MX2013003609A - Metodos para diagnosticar la enfermedad de lyme. - Google Patents

Abstract

Se proporciona un método para diagnosticar un estado de la enfermedad de Lyme en un mamífero. El método causa, en una muestra biológica obtenida o derivada de un mamífero, determinar anticuerpos para las proteínas de superficie externa de Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi), (Osp) OspA, OspC, y OspF. Basándose en la determinación de los anticuerpos OspA, OspC, y OspF, el mamífero puede ser diagnosticado, ya sea vacunado, no vacunado, infectado o no infectado por B. Burgdorferi. También se pueden identificar mamíferos que tienen infección temprana, intermedia o crónica por B. Burgdorferi. El método es particularmente adecuado para usarse con caballos y perros. También se proporcionan antígenos aislados o recombinantes de B. Burgdorferi y composiciones que los contienen.

Description

METODOS PARA DIAGNOSTICAR LA ENFERMEDAD DE LYME REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 61/386,694, presentada el 27 de septiembre, 2010, cuya descripción se incorpora aquí para referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere generalmente al diagnóstico de la enfermedad de Lyme, y más particularmente a determinar varias etapas de la enfermedad de Lyme en mamíferos, tales c orno equinos y caninos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La enfermedad de Lyme es causada por infección con espiroquetas del grupo sensu lato Borrelia burgdorferi. Es una enfermedad son zoonótica que afecta a seres humanos, perros, caballos y otras especies mamíferas. Las bacterias se transmiten a los huéspedes mamíferos por garrapatas infectadas (Ixodes spp.). La enfermedad de Lyme es la enfermedad transmitida por vector más omún de los Estados Unidos, Europa y Asia. En Europa y Asia la enfermedad es comúnmente causada por B. garinii y B. afzelli, mientras en los Estados Unidos están presentes cepas sensu stricto de B. burgdorferi . En métodos actuales para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme, los anticuerpos en suero para lisados de B. burgdorferi enteros o antígenos individuales de la espiroqueta se analizan comúnmente para identificar perros y caballos que estuvieron expuestos al patógeno y están en riesgo de desarrollar la enfermedad. En perros y caballos, la detección de anticuerpos en suero de B. burgdorferi puede realizarse por ELISA seguido por tinción Western (WB), que es un procedimiento inadecuado que sin embargo se considera el estándar de oro para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme humana. Aunque ciertas pruebas están disponibles (tales como pruebas de resorte para detectar el dominio invariable IR6 del antígeno de superficie variable VIsE de B. burgdorferi para perros y caballos), carecen de un nivel deseable de sensibilidad y no se puede distinguir entre varias etapas de la enfermedad. De esa forma, existe una necesidad continua y no satisfecha de métodos mejorados para diagnosticar la enfermedad de Lyme en mamíferos, incluyendo pero no necesariamente limitado a caballos y perros. La presente invención satisface estas y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método para diagnosticar un estado de la enfermedad de Lyme en un mamífero. El método comprende, en una muestra biológica obtenida o derivada del mamífero, determinar la presencia o ausencia de anticuerpos para proteínas de superficie exterior de Borrelia burgdorferi (S. burgdorferi) (Osp) OspA, OspC, y OspF, y basado en la presencia o ausencia de los anticuerpos, identificar al mamífero como infectado o no infectado con B. burgdorferi. El método incluye determinar si el animal ha sido vacunado o no contra ß. burgdorferi. El método permite discriminar entre varias etapas de la enfermedad de Lyme, es decir, infección de B. burgdorferi temprana, intermedia o crónica, basado en la terminación de la presencia o ausencia de los anticuerpos. En una modalidad, el mamífero es identificado como no infectado con B. burgdorferi al determinar una ausencia de los anticuerpos para los antígenos OspA, OspC y OspF. En una modalidad, los únicos anticuerpos para antígenos B. burgdorferi determinados en el método son anticuerpos para B. burgdorferi OspA, OspC, y OspF.

El método es adecuado para determinar la presencia o la ausencia de los anticuerpos utilizando cualquier sistema o dispositivo adecuado. En varias modalidades, los anticuerpos se determinan utilizando un dispositivo de flujo lateral o un ensayo múltiple basado en perla fluorescente.

La invención incluye determinar un nivel de prueba de anticuerpos para B. burgdorferi OspA, OspC, y OspF, y basándose en una comparación del nivel de prueba de los anticuerpos OspA, OspC, y OspF para la referencia, identificar al mamífero como vacunado contra ß. burgdorferi y/o como teniendo una infección de B. burgdorferi temprana, intermedia o crónica. En una modalidad, la referencia es un rango de valores para intensidades de fluorescencia media.

En un aspecto específico de la invención, el método comprende: i) identificar al mamífero como vacunado contra pero no infectado por B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspA y una ausencia de anticuerpos para OspC u OspF; ii) identificar al mamífero como teniendo una infección temprana de ß. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspC y una ausencia de anticuerpos para OspA y OspF; ¡ii) identificar al mamífero como teniendo infección crónica de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspF y una ausencia de anticuerpos para OspA y OspC; iv) identificar al mamífero como vacunado contra y que tiene una infección temprana de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspA y OspC y una ausencia de anticuerpos para OspF; v) identificar al mamífero como vacunado contra y que tiene una infección crónica de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspA y OspF y una ausencia de anticuerpos para OspC; vi) identificar al mamífero como teniendo una infección intermedia de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspC y OspF y una ausencia de anticuerpos para OspA; o vii) identificar al mamífero como habiendo sido vacunado contra y teniendo una infección intermedia de B. burgdorferi basado en determinar la presencia de anticuerpos para OspC, OspF y OspA.

También se incluyen composiciones y equipos que comprenden proteína aislada novedosa que comprende proteínas de 6. burgdorferi y ácidos nucleicos aislados que los codifican.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1: proteínas OspA (A), OspC (B) y OspF (C) de B. burgdorferi recombinante purificado y su detección utilizando sueros de perros vacunados e infectados por inmunotinción. Paneles izquierdos, las proteínas recombinantes se separaron por 15% de SDS-PAGE bajo condiciones de reducción y se tiñéron con Azul Brillante Coomassie (1 = marcador de peso molecular; 2 = proteína B. burgdorferi recombinante purificada). Paneles derechos: las proteínas entonces se transfirieron a membranas de cloruro de polivinilideno (PVDF) por WB y se incubaron con sueros caninos que se presentaron en un WB de lisado de célula B. burgdorferi entera convencional (3 = suero positivo; 4 = suero negativo).

Figura 2: correlación de resultados de ensayo individual (análisis de perla individual) y múltiple para el análisis de anticuerpos de suero para antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi. Se utilizaron un total de 79 sueros caninos para la comparación. Los datos se codificaron por color de acuerdo con los rangos de interpretación negativa (círculos blancos), equívocos (círculos grises) y positivos (círculos negros) determinados en el Cuadro 3. Se calcularon correlaciones de clasificación de Spearman para cada uno de los antígenos. MFI = intensidad fluorescente media.

Figura 3: WB convencional para la detección de anticuerpos para B. burgdorferi en suero canino. Se separó un lisado d e célula de B. burgdorferi entero en un 12% de gel SDS bajo condiciones de reducción. Las proteínas se transfirieron por WB. La membrana de tinción se bloqueó con 5% de leche y entonces se incubó con diferentes sueros caninos. Se utilizó un anticuerpo de inmunoglobulina anti-canino conjugado de peroxidasa secundaria para la detección seguido por un sustrato cromogénico. Carril 1, = marcador de peso molecular; carril 2 = suero de un perro infectado; carril 3 = suero de un perro vacunado; carril 4 = suero canino negativo. Las flechas delgadas apuntan a proteínas indicativas para infección de 22, 28, 29, 30 y 39 kDa, respectivamente. La flecha en negritas muestra la proteína de 31 kDa que confirma la vacunación del perro.

Figura 4: comparación de resultados de WB (lisado bacteriano entero) y análisis múltiple para antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi. Se probó un total de 188 sueros caninos por WB y se agruparon como WB negativo (neg) o WB positivo (pos) para cada antígeno. Se compararon los resultados de ensayo múltiple para los grupos de WB neg y WB pos utilizando pruebas de Mann-Whitney. MFI = intensidad fluorescente media.

Figura 5: curvas operativas de receptor (ROC) para la detección de anticuerpos de suero para antígenos OspA, OspC y OspF de fí. burgdorferi mediante ensayo múltiple. Los resultados del ensayo múltiple se compararon para cada antígeno para la presencia o ausencia de anticuerpos de suero a la proteína de ß. burgdorferi correspondiente detectada por WB. Los resultados de 188 muestras de suero canino se compararon para cada curva ROC. Las áreas bajo la curva (líneas en negritas) son de 0.93 para OspA, 0.82 para OspC y de 0.89 para OspF. Las curvas punteadas muestran los intervalos de 95% de confianza. (Las flechas muestran línea en negrita; dos líneas que rodean la línea en negrita: líneas 'punteadas').

Figura 6: análisis de anticuerpos en suero equino para la detección de proteínas de B. burgdorferi mediante tinción Western. Un lisado de célula entera de S. burgdorferi s e separó a través de SDS -PAGE y se transfirieron proteínas a membranas de nitrocelulosa por tinción Western. El carril (1) muestra el marcador de peso molecular. Los carriles restantes se tiñeron con (2) suero de caballos infectados con B. burgdorferi, (3) suero de un caballo no infectado, o (4) suero de un caballo que se vacunó contra la enfermedad de Lyme. Los sueros de caballos infectados y vacunados muestran un patrón de detección característico. Los anticuerpos para OspC, OspF y también los antígenos de 28, 30 y 39 kDa son indicadores de infección, mientras se considera que OspA es un marcador para caballos vacunados.

Figura 7: comparación de resultados individuales y múltiples para anticuerpos para los antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi detectados en 81 muestras de suero equino. Se expresaron resultados de ensayo múltiple como intensidades de florescencia media (MFI). Se calcularon correlaciones de clasificación de Spearman (rsp) para cada una de las comparaciones.

Figura 8: tinción Western (WB) y resultados múltiples (MFI) para anticuerpos para los antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi se compararon en 562 muestras de suero equino. Se observó un aumento claro en los valores de MFI para los tres ensayos basados en perla utilizando sueros positivos WB comparados con muestras negativas WB indicadas por valores p de <0.0001.

Figura 9: ilustración de una modalidad de un ensayo múltiple para I a d etección de anticuerpos para B. burgdorferi. (1) Antigenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi recombinantes se acoplaron a perlas fluorescentes. (2) Muestras (por ejemplo, suero, CSF u otros fluidos corporales) se incubaron con tres perlas fluorescentes simultáneamente. (3) Se agregó un anticuerpo de inmunoglobulina específico de anti-especies biotinilado al ensayo. (4) Se agregó estreptavidina-ficoeritrina como un tinte de como un tinte reportero. El ensayo entonces se midió en un analizador múltiple que detecta el código de perla fluorescente y el tinte reportero para cada ensayo de perla individual.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método para diagnosticar un estado de la enfermedad de Lyme en un mamífero. En general, el método comprende, en una muestra biológica obtenida derivada de un mamífero, determinar anticuerpos para de proteínas de superficie exterior (Osp) de Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi), OspA, OspC, y OspF. Basándose en determinar los anticuerpos OspA, OspC, y OspF, el mamífero puede diagnosticarse como infectado o no infectado con B. burgdorferi. En varias modalidades, el método proporciona la identificación de un mamífero como habiendo sido vacunado contra B. burgdorferi y/o como teniendo una infección temprana, intermedio crónico de B. burgdorferi. La invención también proporciona composiciones que comprenden proteínas de 8. burgdorferi aisladas novedosas y fragmentos de las mismas.

"Estado" de enfermedad de Lyme como se utiliza aquí se refiere a un perfil de anticuerpo mamífero con respecto a anticuerpos que específicamente reconocen OspA, OspC, y OspF de B. burgdorferi. Determinar el estado de enfermedad de Lyme puede incluir una determinación que el mamífero cae en una de las siguientes categorías: i) vacunado contra pero no infectado por B. burgdorferi; ii) que tiene una infección temprana de B. burgdorferi; iii) que tiene infección crónica de B. burgdorferi; iv) vacunado contra y que tiene una infección temprana de B. burgdorferi; v) vacunado contra y que tiene una infección crónica de B. burgdorferi; vi) que tiene una infección intermedia de B. burgdorferi; vii) que ha sido vacunado contra y que tiene una infección intermedia de B. burgdorferi; o viii) que no ha sido vacunado contra B. burgdorferi y que no tiene una infección de B. burgdorferi. Como se utiliza aquí, la infección "temprana" significa una infección que tiene 2 a 6 semanas. Una infección "crónica" o "tardía" significa una infección que tiene 5 meses o más. Una infección intermedia es una infección que es de 6 semanas a 5 meses.

El método de la invención es útil para determinar un estado de la enfermedad de Lyme en cualquier mamífero. En modalidades particulares, el mamífero es un ser humano, un equino, un canino o un ser humano. Los equinos incluyen miembros de la familia taxonómica Equidae. En ciertas modalidades, el equino diagnosticado de acuerdo con la invención es un caballo. Los caninos incluyen miembros de la familia taxonómica Canidae. En ciertas modalidades, el canino diagnosticado de acuerdo con la invención es un perro, tal como un perro domesticado.

La muestra biológica probada en el método puede ser cualquier muestra biológica que se esperaría que contenga anticuerpos. La muestra biológica es preferiblemente un líquido biológico. En varias modalidades, la muestra biológica comprende sangre, suero, o fluido cerebroespinal (CSF). La muestra biológica puede obtenerse del mamífero utilizando cualquier técnica adecuada y puede utilizarse directamente al determinar la presencia o ausencia de los anticuerpos. Alternativamente, la muestra puede derivarse de la muestra biológica al someterla a un paso de procesamiento, tal como un paso de procesamiento realizado para aislar o purificar sangre, suero, CSF, o componentes de cualquier líquido biológico.

En general, el estado de la enfermedad de Lyme puede valorarse de acuerdo con la invención utilizando la matriz descrita en el Cuadro 1, en donde " + " significa una presencia de anticuerpos que reconocen específicamente el antigeno Osp indicado y "-" significa una ausencia de tales anticuerpos.

CUADRO 1 La matriz descrita en el Cuadro 1 se generó de probar y validar numerosas muestras biológicas obtenidas de una multitud de caballos y perros como se apreciará más completamente a partir de la descripción de los Ejemplos a continuación.

El Cuadro 1 ilustra un resumen de datos que resaltan varios aspectos útiles no limitantes de la invención. Por ejemplo, está claro a partir del Cuadro 1 que la presencia o ausencia de anticuerpos para cada uno de OspA, OspC y OspF es importante para proporcionar una valoración definitiva del estado de enfermedad de Lyme. En particular está claro que determinar anticuerpos para OspA sólo puede proporcionar un positivo falso para la infección de B. burgdorferi , y también puede proporcionar un resultado negativo falso para infecciones tempranas y crónicas. De forma similar, determinar únicamente una ausencia de anticuerpos para OspA y una ausencia de anticuerpos para OspC puede generar un resultado de falso negativo para infección crónica. Además, un diagnóstico definitivo de no haber sido infectado y no haber sido vacunado puede hacerse al determinar una ausencia de anticuerpos para cada uno de OspA, OspC, y OspF, sin tener que determinar cualquier otro anticuerpo o indicador de infección de ß. burgdorferi. De esa forma, el reconocimiento de determinar el estado de anticuerpos dirigidos a los tres antígenos de OspA, OspC, y OspF es una característica importante de la invención y proporciona un beneficio inesperado sobre pruebas previamente disponibles. Con respecto a esto, la invención puede practicarse al determinar anticuerpos para OspA, OspC, y OspF únicamente, y por lo tanto no determinar anticuerpos para cualquier otro antígeno de B. burgdorferi . En una modalidad de la invención, los anticuerpos para una proteína BBK32 no se determinan. La proteína BBK32 se describe en la publicación de patente de E.U.A. no. 20060034862, de la cual la descripción de proteínas BBK32 y la descripción de anticuerpos dirigidos a tales proteínas se incorpora aquí para referencia.

En una modalidad, el método proporciona el diagnóstico de un estado de la enfermedad de Lyme en un mamífero al determinar la presencia o ausencia anticuerpos específicos para OspA, OspC, y OspF, que comprende: i) identificar al mamífero como vacunado contra pero no infectado por B. burgdorferi basado en anticuerpos de determinación para OspA y una ausencia de anticuerpos para OspC u OspF; ii) identificar al mamífero como teniendo un infección temprana de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspC y una ausencia de anticuerpos para OspA y OspF; iii) identificar al mamífero como teniendo infección crónica de ß. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspF y una ausencia de anticuerpos para OspA y OspC; iv) identificar al mamífero como vacunado contra y que tiene un infección temprana de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspA y OspC y una ausencia de anticuerpos para OspF; v) identificar al mamífero como vacunado contra y que tiene una infección crónica de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspA y OspF y una ausencia de anticuerpos para OspC; vi) identificar al mamífero como teniendo una infección intermedia de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspC y OspF y una ausencia de anticuerpos para OspA; vii) identificar al mamífero como habiendo sido vacunado contra y que tiene una infección intermedia de B. burgdorferi basado en determinar la presencia de anticuerpos para OspC, OspF y OspA; o vi i¡) identificar al mamífero como no habiendo sido v acunado contra B. burgdorferi y no teniendo una infección de B. burgdorferi basándose en una ausencia de anticuerpos para OspC, OspF y OspA.

En varios aspectos de la invención, los anticuerpos OspA, OspC, y OspF pueden considerarse anticuerpos de prueba. Con el fin de determinar un estado de la enfermedad de Lyme, los niveles de anticuerpos de prueba determinados de una muestra biológica obtenida o derivada de un mamífero pueden compararse con una referencia.

En una modalidad, la invención proporciona un método para diagnosticar un estado de la enfermedad de Lyme en un mamífero que comprende, en una muestra biológica obtenida derivada del mamífero, determinar un nivel de prueba de anticuerpos para OspA, OspC, y OspF de B. burgdorferi, y basado en una comparación del nivel de prueba de los anticuerpos OspA, OspC, y OspF para una referencia, que identifica al animal como vacunado contra B. burgdorferi y/o como teniendo una infección temprana, intermedia o crónica de B. burgdorferi.

En una modalidad, la referencia se utiliza para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos en la muestra de prueba. También puede utilizarse una referencia para obtener un estimado del nivel de anticuerpos de prueba. La referencia puede establecerse en paralelo con la muestra de prueba, puede ser preestablecida o establecida en un tiempo posterior.

Generalmente, se obtienen valores de referencia al utilizar diferentes cantidades pero conocidas de la variable de interés (es decir, anticuerpos y/o antígenos, según sea el caso) y pueden obtenerse mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La referencia puede ser un solo valor o un rango de valores. Por ejemplo, una referencia puede ser una curva estandarizada o un área en una gráfica. En una modalidad particular, una referencia puede obtenerse utilizando un antígeno conocido para el cual se esperaría que reconocieran anticuerpos en la muestra. El antígeno es preferiblemente el antígeno que se utilizará para determinar anticuerpos en una muestra de prueba. Al exponer uno o más niveles del antígeno a uno o más niveles de anticuerpos esperados para estar en la muestra, puede establecerse un valor individual de referencia, un rango de valores, una gráfica, etc.

En una modalidad, la referencia puede comprender un control positivo. En una modalidad, el control positivo está localizado sobre o en la misma plataforma que la utilizada para la muestra de prueba. Por ejemplo, el control positivo puede estar presente en un dispositivo de flujo lateral en el cual también se colocan uno o más antígenos distintos en distintas ubicaciones y/o niveles. Esta configuración proporciona una señal de la referencia de control bajo condiciones de prueba sin importar si están presentes o ausentes anticuerpos de prueba en la muestra que se analiza, y puede proporcionar una confirmación que la prueba está funcionando apropiadamente. El control positivo puede, por ejemplo, producir una señal que es perceptible por un ser humano o máquina.

En varios aspectos de la invención, los anticuerpos de prueba pueden compararse con una referencia para proporcionar una determinación cualitativa o cuantitativa del nivel de anticuerpos de prueba a los antígenos de B. burgdorferi. En cualquier caso, por comparación a la referencia, el nivel de anticuerpos de prueba puede caracterizarse como habiendo estado presente en, o ausente de, la muestra que se analiza en el método de la invención.

También puede configurarse una referencia para que no genere una señal o tal señal generada de ésta se considerará como señal de fondo. Típicamente, esto se denomina como un control negativo y contiene todos los componentes de reacción excepto el antígeno específico al cual se espera que se unan los anticuerpos de prueba. Alternativamente, el control negativo también puede contener una proteína o antígeno no específico, tal como albúmina de suero de bovino, o similares.

En ciertas modalidades, .el nivel de anticuerpos de prueba se compara con una referencia que comprende uno o más rangos de valores. En ciertas modalidades no limitantes, un nivel de anticuerpos de prueba que cae en un primer rango de valor de referencia significa un nivel alto de anticuerpos que es informativo del estado de enfermedad de Lyme del mamífero. Un nivel de anticuerpos de prueba que cae en un segundo rango de valor de referencia significa un nivel bajo (que puede incluir un nivel indetectable o una ausencia completa) de los anticuerpos de prueba que también es informativo del estado de enfermedad de Lyme del mamífero. Un nivel de anticuerpos de prueba que cae en un tercer rango de valor de referencia puede significar una necesidad de que se realice una prueba adicional.

Pueden generarse referencias compuestas de un rango de valores, por ejemplo, al determinar un nivel promedio de anticuerpos de grupos de mamíferos con infección temprana, crónica o intermedia de B. burgdorferi confirmada, o confirmada por no tener infección de B. burgdorferi, y/o confirmada por haber sido vacunado contra infección de B. burgdorferi. ^ Cualquier técnica, dispositivo, sistema y/o reactivos adecuados pueden utilizarse para detectar los anticuerpos de B. burgdorferi OspA, OspC, y OspF, y/o combinaciones de los mismos. En general, el método para detectar los anticuerpos involucra utilizar proteínas OspA, OspC, y OspF o fragmentos de las mismas en asociación física con una matriz sólida. Los fragmentos de las proteínas son aquellos que se esperaría que se reconocerán por anticuerpos producidos en un mamífero por vacunación contra o infección con B. burgdorferi. La composición de aminoácido de tales fragmentos puede identificarse utilizando la habilidad en la técnica. Las proteínas y/o los fragmentos pueden obtenerse, aislarse o derivarse de B. burgdorferi, o pueden producirse de forma recombinante utilizando cualquiera de una gran variedad de métodos convencionales. La matriz sólida a la cual las proteínas de B. burgdorferi OspA, OspC, y OspA o fragmentos de las mismas están en asociación física puede ser cualquier matriz sólida adecuada. La matriz sólida puede estar presente dentro y/o ser una parte de una placa de ensayo de cavidades múltiples, perlas, tal como perlas fluorescentemente etiquetadas, microesferas, un material de filtro, un dispositivo o tira de flujo lateral, o cualquier otra forma o formato que sea adecuado para mantener las proteínas en una posición por lo cual los anticuerpos presentes dentro o de otra forma derivados de una muestra biológica obtenida de un mamífero pueden capturarse y detectarse. Las proteínas pueden asociarse covalente o no covalentemente con la matriz sólida.

En una modalidad, la proteína OspA comprende la secuencia de SEC ID NO: 1 MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKNKDG KYDLI ATVDKLELKGTSDKN NGSGVLEGVKADKSKVKLTISDDLGQTTLE VF EDG KTLVSKKVTSKDKSSTEEKFN EKGEVSEKI ITRADGTRLEYTG I K SDGSGKAKEVLKGYVLEGTLTAEKTTLVVKEGTVTLSKNISKSGEVLVEL NDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSN GTKLEGSAVEITKLDEI KNAL , o un fragmento de la misma.

En una modalidad, la proteína OspC comprende la secuencia de SEC ID NO: 2: MKKNTLSAILMTLFLFISCNNSGKDGNTSANSADESVKGPNLTEISKKITD SNAVLLAVKEVEALLSSI DELAKAIGKKIKNDGSLDNEANRNESLLAGAYTI STLITQKLSKLNGSEGLKEKIAAAKKCSEEFSTKLKDNHAQLGIQGVTDEN AKKAILKAN AAGKDKGVEELEKLSGSLESLSKAAKEMLANSVKELTSP VV AESPKKP, o un fragmento de la misma.

En una modalidad, la proteína OspC comprende la secuencia de SEC ID NO: 3: MN KMFI ICAVFALI ISCKNYATSKDLEGAVQDLESSEQNVKKTEQEI KKQ VEGFLEILETKDLNKLDTKEIEKRIQELKEKIEKLDSKKTSIETYSEYEEKLK QIKEKLKGKADLEDKLKGLEDSL KKKEER KALEDAKKKFEEFKGQVGS ATGVTTGHRAGNQGSIGAQAWQCANSLGLGVSYSSSTGTDSNELANKVI DDSIKKIDEELKNTIENNGEVKKE, o un fragmento de la misma.

La secuencia de aminoácido de las proteínas OspA utilizada en los ensayos descritos en los ejemplos aquí presentados es novedosa. En particular, el Cuadro 2A describe diferencias de las secuencias de Genbank de B. burgdorferi previamente publicadas.

CUADRO 2A Grado de homología con secuencias de Genbank de B. burgdorferi previamente existentes bp= par de base; aa aminoácido CUADRO 2B Secuencias utilizadas para expresión y rOspA, rOspC y rOspF utilizados en ensayos múltiples CUADRO 2C Iniciadores para clonación de expresión Los sitios de restricción están subrayados; los codones finalizadores están en negritas.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos asociadas con el no. acceso de Genbank HM756743, HM756744 y HM756745 se determinaron en el desempeño de esta invención y primero se volvieron públicamente accesibles hasta principios de enero 1, 2011. De esa forma, en varias modalidades y como se describe en el Cuadro 2B, los antígenos Osp utilizados en el método de la invención para capturar anticuerpos dirigidos a ellos comprenden la secuencia de aminoácido codificada por nucleótidos 1-666 de la secuencia de nucleótido OspA aquí descritas (SEC ID NO:15), y/o la secuencia de aminoácido codificada por nucleótidos 52-636 de la secuencia de nucleótido OspC (SEC ID NO:17), y/o la secuencia de aminoácido codificada por nucleótidos 178-684 de la secuencia de nucleótido OspF aquí descrita (SEC ID NO:19).

En varias modalidades, la invención proporciona composiciones que comprenden proteínas aisladas o recombinantes que comprenden o consisten de las secuencias de SEC ID NO:1, SEC ID NO:2 o SEC ID NO:3. También se proporcionan fragmentos de estas proteínas e incluyen pero no están limitados a fragmentos que comprenden o consisten. Las proteínas o fragmentos de los mismos pueden proporcionarse como componentes de composiciones y/o los equipos que se describen aquí adicionalmente. Por ejemplo, pueden proporcionarse como parte de cualquier sistema, dispositivo o composición que puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de anticuerpos B. burgdorferi que pueden reconocerlos específicamente. En una modalidad, las proteínas pueden proporcionarse en asociación física con una matriz sólida. En una modalidad, la matriz sólida es una perla (microesferas).

En ejemplos no limitantes, los anticuerpos para B. burgdorferi pueden detectarse y discriminarse entre sí utilizando cualquiera de las técnicas de inmunodetección, que incluyen pero no necesariamente están limitadas a tinción Western, ensayo de inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA), una prueba de resorte, técnicas de detección de anticuerpos múltiple de varios tipos, o cualquier modificación de tales ensayos que son adecuados para detectar anticuerpos de interés.

En una modalidad, se proporcionan antígenos OspA, OspC y OspF en ubicaciones separadas en asociación física con una matriz sólida configurada sobre o como una banda de flujo lateral. Una muestra biológica obtenida derivada de un mamífero puede analizarse utilizando la tira para que la presencia de distintos anticuerpos que reconocen específicamente los antígenos OspA, OspC y OspF produzca señales separadas que indican la presencia o ausencia de anticuerpos para cada antígeno. La ausencia de anticuerpos para todos los antígenos es indicativa que el m amífero no sido vacunado y no ha sido infectado con B. burgdorferi. La presencia o ausencia de anticuerpos puede interpretarse generalmente en conexión con la matriz descrita en el Cuadro 1.

En una modalidad, los anticuerpos OspA, OspC y OspF, o combinaciones de los mismos, se detectan utilizando antígenos OspA, OspC y OspF acoplados a perlas fluorescentes. Las perlas fluorescentes puede ser cualquier perla fluorescente adecuada, cuyos ejemplos están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Luminex Corporation. Cada una de las perlas puede etiquetarse con porciones fluorescentemente detectables diferentes o iguales. Las perlas pueden codificarse para que las perlas acopladas a cada uno de los distintos antígenos puedan discriminarse de otra. Los anticuerpos presentes en una muestra biológica obtenida o derivada de un mamífero se enlazarán a las perlas fluorescentes acopladas a antígeno de acuerdo con los antígenos con los cuales está acoplado cada tipo de perla. Un anticuerpo específico anti-especie conjugado a una etiqueta detectable puede utilizarse para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos para OspA, OspC y OspF, o combinaciones de los mismos, que entonces pueden utilizarse para diagnosticar el estado de enfermedad de Lyme de acuerdo, por ejemplo, con la matriz descrita en el Cuadro 1.

Un ejemplo ilustrativo de un ensayo basado en perla fluorescente múltiple para determinar los anticuerpos de acuerdo con la invención se ilustra en la Figura 9. Como se puede observar de la Figura 9, los (1) antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi recombinantes están acoplados a perlas fluorescentes; (2) Muestras (por ejemplo suero, CSF u otros fluidos corporales) se incuban con las tres perlas fluorescentes simultáneamente; (3) se agrega un anticuerpo de ¡nmunoglobulina específico anti-especie biotinilado al ensayo; (4) se agrega Estreptavidina-ficoeritrina como un tinte reportero. El ensayo después se mide en un analizador múltiple que detecta el código de perla fluorescente y el quinto reportero para cada ensayo de perla individual. Las porciones tales como estreptavidina y biotina y sus derivados y otros tintes reporteros pueden sustituirse con cualquiera de una variedad de agentes sustitutos comercialmente disponibles que pueden realizar funciones iguales o similares en el ensayo múltiple.

Los datos de salida de métodos de detección de anticuerpo basados en fluorescencia pueden representarse en varias formas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad, la detección de anticuerpo basado en florescencia puede presentarse como una intensidad fluorescente media (MFI). En la presente invención, se ha determinado que pueden utilizarse ciertos rangos de valor MFI para determinar el estado de enfermedad de Lyme, particularmente para equinos y caninos. Los valores MFI adecuados para usarse en la invención incluyen aquellos descritos en el Cuadro 3.

CUADRO 3 Rangos de interpretación negativos, equívocos y positivos para muestras caninas o equinas utilizando un ensayo múltiple basado en perla fluorescente para anticuerpos para OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi Ántígeno de B. burgdorferi Interpretación Rango de ensayo múltiple (MFI) canino equino OspA Negativo <500 <1000 Equívoco >500 <1,500 =1000-2000 Positivo =1,500 >200 Negativo <250 <500 OspC Equívoco =250 <1,000 =500-1000 Positivo =1 ,000 >1000 Negativo <750 <750 OspF Equívoco =750 <1,500 =750-1250 Positivo =1 ,500 >1250 Los resultados equívocos descritos en el Cuadro 3 son indicativos que debe realizarse prueba adicional para que la muestra pueda clasificarse como positiva o negativa.

En una modalidad, el método se realiza para determinar el estado de enfermedad de Lyme de un equino. Esta modalidad comprende, en una muestra biológica obtenida de o derivada del equino, determinar la presencia o ausencia de anticuerpos OspA, OspC, y OspF. La presencia o ausencia de los anticuerpos se determina utilizando cualquier técnica adecuada, que en una modalidad es un ensayo múltiple que comprende los antígenos OspA, OspC, y OspF proporcionados en asociación física con perlas fluorescentes. Los antígenos OspA, OspC, y OspF se contactan con una muestra biológica obtenida o derivada de un equino. Los anticuerpos para los antígenos, si están presentes, se unirán al antígeno y consecuentemente se inmovilizarán en los complejos de antígeno/perla fluorescentes. Un anticuerpo específico anti-equino detectablemente etiquetado se agrega y se utiliza un analizador múltiple para detectar las perlas fluorescentes y la etiqueta detectable del anticuerpo específico anti-equino para generar un valor MFI para cada uno de los anticuerpos OspA, OspC, y OspF. La presencia o ausencia de los anticuerpos se determina de acuerdo con los valores de equinos descritos en el Cuadro 3 y se hace una determinación del estado de enfermedad de Lyme de acuerdo con la matriz descrita en el Cuadro 1. El mismo razonamiento se aplica al análisis de una muestra biológica obtenida o derivada de un canino, por lo cual los valores MFI descritos en el Cuadro 3 para muestras caninas se utilizan para determinar la presencia o ausencia de los anticuerpos, pero se utiliza un anticuerpo específico anti-canino en lugar de un anticuerpo específico anti-equino. De esa forma, basado en valores MFI para los anticuerpos OspA, OspC, y OspF, el equino o canino puede diagnosticarse como infectado o no infectado con B. burgdorferi y además puede identificarse como habiendo sido vacunado contra B. burgdorferi y/o como teniendo una infección temprana, intermedia o crónica de B. burgdorferi.

En varias modalidades, la invención además comprende fijar la determinación del anticuerpo en un medio tangible. El medio legible puede ser cualquier tipo de medio tangible, tal como cualquier tipo de medio digital, incluyendo pero no limitado a DVD, CD-ROM, un dispositivo de memoria flash portátil, etc. La invención incluye proporcionar el medio tangible al propietario del animal, un creador, y/o un proveedor de cuidado de salud del animal para desarrollar una recomendación para tratamiento de un mamífero que se ha determinado que tiene una infección de enfermedad de Lyme.

También se proporciona en la presente invención un dispositivo para determinar los anticuerpos. En una modalidad, el dispositivo es un dispositivo de flujo lateral que comprende los antígenos OspA, OspC y OspF en asociación física con una matriz sólida. En una modalidad, OspA, OspC y OspF son los únicos antígenos de B. burgdorferi proporcionados en asociación con la matriz sólida. En una modalidad, los antígenos OspA, OspC y OspF proporcionados con el dispositivo comprenden o consisten de las secuencias de aminoácido aquí descritas.

También se proporcionan equipos para detectar la presencia o ausencia de los anticuerpos. En una modalidad, los equipos comprenden antígenos OspA, OspC y OspF en asociación física con una matriz sólida. En una modalidad, OspA, OspC y OspF son los únicos antígenos de B. burgdorferi proporcionados con el equipo. El equipo puede incluir perlas fluorescentes como la matriz sólida. El equipo además puede incluir los antígenos y/o las perlas en uno o más frascos separados. El equipo opcionalmente puede incluir instrucciones para usar el equipo.

Los siguientes ejemplos pretenden ¡lustrar pero no limitar la presente invención.

Ejemplo 1 Este ejemplo proporciona una descripción de una modalidad del método que demuestra su utilidad mejorada para determinar un estado de enfermedad de Lyme en caninos. En particular, en este ejemplo, se describe el desarrollo de alineación de un ensayo múltiple basado en perla fluorescente para la detección simultánea de anticuerpos específicos para antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi en suero canino. La validación se realizó al comparar resultados de ensayo múltiple a la prueba confirmatoria recomendada para diagnosticar la enfermedad de Lyme que es tinción Western (WB) (ver, por ejemplo, wwwxdc.gov/ncidod/dvbid/Lyme/ld_humandisease_diagnosis.htm). Entre otras ventajas de la presente invención, y contrario a estudios previos en caninos que enseñó que OspC no fue un marcador de diagnóstico adecuado, la invención actual claramente demuestra otra cosa. En particular, los resultados de prueba presentados en este Ejemplo proporcionan la determinación mejorada de un estado de enfermedad de Lyme en caninos cuando se compara con cualquiera de los métodos de prueba de enfermedad de Lyme actualmente disponibles, y ofrecen una mejor definición de una vacunación actual y estado de infección de camino al determinar anticuerpos para OspA, OspC y OspF.

Los siguientes materiales y métodos se utilizaron para obtener los resultados presentados en este ejemplo.

Clonación de genes de Borrelia burgdorferi Se expresaron proteínas OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi en E. coli y se utilizaron como antigenos en el ensayo múltiple. Se aisló ADN de B. burgdorferi que se origina de garrapatas Ixodes dammini infectadas recolectadas en un área forestal en el condado de Westchester, Nueva York (Appel y otros 1993). Se amplificaron los genes OspC y OspF completos por PCR utilizando polimerasa de ADN Pfu (Stratagene, La Jolla, CA, E.U.A.). Se designaron observadores OspC y OspF de accesos Genbank NC_001903 y L13925, respectivamente. Las posiciones de los iniciadores utilizados para amplificación se proporcionaron en paréntesis: OspC hacia adelante (1-23) 5' atgaaaaagaatacattaagtgc 3' SEC ID N 0:10; OspC inverso (633-607) 5' ttaaggtttttttggactttctgccac 3' SEC ID NO: 11; OspF hacia adelante (16-44) 5' atgaataaaaaaatgtttattatttgtgc 3' SEC ID NO: 12; y OspF inverso (708-688) 5' ttattcttttttgacttctcc 3' SEC ID NO:13. Se realizó la PCR como se describió previamente (Wagner y otros, 2001). Los productos de PCR se clonaron en vector pCR4 TopoBlunt (Invitrogen, Carlsbad, E.U.A.) y se secuenciaron utilizando un secuenciador automático ABI en BioResource Center, Cornell University. El gen OspA científico se amplificó del plásmido OspA/pRSET. Las secuencias de nucleótido de las regiones de codificación completa de los genes clonados se enviaron a Genbank y recibieron los números de accesión HM756743 (OspA), HM756744 (OspC) y HM756745 (OspF).

Expresión y purificación de genes de B. burgdorferi Se realizó clonación de expresión basada en las siguientes secuencias de ADN que también se refieren en el Cuadro 2.

OspA (822bp), acceso de Genbank HM756743 atgaaaaaatatttattgggaataggtctaatattagccttaatagcatgtaagcaaaatgttagcagccttgacgagaaaaacagcgtttc agtagatttgcctggtgaaatgaaagttcttgtaagcaaagaaaaaaacaaagacggcaagtacgatctaattgcaacagtagacaag cttgagcttaaaggaacttctgataaaaacaatggatctggagtacttgaaggcgtaaaagctgacaaaagtaaagtaaaattaacaattt ctgacgatctaggtcaaaccacacttgaagttttcaaagaagatggcaaaacactagtatcaaaaaaagtaacttccaaagacaagtcat caacagaagaaaaattcaatgaaaaaggtgaagtatctgaaaaaataataacaagagcagacggaaccagacttgaatacacaggaa ttaaaagcgatggatctggaaaagctaaagaggttttaaaaggctatgttcttgaaggaactctaactgctgaaaaaacaacattggtgg ttaaagaaggaactgttactttaagcaaaaatatttcaaaatctggggaagttttagttgaacttaatgacactgacagtagtgctgctacta aaaaaactgcagcttggaattcgggcacttcaactttaacaattactgtaaacagtaaaaaaactaaagaccttgtgtttacaaaagaaaa cacaattacagtacaacaatacgactcaaatggcaccaaattagaggggtcagcagttgaaattacaaaacttgatgaaattaaaaacg ctttaaaataa SEC ID NO: 14 M K K Y L L G I G L I L A L I A C K Q N V S S L D E K N S V S V D L P G E M K V L V S K E KN K D G K YD L I A T V D K L E L K G T S D K N N G S G V L E G V K A D K S K V K L T I S D D L G Q T T L E V F K E D G K T L V S K K V T S K D K S S T E E K F N E K G E V S E K I I T R A D G T R L E Y T G I K S D G S G K A K E V L K G Y V L E G T L T A E K T T L V V K E G T V T L S K N I S K S G E V L V E L N D T D S S A A T K K T A A W N S G T S T SEC ID NO:15 OspC (636bp), acceso de Genbank HM756744 atgaaaaagaatacattaagtgcaatattaatgactttatttttatttatatcttgtaataattcagggaaagatgggaatacatctgcaaattct gctgatgagtctgttaaagggcctaatottacagaaataagtaaaaaaattacggattctaatgcggttttacttgctgtgaaagaggttga agcgttgctgtcatctatagatgagcttgctaaagctattggtaaaaaaataaaaaacgatggtagtttagataatgaagcaaatcgcaac gagtcattgttagcaggagcttatacaatatcaaccttaataacacaaaaattaagtaaattaaacggatcagaaggtttaaaggaaaag attgccgcagctaagaaatgctctgaagagtttagtactaaactaaaagataatcatgcacagcttggtatacagggcgttactgatgaa aatgcaaaaaaagctattttaaaagcaaatgcagcgggtaaagataagggcgttgaagaacttgaaaagttgtccggatcattagaaag cttatcaaaagcagctaaagagatgcttgctaattcagttaaagagcttacaagccctgttgtggcagaaagtccaaaaaaaccttaa S EC I D NO: 16 S C N N S G K D G N T S A N S A D E S V K G P N L T E I S K K I T D S N A V L L A V K E V E A L L S S I D E L A K A I G K K I K N D G S L D N E A N R N E S L L A G A Y T I S T L I T Q K L S K L N G S E G L K E K I A A A K K C S E E F S T K L K D N H A Q L G I Q G V T D E N A K K A I L K A N A A G K D K G V E E L E K L S G S L E S L S K A A K E M L A N S V K E L T S P V V A E S P K K P SEC ID N0:17 OspF (684bp), acceso de Genbank HM756745 atgaataaaaaaatgtttattatttgtgctgtttttgcgttgataatttcttgcaagaattatgcaactagtaaagatttagaaggggcagtgca agatttagaaagttcagaacaaaatgtaaaaaaaacagaacaagagataaaaaaacaagttgaaggatttttagaaattctagagacga aagatttgaataaattggatacaaaagagattgaaaaacgaattcaagaattaaaggaaaaaatagaaaaattagattctaaaaaaactt ctattgaaacatattctgagtatgaagaaaaactaaaacaaataaaagaaaaattgaaaggaaaggcagatcttgaagataaattaaag ggacttgaagatagcttaaaaaagaaaaaagaggaaagaaaaaaagctttagaagatgctaagaagaaatttgaagagtttaaaggac aagttggatccgcgactggagtaactaccgggcatagagctggaaatcaaggtagtattggggcacaagcttggcagtgtgctaatag tttggggttgggtgtaagttattctagtagtactggtactgatagcaatgaattggcaaacaaagttatagatgattcaattaaaaagattga tgaagagcttaaaaatactatagaaaataatggagaagtcaaaaaagaataa SEC ID NO: 18 E T K D L N K L D T K E I E K R I Q E L K E K I E K L D S K K T S I E T Y S E Y E E K L K Q I K E K L K G K A D L E D K L K G L E D S L K K K K E E R K K A L E D A K K K F E E F K G Q V G S A T G V T T G H R A G N Q G S I G A Q A W Q C A N S L G L G V S Y S S S T G T D S N E L A N K V I D D S I K K I D E E L K N T I E N N G E V K K E SEC ID NO:19 Para clonación de expresión primero se amplificaron el OspA (base 1-666), OspC (bases 52-636) y OspF (bases 178-684 de las secuencias de ADN descritas anteriormente) mediante PCR utilizando iniciadores con sitios de restricción BamHI (5') y KpnL (3'). Los genes se clonaron en el vector de expresión pQE-30 Xa (Qiagen Inc., Valencia, CA) y se expresaron como proteínas etiquetadas His en células E. coli SG13009 (Qiagen Inc., Valencia, CA) después de introducción con 1mM IPTG. Las bacterias se Usaron en regulador de pH que contiene 100mM de fosfato de sodio, 10mM de Tris y 8M de urea, pH 8.0. Los Usados se diluyeron 1:5 en 40mM de regulador de imidazol y las proteínas etiquetadas His se purificaron en columnas HisTrapFF utilizando un instrumento AKTA-FPLC (ambos de GE Healthcare, Piscataway, NJ). Se determinaron concentraciones de proteína por ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL).

SDS-PAGE y Tinción Western Se realizaron SDS-PAGE, tinción e inmunotinción Western (las dos últimas se denominan aquí como WB) como se describe (Wagner y otros, 2005). En resumen, se separaron 2-4 pg/carril de las proteínas de B. burgdorferi recombinantes en 15% de mini-geles (BioRad Laboratories, Hercules, CA, E.U.A.) bajo condiciones de reducción. Los geles se tiñeron con Azul brillante Coomassie o las proteínas se transfirieron a una membrana (PVDF, BioRad Laboratories, Hercules, CA, E.U.A.) para inmunotinción. Después de la transferencia, se realizó un paso de bloqueo utilizando 5% (p/v) de leche seca sin grasa en regulador de pH Tris (0.1M d e Tris, pH 7.6 que contiene 0.05% (v/v) Tween 20). Las membranas luego se incubaron con suero canino diluido 1:10 en regulador de pH Tris con 5% de leche seca sin grasa. Se utilizó un anticuerpo lgG(H + L) anti-perro de conejo conjugado de peroxidasa secundario (Jackson InmunoResearch Lab., West Grove, PA) para la detección. Después de incubación de cada anticuerpo, las membranas se lavaron tres veces con regulador de pH Tris y se visualizaron la unión de anticuerpo por el método de quimioluminiscencia ECL (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, E.U.A.). Además, todos los sueros utilizados para validación del ensayo múltiple se probaron por WB de B. burgdorferi convencional utilizando lisado bacteriano entero como se describió previamente (Appel y otros 1993).

Acoplamiento de antígenos de B. burgdorferi recombinantes a perlas fluorescentes Se acopló un total de 100 g de cada proteína de B. burgdorferi recombinante purificada a perlas fluorescentes (Luminex Corp.). Se acopló OspA a perla 33, OspC a perla 34, y OspF a perla 37. El acoplamiento se realizó de acuerdo con el protocolo recomendado del proveedor de perla Luminex Corporation. (Ver www. luminexcorp.com/uploads/data/Protein%20Protocols%20FAQs/Pr otein%20Coupling%20Protocol%200407%2010207.pdf). En resumen, se realizó el procedimiento completo a temperatura ambiente. Se realizaron todos los pasos de centrifugación a 14,000xg durante 4 minutos. Después de eso, se volvieron a suspender las perlas por vórtice y aplicación de sonido durante 20 segundos. Para activación, se lavaron 5x106 perlas una vez en H20. Las perlas se volvieron a suspender en 80 µ? de 100mM de regulador de pH de fosfato de sodio, pH 6.2. Entonces, se agregaron 10 µ? de sulfo-NHS (50 mg/mm) y 10 µ? de clorhidrato de 1 -etil-3-[3-dimetilaminopropilo] carbodiimida (PVC, 50 mg/ml, ambos de Pierce Biotechnology Inc., Rockford, IL) y se incubaron durante 20 minutos. Las perlas se lavaron dos veces con 50mM de ácido 2-[N-morfolino]etansulfónico, pH 5.0 (MES) y se volvieron a suspender en solución de MES. Estas perlas activadas se utilizaron para acoplamiento de los antígenos de B. burgdorferi recombinantes. El acoplamiento se realizó durante 3 horas con rotación. Después de acoplamiento, las perlas se volvieron a suspender en regulador de pH de bloqueo (PBS con 1% (p/v) BSA 0.05% (p/v) azida de sodio) y se incubaron durante 30 minutos. Las perlas se lavaron tres veces en PBS con 0.1% (p/v) de BSA, 0.02% (v/v) de Tween 20 y 0.05% (p/v) de azida de sodio (PBS-T) contado y almacenado en la oscuridad a 2-8°C.

Ensayo de Luminex Se les aplicó sonido a las perlas acopladas con OspA, OspC y OspF, se mezclaron y diluyeron en regulador de pH de bloqueo a una concentración final de 1x105/ml perlas cada una. Para el ensayo, se utilizaron 5x103 perlas/ml cada una por cavidad de microtitulación. Se diluyeron todas las muestras de suero canino 1:600 en regulador de pH de bloqueo. Los sueros caninos y perlas previamente probados negativos, positivo bajo y positivo alto incubados con regulador de pH de bloqueo solos corrieron como controles positivos y negativos en cada placa de ensayo. Se remojaron placas HTS de multifiltro de Millipore (Millipore, Danvers, MA) con PBS-T utilizando un lavador de placa ELx50 (Biotek Instruments Inc., Winooski, VT) durante 2 minutos. La solución se aspiró de las placas y se aplicaron 50 µ? de cada suero o muestra de control a las placas. Luego, se agregaron 50 µ? de solución de perla a cada cavidad y se incubaron durante 30 minutos sobre una agitadora a temperatura ambiente. La placa se lavó con PBS-T y 50 µ? de anti-perro lgG(H + L) de conejo biotinilado (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) diluido 1:5000 en regulador de pH de bloqueo que se agregó a cada cavidad y se incubó durante 30 minutos como anteriormente. Después de lavado, se agregaron 50 µ? de estreptavidina-ficoeritrina (Invitrogen, Carlsbad, CA) diluido a 1:100 en regulador de pH de bloqueo. Se incubaron placas durante 30 minutos como anteriormente y se lavaron. Las perlas se volvieron a suspender en 100 µ? de regulador de pH y cada placa se colocó en el agitador durante 15 minutos para volver a suspender las perlas. El ensayo se analizó en un instrumento Luminex IS 100 (Luminex Corp.). Se reportaron los datos como intensidades fluorescentes medias (MFI).

Muestras de suero Se enviaron todas las muestras de suero canino para prueba serológica de anticuerpos para B. burgdorferi al Centro de diagnóstico de salud animal en la Universidad de Cornell y se probaron en una ELISA cinética y por WB para detectar anticuerpos para B. burgdorferi. Todos los ensayos utilizaron Usados de célula entera de B. burgdorferi y se describieron previamente (Appel y otros 1993, Jacobson y otros 1996). Se utilizaron dos m uestras de suero canino para este estudio: Primero, se utilizaron 79 muestras de suero con ELISA disponibles y resultados de WB para anticuerpos para B. burgdorferi para establecer las condiciones del ensayo basado en perla para cada antígeno y para la comparación de resultados de análisis individual y múltiple. Estas 79 muestras se seleccionaron' para proporcionar números similares de muestras que varían de resultados negativos a positivos altos por ELISA y WB y de acuerdo con éstos los resultados incluyeron sueros de perros vacunados y/o naturalmente infectados. En segundo lugar, se utilizó un total de 188 muestras de suero canino que no se probaron previamente para validación de ensayo múltiple adicional. Se analizaron todas las muestras en paralelo para anticuerpos para antígenos B. burgdorferi por WB. La presencia (positivo) o ausencia (negativo) de anticuerpos de suero para 31 kDa (OspA), 22 kDa (OspC) y 29 kDa (OspF) en las tinciones se determinaron ciegamente por un observador que no estaba consciente de los resultados de ensayo múltiple. Los resultados WB proporcionaron un "estándar de oro relativo" para cada antígeno y se utilizaron para análisis de curva operativa de receptor (ROC) y para determinar rangos de interpretación para anticuerpos para antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi en el ensayo múltiple.

Análisis estadístico Para la comparación de resultados obtenidos por formatos de s ensayo individuales y múltiple se compararon los valores MFI correspondientes de todas las muestras para cada antígeno de B. burgdorferi al calcular correlaciones de clasificación Spearman. Se realizaron pruebas Mann-Whitney para comparar diferencias en valores MFI de ensayo múltiple para muestras que fueron negativas o positivas para el a ntígeno respectivo cuando se probó por WB. Las pruebas Mann-Whitney corrieron con aproximación Gausiana, de 2 lados, con intervalos de 95% de confianza al utilizar p<0.05 como recorte de significancia. Para determinar la sensibilidad y especificidad para cada ensayo de perla dentro de las curvas ROC de formato de ensayo múltiple se generaron curvas ROC al utilizar el resultado WB (positivo/negativo) de cada muestra de suero y la proteína correspondiente como un 'estándar de oro relativo" en comparación con el valor MFI obtenido para esa muestra y antígeno recombinante que utiliza el ensayo múltiple. Se realizó un análisis de relación de probabilidad para definir rangos de interpretación y sensibilidades de diagnóstico y especificidades en el ensayo múltiple. Las curvas ROC y análisis de probabilidad se realizaron separadamente para cada antígeno. Las correlaciones de clasificación de Spearman y las pruebas de Mann-Whitney se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism, versión 5.01. Se generaron curvas ROC utilizando el programa MedCale, versión 11.2.0.0; 2010 F. Schoonjans, Bélgica. Se realizó el análisis de probabilidad utilizando Statistix 9.0, 2008, Analytical Software, Tallahassee, FL, E.U.A.

Resultados Expresión de antígenos de B. burgdorferi Las partes extracelulares de proteínas OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi se expresaron en E. Coli (Figura 1) y fueron 333, 194, y 169 aminoácidos de tamaño, respectivamente. Las proteínas rOspA resultantes tuvieron un peso molecular calculado de 30 kDa. Además de la proteína predominante correspondiente a 30 kDa, se observaron dos proteínas más débiles de 22 y 42 kDa después de purificación que sugiere contaminaciones menores con otras proteínas durante purificación de afinidad rOspA. Los pesos moleculares calculados fueron 17.5 kDa para rOspC y 15.2 kDa para rOspF. Las proteínas resultantes encontradas por SDS-PAGE fueron 29 kDa para rOspC y 27 kDa para rOspF que sugieren dimerización de ambas proteínas.

Desarrollo de un ensayo basado en perla floreciente Las proteínas OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi recombinantes se acoplaron a perlas fluorescentes. Las muestras de suero canino pre-probadas con resultados de prueba WB conocidos para anticuerpos para B. burgdorferi se utilizaron para establecer las condiciones de cada ensayo basado en perla. Sé identificaron controles positivos y negativos y se incluyeron en cada placa de ensayo (Cuadro 3). Después se midió un total de 79 sueros en ensayos individuales en cada antígeno individual y en un ensayo múltiple utilizando los tres antígenos simultáneamente (Figura 2). Las correlaciones de clasificación Spearman entre los análisis individuales y múltiple fueron 0.93 (OspA), 0.88 (OspC) y 0.96 (OspF). Los valores de fondo medio de los ensayos múltiple se determinaron por 40 corridas sin suero y fueron menor que 10 MFI para los ensayos de OspA y OspC y 80 MFI para OspF.

Cuadro 4: Valores MFI (media ± desviaciones estándares) para los ensayos OspA, OspC y OspF obtenidos por 20 corridas de ensayo múltiple separadas utilizando muestras de suero de control canino (positivo, positivo bajo y negativo) y valores de fondo (regulador de pH de dilución).

CUADRO 4 Suero positivo 10386 ±2292 3759 ± 1012 21976 ± 2924 Suero positivo bajo 265 ± 298 1125 ±297 5336 ± 1289 Suero negativo 201 ± 72 48 ± 17 244 ± 71 Fondo (regulador de pH) 7±2 4± 1 84 ±4 Comparación de WB y resultados de ensayo múltiple para OspA, OspC y OspF Se compararon resultados de ensayo WB y múltiple de 188 sueros caninos para cada proteína. La Figura 3 muestra los resultados de WB convencionales de un suero de perro infectado (carril 2), uno vacunado (carril 3), y uno no infectado/no vacunado (carril 4). Los resultados del múltiple OspA se compararon con la ocurrencia de la proteína de 31 kDa sobre la WB, OspC se comparó con la proteína de 22 kDa, y OspF con la proteína de 29 kDa. Los resultados WB se agruparon separadamente como positivos o negativos para cada uno de los tres antígenos (Figura 4). De los 188 sueros, 107 detectaron el antígeno OspA de 31 kDa, 39 detectaron el OspA de 22 kDa y 82 identificaron la proteína OspF de 29 kDa mediante WB. Se obtuvieron valores FI significativamente superiores (p<0.0001) en el ensayo múltiple para las tres proteínas B. burgdorferi u tilizando los positivos WB comparados con aquellos con resultados WB negativos. Además, se generaron curvas RCO para los antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi utilizando los resultados WB de los 188 sueros como un 'estándar de oro relativo' (Figura 5). Las curvas ROC mostraron un alto acuerdo entre el ensayo múltiple y los resultados WB para OspA, OspC y OspF.

Interpretación de resultados de ensayo múltiple Para determinar rangos de interpretación para los antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi en el ensayo múltiple, se realizó un análisis de probabilidad. El análisis toma en cuenta que los análisis serologicos casi siempre resultan en algunos resultados falso positivo y falso negativo cuando se comparan con un estándar de oro (Jacobson y otros 1996). Esto puede provocarse por la naturaleza de algunos sueros que muestran unión no específica aumentada, por un estándar de oro sub-óptimo o por diferencias en la sensibilidad analítica de los ensayos que se comparan. De esa forma, se determinó un rango de interpretación negativo, uno equívoco yo uno positivo para cada antígeno. El Cuadro 5 muestra el rango de interpretación, la relación de probabilidad de una prueba positiva (LR + ) y la sensibilidad de diagnóstico y especificidad del análisis múltiple de anticuerpos para cada uno de los antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi en suero canino. Las especificidades de diagnóstico de ensayos OspA, OspC y OspF en el formato múltiple fueron de 90%, 89% y 86%, respectivamente. Las sensibilidades de diagnóstico fueron 83% (OspA), 62% (OspC) y 82% (OspF).

CUADRO 5 Rangos de interpretación del ensayo múltiple basado en perla fluorescente para anticuerpos para OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi en suero canino Ensayo Positivo Falso LR+ Sensibilidad 95% Especificidad 95% de múltiple (MFI) Verdadero positivo (%) de Cl (%) Cl (WBpos) (WBneg) Negativo <500 3/107 41/81 0.055 Equívoco =500<1,500 15/107 32/81 0.35 Positivo =1,500 89/107 8/81 8.40 83 75-90 90 82-96 Negativo <250 3/39 65/149 0.18 Equívoco =250 <1 ,000 12/39 67/149 0.68 Positivo =1,000 24/39 17/149 5.40 62 45-77 89 82-93 OspF Negativo <750 3/82 37/106 0.11 Equivoco =750<1,500 12/82 56/106 0.28 Positivo =1 ,500 67/82 15/106 5.75 82 72-89 86 78-92 Será evidente a partir de lo anterior que, en este Ejemplo, se demuestra el desarrollo y validación de un nuevo ensayo múltiple para detectar anticuerpos de suero para antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi simultáneamente. El ensayo múltiple combina los procedimientos de pruebas actuales de ELISA y WB en una prueba y también distingue entre los antígenos B. burgdorferi individuales como marcadores para vacunación o infección. ELISA seguido por WB aún se considera el estándar de oro para la detección de anticuerpos para B. burgdorferi. ELISA realizados en lisados de célula entera de B. burgdorferi tuvieron alta sensibilidad de diagnóstico pero más bien baja especificidad de diagnóstico (Jacobson y otros 1996). Los resultados de ELISA falso positivos utilizando lisados de célula entera fueron causados por reacciones de anticuerpos de suero con proteínas de espiroqueta que compartieron una alta homología con proteínas correspondientes de otras bacterias, por ejemplo la proteína flagelar de B. burgdorferi (Lindenmayer y otros 1990, Shin y otros 1993). Que el ensayo múltiple desarrollado aquí utilizara proteínas recombinantes novedosas de B. burgdorferi redujo la posibilidad para reacciones cruzadas en el nuevo ensayo.

Aquí, se comparan resultados WB para antígenos B. burgdorferi específicos para resultados múltiple para los antígenos OspA, OspC y OspF correspondientes. El análisis de curva ROC indicó asociaciones de buenas a muy buena entre las dos pruebas. Sin embargo, se observaron desacuerdos entre WB y el ensayo múltiple. Una posible explicación para los desacuerdos podría ser que WB generalmente depende de interpretación subjetiva del observador sobre sí está presente o no una banda específica. La interpretación del WB también puede influenciarse por variaciones día a día en desarrollo de tinción. La sensibilidad analítica del WB ( rango pg/ml bajo) es menor que la de ELISA (rango ng/ml b ajo) y mucho menor que la sensibilidad analítica de ensayos múltiple (rango pg/ml bajo). De esa forma, es probable que no se detectarán varios sueros con concentraciones inferiores de anticuerpos para B. burgdorferi por WB pero se identificaron por el ensayo múltiple.

Además del aumento de la sensibilidad analítica de ensayos múltiple comparados con WB algunas bandas en la tinción también pueden mal malinterpretarse. Por ejemplo, B. burgdorferi expresa dos proteínas que aparecen alrededor de 22 kDa en el WB, OspC y una proteína adicional de 22 kDa (Magnarelli y otros 2001). Debido a que preparaciones crudas de B. burgdorferi generalmente se utilizaron para WB, el análisis de anticuerpos para OspC puede anticiparse por la presencia de anticuerpos para la proteína de 22 kDa en una muestra. Consecuentemente, las bandas de 22 kDa identificadas por WB pueden no siempre corresponder a anticuerpos para OspC. Esto podría explicar el acuerdo inferior que se observa entre el ensayo OspC basado en perla y los resultados WB. De esa forma, la especificidad y sensibilidad de diagnóstico verdaderas para el ensayo múltiple OspC es probablemente muy superior que aquellos calculados en comparación con la proteína de 22 kDa detectada por WB. En general, se concluye que WB únicamente puede ser un 'estándar de oro relativo' para validación de otros ensayos que detectan anticuerpos para B. burgdorferi.

Utilizando un grupo de 188 muestras de suero canino, se observó una alta discrepancia en los números totales de muestras positivas WB para OspC (n = 39) y OspF (n = 82). Esto está de acuerdo con la expresión diferencial de antígenos de B. burgdorferi y la respuesta de anticuerpos de huésped resultante discutida anteriormente. Las muestras originadas de envíos de campo de diagnóstico y de esa forma, el tiempo de infección y/o vacunación de estos perros no se conocen. Se observó que dependiendo de los anticuerpos de muestra de suero para OspC o OspF o ambos podría detectarse por el ensayo múltiple que sugiere que estos patrones de detección de proteína de superficie exterior son indicativos de etapas diferentes de infección con B. burgdorferi. De esa forma, los patrones de anticuerpo diferencial para los antígenos OspC y OspF son indicativos de cuando ocurrió la exposición a B. burgdorferi en el perro. Tal determinación mejorada de la etapa de infección probablemente va ser más valiosa para decisiones de tratamiento y para predecir éxito de tratamiento.

De esa forma, el ensayo múltiple descrito en este ejemplo para la detección de anticuerpos para antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi proporciona una alternativa cuantitativa, económica y sensible para determinar anticuerpos en suero canino que son indicadores de infección con B. burgdorferi y/o anticuerpos que resultaron de la vacunación.

Ejemplo 2 Este ejemplo proporciona una descripción de una modalidad del método que demuestra su utilidad mejorada para determinar un estado de enfermedad de Lyme en equinos. El ensayo múltiple para caballos utiliza OspA, OspC y OspF, como marcadores para vacunación y/o infección temprana o crónica como se describió previamente para el ensayo de Lyme canino en el Ejemplo 1. En general, los ensayos múltiples utilizan el principio de detección simultánea de analitos solubles en muestras biológicas (Morgan y otros 2004, Prabhakar y otros 2005). Se basan en perlas fluorescentes acopladas por antígenos individuales que proporcionan la matriz del ensayo. Los ensayos múltiple típicamente detectan anticuerpos en el rango pg/ml, mientras ELISA detecta ng/ml y concentraciones de WB de pg/ml (Kellar y Douglas 2003, Morgan y otros 2004, Wagner y Freer 2009). De esa forma, el nuevo ensayo múltiple de Lyme para caballos se basa en proteínas de marcador específicas para infección con o vacunación contra B. burgdorferi y también probablemente tiene una ventaja en situaciones cuando las concentraciones de anticuerpos son bajas tal como temprano después de infección o en muestras de fluido cerebroespinal de caballos con signos neurológicos.

Se utilizó el siguiente material y métodos para obtener los resultados presentados en el Ejemplo.

Proteínas de B. burgdorferi recombinantes y acoplamiento a perlas fluorescentes Se expresaron los antígenos OspA, OspC y OspC de B. burgdorferi en E. Coli y se acoplaron a perlas fluorescentes como se describe en el Ejemplo 1. Se acopló OspA a la perla 33, OspC a la perla 34, y OspF a la perla 37. El acoplamiento se realizó de acuerdo con el protocolo recomendado del proveedor de perla.

Ensayo múltiple Se realizó análisis múltiple como se describió previamente para muestras de suero canino en el Ejemplo 1 con los siguientes cambios: se diluyeron muestras de suero equino a 1:400. Para la detección de anticuerpos de suero se utilizó un anticuerpo lgH(H + L) de anti-caballo cabra biotinilado (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) en una dilución de 1:3000. Todos los otros reactivos, reguladores de pH y pasos de incubación fueron idénticos al procedimiento descrito anteriormente. El ensayo se analizó en un instrumento Luminex IS 100 (Luminex Corp.)- Los se reportaron como intensidades fluorescentes medias (MFI).

Suero de Caballo Se enviaron todas las muestras de suero equino al Centro de Diagnóstico de Salud Animal en la Universidad de Cornell para prueba serológica de Lyme y se probaron en ELISA cinético seguido por WB para detectar anticuerpos para B. burgdorferi. Ambos ensayos utilizaron Usados de célula entera de B. burgdorferi y se realizaron como se describió previamente (Chang y otros 2000a). Se analizaron dos grupos de muestras de suero de equino para este acercamiento: Primero, se utilizaron 81 muestras de suero equino con resultados de ELISA y WB disponibles para anticuerpos para S. burgdorferi para establecer las condiciones del ensayo basado en perla para cada uno de los antígenos y para la comparación de análisis individuales y múltiples. Estas 81 muestras se seleccionaron para proporcionar números similares de muestras dentro de los rangos de interpretación negativo a alto positivo como se identificó por ELISA y WB y se incluyeron sueros de caballos vacunados y/o naturalmente infectados. En segundo lugar, un total de 562 muestras de suero equino que no se probaron previamente se evaluaron para validación de ensayo múltiple adicional. Estas muestras se enviaron al Centro de Diagnóstico de Salud Animal en la Universidad de Cornell entre julio del 2008 y junio del 2009. Todas las muestras también se analizaron por anticuerpos para antígenos de B. burgdorferi mediante WB. La presencia (positivo) o ausencia (negativo) de anticuerpos en suero para 31 kDa (OspA), 22 kDa (OspC) y 29 kDa (OspC) en las tinciones se determinaron ciegamente por un observador que no estaba consiente de los resultados de ensayo múltiple (Figura 6).

Análisis estadístico Los valores MFI obtenidos del primer grupo de muestras de suero (n = 81) se analizaron mediante formatos de ensayo individuales y múltiples y se compararon para cada uno de los antígenos de B. burgdorferi al calcular correlaciones de clasificación Spearman. Se realizaron pruebas de Mann-Whitney para comparar diferencias en valores MFI de ensayo múltiple para muestras que fueron negativas o positivas para el antígeno respectivo cuando se probaron mediante WB. Las pruebas Mann-Whitney corrieron con aproximación Gausiana, de 2 lados, con intervalos de 95% de confianza y utilizando p<0.05 como recorte para importancia. Las correlaciones de clasificación Spearman y las pruebas de Mann-Whitney se realizaron utilizando el programa GraphPad Prism, versión 5.01.

Para el segundo grupo de muestra de suero (n = 562), se utilizaron los resultados de WB como un 'estándar de oro relativo' (positivo/negativo) en un análisis de curva característico operativo de receptor (ROC) y s e compararon con el valor MFI múltiple. Este análisis asumió que WB de hecho es un estándar de oro verdadero (es decir 100% de sensibilidad y especificidad de diagnóstico). Se realizó un análisis de relación de probabilidad para definir rangos de interpretación para anticuerpos para antígenos OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi y sensibilidades y especificidades de diagnóstico del ensayo múltiple. Se realizaron análisis de curvas ROC y de probabilidad separadamente para cada antígeno. Se generaron curvas ROC utilizando el programa MedCale, versión 11.2.0.0 2010, MedCale Software, Broekstraat 52, 9030 Mariakerke. El análisis de probabilidad se realizó utilizando Statistix 9.0, 2008, Analytical Software, Tallahassee, FL, E.U.A.

El segundo grupo de muestras de suero también se utilizó para un aspecto estadístico bayesiano que puede utilizarse para el análisis del desempeño de ensayo si un estándar de oro verdadero no está disponible (Wang y otros 2007). Para la prueba de anticuerpo de Lyme, WB puede considerarse únicamente como un 'estándar de oro relativo' debido a su sensibilidad analítica deficiente y su componente subjetivo al analizar si una banda específica está o no presente (Wagnery otros 2011). Los datos se analizaron utilizando un modelo Bayesiano para identificar la especificidad de diagnóstico, sensibilidad y valores de recorte positivos para ambas pruebas, el nuevo ensayo múltiple de Lyme y WB.

El aspecto Bayesiano requirió dos grupos con diferente prevalencia de indicadores de enfermedad de otra forma el modelo Bayesiano que se utilizó para estimar parámetros se vuelve no identificable (Wang y otros 2006, Wang y otros 2007). De esa forma, las muestras de suero se dividieron artificialmente en dos grupos. Todas las muestras recolectadas entre julio y diciembre del 2008 (n=408) se asignaron en el grupo 1, todas las muestras recolectadas entre enero y junio del 2009 (n = 156) estuvieron en el grupo 2. Esta separación se basó en la suposición que la prevalencia de anticuerpos a B. burgdorferi, como indicadores de enfermedad de Lyme, es superior de julio a diciembre que durante los primeros 6 meses del año. El análisis mostró que esta suposición fue verdadera para anticuerpos para OspC y OspF y se realizó el análisis. Para OspA, la prevalencia entre los dos grupos fue similarmente baja y el aspecto Bayesiano no podría utilizarse para el ensayo OspA.

Resultados Desarrollo de un ensayo múltiple equino para detección de anticuerpos para B. burgdorferi Se utilizó un total de 81 sueros de caballo pre-probados con o sin anticuerpos para B. burgdorferi para establecer las condiciones de los ensayos basados en perla fluorescente. Las perlas se acoplaron con antígenos OspA, OspC u OspF recombinantes de B. burgdorferi. La medida de los anticuerpos de suero con estos antígenos se comparó al correr los ensayos en perlas individuales (individual) y también por análisis múltiple (Figura 7). El análisis individual y múltiple dio como resultado anticuerpos para B. burgdorferi altamente correlacionados. Los valores de clasificación Spearman para las comparaciones de antígeno individuales fueron 0.77, 0.83 y 0.96 para OspA, OspC y OspF, respectivamente. Los valores de fondo para el ensayo múltiple fueron <10% MFI para OspA y OspC y <100 MFI para OspF (Cuadro 6). Las 81 muestras de suero resultaron en MFI entre 347-21,650 para OspA, 75-3842 para OspC, y 192-23,209 para OspC confirmando el rango dinámico amplio del ensayo múltiple de Lyme.

Cuadro 6: Valores de intensidad de fluorescencia media (MFI) (medio, rango) y valores de fondo de un ensayo múltiple basado en perla fluorescente para anticuerpos para antígenos OspA, OspC y OspC de B. burgdorferi en suero equino (n = 562) Antecedentes3 WB negativa WB positiva OspA 3.5 (2.5-8.0) 866 (160-20,451) 2317 (206-27,471) OspC 4.7 (3.0-8.0) 439 (59-4702) 1106 (128-9261) OspF 85.0 (62.5-96.5) 848 (209-14,550) 2560 (217-25,961) a Se obtuvieron valores de fondo de 18 corridas separadas del ensayo múltiple sin suero WB= tinción Western Validación del ensayo múltiple de Lyme equino La validación del ensayo múltiple para anticuerpos para OspA, OspC y OspF se realizó al comparar resultados múltiples con los resultados correspondientes obtenidos mediante WB para un total de 562 sueros de caballo. Mediante WB, los anticuerpos para OspC y OspF pueden detectarse en caballos que fueron infectados con B. burgdorferi después de mordidas de garrapata. Los anticuerpos para OspA se consideraron por desarrollarse después de vacunación contra la enfermedad de Lyme (Figura 6). Los valores MFI obtenidos por el ensayo múltiple se compararon con muestras de suero de WB negativa y positiva. Esto mostró un claro aumento de valores MFI en muestras positivas WB comparadas con muestras negativas WB para cada uno de los antígenos individuales (Figura 8). A pesar de estas claras diferencias en los valores MFI generales, el análisis también mostró un traslape entre los valores MFI de muestras negativas y positivas WB (Cuadro 6) que requirieron evaluación adicional de los valores de recorte de ensayos múltiples por varios aspectos estadísticos.

Análisis utilizando de WB como un 'estándar de oro relativo' WB únicamente puede considerarse como un 'estándar de oro relativo' debido a su sensibilidad analítica relativamente deficiente y el componente selectivo involucrado en evaluación WB. Sin embargo, se crearon curvas ROC al comparar los resultados de ensayo múltiple para ensayos de OspA, OspC u OspF individuales para la presencia de la banda correspondiente en WB o no. Las áreas bajo la curva ROC f ueron 0.765 para OspA, 0.773 para OspC y 0.738 para OspF. Debido a los valores MFI que se traslapan de muestras negativas WB y positivas WB (Figura 8), también se realizó un análisis de relación de probabilidad para establecer tres rangos de interpretación, negativo, equivoco y positivo, para cada uno de los ensayos basados en perla. También se calcularon valores de sensibilidad y especificidad de diagnóstico basados en valores de recorte positivos del análisis de probabilidad (Cuadro 7).

Cuadro 7: Rangos de interpretación del ensayo múltiple basado en perla fluorescente para anticuerpos para OspA, OspC y OspF de B. burgdorferi en suero equino Ensayo % Positivo % Falso LR+ Sensibilidad Especificidad múltiple (MFI) Verdadero positivo (%) (%) (WBpos) (WBneg) Negativo <1000 18.6 57.6 0.323 Equívoco =1000-2000 32.6 27.4 1.19 Positivo >2000 48.8 15.0 3.25 49 85 OspC Negativo <500 19.1 59.2 0.323 Equivoco =500-1000 25.0 26.5 0.943 Positivo >1000 55.9 14.3 3.91 56 86 OspF Negativo <750 15.4 42.4 0.363 Equívoco =750-1250 12.5 24.4 0.512 Positivo >1250 72.0 33.2 2.17 72 67 LR = relación de probabilidad Validación de ensayo en la ausencia de un estándar de oro verdadero utilizando modelo Bayesiano Para tomar en cuenta la WB muy probablemente también resultó en varios errores de interpretación que se realizaron otros análisis utilizando un aspecto Bayesiano que estima sensibilidades y especificidades de diagnóstico para ambas pruebas que se compararon. El análisis requirió dos flujos experimentales con diferente prevalencia. Los datos se obtuvieron de envíos de muestra dentro de un año y se dividieron artificialmente en sueros enviados entre julio a diciembre (grupo 1) y las muestras enviadas entre enero a junio (grupo 2) asumiendo una prevalencia de enfermedad de Lyme superior en el grupo 1. El análisis confirmó que la prevalencia de anticuerpos a B. burgdorferi fue superior en el grupo 1 para los dos marcadores de infección OspC y OspF, pero no para el marcador de vacunación OspA. De esa forma, el modelo únicamente podría correr en resultados para anticuerpos para OspC y OspF y compararse con ensayo basado en perla y la WB como dos pruebas independientes, ninguna de ellas aquí un estándar de oro (Cuadro 8). Para anticuerpos para OspC, el ensayo basado en perla resultó en una sensibilidad de diagnóstico de 80% y una especificidad de diagnóstico de 79%. La WB de OspC tuvo una sensibilidad únicamente de 72% y una especificidad de 92%. Para anticuerpos para OspF, la sensibilidad fue de 86% y especificidad 69% para el ensayo basado en perla. La WB de OspF tuvo una sensibilidad de 80% y una e specificidad de 77%. El análisis Bayesiano sugirió q ue se obtuvo mayor número de falsos negativos por WB que por análisis múltiple. Los valores de especificidad superiores de WB fueron indicativos de números bajos de falsos positivos detectados por esta prueba. Los valores de recorte para los ensayos basados en perla OspC y OspF fueron 813 y 1270 MFI, respectivamente, que cae en los rangos de interpretación equívoca (OspC) o positiva muy baja (OspF) como se define por el análisis de probabilidad (Cuadros 7 y 8).

Cuadro 8: Análisis estadístico Bayesiano que compara el nuevo ensayo múltiple y tinción Western (WB) para anticuerpos para OspC u OspF de B. burgdorferi Proteína de Prueba Sensibilidad (%) Especificidad Valor de recorte superficie óptimo exterior de B, (múltiple) burgdorferi OspC Múltiple 80 (68-90) 79 (73-85) 813 WB 72 (55-89) 92 (88-96) NA OspF Múltiple 86 (77-93) 69 (60-79) 1270 WB (70-89) 77 (69, 88) NA Se expresó sensibilidad y especificidad de ensayo de diagnóstico en términos de valores óptimos con nivel de intervalo de 95% creíble.

NA = no aplicable debido a que WB es una prueba cualitativa y de esa forma no tiene valores de recorte Será evidente a partir de lo anterior que en este Ejemplo se utilizó antígenos OspA, OspC y OspF expresados por E. Coli de B. burgdorferi para desarrollar un nuevo ensayo múltiple para la detección de anticuerpos indicativos para la enfermedad de Lyme. Un reto mayor en la validación del nuevo ensayo múltiple fue la ausencia de un estándar de oro verdadero para establecer valores de recorte, rangos de interpretación, y valores de sensibilidad y especificidad de diagnóstico. WB para detección de anticuerpos para B. burgdorferi se considera una prueba confirmatoria y el mejor estándar disponible para el diagnóstico de Lyme serológico. El uso de WB como un estándar de oro para validación de prueba asume un 100% de sensibilidad y especificidad de diagnóstico para este método. Basando en este hecho una nueva prueba nunca puede ser mejor que la prueba existente al utilizar métodos de estándar de oro convencionales. Sin embargo, WB e s una prueba c ualitativa y tiene limitaciones con respecto a su sensibilidad analítica, variaciones día a día en desarrollo de tinción y su evaluación subjetiva que puede resultar en una mala interpretación de bandas incluso por evaluadores experimentados (ver Ejemplo 1). Aunque la interpretación de resultados WB es directa para muestras con titulaciones de anticuerpo muy altas o en caballos experimentalmente infectados mantenidos en aislamiento, puede ser más difícil en situaciones clínicas cuando el historial de infecciones es desconocido y/o para sueros que contienen niveles de anticuerpo inferiores para B. burgdorferi. Estas características de evaluación de WB, junto con las diferencias esperadas en sensibilidades analíticas entre WB y tecnología múltiple, se provocaron explorar diferentes aspectos estadísticos para validar el nuevo ensayo múltiple de Lyme. Los análisis de curva ROC y de re ación de probabilidad convencionales se realizaron bajo la suposición de que WB es un verdadero estándar de oro, es decir, 100% preciso. El aspecto de modelo Bayesiano puede analizar pruebas de diagnóstico en ausencia de un estándar de oro (Wang y otros 2006, Wang y otros 2007) y WB comparado y ensayos múltiple como pruebas iguales. Por lo tanto, el análisis resultó en datos de sensibilidad y especificidad de diagnóstico para ambos ensayos. Aunque todas estas suposiciones pueden no ser completamente verdaderas debido a que dos pruebas obviamente difieren demasiado en sus sensibilidades analíticas, los análisis Bayesianos nos permitieron estimar la sensibilidad y especificidad de diagnóstico del nuevo ensayo múltiple de forma más precisa al tomar en cuenta que WB no es un verdadero estándar de oro, es decir, no es 100% correcto. Consecuentemente, los valores de sensibilidad y especificidad de diagnóstico para el ensayo múltiple de Lyme fueron más altos en el método Bayesiano que en el aspecto de 'estándar de oro relativo'. El análisis de estándar de oro convencional sugirió valores de 56% y 72% para sensibilidad y 86% y 67% para especificidad de los ensayos basados en perla de OspC y OspF, respectivamente. Basándose en la discusión en WB anterior, estos resultados probablemente subestimaron la especificidad y sensibilidad verdaderas del ensayo múltiple. El modelo Bayesiano confirmó la última declaración en WB y calculó una sensibilidad de diagnóstico inferior pero especificidad de diagnóstico superior para WB comparado con ensayos basados en perla de OspC y OspF. Los análisis Bayesianos resultaron en sensibilidades de diagnóstico de 80% para OspC y 86% para OspF en el ensayo múltiple comparado con 72% y 80%, respectivamente, por WB. Los valores de sensibilidad de diagnóstico del ensayo múltiple mejoraron claramente comparado con el aspecto de estándar de oro convencional y reflejaron mejor los valores de sensibilidad de diagnóstico reales debido a la sensibilidad analítica mejorada de detección de anticuerpo por análisis múltiple (pg/ml) comparado con WB ^g/ml). La especificidad de diagnóstico del ensayo múltiple utilizando análisis Bayesiano fue 79% para OspC (WB 92%) y se 69% para OspA (WB 77%) que también puede mejorar para OspF y ligeramente inferior para OspC comparado con los cálculos basados en estándar de oro. Una razón para la diferencia en valores de especificidad para el ensayo OspC es la mayor diferencia en valores de recorte para OspC por los dos métodos estadísticos que aplican el valor de recorte inferior para OspC en el cálculo del aspecto Bayesiano que el análisis de estándar de oro.

También se utilizaron análisis de estándar de oro y Bayesianos para establecer valores de recorte para anticuerpos para OspC y OspF. Para OspC, el análisis de relación de probabilidad sugirió un valor de recorte positivo de >1000 MFI y el aspecto Bayesiano identificó un valor de recorte inferior de 813 MFI. Para OspF, el análisis de probabilidad encontró >1250 MFI como el recorte positivo óptimo que fue casi idéntico al recorte de 1270 MFI en el aspecto Bayesiano. Al considerar el rango dinámico amplio del ensayo múltiple que resultó para el grupo de muestra en valores MFI de casi 10.000 para OspC y >25.000 para OspF, los valores de recorte sugeridos confirmaron el amplio rango dinámico de esta prueba que permite un análisis cuantitativo detallado de anticuerpos a B. burgdorferi en suero equino. El amplio rango de cuantificación dinámico es una ventaja considerable del aspecto múltiple comparado con pruebas cuantitativas actualmente existentes tal como ELISA que tienen un rango de cuantificación lineal más bien estrecho (Wagner y Freer 2009). En experiencia, la ventaja más considerable del rango dinámico lineal aumentado es que los sueros pueden utilizarse en una dilución individual en el ensayo múltiple y los resultados casi siempre se adaptan en el rango de cuantificación lineal del ensayo con la excepción de muy poco resultados que aún caen en la bandeja superior del ensayo, es decir estos sueros contienen concentraciones muy atrás de anticuerpos para el antígeno Osp de B. burgdorferi respectivo.

Los ELISA de Lyme convencionales actuales frecuentemente se basan en lisados de B. burgdorferi enteros y no distinguen entre infección y vacunación. Estos ensayos descubren el riesgo de reactividad cruzada no específica a componentes bacterianos comunes en la mezcla de lisado (Lindenmayer y otros 1990, Shin y otros 1993, Jacobson y otros 1996). De esa forma si son positivos, estos ensayos necesitan una segunda prueba confirmatoria, tal como una WB cualitativa. En situaciones en donde la cuantificación de anticuerpos se requiere, por ejemplo para determinar el éxito de tratamiento antibiótico en caballos con enfermedad de Lyme, las pruebas siempre requirieron dos pruebas: primero, una ELISA cuantitativa para confirmar la disminución de anticuerpo y una segunda prueba WB para confirmar que la disminución fue específica para anticuerpos indicativos para la enfermedad de Lyme. Se encontraron otras pruebas laterales (pruebas basadas en palo) o pruebas basadas en ELISA tales como la determinación de anticuerpos para C6 para correlacionarse bien con infección de caballos con el patógeno de Lyme (Johnson y otros 2008, Hansen y otros 2010, Maurizi y otros 2010). Sin embargo, no pareció que los anticuerpos para C6 se detectaran temprano o detectaran más rápidamente que anticuerpos detectados por una ELISA de B. burgdorferi convencionales (Johnson y otros 2008).

Ambos, WB y el nuevo ensayo múltiple de Lyme pueden distinguir entre anticuerpos que resultaron de infección natural con S. burgdorferi y aquellos desarrollados después de vacunación. La última respuesta se caracteriza por altos valores para anticuerpos para el antígeno OspA de B. burgdorferi como se describió frecuentemente en seres humanos, roedores de laboratorio, perros (Fikrig y otros 1990, Schaible y otros 1990, Jacobson y otros 1996, Wittenbrink y otros 1996, Wieneke y otros 2000, Tópfer y Straubinger 2007) y también en caballos (Chang y otros 2000b). Las vacunas de Lyme aprobadas para usarse en caballos no existen actualmente. De esa forma, las vacunas para perros algunas veces se utilizan para caballos que están alojados en áreas en donde la enfermedad de Lyme es endémica (Divers 2009). La ausencia de una vacuna aprobada explica los números bajos generales de sueros equinos positivos OspA (43 de 562) en el grupo de muestra. El modelo Bayesiano no podía realizarse en este grupo de datos para anticuerpos para OspA debido a que la prevalencia de anticuerpos para OspA entre los dos grupos fue similar. Esto no es sorprendente debido a que la vacunación puede realizarse en cualquier momento y no necesariamente sigue picos temporales como infección con B. burgdorferi que depende de la ocurrencia de garrapatas infectadas en el ambiente. Para caballos vacunados alojados en áreas endémicas la evaluación cuantitativa de titulaciones de vacunación es información valiosa que puede dirigir la decisión para volver a vacunar o no para prevenir enfermedad de Lyme en estos caballos. El nuevo ensayo múltiple es la primera curva disponible que cuantifica respuestas de anticuerpo para el marcador de vacunación OspA y también es capaz de distinguir respuestas de huésped a vacunación de aquellos para infección. Las respuestas de vacunación pueden caracterizarse por anticuerpos para OspA únicamente o para OspA y OspC dependiendo de la vacuna utilizada. OspF no se incluye en vacunas actualmente disponibles y de esa forma permanece un marcador con infección incluso si se vacunó el caballo.

En resumen, el uso de dos aspectos estadísticos para validar el nuevo ensayo múltiple de Lyme para caballo resultó en un recorte similar y valores de sensibilidad y especificidad de diagnóstico para los marcadores de infección OspC y OspF. El análisis también resultó en la primera evaluación de especificidad y sensibilidad de diagnóstico de WB, el estándar de oro tradicional para análisis de anticuerpos para B. burgdorferi. El desempeño general del ensayo múltiple mostró que éste es una prueba valiosa con sensibilidad analítica y diagnóstico probablemente mejorado comparado con WB. El nuevo ensayo múltiple de Lyme para caballos proporciona una herramienta valiosa, rápida, sensible y cuantitativa para la detección de anticuerpos indicativos para infección con. y/o vacunación contra enfermedad de Lyme en caballos.

Aunque la invención ha sido descrita a través de ejemplos ilustrativos, serán evidentes modificaciones de rutina para aquellos expertos en la técnica, cuyas modificaciones pretenden estar dentro del alcance de la invención.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para diagnosticar un estado de la enfermedad de Lyme en un mamífero que comprende, en una muestra biológica obtenida y derivada del mamífero, determinar la presencia o ausencia de anticuerpos para proteínas de superficie exterior (Osp) de Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi) , OspA, OspC, y OspF, y basado en la presencia o ausencia de los anticuerpos, identificar al mamífero como infectado o no infectado con B. burgdorferi.

2.- El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el mamífero es un caballo o un perro.

3.- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los únicos anticuerpos para antígenos de B. burgdorferi determinados en el método son anticuerpos para OspA, OspC, y OspF de B. burgdorferi.

A.- El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el mamífero se identifica como no infectado con B. burgdorferi al determinar una ausencia de los anticuerpos para los antígenos OspA, OspC y OspF.

5.- El método de acuerdo con la reivindicación 1 , que además comprende determinar que el animal tiene una infección de B. burgdorferi temprana, intermedia o crónica basándose en la determinación de la presencia o ausencia de los anticuerpos.

6.- El método de acuerdo con la reivindicación 1 , que además comprende determinar si el mamífero ha sido vacunado contra infección de B. burgdorferi basándose en la determinación de la presencia o ausencia de los anticuerpos.

7. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la determinación de la presencia o ausencia de los anticuerpos se determina utilizando un dispositivo de flujo lateral.

8. - El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la determinación de la presencia o ausencia de los anticuerpos se determina utilizando un ensayo múltiple basado en perla floreciente.

9. - Un método para diagnosticar un estado de la enfermedad de Lyme en un mamífero que comprende, en una muestra biológica obtenida o derivada del mamífero, determinar un nivel de prueba de anticuerpos para proteínas de superficie exterior (Osp) de Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi), OspA, OspC, y OspF, y basándose en una comparación del nivel de prueba de los anticuerpos OspA, OspC, y OspF a una referencia, identificar al mamífero como vacunado contra B. burgdorferi y/o como teniendo una infección de B. burgdorferi temprana, intermedia o crónica.

10. - El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde los únicos anticuerpos para proteínas de B. burgdorferi determinados en el método son anticuerpos para OspA, OspC, y OspF de B. burgdorferi.

11. - El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el mamífero se identifica como no infectado con B. burgdorferi al determinar una ausencia de los anticuerpos para las proteínas OspA, OspC y OspF.

12.- El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la determinación de la presencia o la ausencia de los anticuerpos se determina utilizando un ensayo múltiple basado en perla fluorescente.

13.- El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la referencia es un rango de valores para intensidades de fluorescencia media.

14.- Un método para diagnosticar un estado de la enfermedad de Lyme en un mamífero que comprende, en una muestra biológica obtenida derivada del mamífero, determinar la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para OspA, OspC, y OspF de proteínas de superficie exterior (Osp) de Borrelia burgdorferi (B. burgdorferi), y: i) identificar al mamífero como vacunado contra pero no infectado por B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspA y una ausencia de anticuerpos para OspC u OspF; ii) identificar al mamífero como teniendo una infección temprana de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspC y una ausencia de cuerpos para OspA y OspF; iii) identificar al mamífero como teniendo infección crónica de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspF y una ausencia de anticuerpos para OspA y OspC; iv) identificar al mamífero como vacunado contra y teniendo una infección temprana de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspA y OspC y una ausencia de a nticuerpos para OspF; v) identificar al mamífero como vacunado contra y que tiene una infección crónica de B. burgdorferi basada en determinar anticuerpos para OspA y OspF y una ausencia de anticuerpos para OspC; vi) identificar al mamífero como teniendo una infección intermedia de B. burgdorferi basado en determinar anticuerpos para OspC y OspF y una ausencia de anticuerpos para OspA; o vii) identificar al mamífero como habiendo sido vacunado contra y que tiene un infección intermedia de B. burgdorferi basado en determinar la presencia de anticuerpos para OspC, OspF y OspA.

15. - Una composición que comprende una proteína aislada que comprende la secuencia de SEC ID NO:15, SEC ID NO:17, SEC ID NO:19, o una combinación de dichas proteínas.

16. - La composición de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende la combinación de proteínas que comprenden SEC ID NO:15, SEC ID NO:16 y SEC ID NO:

17.