MX2011007545A - N-glicanos que contienen galactosa-alfa-1,3-galactosa en productos de glicoproteina derivados de celulas de ovario de hamster chino (cho). - Google Patents

N-glicanos que contienen galactosa-alfa-1,3-galactosa en productos de glicoproteina derivados de celulas de ovario de hamster chino (cho).

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Hetal Sarvaiya
Nathaniel Washburn
Cuihua Lui
xiao-jin Xu
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Abstract

La presente invención proporciona métodos para evaluar una población de células de ovario de hámster chino (CHO) mediante la medición de los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa producidos por estas células, donde las células CHO no han sido diseñadas genéticamente para expresar una secuencia que codifica la alfa-galactosil transferasa.

Description

N-GLICANOS QUE CONTIENEN GALACTOSA-ALFA- 1, 3 -GALACTOSA EN PRODUCTOS DE GLICOPROTEINA DERIVADOS DE CELULAS DE OVARIO DE HAMSTER CHINO (CHO) Campo de la Invención La presente invención se refiere a los métodos y materiales para la detección de estructuras particulares de glicanos en proteínas expresadas a partir de sistemas de expresión de células mamíferas.
Antecedentes de la Invención Muchos productos 'biofarmacéuticos terapéuticos recombinantes se elaboran en cultivos de células mamíferas como las células de ovario de hámster chino (CHO) . Se prefieren los cultivos de células mamíferas con respecto a otros sistemas de expresión como los sistemas de levadura y procarióticos para la producción de glicoproteínas recombinantes, en gran medida porque los cultivos de células mamíferas producen glicoproteínas con patrones de glicosilación que son generalmente reconocidos y tolerados por los seres humanos.
Los efectos potencialmente adversos de los enlaces terminales de galactosa unida a alfa (gal-a- 1 , 3 -gal) son conocidos en Chung et al., N Engl J Med, 358:11 (2008) . Se informó previamente que los enlaces terminales alfa-gal no se encuentran presentes en las glicoproteínas recombinantes producidas por las células de ovario de hámster chino (CHO) .
Ref.: 221459 Por ejemplo, mientras que un anticuerpo anti-CDw52, Campath, producido en NSO, una línea celular de mieloma murino, incluye glicoformas potencialmente inmunogénicas que tienen residuos del extremo no reductor de galactosa unida a alfa, el Campath producido a partir de células CHO contiene principalmente tres glicoformas que concuerdan con la IgG humana. Sheeley et al., Analytical Biochem stry 247:102-110 (1997) .
Sumario de la Invención La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que las glicoproteínas producidas a partir de células CHO recombinantes contienen estructuras de glicano con enlaces terminales de galactosa-a- 1 , 3 -galactosa, que pueden tener efectos nocivos en el uso de estas glicoproteínas para usos terapéuticos. Por ejemplo, la administración de glicoproteínas con enlaces terminales alfa-gal a seres humanos para efectos terapéuticos puede conducir a la formación de anticuerpos monoclonales para las glicoproteínas recombinantes en los pacientes, de forma tal que las administraciones posteriores serán menos eficaces o incluso podrán causar reacciones adversas de hipersensibilidad en el paciente.
Contrariamente a lo anterior, los solicitantes encontraron de forma sorprendente que una fracción significativa de las glicoproteínas recombinantes producidas en cultivos de células CHO pueden presentar enlaces terminales gal-a-1 , 3 -gal , lo que imparte potencial de reacciones adversas a los productos de proteína y peptidilo administrados a los pacientes.
La presente invención proporciona compuestos y métodos que son útiles para la producción y el análisis de los glicoproteínas recombinantes a partir de células CHO y composiciones que contienen estas glicoproteínas, donde las glicoproteínas comprenden niveles modulados (por ejemplo, menores o, en algunos casos, mayores) de enlaces terminales de gal-a- 1 , 3 -gal .
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención comprende métodos para evaluar una población de células de ovario de hámster chino (CHO) . En ciertas modalidades, el método de prueba incluye: (a) proporcionar una o más células CHO de la población; y (b) medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa producidos por estas células, donde las células CHO no se diseñaron genéticamente para expresar una secuencia que codifica la alfa-galactosil transferasa.
La etapa de medición puede incluir cualquiera de las siguientes: (a) aislar las glicoproteínas producidas por las células y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa en las glicoproteínas , (b) aislar una composición específica de glicoproteínas producida por las células y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3-galactosa en la composición aislada de glicoproteínas, (c) aislar los glicanos de las glicoproteínas producidas por las células y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa en los glicanos aislados, (d) escindir los monosacáridos de los glicanos presentes en la glicoproteína o en una o más células CHO y detectar los residuos terminales de alfa-galactosa liberados de los monosacáridos escindidos, (e) proporcionar al menos un péptido de una glicoproteína producida por las células y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa en al menos un péptido, (f) medir un nivel relativo de glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa en la glicoproteína mediante la medición de glicanos sobre la superficie celular de una o más de las células CHO. La técnica utilizada para medir los enlaces terminales de gal-a-1,3 -gal puede incluir uno o más de los siguientes métodos y combinaciones de cualquiera de estos métodos : métodos cromatográficos , métodos de espectrometría de masas (MS) , métodos electroforéticos (como electroforesis capilar) , métodos de resonancia magnética nuclear (NMR) , análisis de raonosacáridos , métodos de fluorescencia, absorbancia UV-VIS, métodos enzimáticos y uso de una molécula de detección (como un anticuerpo o lectina) .
La fuente de glicanos para la medición de la etapa 2 puede seleccionarse del grupo que consiste en: la población de células CHO; glicoproteínas o glicanos expresados en la superficie de las células CHO; péptidos derivados de la escisión de proteínas presentes en la superficie de las células de la población de las células CHO; glicanos presentes en la superficie de la población de las células CHO; glicoproteínas secretadas o expresadas por la población de las células CHO, un producto aislado de la expresión de glicoproteínas expresado a partir de una célula CHO o población de células CHO; péptidos derivados del producto aislado de la expresión de proteínas expresado a partir de una célula CHO o población de células CHO; o glicanos derivados del producto aislado de la expresión de proteínas expresado a partir de una célula CHO o directamente a partir de una población de células CHO. En algunas modalidades, el método incluye tratar una fuente de glicanos o glicopéptidos con una o más exoglicosidasas , que incluye una enzima alfa-galactosidasa, seguida del análisis de una población de glicanos .
En algunas modalidades, el método utilizado proporciona una medida cuantitativa de glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa. En algunas modalidades, el método utilizado proporciona una medida cualitativa.
En algunas modalidades, el método incluye además preparar una preparación de glicoproteínas a partir de un cultivo de células CHO, mediante la escisión de uno o más glicanos de la preparación de glicoproteínas (por ejemplo, con una o más glicosidasas como las a-1, 3-galactosidasas a-1, 4 -galactosidasas o a-1, 6-galactosidasas) y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3-galactosa .
En ciertas modalidades, el método se lleva a cabo durante la producción de una glicoproteína terapéutica mediante la obtención de una muestra de un cultivo de células CHO de la linea de producción, por ejemplo, para controlar la estructura de glicanos durante la producción. En ciertas modalidades, la etapa de medición se repite al menos una vez con el paso del tiempo, por ejemplo, la etapa de medición se repite al menos una vez, dos veces, tres veces o más durante el periodo de tiempo de cultivo de las células CHO. En otras modalidades, el método se lleva a cabo sobre un producto de glicoproteína producido a partir de células CHO, por ejemplo, como parte de una prueba de calidad o liberación del producto de glicoproteína.
En algunas modalidades, la etapa de medición incluye comparar el nivel de glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa en una primera preparación de glicoproteínas producida a partir de una primera población de células CHO con el nivel de glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa- 1-3 -galactosa en una segunda preparación de glicoproteínas producida a partir de una segunda población de células CHO. En algunas de estas modalidades, se determinan y comparan los glicanos de una preparación de glicoproteínas a partir de poblaciones de células CHO cultivadas en diferentes condiciones de cultivo.
En algunas modalidades, el método puede comprender además una etapa de comparar el nivel de glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa con un nivel de referencia (por ejemplo, con un nivel de control o con un intervalo o valor en la especificación de un producto) .
En ciertas modalidades del método la etapa de medición incluye el uso de una molécula de detección que es capaz de detectar la presencia o ausencia de residuos terminales de alfa-galactosil . En ciertas modalidades, la molécula de detección comprende un anticuerpo que es capaz de unirse a los epítopos terminales de alf -galactosil . En otras modalidades de la invención, la molécula de detección comprende una lectina. En algunas modalidades, la molécula de detección puede comprender una porción fluorescente o una porción radioisotópica .
La población de células CHO puede comprender una población de células clónales. La población de células CHO puede encontrarse en cultivo, por ejemplo, o una muestra de un cultivo celular en un biorreactor para la fabricación de una glicoproteína terapéutica. En ciertas modalidades, la población de células CHO podrá transformarse con al menos un vector que codifica una glicoproteína terapéutica. La glicoproteína terapéutica puede ser de origen humano, no humano o sintético. La glicoproteína terapéutica puede ser para el tratamiento de humanos o indicaciones veterinarias.
En algunas modalidades, el método incluye además una etapa de evaluación de la actividad biológica de la glicoproteína producida por la célula, por ejemplo, evaluar la presencia o nivel de potencial inmunogénico de la glicoproteína, por ejemplo, in vitro o in vivo, por ejemplo, en un modelo animal .
En un segundo aspecto, la invención comprende métodos para detectar una o más células de ovario de hámster chino (CHO) por su habilidad de producir glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa- 1-3 -galactosa en una glicoproteína, el método comprende: (a) proporcionar una pluralidad de poblaciones de células CHO donde ninguna de la pluralidad se diseñó genéticamente para producir residuos terminales de alfa- galactosil en glicanos (por ejemplo, no se diseñaron genéticamente para expresar una secuencia que codifica la alfa-galactosil transferasa) ; (b) cultivar cada una de la pluralidad de células CHO en condiciones adecuadas para la expresión de un producto de la expresión de glicoproteínas; (c) medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa producidos por cada una de la pluralidad de células CHO, y (d) seleccionar una o más de la pluralidad de preparaciones de células CHO basadas en la presencia de un nivel diana de residuos terminales de galactosa-alfa-1-3-galactosa producidos por la preparación de células CHO seleccionada.
Los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa pueden obtenerse y medirse a partir de glicoproteínas producidas por las preparaciones de células CHO, a partir de un producto aislado de expresión de glicoproteínas de las preparaciones de células CHO, a partir de péptidos obtenidos a partir de un producto de la expresión de glicoproteínas de las preparaciones de células CHO, a partir de los glicanos de la superficie celular de las preparaciones de células CHO o a partir de preparaciones de glicanos obtenidas a partir de preparaciones de células CHO o a partir de su producto de expresión de glicoproteínas . En ciertas modalidades, el método de detección comprende además la etapa de aislar un producto de expresión de glicoproteínas del cultivo celular y medir los residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa en una glicoproteína producida por las células en la etapa (c) . En ciertas modalidades, el método de detección de células comprende además la etapa de cuantificar la cantidad de residuos de alfa-galactosil presentes en el producto de expresión de glicoproteínas. En ciertas modalidades, la etapa (b) del método de detección de células se lleva a cabo en un biorreactor.
Cada una de la pluralidad de poblaciones de células CHO puede comprender una población de CHO de cepa diferente, una población de células clónales diferente o diferentes muestras (por ejemplo, muestras tomadas con el paso del tiempo) de un cultivo celular en un tren de fabricación para una glicoproteína terapéutica. En ciertas modalidades, la población de células CHO podrá transformarse con al menos un vector que codifica una glicoproteína terapéutica, por ejemplo, una glicoproteína terapéutica humana. En ciertas modalidades del método de detección de células, el producto de expresión de glicoproteínas es una glicoproteína secretada expresada a partir de las células CHO.
La etapa de medición del método de detección puede incluir cualquier técnica divulgada en la presente para identificar y/o cuantificar los residuos terminales de alfa- galactosil en una glicoproteína .
En un tercer aspecto, la invención incluye un método para evaluar una composición de glicoproteínas producida en un hospedero de células CHO. El método incluye medir la cantidad de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en una composición de glicoproteínas, donde la composición de glicoproteínas se produjo en células hospederas CHO y donde las células hospederas CHO no estaban diseñadas genéticamente para expresar una secuencia que codifica la alfa-galactosil transferasa.
En algunas modalidades, el método incluye registrar el nivel de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas en un medio de impresión o medios legibles por computadora.
En algunas modalidades, el método incluye además comparar el nivel medido de galactosa-alfa- 1-3 -galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas con un nivel de referencia, como una especificación de control o referencia. El nivel de referencia puede ser un criterio de especificación (por ejemplo, una etiqueta de la FDA o prospecto del médico) o de calidad para una preparación farmacéutica que contiene la composición de glicoproteínas.
En algunas modalidades, el nivel de referencia o criterio de calidad no es mayor que un 5% de galactosa-alfa-1-3 -galactosa terminal presente en una composición de glicoproteínas , por ejemplo, no mayor que un 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,2%, 0,1% o menos. El nivel de galactosa-alfa-l-3-galactosa presente en una composición de glicoproteínas puede medirse como el nivel de glicanos que contienen galactosa-alfa-1-3 -galactosa con relación a la cantidad total de glicanos en una muestra, como una preparación de glicoproteínas.
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1 , 3-gal incluye un método cromatográfico .
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1, 3-gal incluye métodos de espectrometría de masas (MS) .
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1, 3-gal incluye métodos electroforéticos (como la electroforesis capilar) .
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1, 3-gal incluye métodos de resonancia magnética nuclear (NMR) .
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1, 3-gal incluye el análisis de monosacáridos .
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1, 3-gal incluye métodos de fluorescencia.
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1, 3-gal incluye la absorbancia UV-VIS.
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1, 3-gal incluye métodos enzimáticos .
En una modalidad, la técnica empleada para medir los enlaces terminales de gal-a-1 , 3-gal incluye el uso de una molécula de detección (como un anticuerpo o lectina) .
Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es una representación del pentasacárido nuclear común a las estructuras de N-glicanos.
La figura 2 es una representación de la estructura del extremo no reductor de N-glicano que tiene un enlace gal-a-1, 3-gal.
La figura 3 es un cromatograma de fluorescencia de una fracción de glicanos derivada de Abatacept que muestra la detección de una especie de glicano con la composición de HexNAc Hex6Fuc1 que puede corresponder a una estructura que contiene galactosa-a-1-3 enlazada a galactosa.
La figura 4 ilustra el espectro MS2 de una especie de glicano derivada de Abatacept con la composición de HexNAc Hex6Fuci . El espectro se correlaciona con una estructura de glicano que contiene un extremo no reductor de galactosa-al-3 -galactosa .
La figura 5 es un cromatograma de fluorescencia de una fracción de glicanos derivada de Abatacept y una proteína de control (que asimismo contiene un glicano con la composición de HexNAc4Hex6FuCi) antes y después del tratamiento con a-galactosidasa .
La figura 6 es un espectro MS2 de las especies con la composición de HexNAc4Hex5Fuc1 generadas a partir del tratamiento de la fracción de glicano derivada de Abatecept con alfa galactosidasa.
La figura 7 ilustra un espectro MALDI-MS, una fracción de glicanos derivada de Abatacept tratada con diferentes exoglicosidasas .
Definiciones A menos que se defina de otra forma a continuación, todos los términos utilizados en la presente se utilizan en su significado habitual, como lo entenderla un entendido en la técnica.
Aproximadamente, alrededor de, Ca. : Como se utiliza en la presente, los términos "aproximadamente", "alrededor de" o "ca.", como se aplica a uno o más valores de interés, se refieren a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas modalidades, los términos "aproximadamente", "alrededor de" o "ca.", se refieren a un intervalo de valores que se encuentra entre un 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos con respecto al valor de referencia establecido.
Detección, detectar: Como se utiliza en la presente, los términos "detectar", "detección" y "medios de detección" se utilizan de forma intercambiable para referirse a la determinación de si una porción química particular, como un residuo terminal de alfa-1, 3-galactosil, se encuentra presente o ausente en un compuesto, composición, célula o población de células. Los medios de detección pueden implicar un marcador seleccionable o una característica identificable como una porción fluorescente o radioactiva y pueden implicar el marcado de un reactivo, compuesto, célula o población de células. La detección puede asimismo referirse al análisis de un compuesto, composición, célula o población de células, mediante el uso de técnicas como la espectrometría de masas o métodos relacionados, métodos electroforéticos , resonancia magnética nuclear, métodos cromatograficos o combinaciones de los anteriores, para determinar la presencia o ausencia de una porción química en un compuesto, composición, célula o población de células. La detección puede implicar además la cuantificación de los niveles absolutos o relevantes de la porción química que se está detectando.
Glicano: Como se conoce en la técnica y se utiliza en la presente los "glicanos" son azúcares. Los glicanos pueden ser monómeros o polímeros de residuos de azúcar, pero generalmente contienen al menos tres azúcares y pueden ser lineales o ramificados. El glicano puede incluir residuos naturales de azúcar (por ejemplo, glucosa, N-acetilglucosamina, ácido N-acetil neuramínico, galactosa, mañosa, fucosa, hexosa, arabinosa, ribosa, xilosa, etc.) y/o azúcares modificados (por ejemplo, 2 ' -fluororribosa, 2'-deoxirribosa, fosfomanosa, 6'sulfo N-acetilglucosamina, etc.). El término "glicano" incluye homo y heteropolímeros de residuos de azúcar. El término "glicano" abarca asimismo un componente glicano de una glicoproteína (por ejemplo, de una glicoproteína, glicolípido, proteoglicano, etc.) . El término abarca asimismo glicanos libres, que incluyen glicanos que se escindieron o de otro modo se liberaron de una glicoproteína.
Preparación de glicanos: El término "preparación de glicanos" como se utiliza en la presente se refiere a un conjunto de glicanos obtenidos de conformidad con un método de producción particular. En algunas modalidades, la preparación de glicanos se refiere a un conjunto de glicanos obtenidos a partir de una preparación de glicoproteínas (ver la definición de preparación de glicoproteínas a continuación) . En algunas modalidades, la preparación de glicanos incluye glicoproteínas. En algunas modalidades, la preparación de glicanos incluye glicanos liberados.
Glicoproteína: Como se utiliza en la presente, el término "glicoproteína" se refiere a una "proteína" (como se define en la presente) que contiene una estructura principal de péptido unida covalentemente a una o más porciones de azúcar (es decir, glicanos) . Como lo entienden los entendidos en la técnica, la estructura principal de péptido generalmente comprende una cadena lineal de residuos de aminoácidos. La/s porción/es pueden encontrarse en la forma de monosacáridos , disacáridos, oligosacáridos y/o polisacáridos . La/s porción/es puede/n comprender una cadena simple no ramificada de residuos de azúcar o puede comprender una o más cadenas ramificadas. En ciertas modalidades, las porciones de azúcar pueden incluir grupos sulfato y/o fosfato. De forma alternativa o adicional, las porciones de azúcar pueden incluir acetilo, glicolilo, propilo u otras modificaciones de alquilo. En ciertas modalidades, las glicoproteínas contienen porciones de azúcar ligadas a O; en ciertas modalidades las glicoproteínas contienen porciones de azúcar ligadas a N.
Preparación de glicoproteínas: La "preparación de glicoproteínas", como el término se utiliza en la presente, se refiere a un conjunto de moléculas de glicoproteína individuales, cada una de las cuales comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos particular (donde la secuencia de aminoácidos incluye al menos un sitio de glicosilación) y al menos un glicano enlazado covalentemente a al menos un sitio de glicosilación. Las moléculas individuales de una glicoproteína particular dentro de la preparación de glicoproteínas generalmente tienen secuencias de aminoácidos idénticas pero pueden diferir en la ocupación de al menos un sitio de glicosilación y/o en la identidad de los glicanos unidos a al menos un sitio de glicosilación. Es decir, la preparación de glicoproteínas puede contener solamente una glicoforma simple de una glicoproteína particular, pero más típicamente contiene una pluralidad de glicoformas. Las diferentes preparaciones de la misma glicoproteína pueden diferir en la identidad de las glicoformas presentes (por ejemplo, una glicoforma que se encuentra presente en una preparación puede no estar presente en otra) y/o en las cantidades relativas de las diferentes glicoformas.
Glicosidasa: El término "glicosidasa" como se utiliza en la presente, se refiere a un agente que escinde un enlace covalente entre los azúcares secuenciales en un glicano o entre el azúcar y la porción de la estructura principal (por ejemplo, entre la estructura principal de azúcar y péptido de la glicoproteína) . En algunas modalidades, la glicosidasa es una enzima. En ciertas modalidades, la glicosidasa es una proteína (por ejemplo, una enzima proteica) que comprende una o más cadenas de polipéptidos . En ciertas modalidades, la glicosidasa es un agente de escisión químico, por ejemplo, hidrazina.
N-glicano: El término "N-glicano" como se utiliza en la presente, se refiere a un polímero de azúcares que se liberó de una glicoproteína pero que se encontraba anteriormente ligado a una glicoproteína a través de un enlace de nitrógeno (ver la definición de glicano ligado mediante N a continuación) .
Glicano ligado mediante N: Los glicanos ligados mediante N son glicanos que se encuentran ligados a una glicoproteína a través de un enlace de nitrógeno. Existe una variedad diversa de glicanos mediante N, pero generalmente se basan en el pentasacárido nuclear común (Man) 3 (GlcNAc) (GlcNAc) .
O-glicanos: El término "0-glicano" como se utiliza en la presente, se refiere a un polímero de azúcares que se liberó de un glicoconjugado pero que se encontraba anteriormente ligado al glicoconj ugado a través de un enlace de oxígeno (ver la definición de glicano mediante 0 a continuación) .
Glicanos ligados mediante 0: Los glicanos ligados mediante O son glicanos que se encuentran ligados a un glicoconjugado a través de un enlace de oxígeno. Los glicanos ligados mediante 0 generalmente se encuentran ligados a glicoproteínas a través de la N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) o a través de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) al grupo hidroxilo de L— serina (Ser) o L-treonina (Tlir) . Algunos glicanos ligados mediante 0 pueden además presentar modificaciones como la acetilación y sulfación.
Modular: El término "modular" como se utiliza en la presente, se refiere a la habilidad de un actor de controlar, dentro de los límites prescritos, el valor de un parámetro, como el nivel de residuos de alfa-galactosa presentes en una composición de glicoproteínas . Por tanto, en algunas modalidades, el nivel de residuos de alfa-galactosa puede modularse de forma tal que se mantiene dentro de los límites preestablecidos. En algunas modalidades, el nivel de residuos de alfa-galactosa puede modularse de forma tal que no supera más de un 5,0%, 1,0%, 0,5%, 0,1%, 0,05% o 0,01% del total de N-glicanos presentes en una composición de glicoproteínas. En otras modalidades, el nivel de residuos de alfa-galactosa puede modularse de forma tal que no varía más de un 10,0%, 5,0%, 1,0%, 0,5% o 0,1% con respecto a un nivel preestablecido o deseado.
Proteasa: El término "proteasa" como se utiliza en la presente, se refiere a un agente que escinde un enlace peptídico entre los aminoácidos secuenciales en una cadena de polipéptidos . En algunas modalidades, la proteasa es una enzima (es decir, una enzima proteolítica) . En ciertas modalidades, la proteasa es una proteína (por ejemplo, una enzima proteica) que comprende una o más cadenas de polipéptidos . En ciertas modalidades, la proteasa es un agente de escisión químico.
Proporcionar: El término "proporcionar" como se utiliza en la presente se refiere a un actor que obtiene un producto, como células CHO, preparación de células CHO o preparación de glicoproteínas , a partir de cualquier fuente, incluidas a modo no taxativo, la obtención mediante la fabricación del propio actor o mediante la recepción por parte del actor del producto proporcionado por otra parte. Por ejemplo, se proporciona una preparación de células CHO si esta es preparada o recibida por cualquier máquina, persona o entidad. En algunas modalidades, una máquina puede recibir una preparación de células CHO, la cual luego realizará una o más pruebas, procesos o refinamientos de la preparación de glicoproteínas. En algunas modalidades, una persona puede recibir la preparación de células CHO. En algunas modalidades, una entidad externa puede recibir la preparación de células CHO. En algunas modalidades, una persona o negocio que realice la caracterización de servicios para una segunda persona o empresa, puede recibir la preparación de células CHO.
Residuo terminal de a-1, 3 -galactosa; enlace terminal de gal-a-1, 3-gal: Los términos "residuo terminal de -1 , 3 -galactosa" , "enlaces terminales de gal-a-1, 3-gal" y "residuo del extremo no reductor de galactosa unida a través a-1,3" como se utilizan en la presente, de forma intercambiable, describen la estructura de glicano ilustrada en la figura 2, en la cual una estructura de glicano que puede encontrarse unida a los extremos de un péptido o proteína con dos residuos de galactosa que se encuentran ligados el uno al otro en los residuos denominados como los residuos 1 y 3, respectivamente, en las moléculas de galactosa .
Descripción Detallada de la Invención A pesar de que las células hospederas utilizadas para la síntesis de glicoproteínas recombinantes poseen el mecanismo intracelular para producir una glicosilación compleja, estas células no siempre poseen el mismo complemento de enzimas que las células en donde la glicoproteína se expresa naturalmente. La selección clonal de líneas celulares y las variaciones en las condiciones de fabricación pueden producir asimismo una heterogeneidad en las glicoproteínas expresadas en las células cultivadas. El rol funcional de la glicosilación en la actividad de las glicoproteínas requiere una caracterización cuidadosa de los productos terapéuticos producidos en líneas celulares.
Se ha informado anteriormente que los enlaces terminales gal-a-1 , 3 -gal no se encuentran presentes en las glicoproteínas recombinantes producidas por las células de ovario de hámster chino (CHO) . Chung et al . , N Engl J Med, 358:11 (2008). La presente descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento inesperado de que los residuos terminales de a- 1 , 3 -galactosa pueden encontrarse en las glicoproteínas producidas por las células CHO y por tanto es importante identificar, monitorear y controlar este aspecto de la estructura de glicanos cuando se utilizan células CHO para elaborar productos terapéuticos .
La presente descripción proporciona métodos para analizar la composición de glicanos en las glicoproteínas producidas mediante células CHO. De conformidad con la presente descripción, los glicanos de preparaciones de glicoproteínas producidas en células CHO pueden analizarse para determinar si incluyen los residuos terminales de a-1,3-galactosa. La presente descripción proporciona métodos para detector estas modificaciones y métodos para producir glicoporteínas que incluyen o carecen de estas modificaciones .
Preparaciones de glicanos: La presente descripción proporciona métodos para analizar la estructura y/o composición de glicanos individuales dentro de una preparación de glicanos, por ejemplo, evaluar los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa producidos mediante células CHO, por ejemplo, evaluar los residuos de alfa-galactosil en las glicoproteínas producidas mediante células CHO . La preparación de glicanos puede obtenerse a partir de una preparación de células o a partir de una glicoproteína mediante cualquier método disponible en la técnica. En general, la obtención de una preparación de glicanos comprende las siguientes etapas: (1) obtener una preparación de células o glicoproteínas; y (2) opcionalmente liberar los glicanos de la célula o preparación de glicoproteínas. En algunas modalidades, obtener una preparación de glicanos comprende opcionalmente marcar la preparación de glicanos con un marcador detectable.
Preparaciones de glicoproteínas: Se han descrito los métodos para la producción recombinante de glicoproteínas . Las glicoproteínas secretadas por células cultivadas pueden aislarse y purificarse mediante cualquier medio disponible, como la cromatografía de intercambio aniónico, la cromatografía de fase inversa, la filtración en gel, la cromatografía por inmunoafinidad y sus combinaciones.
Preparación de Glicanos ligados a N En algunas modalidades, la preparación de N-glicanos se obtiene mediante la proporción de una población de glicoproteínas y la extracción de los glicanos unidos mediante N de las glicoproteínas en la población.
En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante N se extraen de las glicoproteínas (por ejemplo, glicoproteínas) mediante digestión. Generalmente, las glicanasas para utilizarse de conformidad con la presente descripción se escinden entre los residuos de GlcNAc-Asn, GlcNAc-GlcNAc , o Man-GlcNAc del núcleo. Las enzimas ejemplares que pueden utilizarse para extraer los glicanos ligados mediante N de las glicoproteínas incluyen, a modo no taxativo, la N-glicanasa F y/o N-glicanasa -A, O-glicanasa y/o Endo H.
En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante N se extraen de las glicoproteínas mediante escisión química. Para proporcionar algunos ejemplos, puede utilizarse hidrazina, borohidruro de sodio y/o ácido trifluorometansulfónico (TFMS) para extraer los glicanos de la glicoproteína .
Preparación de Glicanos ligados a O En algunas modalidades, la preparación de glicanos ligados mediante O se obtiene mediante la proporción de una población de glicoproteínas (por ejemplo, glicoproteína) y la extracción de los glicanos ligados mediante O de las glicoproteínas en la población.
En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante O se extraen de las glicoproteínas (por ejemplo, glicoproteínas) mediante eliminación-b . En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante O se extraen de las glicoproteínas (por ejemplo, glicoproteínas) mediante eliminación-b reductiva. En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante O se extraen de las glicoproteínas (por ejemplo, glicoproteínas) mediante eliminación-b no reductiva.
En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante 0 se extraen de una preparación de glicoproteínas (por ejemplo, una glicoproteína) mediante la incubación de la preparación en una solución que incluye el tetrahidroborato alcalino. En algunas modalidades se utiliza el tetradeuterioborato, por ejemplo, para incorporar un marcador de deuterio para facilitar la detección de los glicanos ligados a O. En varios métodos ejemplares, una preparación de glicoproteínas se incuba en una solución que contiene NaBH4 0,8-1,0 M y NaOH 0,05-0,1 M a 42-45°C durante 2-24 horas. La reacción para extraer los glicanos ligados mediante O puede finalizarse mediante la adición de ácido (por ejemplo, HC1 1,0 M) .
En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante O se extraen de una preparación de glicoproteínas mediante la incubación de la preparación en una solución que incluye NaOH. En varios métodos ejemplares, se incuba una glicoproteína en una solución que contiene NaOH 50-200 mM a 27-45°C durante 2-48 horas. La reacción puede finalizarse mediante la adición de ácido.
En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante O se extraen de una preparación de glicoproteínas mediante la incubación de la preparación en una solución que incluye NH4OH. En varios métodos ejemplares, se incuba una glicoproteína en una solución que contiene 25-28% de NH40H a 45-60°C durante 2-40 horas. La reacción puede finalizarse mediante la extracción del NH4OH bajo vacío. En algunas modalidades, la solución incluye carbonato de amonio (por ejemplo, a una concentración de saturación) . En algunas modalidades, la preparación tratada con NH4OH se trata con ácido (por ejemplo, ácido bórico) .
En algunas modalidades, los glicanos ligados mediante O se extraen de una preparación de glicoproteínas mediante la incubación de la preparación en una solución acuosa que incluye etilamina (por ejemplo, etilamina a aproximadamente el 70%) o metilamina (por ejemplo, metilamina a aproximadamente el 40%) , durante aproximadamente 4-24 horas .
En algunas modalidades, la preparación de glicanos ligados mediante O se obtiene a partir de una población de glicoproteínas de la cual se extrajeron los glicanos ligados mediante N.
Glicanos de marcado En algunas modalidades, los marcadores pueden asociarse a los glicanos antes o después de la liberación de una glicoproteína. Los glicanos ligados mediante N o los glicanos ligados mediante 0 (por ejemplo, N-glicanos que se extrajeron de una población de glicoproteínas) pueden asociarse a uno o más marcadores detectables. Los marcadores detectables generalmente se encuentran asociados a los extremos reductores de los glicanos. En algunas modalidades, los marcadores detectables son porciones fluorescentes. Los fluoróforos ejemplares que pueden utilizarse de conformidad con la presente descripción incluyen, a modo no taxativo, ácido 2-aminobenzoico (2AA) , 2-aminobenzamida (2AB) y/o 2-aminopurina (2AP) . En general, los fluoróforos para el uso de conformidad con la presente descripción se caracterizan por tener reactividad con el extremo reductor de un oligosacárido y/o monosacárido en condiciones que no dañan y/o destruyen el glicano. En algunas modalidades, las porciones fluorescentes se unen a los extremos reductores directamente. Por ejemplo, el enlace directo puede realizarse mediante conjugación directa a través de afinación reductiva. En algunas modalidades, las porciones fluorescentes se unen a los extremos reductores indirectamente. Por ejemplo, el enlace indirecto puede realizarse mediante un brazo de unión reactivo.
En algunas modalidades, los marcadores detectables comprenden porciones radioactivas o moléculas marcadas isotópicamente. Las porciones radioactivas ejemplares que pueden utilizarse de conformidad con la presente descripción incluyen, a modo no taxativo, tritio (3H) , deuterio (2H) , y/o 35S. Generalmente, estas porciones se encuentran unidas directamente o de otro modo asociadas al fluoróforo. Para proporcionar un ejemplo de un fluoróforo radioactivo, la 2AP puede modificarse de forma tal que todos los hidrógenos son deuterados .
Liberación de glicanos La presente descripción proporciona métodos mejorados para determinar los patrones de glicosilación de las glicoproteínas . Tales métodos pueden implicar someter a una población de glicanos a una o más exoglicosidasas y analizar la estructura y/o composición de los productos de digestión. En algunas modalidades, las exoglicosidasas utilizadas de conformidad con la presente descripción reconocen y escinden únicamente un tipo particular de enlace glicosídico. En algunas modalidades, las exoglicosidasas utilizadas de conformidad con la presente descripción reconocen y escinden más de un tipo particular de enlace glicosídico. Entre las exoglicosidasas que pueden resultar útiles para la presente invención se encuentran las a-galactosidasas , ß-galactosidasas ; hexosaminidasas , manosidasas; y sus combinaciones como se describe en la tabla 1.
Exoglicosidasas Las exoglicosidasas son enzimas que escinden los enlaces glicosídicos terminales del extremo no reductor de los glicanos. Generalmente son altamente específicas a los enlaces de monosacáridos particulares y a la anomericidad (a/ß) . En algunas modalidades, los patrones de ramificación vecinos pueden afectar la especificidad de la exoglicosidasa . El tratamiento de la exoglicosidasa generalmente resulta en glicanos de enlaces de antena estándares que se escinden al núcleo de pentasacárido (M3N2) que contiene 3 residuos de mañosa y 2 de GlcNAc. No obstante, las especies modificadas de forma no habitual (por ejemplo, especies fucosiladas en el núcleo o en las antenas, glicanos de alta mañosa e híbridos, glicanos extendidos por lactosamina, glicanos sulfatados, glicanos fosforilados , etc.) son resistentes al tratamiento con exoglicosidasa y pueden resolverse y cuantificarse mediante cromatografía con relación al pentasacárido M3N2.
Las exoglicosidasas ejemplares que pueden utilizarse de conformidad con la presente descripción incluyen, a modo no taxativo, sialidasa, galactosidasa, hexosaminidasa, fucosidasa y manosidasa. Las exoglicosidasas pueden obtenerse a partir de cualquier fuente, incluidas las fuentes comerciales o mediante el aislamiento y/o purificación a partir de una fuente celular (por ejemplo, bacteria, levadura, planta, etc.).
En algunas modalidades, las exoglicosidasas (por ejemplo, sialidasas, galactos idasas , hexosaminidasas , fucosidasas y manosidasas) pueden dividirse en múltiples categorías o "subgrupos". En algunas modalidades, los diferentes subgrupos muestran diferentes habilidades para escindir diferentes tipos de enlaces . La tabla 1 presenta algunas exoglicosidasas ejemplares, sus especificidades de enlace y el organismo del cual se deriva cada una de ellas. Un entendido en la técnica apreciará que la presente es una lista ejemplar, no exhaustiva, de exoglicosidasas y que cualquier exogl icos idasa que tenga cualquier especificidad de enlace puede utilizarse de conformidad con la presente descripción.
Tabla 1. Exoglicosidasas Clase de EC #* Actividad Organismo enzima oc-Sialidasa 3.2.1. a-2/3 ,6,8 Arthrobacter 18 (habitualmente sin ureafaciens especificidad de Vibrio cholerae enlace) Clostridium perfringens a-2,3 (NeuAc de Salmonella oligosacáridos) typhimurium Streptococcus pneumonía a-2/3, 6 (NeuAc del Clostridium complejo) perfringens ß- 3.2.1. Enlaces Gal ß - Testículos bovinos Galactosida 23 1/3,4,6 Especies de sa Xanthamonas Especies de Streptococcus E. coli Enlaces Gal ß - Canavalia 1/4,6 Enlace Gal ß -1, 4 Streptococcus pneumonía Enlace Gal ß -1,3 E. coli Especies de Xanthomonas Enlaces Gal ß Especies de 1/3,6 Xanthomonas E. coli ß 3.2.1. Hexosaminas ß Streptococcus Hexosamini- 52 1/2,3,4,6 plicatus dasa 3.2.1. Streptococcus 30 pneumonía Bacteroides Canavalia a- 3.2.1. -1-3 , 4-Fue Xanthomonas Fucosidasa 51 (habitualmente la Harina de almendra 3.2.1. estructura de Lewis 111 de deglicosilación) a-1/2 ,3,4, 6-Fuc Riñon bovino (habitualmente C. meningosepticum tiene una amplia especificidad) a-1 , 6-Fuc E. coli a-1, 2 -Fue Xanthomonas a- 3.2.1. a-1/2 , 3 , 6-Man Canavalia Manosidasa 24 a-1/2 , 3-Man Xanthomonas manihotis a-1, 6-Man Especies de (generalmente una Xanthomonas manosidasa nuclear) a-?, 2-Man Aspergillus saitoi ß 3.2.1. a-1 , 4 -Man Helix pomatia Manosidasa 25 * "EC #" se refiere al número de registro de la comisión enzimática.
De conformidad con la presente descripción, una población de glicanos puede digerirse con cualquier exoglicosidasa o cualquier conjunto de exoglicosidasas . En general, las reacciones de la exoglicosidasa se llevan a cabo en condiciones que son compatibles con la actividad enzimática. Por ejemplo, el pH, la temperatura, los componentes y la concentración de la solución de reacción (por ejemplo, sal, detergente, etc.) y la duración del tiempo de reacción pueden optimizarse para alcanzar un nivel deseado de actividad de exoglicosidasa . Ver, por ejemplo, la WO 2008/130926, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia.
Análisis de la estructura y actividad de los glicanos En general, los métodos de conformidad con la descripción comprenden someter a una preparación de glicanos a análisis para determinar si el glicano incluye un tipo particular de modificación (por ejemplo, residuos terminales de a- 1 , 3 -galactosa) . En algunas modalidades, el análisis comprende comparar la estructura y/o función de los glicanos en una preparación de glicoproteínas proveniente de una fuente con la estructura y/o función de glicanos en al menos otra preparación de glicoproteínas proveniente de otra fuente. En algunas modalidades, el análisis comprende comparar la estructura y/o función de los glicanos en una o más de las muestras con la estructura y/o función de los glicanos en una muestra de referencia.
La estructura y composición de los glicanos puede analizarse mediante cualquier método disponible. En algunas modalidades, la estructura y composición de los glicanos se analizan mediante métodos cromatográficos , métodos de espectrometría de masas (MS) , métodos cromatográficos seguidos por MS, métodos electroforéticos, métodos electroforéticos seguidos por MS, métodos de resonancia magnética nuclear (NMR) y sus combinaciones.
En algunas modalidades, la estructura y composición de los glicanos puede analizarse mediante métodos cromatográficos , que incluyen a modo no taxativo, la cromatografía líquida (LC) , cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) , cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (UPLC) , cromatografía de capa fina (TLC) , cromatografía en columna de amidas y sus combinaciones.
En algunas modalidades, la estructura y composición de glicanos puede analizarse mediante espectrometría de masas (MS) y métodos relacionados que incluyen, a modo no taxativo, MS en tándem, LC-MS, LC-MS/MS, espectrometría de masas láser de desorción/ionización asistida por matriz (MALDI-MS) , espectrometría de masas de transformada de Fourier (FTMS) , separación de movilidad de iones con espectrometría de masas (IMS-MS) , disociación por transferencia de electrones (ETD-MS) y sus combinaciones.
En algunas modalidades, la estructura y composición de glicanos puede analizarse mediante métodos electroforéticos que incluyen, a modo no taxativo, la electroforesis capilar (CE) , CE-MS, electroforesis en gel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de acrilamida, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) seguida de inmunotransferencia (Western blotting) mediante el uso de anticuerpos que reconocen estructuras de glicanos específicas y sus combinaciones.
En algunas modalidades, la estructura y composición de glicanos puede analizarse mediante resonancia magnética nuclear (NMR) y métodos relacionados que incluyen a modo no taxativo, NMR unidimensional (1D-NMR) , NMR bidimensional (2D-NMR) , resonancia magnética nuclear de espectroscopia de correlación de espín de ángulo magnético (COSY-NMR) , resonancia magnética nuclear de espectroscopia de correlación total (TOCSY-NMR) , resonancia magnética nuclear de correlación cuántica simple heteronuclear (HSQC-NMR) , correlación cuántica múltiple heteronuclear (HMQC-NMR) , resonancia magnética nuclear de espectroscopia nuclear rotacional basada en el efecto Overhauser (ROESY-NMR) , espectroscopia nuclear basada en el efecto Overhauser (NOESY-NMR) y sus combinaciones.
En algunas modalidades, las técnicas descritas en la presente pueden combinarse con una o más tecnologías adicionales para la detección, análisis y/o aislamiento de los glicanos o glicoproteínas . Por ejemplo, en ciertas modalidades, los glicanos se analizan de conformidad con la presente descripción mediante el uso de uno o más métodos disponibles (para proporcionar algunos ejemplos, véase Anumula, Anal. Bioche . 350(1) :1, 2006; Klein et al., Anal. Biochem. , 179:162, 1989; y/o Townsend, R.R. Carbohydrate Analysis" High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis . , Ed. Z. El Rassi, pp 181-209, 1995, cada uno de los cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Por ejemplo, en algunas modalidades, los glicanos se caracterizan mediante el uso de uno o más métodos cromatográficos , métodos electroforéticos, métodos de resonancia magnética nuclear y sus combinaciones. Tales métodos ejemplares incluyen, por ejemplo, NMR, espectrometría de masas, cromatografía líquida, cromatografía bidimensional , SDS-PAGE, tinción de anticuerpos, tinción de lectinas, cuantificación de monosacáridos , electroforesis capilar, electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) , cromatografía electrocinética micelar (MEKC) , tratamientos con exoglicosidasa o endoglicosidasa y sus combinaciones. Los entendidos en la técnica conocerán otras técnicas que pueden utilizarse para caracterizar los glicanos junto con los métodos descritos en la presente.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente permiten la detección de especies de glicanos (como los residuos terminales de alfa-galactosil) que se encuentran presentes a niveles bajos dentro de una población de glicanos. Por ejemplo, los presentes métodos permiten la detección de especies de glicanos que se encuentran presentes a niveles menores que un 10%, menores que un 5%, menores que un 4%, menores que un 3%, menores que un 2%, menores que un 1,5%, menores que un 1%, menores que un 0,75%, menores que un 0,5%, menores que un 0,25%, menores que un 0,1%, menores que un 0,075%, menores que un 0,05%, menores que un 0,025% o menores que un 0,01% dentro de una población de glicanos.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente permiten la detección de estructuras particulares (como los residuos terminales de alfa-galactosil) que se encuentran presentes a niveles bajos dentro de una población de glicanos. Por ejemplo, los presentes métodos permiten la detección de estructuras particulares que se encuentran presentes a niveles menores que un 10%, menores que un 5%, menores que un 4%, menores que un 3%, menores que un 2%, menores que un 1,5%, menores que un 1%, menores que un 0,75%, menores que un 0,5%, menores que un 0,25%, menores que un 0,1%, menores que un 0,075%, menores que un 0,05%, menores que un 0,025% o menores que un 0,01% dentro de una población de glicanos.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente permiten la detección de niveles relativos de especies de glicanos dentro de una población de glicanos. Por ejemplo, el área debajo de cada pico de una cromatografía líquida puede medirse y expresarse como un porcentaje del total. El análisis proporciona una cantidad porcentual relativa de cada especie de glicanos dentro de una población de glicanos. En otro ejemplo, los niveles relativos de especies individuales de glicanos se determinan a partir de las áreas de los picos en un experimento 1D- MR o a partir de los volúmenes de picos cruzados en un espectro 1H-15HSQC (por ejemplo, con corrección basada en las respuestas de los estándares) o mediante cuantificación relativa mediante la comparación del mismo pico en las diferentes muestras.
En algunas modalidades, se evalúa la actividad biológica de una preparación de glicoproteínas (por ejemplo, una preparación de glicoproteínas) . La actividad biológica de las preparaciones de glicoproteínas puede analizarse mediante cualquier método disponible. En algunas modalidades, se evalúa la actividad de unión de una glicoproteína (por ejemplo, la unión a un receptor) . En algunas modalidades, se evalúa la actividad terapéutica de una glicoproteína (por ejemplo, la actividad de una glicoproteína en la disminución de la gravedad o síntoma de una enfermedad o afección o en el retraso de la aparición de un síntoma de una enfermedad o afección) . En algunas modalidades, se evalúa la actividad farmacológica de una glicoproteína (por ejemplo, la biodisponibilidad, la farmacocinética y la farmacodinámica) . Para los métodos · para analizar la biodisponibilidad, la farmacocinética y la farmacodinámica de los productos terapéuticos de glicoproteína, ver, por ejemplo, Weiner et al., J Pharm Biomed Anal. 15(5):571-9, 1997; Srinivas et al., J. Pharm. Sci. 85(1): 1-4, 1996; y Srinivas et al., Pharm. Res. 14(7) :911-6, 1997.
Como lo entenderá un entendido en la técnica, la actividad biológica particular o la actividad terapéutica que puede probarse variará dependiendo de la glicoproteína particular .
La actividad potencial adversa o toxicidad (por ejemplo, la propensión a causar hipertensión, reacciones alérgicas, eventos trombóticos, crisis u otros eventos adversos) de las preparaciones de glicoproteínas puede analizarse mediante cualquier método disponible. En algunas modalidades, se evalúa la inmunogenicidad de una preparación de glicoproteínas, por ejemplo, mediante la determinación de si la preparación suscita una respuesta de anticuerpo en un suj eto .
En varias modalidades, la actividad biológica, actividad terapéutica, etc. de una preparación de glicoproteínas que tiene residuos terminales de alfa-galactosil se compara con una preparación de glicoproteínas que carece de residuos terminales de alfa-galactosil . En varias modalidades, la actividad biológica, actividad terapéutica, etc., de una preparación de glicoproteínas que tiene residuos terminales de alfa-galactosil se compara con una preparación de glicoproteínas que tiene un nivel diferente de residuos terminales de alfa-galactosil .
Aplicaciones Los métodos de la presente descripción pueden utilizarse para analizar los glicanos de glicoproteínas en cualquiera de una variedad de estados que incluyen, por ejemplo, glicanos libres, glicoproteínas (por ejemplo, glicopéptidos , glicolípidos , proteoglicanos , etc.), glicanos asociados a células (por ejemplo, glicanos asociados a la membrana, núcleos, citoplasma, etc.); glicanos asociados a componentes celulares, extracelulares , intracelulares, y/o subcelulares (por ejemplo, proteínas) ; glicanos en el espacio extracelular (por ejemplo, medio de cultivo celular), etc.
Los métodos de la presente descripción pueden utilizarse en una o más etapas del proceso de desarrollo para la producción de un producto terapéutico u otra glicoproteína comercialmente relevante. Los ejemplos no limitativos de estas etapas de desarrollo del proceso que pueden emplear métodos de la presente descripción incluyen la selección celular, selección clonal, optimización de medios, condiciones de cultivo, condiciones de proceso y/o procedimiento de purificación. Los entendidos en la técnica conocerán otras etapas de desarrollo del proceso.
La presente descripción puede utilizarse además para controlar el grado y/o tipo de glicosilación que ocurre en un cultivo celular particular (por ejemplo, el grado de residuos terminales de alfa-galactosil de una preparación de glicoproteínas producida en el cultivo celular) , lo que de ese modo permite el ajuste o la posible finalización del cultivo para, por ejemplo, alcanzar un patrón de glicosilación particular deseado o para evitar el desarrollo de un patrón de glicosilación particular indeseado.
La presente descripción puede utilizarse además para evaluar las características de glicosilación de las células o líneas celulares (por ejemplo líneas celulares CHO) que se consideran para la producción de una glicoproteína particular deseada (por ejemplo, incluso antes de que las células o líneas celulares hayan sido diseñadas para producir la glicoproteína o para producir la glicoproteína a un nivel comercialmente relevante) .
Por ejemplo, cuando la glicoproteína diana es una glicoproteína terapéutica, por ejemplo, que se sometió a revisión regulatoria en uno o más países, será habitualmente deseable controlar los cultivos para evaluar la probabilidad de que generen un producto con un patrón de glicosilación lo más próximo posible al patrón de glicosilación establecido del producto farmacéutico (por ejemplo, que tiene un nivel de residuos terminales de alfa-galactosil que es cercano al del producto farmacéutico) ya sea que se produzca mediante exactamente la misma vía o no. Como se utiliza en la presente "próximo", "cercano", se refiere a un patrón de glicosilación que tiene al menos aproximadamente un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de correlación con el patrón de glicosilación establecido del producto farmacéutico. En tales modalidades, las muestras del cultivo de producción generalmente se toman en diferentes intervalos de tiempo y se comparan con un estándar establecido o con un cultivo de control para evaluar la glicosilación relativa.
Por ejemplo, en algunas modalidades, los métodos para controlar la producción de una glicoproteína pueden comprender las siguientes etapas: (i) durante la producción de una glicoproteína, extraer al menos la primera y segunda muestra que contiene glicanos del sistema de producción; (ii) someter la primera y segunda muestra que contiene glicanos a un análisis para determinar si se encuentra presente alguna modificación particular (por ejemplo, residuos terminales de alfa-galactosil) ; y (iii) comparar los productos obtenidos de la primera muestra que contiene glicanos con aquellos obtenidos en la segunda muestra que contiene glicanos para determinar las diferencias y por tanto controlar el progreso de la producción de glicoproteínas . En algunas modalidades, la glicoproteína es abatacept . En algunas modalidades, el sistema de producción comprende células CHO .
Ya sea que se controle o no la producción de una proteína diana particular a los efectos de control de calidad, la presente descripción puede utilizarse, por ejemplo, para controlar la glicosilación en etapas de desarrollo particulares o en condiciones de cultivo particulares.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente pueden utilizarse para caracterizar, modular y/o controlar o comparar la calidad de los productos terapéuticos. Para proporcionar un ejemplo, las presentes metodologías pueden utilizarse para evaluar la glicosilación en células que producen un producto proteico terapéutico. Particularmente, dado que la glicosilación puede a menudo afectar la actividad, biodisponibilidad u otras características de un producto proteico terapéutico, los métodos para evaluar la glicosilación celular durante la producción del producto proteico terapéutico son particularmente deseables. Entre otras cosas, la presente descripción puede facilitar el análisis en tiempo real de la glicosilación en sistemas de producción para proteínas terapéuticas y, por tanto, puede lograrse la modulación de la glicosilación.
Los productos de glicoproteínas terapéuticos representativos cuya producción y/o calidad puede controlarse de conformidad con la presente descripción incluyen, por ejemplo, cualquiera de una variedad de agentes hematológicos (que incluyen, por ejemplo, eritropoyetina, factores coagulantes, etc.), interferones, factores estimuladores de colonias, anticuerpos, enzimas y hormonas.
Los productos representativos de glicoproteínas disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, aquellos presentados en la tabla 2, si se producen en células CHO: Tabla 2: Ejemplos de productos de glicoproteína sponibles comercialmente Producto proteico Fármaco de referencia Bivalirudina Angiomax Darbepoetina alfa Aranesp Bevacizumab Avastin Interferón beta-la; recombinante Avonex Factor IX de coagulación BeneFix" Interferón beta-lb Betaseron Tositumomab Bexxar Factor antihemofílico Bioclate" Hormona de crecimiento humana BioTropin" Toxina botulínica tipo A Botox Alemtuzumab Campath Acritumomab; marcado con technetium- CEA-Sean 99 Alglucerasa; modificada a partir de Ceredase beta-glucocerebrosidasa Imiglucerasa ; forma recombinante de Cerezyme beta-glucocerebrosidasa Crotalidae inmune Fab polivalente, CroFab ovino Digoxina inmune Fab, ovina DigiFab Rasburicasa Elitek Etanercept Enbrel"" Producto proteico Fármaco de referencia Epoietina alfa Epogen Cetuximab Erbitux" Algasidasa beta Fabrazyme1* Urofolitropina Fertinex" Folitropina beta Follistim Teriparatida Forteo Somatropina humana GenoTropm Glucagon GlucaGen Folitropina alfa Gonal-F Factor antihemofílico Helixate Factor antihemofílico; factor XIII Hemofil"" Trastuzumab Herceptm Insulina Humalog1" Factor antihemofílico/ complejo del Húmate-P factor Von Willebrand humano Somatotropina Humatrope Insulina humana Humulin® Ad limumab HUMIRA Hialuronidasa humana recombinante Hylenex Interferón alf con-1 Infergen Eptifibatida Integrxlm Interferón alfa Intron A Producto proteico Fármaco de referencia Insulina, regular; Novolin R® Insulina Novolin® Factor de coagulación Vlla NovoSeven" Sornatropina Nutropin" Inmunoglobulina intravenosa Octagam PEG-L-asparaginasa Oncaspar Abatacept, proteína de fusión humana Orencia completamente soluble muromomab-CD3 Orthoclone OKT3 Gonadotropina coriónica humana Ovidrel" Peginterferón alfa-2a Pegasys Versión pegilada de interferón alfa- PEG-Intron 2b Abarelix (suspensión inyectable) ; Plenaxis" antagonista de la hormona liberadora de gonadotropina Epoietina alfa Procrit Aldesleukin Proleukm, IL-2 Somatrema Protropm Dornasa alfa Pulmozyme'" Efalizumab; bloqueador de células T Raptiva reversible, selectivo Producto proteico Fármaco de referencia Combinación de ribavirina e Rebetron interferon alfa Interferón beta la Rebif Factor antihemofílico Recombmate rAHF/factor antihemofílico ReFacto Lepirudina Refludan Infliximab Remicade Abciximab ReoPro Reteplasa Retavase Rituximab Rituxan Interferón alfa-2a Roferon-A1" Somatropina Saizen Secretina sintética porcina SecreFlo Basiliximab Simulect" Eculizumab Soliris Pegvisomant Somavert Palivizumab; producido Synagis" recombinantemente, mAb humanizado Tirotropina alfa Thyrogen Tenecteplasa TNKase Natalizumab Tysabri Producto proteico Fármaco de referencia Soluciones intravenosas al 5% y 10% Venoglobulm-S de globulina inmune humana Interferón alfa-nl, linfoblastoide Wellferon Drotrecogina alfa Xigris Omalizumab; anticuerpo monoclonal Xolair" humanizado derivado de ADN dirigido a la inmunoglobulina-E Daclizumab Zenapax Ibritumomab tiuxetan Zevalm Somatotropina Zorbtive (Serostim ) En algunas modalidades, la descripción proporciona métodos en los cuales los glicanos de las glicoproteínas de diferentes fuentes o muestras se comparan entre sí . En algunos de tales ejemplos, se obtienen múltiples muestras de la misma fuente (por ejemplo, a partir de la misma fuente de células CHO) con el paso del tiempo, de forma tal de verificar los cambios en los patrones de glicosilación (y particularmente en los patrones de glicosilación de la superficie celular) (por ejemplo, los cambios en la presencia o grado de residuos terminales de alfa-galactosil) . En algunas modalidades, una de las muestras es una muestra histórica o un registro de una muestra histórica. En algunas modalidades, una de las muestras es una muestra de referencia.
En algunas modalidades, la descripción proporciona métodos en los cuales los glicanos de las glicoproteínas expresadas por diferentes fuentes de células se comparan entre sí. En algunas modalidades, una o más de las fuentes de células comparadas son células CHO.
En algunas' modalidades, los glicanos de diferentes muestras de cultivos celulares preparadas en condiciones que difieren en uno o más parámetros seleccionados (por ejemplo, tipo de célula, tipo de cultivo [por ejemplo, alimentación continua contra alimentación en lotes, etc.], condiciones de cultivo [por ejemplo, tipo de medio, presencia o concentración de componentes particulares de medios particulares, osmolaridad, pH, temperatura, tiempo o grado de giro en uno o más componentes como la osmolaridad, pH, temperatura, etc.], tiempo de cultivo, etapas de aislamiento, etc.) pero que son idénticos, se comparan para determinar los efectos del parámetro seleccionado sobre la glicosilación . En ciertas modalidades, se comparan los glicanos de diferentes muestras de cultivos celulares preparados en condiciones que difieren en un único parámetro seleccionado para determinar los efectos del único parámetro seleccionado sobre los parámetros de glicosilación (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos terminales de alfa-galactosil) . Entre otras aplicaciones, por tanto, el uso de técnicas como se describe en la presente, puede facilitar la determinación de los efectos de los parámetros particulares sobre los patrones de glicosilación en las células.
En algunas modalidades, se comparan los glicanos de diferentes lotes de una glicoproteína, ya sea preparados mediante el mismo método o mediante métodos diferentes y ya sea preparados simultáneamente o separadamente. En tales modalidades, la presente descripción facilita el control de calidad de una preparación de glicoproteínas . De forma alternativa o adicional, algunas de estas modalidades facilitan el control del progreso de un cultivo particular que produce una glicoproteína (por ejemplo, cuando las muestras se extraen del cultivo en diferentes intervalos de tiempo y se analizan y comparan unas con las otras) . En algunos ejemplos, las múltiples muestras de la misma fuente se obtienen con el paso del tiempo de forma tal que se controlan los cambios en los patrones de glicosilación. En algunas modalidades, las muestras que contienen glicanos se extraen en intervalos de aproximadamente 30 segundos, aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 2 minutos, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 12 horas, o aproximadamente 18 horas o incluso en intervalos más prolongados. En algunas modalidades, las muestras que contienen glicanos se extraen en intervalos irregulares. En algunas modalidades, las muestras que contienen glicanos se extraen en intervalos de 5 horas .
En algunas modalidades, los métodos de conformidad con la descripción pueden utilizarse para verificar el patrón de glicosilacion de las glicoproteínas durante el curso de su producción por las células. Por ejemplo, la producción de una glicoproteína (por ejemplo, producción comercial) puede implicar las siguientes etapas: (1) cultivar las células que producen la glicoproteína, (2) obtener muestras en intervalos regulares o irregulares durante el cultivo y (3) analizar el patrón de glicosilacion de las glicoproteínas en las muestras obtenidas. En algunas modalidades, tales métodos pueden comprender la etapa de comparar los patrones de glicosilacion de las glicoproteínas producidas en las muestras obtenidas entre sí. En algunas modalidades, tales métodos pueden comprender la etapa de comparar los patrones de glicosilacion de las glicoproteínas producidas en las muestras obtenidas con los patrones de glicosilacion de una muestra de referencia .
En cualquiera de estas modalidades, pueden registrarse las características del análisis de glicanos, por ejemplo en un registro de control de calidad. Como se indica anteriormente, en algunas modalidades, la comparación se realiza entre un registro histórico de un lote anterior o estándar y/o una muestra de referencia de glicoproteína.
En algunas modalidades, se comparan los glicanos de diferentes lotes de una glicoproteína particular, ya sea preparados mediante el mismo método o mediante métodos diferentes y ya sea preparados simultáneamente o separadamente entre sí y/o con una muestra de referencia. En algunas modalidades, la comparación lote a lote puede comprender las siguientes etapas: (i) proporcionar una primera preparación de glicanos de un primer lote de glicoproteínas , (ii) proporcionar una segunda preparación de glicanos de un segundo lote de glicoproteínas, (iii) someter la primera y la segunda preparación de glicanos a un procedimiento de análisis; y (iv) comparar los resultados del análisis obtenido a partir de la primera preparación de glicanos con los productos de escisión obtenidos a partir de la segunda preparación para evaluar la coherencia de los dos lotes. En algunas modalidades, las preparaciones de glicanos pueden proporcionarse mediante la extracción de al menos un glicano de al menos una glicoproteína de un lote y, opcionalmente , el aislamiento de los glicanos extraídos. En algunas modalidades, las preparaciones de glicanos pueden marcarse como se describe en la presente (por ejemplo, de forma fluorescente y/o radiactiva, por ejemplo, antes y/o después del aislamiento) .
En algunas modalidades, la presente descripción facilita el control de calidad de una preparación de glicoproteínas . Las características del análisis de glicanos puede registrarse, por ejemplo en el registro de control de calidad. Como se indica anteriormente, en algunas modalidades, la comparación se realiza entre un registro histórico de un lote anterior o estándar de glicoproteína . En algunas modalidades, la comparación se realiza con una muestra de glicoproteína de referencia.
En ciertas modalidades, la presente descripción puede utilizarse en estudios para modificar las características de glicosilación de una célula, por ejemplo para establecer una línea celular y/o condiciones de cultivo con una o más características de glicosilación deseables, por ejemplo, una línea celular que produce glicoproteínas que tienen, o carecen de residuos terminales de alfa-galactosil . Esta línea celular y/o condiciones de cultivo pueden utilizarse, si se desea, para la producción de una glicoproteína diana particular para la cual se espera que esta(s) característica (s) de glicosilación sea(n) beneficiosa (s) . En modalidades particulares, la célula es una célula CHO.
De conformidad con la presente descripción, las técnicas descritas en la presente pueden utilizarse para detectar glicanos deseables o indeseables, por ejemplo para detectar o cuantificar la presencia de uno o más contaminantes en un producto de glicoproteína o para detectar o cuantificar la presencia de una o más especies activas o deseadas .
En ciertas modalidades, los métodos descritos en la presente facilitan la detección de glicanos que se encuentran presentes a niveles bajos en una fuente (por ejemplo, una muestra biológica, preparación de glicanos, etc.). En tales modalidades, es posible detectar y/o cuantificar opcionalmente los niveles de glicanos que se encuentran presentes a niveles menores que aproximadamente un 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,075%, 0,05%, 0,025%, o 0,01% dentro de una población de glicanos. En algunas modalidades, es posible detectar y/o cuantificar opcionalmente los niveles de glicanos que comprenden entre el 0,1% y el 5%, por ejemplo, entre el 0,1% y el 2%, por ejemplo, entre el 0,1% y el 1% de una preparación de glicanos .
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente permiten la detección de enlaces particulares que se encuentran presentes a niveles bajos dentro de una población de glicanos. Por ejemplo, los presentes métodos permiten la detección de enlaces particulares (por ejemplo, enlaces terminales de gal-a-1 , 3 -gal) que se encuentran presentes a niveles menores que un 10%, menores que un 5%, menores que un 4%, menores que un 3%, menores que un 2%, menores que un 1,5%, menores que un 1%, menores que un 0,75%, menores que un 0,5%, menores que un 0,25%, menores que un 0,1%, menores que un 0,075%, menores que un 0,05%, menores que un 0,025% o menores que un 0,01% dentro de una población de glicanos.
En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente permiten la detección de niveles relativos de especies de glicanos dentro de una población de glicanos. Por ejemplo, el área debajo de cada pico de una cromatografía líquida puede medirse y expresarse como un porcentaje del total. El análisis proporciona una cantidad porcentual relativa de cada especie de glicanos dentro de una población de glicanos.
La presente descripción se ilustrará de forma más específica con referencia a los siguientes ejemplos. No obstante, debe entenderse que la presente descripción no se encuentra limitada por estos ejemplos en ninguna forma.
Un entendido en la técnica podrá prever fácilmente otras combinaciones dentro del alcance de la presente invención, en consideración del ejemplo con referencia a la memoria descriptiva proporcionada en la presente.
Ejemplos Ejemplo 1: Orencia™ (abatacept) es una proteína de fusión soluble que consiste en un dominio extracelular de antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico humano (CTLA-4) ligado a la porción Fe modificada (dominios bisagra, CH2 y CH3) de la inmunoglobulina humana Gl (IgGl) . El abatacept se produce mediante tecnología de ADN recombinante en un sistema de expresión celular mamífero. El peso molecular aparente de abatacept es 92 kilo Daltons . El Abatacept se utiliza para tratar los síntomas de la artritis reumatoide, para enlentecer la progresión del daño de las articulaciones y para mejorar la función física. La gran complejidad de este producto bioterapéutico que se debe a su glicosilación pesada (3 sitios de glicosilación ligados mediante N y dos ligados mediante O) requiere de una producción y caracterización cuidadosa. Dado que las diferentes modificaciones a la composición química de la proteína (modificaciones de la estructura principal de la proteína, glicosilación, etc.) pueden afectar la función biológica de la glicoproteína, es importante garantizar un buen control de las propiedades químicas y físicas de este producto bioterapéutico durante la fabricación .
El epítopo Gal-al-3Gal ("alfa-gal") no se encuentra generalmente en las proteínas humanas y no se espera en productos derivados de CHO. Este epítopo generalmente se observa en las proteínas aisladas de cerdos y ratones. Los humanos tienen anticuerpos circulantes contra el extremo Galal-3Gal y por tanto es importante controlar estas especies en los productos terapéuticos de glicoproteínas y entender cómo esto se relaciona con el desarrollo del proceso. La presente descripción indica la presencia de la estructura alfa-gal en el abatacept (que se expresa en células CHO) .
Procedimiento utilizado para analizar las especies de glicanos : Se aislaron los N-glicanos de la sustancia de fármaco mediante el tratamiento con PNGASE-F seguido de purificación por extracción en fase sólida. A continuación los glicanos se marcaron con 2AB y las fracciones seleccionadas luego se analizaron mediante LC-MS-MS. Las estructuras de glicanos se confirmaron adicionalmente a través de una combinación de exoglicosidasas , MALDI-MS y Lc-MS/MS .
Estos datos ilustran la presencia de la galactosa terminal ligada a alfa en los N-glicanos de glicoproteína abatacept-CTLA4. Las muestras de glicanos ligados mediante N de Orencia™ (abatacept) , una proteína de fusión soluble que consiste en el dominio extracelular del antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico humano (CTLA-4) ligado a la porción Fe modificada (dominios bisagra, CH2 y CH3) de la inmunoglobulina humana Gl (IgGl) , donde se analizaron mediante LC-MS/MS. La figura 3 muestra el cromatograma de fluorescencia de una fracción de glicanos derivados de Abatacept que muestra la detección de una especie de glicanos con la composición HexNAc4HexGFuc! que puede corresponder a una estructura que contiene galactosa-a-l-3galactosa .
El espectro MS2 de las especies de glicanos derivadas de Orencia™ con la composición HexNAc4Hex6Fuci sugirió la presencia del extremo no reductor de galactosa ligada a a- 1-3 galactosa (Figura 4) a pesar de que no elimina la posibilidad de otras estructuras potenciales como un glicano de tipo híbrido.
Se obtuvo una confirmación adicional de esta estructura mediante el uso de una combinación de diferentes tratamientos de exoglicosidasa seguidos de LC-ESI-MS/MS y MALDI-MS. Las fracciones de N-glicanos derivadas tanto de Orencia™ y una proteína de control, se sometieron a tratamientos con la enzima exoglicosidasa. Ambas muestras fueron tratadas con (i) -galactosidasa y (ii) una mezcla de ß -galactosidasa , ß -N-acetilhexosaminodasa y manosidasa para resolver la estructura de galactosa potencial de extremo no reductor ligada a galactosa a-1-3. En la figura 5 se muestra una comparación de los cromatogramas de fluorescencia para los productos de las dos reacciones.
No se observaron grandes diferencias en los glicanos de la proteína de control antes y después del tratamiento con -galactosidasa . Por otra parte, se observó una clara disminución con la composición HexNAc4Hex6Fuci y un incremento concomitante en la composición HexNAc4Hex5Fuci de una especie en Orencia™. En la figura 6 se muestra asimismo la MS2 para las especies con la composición HexNAc4Hex6FuCi de abatacept como resultado del tratamiento enzimático.
Se obtuvo una confirmación adicional a partir de los resultados del tratamiento con un grupo diferentes de exoglicosidasas (beta-galactosidasa, hexosaminidasa y manosidasa) como se analiza mediante MALDI-TOF-MS (figura 7) .
Los datos sugieren que las especies con la composición HexNAc4Hex6Fuc1 en Orencia™ contienen principalmente la galactosa de extremo no reductor unida a galactosa-al-3.
Extensiones y alternativas Mientras que los métodos se han mostrado y descrito particularmente con referencia a modalidades ilustrativas específicas, debe entenderse que pueden realizarse varios cambios en la forma y detalle sin apartarse del espíritu y alcance de la presente descripción. Por tanto, se pretenden reivindicar todas las modalidades que se encuentren dentro del alcance y espíritu de los métodos y sus equivalentes. Las reivindicaciones, descripciones y diagramas de los métodos, sistemas y ensayos de la presente descripción no deben entenderse como limitados al orden de elementos descrito a menos que se especifique a tales efectos .
Toda la bibliografía y material similar citado en la presente solicitud, que incluyen, a modo no taxativo, las patentes, solicitudes de patentes, artículos, libros, tratados y páginas web, sin importar el formato de esta bibliografía y materiales similares, se incorporan expresamente en la presente a modo de referencia en su totalidad. En el caso de que una o más de las bibliografías y materiales similares incorporados difieran o contradigan la presente solicitud, incluidos a modo no taxativo, los términos definidos, uso de los términos, técnicas descritas o similares, la presente solicitud prevalece. Los encabezados de sección utilizados en la presente se encuentran únicamente a los efectos de la organización y no deben interpretarse como limitaciones de la materia descrita en ninguna forma. Mientras que los métodos han sido descritos conjuntamente con varias modalidades y ejemplos, no se pretende que los métodos se limiten a estas modalidades o ejemplos. Por el contrario, los métodos abarcan varias alternativas, modificaciones y equivalentes como lo apreciarán los entendidos en la técnica.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (50)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para evaluar una población de células de ovario de hámster chino (CHO) caracterizado porque comprende : (a) proporcionar una o más células CHO de la población; y (b) medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa producidos por estas células, donde las células CHO no han sido diseñadas genéticamente para expresar una secuencia que codifica la alfa-galactosil-transferasa .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de medición comprende cualquiera de los siguientes: (a) aislar las glicoproteínas producidas a partir de células CHO y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa en las glicoproteínas , (b) aislar una composición específica de glicoproteínas producida a partir de células CHO y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa de la composición aislada de glicoproteínas , (c) obtener una preparación de glicanos a partir de una preparación de glicoproteínas o una glicoproteína aislada producida a partir de células CHO y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa en la preparación de glicanos, (d) escindir los monosacaridos de los glicanos presentes en una glicoproteína producida a partir de las células CHO o a partir de los glicanos en la superficie de una o más células CHO y detectar los residuos terminales liberados de alfa-galactosa de los monosacáridos escindidos, (e) proporcionar al menos un péptido a partir de una preparación de glicoproteínas producida a partir de las células CHO y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa- 1-3 -galactosa en al menos un péptido, y (f) medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa a partir de glicanos en la superficie celular de una o más de las células CHO.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la población de células CHO es una población de células clónales.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la etapa de comparar el nivel medido en la etapa (b) con un nivel o especificación de referencia.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la medición comprende el uso de un método para identificar o cuantificar los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa seleccionados del grupo que consiste en: métodos cromatográficos , métodos de espectrometría de masas (MS) , métodos electroforáticos , métodos de resonancia magnética nuclear (N R) , análisis de monosacáridos , métodos de fluorescencia, absorbancia UV-VIS, métodos enzimáticos y el uso de una molécula de detección y sus combinaciones.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la población de células CHO es una muestra de un cultivo celular en un biorreactor para la fabricación de una glicoproteína terapéutica.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas de suministro y medición se repiten al menos una vez con el paso del tiempo.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de medición comprende el uso de una molécula de detección que se une a los epítopos de galactosa-alfa-1-3 -galactosa.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula de detección comprende una lectina que es capaz de unirse a los epítopos de galactosa-alfa- 1-3 -galactosa.
10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula de detección comprende un anticuerpo contra los epítopos de galactosa-alfa- 1-3 -galactosa.
11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la molécula de detección comprende o se encuentra unida a una molécula que comprende una porción marcada.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además una etapa de registro del resultado de la etapa de medición en un medio de impresión o medios legibles por computadora.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células CHO se encuentran presentes en un cultivo celular.
14. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células CHO han sido transformadas con un vector que codifica una glicoproteína humana terapéutica.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además la etapa de cuantificar la cantidad de epítopos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa o glicanos que contienen los epítopos presentes en las células CHO.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la medición comprende aislar las glicoproteínas producidas a partir de células CHO y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa en las glicoproteínas.
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la medición comprende aislar una composición de glicoproteína específica producida a partir de células CHO y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa de la composición de glicoproteínas aislada.
18. El método de conformidad con la reivindicación i, caracterizado porque la medición comprende obtener una preparación de glicanos a partir de una preparación de glicoproteínas o una glicoproteína aislada producida a partir de células CHO y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa en la preparación de glicanos.
19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la medición comprende (d) escindir los monosacáridos de glicanos presentes en una glicoproteína producida a partir de células CHO o a partir de glicanos en la superficie de una o más de las células CHO y detectar el extremo.
20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la medición comprende proporcionar al menos un péptido a partir de una preparación de glicoproteínas producida a partir de las células CHO y medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa en al menos un péptido.
21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la medición comprende medir los residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa en los glicoconjugados en la superficie celular de una o más de las células CHO.
22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de medición comprende realizar un método cromatográfico .
23. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de medición comprende realizar un método de espectrometría de masas (MS) .
24. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de medición comprende realizar un método electroforético .
25. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de medición comprende realizar un método de resonancia magnética nuclear (NMR) .
26. Un método para detectar una o más células de ovario de hámster chino (CHO) por su habilidad para producir glicoproteínas que comprenden glicanos que contienen epítopos de alfa-l-3-galactosa, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una pluralidad de poblaciones de células CHO donde ninguna población de la pluralidad ha sido diseñada genéticamente para producir residuos terminales de alfa-galactosil en glicanos; (b) cultivar cada población de la pluralidad de poblaciones de células CHO en condiciones adecuadas para la expresión de un producto de la expresión de glicoproteínas; (c) medir los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa- 1-3 -galactosa producidos por cada célula de la pluralidad de células CHO, y (d) seleccionar una o más preparaciones de la pluralidad de preparaciones de células CHO basadas en la presencia de un nivel diana de residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa producidos por la preparación de células CHO seleccionada, donde las células CHO no se transfectaron con una secuencia que codifica la alfa-galactosil transferasa.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque cada población de la pluralidad de poblaciones de células CHO se encuentra en un cultivo celular.
28. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa se miden en un producto aislado de expresión de glicoproteínas de las preparaciones de células CHO.
29. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa se miden en los péptidos obtenidos a partir de un producto de expresión de glicoproteínas de las preparaciones de células CHO.
30. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa se miden a partir de los glicanos de la superficie celular de las preparaciones de células CHO.
31. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa se miden en las preparaciones de glicanos obtenidas a partir de las preparaciones de células CHO o a partir de su producto de expresión de glicoproteínas.
32. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la etapa de medición incluye las siguientes etapas: (i) aislar un producto de expresión de glicoproteínas de cada población de la pluralidad de poblaciones de células CHO y (ii) medir los residuos terminales de galactosa-alfa-l-3-galactosa en el producto de expresión de glicoproteínas.
33. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el cultivo celular se encuentra en un biorreactor.
34. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la medición comprende el uso de una técnica para identificar o cuantificar los glicanos que contienen residuos terminales de galactosa-alfa-1-3 -galactosa seleccionados del grupo que consiste en: métodos cromatográficos , métodos de espectrometría de masas (MS) , métodos electroforáticos , métodos de resonancia magnética nuclear (NMR) , análisis de monosacáridos , métodos de fluorescencia, absorbancia UV-VIS, métodos enzimáticos, el uso de una molécula de detección y sus combinaciones .
35. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque al menos una población de la pluralidad de poblaciones de células CHO ha sido transformada con un vector que codifica una glicoproteína humana terapéutica.
36. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la pluralidad de poblaciones de células CHO comprende al menos una característica seleccionada del grupo que consiste en: al menos dos cepas CHO diferentes, al menos dos poblaciones de células clónales diferentes y al menos dos muestras diferentes de un tren de proceso de fabricación para una glicoproteína terapéutica.
37. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque comprende además la etapa de cultivar la preparación de células CHO seleccionada para producir un producto terapéutico de glicoproteínas .
38. Un método para evaluar una composición de glicoproteínas producida en un hospedero de células CHO caracterizado porque comprende: medir la cantidad de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en una composición de glicoproteínas, donde la composición de glicoproteínas se produjo en células hospederas CHO y donde las células hospederas CHO no estaban diseñadas genéticamente para expresar una secuencia que codifica la alfa-galactosil transferasa.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque comprende además registrar el nivel de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas en un medio de impresión o medios legibles por computadora.
40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque además comprende comparar el nivel medido de galactosa-alfa- 1-3 -galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas con un nivel de referencia.
41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el nivel de referencia es un criterio de especificación o calidad para una preparación farmacéutica que contiene la composición de glicoproteínas .
42. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el nivel de referencia no es mayor de un 5% de galactosa- alfa- 1 - 3 -galactosa terminal en una base de glicano/glicano total .
43. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la medición de la cantidad de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas comprende realizar un método cromatográfico .
44. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la medición de la cantidad de galactosa - alfa- 1 - 3 - galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas comprende realizar un método de espectrometría de masas (MS) .
45. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la medición de la cantidad de galactosa- al fa - 1 - 3 - galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas comprende realizar un método de resonancia magnética nuclear (NMR) .
46. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la medición de la cantidad de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas comprende realizar un análisis de monosacáridos .
47. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la medición de la cantidad de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas comprende realizar un método de fluorescencia.
48. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la medición de la cantidad de galactosa-alfa- 1 - 3 -galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas comprende realizar un método de absorbancia UV-VIS .
49. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la medición de la cantidad de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas comprende realizar un método enzimático .
50. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la medición de la cantidad de galactosa-alfa-l-3-galactosa terminal presente en la composición de glicoproteínas comprende el uso de una molécula de detección.
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