MX2013010330A

MX2013010330A - Líneas de célula cancerosa de próstata, signaturas de gen, y usos de las mismas.

Info

Publication number: MX2013010330A
Application number: MX2013010330A
Authority: MX
Inventors: Richard G Pestell
Original assignee: Richard G Pestell
Priority date: 2011-03-09
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2014-11-26
Also published as: WO2012122499A3; CA2829219A1; CN104169425A; EP3597761A1; US10952415B2; DK2683643T3; CA2829219C; AU2012225232A1; US20140109245A1; EP2683643B1; BR112013023050A8; AU2012225232B2; JP2014518610A; BR112013023050A2; EP2683643A2; JP2017078070A; EP2683643A4; WO2012122499A2; ES2740399T3

Abstract

La presente invención, en parte, está dirigida a una línea de célula cancerosa de próstata de mamífero que comprende al menos una o un grupo de células epiteliales de mamífero primarias, las cuales han sido infectadas con un vector retroviral llevando un oncogén seleccionado del grupo que consiste de c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y sus combinaciones en donde dicho gen es expresado. Se describen aplicaciones de las líneas de célula de próstata, incluyendo modelos de animal competentes inmunes de cáncer de próstata, un método para la producción in vitro de células epiteliales de mamífero primarias inmortalizadas, un método para determinar si un ser humano que tiene cáncer de próstata está sufriendo o está en riesgo de desarrollar metástasis, un método para prevenir cáncer o inhibir metástasis de cáncer susceptible a tratamiento en un sujeto en riesgo de desarrollar cáncer o metástasis de cáncer, y un método para identificar un compuesto candidato que selectivamente interfiere con la proliferación o viabilidad de una célula cancerosa que tiene niveles elevados de CCR5 y/o de al menos uno de sus ligandos.

Description

LÍNEAS DE CÉLULA CANCEROSA DE PRÓSTATA.

SIGNATURAS DE GEN Y USOS DE LAS MISMAS Campo de la Invención Se proporcionan métodos y composiciones para diagnosticar y tratar cáncer, incluyendo cáncer de próstata. Los aspectos particulares de la presente invención se refieren a métodos y composiciones útiles para diagnósticos, investigación, estratificación de tratamiento, y tratamiento de cáncer de próstata. También se proporcionan en la presente invención, células y mamíferos no humanos, transgénicos que pueden ser utilizados en estos métodos.

Manifestación con Respecto a la Investigación y DesarroMo Patrocinado por la Federación La presente invención se elaboró con soporte gubernamental de acuerdo con las Concesiones Nos. R01CA70896. R01CA75503. R01CA86072. P30CA56036. y R01CA132115-02 otorgadas por National Institutes of Health (Instituto Nacional de Salud) (NIH). El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.

Antecedentes de la Invención El cáncer es un problema importante de salud a nivel mundial. Se han obtenido algunos avances en la detección y terapia de cáncer, actualmente está disponible un método sin vacuna u otros métodos para la prevención y/o tratamiento universalmente exitosos. Las terapias actuales, las cuales generalmente están basadas en una combinación de quimioterapia o cirugía y radiación, continúan probando ser inadecuados en muchos pacientes.

El cáncer de próstata, por ejemplo, es un problema de salud importante para los hombres en los Estados Unidos de América, y a nivel mundial. Aunque se han obtenido avances en la detección y tratamiento de la enfermedad, el cáncer de próstata permanece como una causa importante de muertes relacionadas con cáncer en hombres, afectando a más de 221,000 hombres cada año en los Estados Unidos de América. Para los hombres en Norte América, las probabilidades de tiempo de vida cuando se tiene cáncer de próstata actualmente son del 19.6%, con un riesgo del 4.6% de muerte. El cáncer de próstata fue la causa de aproximadamente 250,000 muertes a nivel mundial en el año de 2009.

Actualmente está disponible el método sin vacuna u otro método universalmente exitoso para la prevención o tratamiento de cáncer de próstata. El manejo de la enfermedad actualmente depende de una combinación de diagnósticos tempranos (a través de la prueba de Antígeno Específico de Próstata ("PSA") de rutina) y tratamiento agresivo, el cual puede incluir una o más de una variedad de tratamientos, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia de hormonas. El curso del tratamiento para un cáncer de próstata particular con frecuencia se selecciona con base en una variedad de parámetros de pronóstico, incluyendo un análisis de la histología y dispersión de la enfermedad. Sin embargo, el uso de PSA, el cual es el estándar de clasificación actual, da como resultado decisiones de tratamiento menos que óptimas, debido a que la prueba de PSA tiene altos rangos de positivos falsos y negativos falsos. Se llevaron a cabo aproximadamente 45 millones de PSA en el año de 2009 en los Estados Unidos de América, con una especificidad de aproximadamente el 27%. Se tomaron aproximadamente 1 millón de biopsias de la próstata el último año en los Estados Unidos de América, con base en un PSA elevado, de los cuales 250,000 tumores fueron identificados. El alto nivel de mortalidad observado en pacientes con cáncer de próstata, indica que se necesitan mejorías en el tratamiento, diagnóstico y prevención de la enfermedad.

Otro factor de complicación con el uso de la prueba de PSA, es que varían las recomendaciones del médico para el chequeo con la PSA. Algunos promueven un cheque anual para hombres de aproximadamente 50 años, y algunos aconsejan a los hombres, quienes están en mayor riesgo de cáncer de próstata, comenzar con el chequeo a la edad de 40 o 45 años. Aún otros tienen precauciones contra el chequeo de rutina. Normalmente, el nivel de PSA debajo de 4.0 ng/mL se considera como normal. Sin embargo, el nivel de PSA referenciado, parece ser arbitrario e inútil en virtud de dos reportes, uno de Thompson IM y asociados. ("Prevalence of prostate cáncer among men with a prostate-specific antigen level < or = 4.0 ng per milliliter" ("Prevalencia de cáncer de próstata entre hombres con un nivel de antígeno específico de próstata < o = 4.0 ng por mililitro"), New England Journal of Medicine 2004, 350(22), páginas 2239 a 2246), y el otro de Smith DS y asociados. ("The early detection of prostate carcinoma with prostate specific antigen: The Washington University experience" ("La detección temprana de carcinoma de próstata con antígeno específico de próstata: Experiencia de la Universidad de Washington"), Cáncer 1997, 80(9), páginas 1853 a 1856). De acuerdo con Thompson IM y asociados, el cáncer de próstata fue diagnosticado en el 15.2% de hombres con un nivel de PSA en o debajo de 4.0 ng/mL. El 15% de dichos hombres, o aproximadamente el 2.3% en general, tuvo cánceres de alto grado. De acuerdo con Smith DS y asociados, del 25% al 35% de los hombres quienes tenían un nivel de PSA entre 4.1 y 9.9 ng/mL, y quienes pasaron por una biopsia de próstata, se encontró que tienen cáncer de próstata, en tanto que del 65% al 75% de los hombres restantes, no tuvieron cáncer de próstata. Por lo tanto, no existe un nivel de PSA normal o anormal específico.

Así mismo, los mecanismos moleculares que contribuyen a la recurrencia de cáncer de próstata y a la resistencia a la terapia, están mal comprendidos. La terapia de destrucción de andrógeno da como resultado del 60% al 80% de un rango de respuesta inicial (ver la publicación de Scher, H. I., and Sawyers, C. L, J Clin Oncol 2005, 23, páginas 8253 a 8261). Sin embargo, la mayoría de los pacientes que pasan por terapia antagonista de andrógenos, tienen reincidencia subsecuentemente. El diagnóstico temprano puede proporcionar una oportunidad para una cirugía curativa, sin embargo, -30% de los hombres quienes recibieron prostatectomía radical reincidieron, esto, atribuido a una enfermedad micrometastática. Por consiguiente, existe la necesidad de intervenciones médicas que puedan detectar y/o prevenir los conductores moleculares de malignidad metastática en etapas tempranas de la enfermedad.

Breve Descripción de la Invención En un aspecto, la presente invención proporciona una línea de célula de cáncer de próstata de mamífero que comprende al menos uno o más de un conjunto de células epiteliales mamíferas primarias, que han sido infectadas con un vector retroviral que lleva un oncogén. En ciertas modalidades, el oncogén se selecciona del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos, y en donde se expresa el oncogén o la combinación de genes. La línea de célula de cáncer de próstata de mamífero, puede incluir cualquier célula de mamífero adecuada, incluyendo células epiteliales de múrido primarias. Las células epiteliales de mamífero primarias pueden ser derivadas de cualquier mamífero inmuno competente, incluyendo roedores competentes inmunes, incluyendo ratas y ratones.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un modelo animal de cáncer, que comprende un mamífero inmuno competente implantado con una línea de célula de cáncer transformada con uno o más de un conjunto de oncogenes seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos.

En una modalidad, el ratón transgénico inmunocompetente creado utilizando la línea célula de cáncer de próstata de mamífero de la presente invención, desarrolla un tumor de próstata con la capacidad de producir una signatura genética molecular detectable con base en el nivel de expresión de uno o más del conjunto de oncogenes seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la producción in vitro de células epiteliales de mamífero primarias inmortalizadas, en donde el método comprende infectar las células epiteliales de mamífero primarias con un vector retroviral que lleva un oncogén seleccionado del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos, para proporcionar células infectadas, en donde las células epiteliales de mamífero primarias tienen la capacidad de ser infectadas mediante el vector retroviral y bajo condiciones mediante las cuales c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y las combinaciones de los mismos, se expresan en dichas células infectadas.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer de próstata, el donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra de prueba biológica de un sujeto que padece de cáncer de próstata o se sospecha que tiene cáncer de próstata, o que está en riesgo de desarrollar cáncer de próstata; (b) determinar un nivel de al menos un marcador biológico o una signatura genética molecular con base en el patrón de expresión de gen o actividad del uno o más conjunto de genes en la muestra de prueba, en donde el uno o más conjunto de genes se seleccionan del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos; (c) comparar el nivel de al menos un marcador biológico o la signatura genética molecular en la muestra de prueba con el nivel del marcador biológico o el nivel de la signatura genética molecular en una muestra de control, en donde un nivel elevado del marcador biológico o la signatura genética molecular en la muestra de prueba relativo al nivel del marcador biológico o la signatura genética molecular en la muestra de control, es un indicador de diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata en el sujeto.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para clasificar un tumor de cáncer, incluyendo un tumor de próstata, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra de tumor de cáncer o de tumor de próstata; (b) detectar una signatura genética molecular derivada del patrón de expresión de gen o actividad de uno o más de un conjunto de genes en la muestra, en donde los genes se seleccionan del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos; y (c) clasificar el tumor de próstata como perteneciendo a una subclase de tumor con base en los resultados del paso de detección (b).

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para estratificar un sujeto que tienen un tumor de cáncer, incluyendo un tumor de próstata, para una prueba clínica, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra derivada del sujeto que tiene el tumor de cáncer o el tumor de próstata; (b) detectar una signatura genética molecular derivada del patrón de expresión de gen o actividad de uno o más conjunto de genes en la muestra, en donde los genes se seleccionan del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src, ErbB2 y combinaciones de los mismos; y (c) estratificar al sujeto para una prueba clínica, con base en los resultados del paso de detección.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene un tumor de próstata, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra derivada del sujeto que tiene un tumor de próstata; (b) detectar una signatura genética molecular derivada de un patrón de expresión de gen o actividad del uno o más conjunto de genes en la muestra, en donde los genes se seleccionan del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos; y (c) seleccionar un tratamiento con base en los resultados del paso de detección.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona una célula de origen no natural producida transformando una célula con uno o más oncogenes exógenos, permitiendo que la célula se divida al menos una vez, en donde la célula es una célula de mamífero transformada por un vector que contiene el uno o más oncogenes exógenos, en donde el uno o más oncogenes exógenos se seleccionan del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos.

Se ha descubierto que la transformación de oncogén de las células epiteliales de próstata, induce a células metastáticas asociadas con la expresión incrementada del receptor de quimiocina tipo 5 ("CCR5") y sus ligando (CCL5, CCL8, CCL7). El receptor CCR5 es funcionalmente relevante para la metástasis ósea, tal como se puede evidenciar mediante la reducción en la metástasis con la administración del antagonista CCR5 Maraviroc, con la administración diaria oral.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 A-F, ilustra que las líneas PEC transducidas con oncogén forman colonias en agar blando; La figura 2 A-D, ilustra aberraciones en el número de copias en las cuatro líneas de células de oncogén evaluadas mediante la formación CGH; La figura 3 A-C, ilustra líneas de célula epitelial de próstata crecidas en ratones inmuno competentes; La figura 4 A-B, ilustra tumores de célula epitelial de próstata transformados con oncogén que hacen metástasis al pulmón; La figura 5 A-C, ilustra la agrupación jerárquica de la expresión de gen de microformación; La figura 6 A-F, ilustra las signaturas de oncogén específicas de c-Myc- y Ha-Ras- en tumores de próstata que son conservados en otros tejidos; La figura 7 A-B, ilustra la expresión de gen que se correlaciona con las líneas de célula de cáncer de próstata transformadas con oncogén, con una supervivencia libre de reincidencia; y La figura 8 A-E, ilustra la expresión de gen que se correlaciona con las líneas de célula de cáncer de próstata transformadas con oncogén, con una supervivencia libre de reincidencia.

La figura 9 A-B, ilustra características histológicas de adenocarcinoma de próstata deficientemente diferenciado; La figura 10, ilustra el incremento de Src de la invasión de Matrigel 3D de líneas de célula de cáncer de próstata isogénicas, en donde: La figura 10A, ilustra el ensayo de curación de la migración celular que muestra la herida, La figura 10B, ilustra la cuantificación del cierre para los experimentos de separación N = 3, La figura 10C, ilustra el ensayo de invasión 3-D utilizando líneas de célula de cáncer de próstata en Matrigel, y La figura 10D, ilustra distancias promedio de invasión ± SEM de 3 experimentos independientes para líneas PEC (PEC-NeuT, PEC-Ras, y PEC-Src); La figura 11, ilustra que los tumores de línea de célula de cáncer de próstata isogénicos son vasculares, en donde: La figura 11A, ilustra el crecimiento de tumor subcutáneo con ratones desprotegidos NCR, cuantificado en 3 semanas después de la inoculación subcutánea de 1 x 105 células para cada una de las 3 líneas utilizando flujo de fotones normalizado para cuantificar el volumen de tumor, La figura 11 B , ilustra el manchado inmunohistoquímico para el factor de von Willebrand (WF) que muestra la vascularidad de las líneas con manchado VWF incrementado de la línea Ras; La figura 12, ilustra líneas de cáncer de próstata que desarrollan metástasis. A continuación se presentan los resultados de un experimento en donde las líneas PEC transducidas con vectores que expresan la proteína de fusión Luc2-Tomato-Red fueron inyectadas en el ventrículo de ratones FVB, y la señal bioluminiscente in vivo fue cuantificada en forma semanal: La figura 12A, ilustra las imágenes representativas de bioluminiscencia de cuerpo total a las dos semanas después de la inyección intracardíaca de células epiteliales de próstata, La figura 12B, ilustra imágenes representativas de metástasis en cerebro en ratones después de la inyección intracardíaca de líneas de cáncer de próstata isogénicas, La figura 12C, ilustra la cuantificación (promedio ± SEM, n = 6) de la Generación de Imágenes de Bioluminiscencia (BLI) mostradas como una proporción de ratones con tumores, La figura 12D, ilustra un flujo de protón total promedio como una medida de carga de tumor de cerebro metastática para cada una de las líneas isogénicas, La figura 12E, ilustra el manchado de Eoxina y Hematoxilina ("H&E") de metástasis de cerebro formadas después de 2 semanas de inyección intracardíaca PEC-Src y PEC-NeuT y manchado con Citoqueratina 14 ("CK14"), que corrobora la presencia de células epiteliales de próstata dentro del cerebro; La figura 13, ilustra metástasis en hígado de líneas de célula de tumor de próstata. A continuación se presentan los resultados de un experimento en donde las líneas PEC ¡sogénicas expresan la proteína de fusión Luc2-Tomato-Red, se inyectaron en el ventrículo de ratones FVB y la señal bioluminiscente in vivo cuantificada: La figura 13A, ilustra el porcentaje de ratones con tumores en hígado, La figura 13B, ilustra el tamaño de tumor determinado mediante flujo de fotones, La figura 13C, ilustra imágenes representativas en ratones que muestran metástasis en hígado, La figura 13D, ilustra el porcentaje de ratones con tumores de riñón, La figura 13E, ilustra el tamaño de tumores de riñón mediante flujo de fotones, y La figura 13F, ¡lustra imágenes representativas de metástasis de riñón; La figura 14, ilustra líneas de célula de cáncer de próstata isogénicas que desarrollan metástasis de hueso osteolítico: La figura 14A, ilustra imágenes representativas in vivo de ratones FVB que pasaron por inyección intracardíaca de líneas PEC que expresan la proteína de fusión Luc2-Tomato-Red y se cuantificó la señal bioluminiscente in vivo, La figura 14B, ilustra la cuantificación (promedio ± SEM, n = 6) de la Generación de Imágenes de Bloluminlscencla (BLI) como una proporción de los ratones con tumores, y La figura 14C, ilustra el tamaño de la masa de tumor en el flujo de fotones; La figura 15, ilustra el aumento Src de las metástasis en huesos por cáncer de próstata osteolítico. A continuación se presentan los resultados de un experimento en donde los ratones FVB, 2 semanas después de la inyección intracardíaca de PEC-Src desarrollaron lesiones de hueso osteolíticas: La figura 15A, ilustra que el área de tumor en huesos fue incrementada significativamente en el grupo PEC-Src en comparación con PEC-Ras y PEC-NeuT, La figura 15B, ilustra los Rayos-X representativos antes de (tO) y 14 días (t14) después de la inyección intracardíaca de las células, La figura 15C, ilustra el manchado de Fosfatasa de Ácido Resistente a Tartrato ("TRAP"), que corrobora la presencia de osteoblastos (filas) en la interfaz de hueso-tumor, La figura 15D, ilustra el manchado H&E de metástasis de huesos formado posteriormente, La figura 15E, ilustra el manchado CK14, y la figura 15F, ilustra el manchado CK8, y ambos corroboran la presencia de las células epiteliales dentro de los huesos; La figura 16, ilustra las líneas de célula de cáncer de próstata osteolíticas que expresan la función CCL5 y los receptores de osteopontina ("OPN"): Las figuras 16A a 16D, ilustran el análisis de clasificación de célula activada por fluorescencia ("FACS") de la expresión CCR5 en líneas PEC, Las figuras 16E y 16F, ilustran los ensayos de invasión Matrigel de la línea PEC-Src llevados a cabo utilizando OPN como el ligando CD44, y CCL5 como el ligando CCR5, y La figura 16G, ilustra la invasión Matrigel de la línea PEC-Src cuantificada como promedio + SEM, y La figura 16F, ilustra la expresión del receptor de químiocina y el gen de ligando de líneas de célula de tumor de próstata en cultivo de tejido, y La figura 16G, ilustra la abundancia relativa de los ligandos de citocina y los receptores después del implante subcutáneo en comparación con la expresión en cultivo de tejido; La figura 17, ilustra los antagonistas CCR5 que bloquean la metástasis de cáncer de próstata osteolítico espinal. En las figuras 16A a 16D, se muestran los resultados de un experimento en donde las líneas PEC transducidas con los vectores que expresan la proteína de fusión Luc2-Tomato-Red, se inyectaron en el ventrículo de ratones FVB y la señal bioluminiscente in vivo fue cuantificada después de 2 semanas: La figura 17A, ilustra ejemplos representativos de ratones de los cuales se muestra cada grupo (Los ratones fueron tratados con araviroc oral (8 mg/kg) o un control), La figura 17B, ilustra el flujo de fotones como un análisis volumétrico de la masa de tumor total, La figura 17C, ilustra una masa de hueso de extremidad inferior en los ratones (Los datos son promedio + SEM para N = 8 ratones separados en cada grupo, P< 0.05); y La figura 17D, muestra imágenes de rayos-X representativos de masa de hueso de extremidad inferior en los ratones.

Las figuras 18A a 18H, ilustran las imágenes generadas de flurina-18, fluoruro de sodio ("F-18-NaF") correlacionadas con el análisis de rayos-X que demostraron la presencia de metástasis espinal; Las figuras 19A y 19B, muestran que el tratamiento diario oral con Maraviroc, redujo la metástasis espinal en un >90%; y La figura 20, ilustra los datos de la microformación de línea de célula tPEC.

Descripción Detallada de la Invención El asunto materia de la presente invención será descrito a continuación en forma más detallada, con referencia a las Figuras y Ejemplos adjuntos, en los cuales se muestran modalidades representativas. Sin embargo, el asunto materia de la presente invención puede ser representado en diferentes formas y no deberá ser construido como limitado a las modalidades aquí establecidas. Más bien, estas modalidades se proporcionan para describir y habilitar a los expertos en la técnica. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos aquí utilizados tienen el mismo significado al comúnmente comprendido por un experto en la técnica a la cual pertenece este asunto materia. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias aquí mencionadas están incorporadas en su totalidad como referencia.

I. Modelos Animales y Líneas Celulares: Los nuevos tratamientos para enfermedades, tales como cáncer y en particular, cáncer de próstata, requieren nuevos regímenes de pruebas en animales. Estos regímenes de pruebas han estado limitados por la carencia de líneas de célula de cáncer de próstata que puedan ser implantadas en animales inmuno competentes (o "inmunocompetentes"). Esto es importante debido a que el sistema inmune desempeña un papel importante en el desarrollo y progreso de cáncer de próstata humana. Para clasificar los nuevos fármacos útiles para tratar pacientes con cáncer de próstata, es necesario desarrollar líneas de célula de cáncer de próstata que puedan ser estudiados en animales inmuno competentes, que reflejan la enfermedad humana mediante histología, y pasan por el mismo tipo de comportamiento in vivo, incluyendo metástasis hacia los pulmones y huesos, como ocurre en la enfermedad en humanos.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona líneas de célula de cáncer que pueden ser implantadas en animales inmuno competentes, o inmunocompetentes, incluyendo humanos y animales no humanos, incluyendo mamíferos. Los mamíferos no humanos de ejemplo incluyen, por ejemplo, roedores tales ratas, cerdos de guinea, y ratones, y animales de granja tales como cerdos, ovejas, cabras, caballos, y ganado.

Ya que cualquier tipo de célula en el cuerpo puede ser una fuente de cáncer, en la presente invención se puede utilizar cualquier tipo de línea de célula de cáncer. Un tipo de cáncer adecuado incluye carcinoma (cáncer de las células epiteliales), sarcoma (cáncer de huesos, músculos u otros tejidos conectivos), linfoma (cáncer del sistema linfático), leucemia (cáncer de células de sangre o células precursoras de sangre) y melanoma (cáncer de células que proporcionan pigmento).

En una modalidad, se proporciona una línea de célula de cáncer de próstata, en donde la línea de célula de próstata comprende al menos uno o más de un conjunto de células epiteliales de mamífero primarias, que han sido infectadas con un vector retroviral que lleva un oncogén seleccionado del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos, y en donde se expresa el oncogén o las combinaciones de genes.

En una modalidad, se proporciona una línea de célula de cáncer de próstata de ratón, en donde las células de próstata de múrido son transducidas con un oncogén seleccionado del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos. Se puede obtener la línea de célula de próstata de ratón, infectando células epiteliales de múrido primarias con un vector retroviral que llevan el oncogén bajo las condiciones que permiten que el oncogén sea expresado en las células epiteliales de múrido primarias.

Los modelos de ratón inmunocompetentes transgénicos de cánceres humanos, por ejemplo, tienen el potencial de ser más reflectivos de cánceres humanos que los modelos de xenoinjerto debido, entre otras cosas, a que los ratones transgénicos forman tumores in situ (por ejemplo, en un ambiente más similar al del tumor humano, y en la configuración de un sistema inmune normal). Por consiguiente, en algunas modalidades de la presente invención, los mamíferos no humanos inmunocompetentes son diseñados para expresar uno o más de los oncogenes aquí descritos, incluyendo c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src o combinaciones de los mismos, y de desarrollar cáncer.

Existen diversas ventajas en el uso de modelos de ratón transgénico de cáncer humano en investigación. Por ejemplo, se podría utilizar tomografía computarizada con rayos-X de animales pequeños (microCT) para monitorear el progreso de un tumor en forma relativamente barata, y también como un método tridimensional altamente cuantitativo para visualizar los vasos sanguíneos y la angiogénesis en forma preclínica. Utilizando dicho método es posible lograr una evaluación rápida y precisa de la vascularidad durante las pruebas terapéuticas preclínicas en ratones vivos. La evaluación de tumor con microCT permite una rápida conversión visual cualitativa de los datos, asi como el análisis cuantitativo del volumen de sangre de tumor, densidad de vaso, calibre del vaso, grado de ramificación, y complejidad utilizando análisis de segmentación.

Los ejemplos de ratones inmunocompetentes que son adecuados para utilizarse en la presente invención, incluyen (cría aleatoria CD1, Charles River Laboratories, St. Constant, PQ), C57BI/6J (B6), C57BI/6x129/J F1 (F1, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), FVB/N, C57BV6, BALB/c y ND4.

En una modalidad preferida, se utilizaron ratones FVB/N para diseñar los modelos de ratón transgénicos de acuerdo con la presente invención. Los ratones FVB/N son adecuados para la mayor parte de los experimentos transgénicos y los análisis genéticos contemplados y/o aquí descritos. La cepa FVB/N pura está caracterizada por un desempeño reproductivo vigoroso y carnadas consistentemente grandes y huevos FVB/N fertilizados que contienen pronúcleos grandes y predominantes, lo cual facilita la microinyección del ADN.

Un ratón transgénico inmunocompetente creado utilizando la línea de célula de cáncer de próstata de mamífero de la presente invención, desarrolla un tumor de próstata con la capacidad de producir una signatura genética molecular detectable con base en el nivel de expresión de uno o más de los conjuntos de oncogenes seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos.

La metástasis, es el origen primordial de muerte en pacientes con cáncer. Los tratamientos anticáncer quimioterapéuticos actuales utilizan fármacos citotóxicos, hormonales o inmunomoduladores dirigidos a la disminución del número de células de cáncer en el cuerpo del paciente. Sin embargo, un cuerpo de evidencia creciente, sugiere que la mayor parte de las células metastáticas son resistentes a los fármacos anticáncer, y por consiguiente, los fármacos actualmente disponibles no detienen en forma efectiva la diseminación de células de cáncer a otros tejidos u órganos. Actualmente, no existe un método efectivo para tratar la mayor parte de los tumores metastáticos a pesar de las numerosas y diversas innovaciones terapéuticas en el campo terapéutico de cáncer.

Un "vector" o "construcción" se refiere a una macromolécula o complejo de moléculas que comprenden un polinucleótido que será suministrado a una célula huésped, ya sea ¡n vitro o ¡n vivo. El polinucleótido que será suministrado puede comprender una secuencia de interés para terapia genética. Los vectores incluyen por ejemplo, transposones y otros elementos móviles específicos del sitio, vectores virales, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), virus pox, virus de papiloma, lentivirus, virus de herpes, virus de espuma y vectores de retrovirus, e incluyendo virus pseudotipificados, liposomas y otros complejos que contienen lípidos, y otros complejos macromoleculares con la capacidad de mediar el suministro de un polinucleótido a una célula huésped, por ejemplo, partículas de oro recubiertas con ADN, complejos de polímero-ADN, complejos de liposoma-ADN, complejos de liposoma-polímero-ADN , complejos de virus-pol ímero-ADN , por ejemplo, complejos de adenovirus-polilisina-AD , y complejos de anticuerpo-ADN . Los vectores también pueden comprender otros componentes o funcionalidades que modulan en forma adicional el suministro de gen y/o expresión de gen, o que proporcionan de otra forma propiedades benéficas a las células a las cuales serán introducidos los vectores. Dichos otros componentes incluyen, por ejemplo, componentes que influencian el enlace o la dirección a células (incluyendo componentes que transmiten el tipo celular o enlace específico de tejido); componentes que influencian la captación del ácido nucleico de vector a través de la célula; componentes que influencian la localización del polinucleótido dentro de la célula después de la captación (tal como agentes que transmiten la localización nuclear); y componentes que influencian la expresión del polinucleótido. Dichos componentes también pueden incluir marcadores, tal como marcadores detectables y/o selecciónateles que pueden ser utilizados para detectar o seleccionar las células que han sido tomadas y que expresan el ácido nucleico suministrado por el vector. Dichos componentes pueden ser proporcionados como una característica natural del vector (tal como el uso de ciertos vectores virales que tienen componentes o funcionalidades que transmiten el enlace y captación), o vectores que pueden ser modificados para proporcionar dichas funcionalidades. Se conoce una gran variedad de dichos vectores en la técnica, y están generalmente disponibles. Cuando se mantiene un vector en una célula huésped, el vector puede ser ya sea replicado en forma estable por las células durante la mitosis como una estructura autónoma, incorporada dentro del genoma de la célula huésped, o se puede mantener en el núcleo o citoplasma de la célula huésped.

El cáncer de Próstata Humano tiene incrustadas dentro, la cubierta genética y las signaturas que reflejan la señalización oncogénica. Las líneas celulares de la presente invención, reflejan de manera conveniente una o más de estas trayectorias de señalización oncogénica, facilitando de esta forma, por ejemplo, la elaboración de pruebas de los compuestos específicos de oncogén o las terapias basadas en ácidos nucleicos. En particular, las líneas de célula de cáncer de próstata tal como aquí se proporcionan, son útiles para probar y/o clasificar los compuestos específicos de oncogén o las terapias a base de ácidos nucleicos.

Los ejemplos de inhibidores específicos de oncogén adecuados incluyen inhibidores de los oncogenes c-Myc, Ha-Ras c-Src, y ErbB2. Diversos de los agentes anticáncer adecuados que dirigen el ErbBs, que están en uso clínico o están en desarrollo, incluyen los que están en las categorías de anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos contra la familia ErbB y los Inhibidores de Cinasa de Tirosina de Molécula Pequeña ErbB. Los anticuerpos monoclonales quiméricos o humanizados, incluyen anticuerpos que evitan la activación de receptor dependiente de ligando y el enlace de ligando (por ejemplo, Cetuximab que dirige el subdominio III de enlace de ligando de ErbB1), anticuerpos que interfieren con la activación de receptor independiente de ligando (por ejemplo, Trastuzumab que dirige el subdominio IV de ErbB2), y anticuerpos que previenen la heterodimerización de receptor (por ejemplo, el anticuerpo anti-ErbB2 Pertuzumab, que dirige un área alrededor del lazo de dimerización en el subdominio II de ErbB2). Los inhibidores de cinasa de tirosina de molécula pequeña ErbB de ejemplo, incluyen dos inhibidores de cinasa de tirosina específicos de ErbB 1, Gefitinib/lressa y Erlotinib, que han sido aprobados para el tratamiento de cáncer de pulmón de célula no pequeña, y el inhibidor ErbBI/ErbB2 dual, Lapatinib, que es comercializado como TYKERB® y está indicado en la combinación con capecitabina para el tratamiento de pacientes con cáncer de seno avanzado o metastático; y en combinación con letrozol para el tratamiento de mujeres postmenopáusicas con cáncer de seno metastático positivo de receptor de hormonas que sobre-expresan el HER2.

Otros inhibidores de receptor ErbB2 incluyen GW-282974 (Glaxo Wellcome PLC), y los anticuerpos monoclonales AR-209 (Aronex Pharmaceuticals Inc. of The Woodlands, Tex., EUA) y 2B-1 (Chiron). Los inhibidores ErbB2 de ejemplo también incluyen los descritos en la Publicación Internacional WO 1998/02434 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 1999/35146 (publicada el 15 de julio de 1999), WO 1999/35132 (publicada el 15 de julio de 1999), WO 1998/02437 (publicada el 22 de enero de 1998), WO 1997/13760 (publicada el 17 de abril de 1997), WO 1995/19970 (publicada el 27 de julio de 1995), la Patente Norteamericana No. 5,587,458 (presentada el 24 de diciembre de 1996), y la Patente Norteamericana No. 5,877,305 (presentada el 2 de marzo de 1999), cada una de las cuales está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Los inhibidores de receptor ErbB2 útiles en la presente invención, también se describen en la Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/117,341, presentada el 27 de enero de 1999, y en la Solicitud Provisional Norteamericana No. 60/117,346, presentada el 27 de enero de 1999, ambas de las cuales están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia.

Los ejemplos de inhibidores de cinasa de tirosina de proteína c-Src que son útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los compuestos que se describen en forma genérica y específica en las Publicaciones Internacionales Nos. WO 1996/10028, WO 1997/28161, WO 1997/32879 y WO 1997/49706, incluyendo los que pertenecen a las clases de estructura de pirrolopirimidinas, especialmente pirrolo[2,3-d]pirimidinas, purinas, pirazo-pirimidinas, especialmente pirazo[3,4-d]pirimidinas, pirazopirimidinas, especialmente pirazo[3,4-d]pirimidinas y piridopirimidinas, especialmente pirido[2,3-d]pirimidinas. Los compuestos de ejemplo incluyen los compuestos de las fórmulas I a IV que se encuentran a continuación.

Los compuestos anteriores pueden ser preparados y administrados como se describe en los documentos mencionados. El compuesto de la formula I se puede preparar y formular tal como se describe en la Publicación Internacional WO 1996/10028. El compuesto de la formula II y su preparación se describe en el Ejemplo 111c3 de la Publicación Internacional WO 1997/16452. El compuesto de la formula IV se puede preparar en analogía al mismo. Ambos de estos últimos compuestos se pueden formular tal como se describe en la Publicación Internacional WO 1997/16452. El compuesto de la formula III se describe en la Publicación de R. Gamse y asociados, en J. Bone Miner. Res. 14 (Suplemento 1), 1999, página S487.

Los compuestos útiles adicionales (por ejemplo, PP1) son descritos por T. Schindler, F. Sicheri y asociados, en Molecular Cell, 1999 (3), 639, página 647; J. M. Hamby y asociados, J. Med. Chem. 40, 1997, páginas 2296 a 2303; R. L. Panek y asociados, J. Pharmacol. Exp. Ther. 283, 1997, páginas 1433 a 1444; y S. R. Klutchko y asociados, J. Med. Chem. 41, 1998, páginas 3276 a 3292.

Otros inhibidores src incluyen SKI606, también conocido como bosutinib (por Wyeth) y el compuesto, dasatinib, también conocido como Spyrcel (por Bristol-Myers Squibb) el cual se describe en la Publicación Internacional WO 2000/62778 y en la Patente Norteamericana No. 6,596,746. Todos estos inhibidores src están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia.

Los inhibidores c-Myc de molécula pequeña incluyen 10074-G5, también conocido como Bifenil-2-il-(7-nitrobenzo[1 ,2,5]oxadiazol-4-ilamina; Quarfloxin (también conocido como CX-3543); y 10074-G5, también conocido como Bifenil-2-il-(7-nitrobenzo[1,2,5]oxadiazol-4-ilamina. CX-3543 suprime en forma reportada la actividad de c-Myc, enlazando al cuádruplex c-Myc, estructuras secundarias de ADN de cuatro hebras que regulan la transcripción de oncogenes específicos, incluyendo c-Myc.

Otros inhibidores c-Myc incluyen los compuestos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0203188 (publicada el 30 de agosto de 2007). Estos inhibidores c-Myc están incorporados en su totalidad a la presente invención.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la producción in vitro de células epiteliales de mamífero primarias inmortalizadas, en donde el método comprende infectar las células epiteliales de mamífero primarias con un vector retroviral que lleva un oncogén seleccionado del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos, para proporcionar células infectadas, en donde las células epiteliales de mamífero primarias tienen la capacidad de ser infectadas mediante el vector retroviral y bajo condiciones mediante las cuales los c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y las combinaciones de los mismos, se expresan en las células infectadas.

Se puede utilizar en la presente invención cualquier sistema de suministro de gen adecuado. Los ejemplos particulares de sistemas de suministro de gen adecuados incluyen Sistemas de Expresión Retroviral y Adenoviral. Se utiliza ampliamente la transferencia de gen transmitida en forma retroviral para expresar proteínas en una variedad de líneas celulares, incluyendo células hematopoyéticas para una variedad de razones, incluyendo el análisis de sus efectos en proliferación, diferenciación, y función biológica de células de sangre. En particular, el Sistema de Expresión Retroviral de Virus de Célula Madre de Múrido ("MSCV") (de Clontech Laboratories, Inc), contiene vectores que son optimizados para introducir y expresar genes objetivo en líneas celulares pluripotentes, incluyendo células hematopoyéticas de múrido o humano, células madre embriónicas (ES), y células de carcinoma embrional (EC). Los ejemplos particulares de Sistemas de Expresión Adenoviral, incluyen el Sistema de Expresión Adenoviral ViraPower™ (de Life Technologies), que es útil, por ejemplo, para la creación de un adenovirus incompetente en réplica que puede ser utilizado para suministrar, y expresar temporalmente, el gen(s) objetivo de interés en células de mamífero ya sea de división o sin división.

II. Métodos de Uso: En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar un cáncer de próstata, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra de prueba biológica de un sujeto que padece de un cáncer de próstata, o se sospecha que tiene cáncer de próstata, o está en riesgo de desarrollar cáncer de próstata; (b) determinar un nivel de al menos un marcador biológico o una signatura genética molecular con base en el patrón de expresión de gen en la muestra de prueba que está asociada con el diagnóstico de cáncer de próstata; (c) comparar el nivel del al menos un marcador biológico o la signatura genética molecular en la muestra de prueba, con un nivel de marcador biológico o el nivel de la signatura genética molecular en una muestra de control, en donde un nivel elevado del marcador biológico, o la signatura genética molecular en la muestra de prueba, relativo al nivel del marcador biológico o la signatura genética molecular en dicha muestra de control, es un indicador de diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata en el sujeto.

En una modalidad, los especímenes biológicos incluyen ácidos nucleicos derivados de tumor obtenidos del paciente. El ácido nucleico puede ser derivado del tumor ya sea mediante biopsia, o de células derivadas del tumor en orina o proteína elaboradas como consecuencia de la signatura genética secretada en la sangre del paciente.

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para clasificar un tumor de próstata, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra de tumor de próstata; (b) detectar una signatura genética molecular derivada del patrón o actividad de expresión de gen de uno o más de los conjuntos de genes en la muestra, en donde los genes se seleccionan del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos; y (c) clasificar el tumor de próstata como perteneciendo a una subclase de tumor basada en los resultados del paso de detección.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para estratificar a un sujeto que tiene un tumor de cáncer, incluyendo un tumor de próstata, para una prueba clínica, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra derivada de un sujeto que tiene un tumor de cáncer o un tumor de próstata; (b) detectar una signatura genética molecular derivada del patrón de expresión de gen o actividad de uno o más conjunto de genes en la muestra, en donde los genes son seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src, ErbB2 y combinaciones de los mismos; y (c) estratificar al sujeto para una prueba clínica con base en los resultados del paso de detección.

En algunas modalidades, los sujetos son estratificados en subcategorías que están basadas en la presencia de una signatura genética molecular y/o las trayectorias funcionales ligadas a la signatura genética molecular.

En una modalidad, la signatura genética molecular está basada en un patrón de expresión de gen o actividad de uno o más de un conjunto de genes en una muestra de prueba derivada de un sujeto que tiene un tumor de cáncer, en particular un tumor de próstata de cáncer, en donde el uno o más conjunto de genes son seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene un tumor de próstata, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra derivada de un sujeto que tiene un tumor de próstata; (b) detectar una signatura genética molecular derivada del patrón de expresión de gen o actividad del uno o más conjunto de genes en la muestra, en donde los genes son seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos; y (c) seleccionar un tratamiento basado en los resultados del paso de detección (b) (por ejemplo, terapias a base de oncogén pueden proporcionarse con base en la onco signatura en el tumor del paciente) .

Aún en otro aspecto, la presente invención proporciona una célula de origen no natural producida transformando una célula con uno o más oncogenes exógenos, permitiendo que la célula se divida al menos una vez, en donde la célula es una célula humana transformada por un vector que contiene el uno o más oncogenes exógenos, en donde el uno o más oncogenes exógenos son seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos. La signatura puede aplicarse al material genético derivado de cáncer de próstata - es decir, en biofluidos relacionados con la próstata, incluyendo bioespecímenes de próstata, orina, sangre y otros. La signatura también puede aplicarse a otros tipos de cáncer, en particular como se muestra para cáncer de seno. En el caso de la signatura de c-Myc, la signatura se observa tanto en tumores de próstata como en cáncer de seno derivados de la expresión transgénica de c-Myc en la glándula mamaria de ratones transgénicos (figura 7C).

En una modalidad, la presente invención incluye identificar un cáncer obteniendo una muestra biológica de un sujeto que padece de cáncer de próstata o se sospecha que tiene cáncer de próstata, o está en riesgo de desarrollar cáncer de próstata, y determinar si el material genético de la muestra biológica tiene una signatura genética tal como aquí se describe. En una modalidad, la muestra biológica se deriva de una biopsia de próstata. En otra modalidad, la muestra biológica se deriva de biofluidos relacionados con la próstata, incluyendo bioespecímenes de próstata, orina, sangre u otros. En otra modalidad, el método de la presente invención incluye manipular una próstata antes de obtener una muestra de orina para identificación de la signatura genética. En otra modalidad, el método incluye otros fluidos tal como los descritos anteriormente.

Nuevos tratamientos requieren nuevos regímenes de pruebas en animales. Estos estudios han quedado limitados por la carencia de líneas de célula de cáncer de próstata que puedan ser implantadas en animales inmuno competentes. El sistema inmune desempeña un papel importante en el desarrollo y progreso de cáncer de próstata humano. Para permitir la clasificación de nuevos fármacos para tratar pacientes con cáncer de próstata, es necesario desarrollar líneas de célula de cáncer de próstata que pueden ser identificadas en animales inmuno competentes, que reflejen la enfermedad humana mediante histología, y el mismo tipo de comportamiento in vivo, incluyendo metástasis hacia los pulmones y huesos, como ocurre en la enfermedad humana. Los métodos relacionados con la creación de estas líneas de células que se pueden utilizar en ratones inmunocompetentes, se describen en el suplemento 3.

Las secuencias de oligonucleótido se pueden introducir en células como se sabe en la técnica. Se puede utilizar transfección , electroporación , fusión, liposomas, partículas poliméricas coloidales y vectores virales y no virales, así como otros medios conocidos en la técnica, para suministrar las secuencias de oligonucleótido a la célula. El método de suministro seleccionado, dependerá al menos de las células que serán tratadas y la ubicación de las células, y será conocido por los expertos en la técnica. La localización puede lograrse mediante liposomas, teniendo marcadores específicos en la superficie para dirigir el liposoma, teniendo la inyección directamente en el tejido que contiene las células objetivo, teniendo un depósito asociado en proximidad espacial con las células objetivo, captación transmitida por receptor específico, vectores virales, o similares. Los oncogenes pueden ser introducidos en células mediante transducción o transfección. La transducción puede llevarse a cabo utilizando sistemas de suministro ya sea retroviral o viral.

EJEMPLOS Ratones, cultivos celulares, químicos y reactivos.

Los procedimientos experimentales con ratones transgénicos fueron aprobados por el comité de éticas de la Thomas Jefferson University. Los ratones eran de la cepa FVB. Se aislaron los cultivos celulares epiteliales de próstata de ratón de las glándulas de próstata de ratones macho de 12 semanas de edad y se mantuvieron tal como se describió anteriormente [42] y se analizaron después de 25 pasajes con al menos tres líneas de cada genotipo. Se describió previamente [43, 44] la transducción de células mediante vector de expresión retroviral que codifica cualquiera de c-Myc, Ha-Ras, v-Src, NeuT, en el vector pBABE-IRES-GFP.

Ensayos de crecimiento celular.

Las células se sembraron en placas de 24 depósitos en una concentración de 1 x 104 células/depósito, cada muestra por triplicado x 7 días. Se crecieron células transformadas en un medio DMEM con 10% FBS, mientras que se cultivaron células PEC de control en un medio de cultivo primario epitelial de próstata. A las células de recolección, células suspendidas en 100 µ? de PBS, se les agregó cada 24 horas un volumen igual de 0.4% de azul Trypan, después de 5 minutos, las células se contaron mediante el Contador Celular Countess™ Autocounted (C10227, Invitrogen Carlsbad, CA).

Formación de Colonias en Agar Blando.

Se sembraron células (3 x 103/ml) en agar blando al 0.3% (Sigma) en un plato de suspensión (Nalgene Nunc International, Rochester, NY). Las colonias se mancharon mediante 0.04% de acetato violeta de cristal, y se contaron bajo un microscopio vertical después de 2 semanas de incubación.

Ensayo de Formación de Tumor I 1 x 106 células en un volumen de 100 µ? se inyectaron en forma subcutánea en ratones macho FVB de 7~8 semanas. La suspensión celular se mezcló con un 20% en volumen de BD Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA), dando como resultado una concentración final de células de 10"7 células/ml. Se midió el crecimiento de tumor mediante calibradores vernier dos veces a la semana. Se recolectaron muestras de tumor después de 30 días (excepto tumores inducidos mediante NeuT y se recolectaron después de 16 días).

Cultivo Celular, Transfección, Transducción, Vectores de Expresión Las líneas PEC (células epiteliales de próstata) transformadas con oncogenes Ha-Ras, v-Src, y NeuT, se generaron y transfectaron con un vector lentiviral que contiene el gen Iuc2 para generar líneas de célula de cáncer bioluminiscente estables. Anteriormente se describió el vector de expresión Luc2-tomato red (Liu, H., y asociados, Proc Nati Acad Sci E.U.A. 2010, 107, páginas 18115 a 18120). Las líneas PEC isogénicas se mantuvieron en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS) y penicilina-Estreptomicina al 1% y se cultivaron en 5% C02 a una temperatura de 37°C.

Las células se crecieron hasta la confluencia en placas de 12 depósitos en un medio DMEM que contiene FBS al 10%. Las monocapas se hirieron con una punta de micropipeta P10. Las células se lavaron inmediatamente después de marcarse con PBS y se agregó DMEM libre de suero (16). Se monitoreó la migración celular durante 20 horas, y se tomaron imágenes en los puntos de tiempo de 9h, 12h, 15h y 20h utilizando un sistema de microalcance Axiovert 200 Zeiss. Las imágenes fueron analizadas utilizando el software ImageJ.

Análisis de Formación de Citocina Se obtuvieron formaciones de citocina de ratón manchadas sobre membrana de nitrocelulosa de Raybiotech. Se preparó un medio acondicionado cultivando células en DMEM libre de suero durante 48 horas. Posteriormente las membranas se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para evaluación de la citocinas secretadas en el medio acondicionado (ver la Publicación de Katiyar, S. et al., Mol Cell Biol 2007, 27, 1356-1369).

Ensayo de Formación de Tumor II Se anestesiaron ratones nu/nu macho de 12 semanas de edad mediante exposición a isoflurano al 3%. Los ratones anestesiados recibieron 1x106 células suspendidas en 50µ? de Amortiguador de Solución Salina de Fosfato de Dulbecco que carece de calcio y magnesio (DPBS) y 50µ?_ de Base de Membrana Matrigel BD (BD Biosciences, Bedford, MA) mediante inyección subcutánea debajo de un flanco dorsal. La inyección se llevó a cabo utilizando una aguja 27G½. Al progreso del tumor se le ha dado seguimiento mediante medida de bioluminiscencia una vez a la semana hasta la extirpación del tumor, utilizando lo previamente descrito (18). Se monitorearon en forma dorsal tres ratones a la vez. Las regiones de interés (ROI) de las imágenes mostradas se dibujaron alrededor de los sitios de tumor o la lesión metastática, y se cuantificaron utilizando el software Living Image 3.0. (Caliper Life Sciences).

Se recolectaron muestras de tumor después de 3 semanas. Todos los experimentos que implicaron ratones, se llevaron a cabo bajo la aprobación de la IACUC de la Universidad Thomas Jefferson .

Ensayo de Metástasis Experimental Se anestesiaron ratones FVB machos de 8 semanas de edad mediante exposición a isoflurano al 3%. Se inyectaron células de cáncer 2x105 suspendidas en 100µ?_ de DPBS en el ventrículo izquierdo del corazón del ratón. Las inyecciones se llevaron a cabo utilizando una aguja 30G½ y una jeringa de 1ml_. Para confirmar la presencia de las células en la circulación sistémica, se generaron imágenes de los animales utilizando el sistema I VI S LUMINA XR (Caliper Life Sciences, Hopkinton MA). Se indicó una inyección intracardiaca exitosa mediante bioluminiscencia sistémica distribuida a lo largo del cuerpo del animal. Los ratones que no fueron inyectados en forma adecuada se eliminaron del estudio. Con el objeto de generar imágenes in vivo de los ratones, los animales recibieron el substrato de luciferasa, DLuciferin (Gold Biotechnology), en 15mg/mL en PBS mediante inyección intraperitoneal de 10 \iL de una solución de reserva de Luciferina por gramo de peso corporal (recomendación del fabricante) y se anestesiaron mediante exposición a 3% de isoflurano. A los 10 a 15 minutos después de la inyección de D-luciferina, los animales se colocaron dentro de la caja de la cámara del I VI S Lumina XR (Caliper Life Sciences, Hopkinton MA) y recibieron exposición continua a isoflurano al 2.5%. Los tiempos de generación de imágenes fluctuaron de 5 segundos (para los últimos puntos de tiempo) a 5 minutos (para los puntos de tiempo más tempranos), dependiendo de la bioluminiscencia de la lesión metastática. Únicamente se generó una imagen en forma ventral. Los resultados fueron analizados utilizando el software Living Image 3.0. Para BLI ex vivo, se diluyó D-luciferina en PBS a una concentración final de 300pg/mL y se utilizó para lavar los órganos aislados frescos durante 2 a 3 minutos antes de generar las imágenes. Los experimentos en animales fueron aprobados por la IACUC de la Universidad Thomas Jefferson.

Análisis Radiográfico de Metástasis de Huesos y CT Se monitoreó el desarrollo de metástasis de hueso mediante radiografía de rayos X utilizando ¡VIS Lumina XR (Caliper Life Sciences). Los ratones fueron anestesiados, se ajustaron en una posición bocabajo y se expusieron a rayos X durante 5 minutos. Administración de Maraviroc (antagonista de CCR5). Los ratones FVB macho recibieron una dosis dorsal de Maraviroc (Selleck Chemicals LLC) de 8 mg/kg cada 12 horas desde los 5 días previos a la inoculación de las células de cáncer, así como después de la inyección ic hasta la eutanasia. El fármaco se disolvió en agua que contiene 5% DMSO y 0.5% 1N HCI. Los ratones de control se mantuvieron en un programa de dosificación idéntico y recibieron la misma inyección de volumen de vehículo.

Ensayo de invasión Se llevó a cabo el ensayo de invasión tridimensional tal como se reportó anteriormente. En síntesis, se pipetearon 100 mi de 1.67 mg/ml de colágeno de cola de rata tipo I (BD Biosciences) en la cámara superior de un transdepósito de poros de 8 mm de 24 depósitos (Corning, Lowell, MA). El transdepósito se incubó a una temperatura de 37°C durante la noche para permitir que se solidificara el colágeno. Posteriormente se sembraron 30,000 células en la parte interior de la membrana de transdepósito y se dejaron adherir. Se colocó el medio de crecimiento libre de suero en la cámara inferior, en tanto que se utilizaron 10ug/ml de osteopontina (R&D System), o 15 ng/ml de CCL5 (R&D System), o 10% FBS como un quimioatrayente en la parte media de la cámara superior. Posteriormente las células fueron quimioatraídas a través del filtro mediante el colágeno superior durante tres días. Las células se fijaron en 4% de formaldehído, se permeabilizaron con 0.2% de Triton-X en PBS, y posteriormente se mancharon con 40 mg/ml de yoduro de propidio (Pl) durante 2 horas. Se analizó la fluorescencia mediante secciones confocales (una sección cada 20 mm) en una magnificación de 10x de la parte inferior del filtro utilizando un microscopio confocal invertido Zeiss LSM 510 Meta en el Kimmel Cáncer Center Bioimaging Facilit.

Análisis Histológicos Seüjaron muestras de tumor y tejidos blandos en 4% de paraformaldehído (PFA, Fisher) y se procesaron para cama de parafina, seccionado, H&E e inmunohistoquímica (HCI). Los huesos se fijaron en 4% de PFA a una temperatura de 4°C durante 72 horas, se descalcificaron en 0.5M EDTA (pH 8) durante 7 días a una temperatura de 4°C y se incrustaron en parafina (19). El manchado vWF en secciones de tumor se llevó a cabo mediante la Pathology Core Facility de KCC. Se llevó a cabo el manchado CK14 (Covance) PRB-155P y CK8 (clon 1E8, Covance) MMS-162P después de la desparafinación y rehidratación sin llevar a cabo el tratamiento de recuperación de antígeno en muestras de huesos y cerebro, para distinguir las células epiteliales de próstata básales de las luminales. Se llevó a cabo manchado TRAP (fosfatase de ácido resistente a tartrato) después de la desparafinización y rehidratación, siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich), para identificar los osteoclastos activos en la superficie entre la lesión metastática y el hueso compacto (5) (20). Se llevó a cabo el método de tetracromo en huesos para identificar el hueso herido en las áreas de lesión osteoblásticas (5,21). Se llevó a cabo el manchado RV202 (Santa Cruz Biotechnology) únicamente en las muestras de cerebro para discriminar el sarcoma del carcinoma.

Microdisección de captura láser y extracción de ARN Los cerebros y las patas completas después de la eliminación de piel y músculos, se congelaron en forma instantánea en un medio de temperatura de corte óptimo (OCT compound Tissue Tek) y se almacenaron a una temperatura de -80°C. Los tejidos se seccionaron en un criostato () y se montaron en rodajas de membrana NF 1.0 PEN. Se llevó a cabo LCM utilizando el sistema PALM Microbeam (Cari Zeiss) y el software PALM Robo v4.2. Las secciones congeladas se mancharon con violeta de cresilo (equipo de manchado LCM, Ambion). Se completó la captura a las 2 horas del paso de manchado para asegurar la calidad del ARN. El tejido recolectado en las tapas de adhesivo (Cari Zeiss) se almacenó directamente a una temperatura de -80°C con la tapa hacia abajo. Las células capturadas fueron Usadas y el ARN fue extraído siguiendo las recomendaciones del fabricante (RNeasy Micro Kit Qiagen). (Ver las Publicaciones de Bos, P. D. et al. Nature 2009, 459, 1005-1009; y Wang, W. Z. et al. BMC molecular biology 2009, 10, 69). Se revisó la integridad del ARN utilizando el 2100 Bioanalyzer (Agilent) mediante Nucleic Acids Facility en KCC. La evaluación de la calidad del ARN estuvo basada en el número de integridad de ARN (RTN).

Métodos de análisis de microformación Análisis de procesamiento previo y expresión diferencial. Se procesaron previamente los datos de la microformación utilizando corrección de antecedente, normalización cuantil y se llevó a cabo la suma en las microformaciones de expresión de gen Mouse Gene 1.0 ST utilizando el flujo de trabajo del Robust Multichip Analysis (RMA) en Affymetrix Expression Consolé versión 1.1 [Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA]. Los genes expresados en forma diferencial fueron identificados para cada una de las cuatro líneas de célula de sobreexpresión, llevando a cabo comparaciones por pares contra la línea de célula de control Pee. Estas comparaciones se llevaron a cabo utilizando el análisis de significancia de microformaciones (SAM) con un corte de rango de descubrimiento falso de 1% y un corte de cambio de dos veces.

Manchado Western Se llevaron a cabo ensayos de manchado Western en células PEC tal como se indicó. Las células se peletizaron y Usaron en amortiguador (50 mM HEPES, pH 7.2, 150 mMNaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.1% Tween 20) suplementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Los anticuerpos utilizados para el manchado Western son: AR (H-280, Santa Cruz Biotechnology).

Resumen de Datos CGH A partir de los datos CGH, se determinaron las ganancias y pérdidas de copias para células transformadas-SRc metastáticas recuperadas de cerebros y huesos, en forma relativa a las líneas de células transformadas de oncogén. Se identificaron regiones de variación de copia genómica como segmentos genómicos, en donde las tres muestras de réplica de la linea de célula transformada con Src metastática demostró una ganancia o pérdida relativa a la línea de célula transformada con Src. Se sumaron los datos del número de copias mediante trazo de la frecuencia de ganancias y pérdidas a través del genoma de ratón.

Generación de imágenes Se llevó a cabo la generación de imágenes de animales de acuerdo con el Institutional Animal Care and Use Committee (Comité Internacional de Uso y Cuidado de Animales). Se inyectó flurine-18, fluoruro de sodio (F-18-NaF) en solución isotónica de IBA Molecular (Ashburn, VA). 210 ± 9.54 de F-18-NaF en 150 µ?, a través de la vena lateral de la cola a ratones no anestesiados. Una hora más tarde, los animales fueron anestesiados con sulfuración al 1.5% en 98.5% de 02 y se generaron imágenes con el escáner Inveon microPET (Siemens Hoffman estáte, IL). Se obtuvieron en una generación de imágenes de 10 minutos una alta resolución espacial (1 mm en ancho total en la mitad del máximo) y sensibilidad escáner PET de sensibilidad (>10%) en un promedio de conteos de 1.5 Millones. Se utilizó para maximización un algoritmo tridimensional (3D) de maximización de expectativa de subconjunto ordenado con 5 interacciones y 8 subconjuntos.

Análisis Estadístico Se analizaron las comparaciones entre los grupos mediante la prueba t de dos lados. Se consideró una diferencia de P < 0.05 como estadísticamente significativa. Todos los análisis se llevaron a cabo con el software SPSS 11.5. Los datos se expresaron como promedio ± SEM.

Métodos de análisis de microformación. Análisis de Procesamiento Previo y Expresión Diferencial Se procesaron previamente los datos de la microformación utilizando corrección de trasfondo, normalización cuantil y se llevó a cabo la suma en una microformación de expresión de gen Mouse Gene 1.0 ST utilizando el flujo de trabajo Robust Multichip Analysis (RMA) [45] en Affymetrix Expression Consolé versión 1.1 [Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA]. Se identificaron genes expresados en forma diferencial para cada una de las cuatro líneas de células de sobreexpresión , c-Myc, NeuT, Ha-Ras y v-Src, llevando a cabo comparaciones por partes contra la línea de célula de control PEC. Estas comparaciones se llevaron a cabo utilizando el análisis de significancia de las microformaciones (SAM), con un corte de rango de descubrimiento falso de 1% y un corte de cambio de dos veces. Comparación con Fibroblastos y Líneas de Célula de Cáncer de Seno de Tumores Mamarios, Se compararon patrones de expresión diferencial de cuatro líneas de célula de sobreexpresión de oncogén contra un conjunto de datos publicado previamente incluyendo fibroblastos transducidos por oncogén y tumores mamarios inducidos [46]. Este conjunto de datos se generó en el conjunto de la microformación A y B de Affymetrix Murine 11K y contiene muestras de sobreexpresión de Ha-Ras, muestras de sobreexpresión de c-Myc, así como controles normales. Los datos sin procesar (Affymetrix .CEL files) de Huang et al. [46], se obtuvieron de las publicaciones del sitio web. Los archivos .CEL fueron procesados utilizando RAM con una definición de conjunto de sonda actualizado del sitio web CDF de University of Michigan (versión 12 de conjuntos de sondas Entrez, con fecha 30 de Julio de 2009) [47]. Se mapearon un total de 6143 genes de este conjunto de datos para símbolos de gen, y se utilizaron para análisis comparativo. Se llevó a cabo el análisis de expresión diferencial para identificar genes regulados en forma diferencial específicos para las líneas de células de Ras y Myc versus los controles utilizando SAM con un corte FDR del 10%. Los genes expresados en forma diferencial identificados en este conjunto de datos fueron comparados contra nuestras cuatro líneas de células de sobreexpresión de oncogén.

Se utilizó una curva característica de operación de receptor (ROC) para trazar la sensibilidad y especificidad en el rango de valores de discriminación para PSA en el diagnóstico y correlación con la signatura c-Myc [29-31]. Para la evaluación de PSA, las muestras con PSA normal y un evento de metástasis clínico, se consideraron como positivos reales, y las muestras con un PSA anormal y un evento de metástasis no clínico se consideraron positivos falsos. Para la evaluación de la signatura c- yc, las muestras con alta correlación con la signatura y metástasis clínica se consideraron positivos reales, y las muestras con baja correlación o negativa y un evento de metástasis clínico se consideraron positivos falsos.

Las signaturas de gen de cada una de las cuatro líneas de células de cáncer de próstata transformadas con oncogén, se comparación contra dos conjuntos de datos de próstata publicados previamente. El primer conjunto de datos comprende 185 muestras log2, los datos de expresión de mARN normalizados se descargaron del sitio web de la base de datos de cáncer de próstata MSKCC (http://cbio.mskcc.org/cancergenomics/prostate/data/) [20]. Los perfiles de gen en este conjunto de datos MSKCC fueron centrados al promedio y se computarizó la correlación de Pearson entre cada muestra MSKCC y el perfil de cambio de log2 veces para cada signatura específica del oncogén. El segundo conjunto de datos de cáncer de próstata, incluyendo muestras de metástasis distantes, se obtuvo previamente del laboratorio MSKCC Gerald Laboratory, y las muestras se procesaron tal como se describe en [33]. En síntesis, las muestras de microformación fueron procesadas utilizando el procedimiento Robust Multichip Average (RMA) [45] con un CDFs personalizado con fecha 30 de Julio, 2009 (versión 12) [47].

Comparación con Características Clínicas de Cáncer de Próstata.

Los patrones de expresión de las cuatro líneas de célula de sobreexpresión de oncogén se compararon contra los datos de expresión para rasgos clínicos, incluyendo etapa, grado y recurrencia de la enfermedad, publicados previamente por Lapointe et al. Se descargó el conjunto de datos del sitio web de las publicaciones. Este conjunto de datos contiene 5153 conjuntos de sondas y 112 muestras de cáncer de próstata con anotaciones que incluyen grado de tumor, etapa de tumor y recurrencia de la enfermedad. Se actualizaron las anotaciones del conjunto de sonda utilizando el archivo de anotaciones Array Information Library Universal Navigator GPL3044 con fecha 7/9/2009. Se eliminaron los conjuntos de sonda que carecen de las anotaciones de símbolos de gen, así como los conjuntos de sonda con valores faltantes de al menos el 25%, dando como resultado un total de 4232 características para 3327 genes únicos. Se llevó a cabo el análisis de expresión diferencial para la etapa avanzada versus etapa temprana, alto grado versus bajo grado, y enfermedad recurrente versus no recurrente, utilizando SAM con un corte FDR del 25%. Los genes expresados en forma diferencial identificados en este conjunto de datos, se compararon contra las cuatro líneas de célula de cáncer de próstata de sobreexpresión de oncogén. La significancia en el traslape entre los genes expresados en forma diferencial del conjunto de datos LaPointe y los genes en nuestros datos, se evaluó utilizando la prueba hipergeométrica.

Todos los genes activados que cumplen con al menos un corte de cambio de dos veces de las cuatro líneas de célula de sobreexpresión de oncogén, se investigaron con respecto a su relación con la recurrencia de la enfermedad, utilizando un conjunto de datos de microformación publicado con datos clínicos de la supervivencia libre de recurrencia [11]. Los datos de la microformación que fueron procesados con Affymetrix Microarray Suite v.5.0, tal como se describe en [11], y los datos clínicos de cada muestra de próstata, fueron descargados de la sección de información suplementaria del sitio web del autor (http://www.ordwayresearch.org/Glinsky-Supplemental2.html).

Los datos fueron transformados log2, y para cada una de las cuatro líneas de células, y los genes con múltiples conjuntos de datos, se manejaron promediándolos juntos y escalándolos al conjunto de sondas con la variedad más grande. Los genes con una varianza en el 50 por ciento más bajo, se filtraron del análisis. La expresión promedio para cada una de las cuatro signaturas de sobreexpresión de las líneas en el conjunto de datos de recurrencia, se utilizó para dividir la población en el grupo de expresión de alto nivel (superior al 25 por ciento) y bajo (inferior al 75 por ciento). Se trazaron curvas de supervivencia libres de recurrencia para las poblaciones de expresión de alto y bajo nivel, y se calcularon los valores p significativos utilizando la prueba de clasificación logarítmica. Las líneas de células de próstata transformadas con oncogén llevan el crecimiento independiente del contacto.

Se establecieron cultivos de célula epitelial de próstata primarios de próstatas ventrales de ratones FVB (figura 1A). Las células fueron transducidas con vectores de expresión retroviral que codifican un oncogén distinto simple (c-Myc, Ha-Ras (V-12), v-Src y NeuT, un mutante de activación de ErbB2). La morfología celular de las células epiteliales de próstata se alteró durante el período de cuatro semanas (figura 1B). Se seleccionaron y caracterizaron colonias individuales de células transducidas con oncogén. Se llevaron a cabo ensayos de crecimiento celular mediante conteo celular (figura 1C). Se observó en cada línea de célula transducida por oncogén una ventaja de crecimiento sustancial, en comparación con células epiteliales de próstata primaria.

Se llevó a cabo el análisis de manchado Western para revisar la expresión relativa de cada uno de los oncogenes utilizados para transducir el PEC. La presencia de c-Myc, Ha-Ras, ErbB2 y v-Src oncogénico se identificó mediante manchado Western. El incremento en abundancia en cada oncogén fue específico para cada línea de célula (figura 2A). La abundancia relativa de Src se incrementó en cada una de las líneas en comparación con PEC primario, y fue de aproximadamente 2 veces más en PEC transformado con v-Src en comparación con otras líneas de célula de tumor (exposición más corta, figura 2A). La transformación de oncogén de fibroblastos o células epiteliales de múrido, lleva a un crecimiento independiente de contacto en el agar sólido. Las líneas PEC transducidas por oncogén fueron revisadas para crecimiento en agar blando. Se caracterizó el tamaño y número de colonias para cada oncogén (figura 2B) [27]. Las PECs no transformadas fallaron en crecer en agar suave tal como se describe previamente [27]. La transducción de oncogén incrementó el tamaño y número de colonias (figura 2C, D).

Metástasis en pulmón de líneas de célula de cáncer de próstata Se llevaron a cabo estudios de formación de tumor en ratones FVB. Una inyección subcutánea de 1x106 células, dio como resultado el crecimiento del tumor. Se llevaron medidas en serie mediante calibradores vernier. Cada una de las líneas de tumor de próstata creció en forma subcutánea en ratones inmunocompetentes. El crecimiento se sostuvo para PECs transformadas con c-Myc, Ha-Ras y v-Src (figura 3A). Los tumores extirpados fueron hemorrágicos (figura 3B) con características histológicas de adenocarcinoma de próstata diferenciado deficientemente (figura 3C, suplemento 1). El inmunomanchado de tumores para factor Von Willebrand (VWF) confirmó la angiogénesis y demostró un manchado VWF significativamente mayor en tumores inducido mediante Ha-Ras (Suplemento 2A, B). El tumor manchó para CK5, AR, MUC1 y MGK (el homólogo de múrido de PSA) (Suplemento 2C). Se caracterizaron las metástasis en pulmón en la autopsia mediante evaluación histopatológica tal como se describe en la sección de Materiales y Métodos (figura 4A). El número de metástasis en pulmón derivado de las PECs primarias, se incrementó en las sublíneas Ha-Ras, v-Src y c-Myc (figura 4B). Signaturas moleculares específicas de oncogén en líneas de célula de cáncer de próstata Con el objeto de caracterizar en forma adicional las trayectorias de señalización genética molecular reguladas por los oncogenes específicos en células epiteliales de próstata, se preparó el mARN de las líneas de célula PEC transformadas con oncogén. El análisis de microformación identificó un total de 2635 de 22115 genes que fueron alterados significativamente en expresión (al menos un cambio de dos veces) en líneas de célula de sobreexpresión de oncogén, cuando se compararon con muestras de control de célula epitelial de próstata no transformadas (figura 5). El mapa térmico de los genes identificado como significativamente diferente en su expresión (al menos un cambio de 2 veces) se muestra en la figura 5. Las filas del mapa térmico representan genes únicos, y se muestran mediante su patrón de activación y desactivación para las cuatro líneas de células inducidas por oncogén. Se compartió un número considerable de genes activados y desactivados entre las cuatro líneas de células (Grupo 1; 251 genes). Por ejemplo, el Grupo 1 contiene genes que comparten patrones de expresión diferencial a través de las cuatro líneas celulares, mientras que el grupo 15 contiene genes cuya expresión diferencial, es específica de las líneas de célula Src. Los genes con activación y desactivación específica para Ha-Ras, fueron los más prevalentes (Grupo 14; 584 genes), seguido de genes específicos de c-Myc (Grupo 8; 332 genes), genes específicos de NeuT (Grupo 12; 277 genes) y grupos específicos de v-Src (Grupo 15; 215 genes).

La signatura de expresión de oncogén de próstata de múrido en cáncer de próstata humano de alto grado y etapa avanzada Se identificó la "signatura de expresión de oncogén" de la próstata como genes que fueron significativamente alterados en el nivel de expresión, y que fueron alterados en forma única en la expresión a través de un oncogén específico en comparación con células epiteliales de próstata primaria (figura 5). La signatura de expresión de oncogén identificada de esta forma se comparó con las signaturas de gen obtenidas de otras bases de datos publicadas para identificar similitudes con otros fenotipos de enfermedad y líneas celulares bien estudiados. Se llevaron a cabo comparaciones contra signaturas de gen representativas de la expresión diferencial en cáncer de próstata de etapa avanzada versus etapa temprana, cáncer de próstata de grado alto versus grado bajo, cáncer de próstata recurrente versus no recurrente [3]. Los mapas de calor de la signatura de gen que representan los fenotipos de cáncer de próstata de etapa avanzada/etapa temprana, grado alto/grado bajo, y recurrente/no recurrente [3] (figura 6A,B), se muestran en el lado izquierdo, y los mapas de calor en el lado derecho, representan genes que son expresados en forma diferencial en la signatura de expresión de oncogén de próstata. Los mapas térmicos en las figuras 6 a 8, son etiquetados con el porcentaje de genes dentro de la "signatura de expresión de oncogén" que se expresan en forma diferencial. Se muestran los valores P para la significancia estadística de la similitud entre los genes expresados en las líneas de célula de cáncer de próstata, y la signatura de gen de fenotipo de enfermedad. Los valores P están basados en la distribución hipergeométrica y representan la probabilidad que tienen estos genes de ser expresados en forma diferencial en el fenotipo de la enfermedad, si fueron seleccionados en forma aleatoria. Los valores P de bajo nivel indican un grado de similitud entre una línea de célula de oncogén y un fenotipo de enfermedad que no es probable que ocurran meramente de manera oportunista.

Se determinó previamente una signatura de gen de cáncer de próstata de "grado alto" de 61 tumores de próstata primarios [3]. La figura 6A muestra que 34 genes de la signatura de expresión de oncogén de próstata, fueron comunes para la signatura de gen de grado alto (p = 2.97 x 10"5). Para cada línea de célula de cáncer de próstata inducida por oncogén, se muestra la proporción de genes significativos que contribuyen a dicha línea celular. Por ejemplo, el traslape entre la signatura de expresión del oncogén de próstata y la enfermedad de grado alto, incluye una combinación de genes que son genes significativos en c-Myc (47%), NeuT (53%), Ha-Ras (71%) y v-Src (62%). La figura 6B ilustra los 72 genes que fueron comunes entre la signatura de oncogén de próstata y la signatura de gen de etapa avanzada (p= 4.13 x 10~8). Estos resultados indican un grado de similitud significativo entre la signatura de expresión de oncogén y la enfermedad de grado alto (p = 2.97 x 10"s), y entre la signatura de expresión de oncogén y el fenotipo de enfermedad de etapa avanzada (p = 4.13 x 10-8).

No se identificó traslape significativo entre la signatura de expresión de oncogén de próstata y la signatura de enfermedad recurrente/no recurrente identificada por Lapointe et al. [3]. Cuando la signatura de expresión de oncogén de próstata se comparó con los datos de Lapointe, la línea de célula Ha-Ras capturó el nivel de similitud más alto con la enfermedad de grado alto (71%), en tanto que la línea de célula v-Src, mostró la similitud más alta con la enfermedad de etapa avanzada (67%).

La signatura de expresión de gen específica de c-Myc en células epiteliales de cáncer de próstata, se asemeja a la signatura c-Myc en fibroblastos y tumores mamarios En estudios previos, identificamos las signaturas de expresión de gen que fueron específicas para el oncogén utilizado para transformar fibroblastos (células 3T3) que fueron recapitulados en tumores mamarios inducidos por c-Myc o Ha-Ras [28]. La signatura molecular inducida por c-Myc y Ha-Ras definida previamente, se comparó con la signatura de expresión de gen inducida por estos oncogenes en las células epiteliales de cáncer de próstata. Los mapas térmicos en la figura 7A ilustran los genes compartidos entre fibroblastos transducidos con c-Myc (figura 7A), tumores mamarios inducidos con c-Myc (figura 7C) (mapas térmicos de lado izquierdo) y la signatura de expresión de oncogén de próstata inducida por c-Myc (mapas térmicos de lado derecho). Se identificó un traslape significativo entre la signatura de expresión de oncogén de próstata y los genes regulados en forma diferencial mediante transducción c-Myc en fibroblastos de ratón (108 genes, hipergeométrico p = 5.84x10"12) o tumores mamarios (363 genes; hipergeométrico p = 7.5916e-012). Dentro de la signatura de expresión de oncogén de próstata, las líneas de célula c-Myc demostraron la proporción de similitud más grande tanto con los fibroblastos transducidos por Myc (92%) (figura 7A), como con los tumores mamarios inducidos por c- yc (85%) (figura 7C).

Las comparaciones de la signatura de expresión de oncogén de próstata contra fibroblastos transducidos por Ha-Ras (figura 7B). Se identificó un traslape significativo entre la signatura de expresión de oncogén de próstata y los genes expresados en forma diferencial en la transduccion de oncogén Ras en los fibroblastos de ratón (64 genes, hipergeométrico p = 5.65x10"9). Sorprendentemente, las líneas de célula epitelial de próstata transformadas con Ha-Ras mostraron menos características comunes con la signatura de fibroblastos transducida por Ha-Ras (52%) (figura 7C) que las líneas de célula v-Src, c-Myc y NeuT.

Se utilizó una curva característica de operación de receptor (ROC) (figura 7D) para evaluar el potencial de discriminación de PSA y la signatura c-Myc para identificar la enfermedad metastática.

Se han utilizado previamente curvas ROC para evaluar la habilidad de diagnóstico de PSA [29, 30], así como su capacidad para identificar enfermedad metastática [31]. En las muestras PCa MSKCC, la curva ROC de la signatura c-Myc exhibieron mejores características de sensibilidad/especificidad que PSA, tal como es evidente en el área bajo las curvas ROC. El área bajo la curva ROC representa el potencial de una variable para discriminar entre dos condiciones [32], que indican que la signatura c-Myc se desempeña como un mejor discriminador de la enfermedad metastática que los niveles de PSA en suero.

La signatura c-Myc se correlaciona con cáncer de próstata metastático Todas las muestras se obtuvieron de conjuntos de datos de cáncer de próstata públicamente disponibles [11, 20, 33]. Esta comparación muestra que la signatura c-Myc muestra una correlación positiva en un subconjunto de muestras de tumor que es más evidente en tumores de etapa avanzada, y está anticorrelacionado con tejido prostático normal (figura 7E). En contraste, las signaturas Ha-Ras y v-Src son las correlacionadas en forma más consistente con los perfiles de expresión dentro del tejido de próstata normal, y su correlación entre las muestras de tumor es más heterogénea.

Expresión de gen inducida por oncogén de próstata y supervivencia libre de recurrencia en cáncer de próstata humano.

Con el objeto de revisar la relación entre los genes expresados en las líneas de células transformadas de oncogén y los rangos de supervivencia del cáncer de próstata humano, se utilizó un conjunto de datos de microformación previamente publicado de muestras de tumor de próstata humano con un tiempo de supervivencia libre de recurrencia clínico [11]. Los genes en este conjunto de datos publicados que corresponden a los activados en cada una de las cuatro líneas de célula de cáncer de próstata transformadas con oncogén, se utilizaron para asignar las muestras como de alto nivel (25 por ciento superior) o de bajo nivel (75 por ciento inferior). Se utilizó análisis de Kaplan Meier para evaluar la diferencia en la supervivencia libre de recurrencia asociada con la alta expresión versus baja expresión de estos genes. La figura 8A proporciona un mapa térmico que muestra los perfiles de expresión de los genes en las muestras de cáncer de próstata humano del conjunto de datos de Glinsky, que se activó en las líneas de célula de cáncer de próstata transformadas con oncogén. Los genes que fueron altamente expresados en cada una de las cuatro líneas de célula de oncogén de próstata, tuvieron una asociación significativa con un resultado deficiente (p<0.005) (figura 8B,E).

Leyendas de las figuras Figura 1: Establecimientos de Líneas de Célula de Cáncer de Próstata Trasformadas con oncogén Ratones FVB (A) (I), (II) las próstatas se utilizaron para establecer células epiteliales de próstata primarias (PEC) tal como se muestra mediante microscopio de contraste de fase (próstatas ventrales de ratones FVB macho a las 12 semanas de edad). (B) representación esquemática de los métodos mostrados y microscopio de contraste de fase de líneas de célula inducidas con oncogén derivadas de PEC transducida mediante oncogenes distintos (c-Myc, NeuT, Ha-Ras, v-Src). Se seleccionaron y caracterizaron las fotografías de colonias individuales derivadas de la PEC transducida con oncogén. (C) Curvas de crecimiento de líneas PEC determinadas mediante control celular. Los datos son promedio ± SEM de N>3 experimentos separados.

Figura 2: Las líneas PEC transducidas con oncogén forman colonias en agar suave.

(A) Análisis de manchado Western de 3 clones separados de cada PEC inducida con oncogén, muestra los anticuerpos que fueron utilizados para la detección de c- yc, NeuT, Ha-Ras y v-Src, tal como se muestra. Se utilizó GDI como un control de carga de proteína. (B) Ensayos de agar suave de PEC transducida con oncogén. La PEC no trasformada falló en crecer en agar suave. (C), (D) El tamaño (C) y el número (D) de colonias de las líneas PEC transducidas con oncogén se muestran como promedio ± SEM de N>5 experimentos separados.

Figura 3: Líneas de célula epitelial de próstata crecidas en ratones inmunocompetentes (A) Diámetro de tumor PEC, determinado mediante medida de calibrador Vernier, se muestra como los días después de la inoculación en ratones FVB. El diámetro promedio ± SEM para N>5 experimentos separados. Los tumores NeuT crecieron durante 2 semanas, posteriormente disminuyeron en tamaño. (B) Fotografía de tumor representativo derivado de líneas inducidas por oncogén. Los tumores inducidos por NeuT fueron recolectados a los 15 días después de la inyección celular. (C) El manchado con hemotoxilina y eosina y (D) VWF de PEC, demuestra un adenocarcinoma de próstata diferenciado pobremente con vascularidad local.

Figura 4: Tumores de célula epitelial de próstata transformados con oncogén, hacen metástasis hacia el pulmón (A) Manchado con hemotoxilina y eosina de implante post tumor de pulmón de múrido que demuestra el ejemplo representativo de metástasis en el pulmón. (B) La frecuencia de las metástasis en pulmón se detectaron en ratones para los grupos PEC c-Myc, NeuT y v-Src, 5 semanas después de la inyección subcutánea. Los rangos fueron de 100% de frecuencia en los grupos Ha-Ras y v-Src.

Figura 5: Agrupación jerárquica de la expresión de gen de microformación.

(A) Panorama general de la agrupación jerárquica de dos vías de tres clones separados de cuatro líneas de células transformadas con oncogén distintas. Se muestra la comparación con PEC primaria (no transformada). Movimiento de los trazos promedios hacia la estadística de prueba T. Ratones FVB inyectados en forma intravenosa con un número igual de PEC. Los genes expresados en forma diferente se organizaron en patrones de activación y desactivación en cada una de las cuatro líneas de célula de sobreexpresión de oncogén. Los datos son promedio ± SEM de N>3 experimentos separados para un total de N = 30 ratones.

Figura 6. Gen asociado con cáncer de próstata humano de alto grado y etapa avanzada Mapas térmicos de genes que fueron expresados en forma diferente en las cuatro líneas PEC transformadas con oncogén, y genes expresados en forma diferente en cáncer de próstata (A) de alto grado versus bajo grado e (B) etapa avanzada versus etapa temprana [3]. Mapas térmicos del lado izquierdo representan las signaturas de cáncer de próstata de grado alto y de etapa avanzada, en tanto que los mapas térmicos del lado derecho, representan genes que fueron expresados en forma diferente en al menos una de las cuatro líneas de célula de cáncer de próstata. El porcentaje de estos genes que son expresados en forma diferente dentro de cada línea de célula de cáncer de próstata individual, se muestra en las columnas respectivas junto con el valor p para el grado de similitud con los fenotipos de alto grado y etapa avanzada.

Figura 7: La signatura de oncogén específica de c-Myc y Ha-Ras en tumores de próstata, se conserva en fibroblastos Los mapas térmicos de (A) y (B) muestran los genes que son expresados en forma diferente en las líneas de célula de cáncer de próstata inducidas con oncogén y en los fibroblastos transducidos mediante c-Myc y Ha-Ras (línea de célula 3T3) [46]. Los mapas térmicos de lado izquierdo representan las signaturas de gen de fibroblastos transducidos, en tanto que los mapas térmicos de lado derecho representan genes que son expresados en forma diferente en al menos una de las cuatro líneas de células de cáncer de próstata. El mapa térmico de (C) muestra la intersección de genes que son expresados en forma diferente en la línea de célula de cáncer de próstata c-Myc, y en las muestras de tumor mamario de ratón inducido mediante c-Myc respectivas [46]. Los mapas térmicos del lado izquierdo representan las signaturas de gen de muestra de tumor, en tanto que los mapas térmicos del lado derecho representan los genes que son expresados en forma diferente en las líneas de célula de cáncer de próstata. Los valores p mostrados bajo cada mapa térmico de la línea de célula de próstata, representan la significancia del traslape entre los conjuntos de dados de cáncer de próstata y mamario. (D) Curva ROC para la utilidad de la signatura PSA (color naranja) y c-Myc (color verde) para identificar enfermedad metastática. El eje x representa el rango positivo falso ( 1 -especificidad) y el eje-y representa el rango positivo cierto (sensibilidad). La línea punteada representa la capacidad no discriminativa. (E) (A) un mapa térmico ilustra la consistencia entre cada una de las cuatro signaturas de la línea de célula de cáncer de próstata y las muestras en conjuntos de datos de cáncer de próstata MSKCC. El color rojo indica una correlación de Pearson positiva, en tanto que el color azul indica una correlación de Pearson negativa.

Figura 8: Correlaciones de expresión de gen de las líneas de célula de cáncer de próstata transformadas con oncogén con supervivencia libre de recurrencia (A) Perfil de expresión de muestras de cáncer de próstata humano [11] que fueron activadas en las líneas de célula de cáncer de próstata transferidas con oncogén. Las barras a lo largo de la parte inferior del mapa térmico, indican si la muestra tiene una alta expresión (percentil 25 superior) o baja expresión (percentil 75 inferior) con base en los genes activados en cada una de las cuatro líneas de células transformadas con oncogén. Las curvas de Kaplan Meier se muestran para las poblaciones de expresión de alto y bajo nivel para (B) genes activados con c-Myc, (C) genes activados con NeuT, (D) genes activados con Ha-Ras, (E) genes activados con v-Src.

Suplemento 2: Manchado VWF (A) Manchado inmunohistoquímico (IHC) de tumores PEC para VWF como un marcador de neoangiogénesis. Ejemplo representativo de IHC para VWF para cada línea de célula. (B) La concentración relativa de los vasos sanguíneos, se muestra para los cuatro tumores de próstata de ratón inducidos con oncogén. Cuantificación de manchado VWF de tumores de próstata inducidos con oncogén. Los datos son promedio ± SEM para N>3 tumores separados. En el grupo NeuT, la concentración de vaso sanguíneo es menor y la vascularidad Ha-Ras es mayor (p<0.01).

Suplemento 3: Método para elaborar líneas de célula de cáncer de próstata transformadas con oncogén para cultivo de célula epitelial de próstata de ratón.

(A) Cultivo de célula epitelial de próstata de ratón Medio para cultivo primario comprendido de F-12 500ml, 10% FBS, Insulina 5 ug/ml, EGF 10ng/ml, Hidrocortisona 1ug/ml, transferrina 5ng/ml, extracto de pituitaria de bovino 30ug/ml, pen-strep 1X y Gentamicina 1 X. Próstata de ratón derivada de ratones FVB de 12 semanas de edad, próstata ventral, se eliminó, se lavó en PBS, los tejidos de próstata se picaron en un plato de 6 cm durante varios minutos utilizando cuchillas razor. Los tejidos picados se agregaron en 0.5 mg/ml de solución de colagenasa y las placas se colocaron en un incubador a una temperatura de 37°C, 5% C02 durante 16 horas. Los tejidos digeridos se lavaron con PBS, y el pelet de las células resultante se volvió a suspender utilizando el medio, y posteriormente se plantó en placas celulares de 10cm.

(B) Células epiteliales de próstata de ratón transformadas con Plásmidos pBABE-IRES-cMvc. PB ABE-I RES-NeuT. pBABE-IRES-h-RAS. pBABE-IRES-vSrc El gen objetivo pBABE-IRES se transfectó en células 293T mediante precipitación de fosfato de calcio. Se mezcló el ADN y CaCI2 en amortiguador HBS, y la mezcla se elaboró hasta un volumen final de 1 mi, lo cual permitió que permaneciera durante 20 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla se mezcló posteriormente en células 293T, y las células se colocaron en un incubador durante 5 horas, posteriormente se eliminó el medio de incubación y se reemplazó con medio fresco. Después de 48 horas, se recolectó el sobrenadante de las células 293T, se mezcló con un volumen igual de medio fresco, y la mezcla resultante se filtró mediante un filtro de 0.45 um. Posteriormente se agregó a la mezcla polibreno (concentración final 8 ug/ml), la cual posteriormente se agregó en las células epiteliales de próstata que se pasaron una vez. Después de otras 48 horas de infección, el medio fue eliminado y se reemplazó con el medio fresco (DM EM , 10% FBS).

(C) Clones positivos seleccionados A un medio de cultivo comprendido de DMEM, 10% FBS y pen-strep 1X, se le agregó puromicina, y la concentración final se elaboró hasta 1~2ug/ml. Las células se trataron en forma repetida con puromicina durante al menos 1 mes, hasta que se murieron las células negativas, y se dejaron los clones positivos con expresión de oncogén. Cuando los clones fueron lo suficientemente grandes, se recogieron, mediante cilindros de clonación (Specialty Media, cat# TR-1004), y las células se marcaron en forma adecuada. Posteriormente las células se crecieron durante al menos 25 pasajes. Se caracterizaron en los ensayos de crecimiento en agar blando de cultivo celular, implante in vivo, metástasis, microformación e histopatología.

La figura 1 ilustra que las líneas PEC transducidas con oncogén, forman colonias en agar blando. La figura 1 ilustra el microscopio de contraste de fase de líneas de células inducidas con oncogén que fueron transducidas mediante distintos oncogenes (c-Myc, NeuT, Ha-Ras, v-Src). Se seleccionaron y caracterizaron las fotografías de colonias individuales derivadas de PEC transducida con oncogén. La figura 1B ilustra las curvas de crecimiento de las líneas PEC determinadas mediante control celular. Los datos son promedio ± SEM de N>3 experimentos separados. Las figuras 1C y 1D describen el análisis de manchado Western de 3 clones separados de cada PEC inducida con oncogén con anticuerpos, tal como se muestra para la detección de c-Myc, NeuT, Ha-Ras y v-Src, y la figura 1D describe marcadores de cáncer de próstata basal (CK5) versus luminal (CK8). GDI se utiliza como un control de carga de proteína. La figura 1E describe ensayos de agar blando de PEC transducida con oncogén. La PEC no transformada falló en crecer en agar blando. El tamaño (figura 1 E) de las colonias de las líneas (figura 1 F) PEC transducidas con oncogén, se muestran como promedio ± SEM de N>5 experimentos separados.

La figura 2, muestra aberraciones en el número de copias en las cuatro líneas de célula de oncogén evaluadas mediante formación CGH. La figura 2A ilustra el porcentaje de las cuatro líneas celulares que comparten regiones de ganancia y pérdida de copias y se muestra como una función de la posición genómica. La figura 2B ilustra que las regiones de la ganancia (color rojo) o la pérdida (color azul) de copias de cada una de las cuatro líneas celulares, se muestran como una función de la posición genómica. En la figura 2C los oncogenes son identificados con sobre-expresión mARN (rojo), amplificación de ADN (Amarillo) o ambos (púrpura) entre las cuatro líneas de célula de oncogén, con amplificación correspondiente en la base de datos de cáncer de próstata MKSCC (descrito en el lado derecho). En la figura 2D, se identifican los genes supresores de tumor con subexpresión de mARN (azul), pérdida de copias de ADN (rosa) o ambos (naranja) entre las cuatro células de línea de oncogén, con la pérdida de copias correspondiente en la base de datos de cáncer de próstata MKSCC (descritos en el lado derecho). La figura 3 ilustra las líneas de célula epitelial de próstata crecidas en ratones in mu nocom peten tes.

En la figura 3A, el diámetro del tumor PEC determinado mediante medida con calibrador Vernier, se muestra como días después de la inoculación en 30 ratones FVB. El diámetro promedio ± SEM de N>5 experimentos separados. La figura 3B muestra la fotografía del tumor representativo derivado de líneas inducidas con oncogén. Los tumores inducidos con NeuT fueron recolectados a los 15 días de la inyección celular. La figura 3C muestra manchado con hematoxilina y eosina en baja y alta magnificación (ver también los datos suplementarios).

La figura 4 muestra la metástasis en pulmón de tumores de célula epitelial de próstata transformados con oncogén. La figura 4A muestra el manchado con hematoxilina y eosina del implante post-tumor en pulmón de múrido que demuestra el ejemplo representativo de metástasis en pulmón. La figura 4B muestra que la Frecuencia de metástasis en pulmón se detectaron en ratones para los grupos PEC c-Myc, NeuT y v-Src cinco semanas después de la inyección subcutánea. Los rangos fueron 100% de frecuencia con los grupos Ha-Ras y v-Src.

La figura 5 muestra la agrupación jerárquica de la expresión de gen de microformación . La figura 5 A muestra una revisión general de una agrupación jerárquica de dos vías de tres clones separados de cuatro líneas células transformadas con oncogén distintas. La comparación se muestra con PEC primario (no transformado). Los genes expresados en forma diferente se organizan en patrones de activación y desactivación en cada una de las cuatro líneas de célula de sobreexpresión de oncogén. Los datos son promedio ± SEM de N>3 experimentos separados para un total de N = 30 ratones. Mapas térmicos de genes que son expresados en forma diferente en las cuatro líneas PEC transformadas con oncogén y genes expresados en forma diferente en (figura 5B) cáncer de próstata de grado alto versus grado bajo y (figura 5C) de etapa avanzada versus etapa temprana (8). Los mapas térmicos de lado izquierdo, representan las signaturas de cáncer de próstata de grado alto y etapa avanzada, en tanto que los mapas térmicos del lado derecho representan genes que son expresados en forma diferente en las cuatro líneas de célula de cáncer de próstata. Los porcentajes de estos genes que son expresados en forma diferente dentro de cada línea de célula de cáncer de próstata individual, se muestra en las columnas respectivas junto con el valor p para el grado de similitud de los fenotipos de alto grado y etapa avanzada.

La figura 6 muestra signaturas de oncogén específicas de c-Myc- y Ha-Ras en tumores de próstata que se conservan en otros cultivos. Los mapas térmicos muestran genes que son expresados en forma diferente en las líneas de célula de cáncer de próstata inducido con oncogén, y en la figura 6A los fibroblastos Ha-Ras y en la figura 6B los fibroblastos c-Myc (línea de célula 3T3). En la figura 6C A, un mapa térmico muestra la intersección de genes que son expresados en forma diferente en la línea de célula de cáncer de próstata c-Myc y las muestras de tumor mamario de ratón. Los valores p mostrados bajo cada mapa térmico de línea de célula de próstata, representan la importancia del traslape entre las signaturas de tumor de próstata y fibroblasto/mamario. La figura 6D muestra un clasificador con base en el análisis canónico de la signatura c-Myc, que distingue el tumor humano (rojo) del tejido normal (azul claro) a lo largo del eje x, en el conjunto de datos de Lapointe 2004. Las curvas ROC para el desempeño del clasificador se muestran para E) el conjunto de datos de Lapointe 2004 y F) el conjunto de datos de Taylor 2010 MSKCC, con valores AUC de 0.990 y 0.977, respectivamente.

La figura 7 muestra las correlaciones de la expresión de gen de las líneas de célula de cáncer de próstata transformadas con oncogén con supervivencia libre de recurrencia. La figura 7 A, muestra el perfil de expresión de las muestras de cáncer de próstata humano (13) que fueron activadas en las líneas de célula de cáncer de próstata transferidas con oncogén. Las barras a lo largo de la parte inferior del mapa térmico indican sí la muestra tiene alta expresión (25 por ciento superior) o baja expresión (75 por ciento inferior) con base en los genes activados en cada una de las cuatro líneas de células transformadas con oncogén. Las curvas de Kaplan Meier se muestran para las poblaciones de alta y baja expresión para los genes activados con c-Myc (figura 7B).

La figura 8 ilustra las correlaciones de expresión de gen de las líneas de célula de cáncer de próstata transformadas con oncogén con supervivencia libre de recurrencia.

La figura 9 ilustra las características histológicas del adenocarcinoma de próstata pobremente diferenciadas.

Las figuras 10A a 10D demuestran que Src incrementa la invasión de matrigel 3D de las líneas de célula de cáncer de próstata isogénica. Las líneas de célula de cáncer de próstata isogénicas se derivaron de la transducción de las células epiteliales de múrido y epiteliales de próstata en retro viruses que codifican ya sea NeuT, Ha-Ras, o c-Src oncogénico. Tal como se muestra en la figura 10A, estas células llevaron la capacidad de migrar en una lesión con la línea NeuT, con una herida llevando el cierre de la herida más rápido. Aunque la figura 10A ilustra un ensayo de herida de migración celular que muestra la herida, la figura 10B ilustra la cuantif icación de cierre para N = 3 experimentos separados. La figura 10C ilustra el ensayo de invasión 3-D utilizando líneas de célula de cáncer de próstata en matrigel. La figura 10D muestra distancias promedios de invasión ± SE para 3 experimentos independientes para líneas PEC (PEC-NeuT, PEC-Ras, y PEC-Src). Tal como se muestra en las figuras 10C y 10D, la invasión en matrigel fue más eficiente para la línea transducida por el c-Src. El análisis estadístico de los resultados mostrados, se llevó a cabo utilizando la prueba t del estudiante.

Las figuras 11A y 11B demuestran que los tumores de línea de célula de cáncer de próstata isogénico son vasculares. En la figura 11A, se cuantificó el crecimiento de tumor subcutáneo en ratones desprotegidos NCR durante 3 semanas después de la inoculación subcutánea de 1 x 105 células para cada una de las 3 líneas (PEC-NeuT, PEC-Ras, y PEC-Src) utilizando flujo de fotones normalizado para cuantificar el volumen del tumor. Se muestran tamaños promedios ± SEM de 3 experimentos independientes de líneas PEC. Asociada con la actividad de cinasa Src incrementada, las líneas crecieron como tumores subcutáneos en ratones desprotegidos NCR; el tamaño relativo tal como se determina mediante flujo de fotones sugirió un crecimiento más rápido entre las líneas derivadas de Ras. Se llevó a cabo un análisis estadístico de los datos utilizando la prueba t del estudiante.

En la figura 11B, el manchado inmunohistoquímico para el factor Willebrand (WF) mostró vascularidad de las líneas con un manchado VWF incrementado de la línea Ras. En otras palabras, el rango de crecimiento de tumor incrementado de la línea Ras estuvo asociado con angiogénesis incrementada, tal como se evidencia mediante el factor Willebrand incrementado, manchado (VWF).

Las figuras 12A a 12E demuestran que las líneas de cáncer de próstata desarrollan metástasis. Se inyectaron células Tomato-Red en el ventrículo cardiaco izquierdo de 16 ratones para cada línea celular. Se adquirieron imágenes de bioluminiscencia y se cuantificaron 14 días después del xenoinjerto. En la figura 12A se muestran imágenes representativas in vivo de los ratones. Tal como se muestra, al momento de la introducción de tumores en la circulación arterial a través del ventrículo izquierdo del corazón (inyección I.C.) los tumores se desarrollaron rápidamente en múltiples órganos, incluyendo hígado, cerebro, vejiga, glándula suprarrenal y riñon, a las dos semanas de la inyección.

La figura 12B muestra imágenes representativas de metástasis del cerebro en ratones, después de la inyección intracardiaca de las líneas de cáncer de próstata isogénicas. La figura 12C muestra la cuantificación (promedio ± SEM, n = 6) de la Generación de Imágenes mediante Bioluminiscencia (BLI) como una proporción de ratones con tumores. (Se llevó a cabo la comparación estadística utilizando la prueba t del estudiante con corrección de Welch para variedades heterogéneas).

La figura 12D muestra un flujo de fotones total promedio como una medida de carga de tumores cerebro metastática para cada una de las líneas isogénicas (los datos son promedio ±SEM, n = 5).

La figura 12E muestra manchado H&E de metástasis de cerebro formado después de 2 semanas de inyección intracardiaca PEC-Src y PEC-NeuT. Asimismo, el manchado CK14 corroboró la presencia de células epiteliales de próstata dentro del cerebro (flecha).

La emisión fotónica evidenció metástasis en los cerebros de los ratones inyectados con las líneas de célula de cáncer de próstata Ras y Src. Ocurrió una metástasis menos frecuente hacia los cerebros de ratones inyectados con líneas NeuT. La frecuencia relativa a la metástasis entre los ratones, demostró que el 100% de las líneas Ha-Ras y Src desarrollaron tumores en ratones, y la carga de tumor relativa fue de 1 x 10 para Ras, 5 x 108 en c-Src, con 1 x 104 para NeuT. Tal como se muestra en la figura 3E, el análisis histológico de la metástasis del cerebro de ratones inyectados con líneas PEC Ras o Src, mostró que la histología primaria fue adenocarcinoma.

Las figuras 13A a 13C demuestran metástasis en hígado de líneas de célula de tumor de próstata. Las líneas PEC isogénicas que expresan la proteína de fusión Luc2-Tomato-Red fueron inyectadas en el ventrículo de ratones FVB y la señal bioluminiscente in vivo cuantificada. La figura 12A ilustra el porcentaje en ratones con tumores en hígado. La metástasis hepática en los ratones inyectados con líneas PEC Ras y Src, desarrollaron metástasis en el hígado (~100% de los animales). Aunque los tumores NeuT crecieron en forma subcutánea, ninguno desarrolló metástasis en el hígado. La figura 12B ilustra el tamaño de tumor determinado mediante flujo de fotones, y la figura 13C ilustra las imágenes de ratones representativas que muestran metástasis en el hígado.

Se identificaron metástasis en el riñón en los ratones inyectados con líneas derivadas de Ras y Src. La figura 13D, ilustra el porcentaje de ratones con tumores de riñón. La figura 13E ilustra el tamaño de tumores del riñón medíante flujo de fotones, la figura 13F ilustra las imágenes representativas de metástasis en el riñón.

Las figuras 14A a 14C demuestran que las líneas de célula de cáncer de próstata isogénicas desarrollan metástasis en huesos osteolíticos. La figura 14A ilustra imágenes ¡n vivo representativas de ratones FVB que pasaron por inyección intracardiaca de líneas PEC que expresan la proteína de fusión Luc2-Tomato-Red, y se cuantificó la señal bioluminiscente.

Tal como se muestra en la 14A, la metástasis en huesos de los ratones fue osteolítica en su naturaleza. La figura 14B mostró la cuantificación (promedio ± SEM, n = 6) de BLI como una proporción de ratones con tumores. Tal como se ilustra, el 100% de los ratones inyectados con los tumores c-Src desarrollaron metástasis en huesos, el 65% entre los Ha-Ras, y el 15% entre los NeuT. El flujo de fotones en huesos fue dramáticamente incrementado en los tumores c-Src con un flujo de fotones total de 5 x 107 versus Ha-Ras 1 x 106 y NeuT 1 x 104. La figura 14C ilustra el tamaño de la masa de tumor en el flujo de fotones. El análisis histológico de las lesiones en hueso osteolíticas de los tumores de próstata evidenciaron, adenocarcinoma que se asemeja al tumor primario.

Las figuras 15A a 15F demuestran que Src incrementa las metástasis en hueso de cáncer de próstata osteolítico. Los ratones FVB 2 semanas después de la inyección intracardiaca PEC-Src, desarrollaron lesiones en huesos osteolíticas. La figura 15A muestra que un área de tumor en huesos fue incrementada significativamente en el grupo PEC-Src en comparación con PEC-Ras y PEC-NeuT. El área de tumor fue seis veces mayor en c-Src en comparación con tumores cargados con Ras.

La figura 15B ilustra los rayos X representativos antes (tO) y 14 días (t 14 ) después de la inyección intracardiaca de las células. Las áreas de baja densidad localizadas junto con los tumores metastáticos (flechas) indican lesiones osteolíticas. Las lesiones en huesos se encontraron principalmente en la unión epifiseal como lesiones osteolísticas, a las dos semanas.

El análisis histológico confirmó adenocarcinoma en el sitio de la metástasis en huesos. El manchado con fosfatasa de ácido resistente a tartrato ("TRAP") mostrado en la figura 15C, corroboró la presencia de osteoblastos (flechas) en la interfaz de hueso-tumor. La figura 15D muestra el manchado de Eosina de Hematoxilina ("H&E") de metástasis formado posteriormente. Las figuras 15E y 15F, muestran el manchado con citoqueratina (CK) 14 y el manchado CK8 respectivamente, ambos corroborando la presencia de células epiteliales dentro de los huesos.

Las figuras 16A a 16G demuestran que las líneas de célula de cáncer de próstata osteolíticas expresan función CCL5 y receptores de osteopontina ("OPN"). Las figuras 16A a 16D muestran el análisis de Clasificación de Célula Activado por Fluorescencia ("FACS") de la expresión CCR5 en líneas PEC. Tal como se muestra, el análisis FACS utilizando un anticuerpo específico CCR5, confirmó la presencia del receptor CCR5 en líneas PEC.

Las figuras 16E y 16F muestran los resultados de los ensayos de invasión de Matrigel de la línea PEC-Src conducidos utilizando OPN como el ligando CD44, y CCL5 como el ligando CCR5, y se cuantificaron como promedio + SEM (figura 16 G). Tal como se muestra en las figuras 16D y 16E, la adición de OPN o CCR5 incrementó la invasividad de PEC en matrigel. Para la comparación con el tejido, la expresión de gen del tumor in vivo en la PEC transformada con oncogén, se comparó con la expresión in vivo en la próstata ventral dorsolateral de ratones con la misma cepa. La figura 16F muestra el receptor de quimiocina y la expresión del gen de ligando de las líneas de célula de tumor de próstata en célula de cultivo de tejido. Y la figura 16G muestra el receptor de quimiocina y la expresión del gen del ligando de líneas de célula de tumor de próstata después de implante subcutáneo. La expresión de gen mostró una notable activación de in vivo de la citocina y quimiocinas. Se observó la activación específica de CCR5 y CCR2 en las líneas PEC c-Myc, NeuT y Src. Se observó la activación de los ligandos de receptor CCL2, CCL7, y CCL8 (2 a 3 veces). CCL7, CCL8 y CCL5 son ligandos para CCR5, CCL8 y CCL5 para CCR1 (figura 15H). Estos estudios indican la inducción del receptor de citocina y la expresión del ligando en tumores PEC in vivo en comparación con el cultivo del tejido marcado en el cuadro rojo.

Por consiguiente, el perfil de expresión de gen basado en microformación mostró la activación de un módulo de señalización CCR5, cuando las líneas PEC se crecieron in vivo versus cultivo de tejido.

CCL2 enlaza a CCR2 y CCR4. Debido a que CCR5 y sus ligandos CCL5, CCL7 y CCL8 fueron inducidos en la PEC in vivo, se revisó el efecto del antagonista CCR5 en el crecimiento de tumor de próstata.

Las figuras 17A a 17D demuestran que los antagonistas CCR5 bloquean la metástasis de cáncer de próstata osteolítica espinal. Las líneas PEC transducidas con vectores que expresan la proteína de fusión Luc2-Tomato-Red, se inyectaron al ventrículo de ratones FVB y se cuantificó después de 2 semanas de señal de bioluminiscente in vivo. Los ratones se trataron con maraviroc oral (8 mg/kg) o control. La figura 17A ilustra los ejemplos representativos de ratones de cada grupo. La figura 17B ilustra el flujo de fotones como un análisis volumétrico de la masa de tumor total, y la figura 17C ilustra la masa de huesos en extremidad inferior en los ratones. Los datos mostrados son promedios de + SEM de N = 8 ratones separados en cada grupo, P< 0.05.

Tal como se muestra en las figuras 17A y 17B, el antagonista CCR5 Maraviroc (8 mg/kg oral), redujo la carga metastática total en el cuerpo en un >50%, y redujo la metástasis en huesos en un >50% (ver figuras 17C y 17D). Además, las imágenes de Fluorine-18, Fluoruro de sodio ("F-18- NaF") correlacionadas con el análisis de rayos X, demostró la presencia de metástasis espinal (figuras 18A-18H). El tratamiento oral diario con Maraviroc redujo la metástasis espinal en un >90% (figuras 19A a 19B).

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Liu, M., et al., p21C1P1 attenuates Ras- and c-Myc-dependent breast tumor epithelial mesenchymal transition and cáncer stem cell-like gene expression in vivo (p21 C1 P1 atenúa la transición mesenquimal epitelial de tumor de seno dependiente de ratas y c-Myc, y la expresión de gen tipo célula madre de cáncer in vivo). Proc Nati Acad Sci U S A, 2009. 106(45): p. 19035-9. 45. Irizarry, R.A., et al., Summaries of Asymetrix GeneChip probé level data (Resúmenes de los datos de nivel de sonda de Asymetrix GeneChip). Nucleic Acids Res, 2003. 31(4): p. e15. 46. Huang, E., et al., Gene expression phenotypic models that predict the activity of oncogénic pathways (Modelos fenotípicos de expresión de gen que anticipan la actividad de trayectorias oncogénicas). Nat Genet, 2003. 34(2): p. 226 - 230. 47. 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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una línea celular de cáncer de próstata de mamífero que comprende al menos una o un conjunto de células epiteliales de mamífero primarias que han sido infectadas con un vector retroviral que llevan un oncogén seleccionado del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos, y en las cuales se expresa el gen.

2. La línea celular de cáncer de próstata de mamífero tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizada porque las células epiteliales de mamífero primarias comprenden células epiteliales de múrido primarias.

3. La línea celular de cáncer de próstata de mamífero tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque las células epiteliales de mamífero primarias se derivan de un ratón inmunocompetente o ratones inmunocompetentes.

4. Un modelo animal de cáncer de próstata humano que comprende un mamífero no humano inmunocompetente implantado con la línea célula de cáncer de próstata de mamífero tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3. 5.

5. El modelo animal tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque el mamífero no humano se selecciona del grupo que consiste en roedores, tales como ratas, cerdos de guinea y ratones; y animales de granja, tales como cerdos, ovejas, cabras, caballos y ganados.

6. El modelo animal tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque el mamífero no humano es un roedor.

7. El modelo animal tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque el mamífero no humano es un ratón.

8. El modelo animal tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 6, caracterizado porque el mamífero no humano es un ratón FVB/N.

9. Un ratón transgénico inmunocompetente que desarrolla un tumor de próstata, en donde el tumor de próstata produce una signatura genética molecular característica de uno o más de un conjunto de oncogenes seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos.

10. Un método para la producción in vitro de células epiteliales de mamífero primarias inmortalizadas tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3, en donde el método comprende infectar células epiteliales de mamífero primarias con un vector retroviral que lleva un oncogén seleccionado del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos para proporcionar células infectadas, en donde las células epiteliales de mamífero primarias tienen la capacidad de ser infectadas mediante el vector retroviral, y bajo condiciones mediante las cuales c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos, se expresan en las células infectadas.

11. Un método para diagnosticar cáncer de próstata en un sujeto que padece cáncer de próstata o se sospecha que tiene cáncer de próstata, o que está en riesgo de desarrollar cáncer de próstata, en donde el método comprende. (a) proporcionar una muestra de prueba biológica en un sujeto que padece de cáncer de próstata o que se sospecha tiene cáncer de próstata o está en riesgo de desarrollar cáncer de próstata; (b) determinar el nivel de al menos un marcador biológico con base en el patrón de expresión de gen en una muestra de prueba biológica obtenida del sujeto, en donde el patrón de expresión de gen está asociado con un conjunto de uno o más oncogenes seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos; (c) comparar el nivel de al menos un marcador biológico en la muestra de prueba biológica con un nivel de marcador biológico en la muestra de control, en donde un nivel elevado de marcador biológico en la muestra de prueba relativo al nivel del marcador biológico en la muestra de control, es un indicador de diagnóstico de la presencia de cáncer de próstata en el sujeto.

12. El método para diagnosticar cáncer de próstata tal como se describe en la reivindicación 11, caracterizado porque el material se deriva de cáncer de próstata o de biofluidos relacionados con la próstata, incluyendo próstata, orina y sangre.

13. Un método para clasificar un cáncer/tumor de próstata en una subclase de cáncer de próstata distinta, que tiene un patrón de expresión de gen característico de un conjunto de uno o más oncogenes seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra de cáncer/tumor de próstata; (b) detectar un marcador genético molecular derivado de un patrón de expresión de gen, o la actividad del conjunto de uno o más oncogenes en la muestra, (c) clasificar el tumor de próstata como perteneciendo a una subclase de cáncer/tumor con base en los resultados del paso de detección (b).

14. El método para clasificar un cáncer/tumor de próstata tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el paso de clasificación del paso (c) comprende correlacionar el marcador genético molecular en la muestra, con un grado histopatológico del cáncer de próstata .

15. El método para clasificar el cáncer/tumor de próstata tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la subclase de cáncer de próstata tiene un patrón de expresión de gen característico del oncogén c-Myc.

16. El método para clasificar una cáncer/tumor de próstata tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la subclase de cáncer de próstata tiene un patrón de expresión de gen característico del oncogén Ha-Ras.

17. El método para clasificar una cáncer de próstata /tumor tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la subclase de cáncer de próstata tiene un patrón de expresión de gen característico del oncogén NeuT.

18. El método para clasificar una cáncer de próstata /tumor tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la subclase de cáncer de próstata tiene un patrón de expresión de gen característico del oncogén c-Src.

19. Un método para estratificar un sujeto que tiene un tumor de próstata para una prueba clínica, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra derivada del sujeto que tiene un tumor de próstata; (b) detectar una signatura genética molecular derivada del patrón de expresión de gen o la actividad de uno o más del conjunto de genes en la muestra, en donde los genes son seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos; y (c) estratificar al sujeto para una prueba clínica con base en los resultados del paso de detección (b).

20. El método tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el paso de estratificación en (c) se realiza después de comparar los resultados del paso de detección en (b), con los resultados obtenidos de la muestra de control.

21. Un método para seleccionar un tratamiento para un sujeto que tiene un cáncer/tumor de próstata, en donde el método comprende: (a) proporcionar una muestra derivada del sujeto que tiene un cáncer/tumor de próstata; (b) detectar una signatura genética molecular derivada del patrón de expresión de gen o actividad de uno o más del conjunto de genes en la muestra, en donde los genes son seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos; y (c) seleccionar un tratamiento con base en los resultados del paso de detección (b).

22. El método tal como se describe en la reivindicación 21, caracterizado porque el paso de selección en (c) se realiza después de comparar los resultados del paso de detección en (b) con los resultados obtenidos en una muestra de control.

23. Una célula de origen no natural producida transformando una célula con uno o más oncogenes exógenos, que permiten que las células se divida al menos una vez, en donde la célula es una célula humana transformada por un vector que contiene los oncogenes exógenos, en donde el uno o más oncogenes exógenos son seleccionados del grupo que consiste en c-Myc, Ha-Ras, NeuT, c-Src y combinaciones de los mismos.

24. La célula de origen no natural tal como se describe en la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es una célula epitelial de mamífero primaria.

25. Un método para seleccionar un tratamiento para un sujeto con cáncer, en donde el método comprende: (a) determinar un nivel de expresión de ácidos nucleicos que corresponden que codifican la signatura de gen aquí descrita o una modificación de los mismos, en una muestra obtenida de un sujeto que necesita de tratamiento de cáncer, y (b) seleccionar un tratamiento para el sujeto con base en la signatura de gen determinada, en donde la signatura de gen se deriva de un oncogén seleccionado del grupo que consiste en c-Myc, Ras, ErbB2 y Src.

26. Un método para determinar si un sujeto humano que tiene cáncer de próstata está sufriendo, o está en riesgo de desarrollar metástasis, en donde el método comprende: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto humano que tiene cáncer de próstata o está en riesgo de desarrollar cáncer de próstata; y (b) determinar el nivel de expresión de CCR5 y/o de al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, CCL5, CCL8, CCL7) en la muestra, en donde el nivel de expresión de CCR5 y/o de al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, CCL5, CCL8, CCL7) en la muestra, si es mayor a un nivel de expresión de control, indica que es probable que el sujeto humano sufra de o esté en riesgo de desarrollar metástasis.

27. Un método para prevenir cáncer o inhibir metástasis de cáncer susceptible a tratamiento en un sujeto en riesgo de desarrollar cáncer o metástasis, en donde el método comprende administrar al sujeto que necesita del mismo un antagonista CCR5.

28. El método tal como se describe en la reivindicación 27, caracterizado porque el antagonista CCR5 es Maraviroc o vicriviroc.

29. El método tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 27 o 28, caracterizado porque el antagonista CCR5 inhibe metástasis de tumor en uno o más órganos seleccionados del grupo que consiste en hígado, cerebro, vejiga, pulmón, glándula suprarrenal, riñón, huesos y combinaciones de los mismos.

30. Un método para identificar un compuesto candidato que interfiere selectivamente con la proliferación o viabilidad de una célula de cáncer, que tiene niveles elevados de CCR5 y/o de al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, CCL5, CCL8, CCL7), en donde el método comprende: contactar un compuesto candidato con una célula de cáncer que tiene niveles elevados de CCR5 y/o de al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, CCL5, CCL8, CCL7) y si está disminuida la proliferación o viabilidad de la célula de cáncer que tiene los niveles elevados de CCR5 y/o de al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, CCL5, CCL8, CCL7), en comparación con una célula de control que no tienen niveles elevados de CCR5 y/o de al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, CCL5, CCL8, CCL7), entonces identificar el compuesto candidato como un compuesto que interfiere con la proliferación o viabilidad de la célula de cáncer que tiene los niveles elevados de CCR5 y/o de al menos uno de sus ligandos (por ejemplo, CCL5, CCL8, CCL7).

31. Un método in vivo para desactivar la expresión de CCR5 en un conjunto de una o más líneas de célula de cáncer de próstata derivadas de la transducción de células epiteliales de múrido y epiteliales de próstata en retroviruses que codifican al menos un oncogén seleccionado del grupo que consiste en NeuT, Ha-Ras, c-Src y combinaciones de los mismos, en donde el método comprende: (a) administrar un compuesto candidato o modelo animal tal como se describe en cualquiera de las reivindicaciones de la 4 a la 8; (b) y medir el nivel de expresión de ARN CCR5 o proteína en el modelo animal, en donde el nivel de expresión de CCR5 en el modelo animal es menor que el nivel de expresión en el CCR5 en un modelo animal de control no tratado con el compuesto candidato.