MX2012006952A - Polipeptido de fusion contra tumor inducido por virus eb y mutante de colicina ia. - Google Patents
Polipeptido de fusion contra tumor inducido por virus eb y mutante de colicina ia.Info
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Abstract
La presente invención proporciona un polipéptido de fusión contra tumor inducido por virus EB, que comprende un anticuerpo o un anticuerpo mimético contra el virus EB y una colicina que forma canales iónicos seleccionada de E1, Ia, Ib, A, B, N y sus mutantes. La presente invención también proporciona un mutante de colicina Ia, que comprende mutaciones de G11A, H22G, A26G, V31L y H40D. La presente invención también proporciona un gen, un vector, un método de preparación y el uso del polipéptido de fusión, y proporciona un gen y el uso del mutante.
Description
POLIPÉPTIDO DE FUSIÓN CONTRA TUMOR INDUCIDO POR VIRUS EB
Y MUTANTE DE COLICINA IA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al campo de los agentes antitumorales , y más específicamente, a un polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB y al uso y al método de preparación del mismo.
TÉCNICA RELACIONADA
En el área de la investigación sobre antibióticos, se han dirigido estudios al desarrollo de nuevos antibióticos que simulan el mecanismo de interdestrucción entre cepas heterólogas homogéneas. Existen muchas toxinas bacterianas en la naturaleza que destruyen células formando canales iónicos en la membrana celular de bacterias directamente. El ejemplo de modelo de una toxina de este tipo es la colicina, una toxina bacteriana secretada por E. coli. La colicina la la descubrió Jacob en 1952, desde entonces, a través del duro trabajo de generaciones, Qiu et al. (Major transmembrane movement associat d with colicin la channel gating. J. Gen. Physiology, 107:313-328 (1996)) finalmente reveló que la estructura espacial transmembrana de colicina la cuando se forman los canales iónicos en membranas de bicapas lipídicas artificiales está abierta o cerrada, lo que proporciona una base fundamental para el diseño y la preparación de nuevos antibióticos a nivel molecular. Posteriormente, se prepararon moléculas polipeptídicas mediante la conexión de polipéptido de colicina con polipéptido señal tal como feromonas de Streptococcus albus o Staphylococcus, que dirigen la colicina hasta la membrana celular de bacterias de interés y destruyen la célula debido a la fuga del contenido celular a través de los canales iónicos transmembrana formados .
Los tumores malignos representan una gran amenaza para la salud humana. Cada año mueren siete millones de personas debido a un tumor maligno en el mundo, de las que una sexta parte son de China. Los tumores malignos es ahora la segunda causa principal de muerte en este país. Puesto que la etiología, patogenia y manifestación clínica del tumor maligno no están claramente dilucidadas, la prevención y el tratamiento no son eficaces. Los agentes antitumorales son importantes en el tratamiento de tumores . Aunque logran un efecto terapéutico en algunos tumores, sigue habiendo algunas desventajas, tales como insuficiente selectividad tumoral, supresión inmunológica, reacciones adversas, resistencia a fármacos, etc.
La superficie de las células de linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin y carcinoma nasofaríngeo causados por el virus de Epstein-Barr (EB) porta un antígeno de superficie específico del virus EB . Por tanto, el antígeno de superficie del virus EB puede considerarse como un marcador específico de tales células tumorales. Para los agentes contra el tumor causado por el virus EB, la invención con la patente china n.° ZL200410081446.8 da a conocer un polipéptido antitumoral formado mediante la conjugación de colicina y miméticos de anticuerpo que reconocen el antígeno de superficie del virus EB . El polipéptido antitumoral puede destruir específicamente las células cancerosas producidas por el virus EB en el organismo, no causa ningún daño a las células normales, cuya capacidad de destrucción es varias veces mayor que la de otros agentes antitumorales , y supera los problemas tales como selectividad tumoral, resistencia a fármacos, afectación de tejido normal cuando se destruyen las células cancerosas. Xiao-Qing Qiu et al. (Xiao-Qing Qiu et al., 2007, Small antibody mimetics comprising two complementar!ty-determining regions and a framework región for tumor targeting, JVature Biotechnology 25, 921-929, 1 de agosto de 2007) comparan el efecto de destrucción de polipéptidos antitumorales construidos mediante una serie de miméticos de anticuerpo y colicina, y encuentran que polipéptidos antitumorales construidos mediante miméticos de anticuerpo de VHCDR1-VHFR2 -VLCDR3 y VLCDR1-VHFR2 -VHCDR3 con colicina tienen una capacidad de destrucción superior. Este trabajo proporciona más miméticos de anticuerpo candidatos para la preparación de polipéptidos contra un tumor causado por el virus EB .
Sin embargo, para el polipéptido antitumoral descrito anteriormente, puesto que el extremo terminal hidrófobo de colicina tiene algunos residuos de aminoácido que pueden incluir hipersensibilidad, es posible que el medicamento que comprende polipéptido de colicina provoque respuestas inmunitarias anómalas in vivo más fácilmente. Se notifica que el mecanismo metabólico de muchos pacientes con cáncer es anómalo debido a la perturbación debida a las células cancerosas, es fácil que experimenten una respuesta alérgica al medicamento de polipéptidos, por tanto no pueden tratarse con tal medicamento. Por tanto, es necesario mejorar el polipéptido de colicina con el fin de obtener un medicamento anticancerígeno que sea más seguro y adecuado para más pacientes .
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Basándose en la desventaja de la técnica anterior expuesta anteriormente, la presente invención proporciona un polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB y el uso y el método preparación del mismo, proporciona así un medicamento para el tratamiento de tumor causado por el virus EB que ' tiene alta capacidad de destrucción, alta especificidad y baja posibilidad de alergia.
Un polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB, que se forma mediante unión operativa de un polipéptido mutante de colicina que puede formar canales iónicos con un polipéptido de anticuerpo anti-virus EB o un polipéptido de miméticos de anticuerpo anti-virus EB, el polipéptido mutante de colicina que puede formar canales iónicos se obtiene mediante mutación de residuos de aminoácido de G11A, H22G, A26G, V31L y H40D en la cadena peptídica de colicina El, la, Ib, A, B, N de tipo natural o un dominio de canal acuoso de las mismas, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de anticuerpo anti-virus EB es la misma que la del polipéptido de anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma de ATCC HB-168.
El polipéptido de miméticos de anticuerpo es un péptido conectado de la región CDR1 de cadena pesada, que une el segmento de péptido de CDR1-CDR2 de cadena pesada y CDR3 de cadena ligera de anticuerpo anti-virus EB .
El polipéptido mutante de colicina que puede formar canales iónicos se obtiene mediante mutación de colicina la de tipo natural.
El polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 29.
Un gen que codifica para el polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB.
El gen, que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 30.
Un plásmido de recombinación que comprende dicho gen. Un método de preparación para el polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB, que comprende las etapas de: transformar dicho plásmido de recombinación en un sistema de expresión para su expresión, y aislar el polipéptido' expresado.
Uso de dicho polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB en la preparación de un medicamento para el tratamiento y la prevención de tumor causado por el virus EB .
Un polipéptido mutante de colicina la, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO. 24.
Un gen que codifica para un polipéptido mutante de colicina la.
Uso de dicho gen en la preparación de medicamento peptídico, uniendo operativamente dicho gen con un gen que induce el péptido, clonando en un vector de expresión, transformando entonces el vector de expresión en un sistema de expresión, y aislando el polipéptido expresado.
La invención proporciona un polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB, que se forma mediante un polipéptido mutante de colicina que puede formar canales iónicos con un polipéptido de anticuerpo anti-virus EB o un polipéptido de miméticos de anticuerpo anti-virus EB . Puesto que existen algunos residuos de aminoácido en la molécula de polipéptido de colicina de tipo natural que pueden incluir hipersensibilidad, en la molécula de polipéptido de colicina que puede formar un constructo de canal iónico, la invención muta selectivamente residuos de aminoácido en la región hidrófoba que pueden provocar una respuesta alérgica fácilmente. Por ejemplo, en una realización preferida de la invención, los sitios mutantes de polipéptido de colicina la son: G11A, H22G, A26G, V31L y H40D. En ratones inmunizados con la inyección de un polipéptido de colicina la o un polipéptido de la mutante respectivamente, los datos experimentales muestran el título sérico producido por los ratones a los que se les inyectó el polipéptido de la mutante es varios órdenes de magnitud menor que el primero, es decir, el nivel de respuesta inmunitaria es menor, demostrando que el polipéptido mutante reduce la posibilidad de alergia, mientras que el polipéptido mutante conserva la función de formación de canales iónicos en la membrana celular. El experimento mostró que la capacidad de destrucción del polipéptido recombinante de la invención no se ve afectada, lo que significa que los residuos de aminoácido mutantes no afectan a la función de formación de canales iónicos para colicina. En el polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB proporcionado por la invención, mediante el reconocimiento del polipéptido de anticuerpo anti-virus EB o el polipéptido de miméticos de anticuerpo anti-virus EB en el antígeno de superficie de células tumorales producidas por el virus EB, el polipéptido mutante de colicina se dirige hasta la membrana de células diana, la región hidrófoba del dominio de canal iónico transmembrana del polipéptido mutante de colicina se inserta en la membrana celular de células tumorales, y forma un canal iónico, por tanto las células tumorales mueren debido a la fuga del contenido celular. La secuencia de aminoácidos del polipéptido de anticuerpo anti-virus EB se refiere por completo a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de anticuerpo secretado por el hibridoma de ATCC HB-168.
En una realización de la invención, se prefiere un polipéptido antitumoral de bajo peso molecular de la invención, que se obtiene mediante unión operativa del polipéptido de miméticos de anticuerpo anti-virus EB descrito anteriormente con el extremo carboxilo-terminal del polipéptido mutante de colicina. Es decir, un polipéptido mimético de bajo peso molecular comprende una cadena peptídica de VHCDR1-VHFR2 -VLCDR3 que se obtiene mediante la conexión de la región VHCDR1, la región VLCDR3 , el segmento de péptido de unión de VHCDR1-VHCDR2 y VLCDR3 de cadena ligera del polipéptido del anticuerpo anti-virus EB. La secuencia de aminoácidos del péptido 1 antitumoral novedoso de miméticos de anticuerpo se muestra en SEQ ID NO. 25. Los miméticos de anticuerpo sólo comprenden menos de 30 aminoácidos, y tienen un peso molecular mucho menor que el anticuerpo natural de 150 aminoácidos. Cumple el requisito de reconocimiento de antígenos mientras que reduce sustancialmente el peso molecular del polipéptido antitumoral, y contribuye a la capacidad de penetración en tejido del polipéptido antitumoral de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar una secuencia génica que codifica para el polipéptido antitumoral de la presente invención. El gen del polipéptido antitumoral de la presente invención se forma mediante unión operativa de un gen que codifica para un polipéptido mutante de colicina con un gen que codifica para un polipéptido de anticuerpo anti-virus EB o un polipéptido de miméticos de anticuerpo del mismo, en el que el polipéptido de colicina y la secuencia génica del anticuerpo anti-virus EB se conocen en la técnica, el gen de polipéptido mutante de colicina se obtiene mediante las siguientes mutaciones puntuales en los codones correspondientes del gen de polipéptido de colicina: G11A, H22G, A26G, V31L y H40D. Como resultado de la degeneración del código genético, un experto en la técnica puede ajustar la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido antitumoral de la presente invención sin alterar la secuencia de aminoácidos .
El plásmido de recombinación de la presente invención significa que el vector original cargado con el gen de colicina de tipo natural se somete a mutagénesis dirigida al sitio en nucleótido bicatenario, y se inserta mediante codones mutantes en el sitio de mutación diana, obteniéndose por tanto un vector mutante que comprende el gen de polipéptido mutante de colicina. El mismo proceso de la mutagénesis dirigida al sitio inserta un gen que codifica para miméticos de anticuerpo de un anticuerpo anti-virus EB en el extremo carboxilo-terminal de un gen del polipéptido mutante de colicina, obteniéndose por tanto un plásmido recombinante de la presente invención. El vector original pSELECTTM-i se adquiere de Promega Corp., que porta genes de colicina la y proteína de inmunidad. El proceso de mutagénesis dirigida al sitio sigue las instrucciones del kit de Strategene Corp. La presente invención lleva a cabo algunas mutagénesis dirigidas al sitio para preparar un polipéptido mutante de colicina, en el que cinco codones se someten a mutagénesis dirigida al sitio. Por tanto, se diseñan 5 pares de secuencias de cebador (SEQ ID No. 1-10) . En el ejemplo de la presente invención, se diseñan 6 pares de secuencias de cebador para el gen de miméticos de anticuerpo (SEQ ID No. 11-22) .
La presente invención también proporciona un método para la preparación del polipéptido antitumoral de la presente invención, que comprende transformar el vector recombinante obtenido anteriormente en bacterias modificadas por ingeniería genética de E. coli BL21(DE3), seleccionar el clon positivo, aislar y purificar la proteína expresada por el clon positivo, obteniéndose por tanto el polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB de la presente invención .
El polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB proporcionado por la presente invención puede usarse en la preparación de un medicamento para el tratamiento y la prevención de un tumor causado por el virus EB. Puede prepararse una composición farmacéutica adecuada clínica añadiendo el polipéptido de antibióticos novedosos obtenidos en la presente invención en un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable u otros componentes opcionales.
La presente invención también proporciona la secuencia de aminoácidos y la secuencia génica del polipéptido mutante de colicina la. El polipéptido mutante puede usarse en la presente invención, también puede usarse en la construcción de un polipéptido de anticuerpo con otros polipéptidos de direccionamiento . Los datos experimentales del ejemplo 3 en la invención demuestran que el medicamento peptídico que comprende el polipéptido mutante tiene una baja inmunogenicidad, y que el polipéptido de anticuerpo formado por el polipéptido mutante con otro polipéptido de direccionamiento tiene una capacidad bactericida. El método de preparación es un proceso experimental de rutina en la técnica .
El polipéptido antitumoral novedoso proporcionado por la invención tiene la ventaja del polipéptido antitumoral dado a conocer en la patente n.° ZL200410081446.8 , es decir, direccionamiento altamente específico y seguridad para células normales, y no se inclina a desarrollar resistencia a fármacos. Al mismo tiempo, el polipéptido antitumoral de la presente invención se ha mutado en los residuos de aminoácido que tienden a provocar una respuesta alérgica, se reduce la inmunogenicidad del polipéptido antitumoral que comprende tal polipéptido mutante, es decir, se reduce la posibilidad de reacción alérgica. Se mejoran la seguridad de uso y el efecto de destrucción de tumores del medicamento de tales polipéptidos. Esto también puede ser un buen ejemplo para la mejora de otro medicamento que comprende polipéptido de colicina .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1. Ilustración esquemática de la estructura del plásmido recombinante pCHCEBll que comprende el gen de polipéptido de miméticos de anticuerpo de VHCDR1 -VHFR2 -VLCDR3 y el gen del polipéptido mutante de colicina la.
Figura 2. Ilustración esquemática de la estructura del plásmido recombinante pCHCEB22 que comprende el gen de polipéptido de miméticos de anticuerpo de VHCDR1 -VHFR2 -(Rev)VLCDR3 y el gen del polipéptido mutante de colicina la.
Figura 3. El experimento 1 del efecto de sensibilización del polipéptido mutante de colicina la.
(A) Se agrupan aleatoriamente ratones Kunming a los que les inyecta por vía intraperitoneal una dosis letal de MRSA (ATCC BAA42) en (1) grupo control, (2) grupo de ampicilina,
(3) grupo de polipéptido contra S. aureus (ZL 01128836.1),
(4) grupo de polipéptido 1 contra S. aureus.
(B) Después de 14 días, se agrupa un nuevo lote de ratones Kunming en un grupo control y un grupo de ampicilina. Se agrupan los ratones supervivientes del grupo de polipéptido contra S. aureus y el grupo de polipéptido 1 contra S. aureus en un grupo de polipéptido contra S. aureus y un grupo de polipéptido 1 contra S. aureus, y se repite el experimento .
(C) Después de 41 días, se agrupa un nuevo lote de ratones Kunming en (1) grupo control, (2) grupo de levofloxacino, (3) grupo de ceftri xona sódica, (4) grupo de polipéptido contra S. aureus, y (5) se agrupan los ratones supervivientes del grupo de polipéptido 1 contra S. aureus en un grupo de polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa, y un grupo de polipéptido 1 contra Pseudomonas aeruginosa.
Figura 4. El experimento 2 del bajo efecto de sensibilización del polipéptido mutante de colicina la.
(A) el suero del grupo de polipéptido contra S. aureus/polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa, título de
1:50.000;
(B) el suero del grupo de polipéptido 1 contra S. aureus/polipéptido 1 contra Pseudomonas aeruginosa, título de 1:50.000.
(1) Semana 1, (2) semana 2, (3) suero de la semana 7, (4) control negativo.
Figura 5. Comparación del efecto de destrucción in vitro del polipéptido antitumoral novedoso frente a linfoma de Burkitt causado por el virus EB .
(A) grupo control, (B) grupo tratado con polipéptido 1 antitumoral novedoso, (C) grupo tratado con polipéptido 2 antitumoral novedoso.
Figura 6. Efecto de destrucción in vitro del polipéptido antitumoral novedoso frente a células de linfoma de Burkitt causado por el virus EB y otras células tumorales .
(A) células positivas para VEB de linfoma de Burkitt,
(B) células negativas para VEB de linfoma de Burkitt,
(C) células positivas para VEB de linfosarcoma maligno de paciente con SIDA.
(1) grupo control, (2) grupo tratado con polipéptido 1 antitumoral novedoso.
Figura 7. Efecto de destrucción del polipéptido antitumoral novedoso frente a tumor sólido hecho crecer a partir de ratones atímicos en los que se implantaron células de linfoma de Burkitt causado por el virus EB .
(A) grupo control .
(B) ratones inmunodeficientes SCID del grupo tratado con el polipéptido 1 antitumoral novedoso se inoculan todos con células de linfoma de Burkitt en ambos ijares axilares. La flecha a la izquierda, linfosarcoma negativo para VEB, la flecha a la derecha, linfosarcoma positivo para VEB.
Figura 8. Efecto de destrucción del polipéptido antitumoral novedoso frente a un tumor sólido hecho crecer a partir de ratones atímicos en los que se implantaron células de linfoma de Burkitt causado por el virus EB .
(A) sección de linfosarcoma negativo para VEB de ratones control, (B) sección de linfosarcoma positivo para VEB de ratones control, (C) sección de linfosarcoma negativo para VEB de ratones tratados con polipéptido 1 antitumoral novedoso, (D) sección de linfosarcoma positivo para VEB de ratones tratados con polipéptido 1 antitumoral novedoso.
REALIZACIONES
La invención se describirá ahora describiendo la realización preferida de la invención y con referencia a los dibujos adjuntos.
El vector original pSELECTTM-1 usado en la invención se adquiere de Promega Corp.
Las bacterias modificadas mediante ingeniería genética de E. coli BL21(DE3) se adquieren de Novagen Corp.
Ejemplo 1. Construcción del plásmido recombinante que comprende el gen que codifica para colicina la mutante.
El vector original es el plásmido pSELECTTM- 1 (8,3 kb) (adquirido de Promega Corp.) que porta genes de colicina la y proteína de inmunidad. Las secuencias de cebadores de oligonucleótido mostradas en SEQ ID NO.1-10 que codifican para aminoácidos mutantes se unen operativamente al gen de colicina la de tipo natural respectivamente mediante una tecnología de mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido bicatenario (QuickChangeTM Kit, Strategene Corp.) , obteniéndose un gen mostrado en SEQ ID NO.23 que codifica para un polipéptido mutante de colicina la, y un plásmido mutante. Después de eso, el gen de SEQ ID NO.26 o SEQ ID NO.28 se inserta en el plásmido mutante después del codón de 1626 del gen de polipéptido mutante de colicina la, obteniéndose dos plásmidos recombinantes pCHCEBll (mostrado en la figura 1) y pCHCEB22 (mostrado en la figura 2) para el polipéptido novedoso contra tumor causado por el virus EB . Se muestran las secuencias de 6 pares de cebadores de oligonucleótido en SEQ ID NO.11-22, que se diseñan para la preparación del gen que codifica para el anticuerpo contra el virus EB en el plásmido recombinante . El plásmido de recombinación se transfecta en las bacterias modificadas mediante ingeniería genética de E. coli BL21(DE3) (adquiridas de Novagen Corp.) para preparar el polipéptido. Los polipéptidos obtenidos se muestran en SEQ ID NO.29
(denominado a continuación en el presente documento
"polipéptido 1 antitumoral novedoso" ) y SEQ ID NO .31
(denominado a continuación en el presente documento
"polipéptido 2 antitumoral novedoso" ) en la lista de secuencias .
El proceso de mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótido bicatenario sigue el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChang de Strategene (n.° de catálogo
200518) .
1. Preparación de reactivo para mutagénesis dirigida al sitio :
5 DI de tampón 10X
2 DI (10 ng) de plásmido original pSELECTTM-1 que porta genes de polipéptido de tipo natural de colicina la y proteína de inmunidad.
1,25 DI (125 ng) de cebador de oligonucleótido 5' -3' diseñado
1,25 DI (125 ng) de cebador de oligonucleótido 3' -5' diseñado
1 DI de dNTP
agua bidestilada, 50 DI
1 DI de ufp
(proporcionado por el kit excepto el plásmido, los cebadores y el agua bidestilada)
2. Amplificación por PCR, condiciones de amplificación: 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 35 segundos, hibridación a 53°C durante 70 segundos, y extensión a 68°C durante 17 minutos;
3. Se añade 1 DI de endonucleasa Dpn 1 para digerir la cadena de ADN parental (37 °C, 1 hora) , se incuban juntos 1 DI de reactivo y 50 DI de células competentes XLl-Blue en hielo durante 30 minutos, después de un choque térmico a 42 °C durante 45 segundos, se incuban en hielo durante 2 minutos,- 4. Se añaden 0,5 mi de medio de cultivo NZY, agitando a 37 °C y 220 rpm durante 1 hora. Se siembran en placa 50-100 DI de reactivo (medio LB más agar al 1% y ampicilina 50 Dg/ml, durante la noche a 37 °C) ;
5. Se recoge la colonia después de 18 horas. Se extrae el plásmido, se secuencia, confirmando que la mutación es satisf ctoria;
6. Se incuban los 50 ng de plásmido de recombinación obtenidos finalmente mediante mutación en múltiples sitios con 40 DI de células competentes de E. coli BL-21(DE3) en hielo durante 5 minutos, se sometieron a choque térmico a 42 °C durante 30 segundos, y se incubaron en hielo durante 2 minutos. Se añadieron 160 DI de medio de cultivo SOC de Novagen Corp., y se sembraron en placa después de agitar a 37 °C y 220 rpm durante 1 hora (medio LB más agar al 1% y ampicilina 50 Dg/ml, durante la noche a 37°C) .
7. Se recoge la colonia individual para amplificación, 8-16 litros de medio FB, 250 rpm, 30°C durante 4-5 horas, se somete a choque térmico a 42 °C y 250 rpm durante 30 minutos, y a 37 °C durante 2 horas. Se precipita la bacteria mediante centrifugación a 6000 g y 4°C durante 20 minutos. Se le añaden a tampón borato 50 mM (EDTA 2 mM + DTT 2 mM) a 4°C, 50-80 mi de suspensión bacteriana con 250 mi de PMSF 0,2 M y se tratan con sonicación con ultrasonidos (4°C, 400 W, 2 minutos) . Se centrifuga a alta velocidad el residuo bacteriano (4°C, 75.000 g, 90 minutos). Se le añaden al sobrenadante 5 millones de unidades de sulfato de estreptomicina para precipitar el ADN. Después de precipitación mediante centrifugación a 15000 g y 4°C durante 10 minutos, se dializa el sobrenadante durante la noche en bolsa de diálisis de peso molecular 15.000 en tampón borato 50 mM a 4°C. Después de precipitación mediante centrifugación a 15000 g y 4°C durante 10 minutos de nuevo, se carga el sobrenadante en una columna de intercambio iónico de C . Se eluye la columna usando un gradiente de NaCl 0,1-0,3 M + tampón borato 50 mM, obteniéndose el polipéptido antitumoral recombinante .
Las secuencias de cebadores diseñados para mutagénesis dirigida al sitio son las siguientes:
SEQ ID NO.l, cebador de oligonucleótido 5' -3' diseñado para la mutación de GllA en el gen de colicina:
cgt att acá aat ccc GCA gca gaa tcg ctg ggg
SEQ ID NO.2, cebador de oligonucleótido 3' -5' diseñado para la mutación de GllA en el gen de colicina:
ccc cag cga ttc tgc TGC ggg att tgt aat acg
SEQ ID NO.3, cebador de oligonucleótido 5' -3' diseñado para la mutación de H22G en el gen de colicina:
gat tea gat ggc GGT aaa tta tgg gtg
SEQ ID NO.4, cebador de oligonucleótido 3' -5' diseñado para la mutación de H22G en el gen de colicina:
cae cea taa ttt ACC gee ate tga ate
SEQ ID NO.5, cebador de oligonucleótido 5' -3' diseñado para la mutación de A26G en el gen de colicina:
gaaa ttatgGGTgt tgatatttat
SEQ ID NO.6, cebador de oligonucleótido 3' -5' diseñado para la mutación de A26G en el gen de colicina:
ataaatatacaacACCcataatttc
SEQ ID NO.7, cebador de oligonucleótido 5' -3' diseñado para la mutación de V31L en el gen de colicina:
gt tgatatttat CTC aaccctc cacgtgtc
SEQ ID NO.8, cebador de oligonucleótido 3' -5' diseñado para la mutación de V31L en el gen de colicina:
gacacgtggagggttGAGataaatatcaac
SEQ ID NO.9, cebador de oligonucleótido 5' -3' diseñado para la mutación de H40D en el gen de colicina:
cgtgtcga tgtctttGATggtaccccgc ctgcat
SEQ ID NO.10, cebador de oligonucleótido 3' -5' diseñado para la mutación de H40D en el gen de colicina:
atgcaggcggggtaccATCaaagacatcgacacg
SEQ ID NO.11, cebador 5' -3' para gen de VHCDR1 en el plásmido de recombinación pCHCEBll:
gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGTCAGtaa ata aaa tat aag acá ggc
SEQ ID NO.12, cebador 3' -5' para gen de VHCDR1 en el plásmido de recombinación pCHCEBll:
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cea gaa ctt att cgc
SEQ ID NO.13, cebador 5' -3' para gen de VHFR2 en el plásmido de recombinación pCHCEBll:
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaa tat aag acá ggc
SEQ ID NO.14, cebador 3' -5' para gen de VHFR2 en el plásmido de recombinación pCHCEBll:
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cae cea atg cat acc
SEQ ID NO.15, cebador 5 '-3' para gen de (Rev)VLCDR3 en el plásmido de recombinación pCHCEBll:
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc ACC TAC CCC TAC TCC TAC GGT
CAG GGT taa ata aaa tat aag acá ggc
SEQ ID NO.16, cebador 3' -5 'para gen de (Rev)VLCDR3 en el plásmido de recombinación pCHCEBll:
gcc tgt ctt ata ttt tat tta ACC CTG ACC GTA GGA GTA GGG GGT ggc cae cea etc cag acc ttt
SEQ ID NO.17, cebador 5' -3' para gen de VHCDR1 en el plásmido de recombinación pCHCEB22:
gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaa tat aag acá ggc
SEQ ID NO.18, cebador 3' -5' para gen de VHCDR1 en el plásmido de recombinación pCHCEB22:
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cea gaa ctt att cgc
SEQ ID NO .19, cebador 5' -3' para gen de VHFR2 en el plásmido de recombinación pCHCEB22:
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ataaaa tat aag acá ggc
SEQ ID NO.20, cebador 3' -5' para gen de VHFR2 en el plásmido de recombinación pCHCEB22:
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cae cea atg cat acc
SEQ ID NO.21, cebador 5' -3' para gen de VLCDR3 en el plásmido de recombinación pCHCEB22:
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC
TAC ACC taa ata aaa tat aag acá ggc
SEQ ID NO.22, cebador 3' -5' para gen de VLCDR3 en el plásmido de recombinación pCHCEB22:
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cae cea etc cag acc ttt
Ejemplo 2. Observación del efecto inmunitario de polipéptidos antitumorales novedosos preparados a partir de los plásmidos de recombinación pCHCEBll y pCHCEB22.
Se inmunizan ratones con el polipéptido 1 antitumoral novedoso y el polipéptido 2 antitumoral novedoso preparados a partir de los plásmidos de recombinación pCHCEBll y pCHCEB22 obtenidos en el ejemplo 1, y el polipéptido antitumoral 1 y el polipéptido antitumoral 2 de la invención previa propiedad del inventor (documento ZL200410081446.8 ) . Se mezcla cada proteína descrita anteriormente con adyuvante. La dosis de sensibilización y la dosis de refuerzo son una inyección intraperitoneal de 50 Dg (0,5 mi) en cada ratón, cinco inyecciones con un intervalo de 2 semanas en total. Se determina que el título es sérico mediante un método de ELISA indirecto. El título de ratones inmunizados con los polipéptidos 1 y 2 antitumorales novedosos preparados mediante la presente invención oscila entre 10-3 y 10-4, mientras que el título de ratones inmunizados con el polipéptido antitumoral 1 y el polipéptido 2 antitumoral oscila entre 10-4 y 10-5.
Puede observarse que la posibilidad de reacción de hipersensibilidad inducida por el polipéptido antitumoral novedoso de la presente invención es de 1 orden a 2 órdenes de magnitud inferior a la posibilidad de reacción de hipersensibilidad inducida por polipéptido antitumoral que comprende colicina la de tipo natural.
Ejemplo 3. Experimento del bajo efecto de sensibilización del polipéptido mutante de colicina la que forma el polipéptido antitumoral novedoso.
El plásmido mutante para polipéptido mutante de colicina la (que se muta en residuos de aminoácido de G11A, H22G, A26G, V31L y H40D en la cadena peptídica del dominio de canal acuoso) del ejemplo 1 se une operativamente a la feromona AgrDl (YSTCDFIM) de S. aureus en el extremo N-terminal o el extremo C-terminal del polipéptido mutante, obteniéndose dos polipéptidos antibacterianos. El polipéptido obtenido mediante la unión de AgrDl en el extremo carboxilo-terminal de la colicina la mutante se denomina polipéptido 1 contra S. aureus, y el polipéptido obtenido mediante la unión de AgrDl en el extremo amino-terminal de la colicina la mutante se denomina polipéptido 1 contra Pseudomonas aeruginosa. El plásmido para colicina la de tipo natural se une en el extremo amino-terminal a la feromona AgrDl (YSTCDFIM) de S. aureus, obteniéndose el polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa .
Experimento 1: Se inyecta a un lote de ratones Kunming por vía intraperitoneal una dosis letal de MRSA (ATCC BAA42) , y se agrupan aleatoriamente en (1) grupo control, (2) grupo de ampieilina, (3) grupo de polipéptido contra S. aureus, (4) grupo de polipéptido 1 contra S. aureus. Cada grupo consiste en 10 ratones.
Método de tratamiento:
Una hora después de la inyección intraperitoneal de la dosis letal de MRSA (ATCC BAA42) :
grupo control: se le inyectan 0,5 mi de NaCl 0,3 M + tampón borato 50 mM a través de la vena de la cola una vez; grupo de ampicilina: se le inyecta ampicilina de 2,5 mg/kg a través de la vena de la cola una vez;
grupo de polipéptido contra S. aureus: se le inyecta polipéptido contra S. aureus propiedad del inventor (documento ZL 01128836.1) de 6 mg/kg a través de la vena de la cola una vez;
grupo de polipéptido 1 contra S. aureus-. se le inyecta polipéptido 1 contra S. aureus de 6 mg/kg a través de la vena de la cola una vez;
Resultado: los ratones en el grupo control y el grupo de ampicilina mueren todos en dos días. Sobrevive el 85% de los ratones en el grupo de polipéptido contra S. aureus y el grupo de polipéptido 1 contra S. aureus.
Experimento 2: 14 días después del experimento 1, se agrupa un nuevo lote de ratones Kunming en un grupo control y un grupo de ampicilina. Se agrupan los ratones supervivientes del grupo de polipéptido contra S. aureus y el grupo de polipéptido 1 contra S. aureus en un grupo de polipéptido contra S. aureus y un grupo de polipéptido 1 contra S. aureus para repetir el experimento descrito anteriormente. Los ratones en el grupo control y el grupo de ampicilina mueren todos en dos días. Sobreviven el 75% de los ratones en el grupo de polipéptido contra S. aureus, y el 90% ratones en el grupo de polipéptido 1 contra S. aureus.
Experimento 3: 41 días después del experimento 1, se agrupa un nuevo lote de ratones Kunming en un grupo control, un grupo de levofloxacino y un grupo de ceftriáxona sódica. Se agrupan los ratones supervivientes del grupo de polipéptido contra S. aureus y el grupo de polipéptido 1 contra S. aureus en un grupo de polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa y un grupo de polipéptido 1 contra Pseudomonas aeruginosa.
Se les inyecta a los ratones por vía intraperitoneal una dosis letal de Pseudomonas aeruginosa con resistencia a múltiples fármacos (aislados clínicos 13578 del Departamento de Medicina Experimental, Universidad del Hospital de Sichuan de China Occidental) . Después de una hora,
se le inyecta al grupo control 0,5 mi de NaCl 0,3 M + tampón borato 50 mM a través de la vena de la cola una vez; se le inyecta al grupo de levofloxacino, levofloxacino de 5 mg/kg a través de la vena de la cola una vez;
se le inyecta al grupo de ceftriáxona sódica, ceftriáxona sódica de 30 mg/kg a través de la vena de la cola una vez ;
se le inyecta al grupo de polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa, el polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa de 8 mg/kg a través de la vena de la cola una vez; se le inyecta al grupo de polipéptido 1 contra Pseudomonas aeruginosa, el polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa de 8 mg/kg a través de la vena de la cola una vez.
Los ratones en el grupo control y el grupo de levofloxacino mueren todos en un día. Sobrevive el 25% de los ratones en el grupo de ceftriáxona sódica. Sobrevive el 60% de los ratones en el grupo de polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa. Sobreviven todos los ratones en el grupo de polipéptido 1 contra Pseudomonas aeruginosa . Se demuestra que el anticuerpo del huésped interfiere con el efecto de destrucción del polipéptido mutante menos que con que el del polipéptido de tipo natural.
Véase la figura 3.
En la semana 1, semana 2 y semana 7 del experimento, se somete a ensayo suero de los ratones supervivientes del grupo de polipéptido contra S. aureus/grupo de polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa, y el grupo de polipéptido 1 contra S. aureus/grupo de polipéptido 1 contra Pseudomonas aeruginosa mediante un método de ELISA indirecto para detectar el anticuerpo en sangre. Se recubren pocilios de placa de marcador enzimático con colicina la de tipo natural y el polipéptido mutante de colicina la, 100 ng/pocillo. Los primeros anticuerpos son sueros de los ratones supervivientes del grupo de polipéptido contra S. aureus /grupo de polipéptido 2 contra Pseudomonas aeruginosa, y el grupo de polipéptido 1 contra S. aureus/grupo de polipéptido 1 contra Pseudomonas aeruginosa . El segundo anticuerpo es anticuerpo de cabra anti-ratón marcado. El primer anticuerpo de control negativo es leche al 5%-PBS. Los resultados del título 1:50.000 son los siguientes (véase la figura 4):
Se demuestra que la posibilidad de reacción de hipersensibilidad del huésped inducida por el polipéptido mutante de colicina la preparado mediante la presente invención es menor que la posibilidad de reacción de hipersensibilidad del huésped inducida por colicina la de tipo natural .
Ejemplo 4. Efecto de destrucción in vitro del polipéptido antitumoral novedoso frente a linfoma de Burkitt causado por el virus EB.
La cepa de células positivas para VEB y la cepa de células negativas para VEB son cepas celulares convencionales de la ATCC, EE.UU.
Cultivo celular: se añaden lentamente 0,1 mi de suspensión de célula de Raj i revivida a 3 mi de medio líquido 1640 (más suero al 10%) en una placa de cultivo (tasa de dilución, 1:30), se mezclan y se cultivan en un incubador a 37°C con C02. La cepa de células positivas para VEB es ATCC CCL-86 (una célula de linfoma de Burkitt convencional usada en laboratorios de todo el mundo, célula de Raji, aislada de un niño africano de 12 años de edad en 1963) .
Las células de prueba se agrupan en 3 grupos.
El grupo 1 es un grupo de blanco, al que se le añade una disolución de conservación (tampón fosfato PB 10 mM + NaCl 0,2 M (pH 7,4)) sin el polipéptido antitumoral.
Al grupo 2 se le añade el polipéptido 1 antitumoral novedoso 200 üg/ml (plásmido pCHCEBll, disolución de conservación, tampón fosfato PB 10 mM + NaCl 0,2 , pH 7,4 ) .
Al grupo 3 se le añade el polipéptido 2 antitumoral novedoso 200 Dg/ml (plásmido pCHCEB22, disolución de conservación, tampón fosfato PB 10 mM + NaCl 0,2 M, pH 7,4 ) .
Después del cultivo durante 24 horas, se le añadió a la placa de cultivo los agentes de tratamiento descritos anteriormente. 72 horas después de la adición de los agentes de tratamiento, se le añaden a la placa de cultivo 20 DI de yoduro de propidio (YP) 100 DMol, y se observa bajo un microscopio 10 minutos después. El resultado muestra que las células del grupo de blanco crecen bien, y la mayoría de las células en el grupo de polipéptido 1 antitumoral novedoso se tiñen de rojo por YP, mostrando que la membrana celular se destruye por el polipéptido antitumoral, lo que conduce a la muerte de las células tumorales . Comparando el número de células muertas, el efecto del polipéptido 2 antitumoral novedoso no es tan bueno entre los dos polipéptidos antitumorales novedosos, véase la figura 5.
Ejemplo 5. Observación de tinción por multifluorescencia para determinar el efecto de destrucción in vi tro del polipéptido antitumoral novedoso frente a células de linfoma de Burkitt causado por el virus EB y otras células tumorales.
Las condiciones de cultivo celular son las mismas que en el ejemplo 2. Se usan tres cepas celulares en el experimento: cepa de células positivas para el virus EB: ATCC CCL-86 (célula de Raji, célula de linfoma de Burkitt) ; ATCC CRL-2230, una cepa de célula de linfosarcoma maligno de un hombre de 46 años de edad con SIDA, que es positivo para el virus EB y virus de sarcoma de Kaposi; cepa de células positivas para el virus EB : ATCC CRL-1648 (CA-46, una célula aislada del líquido ascítico de un paciente con linfoma de Burkitt americano) .
Se agrupa cada cepa en 2 grupos de prueba. Al grupo 1 se le añade una disolución de conservación (tampón fosfato PB 10 mM + NaCl 0,2 M (pH 7,4)) sin el polipéptido antitumoral novedoso. Al grupo 2 se le añade el polipéptido 1 antitumoral novedoso 200 Dg/ml (plásmido pCHCEBll) , la disolución de conservación es tampón fosfato PB 10 mM + NaCl 0,2 M, pH 7 , 4.
Después del cultivo durante 24 horas, se le añaden a la placa de cultivo los agentes de tratamiento del grupo descritos anteriormente. 72 horas después de la adición de los agentes de tratamiento, se le añaden a la placa de cultivo dos tipos de colorantes fluorescentes, es decir 20 DI de FITC 50 D ol y 20 DI de rodamina-123 50 uMol, y se observa bajo un microscopio IX-71 de Olympus 10 minutos después.
El resultado muestra que la cepa de célula tumoral negativa para VEB crece bien después del tratamiento del polipéptido 1 antitumoral novedoso, y en la mayoría de las células de cada cepa de células tumorales positivas para VEB aparece la desaparición de la mitocondria y el núcleo, se hincha y presenta necrosis, la mayoría de ellas están muertas. Aparentemente, en comparación con el experimento de tinción con YP del ejemplo 4, el resultado del experimento de tinción de multifluorescencia muestra más claramente el potente efecto de destrucción del polipéptido 1 antitumoral novedoso contra células tumorales positivas para el virus EB, véase la figura 6.
Las células tumorales negativas para VEB crecen bien, lo que significa que el polipéptido antitumoral novedoso no ataca la célula sin antígeno de superficie del virus EB en la membrana celular. Se sugiere que el polipéptido antitumoral novedoso de la presente invención tiene una seguridad y especificidad de direccionamiento ideales.
Ejemplo 6. Efecto de destrucción del polipéptido antitumoral novedoso frente a un tumor sólido hecho crecer en ratones atímicos a los que se les implantaron células de linfoma de Burkitt causado por el virus EB.
Se adquieren ratones inmunodeficientes SCID del Centro de Animales de Laboratorio de Shanghai, Academia de Ciencias de China. Se alimentan los ratones siguiendo los requisitos de alimentación convencionales. El agua, la paja para los lechos y los productos alimenticios se esterilizan todos ellos mediante alta temperatura o luz UV. Se alimentan los ratones durante una semana en condiciones asépticas relativas, y se usan en el experimento de inoculación si no hay ninguna anomalía.
Se recogen suspensiones de células de Raj i (ATCC CCL-86) y 1648 (ATCC CRL-1648) en fase exponencial en tubos de centrífuga de 50 mi, se centrifugan a 4°C. Entonces se desecha el sobrenadante. Se resuspenden las células en medio d cultivo líquido 1640 (más suero de ternero) a 1,0 x 107 células/ml . Se les inyectan a los ratones por vía subcutánea 0,1 mi de suspensión de células de Raj i en la axila izquierda, y 0,1 mi de suspensión de células de 1648 (ATCC CRL-1648) en la axila derecha.
3-4 días después de la inyección, el tumor crece hasta aproximadamente 2 x 2 mm. Se agrupan los ratones que portan el tumor en:
(grupo A) la disolución de conservación (tampón fosfato PBS 10 mM +NaCl 0,2 M (pH 7,4)) sin el polipéptido antitumoral, como grupo control;
(grupo B) el polipéptido 1 antitumoral novedoso (plásmido pCHCEBll) , como grupo de tratamiento, 300 ?g/ratón/día (calculado como 25 g) , durante 20 días de manera continua .
A diez ratones de cada grupo se les inyectan por vía subcutánea 0(5 mi dos veces al día durante 20 días de manera continua. Se observa el comportamiento de los ratones y se documenta cada día. Se determina el tamaño del tumor y se fotografía cada dos días.
El resultado (véase la figura 7) muestra que el crecimiento del tumor en grupo B del polipéptido antitumoral novedoso se inhibe significativamente, en el que desaparecen los tumores en 7 ratones, y los tumores en los otros 3 ratones son claramente más pequeños que los del grupo control. El polipéptido antitumoral novedoso es eficaz para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en ratones causado por células positivas para VEB de linfosarcoma . Pero el polipéptido antitumoral novedoso es ineficaz para inhibir el crecimiento de un tumor sólido en ratones causado por células negativas para VEB de linfosarcoma .
Ejemplo 7. Observación patológica de un experimento in vivo de eliminación de tumores
Observación histopatológica de tumores: se sacrifican los ratones al final del experimento del ejemplo 6. Se extraen los tumores, se fijan en formalina al 10%. Se tiñen con HE los cortes de parafina y se observan bajo un microscopio óptico de rutina.
Observados bajo el microscopio, los tumores sólidos de los ratones del grupo control están proliferando de forma vigorosa; los tumores sólidos de células positivas para VEB de los ratones del grupo del polipéptido antitumoral novedoso se contraen notablemente. La mayoría de las masas celulares en la sección son células tumorales necróticas, y se observa una gran cantidad de infiltración linfocítica peritumoral. El resultado histopatológico sugiere que durante el tratamiento de 20 días, el polipéptido antitumoral novedoso destruyó casi todas las células tumorales en el tumor sólido (véase figura 8, D) .
Claims (12)
1. Polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB, que se forma mediante unión operativa de un polipéptido mutante de colicina que puede formar canales iónicos con un polipéptido de anticuerpo anti-virus EB o un polipéptido de miméticos de anticuerpo anti-virus EB, el polipéptido mutante de colicina que puede formar canales iónicos se obtiene mediante mutación de residuos de aminoácido de G11A, H22G, A26G, V31L y H40D en la cadena peptídica de colicina El, la, Ib, A, B, N de tipo natural o un dominio de canal acuoso de las mismas, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de anticuerpo anti-virus EB es la misma que la del polipéptido de anticuerpo monoclonal secretado por el hibridoma de ATCC HB-168.
2. Polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB según la reivindicación 1, en el que el polipéptido de miméticos de anticuerpo es un péptido conectado de la región CDR1 de cadena pesada, que une el segmento de péptido de CDR1-CDR2 de cadena pesada y CDR3 de cadena ligera de anticuerpo anti-virus EB.
3. Polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB según la reivindicación 2, en el que el polipéptido mutante de colicina que puede formar canales iónicos se obtiene mediante mutación de colicina la de tipo natural.
4. Polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB según la reivindicación 3, en el que el polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 29.
5. Gen que codifica para el polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Gen según la reivindicación 5, que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO. 30.
7. Plásmido de recombinación que comprende el gen según la reivindicación 5.
8. Método de preparación para el polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de: transformar el plásmido de recombinación según la reivindicación 7 en un sistema de expresión para su expresión, y aislar el polipéptido expresado.
9. Uso del polipéptido novedoso contra un tumor causado por el virus EB según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y la prevención de tumor causado por el virus EB .
10. Polipéptido mutante de colicina la, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO. 24.
11. Gen que codifica para el polipéptido mutante de colicina la según la reivindicación 10.
12. Uso del gen según la reivindicación 11, en la preparación de medicamento peptídico, uniendo operativamente dicho gen con un gen que induce el péptido, clonando en un vector de expresión, transformando luego el vector de expresión en un sistema de expresión, y aislando el polipéptido expresado.
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