenida del sujeto.
Se puede llevar a cabo la cuantificación de la cantidad de anticuerpos contra IFNa en una muestra de suero, por medio de métodos convencionales conocidos en la técnica, tales como un ELISA anti-IFN.
Un ejemplo de puesta en práctica de dicho método es el siguiente: - revestir una placa de 96 concavidades con 100 ng del subtipo de IFNa usado para preparar el producto inmunogénico, tal como IFNOÍ -2b e incubar la placa durante la noche a 2 °C - 8 °C; - bloquear la placa con un regulador bloqueador durante 90 minutos a 37 °C; - incubar la placa con la muestra de suero y un conjunto de muestra simple durante 90 minutos a 37 °C; se diluye típicamente la muestra de suero en series de dilución al doble, comenzando desde la dilución de 200x hasta por lo menos 8 diluciones; - incubar la placa con el anticuerpo secundario marcado, tal como inmunoglobulina antihumana de cabra, conjugada con HRP; - desarrollar el complejo con una solución de substrato de diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) . Después de detener la reacción enzimática, se determina la intensidad del color resultante mediante métodos espectrofotométricos a 492 nm.
Se expresa el título anti-IFN para cada muestra como la dilución mínima para la cual el valor OD medio es mayor que el valor de corte: Valor de corte = OD medio del conjunto de suero simple x 2.08 donde el valor de corte N es igual a 2.08.
Después se expresará el título anti-IFN para cada muestra como la dilución mínima para la cual el valor OD medio es mayor que el valor de corte. Siendo la primera dilución 200, se consideran negativos los pacientes si su OD a 1/200 es inferior al valor de corte (Mire-Sluis y coautores, 2004, J. Immunol. Meth. 289: 1-16).
En una modalidad de la invención, el sujeto que se va a tratar está sufriendo de una condición relacionada con IFNa.
En otra modalidad de la invención, el sujeto que se va a tratar presenta una cantidad indetectable de anticuerpos anti-IFNa en el suero.
[Mecanismo de acción] La presente invención se refiere también a un producto inmunogénico que es útil para inducir una respuesta inmune en un mamífero al que se administra dicho producto inmunogénico, que incluye una respuesta inmune humoral, en la que se inducen anticuerpos que neutralizan las propiedades inmunosupresora, apoptótica o angiogénica de la citoquina endógena IFNa.
La presente invención se refiere también a un método para inducir una respuesta inmune en un mamífero que tenga necesidad de ello; comprendiendo el método la administración al mamífero de un producto inmunogénico como se describió aquí con anterioridad. En una modalidad, la respuesta inmune incluye una respuesta inmune humoral en la que se inducen anticuerpos que neutralizan las propiedades inmunosupresora, apoptótica o angiogénica de la citoquina endógena .
En una modalidad de la invención, el producto inmunogénico es un derivado de citoquina de IFNa inactivado pero inmunogénico, acoplado químicamente a una proteína portadora ajena, estimuladora de T-auxiliar, tal como, por ejemplo, KLH. Dicho producto inmunogénico tiene la capacidad de interrumpir en la célula B pero no en la célula T, la tolerancia a IFNa. La tolerancia de la célula T auxiliar contra sí misma es esquivada enlazando IFNa con la proteína portadora ajena.
Se activan células B específicas para IFNa después que se presentan la unión del antígeno y la endocitosis del producto inmunogénico y los péptidos portadores específicos, por medio de las moléculas del Complejo de Histocompatibilidad Mayor (MHC) de clase II. Esta señal de activación no es suficiente para inducir la diferenciación de la célula B, en el caso de un antígeno dependiente de T, pero debido a que las células B procesan los antígenos propio y portador, la ayuda de célula T puede ser dada por células T específicas para la proteína propia o portadora. Puesto que la selección de célula T es muy estricta, no hay activación de célula T específica para el antígeno propio.
Las células dendríticas (DC) también pueden absorber el antígeno propio y la molécula portadora y los péptidos específicos de portador presentes a través de sus moléculas MHC de clase II. Las DC, por lo tanto, son capaces de activar las células auxiliares T simples, específicas para el portador. A su vez, las células auxiliares T son capaces de proveer células auxiliares T específicas de portadora a células B específicas para el antígeno propio y presentar péptidos portadores en sus moléculas MHC de clase II.
Las células auxiliares T específicas para el portador interactúan con las células B especificas para el antigeno propio, generando una respuesta de anticuerpo normal contra el antigeno propio.
Se usa principalmente el producto inmunogénico en composiciones de vacuna para tratar una enfermedad ligada con la sobreproducción de IFNOÍ.
Más específicamente, esta invención se refiere a un método para tratar una enfermedad enlazada con la sobreproducción de IFNa, que comprende un paso de administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico de la invención.
Esta invención se refiere también a un método para tratar una enfermedad enlazada con la sobreproducción de IFNa, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, donde la administración del producto inmunogénico previene la ocurrencia de los síntomas de la enfermedad.
La invención se refiere también a un método para tratar una enfermedad enlazada con la sobreproducción de IFNOÍ, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico; donde la administración del producto inmunogénico previene la propagación de la enfermedad.
La invención se refiere también a un método para tratar una enfermedad conectada con la sobreproducción de IFNa, que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico; donde la administración del producto inmunogénico induce la producción de anticuerpos que neutralizan la actividad del IFNa endógeno .
La invención se refiere también a un método para tratar una enfermedad relacionada con la sobreproducción de IFNOÍ, que comprende la administración de una cantidad, terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico; donde la administración del producto inmunogénico induce la neutralización de la actividad del I FNOÍ ' endógeno .
Los ejemplos de enfermedades relacionadas con la sobreproducción de IFNOÍ incluyen, pero sin restricción a ellas: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, escleroderma, síndrome de Sjógren, vasculitis, VIH, diabetes tipo I, tiroiditis autoinmune y miositis.
Otro objetivo de la invención consiste en un método para inducir la producción de anticuerpos que neutralicen la actividad del IFNa endógeno en un sujeto; que comprende un paso de administrar el sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico.
[El producto inmunogénico] El producto inmunogénico, como se usa en la invención, comprende IFNOÍ acoplado a una molécula de proteína portadora, tal como KLH, donde el producto inmunogénico está inactivado .
El producto inmunogénico, como se usa en la invención, es un complejo entre por lo menos un subtipo de IFNa recombinante y por lo menos una molécula de proteína portadora, tal como, por ejemplo, KLH, obtenida por conjugación con glutaraldehído e inactivación subsiguiente con formaldehído .
En una modalidad de la invención, la molécula de proteína portadora puede ser cualquier molécula portadora usada convencionalmente en inmunología, tal como KLH (hemocianina de lapa californiana) , ovoalbúmina, albúmina de suero de bovino (BSA) , toxoide de tétanos, toxoide de toxina de cólera diftérica B, toxina de difteria mutante no tóxica (CR 197), proteina de membrana exterior de Neiseria meningitidis en vesículas de membrana exterior, proteína de membrana exterior de Haemophilus influenzae, toxina A de Pseudomonas aeruginosa, partícula similar a virus (VLP) , etc. En una modalidad, . el portador es KLH . De preferencia el producto de partida KLH consiste de una KLH altamente purificada, extraída de la linfa del molusco gasterópodo marino Megathura cre ulata. La KLH producida naturalmente consiste en general de una estructura didecámera que es un ensamble tubular no covalente de 20 subunidades.
En otra modalidad de la invención, el subtipo de IFNa recombinante puede ser cualquier subtipo de entre IFN alfa 1, alfa 2a, alfa 2b, alfa 4, alfa 5, alfa 6, alfa 7, alfa 8, alfa 10, alfa 14, alfa 16, alfa 17 y alfa 21.
Se pueden obtener los subtipos de IFNa recombinante por medio de métodos convencionales conocidos en la técnica, usando las secuencias de Genbank que se describieron aquí antes. Por ejemplo, la producción del subtipo de IFNa recombinante puede efectuarse cultivando células que contengan un vector de expresión que comprenda el gen del subtipo de IFNa y luego cosechando los cuerpos de inclusión y, finalmente, purificando el subtipo de IFNa.
En una modalidad de la invención, el subtipo de IFNa recombinante es el subtipo IFNa 2b.
En una modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende por lo menos el subtipo IFNa 2b.
En una modalidad de la invención, el subtipo de IFNa recombinante está en una solución líquida, de preferencia una solución reguladora que tiene un pH que varía de 3.5, de preferencia de 6, a 7.8.
En una modalidad, cuando el sujeto que se está tratando es un humano, el IFN recombinante usado es humano.
En una modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende IFNa acoplado a una molécula de proteína portadora, tal como, por ejemplo, KLH, donde el producto inmunogénico es reconocido por un anticuerpo anti-IFNa El reconocimiento del producto inmunogénico por un anticuerpo anti- IFNa puede efectuarse por medio de métodos convencionales conocidos en la técnica, tales como un emparedado de ELISA anti- IFNa / proteína portadora. Se revela el ELISA (PRUEBA D) mediante cualquier medio colorimétrico conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, usando un anticuerpo de detección marcado con biotina, un sistema de amplificación HRP de poli-estreptavidina y una solución de sustrato de diclorhidrato de o-fenilendiamina .
Un ejemplo de dicho método es el siguiente: - revestir una placa con el anticuerpo de captura, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-KLH policlonal de conej o ; - bloquear la placa con un regulador bloqueador (tal como caseína al 2 por ciento en PBS, por ejemplo) durante 90 minutos a 37 °C; - incubar la placa durante 90 minutos a 37 °C con una dilución seriada del producto inmunogénico desde 250 ng/mL a 8 diluciones al doble, o con controles negativos, tales como KLH e IFNa; - incubar la placa durante 90 minutos a 37 °C, con el anticuerpo de detección, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti- IFNa biotinilado; - incubar la placa con estreptavidina-HRP durante 30 minutos a 37 °C y revelar el complejo con una solución de substrato de diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) durante 30 minutos. Después de detener la reacción enzimática, se determina la intensidad del color resultante mediante métodos espectrofotométricos a 490 nm.
Cuando la densidad óptica de las concavidades que contienen el producto inmunogénico es por lo menos 10 veces superior a la densidad óptica de las concavidades que contienen el control negativo, la persona experta en la materia considera que el producto inmunogénico es reconocido por un anticuerpo anti- IFNa y que el IFNa del producto inmunogénico está acoplado a la KLH.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora, tal como, por ejemplo, KLH; donde el producto inmunogénico es fuertemente inmunogénico, lo que significa que el producto es capaz de inducir anticuerpos anti- IFNa in vivo en las condiciones de la PRUEBA A probada aqui más adelante.
Se lleva a cabo la prueba A de acuerdo con el siguiente método: Se inyecta de 0.3 a 10 ug de proteínas totales (como se determina mediante un análisis de proteína de Bradford) del producto inmunogénico, en ratones Balb/C de 6 a 8 semanas, dos veces en 30 días, de preferencia el día 0 y el día 21. Se obtiene una muestra de suero antes de la inmunización (muestra de suero preinmune) y entre el día 30 y el día 40 (muestra de suero de prueba), de preferencia, el día 31. Se lleva a cabo un ELISA anti- IFNa, como se explicó aquí más arriba .
Brevemente, se reviste una placa de 96 concavidades con 100 ng del subtipo de IFNa usado para preparar el producto inmunogénico, tal como IFN -2b y se incuba durante la noche a 2 °C hasta 8 °C. Luego se bloquea la placa con un regulador bloqueador durante 90 minutos a 37 °C. Se añade a las concavidades 100 L de muestra preinmune a una dilución de 1/2500 y una dilución seriada de 1/2500 hasta 8 diluciones al doble de las muestras de suero (preinmune y de prueba) . Se añade finalmente a las concavidades un anticuerpo secundario marcado con inmunoglobulinas anti-ratón, tal como un anticuerpo conjugado con HRP, y se revela el ELISA usando cualquier medio colorimétrico conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, una solución de substrato de diclorhidrato de o-fenilendiamina .
Cuando la densidad óptica de las concavidades que contienen la muestra de suero de prueba es por lo menos 2 veces superior a la densidad óptica de las concavidades que contienen la muestra de suero preinmune, la persona experta en la materia considera que el producto inmunogénico es inmunogénico, lo que significa que había inducido anticuerpos anti- IFNa in vivo.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende IFNa acoplado a una molécula de proteína portadora, tal como, por ejemplo, KLH; donde el IFNa está fuertemente inactivado, lo que significa que el producto muestra menos de 5 por ciento, de preferencia menos de 1 por ciento, de actividad antiviral del IFN en las condiciones de la PRUEBA B citada aquí posteriormente. En una modalidad, el producto inmunogénico de la invención, a una concentración de 500 ng/mL o más, muestra menos de 5 por ciento, de preferencia menos de 1 por ciento, de actividad antiviral de IFNa, a una concentración de 500 ng/mL o más, en las condiciones de la PRUEBA B.
Este análisis se basa en el efecto protector de IFNa sobre el efecto citopático (CPE) del virus de estomatitis vesicular (VSV) en células de riñon de bovino de Madin-Darby (MDBK) . Este análisis también se puede llevar a cabo usando células humanas Hep-2C o A549 y virus EMCV.
Se lleva a cabo la prueba B de acuerdo con el siguiente método: Se diluyen el producto inmunogénico y el subtipo de IFNa recombinante usado para preparar el producto inmunogénico (control positivo) a por lo menos 500 ng/mL y por lo menos 1000 U/mL, respectivamente, en medio basal (RPMI, suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de Hepes) . Se forman a placa 50 L del producto inmunogénico y el control positivo en una placa de 96 concavidades, y se diluyen en una serie de diluciones al doble del medio basal. Se añade a cada concavidad 2 x 104 células MDBK en 50 L de medio de células (RPMI suplementado con 4 por ciento de FBS, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 1 mM de Hepes), y se incuba la placa durante la noche a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono. Luego se diluye el virus en medio basal a por lo menos 10 TCID50 (Dosis 50 de infección en cultivo de tejido: 10 veces la dilución para matar el 50 por ciento de células infectadas) . Se vacía la placa y se añaden 100 pL del virus diluido. Luego se incuba la placa durante la noche a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono.
Al finalizar el cultivo se determina la viabilidad de las células DBK usando métodos bien conocidos en la técnica. ün ejemplo de dichos métodos es el siguiente: Se añade 20 L/concavidad de una solución de MTS/PMS (100 pL de MTS / 5 L de P S; Promega G5430) a las concavidades y se incuba la placa durante otras 4 horas a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono. Luego se lee la placa a 490 nm, en un espectrofotómetro .
Se calcula de la siguiente manera el porcentaje de actividad antiviral: % de actividad antiviral = [ (ODproducto - ODvirus) / (media de ODcélulas - 0Dvicus) ] *100 ODproducto representa la densidad óptica de la concavidad que tiene el producto inmunogénico o que tiene el control positivo (subtipo de IFNa) .
ODvirus representa la densidad óptica de la concavidad de control que tiene el virus únicamente. 0DCéiuias representa la densidad óptica de la concavidad de control que tiene IFNa y virus.
El valor EC5o, que corresponde a la cantidad de producto inmunogénico que da por resultado el 50 por ciento de inhibición de la mortalidad mediada por el virus, se determina interpolando el valor EC5o sobre el eje de las equis, en una gráfica de viabilidad / concentración.
La comparación del EC50 del producto inmunogénico y el EC50 del control positivo (el subtipo de IFNa recombinante usado para preparar el producto inmunogénico) , permite determinar si el producto inmunogénico muestra menos del 5 por ciento, de preferencia menos del 1 por ciento, de actividad antiviral.
Se puede calcular un factor de inactivación ECsoproducto / EC50 i ' cuando el producto inmunogénico muestra menos de 5 por ciento, de preferencia menos de 1 por ciento de actividad antiviral, el factor de inactivación es más de 20, de preferencia, más de 100.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende IFN acoplado a una molécula de proteina portadora, tal como, por ejemplo, KLH; donde el producto inmunogénico es capaz de neutralizar la actividad antiviral de IFNa en las condiciones de la PRUEBA C citada más adelante. De acuerdo con la invención, se lleva a cabo este análisis para evaluar la capacidad neutralizadora del suero obtenido de ratones inmunizados con el producto inmunogénico. La capacidad neutralizadora puede ser determinada evaluando la viabilidad de las células en presencia del virus de estomatitis vesicular que replica en células MDBK. Este análisis también puede ser efectuado usando células humanas Hep-.2C y virus EMCV.
Se lleva a cabo la prueba C de acuerdo con el siguiente método: Se inyecta de 0.3 a 10 de proteínas totales (como se determinan mediante un análisis de proteína de Bradford) del producto inmunogénico, en ratones Balb/C de 6 a 8 semanas, dos veces en 30 días, de preferencia el día 0 y el día 21. Se obtiene una muestra de suero antes de la inmunización (muestra de suero preinmune) y entre el día 30 y el día 40 (muestra de suero de prueba) , de preferencia, el Se extienden en placa 25 µ?? de muestras de suero preinmune y de prueba en una placa de 96 concavidades, como una dilución de 1/200 hasta 8 diluciones de 1/200. Se diluye típicamente el control positivo (anti-IFNa policlonal de PBL, Piscataway, NJ, E. U. A., ref. 31100-1) para estar en capacidad de neutralizar la actividad de IFN de 3125 Ul/concavidad hasta 100 Ul/concavidad, en medio basal (RPMI suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 1 mM de Hepes) y también se tienden en la placa 25 yxL.
Se añade a cada concavidad 25 U/concavidad de IFNa (concentración final) en 25 µ?, de medio basal, y se incuba la placa durante 60 minutos a la temperatura ambiente.
Se añade a cada concavidad 20,000 células MDBK en medio de análisis (RPMI suplementado con 4% de FBS, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de Hepes) y se incuba la placa durante la noche a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono.
Se diluye el virus a por lo menos 10 TCID50 (10 veces la dilución para matar el 50 por ciento de las células infectadas) en medio de virus (RPMI suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de Hepes) . Se vacía la placa y se añaden 100 µ?? de virus a cada concavidad, antes de incubar durante 24 horas a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono.
Al finalizar el cultivo se determina la viabilidad de las células MBDK usando métodos bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de dichos métodos es el siguiente: Se añade a las concavidades 20 µL/concavidad de una solución de MTS/PMS (100 µ?, de MTS / 5 L de PMS; Promega G5430) y se incuba la placa durante otras 4 horas a 37 °C, 5% de dióxido de carbono. Luego se lee la placa a 490 nm, en un espectrofotómetro .
Se calcula la viabilidad relativa de las células de la siguiente manera: % = [ ( ODmues tra - ODvirus ) / ( ODI FN+virus ) ] *100 0Dmuestra representa la densidad óptica de la concavidad con el suero obtenido del ratón inmunizado con el producto inmunogénico o con el control positivo (anticuerpo anti-IFN policlonal) . 0Dvirus representa la densidad óptica de la concavidad de control que tiene únicamente el virus.
ODiFN+virus representa la densidad 'óptica de la concavidad de control que tiene IFNa y virus.
El valor NC50, que corresponde a la dilución del suero que da por resultado el 50 por ciento de neutralización de la mortandad mediada por el virus, expresada como un factor de dilución o unidad neutralizadora/mL, se determina interpolando el valor NC50 sobre el eje de las equis, en una gráfica de viabilidad / concentración.
En la PRUEBA C, un resultado que muestre que el suero obtenido del ratón inmunizado con el producto inmunogénico no protege las células MBDK contra la mortandad, significa que el producto inmunogénico tiene la capacidad de inducir anticuerpos dirigidos contra IFNa que neutralizan su actividad antiviral.
En una modalidad, el producto inmunogénico comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora, tal como, por ejemplo, KLH; donde el producto inmunogénico es capaz de neutralizar por lo menos el 50 por ciento de la actividad antiviral de IFNa en las condiciones de la PRUEBA C. En dicha modalidad, se puede calcular NC50. Si la dilución del suero no es capaz de neutralizar por lo menos el 50 por ciento de la actividad antiviral de IFNa en las condiciones de la PRUEBA C, no se puede calcular el NC5o del producto .
En una modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora, tal como, por ejemplo, KLH; donde la proporción IFNa/portador , en peso, varia desde 0.06 a 0.6.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora, tal como, por ejemplo, KLH; donde la proporción IFNa/portador es de 0.1 a 0.5.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora, tal como, por ejemplo, KLH, donde la proporción IFNa/portador es 0.3.
En otra modalidad de la invención, el producto inmunogénico comprende IFNa acoplado a una molécula de proteina portadora, tal como, por ejemplo, KLH; donde la proporción IFNa/portador es 0.05, 0.1, 0.2, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.3, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34, 0.35, 0.36, 0.37, 0.38, 0.39, 0.4, 0.5.
Dicha proporción puede ser calculada de acuerdo con un método basado en detección UV y de fluorescencia (Prueba E) , como se describe 'en el ejemplo 10.
[Método para obtener el producto inmunogénico].
En una modalidad de la invención, el quinoide de IFNa es obtenido de acuerdo con el siguiente método: a) mezclar entre si el al menos un subtipo de IFNa humano recombinante y la al menos una molécula de proteina portadora, con glutaraldehido y bloquear la reacción añadiendo un compuesto mitigador seleccionado de: (i) un agente reductor y (ii) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de lisina y glicina, y mezclas de ellas; b) sacar los compuestos que tengan un peso molecular de menos de 10 kDa, o menos de 8 kDa; c) añadir formaldehído; d) bloquear la reacción con formaldehído añadiendo un compuesto mitigador seleccionado de: (i) un agente reductor y (ii) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de lisina y glicina, y mezclas de ellas; e) recolectar el producto inmunogénico.
En una modalidad del paso a) , se mezclan primero entre si IFNa y la molécula de proteina portadora, tal como, por ejemplo, KLH, en las cantidades apropiadas, antes de añadir el glutaraldehido.
En una modalidad, se mezclan IFNa y KLH en el paso a), a una proporción molar de IFN : subunidad KLH que va de 10:1 a 40:1. En otra modalidad, se mezclan IFNa y KLH en el paso a) a una proporción molar de IFN : subunidad KLH que varia de 15:1 a 25:1. En otra modalidad, se mezclan IFNa y KLH en el paso a) a una proporción molar de IFN : subunidad KLH que varia de 20:1 a 25:1.
En una modalidad del paso a) se usa glutaraldehido a una concentración final en la mezcla de reacción que varia de 1 mM a 250 mM; de preferencia, de 20 mM a 30 mM; más preferible, de 22.5 mM a 25 mM. En una modalidad del paso a) se incuba glutaraldehido con IFNa y KLH durante un periodo de tiempo que va de 15 minutos a 120 minutos, de preferencia, alrededor de 30, 335, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 minutos. En una modalidad, se añade glutaraldehído a 22.5 mM durante alrededor de 45 minutos. Ventajosamente, se lleva a cabo el paso a) de incubación con glutaraldehído a una temperatura que va desde los 18 °C hasta los 37 °C, de preferencia de 18 °C a 27 °C.
De acuerdo con una modalidad se detiene la reacción con el glutaraldehído retirando los compuestos que tengan un peso molecular menor que 10 kDa (paso b) , añadiendo un compuesto mitigador, de preferencia un compuesto mitigador que se selecciona de: (i) un agente reductor y (ii) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de lisina y glicina y mezclas de ellas.
El agente reductor puede consistir de cualquiera de los agentes reductores conocidos en la técnica que, debido a sus propiedades reductoras, tengan la capacidad de reducir los agrupamientos imina restantes, generados durante el tratamiento con el aldehido. Se puede seleccionar el agente reductor del grupo que consiste de borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio.
De acuerdo con una modalidad, en las modalidades en las que el compuesto mitigador es un aminoácido, el aminoácido consiste de glicina. En algunas modalidades del paso b) , cuando se usa glicina y/o lisina para bloquear la reacción con el glutaraldehído, se usa el aminoácido seleccionado a una concentración final en la mezcla de reacción que varía entre 0.01 M y 1 M, de preferencia, de 0.05 M a 0.5 M y, muy preferible, de 0.08 M a 0.2 M, por ejemplo, a 0.1 M, como se muestra en los ejemplos de la presente. En una modalidad, se lleva a cabo la incubación con el compuesto mitigador durante un periodo de tiempo que va de 1 minuto a 120 minutos, de preferencia, de 5 minutos a 60 minutos, por ejemplo, durante 30 minutos, como se muestra en los ejemplos de la presente. En otra modalidad se lleva a cabo este paso a una temperatura que va de los 18 °C a los 30 °C, de preferencia, de 18 °C a 25 °C.
En el paso b) se eliminan los compuestos pequeños, de menos de 10 kDa, que están presentes en la mezcla de reacción. Estos compuestos pequeños comprenden principalmente el exceso de glutaraldehido y el exceso de moléculas del compuesto mitigador, que no han reaccionado con IFNa ni con KLH. Se puede efectuar el paso b) de acuerdo con cualquier técnica conocida, que permita eliminar los compuestos de menos de 10 kDa, y dichas técnicas incluyen la diálisis con una membrana de diálisis que tenga un corte de 10 kDa, o por filtración usando una membrana de filtración que tenga un corte de 10 kDa. Ilustrativamente, el paso b) puede consistir de un paso de filtración en flujo tangencial, usando una membrana de filtración que tenga un corte de 10 kDa, como se muestra en los ejemplos de la presente. El producto retenido en la filtración, que está desprovisto de los compuestos pequeños indeseables, es recolectado al final del paso b) . Si se desea, el paso b) puede comprender un paso preliminar de eliminar los agregados de compuesto eventuales, que se encuentren presentes en la mezcla de reacción obtenida al final del paso b) . El paso preliminar puede consistir de un paso de filtración convencional para eliminar los agregados eventualmente presentes en suspensión en una solución liquida, por ejemplo, un paso de filtración usando una membrana de filtración apropiada, por ejemplo, una membrana de filtración que tenga un tamaño de poros de 0.2 µp?.
En una modalidad del paso c) del método, se añade formaldehido a una concentración final de 6 mM a 650 m , de preferencia, de 25 mM a 250 mM. En una modalidad del paso c) del método, se añade formaldehido durante un periodo de tiempo de 1 hora a 336 horas, de preferencia de 1 hora a 144 horas. En una modalidad, se aplica formaldehido a una concentración final de 50 a 100 mM, de preferencia 66 mM durante 20 a 50 horas, de preferencia 40 horas.
En el paso c) se efectúa la incubación con formaldehido de preferencia a una temperatura que varia de 30 °C a 40 °C, por ejemplo, a 37 °C, como se muestra en los ejemplos de la presente.
En el paso d) del método se detiene la reacción con el formaldehido añadiendo un compuesto mitigador, de preferencia un compuesto mitigador que esté seleccionado de (i) un agente reductor y (ii) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de lisina y glicina.
El agente reductor puede consistir de cualquiera de los agentes reductores conocidos en la técnica que, debido a sus propiedades reductores, reduzca los agrupamientos imina restantes, generados durante el tratamiento con el aldehido. Se puede seleccionar el agente reductor del grupo que consiste de borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio. De acuerdo con una modalidad, en las modalidades en las que el compuesto mitigador es un aminoácido, el aminoácido consiste en glicina. En algunas modalidades del paso b) , cuando se usa glicina y/o lisina para bloquear la reacción con el formaldehido, se usa el aminoácido seleccionado a una concentración final, en la mezcla de reacción, que varia de 0.01 a 1.5 M, de preferencia, de 0.05 M a 1 M y, muy preferible, de 0.1 M a 0.2 M, por ejemplo, a 0.1 M, como se muestra en los ejemplos de la presente. En una modalidad, se lleva a cabo la incubación con el compuesto mitigador durante un periodo de tiempo que va de los 5 minutos a los 120 minutos, de preferencia, de 10 minutos a 60 minutos, por ejemplo, durante 30 minutos, como se muestra en los ejemplos de la presente. En otra modalidad se efectúa este paso a una temperatura que varia de 18 °C a 30 °C, de preferencia de 18 °C a 25 °C.
De acuerdo con una modalidad del método, justo antes de la recolección en el paso e) se puede efectuar la eliminación de sustancias que tengan un peso molecular de menos de 100 kDa, por parte del experto en. la materia, mediante cualquier técnica conocida en el arte, para eliminar las sustancias que tengan un peso molecular de más de 100 kDa, de una solución liquida. En una primera modalidad, la técnica usada es un paso de filtración que se lleva a cabo usando una membrana de filtración que tiene un valor de corte de por lo menos 100 kDa, que comprende un paso de ultrafiltración o un paso de filtración tangencial. En una segunda modalidad, la técnica usada consiste en un paso de filtración tangencial, usando una membrana de filtración que tenga un valor de corte de por lo menos 100 kDa. En otra modalidad, justo antes de la recolección del paso e) , se puede efectuar la eliminación de las sustancias que tengan un peso molecular menor que 300 kDa, usando una membrana de filtración que tenga un valor de corte de por lo menos 300 kDa.
[Composición , emulsión y vacuna que contiene dicha emulsión] Esta invención se refiere a una composición que comprende el producto inmunogénico que se describió aquí más atrás. Esa invención se refiere también a una formulación del producto de la invención, en la que el producto está dentro de una emulsión. Ventajosamente, la composición de vacuna de la invención comprende dicha emulsión o consiste en dicha emulsión. Esa emulsión comprende el producto inmunogénico de la invención, un aceite y un agente tensioactivo o una mezcla de por lo menos un aceite y por lo menos un agente tensioactivo. De preferencia, el aceite o la mezcla de aceite / agente tensioactivo es un excipiente aceptable para uso farmacéutico. Más preferible, la mezcla de aceite y agente tensioactivo es un adyuvante, y todavía más preferible, un inmunoadyuvante . El adyuvante preferido es ISA 51. Otro ejemplo de inmunoadyuvante que puede ser usado es S E (emulsión de aceite en agua a base de escualeno) . Otro ejemplo de inmunoadyuvante que puede ser usado es SWE-a (emulsión de aceite en agua a base de escualeno) . La emulsión de la invención puede ser una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua.
En otra modalidad, la cantidad del producto inmunogénico de acuerdo con la invención es más de 0.01 por ciento (en peso / peso) y menor que 1 por ciento (en peso / peso) del peso total de la emulsión.
[Adyuvantes] La emulsión o la composición de vacuna de la invención pueden comprender adyuvantes, especialmente inmunoadyuvantes . En una modalidad, la. cantidad de adyuvante varia de 0.00001 por ciento (en peso / peso) a 1 por ciento, de preferencia, de 0.0001 a 0.1 por ciento, más preferible, de 0.001 a 0.01 por ciento (en peso / peso) del peso total de la composición de vacuna.
Se puede usar cualquier adyuvante adecuado, conocido por los expertos en la materia, en la composición de vacuna de arriba, incluyendo adyuvantes a base de aceite, tales como, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund, los adyuvantes a base de micolato (por ejemplo, dimicolato de trehalosa), lipopolisacárido bacteriano (LPS) , pepetidoglicanos (es decir, mureinas, micopéptidos o glicoproteinas, tales como N-Opaca, muramil dipéptido [MDP] o análogos de MDP), MPL (lipido A monofosforilico ) , proteoglicanos (por ejemplo, extraídos de Klebsiella pneumoniae) , preparaciones estreptocócicas (por ejemplo, OK432), Biostim™ (por ejemplo, 01 K2 ) , los "Iscoms" de EP 109 942, EP 180 564 y EP 231 039, hidróxido de aluminio, saponina, DEAE-dextrano, aceites neutros (tales como migliol) , aceites vegetales (tales como aceite de cacahuate) , liposomas, Pluronic®™, polioles, el sistema adyuvante de Ribi (ver, por ejemplo, GB-A-2 189 141) o interleuquinas , particularmente aquellas que estimulan la inmunidad mediada por células. Un adyuvante alterno, que consiste de extractos de Amycolata , un género bacteriano del orden los actinomicetos , ha sido descrito en la patente estadounidense No. 4,877,612. Alternativamente, se puede usar también SWE (3.9 por ciento de escualeno, 0.47 por ciento de Span, 0.47 por ciento de Tween 80 en regulador citrato) y SWE-a (3.9 por ciento de escualeno, 0.47 por ciento de Span, 0.47 por ciento de Tween 80 en regulador citrato. Adicionalmente, están disponibles en el comercio mezclas adyuvantes de propietario. El adyuvante usado dependerá, en parte, del organismo receptor. La cantidad de adyuvantes que se va a administrar dependerá del tipo y el tamaño del animal. Se pueden determinar fácilmente las dosis óptimas mediante métodos rutinarios .
Los adyuvantes oleosos, adecuados para uso en las emulsiones de agua en aceite, pueden incluir aceites minerales y/o aceites metabolizables . Se pueden seleccionar los aceites minerales de Bayol®, Marcol® y Drakeol®, incluyendo Drakeol® 6VR (SEPPIC, Francia) . Se pueden seleccionar los aceites metabolizables de aceite SP (descrito más adelante), Emulsigen (MPV Laboratories, Ralston, NZ) , Montanide 264, 266, 26 (Seppic, SA, París, Francia), así como aceites vegetales, tales como aceite de cacahuate y aceite de soya; aceites animales, tales como los aceites de pescado escualano y escualeno, y tocoferol y sus derivados. Además, el adyuvante puede incluir uno o más agentes humectantes o dispersantes en cantidades de alrededor de 0.1 a 25 por ciento, más preferible, de alrededor de 1 a 10 por ciento, y todavía más preferible, de alrededor de 1 a 3 por ciento en volumen del adyuvante. Se prefieren particularmente como agentes humectantes o dispersantes los agentes tensioactivos no iónicos. Los agentes tensioactivos no iónicos útiles incluyen copolímeros de bloques de polioxietileno / polioxipropileno, especialmente los que se venden bajo la marca Pluronic®, y obtenibles de BASF Corporation (Mt. Olive, NJ, E. U. A.). Otros agentes tensioactivos no iónicos, útiles, incluyen los ésteres de polioxietileno, tales como monooleato de polioxietilen sorbitán, obtenible bajo la marca Tween 80®, o monooleato de mannida . Puede ser conveniente incluir más de uno, por ejemplo, al menos dos, agentes humectantes o dispersantes en el adyuvante, como parte de la composición de vacuna de la invención.
Los adyuvantes adecuados pueden incluir, pero no están restringidos a, agentes tensioactivos conocidos por quienes son expertos en la material, tales como, por ejemplo, hexadecilamina, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetildioctadecil amonio, N, N-dioctadecil-N' , N-bis (2-hidroxietil propano diamina) , metoxihexadecil glicerol y polioles plurónicos; polaniones, por ejemplo, pirano, sulfato de dextrano, poli IC, ácido poliacrílico, Carbopol; péptidos, por ejemplo, muranil dipéptido, dimetilglicina, tuftsina, emulsiones de aceite, alúmina y mezclas de ellos. Otros adyuvantes potenciales incluyen las subunidades de péptido B de la toxina térmicamente lábil de E. coli o de la toxina del cólera. McGhee, J. R. y coautores, "Ow VACCINE DEVELOPMENT" , Sem. Hematol., 30: 3-15 (1993).
[Otros agentes tensioactivos] En las modalidades de una composición de vacuna de acuerdo con la invención que comprenden una emulsión, la composición de vacuna de preferencia contiene, además de la combinación del producto inmunogénico y una o más de las sustancias inmunoadyuvantes oleosas, también uno o más agentes tensioactivos. Las modalidades ilustrativas de los agentes tensioactivos incluyen monooleato de mannida, tal como Montamide® 80, vendido por Arlacel (SEPPIC, Francia) .
En una modalidad, la cantidad de agente tensioactivo varia de 0.00001 por ciento (en peso / peso) a 1 por ciento, de preferencia de 0.0001 a 0.1 por ciento; más preferible, de 0.001 a 0.01 por ciento (en peso / peso) del peso total de la composición de vacuna.
[Productos liofilizados] De acuerdo con una modalidad, y para propósitos de almacenamiento, el producto o la composición de vacuna de la invención pueden ser liofilizados. Por lo tanto, se pueden presentar las composiciones de vacuna en una forma secada por congelación ( liofilizada ) . En dicha modalidad, el producto inmunogénico de acuerdo con la invención se combina con una o más sustancias auxiliares de liofilización . Son bien conocidas por quienes son expertos en la materia varias sustancias auxiliares de liofilización . La liofilización de sustancias auxiliares comprende azúcares, como lactosa y manitol .
En esa modalidad en la que la composición de vacuna consiste de una composición liofilizada para uso como una emulsión liquida que comprende un agente tensioactivo, la composición de vacuna de preferencia comprende una cantidad del producto inmunogénico de acuerdo con la invención, de más de 0.1 por ciento (en peso / peso) y menos de 10 por ciento (en peso / peso) del peso, total de la composición de vacuna.
[Estabilizadores] En algunas modalidades, se puede mezclar la vacuna con estabilizadores, por ejemplo, a fin de proteger las proteínas susceptibles de degradarse, contra su degradación, con la finalidad de prolongar la vida de almacén de la vacuna, o para mejorar la eficiencia del secado por congelación. Los estabilizadores útiles son, entre otros: SPGA (Bovarnik y coautores, J. Bacteriology, 59; 509 (1950)), carbohidratos , por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa; proteínas, tales como albúmina o caseína, o sus productos de degradación; mezclas de aminoácidos, tales como lisina o glicina, y reguladores, tales como fosfatos de metal alcalino.
[Ruta de administración] Se pueden administrar las composiciones de vacuna de acuerdo con la invención al sujeto que se va a inmunizar, por medio de cualquier método convencional, incluyendo el suministro inyectable, por ejemplo, inyección intradérmica, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea; o mediante administración tópica, tal como, por ejemplo, mediante suministro transdérmico . El tratamiento puede consistir de una sola dosis o de una pluralidad de dosis durante un periodo de tiempo.
[Forma de dosis] Las formas adecuadas para uso inyectable pueden incluir soluciones o dispersiones estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La prevención contra la contaminación por microorganismos puede efectuarse añadiendo a la composición de vacuna conservadores, tales como diversos agentes antibacterianos y antifungales , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido sórbico, timerosal y otros similares. En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio, para reducir el dolor durante la inyección. Se puede efectuar la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso, en las composiciones, de agentes que retarden la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
De acuerdo con una modalidad, se solubiliza en agua una composición de vacuna liofilizada de la invención, para la inyección, y se mezcla suavemente; luego se añade un inmunoadyuvante, de preferencia ISA 51; se mezcla suavemente la mezcla para que emulsifique y se carga en una jeringa adecuada. Por lo tanto, esta invención se refiere también a un dispositivo médico, que incluye una jeringa llena o prellenada con una composición de vacuna de la invención. Idealmente se prepara la emulsión extemporáneamente. Sin embargo, se puede almacenar la jeringa que contiene la emulsión durante menos de 10 horas a 2 - 8 °C. En este caso, se debe permitir que se caliente la emulsión antes de inyectar, mediante fricción entre las manos.
[Escala de la dosis unitaria] Es otro objetivo de la invención una unidad de dosis que comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia desde más de 30 mcg hasta 1000 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35 mcg a 1000 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35 mcg a 750 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35 mcg a 500 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35 mcg a 450 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35 mcg a 400 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35 mcg a 350 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35 mcg a 300 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35 mcg a 250 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 1000 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 750 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 750 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico por administración es de 60 mcg a 500 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 450 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 400 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 350 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 300 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 250 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 240 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 200 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 150 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 120 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 100 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 10, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 o 400 mcg.
En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 60 mcg a 240 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 60 mcg a 120 mcg .
En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico de 60 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico de 120 mcg. En otra modalidad, la unidad de dosis comprende una cantidad del producto inmunogénico de 240 mcg.
[Estuche y dispositivo médico] Esta invención se refiere también a un estuche que comprende : - 1 frasco (frasco número 1) que contiene el producto inmunogénico de la invención, típicamente de 3 mL; - 1 frasco (frasco número 2) que contiene adyuvante, de preferencia ISA 51; este frasco es capaz de contener 3 mL de adyuvante y puede ser un recipiente de 8 mL; - 1 jeringa, típicamente una Braun Injekt-F® de 1 mL; - 1 aguja (aguja número 1) para la preparación de la emulsión; de preferencia, esta aguja es una aguja 20G; 1 aguja (aguje número 2) para inyección, de preferencia inyección intramuscular; se prefiere que esta aguja sea una aguja 23G.
Esta invención se refiere también a un método para preparar una vacuna a partir del estuche, que comprende: (1) aspirar 0.4 mL de adyuvante del frasco número 2. Descargar este contenido de jeringa en el frasco número 1, que contiene 0.4 mL de producto inmunogénico; (4) bombear hacia arriba y hacia abajo el contenido total del frasco un número suficiente de veces para emulsificar el contenido, típicamente 30 veces y, finalmente, aspirar la emulsión total.
Antes de la inyección, de preferencia se cambia la aguja número 1 por la aguja número 2, y se purga el aire de la jeringa.
En una modalidad, el estuche comprende: - 1 frasco (frasco número 1) que contiene 0.4 mL del producto inmunogénico de la invención; - 1 frasco (frasco número 2) que contiene por lo menos 0.4 mL de adyuvante, de preferencia ISA 51; - 1 jeringa, típicamente una Braun Injekt-F® de 1 mL; - 1 aguja (aguja número 1) para la preparación de la emulsión; de preferencia esta aguja es una aguja 20G; - 1 aguja (aguja número 2) para inyección; se prefiere que esta aguja sea una aguja 23G.
En otra modalidad, el producto inmunogénico está en forma liofilizada. Por lo tanto, el estuche comprende: 1 frasco (frasco número 1) que contiene producto liofilizado de la invención, típicamente de 3 mL; - 1 frasco (frasco número 2) que contiene agua para inyección, típicamente de 2 mL; - 1 frasco (frasco número 3) que contiene adyuvante, de preferencia ISA 51; este frasco es capaz de contener 3 mL de adyuvante y puede ser un recipiente de 8 mL; - 1 jeringa, típicamente una Braun Injekt-F® de 1 mL; - 1 aguja (aguja número 1) para la preparación de la emulsión; esta aguja, de preferencia, es una aguja 20G; 1 aguja (aguja número 2) para inyección, de preferencia inyección intramuscular; se prefiere que esta aguja sea una aguja 23G.
Esta invención se refiere también a un método para preparar una vacuna a partir del estuche, que comprende: (1) inyectar agua para inyección del frasco número 2 al frasco número 1, usando la jeringa conectada a la aguja número 1; (2) hacer girar suavemente el frasco número 1 durante 1 a 5 minutos, hasta obtener la solubilización completa de la preparación; (3) con las mismas jeringa y aguja, extraer el adyuvante del frasco número 3; descargar el contenido de esta jeringa en el frasco número 1; (4) bombear hacia arriba y hacia abajo el contenido total del frasco un número suficiente de veces para emulsificar el contenido, típicamente 30 veces, y extraer finalmente la emulsión completa.
La invención se refiere también al dispositivo médico que es la jeringa llena o prellenada con la composición, la emulsión o la vacuna de la invención.
En una modalidad, dicha jeringa es una jeringa de doble cámara, en la que una cámara comprende una solución con el producto inmunogénico de la invención, y la otra cámara comprende el adyuvante.
La invención se refiere también a un dispositivo médico que comprende un frasco o un pomo llenado previamente con el producto de la invención o con la composición de vacuna de la invención.
En una modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía desde más de 30 mcg a 1000 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 35 mcg a 1000 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 35 mcg a 750 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 35 mcg a 500 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 35 mcg a 450 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 35 mcg a 400 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 35 mcg a 350 mcg. En otra modalidad el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 35 mcg a 360 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varía de 35 mcg a 250 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es. de 60 mcg a 1000 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración es de 60 mcg a 750 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 500 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 450 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 400 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 350 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 300 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 250 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 240 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 200 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 150 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 120 mcg. En otra modalidad de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico, por administración, es de 60 mcg a 100 mcg . En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que varia de 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390 hasta 400 mcg.
En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que va desde 60 mcg hasta 240 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico que va desde 60 mcg hasta 120 mcg.
En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico de 60 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico de 120 mcg. En otra modalidad, el dispositivo médico comprende una cantidad del producto inmunogénico de 240 mcg.
EJEMPLOS EJEMPLO 1: Preparación del producto inmunogénico Se extrajo hemocianina de lapa californiana (KLH) de la linfa del molusco gasterópodo marino Megathura cremulata y luego se purificó bajo condición GMP. Los resultados de los análisis de estabilidad efectuados en condiciones de almacenamiento, a una temperatura de 2 a 8 °C mostraron que la vida de almacén de la KLH purificada es de 36 meses a 2-8 °C Se produjo IFNa 2b humano recombinante en E. coli, bajo condiciones GMP.
Se produjeron lotes del producto de la invención a la escala de 350 mg de IFNa, usando el proceso de fabricación desarrollado más abajo. a) Conjugación con glutaraldehido Se añade la KLH filtrada a la solución de IFNa 2b (IFNa 2b en 70 mM de fosfato ácido de disodio, pH 7.8) con una proporción IFNa: KLH de 20:1, (que corresponde a una proporción molar de 20 monómeros de IFNa por 1 subunidad de KLH) , con base en la concentración UV.
Se lleva a cabo la conjugación con glutaraldehido (añadido hasta alcanzar 22.5 mM de concentración final en el medio de reacción) y borato pH 9 (añadido hasta alcanzar 28.5 mM de concentración final en el medio de reacción) , para obtener un pH de 8.5.
Luego se mezcla esta solución a pH 8.5 durante 45 minutos a 23 ± 2 °C. b) Mitigación con glicina Se mitiga la reacción con glicina 0.1 M durante 30 minutos c) Primera filtración en flujo tangencial (TFF 1) Se lleva a cabo la primera TFF con un sistema TFF Pall Minim II y una membrana de polietersulfona de 0.02 m2, con un corte de peso molecular de 10 kDa, higienizada con 0.5 M de NaOH y equilibrada con el regulador de trabajo (70 mM de fosfato ácido de disodio, pH 7.8).
Luego se clarifica la solución mitigada mediante filtración a 0.22 µ??. Se diluye dos veces el intermedio en el regulador de trabajo y luego se diafiltra mediante filtración en flujo tangencial (TFF) y 12 volúmenes de regulador de trabajo. El producto retenido es cosechado y guardado durante menos de 20 horas. d) Inactivación con formaldehido Se añade formaldehido al producto retenido hasta alcanzar una concentración final de 66.6 mM, usando una bomba peristáltica. Se lleva a cabo la reacción de inactivación durante 40 horas en una incubadora regulada a 37 ± 2 °C, con mezclado diario de la solución mediante un agitador magnético . e) Amortiguación con glicina A continuación se amortigua la reacción con 0.1 M de glicina, durante 30 minutos. f) Segunda filtración tangencial (TFF 2) Se lleva a cabo la segunda TFF con un sistema de TFF Pall Minim II y una membrana de polietersulfona de 0.02 m2, con un corte de peso molecular de 100 kDa, higienizada con 0.5 M de NaOH y equilibrada con el regulador de formulación (70 mM de fosfato ácido de disodio, pH 7.8) .
Se clarifica la solución amortiguada mediante filtración a 0.2 µ??. Se concentra el intermediario para tener un volumen tangencial inicial de alrededor de 900 mL y a continuación se filtra mediante TFF con 12 volúmenes de regulador de formulación (70 mM de regulador fosfato) para eliminar los homopolimeros de bajo peso molecular del IFNOÍ y los ingredientes no reactivos. Se cosecha el producto retenido y luego se diluye a una concentración teórica de 300 µ?/mL con base en la determinación de concentración mediante el análisis de proteina de Bradford, y luego se filtra a 0.2 pm para obtener el producto inmunogénico de la invención.
EJEMPLO 2: Antigenicidad del producto Se formó un emparedado ELISA anti IFN /KLH de la siguiente manera: Brevemente, se revistió una placa de 96 concavidades con el anticuerpo de captura: anticuerpo anti-KLH policlonal de conejo, y se bloqueó con un regulador bloqueador (tal como caseína al 2 por ciento en PBS, por ejemplo) durante 90 minutos, a 37 °C. Se incubó la placa durante 90 minutos a 37 °C, con una dilución seriada del producto inmunogénico de 250 ng/mL hasta 8 diluciones al doble, con controles negativos, tales como KLH y IFNa. Luego se añadió un anticuerpo de detección, tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti IFNa biotinilado, durante 90 minutos. Finalmente se incubó la placa con estreptavidina-HRP durante 30 minutos a 37 °C, y se reveló el complejo con una solución de substrato de diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) durante 30 minutos. Después de detener la reacción enzimática, se determina la intensidad del color resultante mediante métodos espectrofotométricos , a 490 nm.
Esta prueba confirmó que el producto comprende IFNa que es antigénico, es decir, reconocido por el anticuerpo anti IFNa, y que este IFNa está acoplado a KLH.
EJEMPLO 3: Inmunogenicidad del producto (PRUEBA A) Se inyectó 4 iq de proteínas totales del producto, como se determina mediante análisis de proteína de Bradford, a 7 ratones Balb/c de 6 a 8 semanas, el día 0 y el día 21.
Al día 31, se sangraron los ratones y se cosechó el suero.
Se llevó a cabo el ELISA anti- IFN en sueros preinmune y cosechado, de la siguiente manera: - se revistió una placa de 96 concavidades con 100 ng de IFNa 2b y se incubó durante la noche a 2 °C - 8 °C; - se añadió un regulador bloqueador durante 90 minutos, a 37 °C; - se añadió el producto inmunogénico a una dilución de 1/2500 hasta por lo menos 8 diluciones al doble, y se incubó la placa durante 90 minutos a 37 °C; - se incubó la placa con un anticuerpo marcado con inmunoglobulina anti-ratón, tal como un anticuerpo conjugado con HRP durante 90 minutos, a 37 °C. - se reveló el ELISA con una solución de substrato de diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD) . Después de detener la reacción, se determinó la intensidad del color resultante mediante métodos espectrofotométricos a 490 nm.
Esta prueba demostró que en los 7 ratones, la inmunización con el producto inmunogénico condujo a la presencia de títulos de anticuerpos anti- IFNa.
EJEMPLO 4: Actividad residual del producto (PRUEBA B) Este análisis se basa en el efecto protector de IFNa sobre el efecto citopático (CPE) del virus de estomatitis vesicular (VSV) en células de riñon de bovino de Madin-Darby (MDBK) .
Se diluyeron el producto inmunogénico y el IFNa 2b recombinante usados para preparar el producto inmunogénico (control positivo) , a por lo menos 500 ng/mL y por lo menos 1000 U/mL, respectivamente, en medio basal (RPMI suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 m de Hepes) . Se tendieron en placa 50 µ? del producto inmunogénico y el control positivo en una placa de 96 concavidades y se diluyeron en serie de diluciones al doble en medio basal. Se añadieron a cada concavidad 2 x 104 células MDBK, en 50 pL de medio de células (RPMI suplementado con 4 por ciento de FBS, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 1 mM de Hepes), y se incubó la placa durante la noche a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono. Se diluyó luego el virus en medio basal a por lo menos 10 TCID50 (Dosis de infección en cultivo de tejido 50: 10 veces la dilución para matar el 50 por ciento de las células infectadas) . Se vació la placa y se añadió 100 \iL del virus diluido. Luego se incubó la placa durante la noche a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono.
Al finalizar el cultivo se añadió a las concavidades 20 pL/concavidad de una solución de MTS/PMS (100 L de MTS / 5 pL de PMS, Promega G5430) y se incubó la placa durante otras 4 horas a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono. Luego se leyó la placa a 490 nm en un espectrofotómetro .
Se calculó el porcentaje de actividad antiviral del producto inmunogénico y para los dos lotes de producto probado la actividad antiviral fue menor que 1 por ciento de la actividad antiviral de IFNa.
EJEMPLO 5: Capacidad de neutralización del producto (PRUEBA Se determinó la capacidad de neutralización del producto evaluando la viabilidad de las células en presencia del virus de estomatitis vesicular que replica en células MDBK.
Se inyectó a ratones Balb/C de 6 a 8 semanas, 4 µ? de proteínas totales (como se determina mediante el análisis de proteína de Bradford) del producto inmunogénico, el día 0 y el día 21. Se obtuvo una muestra de suero antes de la inmunización (muestra de suero preinmune) y el día 31 (muestra de suero de prueba) .
Se tendió en placas 25 µ] de muestras de suero preinmune y de prueba en una placa de 96 concavidades, a una dilución de 1/200 hasta 8 diluciones a partir de 1/200. Se diluyó el control positivo (anti- IFNOÍ policlonal de PBL, Piscataway, NJ, E. U. A., ref. 31100-1) de 3125 UI/concavidad hasta 100 UI/concavidad en medio basal (RPMI suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 1 mM de Hepes) y se tendió también en la placa 25 i Se añadió a cada concavidad 25 U/concavidad (concentración final) en 25 µ?_ de medio basal de IFNa, y se incubó la placa durante 60 minutos a la temperatura ambiente.
Se añadió a cada concavidad 20,000 células MDK en medio de análisis (RPMI suplementado con 4 por ciento de FBS, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de Hepes), y se incubó la placa durante la noche a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono.
Se diluyó el virus a por lo menos 10 TCID50 (10 veces la dilución que mata el 50 por ciento de las células infectadas) en medio de virus (RPMI suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de Hepes) . Se vació la placa y se añadió 100 ¾L de virus a cada concavidad, antes de la incubación durante 24 horas a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono.
Al finalizar el cultivo se añadió a las concavidades 20 µL/concavidad de una solución de MTS/PMS (100 pL de MTS/5 pL de PMS; Promega G5430), y se incubó la placa durante otras 4 horas a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono. Luego se leyó la placa a 490 nm en un espectrofotómetro .
Se calculó el NC para las 7 muestras de prueba: NC media = 253789 UI/mL (SEM = 172526), lo que demuestra que todos los anticuerpos comprendidos en el suero anti- IFNa fueron capaces de neutralizar la actividad antiviral de IFNa.
EJEMPLO 6: Ejemplos de composiciones de vacuna que comprenden el producto inmunogénico Se describe en la tabla 1 una composición ilustrativa que comprende el producto inmunogénico.
TABLA 1 Una vacuna ilustrativa que comprende el producto inmunogénico está descrita en la tabla 2: TABLA 2 - Emulsión EJEMPLO 7: Análisis clínico Se llevó a cabo un análisis clínico usando la composición de vacuna que se describió en la tabla 2.
Diseño del estudio Se efectuaron 3 o 4 administraciones del producto el día 0, el día 7 y el día 28, o el día 0, el día 7, el día 28 y el día 84, en adultos sujetos a SLE.
Se probaron las siguientes dosis del producto: 30 mcg, 60 mcg, 120 mcg y 240 mcg .
Población del estudio 28 pacientes masculinos o femeninos, con edades entre 18 y 50 años, con SLE suave a moderada (SLEDAI 4-10), enfermedad activa a pesar de recibir el tratamiento. Se estableció una firma de gen interferón de control normal en 48 voluntarios sanos. Se estimuló el PBMC de 18 de los 48 voluntarios sanos in vitro con interferones del tipo I, a fin de identificar una firma de interferón en las formaciones de alta densidad. Se estableció una firma de SLE comparando las firmas entre los voluntarios sanos y los pacientes con SLE, en la línea de base.
Se llevó a cabo un análisis intermedio en los pacientes enrolados en los primeros tres grupos, es decir, que hablan recibido las dosis de 30, 60 o 120 mcg o placebo .
TABLA 3: Demografía de los pacientes enrolados (análisis intermedio) TABLA 4 : Demografía de pacientes enrolados (análisis final) Resultados Seguridad y tolerancia a la vacuna Se han reportado dos brotes de lupus relacionados con SAE. El primero fue en el grupo de placebo. El otro ocurrió después de la primera inyección de 240 mcg de IFN-K en un paciente que había detenido espontáneamente su terapia con corticosteroide dos días después de la inyección. Esta detención abrupta del tratamiento con corticosteroides participó probablemente en la ocurrencia del brote. Se efectuaron análisis de seguridad regulares intermedios por un consejo de seguridad independiente. No se han detectado cambios clínicamente significativos en los parámetros de laboratorio (hematología, bioquímica, orina) .
Inmunogenicidad de la vacuna Se midieron los títulos de anticuerpo anti-IFNa por medio de ELISA a partir de muestras de suero obtenidas de los pacientes .
Se llevó a cabo un ELISA anti- IFNa como se describió aquí con anterioridad.
Los resultados muestran que se detectaron títulos de anticuerpo anti- IFNa en todos los grupos tratados con el producto inmunogénico, a partir del día 28.
Actividad de neutralización de la vacuna Se determinó la actividad de neutralización in vitro usando el siguiente método: Se tendieron en placa 50 L de muestras de suero obtenidas de suero de pacientes, en una placa de 96 concavidades, a una dilución de 1/200 hasta 8 diluciones a partir de 1/200.
Se diluyó el control positivo (anti-IFN policlonal de PBL Piscataway, NJ, E. U. A. , 31100-1) de 100 ng/concavidad a 3.125 ng/concavidad y se añadió 50 pL a la placa. Se llevaron a cabo diluciones en medio basal (RPMI suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio y 1 mM de Hepes) .
Se añadió 10 U/concavidad (concentración final) de IFN 2b a cada concavidad y se incubó la placa durante 60 minutos a la temperatura ambiente.
Se añadió a cada concavidad 30,000 células MDBK en medio de análisis (RPMI suplementado con 4 por ciento de FBS, 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de Hepes) , y se incubó la placa durante la noche a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono.
Se diluyó el virus a por lo menos 10 TCID50 (10 veces la dilución para matar el 50 por ciento de las células infectadas) en medio de virus (RPMI suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 1 mM de Hepes) . Se vació la placa y se añadieron 100 \iL de virus a cada concavidad antes de la incubación durante 24 horas a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono.
Al finalizar el cultivo se añadió a las concavidades 20 µ?/concavidad de una solución de MTS/PMS (100 pL de MTS / 5 ? de PMS; Promega G5430) y se incubó la placa durante otras 4 horas a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono. Luego se leyó la placa a 490 nm en un espectrofotómetro .
Los resultados del reporte intermedio mostraron que ninguno de los sueros de los pacientes tratados con 30 mcg del producto inmunogénico presenta anticuerpos anti-IFNa que tengan capacidad neutralizadora el día 168 después de la inmunización; mientras que los sueros de pacientes tratados con 60 mcg del producto inmunogénico presentan anticuerpos anti- IFNOÍ que tienen capacidad neutralizadora el dia 168 (figura 1) .
Además, los resultados del reporte final mostraron que se detectó una actividad neutralizadora en el 50 por ciento de los sujetos tratados con 60 µg o con 120 g del producto inmunogénico, y en el 80 por ciento de los sujetos tratados con 240 µg del producto inmunogénico (tabla 5).
TABLA 5 Estos resultados demostraron que es necesario un tratamiento con más de 30 mcg del producto inmunogénico para tener una neutralización in vivo de IFN .
EJEMPLO 8: Análisis transcriptónico Se cosecharon PBMC a varios puntos de tiempo antes y después de la inyección del producto inmunogénico. Para este análisis intermedio se extrajo ARN total en muestras de VI (dia 0) y de V6 (dia 38 después de la primera inyección) , se etiquetaron de acuerdo con el protocolo Affymetrix común y corriente, y se hibridaron en disposiciones Genechip HGU133 Plus 2.0. Se llevaron a cabo análisis estadísticos en GeneSpring después de normalización RMA (Análisis dé microformación robusta) de las muestras.
Se llevaron a cabo algoritmos de agrupamiento no' supervisados en las muestras de linea de base y se agruparon los pacientes en dos categorías: los que tenían (n = 11) y los que carecían (n = 7) de la presencia de una "firma de Interferón" en la línea de base, o sea, la sobreexpresión espontánea de genes inducida por el interferón tipo I (se identificaron experimentalmente los genes inducidos por IFN con base en los análisis de microformación de las PB C de control estimuladas por IFN) . No es sorprendente que los títulos de dsADN fueran significativamente superiores en los pacientes con la firma (media ± SEM: 131.1 ± 50.1 UI/mL) en comparación con los pacientes sin ella (media ± SEM: 44.7 + 33.3, p = 0.06 mediante la prueba de ann- hitney) . Se encontraron anticuerpos anti-IFN mensurables en 8 muestras de seguimiento de los 8 pacientes con una firma IFN en la línea de base, quienes recibieron el producto inmunogénico; mientras que únicamente sucedió esto en 2 de 6 pacientes sin la firma IFN, tratados con el producto inmunogénico, y ninguno de los 4 individuos tratados con placebo (p = 0.002 mediante la prueba de Chi cuadrada) . De los 11 pacientes con una firma IFN en la línea de base, 2 recibieron la dosis de 30 mcg, 1 recibió la dosis de 60 mcg, 5 recibieron la dosis de 120 mcg y 3 fueron tratados con una inyección de placebo. Los cambios observados en la expresión de los genes inducidos por IFN entre VI y V6 fueron significativamente diferentes en los pacientes tratados con el producto inmunogénico, en comparación con los pacientes tratados con el placebo (figura 2) .
Este resultado sugiere que el producto inmunogénico tiene efecto sobre la expresión in vivo de los genes inducidos por IFN.
EJEMPLO 9: Firma IFN y respuesta al tratamiento con producto inmunogénico Se midió la "firma de Interferón" en la linea de base en 28 pacientes con SLE baja a moderada del ejemplo 7. La firma de Interferón (firma IFN) corresponde a una maraca calculada usando 21 genes inducidos por IFN, y fue descrita en Yao y coautores, Arthritis & Rheumatísm, 2009, 60 (6): 1785-1796. Se efectuó la medición de la firma de Interferón como se describió en el ejemplo 8.
En los 28 pacientes de SLE del ejemplo 7, 19 mostraron una firma de Interferón positiva y 9 una firma de Interferón negativa, en la linea de base.
Firma de Interferón y actividad de la enfermedad SLE Se midieron los títulos de anticuerpo dsADN y los niveles en el suero de C3, como índices de la actividad de la enfermedad en ambos grupos de pacientes.
Se determinaron los títulos de anticuerpo dsADN usando el estuche anti-ADN DPC (PIKADD-4) de Diagnostic Products Corporation .
Se determinaron los niveles de C3 en suero usando el estuche Complement C3 (Ki # 446450) de Beckman Coulter.
TABLA 6 : índices de la actividad de la enfermedad SLE Como se muestra en la tabla 6 anterior, los pacientes con SLE, con firma de Interferón positiva en la linea de base, tienen índices biológicos de mayor actividad de la enfermedad.
Firma de Interferón y respuesta al tratamiento con el producto inmuno-génico de la invención Se compararon los efectos del tratamiento con el producto inmunogénico de la invención, que se describieron en el ejemplo 7, en pacientes con SLE, con la firma IFN positiva y negativa, en la línea de base.
Genes inducidos por IFN Se midió la evolución de la expresión de genes inducidos por IFN entre VO y VIO o Vil, en pacientes tratados con firma IFN positiva o negativa en la línea de base, y en pacientes tratados con placebo.
Los resultados mostraron que, en comparación con los pacientes de placebo y los de firma IFN negativa, los efectos de la terapia con el producto inmunogénico de la invención, sobre los genes inducidos por IFN, fueron fuerte y significativamente diferentes en VIO y Vil, en los pacientes con SLE, con firma IFN positiva (figura 4).
C3 de complemento Se midieron los valores C3 en suero en los pacientes tratados y en los pacientes que recibieron placebo, en V-l (30 días antes de la inmunización) , V0 (el día de la inmunización), V7 (el día 56), VIO (el día 112) y Vil (el día 138 después de la inmunización) como se describió aquí con anterioridad.
Los resultados mostraron que hay un incremento significativo en los niveles de C3 en los pacientes tratados contra los pacientes de placebo. Además, hay un incremento significativo en los niveles de C3 en los pacientes con SLE con firma IFN positiva tratados con el producto inmunogénico de la invención (figura 5) .
EJEMPLO 10: Determinación de la proporción IFNa / KLH en el producto de la invención A fin de determinar la cantidad de IFNa y de KLH en el producto de la invención, se desarrolló un método de cuantificación basado en detección UV y de fluorescencia. Se fabricaron los productos de la invención con dos etiquetas fluorescentes, cada una específica para IFNa o para KLH. Después del análisis mediante cromatografía por exclusión de tamaños (SEC) , se determinó la cuantificación de IFNa y KLH mediante integración de la señal UV a 220 nm y la señal fluorescente (FLD) específica para la etiqueta de IFNa o la etiqueta de KLH. Este método permitió calcular la proporción en peso de IFNa /KLH. a) Etiquetado de materias primas Se acoplaron etiquetas fluorescentes en los grupos sulfhidrilo, a fin de preservar los grupos amino usados durante la fabricación del producto.
Se llevó a cabo el etiquetado en 70 mM de regulador fosfato de sodio a pH 7 , a la temperatura ambiente, durante 3 horas. Se etiquetó la KLH con 200 equivalentes molares de Atto565-maleimida (18507, Sigma) y el IFN con 100 equivalentes molares de fluoresceina maleimida (46130, Pierce) . Luego se filtraron las proteínas etiquetadas (KLH-atto565 e IFN-fluoresceína) en una columna Zeba (corte 7 kDa, Thermo Scientific, 89893), condicionada con 70 mM de regulador fosfato, pH 7.8, a fin de eliminar las etiquetas no reaccionadas . b) Fabricación del producto Se usaron entonces las materias primas etiquetadas para fabricar productos etiquetados con el mismo proceso que en el ejemplo 1, con filtración por diálisis en lugar de la filtración en flujo tangencial. c) Fabricación de estándares de homopolímeros de KLH e IFNa Para el método analítico cuantitativo se fabricaron estándares de homopolímeros.
Se fabricó un estándar de homopolímeros de IFNOÍ etiquetados con el mismo proceso que en el ejemplo 1, pero con 70 mM de regulador fosfato, pH 7.8, en lugar de KLH, y filtración por diálisis en lugar de filtración en flujo tangencial .
Se fabricó un estándar de homopolímeros de KLH etiquetados con el mismo proceso que en el ejemplo 1, pero con 70 mM de regulador fosfato, pH 7.8, en lugar de IFNa, y filtración por diálisis en lugar de filtración en flujo tangencial . d) Método de análisis mediante cromatografía por exclusión de tamaños.
Se analizaron entonces lotes mediante SEC con UV y detección fluorescente especifica.
Se inyectaron 60 ]i de muestra en columnas SEC5 (1000 °A) SEC3 (300 °A) conectadas en serie (Agilent, 5190-2536, 5190-2511) ; se llevó a cabo la elución con PBS durante 35 minutos, con detección UV a 220 nm y detección fluorescente especifica (para IFNo¡-fluoresceina o para KLH-Atto565), como se describe en la tabla 7.
TABLA 7 : Longitud de onda de excitación y emisión usada para IFNot-fluoresceina o para KLH-Atto-565 Se calcularon las señales UV y fluorescente (FLD) integrando el área debajo de los picos del cromatograma entre 0 y 20 minutos.
Para validar este método, se llevaron a cabo experimentos preliminares para demostrar: la especificidad de la señal fluorescente (no se observó traslape de señal entre las dos proteínas etiquetadas ) ; - para cada lote fabricado (producto de la invención, homopolímeros etiquetados de KLH y de IFNOÍ) se obtuvieron perfiles de UV similares mediante SE-HPLC; - no hubo amortiguación de la señal fluorescente debida a la fabricación; - Las señales FLD fueron lineales y proporcionales a las señales UV.
Se midió la contribución de UV de IFNa en el quinoide etiquetado fabricado, de acuerdo con el área de curva mediante FLDIFNa-fiUOresceína = f(área mediante UV) del estándar de homopolimeros de IFNa etiquetados.
Se midió la contribución de UV de KLH etiquetada en el quinoide etiquetado fabricado, de acuerdo con el área de curva mediante FLDKLH-Atto565 = f(área mediante UV) del estándar de homopolimeros de KLH etiquetados.
Como se comprobó que el área de UV era una función lineal de la concentración de la proteina, este método permitió determinar el porcentaje en peso de IFNa etiquetado en el quinoide etiquetado fabricado, e) Análisis de los lotes Se fabricaron 3 lotes de quinoides etiquetados y se los analizó mediante este método.
Con base en la proporcionalidad de la señal de UV y la concentración, y de FLD y la señal de UV, se calculó la proporción entre la cantidad de IFNa y de KLH (mlFNa / mKLH) para los tres lotes (tabla 8).
TABLA 8 : Proporción en peso de IFNa / KLH en los tres kinoides etiquetados fabricados Se encontró una proporción media de mlFNa / mKLH de 0.28 con una desviación relativa de norma <15 por ciento.
EJE PLO 11: Títulos de anticuerpos anti-mlFNot producidos y capacidades neutralizadoras cuando se inyecta el producto inmunogénico de la invención como una emulsión con SWE o S E-a muIFN-K de fabricación Brevemente, se mezclaron IFNaA de múrido (PBL Biomedical Laboratories) y KLH natural (Sigma) a una proporción 50:1, y se los trató con 22.5 mM de glutaraldehído durante 45 minutos. Después de diálisis contra salina regulada con fosfato (PBS) para eliminar el exceso de glutaraldehído, se incubó la solución con 66 mM de formaldehído durante 48 horas a 37 °C. Después de mitigar con glicina (0.1 M final) y dializar a continuación contra PBS usando una membrana con corte de 10 kDa, se esterilizó en filtro la preparación usando una membrana de 0.22 µp?, y se guardó a 4 °C.
Protocolo de inmunización : Se inmunizaron ratones intramuscularmente dos veces: el día 0 y el día 21, con mIFN-K (10 g por inyección) , como una emulsión 1 a 1 con SE o SE-a adyuvante (100 µ?, de volumen final) .
Determinación de títulos de anticuerpo anti-muIFNa y anti-KLH, mediante ELISA.
Se analizaron los sueros para determinar los anticuerpos contra muIFNa o contra KLH, mediante ELISA. Brevemente, se revistieron placas Maxisorp de 96 concavidades (Nunc) con 100 ng/concavidad de muIFNaA (PBL Biomedical Laboratories) para detectar anticuerpos anti-muIFNa o KLH natural (Sigma) para detectar anticuerpos anti-KLH.
Se añadió una dilución de muestras de suero seriadas al doble (de 1:100 a 1:51,200) a las concavidades. Las concavidades en blanco recibieron 100 L de regulador de dilución. Después de 1.5 horas a 37 °C se detectaron los anticuerpos con 100 µL de inmunoglobulina G (IgG) anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante y 0-fenilendiamina , un substrato colorimétrico para la peroxidasa de rábano picante. Se usó un conjunto de sueros de ratones Balb/c inmunizados con muIFN-K, como control positivo. Se registró la densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 490 nm. Se llevaron a cabo análisis ELISA por duplicado. En cada placa se reservaron dos concavidades para dejarlas en blanco; su valor medio se sustrajo de todas las concavidades.
Se calcularon los títulos de anticuerpo interpolando la OD máxima (ODmax) /2 sobre el eje de las equis. La ecuación usada fue: y = ax + b para una línea recta que pasa a través de dos puntos que rodean la ODmax/2 Determinación de la capacidad neutralizadora de los anticuerpos anti-muIFNa inducida después de inmunizaciones con IFN-K.
Se determinó la capacidad neutralizadora usando el análisis citopático antiviral clásico (EMCV/L929) . En este análisis se determina el título de actividad antiviral de muIFNoí con respecto a su capacidad para inhibir el efecto letal del virus de encefalomiocarditis (EMCV) en células L-929 de múrido (ATCC) .
Brevemente se añadieron 25 L de muestras de suero diluidas (o anticuerpo de control) a placas de cultivo de 96 concavidades (Nunc) en diluciones seriadas al doble (de 1:200 a 1:6400). Se usó como control positivo un anticuerpo policlonal de conejo, comercial, anti-muIFNa (de PBL, ref: 32100-1) . Después de incubación con 25 IU/concavidad de muIFNa durante una hora a la temperatura ambiente, se sembraron 20 x 103 células L-929 por concavidad y se incubaron a 37 °C. Después de desarrollar durante la noche, se lavaron las placas con PBS y se añadió a cada concavidad 100 uL/concavidad de solución EMCV (100 veces la dosis necesaria para matar el 50 por ciento de las células) . Se incubaron las placas durante 48 horas a 37 °C. Finalmente se añadió 20 uL por concavidad de solución de TS/PMS (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil ) -2-tetrazolio, sal interna / metosulfato de fenazina (Promega) y se incubaron las placas durante 4 horas a 37 °C, 5 por ciento de dióxido de carbono, en una incubadora humidificada (protegida de la luz) . A continuación se midió la OD a 490 nm para cada concavidad. Se sustrajo la OD de la muestra en blanco (concavidades con 100 ]i de medio de cultivo solo) de la OD de la muestra.
Se calculó la capacidad neutralizadora de cada muestra de la siguiente manera: Capacidad neutralizadora (%) = 100 x [ODprueba ODvirus) / (ODcélulas) ] , donde: ODprueba es la OD para la muestra probada (células + IFNOÍ + suero + virus); ODprueba es la OD para el virus de control (células + virus ) ODcélulas es la OD para 20,000 células / concavidad (células + IFNOÍ + virus) .
Se graficaron las capacidades neutralizadoras como una función de la dilución en suero. Se determinó el titulo (número de dilución de suero) que neutraliza el 50 por ciento de los valores de actividad de IFNa, interpolando en la parte lineal de la curva.
Los resultados mostraron que estaban presentes títulos anti-muIFNa y títulos anti-KLH en sueros de ratones recolectados el día 31 después de la primera inyección de muIFN-K emulsificado en SWE o SWE-a; y que los anticuerpos anti-muIFNa tuvieron capacidades neutralizadoras (NC50 > 200) .

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. - Un producto inmunogénico que comprende IFNa acoplado a una molécula de proteína portadora, para uso en el tratamiento de una condición relacionada con IFNa en un sujeto que tenga necesidad de ello; donde la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se va a administrar al sujeto es más de 30 mcg de producto inmunogénico por administración.
2. - El producto inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la administración de la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico previene la ocurrencia de los síntomas de una enfermedad relacionada con la sobreproducción de IFNa.
3. - El producto inmunogénico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la administración de la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico previene la difusión de una enfermedad relacionada con la sobreproducción de IFNa.
4. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las condiciones relacionadas con El producto inmunogénico de acuerdo con la reivindicación comprenden: lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, escleroderma, síndrome de Sjogren, vasculitis, VIH, diabetes tipo I, tiroiditis autoinmune y miositis.
5. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la cantidad terapéuticamente efectiva del producto inmunogénico que se va a administrar al sujeto es de 35 mcg a 1000 mcg de producto inmunogénico por administración.
6. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el producto inmunogénico es administrado al sujeto por lo menos dos veces en un mes.
7. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el producto inmunogénico es administrado adicionalmente al sujeto por lo menos una vez cada tres meses.
8. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el producto inmunogénico es administrado adicionalmente al sujeto cuando, en una muestra de suero obtenido del sujeto, la cantidad de anticuerpos anti-IFNa es indetectable .
9. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el producto inmunogénico está fuertemente inactivado, lo que significa que el producto muestra menos del 5 por ciento de la actividad antiviral en las condiciones de la PRUEBA B.
10. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el producto inmunogénico es capaz de neutralizar la actividad antiviral de IFNa en las condiciones de la PRUEBA C.
11. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende por lo menos un subtipo de IFNa.
12. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el subtipo de IFNa es IFNa 2b y la molécula de proteina portadora es KLH.
13. - El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el producto inmunogénico es una vacuna, de preferencia en forma de una emulsión.
14. - Una forma de dosis unitaria que comprende más de 30 mcg de un producto inmunogénico que comprende El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones acoplado con una molécula de proteina portadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
15. - Un dispositivo médico que comprende más de 30 mcg de un producto inmunogénico que comprende El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones acoplado a una molécula de proteína portadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13.
16. - Un estuche que comprende por lo menos un frasco que contiene más de 30 mcg de un producto inmunogénico que comprende El producto inmunogénico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones acoplado a una molécula de proteina portadora de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13; por lo menos un frasco que contiene adyuvante, y medios para poner en contacto el producto inmunogénico con el adyuvante y para emulsificar la mezcla con el adyuvante. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un producto inmunogénico que comprende IFN acoplado a una molécula de proteina portadora que es capaz de inducir anticuerpos anti-IFNa in vivo, y su uso para tratar condiciones relacionadas con IFNa.
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