MX2012009144A - Anticuerpos contra cxcr4. - Google Patents

Anticuerpos contra cxcr4.

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Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos que se unen al receptor de quimiocina CXC (4) (CXCR4) y que no inducen apoptosis significativa de células que expresan CXCR4. También se proporcionan inter alia inmunoconjugados y composiciones que comprenden tales anticuerpos y métodos y usos que involucran tales anticuerpos, particularmente en el campo médico y de diagnóstico.

Description

ANTICUERPOS CONTRA CXCR4 Descripción de la Invención La presente invención se refiere en general a los campos de anticuerpos, biología CXCR4 y terapias relacionadas. Más particularmente, proporciona anticuerpos que se unen a CXCR4. Tales anticuerpos anti-CXCR4 tienen usos diagnósticos y terapéuticos en enfermedades y afecciones asociadas con CXCR4 , tales como el tratamiento de cáncer e infecciones virales, específicamente VIH, en tratamiento de enfermedades inflamatorias e inmunitarias , el mónitoreo y el pronóstico del crecimiento y avance del tumor, por ejemplo, mediante la formación de imágenes de los vasos sanguíneos de tumor, inhibiendo o reduciendo la formación de metástasis e inhibiendo o reduciendo la angiogénesis . Las composiciones y métodos con base en el anticuerpo de la invención también se extienden al uso de inmunoconjugados y otras combinaciones, kits y métodos terapéuticos.
Con más de 800 miembros, los receptores acoplados a la proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) representan la familia más grande de moléculas de superficie celular involucradas en la transmisión de señal, representando >2% de los genes totales codificados por el genoma humano. Los miembros de la superfamilia GPCR comparten una topología de membrana común: un N-terminal extracelular , y un C-terminal Ref. 233408 intracelular y siete hélices de transmembrana (TM) , que se conectan a través de tres ciclos intracelulares y tres ciclos extracelulares . Sobre las bases de su estructura topológica compartida, los GPCR también son referidos como siete receptores de transmembrana (7TM) . Estos receptores controlan las funciones fisiológicas clave, incluyendo la neurotransmisión, la liberación de hormonas y enzimas de glándulas endocrinas y exócrinas, las respuestas inmunitarias , la contracción del músculo cardiaco y liso, y la regulación de la presión sanguínea. Su disfunción contribuye a algunas de las enfermedades humanas más prevalentes. El surgimiento de datos experimentales y clínicos indica que los GPCR tienen un papel crucial en el avance y la metástasis del cáncer. Por lo tanto, existe la posibilidad de que algunos GPCR puedan ser objetivos adecuados para fármacos anticancerígenos.
Las quimiocinas juegan un papel importante ínter alia en respuestas inmunitarias e inflamatorias en varias enfermedades y trastornos, que incluyen cáncer, infecciones virales, asma y enfermedades alérgicas, así como patologías autoinmunitarias tales como artritis reumatoide y ateroesclerosis . Dependiendo de su estructura, las quimiocinas se clasifican como quimiocinas C-C (que contienen un motivo de cisteína-cisteína) o quimiocinas C-X-C (que contienen un motivo de cisteína-X-cisteína) . Los receptores que unen tales quimiocmas de esta forma se clasifican como miembros de las familias CCR o CXCR, respectivamente.
CXCR4 (también denominado fusina, HM89, LESTR, HUMSTR) es un receptor alfa-quimiocina específico del factor 1 derivado de la estroma (SDF-1, también denominado CXCL12 y PBSF) , una molécula dotada con una potente actividad quimiotáctica para linfocitos. Este receptor es uno de varios receptores de quimiocina que aislan VIH y pueden utilizarse para infectar células T CD4+. Varios tejidos normales se expresan CXCR4. Los ejemplos notables de células en donde la expresión ha sido demostrada, tanto en el término ARNm y la proteína funcional, incluyendo: células hematopoyéticas/células progenitoras de la médula espinal, células del sistema inmunitario, por ejemplo, células T, células pre-B y de plasma, células dendríticas, células NK; otras células sanguíneas, por ejemplo monocitos, mastocitos, plaquetas; células del sistema nervioso, por ejemplo, neuronas, astrocitos, microglia; otras células, por ejemplo, células endoteliales , células del músculo liso vascular, del epitelio gastrointestinal y otras ciertas células epiteliales.
CXCR4 se expresa en una variedad de tumores y juega un papel decisivo en la patofisiología del cáncer, particularmente en la metástasis del cáncer (Dorsam and Gutkind, 2007, G-protein-coupled receptors and cáncer. Nat Rev Cáncer 7: 79-94). La expresión de CXCR4 se ha encontrado en casi todos tumores estudiados. También es de interés que SDF-1 se expresa a niveles particularmente altos en el hígado, los pulmones, la médula espinal, los nodos linfoides, y (en cierta forma en niveles inferiores) en el cerebro, es decir, sitios en los cuales los cánceres típicamente se convierten en metástasis. Las indicaciones potenciales para un agente tal como un anticuerpo que activa CXCR4 incluyen cánceres (por ejemplo, cánceres metastáticos) , por ejemplo, de pecho, de próstata, páncreas, esófago, colorectal, hígado y pulmón (tanto SCLC y NSCLC). , así como melanoma maligno o metastático, tumores cerebrales (glioma) , cáncer de cabeza y cuello, ciertas leucemias, linfomas tales como el linfoma no de Hodgkins, tumores en los niños (por ejemplo, neuroblastoma) , cáncer renal, hemangioblastoma . El CXCR4 sobre-expresado se ha encontrado en varios otros cánceres, que incluyen tumores de pulmón, cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer ovárico, cáncer cervical, carcinomas de tiroides papilar, osteosarcomas , y otras malignidades. Un anticuerpo anti-CXCR4 también puede utilizarse para el tratamiento de infecciones virales tales como VIH u otras infecciones retrovirales, y en el tratamiento de enfermedades inmunitarias tales como las enfermedades autoinmunitarias , enfermedades inflamatorias y en la inhibición de la angiogénesis y la vascularización.
Debido a sus complejas estructuras, los GPCR se consideran como "objetivos difíciles" para producir anticuerpos específicos. No pueden ni purificarse fácilmente de la fracción de membrana de células lisadas, ni se pueden producir recombinantemente en diferentes sistemas de expresión ya que las proteínas solubles se pliegan correctamente .
Las dificultades asociadas con la generación de anticuerpos contra GPCR se establecen en Hoogenboom y otros Eur. J. Biochem 260, 774-784 (1999) . Además, Sui y otros Eur. J. Biochem 270, 4497-4506 (2003) explican las dificultades asociadas con tratar de obtener anticuerpos humanos contra CXCR4 receptor de quimiocina GPCR y reportan que aún utilizando el método explorador combinado con la selección en retroceso no han podido identificarse anticuerpos específicos. De esta forma, en el campo del GPCR, la generación de anticuerpos específicos permanece como un reto principal .
Northwest Biotherapeutics Inc. está desarrollando anticuerpos monoclonales contra CXCR4 , algunos de los cuales están en un desarrollo preclínico en etapa final. Los datos sugieren la eficacia potencial de los anticuerpos CXCR4 que se obtuvieron de modelos en animales a través de NWB y otros . El desarrollo posterior puede incluir la humanización de anticuerpos seleccionados y estudios de toxicidad en la preparación de ensayos clínicos de la Fase I.
MDX-1338 es un anticuerpo monoclonal completamente humano, específico de CXCR4 anti-humano de Medarex. Los estudios in vitro demostraron que MDX-1338 se une a las células que expresan CXCR4 con una baja afinidad nanomolar. MDX-1338 bloquea al ligando CXCL12 que se une a las células que expresan CXCR4 e inhibe la migración inducida por CXCL12 y el flujo de calcio con valores EC50 nanomolares bajos. MDX-1338 es un IgG4 , y de esta forma carece de la actividad de ADCC y CDC. MDX-1338 induce la apoptosis en el intervalo de las líneas de células que expresan CXCR4 y también tiene actividad anti-tumoral en modelos de xenoinjerto tumorales de AML múltiple y linfoma.
Además, existe un número de compuestos de células pequeñas y péptidos en diferentes etapas de desarrollo que activan CXCR4/SDF-1.
Los inventores han reconocido que la identificación de anticuerpos adicionales que reconocen CXCR4 sería benéfica en la expansión del número de opciones terapéuticas. Como se explica anteriormente, sin embargo, la naturaleza de los GPCR tal como CXCR4 significa que el desarrollo de tales anticuerpos posee retos reales.
En particular, existe una necesidad de anticuerpos humanos para CXCR4 que reconocen CXCR4 en su forma unida de membrana nativa. Aunque los anticuerpos humanos generalmente se reconoce que despliegan ventajas, se sabe que el desarrollo de los anticuerpos humanos que tienen afinidades lo suficientemente altas y las propiedades funcionales apropiadas para convertirlos en candidatos para terapia humana exitosa es a través de medios no directos. Esto se presenta aún más en el caso del GPCR, debido a su naturaleza compleja y de transmembrana.
La presente invención supera ciertas imitaciones de la técnica anterior proporcionando nuevas composiciones y métodos terapéuticos para utilizarse en el tratamiento seguro y efectivo de tumores, infecciones virales y otras enfermedades y afecciones en donde las células CXCR4+ están involucradas, tales como los trastornos inflamatorios o inmunitarios . La invención proporciona anticuerpos que se unen a CXCR4, preferiblemente a un epítopo dentro de uno o más dominios extracelulares de CXCR4, particularmente anticuerpos humanos. Tales anticuerpos son efectivos en el tratamiento de tumores e infecciones virales y otras enfermedades y trastornos en donde las células CXCR4+ están involucradas, tales como trastornos inflamatorios inmunitarios. Las composiciones y métodos de la invención también se extienden al uso de inmunoconjugados y combinaciones que utilizan esta categoría particular de anticuerpos.
Una ventaja particular de los anticuerpos de la presente invención es que los anticuerpos no inducen una apoptosis significativa de las células que expresan CXCR4. Esto está en contraste con anticuerpos principales en el campo clínico (por ejemplo, los anticuerpos Medarex como se describe en WO 2008/060367), que inducen tal apoptosis. Como CXCR4 se expresa en un número significativo de células normales, esto carece de inducción de apoptosis en una ventaja terapéutica real para evitar la muy alta aniquilación de células indeseadas y tales anticuerpos de esta forma tienen un perfil de seguridad favorable.
Una propiedad preferible adicional o alternativa de los anticuerpos de la invención descritos en la presente es que los anticuerpos son anticuerpos antagónicos. De esta forma la propiedad de no inducir apoptosis significativa preferiblemente también se combina con la propiedad de que los anticuerpos son anticuerpos antagónicos, es decir, bloq ean o inhiben la función de CXCR4 , a través de por ejemplo muestreando el bloqueo o la inhibición de la interacción de receptor-ligando y/o bloqueando o inhibiendo los eventos de señalización en corriente abajo del receptor CXCR4, por ejemplo, bloqueando o inhibiendo la señalización mediada o inducida por el ligando a través de CXCR4. Esta propiedad es importante para el uso de los anticuerpos en terapia según opuesto a su uso meramente para la marcación de células que expresan CXCR4 , por ejemplo, para diagnóstico.
A este respecto, se sabe que CXCR4 se expresa en un amplio intervalo de células sanas/normales y que ambos CXCR4 y su ligando SDF-1 son importantes en el desarrollo. Sin embargo, como se explica anteriormente, también se ha demostrado que CXCR4 se sobre-expresa en la mayor parte de todos los tumores malignos, y contribuye a su crecimiento. Quizás aún más de manera importante, SDF-1 usualmente se expresa fuertemente en aquellos tejidos que es más probable que lleven metástasis, tales como los nodos linfoides, médula espinal, pulmón, hígado, etc., y es ampliamente aceptado que las células tumorales migran a lo largo de un gradiente SDF-1. El propósito principal de los anticuerpos de la invención por consiguiente es limitar el crecimiento del tumor y evitar la formación de metástasis mediante la inhibición de la función de CXCR4 , por ejemplo, bloqueando o inhibiendo la interacción de receptor-ligando . CXCR4 también se cree que está involucrado en la angiogénesis , de esta forma bloquea o inhibe la función de CXCR4 que también puede utilizarse para efectuar la angiogénesis y la vascularización tumoral.
El bloqueo o la inhibición de la función, en particular mediante el bloqueo o la inhibición de la interacción del receptor- ligando, también es importante en el uso de anticuerpos de la invención para tratar enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias . De nuevo, el objetivo principal no es aniquilar las células CXCR4+, sino regular de manera descendente su actividad (en enfermedades autoinmunitarias) y evitar o reducir la migración de las células CXCR4+ a sitios de inflamación (útil tanto en enfermedades inflamatorias como autoinmunitarias) .
La actividad antagónica (bloqueo o inhibición de la función de CXCR4) también es importante en el uso de anticuerpos de la invención para tratar infecciones, por ejemplo, infecciones virales, bacterianas, fúngicas o parasíticas en donde CXCR4 juega un papel funcional. Los ejemplos de tales infecciones virales son infecciones retrovirales , y en particular VIH, en donde algunas cepas (cepas trópicas CXCR4) han demostrado que utilizan al receptor CXCR4 para infectar células hospederas. De esta forma, el bloqueo o inhibición del receptor CXCR4 puede limitar la diseminación de VIH, por ejemplo, mediante el bloqueo o la inhibición de la infección de células CXCR4+ por VIH.
A pesar de esto, como se explica anteriormente, se cree que el modo principal de acción de los anticuerpos de la invención es a través de sus propiedades antagónicas (ventajosamente combinada con su habilidad de no inducir apoptosis significativa de células CXCR4+) , en algunas modalidades los anticuerpos de la invención son capaces de inducir la eliminación selectiva (aniquilación) de células CXCR4+. Tal eliminación selectiva puede ser a través de mecanismos tales como ADCC, CDC, o la inducción de una catástrofe mitótica (en particular en la división de células tales como células de tumor) pero parece que no involucra la inducción de apoptosis significativa.
Los inventores de la presente han preparado anticuerpos específicos CXCR4 que se unen a CXCR4.
Por ejemplo, los anticuerpos se unen a células CXCR4+, tales como células transíectadas con CXCR4 y células que naturalmente expresan CXCR4. En particular, los anticuerpos se unen a células HEK293T, transíectadas con CXCR4, las células DT40 transíectadas con CXCR4 y Ramos (células B) , Jurkat (leucemia de célula T) y CCRF-CEM (leucemia de célula T humana) que naturalmente expresan CXCR4 (ver Ejemplos 2, 3 y 4) .
De manera importante, los anticuerpos no se unen específicamente a células CXCR4 , es decir, células que no expresan CXCR4. En particular, los anticuerpos no se unen específicamente a células transíectadas no CXCR4 , o a células que naturalmente no expresan CXCR4.
Los anticuerpos también inhiben la unión de los ligandos que se sabe que se unen a CXCR4 , por ejemplo, el ligando natural SDF-la (también referido en la presente como SDF-1) y/u otros ligandos (por ejemplo, ligandos no nativos) que se unen a CXCR4 , tal como AMD-3100 (un compuesto químico con muy alta especificidad para CXCR4 y que inhibe CXCR4) (ver Ej emplo 3 ) .
De esta forma, los anticuerpos descritos en la presente se unen específicamente a CXCR4 , convirtiéndolos' en candidatos adecuados para diagnósticos y terapia de las afecciones explicadas en la presente.
Las secuencias de aminoácido y/o de ADN de las moléculas de anticuerpo preferidas de la invención que se unen a CXCR4 , sus dominios VH y VL incluyendo regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), se explican en varias SEC ID NOs . enumeradas en la presente De esta forma, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene una propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4. Preferiblemente el anticuerpo es un anticuerpo antagónico que bloquea o inhibe una o más de las funciones de CXCR4, por ejemplo, bloquea o inhibe la unión de SDF-1 (u otro ligando CXCR4 tal como A D-3100) a CXCR4 , bloquea o inhibe la migración de células CXCR4+ en respuesta a SDF-1 (u otro ligando CXCR4) , bloquea o inhibe el flujo de Ca2+ inducido por la adición de SDF-1 (u otro ligando CXCR4) a células CXCR4+, o bloquea o inhibe cualesquiera otros eventos de señalización en corriente abajo del receptor CXCR4.
Preferiblemente, el anticuerpo se aisla. También preferiblemente, el anticuerpo es humano y/o el CXCR4 es preferiblemente humano. Preferiblemente, el anticuerpo se une a un epítopo en el dominio extracelular de CXCR4. De esta forma, cualquier referencia a "unión a CXCR4" incluye una modalidad preferida de "la unión a un epítopo en el dominio extracelular de CXCR4" . Otras propiedades preferidas de los anticuerpos de la invención son uno o más de la habilidad de inducir ADCC de células que expresan CXCR4 (células CXCR4+) , la habilidad de inducir CDC de células que expresan CXCR4 y la habilidad de unirse a por lo menos un CXCR4 humano, más preferiblemente a CXCR4 humano y de mono o a CXCR4 de humano y ratón, más preferiblemente a CXCR4 de humano, ratón y mono. Cuando se observa una reactividad de especie cruzada, aún más preferiblemente los anticuerpos se unen a CXCR4 de humano y mono, o de humano y ratón con afinidades similares. Preferiblemente los anticuerpos de la invención despliegan actividad anti-tumoral , por ejemplo, la inhibición del crecimiento de las células tumorales, in vivo.
De esta forma, la invención preferiblemente provee un anticuerpo humano aislado que se une a un epítopo en el dominio extracelular de CXCR4 humano y que preferiblemente tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4. De esta forma, en todas las modalidades descritas en la presente, la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 es una característica preferida.
En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4, que comprende un dominio CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, 7, 13, o 19, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de estas secuencias.
Alternativamente o además de, en una modalidad de la invención, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 2,- 8, 14, o 20, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de estas secuencias.
Alternativamente o además de, en una modalidad de la invención, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, 9, 15 ó 21, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de estas secuencias.
Alternativamente o además de, en una modalidad de la invención, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende un dominio CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4, 10, 16, 22 ó 88, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de estas secuencias.
Alternativamente o además de, en una modalidad de la invención, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 5, 11, 17, 23, o 89, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de estas secuencias.
Alternativamente o además de, en una modalidad de la invención, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6, 12, 18, 24 ó 90, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de estas secuencias.
De esta forma, en ciertas modalidades, la invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende uno o más dominios CDR de cadena pesada, en donde el dominio CDR de cadena pesada se selecciona del grupo que consiste de: (a) un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, 7, 13, o 19, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (b) un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 2, 8, 14, o 20, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (c) un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, 9, 15 ó 21, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
La invención también proporciona, en ciertas modalidades un anticuerpo para unirse a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende uno o más dominios CDR de cadena ligera, en donde el dominio CDR de cadena ligera se selecciona del grupo que consiste de: (a) un dominio CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4, 10, 16, 22 ó 88, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (b) un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 5, 11, 17, 23 ó 89, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (c) un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6, 12, 18, 24 ó 90, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende ambas : (a) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma y (b) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Más preferiblemente, un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 5, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, también está presente.
En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende ambas : (a) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 9, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y (b) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Más preferiblemente, un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 11, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, también está presente.
En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende ambas : (a) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 15, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y (b) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Más preferiblemente, un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 17, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, también está presente.
En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende ambas : (a) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma, y (b) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 24, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma.
Más preferiblemente, un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 22, ' o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 23, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, también está presente.
En ciertas modalidades preferidas, el anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprende ambas : (a) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y (b) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 90, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Más preferiblemente, un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 88, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 89, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, también está presente.
En una modalidad preferida, la CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
En aún otra modalidad preferida, la CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 5, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
En una modalidad preferida, la CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 9, o una secuencia sustancialmente homóloga a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
En aún otra modalidad preferida, la CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, GDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 11, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
En una modalidad preferida, la CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, CDR2 que comprende la secuencia de ' aminoácido de SEC ID NO: 14, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
En aún otra modalidad preferida, la CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 17, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
En una modalidad preferida, la CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
En aún otra modalidad preferida, la- CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 22, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 23, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 24, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
En aún otra modalidad preferida, la CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 88, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 89, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 90, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, están presentes individualmente o en combinación.
Visto alternativamente, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 5, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir- apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 9, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 17, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR , que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 24, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 23, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 22, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 90, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 89, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 88, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Visto alternativamente, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo para unirse a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 5, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo para unirse a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8, 0 una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 9, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo para unirse a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 17, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende . un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
Visto alternativamente, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo para unirse a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 23, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 24, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 22, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Visto alternativamente, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo para unirse a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 89, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 90, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 88, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
Visto alternativamente, en ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4, que comprende un dominio CDRl de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 5, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 9, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un .dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de •cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 17, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 22, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 24, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 23, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o uñ dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 88, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Tal anticuerpo opcionalmente además comprende un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 90, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o además comprende un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 2, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 89, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
Ciertos anticuerpos preferidos de la invención comprenden una o más de las CDR seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID NOs : 1, 2, 3, 4, 5 y 6, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores .
Ciertos anticuerpos preferidos de la invención comprenden una o más de las CDR seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11 y 12, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores.
Ciertos anticuerpos preferidos de la invención comprenden una o más de las CDR seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID NOs : 13, 14, 15, 16, 17 y 18, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores.
Ciertos anticuerpos preferidos de la invención comprenden una o más de las CDR seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID NOs: 19, 20, 21, 22, 23 y 24, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores .
Ciertos anticuerpos, preferidos de la invención comprenden una o más de las CDR seleccionadas del grupo que consiste de SEC ID NOs : 1, 2, 3, 88, 89 y 90, o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores .
Ciertos anticuerpos preferidos comprenden dos o más de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs : 4, 5 y 6 ; o 10, 11 y 12; o 16, 17 y 18; o 22, 23 y 24; o 88, 89 y 90, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores.
Las moléculas de unión especialmente preferidas comprenden 3 de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs: 4, 5 y 6; o 10, 11 y 12; o 16, 17 y 18; o 22, 23 y 24; o 88, 89 y 90, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores (es decir, una de cada una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena ligera antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) .
Otros ciertos anticuerpos preferidos comprenden dos o más de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs : 1, 2 y 3 ; o 7, 8 y 9; o 13, 14 y 15; o 19, 20 y 21, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores .
Los anticuerpos especialmente preferidos comprenden 3 de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs: 1, 2 y 3; o 7, 8 y 9; o 13, 14 y 15; o 19, 20 y 21, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las SEC ID NOs anteriores (es decir, una de cada una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena pesada antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) .
Ciertos anticuerpos más especialmente preferidos comprenden 3 de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs: 4, 5 y 6, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena ligera antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) , y 3 de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs : 1, 2 y 3, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena pesada antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) .
Ciertos anticuerpos más especialmente preferidos comprenden 3 de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs: 10, 11 y 12, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena ligera antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) , y 3 de las CDR de cadena pesada de SÉC ID NOs : 7, 8 y 9, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena pesada antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) .
Ciertos anticuerpos más especialmente preferidos comprenden 3 de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs : 16, 17 y 18, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena ligera antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) , y 3 de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs: 13, 14 y 15, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada ' una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena pesada antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) .
Ciertos anticuerpos más especialmente preferidos comprenden 3 de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs : 22, 23 y 24, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDR1 y CDR2 y CDR3 de cadena ligera antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) , y 3 de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs: 19, 20 y 21, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDRl y CDR2 y CDR3 de cadena pesada antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) .
Ciertos anticuerpos más especialmente preferidos comprenden 3 de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs: 88, 89 y 90, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDRl y CDR2 y CDR3 de cadena ligera antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) , y 3 de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs: 1, 2 y 3, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de estas secuencias (es decir, una de cada una de las CDRl y CDR2 y CDR3 de cadena pesada antes mencionadas o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) .
Ciertos anticuerpos específicos preferidos comprenden un dominio CDRl de cadena pesada de SEC ID NO : 1 , un dominio CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 2, y un dominio CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 3, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas; y/o comprenden un dominio CDRl de cadena ligera de SEC ID NO: 4, un dominio CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 5, y un dominio CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 6, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
Ciertos anticuerpos específicos preferidos comprenden un dominio CDRl de cadena pesada de SEC ID NO: 7, un dominio CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 8, y un dominio CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 9, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas; y/o comprenden un dominio CDRl de cadena ligera de SEC ID NO: 10, un dominio CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 11, y un dominio CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 12, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
Ciertos anticuerpos específicos preferidos comprenden un dominio CDRl de cadena pesada de SEC ID NO: 13, un dominio CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 14, y un dominio CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 15, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas; y/o comprenden un dominio CDRl de cadena ligera de SEC ID NO: 16, un dominio CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 17, y un dominio CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 18, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
Ciertos anticuerpos específicos preferidos comprenden un dominio CDRl de cadena pesada de SEC ID NO: 19, un dominio CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 20, y un dominio CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 21, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas; y/o comprenden un dominio CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 22, un dominio CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 23, y un dominio CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 24, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
Ciertos anticuerpos específicos preferidos comprenden un dominio CDR1 de cadena pesada de SEC ID NO: 1, un dominio CDR2 de cadena pesada de SEC ID NO: 2, y un dominio CDR3 de cadena pesada de SEC ID NO: 3, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas; y/o comprenden un dominio CDR1 de cadena ligera de SEC ID NO: 88, un dominio CDR2 de cadena ligera de SEC ID NO: 89, y un dominio CDR3 de cadena ligera de SEC ID NO: 90, o secuencias sustancialmente homologas a cualquiera de las secuencias antes mencionadas.
En una modalidad más, la invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende: (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2, y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3.
En un aspecto preferido de esta modalidad, una o más de las CDR de región variable de cadena ligera son seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4, (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 5, y (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6. Preferiblemente, 2 ó 3 de tales CDR de región variable de cadena ligera se seleccionan del grupo anterior. Los anticuerpos que comprenden secuencias que son sustancialmente homologas a una o más de las secuencias antes mencionadas también son provistos en esta modalidad.
En una modalidad más, la invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7, (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8, y (iü) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 9.
En un aspecto preferido de esta modalidad, una o más de las CDR de región variable de cadena ligera son seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10, (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11, y (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12. Preferiblemente, 2 ó 3 de tales CDR de región variable de cadena ligera se seleccionan del grupo anterior. Los anticuerpos. que comprenden secuencias que son sustancialmente homologas a una o más de las secuencias antes mencionadas también son provistos en esta modalidad.
En una modalidad más, la invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13, (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14, y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15.
En un aspecto preferido de esta modalidad, una o más de las CDR de región variable de cadena ligera son seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16, (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 17, y (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18. Preferiblemente, 2 ó 3 de tales CDR de región variable de cadena ligera se seleccionan del grupo anterior. Los anticuerpos que comprenden secuencias que son sustancialmente homologas a una o más de las secuencias antes mencionadas también son provistos en esta modalidad.
En una modalidad más, la invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende: (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19, (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20, y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21.
En un aspecto preferido de esta modalidad, una o más de las CDR de región variable de cadena ligera son seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 22, (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 23, y (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 24. Preferiblemente, 2 ó 3 de tales CDR de región variable de cadena ligera se seleccionan del grupo anterior. Los anticuerpos que comprenden secuencias que son sustancialmente homologas a una o más de las secuencias antes mencionadas también son provistos en esta modalidad.
En una modalidad más, la invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1, (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 2, y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3.
En un aspecto preferido de esta modalidad, una o más de las CDR de región variable de cadena ligera son seleccionadas del grupo que consiste de: (i) una CDR1 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 88, (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 89, y (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 90. Preferiblemente, 2 ó 3 de tales CDR de región variable de cadena ligera se seleccionan del grupo anterior. Los anticuerpos que comprenden secuencias que son sustancialmente homologas a una o más de las secuencias antes mencionadas también son provistos en esta modalidad.
Ciertas modalidades preferidas adicionales de la invención proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprenden: un dominio VH que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs : 1, 2 ó 3, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs: 1, 2 ó 3, y/o un dominio VL que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs: 4, 5 ó 6, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs : 4, 5 ó 6.
Ciertas modalidades preferidas adicionales de la invención proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprenden: un dominio VH que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs : 7, 8 ó 9, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs: 7, 8 ó 9, y/o un dominio VL que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs: 10, 11 ó 12, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs : 10, 11 ó 12.
Ciertas modalidades preferidas adicionales de la invención proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y qüe comprenden: un dominio VH que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs: 13, 14 ó 15, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs: 13, 14 ó 15, y/o un dominio VL que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs : 16, 17 ó 18, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs: 16, 17 ó 18.
Ciertas modalidades preferidas adicionales de la invención proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprenden: un dominio VH que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs: 19, 20 ó 21, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs: 19, 20 ó 21, y/o un dominio VL que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs : 22, 23 ó 24, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs : 22, 23 ó 24.
Ciertas modalidades preferidas adicionales de la invención proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y que comprenden: un dominio VH que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena pesada de SEC ID NOs: 1, 2 ó 3, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs : 1, 2 ó 3, y/o un dominio VL que comprende una, dos o tres de las CDR de cadena ligera de SEC ID NOs: 88, 89 ó 90, o secuencias sustancialmente homologas a una o más de las SEC ID NOs: 88, 89 ó 90.
En modalidades preferidas una, dos o tres de las CDR de cadena ligera son como se definen en SEC ID NOs : 4, 5 y 6; o 88, 89 y 90, y/o una, dos o tres de las CDR de cadena pesada son como se definen en SEC ID NOs: 1, 2 y 3.
Ciertas modalidades preferidas de la invención proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 69, 71, 73 ó 75, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 70, 72, 74, 76 ó 103, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma .
Las modalidades preferidas adicionales proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 69, 71, 73 ó 75 y un dominio VL que comprende 3 CDR de cadena ligera. Pre eriblemente las CDR de cadena ligera tienen SEC ID NOs 4, 5 y 6 ; o 10, 11 y 12; o 16, 17 y 18; o 22, 23 y 24; o 88, 89 y 90.
Las modalidades preferidas adicionales proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 69, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 70, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Las modalidades preferidas adicionales proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 71, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 72, o una secuencia / sustancialmente homologa a la misma.
Las modalidades preferidas adicionales proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 73, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 74, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Las modalidades preferidas adicionales proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 75, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 76, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Las modalidades preferidas adicionales proporcionan un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 69, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 103, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma.
Los anticuerpos que comprenden un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 69, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y/o un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 103 ó 70, o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, son particularmente preferidas.
En aún otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 35 (tal anticuerpo también es referido en la presente como C-9P21 scFv) , SEC ID NO: 46 (tal anticuerpo también es referido en la presente como B-1M22 scFv) , SEC ID NO: 57 (tal anticuerpo también es referido en la presente como C-1I24 scFv) , SEC ID NO: 68 (tal anticuerpo también es referido en la presente . como D-1K21 scFv) , o SEC ID NO: 101 (tal anticuerpo también es referido en la presente como 9N10 scFv) o que comprende un fragmento de cualquiera de estos que se une a CXCR4 y que tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , o una secuencia sustancialmente homologa a cualquiera de las secuencias .
Los anticuerpos con base en las secuencias C-9P21 ó 9N10 son particularmente preferidas.
La invención se ejemplifica a través de anticuerpos monoclonales C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10, formas de cadena individual que se muestran en las Tablas 1, 2, 3, 4 y 5 (SEC ID NOs : 35, 46, 57, 68 y 101, respectivamente). Las formas IgG de longitud completa de los anticuerpos C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10 se han producido y sus secuencias se muestran en las Tablas 6, 7, 8, 9 y 10, respectivamente. Los dominios CDR, VH y VL de los anticuerpos C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10 se muestran en las Tablas 1 a 5 y las Figuras 1 a 5. Los anticuerpos que comprenden estos dominios CDR o los dominios VH y VL (o secuencias sustancialmente homologas a las mismas) son aspectos preferidos de la invención. Los anticuerpos con base en las secuencias C-9P21 ó 9N10 son particularmente preferidos.
Una modalidad preferida de la invención es una forma scFv del anticuerpo C-9P21 que comprende o consiste de SEC ID NO: 35, que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 34. Más preferiblemente, el anticuerpo comprende o consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 1 y preferiblemente este anticuerpo se codifica por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1.
Otra modalidad preferida de la invención es una forma scFv del anticuerpo B-1M22 que comprende o consiste de SEC ID NO: 46, que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 45. Más preferiblemente, el anticuerpo comprende o consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 2 y preferiblemente este anticuerpo se codifica por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 2.
Otra modalidad preferida de la invención es una forma scFv del anticuerpo C-1I24 que comprende o consiste de SEC ID NO: 57, que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 56. Más preferiblemente, el anticuerpo comprende o consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 3 y preferiblemente este anticuerpo se codifica por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 3.
Otra modalidad preferida de la invención es una forma scFv del anticuerpo D-1K21 que comprende o consiste de SEC ID NO: 68, que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 67. Más preferiblemente, el anticuerpo comprende o consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 4 y preferiblemente este anticuerpo se codifica por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 4.
Otra modalidad preferida de la invención es una forma scFv del anticuerpo 9N10 que comprende o consiste de SEC ID NO: 101, que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 100. Más preferiblemente, el anticuerpo comprende o consiste de la secuencia de aminoácido mostrada en la Figura 5 y preferiblemente este anticuerpo se codifica por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 5.
Otras modalidades preferidas son las formas IgG de los anticuerpos C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10, preferiblemente formas IgG de longitud completa. La forma IgGl de cualquiera de estos anticuerpos es más preferida.
De esta forma, otra modalidad preferida de la invención es un anticuerpo IgG de longitud completa que comprende una cadena pesada de SEC ID NO: 108 (amino ácido) y/o una cadena ligera de SEC ID NO: 109 (amino ácido) . También preferido es un anticuerpo IgG que comprende una cadena pesada codificada por SEC ID NO: 106 y/o una cadena ligera codificada por SEC ID NO: 107. Por supuesto se entiende que los anticuerpos IgG completos comprenderán dos cadenas pesadas sustancialmente idénticas y dos cadenas ligeras sustancialmente idénticas. · Otra modalidad preferida de la invención es un anticuerpo IgG de longitud completa que comprende una cadena pesada de SEC ID NO: 112 (amino ácido) y/o una cadena ligera de SEC ID NO: 113 (amino ácido) . También preferido es un anticuerpo IgG que comprende una cadena pesada codificada por SEC ID NO: 110 y/o una cadena ligera codificada por SEC ID NO: 111.
Otra modalidad preferida de la invención es un anticuerpo IgG de longitud completa que comprende una cadena pesada de SEC ID NO: 116 (amino ácido) y/o una cadena ligera de SEC ID NO: 117 (amino ácido) . También preferido es un anticuerpo IgG que comprende una cadena pesada codificada por SEC ID NO: 114 y/o una cadena ligera codificada por SEC ID NO: 115.
Otra modalidad preferida de la invención es un anticuerpo IgG de longitud completa que comprende una cadena pesada de SEC ID NO: 120 (amino ácido) y/o una cadena ligera de SEC ID NO: 121 (amino ácido) . También preferido es un anticuerpo IgG que comprende una cadena pesada codificada por SEC ID NO: 118 y/o una cadena ligera codificada por SEC ID NO: 119.
Otra modalidad preferida de la invención es un anticuerpo IgG de longitud completa que comprende una cadena pesada de SEC ID NO: 108 (amino ácido) y/o una cadena ligera de SEC ID NO: 125 (amino ácido) . También preferido es un anticuerpo IgG que comprende una cadena pesada codificada por SEC ID NO: 106 y/o una cadena ligera codificada por SEC ID NO: 123.
Los anticuerpos con base en las secuencias C-9P21 ó 9N10 son particularmente preferidos.
En modalidades adicionales de la presente invención, la CDR1 VH tiene o comprende una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 126 (S/G Y X3 M/I H/S) o SEC ID NO: 127 (Xx Y X3 M H) O SEC ID NO: 128 (S Y X3 M H) .
En estas modalidades Xi puede ser S o G, preferiblemente S. X3 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente G o W o Y o A, más preferiblemente W. Las secuencias CDR1 VH preferidas de esta modalidad son SEC ID NOs : 1, 7, 13 ó 19. Una CDR1 VH particularmente preferida tiene o comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 1.
En modalidades adicionales de la presente invención, la CDR2 VH tiene o comprende una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 129 (Xi I X3 X4 D G S X8 X9 Xi0 Y A D S V K G) . En estas modalidades Xlf X3< X4 , X8, Xg y ??? puede ser cualquier aminoácido. Preferiblemente uno o más, más preferiblemente todos, de estos residuos X se seleccionan del siguiente grupo: Xi es V o R (preferiblemente R) , X3 es S o N (preferiblemente N) , X4 es Y o S (preferiblemente S) , X8 es N o S (preferiblemente S) , X9 es K o T (preferiblemente T) y X10 es Y o S (preferiblemente S) . De esta forma, una CDR2 VH preferida tiene o comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 130 (V/R I S/N Y/S D G S N/S K/T Y/S Y A D S V K G) .
Por ejemplo, las secuencias CDR2 VH preferidas de esta modalidad tienen o comprenden SEC ID NOs : 2 ó 14. SEC ID NO: 2 es particularmente preferida.
En modalidades adicionales de la presente invención, la CDR2 VH tiene o comprende una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 131 (Xi I X3 P X5 X6 G X8 X9 N Y A Q K F Q G) . En estas modalidades Xi, X3 , X5 X6, X8 y X9 pueden ser cualquier aminoácido. Preferiblemente uno o más, más preferiblemente todos, de estos residuos X se seleccionan del siguiente grupo: Xi es R o G (preferiblemente R) , X3 es N o I' (preferiblemente N) , X5 es N o I (preferiblemente N) , X6 es S o F (preferiblemente S) , X8 es G o T (preferiblemente G) y X9 es T o A (preferiblemente T) . De esta forma, una CDR2 VH preferida tiene o comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 132 (R/G I N/l P N/I S/F G G/T T/A N Y A Q K F Q G). Por ejemplo, las secuencias CDR2 VH preferidas de esta modalidad tienen o comprenden SEC ID NOs: 8 y 20. SEC ID NO: 20 es particularmente preferida.
Debido a la habilidad de los anticuerpos de la invención a no inducir apoptosis significativa de las células que expresan CXCR4 (una habilidad que no ha sido descrita previamente para anticuerpos CXCR4) se cree que los anticuerpos de la invención pueden unirse a un epítopo diferente a los anticuerpos anti-CXCR4 conocidos (por ejemplo, un epítopo que protege a la célula CXCR4+ de apoptosis o un epítopo que no está involucrado en el mecanismo de la apoptosis o que no activa la apoptosis, pero que aún está involucrado en la unión de ligando a CXCR4) .
De esta forma, también se proporcionan anticuerpos que pueden competir con cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente (por ejemplo, C-9 P21, C1I24, D-1K21, B-1M22 ó 9N10) para la unión a CXCR4.
El término "anticuerpos de competencia", como se utiliza en la presente, se refiere a anticuerpos que se unen a aproximadamente sustancial o esencialmente el mismo o aún el mismo como epítopo como un "anticuerpo de referencia" . Los "anticuerpos de competencia" incluyen anticuerpos que traslapan las especificidades del epítopo. Los anticuerpos de competencia de esta forma son capaces de efectivamente competir con un anticuerpo de referencia para la unión a CXCR4. Preferiblemente, el anticuerpo de competencia puede unirse al mismo epítopo como el anticuerpo de referencia. Visto de manera alternativa, el anticuerpo de competencia preferiblemente tiene la misma especificidad de epítopo como el anticuerpo de referencia.
"Anticuerpos de referencia" como se utiliza en la presente son anticuerpos que se pueden unir a un epítopo en un dominio extracelular de CXCR4 humano y que tienen una o más de secuencia CDR como se define en la presente, preferiblemente un dominio VH y un VL como se definen en la presente, preferiblemente un VH de SEC ID NO: 69 y un VL de SEC ID NO: 70, o un VH de SEC ID NO: 71 y un VL de SEC ID NO: 72, o un VH de SEC ID NO: 73 y un VL de SEC ID NO: 74, o un VH de SEC ID NO: 75 y un VL de SEC ID NO: 76, o un VH de SEC ID NO: 69 y un VL de SEC ID NO: 103. Los anticuerpos de referencia más preferidos se seleccionan de C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10'.
La identificación de uno o más anticuerpos de competencia es ahora un tema técnico directo en donde han sido provistos los anticuerpos de referencia tales como C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10. Como la identificación de los anticuerpos de competencia se determina en comparación con un anticuerpo de referencia, se entenderá que la determinación actual del epítopo al cual cualquiera o ambos anticuerpos se unen no se requiere de ninguna forma con el fin de identificar un anticuerpo de competencia. Sin embargo, se puede llevar a cabo el mapeo del epítopo utilizando técnicas estándar si se desea.
A manera de ejemplo, los siguientes métodos para la identificación y definición de los epítopos se mencionan en la presente. La secuencia de aminoácido de CXCR4 es conocida, de tal forma que los péptidos sintéticos pueden utilizarse para el mapeo del epítopo, por ejemplo, utilizando el ensayo Pepscan. La mutagénesis dirigida al sitio también es una herramienta poderosa en el mapeo de los epítopos y puede utilizarse para evaluar el papel de los aminoácidos individuales en la formación del complejo inmunitario. La formación de huellas proteicas se basa en el hecho de que el epítopo está protegido de separación cuando se une a un complejo de anticuerpo-antígeno . El ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés) y la hemaglutinación y la tinción de ranuras también pueden utilizarse en el mapeo del epítopo. La cristalización del antígeno con el anticuerpo puede utilizase para hacer un mapa de un epítopo no lineal. Los protocolos para llevar a cabo tales métodos están ampliamente disponibles y el experto en la técnica estará consciente de métodos alternativos adecuados para el mapeo de epítopos.
La identificación de anticuerpos de competencia puede fácilmente determinarse utilizando cualquiera de una variedad de ensayos de clasificación inmunológica en donde la competencia del anticuerpo puede evaluarse. Todos tales ensayos son rutinarios en la técnica y además se describen con detalle. Cada una de Patentes de E . U. A. Nos. 6,342,219, 6,524,583, 7,056,509, 6,887,468, 6,342,221, 6,676,941, 6,703,020 y 6,416,758 que se incorporan específicamente en la presente por referencia para los propósitos de incluir aun adicionalmente las enseñanzas de la presente que se refieren a cómo identificar anticuerpos de competencia.
Por ejemplo, cuando los anticuerpos de prueba se van examinar se obtienen de diferentes fuentes animales, o aún de diferentes isotipos, se puede utilizar un ensayo de competencia simple en donde los anticuerpos de referencia y de prueba se mezclan (o pre-adsorben) , y se aplican en una composición que contiene CXCR4 , preferiblemente células que expresan CXCR4, fago que despliega CXCR , o biochips que contienen CXCR4 inmovilizados. Los protocolos con base en ELISA son particularmente adecuados para utilizarse en tales estudios de competencia simple.
En ciertas modalidades, se podrían pre-mezclar los anticuerpos de referencia (por ejemplo, C-9 P21, C1I24, D1K21, B-1M22 ó 9N10) con cantidades variables de anticuerpos de prueba (por ejemplo, 1:10, 1:100 ó 1:1000) durante un periodo de tiempo antes de aplicar a una composición de antígeno. En otras modalidades, las cantidades de referencia y las variables de los anticuerpos de prueba pueden simplemente mezclase durante la exposición a la composición del antígeno. En cualquier caso, al utilizar anticuerpos de especies o isotipos secundarios será capaz de detectar solamente los anticuerpos de referencia unidos. La unión de los cuales se reducirá por la presencia de un anticuerpo de prueba que "compite" para la unión.
En la conducción de un estudio de competencia de anticuerpo entre un anticuerpo de referencia y un anticuerpo de prueba (independientemente de la especie o isotipo) , primero se puede marcar la referencia (por ejemplo, C-9 P21, C1I24, D1K21, B-1M22 ó 9N10) con una etiqueta detectable, tal como, por ejemplo, una etiqueta de biotina o una etiqueta enzimática o radioactiva para permitir la posterior identificación. En estos casos, se podrían pre-mezclar o incubar los anticuerpos de referencia marcados con los anticuerpos de prueba a ser examinados en varias proporciones (por ejemplo, 1:10, 1:100 ó 1:1000) y (opcionalmente después de un periodo de tiempo adecuado) después de ensayar la reactividad de los anticuerpos de referencia marcados y comparar estos con un valor de control en donde no se ha incluido un anticuerpo de prueba de competencia potencialmente en la incubación.
El ensayo puede ser cualquiera de un intervalo de ensayos inmunológicos con base en la unión del anticuerpo, y los anticuerpos de referencia podrían detectarse por medio de la detección entre su etiqueta, por ejemplo, utilizando estreptavidina en el caso de anticuerpos biotinilados o mediante el uso de un sustrato cromogénico en conexión con una etiqueta enzimática (tal como el sustrato 3 , 3 ' 5 , 5 ' -tetrametilbencidina (TMB) con peroxidasa enzima) o a través de la detección simple de una etiqueta radioactiva. Un anticuerpo que compite con los anticuerpos de referencia para la unión a CXCR4 será capaz de efectiva o significativamente reducir la unión del anticuerpo de referencia a CXCR4 , según demostrado por una reducción en la etiqueta unida.
La reactividad de los anticuerpos de referencia (marcados) en la ausencia de un anticuerpo completamente relevante podría ser el alto valor de control. El bajo valor de control podría obtenerse a través de la incubación de los anticuerpos de referencia marcados (por ejemplo, C-9 P21, C1I24, D1K21, B-1M22 ó 9N10) con anticuerpos no marcados de exactamente el mismo tipo, cuando la competencia ocurriría y reduciría la unión de los anticuerpos marcados. En un ensayo de prueba, una reducción significativa en la reactividad del anticuerpo marcado en la presencia de un anticuerpo de prueba indica un anticuerpo de prueba que "compite" , con el anticuerpo marcado para unión a CXCR4.
Una reducción significativa es una reducción "reproducible" , es decir consistentemente observada en la unión. Una "reducción significativa" en términos de la presente solicitud se define como una reducción reproducible (en la unión del anticuerpo de referencia a CXCR4 en un ELISA u otro ensayo adecuado) de por lo menos 20%, más preferiblemente al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ó 65%, aún más preferiblemente de aproximadamente 70%, de aproximadamente 75% o de aproximadamente 80% en cualquier proporción entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100. Los anticuerpos con actividades de competencia aún más estrictas exhibirán una reducción reproducible (en la unión del anticuerpo de referencia a CXCR4 en ELISA u otro ensayo adecuado) de al menos aproximadamente 82%, aproximadamente 85%, aproximadamente 88%, aproximadamente 90%, aproximadamente 92% o aproximadamente 95%, etc., en cualquier proporción entre aproximadamente 1:10 y aproximadamente 1:100. La competencia completa o casi completa, tal como la exhibición de una reducción reversible en la unión del anticuerpo de referencia a CXCR4 de aproximadamente 99%, aproximadamente 98%, aproximadamente 97% o aproximadamente 96%, etc., aunque no existen medios requeridos para la práctica de esta invención, ciertamente no se excluyen.
El método descrito anteriormente es solamente un ejemplo de un ensayo de competencia adecuado. El experto en la técnica está consciente de otros métodos y variaciones adecuados. Un ensayo de competencia alternativo se describe a continuación.
Antes de llevar a cabo el ensayo de competencia alternativo utilizando citometría de flujo, algunas cantidades del anticuerpo de prueba deberán marcarse, por ejemplo, por biotinilación . Se determina la funcionalidad (retención de las propiedades de unión de la célula) del producto biotinilado, y la concentración mínima del anticuerpo biotinilado de la invención (Abl) que dan una unión sub-máxima contra el número fijo de células CXCR4+. Un total de 106 células se cosechan de cultivos exponencialmente en crecimiento y se incuban con varias concentraciones del anticuerpo durante un periodo de tiempo adecuado a una temperatura adecuada, por ejemplo, 1 hr a 4°C. Las células se lavan e incuban con anticuerpo de detección adecuado durante un periodo de tiempo adecuado a una temperatura adecuada, por ejemplo, una hora adicional a 4°C. Después del lavado, las células se analizan a través de citometría de flujo. Para cada anticuerpo de prueba, se genera una curva de saturación de los datos graficando la intensidad de fluorescencia media (MFI, por sus siglas en inglés) contra la concentración del anticuerpo.
Para el ensayo de competencia alternativo, las células CXC 4+ pueden prepararse como anteriormente y tratarse por duplicado con una mezcla de una concentración fija del anticuerpo marcado (biotinilado) (bio-Abl) y aumentando las concentraciones del anticuerpo de competencia no marcado. La concentración fija es la concentración mínima del anticuerpo que genera una señal de fluorescencia razonable contra un número fijo de células tumorales como se determina anteriormente. Idealmente, esta concentración fija en nM deberá estar por debajo de la afinidad del anticuerpo probado en equilibrio (KD) . En este caso el método descrito puede utilizarse para la estimación de afinidades de los anticuerpos de competencia (Schodin and Kranz, 1993, Binding affinity and inhibitory properties of a single-chain anti-T cell receptor antibody. J Biol Chem 268: 25722-7) . La mezcla del anticuerpo se incuba con células objetivo durante un periodo de tiempo adecuado a una temperatura adecuada, por ejemplo, 1 hr a 4°C. Las células se lavan y la unión de las células del anticuerpo biotinilado se revela a través de la incubación con estreptavidina marcada con FITC. Después de sustraer la fluorescencia de fondo (PBS-5% FCS) de la lectura de fluorescencia media para cada muestra de prueba (bio-Abl + Ab2), el porcentaje de inhibición se calcula para cada concentración Ab2 "c" de acuerdo con la fórmula: se calcula % de inhibición = (1- MFI ^0"^ ^2'^" / MFI ^0-^1) ? 100 Se contempla cualquiera de los anticuerpos que puede unirse a CXCR4 y que puede competir con cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente, pero los anticuerpos preferidos se establecen a continuación. Por consiguiente, en algunas modalidades preferidas se proporciona lo siguiente.
Un anticuerpo que se une a un epítopo en el dominio extracelular de CXCR4 humano y que preferiblemente tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , en donde el anticuerpo (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende- tres CDR, en donde la región variable de cadena ligera comprende : (i) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 4; (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 5; y/o (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6; y/o en donde la región variable de cadena pesada comprende (iv) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1; (v) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2; y/o (vi) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
Un anticuerpo que se une a un epítopo en el dominio extracelular de CXCR4 humano y que preferiblemente tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , en donde el anticuerpo (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena ligera comprende : (i) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10; (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11; y/o (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12; y/o en donde la región variable de cadena pesada comprende (iv) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7; (v) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8; y/o (vi) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 9; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
Un anticuerpo que se une a un epítopo en el dominio extracelular de CXCR4 humano y que preferiblemente tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4, en donde el anticuerpo (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena ligera comprende : (i) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16; (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 17; y/o (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18; y/o en donde la región variable de cadena pesada comprende (iv) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13; (v) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14; y/o (vi) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
Un anticuerpo que se une a un epítopo en el dominio extracelular de CXCR4 humano y que preferiblemente tiene l propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 , en donde el anticuerpo (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena ligera comprende : (i) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 22; (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 23; y/o (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 24; y/o en donde la región variable de cadena pesada comprende (iv) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19; (v) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20; y/o (vi) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR .
Un anticuerpo que se une a un epitópo en el dominio extracelular de CXCR4 humano y que preferiblemente tiene la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR , en donde el anticuerpo (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena ligera comprende : (i) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 88; (ii) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 89; y/o (iii) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 90; y/o en donde la región variable de cadena pesada comprende (iv) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1; (v) una CDR2 ' VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2; y/o (vi) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
En una modalidad, el anticuerpo (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 69 y un dominio VL de SEC ID NO: 70; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
En una modalidad, el anticuerpo (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 71 y un dominio VL de SEC ID NO: 72; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
En una modalidad, el anticuerpo (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 73 y un dominio VL de SEC ID NO : 74 ; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
En una modalidad, el anticuerpo (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 75 y un dominio VL de SEC ID NO: 76; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
En una modalidad, el anticuerpo (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 69 y un dominio VL de SEC ID NO: 103; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
Preferiblemente, el anticuerpo (b) tiene una o más secuencias CDR, dominios VH y/o dominios VL descritos en la presente.
Preferiblemente, el anticuerpo (b) puede unirse al mismo epítopo como el anticuerpo (a) .
Ciertos ejemplos de secuencias sustancialmente homologas son secuencias que tienen por lo menos 70% de identidad con las secuencias de aminoácidos descritas. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención que se unen a CXCR4 y que tienen la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 comprenden por lo menos una región variable de cadena ligera que incluye una región de secuencia de aminoácido de al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% ó 95% y más preferiblemente al menos aproximadamente 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia de aminoácido a la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 70, 72, 74, 76 ó 103; y/o al menos una región variable de cadena pesada que incluye una región de secuencia de aminoácido de al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente 85%, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% ó 95% y más preferiblemente al menos aproximadamente 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácido a la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 69, 71, 73 ó 75.
Otros ejemplos preferidos de secuencias sustancialmente homologas son secuencias que contienen sustituciones de aminoácido conservadoras de la secuencia de aminoácido descrita.
Otros ejemplos preferidos de secuencias sustancialmente homologas son secuencias que contienen hasta 1, 2, 3 ó 4 preferiblemente hasta 1 ó 2, aminoácidos alterados en una o más de las regiones CDR descritas. Tales alteraciones podrían ser sustituciones de aminoácido conservadoras o no conservadoras, o una de sus mezclas.
En tales modalidades, las alteraciones preferidas son sustituciones de aminoácido conservadoras.
En todas las modalidades, los anticuerpos que contienen secuencias sustancialmente homologas retienen la habilidad de unirse a CXCR4 y preferiblemente retienen una o más de las otras propiedades descritas en la presente, por ejemplo, la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y/o la propiedad de ser antagónicas .
Otras modalidades de la presente invención proporcionan proteínas de unión que se unen a CXCR4 y preferiblemente tienen una o más de las otras propiedades descritas en la presente, por ejemplo, tienen la propiedad de no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 y/o la propiedad de ser antagónicas y que comprenden un anticuerpo de la invención, un dominio VH o VL de la invención, o una o más de las CDR de la invención. En una modalidad preferida, tales proteínas de unión son anticuerpos .
Los anticuerpos preferidos de la invención comprenden al menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR. Las secuencias ilustrativas y preferidas para estas CDR se describen en la presente.
Como se utiliza en la presente, el término abreviado "CXCR4", a menos que se afirme específicamente lo contrario o se haga claro a partir de la terminología científica, significa el receptor de quimiocina CXC 4 (también conocido como fusina, HM89, LESTR o HUMSTR) .
CXCR4 puede ser CXCR4 libre, por ejemplo, CXCR4 recombinante o purificado, pero preferiblemente está presente en una forma nativa, por ejemplo, en a superficie de una célula.
Los anticuerpos o proteínas de unión de la invención también pueden unirse a fragmentos de CXCR4 , en particular fragmentos que comprende o consiste de todo o parte del dominio extracelular de CXCR4 , o pueden unirse a entidades que comprenden CXCR4 o fragmentos de CXCR4. Ciertamente, los epítopos de los anticuerpos de la invención se localizan en el dominio extracelular de CXCR4.
"CXCR4" también puede referirse a cualquier forma de CXCR4 , particularmente como CXCR4 se conserva a través de especies de mamífero.. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención de esta forma pueden unirse CXCR4 de humano, mono (por ejemplo, mono cynomolgus o mono Macaca mulatta/rhesus) , ratón (murino) , baca (bovino) , rata, hámster, hurón, conejillo de indias y/o conejo, por ejemplo. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se unirán a por lo menos CXCR4 humano. De esta forma, a menos que se afirme lo contrario, cualquier referencia en la presente a "CXCR4" puede leerse para significar "CXCR4 humano". En ciertas modalidades preferidas, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se unirán a por lo menos un CXCR4 humano y mono (por ejemplo, mono cynomologus o mono Macaca mulatta/rhesus) . En otras modalidades preferidas los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se unirán a por lo menos un CXCR4 de humano y ratón. En otras modalidades preferidas los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se unirán a por lo menos un CXCR4 human, de mono y ratón.
Como se utiliza en la presente, el término "que se une a CXCR4" o "anti-CXCR4" en el contexto de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la presente invención, significa anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que son capaces de uno o más de los siguientes; preferiblemente, de uno o más de los siguientes; y más preferiblemente, de todos los siguientes : (a) unirse a CXCR4 expresado en la superficie de una célula, por ejemplo, una célula transfectada con CXCR4 o una célula que naturalmente expresa CXCR4 , por ejemplo, como se evalúa por citometría de flujo o inmunohistoquímica ; (b) unirse a un epítopo CXCR4 conformacionalmente dependiente (por ejemplo, no lineal), por ejemplo como se evalúa por la unión a CXCR4 en Western bajo condiciones no de reducción; (c) unirse a por lo menos un CXCR4 humano, más preferiblemente a un CXCR4 de humano y mono o a un CXCR4 de humano y ratón, más preferiblemente a CXCR4 de humano, mono y ratón; (d) unirse a un CXCR4 de humano y mono o a un CXCR4 de humano y ratón con la afinidad de similares, por ejemplo, con un Kd de 10 nM o menor, preferiblemente 5 nM o menor, más preferiblemente 3 nM o menor o 2n M o menor, por ejemplo 1 nM o menor como también se explica en cualquier lugar en la presente.
Los anticuerpos preferidos o fragmentos de anticuerpo de la presente invención también son capaces de uno o más de los siguientes; preferiblemente, de más de uno de los siguientes; y más preferiblemente, de todas las propiedades funcionales siguientes: (e) no inducir apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 ; (f) bloquear o inhibir la unión de CXCR4 a uno o más de sus ligandos, por ejemplo, bloquear o inhibir la unión de CXCR4 a por lo menos SDF-1 o un ligando alternativo para CXCR4, por ejemplo, el compuesto químico AMD-3100, y preferiblemente inhibir la unión de CXCR4 a por lo menos ambos de SDF-1 °y AMD-3100; (g) bloquear o inhibir los eventos de señalización en corriente abajo del receptor CXCR4 , por ejemplo, inhibir las respuestas celulares mediadas por CXCR4to a un ligando CXCR4 tal como SDF-1, por ejemplo preferiblemente para inhibir la liberación de los iones de calcio en respuesta al ligando CXCR4 tal como SDF-1 o bloquear o inhibir la migración inducida por el ligando (por ejemplo, SDF-1) de células CXCR4+; (h) inducir ADCC de células CXCR4+ como se describe en cualquier lugar en la presente; (i) inducir efectos antitumorales in vivo; (j) localizar los tumores después de la administración a un animal con un tumor; (k) inducir CDC de células CXCR4+; (1) inducir efectos anti-víricos , en particular efectos anti-VIH, in vitro o in vivo; (m) no exhibir una actividad antagónica con respecto al receptor CXCR4 ; En el contexto de la unión de las células CXCR4+, se debe entender que los anticuerpos de la presente invención que se unen a células CXCR4+ y que no se unen significativamente a células CXCR4" (como se muestra en el Ejemplo 2) .
El término "no se unen significativamente a células CXCR4"" deberá entenderse de tal forma que cualquier unión del anticuerpo a células CXCR4" no prohibe el uso de tal anticuerpo para propósitos terapéuticos o diagnósticos. De esta forma, la unión "insignificante" a células CXCR4" incluye la situación en donde la unión del anticuerpo a„ las células CXCR4" es significativamente más débil que su unión a una o más células CXCR4+ o puede considerarse como un nivel de fondo, por ejemplo, comparativo con o no significativamente diferente de un nivel observado en un experimento de control negativo.
Para propósitos terapéuticos o de diagnóstico la consideración principal es que el anticuerpo debe unirse más fuertemente a uno o más tipos de células CXCR4+ que cualquiera de las células CXCR4" con las cuales el anticuerpo puede ponerse en contacto durante la aplicación terapéutica o de diagnóstico.
Los anticuerpos de la invención pueden ser referidos como "específicos de CXCR4" . El término "específico de CXCR4" deberá interpretarse de tal forma que la unión del anticuerpo a células que expresan CXCR4 es suficientemente específica para permitir el uso de tal anticuerpo para propósitos terapéuticos o de diagnóstico. El anticuerpo específico CXCR4 como se describe en la presente tiene la habilidad de unir CXCR4 (por ejemplo, en la superficie de una célula) pero no se une significativamente a proteínas no-CXCR4 (por ejemplo, no se une específicamente a células CXCR4) . El experto en la técnica puede fácilmente determinar si cualquier anticuerpo dado es específico de CXCR4 mediante la comparación de la potencia de la unión a la célula CXCR4+ objetivo (por ejemplo, una célula transfectada con y que expresa CXCR4 , o una célula que naturalmente expresa CXCR4 , por ejemplo, células Ramos, células Jurkat, células CCRF-CEM, células Raji), con la potencia de unión a uno o más tipos de células CXCR4", por ejemplo, células de tipo silvestre no transformadas con CXCR4 tales como células HEK293T \o células DT40.
Se describe en la técnica que CXCR4 tiene una tendencia a desarrollar de alguna formas diferentes conformaciones que dependen del tipo de la célula que la expresa (ver, por ejemplo, Baribaud y otros, 2001) . De esta forma, los anticuerpos de la invención son referidos como teniendo la habilidad de unirse a CXCR4 en la superficie de una célula cuando se pueden unir a uno o más tipos de célula que han sido transíectados con CXCR4 o que naturalmente expresan CXCR4. Los anticuerpos preferidos tienen la habilidad de unirse a CXCR4 en múltiples tipos de células y de esta forma tienen la habilidad de unirse a múltiples conformación de CXCR4. Por ejemplo, los anticuerpos C-9P21, 9N10 y C-1I24 descritos en la presente muestran tales habilidades.
El experto en la técnica estará consciente de que la unión a células CXCR4+ comparado con células CXCR4" puede evaluarse, por ejemplo, utilizando citometría de flujo y un ensayo adecuado como se describe en los Ejemplos 2 y 3.
Las técnicas de inmunohistoquímica, que son bien conocidos en la técnica pueden utilizarse para clasificar la unión de los anticuerpos en células o muestras. Tales ensayos pueden utilizarse para ensayar la especificidad del anticuerpo particular, o para detectar la expresión de CXCR4 en muestras de tejido. Brevemente, el anticuerpo puede ensayarse por ejemplo en un arreglo de alta intensidad de tejidos humanos incluyendo un control positivo (células que se sabe que son CXCR4 positivas) y control negativo (células que se sabe que son CXCR4 negativas) . La intensidad de tinción membranosa puede estimarse a través de inspección visual en una escala de cuatro pasos (0,1,2,3). Los anticuerpos preferidos muestran clasificaciones de débil a fuerte (es decir, clasificaciones por arriba de 0) , preferiblemente clasificaciones inmunohistoquímicas fuertes para tejidos CXCR4+.
Como se explicó anteriormente, los anticuerpos de la invención tienen la propiedad de no inducir apoptosis. significativa de células CXCR4+ (células que expresan CXCR4 ) . Por el término "no inducen apoptosis significativa de células CXCR4+" significa que los niveles de apoptosis inducidos en la presente de un anticuerpo son comparables con o no son significativamente diferentes de los niveles de apoptosis inducidos en la ausencia de un anticuerpo, por ejemplo, bajo condiciones de control negativo o un nivel de fondo, por ejemplo, en la presencia de un medio de cultivo solo. De esta forma, preferiblemente los anticuerpos de la invención no incluyen un aumento miscible o significativo en la apoptosis sobre niveles naturales, o de fondo o de control de apoptosis. Esto está en contraste con los anticuerpos de la técnica anterior tales como los anticuerpos Medarex descritos en O 2008/060367 (por ejemplo, F7) que inducen apoptosis miscible y significativa comparada con la apoptosis observada en la ausencia del anticuerpo (también ver el Ejemplo 10 de la presente) . Preferiblemente, los anticuerpos de la invención no inducen una apoptosis significativa de las concentraciones del anticuerpo de =0.4 µg/ml, por ejemplo, a concentraciones de al menos 0.4 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg ml, 3 µg/ml, 4 µg/ml , 5 µg/ml, 6 µg ml, 7 µg/ml, 8 µg/ml,' 9 µg/ml 10 µg/ml·, 11 µg/ml , 12 µg/ml , 15 µg/ml, 20 µg/ml, 25 µg/ml, 30 µg/ml, 40 µg/ml , 50 µ9 p?1, 75 µg/ml and 100 µ9/??1 (preferiblemente en IgG, por ejemplo, formas de IgGl) . Más preferiblemente, los anticuerpos de la invención no inducen una apoptosis significativa cuando se evalúan en la línea de células Ramos CXCR4+ in vitro (por ejemplo, cuando se evalúan utilizando un ensayo como se describe en el Ejemplo 10) . Preferiblemente, los antecuerpos de la invención no inducen una apoptosis significativa cuando se utilizan a concentraciones de =0.14 µg/lxl05 células, por ejemplo, a concentraciones de o al menos 0.14 µg/lxl05 células, 0.25 µg/l l05 células, 0.5 µg/lxl05 células, 1 µg/lxl05 células, 2 µg/lxl05 células, 3 µg/lxl05 células, 3.5 µg/lxl05 células, 4 µg/lxl05 células, 5 µg/lxl05 células, 10 µg/l l05 células, 15 µg/l l05 células, 20 µg/lxl05 células, 25 µ9/??105 células, 30 µg/lxl05 células y 35 µg/lxl05 células, más preferiblemente las células son células RAMOS. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención no inducen apoptosis significativa cuando se utilizan a una concentración terapéuticamente útil (por ejemplo, a una concentración de anticuerpo de =0.4 µg/ml , por ejemplo, a concentraciones de o al menos 0.4 µg/ml, 1 µg/ml, 2 µg/ml , 3 µg/ml, 4 µg/ml, 5 µg/ml, 6 µg/ml , 7 µg/ml 8 µg/ml, 9 µg/ml 10 µg/ml, 11 µg/ml, 12 µg/ml, 15 µg/ml , 20 µg/ml , 25 µg/ml , 30 µg/ml, 40 µg/ml, 50 µg/ml, 75 µg/ml y 100 µg/ml (preferiblemente en IgG, por ejemplo, en la forma de IgGl, preferiblemente la concentración del anticuerpo es la concentración del anticuerpo en suero) . A manera de ejemplo, un anticuerpo que no induce apoptosis significativa de células CXCR4+ es un anticuerpo que no causa que más del .10% de las células se hagan apoptóticas después de la incubación con el anticuerpo de un ensayo que define las células apoptóticas como aquellas que son positivas a la unión de Anexina V. Un ensayo preferido se describe en el Ejemplo 10 e involucra el uso de células Ramos y anticuerpos IgGl hasta una concentración de 10 ug/ml. Visto alternativamente, un anticuerpo que no induce apoptosis significativa de células CXCR4+ es un anticuerpo en donde cualquier aumento en la apoptosis por arriba del nivel de fondo o de control es un aumento de un máximo de 50% sobre tal nivel de fondo o control en un ensayo que define las células apoptóticas como aquellas que son positivas a la unión de Anexina V. Un ensayo preferido se describe en el Ejemplo 10 e involucra el uso de células Ramos y anticuerpos IgGl de hasta una concentración de 10 µg/ml .
La inducción de la apoptosis puede ensayarse utilizando métodos estándares bien conocidos, por ejemplo métodos que ensayan la tinción con Anexina V (por ejemplo, un método ilustrativo que involucra la tinción con Anexina ver Ejemplo 10) . En breve, las células (por ejemplo, células Ramos) pueden incubarse con un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo en el formato IgGl) durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo, 24 ó 48 horas y el efecto, después de cosechar la célula y la tinción con Anexina V puede medirse a través de análisis FACS (por ejemplo, utilizando EasyCyte) . La tinción con Anexina V es . indicativa de células apoptóticas, mientras las células muertas pueden identificarse (y distinguirse de las células apoptóticas) a través de por ejemplo tinción PI .
Los anticuerpos C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10 han demostrado que son capaces de inhibir la señalización inducida por el ligando a través de CXCR4 , por ejemplo, la inhibición de las respuestas celulares ligadas por CXCR4 a un. ligando CXCR4 tal como SDF-1, en particular a través de la inhibición de la liberación de los iones de calcio en respuesta a un ligando CXCR4 tal como SDF-1 (ver Ejemplo 6) . De esta forma, los anticuerpos de la invención son preferiblemente capaces de inhibir las respuestas celulares ligadas por CXCR4 a un ligando CXCR4 tal como SDF-1, en particular a través de la inhibición de la liberación de los iones de calcio en respuesta a un ligando CXCR4 tal como SDF-1. En particular, los anticuerpos son preferiblemente capaces de inhibir el flujo de calcio inducido por SDF-1. Tales métodos de ensayo son conocidos y un ensayo se describe en el Ejemplo 6.
El "bloqueo" o "inhibición" de varios eventos mediados por CXCR4 se describen en la presente tales como los eventos de señalización en corriente abajo de CXCR4 , la señalización inducida por el ligando a través de CXCR4 , las respuestas celulares mediadas por CXCR4 a un ligando CXCR4 , la liberación de iones de calcio, la migración inducida por el ligando, etc., significa que la propiedad en cuestión es miscible o significativamente se reduce en la presencia del anticuerpo de la invención comparado con la ausencia del anticuerpo. Por ejemplo, tal propiedad puede reducirse en al menos 10, 20, 30, o 40%, más preferiblemente al menos 45, 50, 55, 60, 65, 70 o 75%, aún más preferiblemente al menos 80% en la presencia del anticuerpo comparado con la unión en la ausencia del anticuerpo. La reducción en al menos 85, 90 ó 95% también se contemplan para ciertas propiedades.
En el caso de bloque o inhibición de la liberación de iones de calcio (flujo de calcio) en al menos 20% o 30% de inhibición por lo general se ve con anticuerpos de la invención que elevan hasta al menos 70%, 75%, 80% o 95% (ver Ejemplo 6) . Las concentraciones ilustrativas del anticuerpo utilizado para obtener tal inhibición son de 4 µg/ml , 10 yig/ml o 100 µ9/p?1. En ciertas modalidades de la invención, la concentración del anticuerpo capaz de elevarse a 50% de inhibición de la liberación de iones de calcio (IC50) de células CXCR4+, por ejemplo, células CCRF-CEM, in vitro, es preferiblemente menor de 50 nM, 40 nM, 35 nM o 30 nM (o cualquier número entero entre 30 y 50) , 25 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 7 nM o 5 nM (o cualquier número entero entre 5 y 30) .
Por ejemplo, el anticuerpo C-9P21 de la invención ha demostrado que tiene un IC50 de 29 nM para células CCRF-CEM. El anticuerpo 9N10 ha demostrado que tiene IC50 de 3.85 nM para células CCRF-CEM.
En algunas modalidades, los anticuerpos pueden bloquear o inhibir la migración o la quimiotaxis de células CXCR4+ hacia un ligando de CXCR4 tal como SDF-1 (ver Ejemplo 7) . La inhibición de la migración en la quimiotaxis puede ensayarse utilizando métodos estándar, por ejemplo, utilizando un ensayo de trans-cavidad. En resumen, las células capaces de quimiotaxis que expresan CXCR4 se ponen en contacto con el anticuerpo en una cámara y un ligando de CXCR4 tal como SDF-1 se coloca en otra cámara separada de la primera cámara por una membrana de filtro que tiene un tamaño de poro adecuado. El efecto del anticuerpo sobre la migración celular hacia el ligando (quimiotaxis) se determina comparando la quimiotaxis en la presencia del anticuerpo a la quimiotaxis en la ausencia del anticuerpo. Un ensayo adecuado se describe en el Ejemplo 7. Por lo menos el 50% y hasta el 100% de inhibición de la migración se ve dependiendo de la concentración del anticuerpo.
En ciertas modalidades de la invención, la concentración del anticuerpo capaz de dar origen al 50% de inhibición de migración celular (IC50) de células CXCR4+, por ejemplo, células CCRF-CEM, in vitro, es preferiblemente menor de 20 µ9/??1, 15 g/ml (o cualquier número entero entre 15 y 20) , 10 µ9/p?1 (o cualquier número entero entre 10 y 15) , 5 µ9/??1 (o cualquier número entero entre 5 y 10), 4 µ9/??1, 3 µ9/p?1, 2 µ9/t?1 o 1 µ9/??1. Por ejemplo, el anticuerpo C-9P21 de la invención ha demostrado que tiene un IC50 de 2.9 µ9/p?1 para células CCRF-CEM. En ciertas modalidades de la invención, los anticuerpos son capaces del 100% de inhibición in vitro a 5 µ9/p?1 , 10 µ9/p?1 , 15 µ9/?1, 20 µ9/p?1 , 25 µ9/???1 o 30 µ9/??1 (o cualquier número entero entre 6 y 30 µ9/t?1) .
Preferiblemente los anticuerpos de la invención (por ejemplo, C-9P21, C-1I24, D-1K21, B-1M22 y 9N10) son capaces de inhibir la unión de CXCR4 a uno o más de sus ligandos. -Preferiblemente, la unión de por lo menos SDF-1 se inhibe. Más preferiblemente, la unión a SDF-1 y AMD-3100 se inhibe. Por ejemplo, los anticuerpos C-9P21, C-1I24, 9N10 y D-1K21 han demostrado que son capaces de inhibir la unión de CXCR4 a su ligando SDF-1 (Ejemplo 3) . Los anticuerpos C-9P21, C-1I24 y D-1K21 han demostrado que son capaces de inhibir la unión de CXCR4 a AMD-3100 (Ejemplo 3) . Dados sus efectos en el flujo de calcio, se puede esperar que B-1M22 también compita con el ligando para la unión a CXCR4.
Por "bloqueo de la unión" o inhibición de la unión" de un ligando a CXCR4 significa que la unión del ligando a CXCR4 es miscible o significativamente reducida, por ejemplo se reduce en al menos 10, 20, 30, o 40%, más preferiblemente al menos 45, 50, 55, 60, 65, 70 ó 75%, aún más preferiblemente al menos 80% en la presencia del anticuerpo comparado con la unión en la ausencia del anticuerpo. En modalidades en donde la unión del ligando a CXCR4 se reduce en al menos 85, 90 ó 95% también se contemplan. Visto alternativamente, cuando el ligando primero se pone en contacto con CXCR4 y el anticuerpo posteriormente se adiciona, el ligando puede inhibir la unión del anticuerpo a CXCR4.
Los ensayos para determinar si un anticuerpo puede inhibir la unión de un ligando a CXCR4 son bien conocidos y serán inmediatamente evidentes para un experto en la técnica. Un ensayo adecuado se describe en el Ejemplo 3. Brevemente, las células CXCR4+ se incubaron con SDF-1 (o AMD-3100, según sea apropiado) o sin SDF-1 (o AMD-3100, según sea apropiado), después el anticuerpo se agregó y el anticuerpo después se detectó con un anticuerpo anti-humano marcado. Para anticuerpos con la habilidad de inhibir la unión de un ligando a CXCR4 , la pre- incubación en la presencia de SDF-1 (o AMD-3100, según sea apropiado) dio como resultado la reducción de la unión del anticuerpo a CXCR4. Particularmente, la unión del anticuerpos a células Ramos, células Jurkat o células CCRF-CEM que naturalmente expresa CXCR4 y se pre- incubaron con SDF-1 o AMD-3100 se inhibieron. Alternativamente, los anticuerpos que se han ensayado pueden agregarse a las células al mismo tiempo que el ligando, o los anticuerpos pueden agregarse primero.
Los ensayos alternativos para determinar si un anticuerpo puede bloquear la unión del ligando a CXCR4 incluyen el uso de un ligando marcado, por ejemplo, ligando radiomarcado .
A pesar de que no es mecanismo principal de acción de los anticuerpos de la invención, los anticuerpos de la invención preferiblemente tienen la habilidad de inducir la citotoxicidad celular dependiendo del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés) de células CXCR4+. ADCC puede ensayarse in vitro utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Un método adecuado en el cual las células CXCR4+, por ejemplo, células CCRF-CEM, se marcan con una etiqueta fluorescente con el fin de evaluar la lisis de ADCC en la presencia de PBMC se describe en el Ejemplo 8. Alternativamente, se puede utilizar un ensayo de liberación de Cromio-51, por ejemplo. De esta forma, los anticuerpos de la invención pueden por ejemplo causar por lo menos 10%, 15%, 20%, 22%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de aniquilación de células CXCR4+ in vitro, por ejemplo, en la presencia de PBMC humano. Los anticuerpos que pueden inducir 100% o casi 100% de aniquilación también se incluyen. Por ejemplo, el anticuerpo B-1M22 ha demostrado que induce 100% (o casi 100% dados los límites de error experimental) de aniquilación en algunos experimentos (ver Ejemplo 8, en donde esencialmente se induce el 100% de aniquilación de la línea celular CXCR4+ CCRF-CEM en la presencia de PBMC humano y el anticuerpo B-1M22) . Además, al nivel IgG, los anticuerpos C-9P21 y C-1I24 han demostrado que causan por lo menos 50%, 55% o 60% de aniquilación de la línea celular CXCR4+ CCRF-CEM en la presencia de PBMC humano, el anticuerpo D-1K21 ha demostrado que causa por lo menos 15%, 20% o 25% de aniquilación de la línea celular CXCR4+ CCRF-CEM en la presencia de PBMC (ver Ejemplo 8) .
Aunque no es el mecanismo principal de acción de los anticuerpos de la invención, ADCC es ventajosa para algunas aplicaciones, particularmente algunas aplicaciones terapéuticas. De esta forma, en modalidades preferidas el anticuerpo puede inducir ADCC de células CXCR4+, preferiblemente células tumorales CXCR4+ en la presencia de PBMC. En otras modalidades, los anticuerpos inducen poca o ADCC no significativa.
Los anticuerpos de la invención preferiblemente también demuestran que son adecuadamente potentes en términos de concentración del anticuerpo requerido para obtener tales niveles de ADCC. De nuevo, una prueba adecuada in vitro se describe en el Ejemplo 8.
De esta forma, la concentración del anticuerpo requerida para la lisis celular máxima media (EC50) de células CXCR4+, por ejemplo, células CCRF-CEM, in vitro es preferiblemente menor de 2000 ng/ml, 1500 ng/ml, 1000 ng/ml, 700 ng/ml, 650 ng/ml, 620 ng/ml, 600 ng/ml, 550 ng/ml, 500 ng/ml, 450 ng/ml, 400 ng/ml, 350 ng/ml, 300 ng/ml, 250 ng/ml, 200 ng/ml, 150 ng/ml, 125 ng/ml, 100 ng/ml, 90 ng/ml, 80 ng/ml, 70 ng/ml, 60 ng/ml, 50 ng/ml, 45 ng/ml, 40 ng/ml, 35 ng/ml, 30 ng/ml, 25 ng/ml, 20 ng/ml, 15 ng/ml, 10 ng/ml, 9 ng/ml, 7 ng/ml, 5 ng/ml, 2 ng/ml, 1 ng/ml, 0.5 ng/ml o 0.25 ng/ml. Por ejemplo, al nivel de IgG, el anticuerpo C-9P21 de la invención ha demostrado tener un EC50 de 1852 ng/ml para células CCRF-CEM, y el anticuerpo C1I24 de la invención ha demostrado tener un EC50 de 49.2 ng/ml para células CCRF-CEM. El anticuerpo D-1K21 de la invención ha demostrado tener un EC50 de 79.9 ng/ml y el anticuerpo B-ÍM22 de la invención ha demostrado tener un EC50 de 115.7 ng/ml.
En algunas modalidades, los anticuerpos pueden inducir citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) de células CXCR4+, pero en otras modalidades los anticuerpos no son capaces de inducir CDC. Por ejemplo, los anticuerpos B-1M22 y C1I24, en particular C-1I24, han demostrado tener una buena habilidad para inducir CDC de células CXCR4+, por ejemplo, en células Ramos (ver Ejemplo 9).
La inducción de CDC puede ensayarse utilizando métodos estándar bien conocidos, por ejemplo, la marcación de las células CXCR4+ tal como Ramos con un etiqueta fluorescente con el fin de evaluar la lisis CDC en la presencia de un suero humano. Un ensayo adecuado se explica en el Ejemplo 9.
Otras propiedades preferidas incluyen la ausencia de toxicidad significativa in vivo cuando los anticuerpos de la invención se administran y en la ausencia de otros efectos secundarios significativos in vivo.
Preferiblemente, las habilidades descritas en la presente se observan a un nivel miscible o significativo y más preferiblemente a un nivel estadísticamente significativo cuando se comparan con niveles de control apropiados.
Algunos anticuerpos son capaces ser internalizados en las células a las cuales se unen. De esta forma, en algunas modalidades de la invención los anticuerpos son capaces de ser internalizados. Esta propiedad es particularmente ventajosa para utilizarse en inmunoconjugados como cualquier otro agente acoplado a la molécula del anticuerpo deberá internalizarse con la molécula del anticuerpo. En otras modalidades no se ve ninguna internalización significativa.
El experto en la técnica estará consciente de las formas adecuadas para ensayar la internalización, por ejemplo utilizando marcación fluorescente diferencial en temperatura en citometría de flujo o microscopía confocal . Un ejemplo de un ensayo adecuado involucra un anticuerpo secundario marcado con un tinte sensible al pH (tal como CypHer5E) , que es mínimamente fluorescente a un pH básico (como se encuentra fuera de las células) y máximamente fluorescente a un pH ácido (como se encuentra dentro de las células) .
El término "ligando" de CXCR4 incluye los ligandos naturales de CXCR4 tal como SDF-1, que puede naturalmente producirse, expresarse o sintetizarse recombinantemente en el laboratorio. Este término también incluye ligandos no naturales o modificados de CXCR4 , tal como AMD-3100, que puede unirse a CXCR4.
Por "células CXCR4+" o "células que expresan CXCR4" significa células que expresan CXCR4 en su superficie, preferiblemente al menos sustancialmente en su conformación de tipo silvestre. Las células CXCR4+ pueden ser naturalmente positivas para CXCR4, o después pueden ser transformantes que expresan CXCR4 recombinante .
En vista de esta invención, por consiguiente, un intervalo de anticuerpos anti-CXCR4 puede hacerse y utilizarse en una variedad de modalidades, incluyendo en el tratamiento de cualquiera de los trastornos explicados en cualquier lugar en la presente, particularmente cáncer (incluyendo cáncer metastático) , trastornos autoinmunitarios , trastornos inflamatorios e infecciones, en particular infecciones virales tales como VIH.
Como se utiliza en toda la solicitud, los términos "uno" y "una" se utilizan en el sentido de que significan "por lo menos uno", "por lo menos un primer", "uno o más", o "una pluralidad", de componentes o pasos ref renciados , excepto en casos en donde la limitación superior a continuación se afirma específicamente. Por consiguiente, un "anticuerpo" como se utiliza en la presente, significa "por lo menos un primer anticuerpo" . Los límites y parámetros operables de combinaciones, como con las cantidades de cualquier agente individual, serán conocidos por el experto en la técnica en vista de la presente descripción.
Las modalidades preferidas de la invención son composiciones que comprenden por lo menos un anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, o uno de sus fragmentos de unión a an ígeno .
Las moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótido que codifican los anticuerpos de la presente invención como se describen en la presente o sus partes o fragmentos, o moléculas de ácido nucleico sustancíalmente homogéneas a la misma, forman aspectos adicionales de la invención. Las moléculas de ácido nucleico preferidas comprenden secuencias que codifican la secuencia de aminoácido explicada en SEC ID NO: 35 (que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 34), SEC ID NO: 46 (que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 45) , SEC ID NO: 57 (que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 56), SEC ID NO: 68 (que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 67) o SEC ID NO: 101 (que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 100) . Otras moléculas de ácido nucleico preferidas comprenden secuencias que codifican una región variable de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 69, 71, 73 ó 75 (que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 77, 79, 81 o 83) y/o comprenden secuencias que codifican una región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 70, 72, 74, 76 ó 103 (que preferiblemente se codifica por SEC ID NO: 78, 80, 82, 84 ó 105) . Los más preferidos son los ácidos nucleicos que codifican las siguientes combinaciones: SEC ID NOs : 69 y 70; o SEC ID NOs : 71 y 72; o SEC ID NOs: 73 y 74; o SEC ID NOs : 75 y 76; o SEC ID NOs : 69 y 103. También se prefieren moléculas de ácido nucleico que comprende las siguientes combinaciones: SEC ID NOs: 77 y 78; o SEC ID NOs : 79 y 80; o SEC ID NOS: 81 y 82; o SEC ID NOs: 83 y 84; o SEC ID NOs : 77 y 105.
Otras moléculas de ácido nucleico preferidas comprenden secuencias que codifican formas IgG de los anticuerpos de la invención, por ejemplo las descritas en el Ejemplo 4, o formas quiméricas de murino.
Como se indica anteriormente, otras moléculas de ácido nucleico abarcadas por la presente invención son aquellas que codifican parte o fragmentos de los anticuerpos humanos de la presente invención, por ejemplo, los que codifican una región variable de cadena pesada (VH) de un anticuerpo (por ejemplo, aquellos que codifican SEC ID NO: 69, 71, 73 ó 75, tales como SEC ID NOs : 77, 79, 81 ó 83 respectivamente) o aquellos que codifican una región variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo (por ejemplo, aquellos que codifican SEC ID NO: 70, 72, 74, 76 ó 103, tal como SEC ID NO: 78, 80, 82, 84 ó 105 respectivamente). Otras moléculas de ácido nucleicos preferidas son aquellas que codifican una cadena pesada de un anticuerpo de la presente invención (por ejemplo, las que codifican SEC ID NO: 108, 112, 116 ó 120, tal como SEC ID NOs : 106, 110, 114 ó 118 respectivamente) o las que codifican una cadena ligera de un anticuerpo (por ejemplo, aquellos que codifican SEC ID NO: 109, 113, 117, 121 ó 125 tal como SEC ID NOs : 107, 111, 115, 119 ó 123 respectivamente) .
De esta forma, los fragmentos de los anticuerpos de la invención como se definen en la presente, o las secuencias sustancialmente homologas a las mismas, o moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias que codifican tales fragmentos forman aún otro aspecto de la invención.
Ventajosamente, los anticuerpos de la presente invención, cuando están en formato IgG, tienen una alta afinidad de unión para CXCR4 , es decir, tienen un Kd en el intervalo de lxlO"8 M o lxlO"9 M o menor. De manera importantes, los anticuerpos con tal afinidad están en el intervalo establecido que ha sido demostrado que es útil para terapia .
En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención pueden unirse tanto a CXCR4 humano como CXCR4 de mono. Por ejemplo, los anticuerpos C-9P21, C1I24, D1K21, 9N10 y B-1M22 todos tienen esta capacidad. Tal reactividad cruzadas en las especies en particular entre humanos y especies comúnmente utilizadas como modelos de animal pre-clínicos, pueden ser una ventaja, ya que permite una traducción más efectiva de estudios preclínicos para uso clínico. Por ejemplo, teniendo un anticuerpo que reacciona de manera cruzada con el CXCR4 nativo presente en el modelo de animal particular utilizado significa que los resultados en este modelo más probablemente reflejará la situación en un paciente humano, por lo tanto permitiendo una evaluación más precisa de por ejemplo la dosificación que se va a hacer una probabilidad aumentada de identificar cualquier efecto potencialmente relevante o secundario problemático. Esto es especialmente el caso si el anticuerpo tiene una afinidad similar a ambos CXCR4 de mono y humano.
Por ejemplo, la habilidad de un anticuerpo de la invención a unirse a ambos CXCR4 humano y CXCR4 de mono significa que tales anticuerpos pueden ensayarse en estudios de toxicidad preclínicos para evaluar los efectos secundarios adversos del tratamiento y para encontrar las dosificaciones toleradas apropiadas.
Además, la habilidad de unirse a ambos CXCR4 de humano y CXCR4 de ratón significa que los resultados mostrados por tales anticuerpos de la invención en modelos de ratón, por ejemplo, modelos singeneicos de ratón utilizando ratones inmunocompetentes , más probablemente serán representativos de la actividad de los anticuerpos en sujetos humanos. La razón de esto es que los anticuerpos que pueden unirse a CXCR4 humano pero no a CXCR4 de ratón se unirán a CXCR4 expresado por la células tumorales humanas en modelos de ratón pero no serán capaces de unirse a CXCR4 de murino endógeno. Esto es por supuesto diferente de la situación en un paciente humano, en donde el CXCR4 expresado por el tumor CXCR4 endógeno estaría presente.
La desventaja potencial con tal situación es que un anticuerpo que se une a CXCR4 humano pero no, o con una afinidad significativamente inferior a CXCR4 de ratón podría llevarse a cabo bien en un modelo de xenoinjerto de tumor humano en ratones inmunocomprómetidos (por ejemplo, ratones desnudos o SCID) pero esto podría no verse reflejado por un rendimiento similar en un sistema humano en donde está presente mucho más CXCR4. En otras palabras, el efecto anti-tumoral visto en un sistema de xenoinjerto de ratón con un anticuerpo que puede unirse a CXCR4 humano pero en CXCR4 de ratón podría verse mejor que la realidad clínica. En contraste, cuando se trabaja con un anticuerpo que puede unirse tanto CXCR4 de humano como de ratón entonces esto se unirá a todas las formas de CXCR4 presentes en el sistema del modelo de ratón y probablemente será más representativo de la situación con el anticuerpo se pone en los humanos. Esto es especialmente el caso si el anticuerpo tiene una afinidad similar a ambos CXCR4 de murino y de humano.
En modalidades preferidas, los anticuerpos de la invención se unen a CXCR4 de humano y de mono o a CXCR4 de humano y de ratón o a CXCR4 de humano y mono y ratón con afinidades similares.
Por "afinidad similar" también significa que la afinidad de unión del anticuerpo para CXCR4 humano y para una o más de las otras especies de interés (por ejemplo, mono o ratón) es comparable, por ejemplo, no es más de un factor de 20 diferentes. Más preferiblemente la diferencia entre las afinidades de unión es menor de un factor de 15, más preferiblemente menor de un factor de 10, más preferiblemente menor de un factor de 5 , 4, 3 ó 2. La comparación de las afinidades de unión puede llevarse a cabo a través de cualquier método apropiado. Para un ligando de superficie celular tal como CXCR4 , los métodos de citometría de flujo tales como FACS proporcionan un método conveniente de comparación en donde las curvas de unión y, por ejemplo, los valores medios, pueden compararse, en este experimento. Un método apropiado se describe en el Ejemplo 5.
Sin embargo, en otras modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden no unirse a CXCR4 de mono y/o pueden no unirse a CXCR4 de ratón.
En las siguientes descripciones ' de las composiciones, inmunoconjugados , farmacéuticos, combinaciones, cocteles, primero y segundos usos médicos y todos los métodos de acuerdo con esta invención, los términos "anticuerpos" y "inmunoconjugados" o una región de unión a antígeno o uno de sus fragmentos, a menos que se afirme específicamente lo contrario o sea haga claro a partir de la terminología científica, se refieran al intervalo de anticuerpos anti-CXCR4 así como a anticuerpos C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21, y 9N10 específicos.
El términos "anticuerpo" y "inmunoglobulina" , como se utilizan en la presente se refieren ampliamente a cualquier agente o molécula de unión inmunológica que comprende un dominio de unión de antígeno humano, que incluye anticuerpos policlonales y monoclonales. Dependiendo del tipo de dominio constante en las cadenas pesadas, los anticuerpos completos se asignan a una de las cinco clases principales: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM y los anticuerpos de la invención pueden estar en cualquiera de estas clases. Varios de estos además se dividen en subclases o isotipos, tales como IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , y similares. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobuli a se denominan , d, e, ? y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulina son bien conocidas.
En general, en donde se utilizan anticuerpos completos en lugar de regiones de unión a antígeno en la invención, IgG y/o IgM son preferidos porque son los anticuerpos más comunes en la situación fisiológica y porque son más fáciles de hacer en una instalación de laboratorio. Los anticuerpos IgGl son particularmente preferidos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de mamífero se asignan a uno de los tipos claramente diferentes: kappa (?) y lambda (?) , con base en las secuencias de aminoácido de sus términos constantes y algunos aminoácidos de las regiones de cadena principal de sus dominios variables. Esencialmente no existe ninguna preferencia para utilizar en regiones constantes de cadena ligera ? o ? de los anticuerpos de la presente invención.
Como se entenderá por los expertos en la técnica, los reactivos de unión inmunológicos abarcados por el término "anticuerpo" se extienden a todos los anticuerpos y sus fragmentos de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos completos, anticuerpos diméricos, triméricos y multiméricos , anticuerpos biespecífieos ; anticuerpos quiméricos; anticuerpos recombinantes y modificados, y sus fragmentos.
El término "anticuerpo" de esta forma utilizado para referirse a cualquier molécula de tipo anticuerpo que tiene una región de unión a antígeno, y este término incluye fragmentos de anticuerpo que comprenden un dominio de unión a antígeno tal como Fab 1 , Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio individual (DAB, por sus siglas en inglés) , dímero TandAbs, Fv, scFv (Fv de cadena individual) , dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpos lineales, minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpos biespecíficos, bicuerpos, tricuerpos (fusiones scFv-Fab, biespecíficas o triespecíficas , respectivamente); sc-diacuerpo ; cuerpos kappa (lambda) (fusiones scFv-CL) ; Empleador de Célula T Biespecífico (BiTE) (tándems de scFv-scFv para atraer células T) ; el dominio variable doble (DVD) -Ig (formato biespecífico) ; inmunoproteína pequeña (SIP) (clase de minicuerpo) ,- SMIP (dímero scFv-Fc "inmunofarmacéutico modular pequeño"); DART (diacuerpo ds-estabilizando "Re-Activación de Afinidad Doble"); miméticos de anticuerpo pequeño que comprenden una o más CDR y similar.
Las técnicas para preparar y utilizar varios constructos con base en anticuerpo y fragmentos son bien conocidas en la técnica (ver Kabat y otros, 1991, específicamente incorporada aquí por referencia) . Los diacuerpos, en particular, además se describen en EP 404, 097 y O 93/11161; a pesar de que los anticuerpos lineales además se describen en Zapata y otros (1995) .
Los anticuerpos pueden fragmentarse utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, los fragmentos F(ab' )2 pueden generarse mediante el tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab' )2 resultante puede tratarse para reducir los puentes de disulfuro para producir fragmentos Fab ' . La digestión con papaína puede conducir a la formación de fragmentos Fab. Fab, Fab' y F(ab')2/ scFv, Fv, dsFv, Fd, dAbs, TandAbs, ds-scFv, dímeros , minicuerpos, diacuerpos, fragmentos de anticuerpo biespecífieos y otros fragmentos tambi°én pueden sintetizarse a través de técnicas recombinantes o pueden sintetizarse químicamente. Las técnicas para producir fragmentos de anticuerpo son bien conocidas y se describen en la técnica. Por ejemplo, cada uno de Beckman y otros, 2006; Holliger & Hudson, 2005; Le Gall y otros, 2004; Reff & Heard, 2001; Reiter y otros, 1996; y Young y otros, 1995 además describen y permiten la producción de fragmentos de anticuerpo efectivos.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden producirse naturalmente o pueden completa o parcialmente producirse sintéticamente. De esta forma el anticuerpo puede ser de una fuente apropiada, por ejemplo, fuentes recombinantes y/o producirse en animales transgénicos o plantas transgénicas , o en huevos utilizando tecnología IgY.
De esta forma, las moléculas del anticuerpo pueden producirse in vi ro o in vivo.
Preferiblemente, el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) que comprende tres dominios CDR y una región variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) que comprende tres dominios CDR. Tales VL y VH generalmente forman el sitio de unión a antígeno.
Un fragmento "Fv" es el fragmento del anticuerpo mínimo que contiene un sito de reconocimiento y unión a antígeno completo. Esta región tiene un dímero de un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera en asociación y no covalente hermética. Es en esta configuración en donde las tres regiones hipervariables (CDR) de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables (CDR) confieren la especificidad de unión a antígeno al anticuerpo.
Sin embargo, está bien documentado en la técnica que la presencia de tres CDR del dominio variable de cadena ligera y tres CDR del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo no son necesarias para la unión al antígeno. De esta forma, los constructos más pequeños que el fragmento de anticuerpo clásico anterior se sabe que son efectivos.
Por ejemplo, los anticuerpos de camélido (Hamers-Casterman y otros, 1993; Arbabi Ghahroudi y otros, 1997) tienen un repertorio de unión a antígeno extenso pero están desprovistos de cadenas ligeras. También, los resultados con anticuerpos del dominio individual que comprenden dominios VH solos ( ard y otros, 1989; Davies and Riechmann, 1995) o dominios VL solos (van den Beucken y otros, 2001) muestran que estos dominios pueden unirse al antígeno con una aceptable alta afinidad. De esta forma, las tres CDR pueden efectivamente unirse al antígeno.
También se sabe que una sola CDR, o dos CDR, pueden efectivamente unirse al antígeno. Como un primer ejemplo, una sola CDR puede insertarse en una proteína heteróloga y conferir la habilidad de unión al antígeno en la proteína heteróloga, como se ejemplifica demostrando que una región CDR3 VH insertada a la proteína heteróloga, tal como GFP, confieren la habilidad de unión al antígeno en la proteína heteróloga (Kiss y otros, 2006; Nicaise y otros, 2004) .
Además se sabe que dos CDR pueden efectivamente unirse al antígeno, y aún conferir propiedades superiores que las que posee por el anticuerpo progenitor. Por ejemplo, se ha demostrado (Qiu y otros, 2007) que dos CDR del anticuerpo progenitor (una región CDRl VH y una región CDR3 VL) retienen las propiedades de reconocimiento del antígeno de la molécula progenitora pero tienen una capacidad superior para penetrar tumores. La unión de estos dominios CDR con una secuencia enlazadora apropiada (por ejemplo, FR2 VH) para orientar la CDR en una forma que se asemeja al anticuerpo progenitor nativo produjo aún un mejor reconocimiento del antígeno. Por consiguiente, se sabe en la técnica que es posible construir miméticos del anticuerpo de unión a antígeno que comprenden dos dominios CDR (preferiblemente uno un dominio VH y uno de un dominio VL, más preferiblemente, con uno de los dos dominios CDR siendo un dominio CDR3 ) orientado por medio de una región de cadena principal apropiada para mantener la conformación encontrada en el anticuerpo progenitor.
De esta forma, aunque los anticuerpos preferidos de la invención podrían comprender seis regiones CDR (tres de una cadena ligera y tres de una cadena pesada), los anticuerpos con menos de seis regiones CDR y tan pocas como una o dos regiones CDR están abarcadas por la invención. Además, los anticuerpos con CDR forman solamente la cadena pesada o la cadena ligera que también se contemplan.
Los anticuerpos preferidos de la invención que se unen a CXCR4 comprenden al menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende: (a) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, (b) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y (c) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; o (d) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, (e) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y (f) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de. SEC ID NO: 9 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; o (g) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, (h) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y (i) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; o (j) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, (k) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma, y (1) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; o Las regiones CDR de cadena ligera preferidas para utilizarse junto con las regiones CDR de cadena pesada especificadas se describen en cualquier lugar en la presente. Sin embargo, otras regiones variables de cadena ligera que comprenden tres CDR para utilizarse junto con las regiones variables de cadena pesada de la invención también se contemplan. Las regiones variables de cadena ligera apropiadas pueden utilizarse en combinación con las regiones variables de cadena pesada de la invención y que dan origen a un anticuerpo que se une a CXCR4 pueden fácilmente identificarse por un experto en la técnica.
' Por ejemplo, una región variable de cadena pesada de la invención puede combinarse con una región variable de cadena ligera individual o un repertorio de regiones variables de cadena ligera y los anticuerpos resultantes se ensayan para la unión a CXCR4. Se esperaría que un número razonable de tales combinaciones de cada región variable de cadena pesada de la invención con diferentes regiones variables de cadena ligera retuvieran la habilidad de unirse a CXCR . Ciertamente el anticuerpo 9N10 tiene la misma región variable de cadena pesada que C-9P21 pero una diferente región variable de cadena ligera.
Podrían utilizarse métodos similares para identificar regiones variables de cadena pesada alternativas para utilizarse en combinación con regiones variables de cadena ligera preferidas de la invención.
En ciertas modalidades, el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo comprende todas o una porción de la región constante de cadena pesada tal como una región constante IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4 , IgAl, IgA2 , IgE, igM o IgD . Preferiblemente, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada IgGl o una de sus porciones. Además, el anticuerpo o el fragmento del anticuerpo pueden comprender toda o una porción de la región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena ligera lambda, o una de sus porciones. Toda o parte de las regiones constantes pueden producirse naturalmente, o pueden ser completa o parcialmente ' sintéticas . Las secuencias apropiadas para tales regiones constantes son bien conocidas y están documentas en la técnica. Cuando se incluye un complemento completo de regiones constantes de las cadenas pesada y ligera en los anticuerpos de la invención, tales anticuerpos son típicamente referidos en la presente como anticuerpos "de longitud completa" o anticuerpos "completos" .
Los anticuerpos que contienen una región Fe son preferidos para ciertos usos, particularmente usos terapéuticos in vivo, en donde la región FC media las funciones efectoras tales como ADCC. Las regiones Fe apropiadas serían bien conocidas para un experto en la técnica y pueden seleccionarse por consiguiente.
El término "sustancialmente homólogo" como se utiliza en la presente en conexión con una secuencia de aminoácido o ácido nucleico incluye secuencias que tienen por lo menos 70% o 75%, preferiblemente al menos 80%, y aún más preferiblemente al menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido o ácido nucleico descrita. Las secuencias sustancialmente homologas de la invención de esta forma incluyen bases individuales o múltiples o alteraciones de aminoácido (adiciones, sustituciones, inserciones o eliminaciones) a las secuencias de la invención. Al nivel del aminoácido las secuencias sustancialmente homologas preferidas contienen solamente hasta 1, 2, 3, 4 ó 5, preferiblemente hasta 1, 2 ó 3, más preferiblemente hasta 1 ó 2, aminoácidos alterados, en una o más de las regiones de cadena principal y/o una o más de las CDR que forman las secuencias de la invención. Tales alteraciones pueden estar con aminoácidos conservadores o no conservadores. Preferiblemente tales alteraciones son sustituciones de aminoácido conservadoras.
Las secuencias de ácido nucleico sustancialmente homologas también incluyen secuencias de nucleótido que hibridan las secuencias de ácido nucleico descritas (o sus secuencias complementarias) , por ejemplo, hibridan a secuencias de nucleótido que codifican una o más de las CDR de cadena ligera o cadena pesada de la invención, las regiones variables de cadena ligera o pesada de la invención, o los anticuerpos de la invención (o hibridan a sus secuencias com lementarias) , bajo al menos condiciones de hibridación moderadamente estrictas.
El término "sustancialmente homólogo" también incluye modificaciones o equivalentes químicos de las secuencias de aminoácido y nucleótido de la presente invención que llevan a cabo sustancialmente la misma función que las proteínas o moléculas de ácido nucleico de la invención es sustancialmente la misma forma. Por ejemplo, cualquier anticuerpo sustancialmente homólogo (o el ácido nucleico sustancialmente homólogo que la codifica) deberán retener la habilidad de unirse a CXCR4 como se describe anteriormente. Preferiblemente, cualquier anticuerpo sustancialmente homólogo deberá retener una o más de las capacidades funcionales del anticuerpo, por ejemplo, como se define en cualquier lugar en la presente. Preferiblemente, cualquier anticuerpo sustancialmente homólogo deberá retener la habilidad de específicamente unirse al mismo epítopo de CXCR4 como se reconoce por el anticuerpo en cuestión, por ejemplo, el mismo epítopo reconocido por los dominios CDR de la invención o los dominios VH y VL de la invención como se describe en la presente. La unión al mismo epítopo/antígeno puede fácilmente ensayarse a través de métodos bien conocidos y descritos en la técnica, por ejemplo, utilizando ensayos de unión, por ejemplo, un ensayo de competencia. La retención de estas propiedades funcionales también puede fácilmente ensayarse a través de los métodos bien conocidos y descritos en la técnica. Para los anticuerpos de la presente invención es particularmente preferido que las propiedades antagónicas y/o la propiedad de no inducción de apoptosis se retengan.
De esta forma, un experto en la técnica apreciará que los ensayos de unión pueden utilizarse para ensayar si los anticuerpos "sustancialmente homólogos" tienen las mismas especificidades de unión que los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo de la invención, por ejemplo, los ensayos de unión tales como citometría de flujo, ensayos ELISA o ensayos BIAcore que pueden fácilmente utilizarse para establecer si tales anticuerpos "sustancialmente homólogos" pueden unirse a CXCR4. La citometría de flujo en células es el ensayo más conveniente para analizar la unión a un receptor de superficie celular tal como CXCR4. Como se describe anteriormente, un ensayo de unión de competencia puede utilizarse para ensayar si los anticuerpos "sustancialmente homólogos" retienen la habilidad para específicamente unirse a sustancialmente el mismo epítopo de CXCR4 como se reconoce por los anticuerpos de la invención. El método descrito anteriormente es solamente un ejemplo de un ensayo de competencia adecuado. El experto en la técnica estará consciente de otros métodos y variaciones adecuadas.
Las secuencias de proteínas sustancialmente homologas de la invención incluyen, sin limitación, sustituciones de aminoácido conservadoras, o por ejemplo, alteraciones que no se efectúan en los VH, VL o CDR de los anticuerpos, por ejemplo, incluye anticuerpos scFv en donde se utiliza una diferente secuencia enlazadora o anticuerpos en donde las secuencias de etiqueta u otros componentes se agregan que contribuyen a la unión del antígeno, o las alteraciones para convertir un tipo o formato de molécula de anticuerpo o fragmento en otro tipo o formato de molécula de anticuerpos o fragmento (por ejemplo, la conversión de Fab a scFv o vice versa) , o la conversión de una molécula de anticuerpo a una clase o subclase particular de molécula de anticuerpo (por ejemplo, la conversión de una molécula de anticuerpo de IgG o una de sus clases, por ejemplo, IgGl o IgG3) .
Una "sustitución de aminoácido conservadora" , como se utiliza en la presente, es una en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tiene cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas ^ (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin cargar (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, cisteína, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina , metionina, triptófano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina , triptófano, histidina) .
La homología puede evaluarse a través de un método conveniente. Sin embargo, para determinar el grado de homología entre secuencias, los programas de computadora que hacen múltiples alineaciones de secuencias son útiles, por ejemplo, Clustal W (Thompson y otros, 1994) . Si se desea, el algoritmo Clustal W puede utilizarse junto con la matriz de clasificación BLOSUM 62 (Henikoff and Henikoff, 1992) y la penalidad de abertura de hueco de 10 y una penalidad de extensión de hueco de 0.1, de tal forma que la coincidencia en el orden más alto se obtiene entre dos secuencias en donde por lo menos 50% de la longitud total de una de las secuencias está involucrada en la alineación. Otros métodos que pueden utilizarse para alinear secuencias son el método de alineación de Needleman y Wunsch (1970) , como se revisa por Smith y aterman (1981), de tal forma que la coincidencia de orden más alto se obtiene entre las dos secuencias del número de aminoácidos idénticos se determina entre las dos secuencias. Otros métodos para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido son generalmente reconocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, los descritos por Carillo y Lipton (1988) y los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, e.d. Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing : Informatics and Genomics Proj ects .
Generalmente, los programas de computadora se emplearan para tales cálculos. Los programas que comparan y alinean pares de secuencias, como ALIGN (Myers and Miller, 1988), FASTA (Pearson y Lipman, 1988; Pearson, 1990) y BLAST con huecos (Altschul y otros, 1997) , BLASTP, BLASTN, o GCG (Devereux y otros, 1984) también útiles para este propósito. Además, el servidor Dalí en el Instituto de Bioinformáticas Europeo ofrece alineaciones con base en las estructuras de las secuencias de proteína (Holm, 1993; 1995; 1998).
Para proporcionar un punto de referencia, las secuencias de acuerdo con la presente invención que tienen 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología, identidad de secuencia, etc., pueden determinarse utilizando el programa ALIGN con parámetros o por omisión (por ejemplo, disponible en Internet en el servidor en red GENESTREAM, IGH, Montpellier, Francia) .
Por "condiciones de hibridación al menos moderadamente estrictas" significa que las condiciones se seleccionan para promover la hibridación selectiva entre dos moléculas de ácido nucleico complementarias en solución. La hibridación puede ocurrir en toda o una porción de la molécula de la secuencia de ácido nucleico. La porción de hibridación es típicamente al menos 15 (por ejemplo, 20, 25, 30, 40 ó 50) nucleótidos en longitud. Los expertos en la técnica reconocerán la estabilidad de un dúplex de ácido nucleico, o híbridos, se determina por Tm, que en reguladores de pH que contienen sodio es una función de la concentración del ion sódico y la temperatura (Tm = 81.5°C - 16.6 (LoglO [Na+] ) + 0.41(%(G+C) - 600/1), o ecuación similar). Por consiguiente, los parámetros en las condiciones de lavado que determinan la estabilidad híbrida son la concentración del ión del sodio y la temperatura. Con el fin de identificar moléculas que son similares, pero no idénticas, a una molécula de ácido nucleico conocida, una falta de coincidencia de 1% puede asumirse que resulta de aproximadamente un aumento de un grado en Tm. Por ejemplo, si se buscan moléculas de ácido nucleico que tienen >95% de identidad, la temperatura de lavado final se reducirá en aproximadamente 5°C. Con base estas consideraciones los expertos en la técnica serán capaces de fácilmente seleccionar las condiciones de hibridación apropiadas. En modalidades preferidas, las condiciones de hibridación estrictas se seleccionan. A manera de ejemplo, se pueden utilizar las siguientes condiciones para obtener una hibridación estricta: hibridación a 5x de cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) /5x solución de Denhardt/1.0% de SDS a Tm - 5°C con base en la ecuación anterior, seguido por un lavado de 0.2x SSC/0.1% de SDS a 60 °C. Las condiciones de hibridación moderadamente estrictas incluyen un paso de lavado en 3x SSC a 42°C. A manera de un ejemplo adicional, las secuencias que "hibridan" son aquellas secuencias que se unen (hibridan) bajo condiciones no estrictas (por ejemplo, 6 x SSC, 50% de formamida a temperatura ambiente) , y lavado bajo condiciones de bajo rigor (por ejemplo, 2 x SSC, temperatura ambiente, más preferiblemente 2 x SSC, 42°C) o condiciones de un rigor más alto (por ejemplo, 2 x SSC, 65°C) (en donde SSC = 0.15M de NaCl, 0.015M de citrato de sodio, pH 7.2).
Se entiende, sin embargo, que los rigores equivalentes pueden obtenerse utilizando reguladores de pH, sales y temperaturas alternativas. Las instrucciones adicionales con respecto a las condiciones de hibridación pueden encontrarse en: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6 y en: Sambrook y otros, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Vol .3.
Generalmente .hablando, las secuencias que hibridan bajo condiciones de alto rigor son preferidas, como son secuencias que, para la degeneración del código, hibridarían bajo altas condiciones de rigor.
En otras modalidades preferidas, los anticuerpos de la segunda generación son provistos que tienen propiedades mejoradas o superiores en comparación con un anticuerpo anti-CXCR4 original, tales como C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 ó 9N10. Por ejemplo, los anticuerpos de la segunda generación puede tener una afinidad de unión más fuerte para CXCR4 , un perfil de reactividad cruzada superior, inducir aún niveles inferior de apoptosis de células CXCR4+, una habilidad superior para activar células CXCR4+, particularmente células tumorales, por ejemplo, una habilidad mejorada para inhibir el crecimiento de células tumorales, una habilidad antagónica mejorada, por ejemplo, una habilidad mejorada para bloquear el influjo de Ca inducido por la unión de SDF-1 a CXCR4 , una inhibición mejorada de la migración inducida por el ligando, o una habilidad mejorada para inducir ADCC o CDC, dependiendo de la aplicación, o un tratamiento mejorado de los trastornos explicados en cualquier lugar en la presente.
Las comparaciones para identificar los anticuerpos de la segunda generación efectivos fácilmente se conducen y cuantifican, por ejemplo, utilizando uno o más de los varios ensayos descritos en detalle en la presente o en la técnica. Los anticuerpos de la segunda generación que tienen una propiedad o actividad biológica mejorada de por lo menos aproximadamente 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces y preferiblemente al menos 50 veces, en comparación con los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente invención, se ejemplifican a través de los anticuerpos C-9P21, B-1M22, C-1124, D-1K21, o 9N10, y están abarcados por la presente invención. Los anticuerpos de la segunda generación particularmente preferidos comprenden cadenas VH de los anticuerpos de la presente invención, o sus CDR VH, combinados con cadenas VL (o CDR VL alternativas) .
El anticuerpo, la proteína de unión, y las moléculas de ácido nucleico de la invención son generalmente moléculas "aisladas" o "purificadas" mientras se distinguen de cualquiera de tales componentes que pueden estar presentes in situ dentro de un cuerpo humano o de animal o en una muestra de tejido derivada.de un cuerpo de humano o animal. Las secuencias, sin embargo, pueden corresponder a o ser sustancialmente homologas a las secuencias como se encuentran en el cuerpo del humano o animal. De esta forma, el término "aislado" o "purificado" como se utiliza en la presente hacen referencia a moléculas o secuencias de ácido nucleico y proteínas o polipéptidos, por ejemplo, anticuerpos, y se refieren a tales . moléculas cuando se aislan, purifican de, o están sustancialmente de su entorno natural, por ejemplo, aisladas de o purificadas del cuerpo de humano o animal (si ciertamente son de existencia natural) o se refieren a tales moléculas como se producen a través de un proceso técnico, es decir, incluyen moléculas recombinantes o sintéticamente producidas .
De esta forma, cuando se utilizan en conexión con una molécula de ácido nucleico, tales términos pueden referirse a un ácido nucleico sustancialmente libre de material con el cual está naturalmente asociado tales como otros ácidos nucleicos/genes o polipéptidos. Estos términos también pueden referirse a un ácido nucleico sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se producen a través de técnicas de ADN recombinantes, o están sustancialmente libres de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Un ácido nucleico aislado purificado también puede estar sustancialmente libre de secuencias que naturalmente flanquean el ácido nucleico (es decir, secuencias localizadas en los extremos 51 y 31 del ácido nucleico) del cual se deriva el ácido nucleico o las secuencias que han sido hechas para flanquear el ácido nucleico (por ejemplo, secuencias de etiqueta, u otras secuencias que no tienen un valor terapéutico) a través de, por ejemplo, modificación genética.
De esta forma, cuando se utilizan en conexión con una molécula de proteína o polipéptido tales como las CDR 1, 2 y 3, de cadena ligera, las CDR 1, 2 y 3, de cadena pesada, las regiones variables de cadena pesada, y las proteínas de unión o los anticuerpos de la invención, que- incluyen anticuerpos de longitud completa, el término "aislado" o "purificado" típicamente se refiere a una proteína sustancialmente libre de material celular u otras proteínas de la fuente de la cual se deriva. En algunas modalidades, particularmente en donde la proteína se va administrar a humanos o animales, tales proteínas aislados o purificadas están sustancialmente libres del medio de cultivo cuando se producen a través de técnicas recombinantes , o precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Tales proteínas aisladas o purificadas también pueden estar libres de secuencias de flanqueo tales como aquellas descritas anteriormente para moléculas de ácido nucleico aisladas.
El término "secuencia de ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" como se utiliza en la presente se refiere a una secuencia de nucleósido o monómeros de nucleótido compuestos de bases, azúcares y enlaces ínter-azúcar de existencia natural (cadena principal) . El término también incluye secuencias modificadas sustituidas que comprenden monómeros de existencia no natural o una de sus porciones. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser secuencias de ácido de desoxirribonucleico (ADN) o secuencias de ácido ribonucleico (ARJST) y pueden incluir bases de existencia natural que incluyen adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo. Las secuencias también pueden contener bases modificadas. Los ejemplos de tales bases modificadas incluyen aza y deaza adenina, guanina, citosina, timidina y uracilo; y xantina e hipoxantina. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser monocatenarias o bicatenarias . Las moléculas de ácido nucleico pueden ser completa o parcialmente sintéticas o recombinantes .
En modalidades preferidas los anticuerpos de la invención son anticuerpos humanos, más preferiblemente anticuerpos completamente humanos. A este respecto, los anticuerpos humanos generalmente tienen por lo menos tres ventajas potenciales para utilizarse en terapia para humanos. En primer lugar, el sistema inmunitario humano no deberá reconocer el anticuerpo como foráneo. En segundo lugar, la vida media en la circulación humana será similar a los anticuerpos humanos de existencia natural, permitiendo dosis más pequeñas y menos frecuentes a ser dadas. En tercer lugar, debido a la porción efectora es humana, en modalidades en donde el modo de acción involucra la aniquilación de las células objetivo, interactuará mejor con las otras partes del sistema inmunitario, por ejemplo, para destruir células objetivo más eficientemente a través de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) .
Sin embargo, aunque los anticuerpos humanos generalmente se reconocen por desplegar estas ventajas, se sabe que el desarrollo de anticuerpos humanos que tienen afinidades lo suficientemente altas y propiedades funcionales apropiadas para convertirlos en candidatos para terapia humana exitosa es a través de medios no directos . Por consiguiente la técnica aún carece de anti-CXCR4 para el tratamiento seguro y efectivo de humanos y posee retos en el desarrollo de tales agentes.
El término "humano" como se utiliza en la presente en conexión con moléculas de anticuerpo y proteínas de unión en primer lugar se refiere a anticuerpos y proteínas de unión que tienen regiones variables (por ejemplo, regiones VH, VL, CDR o FR) y, opcionalmente , regiones de anticuerpo constante, aisladas o derivadas de un repertorio humano o derivadas o correspondientes a secuencias encontradas en humanos o repertorios humanos, por ejemplo, en la línea germinal humana o células somáticas. Los anticuerpos C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21, y 9N10 de la invención son ejemplos de tales moléculas de anticuerpo humanas en donde las regiones variables han sido aisladas de un repertorio humano.
Los anticuerpos "humanos" y las proteínas de unión de la invención además incluyen residuos de aminoácido no codificados por las secuencias humanas, por ejemplo, mutaciones introducidas por mutaciones aleatorias o dirigidas el sitio in vitro, por ejemplo, mutaciones introducidas por clonación o PC in Vitro. Los ejemplos particulares de tales mutaciones son mutaciones que involucran sustituciones conservadoras u otras mutaciones en un pequeño número de residuos del anticuerpo o la proteína de unión, por ejemplo, en hasta 5, 4, 3, 2 ó 1 de los residuos del anticuerpo o proteína de unión, preferiblemente por ejemplo en hasta 5, 4, 3, 2 ó 1 de los residuos que forman una o más de las CDR en el anticuerpo a la proteína de unión. Ciertos ejemplos de tales anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos y regiones variables que han sido sometidas a técnicas de modificación estándar para reducir la cantidad de sitios potencialmente inmunogénicos .
De esta forma, los anticuerpos "humanos" de la invención incluyen secuencias derivadas de y relacionadas con secuencias encontradas en humanos, pero pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal del anticuerpo humano in vivo. Además, los anticuerpos humanos y las proteínas de unión de la presente invención incluyen proteínas que comprenden secuencias de consenso humanas identificadas de secuencias humanas, o secuencias sustancialmente homologas a las secuencias humanas.
Además, los anticuerpos humanos y las proteínas de unión de la presente invención no están limitados a las combinaciones de las regiones de VH, VL) CDR o FR que por sí mismas se encuentran en combinación en las moléculas del anticuerpo humano. De esta forma, los anticuerpos humanos y las proteínas de unión de la invención pueden incluir o corresponder a combinaciones de tales regiones que no necesariamente existen naturalmente en humanos.
En modalidades preferidas, los anticuerpos humanos serán anticuerpos completamente humanos. Anticuerpos "completamente humanos" como se utiliza en la presente, son anticuerpos que comprenden dominios de región variable "humanos" y/o, CDR, como se define anteriormente, sin secuencias de anticuerpo sustanciales no humanas, o sin ninguna secuencia de anticuerpo no humana. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden dominios de región variable humano y/o CDR "sin secuencias de anticuerpo no humanas sustanciales" son anticuerpos, dominios y/o CDR en donde solamente hasta 5, 4, 3, 2 ó 1 aminoácidos son aminoácidos que no se codifican por las secuencias del anticuerpo humano. De esta forma, los anticuerpos "completamente humanos" se distinguen de los anticuerpos "humanizados", que se basan en dominios de región variable sustancialmente no humanas, por ejemplo, los dominios de la región variable de ratón, en donde ciertos aminoácidos han sido cambiados para corresponder mejor a los aminoácidos típicamente presentes en los anticuerpos humanos.
Los anticuerpos "completamente humanos" de la invención pueden ser dominios de la región variable humana y/o CDR sin ninguna otra secuencia de anticuerpos sustancial, tales como siendo anticuerpos de cadena individual. Alternativamente, los anticuerpos "completamente humanos" de la invención pueden ser dominios de la región variable humana y/o CDR integrales con u operativamente acoplados á una o más de las regiones constantes del anticuerpo humano. Ciertos anticuerpos completamente humanos preferidos son los anticuerpos IgG con el complemento de las regiones constantes IgG.
En otras modalidades, los anticuerpos "humanos" de la invención serán anticuerpos quiméricos en parte humanos. Los anticuerpos "quiméricos en parte humanos" como se utiliza en la presente son anticuerpos que comprenden dominios de región variable "humanos" y/o CDR operativamente acoplados a, o injertados en, un región constante de una especie no humana, tal como de rata o ratón. Tales anticuerpos quiméricos en parte humanos pueden utilizarse, por ejemplo, en estudios pre-clínicos , en donde la región constante preferiblemente será de la misma especie del animal utilizado en el ensayo pre-clínico. Estos anticuerpos quiméricos en parte humanos pueden también utilizarse, por ejemplo, en diagnósticos ex vivo, en donde la región constante de la especie no humana puede proporcionar opciones adicionales para la detección del anticuerpo.
El término "fragmento" como se utiliza en la presente se refiere a los fragmentos de relevancia biológica, por ejemplo, fragmentos que contribuyen a la unión del antígeno, por ejemplo, forman parte del sitio de unión a antígeno, y/o contribuyen a .la inhibición o reducción en función del antígeno CXCR4. Ciertos fragmentos preferidos comprenden una región variable de cadena pesada (dominio VH) y/o una región variable de cadena ligera (dominio VL) de los anticuerpos de la invención. Otros fragmentos preferidos comprenden una o más de las CDR de cadena pesada de los anticuerpos de la invención (o de los dominios VH de la invención) , o una o más de las CDR de cadena ligera de los anticuerpos de la invención (o de los dominios VL de la invención) . Ciertos fragmentos preferidos son al menos de 5 aminoácidos en longitud y comprenden por lo menos una región CDR, preferiblemente una región CDR3 , más preferiblemente una región CDR3 de cadena pesada.
En modalidades en donde los anticuerpos de la invención comprenden un fragmento de cualquiera de las secuencias definidas (por ejemplo, comprende un fragmento de SEC ID NO:35, 46, 57, 68 ó 101), por ejemplo, los anticuerpos comprenden los dominios VH y/o VL de la invención, o son anticuerpos o proteínas de unión que comprenden una o más CDR de la invención, en todas estas regiones/dominios generalmente se separan dentro del anticuerpo o la proteína de unión de tal forma que cada región/dominio puede llevar a cabo su función biológica y por lo tanto la contribución a la unión del antígeno se retiene. De esta forma, los dominios VH y VL preferiblemente se separan a través de secuencias de andamio apropiadas/secuencias enlazadoras y las CDR preferiblemente se separan a través de regiones de cadena principal apropiadas tales como las encontradas en anticuerpos de existencia natural y/o anticuerpos modificados efectivos. De esta forma, las secuencias VH, VL y CDR individuales de la invención preferiblemente son provistas dentro de o incorporadas en una cadena principal apropiada o andamio para permitir la unión del antígeno. Las secuencias o regiones de cadena principal pueden corresponder a regiones de cadena principal de existencia natural, FR1, FR2 , FR3 y/o FR4 , según sea apropiado para formar un andamio apropiado, o pueden corresponder a regiones de cadena principal de consenso, por ejemplo, identificadas a través de la comparación de varias regiones de cadena principal de existencia natural. Alternativamente, los andamios o cadenas principales no del anticuerpo, por ejemplo, cadenas principales del receptor de célula T pueden utilizarse.
Las secuencias apropiadas que pueden utilizarse para las regiones de cadena principal son bien conocidas y están documentadas en la técnica y cualquiera de estas puede utilizarse. Las secuencias preferidas para regiones de cadena principal son una o más (es decir, una, dos, tres, o cuatro) de .las regiones de cadena principal que forman los dominios VH y/o VL de la invención, es decir, uno o más de las regiones de cadena principal descritas en las Tablas 1, 2, 3, 4 ó 5, o regiones de cadena principal sustancialmente homologas a la misma, y en particular regiones de cadena principal que permiten el mantenimiento de la especificidad del antígeno, por ejemplo, regiones de cadena principal que resultan en sustancialmente la misma o la misma estructura 3D del anticuerpo .
En ciertas modalidades preferidas, las cuatro de las cadenas ligeras variables (SEC ID NOs : 30, 31, 32 y 33) y/o la cadena pesada variable (SEC ID NOs: 25, 26, 27 y 28), según apropiado, las regiones FR de SEC ID NO: 35 (también mostrada en la Tabla 1) , o las regiones FR sustancialmente homologas a la misma, se encuentran en los anticuerpos de la invención .
En ciertas modalidades preferidas, las cuatro de la cadena ligera variable (SEC ID NOs : 41, 42, 43 y 44) y/o la cadena pesada variable (SEC ID NOs : 36, 37, 38 y 39), según sea apropiado, las regiones FR de SEC ID NO: 46 (también mostrada en la Tabla 2) , o las regiones FR sustancialmente homologas a la misma, se encuentran en los anticuerpos de la invención.
En ciertas modalidades preferidas, las cuatro de la cadena ligera variable (SEC ID NOs : 52, 53, 54 y 55) y/o la cadena pesada variable (SEC ID NOs: 47, 48, 49 y 50), según sea apropiado, las regiones FR de SEC ID NO: 57 (también mostrada en la Tabla 3), o las regiones FR sustancialmente homologas a la misma, se encuentran en los anticuerpos de la invención.
En ciertas modalidades preferidas, las cuatro de la cadena ligera variable (SEC ID NOs : 63, 64, 65 y 66) y/o la cadena pesada variable (SEC ID NOs: 58, 59, 60 y 61), según sea apropiado, las regiones FR de SEC ID NO: 68 (también mostrada en la Tabla 4) , o las regiones FR sustancialmente homologas a la misma, se encuentran en los anticuerpos de la invención.
¦ En ciertas modalidades preferidas, las cuatro de la cadena ligera variable (SEC ID NOs: 96, 97, 98 y 33) y/o la cadena pesada variable (SEC ID NOs : 25, 26, 27 y 28), según sea apropiado, las regiones FR de SEC ID NO: 101 (también mostrada en la Tabla 5) , o las regiones FR sustancialmente homologas a la misma, se encuentran en los anticuerpos de la invención.
Además, aunque los anticuerpos preferidos de la invención se forman de VH, VL o CDR de la invención, se debe observar que los anticuerpos de la invención también abarcan uno o más de VH, VL o CDR de la invención en combinación con otros VH, VL o CDR no de la invención, siempre que las propiedades de unión de CXCR4 o las propiedades anti-CXCR4 de los anticuerpos de la invención como se describen en la presente estén aún presentes.
El término "región determinante de complementariedad de cadena pesada" ("CDR de cadena pesada") como se utiliza en la presente se refieren a regiones de hipervariabilidad dentro de la región variable de cadena pesada (dominio VH) de un molécula de anticuerpo. La región variable de cadena pesada tiene tres CDR denominadas CDRl de cadena pesada, CDR2 de cadena pesada, y CDR3 de cadena pesada del término amino al término carboxi . La región variable de cadena pesada también tiene cuatro regiones de cadena principal (FR1, FR2 , FR3 y FR4 del término amino al término carboxi) . Estas regiones de cadena principal separan las CDR.
El término "región variable de cadena pesada" (dominio VH) como se utiliza en la presente se refiere a la de la región variable de una cadena pesada de una molécula del anticuerpo.
El término "región determinante de complementariedad de cadena ligera" ("CDR de cadena ligera") como se utiliza en la presente se refiere a regiones de hipervariabilidad dentro la región variable de cadena ligera (dominio VL) de una molécula de anticuerpo. Las regiones variables de cadena ligera tienen tres CDR denominadas CDR1 de cadena ligera, CDR2 de cadena ligera, y CDR3 de cadena ligera del término amino al término carboxi . Las región variable de cadena ligera tiene cuatro regiones de cadena principal (FR1, FR2 , FR3 y FR4 del término amino al término carboxi) . Estas regiones de cadena principal separan las CDR.
El término "región variable de cadena ligera" (dominio VL) como se utiliza en la presente se refiere a la acción variable de una cadena ligera de una molécula de anticuerpo.
Se debe observar que la nomenclatura de Kabat es seguida en la presente, en donde cuando es necesario, con el fin de definir la colocación de las CDR (Kabat y otros, 1991, incorporada específicamente en la presente por referencia) .
Un experto en la técnica apreciará las proteínas y los polipéptidos de la invención, tales como las CDR ligera y pesada, las regiones variables de cadena ligera y pesada, los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpo, y los inmunoconjugados , pueden prepararse en cualquiera de varis formas bien conocidas y descritas en la técnica, pero más preferiblemente se preparan utilizando métodos recombinantes .
Los fragmentos de ácido nucleico que codifican las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de los anticuerpos de la invención pueden derivarse o producirse a través de cualquier método apropiado, por ejemplo, por clonación o por síntesis. Tales secuencias podrían, por ejemplo, prepararse a través de la clonación de secuencias apropiadas de, por ejemplo, los genes de la línea germinal humana y haciéndoles cualquier modificación necesaria a las secuencias de la línea germinal para obtener las secuencias de la invención utilizando los métodos bien conocidos y descritos en la. técnica. Un método alternativo y más eficiente sería sintetizar la secuencia de región variable de cadena ligera o cadena pesada apropiada como cebadores de traslape, y utilizando la extensión del cebador para obtener la secuencia completa. Esta secuencia completa después podría amplificarse a través de PCR con cebadores que contienen sitios de restricción apropiados para además la clonación y la manipulación, por ejemplo para clonar en un vector de expresión apropiado. De 5 a 7 cebadores de traslape por región variable normalmente es suficiente, por lo tanto hacienda está técnica muy eficiente y precisa.
Una vez que los fragmentos de ácido nucleico que codifican las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de los anticuerpos de la invención han sido obtenidos, estos fragmentos pueden además manipularse a través de técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo, para convertir los' fragmentos de la región variable en moléculas de anticuerpo de longitud completa con dominios de región constante apropiados, o formatos particulares de los fragmentos de anticuerpos publicados en cualquier lugar en la presente, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos scFv, etc. Típicamente, o como parte de este procedimiento de manipulación adicional, los fragmentos de ácido nucleico que codifican las moléculas del anticuerpo de la invención generalmente se .incorporan en un vector de expresión apropiado con el fin de facilitar la producción de los anticuerpos de la invención.
Los posibles vectores de expresión incluyen pero no se limitan a cósmidos, plásmidos, o virus modificados (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus, y virus asociado con adeno) , mientras el vector sea compatible con la célula hospedera utilizada. La vectores de expresión son "adecuados para la transformación de una célula hospedera", que significa que los vectores de expresión contienen una molécula de ácido nucleico de la invención y secuencias reguladoras seleccionadas sobre la base de las células hospederas a ser utilizadas para la expresión, están operativamente enlazadas a la molécula de ácido nucleico. Operativamente enlazado pretende significar que el ácido nucleico está enlazado a secuencias reguladoras en una forma que permite la expresión del ácido nucleico.
Por consiguiente la invención contempla un vector de expresión recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención, o uno de sus fragmentos, y las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y traducción de la secuencia de la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención.
Las secuencias reguladoras adecuadas pueden derivarse de una variedad de fuentes, incluyendo bacterias, hongos, virales, mamíferos o genes de insecto (por ejemplo, ver las secuencias reguladoras descritas en Goeddel, 1990) . La selección de las secuencias reguladoras apropiadas depende de la célula hospedera selecciona como se explicó anteriormente, y puede fácilmente lograrse a través de un experto en la técnica. Los ejemplos de tales secuencias reguladoras incluyen: un promotor de transcripción y un potenciador o secuencia de inhibición de polimerasa de ARN; una secuencia de unión a rizoma, incluyendo una señal de iniciación de ^3? ss???. Adicionalmente , dependiendo de la célula hospedera seleccionada y el vector utilizado, otras secuencias, tales como un origen de replicación, sitios de restricción de ADN adicionales, potenciadores y secuencias que confieren un grado de inducción de transcripción pueden incorporarse en el vector de expresión.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención también pueden contener un gen marcador seleccionable que facilita¦ la selección de las células hospederas transformadas o transfectadas con una molécula recombinante de la invención. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables son genes que codifican una proteína tal como neomicina e higromicina que confieren resistencia a ciertos fármacos,- ß-galactosidasa , cloranfenicol acetiltransferasa , luciferasa o una inmunoglobulina o una de sus porciones tal como la porción Fe de una inmunoglobulina preferiblemente IgG. La transcripción del gen marcador seleccionable se monitorea mediantes los cambios en la concentración de la proteína marcadora seleccionable tal como ß-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, o luciferasa de luciérnaga. Si el gen marcador seleccionable codifica una proteína que confiera resistencia a antibiótico tal como resistencia a neomicina las células transformadas puede seleccionarse con G418. Las células que se han incorporado al gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras las otras células mueren. Esto hace posible visualizar y ensayar la expresión de los vectores de expresión recombinantes de la invención y en particular determinar el efecto de una mutación en la expresión y el fenotipo. Se apreciará que los marcadores seleccionables pueden introducirse en un vector separado desde el ácido nucleico de interés.
Los vectores de expresión recombinantes también pueden contener genes que codifican una fracción de fusión que proporciona la expresión aumentada de la proteína recombinante ; la solubilidad aumentada de la proteína recombinante ; y ayuda en la purificación de la proteína recombinante objetivo mediante la acción como un ligando en la purificación por afinidad (por ejemplo, las "etiquetas" apropiadas para permitir la purificación y/o identificación pueden estar presentes, por ejemplo, etiquetas His o etiquetas myc) . Por ejemplo, se puede agregar un sitio de separación proteolítica a la proteína recombinante objetivo para permitir la separación de la proteína recombinante de la fracción de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), p al (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutationa S-transferasa (GST) , proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante.
Los vectores de expresión recombinantes pueden introducirse en las células hospederas para producir una célula hospedera transformada. Los términos "transformado con" , "transíectado con" , "transformación" y "transíección" pretenden abarcar la introducción de ácido nucleico (por ejemplo, un vector) en una célula a través de una de muchas posibles técnicas conocidas en la técnica. El término "célula hospedera transformada" como se utiliza en la presente pretende también incluir células capaces de glicosilación que han sido transformadas con un vector de expresión recombinante de la invención. Las células procarióticas pueden transformarse con ácido nucleico a través de, por ejemplo, electroporacion o transformación mediada por cloruro y calcio. Por ejemplo, el ácido nucleico puede introducirse en las células de mamífero a través de técnicas convencionales tales como fosfato cálcico o co-precipitación de cloruro cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrina, lipofección, electroporacion o microinyección. Los métodos adecuados para transformar y transfectar células hospederas pueden encontrarse en Sambrook y otros, 1989, y otros libros de texto de laboratorio.
Las células hospederas adecuadas incluyen una amplia variedad de células hospederas eucariotas y células procariotas. Por ejemplo, las proteínas de la invención pueden expresarse en células de levadura o células de mamífero. Otras células hospederas adecuadas pueden encontrarse en Goeddel, 1990. Además, las proteínas de la invención pueden expresarse en células procariotas, tales como Escherichia coli (Zhang y otros, 2004) .
Las células hospederas de levadura y hongos adecuados para llevar a cabo la presente invención incluyen, pero no se limita a, Saccharomyces cerevisiae, el género Pichia o Kluyveromyces y varias especies del género Aspergillus. Los ejemplos de vectores para expresión de levadura S. cerevisiae inclueyen pYepSecl (Baldari. y otros, 1987), pMFa (Kurjan y Herskowitz, 1982), pJRY88 (Schultz y otros, 1987), y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Los protocolos para la transformación de la levadura y los hongos son bien conocidos por el experto en la técnica (ver Hinnen y otros, 1978; Ito y otros, 1983, y Cullen y otros 1987) .
Las células de mamífero adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen, entre otras: células COS (por ejemplo, ATCC No. CRL 1650 ó 1651) , BHK (por ejemplo, ATCC No. CRL 6281), CHO (ATCC No. CCL 61), HeLa (por ejemplo, ATCC No. CCL 2), 293 (ATCC No. 1573), NS-1, NSO (ATCC CRL-11177), y Per.C6® (Crucell, Leiden, países bajos). Los vectores de expresión adecuados para dirigir la expresión en células de mamífero generalmente incluyen un promotor (por ejemplo, derivados del material viral tal como polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40), así como otras secuencias de control de transmisión y traducción. Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen pCDM8 (Seed, B., 1987) y pMT2PC (Kaufman y otros, 1987).
Dadas las enseñanzas provistas en la presente, los promotores, terminadores y métodos para introducir vectores de expresión de un tipo apropiado de una planta, células aviares y de insectos también pueden fácilmente lograrse. Por ejemplo, dentro de una modalidad, las proteínas de la invención pueden expresarse de las células de planta (ver Sinkar y otros, 1987, cuya revisión utiliza vectores rizógenos de Agrobacterium; ver también Zambryski y otros, 1984, que describe el uso de vectores de expresión para células de plantas, incluyendo, entre otras, PAPS2022, PAPS2023, y PAPS2034).
Las células de insecto adecuadas para llevar a cabo la presente invención incluyen células y líneas de células de las especies Bombyx, Trichoplusia o Spodotera. Los vectores de Baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (células SF 9) incluyen las series pAc (Smith y otros, 1983) y las series pVL (Luckow y Summers 1989) . Algunos sistemas de expresión de células de baculovirus- insecto adecuadas para expresión de proteínas recombinantes de la invención se describen en PCT/US/02442.
Alternativamente, las proteínas de la invención también pueden expresarse en animales transgénicos no humanos tales como ratas, conejos, ovejas y puercos (Hammer y otros 1985; Palmiter y otros 1983; Brinster y otros 1985; Palmiter and Brinster 1985, y Patente de E. U. A. No. 4,736,866).
Las proteínas de la invención también pueden prepararse a través de síntesis química utilizando técnicas bien conocidas en la química de las proteínas tales como la síntesis de fase sólida (Merrifield (1964); Frische y otros, 1996) o la síntesis en solución homogénea (Houbenweyl, 1987) .
Las proteínas de fusión N-terminal o C-terminal que comprenden los anticuerpos y proteínas de la invención conjugadas con otras moléculas tales como proteínas, pueden prepararse mediante la fusión a través de técnicas recombinantes . Las proteínas de fusión resultantes contienen un anticuerpo o proteína de la invención fusionado a la proteína seleccionada o la proteína marcadora, o la proteína de etiqueta como se describe en la presente. Los anticuerpos o proteínas de la invención también pueden conjugarse con otras proteínas a través de técnicas conocidas. Por ejemplo, las proteínas pueden acoplarse utilizando enlazadores que contienen tiol heterobifuncional como se describe en WO 90/10457, N-succinimidil-3- (2-piridilditio-proprionat) o N-succinimidil-5 tioacetato. Los ejemplos de proteínas que pueden utilizarse para preparar proteínas de fusión o conjugados incluyen proteínas de unión a célula tales como inmunoglobulina s, hormas, factores, de crecimiento, lectinas, insulina, lipoproteína de baja densidad, glucagón, endorfinas, transíerrinas , bombesina, asialoglicoproteína glutationa-S-transíerasa (GST) , hemaglutinina (HA) , y myc truncada .
Independientemente de la forma de preparación de un primer segmento de ácido nucleico del anticuerpo anti-CXCR4, los segmentos de ácido nucleico de anticuerpo adecuados adicionales pueden fácilmente prepararse a través de técnicas de biología molecular estándar. Con el fin de confirmar que cualquier segmento de ácido nucleico del anticuerpo anti-CXCR4 variante, mutante o de la segunda generación es adecuado para utilizarse en la presente invención, el segmento de ácido nucleico se ve ensayado para confirmar la expresión de un anticuerpo anti-CXCR4 de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, el segmento de ácido nucleico variante, mutante o de la segunda generación también se ensayará para confirmar la hibridación bajo condiciones de hibridación estándar, más preferiblemente estrictas estándar. Las condiciones de hibridación adecuadas ilustrativas incluyen la hibridación de aproximadamente .7% de dodecilsulfato de sodio (SDS) , aproximadamente 0.5 M de NaP04, aproximadamente 1 mM de EDTA a aproximadamente 50°C; y lavado con aproximadamente 1% SDS a aproximadamente 42 °C.
Como una variedad de anticuerpos puede fácilmente prepararse, lós métodos de tratamiento de la invención pueden ejecutarse proporcionando al animal o al paciente por lo menos un primer segmento de ácido nucleico o molécula que expresa una cantidad biológicamente efectiva de al menos un primer anticuerpo anti-CXCR4, de la invención en el paciente.
El "segmento o molécula de ácido nucleico que expresa un anticuerpo anti-CXCR4" generalmente estará en la forma de por lo menos un constructor o vector de expresión, y puede estar en la forma de un constructor o vector de expresión comprendido dentro de un virus o con una célula hospedera recombinante . Los vectores de terapia génica preferidos de la presente invención generalmente serán vectores virales, tales como los comprendidos dentro de un retrovirus recombinante, el virus de herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés) , adenovirus, el virus asociado con adeno (AAV, por sus siglas en inglés) , citomegalovirus (CMV) , y similar'.
Un aspecto más proporciona un constructo de expresión o vector de expresión que comprende uno o más de los segmentos del ácido nucleico o moléculas de la invención. Preferiblemente, los constructos o vectores de expresión son recombinantes . Preferiblemente, los constructos o vectores además comprenden las secuencias reguladoras necesarias para la trascripción y traducción de la secuencia proteica codificada por la molécula de ácido nucleico de la invención.
Aún otro aspecto proporciona una célula hospedera o virus que comprende uno o más constructos de expresión o vectores de expresión de la invención. También se proporcionan células hospederas o virus que comprenden una o más de las moléculas de ácido nucleico de la invención. Una célula hospedera o virus que expresa una anticuerpo de la invención forma un aspecto más.
Un aspecto más de la invención proporciona un método para producir un anticuerpo de la presente invención que comprende un paso de cultivar las células hospederas de la invención. Los métodos preferidos comprenden los pasos (i) cultivar una célula hospedera que comprende uno o más de los vectores de expresión recombinantes o una o más de las secuencias de ácido nucleico de la invención bajo condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o proteína codificada; y opcionalmente (ii) aislar u obtener el anticuerpo o proteína de la células hospedera o sobre el medio de cultivo/sobrenadante . Tales métodos de producción también pueden comprender un paso de purificación del anticuerpo o producto proteico y/o la formulación del anticuerpo o producto de una composición que incluye por lo menos un componente adicional, tal como un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En modalidades cuando el anticuerpo o la proteína de la invención se forman de más de una cadena de polipéptido (por ejemplo, ciertos fragmentos tales como los fragmentos Fab) , entonces todos los polipéptidos preferiblemente se expresan en la célula hospedera, ya sea del mismo o un diferente vector de expresión, de tal forma que las proteínas completas, por ejemplo, las proteínas de unión de la invención, pueden ensamblarse en la célula hospedera y pueden aislarse o purificarse ahí mismo.
Los anticuerpos de la invención también pueden utilizarse para producir anticuerpos adicionales que se unen a CXCR . Tales usos involucran por ejemplo la adición, eliminación, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácido de un anticuerpo progenitor para formar un nuevo anticuerpo, en donde el anticuerpo progenitor es uno de los anticuerpos de la invención como se define en cualquier lugar en la presente, y se ensaya el nuevo anticuerpo resultante para identificar anticuerpos que se unen a CXCR4 y tienen una o más de las propiedades funcionales preferidas descritas en la presente. Tales métodos pueden utilizarse para formar nuevos anticuerpos que todos pueden ensayarse por su habilidad para unirse a CXCR4 y otras propiedades funcionales. Preferiblemente, la adición, eliminación, sustitución o inserción de uno o más aminoácidos toma lugar en uno o más de los dominios CDR.
Tal modificación o la mutación a un anticuerpo progenitor puede llevarse a cabo en cualquier forma apropiada utilizando técnicas bien conocidas y documentadas ' en la técnica, por ejemplo, llevando a cabo métodos de mutagénesis aleatoria o dirigida. Si la mutagénesis dirigida se va a utilizar entonces una estrategia para identificar los residuos apropiados para la mutagénesis utiliza la resolución de la estructura de cristal del complejo de proteína-antígeno de unión, por ejemplo, el complejo Ab-Ag, para identificar los residuos clave involucrados en la unión del antígeno (Davies and Cohén, 1996) . Posteriormente, esos residuos pueden mutarse para mejorar la interacción. Alternativamente, uno o más residuos de aminoácido puede simplemente activarse para mutagénesis directa y el efecto de la unión a CXCR4 se evalúa.
La mutagénesis aleatoria puede llevarse a cabo en cualquier forma apropiada, por ejemplo, a través de PCR propensa al error, intercambia de cadena o cepas E. coli de mutador.
De esta forma, uno o más de los dominios VH de la invención puede combinarse con un solo dominio VL o un repertorio de dóminos VL a partir de cualquier fuente apropiada y los nuevos anticuerpos resultantes ensayarse para identificar anticuerpos específicos para CXCR4. Esto es preferido. Inversamente, uno o más de los dominios VL de la invención puede combinarse con un solo dominio VH o repertorio de dominios VH a partir de cualquier fuente apropiada y nuevos anticuerpos resultantes ensayarse para identificar anticuerpos que se a CXCR4.
Similarmente , una o más o preferiblemente las tres CDR de los dominios VH y/o VL de la invención pueden injertarse en un solo dominio VH y/o VL o un repertorio de dominio VH y/o VL, según sea apropiado, y los nuevos anticuerpos resultantes ensayarse para identificar anticuerpos que se unen a CXCR4.
Las mutaciones activadas de la CDR, especialmente CDR3 de las cadenas ligera y/o pesada, han demostrado que son una técnica efectiva para aumentar la afinidad del anticuerpo y son preferidas. Preferiblemente, los bloques de tres a cuatro . aminoácidos de la CDR3 o las regiones específicas denominadas "puntos calientes" se activan para la mutagénesis .
"Los puntos de acceso" son las secuencias en donde toma lugar la hipermutación somática in vivo (y más adelante Neuberger y Milstein, 1995) . Las secuencias de punto de acceso pueden definirse como secuencias de nucleótido de consenso en ciertos codones. La secuencia de consenso es el tetranucleótido, RGYW, en donde R puede ser ya sea A o G, Y puede ser C o T y W puede ya sea A o T (Neuberger and Milstein, 1995) . Además, los residuos de serina codificados por los nucleótidos AGY están predominantemente presentes en las regiones CDR del dominio variable sobre aquellas codificadas por TCN correspondientes a las secuencias de puntos de acceso potenciales (Wagner y otros, 1995) .
De esta forma, la secuencia de nucleótidos de las CDR de las cadenas pesada y ligera de cada anticuerpo de la invención puede escanearse para la presencia de secuencias de puntos de acceso y codones AGY. Los puntos de acceso identificados de las regiones CDR de la cadena ligera y pesada después pueden opcionalmente compararse por las secuencias germinales de las cadenas pesada y ligera utilizando la base de datos International ImMunoGen Tics (IMGT, http://imgt.cines.fr/textes/vquest/) (Davies y otros, 1990). Una secuencia, idéntica a la línea germinal, sugiere que la mutación somática no ha ocurrido; por consiguiente las mutaciones aleatorias pueden introducirse imitando los eventos somáticos que ocurren in vivo o alternativamente, la mutagénesis dirigida al sitio puede llevarse a cabo, por ejemplo, en los puntos de acceso y/o codones AGY. En contraste, una secuencia diferente muestra que algunas mutaciones somáticas ya han ocurrido. Sin embargo quedará determinar si la mutación somática in vivo fue óptima.
Los puntos de acceso preferidos para la mutación son aquellos que codifican aminoácidos expuestos y preferiblemente aquellos que codifican aminoácidos que forman parte de los sitios de unión a antígeno. Otros puntos de acceso preferidos para la mutación son aquellos que codifican aminoácidos no conservados. Los puntos de acceso que codifican aminoácidos sepultados o conservados dentro de la CDR preferiblemente no están mutagenizados . Estos residuos son usualmente críticos para la estructura general y probablemente no interactúan con el antígeno ya que están sepultados.
Los métodos para llevar a cabo la manipulación antes descrita de aminoácidos y dominios de proteína son bien conocidos por el experto en la técnica. Por ejemplo, las manipulaciones podrían convenientemente llevarse a cabo a través de ingeniería genética al nivel del ácido nucleico en donde las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de unión apropiadas y sus dominios se modifican de tal forma que la secuencia de aminoácido de la proteína expresada resultante a su vez se modifica en la forma apropiada.
El ensayo de la habilidad de uno o más anticuerpos para específicamente unirse a CXCR4 pueden llevarse a cabo a través de cualquier método apropiado que es bien conocido y se describe en la técnica. Las líneas de célula CXCR4+ pueden obtenerse de colecciones de cultivo, o pueden prepararse a través de la transformación de células negativas CXCR4 con un constructor que permite la expresión de CXCR4 recombinante . Tales células pueden fácilmente utilizarse para ensayar la unión, por ejemplo, a través de métodos convencionales tales ELISA, BIACore, FACS, etc.
Los nuevos anticuerpos a través de estos métodos preferiblemente tendrán propiedades funcionales mejoradas, por ejemplo una mayor o mejora afinidad (o por lo menos una afinidad equivalente) para CXCR4 como los anticuerpos progenitores, y también tratarse y utilizarse en la misma forma que los anticuerpos de la invención como se describen en cualquier lugar en la presente (por ejemplo, para terapia, diagnóstico, en composiciones, etc.) . Alternativa o adicionalmente, los nuevos anticuerpos tendrán una o más de las propiedades funcionales mejoradas como se describe en cualquier lugar en la presente.
Los nuevos anticuerpos producidos, obtenidos o que se pueden obtener a través de estos métodos forman otro aspecto de la invención.
La invención además proporciona composiciones que comprenden por lo menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de la invención, opcionalmente incluyendo un diluyente. Tales composiciones pueden ser composiciones farmacéuticamente aceptables o composiciones para utilizarse en estudios de laboratorio. En términos de composiciones farmacéuticas, pueden preferiblemente formularse para administración parenteral, intravenosa o aún subcutánea.
La presente invención proporciona un número de métodos y usos de los anticuerpos humanos y los fragmentos de anticuerpo de la invención. Con referencia a todos los métodos, los términos "un" y "uno" se utilizan para significar "por lo menos uno", "por lo menos un primero", "uno o más", o "una pluralidad" de pasos en los métodos descritos, excepto cuando se especifique lo contrario. Esto es particularmente relevante para los pasos de administración en los métodos de tratamiento. De esta forma, no solamente pueden utilizarse diferentes dosis con la presente invención, sino diferentes números de dosis, por ejemplo, pueden utilizarse inyecciones, de hasta e incluyendo múltiples inyecciones. Los terapéuticos combinados pueden utilizarse, administrarse antes, después o durante la administración del anticuerpo terapéutico anti-CXCR4.
Varios métodos in vitro útiles y usos de los anticuerpos o inmunoconjugados de la invención son provistos que tienen implicaciones biológicas importantes. Primero se proporcionan métodos de, y usos, en la unión de CXCR4, que generalmente comprenden poner efectivamente en contacto una composición que comprende CXCR4 con por lo menos un primer anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, o uno de sus fragmentos de unión antígeno. Los anticuerpos de la invención, o. sus inmunoconjugados, de esta forma pueden utilizarse en ensayos de unión. Los ensayos de unión adecuadamente útiles incluyen aquellos comúnmente utilizados en la técnica, tales como inmunoblots, Western blots, dot blots, RIA, ELISA, inmunohistoquímica , clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) , inmunoprecipitación, cromatografía por afinidad, y similar .
Los métodos de, y los usos en, la detección CXCR4 son provisto, que generalmente comprenden poner en contacto una composición que se sospecha que contiene CXCR4 con por lo menos un primer anticuerpo o inmunoconjugado de la invención, o uno de sus fragmentos de unión a antígeno, bajo condiciones efectivas para permitir la formación de los complejos CXCR4/anticuerpo y detectar los complejos así formados. Los métodos de detección y los usos pueden utilizarse en conexión con muestras biológicas, por ejemplo en el diagnóstico de tumores, y kits de diagnóstico con base en los mismos también son provistos. También se cree que la detección de CXCR4 pueda ser un pronóstico para algunas enfermedades y de esta la mención del diagnóstico en la presente también incluye pronóstico, cuando es relevante. En particular, CXCR4 ha sido indicado para tener un valor de pronóstico para la recurrencia de la metástasis y la supervivencia, glioma y algunos cánceres en la infancia.
Los anticuerpos o las proteínas de unión de la invención pueden utilizarse para detectar CXCR4 in vivo o in vitro, en particular para detectar células CXCR4+. Por ejemplo, como CXCR4 se sobre-expresa en ciertas células tumorales, los anticuerpos o las proteínas de unión de la invención pueden utilizarse para determinar células tumorales in vivo o in vitro. Además, la habilidad de los anticuerpos para localizar las células CXCR4+ significa que los anticuerpos de la invención pueden activar sitios corporales en donde las células CXCR4+ están presentes, con lo cual el anticuerpo puede actuar en el sitio objetivo. En particular, la habilidad de los anticuerpos para localizar células tumorales CXCR4+ significa que los anticuerpos de la invención pueden activar sitios corporales en donde las células tumorales CXCR4+ están presentes, por lo que el anticuerpo debe actuar en el sitio objetivo.
Los métodos y usos de la presente invención están particularmente previstos para utilizarse en animales y pacientes que tienen, o está en riesgo de desarrollar, cualquier enfermedad o afección asociada con la expresión de CXCR4 o actividad o en donde CXCR4 juega un papel biológico. Tales enfermedades y trastornos incluyen, enfermedades que están mediadas por células positivas CXCR4 típicamente células T CXCR4+ T inmunoreguladoras , las cuales, después de la unión de un ligando a CXCR4 , pueden formar tomar parte en la trayectoria de señalización que causará o contribuirá a un trastorno o enfermedad. Estas también incluyen enfermedades causadas por proliferación aberrante de células que expresan CXCR4. Tales células de proliferación aberrante pueden naturalmente ser CXCR4+, o pueden haber sido mutadas/transformadas para expresar CXCR4. Como se mencionó anteriormente, la expresión de CXCR4 puede ayudar a las células cancerígenas a metastatizarse a lo largo de un gradiente SDF-1. También se incluyen las enfermedades caracterizadas por la sobre-expresión de CXCR4 en células que son inherentemente CXCR4+. Además, las cepas tópicas CXCR4 de VIH utilizan CXCR4 para entrar en las células hospederas, de esta forma bloqueando que el receptor pueda habilitar la diseminación de esta enfermedad.
De esta forma, se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno mediado por CXCR4 y/o caracterizado por la proliferación aberrante de células positivas CXCR4 , y/o caracterizado por la sobre-expresión de CXCR4 en células que son inherentemente CXCR4+.
Visto alternativamente, se proporciona el tratamiento de una afección que puede beneficiarse de uno o más de los siguientes: (i) Inhibición de la unión de CXCR4 a su ligando. (ii) Inhibición de las respuestas celulares mediadas por CXCR4 a un ligando CXCR4 , particularmente la inhibición de la quimiotaxis o la migración, por ejemplo, en conexión con la metástasis de cáncer/invasión de órgano o respuesta inflamatoria, o una concentración de ión de calcio intracelular aumentada (activación celular) . (iii) ) Eliminación selectiva de células CXCR4+. (iv) Activación e inducción de la migración de las células madre hematopoyéticas CXCR4+, como aquellas células se mantienen inactivas en la médula espinal a través de la interacción con su receptor CXCR4 con SDF-1 producido en la estroma de la médula espinal . (v) Bloquear la infección de células CXCR4+ a través de las cepas X4 de VIH, que utilizan CXCR4 como el co-receptor durante la infección.
Preferiblemente, el ligando CXCR4 es SDF-1. Es bien conocido por el experto en la técnica que, CXCR4 está involucrado en un amplio intervalo de enfermedades y trastornos, una terapia anti-CXCR4 dada, una vez mostró ser efectiva en cualquier sistema de modelo aceptable, que puede utilizarse para tratar el intervalo completo de enfermedades y trastornos conectados por la expresión de CXCR4.
En una modalidad, la afección mediada por CXCR4 es cáncer, y, en particularmente, la diseminación, formación de metástasis, invención de órgano y/o el crecimiento de tumor mediado o soportado por CXCR4 y la interacción con sus 1 igandos .
CXCR4 se expresó en una variedad de tumores, y ahora existe documentación significativa para la noción de que esta expresión juega un papel decisivo en la patofisíología del cáncer particularmente en la metástasis del cáncer. Varias líneas de la evidencia han conducido a la ahora grandemente aceptable idea de que la expresión de CXCR4 permite que las célula malignas utilicen gradientes con base en SDF-1 para la migración metastática. CXCR4 es por mucho el receptor de quimiocina más comúnmente expresado en células cancerígenas. La expresión se ha encontrado en casi todos los tumores estudiados. También es de interés que SDF-1 (CXCL12) se expresa a particularmente altos niveles en el hígado, pulmón, médula espinal, nodos linfoides y (en de alguna forma niveles inferiores) en el cerebro, es decir, sitios en los cuales los cánceres típicamente se metastatizan, o que están invadidos por tumores hematológicos . Existe una evidencia copiosa de que el bloqueo de la señalización de CXCR4 causado por SDF-1 es capaz de reducir o prevenir la formación de metástasis en modelos de ratón. Esta inhibición de señalización puede lograrse a través de los anticuerpos (Muller y otros, 2001 y muchos otros) , ARNsi para CXCR4 (Liang y otros, 2007) , y péptidos (Kim y otros, 2008) .
El bloqueo de CXCR4 también se describe como teniendo un efecto sobre la angiogénesis , por ejemplo, un efecto inhibidor (efecto anti -angiogénico) . De esta forma, en una modalidad más los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para efectuar la angiogénesis (por ejemplo, tener un efecto anti -angiogénico) . En aún otra modalidad, el anticuerpo antagónico de la invención puede utilizarse junto con cualquier agente anti -angiogénico descrito en la técnica. En particular, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en combinación con bevacizumab (Avastina) para el tratamiento de cáncer, o como segunda línea de tratamiento para pacientes en donde el tumor ha adquirido resistencia a Avastina .
Un estudio de Xu y otros, 2009 demostró que CXCR4 en células tumorales se regula de forma ascendente a través del tratamiento con Avastina. Esto hará a las células de tumor más susceptibles al tratamiento con anticuerpos que activan CXCR4. Esto es de especial interés para pacientes que han hecho resistentes al tratamiento con Avastina. Alternativamente, los dos fármacos pueden darse juntos.
Además, muchos de los compuestos que bloquean la señalización de CXCR4 que se describen como teniendo un efecto anti-metastático también se sabe que inhiben el crecimiento tumoral . Aunque el efecto exacto para limitar el crecimiento del tumor a través del bloqueo del receptor CXCR4 no está completamente entendido, existe una evidencia en aumento de que la interacción entre las células neoplásicas y el estroma es circundante es de importancia central. Un estudio ha demostrado que, aunque la transfección de las células pancreáticas y de cáncer de colon con ARNsi contra CXCR4 conducen a un poco efecto sobre el crecimiento celular in vi ro, el crecimiento in vivo de los tumores derivados de estas células se suprimió significativamente (Guleng y otros, 2005 ) . Además, se ha demostrado que los fibroblastos asociados con el carcinoma, con los aspectos del miofibroblasto, estimulado -en el crecimiento de células de carcinoma de pecho mixtas marcadamente más que los fibroblastos mamarios normales del mismo paciente, y promovieron la angiogénesis mediante el reclutamiento de células progenitoras endoteliales (Orimo y otros, 2005) . Estos efectos se mediaron a través de SDF-1 secretado por el fibroblasto/miofibroblasto de tumor. El anticuerpo contra SDF-1 o ARNsi contra CXCR4 inhibieron el crecimiento del tumor. De esta forma, tomados juntos estos estudios demostraron que el micro-entorno del tumor es de importancia para el comportamiento del cáncer, y se obtuvo una marcada inhibición del crecimiento tumoral activando la interacción SDF-1/CXCR4 in vivo. De esta forma, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para inhibir la atracción de células CXCR4+ en la estroma del tumor, y/o inhibir la activación de tales células para crear un micro-entorno favorable para el tumor.
En otra modalidad, la afección mediada por CXCR4 que es tratada es la presencia de células transformadas que expresan CXCR4.
Como ya se describió, CXCR4 fuertemente se expresa en muchos tumores. Esto puede utilizarse para aniquilar aquellas células por medio de la inducción de apoptosis, ADCC o CDC. Por supuesto, como CXCR4 también se expresa en una amplia variedad de células sanas, los aspectos de seguridad y los efectos secundarios son una razón de preocupación. El número limitado de estudios de la fase I disponibles en antagonistas de molécula pequeña para CXCR4 demostraron algunos efectos secundarios, en su mayor parte de menor preocupación. Sin embargo, no existen datos disponibles en uso a largo plazo de los fármacos que se activan CXC 4. Además, podría haber alguna variación dependiendo del fármaco utilizado; los anticuerpos de tipo MDX-1338, que inducen apoptosis podrían tener un muy diferentes perfil de seguridad de los anticuerpos que no lo tienen. Además, se demostró recientemente que el fármaco derivado del péptido CTCE-9908 causó la muerte de células cancerígenas de ovario a través de la inducción de la multinucleación, la detención de G2-M' y la mitosis anormal (catástrofe mitótica (Kwong y otros, 2009) . Se puede especular que este modelo de acción, por ejemplo, catástrofe mitótica, es mucho más eficiente en células de tumor CXCR4+ que son propensas a la división celular, comparado con células neurales CXCR4+ completamente diferenciadas, que raramente si es que sucede experimentan la mitosis. De esta forma, en algunas modalidades, la aniquilación de las células de células CXCR4+ es un modo adicional de acción para los anticuerpos de la invención, aunque tal aniquilación preferiblemente se induce a través de un mecanismo diferente de la apoptosis.
En otra modalidad, la afección mediada por CXCR4 que se trató es la migración de las células de soporte de la médula espinal al sitio de tumor.
Un ensayo clínico de la fase II en carcinoma hepatocelular investigó el uso de CTCE-9908 (una señalización de CXCR4 de bloqueo de péptido diraerizado) en combinación con quimioembolización transarterial siendo iniciada. La hipótesis es que CTCE-9908 bloquearía el reclutamiento de las células de soporte derivadas de médula espinal a través de un tumor después del procedimiento de quimioembolización transarterial además de bloquear el proceso metastático.
En otra modalidad, la afección mediada por CXCR4 a ser tratada es la migración de células CXCR4+ al sitio de inflamación.
CXCR4 se sabe que juega un papel en inflamación. Al igual que otras citocinas SDF-1 contribuye a la inflamación atrayendo las células CXCR4+ del sistema inmunitario al sitio de inflamación. El bloqueo de la interacción podría ser benéfico para una amplia variedad de trastornos inflamatorios y autoinmunitarios , por ejemplo, artritis reumatoide . El candidato de fármaco de molécula pequeña AMD3465, un antagonista CXCR4 , ha demostrado que anula la respuesta inflamatoria mediada Th2 en un modelo provocado por el antígeno esquistosomal de formación de granuloma pulmonar (Hu y otros, 2006) En aún otra modalidad, la afección mediada por CXCR4 a ser tratada es una infección viral, en particular una infección retroviral tal como la infección VIH, o cualquier otra infección viral en donde el virus se utiliza CXCR4 como un receptor.
Una porción significativa de la cepa de HIH utiliza CXCR4 como un co-receptor durante la infección (cepas VIH X4) . El bloqueo del receptor CXCR4 ha demostrado que es muy efectivo en el bloqueo de la infección. AMD3100 ha demostrado que inhibe la entrada de las cepas VIH X4 en las cepas CXCR4 con una muy alta eficacia tanto in vitro como in vivo en ensayos clínicos en humanos. Un derivado de este compuesto con biodisponibilidad aumentada, AMD070, está actualmente en ensayos clínicos de la fase II para el tratamiento de VIH. Varios otros antagonistas de CXCR4 están varias etapas de desarrollo para este propósito.
En aún otra modalidad, la sección mediada por CXCR4 a ser tratada es una afección en la que se desea movilizar las células madre detenidas en la médula espinal . La movilización de las células madre puede lograrse bloqueando la interacción CXCR4/SDF-1 y esto permite por ejemplo la restauración del sistema inmunitario, requerido, por ejemplo, después de irradiación de cuerpo completo o trasplante de médula espinal o un cáncer de sangre tal como el linfoma no Hodgkins o un mieloma múltiple. Tales métodos son útiles para tratar estas afecciones y cualquier otra enfermedad que refiera o podría beneficiarse de trasplantes de células madre formadoras de sangre .
En enero del 2009, Genzyme recibió una aprobación de la FDA para vender un inhibidor CXCR4 de molécula pequeña plerixafor (anteriormente AMD3100) bajo el nombre comercial de Mozobil™ como un fármaco inyectable para pacientes con linfoma no de Hodgkins y mieloma múltiple, por la necesidad de trasplantes de células madre formadoras de sangre. Este producto pretende utilizarse para la movilización de células madre autólogas en combinación con G-CSF. El bloqueo de interacción entre CXCR4 y SDF-1 ha demostrado que aumenta tanto el conteo de glóbulos blancos como el número de células CD34+ en la sangre periférica significativamente, como SDF-1 es secretado por el estroma de la médula espinal que es en este caso contribuyendo a mantener la células madre en la médula espinal en una forma activada. Existen varios otros antagonistas CXCR4 bajo desarrollo para esta indicación.
En aún otra modalidad, el bloqueo de la señalización mediada por el receptor CXCR4 sensibiliza las células de tumor para el tratamiento con otros compuestos terapéuticos, por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos . De esta forma, las terapias de combinación con fármacos quimioterapéuticos son particularmente preferidas. Tales modalidades son particularmente útiles para el tratamiento de cánceres sanguíneos .
En diciembre del 2009, Genzyme anunció que el ensayo de la fase I/II humano proveyó datos clínicos tempranos sugiriendo que Mozobil (inyección de plerixafor) en combinación con la quimioterapia pueden ofrecer un impacto terapéutico en células leucémicas protegidas en la médula espinal. En el ensayo clínico, Mozobil se dio como una estrategia de pre-acondicionamiento antes de la quimioterapia (régimen MEC : mitoxantrona, etoposida, y citarabina) a pacientes con leucemia mieloide aguda reincidida o refractaria (AML, por sus siglas en inglés) . Muchos de los participantes en el ensayo fueron ya sea no sensibles a, o tuvieron cortas remisiones, después de los tratamientos. De los pacientes disponibles para la primera evaluación de seguimiento, los investigadores observaron una completa remisión (CR o CRi) en 50% de los pacientes. Los ensayos similares se han iniciado para otros cánceres sanguíneos.
Las modalidades descritas anteriormente pueden utilizarse para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades .
Los ejemplos de tipo de tumor en donde se ha demostrado la expresión de CXCR4 aumentada son cáncer de pecho, cáncer de próstata, cáncer colorectal, cáncer pancreático, melamonas malignos o metastáticos , cánceres de cabeza y cuello incluyendo pero no limitándose a carcinomas de células escamosa oral y cáncer nasofaríngeo, cáncer del esófago, tumores de cerebro incluyendo, pero no limitándose a gliomas y meningiomas, leucemias, linfornas tales linfoma no de Hodgkins, neuroblastoma y otros cánceres infantiles, cáncer renal, hemangioblastomas , enfermedad de von Hippel-Lindau, tumores de pulmón (ambos SCLC y NSCLC) , cánceres de hígado, cánceres ováricos, cánceres cervicales, carcinomas de tiroides papila, y osteosarcomas . El tratamiento de cáncer metastático o la inhibición de la invención celular cancerígena es particularmente preferida.
La enfermedad o trastorno mediado por CXCR4 también puede ser una enfermedad o afección asociada con enfermedades inflamatorias o autoinmunitarias . Las enfermedades o afecciones preferidas incluyen: (1) enfermedades alérgicas tales como anafilaxis sistémica o respuestas de hipersensibilidad, alergias a fármacos, aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) , alergias a picaduras de insectos y alergias a alimentos, (2) enfermedades inflamatorias del intestino, tal como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, ileitis y enteritis, (3) vaginitis, (4) psoriasis y dermatosis inflamatorias tales como dermatitis, eczema, dermatitis atópica, dermatitis de contacto alérgica, urticaria y pruritos, (5) vasculitis, (6) espondiloartropatias , (7) escleroderma, (8) asma y enfermedades alérgicas respiratorias tales como asma alérgica, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedades de pulmón hipersensible y similares, (9) enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis (incluyendo reumatoide y psoriática) , esclerosis múltiple, lupus sistémico eritematoso, diabetes de tipo I, glomerulonefritis , y similares, (10) rechazo al injerto (incluyendo rechazo a aloinjerto y enfermedad de injerto contra hospedero) , y (11) otras enfermedades en donde las respuestas inflamatorias indeseadas se van a iniciar, tal como la aterosclerosis , miositis, enfermedades neurodegenerativas medidas por célula T, esclerosis múltiple, encefalitis, meningitis, hepatitis, nefritis, asepsia, sarcoidosis, conjuntivitis alérgica, otitis, enfermedad de Castleman, sinusitis, choque endotóxico inducido por el LPS, síndrome de Behcet y gota. La artritis reumatoide y la inflamación mediada por Th2 son enfermedades particularmente preferidas a ser tratadas con los anticuerpos de la invención .
Como se utiliza en la presente, el término "proliferación aberrante" significa la proliferación celular que se desvía del curso normal, apropiado o esperado. Por ejemplo, la proliferación celular aberrante puede incluir la proliferación inapropiada de células cuyo ADN u otros componentes celulares se han convertido en dañadas o defectuosas.
La proliferación celular aberrante puede incluir proliferación celular cuyas características están asociadas por una indicación causada por, mediada por, o que resulta en niveles inapropiadamente altos en la dirección celular, niveles inapropiadamente bajos de la apoptosis, o ambos.
Tales indicaciones pueden caracterizarse, por ejemplo, por proliferaciones anormales individuales o locales múltiples de células, grupos de células, o tejido(s), cancerígenas o no cancerígenas, benignas o malignas.
Cualquier referencia a "tumor (s)" en la presente también se refiere "cáncer (s)" o "carcinoma (s) " . Los cánceres metastáticos también pueden ser tratados, como puede ser la reducción de las metástasis de un tumor primario. La así denominada enfermedad residual mínima (MRD) , que queda en pacientes después de la cirugía, puede ser manejable para inmunoterapia con anticuerpos anti-CXCR4.
La presente invención de esta forma además proporciona métodos de, y usos en, el tratamiento de una enfermedad como se define anteriormente, que comprende administrar a un animal o paciente con tal enfermedad, una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, o un fragmento de unión antígeno o un inmunoconjugado de tal anticuerpo anti-CXCR4.
Un aspecto más de la invención proporciona el uso de los anticuerpos de la invención o un fragmento de unión antígeno o un inmunoconjugado de tal anticuerpo en la fabricación de una composición de . un medicamento para utilizarse en terapia, formación de imágenes o diagnóstico.
Un aspecto más proporciona los anticuerpos de la invención o · un fragmento de unión a antígeno o un inmunoconjugado para tal anticuerpo para utilizarse en terapia, diagnóstico o formación de imágenes.
Además, la invención proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos de la invención o un fragmento de unión antígeno o un inmunoconjugado de tal anticuerpo con uno o más excipientes, portadores, diluyentes, reguladores de pH o estabilizantes farmacéuticamente aceptables.
Los métodos in vivo como se describen en la presente generalmente se llevan a cabo en un mamífero. Cualquier mamífero puede ser tratado, por ejemplo, humanos y cualquier animal de ganado, doméstico o laboratorio. Los ejemplos específicos incluyen ratones, ratas, puercos, gatos, perros, ovejas, conejos, cabras y monos. Preferiblemente, sin embargo, el mamífero es un humano.
De esta forma, el término "animal" o "paciente" como se utiliza en la presente incluye cualquier mamífero, por ejemplo, humanos y cualquier ganado, animal doméstico o de laboratorio. Los ejemplos específicos incluyen ratones, ratas, puercos, catos, perros, ovejas, conejos, vacas y monos. Preferiblemente, sin embargo, el animal o paciente es un suj eto humano .
Esta invención enlaza ambos métodos de tratamiento de trastornos como se define anteriormente utilizando anticuerpos no conjugados o desnudos y sus fragmentos, y célula CXCR4+ (preferiblemente célula de tumor CXCR4+ o células CXCR4+ del sistema inmunitario, por ejemplo células que pueden ser infectadas por cepas trópicas CXCR4 de VIH) , métodos que se activan utilizando inmunoconjugados en donde un anticuerpo de la invención o uno de sus fragmentos de unión a antígeno, está operativamente acoplado a un agente terapéutico de diagnóstico. A menos que se afirme específicamente lo contrario o se haga claro en términos científicos, los términos "anticuerpo y sus fragmentos" como se utiliza en la presente, por consiguiente significa un anticuerpo o fragmento "no conjugado o desnudo" , que no se une a otro agente, particularmente un agente terapéutico o de diagnóstico. Estas definiciones no excluyen modificaciones del anticuerpo tales como, a manera de ejemplo, solamente modificaciones para mejorar la vida media biológica, la afinidad, la avidez u otras propiedades del anticuerpo, o combinaciones del anticuerpo con otros efectores.
Los métodos de tratamiento y usos de la invención también abarcan el uso de ambos anticuerpos no conjugados o desnudos e inmunoconjugados . En los métodos de tratamiento a base de inmunoconjugados , un anticuerpo de la invención, o uno de sus fragmentos de unión a antígeno, preferiblemente está operativamente acoplado a un segundo agente terapéutico (el anticuerpo anti-CXCR4 mismo siendo el primer agente terapéutico) .
Un agente terapéutico apropiado puede seleccionarse dependiendo de la enfermedad o afección a ser tratada y/o el modo deseado de la acción terapéutica.
Por ejemplo, cuando el modo deseado de acción es antagónico, por ejemplo, para modular la señalización celular de la célula CXCR4+ objetivo, por ejemplo, para modular la señalización dentro de la célula objetivo o para modular la señalización de la célula objetivo a otras células, o para regular de manera descendente o inhibir la función/señalización de las células CXCR4+, por ejemplo, células de tumor, o células del sistema inmunitario involucradas en una respuesta inflamatoria o autoinmunitaria, o células que son susceptibles a infecciones virales tales como VIH, entonces los agentes apropiados podrían ser agentes inmunomodulármente terapéuticos tales como agentes antiinflamatorios, por ejemplo, corticoesteroides (preferiblemente glucocorticoides) o fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAID, por sus siglas en inglés) tales como los inhibidores COX-2, sulfonanilidas , licofelona y ácidos grasos omega-3, antagonistas esteroides, antagonistas de citocina o quimiocina, o inhibidores de la expresión de citocina o quimiocina. Los ejemplos alternativos podrían ser inhibidores de la angiogénesis tales como angiostatina, endostatina, cualquiera de las angiopoyetinas , vasculostatina, canstatina o maspina. Los ejemplos alternativos podrían ser inhibidores de la trayectoria de señalización adicionales tales como el inhibidor de un receptor de factor de crecimiento, por ejemplo, receptores IGF EGFR tales como el receptor de IGF-1 (IGF-1R) , IGF-2R, la proteína de unión IGF (IGFBP-3) y FGFR.
Cuando la inhibición del crecimiento de las células CXCR4+ es un modo deseado de acción (por ejemplo, en el tratamiento de cáncer) entonces un agente apropiado con efectos inhibidores del crecimiento pueden seleccionarse, por ejemplo un agente terapéutico citostático tales como los inhibidores de los receptores de esteroides (por ejemplo, el receptor de estrógeno) .
Cuando la aniquilación de la célula es un modo de acción deseado, entonces un agente citotóxico apropiado tales como los agentes radioterapéuticos o inhibidores ATPase pueden seleccionarse.
Para el tratamiento cáncer los fármacos anticancerígenos apropiados también podrían utilizarse.
Alternativamente, en aplicaciones anti-víricas , por ejemplo el tratamiento de VIH, un agente anti-vírico apropiado puede utilizarse como el terapéutico adicional.
Es importante observar que múltiples modos de acción podrían ser apropiados para ciertas enfermedades o etapas de enfermedad, y, si es así, múltiples terapéuticos adicionales pueden utilizarse. También es importante observar que muchos agentes tienen efectos múltiples, o efectos que difieren dependiendo del contexto. El bloqueo de las trayectorias de señalización puede tener un efecto tanto en la migración de las células tumorales así como el crecimiento de los tumores. Muchos agentes quimioterapéuticos también tienen más de una función. Las quimiocinas y sus antagonistas pueden tener diferentes efectos en conexión con el cáncer comparado con aplicaciones antiinflamatorias. Sin embargo, estaría bien dentro de la capacidad de un experto en la técnica seleccionar un agente terapéutico adicional apropiado dependiendo de la enfermedad, la etapa de la enfermedad y el modo de acción deseado.
Los terapéuticos adicionales pueden se provistos en la forma de un inmunoconjugado pero pueden alternativamente ser provistos en una terapia de combinación, por ejemplo, cuando varios agentes se administran juntos (por ejemplo, como una mezcla) , de manera separada o secuencialmente , si esto es más apropiado.
Los métodos de tratamiento anteriores y los usos generalmente involucran la administración de que una composición farmacéuticamente efectiva al animal o paciente sistémicamente , tal como a través de inyección transdérmica, intramuscular, intravenosa y similar. Sin embargo, cualquier ruta de administración que permita que el agente localice el sitio de tumor u otros sitios apropiados, tales como los sitios de inflamación o infección viral serán aceptables. Por lo tanto, otras rutas adecuadas para el suministro incluyen oral, nasal o respiratoria y tópica.
"Administración", como se utiliza en la presente, significa la provisión o suministro de terapéuticos en de anticuerpo anti-CXCR4 en una cantidad (s) y durante un periodo de tiempo (s) efectivo para ejercer los efectos terapéuticos, por ejemplo, anti -tumorales , antiinflamatorios, o antivíricos. La administración pasiva de terapéuticos proteicos generalmente es preferida, en parte, por su simplicidad y reproducibilidad.
Sin embargo, el término "administración" en la presente se utiliza para referirse a cualquiera y todos los medios a través de los cuales los anticuerpos anti-CXCR4 de la invención se suministran o por el contrario son provistos al sitio objetivo. "Administración" por consiguientes incluye la provisión de células que producen el anticuerpo anti-CXCR4 de la invención en una forma efectiva para resultar en el suministro al sitio objetivo. En tales modalidades, puede ser deseable formular o empacar las células en una membrana selectivamente permeable, estructura o dispositivo implantable, generalmente uno que pueda removerse para cesar la terapia. El anticuerpo anti-CXCR4 exógeno de la invención aún generalmente será preferido, como representa un método no invasivo que permite monitorear cercanamente la dosis y controlarla .
Los métodos terapéuticos y usos de la invención también pueden extenderse a la provisión de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo anti-CXCR4 de la invención en una forma efectiva para dar como resultado su expresión en la vecindad del tumor o su localización en el sitio objetivo. Cualquier técnica de terapia génica puede utilizarse tal como suministro de ADN desnudo, genes recorabinantes y vectores, suministro a base de células, incluyendo la manipulación ex vivo de las células del paciente y similares.
Los anticuerpos anti-CXCR4 de la invención también pueden utilizarse para suministrar otros agentes terapéuticos o de diagnósticos al sitio objetivo. En tales modalidades, los otros agentes terapéuticos o de diagnóstico generalmente están operativamente acoplados a los anticuerpos anti-CXCR4 de la invención.
Las "cantidades terapéuticamente efectivas" para utilizarse en la invención son cantidades del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, o sus inmunoconjugados , efectivos para inhibir la unión de un ligando CXCR4 a CXCR4 ; para inhibir las respuestas celulares mediadas por CXCR4 a un ligando CXCR4 , preferiblemente para inhibir la liberación de los iones de calcio en respuesta a un ligando CXCR4 o para inhibir la migración de células CXCR4+; para reducir la inflamación; para inhibir la formación de metástasis; para inhibir la invasión celular cancerígena; para inhibir el crecimiento del tumor; para inhibir la angiogénesis del tumor; para inducir la regresión o remisión del tumor después de la administración a animales o pacientes que tienen un tumor CXCR4+; para limitar la diseminación de las cepas VIH trópicas CXCR4 y/o cuando el mecanismo de acción involucra la aniquilación de la célula, para específicamente aniquilar por lo menos una porción de las células CXCR4+. Tales efectos preferiblemente se logran mientras se exhibe poca o ninguna unión a, o poca o ninguna aniquilación de las células en tejidos sanos, normales y ejerciendo efectos secundarios adversos insignificantes o manejables en tejidos sanos, normales del animal o paciente.
Por "sito objetivo" significa la ubicación de las células CXCR4+ que median un trastorno o que proliferan en una forma aberrante causando o exacerbando un trastorno. El sitio objetivo puede de esta forma por ejemplo ser un tumor o el sitio de la inflamación mediada por CXCR4. "Células objetivo" son células CXCR4+ que median un trastorno o que proliferan en una forma aberrante causando o exacerbando un trastorno. De esta forma, las células objetivo pueden, por ejemplo, incluir células de tumor CXCR4+, células del sistema inmunitario, por ejemplo, leucocitos CXCR4+ (para aplicaciones antiinflamatorias/anti-inmunitarias) o células inmunitarias CXCR4+ activadas por cepas VIH trópicas CXCR4.
Los términos "preferencialmente" y "específicamente" , como se utilizan en la presente en el contexto de la aniquilación de células CXCR4+ tale como las células de tumor CXCR4+, leucocitos CXCR4+ (para aplicaciones antiinflamatorias/anti-autoinmunitarias) o de reducir la inflamación o de inducir la regresión o remisión del tumor, de esta forma significa que el anticuerpo anti-CXCR4 de la invención o sus inmunoconjugados , funcionan para obtener la destrucción de la célula objetivo CXCR4+, por ejemplo, la destrucción de la célula tumoral, que está sustancialmente confinada en el sitio objetivo, y sustancialmente no se extiende para causar la destrucción en tejidos sanos, normales del animal o sujeto.
Los anticuerpos anti-CXCR4 de la invención o los conjugados terapéuticos preferiblemente se enlazan a uno o más agentes radioterapéuticos, agentes quimioterapéuticos , agentes anti-angiogénicos, agentes que inducen apoptosis, fármacos anti-tubulina, agentes anti -celulares o citotóxicos, antagonistas de citocina o quimiocina, inhibidores de la expresión de citocina o quimiocina, inhibidores ATPase, agentes antiinflamatorios, otros anticuerpos (por ejemplo, como anticuerpos biespecífieos ) o coagulantes (factores de coagulación) , o agentes antiinflamatorios tales como corticoesteroides , preferiblemente glucocorticoesteroides o fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAID) .
La invención de esta forma proporciona un intervalo de anticuerpos conjugados y fragmentos de los mismos en donde el anticuerpo anti-CXCR4 está operativamente acoplado a por lo menos otro agente terapéutico o de diagnóstico. El término "inmunoconjugado" se utiliza ampliamente para definir la asociación operativa del anticuerpo con otro agente efectivo y no pretende referirse solamente a cualquier tipo de asociación operativa, y está particularmente no limitado a "conjugación" química. Las proteínas de fusión recombinantes se contempla particularmente. Mientras como el suministro o activación del agente sea capaz de unirse al objetivo, y al agente terapéutico o de diagnóstico es suficientemente funcional después del suministro, el modo de acoplamiento será adecuado.
El acoplamiento de los agentes a través de fracciones de carbohidrato en anticuerpos también se contempla. La glicosilación, tanto O-enlazada como N-enlazada, naturalmente ocurre en anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden modificarse para recrear o crear sitios de glicosilación adicionales si se desea, que simplemente se logra modificando las secuencias de aminoácido apropiadas (tales como Asn-X-Ser, Asn-X-Thr, Ser, o Thr en donde X es cualquier aminoácido excepto Pro) en la secuencia primaria del anticuerpo.
Los agentes actualmente preferidos para utilizarse en el anticuerpo anti-CXCR4 o conjugados terapéuticos de la invención y métodos relacionados y usos son aquellos que complementan o mejoran los efectos del anticuerpo y/o los seleccionados para un tipo particular de enfermedad (por ejemplo, tipo de tumor) o paciente.
"Agentes terapéuticos que complementan o mejoran los efectos del anticuerpo" incluye agentes radioterapéuticos , agentes quimioterapéuticos , agentes anti-angiogénicos , agentes inductores de apoptosis, fármacos anti-tubulina, agentes anti-celulares o citotóxicos, coagulantes, antagonistas de citocina o quimiocina, inhibidores de la expresión de citocina o quimiocina, inhibidores ATPase, agentes antiinflamatorios tales como corticoesteroides , preferiblemente glucocorticoides , o fármacos antiinflamatorios no esteroidales (NSAID) , otros anticuerpos, (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) , cualquiera o más de los cuales es preferido para utilizarse en la presente.
Los agentes anticancerígenos preferidos, particularmente anti-leucemia incluyen fármacos de antraciclina tales como daunorubicina, Doxorubicina, Citarabina, 6-tioguanina, Mitoxantrona, busulfano (Myleran®) , dasatinib (Sprycel™) , prednisona, sulfato de vincristina (Oncovin®) , Clorambucilo, Fludarabina, Pentostatina y Cladribina.
Los ejemplos anti-angiogénicos actualmente preferidos incluyen angiostatina, endostatina, cualquiera de las angiopoyetinas , vasculostatina , canstatina y maspina.
Los "fármacos anti-tubulina" , como se utiliza en la presente, significa cualquier agente, fármaco, profármaco o combinación de estos que inhibe la mitosis celular, preferiblemente bajo la inhibición directa o indirecta de las actividades de tubulina necesarias para la mitosis celular, preferiblemente la polimerización o despolimerización de tubulina. Los fármacos anti-tubulina actualmente preferidos incluyen colchicina, taxol, vinblastina, vincristina, vindescina y una o más de las combretastatina .
Los NSAID actualmente preferidos incluyen inhibidores COX-2, sulfonanilidas , licofelona y ácidos grasos omega- 3.
El acoplamiento o asociación · de los agentes preferidos con anticuerpos anti-CXCR4 de la invención da los "inmunoconjugados" , en donde tales inmunoconjugados por lo general tienen propiedades terapéuticas mejoradas y aún sinérgicas, por ejemplo, propiedades anti-tumor o antiinflamatorias.
El uso de agentes anti-celulares y citotóxicos (cuando es apropiado) da como resultado las "inmunotoxinas" del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, mientras el uso de factores de coagulación da como resultado "coaguligandos" del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención.
El uso de por lo menos dos agentes terapéuticos también se contempla, tales como las combinaciones de uno o más de los agentes anteriores .
En ciertas aplicaciones, los terapéuticos del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención estarán operativamente enlazadas a agentes citotóxicos, citostáticos o por el contrario anti-celulares que tienen la habilidad de aniquilar o sliprimir el crecimiento o la división celular de las células. Los agentes anti-celulares adecuados incluyen agentes quimioterapéuticos , así como citotoxinas y agentes citostáticos. Los agentes citostáticos generalmente son aquellos que alteran el ciclo natural de la célula de una célula objetivo, preferiblemente de tal forma que la célula se retira del ciclo celular.
Los agentes quimioterapéuticos ilustrativos incluyen: hormonas, tales como esteroides; anti-metabolitos , tales como citosina arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina ; antraciclinas ; mitomicina C; alcaloides vinca; antibióticos; demecolcina; etoposida; mitramicina ; y agentes de alquilación anti -tumorales , tales como clorambucilo o melfalano. Ciertos agentes anti-celulares preferidos son los inhibidores de la síntesis de ADN, tales como daunorubicina, doxorubicina/adriamicina, y similares. En general, taxol/paclitaxel , docetaxel, cisplatina, gemcitabina, una combretastatina y doxorubicina/adriamicina son agentes anticancerígenos actualmente preferidos.
Los inhibidores ATPase de tipo V también son actualmente preferidos, tales como salicilihalamida, concanamicina o bafilomicina , como potentes inhibidores de la síntesis, tales como psimberina, pederina, irciniastatina A.
En ciertas aplicaciones terapéuticas, las fracciones de toxina serán preferidas, debido a su mucha mayor habilidad de la mayor parte de las toxinas para distribuir un efecto aniquilador de la célula, cuando se compara con otros agentes potenciales. Por consiguiente, ciertos agentes anti-celulares preferidos para constructos de anticuerpo anti-CXCR4 de la invención son toxinas derivadas de plantas, derivadas de hongos o de bacterias. Las toxinas ilustrativas incluyen epipodofilotoxinas ; endotoxina bacteriana o la fracción de lípido A de la endotoxina bacteriana; proteínas que inactivan ribosoma, tales como saporina o gelonina; a-sarcina; aspergilina ; restrictocina ; ribonucleasas , tales como ribonucleasa placental; la toxina de difteria y la exotoxinas de ps udornonas. Los ejemplos actualmente preferidos son ricina, gelonina, abrina, las toxinas de difteria, pseudornonas y tosferina.
Ciertas toxinas preferidas son las toxinas de cadena A, tales como la cadena de ricina A. Las fracción de toxina más preferida es por lo general la cadena de ricina A que ha sido tratada para modificar o remover residuos de carbohidrato, la denominada "cadena A desglicosilada" (dgA) . La cadena de ricina A desglicosilada es preferida debido a su potencia extrema, su vida media más larga, y porque es económicamente factible para fabricar en un grado clínico y a escala. La cadena de ricina A recombinante y/o truncada también puede utilizarse.
Los terapéuticos del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención pueden comprender un componente que es capaz de promover la coagulación, es decir, un coagulante. Aquí, la activación del anticuerpo puede ser directa o indirectamente, por ejemplo, a través de otro anticuerpo, enlazado a un factor que directa o indirectamente estimula la coagulación.
Los factores de coagulación preferidos para tales usos son el Factor Tisular (TF, por sus siglas en inglés) y los derivados TF, tales como TF truncado (Ttf, por sus siglas en inglés) , TF dimérico, trimérico, polimérico/multimérico, y TF mutante deficiente en la habilidad de activar el Factor VII. Otros factores de coagulación adecuados incluyen los coagulantes dependientes de la vitamina K, tales como el Factor Il/IIa, Factor VII/VIIa, Factor IX/IXa y Factor X/Xa; los factores de coagulación dependientes de la vitamina K que carecen de modificación Gla; el activador del Factor X del veneno de víbora de Russell; compuestos activadores de plaqueta, tales como tromboxano A2 y tromboxano A2 sintasa; e inhibidores de fibrinólisis , tales como 2 -antiplasmina . En general, el Factor Tisular truncado (tTF) es actualmente preferido.
La preparación de inmunoconjugados e inmunotoxinas es generalmente bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 4,340,535). Cada una de las siguientes patentes además se incorpora en la presente por referencia para los propósitos de aún adicionalmente suplementar las enseñanzas de la presente con respecto a la generación, purificación y uso de inmunotoxinas: Patente de E. U. A. No. 6,004,554; 5,855,866; 5,965,132; 5,776,427; 5,863,538; 5 , 660 , 827 y 6 , 051, 230.
Una variedad de agentes quimioterapéuticos y otros farmacológicos también pueden exitosamente conjugarse con los terapéuticos del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención. Los agentes antineoplásicos ilustrativos que han sido conjugados con anticuerpos incluyen doxorubicina, daunomicina, metotrexato y vinblastina. Además, el acoplamiento de otros agentes tales como neocarzinostatina, macromicina, trenimona y oc-amanitina han sido descrito (ver Patentes de E. U. A. Nos. 5,660,827; 5,855,866; y 5,965,132; cada una de las cuales se incorpora en la presente) .
Las preparaciones de coaguligandos también se practican fácilmente. La asociación operable de uno o más factores de coagulación con un anticuerpo anti-CXCR4 de la invención puede ser un enlace directo, tales como aquellos descritos anteriormente para las inmunotoxinas . Alternativamente, la asociación operativa puede ser un acoplamiento indirecto, tal como en donde el anticuerpo está operablemente enlazado a una segunda región de unión, preferiblemente un antígeno o a una región de unión a antígeno de un anticuerpo, que se une al factor de coagulación. El factor de coagulación deberá acoplarse al anticuerpo anti-CXCR4 de la invención en un sitio diferente de su sitio de coagulación funcional, particularmente en donde se utiliza un enlace covalente para unir las moléculas.
Los anticuerpos biespecífieos o triespecífieos también pueden utilizarse en los métodos de la invención. En tales anticuerpos un brazo se une a CXCR4 y es un anticuerpo de la presente invención. Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son bien conocidos y descritos en la técnica.
En la preparación de inmunoconjugados , inmunotoxinas y coaguligandos, se puede utilizar la expresión recombinante . Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo anti-CXCR4 seleccionado de la invención, y el agente terapéutico, toxina o coagulante, se acoplan en-marco en un vector de expresión. La expresión recombinante de esta forma da como resultado la producción del ácido nucleico para producir el inmunoconjugado deseado. Los enlazadores cruzados químicos, y los puentes de avidina ¡biotina también pueden unirse a los agentes terapéuticos para el anticuerpo anti-CXCR4 de la invención.
Las composiciones y métodos de la presente invención pueden utilizarse en combinación con otros terapéuticos y diagnósticos. En términos de agentes biológicos, preferiblemente agentes de diagnóstico o terapéuticos, para utilizarse "en combinación" con un anticuerpo anti-CXCR4 de acuerdo con la presente invención, el término "en combinación" se utiliza¦ sucintamente para cubrir un intervalo de modalidades. La terminología "en combinación" , a menos que específicamente se dicte lo contrario o se haga claro a partir de la terminología científica, de esta forma se aplica a varios formatos de composiciones combinadas, farmacéuticas, cocteles, kits, métodos y primeros y segundos usos médicos.
Las modalidades "combinadas" de la invención de esta forma incluyen, por ejemplo, en donde el anti-CXCR4 de la invención es un anticuerpo desnudo y se utiliza en combinación con un agente o agente terapéutico que no está operativamente acoplado al mismo. En tales casos, el agente o agente terapéutico puede utilizarse en una forma no activada o activada. En "forma no activada", el agente, particularmente los agentes terapéuticos, generalmente se utilizarán de acuerdo con su uso estándar en la técnica. En "forma activada", el agente generalmente estará operativamente acoplado a un anticuerpo diferente o región de activación que suministra el agente o agente- terapéutico al sitio de la enfermedad objetivo. El uso de tales formas activadas de agentes biológicos, tanto diagnósticos como terapéuticos, también es bastante estándar en la técnica.
En otras modalidades "combinadas" de la invención, el anticuerpo anti-CXCR4 de la invención es un inmunoconjugado en donde el anticuerpo por sí mismo está operativamente asociado o combinado con el agente o el agente terapéutico. El acoplamiento operativo incluye todas las formas de acoplamiento directo o indirecto como se describe en la presente y se conoce en la técnica.
Los usos "combinados." , particularmente en términos de un anticuerpo anti-CXCR4 de la invención en combinación con agentes terapéuticos, también incluye composiciones combinadas, farmacéuticos, cocteles, kits, métodos y primero y segundo usos médicos en donde el agente terapéutico está en la forma de un profármaco. En tales modalidades, el componente de activación capaz de convertir el profármaco en su forma funcional del fármaco puede de nuevo estar operativamente asociado con los anticuerpos anti-CXCR4 de la presente invención.
En ciertas modalidades preferidas, las composiciones terapéuticas, las combinaciones, los farmacéuticos, los cocteles, los kits, métodos y primero y segundo usos médicos, serán las "combinaciones de profármaco" . Como se entenderá por los expertos en la técnica, el término "combinación de profármaco" a menos que se afirme lo contrario significa que el anticuerpo de la invención está operablemente acoplado a un componente capaz de convertir el profármaco en el fármaco activo, y no que el anticuerpo sea acople al profármaco mismo. Sin embargo, no hay requerimientos de que las modalidades del profármaco de la invención necesiten utilizarse como combinaciones de profármaco. Por consiguiente, los profármacos pueden utilizarse en cualquier forma en la que se utilizan en la técnica, incluyendo en la forma ADEPT y otras formas.
De esta forma, cuando las composiciones combinadas, farmacéuticos, cocteles, kits, métodos y primero y segundo usos médicos se describen, preferiblemente en términos de agentes de diagnóstico, y más preferiblemente agentes terapéuticos, las combinaciones incluyen anticuerpos anti-CXCR4 que son anticuerpos desnudos e inmunoconjugados , y en donde la práctica de las modalidades in vivo de la invención involucra la administración anterior, simultánea o posterior de los anticuerpos desnudos o inmunoconjugados y el agente biológico, de diagnóstico o terapéutico; mientras como, en algunas formas conjugadas o no conjugadas, la provisión general de alguna forma del anticuerpo y alguna forma del agente biológico, de diagnóstico o terapéutico se obtiene.
Lo anterior y otras explicaciones de los efectos de la presente invención en tumores se hacen para simplicidad para explicar el modo combinado de operación, el tipo de agente (s) acoplado y similar. Este método descriptivo no deberá interpretarse ya sea como subestimando o una sobre-simplificación de las propiedades benéficas de los anticuerpos anti-CXCR4 de la invención. Por consiguiente se entenderá que tales anticuerpos por sí mismos tienen propiedades anti-CXCR4 y que los inmunoconjugados de tales anticuerpos mantendrán estas propiedades y las combinarán con las propiedades del agente acoplado; y además, que el efecto combinado del anticuerpo y cualquier agente acoplado típicamente será mejorado y/o magnificado.
La invención por consiguiente proporciona composiciones, composiciones farmacéuticas, kits terapéuticos y cocteles medicinales que comprenden, opcionalmente en por lo menos una primera composición o en base, una cantidad biológicamente efectiva de al menos un primer anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, o un fragmento de unión a antígeno o un inmunoconjugado de tal anticuerpo anti-CXCR4; y una cantidad biológicamente efectiva de al menos un segundo agente biológico, componente o sistema.
El "por lo menos un segundo agente, componente o sistema biológico" por lo general será un agente terapéutico o de diagnóstico, componente o sistema, pero no necesita serlo. Por ejemplo, el al menos un segundo agente, componente o sistema biológico, puede comprender componentes para la modificación del anticuerpo y/o para unir estos agentes al anticuerpo. Ciertos segundos agentes, componentes o sistemas biológicos preferidos por profármacos o compuestos para hacer y utilizar profármacos, incluyendo componentes para hacer el profármaco mismo y componentes para abarcar los anticuerpos de la invención para funcionar en tal profármaco o modalidades ADEPT.
Cuando se incluyen agentes terapéuticos o de diagnóstico como al menos un segundo agente, componente o sistema biológico, tales terapéuticos y/o diagnósticos típicamente serán aquellos para utilizarse en conexión con el tratamiento o diagnóstico de uno o más de los trastornos definidos anteriormente.
De esta forma, en ciertas modalidades "por lo menos un segundo agente terapéutico" se incluirá en el kit o coctel terapéutico. El término se selecciona con referencia al anticuerpo anti-CXCR4 de la invención que es el primer agente terapéutico. Los agentes terapéuticos que son apropiados para ser "por lo menos un segundo agente terapéutico" de acuerdo con la invención se explican anteriormente en conexión con los inmunoconjugados .
En términos de composiciones, kits y/o medicamentos de la invención, las cantidades efectivas combinadas de los agentes terapéuticos pueden estar comprendidas dentro de un solo envase o medios de envase, o estar comprendidas dentro de diferentes envases o medios de envase. Los cocteles generalmente se mezclarán juntos para uso combinado. Los agentes formulados para administración intravenosa por lo general serán preferidos . Los componentes formadores · de imagen también pueden incluirse. Los kits también pueden comprender instrucciones para utilizar el al menos un primer anticuerpo y el uno o más de los otros agentes biológicos incluidos .
Generalmente hablando, el al menos un segundo agente terapéutico puede administrarse a un animal o paciente sustancialmente de forma simultánea con el anticuerpo anti-CXCR4 de la invención; tal como de una composición farmacéutica individual o de dos composiciones farmacéuticas administradas muy cercanamente.
Alternativamente, el al menos un segundo agente terapéutico puede administrarse al animal o paciente en un tiempo secuencial a la administración del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención. "En tiempo secuencial", como se utiliza en la presente, significa "alternado" de tal forma que al menos un segundo agente bio-cancerígeno se administra al animal o paciente en un tiempo diferente a la administración del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención. En general, los dos agentes se administran en tiempos efectivamente separados para permitir que los dos agentes ejerzan sus efectos terapéuticos respectivos, es decir, se administran en "intervalos de tiempo biológicamente efectivos" . El al menos un segundo agente terapéutico puede administrarse a un animal o paciente en un tiempo biológicamente efectivo después del anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, o en un tiempo biológicamente efectivo posterior al del terapéutico.
Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para el tratamiento de un animal o paciente con un tumor, que comprende: (a) someter al animal o paciente a un primer tratamiento que sustancialmente reduce la carga del tumor; y (b) posteriormente administrar por lo menos un primer anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, o uno de sus fragmentos de unión a antígeno; opcionalmente en donde el anticuerpo o el fragmento está operativamente asociado con un segundo agente terapéutico.
Los primeros tratamientos preferidos incluyen la resección quirúrgica y la intervención quimioterapéutica.
En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar a un animal o paciente con trastorno mediado con CXCR4 que comprende : (a) someter al animal o paciente a un primer tratamiento que sustancialmente reduce la carga mediada por CXCR4 tal como inflamación; y (b) posteriormente administrar por lo menos un primer anticuerpo anti- CXCR4 de la invención, o uno de sus fragmentos de unión a antígeno; opcionalmente en donde al anticuerpo o el fragmento está operativamente asociado con un segundo agente terapéutico.
En ciertas otras modalidades, los anticuerpos e inmunoconjugados de la invención puede combinarse con uno o más agentes de diagnóstico, típicamente agentes de diagnóstico para utilizarse en conexión con el diagnóstico de un trastorno como se define anteriormente. Un intervalo de composiciones, kits y métodos de diagnóstico de esta forma se incluye dentro de la invención.
Los aspectos adicionales son métodos de diagnóstico o formación de imágenes de un sujeto que comprende la administración de una cantidad apropiada de un anticuerpo u otra proteína de la invención como se define en la presente al sujeto y detectar la presencia y/o cantidad y/o la ubicación del anticuerpo u otra proteína de la invención en el sujeto.
En una modalidad, la invención proporciona un método para reducir la inmunosupresión, asociada con la expresión de CXCR4 en un animal, que comprende administrar al animal el anticuerpo de la invención, o uno de sus inmunoconjugados, en una cantidad efectiva para formar complejos entre el anticuerpo y el CXCR4 en. el animal, por lo tanto reduciendo la inmunosupresion asociada con la expresión de CXCR4 en un animal .
Las enfermedades apropiadas a ser formadas en imágenes o diagnosticadas de acuerdo con los usos antes descritos y los métodos incluyen cualquier enfermedad asociada con CXCR4 como se describe en cualquier lugar en la presente y preferiblemente cualquier cáncer como se describe en cualquier lugar en la presente.
En una modalidad, la invención proporciona un método para el diagnóstico de enfermedades en un animal que comprende el paso de: (a) poner en contacto una muestra de prueba · tomada del animal con un anticuerpo de la invención o uno de sus inmunoconjugados .
En una modalidad más, la invención proporciona un método para el diagnóstico de enfermedades en un animal que comprende los pasos de : (a) poner en contacto una muestra de prueba tomada del animal con un anticuerpo de la invención o uno de sus inmunoconjugados ; (b) medir o detectar la presencia y/o cantidad y/o ubicación del complejo de anticuerpo-antígeno en la muestra de prueba; y opcionalmente (c) comparar la presencia y/o cantidad del complejo de anticuerpo-antígeno en la muestra de prueba para un control.
En los métodos anteriores, el paso de contacto se lleva a cabo bajo condiciones que permitan la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno. Las condiciones apropiadas pueden fácilmente determinarse por un experto en la técnica.
En los métodos anteriores cualquier muestra de prueba apropiada puede utilizarse, por ejemplo células de biopsia, te idos u órganos que se sospecha que están afectados por la enfermedad o secciones histológicas.
En ciertos de los métodos anteriores, la presencia de cualquier cantidad del complejo de anticuerpo-antígeno en la muestra de prueba sería indicativa de la presencia de la enfermedad. Preferiblemente, para hacerse un diagnóstico positivo, la cantidad del complejo de anticuerpo-antígeno en la muestra de prueba es mayor que, preferiblemente significativamente mayor que, la cantidad encontrada en una muestra de control apropiada. Más preferiblemente, los niveles significativamente más altos son estadísticamente significativos, preferiblemente con un valor de probabilidad de <0.05. Los métodos apropiados para determinar la significancia estadística son bien conocidos y están documentados en la técnica y cualquiera de estos puede utilizarse .
Las muestras de control apropiadas pueden fácilmente seleccionarse a través de un experto en la técnica, por ejemplo, en el caso del diagnóstico de una enfermedad particular, un control apropiado podría ser una muestra de un sujeto que no tiene esa enfermedad. Los "valores" de control apropiados podrían fácilmente determinarse sin correr una "muestra" de control en cada prueba, por ejemplo por la referencia de intervalo de sujetos normales conocidas en la técnica.
Para utilizarse en aplicaciones de diagnóstico o formadoras de imágenes, los anticuerpos de la invención pueden marcarse con un marcador detectable tal como un radio-opaco, o radioisótopo, tal como 3H, 1C, 32P, 35S, 123I, 1251 , 131I; un emisor radioactivo (por ejemplo, emisores a, ß o ?) ; un compuesto fluorescente (fluoróforo) o quimioluminiscente (cromóforo) , tales como fluoresceína isotiocianato , rodamina o luciferina; un enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante; un agente formador de imágenes, o un ión metálico; una fracción química tal como biotina que puede detectarse a través de la unión a una fracción detectable de un cognado específico, por ejemplo, avidina/estreptavidina marcada. Los métodos para acoplar una etiqueta a una proteína de unión, tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo son conocidos en la técnica. Tales marcadores detectables permiten la presencia, cantidad o ubicación de los complejos de proteína-antígeno de unión en la muestra de prueba a ser examinada.
Los marcadores detectables preferidos para uso in vivo incluyen un compuesto detectable con rayos X, tal como bismuto (III) , oro (III) , lantano (III) o plomo (II) un ión radioactivo, tal como cobre67, galio67, galio68, indio111, indio113, yodo123, yodo125, yodo131, mercurio197, mercurio203 , renio186, renio188, rubidio97, rubidio103, tecnetio99m o itrio90; un isótopo de resonancia giratoria magnético nuclear, tal como cobalto (II), cobre (II), cromo (III), disprosio (III), erbio (III), gadolinio (III), holmio (III), hierro (II), hierro (III), manganeso (II), neodimio (III), níquel (II), samario (III), terbio (III), vanadio (II) o iterbio (III); o rodamina o fluoresceína.
La invención también incluye agentes de diagnóstico formadores de imagen que comprenden los anticuerpos de la invención acoplados en la etiqueta que produce una señal detectable directa o indirectamente. Las etiquetas apropiadas se describen en cualquier lugar en la presente.
La invención además incluye kits que comprenden uno o más de los anticuerpos, inmunoconjugados o composiciones de la invención o una o más de las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención, o uno o más vectores de expresión recombinantes que comprenden las secuencias de ácido nucleico de la invención, o una o más células hospederas o virus que comprenden los vectores de expresión recombinantes o secuencias de ácido nucleico de la invención. Preferiblemente los kits son para utilizarse en los métodos y usos como se describen en la presente, por ejemplo, métodos terapéuticos de diagnóstico o formadores de imágenes como se describe en la presente, o para utilizarse en ensayos o métodos in vi tro como se describe en la presente. El anticuerpo en tales kits puede preferiblemente ser un conjugado de anticuerpo como se describe en cualquier lugar en la presente, por ejemplo, puede conjugarse con una fracción detectable o puede ser un inmunocon ugado . Preferiblemente tales kits comprenden instrucciones para utilizar los componentes del kit, por ejemplo en diagnósticos. Preferiblemente, los kits son para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades como se describe ' en cualquier lugar en la presente y opcionalmente comprende instrucciones para utilizar los componentes del kit para diagnosticar o tratar tales enfermedades.
Los anticuerpos de la invención como se definen en la presente también pueden utilizarse como herramientas moleculares para aplicaciones y ensayo in vitro o in vivo. Como los anticuerpos tienen un sitio de unión a antígeno, estos pueden funcionar como miembros de pares de unión específicos y estas moléculas pueden utilizarse en cualquier ensayo en donde el miembro del par de unión particular es requerido.
De esta forma, en aún aspectos adicionales de la invención se proporciona un reactivo que comprende un anticuerpo de la invención como se define en la presente y el uso de tales anticuerpos como herramientas moleculares, por ejemplo, en ensayos in vitro o in vivo.
El tratamiento del cáncer también puede llevarse a cabo a través de : (a) formando una imagen de un tumor a través de la administración a un animal o paciente con un tumor de una cantidad de diagnóstico de por lo menos un primer anticuerpo anti-CXCR4 detectablemente marcado de la invención, que comprende un agente de diagnóstico operablemente acoplado al anticuerpo anti-CXCR4 de la invención, por lo tanto formando una imagen de'tectable del tumor; y (b) posteriormente administrar al mismo animal o paciente una cantidad terapéuticamente optimizada de por lo menos un primer anticuerpo anti-CXCR4 desnudo de la invención o un constructo de agente-anticuerpo terapéutico utilizando tal anticuerpo, por lo tanto causando un efecto anti-tumoral .
La invención ahora se describirá con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes con referencia a las Tablas y Figuras en donde : La Tabla 1 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al anticuerpo C-9P21 La Tabla 2 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al anticuerpo B-1M22 La Tabla 3 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al anticuerpo C-1I24 La Tabla 4 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al anticuerpo D-1K21 La Tabla 5 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al anticuerpo 9N10 La Tabla 6 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al IgG del anticuerpo C-9P21. Las regiones variables están subrayadas.
La Tabla 7 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al IgG del anticuerpo B-1M22. Las regiones variables están subrayadas.
La Tabla 8 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al IgG del anticuerpo C-1I24. Las regiones variables están subrayadas.
La Tabla 9 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al IgG del anticuerpo D-1K21. Las regiones variables están subrayadas.
La Tabla 10 enumera algunas de las secuencias descritas en la presente con relación al IgG del anticuerpo 9N10. Las regiones variables están subrayadas.
La Tabla 11 enumera otras secuencias descritas en. la presente con relación a los anticuerpos de la invención.
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótido y aminoácido de inter alia la cadena pesada y ligera del clon C-9P21. ScFv se clonó a través del sitio Ncol/Notl en pH0G21. Los sitios de restricción utilizados para la clonación inicial (Ncol, HindIII, MluI y Notl) están en itálicas y subrayados. La secuencia enlazadora entre VH y VL está en itálicas. El epítopo c-myc y 6 His están subrayados y subrayados dobles, respectivamente.
La Figura 2 muestra la secuencia de nucleótido y aminoácido de inter alia la cadena pesada y ligera del clon B-1M22. ScFv se clonó a través del sitio Ncol/Notl en pH0G21. Los sitios de restricción utilizados para la clonación inicial (Ncol, HindIII, MluI y Notl) están en itálicas y subrayados. La secuencia enlazadora entre VH y VL está en itálicas. El epítopo c-myc y 6 His están subrayados y subrayados dobles, respectivamente.
La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótido y aminoácido de inter alia la cadena pesada y ligera del clon C-1I24. ScFv se clonó a través del sitio Ncol/Notl en pH0G21. Los sitios de restricción utilizados para la clonación inicial (Ncol, HindIII, MluI y Notl) están en itálicas y subrayados. La secuencia enlazadora entre VH y VL está en itálicas. El epítopo c-myc y 6 His están subrayados y subrayados dobles, respectivamente.
La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótido y aminoácido de inter alia la cadena pesada y ligera del clon D-1K21. ScFv se clonó a través del sitio Ncol/Notl en pH0G21.
Los sitios de restricción utilizados para la clonación inicial (Ncol, HindIII, MluI y Notl) están en itálicas y subrayados. La secuencia enlazadora entre VH y VL está en itálicas. El epítopo c-myc y 6 His están subrayados y subrayados dobles, respectivamente.
La Figura 5 muestra la secuencia de nucleótido y aminoácido de inter alia la cadena pesada y ligera del clon 9N10. ScFv se clonó a través del sitio Ncol/Notl en pHOG21. Los sitios de restricción utilizados para la clonación inicial (Ncol, HindIII, MluI y Notl) están en itálicas y subrayados. La secuencia enlazadora entre VH y VL está en itálicas. El epítopo c-myc y 6 His están subrayados y subrayados dobles, respectivamente.
La Figura 6A muestra la tinción EasyCyte que demuestra la unión de los clones scFv B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 a líneas de células HEK293 transfectadas contra no transfectadas con CXCR4. La Figura 6B muestra la tinción EasyCyte que demuestra la unión de los clones scFv B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 para líneas de células DT40 transfectadas contra no transfectadas . La Figura 6C muestra la tinción EasyCyte que demuestra la unión de los clones IgG C-9P21, 9N10, y F7 a líneas de células Ramos y CCRF-CEM.
La Figura 7A muestra la tinción EasyCyte de 105 células Jurkat con 0.5 µg de cada uno de los clones scFv B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 sin y con competencia con el ligando y AMD-3100. La Figura 7B muestra, la tinción EasyCyte de 105 células Ramos con 0.5 µg con cada uno de los clones scFv B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 sin y con competencia con el ligando y AMD-3100. La Figura 7C muestra la tinción EasyCyte de 105 células CCRF-CEM con 0.1 ]ig cada uno de los clones IgG C-9P21, 9N10, y F7 con y sin competencia con el ligando 4 g, 1 µg y 0.5 µg.
La Figura 8A muestra la tinción EasyCyte de 105 células CCRF-CEM con 0.5 ]ig de C-1I24 (línea punteada) , B-1M22 (línea sólida oscura) y F7 (línea sólida pálida) comparado con PBS (sombreado negro) . La Figura 8B muestra la tinción EasyCyte de 105 células CCRF-CEM con 0.5 ]xg de D-1K21 (línea punteada) , C-9P21 (línea sólida oscura) y F7 (línea sólida pálida) comparado con PBS (sombreado negro) . Todos los anticuerpos estuvieron en el formato IgGl y la unión se detectó con anticuerpo secundario IgGrPE anti -humano de cabra .
La Figura 9 muestra la unión de B-1M22, C-9P21, C-1124, y D-1K21 a células HEK293T/17 temporalmente expresando CXCR4 de ratón o mono. Las columnas marcadas como "Fugeno" son células tratadas con agentes de transfeccion aplicado sin ADN. Esta columna sirve como control negativo.
La Figura 10 muestra un experimento EasyCyte en donde los clones scFv B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 se titularon con células CCRF-CEM para determinar la concentración óptima para utilizarse en ensayos de flujo de Ca++.
Las Figuras 11A, 11B, 11C, 11D y 11E muestran los resultados del ensayo de flujo Ca++ en células CCRF-CEM (marcado con Fluo-4). Los anticuerpos B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 se ensayaron en ambos al nivel scFv (Figura 11A) y el nivel IgG (Figura 11B, 11C y 11D) , el clon 9N10 se ensayó al nivel IGg (Figura 11E) . La células se pre-incubaron con 4 Ug/ml de scFv (Figura 11A) o 10 y 100 ug/ml de IgG (Figura 11B, 11C y 11D) , o 1 y 10 ug/ml de IgG (Figura 11E) durante 15 min antes de agregar el SDF-?a ligando específico de CXCR4. El registro de la señal se inició aproximadamente 10 seg después de agregar el ligando. Las áreas bajo las curvas (AUC, por sus siglas en inglés) se integraron y graficaron como porcentajes de AUC para estimulación máxima con SDF-la.
Las Figuras 12A y 12B muestran los resultados del ensayo de flujo de Ca++ en células CCRF-CEM (marcado con Fluo-4) . Los anticuerpos 9P21 y 9N10 se ensayaron al nivel IgG. Las células se pre-incubaron con concentraciones variables de los anticuerpos durante 15 minutos antes de agregar el ligando SDF-la específico de CXCR4. El registro de la señal se inició aproximadamente 10 seg después de agregar el ligando. La Figura 12A muestra la reducción de la señal a una serie de concentraciones. La Figura 12B muestra los datos originales .
La Figura 13 muestra la inhibición de la migración celular inducida por el ligando (SDF-?a) a través de anti-CXCR4 scFv C-9P21. Las células CCRF-CEM de leucemia de célula T humanas marcadas con BATDA se indujeron para migrar en cámaras Boyden, en donde el ligando SDF-1 se colocó en la cámara inferior y las células se co-incubaron con anticuerpos o medios solamente como un control en la cámaras superiores . Las células que migraron a la cámara inferior se detectaron por intensidad de fluorescencia después de la lisis celular inducida por Tritón X-100. Los valores medios y SD por triplicaron .
Las Figuras 14A, 14B y 14C muestran la inducción de ADCC a través de los anticuerpos anti-CXCR4 B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21. La aniquilación de la dosis-respuesta de las células CCRF-CEM se muestra para scFv C-9P21 y D-1K21 (a), e IgG C-9P21 y D-1K21 (b) , e IgG B-1M22 y C-1I24.
Las Figuras 15A y 15B muestran los resultados de ensayos para probar la habilidad de los anticuerpos B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 para inducir CDC. La dosis-respuesta de la aniquilación de las células Ramos en la presencia de suero humano se muestran para IgG B-1M22 y C-1I24 (Figura 15A) . C-9P21 y D-1K21 no induce CDC (Figura 15B) . Como control, el anticuerpo F7 en el formato IgGl se utilizó.
La Figura 16A muestra un análisis de la actividad apoptótica de los anticuerpos anti-CXCR4 B-1M22, C-9P21, C-1124, y D-1K21 con Anexina V. Como controles, el anticuerpo F7 y Estaurosporina (S; 25 nM) se utilizaron. El control negativo (nivel de fondo) , no fue anticuerpo, y no se agregó estaurosporina como se muestra en la columna 0. Sombreado gris claro: Cantidad total de células muertas, positive tanto para Anexina V como PI, sombreado gris oscuro: células apoptóticas como se define como siendo positivas para Anexina V pero negativas para PI . La Figura 16B muestra un análisis de la actividad apoptótica de los anticuerpos anti-CXC 4 C-9P21 y 9N10 con Anexina V. Como controles, se utilizó el anticuerpo F7. Sombreado gris claro: cantidad total de células muertas, positivas tanto para Anexina V como PI, sombreado gris oscuro: células apoptóticas como se define como siendo positivas para Anexina V pero negativas para PI .
EJEMPLOS Ejemplo 1; Nuevos Anticuerpos Se han identificado cinco anticuerpos humanos que pueden específicamente unirse a CXCR4. Las formas de cadena individual de los anticuerpos se clonaron en el plásmido pH0G21 (Kipriyanov y otros, 1997) que contiene los epítopos con etiqueta c-myc y 6xHis. La bacteria TG1 bacteria se transformó, y el scFv se expresó bajo inducción IPTG. La unión del scFv purificado se confirmó por EasyCyte .
Las secuencias de nucleótido de la cadena pesada y ligera del anticuerpo que producen clones se secuenciaron .
Los anticuerpos se designaron como C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10. La secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de C-9P21 se muestran en la Figura 1. Las regiones CDR de las cadenas ligera y pesada de C-9P21 se muestran en la Tabla 1. La secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de B-1M22 se muestran en la Figura 2. Las regiones CDR de las cadenas ligera y pesada de B-1M22 se muestran en la Tabla 2. La secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de C-1124 se muestran en la Figura 3. Las regiones CDR de las cadenas ligera y pesada de C-1I24 se muestran en la Tabla 3. La secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de D-1K21 se muestran en la Figura 4. Las regiones CDR de las cadenas ligera y pesada de D-1K21 se muestran en la Tabla 4. La secuencia de nucleótido y la secuencia de aminoácido de las cadenas ligera y pesada de 9N10 se muestran en la Figura 5. Las regiones CDR de las cadenas ligera y pesada de 9N10 se muestran en la Tabla 5.
La forma IgG de los anticuerpos C-9P21, B-1 22, C- 1124, D-1K21 y 9N10 también se ha elaborado. La forma IgG es del isotipo igGl y comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena pesada comprende un dominio VH de SEC ID NO: 69 (para C-9P21), SEC ID NO: 71 (para B-1M22), SEC ID NO: 73 (para C-1I24), SEC ID NO: 75 (para D-1K21) o SEC ID NO: 69 (para 9N10) y una región constante IgGl humana. Cada cadena ligera comprende un dominio VL de SEC ID NO: 70 (para C-9P21) , SEC ID NO: 72 (para B-1M22) , SEC ID NO: 74 (para C-1I24) , SEC ID NO: 76 (para D-1K21) o SEC ID NO: 103 (para 9N10) y una región constante de cadena ligera lambda humana (para B-1M22 y C1I24), o un región constante de cadena ligera kappa humana (para C-9P21, D-1K21 y 9N10) . Las secuencias IgG completas de C-9P21, B-1M22, C-1I24, D-1K21 y 9N10 se muestran en la Tablas 6, 7, 8, 9 y 10, respectivamente.
Células y Cultivo Celular Las líneas celulares CCRF-CEM (leucemia linfoblástica aguda, número ATCC CCL-119) , HEK293T/17 (riñon humano, número ATCC CRL-11268) , Ramos (linfoma de Burkitt, ATCC CRL-1596) , Jurkat 6E-1 (Leucemia de célula T humana, ATCC ECACC) y DT40 (linfoma de pollo, número ATCC CRL-2111) se obtuvieron de la Colección de Cultivo de Tipo Americano (ATCC, Rockville, MD) . Las células CCRF-CEM, Ramos, Jurkat y DT40 se mantuvieron en medio de cultivo, Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) . Todas las células se mantuvieron en suero de becerro fetal, la concentración fue de 10% para células DT40 y HEK293T y 20% para las células CCRF-CEM, Jurkat y Ramos. Todos los medios se complementaron con Penicilina y Estreptomicina.
Las células Ramos y Jurkat se dividieron tres veces por semana a 3xl05 células/ml por 48 horas de cultivo y a 2xl05 células/ml durante el fin de semana.
Las células CCRF-CEM se dividieron tres veces por semana a 3xl05 células/ml por 48 horas de cultivo y a 2xl05 células/ml durante el fin de semana.
Las células HEK293T/17 se dividieron de dos a tres veces por semana a 3.2xl05 células/ml por 48 horas de cultivo y a 2.7xl05 células/ml durante el fin de semana.
Para la transfeccion temporal, las células HEK293T/17 se sembraron como 2 x 106 células en un frasco T75 (Nunc) . Después de 48 horas del sembrado, las células se transfectaron con Fugene (Roche) . Se utilizaron 40 µ? de Fugene y 16 µg de ADN por T75. Las células se utilizaron para los ensayos 48h después de la transfeccion.
Ejemplo 2; Especificidad de Unión de los Clones del ' Anticuerpo para Células que Expresan CXCR4 Los cuatro anticuerpos B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 se ensayaron al nivel de scFv para su especificidad a CXCR4 mediante su habilidad para unirse a células transfectadas con CXCR4. Las células transfectadas difieren de sus contrapartes sin transfectar solamente en la expresión de CXCR4.
Material y Métodos: Las células DT40 y HEK293T/17 se mantuvieron como se describe anteriormente .
Las células DT40+CXCR4 , HEK293+CXCR4 , DT40 y HEK293 se cosecharon de frascos de cultivo, se lavaron dos veces con PBS (400 x g, 5 min, 4°C) y se volvieron a suspender en PBS conteniendo 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3. Se alicuotaron 1 x 105 células por cavidad en placas de 965 cavidades en forma de V (Greiner Bio-One, Frikenhausen, Alemania) . Las células se centrifugaron (400 x g, 5 min, 4°C) y se volvieron a suspender en 50 µ? de ScFvs (10 pg/ml) en PBS conteniendo 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3. Después de 1 hora de incubación (4°C) , las células se lavaron tres veces con 100 µ? de PBS con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3 y tiñeron con un anticuerpo anti-cMyc de murino producido internamente (2.5 µ9/???1) . Después de 1 hora de incubación (4°C) , las células se lavaron tres veces con 100 µ? de PBS con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3 y se incubaron por 30 minutos a 4°C con IgG anti-ratón de cabra conjugado con RPE (F0479, Dako, Dinamarca) diluido a 5 µg/ml en PBS con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3. Las células se lavaron, se volvieron a suspender en 200 µ? de PBS con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3, y se transfirieron a una placa Costar de 96 cavidades en forma de U (Corning, Schiphol-Rij ik, Países Bajos) para citometría de flujo utilizando un dispositivo Easy Cyte (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) .
Resultados : Los cuatro clones mostraron unión específica a las líneas de células transíectadas, con la excepción de B-1M22 en células HEK transformadas (ver Figuras 6A y 6B) , (aunque el anticuerpo B-1M22 mostró unión específica a las células transfectadas DT40) . Se debe notar que se sabe desde hace mucho que CXCR4 tiene una tendencia a desarrollar conformaciones un tanto diferentes dependiendo de la línea de células que las expresa (Baribaud y otros, 2001) . Este hecho es probablemente la causa de diferentes resultados en las diferentes líneas de células. En estos experimentos, el clon C-9P21 fue generalmente el mejor aglutinante.
Además, como se describe más adelante, los clones 9N10, C-9P21 y F7 se ensayaron a nivel IgG para su habilidad para unirse a células que naturalmente expresan CXCR4 (Ramos, CCRF-CEM) .
Material y Métodos: Las células Ramos y CCRF-CEM se mantuvieron como se describe anteriormente.
Las células se cosecharon de frascos de cultivo, lavaron 2 veces con PBS (350 x g, 5 min, 4°C) y se volvieron a suspender en PBS conteniendo 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3. Se alicuotaron 1 x 105 células por cavidad en placas de 96 cavidades en forma de V (Greiner Bio-One, Frikenhausen, Alemania) . Las células se centrifugaron (350 x g, 5 min, 4°C) y se volvieron a suspender en 50 µ? de IgG (50 µg/ml) en PBS conteniendo 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3. La titulación se hizo en doce puntos y dilución triple. Después de 1 hora de incubación (4°C) , las células se lavaron tres veces con 150 µ? de PBS con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3 y se incubaron por 30 minutos a 4°C con IgG anti-humano de cabra conjugado con RPE (AbD seroTec #204009) diluido a 2.5 ug/ml en PBS con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3. Las células se lavaron, se volvieron a suspender en 200 µ? de PBS con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3, y transfirieron a una placa Costar de 96 cavidades en forma de U (Corning, Schiphol-Rij ik, Países Bajos) para citometría de flujo utilizando un dispositivo Easy Cyte (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) .
Resultados : En este experimento, los tres clones reconocieron las líneas celulares, en una forma dependiente de la dosis (ver Figura 6C) . F7 parece que se une ligeramente mejor a ambas líneas de células cuando se compara con 9N10 y C-9P21.
Ejemplo 3: Interferencia de Anticuerpos Anti-CXCR4 con la Unión del Ligando Los cuatro anticuerpos B-1M22, C-9P21, C-1I24, y D-1K21 se ensayaron a nivel scFv para su especificidad a CXCR4 mediante su habilidad para unirse a células transíectadas CXCR4 y a células de linfoblastoide con expresión constitutiva de CXCR4 en la presencia y ausencia de dos moléculas que específicamente se unen a CXCR4. Una molécula es SDF-1, el ligando natural para CXCR4 , la otra es AMD3100, un inhibidor competitivo' altamente específico derivado de un péptido para la unión de SDF-la a CXCR4.
Materiales y Métodos : Las células Jurkat y Ramos se mantuvieron como se describe anteriormente.
Los clones scFv se expresaron a gran escala y se purificaron como fracción de monómero mediante fraccionamiento SEC. Las líneas de células que expresan CXCR4+ natural Jurkat y Ramos se cosecharon de frascos de cultivo, se lavaron 2 veces con PBS complementado 0.2% de BSA y 0.09% de regulador de pH de NaN3 y alicuotaron a lxlO5 células por cavidad en placas de 96 cavidades en forma de V (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) . Las células se granularon por centrifugación (400 g, 5 min) y después se incubaron por 60 min a 4°C con 1 µg de SDF-la (PeproTech EC, Londres, UK) y 50 µ? de scFv diluido a 10 ug/ml en PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de regulador de pH de NaN3, ambos adicionados al mismo tiempo a las células. Una muestra sin ligado o 157 µg de AMD3100 sirvieron como control para la especificidad de CXCR4 ya que AMD3100 solamente se une a este receptor. AMD3100 se agregó simultáneamente con el scFv a las células. Los sobrenadantes se aspiraron después de un paso de centrifugación a 400 g por 5 min y las células se lavaron otras dos veces con 100 µ? de PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% NaN3 y los pasos de centrifugación (5 min a 400 g) antes de la incubación por 1 hr a 4°C con 50 µ? de anti-cMyc producido internamente diluido a 2.5 µ9/??1 en PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% NaN3. Después de lavado tres veces con PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% NaN3, las células se tiñeron con IgG anti -ratón de Cabra conjugado con rPE (BD Biosciences) diluido a 5 g/ml en PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% NaN3 y se incubaron por 30 minutos a 4°C. Las células se volvieron a lavar y se volvieron a suspender en 200 µ? de PBS con 0.2% BSA y 0.09% NaN3 y se transfirieron a una placa de 96 cavidades en forma de U (Corning) para citometría de flujo utilizando un dispositivo EasyCyte (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) .
Resultados : Tres de los cuatro clones, B-1M22 siendo la excepción, mostraron unión específica a ambas líneas de células. Los tres clones de unión también se inhiben por medio de ambos SDF-1 y AMD3100 aunque los grados de competencia son variables (ver Figura 7A (células Jurkat) y Figura 7B (células Ramos) . Esto sugiere que los clones se unen a grandes rasgos a los mismos sitios de unión que el ligando natural y pueden tener un efecto biológico. Para B-1M22, el nivel de unión es demasiado bajo para permitir testimonios de unión o competencia. Sin embargo, como se muestra en los siguientes ejemplos, B-1M22 es uno de los mejores aglutinantes descritos en la presente en la unión a CXCR4 en células CCRF-CEM (ver Ejemplos 4 y Figura 8A) . De nuevo, se cree que la tendencia de CXCR4 a desarrollar en alguna forma diferentes conformaciones que dependen de la línea celular que la expresa, es la explicación detrás de los datos obtenidos con B-1M22. Se puede observar que C-9P21 y C1I24 muestran una excelente unión a todos los tipos de células ensayadas lo que sugiere que tiene la capacidad de unirse a CXCR4 en múltiples conformaciones que pueden ser muy ventaj osas .
En un experimento más, como se describe más adelante, los tres anticuerpos 9N10, C-9P21 y F7 se ensayaron al nivel de IgG para su especificidad a CXCR4 mediante su habilidad para unirse a células CCRF-CE que naturalmente expresan CXCR4 en la presencia y ausencia de SDF-1, una molécula que específicamente se une a CXCR4.
Materiales y Métodos : CCRF-CEM se mantuvieron como se describe anteriormente .
Las células de la línea celular CCRF-CEM que expresan CXCR4+ natural se cosecharon de frascos de cultivo, se lavaron 2 veces con PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de regulador de pH de NaN3 y alicuotaron a lxlO5 células por cavidad en placas de 96 cavidades en forma de V (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) . Las células se granularon por centrifugación (350 g, 5 min) y después se incubaron por 60 min a 4°C con 4, 1, 0,5 de SDF-?a (PeproTech EC, Londres, UK) y 50 µ? de IgG diluido a 2 ug/ml en PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de regulador de pH de NaN3, ambos agregados al mismos tiempo a las células. Las muestras sin ligando sirvieron como control. Los sobrenadantes se aspiraron después del paso de centrifugación a 350 g por 5 min y las células se lavaron otras dos veces con 150 µ? de PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% NaN3 y los pasos de centrifugación (5 min a 350 g) antes de teñirse con IgG anti -humano de cabra conjugado con RPE (AbD seroTec #204009) diluido a 2.5 ug/ml en PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% NaN3 y se incubaron por 30 minutos a 4°C. Las células se volvieron a lavar y suspender en 200 µ? de PBS con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3 y se transfirieron a una placa de 96 cavidades en forma de U (Corning) para citometría de flujo utilizando un dispositivo EasyCyte (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) .
Resultados : Ambos clones, C-9P21 y 9N10 mostraron unión específica a la línea de células CCRF-CEM. Ambos clones también se inhibieron por SDF-1 (ver Figura 7C) . Se debe notar que en este experimento, F7 muestra la mejor unión a las células según juzgado por la señal absoluta más alta.
Ejemplo 4; Conversión de los Candidatos de Anticuerpo en el Formato IgG Para la comparación de la actividad biológica de los anticuerpos anti-CXCR4 identificados, se convirtieron B-1M22, C-1I24, C-9P21 y D-1K21 y 9N10 en el formato de anticuerpo IgGl de longitud completa. Como un control, se generó el anticuerpo F7. El anticuerpo F7 se describe que se une a CXCR4 (ver WO2008/060367 de Medarex) . La secuencia de las cadenas VH y VL del anticuerpo F7 son provistas en SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 29 de WO2008/060367. Con el fin de producir este anticuerpo en un formato IgGl, una secuencia de nucleótido optimizada se dedujo de la secuencia de aminoácido para el anticuerpo F7 como se describe en la patente WO2008/060367 (VH: SEC ID NO: 25 y VL : SEC ID NO: 29) . Esta secuencia después se sintetizó, se clonó en el formato IgGl/Kappa Humano como se describe por Norderhaug y otros (JIM 204:27-87, 1997), se expresó en células HEK293 células y posteriormente purificó por medio de Proteína A. Para confirmar que los IgG retuvieron su habilidad para unirse a células positivas CXCR4 , todos los IgG se evaluaron en células CCRF-CEM que expresan naturalmente CXCR4.
Materiales y Métodos : Los genes que codifican los dominios variables correspondientes se clonaron en el vector de expresión de mamífero pLNO que comprende los genes para los dominios constantes humanos (Norderhaug y otros, supra) .
Los anticuerpos se expresaron en una fábrica de células, y la primera cosecha se purificó en una columna de proteína A y fraccionó en un monómero mediante cromatografía de exclusión de tamaño.
La línea de células CCRF-CEM que expresa CXCR4+ natural se cosechó de frascos de cultivo, se lavó 2 veces con PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de regulador de pH de NaN3 y alicuotó a lxlO5 células por cavidad en placas de 96 cavidades en forma de V (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) . Las células se granularon por centrifugación (400 g, 5 min) y después se incubaron por 60 min a 4°C con 50 µ? de IgG diluido a 10 g/ml en PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de regulador de pH de NaN3. Los sobrenadantes se aspiraron después del paso de centrifugación a 400 g por 5 min y las células se lavaron otras dos veces con 100 µ? de PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% NaN3 , cada lavado fue seguido por un paso de centrifugación (5 min a 400 g) . Despüés, las células se tiñeron por 30 minutos a 4°C con 50 µ? de IgG anti-huraano de Cabra conjugado con rPE (AbD Serotec) diluido a 5 µg/ml con PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% NaN3 y se incubaron por 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron y suspendieron de nuevo en 200 µ? de PBS con 0.2% BSA y 0.09% NaN3 y se transfirieron a una placa de 96 cavidades en forma de U (Corning) para citometría de flujo utilizando un dispositivo EasyCyte (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) .
Resultados : Todos los clones ensayados retuvieron su capacidad para unirse a células positivas CXCR4 (ver Figura 8A para C-1124 y B-1M22 y Figura 8B para D-1K21 y C-9P21; los datos para 9N10 no se muestran) . También se puede notar de las curvas de EasyCyte de la Figura 8 que en estos experimentos los clones descritos en la presente muestra una significativamente mejor unión a células CCRF-CEM que expresan CXCR4 que el anticuerpo F7 (valores medios 48.11 (F7) , 179.03 (D-1K21), 626.43 (C-9P21) , .910.58 (C-1I24) y 1077.33 (B-1H22) comparado con 3.11 (control negativo con PBS) .
Ejemplo 5 : Reactividad Cruzada de las Especies Los candidatos de anticuerpo se ensayaron a nivel scFv para su habilidad para reaccionar de forma cruzada con CXCR4 de mono y ratón.
Materiales y Métodos : Las células HEK293T/17 se mantuvieron como se describe anteriormente.
Se realizaron análisis de unión FACS (EasyCyte) utilizando células HEK-293 temporalmente transíectadas con plásmidos que codifican CXCR4 ya sea de ratón (número de acceso a Gene bank BC031665) o de mono (Macaca mulatta) (número de Acceso NCBI NP_001036110 ) . Se . realizaron dos experimentos, uno utilizando el anticuerpo IgG anti -ratón de cabra marcado con a-cMyc y PE, el segundo utilizando un anticuerpo RPE-c-Myc directamente conjugado para la detección. Además, se analizó la reactividad cruzada a nivel IgG. En el último caso, se detectó la unión del anticuerpo con el anticuerpo IgG anti -humano de cabra conjugado con PE.
Resultados : D-1K21 mostró una buena reactividad cruzada en ambos CXCR4 de ratón y de mono. Las variantes scFv, B-1M22, C-9P21 y C-1I24 también mostraron buena reactividad cruzada con el antígeno de mono pero de baja (B-1M22) a intermedia (C-1I24, C-9P21) reactividad con CXCR4 de ratón. (Ver Figura 9) . 9N10 también se ensayó, y mostró que tiene el mismo patrón de reactividad cruzada como C-9P21, con valores absolutos ligeramente superiores para la unión.
Ejemplo 6: Inhibición de la Señalización Inducida por Ligando a Través de CXCR4 Los anticuerpos anti-CXCR4, B-1M22, C-1I24, C-9P21 y D-1K21 se ensayaron en ambos niveles scFv y IgG para su habilidad para influenciar el flujo Ca++ inducido por el ligando SDF-?a. 9N10 solamente se ensayó al nivel IgG. El experimento se realizó utilizando la línea de células CCRF-CEM positivas CXCR4+ natural.
En un primer paso se determinaron las concentraciones óptimas del anticuerpo por titulación de los anticuerpos en las células CCRF-CEM.
Materiales y Métodos : Las células CCRF-CEM se mantuvieron como se describe anteriormente.
La línea de células CCRF-CEM que expresan CXCR4+ natural se cosechó de frascos de cultivo, se lavó dos veces con PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de regulador de pH de NaN3 y alicuotaron a lxlO5 células por cavidad en placas de 96 cavidades en forma de V (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) . Las células se granularon por centrifugación (400 g, 5 min) y después se incubaron por 60 min a 4°C con 50 µ? de IgG diluidos a una concentración inicial de 10 ug/ml y además se titularon a diluciones dobles 11 veces en PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de regulador de pH de NaN3. Los sobrenadantes se aspiraron después del paso de centrifugación a 400 g por 5 min y las células se lavaron otras dos veces con 100 µ? de PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3, cada lavado fue seguido por un paso de centrifugación (5 min a 400 g) . Después, las células se tiñeron por 30 minutos a 4 °C con 50 µ? de IgG anti -humano de cabra conjugado con rPE (AbD Serotec) diluido a 5 µg/ml con PBS complementado con 0.2% de BSA y 0.09% de NaN3 y se incubaron por 30 minutos a 4°C. Las células se volvieron a lavar y suspender en 200 µ? de PBS con 0.2% BSA y 0.09% de NaN3 y se transfirieron a una placa de 96 cavidades en forma de U (Corning) para citometría de flujo utilizando un dispositivo EasyCyte (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) .
Resultados : Como un resultado, las concentraciones de los anticuerpos determinadas para utilizarse en el experimento de competencia fueron de 10 g/ml o 100 g/ml para los IgG (con la excepción de 9N10 en donde las concentraciones fueron de 1 ug/ml o 10 µ9/??1) (datos no mostrados) y 4 µ9/??1 para los scFv (ver Figura 10) .
Después de identificar las concentraciones correctas, se realizó el experimento de competencia actual.
Materiales y Métodos : Las células objetivo CCRF-CEM, se cosecharon por centrifugación y se lavaron dos veces en medio de cultivo RPMI-1640. Se mezcló ya sea 1 mi con 2.5xl06 células (para los IgG) o 10 mi con 2.5xl07 células (para los scFv) con Fluo-4-?? (acetoximetil éster; Invitrogen) , Plurónico F-127 (Invitrogen) y Probenecid a concentraciones finales de 1 µ?, 0.02% y 1 mM respectivamente. Las células se incubaron a 37°C por 60 min en una rueda giratoria vertical (7 rpm) . Todos los pasos posteriores se hicieron en la presencia de 1 mM de Probenecid. Las células se lavaron dos veces en RPMI-1640 con 10% de suero de becerro fetal (FCS) , una vez en un regulador de pH de ensayo (145 mM de NaCl, 4 mM d KC1 , 1 mM de NaH2P04, 0.8 mM de MgCl2, 25 mM de Hepes, 22 mM de glucosa) y después se volvieron a suspender a una densidad final de 4x10 células/ml. Se mezclaron volúmenes iguales de células, regulador de pH de ensayo con o sin anticuerpos y ligando (SDF-la) . Los primeros dos componentes (células y anticuerpos) se pre-incubaron por 15 min antes de la adición del ligando, SDF-la (concentración final 50 ng/ml) . Las concentraciones finales del anticuerpo fueron 10 µg/ml o 100 µg/ml para los IgG y 4 ug/ml para los scFv. Las muestras se analizaron inmediatamente utilizando el filtro de paso de banda de 515-545 nm en un a FACSCanto II (BD Biosciences) . Las áreas bajo las curvas (AUC) se integraron utilizando el software Prism (GraphPad) y graficaron como porcentaje de AUC para estimulación máxima con SDF-la solo.
Resultados : Al nivel de scFv, se demostró la actividad antagónica mediante las variantes C-9P21 y D-1K21. C-1I24 desplegó también algo de efecto antagónico. No se demostró actividad por medio de B-1M22 (Figura 11A) .
Al nivel de IgG, la inhibición de la señalización inducida por SDF-la se demostró en cuatro de cinco anticuerpos ensayados: B-1M22, C-1I24, C-9P21 y .9N10 (Figura 11B, C, D y E) . Por razones desconocidas, la variante D-1K21 parece ser solamente marginalmente inhibidora a una alta concentración en el formato IgG.
Además, · ninguno de los anticuerpos fue capaz de inducir la señalización por sí mismo, es decir, los anticuerpos no mostraron actividad antagónica (datos no mostrados) .
En conclusión, se demostró que todos los anticuerpos desplegaron un efecto antagónico en la señalización de Ca++ inducida por la unión de SDFIOÍ a CXCR4. C-9P21 y 9N10 tuvieron el efecto más prominente.
En un experimento más, se ensayó 9N10 al nivel de IgG para la habilidad para reducir el flujo de calcio inducido por ligando en comparación con C-9P21.
Material y Métodos: El experimento se realizó como se describe anteriormente, pero los anticuerpos se utilizaron en una serie de titulación con concentraciones de 100, 20, 4, 0.8, 0.16, 0.032, 0.064 y 0.00128 µg/ml.
Resultados : Los resultados mostraron que 9N10 es aproximadamente ocho veces más eficiente en la inhibición del flujo de Calcio con un IC50 (nM) de 3.85 comparado con un IC50 (nM) de 29 para C-9P21 (ver Figura 12A y Figura 12B) .
Ejemplo 7: Inhibición de la Migración de Célula Inducida por Ligando La habilidad de scFv C-9P21 para reducir la migración celular inducida por ligando se evaluó en la línea' de células CCRF-CEM CXCR4+. El fragmento scFv anti-GFP se utilizó como un control negativo y el anticuerpo anti-cMyc se utilizó para el entrelazamiento de ambos scFv para imitar el efecto de los anticuerpos en el formato IgG.
Materiales y Métodos: Las células CCRF-CEM se mantuvieron como se describe anteriormente.
Las células objetivo CCRF-CEM se sedimentaron por centrifugación y se lavaron dos veces en medio de cultivo RPMI-1640 sin FCS . La densidad celular después se ajustó a lxlO6 células/ml y 60 mi de esta suspensión se mezcló con 38 µ? de BATDA [bis (acetoximetil) 2 , 2 ' : 61 , 21 ' -terpiridin-6 , 61 1 -dicarboxilato] (Perkin Elmer, altham, MA) . Las células se incubaron con BATDA a 37°C por 20 min con mezclado invirtiendo delicadamente el recipiente cada 10 min. Las células se lavaron tres veces en RPMI-1640 con 20% de FCS, y después se volvieron a suspender en RPMI-1640/20% de FCS a una densidad final de 2xl07 células/ml. Las células marcadas se mezclaron con un volumen igual de medio conteniendo 10% de FCS, el anticuerpo anti-c-myc (clon 9E10) y diluciones seriales de 1/2 de scFv C-9P21, de esta forma resultando en concentraciones de anticuerpo finales de 20 ug/ml y 32 ug/ml a 16 ng/ml para IgG anti-cMyc y scFv C-9P21, respectivamente. El scFv anti-GFP se utilizó a 32 g/ml como un control negativo en combinación con 20 g/ml del anticuerpo anti-cMyc. En paralelo, 30 µ? de RPMI conteniendo 0.15 nM del ligando SDF-?a se agregaron en un compartimiento inferior de una placa de cámara Boyden de 96 cavidades ChemoTX (Neuro Probé, Gaithersburg, MD) . Las células marcadas con BATDA recubiertas con 50 µ? del anticuerpo después se agregaron al compartimiento superior de la placa de cámara de 96 cavidades ChemoTX y se incubaron en la presencia a 37°C por 2.5 hr . Las células arriba del filtro después de removieron y el filtro se lavó con PBS seguido por centrifugación de la placa para recolectar todas las células en la cámara inferior antes de remover el filtro. La placa después se invirtió en la parte superior de una placa en forma de V seguido por centrifugación. Las células en la placa en forma de V se lavaron con 100 µ? de PBS, sedimentaron por centrifugación y se volvieron a suspender en 35 µ? de PBS con 1.3% de Tritón X-100. Las muestras se transfirieron a una placa de microtitulación de 906 cavidades negra, se mezclaron con 200 µ? de Solución de Europio (Perkin Elmer) , y analizaron por emisión de fluorescencia (excitación a 340 nm, emisión a 613 nm, tiempo de retraso 0.4 ras y tiempo de integración 0.4 ras) utilizando un lector de placas TECAN M200. Para cada concentración del anticuerpo, la proporción de señales en la presencia/ausencia de scFv y el porcentaje de inhibición de la migración se calcularon. Los datos se graficaron y analizaron mediante la adaptación de la curva de regresión no lineal utilizando el modelo de "log (inhibidor) frente a respuesta" del software Prism (GraphPad) .
Resultados : Los datos demuestran la inhibición de la quimiotaxis inducida por SDF-1 de células CCRF-CEM en la presencia de anti-CXCR4 scFv C-9P21 (ver Figura 13) . Bajo estas condiciones, se calculó el valor JC50 (concentración del anticuerpo que conduce a 50% de inhibición de la migración celular) como 2.9 ug/ml y se obtuvo una inhibición del 100% a una concentración de scFv de 20 µg/ml. El fragmento scFv anti-GFP (control negativo) no mostró inhibición de la migración celular (datos no mostrados) .
De esta forma, el anticuerpo C-9P21 en un formato scFv inhibe la migración inducida por ligando de células CXCR4+ CCRF-CEM con un valor IC50 de 2.9 vg/ml (-100 nM) y demuestra 100% de inhibición a 20 ug/ml (0.7 µ?) .
Ejemplo 8: Inducción de la Citotoxicidad Celular Dependiente del Anticuerpo (ADCC) Un mecanismo potencial a través del cual un anticuerpo puede ser terapéuticamente útil es la habilidad para mediar la ADCC de células objetivo que expresan CXCR4 , si se aniquila la célula objetivo es el modo preferido de acción. Esto se ensayó utilizando células CCRF-CEM que se derivan de linfoma de célula T y tienen expresión constitutiva de CXCR . Los anticuerpos seleccionados se ensayaron ambos como fragmentos scFv entrelazados con el anticuerpo anti-cMyc y como anticuerpos IgGl completamente humanos .
Materiales y Métodos : Las células CCRF-CEM se mantuvieron como se describe anteriormente.
Las células CCRF-CEM objetivo, se sedimentaron por centrifugación y lavaron dos veces en medio RPMI-1640. Se mezclaron 2.5xl06 células/ml con calceína-AM (Invitrogen) a una concentración final de 10 µ? e incubaron a 37°C por 30 min. Las células se lavaron tres veces en medio RPMI-1640 complementado con 10% de FCS y la densidad celular se ajustó a 3xl05 células/ml. Se prepararon PBMC humanos de sangre fresca del donador mediante centrifugación de gradiente de densidad Lymphoprep (Axis-Shield, Liverpool, UK) , se lavaron RPMI-1640/10% de FCS y almacenaron congelados en RPMI con 10% de FCS y 10% de DMSO a una densidad de 3xl07 células/ml en nitrógeno líquido. Las células efectoras se descongelaron en el día del experimento, se lavaron en RPMI con 10% de FCS y volvieron a suspender a una densidad de 6xl06 células/ml. Se mezclaron 50 µ? de cada célula objetivo y efectora en las mismas cavidades de una placa de microtitulación de 96 cavidades, de esta forma proveyendo una proporción de célula efectora-a-objetivo (E:T) de 20:1. Los anticuerpos en formato IgGl se agregaron a las mismas cavidades en un volumen de 100 µ? dando como resultado un intervalo de concentración de 0.8 a 1000 ng/ml . Por consiguiente, los fragmentos scFv se agregaron en 20 µ? en volumen para concentraciones finales de 2.5 a 5xl04 ng/ml, después de haber sido pre-mezcladas con un exceso (20 ug/ml) del anticuerpo IgGl anti-cMyc quimérico (variable de ratón/constante humana) (derivado del hibridoma 9E10) . La placa de microtitulación se incubó por 4 .hrs a 37°C. Después de 3 hrs y 45 min de incubación, se agregaron 20 µ? de 0.9% de Triton-X100 a las cavidades de control para lograr la lisis completa de las células objetivo (lisis máxima) . Después se transfirieron 100 µ? de sobrenadante de cada muestra a una placa de microtitulación negra y se registraron la fluorescencia (excitación a 488 nm, emisión a 518 nm) utilizando un lector de placas TECA M200. Cada experimento se llevó a cabo por cuadriplicado. La intensidad de fluorescencia de las muestras sin anticuerpos se sustrajo como un fondo y se calculó el porcentaje de la lisis específica en las muestras con anticuerpos. Las curvas de dosis-respuesta se calcularon mediante análisis de regresión no lineal y un modelo de adaptación de tres parámetros utilizando el software Prism (GraphPad) .
Resultados : Los resultados mostrados en la Figura 14 demuestran que todos los anticuerpos anti-CXCR4 ensayados fueron incapaces de inducir ADCC tanto como scFv e IgG de longitud completa en la presencia de PBMC humanos con una aniquilación máxima alcanzando el 100%. Los scFv e IgG ensayados pueden clasificarse a su aniquilación máxima como sigue: C-9P21 > D-1K21 (scFv) ; y B-1M22 > C-1I24 ~ C-9P21 > D-1K21 (IgG) (ver también la Tabla A) .
Tabla A. Actividad ADDC Comparativa de los Anticuerpos anti-CXCR4 Ensayados anticuerpos .
ND, no hecho De esta forma, todos los anticuerpos anti-CXCR4 ensayados demostraron actividad ADCC frente a células CCRF-CEM, B-1M22 y C-9P21 demostrando la aniquilación celular máxima mayor .
Ejemplo 9; Inducción de Citotoxicidad Celular Dependiente del Complemento (CDC) Para ensayar si los IgG anti-CXCR4 descritos en la presente son capaces de mediar la citotoxicidad dependiente del complemento, se han realizado experimentos CDC utilizando células Ramos que se derivan de linfoma de célula B de Burkitt y tiene expresión constitutiva de CXCR4.
Materiales y Métodos: Las células Ramos se mantuvieron como se describe anteriormente .
La habilidad de los IgG B-1M22, C-1I24, C-9P21 y D- 1K21 para inducir CDC se evaluó en la línea de células Ramos CXCR4+ natural. Las células Ramos, se sedimentaron por centrif gación y lavaron dos veces en medio de cultivo RPMI- 1640. Se mezclaron 2.5x106 células/ml con calceína-AM (Invitrogen) a una concentración final de 10 µ? y después se incubaron a 37°C por 30 min. Las células se lavaron tres veces en RPMI-1640 con 10% de FCS y la densidad celular se ajustó a 4x106 células/ml. Una alícuota de 25 µ? células objetivo marcadas y 25 µ? de suero humano se mezclaron en las cavidades de una placa de microtitulación de 96 cavidades. Las diluciones de los anticuerpos (todos en el formato IgG) se agregaron a las mismas cavidades en 50 µ? en volumen de esta forma resultando en una concentración de anticuerpo final de 5x10-5 a 5x104 ng/ml . Se agregaron 20 µ? de 0.9% de Triton-X100 a las cavidades de control para obtener la lisis ' completa de las células objetivo (definiendo una lisis máxima de 100%) . La placa de microtitulación se incubó por 1 hr a 37°C. Se agregaron 100 µ? de RPMI-1640 con 10% de FCS a todas las cavidades por centrifugación y se transfirieron 100 µ? de sobrenadante de cada muestra a una placa de microtitulación negra. Se registró la fluorescencia (excitación a 488 nra, emisión a 518 nm) utilizando un lector de placas TECAN M200. Cada experimento se llevó a cabo por cuadriplicado. La intensidad de fluorescencia de las muestras sin anticuerpos se sustrajo como un fondo y el porcentaje de la lisis específica en las muestras con anticuerpos se calculó. Las curvas de dosis-respuesta se calcularon mediante análisis de regresión no lineal y un modelo de adaptación de tres parámetros utilizando el software Prism (GraphPad) .
Resultados : Los resultados mostrados en la Figura 15A y la Figura 15B demostraron que el anticuerpo C-1I24 fue capaz de inducir CDC en presencia de suero humano. C-1I24 mostró un valor EC50 de 0.7 µg/ml y una aniquilación máxima de 100%. También se observó algo de actividad CDC para la variante B-1M22, sin embargo, solamente a una muy alta concentración (100 g/ml) . F7 se utilizó como un anticuerpo de control positivo .
De esta forma, de los anticuerpos descritos en la presente, dos anticuerpos, C-1I24 y B-1M22, demostraron actividad CDC contra células Ramos. C-1I24 mostró una ' actividad CDC superior.
Ejemplo 10; Inducción de Apoptosis La habilidad de los anticuerpos anti-CXCR4 para inducir apoptosis se evaluó en la línea de células Ramos CXCR4+ .
Materiales y Métodos: Las células Ramos se cultivaron como se describe anteriormente .
Las células Ramos se cosecharon por centrifugación, lavaron dos veces en medio de cultivo RPMI-1640 con 10% de FCS y se volvieron a suspender en medio RPMI-1640 con 10% de FCS a una densidad de 3xl05 células/ml . La suspensión celular (250 µ?) se mezcló con el mismo volumen de cualquier anticuerpo a ser ensayados en diluciones (concentración final de 0.08 a 10 g/ml) o estaurosporina (25 nM) en cavidades de una placa de 24 cavidades e incubaron a 37°C por 48 hrs . Las células se recolectaron por centrifugación y lavaron en Regulador de pH de Unión de Anexina V (10 mM de Hepes, 140 mM de NaCl , 2.5 mM de CaCl2, 0.2% de BSA, pH 7.4) . Las células se cosecharon de nuevo y se volvieron a suspender en 300 µ? de Regulador de pH de Unión de Anexina V. Ambos, la Anexina V y el yoduro de propidio conjugados con FITS (PI) se . mezclaron en una suspensión celular de 240 µ? resultando en una concentración final de PI de 0.2 ug/ml . Las muestras se analizaron inmediatamente después de agregar el ligando utilizando los filtros de paso de banda de 515-545 nm y 610/20 nm en un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences) . Las células apoptóticas se definieron como positivas para Anexina V / negativas para PI y las células muertas se definieron como positivas para PI .
Resultados : Los resultados presentados en la Figura 16A (B-1M22, C-1I24, C-9P21 y D-1K21) demostraron que no se indujo apoptosis por arriba del nivel de fondo (nivel de control negativo, marcado como 0 en la Figura 16A, en la presencia de los anticuerpos B-1M22, C-1I24, C-9P21, y D-1K21. En contraste, el F7 IgGl de control indujo apoptosis en todas las concentraciones utilizadas en el ensayo. Los resultados presentados en la Figura 16B demuestran que los anticuerpos C-9P21 y 9N10 no inducen apoptosis significativa.
De esta forma, estos resultados demuestran que los anticuerpos descritos en la presente no inducen la apoptosis de células CXCR4 -positivas , que pueden proveer un perfil de efectos secundarios potencialmente superior en comparación con F7.
Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5 SEC ID NO: 91 es idéntica a SEC ID NO: 25 SEC ID NO: 85 es idéntica a SEC ID NO: 1 SEC ID NO: 92 es idéntica a SEC ID NO: 26 SEC ID NO: 86 es idéntica a SEC ID NO: 2 SEC ID NO: 93 es idéntica a SEC ID NO: 27 SEC ID NO: 87 es idéntica a SEC ID NO: 3 SEC ID NO: 94 es idéntica a SEC ID NO: 28 SEC ID NO: 99 es idéntica a SEC ID NO: 33 SEC ID NO: 102 es idéntica a SEC ID NO: 69 SEC ID NO: 104 es idéntica a SEC ID NO: 77 'Tabla 6 Secuencias IgG de C-9P21 Tabla 7 Secuencias IgG de B-1M22 Tabla 8 Secuencias IgG de C-1I24 Tabla 9 Secuencias IgG de D-1K21 Tabla 10 Secuencias IgG de 9N10 Tabla 11 REFERENCIAS Las siguientes referencias, al grado en el que proporcionan un procedimiento ilustrativo u otros detalles complementarios para los presentados en la presente, se incorporan específicamente en la presente por referencia.
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (56)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un anticuerpo aislado caracterizado porque se une al receptor 4 de quimiocina CXC (CXCR4) y que no induce la apoptosis significativa de células que expresan CXCR4.
2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque no induce la apoptosis significativa de células que expresan CXCR4 si se utiliza a una concentración de =0.4 µg/ml.
3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque es capaz de inhibir la unión de un ligando a CXCR4 , o es capaz de inhibir la migración de células inducida por ligando que expresan CXCR4, o es capaz de inhibir el flujo de calcio inducido por ligando en células que expresan CXCR4.
4. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de S/G Y X3 M/l H/S (SEC ID NO: 126) , o ?? Y X3 M H (SEC ID NO: 127) o S Y X3 M H (SEC ID NO: 128) ; en donde Xi puede ser S o G, preferiblemente S; X3 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente G o W o Y o A, más preferiblemente W; (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de X± I X3 X D G S X8 X9 Xio Y A D S V K G (SEC ID NO: 129) ; en donde Xi, puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente V o R, más preferiblemente R; X3 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente S o N, más preferiblemente N; X4 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente Y o S, más preferiblemente S; X8 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente N o S, más preferiblemente S; X9 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente K o T, más preferiblemente T; y X10 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente Y o S, más preferiblemente S; o una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de Xi I X3 P X5 X6 G X8 X9 N Y A Q K F Q G (SEC ID NO: 131) ; en donde Xi, puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente R o G, más preferiblemente R; X3 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente N o I, más preferiblemente N; X5 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente N o I, más preferiblemente N; X6 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente S o F, más preferiblemente S; X8 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente G o T, más preferiblemente G; y X9 puede ser cualquier aminoácido, preferiblemente T o A, más preferiblemente T; y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NOs : 3, 9, 15 o 21 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene 1, 2 ó 3 sustituciones de aminoácido comparada con la secuencia CDR dada, o en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene sustituciones de aminoácido conservadoras de. la secuencia CDR dada.
5. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y/o en donde la región variable de cadena ligera comprende : (iv) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 4 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (v) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO : 5 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (vi) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 6 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene 1, 2 ó 3 sustituciones de aminoácido comparada con la secuencia CDR dada, o en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene sustituciones de aminoácido conservadoras de la secuencia CDR dada; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR .
6. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 7 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 8 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 9 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y/o en donde la región variable de cadena ligera comprende : (iv) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 10 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (v) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 11 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (vi) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 12 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene 1, 2 ó 3 sustituciones de aminoácido comparada con la secuencia CDR dada, o en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene sustituciones de aminoácido conservadoras de la secuencia CDR dada; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
7. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 13 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 14 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y/o en donde la región variable de cadena ligera comprende : (iv) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 16 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (v) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 17 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (vi) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 18 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; en donde tal secuencia sustancialmente homólog.a es una secuencia que contiene 1, 2 ó 3 sustituciones de aminoácido comparada con la secuencia CDR dada, o en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene sustituciones de aminoácido conservadoras de la secuencia CDR dada; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
8. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 19 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 20 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 21 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y/o en donde la región variable de cadena ligera comprende : (iv) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 22 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (v) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 23 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (vi) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 24 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene 1, 2 ó 3 sustituciones de aminoácido comparada con la secuencia CDR dada, o en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene sustituciones de aminoácido conservadoras de la secuencia CDR dada; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
9. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque (a) comprende por lo menos una región variable de cadena pesada que comprende tres CDR y por lo menos una región variable de cadena ligera que comprende tres CDR, en donde la región variable de cadena pesada comprende : (i) una CDR1 pesada variable (VH) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 1 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (ii) una CDR2 VH que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 2 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (iii) una CDR3 VH que tiene la secuencia de . aminoácido de SEC ID NO : 3 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y/o en donde la región variable de cadena ligera comprende : (iv) una CDR1 ligera variable (VL) que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 88 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; (v) una CDR2 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 89 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; y (vi) una CDR3 VL que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 90 o una secuencia sustancialmente homologa a la misma; en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene 1, 2 ó 3 sustituciones de aminoácido comparada con la secuencia CDR dada, o en donde tal secuencia sustancialmente homologa es una secuencia que contiene sustituciones de aminoácido conservadoras de la secuencia CDR dada; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
10. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porque comprende uno de cada uno de los dominios CDR VH (i), (ii) y (iii), y uno de cada uno de los dominios CDR VL (iv) , (v) y (vi) .
11. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o 5, caracterizado porque (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 69 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o un dominio VL de SEC ID NO: 70' o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
12. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, o 6, caracterizado porque (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 71 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o un dominio VL de SEC ID NO: 72 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
13. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, o 7, caracterizado porque (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 73 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o un dominio VL de SEC ID NO: 74 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
14. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación l,.u 8, caracterizado porque (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 75 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o un dominio VL de SEC ID NO: 76 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
15. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 o 9, caracterizado porque (a) tiene un dominio VH de SEC ID NO: 69 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o un dominio VL de SEC ID NO: 103 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo; o (b) es un anticuerpo que puede competir con el anticuerpo (a) para la unión a CXCR4.
16. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 15, caracterizado porque (b) puede unirse sustancialmente al mismo epítopo como tal anticuerpo (a) .
17. Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es un anticuerpo humano, preferiblemente un anticuerpo completamente humano.
18. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque comprende todo o una porción de una región constante de cadena pesada del anticuerpo y/o una región constante de cadena ligera del anticuerpo.
19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque es un anticuerpo IgG, preferiblemente un anticuerpo IgGl.
20. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 108 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 109 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo.
21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 112 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 113 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo.
22. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 116 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 117 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo.
23. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18 o n 19, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 120 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 121 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo.
24. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18 o 19, caracterizado porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 124 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo, y/o una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 125 o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo.
25. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque es un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo.
26. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el fragmento de unión a antígeno de tal anticuerpo es un Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpo de dominio individual, dímero TandAbs , Fv, scFv, dsFv, ds-scFv, Fd, anticuerpo lineal, minicuerpo, diacuerpo, fragmento de anticuerpo biespecífico, bicuerpo, tricuerpo, sc-diacuerpo, cuerpo kappa ( lambda) , BiTE, DVD-Ig, SIP, SMIP, DART o un mimético de anticuerpo pequeño que comprende uno o más CDR.
27. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizado porque se une a por lo menos un segundo agente de diagnóstico o terapéutico.
28. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque se une a por lo menos un agente radioterapéutico, agente quimioterapéutico, agente anti -agiogénico, agente inductor de apoptosis, fármaco anti-tubulina, agente anti-celular o citotóxico, esteroide, antagonista de citocina, inhibidor de expresión de citocina, antagonista de quimiocina, inhibidor de expresión · de quimiocina, inhibidor ATPase, agente antiinflamatorio, inhibidor de la trayectoria de señalización, agente anticancerígeno, otros anticuerpos, agente coagulante o anti-vírico, en donde el agente anti-vírico preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de un nucleósido, inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido, inhibidor de transcriptasa inversa de no de nucleósido y un inhibidor de proteasa.
29. Un inmunoconjugado caracterizado porque comprende el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28 acoplado a por lo menos un segundo agente terapéutico o de diagnóstico.
30. Una composición caracterizada porque comprende al menos un primer anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28 o uno de sus inmunoconjugados , en donde la composición es preferiblemente una composición farmacéuticamente aceptable..
31. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque además comprende al menos un segundo agente terapéutico.
32. Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una región de la secuencia de nucleótido que codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28.
33. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque comprende la región de la secuencia de nucleótido que tiene la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 34, SEC ID NO: 45, SEC ID NO: 56, SEC ID NO: 67 o SEC ID NO: 100, o una secuencia que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el mismo.
34. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 32 ó 33.
35. Una célula hospedera caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 32 ó 33 o el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 34.
36. Un virus caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 32 ó 33 o el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 3 .
37. Un kit caracterizado porque comprende, en al menos un primer envase : (a) el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28; (b) el inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 29; (c) la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-31; (d) la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 ó 33; (e) el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 34; (f) la célula hospedera d e conformidad con la reivindicación 35; o (g) el virus de conformidad con la reivindicación 36.
38. Un método para producir un anticuerpo, caracterizado porque comprende: (a) cultivar una célula hospedera que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 34 bajo condiciones efectivas para expresar el anticuerpo codificado; y (b) obtener el anticuerpo expresado de tal célula hospedera.
39. Un método para ' la unión de CXCR4 , caracterizado porque comprende poner en contacto una composición que comprende CXCR4 con el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, o uno de sus inmunoconjugados .
40. Un método para detectar CXCR4 , caracterizado porque comprende poner en contacto una composición que se sospecha que comprende CXCR4 con el anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, o uno de sus inmunoconjugados , bajo condiciones efectivas para permitir la formación de complejos entre el CXCR4 y tal anticuerpo y detectar los complejos asi formados.
41. Un método para diagnosticar asociada con la expresión de CXCR4 en un animal, caracterizado porque comprende el paso de : (a) poner el contacto una muestra de prueba tomada de tal animal con un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28 o uno de sus inmunoconjugados ; opcionalmente (b) medir o detectar la presencia y/b cantidad y/o ubicación del complejo de anticuerpo-antígeno en la muestra de prueba; y, opcionalmente (c) comparar la presencia y/o cantidad del complejo de anticuerpo-antígeno en la muestra de prueba con un control
42. El método de conformidad con la reivindicación* 41, caracterizado porque la muestra de prueba se aisla del animal y se pone en contacto con tal anticuerpo o inmunoconjugado in vitro.
43. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el anticuerpo o inmunoconjugado se administran al animal, por lo tanto poniendo el contacto la muestra de prueba in vivo.
44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-43, caracterizado porque la enfermedad asociada con la expresión de CXCR4 es una enfermedad mediada por CXCR4 , o una enfermedad tipificada por la proliferación aberrante de células CXCR4+, o una enfermedad tipificada por la sobre-expresión de CXCR .
45. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-43, caracterizado porque la enfermedad es cáncer, cáncer metastático, invasión de órganos por células cancerígenas, enfermedades asociadas con angiogénesis , una enfermedad inflamatoria o inmunitaria, un trastorno auto-inmunitario tal como artritis reumatoide, infección viral tal como infección por VIH, o una afección en donde se desea movilizar células madre de la médula espinal con el fin de restaurar el sistema inmunitario.
46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-45, caracterizado porque una cantidad aumentada de CXCR4 en tal muestra de prueba es el diagnóstico de tal enfermedad.
47. Un método para tratar una enfermedad q actividad asociada con la expresión de CXCR4 en un animal, caracterizado porque comprende administrar a un animal con la enfermedad, una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, o uno de sus inmunoconjugados .
48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la enfermedad asociada con la expresión o actividad de CXCR4 es una enfermedad mediada por CXCR4 , o una enfermedad tipificada por la proliferación aberrante de células CXCR4+, o una enfermedad tipificada por la sobre -expresión de CXCR4.
49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 48, caracterizado porque la enfermedad es cáncer, cáncer metastático, invasión de órganos por células cancerígenas, enfermedades asociadas con angiogénesis , una enfermedad inflamatoria o inmunitaria, un trastorno auto- inmunitario tal como artritis reumatoide, una infección viral tal como infección por VIH, o una afección en donde se desea movilizar células madres de la médula espinal con el fin de restaurar el sistema inmunitario.
50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47-49, caracterizado porque el anticuerpo o uno de sus inmunoconj ugados causa uno o más de los siguientes: (a) inhibición de la unión de CXCR4 a por lo menos SDF-1; (b) inhibición de las . respuestas celulares mediadas por CXCR4 a un ligando CXCR4 , preferiblemente la inhibición de la liberación de los iones de calcio en respuesta a un ligando CXCR4 , o para inhibir la migración de células inducida por el ligando que expresan CXCR4 ; (c) inducción de ADCC de células CXCR4+; (d) inducción de efectos ant itumorales in vivo; (e) inducción de CDC de células CXCR4+; (f) inhibición de la formación de metástasis causada por un cáncer existente; . g) inhibición de células cancerígenas que invaden nuevos órganos ; (h) inhibición de la atracción de células CXCR4+ a la estroma de tumor, y/o activación de tales células para crear un micro-entorno favorable para el tumor; (i) sensibilizar las células tumorales para el tratamiento con otros compuestos terapéuticamente efectivos ..
51. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47-50, caracterizado porque además comprende administrar un segundo agente terapéutico al animal .
52. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-51, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo bivalente o polivalente que comprende al menos dos fragmentos de unión a antígeno de tal anticuerpo.
53. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 41-52, caracterizado porque el animal es un sujeto humano.
54. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, o uno de sus inmunoconjugados , para usarse en terapia, formación de imágenes o diagnóstico.
55. El anticuerpo o inmunoconj ugado de conformidad con la reivindicación 54, para usarse en terapia, formación de imágenes o diagnóstico de una afección asociada con la expresión o actividad de CXCR4.
56. El anticuerpo o inmunocon ugado de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la enfermedad es como se define de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 48 o 49.
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