MX2011003803A

MX2011003803A - Inhibidores de proteasa de bowman birk, variantes, modificados.

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Publication number: MX2011003803A
Application number: MX2011003803A
Authority: MX
Inventors: David A Estell; Katherine D Collier; Neelam S Amin; Melodie Estabrook; Scott D Power; Bryan Fox; Brian F Schmidt; Gudrun Vogtentanz
Original assignee: Danisco Inc
Priority date: 2008-10-15
Filing date: 2008-10-15
Publication date: 2011-07-04
Also published as: JP2012505652A; CN102245635A; CN102245635B; EP2344531A1; AU2008362898B2; WO2010044786A1; RU2509776C2; AU2008362898A1; EP2344531B1; CA2740197A1; RU2011119481A; BRPI0823193A2; JP5740308B2

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas inhibidoras de proteasa de Bowman Birk (BBPI) variantes, modificadas que comprenden péptidos que se unen a proteínas objetivo y que se modifican adicionalmente para tener mayor actividad inhibitoria de proteasa y/o para ser producidas a mayores rendimientos que las BBPI no modificadas. La invención abarca construcciones de polinucleótido y vectores de expresión que contienen secuencias de polinucleótido que codifican para las BBPI variantes, modificadas, las células hospedadoras transformadas que expresan y producen las BBPI variantes, modificadas, las proteínas BBPI variantes, modificadas, las composiciones que comprenden las BBPI variantes, modificadas, y los métodos para producir y usar las BBPI variantes, modificadas en el cuidado personal.

Description

INHIBIDORES DE PROTEASA DE BOWMAN BIRK, VARIANTES, MODIFICADOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a proteínas inhibidoras de proteasa de Bowman Birk (BBPI) , variantes, modificadas que comprende péptidos que se unen a proteínas objetivo, y que se modifican adicionalmente para tener mayor actividad inhibitoria de proteasas y/o para ser producidas a mayores rendimientos que las BBPI no modificadas. La invención abarca construcciones de polinucleótido y vectores de expresión que contienen secuencias de polinucleótido que codifican para las BBPI variantes modificadas, las células hospedadoras transformadas que expresan y producen las BBPI variantes, modificadas, las proteínas BBPI variantes, modificadas, las composiciones que comprenden las BBPI variantes, modificadas, y los métodos para producir y usar las BBPI variantes, modificadas, en el cuidado personal.

Antecedentes de la Invención Las proteasas están comprendidas en una amplia variedad de procesos biológicos. La alteración del equilibrio entre las proteasas y los inhibidores de proteasa frecuentemente se asocia con destrucción patológica de tejido.

Varios estudios se han enfocado en el papel de las proteasas en la lesión de tejidos, y se piensa que el REF. : 218852 desequilibrio entre las proteinasas y los inhibidores de proteinasas, es un determinante principal en el mantenimiento de la integridad de los tejidos. Las cerina-proteinasas de células inflamatorias, incluyendo neutrófilos, están implicadas en varios trastornos inflamatorios, tal como enfisema pulmonar, la artritis, dermatitis atópica y psoriasis. Estas y otras condiciones inflamatorias frecuentemente están asociadas con niveles desregulados de citocinas .

Las proteasas también degradan la membrana de basamento vascular y participan en el remodelado de la matriz extracelular para facilitar la migración e invasión celular para promover la angiogénesis tumoral. Las proteasas liberan factores de crecimiento angiogénico unidos a la matriz extracelular y generan fragmentos quimiotácticamente activos, derivados de los componentes de la matriz celular, que a su vez ejercen actividades moduladoras quimiotácticas y mitogénicas en las células endoteliales, células de músculo liso y fibroblastos para participar en los proceso angiogénicos . La lista de factores proteicos angiogénicamente activos in vivo incluye factores de crecimiento de fibroblastos, angiogenina, angiopoyetina-1, EGF, HGF, NPY, VEGF, TNF-alfa, TGF-beta, PD-ECGF, PDGF, IGF, IL8, y hormona de crecimiento. Los riesgos asociados con los agentes actuales de bloqueo de citocinas incluyen infecciones serias, anafilaxia y síndrome tipo lupus. Además, se observó pérdida de beneficio clínico después de que se detuvieron los fármacos, y una pequeña proporción de pacientes desarrolló anticuerpos a los agentes biológicos, que probablemente va a limitar su eficiencia con el uso repetido.

Se ha mostrado que los inhibidores sintéticos y naturales de proteasas inhiben la promoción tumoral in vivo e in vitro. Las investigaciones anteriores han indicado que ciertos inhibidores de proteasa que corresponden a una familia de proteínas estructuralmente relacionadas, clasificadas como inhibidores de serina-proteasas o SERPINAS, se conoce que inhiben varias proteasas incluyendo tripsina, catepsina G, trombina, calicreina de tejido, así como elastasa de neutrófilo. Las SERPINAS son extremadamente efectivas en la prevención/supresión de la transformación inducida por carcinógenos in vitro y carcinogénesis en sistemas de modelos de animal. La administración sistémica de inhibidores purificados de proteasas reduce la inflamación de las articulaciones y también la destrucción de hueso y cartílago.

La administración tópica de inhibidores de proteasa encuentra uso en condiciones tal como dermatitis atópica, una forma común de inflamación de la piel, que puede estar localizada en unos pocos parches o estar comprendida en grandes porciones del cuerpo. La actividad despigmentadora de los inhibidores de proteasa y su capacidad para impedir la pigmentación inducida por luz ultravioleta, se ha demostrado tanto in vitro como in vivo. Paine et al., Journal of Investigative Der atology 116:587-595

[2001]. También, se ha encontrado que los inhibidores de proteasa ayudan a la curación de heridas (http : //ww . sciencedaily . com/releases/2000/10/001002071718.ht m) . Se demostró que el inhibidor de proteasa de leucocitos secretorios invierte la destrucción de tejido y acelera el proceso de curación de heridas cuando se aplica de manera tópica. Además, los inhibidores de serina-proteasas también pueden ayudar a reducir el dolor en pacientes con lupus eritematoso (Ver Patente de los Estados Unidos No. 6537968) .

Se pueden encontrar inhibidores de proteasa, que se presentan de forma natural, en una variedad de alimentos tal como cereales (avena, cebada y maíz) , brotes de Brúcelas, cebollas, raíz de remolacha, trigo, mijo y cacahuates. Una fuente de interés es la soya. El nivel promedio en la soya es de aproximadamente 1.4 por ciento y 0.6 por ciento para Kunitz y Bowman-Birk respectivamente, dos de los más importantes inhibidores de proteasa. Estos dos niveles hacen impráctico aislar el inhibidor natural de proteasa para aplicaciones clínicas.

De esta manera, existe la necesidad de un método para producir grandes cantidades de inhibidores de proteasa que tengan características deseadas de productos terapéuticos proteicos, y para composiciones que administren de manera efectiva el inhibidor de proteasa en una forma útil.

Las composiciones y métodos de acuerdo a la invención cumplen algunas de las necesidades anteriores y en particular ofrecen una ventaja al proporcionar inhibidores de proteasa que tienen como objetivo de manera específica la actividad de las citocinas comprendidas en procesos patológicos y no patológicos .

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a proteínas inhibidoras de proteasa de Bowman Birk (BBPI) , variantes, modificadas que comprenden péptidos que se unen a proteínas diana u objetivo, y que además se modifican para tener mayor actividad inhibitoria de proteasas y/o para ser producidas a mayores rendimientos que las BBPI no modificadas. La invención abarca construcciones de polinucleótido y vectores de expresión que contienen secuencias de polinucleótido que codifican para las BBPI variantes modificadas, las células hospedadoras transformadas que expresan y producen las BBPI variantes, modificadas, las proteínas BBPI variantes, modificadas, las composiciones que comprenden las BBPI variantes, modificadas, y los métodos para producir y usar las BBPI variantes, modificadas, en el cuidado personal.

En una modalidad, la invención proporciona un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI), variante, modificado, aislado que comprende un aminoácido sustituido al menos en una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBPI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión. En una modalidad, el núcleo molecular de BBPI se elige de los núcleo moleculares: BBI (SEQ ID NO:13), BBIt (SEQ ID NO:185), BBI-AV (SEQ ID NO:186), BBIt-AV (SEQ ID NO:187), BBIt-VEGK (SEQ ID NO:640), BBIt-VEGT (SEQ ID NO:641), BBIt-VEGKD (SEQ ID NO:642), BBdb (SEQ ID NO:449), BBsb3 (SEQ ID NO:450), BBtc (SEQ ID NO:451), BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3-AV (SEQ ID NO: 453) y BBtc-AV (SEQ ID NO: 454) . En otra modalidad, el péptido de unión se elige de un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a FGF-5, un péptido de unión a TGF y un péptido de unión a TNFa. El péptido de unión a VEGF a su vez se elige de ACYNLYGWTC (SEQ ID NO: 9), KYYLY W (SEQ ID NO:458) , TLWKSYW (SEQ ID NO:459), DLYWW (SEQ ID NO:460) SKHSQIT (SEQ ID NO: 468) KTNPSGS (SED ID NO: 469) RPTGHSL (SEQ ID NO:470), KHSAKAE (SEQ ID NO:471) KPSSASS (SEQ ID NO-.472), PVTKRVH (SEQ ID NO:473), TLHWWVT (SEQ ID NO:492), PYKASFY (SEQ ID NO:493), PLRTSHT (SEQ ID NO:494), EATPROT (SEQ ID NO:495) , NPLHTLS (SEQ ID NO:496), KHERIWS (SEQ ID NO:497), ATNPPPM (SEQ ID NO:498), STTSPNM (SEQ ID NO:499), ADRSFRY (SEQ ID NO: 500) , PKADSKQ (SEQ ID NO: 501) , PNQSHLH (SEQ ID NO: 502) , SGSETWM (SEQ ID NO: 503) , ALSAPYS (SEQ ID NO:504) , KMPTSKV (SEQ ID NO:505) , ITPKRPY (SEQ ID NO: 506) , KWIVSET (SEQ ID NO: 507) , PNANAPS (SEQ ID NO: 508) , NVQSLPL (SEQ ID NO:509) , TLWPTFW (SEQ ID NO: 510) , NL PHF (SEQ ID NO: 511) , SLWPAFW (SEQ ID NO: 512) , SLWPHFW (SEQ ID NO: 513) , APWNSHI (SEQ ID NO: 514) , APWNLHI (SEQ ID NO: 515) , LPS HLR (SEQ ID NO: 516) , PTILEWY (SEQ ID NO: 517) , TLYPQF (SEQ ID NO:518) , HLAPSAV (SEQ ID NO: 519) , KYYLSW (SEQ ID NO: 520) , YTLYK (SEQ ID NO: 521) , TYRLY W (SEQ ID NO: 522) , RYSLYYW (SEQ ID NO : 523 ) , YYLYYWK (SEQ ID NO: 524) , NYQLYG (SEQ ID NO:525) , TKWPSYW (SEQ ID NO:226) , TLWKSYW (SEQ ID NO: 527) , PL PSYW (SEQ ID NO: 528) , RLWPSYW (SEQ ID NO: 529) , TLWPKYW (SEQ ID NO: 530) , KYDLY W (SEQ ID NO: 531) , RYDLYWW (SEQ ID NO : 532 ) , DYRLYWW (SEQ ID NO:533) , DYKLYW (SEQ ID NO: 534) , EYKLY W (SEQ ID NO: 535) , y RYPLYWW (SEQ ID NO: 536) i . El péptido de unión a FGF-5 a su vez se elige de CACRTQPYPLCF (MM007; SEQ ID NO:430), CICTWIDSTPC (PS2; SEQ ID NO:431), CYGLPFTRC (SEQ ID NO:537), CEEIWTMLC (SEQ ID NO:538), CWALTVKTC (SEQ ID NO:539), CLTVLWTTC (SEQ ID NO:540), CTLWNRSPC (SEQ ID NO:541), CHYLLTNYC (SEQ ID NO:542), CRIHLAHKC (SEQ ID NO:543), TNIDSTP (SEQ ID NO:544), HLQTTET (SEQ ID NO:545), SLNNLTV (SEQ ID NO:546), TNIDSTP (SEQ ID NO:547), TNIDSTP (SEQ ID NO:548), LRILANK (SEQ ID NO:549), LLTPTLN (SEQ ID NO:550), ALPTHSN (SEQ ID NO:551), TNIDSTP (SEQ ID NO:552), LCRRFEN (SEQ ID NO:553), TNIDSTP (SEQ ID NO:554), TNIDSTP (SEQ ID NO:555), HLQTTET (SEQ ID NO:556), PLGLCPP (SEQ ID NO:557), GYFIPSI (SEQ ID NO:558), TKIDSTP (SEQ ID NO:559), HLQTTET (SEQ ID NO:560), WNIDSTP (SEQ ID NO:561), TWIDWTP (SEQ ID NO:562), RTQPYPL (SEQ ID NO:670) y TWIDSTP (SEQ ID NO:671) . El péptido de unión a TGFp a su vez se elige de CLCPENINVLPCN (PEN3; SEQ ID NO:436), CICKHNVDWLCF (MM021W; SEQ ID NO:437), CICWTQHIHNCF (WTQ; SEQ ID NO:438), CVTTDWIEC (SEQ ID NO:563), CYYSQFHQC (SEQ ID NO:564), CPTLWTHMC (SEQ ID NO: 565), QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ ID NO: 565), QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID NO: 567), QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID NO:568), acetil-LCPENDNVSPCY-cohn2 (SEQ ID NO:569), KHNVRLL (SEQ ID NO: 570), NDTPSYF (SEQ ID NO: 571), AKLYAGS (SEQ ID NO:572), RGPAHSL (SEQ ID NO:573), NSLAERR (SEQ ID NO:574), HPLASPH (SEQ ID NO:575), QPWNKLK (SEQ ID NO:576), A Lr/Mipy (SEQ ID NO: 577), PTKPAQQ (SEQ ID NO: 578), PSLNRPQ (SEQ ID NO:579), HHARQEW (SEQ ID NO:580), RHHTPGP (SEQ ID NO:581), ASAINPH (SEQ ID NO:582), CHGYDRAPC (SEQ ID NO:644), CFAPADQAC (SEQ ID NO:645), CIPSRFITC (SEQ ID NO:646), CHGHTKLAC (SEQ ID NO:647), CNGKSKLAC (SEQ ID NO:648), PENINVLP (SEQ ID NO;672), KHNVDWL (SEQ ID NO:673) y WTQHIHNC (SEQ ID NO: 674) . El péptido de unión a TNFcx a su vez se elige de RYWQDIP (TI; SEQ ID NO:474), APEPILA (T2; SEQ ID NO:475), DMIMVSI (T3; SEQ ID NO:476), WTPKPTQ (SEQ ID NO:583), ATFPNQS (SEQ ID NO:584), ASTVGGL (SEQ ID NO:585), T LPYRP (SEQ ID NO:586), AWHSPSV (SEQ ID. NO:587), TQSFSS (SEQ ID NO:588), TH NTLR (SEQ ID NO:589), GQTHFHV (SEQ ID NO:590), LPILTQT (SEQ ID NO:591), SILPVSH (SEQ ID NO:592), SQPIPI (SEQ ID -NO:593), y QPLRKLP (SEQ ID NO:594).

En una modalidad, la invención proporciona un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) , variante, modificado, aislado que comprende un aminoácido sustituido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBPI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de BBPI es un péptido de unión. En algunas modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 1 se elige de 1A y 1C. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 4 es 4V. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 5 se elige de P y A. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 13 se elige de 13Y, 131, 13F, 13M, 13L, 13V, 13K, y 13R. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 18 se elige de 181 y 18V y 18L En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 25 se elige de 25K, 25N, 25W, 251, 25A y 25R. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 27 se elige de 27H, 27K, 27V, 27A, y 27Q. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 29 se elige de 29R, 29K, y 29P. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 31 se elige de 31Q, 31H, 31E, 31A, 31R, 31W, 31K y 31T. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 38 se elige de 38N, 38K, y 38R. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 40 se elige de 40H, 40K, 40Q, 40R, y 40Y. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 50 se elige de 50R, 50Q, 50K, 50T, 50V, 50M, y 50S. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 52 se elige de 52K, 52T, 52R, 52Q, 52L, 52H, 52A, 52M, 52S y 52E. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 55 es 55M. En otras modalidades, el aminoácido sustituido en la posición 65 se elige de 65E, 65Q, y 65D.

En otras modalidades, la invención proporciona un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) , variante, modificado, aislado que comprende una inserción de SEQ ID NO: 389, un aminoácido sustituido al menos en una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBPI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de BBPI es un péptido de unión.

En algunas modalidades, cualquiera de las BBPI variantes, modificadas descritas anteriormente se expresa como una proteína de fusión que comprende el dominio catalítico elegido de celulasa, cutinasa y disulfuro-isomerasa. En modalidades alternativas, la BBPI variante, modificada se expresa como la proteína de fusión de SEQ ID NO: 195.

En algunas modalidades, las BBPI variantes, modificadas de la invención comprenden una combinación de al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, y al menos ocho sustituciones de aminoácido elegidas de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBPI variante de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de al menos dos sustituciones de aminoácido en las posiciones de aminoácido equivalentes a las posiciones 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. Un ejemplo de una BBPI variante, modificada que comprende una combinación de dos sustituciones de aminoácido en las posiciones 50 y 52 es la BBPI variante, modificada de SEQ ID NO: 595. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de al menos dos sustituciones de aminoácido en posiciones de aminoácido equivalentes a las posiciones 25, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de al menos tres aminoácidos se elige de las combinaciones 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A. Los ejemplos de BBPI variantes, modificadas que comprende una combinación de tres sustituciones de aminoácido elegida de las posiciones 25, 29, 40, 50 y 52 son las BBPI variantes, modificadas de SEQ ID NOS: 603, 607 y 609. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de al menos cuatro sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de al menos cuatro aminoácidos se elige de las combinaciones 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 13I-A0K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, y 29P-40K-50T-52A. Los ejemplos de las BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido elegidas de las posiciones 13, 29, 50 y 52 son las BBPI variantes, modificadas de SEQ ID NOS: 596, 600, 602, 604, 606, 608, y 643. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de al menos cinco sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 40, 50, y 52 de SEQ ID NO:187. En algunas modalidades, la combinación de al menos cinco aminoácidos se elige de las combinaciones 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, A13I-29P-40K-50T-52A, 25L-29P-40K- 50T- 52A, 13I-29P-40K-50K-52A, y 13I-29P-40K-50T-52T . Los ejemplos de las BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de cinco sustituciones de aminoácido elegidas de las posiciones 13, 25, 29, 40, 50, y 52 son las BBPI variantes, modificadas de SEQ ID NOS: 432, 434, 443, 445, 446, 597, 599, 601, 605, 615, 620, 624 y 625. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada, comprende una combinación de al menos seis sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 1, 4, 5, 11, 13, 25, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO:187. En algunas modalidades, la combinación de al menos seis aminoácidos se elige de las combinaciones 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V- 13I-29P-40K- 50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, y 131-29P-40K-50T-52A-65E . Los ejemplos de las BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de seis sustituciones de aminoácido elegidas de las posiciones 1, 4, 5, 11, 13, 25, 29, 40, 50 y 52 son las BBPI variantes, modificadas de SEQ ID NOS: 598, 611, 612, 613, 614, 616, 619, 621, 622, 623, y 626. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de al menos siete sustituciones de aminoácido elegida de las sustituciones de aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO:187. En algunas modalidades, la combinación de al menos siete aminoácidos se elige de las combinaciones 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, y 13I-27A-29P-31A-50K-52T. Los ejemplos de las BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de siete sustituciones de aminoácido elegidas de las posiciones 13, 25, 29, 31, 40, 50 y 52 son las BBPI variantes, modificadas de SEQ ID NOS: 491, 617, 618, y 632-639. En aún otras modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de ocho sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 27, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de ocho aminoácidos se elige de las combinaciones 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L y 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q. Los ejemplos de las BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de ocho sustituciones de aminoácido elegida de las posiciones 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 y 52 son las BBPI variantes, modificadas de SEQ ID NO:627-631.

En algunas modalidades, la invención proporciona un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) , variante, modificado, aislado que se une a VEGF (VEGF-BBPI) . El VEGF-BBPI comprende un aminoácido sustituido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBPI variante de SEQ ID NO: 187, y contiene un péptido de unión a VEGF que reemplaza la segunda asa inhibitoria de proteasa. En algunas modalidades, el péptido de unión a VEGF se elige de SEQ ID NOS: 9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 y 473. En algunas modalidades, el VEGF-BBPI tiene una secuencia de polipéptido elegida de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635, y 636.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada, aislada de la invención tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina que la correspondiente BBPI variante, precursora, no modificada. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada, aislada de la invención tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina y mayor rendimiento de producción que la correspondiente BBPI variante, precursora, no modificada.

En algunas modalidades, la invención proporciona un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) , variante, modificado, aislado de SEQ ID NO: 187 que comprende además un aminoácido sustituido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50, y 52 de SEQ ID NO:187, y en la cual el péptido de unión a VEGF se reemplaza por un péptido variante que se une a una proteina objetivo elegida de FGF-5, TGFfi y TNF .

En algunas modalidades el péptido de unión a VEGF comprendido en la BBPI variante de SEQ ID NO: 187 se reemplaza con un péptido de unión a FGF que tiene una secuencia elegida de SEQ DI NOS: 430, 431, 670, y 671. En otras modalidades, el péptido de unión a VEGF se reemplaza con un péptido de unión a GF elegido de SEQ ID NOS:436, 437, 438, 672, 673, y 674. En aún otras modalidades, el péptido de unión a VEGF se reemplaza con un péptido de unión a TNFa elegido de SEQ ID N0S:474, 475, y 476.

La invención también abarca BBPI variantes, modificadas que comprenden péptidos de unión de VEGF, FGF- 5, TGF y TNFa que tienen mayor actividad inhibitoria de tripsina y mayor rendimiento de producción que la correspondiente BBPI precursora, no modificada. En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada que comprende un péptido de unión a FGF- 5, ?Gß y TNFa. Se elige de las BBPI variantes, modificadas de SEQ ID NOS: 432, 434, 443, 445, 447, 637, 638, y 639.

En otra modalidad, la invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica para una proteína de fusión de BBPI. El polinucleótido que codifica para la proteína de fusión de BBPI comprende una primera secuencia de polinucleótido que codifica para la unidad catalítica de una enzima, y una segunda secuencia de polinucleótido que codifica para una BBPI variante, modificada, por ejemplo, una BBPI de unión a VEGF (VEGF-BBPI) , una BBPI unión de FGF (FGF-BBPI) , una BBPI de unión a TGF (TGF-BBPI) o una BBPI de unión a TNF (TNF-BBPI) . En algunas modalidades, la primera secuencia de polinucleótido codifica para la unidad catalítica de una celulasa.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para una BBPI variante, modificada en una célula bacteriana, que comprende el paso de mutar un polinucleótido que codifica para una BBPI variante para generar una construcción de polinucleótido que codifica para una BBPI variante, modificada que comprende una sustitución de aminoácido al menos en una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBPI variante de SEQ ID NO: 187; el paso de introducir la construcción de polinucleótido en una célula hospedadora bacteriana; el paso de cultivar la célula bacteriana bajo condiciones adecuadas de cultivo para permitir la expresión de la secuencia eteróloga de ADN; y el paso de producir la BBPI variante, modificada, que tiene una mayor actividad inhibitoria de tripsina que la correspondiente BBPI variante, precursora, no modificada. En algunas modalidades, el método de la invención comprende además el paso de recuperar la BBPI variante, modificada, expresada. En otras modalidades, el método de la invención también comprende activar la BBPI variante, modificada .

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada tiene una mayor actividad inhibitoria de tripsina y mayor rendimiento de producción que la correspondiente BBPI variante, precursora, no modificada. La BBPI variante, precursora, no modificada se elige de BBI-AV (SEQ ID NO:186), BBIt-AV (SEQ ID NO:187), BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3 (SEQ ID NO:453), y BBtc-AV (SEQ ID NO:454). En algunas modalidades, la segunda asa inhibitoria de proteasa de la BBPI variante, modificada es un péptido de unión a proteína objetivo, elegido de un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a FGF-5, un péptido de unión a TGFfi y un péptido de unión a TNFa .

Las BBPI variantes, modificadas que se producen por el método de la invención incluyen, pero no se limitan a, las BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de sustituciones de aminoácido que se eligen de combinaciones de tres sustituciones, por ejemplo, 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A, cuatro sustituciones, por ejemplo, 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 13I-A0K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, 29P-40K-50T-52A, cinco sustituciones, por ejemplo, 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A, y 13L-29P-40K-50T-52T, seis sustituciones, por ejemplo, 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C- 13 I - 29P-40K- 50T- 52A, 4V-13I-29P-40K-50T- 52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G- 13 I - 29P- 4 OK- 5 OT- 52A, 131-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A-65E, siete sustituciones, por ejemplo, 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, y ocho sustituciones, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L, 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q .

En otra modalidad, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para una BBPI variante, modificada de la invención. Como se describe anteriormente, la BBPI variante, modificada es un inhibidor de Proteasa de Bowman Birk en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa se ha reemplazado con un péptido de unión a proteína objetivo y que además se modifica para contener una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBPI variante de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la segunda asa inhibitoria de proteasa de la BBPI variante, modificada es un péptido de unión a proteína objetivo, elegido de un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a FGF-5, un péptido de unión a TGF y un péptido de unión a TNFa. En algunas modalidades, la BBPI modificada se expresa como una proteína que tiene al menos 80 % de identidad al polipéptido de SEQ ID NO: 195.

En otra modalidad, la invención proporciona una célula hospedadora que se transforma con el vector de la expresión, como se describe en la presente. En algunas modalidades, la célula hospedadora es una célula bacteriana, por ejemplo, una célula hospedadora de la especie Bacillus.

En una modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un inhibidor variante, modificado de proteasa de Bowman Birk (BBPI) que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión que se elige de un péptido de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , un péptido de unión al factor-5 de crecimiento de fibroblastos (FGF5) , un péptido de unión al factor ß de crecimiento transformante (?TGß) y un péptido variante del factor a de necrosis tumoral (TNFa) . En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada se une a una proteína objetivo elegida de VEGF, FGF5 , TGFp y TNFa. En algunas modalidades, el núcleo molecular de BBPI se elige de BBI (SEQ ID NO: 13), BBIt (SEQ ID NO: 185), BBI-AV (SEQ ID NO:186), BBIt-AV (SEQ ID NO:187), BBIt-VEGK (SEQ ID N0:640), BBIt-VEGT (SEQ ID NO:641), BBIt-VEGKD (SEQ ID NO:642), BBdb (SEQ ID NO:449), BBsb3 (SEQ ID NO:450), BBtC (SEQ ID " NO:451), BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3-AV (SEQ ID NO:453) y BBtC-AV (SEQ ID NO:454).

En otras modalidades, la BBPI variante, modificada de la invención comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de las siguientes combinaciones: 50T-52A, 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A, 13I-25L-50T-52A, 131-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, 29P-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-29P-40K-50T-52A, D1C-13I-29P-40K-50T-52A, S4V-13I-29P-40K-50T-52A, S5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 131-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A-65E, 13L-25R-29P-31A-40K- 50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40 -50T-52A, 13 I- 25R-27A-29P-31A-50K- 52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L, y 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor variante, modificado de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a VEGF que se elige de los siguientes péptidos de unión a VEGF: ACYNLYGWTC (SEQ ID NO:9), KYYLYWW (SEQ ID NO:458), TLWKSYW (SEQ ID NO:459), DLYWW (SEQ ID NO: 460) SKHSQIT (SEQ ID NO: 468) KTNPSGS (SED ID NO : 469 ) RPTGHSL (SEQ ID NO:470) , KHSAKAE (SEQ ID NO:471) KPSSASS (SEQ ID NO:472) , PVTKRVH (SEQ ID NO:473) , TLH WVT (SEQ ID NO:492) , PYKASFY (SEQ ID NO: 493) , PLRTSHT (SEQ ID NO: 494) , EATPROT (SEQ ID NO:495) , NPLHTLS (SEQ ID NO: 496) , KHERIWS (SEQ ID NO: 497) , ATNPPPM (SEQ ID NO: 498) , STTSPNM (SEQ ID NO : 499 ) , ADRSFRY (SEQ ID NO:500) , PKADSKQ (SEQ ID NO : 501 ) , PNQSHLH (SEQ ID NO: 502) , SGSETWM (SEQ ID NO: 503) , ALSAPYS (SEQ ID NO:504) , KMPTSKV (SEQ ID NO: 505) , ITPKRPY (SEQ ID NO: 506) , KWIVSET (SEQ ID NO: 507) , PNANAPS (SEQ ID NO: 508) , NVQSLPL (SEQ ID NO : 509 ) , TLWPTFW (SEQ ID NO:510) , NLWPHFW (SEQ ID NO:511) , SL PAF (SEQ ID NO: 512) , SLWPHFW (SEQ ID NO: 513) , APWNSHI (SEQ ID NO: 514) , APWNLHI (SEQ ID NO: 515) , LPSWHLR (SEQ ID NO: 516) , PTILEWY (SEQ ID NO:517) , TLYPQFW (SEQ ID NO:518) , HLAPSAV (SEQ ID NO: 519) , KYYLSW (SEQ ID NO: 520) , WYTLYKW (SEQ ID NO: 521) , TYRLYWW (SEQ ID NO:522) , RYSLYYW (SEQ ID NO: 523) , YYLYYWK (SEQ ID NO: 524) , NYQLYGW (SEQ ID NO: 525), TKWPSYW (SEQ ID NO: 226), TL KSY (SEQ ID NO:527), PLWPSYW (SEQ ID NO:528), RLWPSYW (SEQ ID NO:529), TLWPKYW (SEQ ID NO:530), KYDLYWW (SEQ ID N0.531), RYDLY W (SEQ ID NO:532), DYRLYW (SEQ ID NO:533), DYKLY W (SEQ ID NO:534), EYKLYWW (SEQ ID NO:535), y RYPLYWW (SEQ ID NO:536) .

En otra modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor variante, modificado de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a FGF que se elige de los siguientes péptidos de unión a FGF: CACRTQPYPLCF ( M007; SEQ ID NO:430), CICTWIDSTPC (PS2; SEQ ID NO:431), CYGLPFTRC (SEQ ID NO:537), CEEIWTMLC (SEQ ID' NO:538), CWALTVKTC (SEQ ID NO:539), CLTVL TTC (SEQ ID NO:540), CTLWNRSPC (SEQ ID NO:541), CHYLLTNYC (SEQ ID NO:542), CRIHLAHKC (SEQ ID NO:543), TNIDSTP (SEQ ID NO:544), HLQTTET (SEQ ID NO:545), SLNNLTV (SEQ ID NO:546), TNIDSTP (SEQ ID NO:547), TNIDSTP (SEQ ID NO:548), LRILANK (SEQ ID NO:549), LLTPTLN (SEQ ID NO:550), ALPTHSN (SEQ ID NO:551), TNIDSTP (SEQ ID NO:552), LCRRFEN (SEQ ID NO:553), TNIDSTP (SEQ ID NO:554), TNIDSTP (SEQ ID NO:555), HLQTTET (SEQ ID NO:556), PLGLCPP (SEQ ID NO:557), GYFIPSI (SEQ ID NO:558), TKIDSTP (SEQ ID NO:559), HLQTTET (SEQ ID NO:560), WNIDSTP (SEQ ID NO:561), TWIDWTP (SEQ ID NO:562), RTQPYPL (SEQ ID NO:670) y TWIDSTP (SEQ ID NO: 671) .

En otra modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor variante, modificado de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TGF que se elige de los siguientes péptidos de unión a TGF: CLCPENINVLPCN (PEN3; SEQ ID NO:436), CICKHNVDWLCF (MM021W; SEQ ID NO:437), CICWTQHIHNCF (WTQ; SEQ ID NO:438), CVTTDWIEC (SEQ ID NO:563), CYYSQFHQC (SEQ ID NO:564), CPTLWTHMC (SEQ ID NO:565), QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ ID NO: 566), QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID NO:567), QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID NO:568), acetil-LCPENDNVSPCY-cohn2 (SEQ ID NO:569), KHNVRLL (SEQ ID NO:570), NDTPSYF (SEQ ID NO:571), AKLYAGS (SEQ ID NO:572), RGPAHSL (SEQ ID NO:573), NSLAERR (SEQ ID NO:574), HPLASPH (SEQ ID NO:575), QPWNKLK (SEQ ID NO:576), AWLr/Mipy (SEQ ID NO:577), PTKPAQQ (SEQ ID NO:578), PSLNRPQ (SEQ ID NO:579), HHARQE (SEQ ID NO:580), RHHTPGP (SEQ ID NO:581), ASAINPH (SEQ ID NO:582), CHGYDRAPC (SEQ ID NO:644), CFAPADQAC (SEQ ID NO:645), CIPSRFITC (SEQ ID NO:646), CHGHT LAC (SEQ ID NO:647), CNGKSKLAC (SEQ ID NO:648), PENINVLP (SEQ ID NO;672), KHNVDWL (SEQ ID NO:673) y WTQHIHNC (SEQ ID NO:674).

En otra modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor variante, modificado, de Proteasa de Bo man Birk (BBPI) que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a VEGF que se elige de los siguientes péptidos de unión a TNF : RYWQDIP (TI; SEQ ID NO: 474), APEPILA (T2; SEQ ID NO: 475), DMIMVSI (T3; SEQ ID NO: 476), WTPKPTQ (SEQ ID NO: 583), ATFPNQS (SEQ ID NO: 584), ASTVGGL (SEQ ID NO: 585), TMLPYRP (SEQ ID NO: 586), AWHSPSV (SEQ ID NO: 587), TQSFSS (SEQ ID NO: 588), THKNTLR (SEQ ID NO: 589), GQTHFHV (SEQ ID NO: 590), LPILTQT (SEQ ID NO: 591), SILPVSH (SEQ ID NO: 592) , SQPIPI (SEQ ID NO: 593) , y QPLRKLP (SEQ ID NO: 594) .

En otra modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor variante, modificado de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión que se elige de un péptido de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , un péptido de unión al factor-5 de crecimiento de fibroblastos (FGF5), un péptido de unión al factor ß de crecimiento transformante (??G ) y un péptido variante del factor de necrosis tumoral (TNF ) , y que está presente en una cantidad que varía desde aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada, comprendida en la composición de cuidado personal de la invención, tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina y mayor rendimiento de producción que el correspondiente inhibidor variante, precursor, no modificado de la BBPI.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor variante, modificado de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a VEGF que se elige de SEQ ID NOS: 9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 y 473. En algunas modalidades, el núcleo molecular de la BBPI variante, modificada es la BBIt-AV de SEQ ID NO: 187. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada comprendida en la composición de cuidado personal de la invención comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 131-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 131-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L . En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI de unión a VEGF (VEGF-BBPI) que se elige de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635, y 636. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel seleccionada del grupo que consiste de cremas, lociones, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, espumas, aerosoles, líquidos, geles, sueros y sólidos para la piel. En otras modalidades, la composición de cuidado de la piel se elige de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores antimicrobianos, cremas protectoras de la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos antiacné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, bloqueadores de sol, depilantes, inhibidores de crecimiento de pelo y radioprotectores . Típicamente, el radioprotector es un bloqueador de sol que se elige de bloqueadores de sol, no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón. Las composiciones de cuidado de la piel pueden incluir opcionalmente composiciones de venta libre, aplicadas de manera tópica, tratamientos antifungoideos, tratamientos antiacné, protectores de la piel, bloqueadores de sol, desodorantes y antitranspirantes . En algunas modalidades, las composiciones cosméticas de la invención comprenden al menos un pigmento. Estas composiciones cosméticas incluyen formulaciones de polvos prensados, y bases. Las composiciones de base cosméticas se pueden elegir de bases de agua en aceite, bases dé agua en silicón, bases de aceite en agua, barras de maquillaje anhidras, y bases de crema en polvo.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado de la piel para' tratar un trastorno angiogénico de la piel. Esta composición de cuidado de la piel comprende un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) que tiene una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a VEGF que se elige de SEQ ID NOS: 9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 y 473.

En otras modalidades, la composición de cuidado personal se usa para mejorar la apariencia y/o condición de la piel en un sujeto que padece de un trastorno de la piel elegido de psoriasis, escloroderma, úlceras venosas, acné, rosácea, verrugas, eccema, hemangiomas y linfangiogénesis .

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado de la piel para tratar un trastorno angiogénico de la piel. La composición de cuidado de la piel comprende un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) que tiene una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a VEGF que se elige de SEQ ID NOS: 9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 y 473. La composición de cuidado del cabello puede estar en la forma de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado del cabello, colorantes de cabello, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousse, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas, y sólidos. En algunas modalidades, la composición de cuidado del cabello también puede incluir un radioprotector . Los ejemplos de los radioprotectores incluyen bloqueadores de sol seleccionados de bloqueadores de sol, no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón. La composición de cuidado del cabello se puede usar para impedir el crecimiento del cabello.

En otras modalidades, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento del cabello al proporcionar una composición personal que comprende una BBPI que tiene una sustitución de aminoácido al menos en una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a VEGF que se elige de SEQ ID NOS: 9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 y 473; y aplicar la composición a un sujeto en un área donde se desea la inhibición del crecimiento del cabello. Por ejemplo, la composición se puede aplicar para inhibir el crecimiento del vello facial, del pelo de la axila, del vello de las piernas, del vello del torso, del vello de los brazos y del cabello. En algunas modalidades, el método usa una composición de cuidado personal que comprende un VEGF-BBPI elegido de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635, y 636.

En otras modalidades, la invención proporciona un método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de un trastorno angiogénico de la piel al proporcionar una composición personal que comprende, una BBPI que tiene una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a VEGF que se elige de SEQ ID NOS: 9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 y 473; y aplicar la composición a la piel del sujeto. El trastorno angiogénico de la piel se puede elegir de psoriasis, escleroderma, úlceras venosas, acné, rosácea, verrugas, eccema, hemangiomas y linfangiogénesis . En algunas modalidades, el método usa una composición de cuidado personal que comprende un VEGF-BBPI elegido de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635, y 636.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) que tiene una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a FGF elegido de SEQ ID NOS: 430 y 431. En algunas modalidades, el núcleo molecular de la BBPI es el BBIt-AV de SEQ ID NO: 187. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada comprendida en la composición de cuidado personal de la invención comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 131-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 131-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L . En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI variante, modificada que es una BBPI de unión a FGF (FGF-BBPI) elegida de SEQ ID NOS: 432 y 434.

En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado del cabello o pelo que comprende un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) que tiene una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a FGF elegido de SEQ ID NOS: 430 y 431. La composición de cuidado del cabello puede estar en la forma de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado del cabello, colorantes de cabello, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas, y sólidos. En algunas modalidades, la composición de cuidado del cabello también puede incluir un radioprotector . Los ejemplos de los radioprotectores incluyen bloqueadores de sol seleccionados de bloqueadores de sol, no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón. La composición de cuidado del cabello o pelo se puede usar para promover el crecimiento de cabello o pelo o vello .

En otra modalidad, la invención proporciona un método para promover el crecimiento del cabello al proporcionar una composición de cuidado personal que comprende un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) que tiene una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a FGF elegido de SEQ ID NOS: 430 y 431; y aplicar la composición de cabello o pelo a un sujeto en un área donde se desea el crecimiento del cabello o pelo. Por ejemplo, la composición de puede aplicar para promover el crecimiento de vello facial, pelo de axila, vello de las piernas, vello del torso, vello del brazo y crecimiento del cabello. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal, de promoción de crecimiento de cabello o pelo se puede usar para tratar una condición que comprenda pérdida de cabello o pelo. Por ejemplo, las condiciones que comprenden pérdida de cabello o pelo y que se pueden tratar usando la composición de cuidado de pelo o cabello de la invención incluyen alopecias inflamatorias, pseudopelada, escleroderma, picaduras de garrapata, lichen planus, psoriasis, lupus, dermatitis seborreica, síndrome de cabello suelto, hemocromatosis , alopecia androgénica, y alopecia areata. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal que se puede usar para promover el crecimiento de cabello o pelo comprende una BBPI de unión a FGF (FGF-BBPI) elegida de SEQ ID NOS: 432 y 434.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un inhibidor variante, modificado de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TGF que se elige de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673, y 674. En algunas modalidades, el núcleo molecular de la BBPI es el BBIt-AV de SEQ ID NO: 187. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada comprendida en la composición de cuidado personal de la invención comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 131-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 131-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI variante, modificada que es una BBPI de unión a TGF (TGF-BBPI) que se elige de SEQ ID NOS: 443, 445 y 447. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal es capaz de promover el crecimiento de cabello o pelo.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado del cabello o de cuidado de la piel que comprende un Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TGF que se elige de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673, y 674. La composición de cuidado del cabello o piel puede estar en la forma de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado del cabello, colorantes de cabello, formulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. En algunas modalidades, cuando la composición es una composición de cuidado de la piel, puede estar en la forma de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores antimicrobianos, cremas protectoras de la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos anti-acné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, bloqueadores de sol, y radioprotectores . La composición de cuidado de la piel puede incluir además opcionalmente composiciones de venta libre aplicadas tópicamente, tratamientos anti- fungoideos, tratamientos anti-acné, protectores de la piel, bloqueadores de sol, desodorantes y antitranspirantes . Los radioprotectores incluidos en la composición de cuidado de la piel o cabello son bloqueadores de sol que se seleccionan de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición cosmética que comprende un inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TGF que se elige de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673, y 674. Los ejemplos de composiciones cosméticas incluyen máscaras, delineadores de ojos, formulaciones de polvos comprimidos, y bases.

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado del cabello o pelo que comprende un inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TGF que se elige de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673, y 674, y que comprende además un radioprotector . Los ejemplos de radioprotectores que se pueden incluir en la composición de cuidado del cabello o pelo son bloqueadores de sol tal como bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón. La composición de cuidado del cabello es capaz de promover el crecimiento del cabello o pelo.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para promover el crecimiento de cabello o pelo al proporcionar una composición de cuidado personal que comprende un inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TGF que se elige de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673, y 674; y aplicar la composición a un sujeto en un área donde se desea el crecimiento del cabello o pelo. Por ejemplo, la composición se puede aplicar para promover el crecimiento de vello facial, pelo de axila, vello de piernas, vello de torso, vello de brazos y crecimiento de cabello. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal promotora del crecimiento del cabello o pelo se puede usar para tratar una condición que comprende pérdida de cabello o pelo.. Por ejemplo, las condiciones que comprende pérdida de cabello o pelo y que se pueden tratar usando la composición de cuidado de cabello o pelo de la invención incluyen alopecias inflamatorias, pseudopelada, escleroderma, picaduras de garrapata, lichen planus, psoriasis, lupus, dermatitis seborreica, síndrome de pelo suelto, hemocromatosis , alopecia androgénica, y alopecia areata. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal que se puede usar para promover el crecimiento de cabello o pelo comprende una TGF-BBPI variante, modificada elegida de SEQ ID NOS: 443, 445 y 447.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de un trastorno de la piel al proporcionar una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TGF que se elige de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673, y 674; y aplicar la composición al sujeto. En algunas modalidades, los trastornos de la piel que se pueden tratar con la composición incluyen psoriasis, escloroderma y cáncer de piel. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una TGF-BBPI elegida de la TGF-BBPI variante, modificada elegida de SEQ ID NOS: 443, 445 y 447.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TNF que se elige de SEQ ID NOS: 474, 475 y 476. En algunas modalidades, el núcleo molecular de la BBPI es el BBIt-AV de SEQ ID NO: 187. En otras modalidades, la BBPI variante, modificada comprendida en la composición de cuidado personal de la invención comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI variante, modificada que es una TNF-BBPI elegida de SEQ ID NOS: 637, 638 y 639. La composición de cuidado personal se puede usar para promover el crecimiento de cabello o pelo.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado de cabello o pelo que comprende un Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TNF que se elige de SEQ ID NOS: 474, 475 y 476. En algunas modalidades, la composición de cuidado de cabello o pelo es capaz de promover el crecimiento de cabello o pelo en un sujeto que padece de psoriasis. La composición de cuidado de cabello o pelo puede estar en la forma de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado de cabello, colorantes de cabello, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. En algunas modalidades, la composición de cuidado de cabello o pelo comprende además un radioprotector . Los ejemplos de radioprotectores incluyen bloqueadores de sol tal como bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua y bloqueadores de sol de agua en silicón. En algunas modalidades, la composición de cuidado de cabello o pelo es capaz de promover el crecimiento de cabello o pelo.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición de cuidado de la piel que comprende un Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TNF que se elige de SEQ ID NOS: 474, 475 y 476. La composición de cuidado de la piel , se puede usar para mejorar la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de psoriasis o escleroderma. En algunas modalidades, la composición de cuidado de la piel puede estar en la forma de cremas, lociones, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, espumas, aerosoles, líquidos, geles, sueros y sólidos para la piel. De manera alternativa, la composición de cuidado de la piel está en la forma de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores antimicrobianos, cremas protectoras de la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos antiacné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, composiciones de aclaramiento de la piel, composiciones de reducción de rojez de la piel, bloqueadores de sol, depiladores y radioprotectores . Opcionalmente , la composición de cuidado de la piel comprende además composiciones de venta libre, aplicadas de manera tópica, tratamientos antifungoideos, tratamientos antiacné, protectores de la piel, bloqueadores de sol, desodorantes y antitranspirantes .

En otra modalidad, la invención proporciona una composición cosmética que comprende un inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TNF que se elige de SEQ ID NOS: 474, 475 y 476. La composición cosmética se selecciona de máscaras, delineadores de ojos, formulaciones de polvo prensado, y bases. En algunas modalidades, la composición cosmética es una composición cosmética que comprende al menos un pigmento. Una composición cosmética que comprende al menos un pigmento es una máscara, y la máscara se selecciona de máscaras no a prueba de agua, máscaras a prueba de agua, máscaras para dar volumen, máscaras de estiramiento, máscaras de rizado, máscaras a prueba de agua, anhidras, máscaras basadas en agua, y tratamiento para pestañas o cejas. En otras modalidades, la composición cosmética es una composición cosmética seleccionada de una formulación de polvo prensado selecciona de de polvos sueltos, rubores, sombras de ojos, y polvos de bronceado. En aún otras modalidades, la composición cosmética es una base seleccionada de bases de agua en aceite, bases de agua en silicón, bases de aceite en agua, barras anhidras de maquillaje, y bases de crema a polvo.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para promover el crecimiento de cabello o pelo de un sujeto que padece de psoriasis que incluye los pasos de proporcionar una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TNF que se elige de SEQ ID NOS: 474, 475 y 476; y aplicar la composición al sujeto en un área en la cual se desea la promoción de crecimiento de cabello o pelo. Por ejemplo, la composición de puede aplicar para promover el crecimiento de vello facial, pelo de axila, vello de piernas, vello de torso, vello de brazos y crecimiento de cabello. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal que se puede usar para promover el crecimiento de cabello comprende una TNF-BBPI modificada elegida de SEQ ID NOS: 637, 638 y 639.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de psoriasis que incluye los pasos de proporcionar una composición de cuidado personal que comprende un Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de la BBI variante de SEQ ID NO: 187, y en la cual la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de la BBPI es un péptido de unión a TNF que se elige de SEQ ID NOS: 474, 475 y 476; y aplicar la composición a la piel del sujeto. En algunas modalidades, el método comprende proporcionar una composición de cuidado personal que comprende una TNF-BBPI modificada elegida de SEQ ID NOS: 637, 638 y 639.

Breve Descripción de las Figuras Las Figuras 1A-1D proporcionan las secuencias de ADN y de aminoácidos del cásete de de expresión de aprE-BCE103-BBI-histag (EcoRI-HindIII) clonado en el vector de integración pJM103 (SEQ ID NOS: 1 y 2) .

La Figura 2 proporciona un mapa esquemático del vector de expresión pJM103BBIhis .

La Figura 3 proporciona las secuencias de ADN y de aminoácidos de 12BBlck81 del sitio de fusión de BCE103 (en la BamHI) al extremo del gen (SEQ ID NOS: 3 y 4) . La secuencia peptídica CK37281 (ACYNLYGWTC (SEQ ID NO: 9)) se inserta en las asas inhibitorias tanto de tripsina como de quimiotripsin .

La Figura 4 proporciona una gráfica que muestra los títulos de 2BBlck81 activo versus inactivo con varios agentes reductores de tiol adicionados a las concentraciones dadas durante el crecimiento del cultivo. La porción blanca de las barras representa la cantidad de 2BBlck81 activo (determinada por inhibición de tripsina) y la porción negra de las barras representa la cantidad de 2BBlck81 inactivo (determinada de la actividad de BCE103 y asume que se producen BCE103 y 2BBlck81 en una relación molar de 1:1). La fracción de 2BBlck81 activo se indica en la parte superior de las barras. En esta Figura, 37 C = sin adiciones, BME = 2 -mercaptoetanol , Cys = cisteína, Glut = glutationa reducida, DTT ditiotreitol .

La Figura 5 proporciona una gráfica que muestra la activación de 2BBlck81 con 2 -mercaptoetanol (BME) después de la purificación parcial de la proteína de fusión de BCE-Ink2- 2BBck81 por cromatografía de intercambio iónico. Las concentraciones (µ?) de BCE (barras negras) y de 2BBlck81 (barras blancas) medidas por ensayos de actividad se muestran antes y después del tratamiento con 2 -mercaptoetanol 3 mM (BME) .

La Figura 6 proporciona una gráfica que muestra los resultados de un análisis de competición de 2BBlck81 versus anticuerpo anti-VegF para la unión a VegF en un ensayo BioVeris. La competición de unión con el péptido CK37281 se muestra para comparación y la unión con la BBI tipo silvestre se incluye como un control negativo.

Las Figuras 7A-7C proporcionan la secuencia del fragmento sintético de ADN que tiene la PDI- (hiPDl) de H. insolens que se insertó en el vector de expresión de BBI de B. subtilis (usando los sitos BssHII y Sacl) , así como la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NOS: 5 y 6) .

Las Figuras 8A-8C proporcionan las secuencias de ADN y aminoácidos del cásete de expresión de aprE-cutinasa que se ligó en los sitios EcoRI-BamHI de p2JM103 -lnk2-2BBlck81 (SEQ ID NOS: 7 y 8).

La Figura 9 proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína BBIt-AV no modificada (SEQ ID NO: 187) . Se construyeron bibliotecas de saturación de sitio en todos los aminoácidos numerados. La asa inhibitoria de tripsina y la asa del péptido de unión a VEGF (en cursivas) se indican y se muestran los enlaces de disulfuro por las líneas de conexión. En el fondo, la secuencia del péptido de unión a VEGF se compara al asa inhibitoria de quimiotripsina en sBBI que reemplaza. La flecha hacia abajo indica el sitio potencial de escisión de proteasa entre los residuos Pl y Pi' del sitio reactivo de quimiotripsina.

La Figura 10 proporciona las relaciones de actividad relativa de BBI: BCE para cada sustitución de aminoácido hecha en la posición 29. Las relaciones se promediaron de cultivos en cuadruplicado cultivas en placas de microtítulo en la ausencia (barras blancas) o en la presencia (barras negras) de 2-mercaptoetanol . Las relaciones de actividad para sBBI se incluyen para comparación como un control positivo. Las relaciones se normalizaron al valor determinado para el aminoácido tipo silvestre en BBIt-AV (SEQ ID NO: 187) (indicado por una línea horizontal) , leucina, que se muestra en la ausencia (barra trazada horizontalmente) o en la presencia (barra trazada diagonalmente) de 2-mercaptoetanol .

Las Figuras 11A-11B proporcionan respectivamente las relaciones de actividad relativa de BBI: BCE para las sustituciones de aminoácido hechas en la posición 50 (Fig. HA) y la posición 37 (Fig. 11B) (barras blancas) . Las relaciones se promediaron de cultivos en cuadruplicado en la presencia de 2-mercaptoetanol. Las relaciones de actividad para sBBI se incluyen como un control positivo para comparación (barras negras) . Las relaciones se normalizan al valor (indicado por una línea horizontal) determinado para los aminoácidos tipo silvestre en BBIt-AV (SEQ ID NO: 187) y se muestra con barras trazadas de manera diagonal.

La Figura 12 proporciona las relaciones de actividad relativa de BBI : BCE para las sustituciones de aminoácido en la posición P2' (residuo 18 en la Figura 9, SEQ ID NO: 187) en la asa inhibitoria de tripsina. Las relaciones se determinaron en cuadruplicado en la presencia de 2-mercaptoetanol (puntos de datos individuales mostrados) . Las relaciones de actividad para sBBI (BBI; SEQ ID NO: 13), BBIt-AV (CT; SEQ ID NO: 187) y BBIt-AV-F50T (F50T) se muestran en el lado derecho de la línea horizontal y se adicionaron para comparación. Las relaciones se normalizan al valor (mostrado por una línea horizontal) determinado para BBIt-AV (CT) .

La Figura 13 proporciona una comparación de la producción de tres combinaciones que contienen BBIt-AV de 8 sustituciones de aminoácido: variante óctuple BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L (RL8; SEQ ID NO: 630), BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q (QQ8 ; SEQ ID NO: 628) , y BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50 -V52T (KT8; SE<2 ID NO: 627) . La cantidad de la especie BBI activa se determinó por inhibición de tripsina después del crecimiento (?) , después de la activación con 2- mercaptoetanol (¦) y después del tratamiento con ácido/calor ( A ) . BBIt-AV, la variante quíntuple BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (TA5; SEQ ID NO: 601) y se incluyen sBBI para comparación.

La Figura 14 proporciona una comparación de las especies BBI activas (por inhibición de tripsina) después del crecimiento (barras negras) , después de la activación con 2-mercaptoetanol (barras trazadas diagonalmente) y después del tratamiento con ácido/calor (barras blancas) de diferentes péptidos de unión (tres aglutinantes de GF y dos aglutinantes de FGF5) en el núcleo molecular de BBPI variante, precursora (designada de origen (PT) ) versus el núcleo molecular de BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A modificado (Q; SEQ ID NO: 600) . En todos los núcleos moleculares, los péptidos de unión reemplazaron la asa inhibitoria de quimiotripsina . PEN3 (SEQ ID NO: 436), WTQ (SEQ ID NO: 438) y M021W (SEQ ID NO: 437) son péptidos de unión a TGFP , y MM007 (SEQ ID NO: 430) y FGFps2 (SEQ ID NO: 431) son péptidos de unión a FGF5.

La Figura 15 proporciona las secuencias de aminoácidos de los núcleos moleculares del inhibidor de Bowman Birk variante de Dolichos biflorus (BBdb-AV, SEQ ID NO: 452), el inhibidor IV o DII de proteasa, variante (BBsb3-AV, SEQ ID NO: 453) de Glycine max (soya) , y de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc-AV, SEQ ID NO: 454) en el cual se reemplaza la asa de quimiotripsina con un péptido de unión a VEGF, que se alinean a la secuencia del BBI variante, BBIt-AV (SEQ ID NO: 187) . Las diferencias de la secuencia de BBIt-AV entre C9 y C58 se muestran subrayadas en negritas. En todos los núcleos moleculares, el péptido de unión a CK3781 (ACYNLYGWT; SEQ ID NO: 9) reemplaza la segunda asa inhibitoria de proteasa.

La Figura 16 proporciona una comparación de la concentración de BBI activo (por inhibición de tripsina) de BBIt-AV, BBdb-AV y BBtc-AV después de la activación con 2-mercaptoetanol (barras blancas) y después del tratamiento con ácido/calor (barras negras) .

La Figura 17 proporciona una alineación de BBIt-AV, (SEQ ID NO: 187) , BBdb-AV, (SEQ ID NO: 452) , BBsb3-AV (SEQ ID NO: 453) y BBtc-AV (SEQ ID NO: 454) variantes, no modificados y el correspondiente BBIt (SEQ ID NO: 187) , BBsb3 (SEQ ID NO: 449) , BBtC (SEQ ID NO: 450) y BBdb (SEQ ID NO: 451) BBPI, precursores, no modificados. El símbolo de asterisco (*) identifica los residuos C conservados invariantes. Los residuos numerados identifican los aminoácidos que se sustituyen para generar las BBPI variantes, modificadas de la invención.

Las Figuras 18A-18B muestran la identificación de epítopos de células T en BBI tipo silvestre. Figura 18A los valores de índices de estimulación (SI) para todos los 71 donadores se promovieron y se muestran con desviaciones estándar en barras de error. Figura 18B se muestran los porcientos de respondedores a capa péptido en el conjunto de 20 péptidos de BBI tipo silvestre.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a proteínas inhibidoras de proteasa de Bowman Birk (BBPI) variantes, modificadas que comprenden péptidos que se unen a proteínas objetivo, y que se modifican para tener mayor actividad inhibitoria de proteasa y/o para ser producidas a mayores rendimientos que las BBPI no modificadas. La invención abarca construcciones de polinucleótido y vectores de expresión que contienen secuencias de polinucleótido que codifican para las BBPI variantes, modificadas, las células hospedadoras transformadas que expresan y producen las BBPI variantes, modificadas, las proteínas BBPI variantes, modificadas, las composiciones que comprenden las BBPI variantes, modificadas, y los métodos para producir y usar las BBPI variantes, modificadas en cuidado personal.

A menos que se indique de otro modo, la práctica de la presente invención comprende técnicas convencionales comúnmente usadas en los campos de biología molecular, mocrobiología, purificación de proteínas, ingeniería de proteínas, secuenciación de proteínas y ADN, y ADN recombinante , que están dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se conocen por los expertos en la técnica y se describen en numerosos textos estándar y trabajos de referencia. Todas las patentes, solicitudes de patente, artículos y publicaciones mencionadas en la presente se incorporan de este modo de forma expresa en la presente como referencia en su totalidad.

A menos que se defina de otro modo en la presente, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica al cual corresponde esta invención. Varios diccionarios científicos que incluyen los términos incluidos en la presente son bien conocidos y están disponibles para aquellos en la técnica. Aunque cualesquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente encuentran uso en la en la práctica o prueba de la presente invención, se describen algunos métodos y materiales preferidos. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se describen más completamente por referencia a la especificación como una totalidad. Se va a entender que esta invención no se limita a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, puesto que estos pueden variar, dependiendo del contexto en que se usen por los expertos en la técnica.

Como se usa en la presente, los términos singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se indique de otro modo, los ácidos nucleicos se describen de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3' y las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi, respectivamente.

Todas las patentes, solicitudes de patente, y otras publicaciones, incluyen todas las secuencias descritas en la presente en estas referencias, referidas en la presente se incorporan expresamente como referencia, al mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual se indicara de manera específica e individual para que se incorpore por referencia. Todos los documentos citados se incorporan, en parte pertinente, en la presente por referencia. Sin embargo, la cita de cualquier documento no se va a considerar como una admisión que es técnica anterior con respecto a la presente invención.

Los intervalos numéricos son incluyentes de los números que definen el intervalo. Se propone que cada limitación numérica máxima dada de principio a fin en esta especificación incluya cada limitación numérica inferior, como si estas limitaciones numéricas inferior se describieran expresamente en la presente. Cada limitación numérica mínima dada de principio a fin en, esta especificación incluirá cada limitación numérica superior, como si estas limitaciones numéricas superiores se escribieran de manera expresa en la presente. Cada intervalo numérico dado de principio a fin en esta especificación incluirá cada intervalo numérico más estrecho que caiga dentro de este intervalo numérico más ancho, como si estos intervalos numéricos más estrechos se describieran todos expresamente en la presente.

Los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los varios aspectos o modalidades de la invención que se pueden hacer por referencia a la especificación como una totalidad. Por consiguiente, como se indica anteriormente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la especificación como una totalidad. 5.1 Definiciones Como se usa en la presente, los términos "aislado" y "purificado" se refiere a un ácido nucleico o aminoácido (u otro componente) que se remueve de al menos un componente con el cual está asociado de forma natural.

Como se usa en la presente, el término "modificado" cuando se refiere a un inhibidor de proteasa (PI) por ejemplo Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) , se refiere a una BBPI que tiene una secuencia de aminoácidos que se deriva de la secuencia de aminoácidos de una proteína BBPI "precursora" o "de origen", no modificada. La BBPI precursora, no modificada puede ser una proteína tipo silvestre o que se presenta de forma natural, o una BBPI variante. La secuencia de aminoácidos de la proteína modificada se "deriva" de la secuencia de aminoácidos de la proteína precursora por la sustitución, supresión o inserción de uno o más aminoácidos de la región de la secuencia de aminoácidos, precursora. En algunas modalidades, al menos un aminoácido se sustituye para generar el inhibidor modificado de proteasa. En algunas modalidades, el inhibidor de proteasa de origen es una BBPI variante, que contiene una asa de tripsina y/o co-tripsina que se ha reemplazado con una secuencia variante. La sustitución de al menos un aminoácido de una BBPI precursora, variante genera un Inhibidor de proteasa BBPI variante, modificado. En algunas modalidades, el PI variante, modificado comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición equivalente a las posiciones 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, y 65 de SEQ ID NO: 187 (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYG TCFCVDITDFCYE PCKPSE: SEQ ID NO: 187) . En otras modalidades, el PI variante, modificado comprende una combinación de sustituciones como se describe en la presente. En aún otras modalidades, el PI variante, modificado comprende una inserción. Estas modificaciones son la "secuencia de ADN precursora" que codifica para la secuencia de aminoácidos del inhibidor de proteasa, precursor en lugar de la manipulación del inhibidor de proteasa, precursor, per se. Los inhibidores de proteasa, modificados, abarcan en la presente la sustitución de cualquiera de los diecinueve aminoácidos que se presentan de forma natural en cualquiera de los residuos de aminoácido en regiones diferentes de las asas reactivas, por ejemplo, asas de tripsina y/o quimiotripsina . Los polinucleótidos que codifican para la secuencia modificada se refieren como "polinucleótidos modificado" , y los polinucleótidos que codifican para el inhibidor de proteasa, precursor se refieren como "polinucleótidos precursores" .

Como se usa en la presente, el término "inhibidor de proteasa" (PI) se refiere en la presente a y se usa de manera indistinta con Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) , que es un inhibidor de proteasa de alto contenido de cisteína como se describe, por ejemplo por Prakash et al. [J mol Evol 42: 560-569 (1996)] .

Como se usa en la presente, el término "núcleo molecular" se refiere a una secuencia de proteína BBPI en la cual se introduce una secuencia variante. En algunas modalidades, el núcleo molecular es un núcleo molecular variante, que tiene ya sea la primera asa inhibitoria de proteasa, por ejemplo, la asa de tripsina, y/o la segunda asa inhibitoria de proteasa, por ejemplo, la quimiotripsina, reemplazada con una secuencia de péptido de unión. En otras modalidades, el núcleo molecular es un núcleo molecular de BBPI tipo silvestre. El término "núcleo molecular variante, modificado" se refiere a un núcleo molecular variante que comprende modificaciones, por ejemplo, sustituciones o inserciones de aminoácido en la estructura del núcleo molecular de BBPI .

Como se usa en la presente, el término "estructura" cuando se usa con referencia a un núcleo molecular de BBPI variante se refiere a la porción de la BBPI variante que está fuera de la secuencia de péptido de unión que se ha introducido para reemplazar la primera y/o segunda asa inhibitoria de proteasa, es decir, la asa de tripsina y/o quimiotripsina. Por ejemplo, la estructura de la BBPI variante de SEQ ID NO: 187 se refiere a los aminoácidos 1-40 y 50-66 es decir, los aminoácidos N-terminales y C-terminales a los residuos de cisteína invariantes en las posiciones de aminoácido 41 y 49, que se asocian a la secuencia de unión a VEGF que se introdujo para reemplazar la asa de quimiotripsina encontrada en la BBPI tipo silvestre, es decir, el BBI de SEQ ID NO: 13 (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYE PCKPSEDDKEN; SEQ ID NO: 13) . En algunas modalidades, el núcleo molecular tiene al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o al menos 99 % de identidad al núcleo molecular del BBIt de SEQ ID NO: 187.

Como se usa en la presente, los términos "péptido de unión", "secuencia de unión", "secuencia variante" y "péptido variante" se usan de manera indistinta, y se refieren a las secuencias cortas de polipéptido que reemplazan la primera y/o segunda asas inhibitorias de proteasa el inhibidor de proteasa, por ejemplo, Inhibidor de Bowman Birk. El' péptido de unión no necesita ser de la misma longitud como la secuencia de la asa inhibitoria de proteasa que está reemplazando en el núcleo molecular, y difiere de la secuencia de la asa inhibitoria de proteasa de la BBPI tipo silvestre por al menos dos aminoácidos. En algunas modalidades, el reemplazo de la primera y/o segunda asa inhibitoria de proteasa, por ejemplo, las asas de tripsina y/o quimiotripsina de un inhibidor de proteasa, precursor, altera la secuencia que es equivalente a aquella que abarca los aminoácidos 15 a 21 (asa de truipsina) y/o la secuencia que es equivalente a aquella que abarca los aminoácidos 42 a 48 (asa de quimiotripsina) de una BBPI tipo silvestre, por ejemplo, SEQ ID NO: 13 o variante, SEQ ID NO: 187. La secuencia de péptido unión es heteróloga a aquella del inhibidor de proteasa. Los péptidos de unión se unen a proteínas objetivo.

Un "péptido de unión a VEGF" , un "péptido de unión a FGF" , un "péptido de unión a TGF" y un "péptido de unión a TNF" se refieren en la presente a una secuencia de péptido que se une a VEGF, FGF5, TGF y TNF , respectivamente.

Una "composición de VEGF" , una "composición de FGF" , una "composición de TGF" y una "composición de TNF" se refiere en la presente a una composición, por ejemplo, una composición de cuidado personal, que comprende una VEGF-BBPI, una FGF-BBPI, una TGF-BBPI y una TGF-BBPI, respectivamente.

Un "compuesto" cuando se usa con referencia a una formulación descrita en la presente, se refiere a una BBPI variante, modificada, por ejemplo, una VEGF-BBPI, una FGF-BBPI, una TGF-BBPI o una TNF-BBPI. Una formulación puede incluir más de un tipo de BBPI variante, modificada, es decir, la formulación puede comprender una VEGF-BBPI y una TNF-BBPI, o cualquier otra combinación de los cuatro tipos de BBPI descritos en la presente.

El término "una" cuando se usa con referencia a una BBPI variante, modificada comprendida en una composición de cuidado personal, se refiere en la presente a una BBPI variante, modificada que tiene una secuencia particular. Una "una", en este contexto, no limita el número de moléculas de BBPI variantes, modificadas que se necesitan en la composición de cuidado personal.

Los términos "asa de quimiotripsina" y "segunda asa inhibitoria de proteasa" se usan en la presente de manera indistinta y se refieren a la secuencia de aminoácidos que abarca la secuencia de aminoácidos que corresponde a la segunda asa de sitio reactivo de un inhibidor de proteasa de la familia de Bowman Birk. Por ejemplo, la segunda asa inhibitoria de proteasa del inhibidor de BBPI tipo silvestre de Glycine max es decir, el BBI de SEQ ID NO: 13 es la secuencia de péptido que abarca la segunda asa de sito reactivo abarcada por la cisteína 10 y la cisteína 11 (ver Prakash et al. supra) . CIO y Cll abarcan una secuencia de aminoácidos que es equivalente a aquella que abarca desde el aminoácido 42 al aminoácido 48 en el BBIt-AV variante de SEQ ID NO: 187 (Figura 9) . La segunda asa inhibitoria de proteasa o la asa de quimiotripsina de una BBPI variante, por ejemplo, BBIt-AV de SEQ ID NO: 187, corresponde a la secuencia de aminoácidos que abarca los aminoácidos 42-48 abarcados pro la cisteína en las posiciones 41 y 49, que son los residuos de cisteína equivalentes a CIO y Cll como se describe por Prakash et al. En tanto que la secuencia de aminoácidos de la segunda asa inhibitoria de proteasa del BBI tipo silvestre de SEQ ID NO: 13 es un péptido inhibitorio de quimiotripsina, la segunda asa inhibitoria de proteasa del BBIt-AV variante de SEQ ID NO: 187 es un péptido de unión a VEGF. De esta manera, los términos "asa de quimiotripsina" o "segunda asa inhibitoria de proteasa" se refieren en la presente a la posición de la asa y no se proponen implicar que la secuencia entre CIO y Cll imparte actividad inhibitoria de proteasa a una BBPI variante. De manera similar, los términos "asa de tripsina" y "primera asa inhibitoria de proteasa" se usan en la presente de manera indistinta y se refieren a la secuencia de aminoácidos que abarca la secuencia de aminoácidos que corresponde a la primera asa de sitio reactivo de un inhibidor de proteasa de la familia de Bo man Birk. Por ejemplo, la segunda asa inhibitoria de proteasa del inhibidor de BBPI tipo silvestre de Glycine max es decir, BBI de SEQ ID NO: 13 es la secuencia de péptido que abarca la segunda asa de sitio reactivo abarcada por cisteína 4 y cisteína 5 (ver Prakash et al. supra) . C4 y C5 abarca una secuencia de aminoácidos que es equivalente a aquella que abarca el aminoácido 15 al aminoácido 21 en el BBlt-AV variante de SEQ ID NO: 187 (Figura 9) .

Como se usa en la presente, el término "proteína objetivo" se refiere a la proteína (por ejemplo, enzima, hormona, etc.), cuya acción se bloquearía por la unión del péptido variante. En algunas modalidades, el péptido variante se une a la proteína objetivo cuando el péptido reemplaza la asa de tripsina y/o quimiotripsina de una BBPI.

Como se usa en la presente, "sustituido" y "sustituciones" se refieren a reemplazos de un residuo de aminoácido o base de ácido nucleico en una secuencia progenitora. En algunas modalidades, la sustitución comprende el reemplazo de un residuo o base que se presenta de manera natural. En algunas modalidades, se sustituyen dos o más aminoácidos para generar una BBPI modificada que comprende una combinación de sustituciones de aminoácido. En algunas modalidades, las combinaciones de sustituciones se denotan por la posición de aminoácido en la cual se hace la sustitución. Por ejemplo, una combinación denotada por 25-50-52 significa que se sustituyen los tres aminoácidos en las posiciones 25, 50 y 52. En otras modalidades, la combinación de sustituciones se denota por la posición de aminoácido y el aminoácido que resulta de la sustitución. Por ejemplo, una BBPI modificada que comprende la combinación de sustituciones 131-25L-50T-52A es una BBPI modificada en donde el aminoácido en la posición 13 se ha sustituido con una isoleucina, el aminoácido en la posición 25 se ha sustituido con una leucina, el aminoácido en la posición 50 se ha sustituido con una treonina, y el aminoácido en la posición 52 se ha sustituido con una alanina. Las posiciones de aminoácido son posiciones equivalentes a las posiciones numeradas en la BBPI de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de sustituciones se da en el contexto del núcleo molecular en el cual se hacen las sustituciones. Por ejemplo, la BBPI variante, modificada de SEQ ID NO: 601 también se refiere como BBIt-AV-13I-29P-40K-50T-52A, indicando que el núcleo molecular de BBIt-AV (SEQ ID NO: 187) se ha modificado para contener las sustituciones resultantes en los aminoácidos 13, 29, 40, 50, y 52. En algunas modalidades, se indican el aminoácido original y sustituido, por ejemplo, la BBPI variante, modificada de SEQ ID ÑO: 601 se puede referir como BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A.

Como se usa en la presente, "modificación" y "modificar" se refieren a cualquier cambio en una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico, que incluye, pero no se limita a supresiones, inserciones, interrupciones y sustituciones. En algunas modalidades, la modificación comprende el reemplazo de un residuo base que se presenta de forma natural. En otras modalidades, la modificación comprende una combinación de al menos una sustitución de aminoácido. En aún otras modalidades, la modificación comprende una inserción con o sin la inserción que se combina con al menos una sustitución de aminoácido.

Como se usa en la presente, el término "equivalente" cuando se usa con referencia a un residuo de aminoácido o la posición de un residuo de aminoácido en una BBPI se refiere a la posición de un residuo de aminoácido en una BBPI modificada que corresponde en posición en la secuencia primaria de la BBPI precursora, no modificada. A fin de establecer lá posición de las posiciones equivalentes de aminoácido en una BBPI, la secuencia de aminoácidos de la BBPI que se modifica se compara directamente a la BBPI de SEQ ID NO: 187, y en particular a los residuos de cisteína que se conocen que son invariantes en los inhibidores de proteasa de la familia de Inhibidores de Bowman Birk (Prakash et al. supra) . Después de alinear los residuos conservados de cisteína, permitiendo inserciones y supresiones a fin de mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de los residuos conservados de cisteína a través de supresión e inserción arbitraria) , se definen los residuos en las posiciones equivalentes a las posiciones particulares de aminoácido en la secuencia de la BBPI de SEQ ID NO: 187. La alineación de residuos conservados de cisteína debe conservar de manera preferente 100 % de estos residuos. Por ejemplo, la Figura 17 las secuencias de aminoácidos de las BBPI variantes de tipo silvestre se alinean para proporcionar la cantidad máxima de homología entre las secuencias de aminoácido. Una comparación de estas secuencias muestra que se conservan los residuos invariantes de cisteína. En tanto que la secuencia primaria es la estructura preferida para determinar la exposición de aminoácidos equivalentes en las BBPI de la invención, también se pueden identificar residuos equivalentes al determinar la homología al nivel de la estructura terciaria para una proteína BBPI. Las posiciones equivalentes de aminoácido se definen como aquellas para las cuales las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos principales de cadena de un residuo particular de aminoácido de la proteína que tienen residuos putativos equivalentes y la proteína de interés (N en N, CA en CA, C en C y O en O) están dentro de 0.13 nm y de manera preferente 0.1 nm después de la alineación. Se logra la alineación después de que el mejor modelo se ha orientado y colocado para dar el máximo traslape de las coordenadas atómicas de los átomos de proteína no de nitrógeno de las proteínas analizadas. El modelo preferido es el modelo cristalográfico que da el factor R más bajo para datos de difracción, experimentales, a la más alta resolución disponible, determinado usando métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica de cristalografía y caracterizaciones/análisis de proteínas. Se ha determinado la estructura cristalina del Inhibidor de Bowman Birk de soya (Hwang et al. J Biol Chem. 10,-252 (3) : 1099-101

[1977], Wei et al., J Biol Chem. 10;254(11): 4892-4

[1979], Voss et al. Eur J Biochem. 15;242(1): 122-31

[1996]) y se puede usar como se resume anteriormente para determinar posiciones equivalentes de aminoácido al nivel de la estructura terciaria.

Como se usa en la presente, "polipéptidos de fusión" , "proteínas de fusión" y "análogos de fusión" codifican desde el amino-término un péptido de señal funcional como una secuencia secretoria funcional en una célula hospedadora, un polipéptido segregado o porción del mismo normalmente segregado de una célula hospedadora, un polipéptido ligados escindible y un polipéptido deseado. En algunas modalidades, los polipéptidos de fusión incluyen un péptido separador colocado entre la secuencia secretoria y un polipéptido segregado. En algunas modalidades, la proteína de fusión se procesa por enzimas de células hospedadoras (por e emplo, una proteasa) , para producir la proteína deseada libre de las otras secuencias de proteína en la proteína de fusión. Como se usa en la presente, los términos "análogo de fusión", "polipéptido de fusión", y "proteína de fusión" se usan de manera indistinta.

Como se usa en la presente, el término "actividad" se refiere a cualquier actividad asociada con una proteína particular, tal como actividad enzimática asociada con una proteasa. En algunas modalidades, la actividad es actividad biológica. En modalidades adicionales, la actividad abarca la unión de proteínas a receptores lo que da por resultado efectos medibles en etapas posteriores (por ejemplo, unión de VEGF a su receptor cognado) . "Actividad biológica" se refiere a cualquier actividad que normalmente se atribuirá a esa proteína por un experto en la técnica.

Como se usa en la presente, "actividad inhibitoria de proteasa" se refiere a la actividad de una BBPI en la inhibición de la actividad proteolítica de una proteasa es decir, la inhibición de la capacidad de una proteasa para hidrolizar péptidos o sustratos que tengan enlaces peptídicos .

Como se usa en la presente, el término "expresión" se refiere al proceso por el cual se produce un polipéptido en base a la secuencia de ácido nucleico de un gen. El proceso incluye tanto transcripción como traducción.

El término "producción" con referencia a una BBPI, abarca los dos pasos de procesamiento de una proteasa de longitud completa que incluye: 1. La remoción del péptido de señal, que se conoce que se presenta durante la secreción de la proteína; y 2. La remoción de la región pro, que crea la forma madura activa de la BBPI y que se conoce que se presenta durante el proceso de maduración (Wang et al., Biochemistry 37: 3165-3171 (1998); Power et al., Proc Nati Acad Sci EUA 83: 3096-3100 (1986)).

Como se usa en la presente, el término "rendimiento de producción" se refiere a nivel en el cual se produce un inhibidor de proteasa, variante, modificado y/o no modificado, por ejemplo, una BBPI variante. Entre mayor sea el rendimiento de producción, mayor es el nivel o cantidad de inhibidor de proteasa que se produce.

Como se usa en la presente, el término "producción eficiente" con referencia en la presente a la producción de una proteína, por ejemplo, una BBPI variante, modificada, e implica que la proteína se produce a un nivel que es mayor que aquel de una BBPI variante, precursora o no modificada.

Como se usa en la presente, el término "sustancialmente puro" cuando se aplica a las proteínas o fragmentos de las mismas de la presente invención significa que las proteínas están esencialmente libres de otras sustancias a un grado práctico y apropiado para su uso propuesto. En particular, las proteínas son suficientemente puras y están suficientemente libres de otros constituyentes biológicos de las células hospedadoras para ser útiles, por ejemplo, en la secuenciación de proteínas, y/o en la producción, de preparaciones farmacéutica.

Como se usa en la presente, el término "sustancialmente libre" abarca preparaciones del polipéptido deseado que tiene menos de aproximadamente 20 % (en peso seco) de otras proteínas (es decir, proteína contaminante) , menos de aproximadamente 10 % de otras proteínas, menos de aproximadamente 5 % de otras proteínas, o menos de aproximadamente 1 ¾ de otras proteínas.

Como se usa en la presente, los términos "polinucleótido", "molécula de ácido nucleico" y "secuencia de ácido nucleico" incluyen secuencias de cualquier forma de ácido nucleico, incluyendo, pero no limitado a moléculas de ARN, ADN y cADN. Se entenderá que, como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifiquen para una proteína determinada.

Como se usa en la presente, los términos "construcción de ADN", "construcción de polinucleótido" y "ADN transformante" se usan de manera indistinta para referirse a ADN usado para introducir secuencias en una célula hospedadora u organismo. El ADN se puede generar in vitro por PCR o cualquier otra técnica adecuada conocida por aquellos expertos en la técnica. En algunas modalidades, la construcción de ADN comprende una secuencia de interés (por ejemplo, una secuencia modificada) . En algunas modalidades, la secuencia se enlaza de manera operable a elementos adicionales tal como elementos de control (por ejemplo, promotores, etc.) . En algunas modalidades, la construcción de ADN comprende secuencias homologas al cromosoma de la célula hospedadora. En otras modalidades, la construcción de ADN comprende secuencias no homologas. Una vez que la construcción de ADN se monta in vitro, se puede usar para mutageneizar una región del cromosoma de la célula hospedadora (es decir, para reemplazar una secuencia endógena con una secuencia heteróloga.

Como se usa en la presente, el término "secuencia de ADN heteróloga" se refiere a una secuencia de ADN que no se presenta de forma natural en una célula hospedadora. En algunas modalidades, una secuencia de ADN heteróloga es una secuencia de ADN quimérica que está comprendida de partes de diferentes genes, incluyendo elementos reguladores.

Como se usa en la presente, el término "proteína heteróloga" se refiere a una proteína o polipéptido que no se presenta de forma natural en la célula hospedadora, es decir, se codifica por una secuencia heteróloga.

Como se usa en la presente, "proteína homologa" se refiere a una proteína o polipéptido nativo o que se presenta de manera natural en una célula.

Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a una construcción de polinucleótido diseñada para introducir ácidos nucleicos en uno o más tipos de células. Los vectores incluyen vectores de clonación, vectores de expresión, vectores de transferencia, y plásmidos . En algunas modalidades, la construcción de polinucleótido comprende una secuencia de ADN que codifica para una BBPI variante, modificada .

Como se usa en la presente, el" término "vector de expresión" se refiere a un vector que tiene la capacidad de incorporar y expresar fragmentos heterólogos de ADN en una célula extraña. Están comercialmente disponibles muchos vectores procarióticos y eucarióticos de expresión. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de aquellos expertos en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "plásmido" se refiere a una construcción de ADN de doble hebra (ds) , circular, usada como un vector de clonación, y que forma un elemento genético autoreplicante extracromosómica en algunas eucariotas o procariotas, o se integra en el cromosoma del hospedador .

Como se usa en la presente en el contexto de introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula, el término "introducido" se refiere a cualquier método adecuado para transferir la secuencia de ácido nucleico a la célula. Estos métodos para la introducción incluyen pero no se limitan a fusión de protoplasto, transíección, transformación, conjugación, y transducción (ver, por ejemplo, Ferrari et al., "Genetics," in Hardwood et al, (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp., páginas 57-72,

[1989] ) .

Como se usa en la presente, los términos "transformado" y "transformado de manera estable" se refieren a una célula que tiene una secuencia de polinucleótido no nativa (heteróloga) integrada en su genoma o como un plásmido episomal que se mantiene durante al menos dos generaciones.

Como se usa en la presente, "por ciento (%) de identidad de secuencia" o "por ciento de homología" cuando se usa con referencia a un polinucleótido o a una secuencia de polipéptido se define como el porcentaje de residuos de aminoácido o de nucleótido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido o de nucleótido de una secuencia descrita en la presente. El por ciento de identidad compartido por las secuencias de polinucleótido o de polipéptido se determina por comparación directa de la información de secuencia entre las moléculas al alinear la secuencia al determinar la identidad por métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, la alineación incluye la introducción de separaciones en las secuencias que se van a alinear. Además, para secuencias que contienen ya sea más o menos nucleótidos o aminoácidos que aquellas de las secuencias candidatas de polinucleótido o polipéptido, se entiende el porcentaje de homología se determinará en base al número de nucleótidos o aminoácidos homólogos con relación al número total de nucleótidos o aminoácidos. De esta manera, por ejemplo, la homología de secuencias más cortas que aquellas de las secuencias identificadas en la presente se determinará usando el número de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia más corta. Esta homología se determina usando técnicas normales conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Smith y Waterman, Adv. Appl . Math. , 2: 482

[1981]; Needleman y unsch, J. Mol. Biol . , 48:443

[1970]; Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 2444

[1988]; programas tal como GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software Genético de Wisconsin (Genetics Computer Group, Madison, WI) ; y Devereux et al., Nucí. Acid Res., 12:387-395

[1984]).

Como se usa en la presente, una "secuencia análoga" es una en donde la función de la proteína es esencialmente la misma como aquella designada para la familia de Bowman Birk de inhibidores de proteasa. Adicionalmente, las proteínas análogas incluyen al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de la BBPI de SEQ ID NO: 187. Las secuencias análogas se determinan por métodos conocidos de alineación de secuencia. Un método de alineación comúnmente usado es BLAST, aunque como se indica anteriormente y más adelante, hay otros métodos que también encuentran uso en la alineación de secuencias.

Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de múltiples secuencias de un grupo de secuencias relacionadas usando alineaciones en pares, progresivas . También puede graficar un árbol que muestre las relaciones de agrupación usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresiva de Feng y Doolittle (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol., 35:351-360

[1987]). El método es similar a aquel descrito por Higgins y Sharp (Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153

[1989] ) . Los parámetros útiles de PILEUP que incluyen un peso de separación por defecto de 3.00, un peso de longitud de separación por defecto de 0.10, y separaciones terminales ponderadas .

Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, descrito por Altschul et al., (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410,

[1990]; y Karlin et al., Proc . Nati. Acad. Sci. EUA 90:5873-5787

[1993]). Un programa BLAST particularmente útil es el programa U-BLAST-2 (ver, Altschul et al., Meth. Enzymol . , 266: 460-480

[1996]). WU-BLAST-2 usa varios parámetros de busca, la mayoría de los cuales se ajustan a los valores por defecto. Los parámetros ajustables se ajustan con los siguientes valores: intervalo de traslape = 1, fracción de traslape = 0.125, umbral de palabra (T) = 11. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el programa mismo dependiendo de la composición de la secuencia particular y de la composición de la- base de datos particular contra la cual se está buscando la secuencia de interés. Sin embargo, los valores se pueden ajustar para crear sensibilidad. Un valor de porciento de identidad de secuencia de aminoácidos se determina por el número de correspondencia de residuos idénticos dividido por el número total de residuos de la secuencia "más larga" en la región alineada. La secuencia "más larga" es la que tiene la mayoría de los residuos reales en la región alineada (se ignora las separaciones introducidas por WU-Blast-2 para aumentar al máximo la puntuación de alineación) . Un método preferido utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 ajustado a los parámetros por defecto, con el intervalo de traslape y fracción de traslape ajustados a 1 y 0.125, respectivamente.

Una "célula hospedadora" se refiere a una célula adecuada de una célula que sirve como un hospedador para un vector de expresión que comprende ADN de acuerdo a la presente invención. Una célula hospedadora adecuada puede ser una célula hospedadora tipo silvestre o que se presenta de forma natural, o puede ser una célula hospedadora alterada. En una modalidad, la célula hospedadora es un microorganismo Gram-positivo . En algunas modalidades preferidas, el término se refiere a células en el género Bacillus .

Como se usa en la presente, "Bacillus sp." Incluye todas las especies dentro del género "Bacillus" , como se conoce por los expertos en la técnica, incluyendo pero no limitado a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B . megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, y B. thuringiensis. Se reconoce que el género Bacillus continúa experimentado reorganización taxonómica. De esta manera, se propone que el género incluye especies que se han reclasificado , incluyendo pero no limitado a organismos tal como B. stearothermophilus, que ahora se llama "Geobacillus stearothermophilus" . La producción de endosporas resistentes en la presencia de oxígeno se considera la característica definitoria del género Bacillus, aunque esta característica también aplica a los recién nombrados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus, y Virgibacillus , Como se usa en la presente, una "secuencia promotora" se refiere a una secuencia de ADN que se reconoce por el hospedador bacteriano para propósitos de expresión. En modalidades preferidas, se enlaza de manera operable a una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de fusión. Este enlace comprende colocar el promotor con respecto al codón de inicio de traducción de la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de ADN de fusión. En modalidades particularmente preferidas, la secuencia promotora contiene las secuencias de control de transcripción y traducción que median la expresión de la secuencia de ADN de fusión.

Como se usa en la presente, un ácido nucleico se "enlaza de manera operable" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN que codifica para un guía secretorio se enlaza de manera operable al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participan en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se enlaza de manera operable a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión a ribosoma se enlaza de manera operable a una secuencia codificadora si se coloca para facilitar la traducción. Las secuencias de ADN operablemente enlazadas usualmente están contiguas, y en el caso de un guía secretorio, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que estar contiguos. El enlace se logra por la ligación en sitios convenientes de restricción. Si no existen estos sitios, se usan ligadores o adaptadores sintéticos de oligonucleótido de acuerdo con la práctica convencional.

Como se usa en la presente, "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector, que se ha modificado por la introducción de una secuencia heteróloga de ácido nucleico o que la célula se deriva de una célula modificada de esta manera. De esta manera, por ejemplo, la célula recombinante se expresan genes que no se encuentran en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se sub-expresan o no se expresan para nada como resultado de intervención humana deliberada .

Como se usa en la presente, el término "composición de cuidado personal" se refiere a un producto para la aplicación a la piel, pelo, uñas, cavidad oral y membranas relacionadas para los propósitos de mejorar, limpiar, embellecer, tratar, y/o cuidar estas superficies y membranas. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal está en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un gel estabilizado o sistema de dispersión, tal como un suavizante de piel, una emulsión o nutriente, una crema nutriente, una crema de masaje, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara facial tópica, un sistema limpiador basado en agente tensioactivo tal como un champú o lavado corporal, una dispersión o emulsión roseada o nebulizada, un acondicionador de la piel o cabello, ayuda a destilización, o un producto pigmentado tal como maquillaje en forma líquida, de crema, sólida, anhidra o de lápiz. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ninguna forma particular, puesto que varias formas se encuentran en uso en la presente invención.

Los productos de cuidado personal se pueden clasificar/describir como compuestos cosméticos disponibles sin receta ("OTC") que encuentran uso en aplicaciones de cuidado personal (por ejemplo, cosméticos, cuidado de la piel, cuidado oral, cuidado del cabello, cuidado de uñas). En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada se adiciona a una composición de cuidado personal tal como una composición del cuidado del cuidado del cabello o pelo, una composición de cuidado de la piel, una composición del cuidado de las uñas, un composición cosmética, o cualquier combinación de éstas.

Como se usa en la presente, "composición de cuidado de la piel, se refiere a composiciones que se aplican a la piel a fin de proporcionar propiedades benéficas, incluyendo pero no limitado a reducir las arrugas, remoción de arrugas, decoloración, coloración, suavización de la piel, alisamiento de la piel, depilación, limpieza, etc. En algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona composiciones de cuidad de la piel que mejoran el tono de la piel. En estas modalidades, la mejora comprende disminuir las arrugas, alisar la textura de la piel, modificar la coloración de la piel y otros beneficios cosméticos deseados. En modalidades adicionales, la composición de cuidado de la piel está en una forma seleccionada del grupo que consiste de lavados corporales, lavados corporales humectantes, lavados corporales desodorizantes , limpiadores antimicrobianos, tratamientos protectores de la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, lociones para después de afeitar, bálsamos y/o composiciones radioprotectoras (por ejemplo, bloqueadores de sol) .

Como se usa en la presente, "composición cosmética" se refiere a composiciones que encuentran uso en los cosméticos. En la presente se usa la definición del acta de cosméticos y fármacos alimenticios (Acta FD&C) . De esta manera, los cosméticos se definen por su uso propuesto, como artículos propuestos para ser frotados, vertidos, rociados o atomizados en, introducidos en, o aplicados de otro modo al cuerpo humano para limpieza, embellecimiento, promoción de atractividad, o alteración de apariencia. Esas composiciones proporcionan beneficios no terapéuticos y no se regulan como productos farmacéuticos. Sin embargo, en algunas situaciones, se incorporan composiciones ^cosméticas en composiciones farmacéuticas para proporcionar beneficios cosméticos (por ejemplo, productos que tratan enfermedades de la piel o pelo, pero también contienen composiciones cosméticas para su coloración u otros beneficios. Las composiciones cosméticas incluyen composiciones de maquillaje como se define en la presente. También, se propone que la presente invención abarque el uso de cosméticos en animales diferentes de humanos .

Como se usa en la presente, los términos "composiciones farmacéuticas" y "composiciones terapéuticas" se refieren a composiciones tal como fármacos que proporcionan beneficios médicos, en lugar de sólo beneficios cosméticos. En los estados Unidos de América, las composiciones farmacéuticas y terapéuticas se aprueban por la Administración de Fármacos y Alimentos para tratamiento y/o prevención de condiciones particulares.

Como se usa en la presente, el término "fármaco" se define como está en la definición del Acta FD&C. De esta manera, los fármacos se definen como artículos propuestos para el uso en la diagnosis, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades, y artículos (diferentes de alimento) propuestos para afectar la estructura o cualquier función del cuerpo del hombre u otros animales.

Como se usa en la presente, "dejar puesto" se refiere a una composición que se aplica a un sujeto y no se remueve (por ejemplo, no se limpia por lavado, enjuague, etc.), durante un periodo de típicamente al menos varias horas (por ejemplo, 4-12 horas) antes de que se limpie el área expuesta a la composición.

Como se usa en la presente, una composición de "enjuague" es una composición que se aplica y limpia (por ejemplo, por lavado, enjuague, etc.), tan pronto después de su aplicación (en general en el espacio de aproximadamente 30 minutos de aplicación) . En algunas modalidades preferidas, las composiciones de enjuague se formulan para depositar una cantidad efectiva de productos activos en el área tratada.

Como se usa en la presente, el término "beneficio cosmético" se refiere a un cambio cosmético deseado que resulta de la administración de una composición de cuidado personal. Los beneficios cosméticos incluyen, pero no se limitan a mejoras en la condición de la piel, pelo, uñas, y la cavidad oral. En modalidades preferidas, se proporciona al menos un beneficio cosmético por las composiciones de cuidado de la piel, de cuidado del pelo, de cuidado de las uñas y de maquillaje de la presente invención.

Como se usa en la presente, "cosméticamente aceptable" se refiere a materiales que son adecuados para el uso en el contacto con tejidos de humanos y/u otros animales, sin toxicidad indebida, incompatibilidad, inestabilidad, irritación, respuestas alérgicas, etc., en proporción con una relación razonable de beneficio/riesgo.

Como se usa en la presente, los términos "pigmento" , "pigmento de color" , y "tinte" usados en referencia a las composiciones de la presente invención abarcan cualquier compuesto que proporcione un color a la composición y/o imparta un color a la superficie (por ejemplo, piel y/o pelo o cabello) a la cual se aplique la composición.

El término "radioprotector" se refiere a una sustancia capaz de bloquear o filtrar. Bloqueadores de sol de radiación UV y bloqueadores de sol.

Como se usa en la presente, "mejora la apariencia y/o condición de la piel" se refiere a cualquier beneficio logrado a través del uso de las composiciones de cuidado personal de la presente invención. Los ejemplos de los beneficios incluyen pero no se limitan a reducir las imperfecciones y/o manchas en el color de la piel, incluyendo aclaramiento de regiones hiperpigmentadas de la piel y/o igualación de la pigmentación de la piel, alivio de la sequedad, eliminación de aspereza, puntos secos, mejora de la capacidad de la piel para retener humedad y/o protegerse así misma de estrés ambiental, reducción de la apariencia de líneas y arrugas finas, mejora de la apariencia y tono de la piel, incremento de la firmeza y/o flexibilidad de la piel, disminución de la flacidez de la piel, incremento del brillo y claridad de la piel, incremento del proceso de renovación de la piel, y/o remoción de vello. La mejora de la apariencia visual de la piel también abarca la regulación de las arrugas, atrofia, aclaramiento de la piel, oscurecimiento de la piel, suavidad de la piel, y/o reducción de la apariencia visual de poros. En algunas modalidades, la mejora de la apariencia y7o condición de la piel da por resultado mejoras en la piel debido al tratamiento de un trastorno de la piel con la composición de cuidado personal de la invención.

El término "angiogénesis" se refiere a los procesos biológicos que dan por resultado el desarrollo de vasos sanguíneos y/o el incremento en la vascularización del tejido en un organismo.

Los términos "enfermedad angiogénica" , "trastorno angiogénico" , y "trastorno angiogénico de la piel", se usan con referencia a un trastorno, en general un trastorno de la piel o trastorno relacionado que se presenta como consecuencia de, y que da por resultado, vascularización incrementada en el tejido. Frecuentemente, es desconocida la etiología de la enfermedad angiogénica. Sin embargo, si la angiogénesis es una causa real de un estado de enfermedad o es simplemente una condición del estado de enfermedad, no es importante, sino la inhibición de la angiogénesis en el tratamiento o inversión del estado o condición de enfermedad es un aspecto importante de la presente invención. De esta manera, no se propone que la presente invención se limite a ningún mecanismo particular de acción. Los ejemplos de trastornos angiogénicos de la piel que son adecuados para tratamiento utilizando los compuestos de la presente invención incluye, pero no se limitan a psoriasis, acné, rosácea, verrugas, eccema, hemangiomas y linfangiogénesis , síndrome de Sturge-Weber, neurofibromatosis , esclerosis tuberosa, enfermedad inflamatoria crónica, y artritis. Cualquier trastorno de la piel que tenga como una caracterización principal o secundaria, la vascularización incrementada, se considera en la presente un trastorno angiogénico de la piel. De esta manera, las composiciones de cuidado personal que comprenden BBPI de unión a VEGF (VEGF-BBPI) proporcionadas por la presente invención encuentran uso en el tratamiento de una amplia variedad de trastornos y/o condiciones angiogénicas de la piel.

El término "rosácea" se usa para describir acné, rosácea, o eritematosa caracterizada por dilatación folicular que comprende típicamente la nariz y las porciones contiguas de las mejillas. La rosácea puede variar desde eritema muy suave pero persistente a hiperplasia extensiva de las glándulas sebáceas con pápulas y pústulas asentadas de forma profunda y puede estar acompañada por telangiectasia en los sitios eritematosos afectados. Esta condición también se refiere como "rosácea hipertrófica" o "rinofima", dependiendo de la severidad de la condición. Se propone que el término abarque todas las varias formas de la condición.

El término "psoriasis" se usa para describir una condición de la piel que se caracteriza por erupción de maculopápulas circunscritas, discretas y confluentes, rojizas y de escamas planteadas. Aunque no se propone que la presente invención se limite a ningún área corporal particular, las lesiones psoriáticas se presentan típicamente en los codos, rodillas, cuero cabelludo y tronco. De forma microscópica, estas lesiones demuestran paraqueratosis característica y alargamiento de las crestas interpapilares.

El término "acné" se usa para describir una condición de la piel caracterizada por erupciones foliculares, papulares y pustulares inflamatorias que comprenden el aparato sebáceo. Aunque existen numerosas formas de acné, la forma más común se conoce como acné simplex o acné vulgaris que se caracteriza por erupciones de la cara, espalda superior y pecho y está comprendida principalmente de comedones, quistes, pápulas y pústulas en una base inflamatoria. La condición se presenta principalmente durante la pubertad y adolescencia debido a un aparato sebáceo superactivo que se cree que se afecta por la actividad hormonal.

El término "eccema" es un término genérico usado para describir condiciones inflamatorias agudas o crónicas de la piel, típicamente eritematosas, edematosas, papulares, vesiculares y/o costrosas. Estas condiciones frecuentemente se siguen por liquenifi ación, escamación y ocasionalmente, por oscurecimiento de la eritema, e infrecuentemente hiperpigmentación . El eccema frecuentemente se acompaña por Ia sensación de picazón y quemadura. Las vesículas de eccema se forman debido a espongiosis intraepidérmica . Eccema se refiere algunas veces coloquialmente como "dermatopatía" , "dermatopatía seca" y "dermatopatía escamosa" . Hay numerosas subcategorías de eccema, todas las cuales se tratan por uno o más de los compuestos de acuerdo a la presente invención.

El término "hemangioma" se refiere a un tumor auto-involucionado benigno de células endoteliales (las células que forran los vasos sanguíneos) . Los hemangiomas se conectan al sistema circulatorio se rellenan con sangre. La apariencia depende de la ubicación. Si están en la superficie de la piel parecen una fresa madura, si están justo por debajo de la piel presentan una hinchazón azulada. Algunas veces crecen en órganos internos tal como el hígado o la laringe . Aproximadamente 80 % se localizan en la cara y cuello, con la siguiente ubicación más prevalente que es el hígado. Se proponen las composiciones de cuidado personal de la invención para tratar hemangiomas de la piel, es decir, hemangiomas que están en la superficie de la piel y hemangiomas que están justo debajo de la piel.

El término "escleroderma" se refiere en la presente a una enfermedad crónica caracterizada por depósitos excesivos de colágeno en la piel u otros órganos. La escleroderma afecta la piel, y en casos más serios, puede afectar los vasos sanguíneos y los órganos internos. El síntoma más evidente usualmente es el endurecimiento de la piel y cicatrización asociada. La piel puede parecer tirante, rojiza o escamosa. También son más visibles los vasos sanguíneos. Un factor significativo en el proceso es el factor de crecimiento transformante (TGF ) . El tratamiento tópico para los cambios de piel de la escleroderma no altera el trascurso de la enfermedad, pero puede mejorar el dolor y la ulceración.

Como se usa en la presente, "composición de cuidado de pelo" se refiere a composiciones que se aplican al pelo o cabello para proporcionar propiedades benéficas tal como engrosamiento, adelgazamiento, coloración, descoloración, limpieza, acondicionamiento, suavización, formación, etc. En algunas modalidades, la composición de cuidado de pelo está en una forma seleccionada del grupo que consiste de champús, acondicionadores, tratamientos anti-caspa, ayudas de estilizado, acondicionadores de estilizado, sueros de tratamiento o reparación de pelo, lociones, cremas, pomadas, y tratamientos químicos. En otras modalidades, las ayudas de estilizado se seleccionan del grupo que consiste de aspersiones, mouses, enjuague, geles, espumas, y combinaciones de los mismos. En modalidades adicionales, los tratamientos químicos se seleccionan del grupo que consiste de ondulaciones permanentes, alisadores, y tratamientos de color, permanentes, semipermanentes , temporales y combinaciones de los mismos.

Como se usa en la presente, "inhibir crecimiento de pelo" y "inhibición de crecimiento de pelo" se refieren a una disminución observada de la longitud y/o espesor del pelo. De esta manera, en algunas modalidades preferidas, la aplicación de una composición de cuidado personal de la presente invención proporciona el beneficio de disminuir la longitud y/o el espesor del pelo o cabello en comparación a un área en la cual no se ha aplicado una composición de cuidado personal de la presente invención. En algunas modalidades, la reducción observada del crecimiento y/o espesor de pelo está en un intervalo de menos de 1 % a más de 99 % , en comparación a las áreas no tratadas, en tanto que en otras modalidades, la reducción observada es de aproximadamente 100 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 70 %, de aproximadamente 70 % a aproximadamente 60 de aproximadamente 60 a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 40 , de aproximadamente 40 a aproximadamente 30 %, de aproximadamente 30 % a aproximadamente 20 de aproximadamente 20 a aproximadamente 10 de aproximadamente 10 % a aproximadamente 1 %. En realidad, se propone que el término se limite a cualquier porcentaje particular de reducción, en tanto que la reducción sea observable por medio visual (es decir, por el ojo) u otro. También se propone que el término abarque "impedir el crecimiento de pelo" en cualquier grado, como se describe anteriormente. No se propone que el término se limite a la prevención completa del crecimiento del pelo (es decir, no haya crecimiento observado de pelo) .

Los términos "trastorno inflamatorio dermatológico" o "trastorno inflamatorio de la piel" se refieren a la condición de la piel asociada con inflamación de la piel. En algunas modalidades, el trastorno inflamatorio de la piel es un trastorno asociado con niveles elevados de citocinas inflamatorias, por ejemplo, TNFa.

Como se usa en la presente, en algunas modalidades, el término "compuesto" se refiere a la BBPI comprendida en las composiciones de cuidado personal de la invención.

El término "cantidad efectiva" se usa de principio a fin en la especificación para describir concentraciones o cantidades de compuestos de acuerdo a la presente invención que se pueden usar para producir un cambio favorable en la enfermedad o condición tratada, por ejemplo, si ese cambio es el crecimiento del pelo, prevención del crecimiento del pelo o mejora de una condición provocada o asociada con un trastorno. Como se usa en la presente, "cantidad segura y efectiva" se refiere a una cantidad suficiente de un material que induce de manera significativa una modificación positiva al área en la cual se aplica el material y tampoco no da por resultado la producción de efectos secundarios serios (a una relación razonable de riesgo/beneficio) . La cantidad segura y efectiva del material puede variar con la piel u otra parte corporal particular que se trate, la edad del sujeto que se trata, la severidad de la condición que se trata, la duración de tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente, el material específico usado, el portador particular utilizado, etc. Aquellos expertos en la técnica son capaces de ajustar la concentración de las composiciones de cuidado personal proporcionadas en la presente para la aplicación deseada de las composiciones.

Como se usa en la presente, "activo" (y "activos") se refiere a una composición que imparte un beneficio a un sujeto que se trata. Por ejemplo, en algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de cuidado personal que comprenden una BBPI variante, modificada, por ejemplo, VEGF-BBPI variante, modificada, un "activo primario" que funciona para proporcionar beneficio al área a la cual se aplica. De esta manera, en algunas modalidades, la VEGF-BBPI variante, modificada está presente en las formulaciones de cuidado de la piel y sirve para tratar la piel de sujetos que padecen de un trastorno angiogénico de la piel. No se propone que el término se limite a VEGF-BBPI, puesto que hay constituyentes adicionales presentes en las composiciones de cuidado personal de la presente invención que imparten beneficios. En algunas modalidades, estos constituyentes adicionales se abarcan por la designación "activo secundario" . Los activos primarios y secundarios se refieren colectivamente como "activos" en la presente. Otros "activos primarios" proporcionados por la invención incluyen FGF-BBPI, TGF-BBPI y TNF-BBPI.

Como se usa en la presente, "compuesto de vitamina B3" significa un compuesto que tiene la fórmula: en donde R es -CONH2 (es decir, niacinamida) , -COOH (es decir, ácido nicotínico) o CH2OH (es decir, alcohol nicotinílico) ; derivado de los mismos; y sales de cualquiera de los anteriores .

Como se usa en la presente, "no vasodilatador" significa que un éster no produce comúnmente una respuesta de rubor visible después de la aplicación a la piel en las presentes composiciones. Se contempla que la mayoría de la población general no experimentará una respuesta de rubor visible, aunque estos compuestos pueden provocar vasodilatación no visible a simple vista.

Como se usa en la presente, "retinoide" incluye todos los análogos naturales y/o sintéticos de la vitamina A y/o compuestos tipo retinol que poseen la actividad biológica de la vitamina A en/sobre la piel, así como los isómeros y estereoisómeros geométricos de estos compuestos. Sin embargo, no se propone que el término se limite a estos compuestos, puesto que el término abarca alcohol de vitamina A (retinol) y sus derivados tal como aldehido de vitamina A (retinal) , ácido de vitamina A (ácido retinoico) y ésteres de vitamina A (es decir, acetato de retinilo, propionato de retinilo y palmitato de retinilo), etc. Además, se propone que el término abarque ácidos todo-trans-retinoico y ácidos 13-cis-retinoico. También se propone que el término abarque composiciones que se encapsulan, así como se proporcionan para el uso en varias formas. Los términos "retinol" y "retinal" comprenden de manera preferente los compuestos todo-trans. El retinoide usado preferentemente para la formulación de la presente invención es todo- trans-retinol , referido en general en la presente como "retinol" .

Como se usa en la presente, "carotenoide" se usa en referencia a ß-caroteno, licopeno, luteina, astaxantina, zeaxantina, criptoxantina, citranaxantina, cantaxantina, bixina, ß-a o-4-carotenal, ß-apo-S -carotenal , ésteres ß-apo-caroteonicos , _ solos, así como en combinación. Los carotenoides que se usan de manera preferente son ß-caroteno, licopeno, luteina, astaxantina, zeaxantina, citranaxantina y cantaxantina. En algunas modalidades, se utilizan carotenoides en forma cristalina, así como en formulaciones, que incluyen pero no se limitan a polvos secos (ver, por ejemplo, polvos secos, como se describen en EP 0,065,193; incorporada de este modo como referencia) . En algunas modalidades, el uso preferido en el caso de licopeno, astaxantina y cantaxantina es de los polvos secos que contienen licopeno, astaxantina y cantaxantina, por ejemplo LYC0VITMR, Rosa LUCA TINMR, Rojo LUCANTINMR (polvos secos al 10 % respectivamente de licopeno, astaxantina y cantaxantina, comercialmente disponibles de BASF AG, Ludwigshafen, Alemania) .

Como se usa en la presente, el término "fase dispersada" se usa por los expertos en la técnica de tecnología de emulsión como la fase que existe como partículas o gotas pequeñas suspendidas en, y circundadas por una fase continua. La fase dispersada también se conoce como la fase "interna" o "discontinua" .

Como se usa en la presente, "mejoradores de penetración" se refiere a composiciones que facilitan la penetración a través de la barrera córnea del estrato superior a las capas más profundas de la piel. Los ejemplos de mejoradores de penetración incluyen, pero no se limitan a, propilenglicol , azona, etoxidiglicol , dimetil- isosorbide , urea, etanol, sulfóxido de dimetilo, microemulsiones , liposomas y nanoemulsiones .

Como se usa en la presente, los términos "emulsionante" y "agente tensioactivo" se refieren a compuestos que dispersan y suspenden la fase dispersada dentro de la fase continua de un material. Los agentes tensioactivos encuentran uso particular en los productos propuestos para limpieza de la piel y/o pelo. En modalidades particulares, el término "agentes tensioactivos" se usa con referencia a agentes activos en la superficie, ya sea usados como emulsionantes o para otros propósitos de agentes tensioactivos tal como limpieza de la piel.

En varias modalidades, la presente invención también incluye "protectores" tal como absorbedores de UV (por ejemplo, octil-metoxicinamato, benzofenona-3 , dióxido de titanio, y salicilato de octilo) ; agentes formadores de película (por ejemplo, copolímero de VP/Eicoseno) ; agentes cosmecéuticos (por ejemplo, péptidos y proteínas, alfa-hidroxi-ácidos , y derivados de retinol y ácido retinoico) ; antioxidantes (por ejemplo, tocoferol y derivados del mismo y ácido ascórbico y derivados del mismo) ; vitaminas (por ejemplo, B, D, K y sus derivados) ; agentes antitranspirantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio e hidróxido de circonio) ; agentes depiladores (por ejemplo, sales de tioglicolato) ; agentes anti-acné (por ejemplo, ácido salicilico y peróxido de benzoilo) ; abrasivos y exfoliantes (por ejemplo, silicatos, piedra pómez, y polietileno) ; y extractos de planta, fruta, fuentes vegetales y/o marinas.

Como se usa en la presente, el término "bioactividad" se refiere a una relación de causa y efecto entre una composición y un sistema biológico. De esta manera, el término se usa según los expertos en la técnica de biotecnología y ciencias biológicas como la frase que describe una relación de causa y efecto entre una composición molecular y material biológico vivo (por ejemplo, tejido, células , etc . ) .

Como se usa en la presente como un sustantivo, el término "bioactivo" se refiere a una composición que exhibe bioactividad en la administración a una materia biológica viva (por ejemplo, tejido, células, etc.). El término se usa de manera indistinta con "compuesto bioactivo" .

Como se usa en la presente, "goma de silicón" significa silicones de alto peso molecular que tienen un peso molecular promedio en exceso de aproximadamente 200,000 y de manera preferente desde aproximadamente 200,000 a aproximadamente 4,000,000. Se propone que la definición abarque gomas no volátiles de polialquil y poliaril-siloxano.

Como se usa en la presente, una "composición que comprende una BBPI variante, modificada" se refiere ampliamente a cualquier composición que contiene la BBPI variante, modificada, dada. La composición puede estar en cualquier forma, particularmente una forma que es adecuada para administración.

Como se usa en la presente, se dice que un compuesto está "en una forma adecuada para administración" cuando el compuesto se puede administrar a un humano u otro animal por cualquier ruta deseada, (por ejemplo, tópica, oral, etc) .

Como se usa en la presente, "cantidad segura y efectiva" se refiere a una cantidad suficiente de un material que induce de manera significativa una modificación positiva al área en la cual se aplica el material y tampoco da por resultado la producción de efectos secundarios serios (a una relación razonable de riesgo/beneficio) . La cantidad segura y efectiva del material puede variar con la piel u otra parte corporal particular que se trate, la edad del sujeto que se trata, la severidad de la condición que se trata, la duración de tratamiento, la naturaleza de la terapia concurrente, el material específico usado, el portador particular utilizado, etc. Aquellos expertos en la técnica son capaces de ajustar la concentración de las composiciones de cuidado personal proporcionadas en la presente para la aplicación deseada de las composiciones. 5.2 Núcleos Moleculares de Inhibidores de Proteasa de Bowman Birk Las proteínas Inhibidoras de Proteasa de Bowman Birk (BBPI) son una familia de proteínas pequeñas (60-90 residuos) cinética y estructuralmente bien caracterizadas, y se han encontrado sólo en la semilla de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, y no, se han identificado en ninguna otra parte de la planta (ver, por ejemplo, Birt Int. J. Pept. Protein Res., 25: 113-131

[1985]). Las secuencias de muchos núcleos moleculares de BBPI tipo silvestre se han determinado de semillas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, y se han analizado (Prakash et al., J mol Evol 42: 560-569

[1996]). Típicamente, tiene una estructura simétrica de dos dominios tricíclicos cada uno que contiene una asa de unión independiente, aunque algunas tienen un dominio y algunas tienen más de dos dominios. El inhibidor principal de Bowman Birk de aproximadamente 8 kDa aislado de la soyas (BBI) tiene dos asas separadas de sitio reactivo, el asa I inhibe proteasas que tienen especificidad tipo tripsina y la asas II inhibe proteasas con especificidad tipo quimiotripsina (ver, por ejemplo, Chen et al., J. Biol . Chem. , 267: 1990-1994

[1992]; Werner y Wemmer, Biochem. , 31: 999-1010

[1992]; Lin et al., Eur. J. Biochem., 212: 549^-555

[1993]; Voss et al., Eur. J. Biochem., 242: 122-131

[1996]; y Billings et al., Pro. Nati. Acad. Sci., 89: 3120-3124

[1992]). Estas regiones de unión contienen cada una, una estructura de "asa canónica" , que es un motivo encontrado en una variedad de inhibidores de serina-proteinasas (Bode y Huber, Eur. J. Biochem., 204: 433-451

[1992]) . En algunas modalidades, los núcleos moleculares de BBPI tipo silvestre sirven como núcleos moleculares de BBPI precursoras tipo silvestre de las cuales se derivan los núcleos moleculares de BBPI variantes y variantes, modificadas.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona núcleos moleculares de BBPI variantes en los cuales las asas de tripsina (asa I) y/o de quimiotripsina (asa II) se reemplaza por un péptido variante. En algunas modalidades, el asa de tripsina se reemplaza con un péptido variante que da por resultado una BBPI variante que retiene la actividad inhibitoria de quimiotripsina (CIA) . En otras modalidades, el asa de quimiotripsina se reemplaza con un péptido variante para generar una BBPI variante que retiene la actividad inhibitoria de tripsina (TIA). En aún otras modalidades, las asas tanto de tripsina como de quimiotripsina de la BBPI se reemplazan cada una con un péptido variante. Los ejemplos no limitantes de núcleos moleculares de BBPI en los cuales el asa de tripsina y/o quimiotripsina se reemplaza con una secuencia de péptido variante e incluyen núcleos moleculares variantes tipo silvestre, y no modificados. Los ejemplos de núcleos moleculares precursores tipo silvestre incluyen pero no se limitan a núcleos moleculares descritos por Prakash (supra) , tal como el núcleo molecular del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID NO: 13) o la forma madura y truncada del mismo (SEQ ID NO: 185; DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEP CKPSE) , el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO: 449; PSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCVCTFSIPAQCVCVDMKDFCYEP CK) ; el inhibidor D-II de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO: 450; DDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCMCTRSQPGQCRCLDTNDFCYKP CKSRDD) y el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtC ; SEQ ID NO: 451; SSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACTHSIPAQCRCFDITDFCYKPC SG) . Los ejemplos de núcleos moleculares, precursores, variantes, no modificados incluyen pero no se limitan a núcleos moleculares en los cuales la asa de quimiotripsina se ha reemplazado con una secuencia variante de unión a VEGF que incluye la BBI-AV (SEQ ID NO: 186; DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEP CKPSEDDKEN) , BBIt-AV (SEQ ID NO: 187; DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEP CKPSE) , BBdb-AV (SEQ ID NO: 452; DPSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCACYNLYGWTCVCVDMKDFCYE PCK) , BBsb3-AV (SEQ ID NO: 453; DPDDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCACYNLYGWTCRCL DTNDFCYKPCKSRDD) , y BBtC-AV (SEQ ID NO: 454; DPSSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACYNLYGWTCRCFDI TDFCYKPCSG) ( BBIt-VEGK (SEQ ID NO: 640; DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKYYLYWWCKCTDITDFCY EPCKPSE) , BBIt-VEGT (SEQ ID NO: 641; DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSAC SCACTLWKSY CKCTDITDFCY EPCKPSE) y BBIt-VEGKD (SEQ ID NO: 642; DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKYDLYWWCKCTDITDFCY EPCKPSE) . En algunas modalidades, los núcleos moleculares, precursores, variantes, no modificados son núcleos moleculares variantes en los cuales un péptido variante reemplaza el asa de quimiotripsina de la BBPI tipo silvestre y que también introduce una sustitución del aminoácido en la posición equivalente a la posición 40 de la BBPI de SEQ ID NO: 187. Por ejemplo, el núcleo molecular de la BBPI variante, no modificada de SEQ ID NO: 187 (BBIt-AV) se derivó del núcleo molecular, precursor, tipo silvestre de SEQ ID NO: 185 al reemplazar el asa de quimiotripsina de SEQ ID NO: 185 con el péptido variante de VEGF de SEQ ID NO: 9, que introduce una sustitución de aminoácido 140A además de reemplazar la asa de quimiotripsina. La BBPI variante, no modificada de SEQ ID NO: 187 se modifica para generar una BBPI variante, modificada, que además de la asa reemplazada de quimiotripsina, comprende al menos una sustitución de aminoácido como se describe más adelante.

Aunque se han caracterizado numerosas formas de BBI, la SEQ ID NO: 13 es un ejemplo de la secuencia de aminoácidos del núcleo molecular de BBI tipo silvestre usada en algunas modalidades que comprenden aproximadamente 75 residuos de aminoácido (ver Ejemplo 1) . En algunas modalidades, la invención proporciona núcleos moleculares de BBPI, por ejemplo, SEQ ID NO: 11, que incluyen la región pro, en tanto que en otras modalidades, la invención proporciona núcleo moleculares de BBI de los cuales se ha removido el péptido pro, por ejemplo, SEQ ID NO: 185. En aún otras modalidades, la invención proporciona núcleos moleculares de BBI de los cuales se han removido hasta 10 aminoácidos del N-o C-terminal. En algunas modalidades, la invención proporciona núcleos moleculares de BBI de los cuales hasta 5, por ejemplo, SEQ ID NO: 187. Se apreciará que los truncamientos del núcleo molecular de BBI no destruirán la capacidad del BBI para unirse a la proteína objetivo.

En las soyas las BBPI, por ejemplo, el BBI se produce como una pro-proteína con un pro-péptido N- terminal que es 19 aminoácidos de longitud. De esta manera, en algunas modalidades, el BBI se produce con todo o al menos una porción del polipéptido. En algunas modalidades, el BBI está truncado, con tantos como 10 residuos de aminoácido que se remueven de ya sea la N- o C-terminal. Por ejemplo, en la desecación de las semillas, algunas moléculas de BBPI tienen removidos los 9 o 10 residuos de aminoácido C-terminales . De esta manera, en general está altamente tolerada la proteólisis antes del enlace inicial de disulfuro y justo después del enlace terminal de disulfuro, las consecuencias de lo cual usualmente no son perjudiciales a la unión a la proteína objetivo. Sin embargo, se apreciará que cualquiera de las isoformas o formas truncadas de una BBPI encuentran uso en las varias modalidades de la presente invención. En algunas modalidades, la forma truncada de la BBPI que encuentra uso en la presente invención es la BBIt variante en la cual el asa de quimiotripsina se reemplaza con una secuencia variante como se describe más adelante. 5.3 BBPI Variantes Como se indica anteriormente, las BBPI tienen asas de unión (es decir, asas de tripsina y de quimiotripsina) que inhiben proteasas . La presente invención proporciona BBPI variantes, que se derivan de los núcleos moleculares precursores de la BBPI tipo silvestre o variante, no modificada en la cual se han reemplazado uno o más sitios reactivos, por ejemplo, asa I (tripsina) y/o asa II (quimiotripsina) en la BBPI con péptidos variantes que se unen a una proteína objetivo. Los ejemplos no limitantes de proteínas objetivo que se unen por los péptidos variantes comprendidos en la BBPI de la invención incluyen varias citocinas, incluyendo citocinas de la familia del factor de necrosis tumoral (TNF) , particularmente TNF-o¡; citocinas de la familia del factor de crecimiento transformante, particularmente TGF ; citocinas de la familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) , particularmente FGF-5 , y citocinas de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , en particular VEGF-A. Además los péptidos variantes que reemplazan una o ambas asas de las BBPI de la invención incluyen péptidos que interactúan con los inhibidores de la ruta de complemento tal como los inhibidores C2, C3 , C4 o C5 , Compstatina, y otras proteínas de interés. En realidad, no se propone que la presente invención se limite a ninguna secuencia particular sustituida en cualquiera de estas asas, puesto que cualquier secuencia adecuada encuentra uso en la presente invención.

En algunas modalidades, las asas de tripsina y/o de quimiotripsina del núcleo molecular precursor de BBPI se reemplaza con la secuencia variante que se une a VEGF para generar proteínas VEGF-BBPI variantes. En algunas modalidades, la BBPI variante se deriva de un núcleo molecular precursor de BBPI tipo silvestre o variante no modificada, elegido de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID NO: 13) o la forma madura y truncada de los mismos (SEQ ID NO: 185) , el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO: 449) ; el inhibidor D-II de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO: 450), el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc ; SEQ ID NO: 451) , el núcleo molecular de BBI-AV de (SEQ ID NO: 186) , el núcleo molecular de BBIt-AV de (SEQ ID NO: 187) , el núcleo molecular de BBdb-AV de (SEQ ID NO: 452) , el núcleo molecular de BBsb3 -AV de (SEQ ID NO: 453) , el núcleo molecular de BBtc-AV de (SEQ ID NO: 454) , el núcleo molecular de BBIt-VEGK de (SEQ ID NO: 640) , el núcleo molecular de BBIt-VEGT de (SEQ ID NO: 641) y el núcleo molecular de BBIt-VEGKD de (SEQ ID NO: 642) . Además, cualesquiera de los núcleos moleculares precursores de BBPI tipo silvestre, tal como aquellos descritos por Prakash et al., {supra) , se puede usar para generar núcleos moleculares de BBPI variantes .

En algunas modalidades, las secuencias variantes de VEGF incluyen, pero no se limitan a péptidos de unión a VEGF descritos en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Números de Serie 09/832,723 y 10/984,270, que incluyen los péptidos ACYNLYGWTC (SEQ ID NO : 9) , KYYLYWW (SEQ ID NO: 458) , TLWKSYW (SEQ ID NO: 459) , DLYWW (SEQ ID NO: 460) , SKHSQIT (SEQ ID NO: 468) KTNPSGS (SEQ ID NO: 469) RPTGHSL (SEQ ID NO: 470), KHSAKAE (SEQ ID NO: 471) KPSSASS (SEQ ID NO: 472), PVTKRVH (SEQ ID NO: 473), TLHWWVT (SEQ ID NO: 492), PYKASFY (SEQ ID NO: 493), PLRTSHT (SEQ ID NO: 494), EATPROT (SEQ ID NO: 495), NPLHTLS (SEQ ID NO: 496), KHERIWS (SEQ ID NO: 497), ATNPPPM (SEQ ID NO: 498), STTSPNM (SEQ ID NO: 499), ADRSFRY (SEQ ID NO: 500), PKADSKQ (SEQ ID NO: 501), PNQSHLH (SEQ ID NO: 502), SGSETWM (SEQ ID NO: 503), ALSAPYS (SEQ ID NO: 504), KMPTSKV (SEQ ID NO: 505), ITPKRPY (SEQ ID NO: 506), KWIVSET (SEQ ID NO: 507), PNANAPS (SEQ ID NO: 508), NVQSLPL (SEQ ID NO: 509), TLWPTFW (SEQ ID NO: 510), NLWPHFW (SEQ ID NO: 511), SLWPAFW (SEQ ID NO: 512) , SLWPHFW (SEQ ID NO: 513) , APWNSHI (SEQ ID NO: 514) , APWNLHI (SEQ ID NO: 515) , LPSWHLR (SEQ ID NO: 516), PTILEWY (SEQ IDNO : 517), TLYPQFW (SEQ ID NO: 518), y HLAPSAV (SEQ ID NO: 519) . En algunas otras modalidades, las secuencias variantes de VEGF incluyen, pero no se limitan a, los péptidos de unión a VEGF descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número de Serie 11/919,717, incluyendo los péptidos KYYLSWW (SEQ ID NO: 520) , WYTLYKW (SEQ ID NO: 521) , TYRLYWW (SEQ ID NO: 522) , RYSLYYW (SEQ ID NO: 523), YYLYYWK (SEQ ID NO: 524), NYQLYGW (SEQ ID NO: 525), TKWPSYW (SEQ ID NO: 226), TLWKSYW (SEQ ID NO: 527), PLWPSYW (SEQ ID NO: 528), RLWPSYW (SEQ ID NO: 529), TLWPKYW (SEQ ID NO: 530), KYDLYWW (SEQ ID NO/531), RYDLYWW (SEQ ID NO: 532), DYRLYWW (SEQ ID NO: 533), DYKLY W (SEQ ID NO: 534), EYKLYWW (SEQ ID NO: 535), y RYPLYWW (SEQ ID NO: 536).

En algunas modalidades, las asas de tripsina y/o quimiotripsina del núcleo molecular precursor de BBPI se reemplaza con secuencias variantes que interactúan con FGF5 para generar proteínas FGF-BBPI variantes . En algunas modalidades, la BBPI variante se deriva de un núcleo molecular precursor de BBPI tipo silvestre o variante, no modificada, elegido de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID NO: 13) o la forma madura y truncada del mismo (SEQ ID NO: 185) , el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO: 449) ; el inhibidor D-II de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO: 450), el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc ; SEQ ID NO: 451) , el núcleo molecular de BBI-AV de (SEQ ID NO: 186) , el núcleo molecular de BBIt-AV de (SEQ ID NO: 187) , el núcleo molecular de BBdb-AV de (SEQ ID NO: 452) , el núcleo molecular de BBsb3 -AV de (SEQ ID NO: 453) , el núcleo molecular de BBtc-AV de (SEQ ID NO: 454), el núcleo molecular de BBIt-VEGK de (SEQ ID NO: 640), el núcleo molecular de BBIt-VEGT de (SEQ ID NO: 641) y el núcleo molecular de BBIt-VEGKD de (SEQ ID NO: 642) . Además, cualesquiera de los núcleos moleculares precursores de BBPI tipo silvestre, tal como aquellos descritos por Prakash et al., (supra), se puede usar para generar núcleos moleculares de BBPI variantes.

En algunas modalidades, las asas de tripsina y/o quimiotripsina del núcleo molecular precursor de BBPI se reemplaza con secuencias variantes que interactúan con FGF5. En algunas modalidades, las secuencias variantes de FGF5 incluyen, pero no se limitan a péptidos de unión a FGF5 descritos en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Números de Serie 10/984,410 y 12/033,848, que incluyen los péptidos CACRTQPYPLCF (MM007; SEQ ID NO: 430), CICTWIDSTPC ( PS2 ; SEQ ID NO: 431), CYGLPFTRC (SEQ ID NO: 537), CEEIWTMLC (SEQ ID NO: 538) , CWALTVKTC (SEQ ID NO : 539) , CLTVLWTTC (SEQ ID NO: 540) , CTLWNRSPC (SEQ ID NO: 541) , CHYLLTNYC (SEQ ID NO: 542), CRIHLAHKC (SEQ ID NO: 543), TNIDSTP (SEQ ID NO: 544) , HLQTTET (SEQ ID NO: 545) , SLNNLTV (SEQ ID NO: 546) , TNIDSTP (SEQ ID NO: 547), TNIDSTP (SEQ ID NO: 548), LRILANK (SEQ ID NO: 549), LLTPTLN (SEQ ID NO : 550), ALPTHSN (SEQ ID NO: 551), TNIDSTP (SEQ ID NO: 552), LCRRFEN (SEQ ID NO: 553), TNIDSTP (SEQ ID NO: 554), TNIDSTP (SEQ ID NO: 555), HLQTTET (SEQ ID NO: 556) , PLGLCPP (SEQ ID NO: 557) , GYFIPSI (SEQ ID NO: 558), TKIDSTP (SEQ ID NO: 559), HLQTTET (SEQ ID NO: 560), NIDSTP (SEQ ID NO: 561), TWIDWTP (SEQ ID NO: 562), RTQPYPL (SEQ ID NO: 670) y T IDSTP (SEQ ID NO: 671) .

En algunas modalidades, las asas de tripsina y/o quimiotripsina del núcleo molecular precursor de BBPI se reemplaza con secuencias variantes que interactúan con TGF para generar TGF-BBPI variantes. En algunas modalidades, la BBPI variante se deriva de un núcleo molecular precursor de BBPI tipo silvestre o variante, no modificada, elegido de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID NO: 13) o la forma madura y truncada del mismo (SEQ ID NO: 185) , el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO: 449) ; el inhibidor D-II de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO: 450), el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc ; SEQ ID NO: 451) , el núcleo molecular de BBI-AV de (SEQ ID NO: 186) , el núcleo molecular de BBIt-AV de (SEQ ID NO: 187) , el núcleo molecular de BBdb-AV de (SEQ ID NO: 452), el núcleo molecular de BBsb3-AV de (SEQ ID NO: 453) , el núcleo molecular de BBtc-AV de (SEQ ID NO: 454) , el núcleo molecular de BBIt-VEGK de (SEQ ID NO: 640), el núcleo molecular de BBIt-VEGT de (SEQ ID NO: 641) y el núcleo molecular de BBIt-VEGKD de (SEQ ID NO: 642) . Además, cualesquiera de los núcleos moleculares precursores de BBPI tipo silvestre, tal como aquellos descritos por Prakash et al., {supra) , se puede usar para generar núcleos moleculares de BBPI variantes.

En . algunas modalidades, las asas de tripsina y/o quimiotripsina del núcleo molecular precursor de BBPI se reemplaza con secuencias variantes que interactúan con TGFp . En algunas modalidades, las secuencias variantes de TGFp incluyen, pero no se limitan a, péptidos de unión a TGF descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número de Serie 10/581,142, que incluyen los péptidos CLCPENINVLPCN (PEN3; SEQ ID NO: 436), CIC HNVDWLCF (MM021W; SEQ ID NO: 437), CIC TQHIHNCF (WTQ; SEQ ID NO: 438), CVTTD IEC (SEQ ID NO: 563), CYYSQFHQC (SEQ ID NO: 564), CPTL THMC (SEQ ID NO : 565), QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ ID NO: 566), QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID NO: 567), QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID NO: 568), acetil-LCPENDNVSPCY-COhn2 (SEQ ID NO: 569), KHNVRLL (SEQ ID NO: 570), NDTPSYF (SEQ ID NO: 571), AKLYAGS (SEQ ID NO: 572), RGPAHSL (SEQ ID NO: 573), NSLAERR (SEQ ID NO: 574), HPLASPH (SEQ ID NO: 575), QP NKLK (SEQ ID NO: 576) , AWLr/Mipy (SEQ ID NO: 577) , PTKPAQQ (SEQ ID NO: 578) , PSLNRPQ (SEQ ID NO: 579) , HHARQEW (SEQ ID NO: 580) , RHHTPGP (SEQ ID NO: 581) , ASAINPH (SEQ ID NO: 582) , CHGYDRAPC (SEQ ID NO: 644), CFAPADQAC (SEQ ID NO: 645), CIPSRFITC (SEQ ID NO: 646), CHGHTKLAC (SEQ ID NO: 647), CNGKSKLAC (SEQ ID NO: 648), PENINVLP (SEQ ID NO;672), KHNVDWL (SEQ ID NO: 673) y WTQHIHNC (SEQ ID NO: 674).

En algunas modalidades, las asas de tripsina y/o quimiotripsina del núcleo molecular precursor de BBPI se reemplaza con secuencias variantes que interactúan con TNFa para generar TNF-BBPI variantes. En algunas modalidades, la BBPI variante se deriva de un núcleo molecular precursor de BBPI tipo silvestre o variante, no modificada, elegido de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID NO : 13) o la forma madura y truncada del mismo (SEQ ID NO: 185) , el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO: 449) ; el inhibidor D-II de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO: 450), el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc ; SEQ ID NO: 451) , el núcleo molecular de BBI-AV de (SEQ ID NO: 186), el núcleo molecular de BBIt-AV de (SEQ ID NO: 187) , el núcleo molecular de BBdb-AV de (SEQ ID NO: 452) , el núcleo molecular de BBsb3-AV de (SEQ ID NO: 453) , el núcleo molecular de BBtc-AV de (SEQ ID NO: 454) , el núcleo molecular de BBIt-VEGK de (SEQ ID NO: 640) , el núcleo molecular de BBIt-VEGT de (SEQ ID NO: 641) y el núcleo molecular de BBIt-VEGKD de (SEQ ID NO: 642) . Además, cualesquiera de los núcleos moleculares precursores de BBPI tipo silvestre, tal como aquellos descritos por Prakash et al., (supra) , se puede usar para generar núcleos moleculares de BBPI variantes .

En algunas modalidades, las asas de tripsina y/o quimiotripsina del núcleo molecular precursor de BBPI se reemplaza con secuencias variantes que se unen a TNFa. En algunas modalidades, las secuencias de unión a TNFa incluyen, pero no se limitan a, péptidos de unión a TNF descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número de Serie 10/968,732, que incluyen los péptidos RYWQDIP (TI; SEQ ID NO: 474) , APEPILA (T2; SEQ ID NO: 475), DMIMVSI (T3; SEQ ID NO: 476) , WTPKPTQ (SEQ ID NO: 583) , ATFPNQS (SEQ ID NO: 584) , ASTVGGL (SEQ ID NO: 585) , TMLPYRP (SEQ ID NO : 586) , AWHSPSV (SEQ ID NO: 587), TQSFSS (SEQ ID NO: 588), THKNTLR (SEQ ID NO: 589), GQTHFHV (SEQ ID NO: 590), LPILTQT (SEQ ID NO: 591), SILPVSH (SEQ ID NO: 592), SQPIPI (SEQ ID NO: 593), y QPLRKLP (SEQ ID NO: 594) .

En algunas modalidades, las BBPI variantes comprenden además una inserción de péptido que se coloca en el N-terminal de la BBPI variante, modificada. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia de entre 1 y 15 aminoácidos. En otras modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia entre 5 y 10 aminoácidos. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende el péptido de SEQ ID NO: 389 (DDEPSKPCCDPDP; SEQ ID NO: 389) . Los ejemplos de BBPI variantes, modificadas que comprenden la inserción de péptido de SEQ ID NO: 389 son la 4D13BBIt-AV variante, modificada de (DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLY GWTCFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO : 390) , y la BBIt-AV-4D13 -13I-29P-40K-50T-52A variante, modificada de SEQ ID NO: 413 (DPDDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYN LYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEO ID NO: 413) .

En algunas modalidades, las secuencias variantes se seleccionan por varios métodos conocidos en la técnica, que incluyen pero no se limitan a visualización en fagos y otros métodos adecuados de examen. Por ejemplo, una biblioteca de genes de péptidos aleatorios se fusiona con el gen de fago Pili de modo que la biblioteca de péptidos se visualizará en la superficie del fago. De manera subsiguiente, la biblioteca de visualización en fagos se expone a la proteína objetivo y se lava con amortiguador para remover la unión no específica (este proceso se refiere algunas veces como lavado) . Finalmente, se aislan el fago de unión y la secuencia de ADN por PCR para el péptido codificado.

En la mayoría de las modalidades, se reemplaza una de las asas con una secuencia variante, es decir, los péptidos frecuentemente de 3 a 14 aminoácidos de longitud, con de 5 a 10 aminoácidos que son los preferidos, para generar la BBPI variante. Secuencias más largas se encuentran uso en la presente invención, en tanto que proporcionen la unión y/o inhibición deseada. Además, los péptidos adecuados para el uso como reemplazos de las asas de unión adoptan de manera preferente una conformación funcional cuando están contenidos dentro de una asa restringida (es decir, una asa formada por la presencia de un enlace de sulfuro entre dos residuos de cisteínas) . En algunas modalidades especificas, los péptidos son de entre 7 y aminoácidos de longitud. En otras modalidades, las secuencias variantes son péptidos de 10 aminoácidos de longitud. 5.4 Proteínas BBPI Variantes Modificadas 5.4.1 BBPI Variantes Modificadas: Sustituciones Individuales de Aminoácido En algunas modalidades, la invención proporciona BBPI variantes, modificadas, que son BBPI variantes que comprenden además al menos una sustitución de aminoácido en la estructura fundamental de la BBPI. De esta manera, en algunas modalidades, las BBPI variantes, modificadas son BBPI variantes que contienen asas de tripsina y/o quimiotripsina que se ha reemplazado por una secuencia variante que se une a una proteína objetivo, y que se alteran adicionalmente al comprender una sustitución de aminoácidos y/o terminal y/o N-terminal a la asa reemplazada. De esta manera, en algunas modalidades, las BBPI variantes, modificadas son las BBPI variantes descritas en la sección 5.4 en las cuales se han reemplazado las asas de tripsina y/o quimiotripsina por un péptido variante, pero que además comprenden un aminoácido sustituido en al menos una posición equivalente a una posición elegida de las posiciones equivalentes a las posiciones 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40 50, 52, 55 y 65 de SEQ ID NO: 187, como se describe en la sección 5.4.

Un residuo de aminoácido de una BBPI variante, modificada está en un equivalente a la posición de un residuo de una BBPI precursora si es homologa (es decir, que corresponde en posición en la estructura primaria) a un residuo especifico. A fin de establecer la homología a la estructura primaria, la secuencia de aminoácidos de una BBPI precursora se compara directamente a la secuencia de aminoácidos primaria, y de manera particular al conjunto de residuos de cisteína que se conoce que están conservados en las BBPI para los cuales se conoce la secuencia. La Figura 17 muestra los residuos conservados de cisteína entre las BBPI precursoras, variantes y tipo silvestre de ejemplo, descritas en la presente. Se numeran los residuos equivalentes que se sustituyen en las BBPI variantes, modificadas en la invención.

La BBPI precursora puede ser una BBPI que se presenta de manera natural o una BBPI variante. De manera especifica, estas BBPI variantes, modificadas tienen unas secuencia de aminoácidos no encontrada en la naturaleza, que se deriva por reemplazo de la tripsina y/o quimiotripsina de una BBPI precursora con un diferente aminoácido. En algunas modalidades, la sustitución de al menos un aminoácido genera una BBPI variante, modificada, que tiene una mayor actividad inhibitoria de proteasa que aquella de la BBPI precursora, variante, no modificada. En otras modalidades, la sustitución del al menos un aminoácido genera una BBPI variante, modificada que tiene una mayor actividad inhibitoria de proteasa y rendimiento de producción aquella de la BBPI precursora, variante, no modificada.

De esta manera, una BBPI variante, modificada se deriva al sustituir al menos un aminoácido en la estructura fundamental de cualquier núcleo molecular de BBPI variante como se cita en la presente. En algunas modalidades, el inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI), variante, modificante, aislado contiene un péptido variante que reemplaza la asa de quimiotripsina del núcleo molecular de BBPI y comprende además un aminoácido sustituido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 y 65 de la BBI variante de SEQ ID No. 187. En otras modalidades, el inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado, aislado contiene un péptido variante que reemplaza la asa de tripsina del núcleo molecular de BBPI y comprende además un aminoácido sustituido en al menos una posición de aminoácido elegido de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40 50, 52, 55 y 65 de la BBI variante de SEQ ID No. 187. En aún otras modalidades, el inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado, aislado contiene un péptido variante que reemplaza la asa de tripsina y de quimiotripsina del núcleo molecular de BBPI y comprende además un aminoácido sustituido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes l, 4, 5, 11, 13, 18,' 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 y 65 del BBI variante de SEQ ID No. 187. En algunas modalidades, el núcleo molecular de BBPI elegido de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID No. 13) o la forma madura y truncada del mismo (SEQ ID No. 185) , el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID No. 449), el inhibidor D-II de soya de Glycine ax (BBsb3; SEQ ID No. 450), el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc; SEQ ID No. 451), el núcleo molecular de BBI-AV de (SEQ ID No. 186) , el núcleo molecular de BBIt-AV de (SEQ ID No. 187) , el núcleo molecular BBdb-AV de (SEQ ID No. 452), el núcleo molecular BBsb3-AV de (SEQ ID No. 453) , el núcleo molecular BBtc-AV de (SEQ ID No. 454), el núcleo molecular BBIt-VEGK de (SEQ ID No. 640) , el núcleo molecular BBIt-VEGT de (SEQ ID No. 641), y el núcleo molecular BBIt-VEGT de (SEQ ID No. 642) . En algunas modalidades, el péptido variante comprendido en la BBPI variante, modificada se elige del péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a FGF-5, un péptido de unión a TGF y un péptido de unión a TNF-a. En algunas modalidades, las secuencias de unión a VEGF incluyen, pero no se limitan a péptidos de unión a VEGF descritos en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. de Serie 09/832,723 y 10/984,270, que incluye los péptidos ACYNLYGWTC (SEQ ID No . 9), KYYLYW (SEQ ID No . 458), TLWKSYW (SEQ ID No. 459), DLYWW (SEQ ID No. 460), SKHSQIT (SEQ ID No. 468) KTNPSGS (SEQ ID No. 469) RPTGHSL (SEQ ID No. 470) , KHSAKAE (SEQ ID No. 471) KPSSASS (SEQ ID No . 472), PVTKRVH (SEQ ID No. 473), TLHW VT (SEQ ID No. 492), PYKASFY (SEQ ID No. 493), PLRTSHT (SEQ ID No. 494), EATPROT (SEQ ID No . 495), NPLHTLS (SEQ ID No. 496), KHERI S (SEQ ID No. 497), ATNPPPM (SEQ ID No. 498), STTSPNM (SEQ ID No. 499), ADRSFRY (SEQ ID No. 500), PKADSKQ (SEQ ID No. 501), PNQSHLH (SEQ ID No. 502), SGSETWM (SEQ ID No. 503), ALSAPYS (SEQ ID No. 504), K PTSKV (SEQ ID NO. 505), ITPKRPY (SEQ ID No . 506), KWIVSET (SEQ ID No. 507), PNANAPS (SEQ ID No. 508), NVQSLPL (SEQ ID No. 509), TLWPTFW (SEQ ID No. 510) , NLWPHF (SEQ ID No. 511) , SLWPAF (SEQ ID No. 512), SLWPHFW (SEQ ID No. 513), APWNSHI (SEQ ID No. 514), APWNLHI (SEQ ID No. 515), LPSWHLR (SEQ ID No. 516), PTILEWY (SEQ ID No . 517), TLYPQFW (SEQ ID No. 518) y HLAPSAV (SEQ ID No. 519) . En algunas otras modalidades, las secuencias variantes de VEGF incluyen, pero no se limitan a péptidos de unión a VEGF descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 11/919,717, que incluyen los péptidos KYYLSWW (SEQ ID No. 520), WYTLYKW (SEQ ID No. 521), TYRLYWW (SEQ ID No. 522), RYSLYYW (SEQ ID No. 523), YYLYY K (SEQ ID No. 524), NYQLYG (SEQ ID No. 525), T WPSYW (SEQ ID No. 226), TLWKSYW (SEQ ID No. 527), PLWPSYW (SEQ ID No. 528), RL PSYW (SEQ ID No. 529), TLWPKYW (SEQ ID No. 530), YDLYWW (SEQ ID No . 531), TYDLYWW (SEQ ID No. 532), DYRLYWW (SEQ ID No. 533), DYKLYW (SEQ ID No . 534), EYKLYWW (SEQ ID No. 535) y RYPLY (SEQ ID No. 536) .

En otras modalidades, las secuencias de unión a FGF5 incluyen, pero no se limitan a péptidos de unión a FGF5 descritos en las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. de Serie 10/984,410 y 12/033,848 que incluyen los péptidos CACRTQPYPLCF (MM007; SEQ ID No. 430), CICT IDSTPC (PS2; SEQ ID No. 431), CYGLPFTRC (SEQ ID No. 537), CEEIWTMLC (SEQ ID No. 538), C ALTVKTC (SEQ ID No. 539), CLTVLWTTC (SEQ ID No. 540), CTLWNRSPC (SEQ ID No. 541), CHYLLTNYC (SEQ ID No. 542), CRIHLAHKC (SEQ ID No. 543), TNIDSTP (SEQ ID No. 544), HLQTTET (SEQ ID No. 545), SLNNLTV (SEQ ID No. 546), TNIDSTP (SEQ ID No. 547), TNIDSTP (SEQ ID No. 548), LRILANK (SEQ ID No. 549), LLTPTLN (SEQ ID No. 550), ALPTHSN (SEQ ID NO. 551), TNIDSTP (SEQ ID No. 552), LCRRFEN (SEQ ID No. 553), TNIDSTP (SEQ ID No. 554), TNIDSTP (SEQ ID No . 555), HLQTTET (SEQ ID No. 556), PLGLCPP (SEQ ID No. 557), GYFIPSI (SEQ ID No. 558), TKIDSTP (SEQ ID No. 559), HLQTTET (SEQ ID No. 560), WNIDSTP (SEQ ID No. 561), TWIDWTP (SEQ ID No. 562), TRQPYPL (SEQ ID No. 670) y T IDSTP (SEQ ID No. 671) .

En otras modalidades, el péptido variante es un péptido de unión a TGF-ß que se elige de las secuencias de unión a TGF-ß que incluyen, pero no se limitan a péptidos de unión a TGF-ß descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/581,142, que incluye los péptidos CLCPENINVLPCN (PEN3, SEQ ID No. 436), CICKHNVDWLCF (MM021W; SEQ ID No. 437), CICWTQHIHNCF (WTQ; SEQ ID No. 438), CVTTD IEC (SEQ ID No. 563), CYYSQFHQC (SEQ ID No. 564), CPTLWTHMC (SEQ ID No. 565), QSACIVYYVGR PKVECASSD (SEQ ID No. 566) , QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID No. 567) QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID No. 568), acetil -LCPENDNVSPCY-cohn2 (SEQ ID No. 559), KHNVRLL (SEQ ID No. 570), NDTPSYF (SEQ ID No. 571), AKLYAGS (SEQ ID No. 572), RGPAHSL (SEQ ID No. 573), NSLAERR (SEQ ID No. 574), HPLASPH (SEQ ID No. 575), QPWNKLK (SEQ ID No. 576) , AWLr/Mipy (SEQ ID No. 577) , PTKPAQQ (SEQ ID No. 578), PSLNRPQ (SEQ ID No. 579), HHARQEW (SEQ ID No. 580), RHHTPGP (SEQ ID No. 581), ASAINPH (SEQ ID No. 582), CHGYDRAPC (SEQ ID No. 644), CFAPADQAC (SEQ ID No. 645), CIPSRFITC (SEQ ID No. 646), CHGHTKLAC (SEQ ID No. 467), CNGKSKLAC (SEQ ID No. 648), PENINVLP (SEQ ID No. 672), KHNVDWL (SEQ ID No. 673) y WTQHIHNC (SEQ ID No. 674) .

En aún otras modalidades, el péptido variante es un péptido de unión a TNFa que se elige de las secuencias de unión a TNFa que incluyen, pero no se limitan a los péptidos de unión a TNF descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 10/968,732, que incluye los péptidos RYWQDIP (TI; SEQ ID No . 474), APEPILA (T2, SEQ ID No. 475), DMIMVSI (T3 ; SEQ ID No. 476), WTPKPTQ (SEQ ID No. 583), ATFPNQS (SEQ ID No. 584), ASTVGGL (SEQ ID No. 585), TMLPYRP (SEQ ID No. 586), AWHSPSV (SEQ ID No. 587), TQSFSS (SEQ ID No. 588), THKNTLR (SEQ ID No. 589), GQTHFHV (SEQ ID No. 590), LPILTQT (SEQ ID No. 591), SILPVSH (SEQ ID No. 592), SQPIPI (SEQ ID No. 593) y QPLRKLP (SEQ ID No . 594) .

En algunas modalidades, la por lo menos una sustitución de aminoácido contenida en al menos un equivalente a una posición elegida de las posiciones equivalentes a las posiciones 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 y 65 de SEQ ID No. 187 dan por resultado los siguientes aminoácidos sustituidos. En una modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 1 de SEQ ID No. 187 se elige de A y C. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 4 de SEQ ID NO: 187 es V. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 5 de SEQ ID No. 187 se elige de P y A. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 11 de SEQ ID No. 187 es G. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 13 de SEQ ID No. 187 se elige de Y, I, F, M, L, V, K y R. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 18 de SEQ ID No. 187 incluye I, V y L. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 25 de SEQ ID No. 187 se elige de K, N, W, I, A y R. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 27 de SEQ ID No. 187 incluye R, K, V, A y Q. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 29 de SEQ ID No. 187 se elige de R, K y P. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 31 de SEQ ID No. 187 se elige de Q, H, E, A, R, W, K y T. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 38 de SEQ ID No. 187 se elige de N, K y R. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 40 de SEQ ID No. 187 se elige de H, K, Q, R e Y. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 50 de SEQ ID No. 187 se elige de R, Q, K, T, V, M y S. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 52 de SEQ ID No. 187 se elige de K, T, R, Q, L, H, A, M, S y E. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 55 de SEQ ID No. 187 es M. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 65 de SEQ ID No. 187 se elige de E, Q y D. En algunas modalidades, una sustitución de aminoácido individual hecha en una BBPI variante da por resultado una BBPI variante, modificada que tiene una mayor actividad inhibitoria de proteasa que aquella de la BBPI variante, no modificada, precursora. En algunas modalidades, una sustitución de aminoácido individual genera una BBPI variante, modificada que tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina (TIA) que la BBPI variante, precursora, modificada; en tanto que en otras modalidades, una sustitución de aminoácido individual genera una BBPI variante, modificada que tiene mayor actividad inhibitoria de quimiotripsina (CIA) que la BBPI variante, precursora, no modificada.

En una modalidad, la BBPI variante, modificada es el BBI variante de SEQ ID No. 187 (BBIt-AV; Figura 9), que contiene un péptido variante de VEGF en lugar de la asa de quimiotripsina, y que además se modifica para contener una sustitución de aminoácido en al menos una posición elegida de las posiciones 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 y 65 de SEQ ID No. 187 para generar un BBI variante, modificado. Cualquiera de las sustituciones de aminoácidos individuales descritas anteriormente y hechas en la BBIt-AV BBPI variante de SEQ ID No. 187 generaron BBIt-AV BBPI variantes, modificadas que tienen mayor actividad inhibitoria de tripsina que la BBIt-AV variante, precursora, no modificada (SEQ ID No. 187; ver Ejemplo 10) . 5.4.2 BBPI Variantes, Modificadas: Combinaciones de Sustituciones de Aminoácido.

La invención abarca BBPI variantes, modificadas que comprenden al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos al menos doce, trece, al menos catorce, al menos quince y al menos dieciséis sustituciones de aminoácido. En algunas modalidades las por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, por lo menos nueve, por lo menos diez, por lo menos once, por lo menos doce, por lo menos trece, por lo menos catorce, por lo menos quince y por lo menos dieciséis sustituciones de aminoácido generan BBPI variantes, modificadas que tienen mayor TIA que la BBPI variante, precursora, no modificada. En otras modalidades, las por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, por lo menos ocho, sustituciones de aminoácido generan BBPI variantes, modificadas que tienen mayor TIA y rendimiento de producción que la BBPI variante, precursora, no modificada.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de dos sustituciones de aminoácido en los aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 50 y 52 de SEQ ID No. 187. En algunas modalidades, la combinación de dos sustituciones de aminoácido es 50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprende además la combinación de dos sustituciones de aminoácidos 50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF, por ejemplo, SEQ ID No . 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de tres sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI, variante, modificado. En una modalidad, la BBPI variante, modificada, que comprende la combinación de dos sustituciones de aminoácido es la BBIt-AV-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 595 DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFCY EPCKPSE; SEQ ID No . 595) En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de tres sustituciones de aminoácido en los aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID No. 187. En algunas modalidades, la combinación de tres sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 25-50-52, 29-50-52, 40-50-52 y 13-50-52. En algunas modalidades, la combinación de tres sustituciones de aminoácido se elige de 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A y 13I-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprenden además la combinación de las tres sustituciones de aminoácido elegidas de 25L-50T-52A, 29P-50T,52A, 40K-50T-52A y 13I-50T-52A, como se describe en la presente 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF, por ejemplo, SEQ ID No . 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de tres sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificado. En una modalidad, la BBPI variante, modifica que comprende una combinación de tres sustituciones de aminoácidos se elige de la BBIt-AV-S25L-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 603 (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLD RLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 603), la BBIt-AV-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 607 (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSD RPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 607) la BBIt-AV-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 609 (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 609) .

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en los aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID No. 187. En algunas modalidades, la combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-50-52, 13-29-50-52, 25-29-50-52, 13-40-50-52, 25-40-50-52 y 29-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L- 29P-50T- 52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A y 29P-40K-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprenden además la combinación de las cuatro sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A y 29P-40K-50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF elegido de SEQ ID No. 9 y 460, el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificado. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A variante, modifica de SEQ ID No. 596 (DPDDESSKPCCDQCICT SNPPQCRCLD RLNSCHSAC SCACYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 596), la BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 600 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 600) , la BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 602 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 602), la BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 604 (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 604), la BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 606 (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 606), la BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 608 (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 608), la BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 643 (DPDDESSKPCCDQC ICTKSNPPQCRCKDMRPNSCHSACKSCICKYDLYWWCFCKDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID No. 643) . En otra modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de FGF5 elegido de SEQ ID No. 430 y 431, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificado. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 432, y la BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 434. En otra modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de TGF elegido de SEQ ID Nos. 436, 437, 438, 672, 673 y 674 y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-PEN3-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 443, la BBlt-MM02lW-Q-Al3l-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 445, y la BBIt- TQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 447.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de cinco sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID No. 187. En algunas modalidades, la combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-50-52, 13-29-40-50-52, 13-25-40-50-52, 25-29-40-50-52 y 13-29-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A y 13I-29P-40K-50T-52T. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprenden además la combinación de las cinco sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-29P-50T-52A, 138-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A y 13I-29P-40K-50T-52T, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID No. 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cinco sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificado. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 597 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 597), la BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 599 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYG TCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 599) , la BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 601. (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 601) , la BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 605 (DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYG TCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 605) , la BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 615 (DPDDESSKPCCDQCLCTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 615) , la BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 620) (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRKNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 620) , la BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 624) (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYG TCKCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 624) , la BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T variante, modificado de SEQ ID No. 625 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 625) .

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de seis sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID No. 187. En algunas modalidades, la combinación de seis sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-40-50-52, 1-13-29-40-50-52, 4-13-29-40-50-52, 5-13-29-40-50-52, 11-13-40-50-52, 13-25-29-40-50-52 13-27-29-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-38-40-50-52 y 13-29-38-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de seis sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 131-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A y 13I-29P-38N-40K-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprenden además las combinación es de seis sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K- 50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13 I-25R-2 P-40K-50T- 52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 131, 29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 131-29P-38N-40K-50T-52A y 13I-29P-38N-40K-50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID No . 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender la combinación de seis sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificado. En una modalidad, el BBPI variante, modificado que comprende una modificación de seis sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 598 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 598), la BBIt-AV-DlC-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 611 (DPDDEVSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 611) , la BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 612 (DPDDEVSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYG TCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 612), la BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 613 (DPDDESKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYG TCTCADITDFCY EPCKPSE; SEQ ID No. 613), la BBIt-AV-QllG-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 614 (DPDDESSKPCCDGCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 614) , la BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F506-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 616 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE: SEQ ID No. 616), la BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No.619 (DPDDESSKPCCDQCICT SNPPQCRCSDRRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 619) , la BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 621 (DPDDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNACHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDF CYEPCKPSE; SEQ ID No. 621), la BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO. 622 (DPDDESSKPCCDDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNRCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDF CYEPCKPSE; SEQ ID No. 622), la BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 623 (DPDDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKNCKCYNLYGWTCTCADITDF CYEPCKPSE; SEQ ID No. 623) , la BBIt-AV-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 626 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPEE; SEQ ID No . 626) .

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de siete sustituciones de aminoácido_.en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID No. 187. En algunas modalidades, la combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-29- 1-40-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52 y 13-25-27-29-31-50-52. En algunas modalidades, la combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K- 50T- 52A y 13I-25R-27A-29P-31A-50 -52T. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprenden además la combinación de seis sustituciones de aminoácidos elegidas de 13L-25R-29P-31A-40K-50T-r_52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T y 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID No. 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de siete sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de la variante BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A de SEQ ID No. 617 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNACHSACKSCKCYNLYGWTCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 617) la BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID No. 618 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDMRPNRCHSACKSCKCYNLYG TCTCADITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 618) , la BBBIt-VEGF-Vl-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 491 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACSKHSQITCKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 491) , la BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 632 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKTNPSGSCKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 632) , la BBIt-VEGF-V3 -A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 633 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACRPTGHSLCKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 633), la BBIt-VEGF-V4 -A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 634 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKHSAKAECKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 634), la BBIt-VEGF-V5-A138I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 635 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKPSSASSCKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 635) la BBIt-VEGF-V6-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 636 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACPVTKRVHCKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 636) , la BBIt-TNFa-Tl-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 637 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACRYWQDIPCKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 637) la BBIt-TNFa-T2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 638 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACAPEPILACKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 638) y la BBIt-TNFa-T3 -A13I-S25R- 27A- L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 639 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDQRPNECHSACKSCHCYNLYGWTCRCQDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 639) . En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende una combinación de ocho sustituciones de aminoácido en las posiciones de aminoácido equivalentes a las posiciones 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID No. 187. En algunas modalidades, la combinación de ocho sustituciones de aminoácido se eligen de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52 y 13-25-27-29-31-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de ocho sustituciones de aminoácido se elige de las combinaciones 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31A-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L y 131-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprenden además la combinación de ocho sustituciones de aminoácido elegidas de las combinaciones 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40H-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L y 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID No. 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de siete sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID No. 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende de una combinación de ocho sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID No. 627 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCHCYNLYG TCKCTDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 624; KT8 ) , la BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q variante, modificada de SEQ ID No. 628 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDARRNECHSACKSCKYNLYG TCQCQDITDFCY EPCKPSE; SEQ ID No. 628; QQ8), la BBIt-AV-A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K variante, modificada de SEQ ID No. 629 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDRRENACHSACKSCHCYNLYGWTCRCKDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 629; RK8) la BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L variante, modificada de SEQ ID No. 630 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDARARNCHSACKSCHCYNLYGWTCRCLDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No. 630; RL8) y la BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q variante, modificada de SEQ ID No. 631 (DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCKDQRPNECHSACKSCHCYNLYG TCRCQDITDFC YEPCKPSE; SEQ ID No . 631; RQ8 ) .

La invención proporciona adicionalmente BBPI variantes, modificadas que comprenden cualquier combinación de sustituciones de aminoácido descritas anteriormente y que tienen mayor actividad inhibitoria de proteasa que la BBPI variante, precursora, no modificada. En algunas modalidades, las BBPI variante, modificada que contienen un péptido variante en lugar de la asa de quimiotripsina de la BBPI no modificada, precursora, correspondiente tienen mayor actividad inhibitoria de tripsina (TIA) que aquella del núcleo molecular de BBPI, no modificada, precursora. En otras modalidades, las BBPI variantes, modificadas que contienen un péptido variante en lugar de la asa de tripsina de la correspondiente de BBPI no modificada, precursora, tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina (TIA) que aquella del núcleo molecular de BBPI no modificada, precursora .

Como se muestra en los Ejemplos, las sustituciones de al menos un aminoácido en la estructura fundamental de la BBPI variante genera una BBPI variante, modificada que tiene un mayor rendimiento de producción que la BBPI variante, no modificada. En algunas modalidades, las BBPI que comprenden una combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones de aminoácido tienen un mayor rendimiento de producción que la BBPI precursora, no modificada. De esta manera, la invención proporciona BBPI variantes, modificadas que comprenden cualquier combinación de las sustituciones de aminoácido descritas anteriormente y que tienen mayor rendimiento de producción (PY) que las BBPI variantes, precursoras, no modificadas. En aún otras modalidades, la invención proporciona BBPI variantes, modificadas que comprenden cualquier combinación de las sustituciones de aminoácido descritas anteriormente y que tienen mayor actividad inhibitoria de tripsina y mayor rendimiento de producción que la TIA y el PY de las BBPI variantes, precursoras, no modificadas.

En algunas modalidades, las BBPI variantes, modificadas comprenden además una inserción de péptido que se coloca en el N-terminal de la BBPI variante, modificada. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia de entre 1 y 15 aminoácidos. En otras modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia entre 5 y 10 aminoácidos. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende el péptido de SEQ ID No. 389 (DDEPSKPCCDPDP; SEQ ID No. 389) . Los ejemplos de BBPI variantes, modificadas que la inserción de péptido de SEQ ID No. 389 son la 4D13BBIt-AV variante, modificada de (DDEPSKPCCDPDPDDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYG WTCFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID No. 390), la BBIt-AV-4D13 -131- 29P-40K-50T-52A variante, modificada de SEQ ID No. 413 (DPDDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLY GWTCTCADITDFCYEPCKPSE; SEQ ID No . 413) . 5.4.3 Proteínas de Fusión de BBPI En algunas modalidades, cada BBPI variante, modificada se expresa como proteína de fusión que comprende un dominio catalítico, un sitio de escisión y el núcleo molecular de BBPI. El dominio catalítico se elige de celulasa, cutinasa y disulfuro- isomerasa. En algunas modalidades, el dominio catalítico comprendido en la proteína de fusión de BBPI es el dominio catalítico de celulosa de SEQ ID No. 669 DDYSWEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMKWLRDD GITVF RAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIID HILSDNDPNIYKEEAKDFFDEM SELYGDYPNVIYEIANEPNGSDVT DNQIKPYAEEVIPVIRDNDPNNIVIVGTGTWSQDVH HAADNQLADPNVMYAFHFYAGTHGQNLRDQVDYALDQGAAIFVSE GTSAATGDGGVFLDE AQVWIDFMDERNLSWANWSLTHKDESSAALMPGANPTGG TEAELSPSGTFVREKIRESAS (SEQ ID No. 669) .

La proteína de fusión se procesa por una proteasa o tratamiento ácido/térmico para liberar la BBPI variante, modificada. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprende además al menos una secuencia ligadora. En algunas modalidades, la secuencia ligadora se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID Nos. 141-143. Aunque la escisión del polipéptido de fusión para liberar la BBPI variante, modificada frecuentemente será útil, no es necesaria. Las BBPI variantes, modificadas expresadas y segregadas como proteínas de fusión retienen de manera sorprendente su función .

Las proteínas de fusión de BBPI variantes, modificadas se expresan cada una por la célula bacteriana hospedadora de una secuencia de polinucleótido de fusión. Estas secuencias de polinucleótido de fusión se montan en el cuadro de lectura apropiado del 5' -término a 3' -término en el orden de la primera, segunda, tercera y cuarta secuencias de polinucleótido. Para que se monten, la secuencia de polinucleótido codifica para un "polipéptido de fusión" que codifica desde su amino-término . 1. un péptido de señal funcional como una secuencia secretoria en una especie bacteriana, 2. un polipéptido segregado o porción del mismo normalmente segregado de una especie bacteriana, por ejemplo, celulasa o una porción de la misma, 3. un péptido ligador escindible y 4. un polipéptido deseado (por ejemplo, una BBPI variante, modificada) . En algunas modalidades, la secuencia de polinucleótido de fusión definida anteriormente comprende además un polinucleótido que codifica para una porción de un propéptido que funciona como un separador entre la primera y segunda secuencias de polinucleótido de una proteína de fusión. La función del separador se propone para incrementar la distancia entre el primer y el segundo polipéptidos codificados. En algunas modalidades, la secuencia separadora es de 1-10 aminoácidos de largo. En otras modalidades, la secuencia de polinucleótido de fusión definida anteriormente comprende además un polinucleótido que codifica para una inserción de péptido entre el péptido ligador y la BBPI variante, modificada. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende la secuencia entre 1 y 15 aminoácidos. En otras modalidades, la inserción del péptido comprende la secuencia entre 5 y 10 aminoácidos. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende el péptido de SEQ ID No. 389.

Se conocen varios métodos por los expertos en la técnica para la protección de proteínas de fusión (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nos. 5,411,873, 5,429,950 y 5,679,543, todos los cuales se incorporan en la presente como referencia. De esta manera, se propone que cualquier método adecuado encontrará uso en la presente invención . 5.5 Polinucleótidos de Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk Al grado que la presente invención depende de la producción de proteína de fusión, depende de técnicas de rutina en el campo de genética recombinante . Los textos básicos que describen los métodos generales de uso en esta invención incluyen Sambrook et al., Molecular Cloning, A. Laboratory Manual ( (2nd ed.) (1989)); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Ausubel et al., (eds.). Current Protocols in Molecular Biology (1994).

La invención proporciona composiciones que incluyen construcciones de polinucleótido, vectores y células hospedadoras que permiten la expresión de BBPI variantes, modificadas. La construcción del polinucleótido de la invención comprende una secuencia promotora de una secuencia del polinucleótido de fusión que codifica para una proteína de fusión que comprende una BBPI variante, modificada. Como se describe anteriormente, la secuencia del polinucleótido de fusión comprende un dominio catalítico, un sitio de escisión y el núcleo molecular de BBPI. Los fragmentos del polinucleótido naturales o sintéticos se codifican para una BBPI se pueden incorporar en las construcciones de polinucleótido. La por lo menos una sustitución de aminoácidos inducida en una BBPI variante se genera por medio de mutagénesis de saturación de sitio en al menos un codón. En modalidades alternativas, la por lo menos una sustitución de aminoácidos se codifica por oligonucleótidos de ADN que contienen la secuencia codificadora, y que se fijan y ligan a la secuencia de ADN de inhibidor de proteasa. La secuencia de ADN deseada entonces se aisla y usa en los métodos proporcionados en la presente.

En algunas modalidades, las construcciones de polinucleótido de la invención comprenden secuencias de polinucleótido que codifican para una BBPI variante, modificada que comparte al menos aproximadamente 65 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 70 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 75 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 80 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 92 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 97 % de identidad de secuencia de aminoácidos, al menos aproximadamente 98 % de identidad de secuencia de aminoácidos y al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de la BBPI variante, precursora, no modificada y tiene mayor actividad inhibitoria de proteasa que la BBPI variante, precursora, no modificada. La invención proporciona además polinucleótidos que codifican para BBPI variantes, modificadas que comprenden cualquier combinación de las sustituciones de aminoácido descritas anteriormente y que tienen mayor actividad inhibitoria de proteasa, por ejemplo, actividad inhibitoria de tripsina, que la BBPI variante, precursora, no modificada.

En algunas modalidades, las construcciones de polinucleótido de la invención comprenden una secuencia polinucleótido que puede ser optimizada por codón para la expresión de unan BBPI variante, modificada en la célula hospedadora usada. Puesto que las tablas de uso de codón que enlistan el uso de cada codón en muchas células se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Nakamura et al., Nucí. Acids Res. 28:292 (2000)) o son fácilmente derivables, estos ácidos nucléicos se pueden diseñar fácilmente dando la secuencia de aminoácidos de una proteína que se va a expresar.

La invención también abarca construcciones de polinucleótido que comprenden secuencias codificadoras que codifican para las proteínas BBPI variantes, modificadas que se relacionan al ser estructural y/o funcionalmente similares. En algunas modalidades, una BBPI variante, modificada se deriva de una BBPI que se presenta de una forma natural que corresponde a un diferente género y/o especie. En algunas modalidades, se proporcionan proteínas relacionadas de la misma especie. En realidad, no se propone que la invención se limite a las proteínas relacionadas de cualquier fuente particular. Además, el término "proteínas relacionadas" abarca homólogos estructurales terciario y homólogos de secuencia primarios. Por ejemplo, la presente invención abarca estos homólogos que incluyen pero no se limitan a proteínas BBPI tal como aquellas descritas por Prakash et al. (J. mol Evol 42:560-569 (1996)).

En algunas modalidades, la secuencia promotora comprendida en las construcciones del polinucleótido de la invención se enlazan de manera operable al polinucleótido que codifica para BBPI. Los promotores de ejemplo incluyen tanto promotores constitutivos como promotores inducibles. Estos promotores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los expertos en la técnica también están conscientes que se puede modificar un promotor natural por reemplazo, sustitución, adición o eliminación de uno o más nucleótidos sin cambiar su función. La práctica de la presente invención abarca y no se restringe por estas alteraciones al promotor. La elección del promotor usado en la construcción genética está dentro del conocimiento de un experto en la técnica.

En algunas modalidades, la secuencia promotora se puede obtener de una fuente bacteriana. En algunas modalidades, la secuencia promotora se pueden obtener de bacterias Gram-positivas tal como una cepa de Bacillus (por ejemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus lichenifor is, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ,o Bacillus thuringiensis) ; o una sepa Streptomyces (por ejemplo, Streptomyces lividans o Streptomyces murinus) ; o una bacteria gram-negativa (por ejemplo, E. coli o Pseudomonas sp.) .

El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que tenga actividad de transcripción en el organismo hospedador de elección y se puede derivar de genes que son homólogos o heterólogos al organismo hospedador. Los ejemplos de promotores adecuados que se pueden usar para expresar una BBPI variante, modificada en un hospedador bacteriano incluyen, pero no se limitan al promotor del operon lac de E. coli, los promotores dagA del gen de agarasa de -Stre tomyces coelicolor, los promotores de a-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , el promotor aprE de Bacillus subtilis, el promotor del gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , los promotores del gen de a-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , los promotores de los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis y un promotor derivado del promotor derivado de Lactococcus sp. que incluye el promotor PI70. Cuando el gen que codifica para el compuesto se expresa en una especie bacteriana tal como E. coli, se puede seleccionar un promotor adecuado, por ejemplo, de un promotor de bacteriófago que incluye un promotor T7 y un promotor de fago lambda . Para la transcripción de una especie fungoidea, los ejemplos de promotores útiles son aquellos derivados de los genes que codifican para amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizomucor, a-amilasa neutral de A. niger, a-amilasa estable ácido de A. niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor ntiehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa- fosfato- isomerasa de A. oryzae y acetamidasa de A. nidulans . Los ejemplos de promotores adecuados para la expresión en una especie de levadura incluyen, pero no se limitan a los promotores Gal 1 y Gal 10 de Saccharo yces cerevisiae y los promotores AOXl o A0X2 de Pichia pastoris .

La invención también abarca secuencias promotoras que se han mutado para incrementar la actividad del promotor en comparación a la actividad del correspondiente promotor tipo silvestre que da por resultado la expresión de la proteína BBPI . variante, modificada. De esta manera, se entiende que las variantes de las especies que definen el promotor AprE de B. subtilis que encuentran uso en las construcciones de la invención. En la técnica son bien conocidos los métodos para crear variantes promotoras en Bacillus sp. (ver, por ejemplo, Helmann et al., 2002. ARN polymerase and sigma factors, pp289-312 In A. L. Sonenshein, J. A. Hoch and R. Losick (ed) , Bacillus subtilis and its closest relatives : from genes to cells. American Society for Microbiology, Washington, D. C.) . No se propone que la presente invención se limite a ningún promotor particular, puesto que cualquier promotor adecuado conocido por los expertos en la técnica encuentra uso con la presente invención.

En las modalidades, además de una secuencia promotora, una construcción de polinucleótido también contiene una región de terminación de transcripción en la dirección 3' del gen estructural para proporcionar terminación eficiente. En algunas modalidades, la región de terminación se obtiene del mismo gen como la secuencia promotora, en tanto que en otras modalidades, se obtiene de otro gen. La selección de señales adecuadas de terminación de transcripción es bien conocida por los expertos en la técnica. 5.6 Vectores de Inhibidor de Proteasa de Bowman Birk La invención proporciona vectores que comprenden las construcciones de polinucleótido de la invención. Los vectores introducen en una célula hospedadora para expresar las proteínas BBPI variantes, modificadas de la invención. Se puede usar cualquier vector en tanto que sea replicable y viable en las células en las cuales se introduce. Los expertos en la técnica conocen grandes números de vectores y promotores adecuados, y estos están comercialmente disponibles. También se describen vectores apropiados de clonación y expresión en varias referencias conocidas por los expertos en la técnica (Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra y Ausubel et al., supra, incorporado de manera expresa en la presente como referencia) . La secuencia de ADN, apropiada, que codifica para BBPI se insertar en un plásmido vector (referido colectivamente en la presente como "vectores") por cualquier método adecuado. En general, una secuencia de ADN se inserta en un sitio apropiado de endonucleasa de restricción por procedimientos normales conocidos por los expertos en la técnica.

Típicamente, los vectores apropiados están equipados con una secuencia de ácido nucleico que codifica para el marcador seleccionable , sitios de inserción, y elementos adecuados de control, tal como secuencias de terminación. En algunas modalidades, los vectores comprenden secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, elementos de control (es decir, elementos promotores y terminadores o regiones no traducidas en 5' y/o 3'), efectivos para la expresión de la secuencia codificadora en células hospedadoras (y/o en un ambiente de vector o célula hospedadora en el cual normalmente no se expresa una secuencia codificadora de proteína soluble modificada) , operablemente enlazados a la secuencia codificadora. Se conocen por los expertos en la técnica grandes números de vectores y promotores adecuados, mucho de los cuales están comercialmente disponible y se conocen por los expertos en la técnica. La elección del marcador seleccionable apropiado dependerá de la célula hospedadora. Son bien conocidos en la técnica los marcadores apropiados para diferentes hospedadores bacterianos. Los genes marcadores selecciónateles típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibiótico u otras toxinas (por ejemplo, ampicilina, metotrexato, tetraciclina, neomicina, ácido micofenólico, puromicina, zeomicina, o higromicina; o (b) complementan una mutación auxotrópfica o una deficiencia nutricional que se presenta de forma natural en la cepa hospedadora .

En algunas modalidades, la expresión de un polipéptido de BBPI de fusión resulta de la expresión de una o más copias del polinucleótido que codifica para el polipéptido de fusión, correspondiente, que está presente en un plásmido de múltiples copias/replicador que se ha introducido en una célula hospedadora. En algunas modalidades, el vector es un vector de plásmido de múltiples copias/replicador que forma un elemento genético auto-replicador extracromosómico que expresa una proteína BBPI de fusión en la célula hospedadora. Típicamente, el vector es un vector de plásmido, que tiene un gen marcador seleccionable que permite la facilidad de selección de células hospedadoras que contienen el plásmido. Los vectores que se replican de manera autónoma en una célula hospedadora incluyen vectores que comprenden un origen de replicación, que permiten que el vector de replique de manera autónoma en la célula Bacillus .

Los ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de plásmidos, pBR322, pü*C19, pACYC177 , y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUBUO, pC194, pE194, pTA1060, y ???ß? que permiten la replicación en Bacillus. El origen de replicación puede ser uno que tiene una mutación para hacer su función sensible a la temperatura en la célula de Bacillus (ver, por ejemplo, Ehrlich, Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 75:1433

[1978]). Los vectores adicionales de expresión bacteriana que encuentran uso en la presente invención incluyen bacteriófagos ? y M13, y sistemas de expresión de fusión tal como MBP, GST, y LaZ . En modalidades adicionales, se adicionan marcas de epítopo a proteínas recombinantes , a fin de proporcionar métodos convenientes de aislamiento (por ejemplo, c-myc) .

En algunas modalidades, la expresión de un polipéptido de fusión de BBPI resulta de la expresión de al menos una copia de un polinucleótido que codifica para la fusión BBPI que se integra en el genoma de la célula hospedadora. De esta manera, en algunas modalidades, la invención proporciona una construcción de polinucleótido que codifica para BBPI que se incorpora en un vector de integración. De esta manera, cuando el vector se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica con untamente en el cual se ha integrado. Se pueden integrar múltiples copias del gen de BBPI en varias posiciones en el genoma de la célula hospedadora . De manera alternativa, un cásete de expresión amplificable que tiene una secuencia que codifica para una proteína de fusión de BBPI y un marcador seleccionable (por ejemplo, un marcador de resistencia antimicrobiana, tal como un gen que codifica para cloranfenicol-acetil-transferasa) se puede integrar en el genoma mediante un evento de cruce individual y luego amplificar al estimular la célula hospedadora transformada con concentraciones crecientes del antimicrobiano apropiado (por ejemplo, cloranfenicol) . 5.7 Células Hospedadoras de Inhibido de Proteasa de Bowman Birk En una modalidad, una invención proporciona una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para una BBPI variante, modificada. Después de que se introduce el vector de expresión en las células hospedadoras, las células hospedadoras transformadas se cultivan bajo condiciones que favorecen la expresión del gen que codifica para la proteína de fusión de BBPI deseada. Se pueden cultivar grandes lotes de células transformadas como se describe anteriormente. Finalmente, se recupera el producto del cultivo usando técnicas conocidas.

Son bien conocidos los métodos para introducir ADN en células Bacillus que comprenden construcciones de plásmido y la transformación de plásmido en células hospedadoras bacterianas. En algunas modalidades, los plásmidos se aislan de manera subsiguiente de E. coli y se transforman en Bacillus . Sin embargo, no es esencial usar microorganismos interpuestos tal como E. coli, y en algunas modalidades, se introduce directamente un vector o construcción de ADN en un hospedadora Bacillus . Los expertos en la técnica están bien consientes de los métodos adecuados para introducir secuencias de polinucleótido en células Bacillus (Ver, por ejemplo, Ferrari et al., "Genetics," in Harwood et al. (ed.), Bacillus, Plenum Publishing Corp.

[1989] , páginas 57-72; Saunders et al., J. Bacteriol., 157:718-726

[1984]; Hoch et al., J. Bacteriol., 93:1925 -1937

[1967]; Mann et al., Current Microbiol . , 13:131-135

[1986]; y Holubova, Folia icrobiol., 30:97

[1985]; Chang et al., Mol. Gen. Genet . , 168:11-115

[1979]; Vorobjeva et al., FEMS Microbiol. Lett., 7:261-263

[1980]; Smith et al., Appl . Env. Microbiol., 51:634

[1986]; Fisher et al., Arch. Microbiol., 139:213-217

[1981]; y McDonald, J. Gen. Microbiol., 130:203

[1984]). En realidad, los métodos tal como transformación, que incluyen transformación y congresión de protoplastos , transducción y fusión de protetoplastos se conocen y son adecuados para el uso en la presente invención. Los métodos de transformación son particularmente preferidos para introducir una construcción de ADN proporcionada por la presente invención en una célula hospedadora.

Además de los métodos comúnmente usados, en algunas modalidades, se transforman directamente células hospedadoras (es decir, no se usa una célula intermedia para amplificar, o procesar de otro modo, la construcción de ADN antes de la introducción en la célula hospedadora) . La introducción de la construcción de ADN en la célula hospedadora incluye aquellos métodos físicos y químicos conocidos en la técnica para introducir ADN en una célula hospedadora sin la inserción en un plásmido o vector. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, electroporación, inserción de ADN desnudo liposomas y similares. En algunas modalidades, las construcciones de ADN se co-transforman con un plásmido, que se inserta en el plásmido. En modalidades adicionales, se suprime un marcador seleccionadle de la cepa Bacillus alterada por métodos conocidos en la técnica (ver, Stahl et al, J. Bacteriol., 158:411-418

[1984]; y Palmeros et al., Gene 247:255-264

[2000]).

Los métodos conocidos en la técnica para transformar Bacillus, incluyen métodos tal como transformación de rescate de marcador de plásmido, que comprende la captación de un plásmido donador por células competentes que tienen un plásmido presidente parcialmente homólogo (Contente et al., Plasmid 2:555-571

[1979]; Haima et al., Mol. Gen. Genet . , 223:185-191

[1990]; Weinrauch et al., J. Bacteriol., 154:1077-1087

[1983]; y Weinrauch et al., J. Bacteriol., 169 : 1205-1211

[1987]). En este método, el plásmido donador entrante se recombina con la región homologa el plásmido "auxiliar" residente en un proceso que imita la transformación cromosómica.

Otros métodos que comprenden la transformación por transformación de protoplastos son bien conocidos en la técnica (Ver, por ejemplo, Chang y Cohén, Mol. Gen. Genet., 168:111-115

[1979]; Vorobj eva et al., FEMS Microbiol . Lett . , 7:261-263

[1980]; Smith et al., Appl . Env. Microbiol., 51:634

[1986]; Fisher et al., Arch. Microbiol., 139:213-217

[1981]; McDonald

[1984] J. Gen. Microbiol., 130:203

[1984]; y Bakhiet et al., 49:577

[1985]). Además, Mann et al., (Mann et al., Curr. Microbiol., 13:131-135

[1986]) describen la transformación de protoplastos de Bacillus, y Holubova (Holubova, Microbiol., 30:97

[1985]) describen métodos para introducir ADN en los protoplastos usando liposomas que contienen ADN. En algunas modalidades, se usan genes marcadoras a fin de indicar sí o no el gen de interés está presente en la célula hospedadora. En algunas modalidades, la secuencia de polinucleótido de fusión de BBPI contenida en el vector de la invención codifica para una proteína de fusión de BBPI que tiene SEQ ID NO: 195. Además de estos métodos, en otras modalidades, se transforman directamente las células hospedadoras. En la "transformación directa", no se usa una célula intermedia- para amplificar, o procesar de otro modo, el polinucleótido modificado antes de la introducción de la célula hospedadora (es decir, Bacillus) . La introducción del polinucleótido modificado en la célula hospedadora incluye aquellos métodos físicos y químicos conocidos en la técnica para introducir el polinucleótido modificado en una célula hospedadora sin la inserción en un plásmido vector. Estos métodos incluyen, pero no se limitan al uso de células competentes, así como al uso de "medios artificiales" tal como precipitación con cloruro de calcio, electroporación, etc. para introducir ADN en células. De esta manera, la presente invención encuentra uso con ADN desnudo, liposomas y similares.

Los ejemplos de organismos hospedadoras bacterianos adecuados son especies gram-positivas , que incluyen, pero no se limitan a los miembros de la especie de Bacillus, tal como Bacillaceae, (por ejemplo, B . subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B . alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium y B. thuringiensis) , especies Streptomyces (por ejemplo, S. murinus y S. lividans) bacterias de ácido láctico (por ejemplo, Lactococcus spp. tal como Lactococcus lactis; Lactobacillus spp. que incluyen Lactobacillus reuteri; Leuconostoc spp. ; Pediococcus spp. ; y Streptococcus spp. De manera alternativa, las cepas de Gram-negativas que corresponden a Ei-terojbacteriaceae (por ejemplo, E. coli) o miembros de la Pseudomonadaceae encuentran uso de la presente invención.

En algunas modalidades, un organismo hospedador de levadura adecuados se selecciona de varias especies de levadura biotecnológicamente útiles, que incluyen, pero no se limitan a Pichia sp. , Hansenula sp o Kluyveromyces, Yarrowinia , Saccharomyces (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) , Schizosaccharomyce (por ejemplo, S. pombe) . En algunas modalidades, las cepas de la especie de levadura metilotrófica Pichia pastoris se usan como el organismo hospedador, en tanto que en otras modalidades, el organismo hospedador es una especie de Hansenula . Los organismos hospedadores adecuados entre hongos filamentosos incluyen especies de Aspergillus (por ejemplo, A. niger, A. oryzae, A. tubigensis, A. awamori y Aspergillus nidulans) . De manera alternativa, las especies de Fusarium (por ejemplo F. oxysporum) y Rhizo ucor (por ejemplo, Rhizomucor miehei) encuentran uso en el organismo hospedador. Las cepas adecuadas adicionales incluyen, pero no se limitan a las especies Thermomyces y Mucor. Las proteínas auxiliares tal como tiol-disulfuro-oxidoreductasa o chaperonas encuentran uso en algunas modalidades, puesto que pueden ser benéficas para mantener la proteína secretoria en su conformación activa. Las tiol-disulfuoro-óxidoreductasas y proteína-disulfuro- isomerasas catalizan la formación de los enlaces correctos de disulfuro en la proteína. Se ha mostrado que la sobreexpresión de bdbDC en B. subtilis es benéfica para la producción en una proteína con enlaces de disulfuro (Ver, por ejemplo, Meima et al, J. Biol. Chem, 277:6994-7001,

[2002]). Las chaperonas ayudan a la proteína secretoria a plegarse por la unión a regiones hidrófobas expuestas en los estados no plegados y al impedir las interacciones desfavorables y las propil-peptidil-cis-trans-isomerasas ayudan en la formación de la conformación apropiada de la cadena del péptido adyacente a los residuos de prolina.

En algunas modalidades de la presente invención, las células hospedadoras se transforman con un vector de expresión que codifica para una tiol-disulfuro-óxidoreductasa o chaperona. No se propone que la presente invención se limite a ninguna tiol-disulfuro-oxidoreductasa o chaperona particular, puesto que cualquier tiol-disulfuro-óxidoreductasa o chaperona adecuada conocida por los expertos en la técnica encontraron uso en la presente invención.

En algunas modalidades de la presente invención y como se describe adicionalmente más adelante, la fracción de proteína secretoria apropiadamente plegada se incrementa por la adición de productos químicos al medio de crecimiento que reducen/oxidan los enlaces de disulfuro, y/o alteran el potencial general de reducción-oxidación y/o los productos químicos que alteran las propiedades de solvente afectando de este modo la agregación y conformación de la proteína en modalidades particularmente preferidas, un reactivo que reducir los enlaces de disulfuro, tal como 2-mercaptoetanol (ß??) , se prefiere para incrementar la fracción de proteína correctamente plegada. Sin embargo, en otras modalidades y dependiendo del medio usado, otros agentes oxidante o reductores de disulfuro (por ejemplo, DTT, TCEP, glutationa reducida y oxidada, cisteína, cistina, cisteamina, tioglicolato, S2032~, S2042", S2052~, S032", S207 ~, Cu+, etc.), usados ya sea solos o en combinación encuentran uso en la presente invención. Se contempla que otros adyuvantes que alteran las propiedades de solvente (por ejemplo, urea, DMSO, TWEENMR- 80 , etc.), ya sea adicionados al medio de crecimiento solos o preferentemente en combinación con agentes reductores/oxidantes de disulfuro, tal como ß??, también incrementarán la fracción de proteínas secretoria correctamente plegada y encuentran uso en las varias modalidades de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, el ß?? se usa a concentraciones que varían de 0.5 a 4 mM, en tanto que en otras modalidades, las concentraciones varían de 0.1 mM a 10 mM. En realidad, aquellos expertos en la técnica conocen como seleccionar el mejor medio de crecimiento y las mejores condiciones de crecimiento para optimizar los efectos de los agentes reductores/oxidantes de tiol, adicionados, y/o otros agentes tensoactivos , así como la concentración de agentes reductores/oxidantes de tiol y/u otros adyuvantes para el uso. No se propone que la presente invención se limite a ningún agente reductor/oxidante de disulfuro, particular, o adyuvante, puesto que cualquier reactivo adecuado, conocido por los expertos en la técnica, encuentra uso en la presente invención . 5.7.1 Parámetros de Fermentación La presente invención depende de procedimientos de fermentación para cultivar especies bacterianas. Los procedimientos de fermentación para la producción de proteínas heterólogas por especies bacterianas son bien conocidos en la técnica. El cultivo se logra en un medio de crecimiento que comprende un medio acuoso de sales minerales, factores orgánicos de crecimiento, el material fuente de energía y carbono, oxígeno molecular (para bacterias aeróbicas y facultativas) , y por supuesto, un inoculo de inicio de una o más especies particulares de microorganismos que se van a emplear.

Además de la fuente de carbono y energía, del oxígeno, del nitrógeno asimilable y un inoculo del microorganismo, es necesario suministrar cantidades adecuadas en proporciones apropiadas de nutrientes minerales para asegurar el crecimiento apropiado de microorganismo, para aumentar al máximo la asimilación de la fuente de carbono y energía por las células en el proceso de conversión microbiana, y para lograr rendimientos celulares máximos con densidad celular máxima en el medio de fermentación.

Varios medios de cultivo encuentran uso en la presente invención, como se conocen por aquellos expertos en la técnica. Sin embargo, los medios de cultivo bacterianos normales encuentran uso en la presente invención. En algunas formulaciones de medios preferidos, los medios incluyen, además de nitrógeno, cantidades adecuadas de fósforo, magnesio, calcio, potasio, azufre, y sodio en formas iónicas y combinadas, asimilables, solubles, adecuadas y también deben estar presentes de manera preferente ciertos elementos traza tal como cobre, manganeso, molibdeno, zinc, hierro, boro y yodo, nuevamente en forma asimilable, soluble, adecuado, todos como se conoce en la técnica.

En algunas modalidades, la reacción de fermentación comprende un proceso aeróbico en el cual se suministra el oxígeno molecular necesario por un gas que contiene oxígeno molecular tal como aire, aire enriquecido con oxígeno, o a un óxido molecular sustancialmente puro, proporcionado para mantener los contenidos del recipiente de fermentación con una presión parcial de oxígeno adecuada efectiva en ayudar a la especie de microorganismo a crecer de una manera próspera. En efecto, al usar un substrato de hidrocarburo, oxigenado, se reduce el requisito de oxígeno para el crecimiento del micro organismo. Sin embargo, se debe suministrar oxígeno molecular para el crecimiento del organismo aeróbico y a un menor grado, de los organismos facultativos.

Aunque la velocidad de aereación puede variar sobre un intervalo considerable, en genera la aereación se lleva a cabo a una velocidad que está en el intervalo de aproximadamente 0.5 a 10, de manera preferente de aproximadamente 0.5 a 7, volúmenes (a la presión empleada y a 25°C.) de gas que contiene oxígeno por volumen líquido en el termentador por minuto. Esta cantidad se basa en aire de contenido normal de oxígeno que se suministra al reactor, y en términos de oxígeno puro los intervalos respectivos serían aproximadamente 0.1 a 1.7, o de manera preferente de aproximadamente 0.1 a 1.3, volúmenes (a la presión empleada y a 25°C.) de oxígeno por volumen de líquido en el termentador por minuto.

La presión empleada para el proceso de conversión microbiana puede variar ampliamente. Las presiones están en general dentro del intervalo de aproximadamente 0 a 50 lb/pul2 (0 a 3.51 kg/cm2) , actualmente de manera preferente de aproximadamente 0 a 30 lb/pul2 (0 a 2.11 kg/cm2), de manera más preferente al menos ligeramente sobre presión atmosférica, como un equilibrio del costo del equipo y de operación versus solubilidad de oxígeno lograda. Presiones mayores que la atmosférica son ventajosas ya que estas presiones tienden a incrementar la concentración de oxígeno disuelto en el fermento acuoso, que a su vez puede lograr a incrementar las velocidades de crecimiento celular. Al mismo tiempo, esto se equilibra por el hecho que altas presiones atmosféricas incrementan los costos de equipo y de operación.

La temperatura de fermentación puede variar algo, pero para la mayoría de las especies bacterianas usadas en la presente invención, la temperatura estará en general dentro del intervalo de aproximadamente 20 °C a 40°C, de manera preferente en general en el intervalo de aproximadamente 28 °C a 37 °C, dependiendo de la cepa de microorganismo elegida, como se conoce por los expertos en la técnica.

Los microorganismos también requieren una fuente de nitrógeno asimilable. La fuente de nitrógeno asimilable puede ser cualquier compuesto o compuestos que contengan nitrógeno capaces de liberar nitrógeno en una forma adecuada para utilización metabólica por el microorganismo. En tanto que se pueden emplear una variedad de compuestos fuente de nitrógeno orgánico, tal como hidrolizados de proteína, usualmente se pueden utilizar compuestos baratos que contienen nitrógeno tal como amoníaco, hidróxido de amonio, urea, y varias sales de amonio tal como fosfato de amonio, sulfato de amonio, pirofosfato de amonio, cloruro de amonio o varios otros compuestos de amonio. El gas amoníaco mismo es conveniente para operaciones a gran escala, y se puede emplear al burbujear a través del fermento acuoso (medio de fermentación) en cantidades adecuadas. Al mismo tiempo, este amoníaco también se puede emplear para ayudar en el control del pH.

El intervalo de pH en el fermento microbiano acuoso (mezcla de fermentación) debe estar en el intervalo de ejemplo de aproximadamente 2.0 a 8.0. Sin embargo, el intervalo de pH óptimo para ciertos microorganismos es dependiente del medio empleado en algún grado, así como del organismo particular, y de esta manera, cambia algo con el cambio en el medio como se conoce por los expertos en la técnica .

En tanto que el tiempo promedio de retención de la mezcla de fermentación en el termentador puede variar considerablemente, dependiendo en parte de la temperatura de fermentación y del cultivo empleado, como se conoce en la técnica .

En algunas modalidades, la fermentación se lleva a cabo de manera preferente de una manera tal que el substrato que contiene carbono se puede controlar como un factor limitante, proporcionando de este modo buena conversión del substrato que contiene carbono a las células y ubicando la contaminación de las células con una cantidad sustancial de substrato no convertido. Esto último no es un problema con los substratos solubles en agua, puesto que se remueve fácilmente cualquier traza restante. Puede ser un problema, sin embargo, en el caso de substratos no solubles en agua, y requiere adicionar pasos de tratamiento-producto tal como pasos adecuados de lavado. El tiempo necesario para alcanzar este nivel limitante de substrato no es crítico y puede variar con el organismo particular y el proceso de fermentación que se lleva a cabo. Sin embargo, es bien conocido en la técnica como determinar la concentración de la fuente de carbono en el medio de fermentación y si o no se ha logrado el nivel deseado de fuente de carbono.

Aunque en algunas modalidades, la fermentación se lleva a cabo como una operación por lotes o continua, en general se prefiere la operación de lotes de alimentación para facilidad de control, producción de cantidades uniformes de productos, y usos más económicos de todo el equipo.

Si se desea, parte o todo el material de fuente de carbono y energía y/o parte de la fuente asimilable de nitrógeno tal como amoníaco se puede adicionar al medio mineral acuoso antes de alimentar el medio mineral acuoso en el fermentador. En realidad, cada una de las corrientes introducidas en el rector se controla de manera preferente a una velocidad apropiada, o respuesta a una necesidad determinable al monitorizar la concentración del substrato de carbono y energía, pH, oxígeno disuelto, oxígeno o dióxido de carbono en los gases residuales del fermentador, densidad celular medible por transmisión de luz, o similares. Las velocidades de alimentación de los varios materiales se puede variar para obtener una velocidad de crecimiento celular tan rápida como sea posible, consistente con la utilización eficiente de la fuente de carbono y energía, para obtener un rendimiento de células de microorganismo con relación a la carga de substrato, tan alta como sea posible, pero de manera más importante para obtener la producción más alta de la proteína deseada por volumen unitario.

En ya sea un lote, o la operación preferida del lote de alimentación, todo el equipo, reactor, o medios de fermentación, recipientes o contenedores, tubería, dispositivos auxiliares de circulación y enfriamiento, y similares, se esterilizan de forma inicial, usualmente al emplear vapor tal como a aproximadamente 121°C durante al menos aproximadamente 15 minutos. El reactor esterilizado entonces se inocula con un cultivo del microorganismo seleccionado en la presencia de todos los nutrientes requeridos, incluyendo oxígeno, y el substrato que contiene carbono. El tipo de fermentador empleado no es crítico aunque en algunas modalidades, se prefiere el Biolafitte de 15L (Saint-Germain-en-Laye, Francia) . 5.6 Separación de Proteína En algunas modalidades, las células hospedadoras transformadas con las secuencias de polinucleótido que codifican para proteasas modificadas se cultivan bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. La proteína producida por el hospedador recombinante que comprende una BBPI de fusión de la presente invención se segrega en el medio de cultivo. En algunas modalidades, se recupera la BBPI de fusión, segregadas. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para separar una proteína deseada de su análogo de fusión. Se contempla que los métodos descritos en la presente encontrarán uso en la separación de la BBPI variante, modificada del análogo de fusión.

La recolección y purificación de la proteína BBPI de fusión, deseada del caldo de fermentación también se puede lograr usando procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica. El caldo de fermentación contendrá en general desechos celulares, que incluyen células, varios sólidos suspendidos y otros contaminantes de biomasa, así como el producto de proteína deseado, que se remueven de manera preferente del caldo de fermentación por medios conocidos en la técnica. Los procesos adecuados para esta remoción incluyen técnicas convencionales de separación sólido-líquido (por ejemplo, centrifugación, filtración, diálisis, microfiltración, filtración al vacío, giratoria, u otros procesos conocidos) , para producir un filtrado libre de células. En algunas modalidades, se prefiere concentrar adicionalmente el caldo de fermentación o el filtrado libre de células antes del proceso de purificación y/o cristalización usando técnicas tal como ultrafiltración, evaporación y/o precipitación.

La precipitación de los componentes proteináceos del sobrenadante filtrado se puede lograr por medio de una sal (por ejemplo, sulfato de amonio) o pH bajo (típicamente menos de 3) , seguido por purificación por una variedad de procedimientos cromatográficos (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de inducción de carga hidrófoba, etc.), o procedimientos similares reconocidos en la técnica. No se propone que la presente invención se limite a ningún método particular de separación, puesto que se contempla que cualquier método encontrará uso en la presente invención .

En ciertas modalidades preferidas, cuando el polipéptido deseado, expresado se segrega de las células bacterianas, el polipéptido se purifica del medio de crecimiento. En modalidades preferidas, las células hospedadoras de expresión se remueven del medio antes de la purificación del polipéptido (por ejemplo, por centrifugación) .

Cuando el polipéptido deseado, recombinante , expresado no se segrega de la célula hospedadora, la célula hospedadora se rompe de manera preferente y el polipéptido se libera en un "extracto" acuoso que es la primera etapa de purificación. De manera preferente, las células hospedadoras de expresión se recolectan del medio antes del rompimiento celular (por ejemplo, por centrifugación). El rompimiento celular se puede realizar al usar cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como digestión por lisozimas o beta-glucanasa o al forzar las células a través de alta presión (Ver, por ejemplo, Protein Purification, Second edition, Springer-Verlag) .

En algunas modalidades, otras construcciones recombinantes incluyen la adición de dominios que facilitan la purificación, a la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de polipéptido de BBPI variante, modificada que facilita la purificación de las proteínas solubles (Kroll DJ et al (1993) ADN Cell Biol 12:441-53). En algunas modalidades, la adición seis residuos de cisteína (es decir, una "Marca His") al C-terminal de la BBPI variante, modificada se usa como una ayuda en la purificación de la proteína deseada y su análogo de fusión. El uso de las marcas His como una ayuda de purificación es bien conocido en la técnica (ver, por ejemplo Hengen, TIBS 20:285-286

[1995]). Las proteínas marcadas con His 6x se purifican fácilmente usando cromatografía por afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) , como se conoce por los expertos en la técnica. Otros dominios que facilitan la purificación e incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes metálicos tal como módulos de histidina-triptofano que permiten la purificación en metales inmovilizados (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3:263-281), dominios de proteína A que permiten la purificación en inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación por afinidad/extensión FLAGS (Immunex Corp, Seattle A) . La inclusión de una secuencia ligadora escindible tal como Factor XA o enterocinasa (Invitrogen, San Diego CA) entre el dominio de purificación y la proteína heteróloga también encuentra uso para facilitar la purificación.

De esta manera, cualquier método adecuado para recuperar las BBPI de fusión de la presente invención encuentra uso en la presente invención. En realidad, no se propone que la presente invención se limite a ningún método particular de purificación.

Para algunas aplicaciones, es de gran importancia que los inhibidores de proteasa producidos usado la presente invención sean altamente puros (por ejemplo, que tengan una pureza de más de 99 %) . Esto es particularmente cierto ya sea que la proteína deseada se vaya a usar como un producto terapéutico, pero también es necesario para otras aplicaciones. Los métodos descritos en la presente proporcionan una manera para producir proteínas deseadas sustancialmente puras. Las proteínas deseadas descritas en la presente son útiles en composiciones de cuidado personal y f rmacéuticas. Sin embargo, se contempla que las proteínas de niveles variables de pureza se producirán usando los métodos de la presente invención y no se propone que las proteínas producidas usando la presente invención se limiten a ningún nivel particular de pureza. 5.8.1 Activación de BBPI Durante Purificación: Actividad Inhibitoria de Proteasa En algunas modalidades de la presente invención, después de crecer durante el proceso de purificación, la actividad de la proteína, es decir, la actividad inhibitoria de proteasa, se incrementa por la adición de productos químicos que reducen/oxidan los enlaces de disulfuro y/o alteran el potencial general de reducción-oxidación, y/o los productos químicos que alteran las propiedades de solvente que afectan de esta manera la conformación y agregación de proteínas. En algunas modalidades particularmente preferidas, para incrementar la actividad de la proteína se usa la adición de un reactivo que reduce los enlaces de disulfuro, tal como 2 -mercaptoetanol . Sin embargo, como lo aprecian aquellos expertos en la técnica, dependiendo de la pureza y de la composición del amortiguador, otros agentes oxidantes o reductores de disulfuro (por ejemplo, DTT, TCEP, glutationa reducida y oxidada, cisteína, cistina, cisteamina, tioglicolato, S2032", S2042", S2Os2~, S032", S2072", Cu+, isomerasas de disulfuro de proteína, óxido reductasas de tiol-disulfuro de proteína, etc.), ya sea solos o en combinación, encuentran uso en la presente invención. Otros adyuvantes que alteran las propiedades de solvente, (por e emplo, etanolamina, DMSO, TWEENMR- 80 , argionina, urea, etc.), ya sea se adicionan solos o de manera preferente en combinación con agentes reductores/oxidantes de disulfuro, tal como ß??, durante el proceso de purificación también encuentran uso en la presente invención al incrementar la actividad de la proteína. En ciertas modalidades preferidas, la proteína parcialmente purificada se diluye en amortiguador (en algunas modalidades particularmente preferidas, un amortiguador z iteriónico con TWEENMR80 a pH básico) y activado con ß?? y un agente oxidante de disulfuro (en modalidades preferidas alternativas, glutationa oxidada o sulfito de sodio) .

Además, se contempla que las condiciones se examinarán a fin de determinar la activación óptima de la proteína de BBPI, si se desea. Por ejemplo, varias concentraciones de ß?? (0.1-10 mM) , concentraciones de agente oxidante (de 0 a 1/20 a 20 veces la concentración de ß ?) , pH (7.5-9.5), temperaturas (15-40°C), diluciones (1-20 veces), tiempos de incubación (12-72 h) , aireación (incubaciones bajo gas inerte a mezclado vigoroso bajo gases que contienen oxígeno) , tipos de amortiguador (Tris, CHES, CAPS, Tricina, TAPS, otros amostiguadores zwiteriónicos , etc.), concentraciones de amortiguador (0.1-1M), y la adición de varios adyuvantes conocidos por alterar la propiedades de solvente que afectan de este modo la conformación y agregación de proteínas (por ejemplo, etanolamina, DMSO, T EENMR80, arginina, urea, etc.), se prueban a fin de determinar las condiciones óptimas para el sistema de expresión usado. No se propone que la presente invención se limite a ningún agente reductor/oxidante de disulfuro, particular, dilución, temperatura, pH, tipo o composición de amortiguador, adyuvante, puesto que cualquier reactivo adecuado conocido por los expertos en la técnica encuentra uso en la presente invención.

La activación óptima de las BBPI por agentes reductores de tiol y/o agentes oxidantes, se monitoriza al medir un incremento en la actividad inhibitoria de proteasa de la BBPI variante, no modificada. La actividad inhibitoria de tripsina es la proteasa inhibitoria que se valora en las BBPI variantes en las cuales se ha reemplazado la asa de quimiotripsina por un péptido variante, en tanto que la actividad inhibitoria de quimiotripsina es la proteasa inhibitoria que se valora en las BBPI variantes en las cuales se ha reemplazado la asa de tripsina por una péptido variante. En algunas modalidades, el efecto de al menos una sustitución de aminoácido en la actividad inhibitoria de tripsina de una BBPI modificada se valora y se compara a la actividad inhibitoria de tripsina de la BBPI precursora, no modificada .

En algunas modalidades, las BBPI variantes, modificadas que comprenden al menos una sustitución de aminoácido tienen mayor actividad inhibitoria de tripsina que aquella de la BBPI precursora, no modificada. En algunas modalidades, la sustitución de aminoácido individual que genera una BBPI variante, modificada que tiene una mayor TIA que la precursora no modificada se elige del equivalente a una posición elegida de las posiciones equivalentes a las posiciones 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de SEQ ID NO: 187 da por resultado los siguientes aminoácidos sustituidos. En una modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 1 de SEQ ID NO: 187 se elige de A y C. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 4 de SEQ ID NO: 187 es V. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 5 de SEQ ID NO: 187 se elige de P y A. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 11 de SEQ ID NO: 187 es G. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 13 de SEQ ID NO: 187 se elige de Y, I, F, M, L, V, K y R. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 18 de SEQ ID NO: 187 incluye I, V y L. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 25 de SEQ ID NO: 187 se elige de K, N, W, I, A y R. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 27 de SEQ ID NO: 187 incluye R, K, V, A, y Q. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 29 de SEQ ID NO:187 se elige de R, K y P. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 31 de SEQ ID NO: 187 se elige de Q, H, E, A, R, W, K y T. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 38 de SEQ ID NO: 187 se elige de N, K y R. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 40 de SEQ ID NO: 187 se elige de H, K, Q, R, y Y. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 50 de SEQ ID NO: 187 se elige de R, Q, K, T, V, ?, y S. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 52 de SEQ ID NO: 187 se elige de K, T, R, Q, L, H, A, M, S, y E. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 55 de SEQ ID NO: 187 es M. En otra modalidad, el aminoácido sustituido en la posición de aminoácido equivalente a la posición 65 de SEQ ID NO:187 se elige de E, Q, y D.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada que tiene mayor TIA y PY que las BBPI no modificadas, precursoras, correspondientes, comprenden cada una, una combinación de dos sustituciones de aminoácido en los aminoácidos en las posiciones equivalentes a las posiciones 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de dos sustituciones de aminoácidos es 50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variante descritas en la Sección 5.3 y que comprenden además la combinación de dos sustituciones de aminoácido 50T-52a, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de tres sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI, variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de dos sustituciones de aminoácido es la BBIt-AV-F50T-V52A variante, modificada de de SEQ ID NO: 595.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI no modificadas, precursoras cada una que comprende una combinación de tres sustituciones de aminoácido en los aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de tres sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 25-50-52, 29-50-52, 40-50-52, y 13-50-52. En algunas modalidades, la combinación de tres sustituciones de aminoácido se elige de 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A y 13I-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en 5.3 y que comprende además la combinación de las tres sustituciones de aminoácido elegidas de 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A y 13I-50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de tres sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de tres sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-S25L-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 603, la BBIt-AV-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 607, y la BBIt-AV-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 609.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada que tiene mayor TIA que las BBPI no modificadas, precursoras, correspondientes comprenden cada una, una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en los aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-50- 52, 13-29-50-52, 25-29-50-52, 13-40-50-52, 25-40-50-52, y 29-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-50T-52A, 131-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, y 29P-40K-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprende además la combinación de las cuatro sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, y 29P-40K-50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF elegido de SEQ ID NO: 8 y 460, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de l BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 596, la BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 600, la BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 602, la BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 604, la BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 606, la BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 608, y la BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52K variante, modificada de SEQ ID NO: 643. En otra modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de FGF5 elegido de SEQ ID NOS: 433 y 434, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO:432, y la BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO:434. En otra modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de ???ß elegido de SEQ ID NOS: 436, 437 y 438, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-PEN3 -Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 43, la BBIt-MM021W-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO:445, y la BBIt-WTQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 447.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada que tiene mayor TIA que las BBPI no modificadas, precursoras, correspondientes comprende cada una, una combinación de cinco sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-50-52, 13-29-40-50-52, 13-25-40-50-52, 25-29-40-50-52, 13-29-40-50-52, 13-29-40-50-52, 13-29-40-50-52 y 13-29-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A y 13I-29P-40K-50T-52T. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprenden además la combinación de cinco sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A y 13I-29P-40K-50T-52T, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cinco sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO:187 para generar un núcleo molecular de BBPI, variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 597, la BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 599, la BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 601, la BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 605, la BBIt-AV-A13L-L29P-A40 -F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 615, la BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 620, la BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 624, y la BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 625.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada tiene mayor TIA que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas que comprenden cada una, una combinación de seis sustituciones de aminoácido en los aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 40, 50, y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de seis sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-40-50-52, 1-13-29-40-50-52, 4-13-29-40-50-52, 5-13-29-40-50-52, 11-13-29- 0-50-52, 13-25-29-40-50-52, 13-27-29-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-38-40-50-52, y 13-29-38-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de seis sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V- 13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R- 29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, y 13I-29P-38N-40K-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprenden además la combinación de seis sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V- 131-29P-40K-50T- 52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K- 50T- 52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, y 13I-29P-38N-40K-50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de seis sustituciones de aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de seis sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 598, la BBIt-AV-DlC-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 611, la BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 612, la BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 613, la BBIt-AV-QllG-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 614, la BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 616, la BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40 -F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 619, la BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 621, la BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 622, la BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 623, y la BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 626.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada que tiene mayor TIA que las correspondientes BBPI precursoras no modificadas comprende cada una, una combinación de siete sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, y 13-25-27-29-31-50-52. En algunas modalidades, la combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A- 29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, y 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprende además la combinación de seis sustituciones de aminoácido elegidas de 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, y 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID NO : 9 , y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de siete sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, el BBPI variante, modificado que comprende una combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 617, la BBIt -AV-A13I-S25R-L29P-S31R- A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 618, la BBIt-VEGF-Vl-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO:491, la BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R- 27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO:632, la BBIt-VEGF-V3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 633, la BBIt-VEGF-V4-A13I-S25R-M27A- L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 634, la BBIt-VEGF-V5-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 635, la BBIt-VEGF-V6-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 636, la BBIt-TNFa-Tl-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 637, la BBIt-TNFa-T2-A13I-S25R- 27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 638, y la BBIt-TNFa-T3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 639.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada que tiene mayor TIA que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas, comprenden cada una, una combinación de ocho sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50, y 52 de SEQ ID NO:187. En algunas modalidades, la combinación de ocho sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, y 13- 25-27-29-31-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de ocho sustituciones de aminoácido se elige de las combinaciones 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40 -50Q-52Q, 13I-25 -27R-29E-31A-40H-50R-52K, 131-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L, y 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprenden además la combinación de las ocho sustituciones de aminoácido elegidas de las combinaciones 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I- 25K-27A- 29R-31A-40H-50R-52L, y 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de siete sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de ocho sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 627, la BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q variante, modificada de SEQ ID NO: 628, la BBIt-AV-A13I-S25K- 27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K variante, modificada de SEQ ID NO: 629, la BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L variante, modificada de SEQ ID NO: 630, y la BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q variante, modificada de SEQ ID NO: 631.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada que tiene mayor TIA que las correspondientes BBPI precursoras no modificadas comprenden además cada una, una inserción de péptido que se coloca en el N-terminal de la BBPI variante, modificada. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia de entre 1 y 15 aminoácidos. En otras modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia entre 5 y 10 aminoácidos. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende el péptido de SEQ ID NO:389 (DDEPSKPCCDPDP; SEQ ID NO:389). Los ejemplos de BBPI variantes, modificadas que la inserción de péptido de SEQ ID NO: 389 son la 4D13BBIt-AV variante, modificada de SEQ ID NO: 390 (DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGW TCFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:390), y la BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A variante, modificada de SEQ ID NO: 413.

Una medida de mejora en la actividad inhibitoria de tripsina y/o quimiotripsina se puede determinar como el incremento en la relación de la actividad enzimática, es decir, BCE:BBPI, en la BBPI variante, modificada en comparación a aquella de la BBPI variante, no modificada. La relación de actividad enzimática BCE:BBPI es la relación de la actividad inhibitoria de proteasa de BBPI, por ejemplo, actividad inhibitoria de tripsina, a la BCE, es decir, actividad enzimática de celulasa. La relación de la BBPI variante, modificada se asigna a un valor de 1. Una relación igual a o mayor que 1 para una BBPI variante, modificada indica que la BBPI variante, modificada tiene mayor actividad inhibitoria de proteasa, por ejemplo, actividad inhibitoria de tripsina que aquella de la BBPI precursora, no modificada. En algunas modalidades, la relación de actividad de la BBPI variante, modificada es al menos 1, al menos aproximadamente 1.05, al menos aproximadamente 1.1, al menos aproximadamente 1.2, al menos aproximadamente 1.3, al menos aproximadamente 1-4, al menos aproximadamente 1.5, al menos aproximadamente 1.6, al menos aproximadamente 1.7, al menos aproximadamente 1.8, al menos aproximadamente 1.9, y al menos aproximadamente 2. En otras modalidades, la relación de actividad es al menos 2.1, al menos 2.2, al menos 2.3, al menos 2.4, al menos 2.5, al menos 2.6, al menos 2.7, al menos 2.8, al menos 2.9, y al menos 3. En aún otras modalidades, la relación de actividad es al menos aproximadamente 3.5, al menos aproximadamente 4.0 y al menos aproximadamente 5. De esta manera, en algunas modalidades, la actividad inhibitoria de proteasa, por ejemplo, actividad inhibitoria de proteasa de la BBPI variante, modificada mayor que aquella de la BBPI precursora, no modificada, correspondiente por al menos aproximadamente 0.5 %, aproximadamente 1.0 %, aproximadamente 1.5 %, aproximadamente 2.0 %, aproximadamente 2.5 %, aproximadamente 3.0 %, aproximadamente 4.0 %, aproximadamente 5.0 %, aproximadamente 8.0 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 100 %, o más. En otras modalidades, la actividad inhibitoria de proteasa, por ejemplo, actividad inhibitoria de proteasa, de la BBPI variante, modificada mayor que aquella de la correspondiente BBPI precursora no modificada por al menos aproximadamente 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % y hasta al menos aproximadamente 200 %.

En otras modalidades, las BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de sustituciones de aminoácido tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina que aquella de la BBPI precursora, no modificada. En algunas modalidades, las por lo menos dos, por lo menos tres, por lo menos cuatro, por lo menos cinco, por lo menos seis, por lo menos siete, y por lo menos ocho sustituciones de aminoácido generan BBPI variantes, modificadas que tienen mayor TIA que la BBPI variante, precursora, no modificada. Todas las BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de sustituciones de aminoácido como se describe en la sección 5.4 tienen mayor actividad inhibitoria de tripsina que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas. 5.8.2 Rendimiento de Producción de BBPI En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido hechas en la BBPI precursora, variante se valoran por la capacidad de la BBPI variante, modificada, resultante para tener un mayor rendimiento de producción que es mayor ¦ que aquel en el cual se produce la BBPI precursora, no modificada, es decir, la BBPI variante, modificada se produce a un nivel que es mayor que aquel en el cual se produce la BBPI precursora, no modificada. En algunas modalidades, la invención proporciona BBPI variantes, modificadas que comprenden una combinación de sustituciones de aminoácido como se describe en la sección 5.4 que tienen mayor actividad inhibitoria de proteasa, por ejemplo, actividad inhibitoria de tripsina, y mayor rendimiento de producción que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas.

Las BBPI variantes, modificadas tienen mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI no modificadas, precursoras, » cada una que comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, y al menos ocho sustituciones de aminoácido (ver Ejemplos 12, 13, 14 y 15) .

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas, cada una que comprende una combinación de dos sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de dos sustituciones de aminoácido es 50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprenden además la combinación de dos sustituciones de aminoácido 50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de tres sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI, variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de dos sustituciones de aminoácido es la BBIt-AV-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 6595.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI no modificadas, precursoras, cada una que comprende una combinación de tres sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de tres sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 25-50-52, 29-50-52, 40-50-52 y 13-50-52. En algunas modalidades, la combinación de tres sustituciones de aminoácido se elige de 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A y 13I-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprenden además la combinación de tres sustituciones de aminoácido elegidas de 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A y 13I-50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF, por ejemplo, SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de tres sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI, variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de tres sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-S25L-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 603, la BBIt-AV-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 607 y la BBIt-AV-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 609.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas cada una que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-50-52, 13-29-50-52, 25-29-50-52, 13-40-50-52, 25-40-50-52, y 29-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-50T-52A, 131-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, y 29P-40K-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variante descritas en la Sección 5.3 y que comprenden además la combinación de las cuatro sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, y 29P-40K-50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF elegido de SEQ ID NO: 9 y 460, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 596, la BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 600, la BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 602, la BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO:604, la BBIt-AV-S25L-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 606, la BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 608, y la BBIt-VEGKD-A13I-S25K-L29P-V52K variante, modificada de SEQ ID NO:643. En otra modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de FGF5 elegido de SEQ ID NOS: 430 y 431, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-MM007-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 432, y la BBIt-FGFps2-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO:434. En otra modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de TGF elegido de SEQ ID NOS: 436, 437 y 438, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-PEN3 -Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO:443, la BBIt-MM021W-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID N0:445, y la BBIt-WTQ-Q-A13I-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 447.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas cada una que comprende una combinación de cinco sustituciones de aminoácido en los aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO:187. En algunas modalidades, la combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-50-52, 13-29-40-50-52, 13-25-40-50-52, 25-29-40-50-52, 13-29-40-50-52, 13-29-40-50-52, 13-29-40-50-52 y 13-29-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A y 13I-29P- 40K-50T-52T. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprenden además la combinación de cinco sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A y 13I-29P-40K-50T-52T, como se describe en la sección 5.4. En otra modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de cinco sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI, variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de cinco sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 597, la BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 599, la BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 601, la BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 605, la BBIt-AV-A13L-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 615, la BBIt-AV-A13I-L29K-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 620, la BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50K-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 624, y la BBIt-AV- A13I-L29P-A40K-F50T-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 625.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas cada una que comprende una combinación de seis sustituciones de aminoácido en los aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 40, 50, y 52 de SEQ ID NO.-187. En algunas modalidades, la combinación de seis sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-40-50-52, 1-13-29-40-50-52, 4-13-29-40-50-52, 5-13-29-40-50-52, 11-13-29-40-50-52, 13-25-29-40-50-52, 13-27-29-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-31-40-50-52, 13-29-38-40-50-52, y 13-29-38-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de seis sustituciones de aminoácido se elige de 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, y 13I-29P-38N-40K-50T-52A. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprenden además la combinación de las seis sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I- 29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, y 13I-29P-38N-40K-50T-52A, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un peptido . variante de VEGF de SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de seis sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de seis sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO:598, la BBIt-AV-DlC-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 611, la BBIt-AV-S4V-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 612, la BBIt-AV-S5P-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 613, la BBIt-AV-QllG-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO:614, la BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 616, la BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 619, la BBIt-AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 621, la BBIt-AV-A13I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 622, la BBIt-AV- A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 623, y la BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 626.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada, tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI precursoras no modificadas cada una que comprende una combinación de siete sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO:187. En algunas modalidades, la combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, 13-25-27-29-31-50-52, y 13-25-27-29-31-50-52. En algunas modalidades, la combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50 -52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, y 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la Sección 5.3 y que comprende además la combinación de seis sustituciones de aminoácido elegidas de 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, y 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID NO: 9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de siete sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificado que comprende una combinación de siete sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 617, la BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A variante, modificada de SEQ ID NO: 618, la BBIt-VEGF-Vl-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 491, la BBIt-VEGF-V2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 632, la BBIt-VEGF-V3-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 633, la BBIt-VEGF-V4-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 634, la BBIt-VEGF-V5-A13I-S25R- 27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 635, la BBIt-VEGF-V6 -A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 636, la BBIt-TNFa-Tl-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 637, la BBIt-TNFp-T2-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 638, y la BBIt-TNFß-T3-A13I-S25R-M27A-L2 P-S31A-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 639.

En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada que tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI precursoras, no modificadas, comprenden cada una, una combinación de ocho sustituciones de aminoácido en aminoácidos en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50, y 52 de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la combinación de ocho sustituciones de aminoácido se elige de una combinación de sustituciones en las posiciones 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, 13-25-27-29-31-40-50-52, y 13-25-27-29-31-40-50-52. En algunas modalidades, la combinación de ocho sustituciones de aminoácido se elige de las combinaciones 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 131-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L, y 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q. La invención proporciona cualquiera de los núcleos moleculares de BBPI variantes descritos en la sección 5.3 y que comprenden además la combinación de las ocho sustituciones de aminoácido elegidas de las combinaciones 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I- 25K-27A-29R- 31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L, y 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q, como se describe en la sección 5.4. En una modalidad, la asa de quimiotripsina del núcleo molecular variante es un péptido variante de VEGF de SEQ ID NO :9, y el núcleo molecular variante se altera adicionalmente para comprender una combinación de siete sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187 para generar un núcleo molecular de BBPI variante, modificada. En una modalidad, la BBPI variante, modificada que comprende una combinación de ocho sustituciones de aminoácido se elige de la BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T variante, modificada de SEQ ID NO: 627, la BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q variante, modificada de SEQ ID NO: 628, la BBIt-AV-A13I-S25K-M27R-L29E-S31A-A40H-F50R-V52K variante, modificada de SEQ ID NO: 629, la BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31A-A40H-F50R-V52L variante, modificada de SEQ ID NO: 630, y la BBIt-AV-A13I-S25K-M27Q-L29P-S31E-A40H-F50R-V52Q variante, modificada de SEQ ID NO: 631.

En algunas modalidades, las BBPI variantes, modificadas comprenden además una inserción de péptido que se coloca en el N-terminal de BBPI variante, modificada. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia de entre 1 y 15 aminoácidos. En otras modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia de entre 5 y 10 aminoácidos. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende el péptido de SEQ ID NO -.389. Los ejemplos de las BBPI variantes, modificadas que la inserción de péptido de SEQ ID NO: 389 son la 4D13BBIt-AV variante, modificada de SEQ ID NO:390 y la BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A variante, modificada de SEQ ID NO: 413.

La invención proporciona además BBPI variantes, modificadas que tiene mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI precursoras no modificadas cada una que comprende cualquier combinación de sustituciones de aminoácido descritas anteriormente y que tienen mayor actividad inhibitoria de proteasa que la BBPI precursora, variante, no modificada. En algunas modalidades, las BBPI variantes, modificadas que contienen un péptido variante en lugar de la asa de quimiotripsina de la correspondiente BBPI precursora no modificada tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina (TIA) que aquella del núcleo molecular de la BBPI precursora no modificada. En otras modalidades, las BBPI variantes, modificadas que contienen un péptido variante en lugar del asa de tripsina de la correspondiente BBPI precursora no modificada tienen mayor actividad inhibitoria de quimiotripsina (TIA) que aquella del núcleo molecular de BBPI precursora no modificada.

Como se muestra en los ejemplos, las sustituciones de al menos un aminoácido en la estructura fundamental de la BBPI variante genera una BBPI variante, modificada que tiene un mayor rendimiento de producción que la BBPI variante, no modificada. En algunas modalidades, las BBPI que comprenden una combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones de aminoácido tienen un mayor rendimiento de producción que la BBPI precursora no modificada. De esta manera, la invención proporciona BBPI variantes, modificadas que comprenden cualquier combinación de sustituciones de aminoácido descritas anteriormente y que tienen mayor rendimiento de producción (PY) que las BBPI precursoras, variantes, no modificadas. En aún otras modalidades, la invención proporciona BBPI variantes, modificadas que comprenden cualquier combinación de las sustituciones de aminoácido descritas anteriormente y que tienen mayor actividad inhibitoria de tripsina y mayor rendimiento de producción que la TIA y PY de las BBPI precursoras, variantes, no modificadas.

En algunas modalidades, las BBPI variantes, modificadas que tienen mayor TIA y PY que las correspondientes BBPI . precursoras , no modificadas comprenden cada una además una inserción de péptido que se coloca en el N- terminal de la BBPI variante, modificada. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia de entre 1 y 15 aminoácidos. En otras modalidades, la inserción de péptido comprende una secuencia de entre 5 y 10 aminoácidos. En algunas modalidades, la inserción de péptido comprende el péptido de SEQ ID NO: 389. Los ejemplos de las BBPI variantes, modificadas incluyen la 4D13BBIt-AV variante, modificada de SEQ ID NO: 390 y la BBIt-AV-4D13-13I-29P-40K-50T-52A variante, modificada de SEQ ID NO: 413.

Una medida de mejora en el rendimiento de producción se puede determinar como el incremento en el nivel de la BBPI libre después de la escisión de la BBPI del C-terminal del núcleo de BCE. Como se describe anteriormente, en algunas modalidades, las proteínas de fusión de BBPI se pueden escindir usando proteasas o por medios químicos. En otras modalidades, la BBPI se puede escindir de la proteína de fusión de BBPI por tratamiento ácido/térmico, que escinde los enlaces A-P presentes en el ligador de CBD que une el BCE a la BBPI. En aún otras modalidades, las proteínas de fusión de BBPI se pueden escindir usando glutamil-endopeptidasa I de B. licheniformis. En algunas modalidades, la mejora en el rendimiento de producción de una BBPI variante, modificada se mide como el incremento en el nivel de la BBPI variante, modificada, libre después de la activación de la BBPI de fusión y después del tratamiento ácido/térmico de la proteína de fusión de BBPI, en comparación al nivel de BBPI precursora, no modificada, libre que se sometió al mismo tratamiento. En otras modalidades, la mejora en el rendimiento de producción de una BBPI variante, modificada se mide como el incremento en el nivel de la BBPI variante, modificada, libre sin la activación de la BBPI de fusión y después del tratamiento ácido/térmico de la proteína de fusión de BBPI, en comparación al nivel de la BBPI precursora, no modificada, libre que se sometió al mismo tratamiento. En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada, libre, tiene un mayor rendimiento de producción y una mayor TIA que la BBPI precursora, correspondiente.

En algunas modalidades, el rendimiento de producción de la BBPI variante, modificada es mayor que aquella de la BBPI precursora, no modificada, correspondiente por al menos aproximadamente 0.5 %, aproximadamente 1.0 %, aproximadamente 1.5 %, aproximadamente 2.0 %, aproximadamente 2.5 %, aproximadamente 3.0 %, aproximadamente 4.0 %, aproximadamente 5.0 %, aproximadamente 8.0 %, aproximadamente 0 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 100 %, o más. En otras modalidades, el rendimiento de producción de la BBPI variante, modificada es mayor que aquel de la correspondiente BBPI precursora no modificada por al menos 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % y hasta al menos aproximadamente 200 %. 6. Composiciones de Cuidado Personal 6.0.1 Composiciones de Cuidado Personal que Comprenden BBPI Variantes, Modificadas La presente invención proporciona composiciones de cuidado personal que comprenden al menos una BBPI variante, modificada para condiciones médicas y no médicas. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de cuidado personal y los métodos de uso. En algunas modalidades, la invención proporciona composiciones de cuidado personal para el uso en el cuidado de la piel. En otras modalidades, las composiciones de cuidado personal son para el uso en el cuidado del pelo. En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal para el uso en el cuidado de la piel incluyen composiciones cosméticas. En otras modalidades, las composiciones de cuidado personal de la invención son para el uso en el tratamiento de varios trastornos .

Como se describe en mayor detalle en la presente, la presente invención proporciona composiciones para el uso en numerosos aspectos del cuidado personal, que incluyen pero no se limitan al cuidado de la piel y del pelo, así como cosméticos (por ejemplo, maquillaje) . Por ejemplo, la presente invención proporciona composiciones que encuentran uso en el cuidado personal diario, cuidado de la piel, cuidado contra el sol (por ejemplo, bloqueadores de sol, así como bronceadores) , cuidado del pelo (por e emplo, champú, acondicionadores de dejar puesto y/o de enjuague, tónicos para el pelo, aspersiones para el pelo, geles, espumas, mouses, productos de fijación, colorantes de pelo, formulaciones permanentes, otros productos de limpieza y estilizado, etc.), cuidado para después de exposición al sol de la piel, pelo y labios, cuidado oral (por ejemplo, pastas de dientes y geles, lavados bucales, enjuagues, etc.), baño (por ejemplo, lavados, jabones de regadera, jabones de baño, sales, perlas, etc.), aclaradores de la piel, tratamientos de limpieza para condiciones de la piel (por ejemplo, granos, acné, tonificadores de la piel, etc.), depilantes, toallitas húmedas, desodorantes, antitranspirantes, máscaras faciales, afeitado (por ejemplo, cremas de afeitar, geles, etc.), para después de afeitar, desfoliación de piel, por ejemplo, exfoliantes) , productos de cuidado íntimo (por ejemplo, productos de higiene femenina) , refrescantes personales y cuidado de los pies. La presente invención también proporciona composiciones que encuentran uso en cosméticos (por ejemplo, bases, máscaras, sombras para ojos, delineadores de ojos, lápices labiales, brillo para labios, coloretes, etc.). Además, la presente invención proporciona composiciones de cuidado personal para el uso en la mejora de una condición del pelo, asociada con un trastorno. En otras modalidades, las composiciones de cuidado personal son para el uso en la mejora de una condición de la piel asociada con un trastorno. Se contempla que las composiciones de la presente invención encontrarán uso en varias formas, que incluyen, pero no se limitan a sólidos, líquidos, suspensiones coloidales, emulsiones, aceites, geles, aerosoles, espumas, polvos, aspersiones de bombeo, etc., así como que se usen en unión con artículos tal como toallitas húmedas, etc. En realidad, se contempla que la presente invención encontrará uso en cualquier forma adecuada para los usos propuestos .

En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI variante, modificada que comprende un péptido variante y al menos una sustitución de aminoácido, como se describe en la sección 5.4.1 anterior. En otras modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI variante, modificada que comprende un péptido variante y una combinación de sustituciones de aminoácido, como se describe en la sección 5.4.2 anterior. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI variante, modificada en la cual la asa de quimiotripsina equivalente es un péptido de unión a VEGF. En otras modalidades, las composiciones de cuidado personal comprenden una BBPI variante, modificada en la cual la asa de quimiotripsina equivalente es un péptido de unión a FGF5. En otras modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI variante, modificada en la cual la asa de quimiotripsina equivalente es un péptido de unión a TGF . En aún otras modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI variante, modificada en la cual la asa de quimiotripsina equivalente es un péptido de unión a TNFOÍ. En algunas modalidades, la BBPI variante, modificada comprende de aproximadamente 0.0001 por ciento en peso a aproximadamente 5 por ciento en peso de la composición de cuidado personal, en tanto que en modalidades alternativas, la BBPI variante, modificada comprende de aproximadamente 0.001 por ciento en peso a aproximadamente 0.5 por ciento en peso de la composición de cuidado personal, y en aún modalidades adicionales, la BBPI variante, modificada comprende desde aproximadamente 0.01 por ciento en peso a aproximadamente 1 por ciento en peso de la composición de cuidado personal. 6.0.2 Composiciones de Cuidado Personal Que Comprenden VEGF-BBPI Variante, Modificadas El VEGF juega un papel central en la promoción de la angiogénesis así como en la influencia de diversas funciones celulares que incluyen supervivencia celular, proliferación y la generación de óxido nítrico y prostaciclina (Zachary et al., Cardiovasc Res, 49: 568-81

[2001] ) . El reconocimiento de VEGF como un estímulo primario de la angiogénesis en condiciones patológicas ha conducido a varios intentos para bloquear la actividad de VEGF. Los anticuerpos inhibitorios anti-receptor de VEGF, las construcciones de receptor soluble, las estrategias antisentido, los aptámeros de ARN contra VEGF y los inhibidores de tirosina-cinasa de receptor de VEGF (RTK) de bajo peso molecular se han propuesto todos para el uso en la interferencia de la señalización de VEGF (Ver, Siemeister et al.,

[1998]). En realidad, se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales contra VEGF inhiben el crecimiento de xenoinjertos tumorales humanos y formación de ascitis en ratones (Ver, Kim et al.,

[1993]; Asano et al.,

[1998]; Mesiano et al.,

[1998]; Luo et al., [1998a] y [1998b] ; y Borgstrom et al.,

[1996] y

[1998]).

La angiogénesis, que comprende VEGF y RTK no solo está comprendida en el desarrollo de cáncer, sino también en otras enfermedades o condiciones que afectan diferentes sistemas fisiológicos que son dependientes de la angiogénesis, tal como artritis y placas ateroscleróticas (hueso y ligamento) , retinopatía diabética, glaucoma neovascular, degeneración macular, herpes ocular, tracoma y neovascularización de injerto corneal (ojo) y angiofibroma .

La expresión de VEGF se favorece en la epidermis hiperplástica de pacientes con psoriasis (Detmar y Yeo et al.

[1995] ) , y en otras enfermedades de la piel caracterizadas por angiogénesis mejorada que incluye, escleroderma, rosácea, hemangioma, dermatitis de contacto, y cicatrización hipertrófica de la piel. La sobre-expresión buscada de VEGF en la epidermis de ratones transgénicos se reportó que da por resultado vascularización mejorada de la piel con iguales números de vasos sanguíneos tortuosos y con fuga (Ver, por ejemplo, Brown et al.,

[1998]). También, la síntesis crónica de VEGF en la piel de ratones conduce al primer modelo murino histológicamente equivalente de psoriasis humana (Xia et al.,

[2003] ) que es reversible por agentes de unión específicos para VEGF. Además la radiación ultravioleta induce producción de VEGF en queratinocitos y mejora la angiogénesis cutánea (Kim et al., Soc . Investigative Dermatol . 126:2697

[2006]; Blaudshun et al., FEBS Let . 474:195-200

[2000]; Kosmadaki et al., FASEB J. 17:446-8

[2003]).

Además, la expresión de VEGF en la funda de raíz exterior de los folículos de pelo murino se encontró que está temporal y espacialmente asociada con proliferación de capilares durante la anagénesis . La sobreexpresión transgénica de VEGF en la funda de raíz exterior incrementó la vascularización perifolicular y condujo a crecimiento acelerado del pelo después de depilación y el crecimiento de pelo más grande (Yano et al. J" Clin Invest 107: 409-17

[2001] ) .

De esta manera, VEGF está comprendido en la vascularización asociada con condiciones no patológicas y patológicas.

La invención proporciona composiciones de cuidado del pelo y/o de cuidado de la piel, personales, que comprenden una VEGF-BBPI variante, modificada. Las VEGF-BBPI comprendidas en las composiciones de cuidado personal de la invención son BBPI variantes, modificadas en las cuales la asa equivalente de quimiotripsina del núcleo molecular precursor de la VEGF-BBPI se ha reemplazado por un péptido variante de VEGF, y que comprende además al menos una sustitución de aminoácido como se describe en las secciones 5.4.1 y 5.4.2. En algunas modalidades de la presente invención, la unión de la VEGF-BBPI variante, modificada a VEGF impide que VEGF incremente la vascularización perifolicular e inhibe que el VEGF promueva el crecimiento de pelo. En otras modalidades, la unión de la VEGF-BBPI variante, modificada a VEGF impide que VEGF incremente la vascularización de la piel en un sujeto que padece de un trastorno angiogénico de la piel, por ejemplo, hemangioma y lichen planus . En aún otras modalidades, la unión de la VEGF-BBPI variante modificada a VEGF impide que VEGF promueva la angiogénesis desregulada asociada con trastornos inflamatorios de la piel que incluyen psoriasis, escleroderma, úlceras venosas, acné, rosácea, verrugas, eccema y linfangiogénesis . Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ningún mecanismo particular.

En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una VEGF-BBPI en la cual la asa de quimiotripsina es un péptido de unión a VEGF elegido de las Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Números de Serie 09/832,723 y 10/984,270, incluyendo los péptidos ACYNLYGWTC (SEQ ID NO : ) , KYYLYWW (SEQ ID NO:458) , TLWKSYW (SEQ ID NO: 459) , DLYWW (SEQ ID NO: 460) , SKHSQIT (SEQ ID NO: 468 ) KTNPSGS (SEQ ID NO:469) RPTGHSL (SEQ ID NO:470), KHSAAE (SEQ ID NO: 471) KPSSASS (SEQ ID NO: 472) , PVTKRVH (SEQ ID NO:473) , TLH WVT (SEQ ID NO: 492) , PYKASFY (SEQ ID NO: 493) , PLRTSHT (SEQ ID NO: 494) , EATPROT (SEQ ID NO: 495) , NPLHTLS (SEQ ID NO: 496) , KHERIWS (SEQ ID NO: 497) , ATNPPPM (SEQ ID NO: 498) , STTSPNM (SEQ ID NO: 499) , ADRSFRY (SEQ ID NO:500) , PKADS Q (SEQ ID NO: 501) , PNQSHLH (SEQ ID NO:502) , SGSETWM (SEQ ID NO:503) , ALSAPYS (SEQ ID NO: 504) , KMPTSKV (SEQ ID NO: 505) , ITPKRPY (SEQ ID NO:506) , KWIVSET (SEQ ID NO: 507) , PNANAPS (SEQ ID NO: 508) , NVQSLPL (SEQ ID NO: 509) , TLWPTFW (SEQ ID NO:510) , NLWPHFW (SEQ ID NO: 511) , SLWPAFW (SEQ ID NO: 512) , SLWPHF (SEQ ID NO:513) , APWNSHI (SEQ ID NO: 514) , APWNLHI (SEQ ID NO:515), LPSWHLR (SEQ ID NO:516), PTILEWY (SEQ IDNO:517), TLYPQFW (SEQ ID NO:518), y HLAPSAV (SEQ ID NO:519). En algunas otras modalidades, las secuencias variantes de VEGF incluyen, pero no se limitan a, péptidos de unión a VEGF descritos en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Número de Serie 11/919,717, que incluyen los péptidos KYYLSWW (SEQ ID NO: 520), WYTLYKW (SEQ ID NO: 521), TYRLYW (SEQ ID NO: 522), RYSLYY (SEQ ID NO: 523), YYLYY K (SEQ ID NO:524), NYQLYGW (SEQ ID NO:525), TKWPSYW (SEQ ID NO:226), TLWKSY (SEQ ID NO:527), PLWPSY (SEQ ID NO:528), RLWPSYW (SEQ ID NO:529), TL PKYW (SEQ ID NO:530), KYDLYWW (SEQ ID NO;531), RYDLYWW (SEQ ID NO:532), DYRLYWW (SEQ ID NO:533), DYKLY W (SEQ ID NO:534), EYKLYW (SEQ ID NO:535), y RYPLYWW (SEQ ID NO:536). En otras modalidades, el péptido de unión a VEGF se elige SEQ ID N0S-.9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 y 473.

El núcleo molecular en el cual se introduce el péptido variante de VEGF para reemplazar la asa de quimiotripsina se elige de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI SEQ ID NO: 13) o la forma madura y truncada del mismo (SEQ ID NO:185), el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO:449); el inhibidor D-II de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO:450), el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc ; SEQ ID NO:451) , el núcleo molecular de BBI-AV de (SEQ ID NO:186), el núcleo molecular de BBIt-AV de (SEQ ID NO: 187), el núcleo molecular de BBd -AV de (SEQ ID NO:452), el núcleo molecular de BBsb3-AV de (SEQ ID NO:453), el núcleo molecular de BBtc-AV de (SEQ ID NO:454), el núcleo molecular de BBIt-VEGK de (SEQ ID NO:640), el núcleo molecular de BBIt-VEGT de (SEQ ID NO: 641) y el núcleo molecular de BBIt-VEGKD de (SEQ ID NO: 642) . Además, cualquier núcleo molecular precursor de BBPI tipo silvestre, tal los descritos por Prakash et al., {supra) , se puede usar para generar núcleos moleculares de BBPI variantes. En algunas modalidades, el núcleo molecular de la VEGF-BBPI es aquel de SEQ ID NO: 187.

En algunas modalidades, la estructura fundamental de la VEGF-BBPI variante, modificada comprende al menos una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 del BBPI variante de SEQ ID NO: 187, como se describe en la sección 5.4.1. En otras modalidades, la estructura fundamental de la VEGF-BBPI variante, modificada comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de una combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones de aminoácido como se cita anteriormente en la sección 5.4.2. En otras modalidades, la estructura fundamental de la VEGF-BBPI variante, modificada comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-29P-50T-52A, 131-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R- 27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 131-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 131-25K- 27A-29R-31A-4OH- 50R-52L .

En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal de la invención comprenden una BBPI variante, modificada en la cual la asa de quimiotripsina equivalente del núcleo molecular precursor se reemplaza con un péptido variante de VEGF elegido de SEQ ID NOS : , 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 yd 473, en donde el núcleo molecular es aquel de SEQ ID NO: 187, y que comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 131- 40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 131- 29P-40K-50T-52A, 13I-25R- 27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 131- 25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 131- 25K-27A-29R-31A-4OH- 50R-52L .

En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal comprenden una VEGF-BBPI elegida de las VEGF-BBPI de SEQ ID NOS:601, 602, 627, 628, 629, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 y 636.

En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende una VEGF-BBPI que se une a VEGF. En algunas modalidades, la unión de VEGF-BBPI a VEGF bloquea la actividad de etapa posterior de VEGF. En algunas modalidades, la composición es capaz de modular la angiogénesis .

En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende una BBPI-VEGF variante, modificada para el uso en el cuidado de la piel. En algunas modalidades, las composiciones de cuidado de la piel son para uso cosmético al mejorar la apariencia de la piel. En otras modalidades, las composiciones de cuidado de la piel son para uso terapéutico en la mejora de la apariencia de la piel en un sujeto que padece de un trastorno de la piel. En algunas modalidades, el trastorno de la piel es un trastorno angiogénico de la piel. En modalidades adicionales, el trastorno de la piel se elige al menos de psoriasis, escleroderma, úlceras venosas, acné, rosácea, verrugas, eccema, hemangiomas y linfangiogénesis . En algunas modalidades, el trastorno de la piel es rosáceo. En otras modalidades, el trastorno de la piel es psoriasis.

En una modalidad, la composición personal de cuidado de la piel que comprende una VEGF-BBPI se elige de cremas para la piel, lociones, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, espumas, aerosoles, líquidos, geles, sueros y sólidos. En otra modalidad, la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel seleccionada de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores antimicrobianos, cremas protectoras de la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos, geles exfoliantes faciales, tratamientos antiacné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, composiciones de aclaramiento de la piel, composiciones de reducción de rojez de la piel, bloqueadores de sol, depiladores, inhibidores de crecimiento de pelo, y radioprotectores . Los radioprotectores se eligen de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua y bloqueadores de sol de agua en silicón .

En una modalidad, la composición personal de cuidado de la piel que comprende una VEGF-BBPI comprende composiciones tópicamente aplicadas disponibles sin receta, tratamientos anti-fungoideos , tratamientos anti-acné, protectores de la piel, bloqueadores de sol, desodorantes, y antitranspirantes . En otras modalidades, la composición de cuidado de la piel es capaz de aclarar el tomo de la piel, de reducir la rojez, de impedir el oscurecimiento del tono de la piel o de impedir el desarrollo de color.

La presente invención también proporciona composiciones de cuidado personal que son composiciones cosméticas. En algunas modalidades preferidas, las composiciones cosméticas que comprenden una VEGF-BBPI se eligen de formulaciones de polvo prensado y bases. En algunas modalidades preferidas, las composiciones cosméticas comprenden al menos un pigmento.

En aún modalidades adicionales, la composiciones de maquillaje son formulaciones de polvo prensado seleccionadas de polvo suelto, coloretes, y polvos bronceadores . En aún modalidades adicionales, las composiciones de maquillaje son bases seleccionadas de bases de agua en aceite, bases de agua en silicón, bases de aceite en agua, barras cosméticas anhidras, y bases de crema a polvo.

En algunas modalidades, las composiciones personales de cuidado de la piel comprenden una VEGF-BBPI variante, modificada, como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, la VEGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. También de manera preferente, la VEGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un gel estabilizado o sistema de dispersión, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema de limpieza basado en agente tensioactivo tal como un champú o lavado corporal, una dispersión o emulsión rociada o en aerosol, un acondicionador del pelo o piel, ayuda de estilizado, o producto pigmentado tal como maquillaje, así como otras preparaciones cosméticas y de maquillaje, adecuadas. En algunas modalidades, el portador se selecciona al menos de manera preferente del grupo que consiste de agua, propilenglicol , etanol, propanol, glicerol, butilenglicol y polietilenglicol .

En algunas otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende una VEGF-BBPI variante, modificada para el uso en el cuidado del pelo.

En algunas modalidades, las composiciones de cuidado del pelo encuentran uso al inhibir el crecimiento de pelo. En otras modalidades, la inhibición de crecimiento de pelo comprende remoción de pelo para el tratamiento de al menos una enfermedad o condición para la cual es deseable el crecimiento disminuido de pelo. En algunas modalidades, la inhibición y/o remoción comprende depilación. En algunas modalidades, el pelo se selecciona del grupo que consiste de vello facial, vello de las piernas, vello del brazo, y vello del torso.

En una modalidad, la composición de cuidado de pelo se selecciona del grupo que consiste de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado de pelo, colorantes de pelo, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mouses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. En algunas modalidades, la composición de cuidado de pelo comprende además un radioprotecto . Como se describe para las composiciones personales de cuidado de la piel, el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua y bloqueadores de sol de agua en silicón. En otras modalidades, el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua y bloqueadores de sol de agua en silicón.

En algunas modalidades, las composiciones personales de cuidado de pelo comprenden una VEGF-BBPI variante, modificada, como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, la VEGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. También de manera preferente, la VEGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 1 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un gel estabilizado o sistema de dispersión, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema limpiador basado en agente tensioactivo tal como un champú o lavado corporal, una dispersión o emulsión rociada o en aerosol, un acondicionador del pelo o piel, ayuda de estilizado, o producto pigmentado tal como maquillaje, asi como otras preparaciones cosméticas y de maquillaje adecuadas. En algunas modalidades, el portador se selecciona al menos de manera preferente del grupo que consiste de agua, propilenglicol, etanol, propanol, glicerol, butilenglicol y polietilenglicol .

En otras modalidades, las composiciones de cuidado personal de la invención son para el uso en el tratamiento de varias enfermedades asociadas con niveles elevados de VEGF .

La presente invención también proporciona métodos para inhibir el crecimiento de pelo de un sujeto, que comprende los pasos de proporcionar la composición de cuidado de pelo de VEGF de cuidado personal de la presente invención; proporcionar un sujeto que se va a tratar; y aplicar la composición al sujeto en el área en la cual se desea la inhibición del crecimiento de pelo. En algunas modalidades, la inhibición de crecimiento de pelo comprende inhibir el crecimiento del pelo del sujeto, en donde el pelo que se va a inhibir se selecciona del grupo que consiste de vello facial, pelo de la axila, pelo de la pierna, vello del torso, y vello del brazo, y pelo de la cabeza. En modalidades adicionales, el método para inhibir el crecimiento de pelo que usa una composición de cuidado de pelo de VEGF de la invención comprende una composición de cuidado personal que comprende una VEGF-BBPI que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 629, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 y 636.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel en un sujeto que padece de un trastorno de piel, que comprende proporcionar la composición de cuidado personal de la presente invención; proporcionar un sujeto que se va a tratar; y aplicar la composición a la piel afectada del sujeto. En algunas modalidades, el trastorno de piel se elige de psoriasis, úlceras venosas, acné, rosácea, verrugas, eccema, hemangiomas, linchen planus cutáneo, y linfangiogénesis , etc. En algunas modalidades particularmente preferidas, el trastorno cutáneo es rosáceo. En otras modalidades, el trastorno cutáneo es psoriasis. En modalidades adicionales, el método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel en un sujeto que padece de un trastorno de piel que usa una composición de cuidado de la piel de VEGF de la invención comprende una composición de cuidado personal que comprende una VEGF-BBPI que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 629, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 y 636. 6.0.3 Composiciones de Cuidado Personal que Comprenden FGF-5 -BBPI Variantes, Modificadas La familia de Factores de Crecimiento de Fibroblastos (FGF) es una superfamilia de factores de crecimiento que contiene al menos 23 miembros, muchos de los cuales son potentes reguladores de la proliferación, diferenciación y función celular. Todos los FGF tienen un núcleo conservado de 120 aminoácidos. Los miembros de la familia comparten residuos conservados de cisteína y 30-50 % de homología de secuencia al nivel de aminoácido. El peso molecular de los FGF varía desde 7 kDa para FGF- 1 a 38 kDa para FGF-5. La longitud de las proteínas es de 60 aminoácidos en el caso de una variante de empalme de FGF- 1 a 288 aminoácidos para FGF-2. La unión a heparina es un paso esencial requerido para un factor de FGF para interactuar con los receptores de superficie celular. El FGF5 es una proteína segregada de señalización que consiste de 268 aminoácidos con una secuencia de señal de 17 aminoácidos y un péptido maduro de 251 aminoácidos. El gen humano también da lugar a una forma de empalme alterna glicosilada que es de 18 kDa de tamaño y 123 aminoácidos de longitud. El homólogo murino del FGF-5 se clonó y se encontró que es 84 % homólogo a la proteína humana al nivel de la secuencia de aminoácidos. El FGF-5 humano consiste de tres exones y mapas al cromosoma 4q21 y reaccionan de forma cruzada con FGF-5 murino.

La formación de folículos de pelo comprende una serie compleja de pasos: crecimiento (anágena) , regresión (catágena) , reposo (telógena) y derrame (exógena) . El FGF-5 se ha implicado como uno de los principales impulsores de la transición de anágena a catágena en el ciclo del pelo. La expresión de FGF-5 se detecta en folículos de pelo de ratones tipo silvestre y se localiza en la funda de raíz exterior durante la fase de anágena. Los ratones homocigotos para un alelo nulo previsto de FGF-5, fgfSneo, tienen pelo anormalmente largo (ver, Hebert et al., Cell 78: 1017-25

[1994] ) . El fenotipo parece ser idéntico a aquel de ratones homocigotos para angora de mutación espontánea (go) . Recientemente, se han identificado secuencias parciales de FGF-5, FGF5S, que se piensa que compiten con FGF-5 en la unión al receptor (Ver, lto et al., J. Cell Physiol . , 197 : 272-83

[2003] ) .

La invención proporciona composiciones personales de cuidado de pelo que comprenden al menos una FGF-BBPI variante, modificada para el uso en la promoción de crecimiento de pelo y/o prevención de pérdida de pelo. En una modalidad, la invención proporciona composiciones de FGF-BBPI para cuidado personal de la piel. En otras modalidades, la invención proporciona composiciones de FGF-BBPI para cuidado de pelo. Las FGF-BBPI comprendidas en las composiciones de cuidado personal de la invención son BBPI variantes, modificadas en las cuales la asa equivalente de quimiotripsina del núcleo molecular precursor de la FGF-5 -BBPI se ha reemplazado por un péptido variante de FGF-5, y que comprende además al menos una sustitución de aminoácido como se describe en las secciones 5.4.1 y 5.4.2. En la presente invención, la unión de la FGF-BBPI variante, modificada a FGF-5 impide que FGF-5 interactúe con su receptor cognado e inhibe la transición de la anagéna a la catágena que promueve el crecimiento de pelo y previene la pérdida de pelo. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ningún mecanismo particular.

En algunas modalidades, la composición de cuidado personal comprende al menos una FGF-BBPI en la cual la asa de quimiotripsina es un péptido variante de FGF-5 elegido de CACRTQPYPLCF (MM007; SEQ ID NO:430), CICTWIDSTPC (PS2; SEQ ID NO:431), CYGLPFTRC (SEQ ID NO:537), CEEIWTMLC (SEQ ID NO: 538), CWALTVKTC (SEQ ID NO: 539), CLTVLWTTC (SEQ ID NO: 540), CTLWNRSPC (SEQ ID NO: 541), CHYLLTNYC (SEQ ID NO:542), CRIHLAHKC (SEQ ID NO:543), TNIDSTP (SEQ ID NO:544), HLQTTET (SEQ ID NO:545), SLNNLTV (SEQ ID N0:546), TNIDSTP (SEQ ID NO:547), TNIDSTP (SEQ ID NO:548), LRILANK (SEQ ID NO:549), LLTPTLN (SEQ ID NO:550), ALPTHSN (SEQ ID NO:551), TNIDSTP (SEQ ID NO: 552), LCRRFEN (SEQ ID NO: 553), TNIDSTP (SEQ ID NO:554), TNIDSTP (SEQ ID NO:555), HLQTTET (SEQ ID NO:556), PLGLCPP (SEQ ID NO:557), GYFIPSI (SEQ ID NO:558), TKIDSTP (SEQ ID NO: 559), HLQTTET (SEQ ID NO: 560), WNIDSTP (SEQ ID NO:561), TWIDWTP (SEQ ID NO:562), RTQPYPL (SEQ ID NO:670) y TWIDSTP (SEQ ID NO:671). En otras modalidades, el péptido variante de FGF se elige de SEQ ID NOS: 430, 431, 670 y 671.

El núcleo molecular en el cual se introduce el péptido variante de FGF para reemplazar la asa de quimiotripsina se elige de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID NO: 13) o la forma madura y truncada del mismo (SEQ ID NO: 185) , el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO: 449), el inhibidor de DII de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO: 450) , el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc; SEQ ID NO: 451 ) , el núcleo molecular de BBI-AV de (SEQ ID NO: 186), el núcleo molecular de BBIt-AV de (SEQ ID NO: 187), el núcleo molecular de BBdb-AV de (SEQ ID NO: 452) , el núcleo molecular de . BBsb3-AV de (SEQ ID NO: 453) , el núcleo molecular de BBtc-AV de (SEQ ID NO: 454) , núcleo molecular de BBIt-VEGK de (SEQ ID NO: 640), núcleo molecular de BBIt-VEGT de (SEQ ID NO: 641) y núcleo molecular de BBIt-VEGKD de (SE ID NO: 642) . Además, se pueden usar cualquiera de los núcleos moleculares precursores de BBPI tipo silvestre, tal como aquellos descritos por Prakash et al., {supra) , para generar núcleos moleculares variantes de BBPI . En algunas modalidades, el núcleo molecular de la VEGF-BBPI es aquel de SEQ ID NO: 187.

En algunas modalidades, la estructura fundamental de la FGF-BBPI variante, modificada comprende al menos una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 del BBI variante de SEQ ID NO: 187, como se cita en la sección 5.4.1. En otras modalidades, la estructura fundamental de la VEGF-BBPI variante modificada comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de una combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones de aminoácido como se cita anteriormente en la sección 5.4.2. En otras modalidades, la estructura fundamental de la FGF-BBPI variante, modificada comprende una modificación de sustituciones de aminoácido elegidas de una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-29P-50T-52A, 131-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 131-25K-27A-29R-31E-40 -50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A- OH- 50R-52L . En algunas modalidades, la combinación de sustituciones es 13I-29P-50T-52A.

En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal de la invención comprenden una FGF-BBPI en la cual la asa equivalente de quimiotripsina del núcleo molecular precursor se reemplaza con un péptido variante FGF elegido de SEQ ID NOS: 433 y 434, en donde el núcleo molecular es aquel de SEQ ID NO: 187, y que comprende la combinación de sustituciones de aminoácido 13I-40K-50T-52A. De esta manera, en algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal comprenden una FGF-BBPI elegida de las FGF-BBPI de SEQ ID NOS: 439 y 441.

En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende una FGF-BBPI que se une a FGF. En modalidades alternativas, la unión de FGF-BBPI a FGF bloquea la actividad de etapa posterior de FGF. En algunas modalidades, la composición es capaz de promover el crecimiento de pelo.

En algunas modalidades, la composición de cuidado personal que comprende una BBPI-FGF variante, modificada es para el uso en cuidado de la piel. En algunas modalidades, las composiciones de cuidado de la piel son composiciones cosméticas para el uso en la promoción de crecimiento de pelo. En algunas modalidades, las composiciones de cuidado de la piel son para el uso en la promoción de crecimiento de pelo o cabello en un sujeto que padece de una enfermedad o condición que comprende pérdida de pelo. En alguna de estas modalidades, la enfermedad o condición es al menos una seleccionada del grupo que consiste de alopecias inflamatorias, pseudopelada, escleroderma, picaduras de garrapata, lichen planus, psoriasis, lupus, dermatitis seborreica, síndrome de pelo suelto, hemocromatosis , alopecia androgénica, alopecia areata, cáncer, condiciones que afectan la producción defectuosa de fibra de pelo, y factores ambientales que afectan la producción de pelo. En una modalidad preferida, la enfermedad es alopecia androgénica o alopecia areata.

En una modalidad, la composición de cuidado personal que comprende una FGF-BBPI es una composición de cuidado de la piel que se elige de cremas para la piel, lociones, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, espumas, aerosoles, líquidos, geles, suero y sólidos. En otra modalidad, la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel seleccionada de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores antimicrobianos, cremas protectoras para la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos anti-acné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, composiciones de aclaramiento de piel, composiciones de reducción de rojez de piel, bloqueadores solares, depiladores, inhibidores de crecimiento de pelo o cabello y radioprotectores . Los radioprotectores se eligen de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agµa en silicón.

En una modalidad, la composición personal del cuidado de la piel que comprende una FGF-BBPI es una composición del cuidado de la piel que comprende composiciones de venta libre, aplicadas tópicamente, tratamientos anti-funguideos, tratamientos anti-acné, protectores de piel, bloqueadores de sol, desodorantes y anti-transpirantes .

En algunas modalidades, las composiciones personales de cuidado de la piel comprenden una VEGF-BBPI variante, modificada, como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, la VEGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. También de manera preferente, la VEGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un gel estabilizado o sistema de dispersión, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema limpiador basado en agentes tensioactivos tal como un champú o lavado corporal, una emulsión o dispersión en aerosol o en aspersión, un acondicionador de la piel o pelo, ayuda de estilizado, o un producto pigmentado tal como maquillaje, así como otras preparaciones cosméticas y de maquillaje. En algunas modalidades, el portador es de manera preferente al menos uno seleccionado del grupo que consiste de agua, propilenglicol, etanol, propanol, glicerol, butilenglicol y polietilenglicol .

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende una FGF-BBPI variante, modificada para el uso en el cuidado de pelo.

En algunas modalidades, las composiciones de cuidado de pelo o cabello encuentran uso en la promoción del crecimiento de pelo o cabello. En otras modalidades, la modulación comprende promover el crecimiento de pelo en un sujeto que padece de una enfermedad o condición que comprende pérdida de pelo. En algunas de estas modalidades, es al menos una seleccionada del grupo que consiste de alopecias inflamatorias, pseudopelada, escleroderma, picaduras de garrapata, lichen planus, psoriasis, lupus, dermatitis seborreica, síndrome de pelo suelto, hemocromatosis , alopecia androgénica, alopecia areata, cáncer, condiciones que afectan la producción defectuosa de fibra de pelo, y factores ambientales que afectan la producción de pelo. En una modalidad preferida, la enfermedad es alopecia androgénica o alopecia areata.

En una modalidad, la composición de cuidado de pelo se selecciona del grupo que consiste de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado de pelo, colorantes de pelo, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. En algunas modalidades, la composición de cuidado de pelo comprende además un radioprotector . Como se describe para las composiciones personales de cuidado de la piel, el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón. En otras modalidades, el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón.

En algunas modalidades, las composiciones personales de cuidado de pelo o cabello comprenden una FGF-BBPI variante, modificada como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, la FGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. También, de manera preferente la FGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un gel estabilizado o sistema de dispersión, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema limpiador basado en agentes tensioactivos tal como un champú o lavado corporal, una dispersión o emulsión en aerosol o en aspersión, un acondicionador del pelo o la piel, u a ayuda de estilizado, o un producto pigmentado tal como maquillaje, así como otras preparaciones cosméticas y de maquillaje, adecuadas. En algunas modalidades, el portador es al menos uno preferentemente seleccionado del grupo que consiste de agua, propilenglicol , etanol, propanol, glicerol, butilenglicol y polietilenglicol .

En otras modalidades, las composiciones de FGF-BBPI de cuidado personal de la invención son para el uso del tratamiento de varias enfermedades asociadas con niveles elevados de FGF.

La presente invención también proporciona métodos para promover el crecimiento de pelo de un sujeto, que comprende los pasos de proporcionar la composición de FGF de cuidado personal de la presente invención proporcionar un sujeto que se va a tratar; y aplicar la composición al sujeto en un área en la cual se desea la promoción de crecimiento de pelo o cabello. En algunas modalidades, la composición de FGF es una composición de cuidado de la piel. En otras modalidades, la composición de FGF es una composición para el pelo. En algunas modalidades, la promoción del crecimiento de pelo comprende promover el crecimiento del cabello de sujetos, en donde el crecimiento de pelo o cabello que se va a promover se elige de vello facial, pelo de axila, vello de pierna, vello de torso y vello de brazo, y cabello. En modalidades adicionales, el método para promover el crecimiento de pelo usando una composición de cuidado de pelo o de FGF de la invención comprende aplicar una composición de cuidado personal que comprende una FGF-BBPI que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS: 439 y 441. 6.0.4 Composiciones de Cuidado Personal que Comprenden TGFfi-BBPI Variantes, Modificadas Las Proteínas de la Familia del Factor-ß de Crecimiento Transformante (TGF ) se sintetizan por casi toda las células. Los TGF son un grupo de factores de crecimiento, polipeptídicos , multifuncionales , estables cuyas actividades incluyen, entre otras cosas, inhibición específica de contexto, y estimulación de la proliferación celular, el control de la matriz extracelular , la degradación y control de interacciones mesenquimales-epiteliales durante la embriogénesis , la mediación de las respuestas de células y de tejido a lesión, el control de la carcinogénesis y la modulación de respuestas inmunitarias . Se sintetiza ?TGß-? virtualmente por todas las células (con sólo unas poseas excepciones) . Se ha encontrado TGF[3-1 en la más alta concentración en plaquetas humanas y hueso de mamífero. TGFp -1 tiene muchas funciones que incluyen supresión de proliferación celular, mejora de depósito de matriz extracelular e inmunosupresión fisiológica. También se ha determinado que ?TGß-? es biológicamente activo en el desarrollo de folículo de pelo. ?T?ß-? humano es una proteína de 25.0 kDa con subunidades que contienen aproximadamente 112 aminoácidos por subunidad. Se proporcionan dos diferentes proteínas de receptor en la unión y señalización de TGFp-l, específicamente TGF-F^II y TGF-Rpi. Se expresa GF -2 en una variedad de células, que incluyen queratinocitos , fibroblastos, osteoclastos , epitelio tímico, células del músculo esquelético, epitelio prostático, epitelio bronquial, neuronas y astrocitos, músculo liso viceral, macrófagos y otras varias células. El ts?ß-2 tiene muchas actividades fundamentales, que incluyen la función como un inhibidor de crecimiento para la mayoría de las células, un mejorador del depósito de la matriz extracelular, e inmunosupresión. La región madura es 71 % idéntica a TGFp-l, 80 % idéntica a ??G -3, y 97 % idéntica al homólogo de ratón de la misma proteína al nivel de aminoácidos. ??? -2 se dimeriza con la formación de enlaces de disulfuro entre las proteínas "pro" y enlaces de disulfuro entre las regiones maduras. Se sintetiza TGF -2 como una pre-procitocina con una secuencia de señal de 19 aminoácidos, una pro-región de 283 y un segmento maduro de 112 aminoácidos. El receptor para TGFp-2 forma un complejo heterotetramérico de dos receptores de traducción de señal del tipo I y dos receptores de unión a ligando del tipo II.

La formación de folículos de pelo o cabello comprende una serie compleja de pasos: crecimiento (anagena) , regresión (catagena) , reposo (telogena) y desprendimiento (exógena) (ver, Stenn y Paus, Physiol. Rev, Exp. Dermatol . , 8:229-233

[1999]). Se han implicados a los ??G como uno de los principales activadores de la transición de anagena a catagena en el ciclo del pelo o cabello (ver, por ejemplo, Foitzik et al., FASEB J. , 5:752-760

[2000]; y Soma et al., J. Infect. Dis., J. Invest. Dermatol., 118:993-9997

[2002]), y TGF 2 es tanto un inductor requerido como suficiente de la morfogénesis de folículos de pelo murino (ver, Foitzik et al., Develop. Biol., 212:278-289

[1999]) . La expresión condicional de ?Gß-? en ratones transgénicos demuestra que se puede inducir de manera reversible alopecia (ver, Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 98:9139-9144

[2001]) . Además, se han asociado mutantes de, TGF -l con el retraso del comienzo de la catagena en ratones (ver, Foitzik et al.,

[2000] , supra) . Recientemente, se ha mostrado que se puede retrasar la catagena a través del uso de anticuerpos de TGF - 2 (ver, Soma et al.,

[2002], supra) . Finalmente, los andrógenos que inducen producción de TGFp-l en células de papila dérmica parcialmente calvas pueden inhibir el crecimiento de células epiteliales (Inui et al., FASEB J. , 14 : 1967-1969

[2002] ) .

También, TGF es un potente estímulo de la acumulación de tejido conectivo, y está implicado en la patogénesis de escleroderma y otros trastornos fibróticos (Blobe et al., N Engl J Med 342:1350-1358

[2000]). La escleroderma es una enfermedad autoinmunitaria crónica caracterizada por inflamación temprana y lesión vascular, seguido por fibrosis progresiva de la piel y otros órganos (Kissin y Korn, Rheum Dis Clin North Am 29:351-369

[2003]) . El síntoma más evidente usualmente es el endurecimiento de la piel y cicatrización asociada.

También se ha implicado TGFP en la formación de tumores de piel (Li et al., Molecular Carcinogenesis 45:389-396

[2006] ) . La ruta de señalización de TGFP es uno de los mecanismos más importante en el mantenimiento de homeostasis epitelial. Se ha mostrado que las alteraciones que conducen ya sea en la represión o mejora de esta ruta afectan el desarrollo del cáncer. Aunque TGF inhibe el crecimiento de células epiteliales normales, paradójicamente se sobreexpresa en muchos cánceres epiteliales. Se ha postulado que ??? actúa como un supresor tumoral en las etapas tempranas de la carcinogénesis , pero la sobreexpresión de TGF en etapas tardías de la carcinogénesis puede ser un factor crítico para invasión y metástasis tumoral .

La invención proporciona composiciones de cuidado personal que comprenden una TGF-BBPI variante, modificada. La TGF -BBPI comprendida en las composiciones de cuidado personal de la invención es una ts?ß-???? variante, modificada en la cual la asa de quimiotripsina del núcleo molecular precursor de la TGF-BBPI se ha reemplazado por un péptido variante de TGF y que además comprende al menos una sustitución de aminoácido como se describe en las secciones 5.4.1 y 5.4.2. En algunas modalidades, la unión de la TGF-BBPI variante, modificada a TG pi y/o GF 2 impide que TGF^l y/o TGF 2 interactúen con su receptor cognado e inhiban la transición de la anagena a la catagena para promover el crecimiento de pelo e impedir la pérdida de pelo. En otras modalidades, la unión de la TGF-BBPI variante, modificada a TGFpi y/o ? ? 2 impide que TGF 1 y/o TGF 2 interactúen con su receptor cognado para impedir la fibrosís de la piel que es característica de la escleroderma . En otras modalidades, la unión de la TGF-BBPI variante, modificada a TGF i y/o TGF32 impide que TGF 1 y/o TGF 2 interactúen con su receptor cognado para impedir el progreso de lesiones cutáneas benignas a malignas. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ningún mecanismo particular.

En algunas modalidades, el péptido variante de TGFp comprendido en la TGF -BBPI se elige de CLCPENINVLPCN (PEN3; SEQ ID NO: 436), CICKHNVDWLCF (MM021W; SEQ ID NO: 437), CICWTQHIHNCF (WTQ; SEQ ID NO: 438) , CVTTDWIEC (SEQ ID NO: 563), CYYSQFHQC (SEQ ID NO: 564), CPTLWTHMC (SEQ ID NO: 565), QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ ID NO : 566) , QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID NO: 567), QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID NO: 568), acetil-LCPENDNVSPCY-cohn2 (SEQ ID NO: 569), KHNVRLL (SEQ ID NO: 570), NDTPSYF (SEQ ID NO: 571), AKLYAGS (SEQ ID NO: 572), RGPAHSL (SEQ ID NO : 573), NSLAERR (SEQ ID NO: 574), HPLASPH (SEQ ID NO: 575), QPWNKLK (SEQ ID NO: 576), AWLr/Mipy (SEQ ID NO: 577), PTKPAQQ (SEQ ID NO: 578), PSLNRPQ (SEQ ID NO: 579), HHARQEW (SEQ ID NO: 580), RHHTPGP (SEQ ID NO: 581), ASAINPH (SEQ ID NO: 582) , CHGYDRAPC (SEQ ID NO : 644) , CFAPADQAC (SEQ ID NO: 645), CIPSRFITC (SEQ ID NO: 646), CHGHTKLAC (SEQ ID NO: 647), CNGKSKLAC (SEQ ID NO: 648), PENINVLP (SEQ ID NO; 672), KHNVDWL (SEQ ID NO: 673), y WTQHIHNC (SEQ ID NO: 674) . SEQ ID NOS: 644-648 son los péptidos de unión a TGFpi, en tanto que SEQ ID NOS : 463, 437, 438, 563-582 son los péptidos de unión a TGFp2.

En otras modalidades, el péptido variante de TGF se elige de SEQ ID NOS: 436, 437 y 438.

El núcleo molecular en el cual se introduce el péptido variante de TGFp para reemplazar la asa equivalente de quimiotripsina se elige de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID NO: 13) o la forma madura o truncada del mismo (SEQ ID NO: 185), el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO: 449), el inhibidor D-II de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO: 450) , el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc ; SEQ ID NO: 451), el núcleo molecular de BBI-AV (SEQ ID NO: 186), el núcleo molecular de BBIt-AV (SEQ ID NO: 187), el núcleo molecular de BBdb-AV de (SEQ ID NO: 452) , el núcleo molecular de BBsb3-AV de (SEQ ID NO: 453), el núcleo molecular de BBtc-AV de (SEQ ID NO: 454) , el núcleo molecular de BBIt-VEGK de (SEQ ID NO: 640) , el núcleo molecular de BBIt-VEGT de (SEQ ID NO: 641) el núcleo molecular de BBIt-VEGKD de (SE ID NO: 642) . Además, cualesquiera de los núcleos moleculares precursores de BBPI tipo silvestre, tal como aquellos descritos por Prakash et al., (supra) , se pueden usar para generar núcleos moleculares variantes de BBPI. En algunas modalidades, el núcleo molecular de la VEGF-BBPI es aquel de SEQ ID NO: 187.

En algunas modalidades, la estructura fundamental de la TGFp-BBPI variante, modificada comprende al menos una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 del BBI variante de SEQ ID NO: 187, como se cita en la sección 5.4.1. En otras modalidades, la estructura fundamental de la TGF - BBPI variante, modificada comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de una combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones de aminoácido como se cita anteriormente en la sección 5.4.2. En otras modalidades, la estructura fundamental de la ??? -???? variante, modificada comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-29P-50T-52A, 131-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 131-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-4OH- 50R- 52L . En algunas modalidades, la combinación de sustituciones es 13I-29P-50T-52A. En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal de la invención comprenden una BBPI en la cual se reemplaza la asa equivalente de quimiotripsina del núcleo molecular precursor con un péptido variante de TGF elegido de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673, y 674, en donde el núcleo moleculares es aquel de SEQ ID NO: 187, y que comprende la combinación de sustituciones de aminoácido 131-29P-50T-52A. En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal comprenden una FGF-BBPI elegida de las TGF -BBPI de SEQ ID NOS: 443, 445 y 447.

En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende una ??ß-BBPI que se une a TG i y/o TGF 2. En modalidades alternativas, la unión de TGF - BBPI a TGF bloquea la actividad de etapa posterior de ??Gß. En algunas modalidades, la composición es capaz de promover el crecimiento de pelo.

En algunas modalidades, la composición de cuidado personal que comprende una TGF-BBPI variante, modificada es para el uso en el cuidado de la piel. En algunas modalidades, las composiciones del cuidado de la piel son composiciones cosméticas para el uso en la promoción de crecimiento de pelo o cabello.

En algunas modalidades, las composiciones del cuidado de la piel son para el uso en la promoción de crecimiento de pelo en un sujeto que padece de una enfermedad o condición que comprende pérdida de pelo. En algunas de estas modalidades, la enfermedad o condición es al menos una seleccionada del grupo que consiste de alopecias inflamatorias, pseudopelada, escleroderma, picaduras de garrapata, lichen planus, psoriasis, lupus, dermatitis seborreica, síndrome de pelo suelto, hemocromatosis , alopecia androgénica, alopecia areata, cáncer, condiciones que afectan producción defectuosa de fibra de pelo, y factores ambientales que afectan producción de pelo. En una modalidad preferida, la enfermedad es alopecia androgénica o alopecia areata .

En otras modalidades, la composición de cuidado personal que comprende una TGF-BBPI variante, modificada es para el uso en la mejora de la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de escleroderma . En aún otras modalidades, la composición de cuidado personal que comprende una TGF-BBPI variante, modificada es para el uso de la mejora y la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de cáncer de piel.

En una modalidad, la composición de cuidado personal que comprende una TGFp-BBPI es una composición de cuidado de la piel que se elige de cremas para la pile, lociones, aspersiones, emulsiones,, suspensiones coloidales, espumas, aerosoles, líquidos, geles, suero y sólidos. En otra modalidad, la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel seleccionada de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores antimicrobianos, cremas protectoras para la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos anti-acné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, composiciones de aclaramiento de piel, composiciones de reducción de rojez de piel, bloqueadores solares, depiladores, inhibidores de crecimiento de pelo, y radioprotectores . Los radioprotectores se eligen de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón.

En una modalidad, la composición de cuidado personal que comprende una ??Gß-???? es una composición de cuidado de la piel que comprende composiciones disponibles en receta, aplicadas de forma tópica, tratamientos anti-funguideos, tratamientos anti-acné, protectores de piel, bloqueadores de sol, desodorantes y anti- transpirantes .

La presente invención también proporciona composiciones de cuidado personal que son composiciones cosméticas. En algunas modalidades preferidas, las composiciones cosméticas se seleccionan de máscaras, formulaciones de polvo prensado, y bases. En algunas modalidades preferidas, las composiciones de maquillaje comprenden al menos un pigmento.

En algunas modalidades preferidas, la composición de maquillaje comprende al menos un pigmento que es una máscara seleccionada de máscaras no a prueba de agua, máscaras a prueba de agua, máscaras de volumen, máscaras de estiramiento, mascaras de rizado, máscaras anhidras a prueba de agua, máscaras basadas en agua, y tratamientos para pestañas o cejas.

En aún en modalidades adicionales, las composiciones de maquillaje son formulaciones de polvo prensados seleccionadas de polvos sueltos, rubores, sombras para ojos, y polvos de bronceado. En aún en modalidades adicionales, las composiciones de maquillaje son base seleccionadas de bases de agua en aceite, bases de agua en silicón, bases de aceite en agua, barras de maquillaje anhidras y bases de crema a polvo.

En algunas modalidades, las composiciones personales del cuidado de la piel comprenden una TGF-BBPI variante, modificada, como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, la TGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. También de manera preferente, a TGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente( 0.001 % a aproximadamente 0.5 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un sistema de dispersión o gel estabilizado, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema limpiador basado en agente tensioactivo tal como un champú o lavado corporal, una emulsión o dispersión en aerosol o aspersión, un acondicionador del pelo o piel, ayuda de estilizado, o un producto pigmento tal como maquillaje, así como otras preparaciones cosméticas y de maquillaje, adecuadas. En algunas modalidades, el portador es de manera preferente al menos uno seleccionado del grupo que consiste de agua, propilenglicol, etanol, propanol, glicerol, butilenglicol y polietilenglicol .

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende una TGF-BBPI variante, modificada para el uso en el cuidado de pelo. En algunas modalidades, la composición de cuidado de pelo es para el uso en la promoción de crecimiento de pelo.

En algunas modalidades, las composiciones de cuidado de pelos encuentran uso en la promoción de crecimiento de pelo o cabello. En otras modalidades, la modulación comprende promover el crecimiento de pelo en un sujeto que padece de una enfermedad o condición que comprende pérdida de pelo o cabello. En alguna de estas modalidades, la enfermedad o condición es al menos una seleccionada del grupo que consiste de alopecias inflamatorias, pseudopelada, escleroderma, picaduras de garrapata, lichen planus, psoriasis, lupus, dermatitis seborreica, síndrome de pelo suelto, hemocromatosis , alopecia androgénica, alopecia areata, cáncer, condiciones que afectan la producción defectuosa de fibra de pelo, y factores ambientales que afectan la producción de pelo o cabello. En una modalidad preferida, la enfermedad es alopecia androgénica o alopecia areata.

En una modalidad, la composición de cuidado de pelo se selecciona del grupo que consiste de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado de pelo, colorantes de pelo, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. En algunas modalidades, la composición de cuidado de pelo o cabello comprende además un radioprotector . Como se describe para las composiciones personales de cuidado de la piel, el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón. En otras modalidades, el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón.

En algunas modalidades, las composiciones personales de cuidado de pelo comprenden una TGFp-BBPI variante, modificada, como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, la TGF -BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. También de manera preferente, la TGF -BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un sistema de dispersión o gel estabilizado, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema limpiador basado en agente tensioactivo tal como un champú o lavado corporal, una dispersión o emulsión en aerosol o aspersión, un acondicionador de pelo o la piel, ayuda de estilizado, un producto pigmentado tal como maquillaje, así como otras preparaciones cosméticas y de maquillaje, adecuadas. En algunas modalidades, el portador es de manera preferente al menos uno seleccionado del grupo que consiste de agua, propilenglicol , etanol, propanol, glicerol, butilenglicol y polietilenglicol .

En otras modalidades, las composiciones de TGF-BBPI de cuidado personal de la invención son para el uso en el tratamiento de varias enfermedades asociadas con niveles elevados de ?TGß? y/o TGF 2.

La presente invención también proporciona métodos para promover el crecimiento de pelo de un sujeto, que comprende los pasos de proporcionar la composición de TGF de cuidado personal de la presente invención; proporcionar un sujeto que se va a tratar; y aplicar la composición al sujeto en un área en la cual se desea la promoción del crecimiento de pelo o cabello. En algunas modalidades, la composición de TGF es una composición de cuidado de la piel. En otras modalidades, la composición de FGF es una composición para el pelo. En algunas modalidades, la promoción del crecimiento del pelo o cabello comprende promover el crecimiento del pelo del sujeto, en donde el crecimiento del pelo o cabello que se va a promover se elige de vello facial, pelo de axila, vello de pierna vello de torso, y vello de brazo y cabello. En modalidades adicionales, el método para promover el crecimiento de pelo usando una composición de cuidado de pelo de TGF de la invención comprende aplicar una composición de cuidado personal que comprende una TGF-BBPI que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS: 443, 445 y 447.

En otra modalidad, la invención proporciona un método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel en un sujeto que padece de un trastorno de piel, que comprende proporcionar la composición personal del cuidado de la piel de la presente invención; proporcionar un sujeto que se va a tratar; y aplicar la composición de la piel afectada del sujeto. En algunas modalidades, el trastorno de la piel se elige de psoriasis, escleroderma y cáncer de piel. En modalidades adicionales, el método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel en un sujeto que padece de un trastorno de piel usando una composición de cuidado de la piel de TGF de la invención comprende una composición de cuidado personal que comprende una TGF-BBPI que tiene una secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS: 443, 445 y 447. 6.0.5 Composiciones de Cuidado Personal que Comprenden TNFot-BBPI Variantes, Modificadas Las Proteínas de la Familia del Factor de Necrosis de Tejido (TNF) son miembros de una gran familia de citocinas . El Factor Alfa de Necrosis de Tejido (TNFa) es un miembro prototípico de la familia de TNF de ligandos. Se produce por varias células inmunitarias , y juega un papel clave en las enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas .

Se sintetiza TNFa por T- linfocitos , células B, sinoviocitos , fibroblastos, y macrófagos inicialmente como una proteína de 26kD. Esta última se escinde por la enzima convertidora de TNFa (la metaloproteinasa, ADAMS 17) en una molécula monomérica de 17-kD. Tres de estas moléculas forman, bajo condiciones fisiológicas, un homotrímero en forma de cono, no covalentemente unido que retícula los receptores unidos a membrana que existen en dosis o isoforma: receptor de I de TNF (TNF-RI) y receptor II de TNF (TNF-RII) . Su función natural es estimular el reclutamiento de neutrófilos y monocitos a sitios de infección y activar estas células para erradicar microbios, ejerciendo su función por la unión a su correspondiente receptor de TNF en la fuente de numerosos tipos de célula. Activa localmente el endotelio vascular, provocando vasodilatación y permeabilidad incrementada. Las moléculas de adhesión de endotelio vascular (ICAM-l, VCAM-1, E-selectina) y MHC clase II se favorecen en expresión lo que conduce al reclutamiento de células proinflamatorias , y a la inducción de inmunoglobulinas, y el complemento. Las plaquetas se llegan a activar y "ser más pegajosa", provocando pequeña oclusión de los vasos, y la contención de infecciones. Además, induce a los macrófagos y células endoteliales a segregar quimiosinas y promover la apoptosis de células objetivos. El TNFa tiene una potente función paracrina, que induce (mediante un mecanismo mediado por NFKB) la secreción de citocinas proinflamatorias tal como IL-1, IL-6, y GM-CSF, y también estimula la producción de varias quimiocinas que incluyen RANTES, IL-8, MCP-1, y MIP-la. Finalmente, TNFa juega un papel en la angiogénesis , que es crítico el crecimiento y propagación del sinovio reumatoide .

Las enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas (I ID) se activan por una producción anormal de citocinas pro- inflamatorias, incluyendo TNFa. Estas enfermedades incluyen: artritis reumatoide (RA) , enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) tal como enfermedad de Crohn, psoriasis de placa, crónica, artritis psoriática, vasculitis, y espondilitis anquilosantes.

Han surgido nuevos desarrollos en el tratamiento de enfermedades inflamatorias inmuno-mediadas de la investigación básica en la expresión de citocinas y en la señalización que identificó dos jugadores claves en la patofisiología de varias enfermedades en esta categoría: TNFa e interleucina-1 (IL-1) . Por ejemplo, se ha encontrado que ambas citocinas se elevan en el suero en el sinovio y en el fluido sinovial de pacientes con RA. Además, TNFa e IL-1 son capaces de inducir y aumentar el daño a las articulaciones en modelos experimentales de artritis. Estos hallazgos conducen al desarrollo de estrategias para bloquear/antagonizar sus efectos, y la selección específica por genes biológicos ha llegado ser posible en los años recientes. Esta primera generación de productos incluye anticuerpos monoclonales (mAb) y proteínas de fusión de receptor, solubles, todos que actúan para competir con el receptor para la unión de la citocina .

A la fecha, la US FDA ha probado tres inhibidores/agentes bloqueadores de TNFa para uso clínico en el tratamiento de varias IMID, incluyendo psoriasis y artritis psoriática. Estos son: Etanercept (EnbrelMR, Amgen-Wyeth) , una proteína quimérica completamente humana del receptor II de TNF fusionada al componente Fe de IgGl humana, Infliximab (RemicadeMR, Centocor) , un anticuerpo monoclonal quimérico y Adalimumab (HumiraMR, Abbott) , un anticuerpo monoclonal anti-TNFa de IgGl completamente humano. La eficiencia inicial probada y el perfil de seguridad de estos agentes tiene que ser ponderado contra las cuestiones de declinar la eficiencia con el paso del tiempo, el alto costo de estos agentes biofarmacéuticos y las limitaciones impuestas por la administración actual con aguja para estos agentes .

Un modelo de animal desarrollado por Boyman y colaboradores (Boyman et al., J. Exp. Med. 199:731-736

[2004] ) demostró el papel esencial para células T residentes y TNFa en el desarrollo espontáneo de psoriasis. En este modelo, se injertaron lesiones de piel humana pre-psoriática, sin síntomas, en ratones transgénicos AGR129. El grupo mostró que el bloqueo de células T conduce a la inhibición del desarrollo de psoriasis. También mostró que la aplicación del anticuerpo monoclonal anti-TNF humano, neutralizante (Infliximab, i.v.) o la proteína de fusión del receptor de TNF (Etanercept, s.c.) condujo a inhibición dramática del desarrollo del fenotipo psoriático. Esta resultados han servido para dar soporte a la noción que los antagonistas de TNFa tiene un efecto directo en el desarrollo de la enfermedad IMID.

Desdichadamente, más de un tercio de los pacientes que padecen de cualquiera de las indicaciones aprobadas de IMID no se beneficial clínicamente del tratamiento anti-TNF (Wong et al., Clin. Immunol . 126:121-136

[2008]) . Los esfuerzos continúan en el desarrollo de nuevos productos terapéuticos para afrontar esta área médica. Hay varios antagonistas "inteligentes" de TNFa, actualmente en ensayos clínicos, que incluyen: varios anticuerpos monoclonales anti-TNF, fragmentos pegilados de anticuerpo o moléculas truncadas del receptor de TNF. Además, un inhibidor de molécula pequeña que promueve el desmontaje de la subunidad de TNFa de la citocina trimérica ha mostrado resultados promisorios in vitro (He et al., Science 310:1022-1025

[2005]) pero no se ha reportado desarrollo clínico adicional.

La psoriasis es un trastorno cutáneo común que afecta aproximadamente 2.8 por ciento de la población (Linden y Weinstein Am. J. Med. 107:595-605

[1999]). Unas 4.5 millones de personas, estimadas, en los estados unidos de América, padecen de psoriasis y 1.5 millones tienen psoriasis de placa, moderada a severa. La enfermedad se caracteriza por inflamación crónica de la piel. Esta inflación ayuda activar la formación de placas rojas, urticantes de piel que frecuentemente son dolorosas y desfigurantes. El TNF-a juega un papel crítico en su formación y existencia continua debido a que incluce la síntesis de IL-1 e IL-8, lo que activa la inflación. Las concentraciones de' TNF-a son mayores en lesiones psoriáticas que en piel sin afectar de pacientes psoriáticos y tienden a declinar con la limpieza de lesiones después de terapia efectiva (Mussi et al., J . Biol. Regul .

Homeost. Agents 11:1 15-118

[1997]). TNF-a también promueve la proliferación de queratinocitos y la angiogénesis (Asadullah et al., Drugs today 35:913-924

[1999]), inhibiendo de esta manera esta citocina que debe detener la enfermedad en múltiples etapas.

Tradicionalmente, el tratamiento de primera línea de psoriasis moderada ha consistido de agentes tópicos debido a que frecuentemente son menos invasivos que la terapia sistémica, con una baja incidencia de los efectos secundarios m s serios, tal como falla renal o hepática (Kincaid (2005) Drug discovery today 10:884). Algunos agentes tal como: tioureilenos, propoltiouracilo y metimazol, son efectivos en el tratamiento de pacientes con psoriasis con un número significativo de pacientes que muestran limpieza o casi limpieza de sus lesiones después de varias semanas de tratamiento. El tratamiento sistémico con los nuevos productos biológicos anti-TNF : Enbrel, Remicade, y Humira, se ha probado para psoriasis de placa, crónica, moderada a severa. Los pacientes tratados con estos agentes muestran muy frecuentemente mejora marcada en su enfermedad con limpieza principal en varios casos (Chaudhari et al., Lancet 357:1842-1847

[2001]; Leonardi et al., N. Engl . J. ed. 349:2014-2022

[2003] ) . Pero' la actual terapia de la enfermedad no es particularmente satisfactoria y muchas terapias actualmente en uso están asociadas con toxicidad acumulada significativa (Gottlieb et al., J Am Acad Dermatol. 48:829-835

[2003]). Los riesgos asociados con los agentes bloqueadores de TNFa incluyen infecciones serias, malignidades, anafilaxia, reactivación de hepatitis B, enfermedad desmielinante , citopenias, falla cardíaca, y síndrome tipo lupus. Además, se observa pérdida de beneficio clínico después de que se detienen los fármacos, y una pequeña proporción de pacientes desarrollan anticuerpos a los agentes biológicos que igualmente va a limitar suficiencia con el uso repetido.

Las proteínas tal como las BBPI variantes, modificadas, manejadas, que son de tamaño mucho más pequeño y de esta manera se presume que son mucho menos inmunogénicas deben reducir significativamente las cuestiones acerca del desarrollo de anticuerpos neutralizantes en pacientes. Las moléculas de BBPI, debido a su peso molecular reducido en comparación a anticuerpos o proteínas de fusión, igualmente serán más tratables para la administración mediante una ruta tópica, o mediante administraciones sistémicas menos invasivas tal como inyección subcutánea o métodos de administración sin aguja.

La invención proporciona composiciones de cuidado personal que comprenden una TNF-BBPI variante, modificada para el uso en el cuidado de la piel y/o pelo. En algunas modalidades, la composición de cuidado personal que comprende una TNF-BBPI se usa para promover el crecimiento de pelo y/o para mejorar la condición de la piel de un sujeto que padece de un trastorno inflamatorio dermatológico. En algunas modalidades, el trastorno inflamatorio de la piel se elige de dermatitis, eccema, psoriasis, acné, rosácea y urticaria. En algunas modalidades, el trastorno inflamatorio dermatológico es psoriasis. De esta manera, la invención proporciona composiciones personales del cuidado de la piel y/o del cuidado del pelo. Las TNF-BBPI comprendidas en las composiciones de cuidado personal de la invención son BBPI variantes, modificadas en las cuales la asa equivalente de quimiotripsina del núcleo molecular precursor de la TNF- 5-BBPI se ha reemplazado por un péptido variante de TNF, y que además comprenden al menos una sustitución de aminoácido como se describe en las secciones 5.4.1 y 5.4.2. En la presente invención, la unión de la TNF-BBPI variante, modificada a TNFa desvía al TNFOÍ de interactuar con su receptor cognado inhibe la inflamación inducida por TNFa del cuero cabelludo e impide la pérdida de pelo o cabello. En algunas modalidades, la unión de la TNF-BBPI variante, modificada a TNFa disminuye la inflamación de la piel y mejora la condición de la piel en un sujeto que padece de un trastorno inflamatorio dermatológico citado en la presente, por ejemplo, psoriasis. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ningún mecanismo particular.

En algunas modalidades, el péptido variante de TNF comprendido en la composición de TNF-BBPI se elige de RYWQDIP (TI; SEQ ID NO: 474), APEPILA (T2; SEQ ID NO: 475), DMIMVSI (T3; SEQ ID NO: 476), WTPKPTQ (SEQ ID NO: 583), ATFPNQS (SEQ ID NO: 584), ASTVGGL (SEQ ID NO: 585), TMLPYRP (SEQ ID NO: 586), AWHSPSV (SEQ ID NO: 587), TQSFSS (SEQ ID NO: 588), THKNTLR (SEQ ID NO: 589), GQTHFHV (SEQ ID NO : 590), LPILTQT (SEQ ID NO: 591) , SILPVSH (SEQ ID NO: 592) , SQPIPI (SEQ ID NO: 593), y QPLRKLP (SEQ ID NO: 594) . En otras modalidades, el péptido variante de TNF se elige de SEQ ID NOS: 483, 484 y 485.

El núcleo molecular en el cual se introduce el péptido variante de TNF para reemplazar la asa equivalente de quimiotripsina se elige de los núcleos moleculares del inhibidor de soya de Glycine max (BBI; SEQ ID NO : 13) o la forma madura o truncada del mismo (SEQ ID NO: 185) , el inhibidor de Dolichos biflorus (BBdb; SEQ ID NO: 449), el inhibidor D-II de soya de Glycine max (BBsb3; SEQ ID NO: 450) , el inhibidor de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc; SEQ ID NO: 451) , el núcleo molecular de BBI-AV de (SEQ ID NO: 186), el núcleo molecular de BBIt-AV de (SEQ ID NO: 187), el núcleo molecular de BBdb-AV de (SEQ ID NO: 452) , el núcleo molecular de BBsb3-AV de (SEQ ID NO: 453) , el núcleo molecular de BBtc -AV de (SEQ ID NO: 454) , el núcleo molecular de BBIt-VEGK de (SEQ ID NO: 640) , el núcleo molecular de BBIt-VEGT de (SEQ ID NO: 641) el núcleo molecular de BBIt - VEGKD de (SE ID, NO: 542) . Además, cualquiera núcleo molecular precursor de BBPI tipo silvestre, tal como aquellos descritos por Prakash et al., {supra) , se pueden usar para generar núcleos moleculares variantes de BBPI. En algunas modalidades, .el núcleo molecular de la VEGF-BBPI es aquel de SEQ ID NO: 187. En algunas modalidades, la estructura fundamental de la TNF-BBPI variante, modificada comprende al menos una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a l, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55, y 65 de BBI variante de SEQ ID NO: 187, como se cita en la sección 5.4.1. En otras modalidades, la estructura fundamental de la TNF-BBPI variante, modificada comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de una combinación de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones de aminoácido como se cita anteriormente en la sección 5.4.2.

En otras modalidades, la estructura fundamental de la TNF-BBPI variante, modificada que comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 131-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-4OH-50R-52L en posiciones equivalentes en SEQ ID NO: 187.

En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal de la invención comprende una BBPI en la cual la asa equivalente de quimiotripsina del núcleo molecular precursor se reemplaza con un péptido variante de TNF elegido de SEQ ID NOS : 474, 475 y 476, en donde el grupo molecular es aquel de SEQ ID NO: 187, y que comprende una combinación de sustituciones de aminoácido 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T.

En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal comprenden una TNF-BBPI elegida de las TNF-BBPI de SEQ ID NOS : 647, 648, y 649.

En algunas modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende una TNF-BBPI que se une a TNF. En modalidades alternativas, la unión de TNF-BBPI a TNF bloquea la actividad en etapa posterior de TNF. En algunas modalidades, la composición es capaz de modular la inflamación.

En algunas modalidades, la composición de cuidado personal que comprende una BBPI-TNF variante, modificada es para el uso en cuidado de la piel. En algunas modalidades, las composiciones del cuidado de la piel son para el uso en la mejora de la apariencia y/o condición de la piel en un sujeto que padece de un trastorno de la piel. De esta manera, en algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal para el uso en el cuidado de la piel incluyen composiciones cosméticas. En algunas modalidades, el trastorno de la piel es un trastorno inflamatorio de la piel. En algunas modalidades, el trastorno inflamatorio de la piel es psoriasis .

En una modalidad, la composición de cuidado personal que comprende una TNF-BBPI es una composición del cuidado de la piel que se elige de cremas, lociones, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, espumas, aerosoles, líquidos, geles, sueros y sólidos para la piel, en otra modalidad, la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel seleccionada de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores antimicrobianos, cremas protectoras para la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos anti-acné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, composiciones de aclaramiento de piel, composiciones de reducción de rojez de piel, bloqueadores de sol, depiladores, inhibidores de crecimiento de pelo o cabello y radioprotectores . Los radioprotectores se eligen de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón.

En una modalidad, la composición de cuidado personal que comprende una TNF-BBPI es una composición de cuidado de la piel que comprende composiciones de venta libre, aplicadas de forma tópica, tratamientos anti-funguideos, tratamientos anti-acné, protectores de la piel, bloqueadores de sol, desodorantes y anti-transpirantes . En otras modalidades, la composición del cuidado de la piel es capaz de aclarar el tono de la piel, de reducir la rojez, de impedir el oscurecimiento del tono de la piel o impedir el desarrollo de color.

En algunas modalidades preferidas, la composición de maquillaje que comprende al menos un pigmento es una máscara a seleccionada de máscaras no aprueba de agua, mascaras a prueba de agua, mascaras de volumen, máscaras de estiramiento, mascaras de rizado, máscaras anhidras a prueba de agua, máscaras basadas en agua, y tratamientos para pestañas o cejas.

En aún modalidades adicionales, las composiciones de maquillaje son formulaciones de polvo prensados seleccionadas de polvos sueltos, rubores, sombras para ojos, y polvos de bronceado. En aún en modalidades adicionales, las composiciones de maquillaje son base seleccionadas de bases de agua en aceite, bases de agua en silicón, bases de aceite en agua, barras anhidras de maquillaje y bases de crema a polvo .

En algunas modalidades, las composiciones personales del cuidado de la piel comprenden una TNF-BBPI variante, modificada como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, la TNF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. También, de manera preferente, la TNF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción o nutriente, un sistema de dispersión o gel estabilizado, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema limpiador basado en agente tensioactivo tal como un lavado corporal o champú, una dispersión o emulsión en aerosol o aspersión, un acondicionador del pelo o piel, ayuda de estilizado, o un producto pigmentado tal como maquillaje, así como otras preparaciones cosméticas y de maquillaje, adecuadas. En algunas modalidades, el portador es de manera preferente al menos uno seleccionado del grupo que consiste de agua, propilenglicol , etanol, propanol, glicerol, butilenglicól y polietilenglicol .

En otras modalidades, la invención proporciona una composición de cuidado personal que comprende BBPI variantes, modificadas que comprenden un péptido variante de TNF (TNF-BBPI) para el uso en el cuidado del pelo o cabello.

En algunas modalidades, la composición de cuidado de pelo encuentran uso en la mejora de la apariencia y/o condición del cuero cabelludo en pacientes que padecen de psoriasis .

En una modalidad, la composición de cuidado pelo o cabello se selecciona del grupo que consiste de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado de pelo, colorantes de pelo, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos.

En algunas modalidades, la composición de cuidado de pelo o cabello comprende además un radioprotector . Como se describe para las composiciones personales de cuidado de la piel, el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón. En otras modalidades, el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón.

En algunas modalidades, las composiciones personales de cuidado de pelo comprenden una VEGF-BBPI variante, modificada como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, la VEGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso en base al peso total de la composición. También, de manera preferente la VEGF-BBPI está presente en una cantidad de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un sistema de dispersión o gel estabilizado, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema limpiador basado en agente tensioactivo tal como un champú o lavado corporal, una dispersión o emulsión en aerosol o en aspersión, un acondicionador del pelo o la piel, una ayuda de estilizado, o un producto pigmentado tal como maquillaje, así como otras preparaciones cosméticas y de maquillaje, adecuadas. En algunas modalidades, el portador es de manera preferente al menos uno seleccionado del grupo que consiste de agua, propilenglicol , etanol, propanol, glicerol, butilenglicol y polietilenglicol . 6.1.1 Formulaciones En modalidades adicionales preferidas, la presente invención proporciona composiciones cosméticas y/o farmacéuticas que comprenden al menos una BBPI variante, modificada, como se expone en la presente, y un portador o excipiente fisiológicamente aceptable. De manera preferente, el compuesto está presente en una cantidad de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 5 % en peso, en base al peso total de la composición. También de manera preferente, el compuesto está presente en una cantidad de de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 % en peso en base al peso total de la composición. La composición puede estar en la forma de un vehículo emulsionado, tal como una crema o loción nutriente, un sistema de dispersión o gel estabilizado, un suero de tratamiento, un sistema de administración liposómica, un paquete o máscara tópica, un sistema limpiador basado en agente tensioactivo tal como un champú o lavado corporal, una emulsión o dispersión en aerosol o en aspersión, un acondicionador del pelo o piel, ayuda de estilizado, o un producto pigmento tal como maquillaje, de manera preferente, el portador es al menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de agua, propilenglicol, etanol, propanol, glicerol, butilenglicol y polietilenglicol.

Se contempla que la presente invención encontrará uso en numerosas composiciones de cuidado personal. No propone que la presente invención se limite a ningún formato o tipo particular de composición. La siguiente descripción proporciona composiciones de ejemplo, no limitantes que comprenden la siguiente invención.

Las emulsiones comprenden un grupo de cosméticos habituales, comúnmente usados. El término "emulsión" se usa en general en referencia a un sistema heterogéneo de dos líquidos que son inmiscibles o miscibles sólo a un grado limitado entre sí, que usualmente se refieren como "fases". Una fase está típicamente en la forma de gotitas (es decir, la fase "dispersada", "discontinua" o "interna"), en tanto que el otro líquido forma una fase continua (es decir, "coherente" o "externa"). Las formas menos comunes de aplicación incluyen múltiples emulsiones (es decir, aquellas en las cuales las gotitas de la fase dispersada (o discontinua) , comprenden por su parte gotitas de una fase dispersada adicional, tal como emulsiones de agua/aceite/agua (W/O/W) y emulsiones de aceite/agua/aceite (/W/O) ) .

Si la fase de aceite se distribuye finalmente en la fase de agua, entonces esto es una emulsión de aceite en agua (emulsión de O/W; por ejemplo, leche) . El carácter básico de una emulsión de O/W se determina" por el agua. Estas emulsiones en general son menos grasosas en la piel, son más bien apelmazadas, y se absorben más rápidamente en la piel que las emulsiones de W/0 (agua en aceite) .

Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con un gran número de opciones de formulación de preparaciones estables de W/0 para usos cosméticos y/o dermatológicos, incluyendo formulaciones tal como cremas y ungüentos, que son diseminables en el intervalo desde temperatura ambiente a temperatura de la piel, así como lociones y leches, que son más fluidas en este intervalo de temperaturas .

La estabilidad de las emulsiones es dependiente de su viscosidad, en particular en la viscosidad de fase externa. Una emulsión llega a ser inestable cuando las partículas finalmente dispersadas se recolectan conjuntamente para formar agregados relativamente grandes, y las gotitas que están en contacto, coalescen. Este proceso se refiere como "coalescencia" . Entre más viscosa se la fase externa de la emulsión más lento es el proceso de coalescencia. Las emulsiones de consistencia "líquida" (= fluida) se usan en varios cosméticos (por ejemplo, lociones de cuidado de la piel, lociones limpiadoras, lociones faciales, lociones para manos, etc.). Estas composiciones tienen en general una viscosidad de aproximadamente 2000 raPa-s a aproximadamente 10,000 mPa-s. La estabilidad de las emulsiones fluidas es digna de atención particular puesto que la movilidad considerablemente mayor de las partículas promueve una coalescencia más rápida.

Se sabe que las emulsiones líquidas actualmente de forma típica en uso comprenden en general espesadores y son estables hacia concentraciones relativamente altas de electrolitos. Estos se manifiesta en la separación de fases de las composiciones. Sin embargo, en algunas modalidades, es deseable usar ciertos electrolitos (por ejemplo, filtros UV solubles en agua) , a fin de ser capaces de utilizar las otras propiedades físicas, químicas o fisiológicas de los mismos. Aunque muchos casos la elección apropiada del sistema emulsionante puede proporcionar remedios a un cierto grado, entonces surgen más frecuentemente otras desventajas.

Por ejemplo, algunas desventajas resultan debido a hecho de que los emulsionantes, igual que cualquier sustancia finalmente, pueden activar reacciones alérgicas o reacciones basadas en la supersensibilidad (es decir, hipersensibilidad) del usuario. El uso de emulsionantes cosméticos habituales en general está bastante sin riesgo, aunque para algunos individuos, son necesarias y/o preferidas composiciones hipoalergénicas . En realidad, en algunos individuos particularmente sensibles, se activan ciertas dermatosis por exposición a ciertos emulsionantes y exposición simultánea a la luz del sol. De esta manera, como se conoce por los expertos en la técnica, en algunas composiciones, los emulsionantes particulares son menos preferidos y/o se evitan .

Es posible preparar preparaciones libres de emulsionante. Por ejemplo, algunas preparaciones tienen una fase aceitosa que contiene gotitas dispersadas de agua (es decir, es similar a una emulsión de W/0) . Estos sistemas se llaman algunas veces "hidrodispersiones" o "oleodispersiones" , dependiendo que sea la fase dispersa y que sea la fase continua.

Para tecnología cosmética, sin embargo, no es necesario ni posible dispensar conjuntamente con emulsionantes, especialmente puesto que existe una cierta elección de emulsionantes particularmente moderados.

En algunas modalidades liposómicas, los liposomas comprenden agua y uno o más ingredientes capaces de formar vesículas de bicapa de líquido que pueden mantener uno o más ingredientes funcionales o activos. Los ejemplos no limitantes de ingredientes capaces de formar vesículas de bicapas de líquidos incluyen: fosfolípidos , fosfatidilcolina hidrogenada, lecitina, colesterol y esfilgolípidos . Los liposomas preferidos incluyen, sin limitación: a) liposoma lipoide 0003 (compuesto de agua y lecitina y glicerina) ; b) liposoma lipoide 0300 (compuesto de agua y fosfatidilcolina) ; c) liposoma lipoide 0111 (compuesto de agua, extracto de hojas de Ginkgo biloba, alcohol desnaturalizado, lecitina hidrogenada y colesterol) ; d) liposomas anti-irritantes (compuestos de agua, extracto de semilla de" nuez ce cola (cola acuminata) , bisabolol y fosfolípidos ) ; e) liposomas de vitamina C y E (compuestos de agua, fosfolípidos , acetato de tocoferilo y palmitato de ascorbilo) ; f) liposomas de endurecimiento (compuestos de agua, butilenglicol , extracto de fruta pyrus malus (Manzana) , fosfolípidos , acetato de tocoferilo y carbómero) ; y g) liposomas humectantes (compuestos de agua, PCA sódico, acetato de tocoferilo, goma de xantano, arginina, lisina, glicina y prolina) .

En otras modalidades, las composiciones de cuidado personal de la presente invención comprenden además al menos un ingrediente activo además de los núcleos moleculares proporcionados en la presente. Hay numerosos ingredientes activos conocidos por los expertos en la técnica que encuentran uso en las composiciones de cuidado personal de la presente invención. En realidad, se contempla que cualquier ingrediente activo adecuado o combinación de ingredientes activos adecuados encontrará uso en la presente invención (ver, por ejemplo, McCutcheon's Functional Materials, North American and International Editions, publicado por MC Publishing Co .

[2003]). Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal comprenden en la presente un ingrediente activo de cuidado de la piel a un nivel de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 20 %, en peso de la composición. En otra modalidad, las composiciones del cuidado personal comprenden un ingrediente activo del cuidado de la piel de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 %, en peso de la composición. En aún otra modalidad, las composiciones de cuidado personal comprenden un ingrediente activo de cuidado de la piel de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 2 %, en peso de la composición .

Los ejemplos no limitantes de ingredientes activos o funcionales que se pueden administrar mediante liposomas incluyen: vitaminas y sus derivados, antioxidantes, proteínas y péptidos, agentes queratolíticos , bioflavinoides , terpenoides, fitoquímicos , y extractos de origen vegetal, marino o fermentado. En una modalidad preferida, la composición comprende además un producto activo de cuidado de la piel o de cuidado del pelo. Los ingredientes activos pueden incluir cualquiera de una amplia variedad de ingredientes tal como se conoce en la técnica. (ver, por ejemplo, McCutcheon' s Functional Materials, North American and International Editions, (2003) , publicado por MC Publishing Co . ) . de manera preferente, estos ingredientes activos incluyen, pero no se limitan a antioxidantes, tal como derivados de tocoferilo y ascorbilo, bioflavinoides , terpenoides, sintéticos y similares, vitaminas y derivados de vitamina, hidroxil- y polihidroxi-ácidos y sus derivados, tal como AHA y BHA y sus productos de reacción, péptidos y poliopéptidos y sus derivados, tal como glicopéptidos y péptidos lipofilizados , proteínas de choque térmico y citocinas, enzimas e inhibidores de enzimas y sus derivados, tal como proteasas, inhibidores de MMP, catalasas, glucosa-oxidada y superóxido-dismutasa, productos de fermentación bacteriana, fungoidea y de levadura y sus derivados, incluyendo hongos, algas, y algas marinas y sus derivados, fitoesteroles y extractos de planta y de partes de planta y sus derivados y fosfolípidos y sus derivados, agentes anti-caspa tal como piritiona de zinc y sistemas de administración que los contienen, como se proporciona en la presente y/o como se conoce en la técnica.

En algunas modalidades preferidas, el ingrediente activo del cuidado de la piel se selecciona del grupo que consiste de un componente de Vitamina B3 , pantenol, Vitamina E, acetato de Vitamina E, retinol, propionato de retinilo, palmitato de retinilo, ácido retinoico, Vitamina C, teobromina, alfa-hidroxiácido, farnesol, fitrantriol, ácido salicílico, palmitil-peptapéptido-3 y mezclas de los mismos. En algunas modalidades preferidas, el componente de Vitamina B3 es niacinamida. En algunas modalidades, las composiciones proporcionadas en la presente comprenden un ingrediente activo del cuidado de la piel a un nivel de aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 20 %, de manera preferente de aproximadamente 0.001 % a aproximadamente 0.5 %, de manera más preferente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 1 %, en peso.

Los derivados de ejemplo de los compuestos de vitamina B3 anteriores incluyen ésteres de ácido nicotínico, incluyendo ésteres no vasodilatadores de ácido nicotínico, nicotinil-aminoácidos , ésteres de alcohol nicotinílico de ácidos carboxílieos , N-óxido de ácido nicotínico y N-óxido de niacinamida . Los ésteres adecuados de ácido nicotínico incluyen ésteres de ácido nicotínico de alcoholes de C1-C22 de manera preferente de Ci-C16í de manera más preferente de Cx-Ci6. En estas modalidades, los alcoholes son de manera adecuada de cadena recta o de cadena ramificada, cíclicos o acíclicos, saturados o insaturados (incluyendo aromáticos) , sustituidos o insustituidos . Los ésteres son de manera preferente no vasodilatadores.

Los ésteres no vasodilatadores de ácido nicotínico incluyen nicotinato de tocoferol y hexanicotinato de inositol; se prefiere nicotinato de tocoferol. Una descripción más completa de los compuestos de vitamina B3 se proporciona en O 98/22085. Los compuestos preferidos de vitamina B3 incluyen niacinamida y nicotinato de tocoferol.

En modalidades adicionales, el ingrediente activo de cuidado de la piel comprende al menos un retinoide. El retinoide es de manera preferente retinol, ásteres de retinol (por ejemplo, ésteres alquílicos de C2-C22 de retinol, incluyendo palmitato de retinilo, acetato de retinilo, propionato de retinilo) , retinal y/o ácido retinoico (incluyendo ácidos todo-trans-retionico y/o ácido 13-cis-retinoico, de manera más preferente retinoides diferentes de ácido retinoico. Estos compuestos son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles de varias fuentes (por ejemplo, Sigma y Boehringer Mannheim) . Los retinoides preferidos incluyen retinol, palmitato de retinilo, acetato de retinilo, propionato de retinilo, retinal, ácido retinoico y combinaciones de los mismos. Más preferidos son retinol, propionato retinoico, ácido retinoico y palmitato de retinilo. En algunas modalidades, el retinoide se incluye como un material sustancialmente puro, en tanto que en otras modalidades, se proporciona como un extracto obtenido por aislamiento físico y/o químico adecuado de fuentes naturales (por ejemplo, plantas) . Cuando se incluye un retinoide en las composiciones de la presente, comprende de manera preferente de aproximadamente 0.005 % a aproximadamente 2 %, de manera preferente de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 1 % de retinoide. De manera preferente se usa retinol en una cantidad de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 0.15 %; de manera preferente se usan ésteres de retinol en una cantidad de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 2 % (por ejemplo, aproximadamente 1 %) .

En aún modalidades adicionales de la presente invención, se incorporan antioxidantes en las composiciones de cuidado personal. Se contempla que cualquier antioxídante adecuado encontrará uso en las composiciones de cuidado personal de la presente invención. Los antioxidantes adecuados incluyen, pero no se limitan a aminoácidos (por ejemplo, glicina, histidina, tirosina, y triptofano) y derivados de los mismos, imidazoles (por ejemplo ácido urocánico) y derivados de los mismos, péptidos (por ejemplo, D, L-carnosina, D-carnosina, y L-carnosina) y derivados de los mismos (por ejemplo, anserina) , carotenoides , carotenos (por ejemplo, a-caroteno, ß-caroteno, y ?-licopeno) y derivados de los mismos, ácido clorogénico y derivados de los mismos, aurotioglucosa, propiltiouracilo y otros tioles (por ejemplo, tioredoxina, glutationa, cisteína, cistina, cistamina y los ásteres de glicosilo, N-acetilo, metilo, etilo, propilo, amilo, butilo y laurilo, palmitoilo, oleilo, g-linoleilo, colesterilo y glicerilos de los mismos) y sales de los mismos, dilauril-tiodipropionato, diestearil-tiodipropionato, ácido tiodipropiónico y derivados de los mismos (por ejemplo, esteres, éteres, péptidos, lipidos, nucleótidos, nucleósidos y sales), y compuestos de sulfoximina (por ejemplo butionina sulfoximinas , homocisteína-sulfoximina, butionina-sulfonas , penta-, hexa-, y heptationina-sulfoxiraina) en dosis toleradas muy pequeñas (por ejemplo, típicamente pmol a mmol/kg) , agentes quelantes (por ejemplo, ácidos a-hidroxi-grados , ácido palmítico, ácido fítico y lactoferrina) , a-hidroxi-ácidos (por ejemplo ácido cítrico, ácido láctico y ácido málico) , ácido húmico, ácido biliar, extractos de bilis, bilirrubina, biliberdina, EDTA, EGTA y derivados de los mismos, ácidos grasos insaturados y derivados de los mismos (por ejemplo, ácidos linolénicos, ácido linoleico, ácido oleico) , ácido fólico y derivados de los mismos, furfurilidenosorbitol y derivados de los mismos, ubiquinona y ubiquinol y derivados de los mismos, vitamina C y derivados de la misma (por ejemplo, ascorbilo fosfato sódico, palmitato de ascorbilo, ascorbil-fosfato de Mg, y acetato de ascorbilo) , tocoferóles y derivados (por ejemplo, acetato de vitamina E) , benzoato de coniferilo de resinas de benzoína, ácido ferúlico, furfurilidenoglucitol , carnosina, butilhidroxitolueno, butilhidroxianisol , ácido nordihidroguaiácico, ácido nordihidroguaiarético, trihidroxibutirofenona, ácido úrico derivados del mismo, mañosa y derivados del mismo, zinc y derivados del mismo (por ejemplo, ZnO, ZnS04) , selenio y derivados del mismo (por ejemplo, selenometionina) , estilbenos y derivados del mismo (por ejemplo, óxido de estilbeno, óxido de trans-estilbeno) y derivados del mismo (por ejemplo, sales, ásteres, éteres, azúcares, nucleótidos, nucleósidos, péptidos y lípidos) de estos ingredientes activos que son adecuados para el uso propuesto de las modalidades particulares de la presente invención .

En algunas modalidades, la concentración de uno o más antioxidantes en las composiciones de la presente invención es de manera preferente de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 30 % en peso, de manera particularmente preferente de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 20 % en peso, y de manera más preferente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 % en peso, en base al peso total de la preparación. En modalidades adicionales, en las cuales se utilizan vitamina E y/o sus derivados como anti-oxidantes , el intervalo preferido es de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10 % en peso, en base al peso total de la formulación. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ninguna concentración específica de antioxidante, puesto que varias concentraciones encontraron uso en las varias modalidades de la presente invención.

En aún modalidades adicionales, los ingredientes activos son catequinas, ésteres biliares de catequinas, y/o extractos acuosos orgánicos de plantas o secciones de plantas que tienen un contenido de catequinas o ásteres biliares de catequinas (por ejemplo, las hojas de la familia de plantas Theaceeae, en particular de la especie Camellia sinensis, (té verde) ) . Sus ingredientes típicos (por ejemplo, polifenoles o catequinas, cafeína, vitaminas, azúcares, minerales, aminoácidos, lípidos) se encuentran en uso particular en algunas modalidades de la presente invención.

En algunas modalidades, las catequinas se encuentran uso en la presente invención. Las catequinas son un grupo de compuestos que se consideran como flavonas hidrogenas o antocianidinas , y son derivados de "catequinas "(catecol, 3 , 3 ' , 4 ' , 5 , 7-flanvanpentol , 2- (3,4-dihidroxifenil) croman-3 , 5 , 7-triol) . La epicatequina ( (2R, 3R) , 3 , 3 ' , 4 ' , 5 , 7-flavanpentol) también es un ingrediente activo que encuentra uso en algunas modalidades de la presente invención.

En aún modalidades adicionales, los extractos de planta con un contenido de catequina, En particular extractos de té verde (por ejemplo extractos de hojas de las plantas del género Camellia, en particular aquellos usados para té, tal como C. sinenis, C. assamica, C. taliensis, y C. irrawadiensis, e híbridos de estas especies con otras especies, tal como C. japónica) encuentran uso en algunas composiciones de cuidado personal de la presente invención.

En algunas modalidades adicionales, los ingredientes activos preferidos incluyen polifenoles y catequinas del grupo (-) -catequina, (+) -catequina, (-)-catequina-galato , ( - ) -galocatequina-galato , (+) -epicatequina, (-) -epicatequina, ( - ) -epicatequina-galato , (-)- epigalocatequina, y ( - ) -epigalocatequina-galato .

En algunas modalidades adicionales de las composiciones de la presente invención, la flavona y sus derivados (también llamados frecuentemente de forma colectiva "flavonas") encuentran uso. Estos compuestos tienen la siguiente estructura básica (se muestran las posiciones de sustitución) : 3' Algunas de las flavonas más importantes que encuentran uso en algunas composiciones de cuidado personal de la presente invención se proporcionan más adelante. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ninguna flavona particular.

FLAVONAS Posiciones de Sustitución de OH 3 5 7 8 2' 3 ' 4' 5' Flavona - - - - - - - - Flavonol + - - - - - - - Crisina - + + - - - - - FLAVONAS Posiciones de Sustitución de OH 3 5 7 8 2' 3 ' 4 ' 5' Galangina + + + - - - - - Apigenina - + + - - - + - Fisetina + - + - - + + - Luteolina - + + - - + + - Kaempferol + + + - - - + - Quercetina + + + - - + + - Morina + + + - + - + - Robinetina + - + - - + + + Gossipetina + + + + - + + - Miricetina + + + - - + + + En la naturaleza, las flavonas usualmente están presentes en forma glicosilada.

En algunas modalidades adicionales, las composiciones de cuidado personal de la presente invención comprenden al menos algunos flavonoides que tienen la fórmula estructural genérica: donde Zi a Z7, independientemente entre sí, se eligen del grupo que consiste de H, OH, alcoxi e hidroxialcoxi, donde los grupos alcoxi hidroxialcoxi pueden estar ramificados o no ramificados y tienen de 1 a 18 átomos de carbono, y donde Gly se elige del grupo de radicales de mono y oligo-glicosidos .

En algunas modalidades alternativas, las composiciones de cuidado personal de la presente invención comprenden al menos un flavonoide que tiene la fórmula estructural genérica: donde Zi a Zs, independientemente entre sí, se eligen del grupo que consiste de H, OH, alcoxi e hidroxialcoxi, donde los grupos hidroxi e hidroxialcoxi pueden estar ramificados o no ramificados y tienen de 1 a 18 átomos de carbono, donde Gly se elige del grupo de radicales de mono- y oligo-glicosido .

En algunas modalidades preferidas, la composición tiene la fórmula estructural genérica: donde Glyi Gly2, y Gly3, independientemente entre sí, son radicales de monoglicósido. Gly2 y Gly3 también pueden representar, individualmente, .o de forma conjunta, saturaciones por átomos de hidrógeno. En algunas modalidades preferidas, Glyi Gly2, y Gly3, independientemente entre sí, se seleccionan del grupo de radicales de hexosilo, en particular, los radicales de ramnosilo y radicales de glucosilo. Sin embargo, los radicales de hexosilo, por ejemplo, alosilo, altrosilo, galactosilo, gulosilo, idosilo, mannosilo y talosilo, también encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. En aún modalidades adicionales, lo radicales de pentosilo encuentran uso en algunas composiciones de cuidado personal de la presente invención .

En algunas modalidades, ?? a Z5, son, independientemente entre sí, elegidos ventajosamente del grupo que consiste de H, OH, metoxi, etoxi y 2-hidroxietoxi , y los glicósidos de flavona tienen la estructura: En algunas modalidades, los glicósidos de flavona proporcionados en algunas de las composiciones de cuidado personal de la presente invención tienen la siguiente estructura : donde Gly- Gly2, y Gly3, independientemente entre sí, son radicales de monoglicósido . Gly2 y Gly3 también pueden representar, de manera individual, o conjuntamente, saturaciones por átomos de hidrógeno. Modalidades alternativas, Gly! Gly2, y Gly3 , independientemente entre sí, se seleccionan del grupo de radicales de hexosilo, en particular, de radicales de ramnosilo y radicales de glucosilo. Sin embargo, otros radicales de hexosilo, por ejemplo, alosilb, altrosilo, galactosilo, gulosilo, idosilo, mannosilo y talosilo, encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. Además, en algunas modalidades, lo radicales de pentosilo encuentran uso en la presente invención. En algunas modalidades, las composiciones de cuidado personal de la presente invención comprenden uno o más glucósidos de flavona seleccionados del grupo que consiste de a-glucosilrutina, a-glucosilmiricetina, a-glucosilisoquecitrina, a-glucosilisoquercetina y a-glucosilquercitrina . En algunas modalidades, particularmente preferidas, el glucósido de flavona es a-glucosilrutina.

En aún algunas modalidades adicionales, las composiciones de cuidado personal de la presente invención comprenden al menos una naringina (por ejemplo, arantina, naringenin-7-ramno-glucosido) , herperidin3' , 5 , 7- trihidroxi-4 ' -metoxiflavanon-7-rutinosido, hesperidosido , herperetin-7-0—rutinosido) , rutina (3 , 3 ' , 4 ' , 5 , 7 -pentahidroxiflavona-3 -rutinosído, quercetina-3 -rutinosido, soforina, birutan-rutabion, taurutina, fitomelina, melina) , troxerutina (3,5-dihidroxi-3 ' , 4 ' -7- tris (2-hidroxietoxi) flavon-3- (6-0- (6-desoxi-a-L-mannopiranosil) -b-D-glucopiranosido) ) , monoxerutina (3 , 3 ' , 4 ' , 5-tetrahidroxi-7- (2- hidroxietoxi) flavon-3- (6-0- (6-desoxi-a-L-mannopiranosiil) -b-D-glucopiranosido) ) , dihidrorobinetina (3 , 3 ' , 4 ' , 5' , 7-pentahidroxiflavanona) , taxifolina (3, 3', 4', 5, 7-pentahidroxiflavanona) , eriodictiool-7-glucosido (3 ',4', 5,7-tetrahidroxiflavanon- 7 -glucósido) , flavanomareina (3',4',7,8-tetrahidroxiflavanona-7-glucosio) , y/o isoquercetina (3 , 3 ' , 4 ' , 5, 7 -pentahidroxiflavanona- 3- (b-D-glucopiranosido) . En algunas modalidades aún adicionales, el ingrediente activo se selecciona del grupo que consiste de ubiquinonas y plastiquinonas . Las ubiquinonas se caracterizan por la fórmula estructural : Las ubiquinonas son las bioquinonas más ampliamente extendidas y las más investigadas. Las ubiquinonas se refieren a, dependiendo del número de unidades de isopreno enlazadas en la cadena lateral, como Q-l, Q-2, Q-3 etc., o de acuerdo al número de átomos de carbono, como U-5-U-10, U-15, etc. De manera preferente surgen con ciertas longitudes de cadena (por ejemplo, en algunos microorganismos y levaduras donde n=6) . En la mayoría de los mamíferos, incluyendo humanos, predomina Q10. La coenzima Q10 encuentra uso particular en algunas modalidades de la presente invención. Su fórmula estructural es: Las plastoquinonas tienen la fórmula estructural general Las plastoquinonas difieren en el número n de radicales de isopreno y se refieren por consiguiente (por ejemplo PQ-9 [n=9] ) . Además, otras plastoquinonas con sustituyentes variables en el anillo de quinona existen en algunas modalidades.

En aún modalidades adicionales, la presente invención proporciona preparaciones adecuadas para el uso como desodorantes y/o antitranspirantes . Se contempla que cualquiera de los ingredientes activos que encuentran comúnmente uso en estas preparaciones también encontrarán uso en varias modalidades de la presente invención. Los componentes adicionales que se usan comúnmente en estas preparaciones también encuentran uso en varias modalidades de la presente invención. Los ejemplos de estos ingredientes activos y compuestos inactivos, incluyen, pero no se limitan a, enmascaradores de olor, (por ejemplo, perfumes), absorbedores de olor (por ejemplo, filosilicatos descritos en DE-P 40 09 347) ; así como montmorillonita, caolinita, ilita, beidelita, nontronita, saponita, hectorita, bentonita, smectita, y sales de zinc de ácido ricinoleico. En algunas modalidades, de la presente invención, el intervalo de ingredientes activos (es decir, uno o mas compuesto) en estas preparaciones es de manera preferente de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 30 % en peso; de manera más preferente de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 20 % en peso; de manera más particular en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 % en peso, en base al peso total de la preparación.

En algunas modalidades, las composiciones de la presente invención comprenden cantidades seguras y efectivas de un portador dermatológicamente aceptable que es adecuado para aplicación tópica a la piel o pelo dentro del cual se incorporan los materiales esenciales y otros materiales opcionales para permitir que los materiales esenciales y componentes opcionales se administren a la piel o pelo a una concentración apropiada. De esta manera, en algunas modalidades, el portador actúa como un diluyente, dispersante, solvente o similar, para los componentes esenciales, asegurando que estos componentes se pueden aplicar y distribuir de manera uniforme sobre el objetivo seleccionado a una concentración apropiada.

En modalidades adicionales, también se va a incluir una cantidad efectiva de uno o más compuestos descritos en la presente en las composiciones que se van aplicar a materiales queratinosos tal como uñas y pelo, incluyendo pero no limitando a aquellas útiles como composiciones de aspersión para pelo, composiciones de estilizado de pelo, composiciones de acondicionamiento y/o de champú para pelo, composiciones aplicadas para el propósito de regulación de crecimiento de pelo y composiciones aplicadas al cabello y cuero cabelludo para el propósito de tratar seborrea, dermatitis y/o caspa.

En modalidades aún adicionales, se incluye una cantidad efectiva de uno o más compuestos descritos en la presente, en las composiciones adecuadas para aplicación tópica a la piel o pelo. Estas composiciones se proporcionan en cualquier forma adecuada, incluyendo pero no limitando a cremas, lociones, geles, suspensiones, dispersiones, microemulsiones , nanodispersiones , macroesferas , hidrogeles, emulsiones (por ejemplo, aceite en agua y agua en aceite, así como múltiples emulsiones) , y geles multilamelares y similares (ver, por ejemplo, Schlossman et al., The Chemistry and Manufacture of Cosmetics,

[1998] , incorporada en la presente como referencias). En algunas modalidades, las composiciones se formulan como composiciones acuosas o de silicón, en tanto que en otras modalidades se formulan como emulsiones de una o más fases de aceite en una fase continua acuosa (o una fase acuosa en una fase de aceite) .

El tipo de portador utilizado en la presente invención depende del tipo de forma de producto, deseada para la composición. El portador puede ser sólido, semisólido o líquido. Los portadores adecuados incluyen líquidos, semisólidos (por ejemplo, cremas, lociones, geles, barras, ungüentos y pastas), aspersiones y mousses. De manera preferente, el portador está en la forma de una loción, crema o un gel, de manera preferente uno que tiene un espesor o punto de deformación, suficiente para impedir que se cedimenten las partículas. En algunas modalidades, el portador es inerte, en tanto que en otras modalidades proporciona beneficios dermatológicos. En algunas modalidades, el portador se aplica directamente a la piel y/o pelo, en tanto que en otras modalidades, se aplica mediante una toallita o tela tejida o no tejida. En aún otras modalidades, hasta en la forma de un parche, máscara o envoltura. En aún modalidades adicionales, se aplica en aerosol o se rocía de otro modo o se bombea sobre la piel y/o pelo. El portador elegido es física y químicamente compatible con los componentes esenciales descritos en la presente, y no debe deteriorar excesivamente la estabilidad, eficiencia y otros beneficios útiles asociados con las composiciones de la presente invención.

Los portadores preferidos contienen un diluyente hidrófilo, dermatológicamente aceptable. Los diluyentes hidrófilos adecuados incluyen agua, diluyentes hidrófilos orgánicos tal como alcoholes monohídricos de C2-Ci0, de manera preferente C2-C3, de manera preferente C3-C6 y glicoles y polioles de bajo peso molecular, incluyendo propilenglicol , polietilenglicol , polipropilenglicol , glicerol, butilenglicol , 1 , 2 , 4 -butanotriol , esteres de sorbitol, 1,2,6-hexametriol, pentilenglicol , hexilenoglicol , ésteres de sorbitol, éteres etoxilados, éteres propoxilados , y combinaciones de los mismos. El diluyente es preferentemente líquido. El agua es un diluyente preferido. La composición comprende de manera preferente al menos aproximadamente 20 % del diluyente hidrófilo.

En algunas modalidades, los portadores adecuados también comprenden una emulsión que comprende una fase hidrófila, especialmente una fase acuosa, y una fase hidrófoba (por ejemplo, un lípido, aceite o material aceitoso) . Como es bien conocido por aquellos expertos en la técnica, la fase hidrófila se dispersa en la fase hidrófoba, o viceversa, para formar respectivamente fases hidrófilas o hidrófobas, dispersadas y continuas, dependiendo de la composición de los ingredientes. El término "fase dispersada" es un término bien conocido para el experto en la técnica de emulsiones, usado con referencia a la fase que existe como partículas o gotitas pequeñas que están suspendidas en o circundadas por una fase continua. La fase dispersada también se conoce como la fase interna o discontinua. La emulsión puede ser o comprende (por ejemplo, en una emulsión de triple fase o de múltiple fase) una emulsión de aceite en agua o una emulsión de agua en aceite tal como una emulsión de agua en silicón. Típicamente, las emulsiones de aceite en agua comprenden de aproximadamente 1 % a aproximadamente 60 % (de manera preferente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 30 ) de la fase hidrófoba dispersada y de aproximadamente 1 % a aproximadamente 99 % (de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %) de la fase hidrófila continua, en tanto que las emulsiones de agua en aceite comprenden típicamente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 98 % (de manera preferente de aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %) de la fase hidrófila dispersada y de aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 % (de manera preferente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 30 %) de la fase hidrófoba continua.

En modalidades adicionales, el portador también incluye uno o más componentes que facilitan la penetración a través de la barrera del extracto corneo superior a los niveles inferiores de la piel. Los ejemplos de mejoradores de penetración incluyen, pero no se limitan a, propilenglicol , azona, etoxidiglicol , dimetil-isosorbide , urea, etanol y sulfóxido de dimetilo, así como microemulsiones , liposomas y nanoemulsiones .

En algunas modalidades adicionales, las composiciones de la presente invención comprenden humectantes que están presentes de manera preferente a un nivel de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 20 %, de manera preferente de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 15 % y de manera preferente de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 10 %. Los humectantes preferidos incluyen, pero no se limitan, a, compuestos seleccionados de alcoholes polihídricos , sorbitol, glicerol, urea, betaina, D-pantenol, DL-pantenol, pantotenato de calcio, jalea real, pantetina, pantoteina, éter etílico de pantenilo, ácido pangámico, piridoxina, complejo de pantoil- lactosa-vitamina B, ácido carboxílico de pirrolidona sódica, hexano-1, 2 , S-triol, guanidina o sus derivados, y mezclas de los mismos.

Los alcoholes polihídricos adecuados para el uso en la presente incluyen, pero no se limitan a polialquilenglicoles y de manera preferente alquilen-polioles y sus derivados, incluyendo propilenglicol , dipropilenglicol, polipropilenglicol , polietilenglicol y derivados de los mismos, sorbitol, hidroxipropil-sorbitol, eritritol, treitol, pentaeritritol , xilitol, glucitol, manitol, pentilenoglgicol , hexilenglicol , butilenglicol (por ejemplo, 1,3-butilenglicol) , hexanotriol (por ejemplo 1 , 2 , 6 -hexanotriol) , trimetilolpropano, neopentilglicol, glicerina, glicerina etoxilada, propano- 1 , 3 -diol , glicerina propoxilada y mezclas de los mismos. Los derivados alcoxilados de cualquiera de l°s alcoholes polihídricos anteriores también son adecuados para el uso en la presente. Los alcoholes polhídricos preferidos de la presente invención se seleccionan de glicerina, butilenglicol, propilenglicol, pentilenglicol , hexilenglicol, dipropilenglicol, polietilenglicol, hexanotriol, glicerina etoxilada y glicerina propoxilada y mezclas de los mismos.

Los humectantes adecuados útiles en la presente son 2-pirrolidona-5-carboxilato de sodio (NaPCA) , guanidina; ácido glicólico y sales de glicolato (por ejemplo, amonio y alquil-amonio cuaternario) ; ácido láctico y sales de lactato (por ejemplo, amonio y alquil-amonio cuaternario) ; aloe vera en cualquiera de sus formas variadas (por ejemplo, gel de aloe vera) ; ácido hialurónico y derivados del mismo (por ejemplo, derivados de sal tal como hialuronato de sodio); lactamida-monoetanolamina; acetamida-monoetanolamina; urea; betaina, pantenol y derivados del mismo; y mezclas de los mismos .

En algunas modalidades, al menos parte (hasta aproximadamente 5 % en peso de la composición) de un humectante se incorporan las composiciones de la presente invención en la forma de una mezcla con un copolímero de metacrilato o acrilato hidrófobo, reticulado, en partículas, de manera preferente está presente una cantidad de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 10 %, que se puede adicionar ya sea a la fase acuosa o dispersada. Este copolímero es particularmente valioso para lucir el brillo y controlar el aceite en tanto que ayuda a proporcionar beneficios efectivos de humectación y se describe adicionalmente a detalle en: W096/03964, incorporada en la presente como referencia.

En algunas modalidades, las composiciones de aceite en agua y de agua en aceite de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 20 %, de manera preferente de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15 %, de manera preferente de aproximadamente 2 % a aproximadamente 10 ¾, de manera preferente de aproximadamente 2 % a aproximadamente 5 % de un emoliente dermatológicamente aceptable. Los emolientes tienden a lubricar la piel, a incrementar la suavidad y elasticidad de la piel, a prevenir o aliviar la resequedad de la piel y/o a proteger la piel.

Los emolientes son típicamente materiales inmiscibles en agua, aceitosos o cerosos y los emolientes pueden conferir propiedades estéticas a una composición tópica. Se conocen una amplia variedad de emolientes adecuados (ver, por ejemplo, Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2a. Edition, Vol. 1, pp. 32-43

[1972]; y WO 00/24372), y encuentran uso en la presente, contienen numerosos ejemplos de materiales adecuados como emolientes. Los emolientes adicionales incluyen, pero no se limitan a los siguientes: i) Hidrocarburos de cadena recta y ramificada que tienen de aproximadamente 7 a aproximadamente 40 átomos de carbono, tal como aceites minerales, dodecano, escualeno, colesterol, poliisobutileno hidrogenado, isohexadecano, isoeicosano, isooctahexacontano, isohexapentacontahectano , y las parafinas de C7-C40, que son hidrocarburos ramificados de C7-C4o- Los hidrocarburos adecuados de cadena ramificada para el uso en la presente se seleccionan de isopentacontaoctactano, petrolato y mezclas de los mismos; ii) Esteres de ácido graso de Ci-Cso, de ácidos carboxílicos de Ci-C30, benzoatos de C12-15 alquilo y de ácidos dicarboxílieos de C2-C30, por ejemplo, isononanoato de isononilo, neopentanoato de isoesarilo, octanoato de isodecilo, isononanoato de isodeciclo, isononanoato de tridecilo, octanoato de miristilo, pelargonato de octilo, isononanoato de octilo, miristato de miristilo, neopentanoato de miristilo, octanoato de miristilo, miristato de isopropilo, propionato de miristilo, estearato de isopropilo, isoestearato de isopropilo, isoestearato de metilo, benato de behenilo, maleato de dioctilo, adipato de diisopropilo, y dilinoleato de diisopropilo y mezclas de los mismos también encuentran uso en la presente invención; iii) Mono- y poli-ésteres de Ci-C30, de azúcares y materiales relacionados. Estos esteres se derivan de una porción de azúcar o poliol y una o más porciones de ácido carboxílico. Dependiendo del ácido y azúcar constituyentes, estos ésteres pueden estar ya sea en la forma sólida o líquida a temperatura ambiente. Los ejemplos incluyen: tetraoleato de glucosa, los tetraésteres de galacotsa de ácido oleico, el tetraoleato de sorbitol, tetraoleato de sacarosa, penaoleato de sacarosa, hexaoleato de sacarosa, heptaoleato de sacarosa, octaoleato de sacarosa, hexaéster de sorbitol. Otros materiales incluyen ésteres grasos de sacarosa de aceite de algodón o de aceite de soya. Otros ejemplos de estos materiales se describen en la WO 96/16636, incorporada en la presente como referencia; iv) Aceites vegetales y aceites vegetales hidrogenados. Los ejemplos de aceites vegetales y aceites vegetales hidrogenados incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de uva, aceite de coco, aceite de algodón, aceite de lacha, aceite de cogollo de palma, aceite de palma, aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite de naba, aceite de linaza, aceite de salvado de arroz, aceite de pino, aceite de nuez, aceite de ajonjolí, aceite de girasol, aceites hidrogenados parcial y completamente de las fuentes anteriores y mezclas de los mismos; v) Agentes humectantes solubles o coloidalmente solubles. Los ejemplos incluyen ácido hialurónico y sulfato de condroitina.

El término "lípido" se usa f ecuentemente como un término genérico para referirse a grasas, aceites, ceras y similares. Además, los términos "fase de aceite" y "fase de lípido" también se usan de manera indistinta. Sin embargo, los aceites y grasas difieren entre sí en su polaridad, que es difícil de definir. Se ha propuesto adoptar la tensión entre facial hacia el agua como una medida del índice de polaridad de un aceite o de una fase aceitosa. De esta manera, se contempla que la tensión interfacial se considera como una medida adecuada de la pluralidad de un componente de un aceite, determinado. La "tensión interfacial" es la fuerza que actúa en una línea imaginaria de un metro de longitud en la entrecara entre las dos fases . En esta medida, entre menor sea la tensión interfacial entre la fase de aceite y el agua, mayor será la polaridad de la fase aceitosa que se analiza. La unidad física para esta tensión interfacial se calcula convenientemente de la relación de fuerza/longitud y usualmente se expresa en mN/m (milinewtos divididos por metros) . Tiene un signo positivo si se trata de reducir la entrecara. En el caso contrario tiene un signo negativo. Como se usa en la presente, los lípidos se consideran como "polares", si su tensión interfacial hacia el agua es menos de 30 mN/m.

Los "aceites polares" incluyen aquellos del grupo de lecitinas y de triglicéridos de ácidos grasos, específicamente los ésteres de triglicerol de ácidos alcano-carboxílieos saturados y/o insaturados , ramificados y/o no ramificados que tienen una longitud de cadena de 8 a 24, en particular de 12 a 18 átomos de carbono. En algunas modalidades, los triglicéridos de ácidos grasos se eligen del grupo que consiste de aceites sintéticos, semi-sintéticos y naturales (por ejemplo, aceite de oliva, aceite de ajonjolí, aceite de soya, aceite de cacahuate, aceite de colsa, aceite de almendras, aceite de palmas, aceite de coco, aceite de ricino, aceite de germen de trigo, aceite de semilla de uva, aceite de cardo, aceite de hierba de asno, aceite de nuez de macadamia y similares) . Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a las composiciones que contienen aceites polares particulares. Los ejemplos adicionales de aceites polares que encuentran uso en la presente invención incluyen el grupo de ésteres de ácidos alcano-car-boxílieos saturados y/o insaturados, ramificados y/o no ramificados que tienen una longitud de cadena de 3 a 30 átomos de carbono y alcoholes saturados y/o insaturados, ramificados y/o no ramificados que tienen una cadena de 3 a 30 átomos de carbono, y del grupo de esteres de ácidos carboxílicos aromáticos y alcoholes saturados y/o insaturados, ramificados y/o no ramificados que tienen una longitud de cadena de 3 a 30 átomos de carbono. En algunas modalidades, estos aceites de éster se eligen del grupo que consiste de miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, estearato de isopropilo, oleato de isopropilo, estearato de n-butilo, laurato de n-hexilo, oleato de n-decilo, estearato de isooctilo, estearato de isononilo, isononanoato de isononilo, palmitato de 2 -etilhexilo, laurato de 22-etilhexilo, estearato de 2-hexildecilo, palmitato de 2-octildodecilo, oleato de oleilo, urecato de oleilo, oleato de erucilo, erucato de erucilo y mezclas sintéticas, semi-sintéticas y naturales de estos ésteres (por ejemplo, aceite de jojoba) .

Además, en algunas modalidades, la fase aceitosa se elige del grupo que consiste de éteres dialquílieos , así como alcoholes saturados o insaturados, y ramificados o no ramificados . En algunas modalidades particularmente preferidas, la fase aceitosa de las composiciones de las modalidades preferidas también contiene benzoato de C12-15-alquilo, en tanto que en modalidades alternativas, las modalidades preferidas contienen sólo este último. En aún modalidades adicionales, la fase de aceite se elige del grupo de alcoholes de Guerbet (es decir, el grupo de alcoholes nombrados después de Marcel Guerbet quien describió primero su preparación) . Estos alcoholes se forman de acuerdo a la ecuación : R R— CH2-CH2— OH ? R CH— CH2— OH catalizador por oxidación de un alcohol a un aldehido, por condensación por aldol del aldehido, eliminación de agua del aldol e hidrogenación del alil-aldehído. Los alcoholes de Guerbet son líquidos aún a bajas temperaturas y no dan por resultado virtualmente ninguna irritación de la piel. De esta manera, encuentran uso como constituyentes de relleno, de súper relleno, y también de relleno en las composiciones de cuidado de la piel y cuidado de pelo. En realidad, el uso de alcoholes Guerbet se conoce en el arte cosmético. En estas aplicaciones, las especies se caracterizan en general como que tienen la siguiente estructura: En esta estructura, Ri y R2, son usualmente radicales alquilo no ramificados. En algunas modalidades preferidas de la presente invención, los siguientes alcoholes Guerbet en los cuales Ri es propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo u octilo y/o R2 es hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tridecilo o tetradecilo encuentran uso en la presente invención. En modalidades adicionales, los alcoholes Guerbet preferidos incluyen 2-butiloctanol con la siguiente estructura química: que está comercialmente disponible, por ejemplo, bajo el nombre comercial ISOFOLMR 12 (Condea Chemie GmbH) , y 2-hexildecanol con la siguiente estructura química: que está comercialmente disponible, por ejemplo, bajo el nombre comercial ISOFOLMR 16 (Condea Chemie GmbH) .

En modalidades adicionales, las mezclas de alcoholes Guerbet encuentran uso en las composiciones de la presente invención, por ejemplo, las mezclas de 2-butiloctanol y 2 -hexildecanol encuentran uso en algunas modalidades . La cantidad total de alcoholes Guerbet en las preparaciones dermatológicas o cosméticas terminadas se selecciona del intervalo hasta aproximadamente 25.0 % en peso, de manera preferente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 15.0 % en peso, en base al peso total de las preparaciones. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ninguna concentración ni intervalo particular de concentraciones, puesto que los expertos en la técnica conocen cómo preparar las composiciones que tienen concentraciones adecuadas para las composiciones deseadas y sus usos. Además, se contempla que cualquier mezcla de componentes de aceite y/o cera encontrará uso en la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, las ceras (por ejemplo, palmitato de cetilo) encuentran uso como el componente de lípido sólo de la fase de aceite. En modalidades adicionales, los aceites no polares (por ejemplo, aquellos que se eligen del grupo de hidrocarburos ramificados y no ramificados y ceras de hidrocarburos, en particular VASELINEMR [es decir, petrolato] , aceite de parafina, escualano y escualeno, poliolefinas y poliisobutenos hidrogenados encuentran uso en la presente invención. En algunas modalidades que contienen poliolefinas, los polidecenos son las sustancias preferidas.

Los componentes grasos y/o de cera que encuentran uso en las modalidades de la presente invención incluyen pero no se limitan a ceras vegetales, ceras animales, ceras minerales y ceras petroquímicas. Los ejemplos de ceras particularmente preferidas incluyen cera de candelilla, cera de carnauba, cera de japón, cera de esparto, cera de corcho, cera de guaruma, cera de aceite de germen de arroz, cera de caña de azúcar, cera de baya, cera de ouricury, cera de montan, cera de jojoba, mantequilla de karite, cera de abeja, cera de goma laca, esperma de ballena, lanolina (cera de lana) , grasa uropigial, ceresina, ozocerina (cera de tierra) , ceras de parafina y ceras microcristalinas .

Los componentes grasos y/o de cera adicionales que encuentran uso en la presente invención incluyen ceras químicamente modificadas y/o ceras sintéticas (por ejemplo, aquellas comercialmente disponibles bajo los nombres comerciales SYNCROWAXMR HRC [gliceril- tribehenato] y SYNSCROWAXMR A 1C [ácido graso de C18-C36] , que están disponibles de CRODA GmbH) , y ceras de éster de montan. Ceras de sasol, ceras hidrogenadas de jojoba, ceras de abeja sintéticas o modificadas (por ejemplo, cera de abeja de dimeticona-copoliol y/o cera de abeja de C30-5o alquilo) , ceras de polialquileno, ceras de polietilenglicol , así como grasas químicamente modificadas (por ejemplo, aceites vegetales hidrogenados, tal como aceite de ricino hidrogenado y/o glicéridos grasos de coco, hidrogenados) . Triglicéridos (por ejemplo, trihidroxiestearina, ácidos grasos, esteres de ácidos grasos, y glicol-ésteres , tal como estearato de C20-C40-alquilo., estearato de C2o-C40-alquilhidroxiestearoilo y/o montanato de glicol) . En modalidades adicionales, la presente invención comprende ciertos compuestos de organosilicon, que tienen propiedades físicas similares a los componentes grasos y/o de cera especificados (por ejemplo, estearoxitrimetilsilano) . En modalidades adicionales, los componentes grasos y/o de cera se proporcionan de manera individual, en tanto que en aún modalidades adicionales, se proporcionan como una mezcla. En realidad, se propone que cualquier mezcla deseada de estos componentes de aceite y/o cera encontrarán uso en varias modalidades de la presente invención.

En algunas modalidades, la fase aceitosa se selecciona del grupo que consiste de isoestearato de 2-etil exilo, octildodecanol , isononanoato de isotridecilo, isoeicosano, cocoato de 2-etilhexilo, benzoato de Ci2-Ci5-alquilo, triglicérido caprílico/cáprico, y dicaprilil-éter. En modalidades alternativas, se proporcionan mezclas de varias fases aceitosas, incluyendo pero no limitado a mezclas que comprenden uno o más de octildodecanol, triglicérido caprílico/cáprico, dicaprilil-éter, benzoato de Ci2-Ci5-alquilo, isoestearato de 2-etilhexilo, isononanoato de isotridecilo. La siguiente tabla proporciona una lista de lípidos que encontrarán uso solos o en combinación con otros lípidos en varias modalidades de la presente invención. Las tensiones interfaciales correspondientes hacia el agua se dan en la última columna. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a estos componentes específicos, puesto que otros componentes encuentran uso en las varias modalidades de la presente invención, incluyendo mezclas de componentes más o menos polares y similares.

LIPIDOS Nombre comercial Nombre INCI (m/Nra) ISOFOLMR 14T Butil-Decanol + Hexil-Decanol + 27.6 Hexil Octanol + Butil Octanol ISOFOLMR 16 Hexil Decanol 24.3 EUTAN0LMR G Octildodecanol 24.8 CETI0LMR OE Dicaprilil-éter 22.1 MIGLY0LMR 812 Triglicerido Caprílico/cáprico 21.3 CEGES0FTMR C24 Palmitato de Octilo 23.1 Estearato de Estearato de Isopropilo 21.9 isopropilo ESTOLMR 1540 EHC Octanoato de Octilo 30.0 FINS0LMR TN Benzoato de Ci2-Ci5-Alquilo 21.8 CETI0LMR SN Isonoanoato de Cetearilo 28.6 DER OFEELM BGC Dicaprilato/Dicapato de 21.5 Butilenglicol LIPIDOS Nombre comercial Nombre INCI (m/Nra) TRIVENTMR OCG Tricaprilina 20.2 MOD Miristato de Octildodeceilo 22.1 COS ACOLMR ETI Tartrato de Di-Ci2-Ci3-Alquilo 29.4 MIGLYCOLMR 829 Succinato de Diglicerilo 29.5 caprilico/caprico PRISORINEMR 2036 Isostearato de Octilo 29:7 TEGOSOFTMR SH Heptanoato de Estearilo 28.7 ABILMR Wax 9840 Cetil-Dimeticona 25.1 CETIOLMR LC Coco-Caprilato/Caprato 24.8 IPP Palmitato de Isopropilo 22.5 LUVITOLMR EHO Octanoato de Cetearilo 28.6 CETIOLMR 868 Estearato de Octilo 28.4 En algunas modalidades, algo o toda la fase de aceite de las preparaciones se selección del grupo que consiste de silicones lineales y/o cíclicos que también se refieren frecuentemente como "aceites de silicón" . En algunas modalidades, estos silicones o aceites de silicón se presentan como monómeros que se caracterizan en general por elementos estructurales como sigue: Los silicones que tienen dos o más unidades de siloxilo que encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención se caracterizan en general por elementos estructurales como sigue: donde los átomos de silicio se pueden sustituir por radicales alquilo idénticos o diferentes y/o radicales arilo, que se representan en términos generales por los radicales Ri a R ; donde el número de diferentes radicales no se limitan necesariamente a 4 y puede asumir valores de 2 a 200,000.

Los silicones cíclicos que se van a usar ventajosamente de acuerdo a la invención se caracterizan en general por los elementos estructurales como sigue: donde los átomos de silicio se pueden sustituir por radicales arilo y/o radicales alquilo idénticos o diferentes, que se representan en la presente en términos generales por los radicales Ri a R4, donde el número de radicales diferentes no se limitan necesariamente a . n se puede asumir valores de 3/2 a 20. Los valores fracciónales para "n" toman en consideración que pueden estar presentes números impares de grupos siloxilo en el ciclo.

En algunas modalidades, se selecciona feniltrimeticona como el aceite de silicón. Otros aceites de silicón adecuados para el uso en las varias modalidades de la presente invención incluyen, pero no se limitan a dimeticona, fenildimeticona, ciclometicona (octametilciclotetrasiloxano) , hexametilciclotrisiloxano, polidimetilsiloxano, poli (metilfenilsiloxano) , cetildimeticona, y behenoxidimeticona . En modalidades alternativas, las mezclas de estos compuestos encuentran uso en la presente invención, que incluyen pero no se limitan a mezclas de ciclometicona e isononanoato de isotridecilo, y mezclas de ciclometicona e isoestearato de 2 -etilhexilo . En modalidades aún adicionales, los aceites de silicón de constitución similar, tal como los compuestos referidos anteriormente cuyas cadenas laterales orgánicas se han derivatizado (por ejemplo, polietoxilado y/o polipropoxilado) encuentran uso en la presente invención. Estos incluyen, pero no se limitan a compuestos tal como copolímeros polisiloxano-polialquilo-poliéter tal como cetildimeticona-copoliol (es decir, cetildimeticona-copoliol (y) poligliceril-4-isoestearato (y) laurato de hexilo) . En realidad, no se propone que la presente invención se limite a ningún aceite de silicón específico ni mezcla de aceites de silicón, puesto que varios aceites encuentran uso en las varias modalidades de la presente invención.

En modalidades adicionales, las emulsiones de agua en aceite (W/0) encuentran uso en la presente invención. En algunas modalidades, se usan emulsionantes de W/0 con o sin co-emulsionantes adicionales. En modalidades aún adicionales, las emulsiones de W/0 de la presente comprenden además uno o más emulsionantes, que incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes compuestos: lecitina, lanolina, cera microcristalina (Cera microcristalina) en una mezcla con aceite de parafina (parafina líquida) ozocerita, aceite de ricino hidrogenado, oleato de poligliceril-3 , mezclas de ácido de cera de lana, mezclas de alcohol de cera de lana, isoestearato de pentaeritritilo, poligliceril-3 -diisoestearato, cera de abeja (Cera alba) y ácido esteárico, dihidroxicetilfosfato de sodio en una mezcla con éter hidroxicetílico de isopropilo, dioleato de metilglucosa, dioleato de metilglucosa en una mezcla con hidroxiestearato y cera de abeja, aceite mineral en una mezcla con petrolato y ozocerita y oleato de glicerilo y alcohol de lanolina, petrolato en una mezcla con ozocerita y aceite de ricino hidrogenado e isoestearato de glicerilo y oleato de poligliceril-3 , aceite de ricino hidrogenado de PEG-7, ozocerita y aceite de ricino hidrogenado, isoestearato de poligliceril-4, isoestearato de poligliceril-4, en una mezcla con cetildimeticona-copoliol y hexil-laurato, laurilmeticona-copoliol, cetildimeticona-copoliol, polímero cruzado de acrilato/acrilato de C10-C30-alquilo, Poloxamero 101, dipolihidroxiestearato de .poligliceril-2-, diisoestearato de poligliceril-3, dipolihidroxiestearato de poligliceril-4, dipolihidroxiestearato de PEG-30, diisoestearato de diisoesaroil-poligliceril-3, dipolihidroxiestearato de poligliceril-2, dipolihidroxiestearato de poligliceril-3, dipolihidroxiestearato de poligliceril-4, dioleato de poliglicerilo-3.

En modalidades aún adicionales de la presente invención, las emulsiones de W/O de la presente invención comprenden uno o más co-emulsionantes , que incluyen, pero no se limitan a los siguientes: estearato de glicerilo en una mezcla con ceteareth-20 , ceteareth-25 , ceteareth-6 en una mezcla con alcohol estearílico, alcohol cetilestearilico en una mezcla con aceite de ricino PEG-40 y cetilestearil-sulfato de sodio, fosfato de triceteareth-4 , cetilestearil-sulfato de sodio, trialuret-4 - fosfato de lecitina, lauret-4-fosfato, ácido esteárico, estearato de propilenglicol SE, aceite de ricino hidrogenado PEG-25, aceite de ricino hidrogenado PEG-54, glicéridos caprílicos/cápricos PEG-6, oleato de glicerilo en una mezcla con propilenglicol, ceteth-2, ceteth-20, polisorbato 60, estearato de glicerilo en una mezcla con estearato de PEG-100, lauret-4, ceteareth-3, éter glicerílico de isoestearilo, alcohol cetilestearílico en una mezcla con cetilestearil-sulfato de sodio, laureth-23, esteareth-2, estearato de glicerilo en una mezcla con estearato de PEG-30, estearato de PEG-40, glicol-diestearato , copolímero de dodecil-glicol PEG-22, estearato de poligliceril-2 PEG-4, cetearethh-20, sesquiestearato de metilglucosa, estearet-10, estearato de PEG-20, esteareth-2 en una mezcla con diestearato de PEG-8, esteareth-21 , esteareth-20 , isoesteareth-20 , copolímero de PEG-45/dodecilglicol , copolímero de metoci-PEG-22/dodecilglicol , estearato de gliceril PEG-20, cera de abeja de PEG-8, laurato de poligliceril-2, succinato de isoestearil-diglicerilo , fosfato de cloruro de dimonio de estearamidopropil PG, estearato de glicerilo SE, ceteth-20, citrato de trietilo, sesquiestearato de metilglucosa PEG-20, cetearethh-12 , citrato de estearato de glicerilo, fosfato de cetilo, fosfato de tricetearethh-4 , fosfato de trilaureth-4 , diestearato de poligliceril-metilglucosa, fosfato de cetilo potásico, isoesteareth-10, sesquiestearato de poligliceril-2, ceteth-10, oleth-20, isoceteth-20 , estearato de glicerilo en una mezcla con ceteareth-20 , ceteareth-12 , alcohol cetilestearílico y palmitato de cetilo, alcohol cetilestearílico en una mezcla con estearato de PEG-20, estearato de PEG-30, estearato de PEG-40 y estearato de PEG-100.

En modalidades aún adicionales en las cuales la fase de aceite de las preparaciones consiste al menos parcialmente de aceites de silicón, los emulsionantes de silicón encuentran uso. En algunas modalidades, los emulsionantes de silicón se seleccionan del grupo de sustancias activas en la entrecara, copolioles de alquilmeticona y/o copolioles de dimeticona, particularmente del grupo de compuesto caracterizados por la siguiente estructura química: H3 en la cual X e Y independientemente entre sí, se eligen del grupo H y los grupos alquilo, grupos acilo y grupos alcoxi ramificados y no ramificados que tienen de 1 a 24 átomos de carbono, p es un número de 0 a 200, q es un número de 1 a 40, y r es un número de 1 a 100. Algunos ejemplos de emulsionantes de silicón que encuentran uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a copolioles de de dimeticona (por ejemplo, ABIL B 8842, ABILMR B 8843 ABILMR B 8847 ABILMR B 8851 ABILMR B 8852 ABILMR B 8863 ABILMR B 8873 y ABILMR B 88183, todos están comercialmente disponibles de Th. Goldschmidt AG) . Un ejemplo adicional de sustancias activas en la entrecara que encuentran uso en la presente invención incluye cetildimetícona-copoliol ABILMR EM90) , así como ciclometiconadimeticona-copoliol (ABILMR EM97) , ambas de las cuales están comercialmente disponibles de Th. Goldschmidt AG. Un emulsionante adicional que ha probado ser útil en varias composiciones que encuentran uso en las modalidades de la presente invención es laurilmeticona-copoliol (Dow CorningMR 5200 Formulation Aid) , que está comercialmente disponible de Dow Corning Ltd.

En modalidades preferidas de la presente invención, la cantidad total de emulsionantes usadas en las composiciones de cuidado personal (por ejemplo, preparaciones de cuidado de la piel o cosméticas, están presentes en el intervalo de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10.0 % en peso, de manera preferente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5.0 % en peso, en base al peso total de las preparaciones. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ninguna concentración específica de emulsionante/co-emulsionante, puesto que varias modalidades de la presente invención tienen diferentes concentraciones preferidas y/o intervalos preferidos de concentración.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona emulsiones en varias formas, que incluyen cremas de protección para la piel, lociones para la piel, leches cosméticas, cremas de bloqueador solar, y leches de protección solar. En algunas modalidades preferidas, estas composiciones comprenden grasas, aceites ceras y/o otras sustancias grasas así como agua, y uno o más emulsionantes como se usan habitualmente para este tipo de formulación.

Además de las emulsiones líquidas y emulsiones un poco más sólidas de las lociones limpiadoras cosméticas y/o cremas limpiadoras de la presente invención, la presente invención también proporciona preparaciones limpiadoras rociables ("aspersiones limpiadoras"), que se usan, por ejemplo, para remover maquillaje o como una loción de lavado suave. Además estas aspersiones limpiadoras encuentran uso en aplicaciones para el tratamiento de piel manchada. Estas preparaciones limpiadoras también encuentran uso como "preparaciones de enjuague" (es decir, productos que se enjuagan de la piel después de la aplicación) .

Además de los constituyentes anteriores, las varias modalidades de la presente invención incluyen componentes adicionales, tal como productos auxiliares y aditivos, que incluyen pero no se limitan a agentes corporales, agentes de relleno, perfumes, tintes, emulsionantes, ingredientes activos adicionales (por ejemplo, vitaminas y proteínas) , agentes de protección de luz, estabilizadores, repelentes de insectos, alcohol, sustancias de autobronceado, agua, sales, antimicrobianos, proteasas y/o queratinasas , etc. En realidad, se propone que la presente invención se limite a ningún componente particular en tanto que se incluye el componente activo que comprende un núcleo molecular y un péptido. Además se contempla que la presente invención encontrará uso en numerosas y varias preparaciones médicas.

En algunas modalidades, las composiciones de la presente invención contienen un emulsionante y/o agente tensioactivo , en general para ayudar a dispersar y suspender la fase dispersas dentro de la fase acuosa, continua. También puede ser útil un agente tensioactivo si el prodcuto se propone para limpieza de la piel o pelo. Por conveniencia más adelante en la presente, "emulsionantes" se abarcan por el término "agentes tensioactivos" . De esta manera, como se usa en la presente, el término "agentes tensioactivos" se refiere a agentes activos en la superficie, ya sea usados como emulsionantes o para otros propósitos de agentes tensioactivos tal como limpieza de la piel. Los agentes tensioactivos conocidos, incluyendo los convencionales, encuentran uso en la presente invención con la condición que el agente seleccionado sea química y físicamente compatible con los componentes esenciales de la composición y proporcionan las características deseadas (ver, por ejemplo, WO 00/24372). Los agentes tensioactivos adecuados incluyen materiales no derivados de silicón, materiales derivados de silicón, y mezclas de los mismos.

En modalidades adicionales, las composiciones de la presente invención comprenden de manera preferente de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 30 %, de manera más preferente de aproximadamente 0.5 % a 15 %, y de manera más preferente de aproximadamente 1 % a 10 % de un agente tensioactivo o mezcla de agente tensioactivos. El agente tensioactivo exacto o la mezcla de agentes tensioactivos, elegida, depende del pH de la composición, de los otros componentes presentes y de la estética final, deseada del producto .

Entre los agentes tensioactivos no iónicos que son útiles en la presente están aquellos que se pueden definir ampliamente como productos de condensación de alcoholes de cadena larga (por ejemplo, alcoholes de C8-30) , con polímeros de almidón o azúcar (por ejemplo, glicósidos) . Otros agentes tensioactivos no iónicos, útiles incluyen los productos de condensación de óxidos de alquileno con ácidos grasos (es decir, ésteres de óxido de alquileno de ácidos grasos) . Estos materiales tienen la fórmula general RCO(X)nOH en donde R es un grupo C10-30 alquilo, X es -OCH2CH2- (es decir, derivado de etilenglicol u óxido) o -OCH2CHCH3- (es decir, derivado de propilenglicol u óxido) y n es un número entero de aproximadamente 6 a aproximadamente 200. Otros agentes tensioactivos no iónicos son los productos de condensación de óxidos de alquileno con dos moles de ácidos grasos (es decir, diésteres de óxido de alquileno de ácidos grasos) . Estos materiales tiene la fórmula general RCO(X)nOOCR en donde R es un grupo C10-30 alquilo, X es -OCH2CH2- (es decir, derivado de etilenglicol u óxido) o -OCH2CHCH3- (es decir, derivado de propilenglicol u óxido) y n es un número entero de aproximadamente 6 a aproximadamente 100. En algunas modalidades, un emulsionante para el uso en la presente es de manera preferente una mezcla de ésteres de ácido graso, en base a una mezcla de éster de ácido graso de sorbitan y éster de ácido graso de sacarosa, especialmente una mezcla de estearato de sorbitan o cocoato de sacarosa. Los ejemplos adecuados adicionales incluyen una mezcla de alcohol cetearílicos y cetearil-glucósidos . Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ningún emulsionante particular puesto que en la técnica se conocen varios emulsionantes adecuados.

En modalidades adicionales, los agentes tensioactivos hidrófilos útiles en la presente incluyen de manera alternativa o adicionalmente cualquiera de una amplia variedad de agentes tensioactivos catiónicos, aniónicos zwiteriónicos , y anfotéricos tal como se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, McCutcheon' s , Emulsifiers and Detergents , North American and International Editions, MC Publishing Co.

[2003] ; Patente de los estados unidos No. 5,011,681 Patente de los estados unidos No. 4,421,769; y Patente de los estados unidos No. 3,755,560) .

En algunas modalidades adicionales, los agentes activos en la entrecara y/o en las superficies se incluyen en algunas composiciones de cuidado personal de la presente invención, aunque pero no limitado a emulsionantes catiónicos (por ejemplo, agentes tensioactivos cuaternarios) .

Los agentes tensioactivos cuaternarios que contienen un átomo N que se une de manera covalente a 4 grupos alquilo o arilo. Esto conduce, a pesar del pH a una carga positiva. La alquilbetaína, alquilamidopropilbetaína y alquilamidopropilhidroxisultalna son ejemplos de agentes tensioactivos cuaternarios que encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención.

Los agentes tensioactivos catiónicos proporcionados en algunas modalidades de la presente invención también incluyen, pero no se limitan a compuestos de amonio cuaternario, en particular cloruros o bromuros de benciltrialquilamonio (por ejemplo, cloruro de bencildimetilestearilamonio) , sales de alquiltrialquilamonio (por ejemplo, cloruro o bromuro de cetiltrimetilamonio) , cloruros o bromuros de alquildimetilhidroxietilamonio, cloruros o bromuros de dialquildimetilamonio , sulfatos de éter de alquilamidoetiltrimetilamonio, sales de alquilpiridinio (por ejemplo, cloruro de lauril- o cetilpirimidinio) , derivados de imidazolina, y compuestos con un carácter catiónico, tal como óxidos de amina, (por ejemplo, óxidos de alquildimetilamina y óxidos de alquilaminoetildimetilamina) . En algunas modalidades preferidas, las sales de cetiltrimetilamonio encuentran uso en algunas composiciones de cuidado personal de la presente invención .

En aún en modalidades adicionales, los polímeros catiónicos (por ejemplo, JAGUARMR C 162 [cloruro de hidroxipropil-guar-hidroxipropiltrimonio] ) , silicatos de aluminio y magnesio modificados (por ejemplo, cuatemiom-18-hectorita, que está comercialmente disponible (por ejemplo, BENTONENR 38; Rheox) , y/o hectorita de estearalconio, que está comercialmente disponible (por ejemplo, S0FTISA MR gel; Hüls AG) encuentran uso en algunas composiciones de cuidado personal de la presente invención. Sin embargo, no se proponen que la presente invención se limite a ningún polímero catiónico particular. En algunas modalidades aún adicionales, algunas composiciones de la presente invención comprenden todos los espesadores a fin de mejorar las propiedades táctiles de las emulsiones. Los espesadores de aceite, preferidos, incluyen, pero no se limitan a otros sólidos (por ejemplo, óxidos de silicio hidrófobos del tipo AEROSIL , que están disponibles de Degussa AG) . Los ejemplos de grados ventajosos de óxido de AEROSILMR incluyen AEROSILMR OX50, AEROSILMR 130, AEROSILMR 150, AEROSILMR 200, AEROSILMR 300, AEROSILM 380, AEROSILMR MOX 80, AEROSILMR MOX 170, AEROSILMR COK 84, AEROSILMR R 202, AER0SILMR R 805, AEROSILMR R 812, AEROSILMR R 972, AEROSILMR D R974 y AEROSILMR R976.

En algunas modalidades adicionales, algunas composiciones de cuidado personal de la presente invención comprenden al menos un "jabón metálico" es decir, una sal de un ácido graso superior, con la excepción de la sal metálica alcalina, que funcionan como espesadores de aceite. Los ejemplos de estos jabones metálicos incluyen, pero no se limitan a estearato de aluminio, estearato de zinc y/o estearato de magnesio.

Una variedad de agentes tensioactivos aniónicos también son útiles en la presente (ver, ejemplo, Patente de los estados unidos No. 3,929,678). Los agentes tensioactivos aniónicos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a isetionatos de alcoilo (por ejemplo, de C12 - C30) , sulfatos de alquilo y de alquil-éter y sales de los mismos, fosfatos de alquilo y alquil-éter y sales de los mismos, tauratos de alquil-metilo (por ejemplo, de C12 - C30) , y jabones (por ejemplo, sales de metales alcalinos y alquilamina sustituida, por ejemplo, sales de sodio o potasio) de ácidos grasos.

Los agentes tensioactivos anfotéricos y zwiteriónicos también son útiles en la presente. Los ejemplos de agentes tensioactivos anfotéricos y zwiteriónicos preferidos que encuentran uso en las composiciones de la presente invención son aquellos que se describen ampliamente como derivados de aminas terciarias y secundarias alifáticas en las cuales el radical alifático puede ser de cadena recta o ramificada y en donde uno de los sustituyentes alifáticos contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 22 átomos de carbono (de manera preferente de C8 - C18) y uno contiene un grupo solubilizador de agua aniónico (por ejemplo, carboxi, sulfonato, sulfato, fosfato, o fosfonato) . Los ejemplos, incluyen pero no se limitan a acetatos de alquil- imino de iminodialcanoatos y aminoalcanoatos , derivados de imidazolinio y amonio. Otros agentes tensioactivos anfotéricos y zwiteriónicos adecuados son aquellos seleccionados del grupo que consiste de betainas, sultainas, hidroxisultainas , y sarcosinatos de alcanoilo ramificados y no ramificados, y mezclas de los mismos.

En algunas modalidades adicionales, algunas composiciones de cuidado personal comprenden al menos un agente tensioactivo anfotérico y/o zwiteriónico (por ejemplo, cocamidopropilbetaina) y/o humectante (por ejemplo betaína) . Los ejemplos de agentes tensioactivos anfotéricos que encuentran uso en estas modalidades de la presente invención incluyen pero no se limitan a acil/dialquiletilendiamina (por ejemplo, acilamfoacetato de sodio) , acilamfodipropionato de disodio, alquilamfodiacetato de disodio, acilamfohidroxipropilsulfonato de sodio, acilamfodiacetato de disodio, acilamfopropionato de sodio, N-alquilamino-ácidos , por ejemplo aminopropilalquilglutamida, ácido alquilaminopropiónico, alquilimidodipropionato de sodio, y lauroamfocarboxiglicinato .

En algunas modalidades, la cantidad de sustancias activas en la superficie o en la entrecara (uno o más compuestos) en las preparaciones está de manera preferente entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 30 % en peso, y de manera más preferente entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 20 % en peso, entre de manera más preferente de aproximadamente 1 y aproximadamente 10 % en peso, en base al peso total de la preparación.

En algunas modalidades aún adicionales, los ingredientes activos (uno o más compuestos) comprenden al menos un ingrediente activo lipófilo. En algunas modalidades, estos ingredientes activos lipófilos se seleccionan del grupo que consiste de ácido acetilsalicílico, atropina, azuleno, hidrocortisona y derivados de los mismos (por ejemplo, hidrocortisona-17 -valerato) , vitaminas B, vitaminas D, vitamina Bi, vitamina B12l vitamina D1( retinoide, bisabolol, ácidos grasos insaturados (por ejemplo, los ácidos grasos esenciales también referidos frecuentemente como "vitamina F" ) , ácido ?-linolénico, ácido oleico, ácido eicosapentenoico, ácido docosahexenoico y derivados de los mismos, cloranfenicol , cafeína, prostaglandinas , timol, canfor, extractos u otros productos de origen vegetal y animal (por ejemplo aceite de hierba de asno, aceite de borraja o aceite de grosella, aceites de pescado, aceite de hígado de bacalao) , y ceramidas y compuestos tipo ceramida, etc. En algunas modalidades, los ingredientes activos son sustancias de relleno (por ejemplo, aceite de purcelina, EUCERITMR y/o NEROCERITMR) .

En modalidades adicionales, algunas emulsiones de la presente invención incluyen un agente tensioactivo o emulsionante que contiene silicón. Una amplia variedad de emulsionantes de silicón encuentran uso en la presente. Estos emulsionantes de silicón son típicamente organopolisiloxanos orgánicamente modificados, también conocidos por los expertos en la técnica como agentes tensioactivos de silicón. Los emulsionantes de silicón útiles incluyen, pero no se limitan a dimeticona-copolioles . Estos materiales son polidimetil-siloxanos que se han modificado para incluir cadenas laterales de poliéter , tal como cadenas de óxido de polietileno, cadenas de óxido de polipropileno, mezclas de estas cadenas y cadenas de poliéter que contienen porciones derivadas tanto de óxido de etileno como óxido de propileno. Otros ejemplos incluyen dimeticona-copolioles modificados con alquilo (por ejemplo, compuestos que contienen cadenas laterales colgantes de C2-C30) . Aún otros dimeticona-copolioles útiles incluyen materiales que tienen varias porciones colgantes catiónicas, aniónicas, anfotéricas y zwiteriónicas .

En algunas modalidades, las composiciones de la presente invención comprenden al menos un agente espesante polimérico. Los agentes espesantes poliméricos útiles en la presente tienen de manera preferente un peso molecular promedio en número mayor de aproximadamente 20,000, de manera más preferente mayor de aproximadamente 50,000, y de manera más preferente mayor de aproximadamente 100,000. En algunas modalidades, las composiciones de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 10 %, de manera preferente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 8 % y de manera más preferente de aproximadamente 0.2 % a aproximadamente 5 % en peso de la composición del agente espesante polimérico o mezclas del mismo .

Los agentes espesantes poliméricos preferidos para el uso en la presente incluyen, pero no se limitan a agentes espesantes no iónicos y agentes espesantes aniónicos o mezclas de los mismos. Los agentes espesantes no iónicos adecuados incluyen, pero no limitan a polímeros de poliacrilamida, poli (N-vinilpirrolidonas) , reticuladas, polisacáridos , gomas naturales o sintéticas, polivinilpirrolidona y alcohol polivinílico . Los agentes espesantes aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a copolímeros de ácido acrílico/acrilato de etilo, polímeros 5 decarboxivinilo y copolímeros reticulados de alquil-vinil- éteres y anhídrido maleico. Los espesadores comercialmente disponibles (por ejemplo, Carbopol; Noveon) encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. Las resinas de Carbopol adecuadas se pueden modificar de manera hidrófoba, y 10 otras resinas adecuadas se describen en O98/22085, o mezclas de las mimas .

En algunas modalidades de la presente invención, la fase de agua tiene un carácter de gel que, además de un contenido efectivo de compuestos y solventes (como sea 15 apropiado) comprenden de manera preferente agua, espesadores orgánicos y/o inorgánicos adicionales, y/o hidrocoloides .

En algunas modalidades, los espesadores inorgánicos se seleccionan del grupo que consiste de filosilicatos modificados, no modificados, que se presentan de manera 20 natural y sintéticos. Aunque en general es preferible usar componentes puros, en algunas modalidades, las mezclas de :.·.·¦.·¦ diferentes filosilicatos modificados y/o no modificados encuentra uso en las varias composiciones de la presente invención. Como se conoce en general en la técnica, los 25 filosilicatos son silicatos y aluminosilicatos en los cuales las unidades de silicato o aluminato se enlazan conjuntamente mediante tres enlaces de Si-O- o Al-O- y forman una estructura de capa u hoja ondulada. La cuarta valencia de Si-0- o Al-O- se satura por cationes. Las interacciones electrostáticas relativamente débiles (por ejemplo enlaces de puente de hidrógeno), existen entre las capas individuales. La estructura de capa se define en su mayor parte enlaces covalentes fuertes. La estequiometría de los silicatos de hoja es (Si2052~) para estructuras de silicato puro y (AlmSi2" m05(2+m)") para alumosilicatos , donde "m" es un número mayor de cero y menor de 2. En algunas modalidades en las cuales están presentes alumosilicatos en la ausencia de silicatos puros, cada grupo Si4+ reemplazado por Al3+ requiere otro catión individualmente cargado para neutralizar la carga. El balance de carga se empareja de manera preferente por H+, iones de metales alcalinos o iones de metales alcalinotérreos . En modalidades alternativas, se usa aluminio como un contra- ión. En contraste a los aluminosilicatos , estos compuestos se refieren, "silicatos de aluminio" . Los "alumosilicatos de aluminio" en los cuales está presente aluminio tanto en la red de silicato y también como un contra-ión, también encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención .

En la técnicas son bien conocidos los filosilicatos (ver por ejemplo, Hollemann et al., Lehrbuch der Anorqanischen Chemie [Textbook of Inorganic Chemistry] , 91 st-100th Ed., alter de Gruyter - Verlag

[1985]; Remy, Lehrbuch der Anorqanischen Chemie, 12th Ed. , Akademische Verlagsgesellschaft , Leipzig

[1965] ) . La estructura de capa de la montmorillonita también se conoce (ver, Rómpps Chemie-Lexikon, Franckh 1 sche Verlagshandlung, W. Keller & Co., Stuttgart, 8th Ed.,

[1985], p. 2668 f) . Los ejemplos de filosilicatos incluyen lo siguiente (la montmorillonita es el mineral principal que comprende las bentonitas que se presentan de forma natural) ; Montmorillonita Na0.33 ( (Al1.e7Mgo.33) (OH) 2 (Si4Oi0) ) simplificado a menudo: Al203*4Si02*H20*nH20 o Al2 [ (OH) 2/Si4Oi0] ·? H20 Kaolinita Al2 (OH) 4 (Si205) Hita (K,H30)y(Mg3(OH)2(SÍ4-yAlyOio) ) o (K, H30) y (AI2 (OH) 2 (Si4-yAlyO10) ) donde y = 0.7 - 0.9 Beidelita (Ca,Na) 0.3 (Al2 (OH) 2 (Al0.sSi3.5Oi0) ) Nontronita Na0.33 (Fe2 (OH) 2 (Alo.33Si3.e7/O10) ) Saponita (Ca, Na) 0.33 ( (Mg, Fe) 3 (OH) 2 (Alo.33Si3.67O10) ) Hectorita Na0.33 ( (Mg, Li) 3 (OH, F) 2 (Si4O10) ) En algunas modalidades preferidas, los formadores de geles inorgánicos que incluyen pero no se limitan a silicatos de aluminio, tal como las montmorillonitas (bentonitas, hectoritas y derivados de las mismas, tal como quaternio-18-bentonita, quaternio- 18 -hectoritas , bentonitas de estearalconio y hectoritas de estearalconio) , y también silicatos de magnesio-aluminio (grados VEEGUMMR) , y silicatos de sodio-magnesio (grados LAP0NITEMR) encuentran uso en la presente invención.

Las montmorillonitas representan minerales de arcilla que son un tipo de esmectitas dioctahédricas , y son masas que se hinchan en el agua, pero no llegan a ser plásticas . Los paquetes de capas en la estructura de tres capas de las montmorillonitas pueden hincharse como resultado de la incorporación reversible de agua (en una cantidad de 2 a 7 veces) y otras sustancias tal como por ejemplo, alcoholes, glicoles, piridina, picolina, compuestos de amonio, iones de hidroxi-aluminosilicato etc. La fórmula química dada anteriormente proporciona sólo una aproximación de la fórmula, puesto que las montmorillonitas tienen una gran capacidad para intercambio iónico. Por ejemplo, Al se puede reemplazar por Mg, Fe2+, Fe3+, Zn, Pb (por ejemplo, de sustancias peligrosas en aguas residuales) , Cr, Cu y otros elementos. La carga negativa resultante de las capas octahédricas se compensa por la presencia de cationes, en particular Na+ (es decir, montmorillonita sódica) y Ca2† (es decir, montmorillonita cálcica, un compuesto que sólo se puede hinchar a muy poco grado) en las posiciones entre las capas.

En modalidades alternativas, los silicatos de magnesio sintéticos y/o las bentonitas encuentran uso en la presente invención, incluyendo pero no limitado a compuestos comercialmente disponibles tal como OPTIGELMR (Süd-Chemie) . Como se indica anteriormente, en algunas modalidades, los silicatos de aluminio tal como el VEEGU MR comercialmente disponible (RT. Vanderbilt Comp., Inc) , encuentran uso en la presente invención. Varios grados de VEEGUMMR que encuentran uso en las varias modalidades de la presente invención se proporcionan más adelante.

Grados de VEEGUM Los productos anteriores se hinchan en agua para formar geles viscosos, que tienen una reacción alcalina. La organofilización de móntmorillonita o bentonitas (intercambio de los cationes de entre capa por cationes de alquilamonio cuaternarios) produce productos (bentonas) que se usan de manera preferente para dispersión en solventes orgánicos y aceites, grasas, ungüentos, tintas, revestimientos superficiales y en detergentes.

BENTONEMR es una marca comercial para varios agentes formadores de gel, neutrales y químicamente inertes que se construyen de sales de amonio, orgánicas, de cadena larga y tipos específicos de montmorillonita. Los agentes formadores de gel BENTONEMR se hinchan en medios orgánicos, que provoca que también se hinchen los medios. Los geles son resistentes a ácidos y álcalis diluidos, aunque parcialmente pierden sus propiedades de formación de gel en el contacto prolongado con ácidos fuertes y álcalis. Debido a su carácter organofílico, los agentes formadores de gel BENT0NEMR sólo son humectables por agua con dificultad. Hay varios grados de agentes formadores de gel BENTONEMR, comercialmente disponibles, incluyendo aquellos vendidos por Kronos Titán: BENTONER 27, una montmorillonita orgánicamente modificada; BENTONEMR 34 (bentonita de dimetildioctilamonio ; preparada de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos No. 2,531,427, incorporada en la presente como referencia, que debido a sus grupos lipófilos, se hinchan más rápidamente en medio lipófilo que en agua); BENTONEMR 38, una montmorillonita orgánicamente modificada, disponible como un polvo color crema a blanco; BENT0NEMR LT, un mineral purificado de arcilla; BENTONEMR Gel MIO, una montmorillonita orgánicamente modificada que se suministra como una suspensión muy fina en aceite mineral (SUS-71) (10 % de bentonita, 86.7 % de aceite mineral y 3.3 % de agente humectante) ; BENTONEMR Gel IPM, una bentonita orgánicamente modificada que se suspende en miristato de isopropilo (10 % de bentonita, 86.7 % de isopropilmiristato, 3.3 % de agente humectante) ; BENTONEMR Gel CAO, una montmorillonita orgánicamente modificada que se toma en aceite de resino (10 % de bentonita, 86.7 % de aceite de resina y 3.3 % de agente humectante); BENTONEMR Gel Lantrol, una montmorillonita orgánicamente modificada que, en forma de pasta, se propone para el procesamiento adicional, en particular para la preparación de composiciones cosméticas; 10 % de bentonita, 64.9 LA TROLMR (aceite de cera de lana), 22.0 de miristato de isopropilo, 3.0 de agente humectante y 0.1 de propil-p-hidroxibenzoato; BENTONEMR Gel Lan I, una pasta de BENTONEMR 27 al 10 % de concentración en una mezcla de cera de lana USP y palmitato de isopropilo; BENT0NEMR Gel Lan II, una pasta de bentonita en cera de lana, líquida, pura; Gel BENTONEMR NV, una pasta de BENTONEMR 27 al 15 % de concentración en dibutil-ftalato; BENTONEMR Gel OMS, una pasta de bentonita en Shellsol T.; BENTONEMR Gel OMS 25, una pasta de bentonita en hidrocarburos isoparafínicos (IDOPAR® H) ; y BENTONEMR Gel IPP, una pasta de bentonita en palmitato de isopropilo.

"Hidrocoloide" es la abreviación tecnológica para el nombre más correcto "coloide hidrófilo" . Los hidrocoloides son macromoléculas que tienen una estructura bastante lineal y fuerzas intramoleculares de interacción que permiten enlaces de valencia secundarios y primarios entre las moléculas individuales para formar una estructura reticular. Algunos hidrocoloides son polímeros naturales o sintéticos solubles en agua que, en sistemas acuosos, forman geles o soluciones viscosas. Estos compuestos incrementan la viscosidad de agua ya sea por unión de moléculas de agua (hidratación) , o al absorber y encapsular el agua en sus macromoléculas entrete idas, en tanto que restringe la movilidad del agua. Estos polímeros solubles en agua representan un gran grupo de polímeros naturales y sintéticos que son químicamente muy diferentes, pero que comparten una característica común en su solubilidad y en medios acuosos o en agua. Un pre-requisito para esto es que estos polímeros tengan varios grupos hidrófilos suficientes para la solubilidad en agua y no estén en su mayor parte reticulados. Estos grupos hidrófilos pueden ser de naturaleza no iónica, aniónica o catiónica; por ejemplo, como sigue: — NH2 — COOH — COO * M+ — NR2 I — NH-R O — S03 " M+ (CH2)n —OH — NH—C— NH2 —PO3" M2+ SO3" — CH=N O En algunas modalidades preferidas, el grupo de hidrocoloides cosmética y dermatológicamente pertinente se divide en los siguientes grupos : compuestos naturales orgánicos (por ejemplo, agar agar, carragenina, tragacanto, goma arábiga, alginatos, pectinas, poliosas, harina de guar, harina de algarrobo, almidón, dextrinas, gelatinas, y caseína) ; sustancias naturales orgánicas modificadas (por ejemplo, carboximetilcelulosa y otros celulosa-éteres, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilcelulosa y celulosa microcristalina) ; compuestos orgánicos completamente sintéticos (por ejemplo, compuestos poliacrílicos y polimetacrílicos , polímeros de vinilo, ácidos policarboxílieos , poliéteres, poliiminas, poliamidas y poliuretanos ) ; y compuestos inorgánicos (por ejemplo, ácidos polisilleícos , minerales de arcilla, tal como montmorillonitas , zeolitas, y sílices).

En modalidades alternativas, las etilcelulosas encuentran uso en composiciones de la presente invención como estabilizadores. Las cetilcelulosas se caracterizan por la siguiente estructura. En esta estructura, el Rs son ya sea grupos etilo o átomos de hidrógeno.

En algunas modalidades preferidas, el grado de etilación en la etilcelulosa es de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 3.0, que corresponde a aproximadamente 40 a aproximadamente 55 %, y de manera más preferente de aproximadamente 48.0 a aproximadamente 49.5 % de etilación. La masa molecular promedio se elige de manera preferente tal que la viscosidad de una solución de aproximadamente 5 % de concentración en una mezcla de 80 partes de tolueno y 20 partes de etanol a 25 °C es de 3 a 110 mPas, y de manera más preferente de 9 a 11 mPas . En algunas modalidades particularmente preferidas, la masa molar promedio es de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 400,000 g/mol . En algunas modalidades preferidas, la concentración de etilcelulosa en las composiciones de la presente invención varía de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 % en peso, en base al peso total de las preparaciones. Las varias cetilcelulosas encuentran uso en la presente invención, incluyendo pero no limitado a aquellas que están comercialmente disponibles (por ejemplo, ETHOCELMR Standard 10 Premium; Dow Chemicals) .

En aún modalidades adicionales, la celulosa microcristalina encuentra uso como hidrocoloide en composiciones de la presente invención. Varias preparaciones de celulosa microcristalina encuentran uso en la presente invención, incluyendo pero no limitado a aquellas que están comercialmente disponibles (por ejemplo, AVICELMR, tal como AVICELMR RC-591, así también como AVICELMR RC/CL; AVICELMR CE-15; y AVICELMR 500; FMC Corporation Food and Pharmaceutical Products) . En algunas modalidades particularmente preferidas, AVICELMR RC-591 (una celulosa microcristalina modificada que está constituida de 89 % de celulosa microcristalina y 11 % de carboximetilcelulosa sódica) encuentra uso en la presente invención .

Los hidrocoloides adicionales que encuentran uso en la presente invención incluyen metilcelulosas (es decir, metilésteres de celulosas) . Estos compuestos se caracterizan por la siguiente fórmula estructural en la cual R puede ser un hidrógeno o un grupo metilo.

Los éteres mezclados de celulosa (referidos en general como metilcelulosas, que contienen, además de un contenido predominante de grupos metilo, también grupos 2-hidroxietilo, 2-hidroxipropilo o 2-hidroxibutilo) también encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, las hidroxipropilmetil-celulosas (por ejemplo, METHOCELMR E4M; Dow Chemical Co . ) encuentran uso en la presente invención.

En aún modalidades adicionales, la carboximetilcelulosa sódica (es decir, la sal sódica del éter glicólico de celulosa, para el cual R en la fórmula estructural anterior puede ser hidrógeno y/o CH2-COONa) encuentran uso en la presente invención. En algunas modalidades preferidas, la carboximetilcelulosa sódica, referida también algunas veces como "goma de celulosa" (por ejemplo, NATROSOLMR Plus 330 CS; Aqualon) encuentra uso en la presente invención.

En modalidades adicionales, xantano (CAS No. 11138-66-2) , (es decir, goma de xantano) , un heteropolisacárido aniónico formado en general por fermentación de azúcar de maíz y aislado como sal de potasio encuentra uso en la presente invención. Se produce por Xanthomonas campestris y algunas otras especies bajo condiciones aeróbicas y tiene un peso molecular de 2x10s a 24xlOe. Se forma xantano a partir de una cadena que tiene celulosa con cadenas laterales. La estructura de los subgrupos consiste de glucosa, mañosa, ácido glucurónico, acetato y piruvato. El número de unidades de piruvato determina la viscosidad del xantano.

En aún modalidades adicionales, se usa carragenina como un formador de gel en composiciones de la presente invención. Este compuesto es un extracto de las algas rojas del Norte del Atlántico (Florideae; Chondrus crispus y Gigartina stellata) que tiene una estructura similar a aquella del agar. El término "carragenina" se usa frecuentemente en referencia a un producto seco de algas y "carragenano" se usa en referencia al extracto del mismo. La carragenina precipitada del extracto en agua caliente de las algas es un polvo incoloro o de color arena con un intervalo de peso molecular de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 800,000 y un contenido de sulfato de aproximadamente 25 %. La carragenina, que es muy fácilmente soluble en agua caliente, forma un gel tixotrópico en el enfriamiento, aún si el contenido de agua es de 95-98 %. La rigidez del gel se afecta por la estructura de doble hélice de la carragenina.

En el caso de carrgenano, se diferencian tres constituyentes principales. La "fracción ?" formadora de gel consiste de 4-sulfato de D-galactosa y 3 , 6 -anhidro-a-D-galactosa, que tiene enlaces alternos de glicósido en la 1,3- y 1,4 prosecución (en contraste, el agar contiene 3,6-anhidro-a-L-galactosa) . La "fracción ?" no formadora de gel está compuesta de 2-sulfato de D-galactosa enlazado 1,3-glicosídicamente y radicales de D-galactosa-2 , 6-disulfato 1, -unidos y es fácilmente soluble en agua fría. Finalmente, "i-carragenano" , compuesto de 4-sulfato de D-galactosa en enlace 1,3 y 3 , 6-anhidro-a-D-galactosa-2-sulfato en enlace 1,4, ambos son solubles en agua y también formadores de gel. La naturaleza de cualquier catión que esté presente (K+, NH4+, Na+, Mg2+, Ca+) también tiene influencia en la solubilidad de las carrageninas .

En aún modalidades adicionales, el quitosano (es decir, quitina parcialmente desacilada) se encuentra uso en varias composiciones de la presente invención. El quitosano tiene propiedades formadoras de película y se caracteriza por tener una sensación sedosa en la piel. Una desventaja para algunos usos, es su severa pegajosidad en la piel y se presenta temporalmente (usualmente) durante la aplicación. Debido a . su pegajosidad, algunas preparaciones no son aceptables a los consumidores. Sin' embargo, el quitosan encuentra uso en algunas preparaciones, incluyendo composiciones de cuidado de pelo, puesto que es mejor que la quitina en espesar y/o estabilizar, así como en mejorar la adhesión y resistencia a agua de películas poliméricas. El uso de quitosan es bien conocido por los expertos en la técnica de cuidado personal (ver por ejemplo, Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, [Lexikon of auxiliarles for pharmacy, cosmetics and related fields] , 3rd edition, Editio Cantor, Aulendorf ,

[1989] , p. 293) . El quitosan se caracteriza por la siguiente fórmula estructural: donde n asume valores hasta aproximadamente 10 000, y X es ya sea el radical acetilo o hidrógeno. El quitosan se forma por desacetilación y despolimerización parcial (hidrólisis) de quitina, que se caracteriza por la fórmula estructural La quitina es un constituyente esencial del ectoesqueleto de los artrópodos (por ejemplo insectos, cangrejos y arañas), y también se encuentra en los tejidos conectivos y/o de soporte de otros organismos (por ejemplo moluscos, algas y hongos) . En la región de aproximadamente pH <6, el quitosan está positivamente cargado y en ese intervalo también soluble en sistemas acuosos. Es incompatible con primas materias primas aniónicas . Por esta razón, a fin de preparar emulsiones de aceite en agua que contienen quitosan, es apropiado el uso de emulsionantes no iónicos (ver, por ejemplo, EP 776657) . En algunas modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención contienen al menos unos quitosanes con un grado de desacetilación de al menos aproximadamente > 25 %, de manera más preferente, un intervalo de más de aproximadamente 55 a aproximadamente 99 % (como se determina por medio de RMN-1H) . En algunas modalidades, los quitosanes de pesos moleculares entre aproximadamente 10,000 y aproximadamente 1,000,000, en particular aquellos con pesos moleculares entre 100,000 y 1,000,000 (determinado por medio de cromatografía de permeación en gel) encuentran uso en la presente invención.

En aún modalidades adicionales, los poliacrilatos encuentran uso como agentes formadores de gel en algunas composiciones de la presente invención. Los poliacrilatos adecuados incluyen, pero no se limitan a copolímeros de acrilato-acrilato de alquilo, en particular aquellos elegidos del grupo de carbómeros o copolímeros CARBOPOLMR (B. F. Goodrich Co . ) . En particular, los polímeros de acrilato- acrilato de alquilo encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención tiene la siguiente estructura: donde R' es un radical alquilo de cadena larga, y x e y representan números que simbolizan la proporción estequiométrica respectiva de cada uno de los comonomeros.

En algunas modalidades, los copolímeros de acrilato y/o los copolímeros de acrilato-acrilato de alquilo, incluyen, pero no se limitan a aquellos que están comercialmente disponibles (por ejemplo, CARB0P0LMR 1382, CARB0P0LMR 981, y CARB0P0LMR 5984; B. F. Goodrich Co., y en particular, poliacrilatos del grupo de CARBOPOL grados 980, 981, 1382, 2984, 5984 y Carbomero 2001). En modalidades adicionales, los copolímeros de acrilatos de C10-30 alquilo y uno o más monómeros de ácido acrílico, de ácido metacrílico o ásteres de los mismos que se reticulan con un éter alílico de sacarosa o un éter alílico de pentaeritritol encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención.

Los compuestos que tienen el nombre INCI "polímero entrelazado de Acrilatos/Acrilato de Ci0-3o" encuentran también uso en algunas modalidades de la presente invención. En algunas modalidades, los polímeros comercialmente disponibles (por ejemplo, PEMULENMR TR1 y PEMULENMR TR2 ; B. F. Goodrich Co.) encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención, aunque no se propone que la presente invención se limite a ninguna composición específica que contenga acrilato .

En aún modalidades adicionales, los compuestos que tienen el nombre INCI "copolímeros de acriloildimetiltauratos de amonio/vinilpirrolidona" encuentran uso en la presente invención. Estos copolímeros de acriloildimetiltaurato de amonio/vinilpirrolidona tiene la fórmula empírica [C7H16 2S04] n [C6H9NO]m, que corresponde a la siguientes estructura: Las especies preferidas de este compuesto se listan en el Chemical Abstracts bajo los números de registro 58374- 69-9, 13162-05-5 y 88-12-0, y están comercialmente disponibles (por ejemplo, ARISTOFLEXMR; Clariant GmbH) . Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a ninguna especie particular. En aún modalidades adicionales de la presente invención, los copolímeros/polímeros entrelazados que comprenden taurato de acriloildimetilo (por ejemplo, SIMUGELM EG y SIMUGELMR EG; Seppic S.A.) encuentran uso en algunas composiciones de la presente invención.

Los hidrocoloides completamente sintéticos, adicionales, que encuentran uso en la presente invención incluyen pero no se limitan a poliuretanos aniónicos que son solubles o dispersables en agua y que se pueden obtener de manera ventajosa de: Aa) al menos un compuesto que contiene dos o más átomos de hidrógeno activos por molécula, Ab) al menos un diol que contiene grupos de sal o de ácido, y Ac) al menos un diisocianato .

En algunas modalidades preferidas, el componente Aa) es, en particular, un diol, aminoalcohol , diamina, poliesterol, polieterol con un peso molecular promedio en número en cada caso de hasta 3000, o mezclas de los mismos, en donde hasta 3 % en mol de estos compuestos se puede reemplazar por trioles o triaminas . Se da preferencia a dioles y poliesterdiole . En particular, el componente Aa) comprende al menos 50 % en peso, en base al peso total del componente Aa) , de un poliesterdiol . Los poliesterdioles adecuados son todos aquellos que se usan habitualmente para la preparación de poliuretanos , en particular los productos de reacción de ácido pfálico y dietilenglicol, ácido isoftálico y 1,4-butanodiol, ácido isoftálico/ácido adípico y 1, 6-hexanodiol, y ácido adípico y etilenglicol o 5-NaS03-ácido isoftálico, ácido ftálico, ácido adípico, y 1,6-hexanodiol .

Los ejemplos de dioles que encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención incluyen, pero no se limitan a etilenglicol, propilenglicol , butilenglicol , neopentilglicol, polieteroles (por ejemplo, polietilenoglicoles qué tienen pesos moleculares de hasta 3000) , copolímeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno con pesos moleculares promedio en número de hasta 3000, y copolímeros de bloque de óxido de etileno, óxido de propileno y óxido de butileno que contienen las unidades de óxido de etileno copolimerizadas de una manera aleatoriamente distribuida o en la forma de bloques. Se da preferencia a etilenglicol, neopentilglicol, di-, tri-, tetra-, penta- o hexa-etilenglicol . Otros dioles que encuentran uso incluyen poli (ácido -hidroxicarboxílico) dioles .

Los aminoalcoholes adecuados que encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención incluyen pero no se limitan a 2 -aminoetanol , 2 - (N-metilamino) etanol , 3-aminopropanol , y 4 -aminobutanol .

En algunas modalidades, las diaminas tal como etilendiamina, propilendiamina, 1 , 4 -diaminobutano, 1,6-diaminohexano, y a, ?-diaminas que se pueden preparar por aminación de óxidos de polialquileno con amoníaco encuentran uso en algunas composiciones de la presente invención.

El componente Ab) es, en particular, ácido dimetilolpropanoico o un compuesto con la fórmula: donde RR es en cada caso un grupo C2-Ci8-alquileno y Me es Na o K.

El componente Ac) es, en particular, diisocianato de hexametileno, diisocianato de isoforona, isocianato de metildifenilo (MDI) , y/o diisocianato de tolileno.

En algunas modalidades, los poliuretanos se obtienen al hacer reaccionar los compuestos de los grupos Aa) y Ab) bajo una atmósfera de gas inerte en un solvente inerte a temperaturas de 70 a 130°C con los compuestos del grupo Ac) . Esta reacción se puede llevar a cabo, donde es apropiado, en la presencia de extendedores de cadena a fin de preparar poliuretanos con pesos moleculares relativamente altos. Como es habitual en la preparación de poliuretanos, los componentes [(Aa)+(Ab)] :Ac se usan de manera ventajosa en la relación molar de 0.8 a 1.1:1. El índice de acidez de los poliuretanos se determina por la composición y la concentración de los compuestos del componente (Ab) en la mezcla de componentes (Aa) y (Ab) .

En algunas modalidades, los poliuretanos tienen valores K de acuerdo a H. Fikentscher (determinado en soluciones al 0.1 % de concentración en peso en N-metilpirrolidona a 25 °C y pH 7) de aproximadamente 15 a aproximadamente 100, de manera preferente aproximadamente 25 a aproximadamente 50. El valor K (es decir, "viscosidad intrínseca" ) , es un parámetro que se va a determinar fácilmente por medio de mediciones de viscosidad de soluciones de polímero y por lo tanto se usa frecuentemente en el sector industrial para caracterizar polímeros. Los poliuretanos que contienen grupos ácidos que encuentran uso en unas modalidades de la presente invención incluyen, pero no se limitan a poliuretanos que son solubles en agua o dispersables en agua sin la ayuda de emulsionantes después de neutralización parcial o completa. Las sales de los poliuretanos tienen en general mejor solubilidad o dispersabilidad en agua que los poliuretanos no neutralizados. Las bases que encuentran uso para la neutralización de los poliuretanos incluyen bases de metales alcalinos (por ejemplo, solución de hidróxido de sodio, solución de hidróxido de potasio, sosa, y carbonato ácido de sodio, carbonato de potasio o carbonato ácido de potasio) y bases de metales alcalinotérreos (por ejemplo, hidróxido de calcio, óxido de calcio, hidróxido de magnesio o carbonato de magnesio, y aminoácido, y aminas) . En algunas modalidades, 2-amino-2-metilpropanol , dietilaminopropilamina y triisoproanolamina encuentran uso particular en la neutralización de los poliuretanos que contienen grupos ácidos. En aún modalidades adicionales, la neutralización de los poliuretanos que contienen grupos ácidos se lleva a cabo usando mezclas de dos o más bases, por ejemplo, mezclas de solución de hidróxido de sodio y triisopropanolamina) . Dependiendo del uso propuesto, la neutralización es parcial (por ejemplo aproximadamente 20 a aproximadamente 40 %) o completo (es decir, 100 %) . Estos polímeros y su preparación se describen en más detalle en DE-A-42 25 045, incorporado en la presente por referencia.

B. Poliureas y poliuretanos catiónicos dispersable o solubles en agua, de: Ba) al menos un diisocianato, que puede haber sido hecho reaccionar ya de antemano con uno o más compuestos que contienen dos o más átomos de hidrógeno activos por molécula, y Bb) al menos un diol, amino alcohol, primario o secundario, diamina primaria o secundario o triamina primaria o secundaria o triamina primaria o secundaria con uno o más átomos de nitrógeno de amino terciario, cuaternario o terciario protonado.

Los diisocianatos preferidos son como se dan anteriormente bajo A) . Los compuestos con dos o más átomos de hidrógeno activos son dioles, aminoalcoholes , diaminas, polioesteroles , poliamidadiaminas y polieteroles . Los compuestos adecuados de este tipo son como se dan anteriormente bajo A) .

Los poliuretanos se preparan como se describe anteriormente bajo A) . Los grupos catiónicos cargados se pueden producir en las poliureas de los átomos de nitrógeno de aminoterciario presentes ya sea por protonación (por ejemplo, con ácidos carboxílicos, tal como ácido láctico) o por cuaternización (por ejemplo, con agentes de alquilación, tal como haluros de Ci a C4 -alquilo) o sulfatos . Los ejemplos de estos grupos de alquilación incluyen, pero no se limitan a cloruro de etilo, bromuro de etilo, bromuro de etilo, cloruro de metilo, bromuro de metilo, sulfato de dimetilo y sulfato de dietilo. Estos polímeros y su preparación se describen en más detalle en DE-A-4241118 , que se incorpora en la presente por referencia.

C. Poliuretanos lineales con grupos carboxilato de: Ca) un ácido carboxílico 2,'2-hidroximetil-sustituido de la fórmula en la cual RR' es un átomo de hidrógeno o un grupo Ci-C2o-alquilo, que se usa en una cantidad suficiente para que aproximadamente 0.35 a aproximadamente 2.25 miliequivalentes de grupos carboxilo esté presente en el poliuretano por g del poliuretano , Cb) de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 % en peso, en base al peso del poliuretano, de uno o más compuestos orgánicos con no más de dos átomos de hidrógeno activos; y Ce) uno o más diisocianatos orgánicos.

En algunas modalidades preferidas, los grupos carboxilo presentes en el poliuretano se neutralizan finamente, al menos parcialmente con una base adecuada. Estos , . polímeros y su preparación se describen en EP-A-619111, incorporado en la presente como referencia.

D. Productos de policondensación que contienen carboxilo de anhídridos de ácidos tri- o tetracarboxílico y dioles, diaminas o aminoalcoholes (poliésteres , poliamidas o poliéster-amida) . Estos polímeros y su preparación se describen en más detalle en DE-A-42 24 761, incorporada en la presente como referencia.

E. Poliacrilatos y polimetacrilatos , como se describen en más detalle en DE-A-43 14 305, 36 27 970 y 29 17 504, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia .

Los polímeros usados en algunas modalidades de la presente invención tienen un valor K de aproximadamente 15 a aproximadamente 100, y de manera más preferente de aproximadamente 25 a aproximadamente 50. Los polímeros están presentes en general en la composición en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 20 % en peso, en base al peso total de las composiciones. La sal se usa en una cantidad efectiva para mejorar la intercambialidad de los polímeros. La sal se usa en una cantidad de aproximadamente 0.02 a aproximadamente 10 % en peso, y de manera más preferente de aproximadamente 0.05 ato aproximadamente 5 % en peso, y en particular, de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 3 % en peso, en base al peso total de la composición.

La cantidad total de uno o más hidrocoloides en algunas modalidades de las composiciones de cuidado personal de la presente invención es menos de aproximadamente 5 % en peso, de manera preferente entre aproximadamente 0.05 y aproximadamente 3.0 % en peso, y de manera más preferente entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 1.0 % en peso, en base al peso total de las preparaciones.

En algunas modalidades, las presentes composiciones comprenden al menos una fase de aceite de silicón. Las fases de aceite de silicón comprenden en general de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 20 %, de manera preferente de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 10 %, y de manera más preferente de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 5 %, de 1¾ composición. La fase de aceite de silicón comprende de manera preferente uno o más componentes de silicón.

En algunas modalidades, los componentes de silicón son fluidos, que incluyen silicones de cadena recta, ramificada y cíclica. Los fluidos de silicón adecuados útiles en la presente incluyen silicones incluyendo fluidos de polialquil-siloxano, fluidos de poliaril-siloxano, polialquilsiloxano cíclicos y lineales, silicones polialcoxilados , silicones modificados de amino y amonio cuaternario, polialquilarilsiloxanos o un copolímero de poliéter-siloxano y mezclas de los mismos. Los fluidos de silicón volátiles, así como los no volátiles encuentran uso en la presente. En general los fluidos de silicón tienen un peso molecular promedio de menos de aproximadamente 200,000. En modalidades preferidas, los fluidos adecuados de silicón tienen un peso molecular de aproximadamente 100,000 o menos, de manera preferente de aproximadamente 50,000 o menos, y de manera más preferente de aproximadamente 10,000 o menos. De manera preferente el fluido de silicón se selecciona de fluidos de silicón que tienen un peso molecular promedio en peso en el intervalo de aproximadamente 100 a aproximadamente 50,000 y de manera preferente de aproximadamente 200 a aproximadamente 40,000. Típicamente, los fluidos de silicón tienen una viscosidad que varía de aproximadamente 0.65 a aproximadamente 600,000 mm2s"1, de manera preferente de aproximadamente 0.65 a aproximadamente 10,000 mn^.s"1 a 25°C. La viscosidad se puede medir por medio de un viscosímetro de capilaridad de vidrio como se expone en el método de prueba CTM0004 de Dow Corning Corporate, de 29 de Julio de 1970. Los polidimetil-siloxanos que se pueden usar en la presente incluyen comercialmente disponibles (por ejemplo, de la General Electric Company and Dow Corning) . También útiles son los polialquilarilsiloxanos esencialmente no volátiles, por ejemplo, polimetilfenilsiloxanos , que tienen viscosidades de aproximadamente 0.65 a 30,000 mms_1 a 25°C (General Electric Company o de Dow Corning) . Los polidimetilsiloxanos cíclicos adecuados para el uso en la presentes son aquellos que tienen una estructura de anillo que incorpora de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 siete porciones (CH3)2SiO, de manera preferente de aproximadamente 5 o más.

En modalidades adicionales, las gomas de silicón encuentran uso en la presente. En algunas modalidades preferidas, una fase de aceite de silicón comprende una goma de silicón o una mezcla de silicones que incluyen la goma de silicón. Típicamente, las gomas de silicón tienen una viscosidad a 25°C en exceso de aproximadamente 1,000,000 mm2s" 1. Las gomas de silicón incluyen dimeticonas como se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,152,416; y Noli, Chemistry y Technology of Silicones , Academic Press, Nueva York

[1968]) . Las gomas de silicón tal como aquellas descritas en las hojas de datos de producto de caucho de silicón de General Electric SE 30, SE 33, SE 54 y SE 76, también encuentran uso en la presente invención. Los ejemplos específicos de gomas de silicón incluyen polidimetilsiloxano, copolímero de (polidimetilsiloxano) - (metilvinilsiloxano) , copolímero de poli (dimetilsiloxano) (difenil) (metilvinil- siloxano) y mezclas de los mismos. Las gomas de silicón preferidas para el uso en la presente son gomas de silicón que tienen un peso molecular de aproximadamente 200,000 a aproximadamente 4,000,000 seleccionadas de dimeticonol, dimeticona-copoliol , dimeticona y mezclas de los mismos.

En algunas modalidades, una fase de silicón en la presente comprende de manera preferente una goma de silicón incorporada en la composición como parte de una mezcla de goma de silicón-fluido. Cuando la goma de silicón se incorpora como parte de una mezcla de goma de silicón- fluido, la goma de silicón constituye de manera preferente de aproximadamente 5 % a aproximadamente 40 %, especialmente de aproximadamente 10 % a 20 % en peso de la mezcla de goma de silicón-f luido . Las mezclas adecuadas de goma de silicón-fluido en la presente son mezclas que consisten esencialmente de: (i) un silicón que tiene un peso molecular de aproximadamente 200,000 a aproximadamente 4,000,000 seleccionado de dimeticonol, fluorosilicona y dimeticona y mezclas de los mismos; y (ii) un portador que es un fluido de silicón el portador que tiene una viscosidad de aproximadamente 0.65 mm2s"1 a aproximadamente 100 mm2s"1, en donde, la relación de i) a ii) es de aproximadamente 10:90 a aproximadamente 20:80 y en donde el componente basado en goma de silicón tiene una viscosidad final de aproximadamente 100 mn^s"1 a aproximadamente 100,000 mm2s"1, de manera preferente de 500 mm2s"1 a aproximadamente 10,000 mm2s""1.

Los componentes adicionales de silicón adecuados para el uso en una fase de aceite de silicón en la presente incluyen polímeros reticulados de poliorganosiloxano, opcionalmente dispersados en un portador fluido. En general, cuando están presentes los polímeros reticulados de poliorganosiloxano, conjuntamente con su portador (si está presente) comprenden de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 20 %, de manera preferente de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 10 %, y de manera más preferente de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 5 % de la composición. Estos polímeros comprenden polímeros de poliorganosiloxano reticulados por un agente reticulador (ver, por ejemplo, WO98/22085) . Los ejemplos de polímeros adecuados de poliorganosiloxano para el uso en la presente incluyen, pero no se limitan a metil-vinil-dimeticona, metil-vinil-difenil-dimeticona y metil-vinil-fenil-metil-difenil-dimeticona .

Otra clase de componentes de silicón adecuados para el uso en una fase de aceite de silicón incluye en la presente copolímeros de polidiorganosiloxano-polioxialquileno que contienen al menos un segmento de polidiorganosiloxano y al menos un segmento de polioxialquileno (ver por ejemplo, O98/22085) . Los copolímeros adecuados de polidiorganosiloxano-polialquileno están comercialmente disponibles bajo los nombres comerciales BELSILMR de Wacker-Chemie GmbH. Una mezcla de fluido de copolímero particularmente preferida para el uso en la presente incluye Dow Corning DC3225C que tiene la designación CTFA Dimeticona/Dimeticona-copoliol .

En modalidades adicionales, las composiciones de la presente invención comprenden un bloqueador de sol, orgánico. En algunas modalidades, los bloqueadores de sol adecuados tienen propiedades absorbedoras de UVA, en tanto que otras tienen propiedades absorbedoras de UVB, y aún otros comprenden una mezcla de los mismos. La cantidad exacta del componente activo de bloqueador de sol varía, dependiendo del Factor de Protección de Sol (es decir, el "SPF") deseado de la composición, así como del nivel deseado de protección de UV. El SPF es una medida comúnmente usada de fotoprotección de un bloqueador de sol contra eritema. El SPF se define como la relación de la energía ultravioleta requerida para producir eritema mínimo en la piel protegida a aquella requerida para producir la misma eritema mínima en piel no protegida en el mismo individuo. Las cantidades del bloqueador de sol usadas son de manera preferente de aproximadamente 2 % a aproximadamente 20 %, y de manera más preferente de aproximadamente 4 % a aproximadamente 14 %. Los bloqueadores de sol adecuados incluyen, pero no se limitan a aquellos aprobados para el uso en los Estados Unidos, Japón, Europa y Australia. Las composiciones de la presente invención comprenden de manera preferente un SPF de aproximadamente 2 a aproximadamente 30, de manera preferente aproximadamente 4 aproximadamente 30, y de manera más preferente aproximadamente 4 a aproximadamente 15.

En algunas modalidades, las composiciones de la presente invención comprenden uno o más ingredientes activos de bloqueador de sol, absorbedores de UVA que absorben radiación UV que tiene una longitud de onda de aproximadamente 320nm a aproximadamente 400nm. Los ingredientes activos adecuados de bloqueador de sol, absorbedores de UVA incluyen, pero no se limitan a derivados de dibenzoilmetano (ver por ejemplo, Lowe y Shaath (eds.), Sunscreens: Development, Evaluation, and Regulatory Aspects, Marcel Dekker, Inc.) derivados de antranilato tal como metilantranilato y homometilo, 1-N-acetilantranilato, y mezclas de los mismos. El ingrediente activo de bloqueador de sol absorbedor de UVA está preferentemente presente en una cantidad suficiente para proporcionar protección de UVA de espectro amplio ya sea de manera independiente, o en combinación con, otros ingredientes activos protectores de UV que pueden estar presentes en la composición.

Los ingredientes activos adecuados de bloqueadores de sol de UVA incluyen ingredientes activos de bloqueador de sol de dibenzoilmetano y sus derivados. Estos incluye, pero no se limitan a, aquellos seleccionados de 2-metildibenzoilmetano , 4 -metildibenzoilmetano, 4-isopropildibenzoilmetano, 4 - er-butildibenzoilmetano, 2,4-dimetildibenzoilmetano , 2 , 5 -dimetildibenzoilmetano , 4,4'-diisopropilbenzoilmetano, 4- (1, 1-dimetiletil) -4 ' -metoxidibenzoilmetano, 2-metil-5-isopropil-4 ' - metoxidibenzoilmetano, 2-metil-5-ter-butil-41 -metoxi-dibenzoilmetano, 2 , 4-diraetil- 1 -raetoxidibenzoilmetano, 2,6-dimetil-4 ' -ter-butil-4 ' -metoxidibenzoilmetano, y mezclas de los mismos. Los ingredientes activos de bloqueador de sol de dibenzoilo preferidos incluyen aquellos seleccionados de 4-(1, 1-dimetiletil) -41 -metoxidibenzoilmetano, 4-isopropildibenzo lmetano, y mezclas del mismo. Un ingrediente active preferido de bloqueador de sol es 4- (1, 1-dimetiletil) -4 ' -metoxidibenzoilmetano.

El ingrediente activo de bloqueador de sol 4- (1,1-dimetiletil ) -41 -metoxidibenzoilmetano , que también se conoce como butil-metoxidibenzoilmetano o "avobenzona" , Esta comercialmente disponible bajo los nombre de ParsolMR 1789 de Givaudan Roure (International) S. A., y EusolexMR 9020 de Merck & Co . , Inc. El bloqueador de sol 4-isopropildibenzoilmetano , que también se conoce como isopropildibenzoilmetano, está comercialmente disponible de Merck bajo el nombre de EusolexMR 8020.

En algunas modalidades, las composiciones de la presente invención incluyen además uno o más ingredientes activos de bloqueador de sol de UVB que absorben radiación UV que tienen una longitud de onda de aproximadamente 290 nm a aproximadamente 320 nm. Las composiciones comprenden una cantidad del ingrediente activo de bloqueador de sol de UVB que es segura y efectiva en promover la protección de UVB ya sea independientemente, o en combinación con, otros ingredientes activos protectores de UV que pueden estar presentes en las composiciones. Las composiciones comprenden de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 20 %, de manera preferente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 12 %, y de manera más preferente de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 8 % en peso, de cada bloqueador de sol, orgánico, absorbedor de UVB, o como se obligue por las autoridades regulatorias pertinentes.

Una variedad de ingredientes activos de bloqueador de sol de UVB son adecuados para el uso en la presente (Ver por ejemplo., Patente de los Estados Unidos No. 5,087,372; Patente de los Estados Unidos No. 5,073,371; Patente de los Estados Unidos No. 5,073,372; Patente de los Estados Unidos No. 4,937,370; y Patente de los Estados Unidos No. 4,999,186). Los ingredientes activos preferidos de bloqueador de sol de UVB se seleccionan de 2 -etilhexil-2-ciano-3 , 2-etilhexil-N, N-dimetil-p-aminobenzoato, ácido p-aminobenzoico, oxibenzona, salicitato de homomentilo, salicitato de octilo, , 41 metoxi- t-butildibenzoilmetano, 4-isopropil-dibenzoilmetano, 3 -benzilideno-canfor, 3- (4-metilbenzilideno) -canfor, 3 -difenilacrilato , ácido 2-fenil-benzimidazol-5-sulfónico (PBSA) , ásteres de cinamato y sus derivados tal como 2-etilhexil-p-metoxicinamato, ásteres de salicilato y sus derivados tal como salicilato de trietanolmina, salicilato de etilhexilo, ácido octildimetil-para-aminobenzoico, derivados de canfor y sus derivados, y mezclas de los mismos. Los ingredientes activos orgánicos preferidos de bloqueador de sol incluyen 2 -etilhexil-2-ciano-3 , 3 -difenilacrilato, ácido 2-fenil-bencimidazol-5-sulfónico (PBSA) , octil-p-metoxicinamato, y mezclas de los mismos. Las formas neutralizadas de sal y ácido de los bloqueadores de sol, ácidos. También son útiles en la presente.

De esta manera, en algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones que comprenden cualquier filtro orgánico de UV-A y UV-B, por ejemplo, pero no limitado a los siguientes: No. Compuesto CAS-No. (=Ácido) 1 Ácido 4 -Aminobenzoico 150-13-0 2 3- (4' -Trimetilamonio) -bencilidenbornan-2- 52793-97-2 on-metilsulfato 3 3,3, 5-Trimetil-ciclohexil-salicilato (Homosalato) 118-56-9 4 2-Hidroxi-4-metoxi-benzofenona (Qxibenzonio) 131-57-7 5 Ácido 2-fenilbencimidazol-5-sulfónico y sus sales 27503-81-7 de Calcio, Sodio y Trietanolamino 6 3 , 31 - (1, 4-fenilendimetin) -bis (ácido 7,7- 90457-82-2 dimetil-2-oxobiciclo [2.2.1] heptan-1- metansolfónico y sales del mismo o. Compuesto CAS-No. (=Ácido) 7 Éster polietoxi-etílico del ácido 4- 113010-52-9 bis (polietoxi) amino-benzoico 8 Éster 2-etilhexílico del ácido 4- 21245-02-3 dimetilamino-benzoico 9 Éster 2-etilhexílico del ácido salicílico 118-60-5 10 Éster 2-isoamílico del ácido 4-metoxi-cinámino 71617-10-2 11 Éster 2-etilhexílico del ácido 4-metoxi-cinámico 5466-77-3 12 Ácido 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenon-5-sulfónico 4065-45-6 (Sulisobenzonio) y la sal de sodio 13 3 - (4 ' -Sulfobenciliden) -bornan-2-ona y 58030-58-6 sales de la misma 14 3 -Bencilindebornan-2-ona 16087-24-8 15 1- (4' -Isopropilfenil) -3-fenilpropan-l, 3-diona 63260-25-9 16 4 -Isopropilbencilsalicitalo 94134-93-7 17 Ácido 3-imidazol-4-il-acrílico y su éster etílico 104-98-3 18 Éster etílico del ácido 2-ciano-3,3- 5232-99-5 difenilacrílico 19 Éster 2 ' -etilhexílico del ácido 2-Ciano- 6197-30-4 3 , 3 -difenilacrílico 20 Metil-o-aminobenzoato o: 5-metil-2- (1- 134-09-8 metiletil) -2-aminobenzoato Compuesto CAS-No. (=Ácido) Gliceril-p-aminobenzoato o: éster 1- 136-44-7 glicerllico del ácido 4 -aminobenoico 2,2' -dihidroxi-4-metoxibenzofenona 131-53-3 (Dioxibenzona) 2-Hidroxi-4-metoxi-4-metilbenzofenona (Mexenona) 1641-17-4 Trietañolamina-salicilato 2174-16-5 Ácido dimetoxifenilglioxílico o: 3,4- 4732-70-1 dimetoxi-fenil-glioxalato sódico 3- (4' -sulfobenciliden) -bornan-2-ona y sus sales 56039-58-8 4 -Ter-butil-4 ' -metoxi-dibenzoilmetano 70356-09-1 2,2' ,4,4' -Tetrahidroxibenzofenona 131-55-5 2,2' -Metilen-bis- [6- (2H-benzotriazol-2- 103597-45-1 il) -4 - (1,1,3, 3-tetrametilbutil) fenol] Ácido 2, 2' - (1,4-fenil) -bis-lH- 180898-37-7 bencimidazol-4 , 6-disulfónico, sal sódica 2,4-bis- [4- (2-Etilhexiloxi) -2-hidroxi] 187393-00-6 fenil-6- (4-metoxifenil) -(1,3,5) -triazina 3- (4 -Metilbenciliden) -canfor 36861-47-9 Éster polietoxietílico del ácido 4- 113010-52-9 bis (polietoxi) araaminobenzoico 2 , 4 -Dihidroxibenzofenona 131-56-6 No. Compuesto CAS-No. (=Ácido) 35 2,2' -Dihidroxi-4 , 4 ' -dimetoxibenzofenon- 3121-60-6 5 , 5 ' -sulfonado disódico 36 Ester hexílico 2- [4 - (dietilamino) -2- 302776-68-7 hidroxibenzoil] del ácido benzoico 37 2- (2H-Benzotriazol-2-il) -4-metil-6- [2- 155633-68-7 metil-3 - [1,3,3, 3 -tetrametil-1- [ ( trimetil- silil) oxi] disiloxanil] ropil] fenol 38 1,1- [(2,2' -Dimetilpropoxi) carbonil] -4,4- 363602-15-7 difenil-1, 3-butadieno En algunas modalidades, se adiciona al menos un agente a cualquiera de las composiciones útiles en la presente invención para estabilizar el bloqueador de sol de UVA para impedir la fotodegradación en la exposición a radiación UV y mantener de este modo su eficiencia de protección de UVA. Se reporta que una amplia variedad de compuestos tienen estas propiedades estabilizadoras y se debe elegir para complementar tanto el bloqueador de sol de UVA y la composición como una totalidad (Ver, por ejemplo. , Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,972,316; 5,968,485; 5,935,556; 5,827,508; y WO 00/06110). Los ejemplos preferidos de agentes estabilizadores para el uso en la presente invención incluyen 2-etilhexil-2-ciano-3 , 3 -difenilacrilato, etil-2-ciano-3 , 3 -difenilacrilato, 2-etilhexil-3 , 3-difenilacrilato, etil-3, 3-bis (4 -metoxifenil) acrilato, dietilhexil-2 , 6-naftalato y mezclas de los mismos (Symrise Chemical Company) .

En algunas modalidades preferidas, la presente invención proporciona preparaciones dermatológicas tópicas y/o cosméticas adecuadas para el uso como cremas de protección para la piel, leches limpiadoras, lociones bloqueadoras de sol, cremas nutritivas, cremas de día, cremas de noche, etc. En algunas modalidades, la presente invención encuentra uso en componentes de composiciones de fármacos (es decir, farmacéuticas) . En modalidades adicionales, la presente invención encuentra uso en cosméticos decorativos (por ejemplo, formulaciones de maquillaje) .

En algunas modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona bloqueadores de sol útiles en preparaciones cosméticas y/o de cuidado de la piel. Además del ingrediente activo usado de acuerdo a las modalidades de la- presente invención, en algunas modalidades, estas preparaciones comprenden de manera preferentemente adicional al menos un filtro de banda amplia y/o al menos una sustancia de filtro de UVA y/o al menos una sustancia de filtro de UVB y/o al menos un pigmento inorgánico.

En modalidades aún adicionales, la presente invención proporciona composiciones de cuidado personal que tienen componentes de protección de UV, pero que no son principalmente bloqueadores de sol. Por ejemplo, en algunas modalidades, las sustancias de filtro de UV-A y/o UV-B se incorporan en cremas en día y/o composiciones de cuidado de pelo .

En modalidades adicionales, las composiciones de cuidado personal de la presente invención comprenden ingredientes, auxiliares y/o aditivos cosméticamente activos, como se usan habitualmente en estas preparaciones (por ejemplo, antioxidantes, conservadores, bacteriocidas , perfumes, antiespumas, tintes, pigmentos que tienen una acción colorante, espesadores, sustancias activas en la superficie, emulsionantes, emolientes, humectantes y/o humectadores, grasas, aceites, ceras u otros constituyentes habituales de una formulación cosmética o dermatológica, tal como alcoholes, polioles, polímeros, estabilizadores de espuma, electrolitos, solventes orgánicos o derivados de silicón) . En realidad, se contempla que varios compuestos encontrarán uso en las varias modalidades de la presente invención, como sea apropiado para el producto y el usuario.

En algunas modalidades, se adiciona al menos un agente a cualquiera de las composiciones útiles en la presente invención para mejorar la sustantividad de la piel de estas composiciones, particularmente para mejorar su resistencia a ser lavadas por agua o enjuagadas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, copolímero de acrilatos/Ci2-22alquilmetacrtilato, copolímero de acrilato/acrilato, dimeticona, dimeticonol, injerto-copoli (dimetilsiloxano/i-butil-metacrilato) , lauril-dimeticona, copolímero de PVP/Hexadecano, copolímero de PVP/Eicoseno , tricontanil-PVP y trimetoxisiloxisilicato .

Además de los bloqueadores de sol orgánicos, en algunas modalidades, las composiciones de la presente invención comprenden adicionalmente bloqueadores de sol, físicos, inorgánicos (Ver, por ejemplo, TFA International Cosmetíc Ingredient Dictionari, 6t Edition, pp . 1026-28 y 1103

[1995] ; Sayre et al., J. Soc . Cosmet . Chem. , 41:103-109

[1990] ; y Lowe et al., supra) . Los bloqueadores de sol, físicos, inorgánicos, preferidos incluyen óxido de zinc y dióxido de titanio y mezclas de los mismos.

Cuando se usa en modalidades preferidas, los bloqueadores de sol, físicos, están presentes en una cantidad tal que las presentes composiciones son transparentes en la piel (es decir, sin blanqueamiento) , de manera preferente de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 20 %, de manera preferente de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 10 %, y de manera más preferente de aproximadamente 0.5 % a 5 % en peso. Cuando se usa dióxido de titanio, puede tener una estructura de anatasa, rutilo o amorfa. Los fabricantes de dióxido de titanio y óxido de zinc, grado micronizado, para el uso en bloqueadores de sol, incluyen, pero no se limitan a Tayca Corporation, Uniqema, Shinetsu Chemical Corporation, Kerr-McGee, Nanophase, Nanosource, Sachtleben, Elementis, and BASF Corporation, así como sus agentes y distribución y aquellas compañías que procesan adicionalmente el material para el uso en bloqueador de sol. Las partículas de bloqueador de sol, físico (por ejemplo, dióxido de titanio y óxido de zinc) pueden estar no revestidas o estar revestidas con una variedad de materiales que incluyen pero no se limitan a aminoácidos, compuestos de aluminio tal como alúmina, estearato de aluminio, laurato de aluminio, y similares; ácidos carboxílicos y sus sales (por ejemplo, ácido esterárico y sus sales) ; fosfolípidos tal como lecitina; compuestos de silicón, orgánicos; compuestos de silicón, inorgánicos tal como sílice y silicatos y mezclas de los mismos. En algunas modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención comprenden de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 15 .%, de manera preferente de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 7 %, y de manera más preferente de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 5 %, en peso, de bloqueador de sol, inorgánico .

Además de los efectos perjudiciales de algunos emulsionantes, la exposición a otros factores se conoce que daña la piel y el pelo. Por ejemplo, en general se conoce el efecto dañino de la porción ultravioleta de la radiación solar en la piel. En tanto que los rayos que tienen una longitud de onda de menos de 290 nm (es decir, la región UVC) · se absorben por la capa de ozono en la atmósfera de la tierra, los rayos en el intervalo entre 290 nm y 320 nm (es decir, la región UVB) , provoca eritema, quemadura simple de sol o aún quemaduras de severidad variable. La actividad máxima de eritema de la luz de sol se da como la región relativamente estrecha alrededor de 308 nm.

Se conoce que numerosos compuestos proporciona protección contra la radiación UVB dañina. Más comúnmente, estos compuestos se derivan1 de 3 -bencilideno canfor, de ácido 4 -aminobenzoico, de ácido cinnámico,' de ácido salicílico, de benzofenona, y de 2-fenil-bencimidazol .

También es importante tener sustancias de filtro, disponibles, para el intervalo entre aproximadamente 320 nm y aproximadamente 400 nm, la región UVA, puesto que sus rayos también pueden provocar daño. Durante un largo tiempo, se asumió incorrectamente que la radiación UV-A de onda larga que tiene una longitud de onda de entre 320 nm y 400 nm tiene sólo acción biológica insignificante y que, por consiguiente, los rayos UV-B fueron responsables del mayor fotodaño a la pile humana. Sin embargo, numerosos estudios recientes han mostrado que la radiación UV-A es mucho más peligrosa que la radiación UV-B con respecto a activar reacciones fotodinámicas , específicamente fototóxicas y cambios crónicos en la piel. Además, los efectos peligrosos de la radiación UV-B se pueden intensificar adicionalmente por exposición a radiación UV-A.

Se ha mostrado que la radiación UV-A por sí misma y bajo condiciones comunes muy normales, es suficiente para dañar las fibras de elastina y colágeno, que . son de importancia esencial para la estructura y resistencia de la piel, dentro de un periodo corto. Esto conduce a cambios crónicos inducidos por luz en la piel, tal que la piel "envejece" prematuramente. La apariencia clínica de la piel envejecida por la luz incluye típicamente arrugas y rayas incrementadas, y un relieve irregular surcado de arrugas. Además, las áreas de la piel afectadas por el envejecimiento de la piel inducido por luz muestran frecuentemente pigmentación irregular. En algunos casos, surgen manchas café, queratosas, carcinomas, o melanomas malignos. La piel prematuramente envejecida como resultado de la exposición diaria a UV también se caracteriza como que tiene menor actividad de las células de Langerhans e inflamación crónica ligera .

Aproximadamente 90 % de la radiación ultravioleta que llega a la Tierra consiste de rayos UV-A. En tanto que la cantidad de radiación UV-B que llega a la Tierra varía ampliamente dependiendo de numerosos factores (por ejemplo, el momento del año y día y/o el grado de latitud) , los niveles de radiación UV-A que llegan a la Tierra permanecen relativamente constantes en una base diaria, a pesar del momento del año y del día o de factores geográficos. Adicionalmente , la mayoría de la radiación UV-A penetra la epidermis viva, en tanto que 70 % de los rayos UV-B se retienen por la capa córnea. La protección preventiva contra rayos UV-A, por ejemplo, al aplicar sustancias de filtro, de protección a la luz en la forma de una formulación cosmética o dermatológica a la piel, por lo tanto es de importancia fundamental .

En general, el comportamiento de absorción de luz de las sustancias filtro de protección a la luz es bien conocido y está bien documentado, en su mayor parte debido al hecho que los países más industrializados tienen listas positivas para el uso de estas sustancias, que imponen normas muy estructuras en la documentación que acompaña cada producto que incorpora estas sustancias. Para la concentración de las sustancias en las formulaciones terminadas, los valores de absorbancia proporcionan una guía, puesto que la interacción con sustancias dentro de la piel o la superficie de la piel misma presenta frecuentemente variables que pueden impactar qué también se desempeña en las composiciones en cada individuo. Sin embargo, usualmente es difícil estimar de antemano, que tan uniformemente y espesamente se distribuye la sustancia de filtro en y sobre la capa córnea de la piel.

Pata probar el desempeño de protección a UV-A, usualmente se hace uso del método de IPD (oscurecimiento inmediato de pigmento IPD 5) conocido por los expertos en la técnica. Este método es similar a la determinación del factor de protección de sol, y proporciona un método que indica que tanta piel protegida con la composición de protección a la luz se puede irradiar con radiación UV-A antes de la pigmentación que se presenta, es la misma como aquella producida para la piel no protegida.

Otro método de prueba que se ha llegado a establecer a todo lo largo de Europa es la norma Australiana AS/NZS 2604:1997. En este método, se mide la absorción de la preparación en la región UV-A. A fin de satisfacer la norma, la preparación debe absorber al menos 90 % de la radiación UV-A en la región de 320-360 nm.

De importancia en la formulación de las composiciones de bloqueador de sol es que la concentración de uso de las sustancias de filtro, de protección a la luz, conocidas, que también exhiben una alta acción de filtro en la región UV-A frecuentemente se limita por el hecho que se combinan por otras sustancias que están en la forma de sólidos. De esta manera, hay ciertas dificultades de formulación asociadas con el logro de factores relativamente altos de protección al sol y desempeño de protección a UV-A. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica en general están consientes de los de los medios para superar y/o compensar estas dificultades.

Puesto que las sustancias de filtro, de protección a la luz, en general son costosas y algunas sustancias de filtro de protección a la luz son difíciles adicionalmente de incorporar en las preparaciones cosméticas y/o dermatológicas a concentraciones relativamente altas, algunas modalidades de la presente invención se diseñaron para proporcionar preparaciones simples y efectivas en el costo que, a pesar de tener concentraciones inusualmente bajas de sustancias de filtro, convencionales, de protección a la luz UV-A, no obstante logran desempeño aceptable o aún alto de protección a UV-A.

Sin embargo, como se conoce en la técnica, la radiación UV también puede conducir a reacciones fotoquímicas que producen productos que interfieren con el metabolismo de la piel. Estos productos de reacción fotoquímica son predominantemente compuestos de radicales libres (por ejemplo, radicales de hidroxilo) . Los fotoproductos no definidos, de radicales libres que se forman en la piel por sí mismos también pueden exhibir reacciones secundarias descontroladas como resultado de su alta reactividad. Sin embargo, el oxígeno singlete, un estado no excitado por radicales libres de la molécula de oxígeno, también puede surgir durante la radiación UV, como lo hacen los epóxidos de vida corta y muchos otros. Por ejemplo, el oxígeno singlete difiere del oxígeno triplete normal (estado basado en radicales libres) en virtud de su reactividad incrementada. Sin embargo, también existen estados tripletes "de radicales libres", reactivos, excitados de la molécula de oxígeno. De esta manera, a fin de impedir estas reacciones, los antioxidantes y/o eliminadores de radicales libres encuentran uso en las formulaciones cosméticas y/o dermatológicas.

Los compuestos que se usan comúnmente como agentes de protección a la luz en formulaciones de protección a la luz, cosméticas y/o dermatológicas en general se caracterizan como que proporcionan buena protección a la luz. Sin embargo, tienen la desventaja que algunas veces es difícil incorporarlos en las formulaciones deseadas de una manera satisfactoria .

Como se indica anteriormente, el factor de protección al sol (SPF) indica cuanta de la piel protegida con la composición de protección a la luz se puede irradiar antes de que la reacción de eritema que se presenta sea la misma como aquella para la piel no protegida (es decir, diez veces en comparación con la piel no protegida para un SPF = 10) . Los consumidores están muy consientes del significado de "SPF" y eligen productos de cuidado de la piel y/o pelo en base a valores de SPF indicados en los productos . Los consumidores esperan recibir información confiable de fabricantes con respecto al factor de protección al sol, en su mayor parte debido a la conciencia pública incrementada de la asociación entre exposición excesiva al sol y cáncer de piel, así como envejecimiento prematuro. Además, en algunas partes del mundo, la degradación de la capa de ozono es una cuestión principal. Dependiendo del tipo de piel y de la exposición al sol, esperada, los consumidores eligen productos con un mayor o menor SPF. Sin embargo, parece haber una tendencia a que los consumidores seleccionen factores SPF relativamente altos, particularmente para productos que se van a aplicar a niños y aquellos con piel hermosa. En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones con concentraciones relativamente bajas de sustancias convencionales de filtro de protección a la luz, aun con valores de SPF que son aceptables a los consumidores .

En algunas modalidades preferidas, los constituyentes básicos de las preparaciones de bloqueador de sol proporcionadas por la persona presente invención incluyen: soluciones acuosas o agua; soluciones etanólicas acuosas; aceites naturales y/o aceites naturales químicamente modificados y/o aceites sintéticos; grasas, ceras y otras sustancias grasas naturales y sintéticas, de manera preferente, ásteres de ácidos grasos con alcoholes de bajo número de carbonos (por ejemplo, con isopropanol, propilenglicol o glicerol) , o ásteres de alcoholes grasos con ácidos alcanoicos de bajo número de carbonos o con ácidos grasos; alcoholes, dioles o polioles de bajo número de carbonos, y éteres de los mismos, de manera preferente etanol, isopopanol, propilenglicol, glicerol, etilenglicol , etilenglicol-monoetilo o monobutiléter, propilenglicol-monometilo, monoetilo o monobutiléter, dietilenglicol-monometil o monoetiléter y productos análogos. En modalidades alternativamente preferidas, las mezclas de dos o más de estos constituyentes encuentran uso en la presente invención. En algunas modalidades preferidas, la composición de la presente invención también incluye conservadores. Estos conservadores incluyen, pero no se limitan a pentilenglicol , etilen-diamina-tetraacetato (EDTA) y sus sales, clorhexidina (y sus derivados de diacetato, diclorhidrato, digluconato) , 1,1, l-tricloro-2-metil-2-propanol, paracloro-metaxilenol , clorhidrato de polihexametilendiguanida, ácido dihidroacético, diazolidinil-urea, alcohol 2,4-diclorobencílico, 4, 4-dimetil-l, 3 -oxazolidina, formaldehído (por ejemplo, solución acuosa al 37 %, con 10-15 % de metanol para evitar la polimerización) , glutaraldehído, demetilidantoina, imidazolidinil-urea, 5-cloro-2-metil-4- isotiazolin-3-ona, orto- fenilfenol , ásteres de ácido 4-hidroxibenzoico (por ejemplo, "parabeno" ) y sus ásteres de metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo e isobutilo, triclosán, 2 - fenoxietanol , acetato fenil-mercúrico, borato, nitrato, cuaternio- 15 , salicilato,-ácido salicílico y sus sales, calcio, sorbato de calcio, ácido sórbico y sus sales, butilcarbamato de yodopropani lo , piriditiona de zinc, alcohol bencílico, 5 -bromo- 5-nitro-l,3 -dioxano , 2 -bromo- 2 -nitropropano-1,3-diol, ácido benzoico y sus sales, sulfitos, bisulfitos, feniloxietanol , cloroxilenol , diazolidinil -urea, metilparabenos , propilparabenos, isopropilparabenos, isobut ilparabenos , butilparabenos , et ilparabeno , fenoxietanol PG, y cloruro de benzalconio.

En modalidades aún adicionales, los conservadores, tal como aquellos usados en las aplicaciones de alimento y forraje encuentran uso en las varias composiciones de la presente invención. La siguiente tabla proporciona lista de estos compuestos, así como el número E para cada compuesto. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a estos conservadores específicos, puesto que se contempla que los conservadores adicionales encontraran uso en las varias modalidades de la presente invención.

Ejemplos de Conservadores Grado Alimento que Encuentran Uso en las Modalidades de la Presente invención 200 Ácido sórbico 201 Sorbato de sodio 202 Sorbato de potasio 203 Sorbato de calcio 210 Ácido benzoico 211 Benzoato de sodio 212 Benzoato de potasio 213 Benzoato de calcio 214 p-hidroxibenzoato de etilo 215 Sal sódica de áster etílico de ácido p-hidroxibenzoico 216 p-hidroxibenzoato de N-propilo 217 Sal sódica de éster n-propílico de ácido p-hidroxibenzoico 218 p-hidroxibenzoato de metilo 219 Sal sódica de éster metílico de ácido p-hidroxibenzoico 220 Dióxido de azufre 221 Sulfito de sodio 222 Sulfito ácido de sodio 223 Disulfito de sodio 224 Disulfito de potasio 226 Sulfito de calcio 227 Sulfito ácido de calcio 228 Sulfito ácido de potasio Ejemplos de Conservadores Grado Alimento que Encuentran Uso en las Modalidades de la Presente invención 230 Bifenilo (Difenilo) 231 Ortofenilfenol 232 Ortofenilfenóxido sódico 233 Tiabendazol 235 Natamicina 236 Ácido fórmico 237 Formiato de sodio 238 Formiato de calcio 239 Hexametilentetramina 249 Nitrito potásico 250 Nitrito sódico 251 Nitrato de sodio 252 Nitrato de potasio 280 Ácido propiónico 281 Propionato de sodio 282 Propionato de calcio 283 Propionato de potasio 290 Dióxido de carbono Los conservadores adicionales que encuentran uso e las varias modalidades incluyen pero no se limitan dibromodicianobutano ( 2 -bromo-2 -bromometilglutarodinitrilo) 3 -yodo-2-propinilbutilcarbama o, 2 -bromo-2-nitropropano-1,3-diol, imidazolidinilurea, 5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona, 2-cloroacetamida, cloruro de benzalconio, alcohol bencílico, y donadores de formaldehído. Los conservadores adicionales que encuentran uso en las varias modalidades de la presente invención incluyen éteres hidroxialquílieos de fenilo, en particular los compuestos conocidos como "fenoxietanol" , debido a sus efectos bactericidas y fungicidas en varios microorganismos.

Una variedad de ingredientes opcionales tal como agentes neutralizantes, perfumes y agentes solubilizantes de perfume, agentes colorantes también encuentran uso en algunas de las composiciones de la presente. Se prefiere que cualquier ingrediente adicional que mejore los beneficios de suavidad/lisura de la piel del producto. Además, se prefiere que cualquiera de estos ingredientes no tenga impacto negativo en las propiedades estéticas del producto.

Otros materiales opcionales incluyen agentes queratolíticos , así como conservadores solubles en agua y/o solubilizables en agua de manera preferente en un nivel de aproximadamente 0.1' % a aproximadamente 5 % (por ejemplo, Germall 115, éteres metílico, etílico, propílico y butílico de ácido hidroxibenzoico, alcohol bencílico, DMDM hidantoina-yodopropanil -butilcarbanato disponible bajo el nombre comercial Glydant Plus de Lonza; EDTA, EUXYLMR K400, Bromopol (2-bromo-2-nitropropano-l, 3-diol) y fenoxipropanol) ; antibacterianos (por ejemplo, IRGASA MR) y fenoxietanol (de manera preferente niveles de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 5 %) ; así como agentes humectantes solubles o coloidalmente solubles tal como ácido hialurónico, sulfato de condroitina, y poliacrilatos de sodio injertados con almidón (por ejemplo, SANWETMR IM-1000, IM-1500 y IM-2500, disponibles de Celanese Superabsorbent Materials, Portsmith, VA, Ver, por ejemplo., Patente de los Estados Unidos No. 4,076,663; vitaminas tal como vitamina A, vitamina C, vitamina E y derivados de las mismas y bloques de construcción de los mismos tal como fitantriol, y vitamina K y componentes de los mismos tal como el alcohol graso dodecatrietol ; alfa y beta-hidroxiácidos ; aloe vera; esfingocinas y fitoesfingocinas , colesterol; agentes aclaradores de la piel; N-acetil-cisteína; agentes colorantes; agentes antibacterianos tal como TCC/TCS, también conocidos como triclosán y triclorocarbono ; perfumes y solubilizadores de perfume. Los ejemplos de alfa-hidroxiácidos incluyen ácido glicólico, ácido láctico, ácido málico, ácido cítrico, . ácido glicólico en unión con glicolato de amonio, ácido alfa-hidroxi-etanoico , ácido alfa-hidroxioctanoico, ácido alfa-hidroxicaprílico, ácido hidroxicaprílico, ácido de fruta mezclada, ácidos tri-alfa-hidroxido-de fruta, ácido de triple fruta extracto de azúcar dé caña, alfa-hidroxi y botánicos, 1-alfa-hidro-ácido y glicómero en ácidos grasos reticulados (por ejemplo, alfa-nutrio) . .Los ejemplos preferibles de alfa-hidroxi-ácidos son ácido glicólico y ácido láctico. Se prefiere que se usen alf -hidroxi-ácidos a niveles de hasta aproximadamente 10 %. No se propone que la presente invención se limite a ningún compuesto particular derivado de cualquier fuente particular, puesto que cualquier compuesto aditivo adecuado, ya sea obtenido de fuentes naturales o a través de síntesis en el laboratorio, encuentra uso en la presente invención.

Otros materiales opcionales incluyen conservadores solubilizables o solubles en agua, de manera preferente a un nivel de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 5 % cada uno, tal como Germall 115, ásteres metílico, etílico, propílico y butílico de ácido hidroxibenzoico, alcohol bencílico, DMDM hidantoina-yodopropanil-butilcarbanato disponible bajo el nombre comercial Glydant Plus de Lonza, EDTA, Euxyl (RTM) K400, Bromopol (2-bromo-2-nitropropano-l , 3 -diol) , pentilenglicol y fenoxipropanol ; anti-bacterianos tal como Irgasan (RTM) y fenoxietanol (de manera preferente a niveles de 0.1 % a aproximadamente 5 %) . Los agentes antibacterianos tal como TCC/TCS, también conocidos como triclosán y triclorocarbono también son útiles en las composiciones de la presente invención.

Aún otros agentes antimicrobianos igualmente son adecuados para el uso en las varias modalidades de la presente invención, que incluyen, pero no se limitan a 2 , 4 , 4 ' -tricloro-2 ' -hidroxidifenil-éter (es decir, IRGASA MR) , 1, 6-di (4-clorofenilbiguanido) hexano (es decir, clorhexidin) , 3 , 4 , 4 ' -triclorocarbanilida, compuestos de amonio cuaternario, aceite de diente de ajo, aceite de menta, aceite de tomillo, citrato de trietilo, FARNESOLMR (3 , 7 , 11-trimetil-2 , 6 , 10-dodecatrien-l-ol) y los ingredientes activos y/o combinaciones de ingredientes activos descritos en DE-37 40 186, DE-39 38 140, DE-42 04 321, DE-42 29 707, DE-43 09 372, DE-44 11 664, DE-195 41 967, DE-195 43 695, DE-195 43 696, DE-195 47 160, DE-196 02 108, DE-196 02 110, DE-196 02 111, DE-196 31 003, DE-196 31 004, DE-196 .34 019, DE-42 29 737, DE-42 37 081, DE-43 24 219, DE-44 29 467, DE-44 23 410, y DE-195 16 705, todas las cuales se incorporan de este modo como referencia. En aún modalidades adicionales, también se incluye carbonato ácido de sodio en algunas composiciones de la presente invención. Sin embargo, no se propone que la invención se limite a ningún antimicrobiano particular ni combinación de antimicrobianos, puesto que los varios compuestos que tienen estos efectos encontrarán uso en las varias modalidades de la presente invención.

En modalidades adicionales de las composiciones de cuidado personal de la presente invención, se incluyen compuestos tal como anti-irritantes y/o ingredientes activos antiinflamatorios. En algunas modalidades, se incluyen alcohol batílico (a-octadecil-gliceril-éter) , alcohol selaquílico (a-9-octanecenil-gliceril-éter) , alcohol quimílico (a-hexadecil-gliceril-éter) , bisabolol, y/o pantenol . Sin embargo, . no se propone que la presente invención se limite a la incorporación de cualquiera de los irritantes y/o anti- inflamatorios específicos, puesto que varios compuestos disponibles para estas aplicaciones encuentran uso en la presente invención.

Los agentes neutralizantes adecuados para el uso en neutralizar agentes formadores de gel, hidrófilos, que contienen grupos ácidos, incluyen en la presente hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, monoetanolamina, dietanolamina, amino-metil-propanol , tris-amortiguador y trietanolamina .

Otros materiales opcionales que encuentran uso en la presente invención incluyen cualquiera de los numerosos ingredientes funcionales y/o activos conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo McCutcheon' s Functional Materials, North American and International Editions, MC Publishing Co .

[2003]). Como se indica anteriormente, los ejemplos no limitantes incluyen agentes queratolíticos ; agentes humectantes solubles o coloidalmente solubles tal como ácido hialurónico y sulfato de condroitina; vitaminas tal como vitamina A, vitamina C, vitamina E, vitamina K y derivados de las mismas y bloques de construcción de las mismas; fitantriol; alcoholes grasos tal como dodecatrienol ; alfa- y beta-hidroxiácidos ; aloe vera; esfingocinas y fitoesfingocinas, colesterol; agentes blanqueadores de la piel; N-acetil-cisteína; agentes colorantes; los ejemplos de alfa-hidroxiácidos incluyen ácido glicólico, ácido láctico, ácido málico, y ácido cítrico (ya sea derivado de manera sintética o de fuentes naturales y ya sea usado sólo en combinación) y sus ásteres o combinaciones amortiguadas pertinentes. Otros ejemplos de alfa-hidroxiácidos incluyen: ácido alfa-hidroxi-etanoico, ácido alfa-hidroxi-octanoico, ácido alfa-hidroxicaprílico, y ácido hidroxicaprílico . Los ejemplos preferidos de alfa-hidroxiácidos incluyen ácido glicólico y ácido láctico. Se prefiere que se usen alfa-hidroxiácidos a niveles de hasta aproximadamente 10 %.

Otros materiales incluyen pigmentos que, donde son insolubles a agua, contribuyen a, y se incluyen, en el nivel total de los ingredientes de fase de aceite. Los pigmentos adecuados para el uso en las composiciones de la presente invención pueden ser orgánicos y/o inorgánicos. También incluidos dentro del término "pigmento" están materiales que tienen poco color o brillo, tal como agentes de acabado mate, agentes de dispersión de luz y ayudas de formulación tal como micas, seracitas y sales de carbonato. Los ejemplos adicionales de pigmentos adecuados incluyen dióxido de titanio, óxidos de hierro, óxidos de hierro-glutamato, óxido de zinc, oxicloruro de bismuto, azul ultramarino (todos los cuales pueden estar ya sea pre-dispersados y/o pre-revestidos o no) tintes y lacas D&C, colores FD&C, aditivos naturales de color tal como carmina, y mezclas de los mismos. Dependiendo del tipo de composición, usualmente se usa una mezcla de pigmentos en las modalidades preferidas de la presente invención. Los pigmentos preferidos para el uso en la presente desde el punto de vista de humectación, sensación de piel, apariencia de piel y compatibilidad de emulsión son pigmentos tratados. En algunas modalidades, los pigmentos se hidratan con compuestos, incluyendo pero no limitado a aminoácidos, siliconas, lecitina y aceites de éster.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones que comprenden pigmentos, que incluyen, pero no se limitan a, pigmentos inorgánicos basados en óxidos metálicos y/u otros compuestos metálicos insolubles o ligeramente solubles en agua tal como óxidos de zinc (ZnO) , titanio (Ti02) , hierro (por ejemplo, Fe203) , zirconio (Zr02) , sílice (Si02) , manganeso (por ejemplo, MnO) , aluminio (Al203) , cerio (por ejemplo, Ce203) , y composiciones mezcladas de estos óxidos, así como mezclas de los mismos. En algunas modalidades preferidas, los óxidos metálicos son microfinos, en tanto que en modalidades alternativas preferidas, los óxidos metálicos son de grado pigmento. En aún modalidades adicionales, los pigmentos están "revestidos" tal que están tratados en la superficie. En algunas modalidades preferidas, el revestimiento comprende una capa delgada de película hidrófoba, en tanto que en otras modalidades, el revestimiento comprende una capa delgada de película hidrófila .

Como se usa en la presente, los términos "pigmento", "pigmento de color" y "tinte" usados con referencia a las composiciones de la presente invención abarcan cualquier compuesto que proporciona un color a la composición y/o imparte un color a la superficie (por ejemplo, piel y/o pelo) a la cual se aplica la composición. En algunas modalidades, los tintes y pigmentos se eligen de la lista de colorantes cosméticos proporcionada por la Cosmetics Directive o la EC. En la mayoría de los casos, estos tintes y pigmentos son idénticos a los tintes aprobados para alimentos. Los pigmentos/tintes preferidos incluyen por ejemplo, dióxido de titanio, mica, óxidos de hierro (por ejemplo Fe203, Fe304, FeO(OH)) y/u óxido de estaño. Los pigmentos/tintes ventajosos incluyen, por ejemplo, carmina, azul de Berlín, verde de óxido de cromo, azul ultramarino y/o violeta de manganeso. En algunas modalidades preferidas, los pigmentos/tintes incluyen, pero no se limitan a aquellos en la siguiente tabla. Los Números de índice de Color (CIN) aquellos conocidos en la técnica (Ver, Society of Dyers and Colourists, Rowe Colour Index, 3rd Edition, Bradford, Inglaterra,

[1971] ) .

Producto Químico u Otro Nombre CIN Color Pigmento Verde 10006 verde Verde Ácido 1 10020 verde Ácido 2, 4-dinitrohidroxinaftalen-7-sulfónico 10316 amarillo Pigmento Amarillo 1 11680 amarillo Pigmento Amarillo 3 11710 amarillo Pigmento Naranja 1 11725 naranj a 2 , 4 -dihidroxiazobenceno 11920 naranj a Rojo Solvente 3 12010 roj o 1— (2' -cloro-4' -nitro-1' -fenilazo) -2- 12085 roj o hidroxinaftaleno Pigmento Rojo 3 • 12120 roj o Rojo Ceres,- Rojo Sudan; Rojo Grasa G 12150 ro o Pigmento Rojo 112 12370 rojo Pigmento Rojo 7 12420 roj o Pigmento Café 1 12480 café 4- (2' -Metox-51 -sulfodietilamido-1' -fenilazo) -3- 12490 roj o hidroxi-5' ' -cloro-2' ' ,4' ' -dimetoxi-2-naftanilida Amarillo disperso 16 12700 amarillo Ácido 1- (4 -Sulfo-l-fenilazo) -4- 13015 amarillo aminobenzeno- 5 - sulfócino Producto Químico u Otro Nombre CIN Color Ácido 2 , 4 -Dihidroxiazobencen-4 ' -sulfónico 14270 naranj a Ácido 2- (2, 4-Dimetilfenilazo-5-sulfo) -1- 14700 roj o hidroxinaftalen- -sulfónico Ácido 2- (4-Sulfo-l-naftilazo) -l-naftol-4- 14720 rojo sulfónico Ácido 2 - (6 -Sulfo-2, 4-xililazo) -1-naftol- 14815 roj o 5-sulfónico 1- (4 ' -Sulfofenilazo) -2-hidroxinaftaleno 15510 naranj a 1- (2-Sulfo-4-cloro-5-carboxi-l-fenilazo) - 15525 rojo 2-hidroxinaftaleno 1- (3-Metilfenilazo-4-sulfo) -2- 15580 rojo hidroxinaftaleño 1- (4' , (8' ) -Sulfonaftilazo) -2-hidroxinaftaleno 15620 rojo Ácido 2-hidroxi-l, 2' -azonaftalen-1' -sulfónico 15630 roj o Ácido 3-hidroxi-4-fenilazo-2-naftilcarboxílico 15800 roj o Ácido 1- (2-sulfo-4-metil-l-fenilazo) -2- 15850 roj o naftil-carboxílico Ácido 1- (2-sulfo-4-metil-5-cloro-l- 15865 rojo fenilazo) -2 -hidroxinaftalen- 3 -carboxílico Ácido 1- (2-sulfo-l-naftilazo) -2- 15880 rojo hidroxinaftalen-3 -carboxílico Ácido 1- (3-sulfo-l-fenilazo) -2-naftol-6- 15980 naranj a sulfónico Producto Químico u Otro Nombre CIN Color Ácido 1- (4-sulfo-l-fenilazo) -2-naftol-6- 15985 amarillo sulfónico Rojo Allura 16035 roj o Ácido 1- (4-sulfo-l-naftilazo) -2-naftol- 16185 rojo 3 , 6-disulfónico Naranja Ácido 10 16230 naranja Ácido 1- (4 -sulfo-l-naftilazo) -2-naftol- 16255 rojo 6 , 8 -disulfónico Ácido 1- (4-sulfo-l-naftilazo) -2-naftol- 16290 roj o 3,6, 8 -trisulfónico Ácido 8-amino-2-fenilazo-l-naftol-3, 6- 17200 rojo disulfónico Rojo Ácido 1 18050 roj o Rojo Ácido 155 18130 roj o Amarillo Ácido 121 18690 amarillo Rojo Ácido 180 18736 roj o Amarillo Ácido 11 18820 amarillo Amarillo Ácido 17 18965 amarillo Ácido 4- (4-sulfo-l-fenilazo) -1- (4-sulfofenil) - 19140 amarillo 5-hidroxi-pirazolon-3-carboxílico Pigmento amarillo 16 20040 amarillo 2,6- (4' -Sulfo-2' ' , 4 ' ' - 20170 naran a dimetil) bisfenilazo) -1, 3 -dihidroxibenceno Producto Químico u Otro Nombre CIN Color Negro Ácido 1 20470 negro Pigmento Amarillo 13 21100 amarillo Pigmento Amarillo 83 21108 amarillo Solvente Amarillo 21230 amarillo Rojo Ácido 163 24790 rojo Rojo Ácido 73 27290 rojo Ácido 2- [4' - (4' ' -sulfo-1' ' -fenilazo) -7' - 27755 negro sulfo-1' -naftilazo] -l-hidroxi-7-aminonaftalen-3 , 6-di-sulfónico Ácido ' - [ (4 ' ' -Sulfo-l' ' -fenilazo) -7' - 28440 negro sulfo-1' -naftilazo] - 1-hidroxi- 8 -acetilaminonaftalen-3 , 5 -disulfónico Naranja Directo 34, 39, 44, 46, 60 40215 naranj a Amarillo Alimenticio 40800 naranj a trans-ß-???-d ' -carotinaldehído (C30) 40820 naranj a Ester (C30) -etílico de ácido trans-Apo-8' - 40825 naranj a carotínico Cantaxantina 40850 naranja Azul Ácido 1 42045 azul 2 , 4-Disulfo-5-hidroxi-4 ' -4' ' - 42051 azul bis (dietilamino) trifenilcarbinol Producto Químico u Otro Nombre CIN Color 4- [ (4 -N-Etil-p-sulfobencilamino) fenil (4- 42053 verde hidroxi-2 -sulfofenil) (metilen) -1- (N-etil-N-p-sulfobencil) -2 , 5-ciclohexadienimina] Azul Ácido 7 42080 azul (N-Etil-p-sulfobencilamino) fenil (2- 42090 azul sulfofenil) metilen- (N-etil-N-p-sulfobencil) D2,5-ciclohexadienimina Verde Ácido 9 42100 verde Dietildisulfobenzildi-4 -amino-2 -cloro-di- 42170 verde 2-metil-f csonimonio Violeta Básico 14 42510 violeta Violeta Básico 2 42520 violeta 2' -Metil-4' - (N-etil-N-m- 42735 azul sulfobencil) amino-4 ' ' - (N-dietil) amino-2-metil-N-etil-N-m-sulfobencilfucsonimonio 4 ' - (N-dimetil) amino-4 ' ' - (N- 44045 azul fenil ) aminonafto-N-dimetilfucsonimonio 2-Hidroxi-3 , 6-disulfo-4 , 4 ' - 44090 verde bisdimetilaminonaftofucsonimonio Rojo Ácido 52 45100 roj o Sal de 3- (2 ' -Metilfenilamino) -6- (2 ' - 45190 violeta metil-41 -sulfofenilamino) -9- (2 ' ' -carboxifenil) antenio Producto Químico u Otro Nombre CIN Color Rojo Ácido 50 45220 rojo Ácido fenil-2-oxifluorona-2-carboxílico 45350 amarillo 4 , 5 -Dibromofluoresceína 45370 naran a 2,4,5, 7-Etrabromofluoresceína 45380 rojo Tinte de Solvente 45396 naranj a Rojo Ácido 98 45405 roj o 3 ' , 4 ' , 5' , 6 ' -Tetracloro-2 , 4,5,7- 45410 roj o tetrabromofluoresceína , 5-Diyodofluoresceína 45425 rojo 2,4,5, 7-Tetrayosofluoresceína 45430 rojo Quinoftalona 47000 amarillo Ácido quinoftalonadisulfónico 47005 amarillo Violeta Ácido 50 50325 violeta Negro Ácido 2 50420 negro Pigmento Violeta 23 51319 violeta Complejo de 1, 2-dioxiantraquinona, calcio- 58000 roj o aluminio Ácido 3-oxipireno-5 , 8 , 10-sulfónico 59040 verde 1-Hidroxi-4 -N- fenilaminoantraquinona 60724 violeta l-Hidroxi-4- (4' -metilfenilamino)antraquinona 60725 violeta Violeta Ácido 23 60730 violeta 1 , 4 -Di (4 ' -metilfenilamino) antraquinona 61565 verde 1, 4-Bis (o-sulfo-p-toluidino) antraquinona 61570 verde Producto Químico u Otro Nombre CIN Color Azul Ácido 80 61585 azul Azul Ácido 62 62045 azul ?,?' -Dihidro-1, 2,1' ,2' -antraquinona-azina 69800 azul Tina Azul 6; Pigmento Azul 64 69825 azul Tina Naranja 7 71105 naranja índigo 73000 azul Ácido índico-disulfónico ¦ 73015 azul 4,4' -Dimetil-6 , 6 ' -diclorotioindigo 73360 roj o 5,5' -Dicloro- 7 , 7 ' -dimetiltioindigo 73385 violeta Violeta Quinacridona 19 73900 violeta Pigmento Rojo 122 73915 roj o Pigmento Azul 16 74100 azul Ftalocianina 74160 azul Azul Directo 86 74180 azul Ftalocianinas cloradas 74260 verde Amarillo Natural 6,19; Rojo Natural 1 75100 amarillo Bixina, Nor-Bixina 75120 naranja Licopeno 75125 amarillo trans-alfa-, beta- y gama-caroteno 75130 naranj a Ceto- y/o hidroxil-derivados de caroteno 75135 amarillo Agente perlescente o guanina 75170 blanco 1, 7-Bis (4-hidroxi-3-metoxifenil) -1, 6- 75300 amarillo heptadien-3 , 5-diona Producto Químico u Otro Nombre CIN Color Sal compleja (Na, Al, Ca) de ácido carmínico 75470 rojo Clorofila a y b; compuestos de cobre de 75810 verde clorofilas y clorofilinas Aluminio 77000 blanco Alúmina hidratada 77002 blanco Silicatos de aluminio hidratados 77004 blanco Ultramarino 77007 azul Pigmento Rojo 101 y 102 77015 roj o Sulfato de bario 77120 blanco Oxicloruro de bismuto y sus mezclas con mica 77163 blanco Carbonato de calcio 77220 blanco Sulfato de calcio 77231 blanco Carbón 77266 negro Pigmento Negro 9 77267 negro Carbo medicinales vegetabilis 77268 negro Óxido de cromo 77288 verde Óxido de cromo, hidratado 77289 verde Pigmento Azul 28, Pigmento Verde 14 77346 vede Pigmento Metal 2 77400 café Oro 77480 café Óxidos e hidróxidos de hierro 77489 naranj a Óxido de hierro 77491 rojo Óxido de hierro, hidratado 77492 amarillo Producto Químico u Otro Nombre CIN Color Óxido de hierro 77499 negro Mezclas de hexaciano-ferrato de 77510 azul hierro (II) y de hierro (III) Pigmento Blanco 18 77713 blanco Difosfato de manganeso-aluminio 77742 violeta Fosfato de manganeso; Mn3(P04)2 ? 7 H20 77745 rojo Plata 77820 blanco Dióxido de titanio y sus mezclas con mica 77891 blanco Óxido de zinc 77497 blanco 6, 7-Dimetil-9- (1' -D-ribitil) - amarillo isoaloxazina, lactoflavina Colorante de azúcar café Capsantina, capsorrubina naranja Betanina roj o Sales de benzopirilo, Antocianos rojo Aluminio, zinc, magnesio y estearato de calcio blanco Azul bromotimol azul Verde bromocresol verde Rojo Ácido 195 roj o aún modalidades adicionales, las composiciones de la presente invención comprenden además una o más sustancias del siguiente grupos: 2 , 4 -dihidroxiazobenceno , 1-(2' -cloro-4 ' -nitro-1' -fenilazo) - 2 -hidroxinaftaleno, Rojo Ceres, ácido 2- (4 -sulfo-l-naftilazo) -1-naftol-4-sulfónico, sal cálcica de ácido 2-hidroxi-l , 2 ' -azonaftalen-1 ' -sulfónico, sales cálcica y de bario de ácido 1- (2-sulfo-4-metil-l-fenilazo) -2-naftilcarboxílico, sal cálcica de ácido 1- (2-sulfo-l-naftilazo) -2 -hidroxinaftalen-3 -carboxílico, sal de aluminio de 1- (4-sulfo-l-fenilazo) -2-naftol-6-sulfónico, sal de aluminio de ácido 1- (4-sulfo-l-naftilazo) -2-naftol-3 , 6-disulfónico, ácido 1- (4-sulfo-l-naftilazo) -2-naf ol-6 , 8-disulfónico, sal de aluminio de ácido 4- (4-sulfo-l-fenilazo) -1- (4-sulfofenil) - 5-hidroxipirazolon- 3 -carboxílico, sales de aluminio y circonio de 4 , 5-dibromofluoresceína, sales de aluminio y circonio de 2 , 4 , 5 , 7-tetrabromofluoresceína, 3 ' , 4 ' , 5 ' , 6 ' -tetracloro-2 , 4 , 5, 7 -tetrabromofluoresceína y sus sal de aluminio, sal de aluminio de 2,4,5,7-tetrayodofluoresceína, sal de aluminio de ácido quinoftalona-disulfónico, sal de aluminio de ácido índigo-disulfónico , óxido de hierro rojo y negro (CIN: 77 491 (rojo) y 77 499 (negro)), óxido de hierro hidratado (CIN: 77 492), difosfato de manganeso-amonio y dióxido de titanio.

En aún modalidades adicionales, los tintes naturales solubles en aceite, tal como por ejemplo, extractos de pimentón dulce, ß-caroteno o cochinilla encuentran uso en la presente invención.

En modalidades aún adicionales, las composiciones de crema en gel de la presente invención comprenden pigmentos perlescentes . En algunas modalidades preferidas, varios pigmentos perlescentes no encuentran uso en la presente invención, incluyendo pero no limitado a "pigmentos perlescentes naturales" (por ejemplo, "esencia de peral" [cristales mezclados de guanina/hipoxantina de escamas de pescado], "madre de perla" [conchas molinas de mejillón]), y "pigmentos perlescentes microcristalinos" (por ejemplo, oxicloruro de bismuto [BiOCl] ) ; y "pigmentos de sustrato de capa" (por ejemplo, mica/óxido metálico) .

Las bases para pigmentos perlescentes incluyen, pero no se limitan a pigmentos polvorientos, dispersiones de aceite de ricino de oxicloruro de bismuto y/o dióxido de titanio, oxicloruro de bismuto y/o dióxido de titanio en mica. El pigmento brilloso listado bajo CIN 77163, por ejemplo, es particularmente ventajoso.

Un grupo adicional de pigmentos perlescentes basados en mica/óxido metálico encuentran uso particular en la presente invención, se proporciona a continuación.

Grupo Espesor de Color Revestimiento/Capa Pigmentos perlescentes Ti02: 40-60 nm plata blanco plata pigmentos de interferencia Ti02 : 60-80 nm amarillo Grupo Espesor de Color Revestimiento/Capa Ti02: 80-100 nm rojo Ti02: 100-140 nm azul Ti02: 120-160 nm verde pigmentos brillosos de Fe203 bronce color Fe203 cobre Fe203 rojo Fe203 rojo-violeta Fe203 ro o- erde Fe203 negro pigmentos de combinación Ti02/Fe203 matices dorados Ti02/Cr203 verde Ti02/azul de Berlín azul intenso Ti02/carmina roj o En algunas modalidades preferidas, los pigmentos perlescentes disponibles de Merck bajo los nombres comerciales Timiron, Colorona o Dichrona encuentran uso en la presente invención. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a los pigmentos específicos listados en la presente. En realidad, los pigmentos perlescentes que encuentran uso en la presente invención se pueden obtener de numerosas fuentes. Por ejemplo, otros sustratos a parte de mica se pueden revestir con óxidos metálicos adicionales, tal como por ejemplo, sílice y similares. Las partículas de Si02 revestidas con, por ejemplo, Ti02 y Fe203 ( "ronasferas" ) , que se venden por Merck y son particularmente adecuadas para reducción óptica de líneas finas encuentran uso en la presente invención.

En modalidades alternativas, no se incluye el sustrato (por ejemplo, mica) . En algunas modalidades preferidas, se da preferencia particular a pigmentos perlescentes preparados usando Si02. Estos pigmentos, que también pueden tener adicionalmente efectos goniocromáticos , están disponibles, por ejemplo, bajo el nombre comercial Sicopearl Fantástico, disponible de BASF.

En modalidades adicionales, los pigmentos obtenidos de Engelhard/Mear1 basados en borosilicato de calcio y sodio que se han revestido con dióxido de titanio también encuentran uso. Estos están disponibles bajo el nombre Reflecks. Además del color, como resultado de su tamaño de partícula de 40 nm a 180 mm, tiene un efecto de brillo.

En modalidades aún adicionales, los pigmentos de efecto que están disponibles bajo el nombre comercial Metasomes Standard/Glitter en varios colores (amarillo, rojo, verde, azul) de Flora Tech encuentran uso en las composiciones de la presente invención. Las partículas de brillo están presentes aquí en las mezclas con varios productos auxiliares y tintes (tal como por ejemplo, los tintes con los Números de índice de Color (CI) 19140, 77007, 77289, 77491) .

En algunas modalidades, los tintes y pigmentos están presentes ya sea de manera individual o en una mezcla. En modalidades alternativas, se revisten mutuamente entre sí, diferentes espesores de revestimiento que dan en general diferentes efectos de color. En algunas modalidades, la cantidad total de tintes y pigmentos impartidores de color se elige de un intervalo de concentraciones (por ejemplo, de aproximadamente 0.1 % en peso a aproximadamente 30 % en peso; de manera preferente de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 15 % en peso; y de manera más preferente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 10 % en peso, en cada caso, en base al peso total de las preparaciones) .

En modalidades preferidas, el pH de las composiciones en la presente está en el intervalo de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 10, de manera preferente de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 , y de manera más preferente de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, en donde el pH de la composición final se ajusta por adición de sales acidas, básicas o amortiguadoras como sea necesario, dependiendo de la composición de las formas y los requisitos de H de los compuestos.

Las composiciones de la presente invención se preparan por técnicas normales bien conocidas por los expertos en la técnica. En general, la fase acuosa y/o la fase de aceite se preparan de manera separada, con los materiales de división similar de fase que se adicionan en cualquier orden. Si el producto final es una emulsión, las dos fases entonces se combinan con agitación vigorosa y/o homogenización como sea necesario, para reducir el tamaño de las gotitas de fase interna. Cualquier ingrediente en la formulación con alta volatilidad, o que sea susceptible a hidrólisis o descomposición a altas temperaturas, se adicionan con agitación suave hacia el final del proceso, después del emulsionamiento, si es aplicable. La frecuencia y cantidad de dosis dependerá de los criterios deseados de desempeño .

En algunas modalidades de la presente invención, se proporcionan métodos para disminuir la actividad de VEGF . En estas modalidades, los métodos comprenden aplicar a un organismo en necesidad de lo mismo una cantidad efectiva de cualquiera de los compuestos expuestos en la presente. En modalidades preferidas, adicionales, la presente invención proporciona compuestos para el tratamiento de un organismo en necesidad del mismo, incluyendo humanos y otros animales.

En aún algunas modalidades adicionales, la presente invención comprende al menos una creatinina y/o derivado de creatinina. La creatinina tiene la siguiente estructura: En algunas modalidades preferidas de las composiciones de cuidado personal de la presente invención, encuentran uso el fosfato de creatinina, sulfato de creatinina, acetato de creatinina, ascorbato de creatinina, y/o derivados esterificados en el grupo carboxilo con alcoholes mono- o poli-funcionales.

En algunas modalidades adicionales, las composiciones de cuidado personal de la presente invención contienen L-carnitina [3 -hidroxi-4 - ( trimetilamonio) (butirobetaína] . Las acilcarnitinas tienen la siguiente estructura general: donde R se elige del grupo de radicales alquilo ramificados y no ramificados que tienen hasta 10 átomos de carbono, y encuentran uso en algunas modalidades de la presente invención. En algunas modalidades preferidas, la propionilcarnitina y/o acetilcarnitina encuentran uso. Ambos enantiomeros (formas D y L) , así como mezclas y racematos de las D- y L- formas encuentran uso en algunas composiciones de cuidado personal de la presente invención.

En algunas modalidades adicionales, los ingredientes activos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a sericósido, piridoxol, vitamina K, biotina y sustancias de aroma. Además, no se propone que los ingredientes activos presentes en las composiciones de cuidado personal de la presente invención se limiten a ningún constituyente particular y/o mezclas de ingredientes activos. En realidad, se propone que varios ingredientes activos y mezclas de ingredientes activos encontraron uso en las varias modalidades de la presente invención. Tampoco se propone que las concentraciones de estos ingredientes activos se limiten a un nivel particular. En algunas modalidades, la concentración es de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 30 % en peso, en tanto que en otras modalidades es de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 20 % en peso, y en aún modalidades adicionales, es de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 % en peso, en base al peso total de la preparación. Además, se contempla que aquellos expertos en la técnica formularán composiciones de cuidado personal de la presente invención con concentraciones de ingredientes activos que son adecuadas para el uso propuesto de las composiciones .

Las modalidades aún adicionales de la presente invención proporcionan métodos para la preparación de las composiciones de la presente invención. En algunas modalidades, estos métodos incluyen combinar y calentar los constituyentes de la fase de aceite y/o de la fase de agua, de manera separada, y luego combinarlos conjuntamente con agitación. En algunas modalidades preferidas, las fases se homogenizan. En algunas modalidades particularmente preferidas, las composiciones se agitan con entrada moderada alta de energía, usando de manera ventajosa una máquina de dispersión de corona dentada a un número de vueltas de hasta a lo mucho 10000 rpm (de manera preferente, en el intervalo de aproximadamente 2500 a aproximadamente 7700 rpm) . 6.2 Parte Esperimental La presente invención se describe en detalle adicional en los siguientes ejemplos que no se propone de ningún modo que limiten el alcance de la invención como se reivindica. Las figuras anexas se proponen para que se consideren como partes integrales de la especificación y descripción de la invención. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan específicamente por referencia para todo lo que se describe en la presente. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la invención reivindicada.

En la descripción experimental que sigue, aplican las siguientes abreviaciones PI (Inhibidor de Proteinasa) , BBI (Inhibidor de Bowman-Birk de Glycine max Acc. No. P01055) BBI-AV (Inhibidor de Bowman-Birk Anti-Vegf) , STI (Inhibidor de Tripsina de Soya de Glycine max) ; VEGF y VegF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular) ; BBdb (Inhibidor de Bowman-Birk de Dolichos biflorus Acc. No. AAK97765) , BBsb3 (Inhibidor de Bowman-Birk de inhibidor IV o D-II de proteasa de Glycine max (soya) ) , y BBtc (Inhibidor de Bowman-Birk de Torresea cearensis) , FGF-5 (factor 5 de crecimiento de fibroblastos), TGGF (factor ß de crecimiento transformante), TNFa (factor de necrosis tumoral) , ppm (partes por millón); M (molar) ; mM (milimolar) ; µ? (micromolar) ; nM (nanomolar) ; mol ( (moles) ; mmol (milimoles) ; \xmol (micromoles) ; nmol (nanomoles) ; gm (gramos) ; mg (miligramos) ; pg (microgramos) ; pg (picogramos) ; L (litros) ; mi y mL (mililitros) ; µ? y L (microlitros) ; cm (centímetros) ; mm (milímetros) ; pm (micrómetros ) ; nm (nonametros) ; U (unidades) ; V (voltios) ; MW (peso molecular) ; seg (segundos) ; min(s) (minuto/minutos) ; h(s) y hr(s) (hora/horas); °C (grados Centígrados), CS (cantidad suficiente) ; ND (no realizado) ; NA (no aplicable) rpm (revoluciones por minuto) ; H20 (agua) ; dH20 (agua desionizada) ; (HC1 (ácido clorhídrico) ; aa (aminoácido) ; bp (par de base) ; kb (par de kilobase) ; kD (kilodalton) ; cADN (ADN de copia o complementario) ; ADN (ácido desoxiribonucleico) ; sADN (ADN de hebra individual) ; dsADN (ADN de doble hebra) dNTP (desoxiribonucleotido trifosfato) ; ARN (ácido ribonucleico) ; MgCl2 (cloruro de magnesio) NaCl (cloruro de sodio) ; p/v (peso a volumen) ; v/v (volumen a volumen) ; g (gravedad) ; OD (densidad óptica) ; solución amortiguada de fosfato de Dulbecco (DPBS) ; SOC (2 % de Bacto-Triptona, 0.5 % de Extracto de Levadura Bacto, NaCl 10 mM, KC1 2.5 mM) ; Caldo Terrífico (TB; 12 g/1 de Bacto Triptona, 24 g/1 de glicerol, 2.31 g/1 de KH2P04; y 12.54 g/1 de K2HP04) ; OD28o (densidad óptica 280 nm) ; OD26o (densidad óptica 600 nm) ; A405 (absorbancia a 405 nm) ; Vmax (la velocidad inicial máxima de la reacción catalizada por enzima) ; PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) ; PBS (solución salina amortiguada con fosfato [NaCl 150 mM, amortiguador de fosfato de sodio 10 mM, pH 7.2]); PBST (PBS+0.25 % TWEENMR 20) ; PEG (polietilengli'col) ; PCR (reacción en cadena de la polimerasa) ; RT-PCR (PCR de transcripción inversa) ; SDS (dodecil-sulfato de sodio) ; Tris (tris (hidroximetil) aminometano) ; HEPES (ácido N- [2-Hidroxietil] piperacin-N- [2-etanolsulfónico) ; HBS (solución salina amortiguada con HEPES) ; SDS (dodecilsulfato de sodio) ; bME, BME y ß?? (beta-mercaptoetanol o 2 -mercaptoetanol ) ; Tris-HCl (tris [Hidroximetil] aminometano-clorhidrato) ; Tricina (N- [tris- (hidroximetil) -metil] -glicina) ; CHES (ácido (2- (N-ciclo-hexilamino) etano-sulfónico) ; TAPS (ácido 3-{[tris- (hidroximetil) -metil] -amino} -propanosulfónico) ; CAPS (ácido 3- (ciclo-hexilamino) -propan-sulfónico; DMSO (sulfóxido de dimetilo); DTT ( 1 , 4 -ditio-DL-treitol) ; Glut y GSH (glutationa reducida); GSSG (glutationa oxidada); TCEP (Tris [2-carboxietil] fosfina) ; Ci (Curios) mCi (milicurios) ) ; Ci (microCurios) ; TLC (cromatografía de capa delgada) ; Ts (tosilo) ; Bn (bencilo) ; Ph (fenilo) ; Ms (mesilo) ; Et (etilo) ; Me (metilo) ; Taq (ADN-polimerasa de Thermus aquaticus) ; Klenow (fragmento grande (Klenow) de ADN polimerasa I) ; rpm (revoluciones por minuto); EGTA (ácido etileno-glicol-bis ( ß-aminoetil-eter) N, N, ' , 1 -tetracético) ; EDTA (ácido etilendiaminotetracético) ; bla (gen de resistencia a ß-lactamasa o ampiei1ina) ; GE Healthcare (GE Healthcare, Chalfont St . Giles, Reino Unido); ADN2.0 (ADN2.0, Menlo Park, CA) ; OXOID (Oxoid, Basingstoke, Hampshire, RU) ; Megazyme (Megazyme International Ireland Ltd. , Bray Bussiness Park, Bray, Co. , Wicklo , Irlanda) ; Corning (Corning Life Sciences, Corning, NY) ; ( E (NEN Life Science Products, Boston, MA) ; Pharma AS (Pharma AS, Oslo, Noruega); Dynal (Dynal, Oslo, Noruega) ; Bio-Synthesis (Bio-Synthesis, Lewisville, TX) ; ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) ; Gibco/BRL (Gibco/BRL, Grand Island, NY) ; Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ; Pharmacia (Pharmacia Biotech, Pisacataway, NJ) ; NCBI (Nacional Center for Biotechnology Information) ; Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA) ; Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) ; Operon Technologies (Operon Technologies, Inc., Alameda, CA) ; MWG Biotech (M G Biotech, High Point, NC) ; Oligos Etc (Oligos Etc. Inc, Wilsonville, OR) ; Bachem (Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA) ; Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI) ; Mediatech (Mediatech, Herndon, VA; Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) ; BioVeris (BioVeris Corp., Gaithersburg, MD) ; Oxoid (Oxoid Inc., Ogdensburg, NY) ; Worthington (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) ; GIBCO BRL o Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaitherburg, MD) ; Millipore (Millipore, Billerica, MA) ; BIO-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA) ; Invitrogen (Invitrogen Corp., San Diego, CA) ; NEB (New England Biolabs, Beverly, MA) ; Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ; Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) ; Takara (Takara Bio Inc. Otsu, Japón); Roche (Hoffmann-La Roche, Basel Switzerland) ; EM Science (EM Science, Gibbstown, NJ) ; Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA) ; Biodesign (Biodesign Intl., Saco, Maine) ; Aptagen (Aptagen, Inc., Herndon, VA); Molecular Devices (Molecular Devices, Corp., Sunnyvale, CA) ; R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis, MN) ; Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) ; Marsh (Marsh Biosciences, Rochester, NY) ; Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) ; (Biacore (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) ; Pepro Tech (Pepro Tech, Rocky Hill, NJ) , SynPep (SynPep, Dublin, CA) ; y Microsoft (Microsoft, Inc., Redmond, A) .

Ejemplo 1 Producción de Proteínas de Fusión BCE103-BBI en B . subtilis En este ejemplo, se describen experimentos llevados a cabo para producir proteínas de fusión BCE103-BBI en B . subtilis . La secuencia de ADN del gen sintético (Operon Technologies) que codifica para la proteína pro-BB con una marca de hexa-histidina C- terminal usada en este experimento es : AACCTGCGTCTGTCTAAGCTTGGCCTGCTTATGAAATCAGACCATCAGCACAGC AATGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCA AATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATAGCTGTCATAGTGCA TGCAAAAGCTGTATCTGCGCCCTGAGTTATCCAGCTCAATGTTTTTGCGTCGAC ATCACGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAGCGAGGACGATAAAGAGAAC CATCATCACCATCACCAT (SEQ ID No . 10) La secuencia de proteína de pro-BBl con una marca de hexa-histidina C-terminal codificada por el gen sintético anterior es : NLRLSKLGLLMKSDHQHSNDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSA CKSCICALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKENHHHHHH (SEQ ID No . 11) La porción de la secuencia de ADN del gen sintético que codifica para la forma madura principal de BBI es: GACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCAAAT CCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATAGCTGTCATAGTGCATGC AAAAGCTGTATCTGCGCCCTGAGTTATCCAGCTCAATGTTTTTGCGTCGACATCA CGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAGCGAGGACGATAAAGAGAAC (SEQ ID O. 12) .

La secuencia de proteína de la forma madura principal de BBI codificado por el gen sintético anterior es: DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDIT DFCYEPCKPSEDDKEN (SEQ ID No . 13) .

Los cebadores de PCR usados para amplificar el gen de BBI para la fusión al cásete de expresión de celulasa BCE103 en el vector pJ103 fueron: BBifusion_FW : 5 ' CAGCACGGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCC3 ' (SEQ ID No. 14) .

BBIHindIII_RV: 5 ' CTGCAGAAGCTTAAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCA GGAAATCCGTCCTCTGTTAACTTTTAGTTCTCTTTATCGTCCTCGC 3' (SEQ ID No. 15) .

BBIHIS-HindIII_RV: 5 ' CTGCAGAAGCTTAAAAATAAAAAAACGGATT TCCTTCAGGAAATCCGTCCTCTGTTAACTTTTAATGGTGATGGTGATGAT GGTTCTC 3' (SEQ ID No . 16) .

La secuencia del cásete de expresión de aprE- BCE103 -BBI-His Tag {EcoRI-HindIII) que se clonó en el vector de integración pJM103 se proporciona las Figuras 1A a ID. Un mapa esquemático de plásmidos del vector de expresión pJ 103BBIHis se proporciona en la Figura 2.

El gen de celulosa alcalina (BCE 103) (ver van Soligen, Patente de los Estados Unidos No. 6,063,611, incorporado de este modo como referencia) fusionado al promotor aprE de B . subtilis y la secuencia de señal, se clonó de pUCAPR103 (Shaw et al., J. Mol. 320 : 303-309

[2002] ) como el fragmento EcoRI-BamHI (es decir, un fragmento que tiene la secuencia codificadora del dominio catalítico BCE103 y sólo el primer ligador del dominio de unión a celulosa) en pJM103 (Perego, "Jn egrrational vectors for grenetic manipulation in Bacillus subtilis" In, Bacillus subtilis and Other Gram- positive Bacteri : Biochemistry, Physiology, and Molecular Genetics, Sonenshein, Hoch, y Losick (eds) , American Society for Microbiology, Washington D.C., pp. 615-624 (1993)) . Un gen que codifica para el inhibidor de proteasa de Bowman-Birk de soya (BBI) (Swiss-Prot Acceso # P01055; Ver Odain y Ikenaka, J. Biochem., 71:839-848

[1972]) con una marca de hexa-histidina C-terminal (His- Tag) se sintetizó por Operon Technologies (ver la secuencia de ADN anterior) . El de gen BBI se amplificó por PCR con cebadores (todos los cebadores se sintetizaron por MWG Biotechg, Oligos Etc., u Operon Technologies) que generó un sitio S'BamHI en el cuadro de lectura correcto con el gen de BCE103, y en el extremo 3' introdujo un fuerte terminador transcripcional (LAT, del gen de a-amilasa Baccillus lichenifor is) después del final del gen .de BBI con un sitio 3'HindIII para la clonación en el vector pJM103.

Se generaron fragmentos de PCR con o sin una His-Tag C-terminal con los cebadores BBIfusion_FW (SEQ ID NO: 14) y BBIHISindIII_RV (SEQ IN NO: 16) . O BBIfusion_FW (SEQ ID NO: 14) y BBI-HindIII_RV (SEQ IN NO: 15), respectivamente, usando el gen sintético de BBI como una plantilla. A menos que se indique de otro modo, las reacciones de PCR se realizaron típicamente en un termocicladora durante 30 ciclos con Taq-polimerasa Platino de Alta Fidelidad (Invitrogen) de acuerdo a las instrucciones del proveedor (con una temperatura de fijación de 55 °C) . Los fragmentos de PCR se clonaron como fragmento de BamHI-HindIII en pJM103 que tiene el cásete de expresión aprE-BCE103. La secuencia génica correcta se verificó por secuenciación de ADN..

De esta manera, como se muestra en las Figuras 1A a ID, el N- terminal de la región codificante madura del gen de BBI (con o sin el His- Tag) se fusionó en cuadro a la región codificadora C-terminal de la primera secuencia ligadora de CBD (dominio de unión a celulosa) codificada por el gen de celulasa BCE103. De este modo, los dos CBD de BCE103 (Shaw et al., supra) se reemplazaron por BBI en los vectores finales de expresión, pJM103BBI o pJM103BBIhis (Ver, Figura 2) . El promotor aprE controla la expresión de las fusiones génica BCE103-BBI (Ver, Ferrari et al., J. Bact . , 170:289-295

[1988]; y Henner et al., J. Bact., 170:296-300

[1988]).

Las células competentes de Bacillus subtílis BG3934comK (deglf¥ 32, oppA, AspollE3501 , AaprE, AnprE, AeprA, AíspA, Abpr, amyE: :xylRPxylAcomK-phleo) , se transformaron con los plásmidos de expresión pJM103BBI o pJM103BBIhis . Las bacterias se hicieron competentes por la inducción del gen comK bajo el control de un promotor inducible de xilosa (Hahn et al., Mol. Microbiol., 21:763-775

[1996]). Los transformantes se seleccionaron en placas de agar de Caldo Luria (LA) que contiene 5 pg/ml de cloranfenicol . Para incrementar la expresión por amplificación génica, las colonias se vetearon y cultivaron varias veces en placas de LA con 25 g/mL de cloranfenicol hasta que la velocidad de crecimiento con el antibiótico fue similar a la velocidad de crecimiento en la ausencia de cloranfenicol . Se produjo la proteína de fusión de BCE103-BBI por cultivo en matraces agitados a 37 °C en medio TSB (Caldo de Triptona de Soya de OXOID, 30 g/L) o en medio MBD, un medio definido basado en MOPS . El medio MBD se hizo esencialmente como se describe (Neidhardt et al., J. Bacteriol . , 119:736-747

[1974]), excepto que se dejaron NH4C12, FeS04, y CaCl2, fuera del medio base, se usó K2P04, 3 mM, y el medio base se complementó con urea 60 mM, 75 g/L de glucosa, y 1 % de soytone . También, los micronutrientes se constituyeron como un material concentrado 100 X que contiene en un litro, 400 mg de FeS04'7H20, 100 mg de MnS04H20, 100 mg de ZnS04-7H20, 50 mg de CuCl2'2H20, 100 mg de COCl2'6H20, 100 mg de NaMo042H20, 100 mg de Na2B4O '10H2O, 10 mi de CaCl2 1M, 10 mi de citrato de sodio 0.5 M .

Se puede visualizar fácilmente la proteína de fusión de BCE103-BBI en muestras de sobrenadantes libres de célula (después de 24 horas de crecimiento en medio TSB o 48 horas en medio MBD) como la banda principal de proteína en geles de SDS-PAGE (NuPAGE al 10 % en amortiguador MES, corrido como se describe por el fabricante, Invitrogen) que corre a -44 kDA al usar manchas de proteína normal (por ejemplo GelCode Blue Stain Reagent; Pierce) . La identidad de la proteína de fusión BCE1033-BBI se verificó por inmunotransferencnias de geles de SDS-PAGE usando los protocolos administrados por el fabricante (Equipo de Transferencia Western Cromogénico BM; Roche Applied Science usando un anticuerpo anti-HisTag o un anticuerpo policlonal anti-celulasa BCE103 para la detección) .

Para determinar la actividad de BCE103, se valoró cualitativamente la degradación de celulosa en placas indicadoras de celulasa de LA (con 1 % de carboximetilcelulosa teñida con Rojo Congo al 0.2 %, o con azo-CM-celulosa al 0.5 %·, Megazyme) , o de manera cuantitativa por un ensayo directo en amortiguador de ensayo (Tris 100 mM, pH 8.6, Tween-80 al 0.005 %) en el caldo de cultivo usando el sustrato sintético 4-nitrofenil-DD-celobiosida (Sigma) , usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, van Tilbeurgh et al., Meth. Enzymol . , 160:40-59

[1988]).

Se realizaron ensayos inhibitorios de tripsina en Amortiguador de Ensayo para determinar la actividad de BBI . De manera específica, se generó una curva normal al producir once diluciones en serie 1:1 (100 µ?_ de BBI + 100 µ?_ de Amortiguador de Ensayo) de una solución de BBI normal de 2 g/mL. La norma de BBI se purificó de una solución de inhibidor de Tripsina-Quimiotripsina a 1 mg/ml (Sigma Cat . #T-9777) en MES 20 mM pH 6.0 usando una columna de interacción hidrófoba (POROS HP2 , columna fenilo, Applied Biosystems) . La columna se puso en equilibrio con MES 20 mM pH 6.0, cargada con 5 mg del inhibidor, lavada con el amortiguador de equilibrio, y luego el BBI se diluyó con agua. Las muestras de BBI desconocidas que se van a probar en el ensayo inhibitorio se diluyeron como sea necesario, de modo que dos o más puntos de datos caerán dentro de la curva normal (usualmente diluciones de muestra a 1:10, 1:100, 1:200, 1:1000 1:2000 se probaron y luego las diluciones se ajustaron finamente si es necesario) . A cada 20 L de norma muestra de BBI diluida, se adicionaron 80 L de tripsina pancreática bovina a 50 ng/ml (Worthington) (producida al diluir una dilución concentrada de tripsina a 1 mg/mL en Amortiguador de Ensayo) . Por conveniencia, las normas y las muestras se arreglaron en placas de microtítulo de 96 concavidades. Las reacciones se mezclaron e incubaron 15 minutos a 25°C. Después de la incubación, se adicionaron 100 L del sustrato de tripsina a 0.5 mg/ml (diluida en Amortiguador de Ensayo de una solución a 100 mg/ml en DMSO) , Suc-AAPR-pNA (succinil-Ala-Ala-Pro-Arg-para-nitroanilida, Bachem) , y se mezclaron y se monitorizó la OD (A405) durante 15 minutos, con un punto de tiempo registrado cada 12 segundos usando un Spectra Max 250 (Molecular Devices) . Los puntos de datos se usaron para determinar la Vmax para cada reacción. La curva normal se generó al graficar Vmax versus concentración de BBI y se ajustó a una curva de cuatro parámetros. Todos los ajustes de datos se hicieron usando software suministrado por el fabricante (Molecular Devices) . La concentración de BBI de las muestras desconocidas se calculó de la curva normal. De manera alternativa, la actividad de BBI se midió usando el mismo protocolo pero al determinar la inhibición de quimiotripsina pancreática bovina (Worthington) (se usó quimiotripsina a la misma concentración puesto que la actividad de tripsina y quimiotripsina se midió al adicionar 100 pL de un sustrato de quimiotripsina a 0.4 mg/ml, succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-para-nitroanilida, Bachem) .

Los títulos de las corridas de los matraces agitados (500 mi de medio MBD en matraces con deflectores Fernbach 6 de 2.8 L, 37°C, 225 rpm, recolectados 60 horas después del crecimiento) variaron típicamente de 0.4-0.9 de mg/ml de actividad de BCE y 40-150 g/ml de actividad inhibitoria de tripsina de BBI. Sin embargo, se contempla que los títulos igualmente se pueden mejorar adicionalmente al optimizar la cepa bacteriana, medio de cultivo y condiciones de crecimiento (aireación, temperatura, tiempo de recolección, etc.) .

Además de la fusión de BCE103 al BBI tipo silvestre, se produjeron proteínas de fusión a variantes de BBI y proteínas de fusión con varios ligadores entre BCE103 y BBI usando los métodos resumidos anteriormente, como se describe en los siguientes ejemplos. Además, también se produjeron proteínas de fusión donde el BBI se fusionó al segundo ligador de CBD (BCE- cbdD-BBI ; ver Ejemplo 4) que hace posible usar el primer CBD para ayudar en el proceso de purificación .

Ejemplo 2 Producción de Péptidos Sustituidos en las Asas de Sitio Reactivo de BBI como Proteínas de Fusión de BCE103-BBI En este ejemplo, se describen experimentos llevados a cabo para producir péptidos sustituidos en las asas de sitio reactivo de BBI como proteínas de fusión de BCE103-BBI. Los cebadores, así como otras secuencias usadas en los varios pasos de estos experimentos se proporcionan más adelante. La secuencia de 12BBIck81 del sitio de fusión de BCE103 (en el BairíHI) al final del gen se proporciona en la Figura 3. Las secuencias peptídicas de CK37281 (ACYNLYGWTC (SEQ ID No. 9) se insertan tanto en las asas inhibitorias de tripsina como de quimiotripsina .

Los cebadores usados para introducir un sitio de EcóRl en el gen de BBI usando mutagénesis dirigir al sitio QuikChangeMR (Stratagene) fueron: BowBeco-F 5 ' -GATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCAT (SEQ ID No. 17) BowBeco-R 5 ' -ATGCACTATGACAGGAATTCAGACGCATATC (SEQ ID No . : 18) Las secuencias de los oligonucleótidos de ADN que se fijaron y clonaron en el gen de BBI (SacI-EcoRI) para reemplazar el asa inhibitoria de tripsina con el péptido de unión a VegF CK37281 fueron: lBBck81+ 5 ' -CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTTATAATTTGTATGGGTGGACTT GTCGCTGCAGCGATATGGGTCTG (SEQ ID No . 19) lBBck81- 5 ' -AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAAGTCCACCCATACAAATTATAA CATGCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID No.: 20) Las secuencias de los oligonucleótidos de ADN que se fijaron y clonaron en el gen de BBI (EcoRI-SalI) para reemplazar la asa inhibitoria de quimiotripsina con el péptido de unión a VegF CK37281 fueron: 2BBck81+ 5 ' -AATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGG TGGACCTGTTTTTGCG (SEQ ID No. 21) 2BBck81- 5 ' -TCGACGCAAAAACAGGTCCACCCGTACAGGTTATAACATGCGCAGCTTTT GCAGGCACTATGACAGG (SEQ ID No . : 22) Las secuencias de ADN de los pares de oligonucleótidos usados para producir casetes para introducir péptidos en las asas de sitios reactivos de tripsina (sitios de restricción Sal y EcoRI) o de quimiotripsina (sitios de restricción de EcoRI y Salí) del gen de BBI sintético se proporciona mas adelante. Estas secuencias codificadoras peptídicas entonces se movieron al vector de expresión p2JM103BBI como fragmentos de Sacl-Sall.

Constatina (1er asa) CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTGTTGTTCAGGACTGGGGTCACCACC GTTGTCGCTGCAGCGGATATGCGTCTG (SEQ ID No . 23) y AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAACGGTGGTGACCCCAGTCCTGAACA ACACATGCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID No. 24) Constantina (2a asa) CAAAAGCTGTATCTGCGTTGTTCAGGACTGGGGTCACCACCGTTGTTTTTGCG (SEQ ID No. 25) y TCGACGCAAAAACAACGGTGGTGACCCCAGTCCTGAACAACGCAGATACAGCT TTTGCATG (SEQ ID No . 26) C2c (1er asa) CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCAGCTGTGGTCGTAAAATCCCGATCCAGTGTC GCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID No . : 27) y AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACTGGATCGGGATTTTACGACCACAGC TGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID No . 28) C3c (1er asa) CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGGTTGTGCTCGTTCTAACCTGGACGAATGTC GCTGCAGCGATATGCGTCTGG (SEQ ID No . : 29) y AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACATTCGTCCAGGTTAGAACGAGCACAAC CGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID No . : 30) C4c (1er asa) CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGGTTGTCAGCGTGCTCTGCCGATCCTGTGTC GCTGCAGCGATATGCGTCTG ( SEQ ID No . : 31). y AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACAGGATCGGACAGAGCACGCTGACAA CCGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID No . 32) C5c (1er asa) CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCCAGTGTGGTCGTCTGCACATGAAAACCTGTC GCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID No . : 33) . y AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACAGGTTTTCATGTGCAGACGACCACACT GGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID No . : 34) Xal (2a asa) AATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTGTATCTGCGCCCGTAGTTTGCCAGCT CAATGTTTTTGCG (SEQ ID No . : 35) y TCGACGCAAAAACATTGAGCTGGCAAACTACGGGCGCAGATACAGCTTTTGCAG GCACTATGACAGGG (SEQ ID No . 36) hSSCCl (1er asa) CTAAACCCTGTTGCGATCAATGCAACTGTACGTACTCAACCCCTCCACAGTGTC GCTGCAGCGATATGCGTCTG (SEQ ID No. 37) y AATTCAGACGCATATCGCTGCAGCGACACTGTGGAGGGGTTGAGTACGTACAG TTGCATTGATCGCAACAGGGTTTAGAGCT (SEQ ID No . 38) Las secuencias de ADN de los pares de cebadores de oligonucléotido usados para introducir secuencias peptídicas en las asas de sitio reactivo de tripsina o quimiotripsina usando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio QuikCHangeME II XL (Stratagene) se proporcionan a continuación. Las reacciones se realizaron como se resume por el fabricante y se describe en este ejemplo. Se realizaron veinte ciclos con extensiones de 6 minutos a 68 °C, desnaturalizaciones de 50 s a 95°C, y fijaciones a 55°C durante 50 s. Después de los ciclos, se realizó una extensión final a 68 °C durante 20 minutos . 1 (2a asa) CTGTATCTGCAAACGCTCAAAATCTCGTGGCTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No . 39 ) y CGCAAAAACAGCCACGAGATTTTGAGCGGTTTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 40) 2B (2a asa) CTGTATCTGCTGGTATAATCAAATGACAACATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 41) y CGCAAAAACATGTTGTCATTTGATTATACCAGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No . 42) 4A (2a asa) CTGTATCTGCCATCAACTTGGCCCGAATTCATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 43) y CGCAAAAACATGAATTCGGGCCAAGTTGATGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 44) 5A (2a asa) CTGTATCTGCCATCCGTGGGCACCGTATTCTTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 45) y CGCAAAAACAAGAATACGGTGCCCACGGATGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 46) 6-1A (2a asa) CTGTATCTGCAATCTTCATTATCTTCAACAGTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 47) y CGCAAAAACACTGTTGAAGTAATGAAGATTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 48) 7A (2a asa) CTGTATCTGCACACCGTCTCTTTATCGCCCGTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 49) y CGCAAAAACACGGGCGATAAAGAGACGGTGTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 50) 8B (2a asa) CTGTATCTGCCTTACAGATCAATCTAAACCGTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 51) y CGCAAAAACACGGTTTAGATTGATCTGTAAGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 52) 9A (2a asa) CTGTATCTGCGTTACAACATCAATGGGCATGTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 53) y CGCAAAAACACATGCCCATTGATGTTGTAACGCAGATACAGCTTTTGCATGG .

(SEQ ID No. 54) 10B (2a asa) CTGTATCTGCCGCGCATCACCGTATGATTGGTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 55) y CGCAAAAACACCAATCATACGGTGATGCGCGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 56) 11-1A (2a asa) CTGTATCTGCTCAACACAAAAAATTCCGCAATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 57) y CGCAAAAACATTGCGGAATTTTTTGTGTTGAGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 58) 12B (2a asa) CTGTATCTGCACAATTTCGCTCTGCAACATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 59) y CGCAAAAACATGTTGCAGAGCGAAATTGTGTGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 60) 13A (2a asa) CTGTATCTGCCCGGATCATGTTCCGCATCTTTGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No 61) y CGCAAAAACAAAGATGCGGAACATGATCCGGGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 62) 15-1A (2a asa) CTGTATCTGCTCAGGCTTTCCGCTTTCTACATGTTTTTGCGTCGACATCAC (SEQ ID No. 63) y CGCAAAAACATGTAGAAAGCGGAAAGCCTGAGCAGATACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 64) 1A6 (1er asa) TCAATGCGCATGTGAAGAGATCTGGGACTATGCTTTGCCGGTGTTCCGATATGCG TC (SEQ ID No. 65) y CGGAACACCGGCAAAGCATAGTCCAGATCTCTTCACATGCGCATTGATCGCAAC AGG (SEQ ID No. 66) 1A6 (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGTGAAGAGATCTGGACTATGCTTTGCTTTTGCGTCGACAT CACGGG (SEQ ID No. 67) y ACGCAAAAGCAAAGCATAGTCCAGATCTCTTCACAAGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 68) 1C2 (1er asa) TCAATGCGCATGTTGGGCCCTTACTGTCAAAACATGCCGGTGTTCCGATATGCG TC (SEQ ID NO. 69) y CGGAACACCGGCATGTTTTGACAGTAAGGGCCCAACATGCGCATTGATCGCAA CAGG (SEQ ID No. 70) 1C2 (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGTTGGGCCCTTACTGTCAAAACATGCTTTTGCGTCGACAT CACGG (SEQ ID No. 71) y ACGCAAAAGCATGTTTTGACAGTAAGGGCCCAACAAGGCAACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 72) 2E2 (1er asa) TCAATGCGCATGTCTTACAGTACTGTGGACTACATGCCGGTGTTCCGATATGCG TC (SEQ ID NO. 73) y CGGAACACCGGCATGTAGTCCACAGTACTGTAAGACATGCGCATTGATCGCAAC AGG (SEQ ID No . 74) 2E2 (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGTCTTACAGTACTGTGGACTACATGCTTTTGCGTCGACATC 5 ACGG (SEQ ID No . 75) y ACGCAAAAGCATGTAGTCCACAGTACTGTAAGACAAGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 76) 2E5 (1er asa) o TCAATGCGCATGTACTCTTTGGAACAGATCTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCG TC (SEQ ID NO. 77) y CGGAACACCGGCAAGGAAGATCTGTTCCAAAGAGTACATGCGCATTGATCGCAA CAGG (SEQ ID No. 78) 5 2E5 (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGTACTCTTTGGAATCGATCTCCTTGCTTTTGCGTCGACATC ACGG (SEQ ID No. 79) y ACGCAAAAGCAAGGAGATCGATTCCAAAGAGTACAAGCACAGCTTTTGCATGCA 0 CTATG (SEQ ID No. 80) FGFns (1er asa) TCAATGCGCATGTACAAAACATCGATTCTACTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCG TC (SEQ ID No. 81) y 5 CGGAACACCGGCAAGGAGTAGAATCGATGTTTGTACATGCGCATTGATCGGCAAC AGG (SEQ ID No. 82) FGF ns (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGCACAAACATCGATTCTACTCCTTGTTTTTGCGTCGACATC ACGG (SEQ ID No. : 83) y ACGCAAAAACAAGGAGTAGAATCGATGTTTGTGCAAGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 84) FGFkr (1er asa) TCAATGCGCATGTACAAAAATCGATCGTACTCCTTGCCGGTGTTCCGATATGCG TC (SEQ ID No. 85) y CGGAACACCGGCAAGGAGTACGATCGATTTTTGTACATGCGCATTGATCGCAAC . AGG (SEQ ID No. 86) FGFkr (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGCACAAAAATCGATCGTACTCCTTGTTTTTGCGTCGACATC ACGG (SEQ ID No. 87) y ACGCAAAAACAAGGAGTACGATCGATTTTTGTGCAAGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 88) FGFhl (1er asa) TCAATGCGCATGTCACCTGCAGACAACTGAAACATGCCGGTGTTCCGATATGGCG TC (SEQ ID No. 89) y CGGAACACCGGCATGTTTCAGTTGTCTGCAGGTGACATGCGCATTGATCGCAAC AGG (SEQ ID No. 90) FGFhl (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGCCACCTGCAGACAACTGAAACATGTTTTTGCGTCGACAT CACGG (SEQ ID No. 91) y ACGCAAAAACATGTTTCAGTTGTCTGCAGGTGGCAAGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 92) FGFgy (1er asa) TCAATGCGCATGTGGCTACTTCATCCCATCGATTTGCCGGTGTTCCGATATGCGG TC (SEQ ID No. 93) y CGGAACACCGGCAAATCGATGGGATGAAGTAGCCACATGCGCATTGATCGCAA CAGG (SEQ ID No . 94) FGFgy (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGCGGGCTACTTCATCCCATCGATTTGTTTTTGCGTCGACATC ACGG (SEQ ID No, 95) y ACGCAAAAACAAATCGATGGGATGAAGTAGCCGCAAGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 96) MM005 (1er asa) TCAATGCGCATGTTTACGTATCCTTGCTAACAAATGCCGGTGTTCCGATATGCGT C (SEQ ID No. 97) y CGGAACACCGGCATTTGTTAGCAAGGATACGTAAACATGCGCATTGATCGCAAC AGG (SEQ ID No. 98) MM005 (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGCTTACGTATCCTTGCTAACAAATGTTTTTGCGTCGACATC ACGG (SEQ ID No . 99) y ACGCAAAAACATTTGTTAGCAAGGATACGTAAGCAAGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No . 100) MM007 (1er asa) GCGATCAATGCGCCTGCAGAACTCAACCTATCCTTTATGTCGGTGTTCCGATA TGCGTC (SEQ ID No. 101) y GGAACACCGACATAAAGGATATGGTTGAGTTCTGCAGGCGCATTGATCGCAACA GGGTTT (SEQ ID No . 102) MM007 (2a asa) CAAAAGCTGTGCCTGCAGAACACAACCTTACCCACTTTGTTTTTGCGTCGACAT CACGG (SEQ ID No . 103) y ACGCAAAAACAAAGTGGGTAAGGTTGTGTTCTGCAGGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No . 104) M 009 (2a asa) CAAAAGCTGTGCCTGCCTGTTAACACCTACTCTTAACTGTTTTTGCGTCGACATC ACGG (SEQ ID No . 105) y ACGCAAAAACAGTTAAGAGTAGGTGTTAACAGGCAGGCACAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 105) MM010 (1er asa) TCAATGCGCATGCGCTCTTCCAACTCATTCTAACTGTCGGTGTTCCATATGCG TCT (SEQ ID No. 107) y CGGAACACCGACAGTTAGAATGAGTTGGAAGAGCGCATGCGCATTGATCGCAA CAGG (SEQ ID No. 108) MM010 (2a asa) CAAAAGCTGTGCCTGCGCGCTTCCTACACACTCTAACTGTTTTTGCGTCGACAT CACGG (SEQ ID No. 109) y ACGCAAAAACAGTTAGAGTGTGTAGGAAGCGCGCAGGCACAGCTTTTGCATGC ACTATG (SEQ ID No. 110) MM017 (2a asa) CAAAAGCTGTGCCTGCCCTTTAGGCCTTTGCCCACCTTGTTTTTGCGTCGACAT CACGG (SEQ ID No. 111) y ACGCAAAAACAAGGTGGGCAAAGGCCTAAAGGGCAGGCACAGCTTTTGCATGC ACTATG (SEQ ID No. 112) FGFpsl (2a asa) AAGCTGTATCTGCTGGAACATCGATTCTACACCTTGTTTTTGCGTCGACATCACG G (SEQ ID No. 113) y ACGCAAAAACAAGGTGTAGAATCGATGTTCCAGCAGATACAGCTTTTGCATGCA CT (SEQ ID No. 114) FGFps2 (1er asa) GCGATCAATGCATCTGTACTTGGATTGACAGTACTCCTTGTCGGTGTTCCGATAT GCGTC (SEQ ID No. 115) y GGAACACCGACAAGGAGTACTGTCAATCCAAGTACAGATGCATTGATCGCAACA GGGTTT (SEQ ID No . 116) FGFps2 (2a asa) AAGCTGTATCTGCACATGGATCGATAGTACTCCTTGTTTTTGCGTCGACATCACG G (117) y ACGCAAAAACAAGGTGTAGAATCGATCCATGTGCAGATACAGCTTTTGCATGCA CT (SEQ ID No. 118) FGFpsB (2a asa) AAGCTGTATCTGTACATGGATCGATTGGACACCTTGTTTTTGCGTCGACATCAC GG (SEQ ID No. 119) y ACGCAAAAACAAGGTGTCAATCGATCCATGTACAGATACAGCTTTTGCATGCA CT (SEQ ID No. 120) 1A8 (2a asa) CAAAAGCTGCGCATGTGTTACTACAGATTGGATCGAATGTTTTTGCGTCGACAT » CACGG (SEQ ID No . 121) y¦ ACGCAAAAACATTCGATCCAATCTGTAGTAACACATGCGCAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 122) 1A12 (2a asa) CAAAAGCTGTGCCTGCCCAACACTTTGGACTCATATGTGTTTTTGCGTCGACAT CACGGAC (SEQ ID No . 123) ACGCAAAAACACATATGAGTCCAAAGTGGTTGGGCAGGCACAGCTTTTGCATGCA CTATGAC (SEQ ID No . 124) 1E11 (2a asa) CAAAAGCTGCGCATGTTACTACTCTCAATTCCACCAATGTTTTTGCGTCGACATC ACGG (SEQ ID No . 125) Y ACGCAAAACATTGGTGGAATTGAGAGTAGTAACATGCGCAGCTTTTGCATGCA CTATG (SEQ ID No. 126) TGFpsl (2a asa) CAAAAGCTGTCTTTGTCCGGAAAACGATAACGTTTCTCCTTGTAATTGCGTCGAC ATCACGGACTTCTG (SEQ ID No . 127) y TGTCGACGCAATTACAAGGAGAAACGTTATCGTTTTCCGGACAAAGACAGCTTT TGCATGCACTATGAC (SEQ ID No . 128) Las secuencias de ADN del par de oligonucleótidos usado para producir el cásete para introducir el péptido MM021 en las asas de sitio reactivo de quimiotripsina del vector de expresión p2JM103-Ink2-BBI se proporcionan a continuación. El cásete se ligó en los sitios de restricción Sphl y Salí MM021 (2a asa) CAAAAGCTGTGCTTGTAAACACAACGTACGTCTTTTATGTTTTTGCG (SEQ ID No. 129) y TCGACGCAAAAACATAAAAGACGTACGTTGTGTTTACAAGCACAGCTTTTGCATG (SEQ ID No. 130) Las bibliotecas producidas de péptidos restringidos de cisteína son reactivos populares (por ejemplo, el equipo de biblioteca peptídica de visualización en fagos PhD-C7C Comercialmente disponible; NEB) para seleccionar péptidos que se unen a sustratos de interés. El BBI tiene dos asas de sitio reactivo, restringidas de cisteína que son estructuralmente similares a las asas peptídicas presentadas en varios métodos para seleccionar aglutinantes peptídicos . De este modo, una vez que se ha seleccionado un péptido de unión restringido de cisteína, el BBI es adecuado para el uso como un núcleo molecular para presentar el péptido en una reacción de unión.

El péptido de unión a VEGF CK37281 (ver, por ejemplo, solicitud co-pendiente provisional de Patente de los Estados Unidos No. De Serie 60/520,403, presentada el 13 de noviembre de 2003, incorporada en la presente como referencia) se injertó en el BBI al reemplazar las asas de sitio reactivo de tripsina, de quimiotripsina o de ambas, con l secuencia peptídica CK37281 (ACYNLYGWTC) (SEQ ID No: 9) al usar casetes de oligonucleótido de ADN. Para facilitar la construcción, se introdujo un sitio de EcoRI en la región codificadora del gen de BBI (sintetizado habitualmente por Operon Technologies; ver, Ejemplo 1) entre las asas de sitio reactivo de tripsina y quimiotripsina por mutagénesis dirigida al sitio QuikChange , usando los métodos descritos por el fabricante (Stratagene) usando los cebadores BowBeco-F y BowBeco-R, mostrados anteriormente (se usó 0.5 pmol de cada cebador en la reacción QuikChangeMR; después de un paso inicial de desnaturalización de 97 °C durante 3 minutos, 18 ciclos de PCR de 68°C durante 12 minutos, 95°C durante 30 segundos y 55°C durante un minuto, seguido por una reacción de extensión final durante 15 minutos a 68 °C) .

Para reemplazar la asa peptídica inhibitoria de tripsina, se fijaron dos oligonucleótidos de ADN (IBBCK81+ y lBBCk81-) y se ligaron en los sitios de restricción SacI y EcoRI . Igualmente, para reemplazar la asa peptídica inhibitoria de quimiotripsina, se usaron los sitios EcoRI y Salí para la inserción de un cásete de ADN producido al fijar los oligonucleótidos (2BBck81+ y 2BBck81-) . El péptido CK37281 se injertó en ambas asas al insertar el péptido CK37281 en la asa de quimiotripsina (usando los oligonucleótidos (2BBck81+ y 2BBck81-) después de que la asa de quimiotripsina se reemplazó primero por el péptido CK37281. El BBI con el péptido CK37281 en la asa de tripsina (lBBlck81) se movió en el vector de expresión pJM103BBI como un fragmento de Sacl-Sphl . El BBI con CK37281 en la asa de quimiotripsina (2BBIck81) , o ambas asas (12BBIck81) , se movió en pJM103BBI como fragmentos de Sacl-Sall . Las secuencias correctas se verificaron por secuenciación de ADN (la secuencia del gen de 12BBIck81 se muestra en la Figura 3) . Los vectores resultantes pJM103 - lBBIck81 , pJM103 - 2BBIck81 , o pJM103-12BBIck81, se usaron para transformar B. subtilis BG3934comK, y la producción de las proteínas de fusión de BCE se determinó como en el Ejemplo 1 anterior.

La proteína de fusión que corre a -44 kDa se detectó por SDS-PAGE que es la proteína principal presente en el caldo libre de células. Aunque en algunos casos, hubo degradación significativa (hasta 50 %) de la porción de BBI (especialmente después de > 48 horas de crecimiento en medio MBD) , como se observa por la presencia de una banda prominente de proteína que corre a -34 kDa que corresponde al núcleo catalítico BCE 103. En estos casos, los títulos de la celulasa BCE 103 fueron similares a aquellos medidos con fusiones al BBI tipo silvestre (Ejemplo 1) , pero la actividad del BBI (inhibición de tripsina con 2BBlck81, o inhibición de quimiotripsina con lBBIck81) fue en general aproximadamente dos veces menor.

Para reducir la degradación proteolítica de las variantes de BBI durante el crecimiento (es decir, disminuir la cantidad del núcleo de celulasa BCE 103 presente en los geles de SDS-PAGE en comparación a las proteínas de fusión) , una cepa de Bacillus subtilis con nueve genes de proteasa suprimidos BG6006 {deglfy32, oppA, AspoIIE3501 , AaprE, nprE, Aepr, AispA, Abpr, Avpr AwprA, Ampr-ybj F, AnprB, amyE: :xyIRPxylAcomK-ermC) , se usó como un hospedador de expresión, y se redujeron a temperatura de crecimiento (35°C) y la aereación (200 rpm) . Con estos cambios, se observó la banda principal de proteína de fusión (~ 44 kDa) en los geles de SDS-PAGE con una banda insignificante presente en el peso molecular esperado para la proteína núcleo catalítica BCE (~ 34 kDa) .

Además del péptido CK37281, se produjeron varios péptidos restringidos de cisteínas, diferentes cuando se sustituyó en las asas de sitio reactivo de tripsina y/o quimiotripsina del BBI fusionado al C-terminal de la celulasa BCE 103. Los ejemplos específicos se incluyeron: (1) Péptidos diseñados o seleccionados como antagonistas de complemento, constatina introducida en la Ia o 2a asa de sitio reactivo (ver, Sahu et al., J. Immunol., 157: 884-891,

[1996]), C2c (1er asa) C3c (1er asa), C4c (1er asa) y C5c (1er asa) ; o péptidos seleccionados en una reacción de unión a Factor B IB, 2B, 4A, 5A, 6-1A, 7A, 8B, 9A, 10B, 11-1A, 12B, 13A, y 15-1A (todas en la 2a asa) ; (2) Péptidos diseñados para la unión a las proteasas factor Xa o quimiotripsina de extracto corneo Xal (2a asa) o hSCCl (1er asa), respectivamente; (3) Péptidos seleccionados en las reacciones de unión a FGF5 1A6 (1er o 2a asa), 1C2 (1er o 2a asa), 2E2 (1er o 2a asa) , 2E5 (1er, 2a o ambas asas) , FGFns (1er o 2a asa) , FGFkr (1er o 2a asa) , FGFhl (1er o 2a asa), FGFgy (1er o 2a asa) , MM005 (1er o 2a asa) , M 007 (1er, 2a o ambas asas) , MM009 (2a asa), MM010 (1er, 2a o ambas asas), MM017 (2a asa), FGFpsl (2a asa), FGFps2 (1er, 2a o ambas asas), y FGFpsB (2a asa); y (4) Péptidos seleccionados en las reacciones de unión a TGF -l 1A8 (2a asa) , 1A12 (2a asa) , 1E11 (2a asa) , TGFpsl (2a asa) , y MM021 (2a asa) .

Los oligonucleótidos usados para introducir estos péptidos en ya sea las asas de sitio reactivo de tripsina (1er asa) ó quimiotripsina (2a asa) , y los métodos usados para injertar estos péptidos a BBI, se proporcionan a continuación. En todos los casos, se produjeron proteínas de fusión como se determina por geles de SDS-PAGE. Sin embargo, con algunos péptidos sustituidos, la cantidad de proteína de fusión intacta se incrementó al reducir la degradación proteolítica como se describe anteriormente para el péptido sustituido CK37281.

Ejemplo 3 Activación de BBI por Agentes Reductores/Oxidantes de Tiol Después del crecimiento, la actividad del BBI (por inhibición de tripsina o quimiotripsina) es típicamente algo 5-20 veces menor que aquella que se esperaría de la actividad de la celulasa BCE103 medida en sobrenadantes libres de célula (las dos moléculas deben estar presentes a una relación molar 1:1 en la proteína de fusión) . Un incremento en la actividad de BBI (medida ya sea por inhibición de tripsina o quimiotripsina) en la proteína de fusión BCE103-BBI se puede obtener por rutina al adicionar ß??, típicamente a concentraciones de 1-4 mM adicionadas al medio de crecimiento de BD aproximadamente 14 horas después de la inoculación. La actividad inhibitoria de tripsina o quimiotripsina de BBI en la proteína de fusión también es menor que la esperada cuando los péptidos de unión (por ejemplo, péptido de unión a VegF CK37281) reemplazan la asa del sitio reactivo de quimiotripsina o tripsina, respectivamente. Como con el BBI tipo silvestre, se puede incrementar la actividad inhibitoria por tratamiento con ß?? . Inesperadamente, otros agentes reductores de tiol (por ejemplo, cisteína, glutationa reducida, DL-ditiotreitol y Tris [2-carboxietil] fosfina) tiene efectos pequeños o imperceptibles en la activación de BBI durante el crecimiento en estos experimentos. También, las adiciones de antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico o acetato de DL- -tocoferol) u otros adyuvantes al medio de crecimiento (por ejemplo, isoleucina, aceite de soya, Tween 80) , o cultivado a 30°C no mejoran de manera significativa la relación de actividad de BCE103.-BBI.

Específicamente, para determinar la activación de BBI durante el crecimiento, cultivos de B . sutilis BG6006 transformado con p2JM103-E3-2BBIck81 (ver, Ejemplo 4 posterior) se cultivaron en 40 mi de medio BD en matraces agitados de 250 mi a 37°C durante 13 horas. Entonces, los agentes reductores de tiol indicados · en la gráfica en la Figura 4 se adicionaron y los sobrenadantes celulares se recolectaron después de 62 horas de crecimiento. Los reactivos 2 -mercaptoetanol (BME) , cisteína (Cys) , glutationa reducida (Glut) , y DL-ditiotreitol (DTT) se adicionaron por medio de crecimiento a las concentraciones finales indicadas en la gráfica proporcionada en la Figura 4. Las concentraciones de ß?? 5 mM pueden dar por resultado mejores relaciones de actividad de BCE103:BBI pero típicamente dan por resultado una disminución completa tanto en los títulos de BCE103 como de BBI (ver Figura 4) , al menos parcialmente debido a la reducción en el crecimiento bacteriano provocado por el reactivo adicionado. Se determinaron los títulos de BCE103 y 2BBIck81 usando los ensayos descritos en el Ejemplo 1.

También se logró la activación de BBI después de la purificación parcial de las proteínas de fusión (por ejemplo BCE-Ink2-2BBIck81, ver Ejemplo 4 posterior) por cromatografía de intercambio iónico de Q-sefarosa.

La proteína de fusión se purificó de caldo libre de células obtenido de matraces agitados o corridas de termentador. El caldo se filtró, se diluyó de cinco a diez veces en agua y el pH se ajustó a pH 7.5-8.0. La muestra diluida se cargó en una columna envasada con resina de Q-sefarosa (GE Healthcare) . La columna se lavó con Tris 50 mM pH 7.5 y luego se lavó nuevamente en el mismo amortiguador que contiene NaCl 300 mM. La proteína de fusión se eluyó en el mismo amortiguador con NaCl 700 mM.

Para activar el BBI, las fracciones mezcladas de la proteína de fusión se diluyeron diez veces en amortiguador de ensayo, luego se trataron con ß?? 2 mM y glutationa oxidada (GSSG) 0.2 mM con mezclado constante en una plataforma mecedora o de placa agitadora durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente . El BBI se puede activar en general a aproximadamente 70 - 100 % de la actividad inhibitoria de tripsina, esperada, en base a la concentración medida de la celulasa BCE103. Aunque el método de activación resumido anteriormente produjo en general los mejores resultados, en algunos casos, a fin de aumentar al máximo la activación de una muestra determinada, se realizaron exámenes en placas de 96 concavidades para determinar las condiciones óptimas. Inicialmente, las condiciones típicas examinadas fueron la dilución en Amortiguador de Ensayo (por ejemplo, una serie de dilución de 2-50 veces) , concentración de ß?? (por ejemplo, series entre 0.5-5 mM) y concentración de glutationa oxidada (por ejemplo 0 mM luego una serie de 1/20 a 1/2 la concentración de ß??) .

La activación de la proteína de fusión BCE-lnk2-2BBIck81 se muestra en la Figura 5. En este ejemplo específico, la proteína de fusión de una purificación en Q-Sefarosa se diluyó 1:10 en PBS de Dulbecco (Mediatech) con TWEENMR- 80 al 0.005 %. Se adicionó beta-mercaptoetanol a una concentración final de 3 mM y se incubó durante la noche a temperatura ambiente en una mecedora. La muestra se incubó adicionalmente a temperatura ambiente durante aproximadamente 60 horas con agitación vigorosa en una placa agitada magnética. Se determinaron los títulos de BCE103 y 2BBIck81 (antes y después del tratamiento con ß??) por ensayos de celulasa y ensayos inhibitorios de tripsina, respectivamente.

En algunas modalidades, tal como para activar BBI o sus variantes en caldo libre de células de fermentaciones de gran volumen, es deseable reducir la dilución y la concentración de ß?? en la reacción de activación. Esto se puede lograr al usar mayores concentraciones de amortiguador (Tris 500 mM pH 8.6), o cambiando a amortiguadores z iteriónicos tal como CHES (también CAPS, Tricina, TAPS, y otros amortiguadores zwiteriónicos adecuados) . Por ejemplo, el caldo libre de células (o fracciones de proteína de fusión purificadas por cromatografía de intercambio iónico), se diluyeron 1:1 en CHES 375 mM pH 8.6 con TWEENMR- 80 al 0.005 % luego se activó con ß?? 1 mM y Na2S03 10 mM y se incubó con agitación a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 h. El BBI o sus variantes, como las proteínas de fusión de celulasa BCE103, se activaron rutinariamente por este método a 70 - 100 % del valor esperado (en base a las actividades de celulasa BCE103) .

Ejemplo 4 Liberación de BBI Libre/Variantes por Escisión de las Proteínas de Fusión BCE103-BBI Este ejemplo describe experimentos desarrollados para liberar BBI libre o sus variantes por escisión de las proteínas de fusión BCE103-BBI.

Las secuencias de los pares de oligonucleótidos de ADN que se fiaron y ligaron en los sitios Ba HI y Sacl de pJM103-BBI para generar sitios potenciales de escisión durante el crecimiento de cultivo entre el dominio catalítico de BCE103 y BBI se proporcionan a continuación.

BCEsubBBI (una secuencia peptídica sensible, tipo subtilisina) GATCCAGGTGGAGCTGCTTTAGTTGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO:131) y CTCATCGTCAACTAAAGCAGCTCCACCTG (SEQ ID NO: 132) BCEcbdLBBI (una porción del lo CBD) GATCCAGGTGAACCTGACCCAACTCCTCCATCTGATCCTGGAGAATACCCAGCT TGGGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO : 133 ) y CTCATCGTCCCAAGCTGGGTATTCTCCAGGATCAGATGGAGGAGTTGGGTCAG GTTCACCTG (SEQ ID NO: 134) BCEproBBI (el pro péptido completo de BBI) GATCCGGCGAACCTGCGTCTGTCTAAGCTTGGCCTGCTTATGAAATCAGACCAT CAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 135) y CTCATCGTCATTGCTGTGCTGATGGTCTGATTTCATAAGCAGGCCAAGCTTAGA CAGACGCAGGTTCGCCG (SEQ ID NO: 136) BCEshortproBBI (una porción C- terminal del pro péptido de BBI) GATCCAAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 137) y CTCATCGTCATTGCTGTGCTGATGGTCTGATTTTG (SEQ ID NO: 138) Las secuencias del par de oligonucleótidos de ADN que se fijó y ligó en los sitios BamHI y Sacl de p2JM103-BBI para fusionar BBI al 2o ligador de CBD de la celulasa BCE103 se proporcionan a continuación.

BCEcbdDBBI GATCCAGGAGAACCGGACCCAACGCCCCCAAGTGATCCAGGAGAGTATCCAGC ATGGGATTCAAATCAAATTTACACAAATGAAATTGTGTATCATAACGGTCAGTTAT GGCAAGCGAAATGGTGGACACAAAATCAAGAGCCAGGTGACCCATACGGTCCG TGGGAACCACTCAAATCTGACCCAGATTCAGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 139) y CTCATCGTCTGAATCTGGGTCAGATTTGAGTGGTTCCCACGGACCGTATGGGTC ACCTGGCTCTTGATTTTGTGTCCACCATTTCGCTTGCCATAACTGACCGTTATGA TACACAATTTCATTTGTGTAAATTTGATTTGAATCCCATGCTGGATACTCTCCTGG ATCACTTGGGGGCGTTGGGTCCGGTTCTCCTG (SEQ ID NO: 140) Las secuencias peptídicas susceptibles a escisión ácida entre residuos de ácido aspártico y prolina se proporcionan a continuación.

Ligador 1 - WGDPHY (SEQ ID NO:141 ) (Lidell et al . , J. Biol . Chem. 278:13944-51

[2003]) Ligador 2 - DNNDPI (SEQ ID NO : 142 ) ( Segalas et al., FEBS Lett., 371 :171 -175

[1995]) Ligador 3 - VVADPN (SEQ ID NO : 143) (Kemperman et al . , Appl . Env. Microbiol., 69: 1589-1597

[2003]) Los cebadores de oligonucleótido usados para introducir un sitio BssHII en pJM103BBI por mutagénesis dirigida al sitio QuikChangeMR se proporcionan a continuación. BCEbss-F 5 ' - GGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCTGATGATTA (SEQ ID NO: 144) BCEbss-R 5 ' -TAATCATCAGCCTGCGCGCTCATGTTGCTGAACGCCA (SEQ ID NO: 145) Las secuencias de los oligonucleótidos de ADN que se fijaron como un cásete (SalI-HindIII) para introducir los sitios Hindlll y Xhol después del codón finalizador de BBI, para introducir un sitio Pací después del LAT, y para remover el sitio HindIII original, se proporcionan a continuación. BCEterm+ 5 ' -GACATCACGGACTTCTGCTATGAGCCATGTAAACCAAGCGAGGACGATAA AGAGAACTAAAAGCTTAACTCGAGGTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAA TCCGTTTTTTTATTTTTAATTAAG (SEQ ID NO: 146) BCEterm- 5 ' -AGCTCTTAATTAAAAATAAAAAAACGGATTTCCTTCAGGAAATCCGTCCTC TGTTAACCTCGAGTTAAGCTTTTAGTTCTCTTTATCGTCCTCGCTTGGTTTACATG GCTCATAGCAGAAGTCCGTGATG (SEQ ID NO: 147) Los cebadores de PCR usados para generar los ligadores lábiles a ácido proporcionados anteriormente (es decir, Ligador 1, Ligador 2, y Ligador 3) insertados entre el dominio catalítico de BCE103 y BBI se proporcionan a continuación .

BCE103núcleoBssHII_FW 5 ' -CAGCAACATGAGCGCGCAGGCTG (SEQ ID NO: 148) 1igadorWGDPHY_RV 5' - ATCGTCTGGATCCGGATAGTGGGGGTCTCCCCAAGATGCTGATTCTCTTATTTTTTCCC (SEQ ID NO: 149) 1igadorDNNDPI_RV 5 ' -ATCGTCTGGATCCGGTATGGGATCATTGTTGTCAGATGCTGATTCTCTTATT TTTTCCC (SEQ ID NO: 150) 1igadorWADPN_RV 5 ' -ATCGTCTGGATCCGGGTTGGGATCTGCAACTACAGATGCTGATTCTCTTAT TTTTTCCC (SEQ ID NO: 151) Los cebadores de PCR usados para generar los ligadores lábiles a ácido, proporcionados anteriormente (es decir, Ligador 1, Ligador 2, y Ligador 3) insertados en el ler ligador de CBD.

BCE103núcleo_F GCATAAGGAT GAGTCATCTG CAGCG (SEQ ID NO: 152) LplusWGDPHY_RV 5 ' -ATCGTCTGGATCCGGATAGTGGGGGTCTCCCCACGGTTCTCCTGGATCAGA TGGCGG (SEQ ID NO.-153) LplusDNNDPI_RV 5' -ATCGTCTGGATCCGGTATGGGATCATTGTTGTCCGGTTCTCCTGGATCAGA TGGCGG (SEQ ID NO:154) LplusWADPN_RV 5 ' -ATCGTCTGGATCCGGGTTGGGATCTGCAACTACCGGTTCTCCTGGATCAGA TGGCGG (SEQ ID NO: 155) La secuencia de proteína de los ligadores lábiles a cido, insertados entre el dominio catalítico de BCE103 y el BBI se proporciona más adelante. Los ligadores lábiles a ácido se muestran en negritas y están subrayadas la secuencias del primer dominio de CBD.

Ligador 1 BCE-WGDPHY-PDP-BBI (SEQ ID NO: 156) Ligador 2 BCE-DNNDPI-PDP-BBI (SEQ ID NO: 157) Ligador 3 BCE-WADPN-PDP-BBI (SEQ ID NO: 158) LigadorPlus 1 BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-WGDPHY-PDP-BBI (SEQ ID NO: 159) LigadorPlus 2 BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-DNNDPI-PDP-BBI (SEQ ID NO: 160) LigadorPlus 3 BCE-IPPSDPTPPSDPGEP-WADPN-PDP-BBI (SEQ ID NO: 161) Las secuencias de los pares de oligonucleótido de ADN que se fijaron y ligaron en los sitios BamUI y SacI de pJM103-BBI para generar sitios potenciales de escisión entre el dominio catalítico de BCE103 y el BBI durante el proceso de purificación se proporcionan a continuación.

BCEentBBI (Sitio de escisión de enteropeptidasa) GATCCAGGTGGAGACGACGATGACAAAGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 162) y CTCATCGTCTTTGTCATCGTCGTCTCCACCTG (SEQ ID NO: 163) BCEgeneniBBI (Sitio de escisión de genenasa I) GATCCAGGTGCTGCTCATTACGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 164) y CTCATCGTCGTAATGAGCAGCACCTG (SEQ ID NO: 165) Las secuencias de los pares de oligonucleótido de ADN que se fijaron y ligaron en los sitios BamHI y SacI de pJM103-lnk2-lBBIck81 para generar sitios potenciales de escisión entre el dominio catalítico de BCE103 y el BBI durante el proceso de purificación se proporcionan a continuación.

BCEfurinBBI (Sitio de escisión de furina/blisterasa) GATCCACGTGCTAAAAGAGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 166) y CTCATCGTCTCTTTTAGCACGTG (SEQ ID NO: 167) BCEgenen2BBI (Sitio de escisión de genenasa I) GATCCAGGCGCTGCACACTACAACGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 168) y CTCATCGTCGTTGTAGTGTGCAGCGCCTG (SEQ ID NO: 169) BCEfleBBI (sitio de Escisión de Mpr) GATCCATTCCTTGAAGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO: 170) y CTCATCGTCTTCAAGGAATG (SEQ ID NO: 171) Las secuencias de los pares de cebadores de oligonucleótido, usados para introducir los ligadores E y E3 en el Ligador 2 por mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Stratagene) se proporcionan a continuación.

BCE-Elnk-BBI (Sitio de escisión de Mpr) CCCATACCGGAGCCAGACGATGAGAGCTC (SEQ ID NO: 172) y CATCGTCTGGCTCCGGTATGGGATCATTGTTG (SEQ ID NO: 173) La secuencia de proteína del ligador E3 entre el dominio catalítico de BCE103 y el BBI fue DNNDPIPEPDDESFN PIPEP (SEQ ID NO: 174) . En esta secuencia, el ligador E está subrayado y la secuencia generada por recombinación por omisión en E. coli se muestra en negritas. La escisión por Mpr (o V8 proteasa) puede presentarse después de cualquiera de los tres ácidos glutámicos presentes en el ligador E3. De esta manera, la estructura fue BCE- (SEQ ID NO: 174) -BBI Las secuencias de los pares de oligonucleótido de ADN que se fijaron y ligaron en los sitios BanMl y Sacl de p2JM103-lnk2-2BBIck81 para generar sitios potenciales de escisión de Genenasa I entre el dominio catalítico de BCE103 y el BBI, se proporcionan a continuación.

BCEgenen3BBI GATCCAGGCGCTGCACACTACAAATCAGACCATCAGCACAGCAATGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO:175) y CTCATCGTCATTGCTGTGCTGATGGTCTGATTTGTAGTGTGCAGCGCCTG (SEQ ID NO:176) BCEgenen4BBI GATCCAGGCGCTGCACACTACGTAGAATTTCAAGACGATGAGAGCT (SEQ ID NO:177) y CTCATCGTCTTGAAATTCTACGTAGTGTGCAGCGCCTG (SEQ ID NO:178) La secuencia de proteína de un sitio de escisión, sensible a Genenasa I (también sensible a ácido Mpr) insertado entre el dominio catalítico de BCE103 y el BBI fue DNNDPIPDPGAAHYVEFQ (SEQ ID NO:179). El sitio de Genenasa I (Ligador Gen4 ) está en negritas (la escisión se presenta entre la tirosina y la valina) (NEB) y el Ligador 2 está subrayado. La escisión por Mpr también puede presentarse después del ácido glutámico que sigue a la valina en el ligador Gen4. La secuencia usada en la presente fue BCE-SEQ ID NO: 179) -BBI Los sitios de escisión en la proteína de fusión BCE103-lnk2-2BBIck81 se indican más adelante. Los siete aminoácidos C-terminales del dominio catalítico de BCE103 (subrayado) , la secuencia del ligador 2 (en negritas) , y las secuencias 2BBIck81 se muestran. Los enlaces Asp-Pro lábiles a ácido/calor se indican con flechas de cabeza negra y los enlaces sensibles a Mpr después de los ácidos glutámicos indican con flechas de cabeza de línea ... KIRES ASDNNDPIPDPDDESSKPCCDOC ACT SNPPOCRCSDMRLNSCHS ACK SCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSEDD EN (SEQ ID NO: 180) A fin de aislar el BBI libre o sus variantes, las porciones de BBI necesitan ser escindidas de la proteína de fusión BCE103-BBI. En algunas modalidades, esto se logra durante el crecimiento, por proteasas intrínsecamente producidas por B. subtilis . En algunas modalidades alternativas, esta escisión se presenta después del crecimiento, durante el proceso de purificación (por ejemplo por escisión con ácido/calor o proteolítica) . Los ligadores potencialmente susceptibles a escisión durante el crecimiento se diseñaron (ver, anteriormente, sub, cbdL, pro, shortpro, y cbdD) y se clonaron en los vectores de expresión pJM103BBI o p2JM103BBI como casetes de BarriHI-SacI . La producción de la proteína de fusión versus dominio catalítico de BCE103 se analizó en geles de SDS-PAGE como se describe en el Ejemplo i .

La poca escisión de la proteína de fusión se observó para estos todos estos ligadores excepto con el ligador pro, que se escindió casi completamente de modo que se observó muy poca proteína de fusión intacta en los geles, aunque hubo una gran banda que corresponde al núcleo catalítico de BCE103. Desdichadamente, esta escisión durante el crecimiento dio por resultado actividad insignificante de BBI medida en sobrenadantes libre de célula y no se puede identificar banda de BBI en geles de SDS-PAGE. Aunque no se propone que la presente invención se limite a ningún mecanismo o teoría particular, es posible que el BBI sea particularmente sensible a degradación proteolítica en su forma inactiva. De esta manera, la escisión durante el proceso de purificación después de la activación se prefiere en general .

En algunas modalidades, los enlaces entre los residuos de ácido aspártico y prolina se escinden por tratamiento térmico a pH ácido como se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Landon, Meth. Enzymol . , 47:145-149

[1977] ) . El 1er ligador de CBD en la celulasa BCE103 tiene tres secuencias dipeptídicas de Asp-Pro (ver, Figuras 1A a ID) con el potencial para ser escindidas por tratamiento ácido/térmico . Sin embargo, la escisión por tratamiento ácido/térmico en estos sitios se encontró que es ineficiente. Las secuencias de proteína que son especialmente lábiles a ácido/calor se han descrito en la literatura, tres de esta secuencias son WGDPHY (SEQ ID NO: 141), DNNDPI (SEQ ID NO:142), y WADPN (SEQ ID NO-.143) (es decir, Ligadores 1, 2 y 3) .

Antes de que estos ligadores lábiles a ácido se introduzcan en el vector de expresión de BCE103-BBI, pJM103BBI, se introdujo un sitio BssHW por mutagénesis QuikChange XL (Stratagene) (usando los métodos del fabricante; y se describe en el Ejemplo 2 anterior, excepto los pasos de extensión de 8 minutos y desnaturalización de 1 minuto, se usaron) en la región codificadora de la secuencia de señal de aprE usando los cebadores de oligonucleótido BCEbss-F y BCEbss-R (proporcionados anteriormente). Entonces, se introdujeron los sitios HindlII y Xhol enfrente del terminador de LAT (después del codón finalizador de BBI) y se adiciona un sitio Pací después del terminador (el sitio HindlII original después del terminador de LAT se removió) al insertar un cásete de oligonucleótido (BCEterm+ y BCEterm- ; proporcionados anteriormente) en el Salí y los sitios HindlII originales. Este nuevo vector se llamó "p2JM103BBI" .

Los fragmentos del ligador lábiles a ácido se generaron por PCR, usando el cebador directo BCE103nucleoBssHII_FW con cada uno de los cebadores inversos, el ligador WGDPHY_R, el ligador DNNDPI RV, o el ligador WADPN_RV (las secuencias de los cuales proporcionan todas anteriormente) y p2JM103BBI como la plantilla (ver Ejemplo 1 para el protocolo de PCR) . Los fragmentos de PCR de 970 pb se digirieron con BamHI y PstI, los fragmentos de 154 pb que codifican para los fragmentos del ligador ácido se aislaron de un gel de agarosa después de la electroforesis , y se ligaron en el vector p2JM103 digerido con BamHI y PstI que también se ha purificado de un gel. Las secuencias ligadoras en los vectores de expresión final p2J 1031nkl-BBI , p2J 1031nk2-BBI y p2JM1031nk3-BBI, se verificaron por secuenciación de ADN.

Se transformaron la cepa BG3934comK o BG6006 de B . subtilis competente con los plásmidos, las colonias seleccionadas en placas de LA de cloranfenicol de 5 µ?/??? y se amplificaron a 25 ug/ml de cloranfenicol como se describe en el Ejemplo 1.

De manera similar, se insertaron los ligadores lábiles a ácido en el primer ligador de CBD. Específicamente, se generaron fragmentos de PCR usando el cebador directo BCE103núcleoPstl_F con los cebadores inversos LplusWGDPHY_RV, LplusDNNDPI_RV, o LplusWADPN_RV (ver anteriormente, para las secuencias) con p2JM103BBI como una plantilla. Los fragmentos de PCR de aproximadamente 150 pb se digirieron con BamUI y Psfcl, se purificaron y ligaron en el vector p2J 103BBI digerido con BamHI y PstI . Las secuencias correctas se verificaron por secuenciación de ADN y los plásmidos p2JM103pllnkl-BBI , p2JM103pllnk2 -BBI y p2JM103pllnk3-BBI se usaron para transformar cepas de B. subtilis como se describe anteriormente.

Después de crecer en medio MBD, las proteínas de fusión se purificaron por cromatografía de intercambio iónico esencialmente como se describe anteriormente (ver, Ejemplo 2) . La proteína de fusión se escindió por tratamiento a 55°C durante 16 h en ácido fórmico al 10 %. El dominio catalítico de BCE103 se precipitó durante el tratamiento ácido y se removió por centrifugación. El BBI libre en el sobrenadante se secó durante la noche en un SpeedVac . La muestra se suspendió en Tris 50 mM pH 8 antes de la carga en gel de SDS-PAGE. Por análisis de los geles de SDS-PAGE teñidos con proteína, se observó que la escisión ácida fue mucho más eficiente en las proteínas de fusión donde se insertó el Ligador 2 entre el dominio catalítico de BCE103 y BBI (BCE-DNNDPI-PDP-BBI) . Este ligador se encontró que se escinde en un par de horas a 75°C en glicina 20 mM. pH 2.

En modalidades alternativas, la proteína de fusión se escindió por tratamiento con una proteasa durante el proceso de purificación. Se diseñaron ligadores con sitios de escisión para proteasas específicas a ácido glutámico (por ejemplo, Mpr o V8-proteasa) , Furina/bliesterasa, Genenasa I, y Enteropeptidasa (Enterocinasa) . Estos ligadores se introdujeron como casetes de oligonucleótido (ver anteriormente, para la secuencia) entre el núcleo catalítico de BCE103 y el BBI en el vector de expresión usando los sitios Baitíñl y SCLCI (ver, Figuras 1A a ID) . En la región codificadora del vector de expresión original (pJM103BBI) , está un residuo de ácido glutámico en el 1er dominio de CBD y en el tercer residuo en el BBI (ver, Figuras 1A a ID) , se contempla que es susceptible a escisión por proteasas específicas a ácido glutámico tal como Mpr de B. subtilis (BsMpr) o V8-proteasa. Sin embargo, ni BsMpr ni V8-proteasa se encontraron que escinden la proteína de fusión de BCE-BBI muy eficientemente en estos sitios. De esta manera, fue necesario diseñar otros ligadores que fueron susceptibles a la escisión por estas proteasas.

Los seis ligadores lábiles a ácido, descritos anteriormente, se prepararon para escisión por BsMpr. Estas proteínas de fusión se escindieron por tratamiento durante 16 horas con 16 \ig de BsMpr a temperatura ambiente. Después de la escisión, el dominio catalítico BCE103 se precipitó por la adición de ácido fórmico al 10 % se removió por centrifugación. El BBI libre de sobrenadante se secó durante la noche en un SpeedVac . La muestra se suspendió en Tris 50 mM pH 8, antes de la carga en el SDS-PAGE. Similar a la escisión ácida, la .proteína de fusión BCE-DNNDPI-PDP-BBI (Ligador 2) fue escindida de manera mucho más eficiente por BsMpr que por cualquiera de los otros ligadores. Por lo tanto, el BBI y sus variantes se encontraron que se liberan de manera efectiva de la proteína de fusión BCE-DNNDPI-PDP-BBI ya sea por tratamiento ácido/térmico o digestión proteolítica con una proteasa específica a ácido glutámico tal como BsMpr. Varios ligadores diferentes diseñados para escindirse por Mpr (por ejemplo, Ligador E, E3 , y fie, proporcionados anteriormente) se probaron pero ninguno de ellos tiene ninguna ventaja con respecto al Ligador 2 (el ligador E3 se generó por recombinación por defecto en E. coli después de la transformación con reacción de mutagénesis dirigida al sitio QuikChangeMR diseñada para construir el ligador E ligador) . Como se muestra anteriormente, hay dos sitios de escisión lábiles a cido/calor en el Ligador 2 y tres sitios sensibles a escisión por Mpr. Los ligadores diseñados para escisión por Furina o Blisterasa (NEB) (BCEfurinBBI) , o Enteropeptidasa (Enterocinasa, NEB) (BCEentBBI) se probaron, pero ninguna de estas secuencias se escindió de manera eficiente por la proteasa apropiada. También se diseñaron cuatro ligadores (BCEgenenlBBI , BCEgenen2BBI , BCEgenen3BBI , y BCEgenen4BBI) y se probaron para la escisión por Genenasa I (NEB) . Se observó la escisión eficiente de la proteína de fusión sólo con el Ligador Gen4 (BCEgenen4BBI) . También se encontró que BsMpr escinde eficientemente el ligador Gen4.

Después de la activación de la proteína de fusión BCE-lnk2-2BBIck81 purificada, la escisión por BsMpr no llega a término como se juzga por los geles de SDS-PAGE. Sin embargo, se descubrió que la escisión completa después de la activación de las proteínas de fusión de BCE-BBI con el Ligador 2 (o el ligador Gen4) se puede lograr al usar la proteasa Mpr aislada de Bacillus licheniformis (BIMpr) . En tanto que no se propone que la presente invención se limite a ningún mecanismo particular, la escisión después del tercer aminoácido en el BBI maduro parece ser más sensible a BIMpr en tanto que la escisión después del sexto aminoácido del C-terminal del BBI es más sensible a la escisión con BsMpr.

En algunas modalidades, después de la escisión, el BBI se purifica del dominio catalítico de BCE1031 por precipitación ácida selectiva (pH 3 o menor) del dominio catalítico de BCE103 como se describe anteriormente, cromatografía de intercambio iónico (ver, Ejemplo 5) , o por unión selectiva de BBI en una columna de anhidrotripsina-agarosa (Sigma) cargad en Tris 50 mM pH 8.0, lavada con Tris 50 mM pH 8.0 con NaCl 150 mM, luego eluyendo el BBI unido con glicina 50 mM pH 2.2 con NaCl 300 mM) .

Ejemplo 5 Unión a BBIck81 a VegF En este Ejemplo, se describen experimentos llevados a cabo para valorar la unión de BBIck81 a VegF. La proteína de fusión BCE103 - lnk2 - 2BBIck81 se produjo en B. subtilis como se describe en el Ejemplo 2. La proteína de fusión se purificó, y la actividad inhibitoria de tripsina de BBI se incrementó por tratamiento con ß?? y glutationa oxidada como se describe en el Ejemplo 3. La proteína de fusión se escindió por la proteasa BsMpr (ver, Ejemplo 4) y el 2BBIck81 libre se purificó el dominio catalítico de BCE103 por cromatografía de intercambio iónico usando una columna de Q- Sefarosa.

Brevemente, después de la escisión, el pH de la muestra escindida se ajustó a 5.5, la muestra entonces se cargó sobre la columna (puesta en equilibrio con MES25 mM pH 5.5) . El 2BBIck81 libre se lavó a través de la columna usando acetato de sodio 25 mM pH en tanto que el dominio catalítico de BCE103 permaneció unido a la resina. La fracción 2BBIck81 se concentró por ultrafiltración y se analizó usando un ensayo de unión basado en electroquimioluminiscencia (ECL) (BioVeris) . El anticuerpo Anti-VegF (Santa Cruz) y VegF (PeproTec ) se marcaron con el tinte electroqui ioluminiscente y biotina, respectivamente, como se describe por el fabricante (BioVeris) . Todos los materiales estuvieron en PBS de Dulbecco (Mediatech) complementado con TWEENO-80 al 0.1 %. Una serie de dilución inicial de anticuerpo Anti-VegF (125, 250 y 500 ng/ml) y VegF (100, 150, 200 y 250 ng/ml) se probó en el ensayo de unión para determinar las concentraciones de cada uno que darán una señal fuerte de ECL.

Para probar la unión de 2BBIck81, se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación 50 pL de anticuerpo Anti-VegF marcado con ECL a 500 ng/ml, 50 L de VegF biotinilado a 250 ng/ml y 100 L de 2BBIck81 (serie de 12.5, 15, 31.25, 62.5, 125, 250 o 500 ng/ml). Entonces, se adicionaron 50 yL de cuentas revestidas con estreptavidina 0.2 rag/ml y la reacción se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. La señal de ECL se midió usando un analizador BioVeris M8/384 como se describe por el fabricante (BioVeris) . Como se muestra en la Figura 6, la señal de ECL disminuida conforme se incrementa las concentraciones de 2BBIck81, desplazó más el anticuerpo Anti-VegF marcado, unido a VegF unido a las cuentas magnéticas.

De esta manera, el péptido CK37281 cuando se injertó sobre la asa inhibitoria de quimiotripsina de BBI (2BBIck81) compitió con el anticuerpo Anti-VegF para la unión a VegF a concentraciones micromolares . De hecho, 2BBIck81 compitió para la unión a VegF mejor que el péptido CK37281 sintetizado, mismo (ver, Figura 6) . El péptido CK37281 insertado en la asa inhibitoria de tripsina, lBBIckSl, también compitió con el anticuerpo Anti-VegF en el ensayo de BioVeris. De esta manera, se encontró que BBI es útil como un núcleo molecular para presentar péptidos activos de unión seleccionados por varios métodos de examen.

Ejemplo 6 Uso de Compañeros Alternativos de Fusión para la Producción de 2BBIck81 En este Ejemplo, se describen experimentos llevados a cabo para evaluar los compañeros alternativos de fusión. La secuencia de ADN de los cebadores de oligonucleótido usados para amplificar el gen dsbC {E. coli) de pET-40b( +) se proporcionan a continuación. Estos cebadores generan un sitio BssHII en el extremo 5' y un BamUI en el extremo 3' para clonación en p2J 103 -Gen4 -2BBIck81.

DsbCBBI-F AACATGAGCGCGCAGGCTGATGACGCGGCAATTCAACAAACGTTAG (SEQ ID NO: 181) DsbCBBI-R TCGTCTGGATCCGGTATGGGATCATTGTTGTCACCAGAACCACTAGTTGATCCT TTACCGCTGGTCATTTTTTGGTG (SEQ ID NO: 182) Las secuencias de ADN de los oligonucleótidos que se fijaron conjuntamente para producir un cásete (Alw44I-Ba/nHI) para fusionar el gen de cutinasa de P. mendocina al BBI con el Ligador 2, se proporcionan a continuación.

CutinasaBBI+ TGCACTTCTCTGCTTTGGTCTGTTGAACGCAGAGGTCTTGACAACAATGATCCTA TTCCG (SEQ ID NO:183) CutinasaBBI- GATCCGGAATAGGATCATTGTTGTCAAGACCTCTGCGTTCAACAGACCAAAGCA GAGAAG (SEQ ID NO: 184) Debido a que la porción de BBI tiene siete enlaces de disulfuro, se contempla que se obtendrán mayores títulos de BBI activo usando proteínas de fusión diferentes del dominio catalítico de BCE103. Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones tal como tiol-disulfuro-óxidoreductasa y/o proteína disulfuro-isomerasa encuentran uso como proteínas de fusión para ayudar a producir porciones de BBI, correctamente plegadas. En esta modalidad, no se necesita paso adicional de activación bajo la mayoría de las circunstancias. En modalidades adicional, otras proteínas producidas a altos títulos en B. subtilis también encuentran uso como compañeros de fusión. Por ejemplo, la proteína termoestable, disulfuro- isomerasa, del hongo Humicola insolens (hiPDI) se ha usado como un compañero de fusión para producir la cadena ligera de inmunoglobulina G (2 disulfuros) en Bacillus brevis (ver, Kajino et al., Ap l . Env. icrobiol., 66:638-642

[2000]).

Para determinar si hiPDI puede ser un mejor compañero de unión que BCE103 para la producción de BBI, este gen de hiPDI se sintetizó (ADN2.0) y se clonó el vector de expresión p2JM103-lnk2-2BBIck81 (ver, Ejemplo 4) como un fragmento de BssHII-SacI. Al diseñar el gen sintético, los codones que se presentan con alta frecuencia en los genes de B. subtilis altamente expresados se seleccionaron excepto en casos donde se introdujeron o suprimieron sitios de restricción. En la construcción final, el N-terminal del gen hiPDI maduro se fusionó a la secuencia de señal de AprE y el C-terminal se fusionó a un ligador con un sitio de escisión de Enteropeptidasa (Kajino et al., Appl. Env. Microbiol., 66:638-642

[2000]), que a su vez se fusionó a 2BBIck81 (ver, Figuras 7A a 7C) . Este vector de expresión, p2JM-PDl-EK- 2BBIck81, se usó para transformar B . subtilis BG6006 y se determinó la producción de la proteína de fusión en el medio MBD (como se describe en el Ejemplo 1) con o sin B E 2 mM adicionado 14 horas después de la inoculación.

Como se determinan por los genes de SDS-PAGE, la producción de la proteína de fusión PDI-2BBIck81 fue típicamente algo menor que la BCE-2BBck81 cultivada bajo condiciones idénticas. Los títulos de BBI (inhibición de tripsina) medidos de los sobrenadantes libres de cultivo de PDI-2BBIck81 también fueron típicamente menores que la fusión BCE-2BBIck81. Como con las fusiones a BCE103, las actividades medidas de BBI cuando se fusiona a PDI fueron mayores que cuando se cultivaron en BME 2 mM y la actividad de BBI se incrementó por la adición de BME a los sobrenadantes libres de célula después de crecer cuando crecen en medio libre de BME (como se describe en el Ejemplo 3) . De esta manera, la actividad de tiol-dísulfuro-óxidoreductasa de PDI no parece mejorar significativamente los títulos de 2BBIck81 activo en la proteína de fusión o evitar la necesidad de activación de la molécula de BBI.

A fin de incrementar el potencial de reducción de la proteína de fusión, que se contempló que mejora los títulos de BBI durante el crecimiento, se usó DsbC de Escherichia coli como un compañero de fusión para 2BBlck8l. El gen de dsbC se amplificó por PCR usando ADN polimerasa mejorada, Herculasa como se describe por el fabricante (Stratagene) usando DsbCBBI-F y DsbCBBI-R como cebadores (secuencias mostradas anteriormente) y pET-40b(+) (Novagen) como una plantilla. El fragmento de PCR aislado se clonó en el vector p2JM103-Gen4-2BBIck81 (ver, Ejemplo 4) como un fragmento de BssHII-BaMil . La secuencia correcta del gen de fusión se verificó por secuenciación de ADN. En este caso, los títulos de la proteína de fusión DsbC-2BBIck81 fueron significativamente menores que la proteína de fusión BCE-2BBIck81 como se juzga por geles de SDS-PAGE y los títulos del 2BBIck81 activo medidos por inhibición de tripsina fueron mucho menores también.

Otras proteínas que se producen a altos títulos en B . subtilis encuentran uso como compañeros de fusión para la producción de BBI. Esta proteínas es la cutinasa de Pseudomonas mendocina, que se ha expresado en altos títulos utilizando el promotor de aprE de B. subtilis (ver por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 5,429,950, incorporada en la presente como referencia) . La fusión del gen de aprE-cutinasa como un fragmento de EcoRI-Altv441 (de pAK-15) se ligó con un cásete de oligonucleótido de ligador Alw -Ba HI (ver, secuencia anterior) en la p2JM103 - lnk2 -2BBIck81 (ver, Ejemplo 4) que se ha cortado con EcoRI y BamUI. Este vector de expresión de cutinasa- ligador2-2BBIck81 (ver, Figuras 8A a 8C para la secuencia de EcoRI-Ba/nHT aprE- cutirías -ligador2) se usó para transformar células BG6006 de B . subtilis y la proteína de fusión se produjo en medio MBD como se describe anteriormente para las otras proteínas de fusión (ver, Ejemplo 1) . En este caso, la proteína de fusión cutinasa-ligador2-2BBIck81 no fue la banda principal observada en los geles de SDS-PAGE y los títulos medidos de lipasa (como se mide usando los métodos proporcionados en la patente de los Estados Unidos No. 5,429,950) y los títulos de BBI fueron mucho menores (aproximadamente 20 veces) que los encontrados con la proteína de fusión BCE-2BBIck81. También, los títulos de BBI en la proteína de fusión de cutinasa no se mejoraron de manera significativa cuando se adicionó ß?? 3 m al medio de crecimiento. De esta manera, los títulos más altos de 2BBIck81 activo se obtuvieron de manera consistente por la activación de la proteína de fusión BCE-2BBIck81 sin embargo, se contempla que varios compañeros de fusión encontraron uso en la presente invención.

Ejemplo 7 Expresión de BBI-AV Truncada (BBIt-AV; SEQ ID NO: 187) Este Ejemplo describe experimentos que se realizaron para mejorar la producción de la proteína 2BBIck81BBI (BBI-AV; SEQ ID NO: 186) DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEP CKPSEDDKEN (SEQ ID N0:18).

Los Ejemplos anteriores y el artículo de Vogtentanz et al., 2007 (Protein Expr Purif 55:40-52

[2007]) describen un método para producir una proteína de fusión que comprende el inhibidor de proteasa de Bowman-Birk (BBI) de soya fusionado al C-terminal del dominio catalítico de celulasa BCE103 (BCE) . Como se describe anteriormente, se ha usado este sistema para producir moléculas de BBI con varios péptidos variantes que reemplazan las asas inhibitorias de tripsina y/o quimiotripsina . Por ejemplo, una molécula de BBI, BBI-AV (SEQ ID NO: 186) que contiene el péptido de unión a VEGF, CK37281 (ACYNLYG TC; SEQ ID NO: 9), que reemplaza la asa inhibitoria nativa de quimiotripsina (ICALSYPAQC; SEQ ID NO: 388) se produjo, se purificó y se muestra que compite en un ensayo de unión basado en electroquimioluminiscencia (ECL) (BioVeris) con un anticuerpo monoclonal para la unión a VEGF. Sin embargo, el rendimiento recuperado del BBI-AV variante fue menor que aquel del BBI tipo silvestre más probablemente debido a un mayor porcentaje inicial de moléculas con enlaces de disulfuro, incorrectamente formados.

Una forma truncada del BBI-AV de SEQ ID NO: 186 (es decir BBIt-AV de SEQ ID NO:187) DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCFCVDI TDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 187), que carece de los 5 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 186 se muestra que se une mejor que la molécula de longitud completa (es decir, molécula no truncada) a VEGF en el ensayo ECL (BioVeris) usando un anticuerpo monoclonal marcado contra VEGF como un competidor. La versión C-truncada de BBI-AV, llamada BBIt-AV (SEQ ID NO:187), se puede producir durante el proceso de purificación al recortar el C-terminal con la proteasa GIuBL (glutamil-endopeptidasa I de Bacillus licheniformis) . De manera alternativa, el BBIt-AV se puede obtener al introducir un codón finalizador usando un cásete de oligonucleótido, manejado, como sigue. Los siguientes oligonucleótidos BBI-trunc+ y BBI-trunc se fijaron para generar un cásete de oligonucleótido BBI-trunc+ 5 ' -TCGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAA (SEQ ID NO:188) y BBI-trunc-5 ' -AGCTTTTACTCGCTTGGTTTACATGGTTCATAGCAGAAGTCCGTGATG (SEQ ID NO: 189) El cásete de oligonucleótido entonces se ligó en los sitios Salí y HindIII del vector de expresión p2JM103-lnk2-2BBIck81, y la secuencia correcta se verificó y el vector resultante de expresión se llamó p2JM103-lnk2-BBIt-AV.

Para mejorar la expresión, se insertó una secuencia de polinucleótido (SEQ ID NO: 190 GCTGGTAAA) que codifica para los primeros tres aminoácidos del pro-péptido de AprE, AGK (SEQ ID NO: 191) (Patente de los Estados Unidos No. 5,429,950), entre el extremo de la secuencia de señal de AprE y el inicio de la celulasa BCE103 madura usando un equipo de mutagénesis dirigida al sitio QuikChangeMR (Stratagene) . La mutagénesis dirigida al sitio se realizó esencialmente como se describe por el fabricante usando p2JM103-lnk2-BBIt-AV como una plantilla con los cebadores de oligonucleótidos : BCE-AGK-F: 5 ' -GCGCGCAGGCAGCTGGTAAAGATGATTATTCAGTTGTAGA (SEQ ID NO: 192) y BCE-AGK-R: 5 ' -AATAATCATCTTTACCAGCTGCCTGCGCGCTCATGTTGCT (SEQ ID NO: 193) La inserción correcta se verificó por secuenciación de ADN y el vector resultante de expresión se llamó p2JMagkl03-lnk2-BBIt-AV (SEQ ID N0:194).

GAATTCTCCATTTTCTTCTGCTATCAAAATAACAGACTCGTGATTTTCCAAACGA GCTTTCAAAAAAGCCTCTGCCCCTTGCAAATCGGATGCCTGTCTATAAAATTCCC GATATTGGTTAAACAGCGGCGCAATGGCGGCCGCATCTGATGTCTTTGCTTGGC GAATGTTCATCTTATTTCTTCCTCCCTCTCAATAATTTTTTCATTCTATCCCTTTTC TGTAAAGTTTATTTTTCAGAATACTTTTATCATCATGCTTTGAAAAAATATCACGAT AATATCCATTGTTCTCACGGAAGCACACGCAGGTCATTTGAACGAATTTTTTCGA CAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAAAAAAGCATGACATTTCAG CATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAATAGTTATT TCGAGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATATACCTAAATAGAGATAAAATCAT CTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCTATTACAATAAATTCACAGA ATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGT GAGAAGCAAAAAATTGTGGATCAGCTTGTTGTTTGCGTTAACGTTAATCTTTACG ATGGCGTTCAGCAACATGAGCGCGCAGGCAGCTGGTAAAGATGATTATTCAGTT GTAGAGGAACATGGGCAACTAAGTATTAGTAACGGTGAATTAGTCAATGAACGA GGCGAACAAGTTCAGTTAAAAGGGATGAGTTCCCATGGTTTGCAATGGTACGGT CAATTTGTAAACTATGAAAGCATGAAATGGCTAAGAGATGATTGGGGAATAACTG TATTCCGAGCAGCAATGTATACCTCTTCAGGAGGATATATTGACGATCCATCAGT AAAGGAAAAAGTAAAAGAGACTGTTGAGGCTGCGATAGACCTTGGCATATATGT GATCATTGATTGGCATATCCTTTCAGACAATGACCCGAATATATATAAAGAAGAA GCGAAGGATTTCTTTGATGAAATGTCAGAGTTGTATGGAGACTATCCGAATGTG ATATACGAAATTGCAAATGAACCGAATGGTAGTGATGTTACGTGGGACAATCAA. ATAAAACCGTATGCAGAAGAAGTGATTCCGGTTATTCGTGACAATGACCCTAATA ACATTGTTATTGTAGGTACAGGTACATGGAGTCAGGATGTCCATCATGCAGCCG ATAATCAGCTTGCAGATCCTAACGTCATGTATGCATTTCATTTTTATGCAGGAAC ACATGGACAAAATTTACGAGACCAAGTAGATTATGCATTAGATCAAGGAGCAGC GATATTTGTTAGTGAATGGGGGACAAGTGCAGCTACAGGTGATGGTGGTGTGTT TTTAGATGAAGCACAAGTGTGGATTGACTTTATGGATGAAAGAAATTTAAGCTGG GCCAACTGGTCTCTAACGCATAAGGATGAGTCATCTGCAGCGTTAATGCCAGGT GCAAATCCAACTGGTGGTTGGACAGAGGCTGAACTATCTCCATCTGGTACATTT GTGAGGGAAAAAATAAGAGAATCAGCATCTGACAACAATGATCCCATACCGGAT CCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAAATCA AATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGTGCC TGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTTTTTGCGTCGAC ATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTTAAGTCG AGGTTAACAGAGGACGGATTTCCTGAAGGAAATCCGTTTTTTTATTTTTAATTAA GAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC ACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTA ATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC GGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAG GCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGC TCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACG GTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCC AGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGG CTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCG AAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGT GCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCC TTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGT GTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCG ACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACG ACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTAT GTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAG AAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAG AGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTT TGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTT GATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGAT TTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAAT GAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAA TGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAG TTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTG GCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTA TCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAAC TTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGT TCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTG TCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGG CGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCT CCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCA GCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTG GTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCT CTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAG TGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGC TGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCAT CTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCG CAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTT TCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTG AATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGT GCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGG CGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCT CTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCG GGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGG GCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAGAT CTGGAGCTGTAATATAAAAACCTTCTTCAACTAACGGGGCAGGTTAGTGACATTA GAAAACCGACTGTAAAAAGTACAGTCGGCATTATCTCATATTATAAAAGCCAGTC ATTAGGCCTATCTGACAATTCCTGAATAGAGTTCATAAACAATCCTGCATGATAA CCATCACAAACAGAATGATGTACCTGTAAAGATAGCGGTAAATATATTGAATTAC CTTTATTAATGAATTTTCCTGCTGTAATAATGGGTAGAAGGTAATTACTATTATTA TTGATATTTAAGTTAAACCCAGTAAATGAAGTCCATGGAATAATAGAAAGAGAAA AAGCATTTTCAGGTATAGGTGTTTTGGGAAACAATTTCCCCGAACCATTATATTT CTCTACATCAGAAAGGTATAAATCATAAAACTCTTTGAAGTCATTCTTTACAGGA GTCCAAATACCAGAGAATGTTTTAGATACACCATCAAAAATTGTATAAAGTGGCT CTAACTTATCCCAATAACCTAACTCTCCGTCGCTATTGTAACCAGTTCTAAAAGC TGTATTTGAGTTTATCACCCTTGTCACTAAGAAAATAAATGCAGGGTAAAATTTAT ATCCTTCTTGTTTTATGTTTCGGTATAAAACACTAATATCAATTTCTGTGGTTATA CTAAAAGTCGTTTGTTGGTTCAAATAATGATTAAATATCTCTTTTCTCTTCCAATT GTCTAAATCAATTTTATTAAAGTTCATTTGATATGCCTCCTAAATTTTTATCTAAAG TGAATTTAGGAGGCTTACTTGTCTGCTTTCTTCATTAGAATCAATCCTTTTTTAAA AGTCAATATTACTGTAACATAAATATATATTTTAAAAATATCCCACTTTATCCAATT TTCGTTTGTTGAACTAATGGGTGCTTTAGTTGAAGAATAAAAGACCACATTAAAA AATGTGGTCTTTTGTGTTTTTTTAAAGGATTTGAGCGTAGCGAAAAATCCTTTTCT TTCTTATCTTGATAATAAGGGTAACTATTGCCGGATCGTCCTCAGGAGTAGGCG ACATCGCTAAATAATGATCTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGA GAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAA GGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGAT GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGT TGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO:194) El vector de expresión p2JMagkl03-lnk2-BBIt-AV se usó para transformar células bacterianas para expresar BBIt-AV fusionado a la proteína de BCE (SEQ ID NO: 195) AGKDDYSWEEHGQLSISNGELVNERGEQVQLKGMSSHGLQWYGQFVNYESMK WLRDDWGITVFRAAMYTSSGGYIDDPSVKEKVKETVEAAIDLGIYVIIDWHILSDNDP NIYKEEAKDFFDE SELYGDYPNVIYEIA EPNGSDVTWDNQIKPYAEEVIPVIRDND PNNIVIVGTGTWSQDVHHAADNQLADPNV YAFHFYAGTHGQNLRDQVDYALDQG AAIFVSEWGTSAATGDGGVFLDEAQVWIDF DERNLSWANWSLTHKDESSAAL P GANPTGGWTEAELSPSGTFVREKIRESASDNNDPIPDPDDESSKPCCDQCACTKS NPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYG TCFCVDITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 195) Ejemplo 8 Bibliotecas de Saturación de Sitio de BBIt-AV Este ejemplo describe los experimentos que se realizaron para generar BBPI variantes, modificadas, derivas del BBIt-AV no modificado al construir bibliotecas de saturación de sitio que comprenden sustituciones en cada una de las 39 posiciones de aminoácido de la molécula de BBIt- AV (SEQ ID NO: 187) como se muestra en la Figura 9.

Las bibliotecas de saturación de sitio de BBIt-AV se crearon esencialmente como es describe por Amin et al. (Biotechniques 35: 1134-1140,

[2003] ) usando una versión modificada del equipo de mutagénesis dirigida a múltiples sitios QuikChange (QCMS) de Stratagene (La Jolla, GA) como sigue. Los cebadores directo y inverso de traslape con el codón NNS en la parte intermedia y 17 - 20 bases de flanqueo se diseñaron para cada sitio elegido, y la secuencia para cada cebador directo (F) e inverso (R) en cada una de las 66 posiciones de aminoácido en la molécula de BBI-AV se muestran en la Tabla 1. Cada reacción de mutagénesis contuvo 50 - 100 ng de plásmido de plantilla (p2J agkl03-lnk2-BBIt-AV; SEQ ID NO: 194), 0.5 µ? de cebador directo (25 µ?) , 0.5 µ? de cebador inverso (25 µ?) , 1 µ? de dNTP (equipo QCMS), 2.5 µ? de amortiguador de reacción lOx QCMS, 18.5 µ? de agua desionizada, y 1 µ? de mezcla enzimática (equipo QCMS) , para un volumen total de 25 µ?. Para bibliotecas de BBI-AV en los residuos 10, 11, 13 y 25, sólo se usó 1 i del cebador directo (25 µ?) sin el cebador inverso. Para bibliotecas en los residuos 6, 37, 38, 50 y 53, la reacción de mutagénesis se llevó a cabo con 0.5 µ? del cebador mutagénico directo en combinación con el otro cebador (5'- CTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTAC ; SEQ ID NO: 328 complementaria a una secuencia en el vector. Para la reacción de mutagénesis, el programa del termociclador usado fue un ciclo de 95° durante 2 minutos, seguido por 29 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 55 °C durante 1 minuto, y 68 °C durante 10 minutos (termociclador MJ Research) . El ADN de plantilla se digirió por la adición de 0.5-1 µ? de Dpnl (del equipo QCMS) e incubación a 37 °C durante 1 - 4 horas, seguido por otra adición de 0.5 - 1 µ? de Dpnl y otra incubación a 37°C durante 1-4 horas. El ADN de plantilla se obtuvo de cepas dam+ E. coli, tal como TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) , para asegurarse que serán susceptibles a digestión con Dpnl.

Para la transformación eficiente de B. subtilis , el ADN en cada reacción de mutagénesis se amplificó por amplificación de círculo rodante (RCA) usando el equipo Templiphi de Amersham. Específicamente, se mezclaron 1 \iL de la reacción QCMS no diluida con 5µ? de amortiguador de muestra del equipo Templiphi. La mezcla se calentó durante 3 minutos a 95 °C para desnaturalizar el ADN. La reacción se colocó en hielo para enfriar durante 2 minutos. Entonces, se adicionaron a la reacción 5 µL de amortiguador de reacción y 0.2 L de polimerasa phi29 y se incubó a 30°C en un termociclador MJ Research durante 5 horas. Finalmente, la enzima phi29 en la reacción se inactivo térmicamente por incubación a 65°C durante 10 minutos en un termociclador MJ Research. El ADN amplificado se diluyó 10-100 veces y se usó 1 UL para transformar 100 de células BG6006 de B . subtilis competentes (Vogtentanz et al., 2007) . Alícuotas de 25 o 75 µL de la mezcla de transformación se colocaron en placas de agar Luria complementadas con 5 pg/ml de cloranfenicol . Después del crecimiento, se recolectaron transformantes individuales para inocular 200 µ? del caldo Luria complementado con 5 pg/ml de cloranfenicol en cada concavidad de una placa de microtítulo de 96 concavidades. Los cultivos se cultivaron en una caja humidificada y aireada a 37°C y 270 rpm (incubadora Innova 4230, New Brunswick Scientific) . Después de crecimiento, a cada concavidad se adicionaron 80 µ? de glicerol al 50 % y se mezcló. Se hizo una placa en duplicado al remover 140 µ? del cultivo de cada concavidad y al colocarlo en una nueva placa de microtítulo. Ambas placas se almacenaron a -80°C. Una placa se salvó como un maestro y la otra se sometió a secuenciación de ADN (Cogenics, Huston, TX) de los mutantes individuales. Para secuenciación de ADN, un cultivo durante la noche de cada colonia cultivada en una placa de microtítulo se diluyó 10 - 40 veces y se usaron 2 µ?, en una reacción de PCR con cuentas ' de PCR Amersham Biosciences Ready-to-go y los cebadores BBI-PCR-F y BBI-PCR-R. Las condiciones de termo-ciclo fueron un ciclo a fue un ciclo de 95 °C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 95 °C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72 °C durante 1 minuto, y un ciclo final a 72°C durante 7 minutos. Los productos de PCR se trataron con Exonucleasa I y fosfata alcalina de camarón (EXOSAP-IT, "'Amersham Biosciences) o se purificaron en columna antes de secuenciación con el cebador inverso M13.

Tabla 1. Cebadores de mutagénesis NS Nom. de Secuencia de Cebador SEQ ID cebador NO: Cebadores directos BBI1F GATCCCATACCGGATCCANNSGATGAGAGCTCTAAACC 196 BBI2F CCATACCGGATCCAGACNNSGAGAGCTCTAAACCCTG 197 BBI3F CATACCGGATCCAGACGATNNSAGCTCTAAACCCTGTTG 198 BBI4F CGGATCCAGACGATGAGNNSTCTAAACCCTGTTGCGATC 199 BBI5F GATCCAGACGATGAGAGCNNSAAACCCTGTTGCGATCAATG 200 BBI6F CAGACGATGAGAGCTCTNNSCCCTGTTGCGATCAATG 201 BBI7F GACGATGAGAGCTCTAAANNSTGTTGCGATCAATGCGC 202 Nom. de Secuencia de Cebador SEQ ID cebador NO: BBI8F GATGAGAGCTCTAAACCCNNSTGCGATCAATGCGCATG 203 BBI9F GAGAGCTCTAAACCCTGTNNSGATCAATGCGCATGTAC 204 BBI10F GCTCTAAACCCTGTTGCNNSCAATGCGCATGTACGAAATC 205 BBI11F CTAAACCCTGTTGCGATNNSTGCGCATGTACGAAATC 206 BBI12F CTAAACCCTGTTGCGATCAANNSGCATGTACGAAATCAAATC 207 BBI13F CCTGTTGCGATCAATGCNNSTGTACGAAATCAAATCC 208 BBI14F GTTGCGATCAATGCGCA NSACGAAATCAAATCCTCC 209 BBI15F GCGATCAATGCGCATGTNNSAAATCAAATCCTCCACAG 210 BBI16F GATCAATGCGCATGTACGNNSTCAAATCCTCCACAGTG 211 BBI17F CAATGCGCATGTACGAAANNSAATCCTCCACAGTGTCG 212 BBI18F GCGCATGTACGAAATCANNSCCTCCACAGTGTCGGTG 213 BBI19F CATGTACGAAATCAAATNNSCCACAGTGTCGGTGTTC 214 BBI20F GTACGAAATCAAATCCTNNSCAGTGTCGGTGTTCCGATAT 215 BBI21F CGAAATCAAATCCTCCANNSTGTCGGTGTTCCGATATG 216 BBI22F GAAATCAAATCCTCCACAGNNSCGGTGTTCCGATATGCG 217 BBI23F CAAATCCTCCACAGTGTNNSTGTTCCGATATGCGTCTG 218 BBI24F CAAATCCTCCACAGTGTCGG-SINSTCCGATATGCGTCT^ 219 BBI2SF CTCCACAGTGTCGGTGTNNSGATATGCGTCTGAATTC 220 BBI26F CACAGTGTCGGTGTTCCNNSATGCGTCTGAATTCCTG 221 BBI27F CAGTGTCGGTGTTCCGATNNSCGTCTGAATTCCTGTCATAG 222 BBI28F GTCGGTGTTCCGATATGNNSCTGAATTCCTGTCATAG 223 BBI29F GGTGTTCCGATATGCGTNNSAATTCCTGTCATAGTGC 224 Nom. de Secuencia de Cebador SEQ ID cebador NO: BBI30F GTTCCGATATGCGTCTGNNSTCCTGTCATAGTGCCTG 225 BBI31F CCGATATGCGTCTGAATNNSTGTCATAGTGCCTGCAAAAG 226 BBI32F GATATGCGTCTGAATTCCNNSCATAGTGCCTGCAAAAG 227 BBI33F ATATGCGTCTGAATTCCTGTNNSAGTGCCTGCAAAAGCTG 228 BBI34F GTCTGAATTCCTGTCATNNSGCCTGCAAAAGCTGCGC 229 BBI35F CTGAATTCCTGTCATAGTNNSTGCAAAAGCTGCGCATG 230 BBI36F GAATTCCTGTCATAGTGCCNNSAAAAGCTGCGCATGTTATAA 231 BBI37F CCTGTCATAGTGCCTGCNNSAGCTGCGCATGTTATAAC 232 BBI38F GTCATAGTGCCTGCAAA NSTGCGCATGTTATAACCTG 233 BBI39F CATAGTGCCTGCAAAAGCNNSGCATGTTATAACCTGTAC 234 BBI40F GTGCCTGCAAAAGCTGCNNSTGTTATAACCTGTACGG 235 BBI41F CCTGCAAAAGCTGCGCANNSTATAACCTGTACGGGTG 236 BBI42F GCAAAAGCTGCGCATGTNNSAACCTGTACGGGTGGAC 237 BBI43F CAAAAGCTGCGCATGTTATNNSCTGTACGGGTGGACCTG 238 BBI44F GCTGCGCATGTTATAACNNSTACGGGTGGACCTGTTTTTG 239 BBI4SF GCGCATGTTATAACCTGNNSGGGTGGACCTGTTTTTG 240 BBI46F CATGTTATAACCTGTACNNSTGGACCTGTTTTTGCGTC 241 BBI47F GTTATAACCTGTACGGGNNSACCTGTTTTTGCGTCGAC 242 BBI48F GTTATAACCTGTACGGGTGGNNSTGTTTTTGCGTCGACATC 243 BBI49F ATAACCTGTACGGGTGGACCNNSTTTTGCGTCGACATCAC 244 BBI50F CTGTACGGGTGGACCTGTNNSTGCGTCGACATCACGGAC 245 BBI51F GTACGGGTGGACCTGTTTTNNSGTCGACATCACGGACTTC 246 Nom. de Secuencia de Cebador SEQ ID cebador NO: BBI52F GGTGGACCTGTTTTTGCNNSGACATCACGGACTTCTG 247 BBI53F GGACCTGTTTTTGCGTCNNSATCACGGACTTCTGCTATG 248 BBI54F CCTGTTTTTGCGTCGAC SACGGACTTCTGCTATGAAC 249 BBI5SF GTTTTTGCGTCGACATCNNSGACTTCTGCTATGAACC 250 BBI56F GTTTTTGCGTCGACATCACGNNSTTCTGCTATGAACCATG 251 BBI57F GCGTCGACATCACGGACNNSTGCTATGAACCATGTAAAC 252 BBI58F GTCGACATCACGGACTTCNNSTATGAACCATGTAAACC 253 BBI59F GACATCACGGACTTCTGCNNSGAACCATGTAAACCAAG 254 BBI60F CATCACGGACTTCTGCTATNNSCCATGTAAACCAAGCGAG 255 BBI61F CGGACTTCTGCTATGAA NSTGTAAACCAAGCGAGTAAAA 256 BBI62F GACTTCTGCTATGAACCA NSAAACCAAGCGAGTAAAAG 257 BBI63F CTTCTGCTATGAACCATGTNNSCCAAGCGAGTAAAAGCTTAA 258 BBI64F GCTATGAACCATGTAAANNSAGCGAGTAAAAGCTTAAC 259 BBI6SF CTATGAACCATGTAAACCA NSGAGTAAAAGCTTAACTC 260 BBI66F GAACCATGTAAACCAAGCNNSTAAAAGCTTAACTCGAG 261 Cebadores inversos BBI1R GGTTTAGAGCTCTCATCSNNTGGATCCGGTATGGGATC 262 BBI2R CAGGGTTTAGAGCTCTCSNNGTCTGGATCCGGTATGG 263 BBI3R CAACAGGGTTTAGAGCTSNNATCGTCTGGATCCGGTATG 264 BBI4R GATCGCAACAGGGTTTAGASNNCTCATCGTCTGGATCCG 265 BBI5R CATTGATCGCAACAGGGTTTSNNGCTCTCATCGTCTGGATC 266 BBI6R CATTGATCGCAACAGGGSNNAGAGCTCTCATCGTCTG 267 Nom. de Secuencia de Cebador SEQ ID cebador NO: BBI7R GCGCATTGATCGCAACASNNTTTAGAGCTCTCATCGTC 268 BBI8R CATGCGCATTGATCGCASNNGGGTTTAGAGCTCTCATC 269 BBI9R GTACATGCGCATTGATCSNNACAGGGTTTAGAGCTCTC 270 BBI10R GATTTCGTACATGCGCATTGSNNGCAACAGGGTTTAGAGC 271 BBI11R GATTTCGTACATGCGCASNNATCGCAACAGGGTTTAG 272 BBI12R GATTTGATTTCGTACATGCSNNTTGATCGCAACAGGGTTTAG 273 BBI13R GGATTTGATTTCGTACASNNGCATTGATCGCAACAGG 274 BBI14R GGAGGATTTGATTTCGTSNNTGCGCATTGATCGCAAC 275 BBI15R CTGTGGAGGATTTGATTTSNNACATGCGCATTGATCGC 276 BBI16R CACTGTGGAGGATTTGASNNCGTACATGCGCATTGATC 277 BBI17R CGACACTGTGGAGGATTSNNTTTCGTACATGCGCATTG 278 BBI18R CACCGACACTGTGGAGGSNNTGATTTCGTACATGCGC 279 BBI19R GAACACCGACACTGTGGSNNATTTGATTTCGTACATG 280 BBI20R ATATCGGAACACCGACACTGSNNAGGATTTGATTTCGTAC 281 BBI21R CATATCGGAACACCGACASNNTGGAGGATTTGATTTCG .282 BBI22R CGCATATCGGAACACCGSNNCTGTGGAGGATTTGATTTC 283 BBI23R CAGACGCATATCGGAACASNNACACTGTGGAGGATTTG 284 BBI24R GAAlTC¾GAaX_ATA a-X3^ 285 BBI25R GAATTCAGACGCATATCSNNACACCGACACTGTGGAG 286 BBI26R CAGGAATTCAGACGCATSNNGGAACACCGACACTGTG 287 BBI27R CTATGACAGGAATTCAGACGSNNATCGGAACACCGACACTG 288 BBI28R CTATGACAGGAATTCAGSNNCATATCGGAACACCGAC 289 om. de Secuencia de Cebador SEQ ID cebador NO: BBI29R GCACTATGACAGGAATTSNNACGCATATCGGAACACC 290 BBI30R CAGGCACTATGACAGGAS NCAGACGCATATCGGAAC 291 BBI31R CTTTTGCAGGCACTATGACASNNATTCAGACGCATATCGG 292 BBI32R CTTTTGCAGGCACTATGSNNGGAATTCAGACGCATATC 293 BBI33R CAGCTTTTGCAGGCACTSNNACAGGAATTCAGACGCATAT 294 BBI34R GCGCAGCTTTTGCAGGCSNNATGACAGGAATTCAGAC 295 BBI35R CATGCGCAGCTTTTGCASNNACTATGACAGGAATTCAG 296 BBI36R TTATAACATGCGCAGCTTTTSNNGGCACTATGACAGGAATTC 297 BBI37R GTTATAACATGCGCAGCTSNNGCAGGCACTATGACAGG 298 BBI38R CAGGTTATAACATGCGCASNNTTTGCAGGCACTATGAC 299 BBI39R GTACAGGTTATAACATGCSN GCTTTTGCAGGCACTATG 300 BBI40R CCGTACAGGTTATAACAS NGCAGCTTTTGCAGGCAC 301 BBI41R CACCCGTACAGGTTATAS TGCGCAGCTTTTGCAGG 302 BBI42R GTCCACCCGTACAGGTTSNNACATGCGCAGCTTTTGC 303 BBI43R CAGGTCCACCCGTACAGSNNATAACATGCGCAGCTTTTG 304 BBI44R CAAAAACAGGTCCACCCGTASNNGTTATAACATGCGCAGC 305 BBI45R CAAAAACAGGTCCACCCSNNCAGGTTATAACATGCGC 306 BBI46R GACGCAAAAACAGGTCCASNNGTACAGGTTATAACATG 307 BBI47R GTCGACGCAAAAACAGGTSNNCCCGTACAGGTTATAAC 308 BBI48R GATGTCGACGCAAAAACASNNCCACCCGTACAGGTTATAAC 309 BBI49R GTGATGTCGACGCAAAASNNGGTCCACCCGTACAGGTTAT 310 BBI50R GTCCGTGATGTCGACGCASNNACAGGTCCACCCGTACAG 311 Nom. de Secuencia de Cebador SEQ ID cebador NO: BBI51R GAAGTCCGTGATGTCGACSNNAAAACAGGTCCACCCGTAC 312 BBI52R CAGAAGTCCGTGATGTCSNNGCAAAAACAGGTCCACC 313 BBI53R CATAGCAGAAGTCCGTGATSNNGACGCAAAAACAGGTCC 314 BBI54R GTTCATAGCAGAAGTCCGTSNNGTCGACGCAAAAACAGG 315 BBI55R GGTTCATAGCAGAAGTCSNNGATGTCGACGCAAAAAC 316 0 BBI56R CATGGTTCATAGCAGAASNNCGTGATGTCGACGCAAAAAC 317 BBI57R GTTTACATGGTTCATAGCASNNGTCCGTGATGTCGACGC 318 BBI58R GGTTTACATGGTTCATASNNGAAGTCCGTGATGTCGAC 319 BBI59R CTTGGTTTACATGGTTCSNNGCAGAAGTCCGTGATGTC 320 BBI60R CTCGCTTGGTTTACATGGSNNATAGCAGAAGTCCGTGATG 321 BBI61R TTTTACTCGCTTGGTTTACASNNTTCATAGCAGAAGTCCG 322 BBI62R CTTTTACTCGCTTGGTTTSNNTGGTTCATAGCAGAAGTC 323 BBI63R TTAAGCTTTTACTCGCTTGGSNNACATGGTTCATAGCAGAAG 324 BBI64R GTTAAGCTTTTACTCGCTSNNTTTACATGGTTCATAGC 325 BBI65R GAGTTAAGCTTTTACTCSNNTGGTTTACATGGTTCATAG 326 BBI66R CTCGAGTTAAGCTTTTASNNGCTTGGTTTACATGGTTC 327 Los cultivos en cada placa maestra se descongelaron y se usó un replicador de espiga para inocular una nueva placa estéril de microtítulo que contiene 150 µ? de caldo Luria con 5 pg/ml de cloranfenicol en cada concavidad. Las placas se cultivaron durante aproximadamente 10 horas en una caja humidificada y aireada como se describe anteriormente.

Para los controles, los cultivos en dos concavidades se reemplazaron con cultivos de BBI y BBI-AV que se han cultivado concurrentemente en tubos de cultivo de 15 mi (5 mi de caldo Luria con 5 yg/ml de cloranfenicol) . Después de que se cultivaron los cultivos, la placa se usó para inocular dos placas duplicadas de filtro de 96 concavidades (Millipore, MSGV2210) que contienen 150 µ? de medio MBD (Vogtentanz et al., 2007) con 5 g/ml de cloranfenicol en cada concavidad al usar un replicador de espiga. Las placas duplicadas se cultivaron durante aproximadamente 14 horas (como antes, con separador plásticos colocados entre las placas apiladas para permitir eficiente flujo de aire alrededor de las placas) y luego se adicionó 2-mecaptoetanol a cada concavidad en una de las placas a una concentración final de 2 mM. Las placas se cultivaron durante aproximadamente 46 horas adicionales. Las placas de filtro de 96 concavidades que contienen el caldo de cultivo (con o sin 2-mecaptoetanol adicionado) entonces se valoraron para actividad de BBI y BCE.

Ejemplo 9 Examen Primario de Variantes de BBIt-AV: Ensayos de Actividad de BBI y BCE para Determinar Variantes que Tienen la Más Alta Relación de Actividad de BBIt-AV : BCE En este ejemplo, se proporcionan métodos para valorar el efecto de las sustituciones de aminoácido introducidas en los BBIt-AV variantes, modificados, generados de acuerdo a los métodos de saturación de sitio. La actividad inhibitoria de tripsina del BBIt-AV modificado, generado por los métodos de saturación de sitio descritos anteriormente se midió y se comparó a la actividad inhibitoria de tripsina del BBI tipo silvestre de control (SEQ ID NO: 13; BBI-wt o sBBI) o el BBIt-AV no modificado de control (SEQ ID NO:187). No se propone que la presente invención se limite a estos métodos específicos, puesto que otros métodos adecuados encuentran uso.

Ensayo Inhibitorio de Tripsina: Determinación de Actividad de BBI La concentración relativa de los BBIt-AV modificados y de control, activos se determinó por un. ensayo inhibitorio de tripsina que usa sBBI purificados como una norma como se describe anteriormente. Para algunas muestras, la concentración de BBI activos se midió por actividad residual de tripsina de acuerdo al método descrito por Flecker (Flecker, P. FEBS Lett. 252:153-157

[1989]; Vogtentanz et al. supra) .

Se analizaron bibliotecas usando diluciones de cultivos crecidos en placas de 96 concavidades. Típicamente, el caldo de cultivo de cada concavidad se diluyó (200 veces) en Amortiguador de Ensayo (Tris 100 mM, pH 8.6, Tween 80 al 0.005 %) y se transfirió a una segunda placa de microtítulo (Costar 9017, Corning, Inc., Corning, NY) . Entonces, se transfirieron 20 µ? de las muestras diluidas a una tercera placa de microtítulo. Se creó una curva normal al adicionar 20, 10, o 2.5 µ? del cultivo de control de sBBI diluido (SEQ ID NO: 13) a concavidades vacías entonces, a cada concavidad de la placa se adicionaron 80 µ? de tripsina a 50 ng/ml (tripsina pancreática bovina, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ) (preparada de una solución concentrada a 1 mg/ml diluida en Amortiguador de Ensayo) . Las reacciones se mezclaron e incubaron 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, 100 µ? de sustrato de tripsina a 0.5 mg/ml (succinil-Ala-Ala-Pro-Arg-para-nitroanilida, Bachem Bioscience, Inc., King of Prussia, PA) , diluida en Amortiguador de Ensayo de una solución a 100 mg/ml de DMSO, se adicionó a cada concavidad, se mezcló, y la absorbancia a 405 nm se monitorizó durante 15 minutos, con un punto de tiempo registrado cada 12 segundos usando un Spectra Max 250 (Molecular Devices) . Los puntos de datos se usaron para determinar la velocidad de cada reacción. La curva normal se generó al graficar la velocidad de reacción versus el volumen de BBI y se adaptó a una ecuación de cuatro parámetros. Se realizó el ajuste de todos los datos usando el software suministrado por el fabricante (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) . La actividad de cada variante BBIt-AV se calculó de la curva normal. De esta manera, las actividades de todas las proteínas variantes modificadas se determinaron con relación a la actividad en el cultivo de control de sBBI (BBI- T) . Si la mayoría de los datos no caen cerca de la IC50 de la curva normal, se hizo y valoró una nueva placa de dilución.

Ensayo de Actividad Enzimática de Celulasa: Ensayo de BCE La concentración de BCE se determinó por un ensayo de actividad usando BCE purificada como una norma como se describe anteriormente y por (Vogtentanz et al. 2007). Para el análisis de bibliotecas cultivadas en placas de microtítulo de 96 concavidades, se transfirieron 20 mi de caldo de cultivo a cada concavidad de una nueva placa de microtítulo. Se creó una curva normal al adicionar 20, 10, 5 o 2.5 µ? del cultivo de control de BBI-WT diluido a estas concavidades vacías. Entonces, a la placa se adicionaron 180 µ? del sustrato de BCE (0.25 pg/ml en Amortiguador de Ensayo), 4 -nitrofenil- ß-D-celobiosida (Sigma, St. Louis, MO) . La placa se mezcló y la absorbancia a 405 nm se monitorizó durante 15 minutos, con un punto de tiempo registrado cada 12 segundos usando un Spectra Max 250 (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) . Los puntos de datos se usaron para determinar la velocidad para cada reacción. La curva normal se generó al graficar la velocidad versus volumen de cultivo y se ajustó a una curva cuadrática. La concentración de BCE en cada cultivo variante se determinó con relación al cultivo de control normal.

Relación de Actividad Enzimática : relaciones BBIt-AV: BCE De los resultados del ensayo de placa de microtítulo, la relación de actividad de BBIt-AV: BCE de cada concavidad se determinó al dividir los valores de la actividad inhibitoria de tripsina de BBIt-AV relativa por los valores de actividad de BCE relativa. Los datos se clasificaron en base a la relación de actividad de BBIt-AV: BCE. Se seleccionaron variantes modificadas con las relaciones más altas de actividad de BBlt-AV:BCE y se sometieron a un examen secundario descrito más adelante. Análisis de Relación de Actividad Enzimática BBIt-AV : BCE . -Examen Secundario de Variantes En este ejemplo los BBIt-AV modificados que tienen actividad mejorada de BBIt-AV:BCE con relación a aquella del BBIt-AV no modificado de control cuando se cultivaron en la presencia o ausencia de un agente reductor (2-mercaptoetanol) , como se determina en el examen primario, se arreglaron y valoraron en cuadruplicado en un examen secundario. Inicialmente, sólo los polinucleótidos que codifican para cada uno de los BBIt-AV modificados que tiene la relación más alta BBIt-AV:BCE como se determina en el examen secundario, se secuenciaron. Finalmente, se secuenciaron todos los clones de BBIt-AV.

Prueba en Cuadruplicado en Placas de Microtítulo.- Examen Secundario Para cada placa, se cultivaron veintidós muestras de cultivos que contienen BBIt-AV modificados seleccionados del examen inicial, y dos muestras del cultivo de control que contienen sBBI y BBIt-AV no modificado durante aproximadamente 10 horas en 5 mi de caldo Luria con cloranfenicol 5 ppm (37°C, 250 rpm) en tubos de cultivo de 15 mi. Entonces, se arreglaron 150 µ? de cada uno de los 24 cultivos en cuadruplicado en una placa de microtítulo de 96 concavidades. Esta placa arreglada entonces se usó para inocular placas de filtro en duplicado (Millipore, MSGV2210) que contiene 150 µ? del medio BD con 5 pg/ml de cloranfenicol por concavidad al usar un replicador de' espiga. Los cultivos en placa se cultivaron (en la presencia y ausencia de 2-ß-mercatoetanol) (ß??) , y se determinaron las relaciones BBI-AV:BCE y se analizaron como se describe anteriormente.

La Figura 10 muestra un ejemplo del efecto de todas las 19 posibles sustituciones de aminoácido en la posición 29 de SEQ ID NO: 187 en la actividad inhibitoria de tripsina del BBIt variante, modificado. Los datos muestran la relación de las actividades de BBI y de BCE determinadas de mediciones en cuadruplicado de actividades de BCE y tripsina de los BBI-AV modificados que tienen una sustitución de aminoácido individual en la posición 29 de SEQ ID NO: 187.

Ejemplo 10 Selección de BBIt-AV Modificados, Mejorados con Sustituciones Conocidas de Aminoácido En este ejemplo, se construyeron bibliotecas de saturación de sitio para generar un conjunto completo de sustituciones de aminoácido en sitios identificados en el examen inicial que dieron por resultado BBIt-AV que tienen actividad inhibitoria de tripsina, mejorada, en comparación a la actividad inhibitoria de tripsina del BBI-AV no modificado de origen. Además, un conjunto completo de sustituciones de aminoácido en los sitios que no se han sustituido anteriormente con todos los 19 posibles aminoácidos se generaron por mutagénesis dirigida al sitio. Un total de 39 bibliotecas de saturación de sitio se generaron y las mediciones de actividad en cuadruplicado de la actividad inhibitoria de tripsina de BBI y la actividad de BCE se analizaro para determinar las sustituciones individuales que dieron por resultado moléculas de BBIt-AV modificadas que tienen actividad inhibitoria de tripsina que fue mayor que aquella de las moléculas de BBI de control, es decir, sBBI y BBIt-AV no modificados. Las posiciones de los aminoácidos que se sustituyeron en el BBIt-AV no modificado se muestran en la Figura 9.

Construcción de un Segundo Conjunto de Bibliotecas de Saturación de Sitio en los Sitios 18, 38 y 61 Primero, para ayudar a la construcción de la biblioteca, se sintetizó un gen sintético para reemplazar el sitio EcoRI con un sitio Sphl entre la región que codifica para el asa inhibitoria de tripsina y la región que codifica para el asa inhibitoria de quimiotripsina en la región codificadora 2BBIck81 (la ubicación del sitio EcoRI se muestra en la Figura 3). La secuencia de gen sintético es: 5' -GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCGCTTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTTTCTGCGTCG ACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 329). Este gen sintético se clonó en p2JMagkl03-Ink2- BBIt-AV como un fragmento BamHI-HindIII y el vector resultante se llamó p2JMagkl03 - Ink2 - BBIt-AVsph.

Las bibliotecas de saturación de sitio se construyeron en las posiciones 18, 37 y 61 usando casetes de oligonucleótidos como sigue.

Una biblioteca de saturación de sitio en el sitio 18 se construyó al fijar los oligonucleótidos 5'-GTACAAAATCANNSCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTTTAAATAGCTG TCATTCTGCATG (SEQ ID NO: 330) y 5'- CAGAATGACAGCTATTTAAACGCATATCAGAACAACGACATTGTGGAGGSNNTG ATTTT (SEQ ID NO: 331) y ligando el cásete resultante en los sitios BsrGI y Sphl de p2JMagkl03 - Ink2 -BBI-AVsph.

Una biblioteca de saturación de sitio en el sitio 37 se construyó al fijar los oligonucleótidos 5'-TCGACGCAGAAACATGTCCAACCGTAAAGGTTATAGCAAGCACATGASNNGCATG (SEQ ID NO:332) y 5'- CNNSTCATGTGCTTGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTTTCTGCG (SEQ ID NO: 333) y ligando el cásete resultante en los sitios Salí y Sphl de p2JMagkl03-Ink2-BBI-AVsph.

La biblioteca de saturación de sitio en la posición 61 se produjo al fijar los oligonucleótidos 5'-TCGACATCACTGACTTCTGCTATGAANNSTGTAAACCTTCTGAATAAA (SEQ ID NO: 334) con los dos oligonucleótidos 5'- TTCATAGCAGAAGTCAGTGATG (SEQ ID NO: 335) y 5'- AGCTTTTATTCAGAAGGTTTACA (SEQ ID NO: 336) y ligando el c sete en los sitios Salí y HindIII de p2JMagkl03-Ink2- BBIt-AVsph.

Las mezclas de ligación se usaron para transformar células TOP10 de E. coli (Invitrogen) . Se seleccionaron noventa y seis transformantes y la sustitución de aminoácido presente en cada clon se determinó por secuenciación de ADN. Los plásmidos aislados de cada sustitución individual de aminoácido entonces se usaron para transformar B. subtilis . Generación de Sustituciones de Aminoácido por Mutagénesis Dirigida al Sitio Se construyeron sustituciones de aminoácido en sitios seleccionados al ligar un oligonucleótido o un cásete de oligonucleótido en el vector p2JMagkl 0 - Ink2 -BBI-AVsph usando los sitios apropiados de restricción. Las sustituciones, las secuencias de oligonucleótido y los sitios de restricción usados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2 Oligonucleótidos para mutagénesis dirigida a sitio Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción A13Y 5' -Phos- SaCl & GTACAGTAGCATTGATCGCAACAAGGTTTAGA BsrGI GCT (SEQ ID NO: 337) R23D,E 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTGANTGT Sph TCTGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 338) 5' - CAGAATGACAGCTATTTAAACGCATATCAGAA CANTCACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:339) S25 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph ATGGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 340) 5' - CAGAATGACAGCTATTTAAACGCATATCCATA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO: 341) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción S25 5 ' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TGGGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 342) 5' - CAGAATGACAGCTATTTAAACGCATATCCCAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO: 343) S25A,V,G 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph GBAGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 344) 5' - CAGAATGACAGCTATTTAAACGCATATCTVCA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:345) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción S25N,Q,K,H 5' -Phos- BsrGI £¿ GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph MAWGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID N0:346) 5 '_ CAGAATGACAGCTATTTAAACGCATATCWTKA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:347) M27 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATTGGCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 348) 5 ' - CAGAATGACAGCTATTTAAACGCCAATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO: 349) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción M27H 5 ' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATCACCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO:350) 5' -CAGAATGACAGCTATTTAAACGGTGATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:351) M27G,A, V,D 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATGNTCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 352) 5' - CAGAATGACAGCTATTTAAACGANCATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:353) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción M27F, I 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATWTTCGTTTAAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 354) 5' - CAGAATGACAGCTATTTAAACGAAWATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:355) L29I 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTATTAATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 356) 5' - CAGAATGACAGCTATTAATACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:357) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción L29D, E 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTGA AATAGCTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO:358) 5' - CAGAATGACAGCTATTNTCACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:359) S31M 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTTTAAATATGTGTCATTCTGCA TG (SEQ ID NO:360) 5 ' CAGAATGACACATATTTAAACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO: 361) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción S31D, E, Y 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTTTAAATKAWTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 362) 5' - CAGAATGACA T ATTTAAACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO: 363) S31Q,H 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTTTAAATCANTGTCATTCTGC ATG (SEQ ID NO: 364) 5' - CAGAATGACANTGATTTAAACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO: 365) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción S34I 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATATCGC ATG (SEQ ID NO:366) 5' - CGATATGACAGCTATTTAAACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:367) S34W 5' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATTGGGC ATG (SEQ ID NO: 368) 5' - CCCAATGACAGCTATTTAAACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO: 369) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción S34R,Q 5 ' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATCRAGC ATG (SEQ ID NO: 370) 5 ' - CTYGATGACAGCTATTTAAACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:371) S34D,E 5 ' -Phos- BsrGI & GTACAAAATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGT Sph TCTGATATGCGTTTAAATAGCTGTCATGANGC ATG (SEQ ID NO: 372) 5' - CNTCATGACAGCTATTTAAACGCATATCAGAA CAACGACATTGTGGAGGGTTTGATTTT (SEQ ID NO:373) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción A40V,D 5' -Phos- Sphl & TCGACGCAGAAACATGTCCAACCGTAAAGGT Salí TATAGCAAWCACATGATTTGCATG (SEQ ID NO: 374) 5' - CAAATCATGTGWTTGCTATAACCTTTACGGTT GGACATGTTTCTGCG (SEQ ID NO: 375) A40H, P 5' -Phos- Sphl & TCGACGCAGAAACATGTCCAACCGTAAAGGT Salí TATAGCAAKGACATGATTTGCATG (SEQ ID NO: 376) 5' - CAAATCATGTCMTTGCTATAACCTTTACGGTT GGACATGTTTCTGCG (SEQ ID NO: 377) A40Y, 5' -Phos- Sphl & TCGACGCAGAAACATGTCCAACCGTAAAGGT Salí TATAGCAMYAACATGATTTGCATG (SEQ ID NO: 378) 5' - CAAATCATGTTRKTGCTATAACCTTTACGGTT GGACATGTTTCTGCG (SEQ ID NO: 379) Sustituciones de, Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción F50D 5'-Phos- Sphl & TCGACGCAATCACATGTCCAACCGTAAAGGTT Salí ATAGCAAGCACATGATTTGCATG (SEQ ID NO : 380 ) 5' - CAAATCATGTGCTTGCTATAACCTTTACGGTT GGACATGTGATTGCG (SEQ ID NO: 381) F50Q, P 5' -Phos- Sphl & TCGACGCATKGACATGTCCAACCGTAAAGGTT Salí ATAGCAAGCACATGATTTGCATG (SEQ ID NO:382) 5' - CAAATCATGTGCTTGCTATAACCTTTACGGTT GGACATGTCMATGCG (SEQ ID NO: 383) F50S,R 5' -Phos- Sphl S TCGACGCAKCTACATGTCCAACCGTAAAGGTT Salí ATAGCAAGCACATGATTTGCATG (SEQ ID NO: 384) 5' - CAAATCATGTGCTTGCTATAACCTTTACGGTT GGACATGTAGMTGCG (SEQ ID NO: 385) Sustituciones de Secuencias de Pares de Oligonucleótidos Sitios de Aminoácido Restricción V52D 5' -Phos- Sphl & CAAATCATGTGCTTGCTATAACCTTTACGGTT HindIII GGACATGTTTCTGCGATGACATCACTGACTTC TGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAA (SEQ ID NO: 386) 5' - AGCTTTTATTCAGAAGGTTTACATGGTTCATA GCAGAAGTCAGTGATGTCATCGCAGAAACAT GTCCAACCGTAAAGGTTATAGCAAGCACATGA TTTGCATG (SEQ ID NO: 387) Examen Secundario de Sustituciones Individuales de Aminoácido: Prueba en Cuadruplicado en Placas de Microtítulo Para cada sitio elegido, se seleccionaron clones que corresponden a sustituciones individuales de aminoácido. Estos clones se cultivaron, junto con cultivos de BBI-WT, BBIt-AV y BBIt-AV-F50T como controles, en 5 mi de caldo Luria con cronanfenicol 5 ppm (37 °C, 250 rpm) en tubos de cultivo de 15 mi durante aproximadamente 10 horas a 37 °C. Alícuotas de 150 raicrolitros de dada uno de los cultivos se arreglaron en las concavidades de una placa de microtículo de 96 concavidades, 4 concavidades para cada sustitución de aminoácido y cada control. Cada cultivo cultivado en la placa arreglada entonces se usó para inocular placas de filtro, en duplicado (Millipore, MSGV2210) que contienen 150 µ? del medio BD con 5 g/ml de cloranfenicol por concavidad al usar un replicador de espiga. Los cultivos en las placas se cultivaron en la presencia y ausencia de 2 -mercatoetanol y se analizaron como se describe anteriormente. BBIt-AV-F50T es un BBIt-AV modificado que se identificó como que tiene relación de actividad inicial BBIt-AV: BCE antes de la activación que fue comparable a aquella del BBIt-AV no modificado de origen, pero que tiene tres veces mayor relación de actividad de BBIt-AV: BCE que aquella del BBIt-AV no modificado después de la activación con un agente reductor tal como 2-mercaptoetanol .

Para cada sitio, la relación de actividad BBI:BCE se determinó para cada concavidad y se calcularon los valores promedio para las mediciones en cuadruplicado. Las relaciones de actividad para las sustituciones individuales de aminoácido se compararon a las relaciones calculadas para BBIt-AV no modificado de origen (SEQ ID NO: 187), el BBI tipo silvestre (SEQ ID NO: 13) y el BBIt-AV modificado nombrado BBIt-AV-F50T.

Las Figuras 11A y 11B muestran el promedio de las determinaciones sen cuadruplicado de la relación BBI-BCE determinada en la presencia de 2 -mercaptoetanol (BME) con relación a. aquella determinada para el sBBI para cada una de las sustituciones en las posiciones 50 y 37, respectivamente.

En conjunto, los datos muestran sustituciones individuales de aminoácido hechas en 16 de las 66 posiciones/sitios en la molécula de BBIt-AV de origen que dan por resultado variantes de BBIt-AV que tienen actividad inhibitoria de tripsina igual o mayor que aquella del BBIt-AV precursor (datos resumidos en la Tabla 3) . De todas las sustituciones de sitio individual, F50R dio por resultado la mejor relación de actividad BBIt-AV:BCE, en tanto que varias sustituciones en la posición 50 produjeron BBIt-AV variantes, modificadas que tienen relaciones de actividad BBIt-AV: BCE cuatro veces mayores que aquella del BBIt-AV precursor no modificado, y fueron comparables a aquella del inhibidor tipo silvestre (Figuras 11A-11B) .

Estos datos muestran que una sustitución individual en la molécula de BBI-AV puede tener un efecto significativo en la actividad del BBI-AV.

Tabla 3 Sustituciones que dan por resultado moléculas de BBIt-AV modificadas con mayores relaciones de actividad de BBI : BCE que el BBIt-AV no modificado Posición Aminoácido Nativo Sustituciones Mejoradas (con BME) 1 D A, P 4 S V (inserción 4D13>* 5 S P, A Posición Aminoácido Nativo Sustituciones Mejoradas (con BME) 11 Q G 13 A Y, I, F, M, L, V, K, R 18 N I, v 25 S K, N, W, I, A, R 27 M H, R, K, V, A, Q 29 L R, K, P 31 S Q, H, E, A, R, W, K, T 38 S N, K, R 40 A H , K, Q, R, Y 50 F R, Q, K, T, V, M, S 52 V K, T, R, Q, L, H, A, M, S, E 55 T M 65 S E, D * La inserción 4D13 es una secuencia de 13 aminoácidos que se adicionó al N-terminal de la proteína de BBI como se describe más adelante.

Ejemplo 11 Selección de Variantes Modificadas que Tienen Rendimiento Mejorado de Purificación En este ejemplo, los métodos descritos se usaron para identificar BBIt-AV modificados que contienen sustituciones individuales de aminoácido que retuvieron la actividad inhibitoria de tripsina en tanto que se producen a rendimientos mayores que el correspondiente BBIt-AV precursor, no modificado.

Los BBIt-AV modificados que se han seleccionado por tener la más grande relación de actividad de BBIt-AV : BCE en los exámenes en placa en cuadruplicado se probaron adicionalmente en un examen de matraz agitado que se diseño para imitar el tratamiento ácido/térmico que se usa durante el proceso de purificación para escindir el BBIt-AV de la proteína de fusión de BCE: BBIt-AV. De esta manera, los BBIt-AV modificados que retuvieron una relación de actividad BBI : BCE mayor que aquella del BBIt-AV no modificado después del tratamiento ácido/térmico se identificaron como los BBlt-AV modificados que se producirán a rendimientos mayores que aquel del BBIt-AV precursor, no modificado.

Después de la activación con el agente reductor, por ejemplo, 2 -mercaptoetanol , una mayor relación de actividad de BBIt-AV: BCE indica que una sustitución dada de aminoácido ha incrementado significativamente la fracción de moléculas con al menos una asa inhibitoria de tripsina, correctamente plegada. Sin embargo, dos diferentes sustituciones de aminoácido con relaciones de actividad de BBIt-AV: BCE similares pueden tener rendimientos totales algo diferentes después de la purificación. Por ejemplo, V52L y M27A se activan a niveles pero M27A tiene aproximadamente 40 % mejor rendimiento después del tratamiento ácido/térmico. De esta manera, las variantes seleccionadas en los primeros exámenes como "buenos activadores" se evaluaron adicionalmente por un segundo criterio que se desarrolló para predecir mejor el rendimiento de purificación.

Examen de Matraz Agitado: Prueba para el Rendimiento de Purificación Para incrementar la expresión, la copia génica de los clones seleccionados se amplificó al vetear secuencialmente colonias en placas de agar Luria con 25 g/ml de cloranfenicol hasta que la velocidad de crecimiento fue similar al crecimiento en placas de agar Luria sin cloranfenicol . Los cultivos de las variantes y controles seleccionados se cultivaron en 3 mi de caldo Luria con 25 pg/ml de cloranfenicol en tubos de 15 mi durante aproximadamente 10 hora. Estos cultivos (30 µ) entonces se usaron para inocular 30 mi del medio MBD en matraces agitados con deflector de 250 mi y cultivados a 37 °C y 225 rpm durante aproximadamente 60 h.

Para la selección de las variantes con los mejores rendimientos, los caldos de cultivo se procesaron como sigue. El caldo se activó primero al mezclar 20 mi de caldo con 20 mi de amortiguador de glicina 0.25 M (pH 9.3) y el pH se ajustó a 9.0 con NaOH al 50 %. Entonces, se adicionó 2-mercaptoetanol a los cultivos diluidos a una concentración final de 2 mM y los cultivos se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave. La porción de BBIt-AV entonces se escindió de la proteína de fusión por tratamiento ácido/térmico . Que se logró al ajustar primero el pH del caldo activado a pH 1.9-2.0 con ácido sulfúrico, y seguido por incubación a 60 °C durante 16 horas, con agitación. La proteína de fusión BBIt-AB-BCE y el dominio catalítico de BCE no son solubles a pH 2 , en tanto que la especie BBI libre es soluble. Después de la reacción de escisión, el material insoluble se removió por centrifugación (5 minutos a 3000 rpm) y el sobrenadante se analizó para la actividad inhibitoria * de tripsina como se describe anteriormente. La actividad de BBI también se determinó para el material de inicio y para las muestras tomadas después de la activación. La actividad de BCE del material de inicio también se determinó como se describe anteriormente. Las relaciones de actividad BBIt-AV:BCE entonces se calcularon para cada paso en el proceso. Los BBIt-AV modificados producidos a los más altos rendimientos después del tratamiento ácido/térmico se seleccionaron para estudio adicional.

Se encontraron sustituciones de aminoácido en los sitios 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 y 52 que mejoraron significa ivamente el rendimiento de BBIt-AV después del tratamiento ácido/térmico . Otras sustituciones con rendimientos mejorados después del tratamiento ácido/térmico fueron D1C (cuando no se activa) , S4V, S5P, Q11G, S38N y S65E. Una variante adicional que se produjo por una duplicación inesperada de un cebador (durante la reacción OuikChange usada para producir la biblioteca de saturación de sitio en la posición 4) también tiene mayor relación de actividad BBIt-AV:BCE después del tratamiento ácido/térmico . En esta variante, la secuencia de aminoácidos DDEPSKPCCDPDP (SEQ ID NO:389) (llamada la inserción 4D13) , se insertó entre el ligador y el N-terminal de BBIt-AV (SEQ ID NO: 187) para generar un BBIt-AV modificado, fusionado al ligador en SEQ ID NO: 391.

DNNDPIPDPddepskpccdpdpDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSA CKSCACYNLYGWTCFCVDITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 391) .

El ligador se muestra en letras cursivas, la inserción se escribe en minúsculas y el BBIt-AV que corresponde a SEQ ID NO: 187 en negritas. La secuencia del BBIt-AV modificado con 4D13 es: DDEPSKPCCDPDPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC YNLYG TCFCVDITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 390).

El gen sintético que codifica para 4D13- BBIt-AV de SEQ ID NO: 390 es : GGATCCAGATGACGAACCGAGCAAACCTTGCTGTGATCCAGACCCTGACGATG AGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATCAAATCCTCCACA GTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGTGCCTGCAAAAGCTG CAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGCCGACATCACGGACTT CTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO: 394) .

Ejemplo 12 Combinaciones de Mutaciones En este ejemplo, las sustituciones individuales de aminoácido que dan por resultado BBIt-AV que tiene relaciones mejoradas de actividad de BBI-BCE en ya sea los exámenes de placa o en el examen de matraz agitado, se combinaron para generar los BBIt-AV modificados que tienen mayores relaciones de actividad de BBIt-AV:BCE y/o rendimientos de producción que aquellos de los BBIt-AV modificados que tienen sustituciones individuales de aminoácido.

Después de los exámenes primarios y secundarios descritos en los Ejemplos 9 y 10 anteriores, se identificaron tres BBIt-AV modificados cada uno que contiene una sustitución individual de aminoácido A13I, F50T y V52A, respectivamente como que tiene una relación mejorada de actividad de BBI : BCE con relación al control respectivo. Se construyó una biblioteca para seleccionar la mejor combinación de estas tres sustituciones. La biblioteca se hizo por el protocolo de mutagénesis QuikChangeMR descrito anteriormente usando concentraciones equimolares de los siguientes cebadores en la mezcla de reacción: el cebador 5'-CTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAAATC (SEQ ID NO: 395) se usó para generar la sustitución A13I, el cebador 5'-CTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGYCGACATCACGGACTTC (SEQ ID NO: 396) se usó para generar las sustituciones F50T y F50T-V52A, y el cebador 5 ' -GACCTGTTTTTGCGYCGACATCACGGAC (SEQ ID NO: 397) se usó para generar la sustitución V52A en ,1a mezcla de reacción. Los clones se seleccionaron y examinaron en placas de microtítulo y se examinaron como se describe anteriormente .

El BBIt-AV variante, doble, modificado que contiene F50T y las sustituciones V52A (BBIt-AV-F50T-V52A; SEQ ID NO : 595 ) se obtuvo, y se determinó que tiene la secuencia de polinucleótido de SEQ ID NO: 398.

BBIt-AV-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO: 398) DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACYNLYG TCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 595) .

Generación de BBIt-AV Modificados que Contienen Tres, Cuatro y Cinco Sustituciones de Aminoácido Las combinaciones de cuatro sustituciones productivas, A13I, S25L, L29P y A40K, identificadas en los exámenes descritos en los Ejemplos 9 y 10 anteriores se produjeron en el variante doble BBIt-AV- F50T-V25A. Estas sustituciones se combinaron al usar genes sintéticos que se clonaron en los sitios BamHI y HindIII del vector p2JMagkl03Ink2BBIt-AV. Las secuencias de polinucleótido que codifican para las correspondientes secuencias de aminoácidos para los BBIt-AV que comprenden combinaciones de sustituciones se dan a continuación.

BBIt-AV-A13I-S25L-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO: 399) DPDDESSKPCCDOCICTKSNPPOCRCLD RLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 596) BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:400) DPDDESSKPCCDOCICTKSNPPOCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYG TCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:597).

BBIt-AV-A13I-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT . (SEQ ID NO: 401) DPDDESSKPCCDOCICTKSNPPOCRCLD RPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 598) BBIt-AV-A13I-S25L-A40K-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:402) DPDDESSKPCCDOCICTKSNPPOCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 599) BBIt-AV-A13I-L29P-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAG TGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO: 03) DPDDESSKPCCDOCICTKSNPPOCRCSDMRPNSCHSACASCACYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 600) BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (TA5) GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAG TGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO: 404) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 601) BBIt-AV-A13I-A40K-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCATTTGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:405) DPDDESSKPCCDOCICTKSNPPOCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 602) BBIt-AV-S25L-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:406) DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 603) BBIt-AV-S25L-L29P-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO: 07) DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:604) BBIt-AV-S25L-L29P-A40K-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:408) DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:605) BBIt-AV-S25L-A40 -F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTCTTGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:409) DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCLDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:606) BBIt-AV-L29P-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAG TGCCTGCAAAAGCTGCGCATGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:410) DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACYNLYGWTCTC ADITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 607) BBIt-AV-L29P-A40K-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCCGAATTCCTGTCATAG TGCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:411) DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTC ADITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:608) BBIt-AV-A40K-F50T-V52A GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCCTGTTGCGATCAATGCGCATGTACGAA ATCAAATCCTCCACAGTGTCGGTGTTCCGATATGCGTCTGAATTCCTGTCATAGT GCCTGCAAAAGCTGCAAGTGTTATAACCTGTACGGGTGGACCTGTACATGCGC CGACATCACGGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCAAGCGAGTAAAAGCTT (SEQ ID NO:412) DPDDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCKCYNLYGWTCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:609) Generación de BBIt-AV Modificados que Contienen Seis y Siete Sustituciones de Aminoácido Se generaron BBIt-AV modificados, adicionales que comprenden variaciones que incluyen la inserción 4D13, las sustituciones individuales de aminoácido D1C, S4V, S 5 P , Q11G, I13L, S25R, M27R, P29K, S31A, S31R, S38N, T50K, A52T, ?65?, y las s stituciones doble de aminoácido que incluyen S25R-S31R y S25R-S31 con sustituciones presentes en una variante quíntuple (BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A) codificada por el polinucleót ido de SEQ ID NO:404.

El péptido 4D13 se insertó en el vector basado en p2JM103 construido para la expresión de BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:404) con un cásete de oligonucleótido que tiene los sitios de restricción BamKI y SacI en los extremos usando los oligonucleót idos : 5'-GATCCAGATGACGAACCGAGCAAACCTTGCTGTGATCCAGACCCTGACGATGA GAGCT (SEQ ID NO:392) y 5 ' - CTCATCGTCAGGGTCTGGATCACAGCAAGGTTTGCTCGGTTCGTCATCTG (SEQ ID N0:393) .

La secuencia de aminoácidos de BBIt-AV-4D13 inserción-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A: DPDDEPSKPCCDPDPDDESS PCCDQCICTKSNPPQCRCSD RPNSCHSACKS C KCYNLYGWTCTCADITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 413) Las otras variantes se hicieron al clonar genes sintéticos en los sitios BamHI y HindlII de p2 JM103 - Ink2. Las secuencias de pol inuc leó t ido de cada uno de los genes sintéticos y las secuencias de aminoácidos, modificadas, resultantes de los BBIt-AV variantes, modificados se dan en la Tabla 4.

Tabla 4 BBIt-AV que comprenden sustituciones/modificaciones en base a la variante BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO: 601) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de de aminoácido codifica para variante de BBIt-AV aminoácidos de la en BBIt-AV variante de BBIt-AV BBIt-AV-DIC- GGATCCATGCGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPCDESSKPCCDQ A13I-L29P- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS A40K-F50T- TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNSCHSACKS V52A ATTCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO: 611) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 14) BBIt-AV-S4V- GGATCCAGACGATGAGGTTTCTAAACCTTGT DPDDEVSKPCCDQ A13I-L29P- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS A40K-F50T- TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNSCHSACKS V52A ATTCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT NO: 612) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:415) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de de aminoácido codifica para variante de BBIt-AV aminoácidos de la en BBIt-AV variante de BBIt -AV BBIt -AV-S5P- GGATCCAGACGATGAGAGCCCTAAACCTTGT DPDDESPKPCCDQ A13I -L29P- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS A40K -F50T- TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNSCHSACKS V52A ATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO:613) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID N0:416) BBIt -AV-Q11G- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESS PCCDG Al31 -L29P- TGCGATGGCTGCATTTGTACTAAATCAAACC CICTKSNPPQCRCS A40K -F50T- CTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCT DMRPNSCHSACKS V52A AATTCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAA CKCYNLYGWTCTCA ATGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACAT DITDFCYEPCKPSE GCGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACC (SEQ ID NO:614) ATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 417) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de de aminoácido codifica para variante de BBIt-AV aminoácidos de la en BBIt-AV variante de BBIt -AV BBIt -AV- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ Al31 -L29P- TGCGATCAATGCCTTTGTACTAAATCAAACCC CLCT SNPPQCRCS A40K -F50T- TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNSCHSACKS V52A ATTCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO:615) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:418) BBIt -AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ S25R -L29P- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCR A40K -F50T- TCCACAATGTCGTTGTAGAGATATGCGTCCT DMRPNSCHSACKS V52A AATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAA CKCYNLYGWTCTCA ATGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACAT DITDFCYEPCKPSE GCGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACC (SEQ ID NO: 616) ATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:419) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de de aminoácido codifica para variante de BBIt-AV aminoácidos de la en BBIt-AV variante de BBIt-AV BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ S25R-L29P- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCR S31A-A40K- TCCACAATGTCGTTGTAGAGATATGCGTCCT DMRPNACHSACKS F50T-V52A AATGCTTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAA CKCYNLYGWTCTCA ATGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACAT DITDFCYEPCKPSE GCGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACC (SEQ ID NO: 617) ATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:420) BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ S25R-L29P- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCR S31R-A40K- TCCACAATGTCGTTGTAGAGATATGCGTCCT DMRPNRCHSACKS F50T-V52A AATCGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAA CKCYNLYGWTCTCA ATGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACAT DITDFCYEPCKPSE GCGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACC (SEQ ID NO:618) ATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 421) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de de aminoácido codifica para variante de BBIt-AV aminoácidos de la en BBIt-AV variante de BBIt -AV BBIt -AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ M27R -L29P- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS A40K -F50T- TCCACAATGTCGTTGTTCTGATAGACGTCCTA DRRPNSCHSACKSC V52A ATTCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CYNLYGWTCTCAD TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG ITDFCYEPCKPSE CGCAGA ATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO: 619) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:422) BBIt -AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ L29K -A40K- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS F50T -V52A TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTAAAA DMRKNSCHSACKS ATTCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO:S20) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:423) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de de aminoácido codifica para variante de BBIt-AV aminoácidos de la en BBIt-AV variante de BBIt-AV BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESS PCCDQ L29P-S31A- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS A40 -F50T- TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNACHSAC S V52A ATGCTTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO: 621) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:424) BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ L29P-S31R- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS A40K-F50T- TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNRCHSACKS V52A ATAGATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO: 622) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:425) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de de aminoácido codifica para variante de BBIt-AV aminoácidos de la en BBIt-AV variante de BBIt-AV BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ L29P-S38N- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS A40K-F50T- TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNSCHSACKN V52A ATAGCTGTCATTCTGCATGCAAAAACTGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT- (SEQ ID NO: 623) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:426) BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ L29P-A40K- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS F50K-V52A TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNSCHSACKS ATTCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCKC TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTAAATG ADITDFCYEPCKPSE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO:624) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 427) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de de aminoácido codifica para variante de BBIt-AV aminoácidos de la en BBIt-AV variante de BBIt-AV BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ L29P-A40K- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS F50T-V52T TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNSCHSACKS ATTCATGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCT TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPSE CACAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO: 625) GTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 428) BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGT DPDDESSKPCCDQ L29P-A40K- TGCGATCAATGCATTTGTACTAAATCAAACCC CICTKSNPPQCRCS F50T-V52A TCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTA DMRPNSCHSACKS ATAGCTGTCATTCTGCATGCAAATCATGTAAA CKCYNLYGWTCTCA TGCTATAACCTTTACGGTTGGACATGTACATG DITDFCYEPCKPEE CGCAGATATCACTGACTTCTGCTATGAACCAT (SEQ ID NO: 626) GTAAACCTGAAGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 29) La relación de BBI : BCE de los BBIt-AV variantes, modificados se determinó como se describe anteriormente, y se calculó el rendimiento para cada uno de los BBIt-ÁV variantes, modificados. Los BBIt-AV BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:618) , BBIt-AV-A13I-S25R-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:617) , BB 11 -AV - Al 3 I - S 25 R - L29 P - 40 K- F 50 T - V52A (SEQ ID NO:616) , BBIt -AV-A13 I-L29P-S31R-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:622) modificados tienen significativamente mejores rendimientos después del tratamiento ácido/ térmico que los BBIt -AV-A13 I - L29 P -A40K- F50T-V52A ( SEQ ID NO:601), mientras BBIt -AV-A13 I -L29P-A40K- F50K-V52A (SEQ ID NO:624), BBI t -AV-Al 3 I - L29 P -A40 K- F5 OT-V52A (SEQ ID NO:615) y BBIt-AV-4D13 inserC ion-Al3 I - L29P -A40K-F50T- V52A (SEQ ID NO:413) quíntuples tienen ligeramente mejores rendimientos que BBIt-AV-A13 I -L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:601) . Los BBI t -AV-Al 3 I -L29P-A40K-F50T-V52A-S65E (SEQ ID NO : 626 ) y BBIt-AV-A13I-L29P-S38N-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:623) modificados tienen rendimientos similares como BBIt -AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52 (SEQ ID NO: 624), BBIt-AV-A13I-M27R-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO : 61 ) , BBI t -AV-A13I-L29P-S31A-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:621) y BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52T (SEQ ID NO: 625) algo menor, en tanto que BBI t -AV- S4V-Al 3 I - L29 P -A40K- F5 OT -V52A (SEQ ID NO:612), BBIt -AV- QI 1G-Al 3 I - L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO:614), BBIt -AV-A13 I - L29K-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO : 620 ) y BBI t -AV- S 5 P -Al 3 I - L29 P -A40K-F50T- V52A (SEQ ID N0.-611) tuvieron todos rendimientos significativamente menores que BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO : 601 ) , después del tratamiento ácido- térmico . El rendimiento de BBI t -AV- D1C-A13I-L29P-A40K- F50T-V52A (SEQ ID N0:611) en ausencia de activación también fue mucho menor que BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO : 601 ) . Sin embargo, el rendimiento después del tratamiento ácido/térmico de BBIt-AV-DlC-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO: 611) cuando no se activó fue aproximadamente dos veces mayor que BBIt-AV-A13I-L29P-A4 OK-F50T- V52A (SEQ ID NO : 601 ) , cuando se activó pero similar a BB It -AV-Al 3 I - L29P -A40K- F50T-V52A (SEQ ID NO:601) cuando no se activó. De esta manera, no se encontraron sustituciones que puedan producir altos rendimientos sin activación.

Generación de BBI-AV Modificados que Contienen Ocho Sustituciones de Aminoácidos: Variantes Óctuples Después de la prueba de los BBI-AV modificados, basados en quíntuple, se generaron BB I variantes, modificados, adicionables (variantes óctuples) que contiene ocho sustituciones de aminoácido. La actividad y el rendimiento de purificación de las variantes óctuples se determinaron como se describe anteriormente. La construcción de los BB I t -AV modificados, óctuples se logró como se describe anteriormente usando los genes sintéticos mostrados en la Tabla 5.

Tabla 5 BBIt-AV Variantes, Modificados, Óctuples Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de aminoácidos de aminoácidos codifica para la variante óctuple de la variante de BBIt-AV BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTT DPDDESSKPCCDOCICTKSNP 525R-M27A- GTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCA POCRCRDARPNACHSACKSC L29P-531A- AAO00TCCACAATGTCGTTGTAGAGATGC HCYNLYGWTCKCTDITDFCYE A40H-F50 -V52T TCGTCCTAATGCATGTCATTCTGCATGCA PCKPSE (KT8) AATCATGTCACTGCTATAACCTTTACGGTT (SEC ID NO: 627) GGACATGTAAATGCACAGACATCACTGAC TTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAA TAAAAGCTT (SEC ID NO: 486) BBIt-AV- 13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTT DPDDESSKPCCDQCICTKSNP S25K-M27A- GTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCA PQCRCKDARRNECHSACKSCK L29R-S31E- AACCCTCCACAATGTCGTTGTAAAGATGC KCYNLYGWTCQCQDITDFCYE A40K-F50Q-V52Q TCGTAGAAATGAATGTCATTCTGCATGCA PCKPSE (QQ8) AATCATGTAAATGCTATAACCTTTACGGTT (SEC ID NO: 628) GGACATGTCAATGCCAAGACATCACTGAC TTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAA TAAAAGCTT (SEC ID NO: 487) Sustituciones Secuencia de gen sintético que Secuencia de aminoácidos de aminoácidos codifica para la variante óctuple de la variante de BBIt-AV BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTT DPDDESSKPCCDOCICTKSNP 525K-M27R- Gl'TGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCA PQCRCKDRRENACHSACKSC L29E-531A- AACCCTCCACAATGTCGTTGTAAAGATAG HCYNYGWTCRC DITDFCYE A40H-F50R-V52K ACGTGAAAATGCTTGTCATTCTGCATGCA PCKPSE (RK8) AATCAGTCACTGCTATAACCTTTACGGTT (SEC ID NO:629) GGACATGTAGATGCAAAGACATCACTGAC TTCTGCTTGAACCATGTAAACCTTCTGAA.

TAAAAGCTT (SEC ID NO: 88) BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTT DPDDESSKPCCDQCICTKSNP 525K-M27A- GTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCA PQCRCKDARARNCHSACKSC L29R-531A- AACCCTCCACAATGTCGTTGTAAAGATGC HCYNLYGWTCRCLDITDFCYE A40H-F50R- TCGTAGAAATGCTTGTCATTCTGCATGCA PCKPSE V52L (RL8) AATCTGTCACTGCTATAACCTTTACGGTT (SEC ID NO: 630) GGACATGTAGATGCTTAGACATCACTGAC TTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAA TAAAAGCTT (SEC ID NO: 489) BBIt-AV-A13I- GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTT DPDDESSKPCCDOCICTKSNP 525K-M27Q- GTTGCGATCAATGCATCTGTACAAAATCA PQCRCKDQRPNECHSACKSCH L29P-531E- AACCCTCCACAATGTCGTTGTAAAGATCA CYNLYGWTCRCQDITDFCYE A40H-F50R- ACGTCCTAATGAATGTCATTCTGCATGCA PCKPSE V52Q (RQ8) AATCATGTCACTGCTATAACCTTTACGGTT (SEC ID NO:631) GGACATGTAGATGCCAAGACATCACTGAC TTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAT AAAAGCTT (SEC ID NO: 490) Las mejores variantes óctuples seleccionadas en el examen de matraz agitado se probaron en el proceso de purificación esencialmente como se describe anteriormente, incluyendo los siguientes cambios: 1) después del crecimiento, el cultivo se diluyó dos veces en amortiguador de glicina (concentración final) 125 mM y pH ajustado a 9.0) en lugar de amortiguador CHES; 2) las muestras se activaron con 2 -mercaptoetanol 2 mM únicamente (no se detectó sulfito de sodio; 3) la proteína de fusión precipitada con ácido se re-suspendió en 100 mi de glicina 125 mM (en lugar de 350 mi de glicina 40 mM) ; y 4) el sedimento recolectado después del tratamiento ácido/térmico se lavó con 10 mi de agua, se filtró, y este filtrado de "sedimento a lavado" se combinó con el filtrado original. Los filtrados finales se concentraron y trituraron con Glu-BL como se describe anteriormente .

Los resultados muestras que las moléculas QQ8 (SEQ ID NO: 628) y KT8 (SEQ ID NO: 627) de los BBIt-AV variantes, óctuples dieron por resultado rendimientos de purificación que fueron mayores que aquel de la variante modificada óctuple BBIt-AV-A13I-L29P-A40K-F50T-V52A (SEQ ID NO: 601). Las variantes óctuples modificadas BBIt-AV-A13I-S25K-M27A- L29R-S31A-A40H-F50R-V52L (RL8; SEQ ID NO:630), BBIt-AV-A13I-S25K-M27A-L29R-S31E-A40K-F50Q-V52Q (QQ8; SEQ ID NO: 628) y BBIt-AV-A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-A40H-F50K-V52T (KT8; SEQ ID NO: 627) dieron por resultado rendimientos que fueron mejores que la molécula/proteína de sBBI tipo silvestre (Figura 13) .

Ejemplo 13 Producción Mejorada de Núcleos Moleculares de BBI que Tienen Péptidos de Unión a FGF5 o ???ß? En este ejemplo, las mismas sustituciones de aminoácido que dieron por resultado BBIt-AV variantes, modificados que tienen actividad inhibitoria de tripsina, mejorada, y/o rendimientos de purificación, mejorados (ver Ejemplos 7-13) se probaron para mejorar la actividad inhibitoria de tripsina y/o el rendimiento de purificación de los núcleos moleculares de BBI variantes en los cuales la asa de quimiotripsina se reemplazó con ya sea un péptido de unión a FGF-5 o a TGFpl.

Generación de Proteínas BBI-FGF-5 Variantes y Variantes, Modificadas : Los inhibidores de proteasa BBIt-FGF-5 variantes, modificados que comprenden la combinación de sustituciones A13I-L29P-F50T-V52A (todas con alanina en la posición 40) y ya sea el péptido de unión a FGF-5 MM007: RTQPYPL (SEQ ID NO:670), o el péptido de unión a FGF-5 FGFps2 : TWIDSTP (SEQ ID NO: 671) en lugar de la asa de quimiotripsina, se construyeron al ligar un gen sintético en los sitios BanMI y tfindIII del vector p2JMagkl03 - lnk2 -BBIt-AV. Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ADN de los genes sintéticos que codifican para la variante modificada resultante MM007-Q- BBIt-FGF-5 (SEQ ID NO: 432; SEQ ID NO: 433) y la variante modificada FGFps2 -Q-BBIt-FGF- 5 , respectivamente (SEQ ID NO:434 SEQ ID NO:435) son como sigue.

Gen sintético MM007-Q-BBIt-FGF-5 GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAA ATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCCGTACTCAACCATACCCTCTTTGTACATGCGCA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:433) Proteína MM007-Q-BBIt-FGF-5 DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACRTQPYPLCTCA DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 432) FGFps2-Q-BBIt-FGF-5 GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAA ATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCACTTGGATTGATTCAACACCATGTACATGCGCA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:435) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACTWIDSTPCTCAD ITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 434) Generación de Proteínas BBI-TGFp Variantes y Variantes, Modificadas : La asa inhibitoria de quimiotripsina del BBIt-AV de SEQ ID NO: 187 se reemplazó con el péptido de unión a TGFpi, PEN3: CLCPENI VLPCN (SEQ ID NO:436), el péptido de unión a TGF l MM021W: CICKH VD LCF (SEQ ID NO: 437) o el péptido de unió a TGF i WTQ: CIC TQHIHNCF (SEQ ID NO -.438) para generar las BBPI variantes de acuerdo al método descrito en el Ejemplo 2, como sigue.

Se usaron pares de oligonucleótidos para producir casetes para -'reemplazar el péptido de unión a FGFhl en la asa de sitio reactivo de quimiotripsina codificada por el vector de expresión p2JM103-lnk2-2BBI-FGFhI con los péptidos de unión a TGF l, PEN3 , MM021W o WTQ. El p2JM103 - lnk2 -2BBI-FGFhl se construyó usando los cebadores (SEQ ID NO: 91 y SEQ ID NO: 92) y el método QuikChangeMR como se describe en el Ejemplo 2. Los casetes de unión a GFP se ligaron en los sitios de restricción Sphl y Salí en el vector p2JM1031nk2-2BBI-FGFhI para construir las moléculas de BBI variantes PEN3 -BBIt-TGF I, MM021W-BBIt-TGF y WTQ-BBIt-TGF i , respectivamente. Las secuencias de ADN de los oligonucleótidos usados para producir los casetes se muestran a continuación.

PEN3 (2da asa) CAAAAGCTGTCTTTGTCCTGAAAATATTAACGTTCTTCCTTGTAACTGCG (SEQ ID NO:439) y TCGACGCAGTTACAAGGAAGAACGTTAATATTTTCAGGACAAAGACAGCTTTTG CATG (SEQ ID NO: 440) MM021W (2da asa) CAAATCATGCATTTGTAAACACAACGTAGATTGGTTATGTTTTTGCG (SEQ ID NO: 129) y TCGACGCAAAAACATAACCAATCTACGTTGTGTTTACAAATGCATGATTTGCATG (SEQ ID NO: 130) WTQ (2da asa) CAAATCATGCATTTGTTGGACACAACATATCCACAACTGTTTTTGCG (SEQ ID NO:441) y TCGACGCAAAAACAGTTGTGGATATGTTGTGTCCAACAAATGCATGATTTGCATG (SEQ ID NO:442) Además, las variantes BBPI-TGFpi modificadas que comprenden la combinación de sustituciones A13I-L29P-V52A (todas tienen también alanina en la posición 40 y treonina en la posición 50) y el péptido de unión a TGF i PEN3-Q: CPENINVLPC (SEQ ID NO:672), MM021W-Q: CKHNVDWLC (SEQ ID NO: 673) o WTQ-Q: CWTQHIHNC (SEQ ID NO: 674) en lugar de la asa de quimiotripsina, se construyeron al ligar un gen sintético en los sitios BamUI y HindIII del vector p2JMagkl03-lnk2-BBIt-AV. Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ADN de los genes sintéticos que codifican para la variante modificada resultante PEN3 -Q-BBIt- TGF l (SEQ ID NO:443; SEQ ID NO:444), la variante modificada MM021W-BBI-TGFP1 (SEQ ID NO:445; SEQ ID N0:446), y la variante, modificada WTQ-BBI-TGFj3l (SEQ ID NO: 447; SEQ ID NO: 448) son como sigue.

PEN3 -Q-BBIt -TGFP (SEQ ID NO:443) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACPENI VLPCTCA DITDFCYEPCKPSE PEN3-Q-BBIt-TGF01 (SEQ ID NO:444) GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAA ATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCCCAGAAAACATCAACGTTCTTCCTTGTACATGC GCAGACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT MM021W-Q-BBIt-TGFpi (SEQ ID NO:445) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACKHNVD LCTCA DITDFCYEPCKPSE MM021 -Q-BBIt-TGFpi (SEQ ID NO:446) GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAA ATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCAAACATAACGTTGATTGGCTTTGTACATGCGCA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT WTQ-Q-BBIt-TGFpi (SEQ ID NO:447) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCSDMRPNSCHSACKSCACKHNVDWLCTCA DITDFCYEPCKPSE WTQ-Q-BBIt-TGF (SEQ ID NO:448) GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATTTGTACTAA ATCAAATCCTCCACAATGTCGTTGTTCTGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCTGGACACAACATATCCACAACTGTACATGCGCA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCATCTGAATAAAAGCTT Los diez vectores que comprenden los BBI variantes y variantes modificados que contienen un péptido de unión a FGF-5 o a GFP se usaron para transformar células hospedadoras B. subtilis BG6006. Los transformantes se cultivaron y los BBI manejados producidos por las células hospedadoras se probaron para las actividades inhibitorias de tripsina y los rendimientos de producción como se describe anteriormente.

La Figura 14 muestra la actividad inhibitoria de tripsina de la variante no modificada de origen MM007-PT-BBIt-FGF-5 (SEQ ID NO:678): (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACRTQPYPL CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO: 678), la variante no modificada de origen FGFps2 - PT-BBIt-FGF5 (SEQ ID NO:679) : (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACTWIDSTP CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO: 679), la variante no modificada de origen PEN3 -PT-BBIt-TGFpl (SEQ ID NO:680): (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCAC PENINVLP CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO: 680), la variante no modificada de origen WTQ-PT- TGF^l (SEQ ID NO: 681) : (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACWTQHIHNCF CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO: 681), y la variante no modificada de origen M 0021W-PT-TGF l (SEQ ID NO: 682): (DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCACKHNVD L CFCVDITDFCYEPCKPSE; SEQ ID NO:682), (designada a PT en la Figura 14) y las proteínas MM007-Q-BBIt-FGF-5 (SEQ ID NO: 432) variante, modificada, la proteína FGFps2-Q-BBIt-FGF5 (SEQ ID NO:434) variante, modificada, la proteína PEN3-Q-BBIt-TGFP1 (SEQ ID NO: 443) variante modificada, la proteína WTQ-Q-BBlt-TGFpi (SEQ ID NO: 445) variante modificada, y la proteína MM0021W-Q-BBIt-TGFpi (SEQ ID NO:447) variante, modificada correspondientes (designadas Q en la Figura 14) medidas después del crecimiento, después de la activación con 2-mercaptoetanol y después del tratamiento ácido/térmico. Los datos muestran que la combinación de aminoácidos 13I-29P-40A-50T-52A cuando están presentes en el núcleo molecular de BBIt que tiene péptidos de unión a FGF-5 o TGFpi mejora la actividad inhibitoria de tripsina después del crecimiento y activación, y el rendimiento de producción después del tratamiento ácido/térmico en comparación al núcleo molecular de BBI, de origen, correspondiente que tiene los péptidos de unión.

Los datos también evidencian que las sustituciones que se mostraron que mejoran la actividad inhibitoria de tripsina y/o el rendimiento de purificación de un BBI variante, modificado en el cual se ha reemplazado la asa de quimiotripsina con un péptido de unión a VEGF no son específicos a BBI-AV puesto que las mismas sustituciones mejoran la actividad inhibitoria de tripsina y/o el rendimiento de producción de los BBI en los cuales se reemplazó la asa de quimiotripsina por otros péptidos de unión, por ejemplo, péptidos de unión a FGF-5 y péptidos de unión a TGFpl.

Por lo tanto, las sustituciones de aminoácido hechas en el núcleo molecular de BBI que incrementan el rendimiento de producción y la actividad de tripsina del BBIt-AV se espera que sean en general aplicables a los núcleos moleculares de BBI que tienen otros péptidos de unión.

Ejemplo 14 Desempeño de Núcleos Moleculares de Inhibidor de Bowman Birk En este ejemplo, se probó la capacidad para predecir el efecto de las sustituciones de aminoácido en la actividad de tripsina y/o rendimiento de producción de un Inhibidor de Bowman Birk variante, por ejemplo BBIt-AV (SEQ ID NO: 187) al sustituir los aminoácidos que no están conservados a través de las secuencias inhibidoras de Bowman Birk de Dolichos biflorus (BBdb, Ace. No. AAK97765; SEQ ID NO:449) PSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCVCTFSIPAQCVCVDMK DFCYEPCK (SEQ ID NO:449), del inhibidor IV o D-II de proteasa de Glycine max (soya) (BBsb3( Acc. No. P01064; SEQ ID NO: 450) DDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCMCTRSQPGQCRCLDT NDFCYKPCKSRDD (SEQ ID NO: 450), y de Torresea (ñmburana) cearensis (BBtC, Acc . No. P83283; SEQ ID NO:451) SSK EACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACTHSIPAQCRCFDITDF CYKPCSG (SEQ ID NO:451), en el núcleo molecular de BBIt-AV.

Los Inhibidores de Bowman Birk variantes se generaron al reemplazar la segunda asa inhibitoria de proteasa del Inhibidor de Bowman Birk de Dolichos biflorus (BBdb, Acc. No. AAK97765; SEQ ID N0:449), la segunda asa inhibitoria de proteasa del Inhibidor de Bowman Birk del inhibidor IV o D-II de proteasa de Glycine max (soya) (BBsb3, Acc. No. P01064; SEQ ID NO: 450) y la segunda asa inhibitoria de proteasa del Inhibidor de Bowman Birk de Torresea (Amburana) cearensis (BBtc, Acc. No. P83283; SEQ ID NO: 451) con el péptido de unión a VEGF CK37281 (ACYNLYGWTC; SEQ ID NO: 9) para generar la correspondiente variante BBdb-AV (SEQ ID NO:452), BBsb3 -AV (SEQ ID NO:453), y BBtC-AV (SEQ ID NO: 454) .

Las secuencias se alinearon, como se muestra en la 15, y los aminoácidos en las posiciones equivalentes a las posiciones 11, 13, 18, 23, 25, 27, 35, 37, 52, 54 y 55 de la BBPI de SEQ ID NO: 187 (BBIt-AV) se identificaron como están conservadas a través de los cuatro inhibidores, y se eligieron para modificar el núcleo molecular de BBIt-AV.

Los genes sintéticos que codifican para BBdb-AV (SEQ ID NO: 455) y BBsb3-AV (SEQ ID NO: 456) se ligaron de p2JMagkl03-lnk2-BBIt-AV como fragmentos BarriHI/HindlII . Para clonar el gen de BBtc-AV, el gen se digirió con Bfrl, la saliente rellena con T4 ADN-polimerasa y dNTP, el ADN se purifica y luego se digiere con BamHI . Este fragmento se ligó con el vector p2JMagkl03-lnk2-BBIt-AV que se ha digerido con Hindlll , la saliente rellena con T4 ADN-polimerasa y dNTP, el ADN se purificó, y luego se digirió con Ba UI . Las secuencias de ADN y las correspondientes secuencias de aminoácidos de los PI variantes son como sigue.

BBdb-AV GGATCCTTCTGAGAGCTCTAAACCATGCTGTGATCAATGCGCTTGTACAAAATCT ATCCCTCCACAATGCCGTTGCACTGATGTTCGTCTTAACTCATGTCACTCTGCAT GCAGCTCATGCGCTTGTTACAACCTTTACGGTTGGACATGCGTTTGCGTCGACA TGAAAGATTTCTGCTACGAACCTTGTAAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 455) BBdb-AV (SEQ ID NO: 452) DPSESSKPCCDQCACTKSIPPQCRCTDVRLNSCHSACSSCACYNLYGWTCVCVD MKDFCYEPCK BBsb3-AV GGATCCAGATGACGAATACTCTAAACCTTGCTGTGATCTTTGCATGTGTACACGT TCTATGCCACCTCAATGCTCATGTGAAGACATCCGCCTTAACTCTTGCCACTCA GATTGCAAAAGCTGCGCTTGTTACAACCTTTACGGTTGGACATGCCGTTGTTTA GATACTAACGATTTCTGCTACAAACCTTGCAAATCTCGTGATGATTAAAAGCTT (SEQ ID NO:456) BBsb3-AV AA (SEQ ID NO:453) DPDDEYSKPCCDLCMCTRSMPPQCSCEDIRLNSCHSDCKSCACYNLYGWTCRCL DTNDFCYKPCKSRDD BBtC-AV GGATCCTTCTTCAAAATGGGAAGCTTGCTGTGATCGTTGCGCATGCACAAAATC TATCCCTCCACAATGCCACTGCGCTGATATCCGTCTTAACTCATGCCATTCTGCA TGCGAAAGCTGCGCTTGTTACAACCTTTACGGTTGGACATGCCGTTGCTTCGAT ATCACTGATTTCTGTTACAAACCTTGCTCTGGCTAAAAGCTTAAAAGGAGACCGT TAATCTAAAATCATTATTTGAGGCCCGAGCTTAAAGCTTAAG (SEQ ID NO:457) BBtC-AV AA (SEQ ID NO:454) DPSSKWEACCDRCACTKSIPPQCHCADIRLNSCHSACESCACYNLYGWTCRCFDI TDFCYKPCSG Los tres vectores de expresión que comprenden las secuencias inhibidoras variantes se usaron para transformar células hospedadoras BG6006 de B . subtilis .

Típicamente, las sustituciones en los extremos N-terminal y C-terminal, que están fuera del primer enlace de disulfuro (C8-C62) , tienen pequeños efectos en la actividad inhibitoria de tripsina y/o en el rendimiento de purificación. De esta manera, sólo se estudiaron las sustituciones de aminoácidos en las posiciones entre C8 y C62. Las sustituciones seleccionadas, objetivo en este estudio se muestran en la Figura 15 (en negritas y subrayadas) .

Las sustituciones individuales de aminoácido en las posiciones 11, 13, 18, 23, 25, 27, 35, 37, 50, 52, 54, 55, y 60 en BBIt-AV (SEQ ID NO: 187) se construyeron como se describe en los Ejemplos 8 y 10. Estas sustituciones se analizaron al examinar en placas de microtítulo con o sin agente reductor) como se describe en los Ejemplos 9 y 10. Los resultados se resumen en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6 Efecto de sustituciones individuales de aminoácido presentes en los núcleos moleculares de BBtc-AV, BBdb-AV y BBsb3-AV en la actividad de tripsina en el BBIt-AV variante, modificado Posición y anri-noácido Aminoácido presente en el núcleo molecular presente en el núcleo alternativo y actividad relativa de la molecular de BBIt-AV sustitución de aminoácido BBItC-AV SEQ ID BBIdb-AV (SEQ BBIsb-AV (SEQ NO: 454 ID NO: 452) ID NO: 453 Qll R (+/-) wt* L(/) ** Al3 wt Wt M (+) *** N18 1 (+++) K+++) M (+/-) R23 H (-) t S (---} S25 A ( + ) T (+/-) E (---) M27 1 (+/-) V (+/-) I (+/-) A35 Wt Wt D (+/-) K37 E (+/-) s (+/-) Wt E50 R (++ ) V ( + ) R (++) V52 F (+/-) wt L ( + ) 154 Wt M (-) T (_)**** T55 Wt K (-) N (+/-) E60 K (+/-) wt K (+/-) *wt indica que el aminoácido en esta posición es el mismo como en el núcleo molecular de BBIt-AV (SEQ ID NO : 187 ) ** (+/-) indica que la relación relativa de actividad de BBI:BCE en la presencia de agente reductor no es significativamente diferente que aquella de BBIt-AV. *** (+) indica que la relación relativa de actividad de BBI:BCE en la presencia de agente reductor es mayor que aquella de BBIt-AV; entre mayor es el número de "+", mayor es la diferencia. **** (_) indica que la relación relativa de actividad de BB I : B CE en la presencia de agente reductor es menor que aquella de BBIt-AV; entre mayor es el número de mayor es la diferencia.

Asumiendo que los efectos de las sus ituciones de aminoácido son aditivos, los datos proporcionados en la Tabla 6 predicen que la variante BBItc-AV se desempeñaría significativamente mejor que BBIt-AV, en tanto que BBIsb3-AV, se debe desempeñar significativamente peor que BBIt-AV. Además, se predice que BBIdb-AV se desempeñaría algo mejor que BBIt-AV en términos de activación con agente reductor .

Para probar estas predicciones, la actividad de tripsina y el rendimiento de producción de BBIdb- AV, BBIsb3-AV y BBItc-AV se probaron usando el examen de matraz agitado descrito en el Ejemplo 11 y en su actividad en comparación a aquella del BBIt-AV variante, no modificado.

Los datos mostrados en la Figura 16 muestran que, como se predice, BBItc-AV tiene la más alta actividad inhibitoria de tripsina después de la activación, y la actividad inhibitoria de BBIdb-AV fue también mayor que aquella del inhibidor BBIt-AV pero menos que aquella del inhibidor BBItc-AV. Además, como se predice, BBIsb3-AV tiene muy baja actividad inhibitoria de tripsina y no se activa con el agente reductor (la actividad inhibitoria también fue pequeña para ser mostrada en la Figura 16) . Además, no sólo BBItc-AV y BBIdb-AV tienen mayores actividades inhibitorias después de la activación que BBIt-AV, también tienen mayores actividades inhibitorias después del tratamiento ácido/térmico que indica rendimientos mejorados de producción.

Por lo tanto, los resultandos indican que los datos de actividad obtenidos cuando se prueban sustituciones individuales de aminoácido en BBIt-AV se pueden usar para predecir el desempeño de otros inhibidores de Bowman Birk cundo se usan como núcleos moleculares con péptidos de unión que reemplazan la segunda asa inhibitoria de proteasa.

Ejemplo 15 Unión de BBI Variantes, Modificados a Proteínas Obj etico En este ejemplo, se probó la capacidad de péptidos variantes para retener su capacidad para unirse a las correspondientes proteínas objetivo cuando los péptidos variantes se injertaron en un núcleo molecular de Inhibidor de Bowman Birk modificado para reemplazar la asa de quimiotrips ina .

La construcción del vector de expresión para BBI se describe en el Ejemplo 1 y las construcciones de vectores para los BBI variantes que contienen el péptido de unión a VEGF CK37281 (SEQ ID NO : 9 ) , el péptido de unión a FGF-5- MM007 (SEQ ID NO : 430 ) o el péptido de unión a FGF-5 FGF5ps2 (SEQ ID NO : 431 ) en lugar de la secuencia inhibitoria de quimiotrips ina se describen en el Ejemplo 13 anterior. El método para la construcción de vectores de expresión que codifican para los BBIt-AV variantes, modificados que tienen varias combinaciones de sustituciones de aminoácido se describen en el Ejemplo 12 y el método para construir los BBI de unión a FGF5 y TGFp se describe en el Ejemplo 13.

Los péptidos de unión a VEGF nombrados VegK (KYYLYWW; SEQ ID NO:458) , VegT (TLWKSYW ; SEQ ID NO:459) y VegKD (KYDLYW SEQ ID NO : 460) se introdujeron en la asa inhibitoria de quimiot r ips ina al ligar casetes de nucleótido en los sitios Sphl y Salí de p2 JM103 - Ink2 - 2BBIck81. Las secuencias de los oligonucleótidos usados para generar las variantes modificadas VEGK y VEGT BBPI se muestran a continuación .

VegK: CAAATCTTGCGCATGTAAATATTACCTTTACTGGTGGTGTTTTTGCG (SEQ ID NO: 461) y TCGACGCAAAAACACCACCAGTAAAGGTAATATTTACATGCGCAAGATTTGCATG (SEQ ID NO:462) BBIT-VEGK DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKYYLYWWCKCT DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 640) VegT: CAAATCTTGCGCGTGCACACTTTGGAAATCTTACTGGTGTTTTTGCG (SEQ ID NO:463) y TCGACGCAAAAACACCAGTAAGATTTCCAAAGTGTGCACGCGCAAGATTTGCAT G (SEQ ID NO:464) BBIt-VEGT DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACTLWKSY CKCTDITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 641) VegKD: CAAATCTTGCATCTGTAAATATGATCTTTACTGGTGGTGTTTTTGCG (SEQ ID NO: 465) y TCGACGCAAAAACACCACCAGTAAAGATCATATTTACAGATGCAAGATTTGCATG (SEQ ID NO:466) El péptido de unión a VEGF nombrado VegKD se introdujo en la variante BBI - Al 3 I - S 25 K- L29 P - V52K al ligar el gen sintético ( VegKD-Q) en los sitios BamRI y HindIII de p2 JMagkl 03 - Ink2 - 2BBIck81. La secuencia del gen sintético se muestra y el BBPI codificado se muestran a continuación.

VegKD-Q : GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAAAGATATGCGTCCTAATAGCTGTCATTCT GCATGCAAATCATGTATCTGCAAATATGACCTTTACTGGTGGTGTTTCTGCAAAG ACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 467) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKYDLYWWCKCT DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 642) Los péptidos de unión a VEGF VI (SKHSQIT; SEQ ID NO:468) , V2 (KTNPSGS; SEQ ID NO:469) , V3 (RPTGHSL; SEQ ID NO:470), V4 (KHSAKAE; SEQ ID NO : 471 ) , V5 (KPSSASS; SEQ ID NO:472) y V6 ( PVTKRVH ; SEQ ID NO:473), y los péptidos de unión a TNFa TI (RYWQDIP; SEQ ID NO:474), T2 (APEPILA; SEQ ID NO : 475 ) y T3 (DMI VSI; SEQ ID NO: 476) , se introdujeron en la asa inhibitoria de quimiotripsina de un BBIt modificado que contiene las sustituciones de aminoácido A13I-S25R-M27A-L29P-S31A-140A- F50K-V52T al ligar genes sintéticos en los sitios BamHI y HinlII de p2JMagkl03-Ink2-2BBIck81. Las secuencias de ADN de los genes sintéticos que codifican para los BBI modificados, resultantes se muestran a continuación.

BBIt -AV-VI : GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCAGCAAACACTCTCAAATTACTTGTAAATGCACAG ACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:477) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACSKHSQITCKCTDI TDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 491) BBH-AV-V2 : GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCAAAACAAACCCAAGCGGTTCTTGTAAATGCACA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 478) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKTNPSGSCKCT DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 632) BBIt-AV-V3 : GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCAGACCAACTGGTCACAGCCTTTGTAAATGCACA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:479) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACRPTGHSLCKCT DITDFCYEPC PSE (SEQ ID NO:633) BBH-AV-V4 : GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCAAACACAGCGCTAAAGCAGAATGTAAATGCACA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:480) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKHSAKAECKCT DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:634) BBIt-AV-V5: GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCAAACCAAGCTCTGCTTCATCTTGTAAATGCACAG ACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:481) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACKPSSASSCKCTD ITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:635) BBH-AV-V6 : GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCCCAGTTACTAAAAGAGTACACTGTAAATGCACA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:482) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACPVT RVHCKCT DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:636) BBIt-TNF-TI: GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCAGATACTGGCAAGATATTCCATGTAAATGCACA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ DINO:483) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACRYWQDIPCKCT DITDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:637) BBIt-TNF-T2 : GGATCCAGACGATGAGAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAAA ATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTCT GCATGCAAATCATGTGCTTGCGCACCAGAACCTATTCTTGCTTGTAAATGCACA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO:484) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACAPEPILACKCTDI TDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO:638) BBIt -TNF-T3 : GGATCCAGACGATGAGaAGCTCTAAACCTTGTTGCGATCAATGCATCTGTACAA AATCAAACCCTCCACAATGTCGTTGTAGAGATGCTCGTCCTAATGCATGTCATTC TGCATGCAAATCATGTGCTTGCGATATGATTATGGTTAGCATCTGTAAATGCACA GACATCACTGACTTCTGCTATGAACCATGTAAACCTTCTGAATAAAAGCTT (SEQ ID NO: 85) DPDDESSKPCCDQCICTKSNPPQCRCRDARPNACHSACKSCACDMIMVSICKCTDI TDFCYEPCKPSE (SEQ ID NO: 639) Los vectores resultantes se usaron para transformar células hospedadoras BG6006 de B. subtilis. Los cultivos se cultivaron en 500 mi del medio MBD y las especies de BBI se purificaron esencialmente como se describe anteriormente y por Vogtentanz et al., 2007 (Protein Expr Purif 55:40-52

[2007] ) . Se realizaron los ensayos de unión de BioVeris esencialmente como se resume en el Ejemplo 5 y por el fabricante. La unión de la BBI variantes, modificados a sus respectivas proteínas objetivo se midió usando un ensayo de unión BioVerisMR, que es un ensayo de competición que determina la unión de los BBI variantes, modificados a su proteína objetivo (por ejemplo VEGF, FGF5 , TGFp y TNF ) en la presencia o ausencia de un competidor marcado. El competidor puede ser un anticuerpo monoclonal marcado formulado contra la proteína objetivo o un receptor nativo marcado de la proteína objetivo. Los ensayos de unión, electroquimioluminiscentes , se realizaron esencialmente como se describe en el Ejemplo 5. Las IC50 aparente se determinaron de los datos de unión al determinar la concentración de la especie de BBI necesaria para reducir la señal de BioVeris a la mitad. Los núcleos moleculares de BBI sin el péptido de unión, objetivo, en la asa inhibitoria de quimiotripsina se usaron como controles negativos .

Tabla 7 Actividad de unión de inhibidores de Bowman Birk variantes, modificados, en los cuales se reemplazó la asa de quimiotripsina por péptido variante de unión a VEGF- , FGF-5-TGF - o TNFot Proteína Nombre de Secuencia Núcleo Inhibidor Unión obj etivo péptido de péptido inhibidor de de Bowman BioVeris* variante* variante* Bowman Birk Birk variante , modificado , resultante VEGF CK37281 YNLYGWT BBIt BBIt-AV de +++ (SEQ ID SEQ ID NO: NO: 9) 187 VEGF CK37281 YNLYGWT BBIt-A13I- BBIt-AV de +++ (SEQ ID A40K-F50T-V52A SEQ ID NO: NO: 9) 602 VEGF CK37281 YNLYGWT BBIt-A13I- BBIt-AV de +++ (SEQ ID L29P-A40K- SEQ ID NO: NO: 9) F50T-V52A 601 VEGF CK37281 YNLYGWT BBIt-A13I-S25R- BBIt-AV de + ++ (SEQ ID M27A-L29P-S31A- SEQ ID NO: NO: 9) A40 -F50 -V52T 627 ( T8) Proteína Nombre de Secuencia Núcleo Inhibidor Unión obj etivo péptido de péptido inhibidor de de Bowman BioVeris* variante- variante* Bowman Birk. Birk variante , modificado, resultante VEGF CK37281 YNLYGWT BBIt-A13I-S25K- BBIt-AV de +++ (SEQ ID M27A-L29R-S31E- SEQ ID NO: NO: 9) A40K-F50Q-V52Q 628 (QQ8) VEGF CK37281 YNLYGWT BBIt-A13I-S25K- BBIt-AV de +++ (SEQ ID M27A-L29R-S31A- SEQ ID NO: NO: 9) A40H-F50R-V52L 630 (LR8) VEGF CK37281 YNLYGWT BBdb BBdb-AV de +++ (SEQ ID SEQ ID NO: NO: 9) 452 VEGF CK37281 YNLYGWT BBtC BBtC-AV de +++ (SEQ ID SEQ ID NO: NO: 9) 454 VEGF VegK KYYLYWW BBIt BBIt-AV de +++ (SEQ ID SEQ ID NO: NO: 458) 640 VEGF Veg T TLW SYW BBIt BBIt-AV de +++ (SEQ ID SEQ ID NO: NO: 459) 641 VEGF Veg KD KYDLYWW BBIt BBIt-AV de +++ (SEQ ID SEQ ID NO: NO: 460) 642 Proteína Nombre de Secuencia Núcleo Inhibidor Unión obj etivo péptido de péptido inhibidor de de Bowman BioVeris* variante- variante* Bowman Birk Birk variante , modificado, resultante VEGF Veg KD KYDLYWW BBIt-A13I- BBIt-AV de +++ (SEQ ID S25K-L29P-V52K SEQ ID NO: NO: 460) 643 VEGF VI SKHSQIT BBIt-A13I- BBIt-AV-Vl ++ (SEQ ID S25R-M27A- de SEQ ID NO: 4S8) L29P-S31A- NO: 491 F50K-V52T VEGF V2 KTNPSGS BBIt-A13I- BBIt-AV-V2 + ++ (SEQ ID S25R-M27A- de SEQ ID NO: 469) L29P-S31A- NO: 632 F50K-V52T VEGF V3 RPTGHSL BBIt-A13I- BBIt-AV-V3 ++ (SEQ ID S25R-M27A- de SEQ ID NO: 470) L29P-S31A- NO: 633 F50K-V52T VEGF V4 HSAKAE BBIt-A13I- BBIt-AV-V4 +++ (SEQ ID S25R-M27A- de SEQ ID NO: 471) L29P-S31A- NO: 634 F50 -V52T VEGF V5 KPSSASS BBIt-A13I- BBIt-AV-V5 ++ (SEQ ID S25R-M27A- de SEQ ID NO: 472) L29P-S31A- NO: 635 I40A-F50K-V52T Proteína Nombre de Secuencia Núcleo Inhibidor Unión obj etivo pép ido de péptido inhibidor de de Bowman BioVeris* variante* variante* Bowman Birk Birk variante , modificado, resultante VEGF VS PVT RVH BBIt-A13I- BBIt-AV-V6 + ++ (SEQ ID S25R-M27A- de SEQ ID NO: 473) L29P-S31A- NO: 636 F50 -V52T VEGF Control ALSYAQ BBI SBBI - negativo (SEQ ID SEQ ID NO: NO: 675) 13 tipo silvestre para unión VEGF FGF-5 MM007 RTQPYPL BBIt-A13I- MM007-Q- ++ (SEQ ID L29P-F50T-V52A BBIt- FGF-5 NO: 670) de SEQ ID NO: 432 FGF-5 FGFps2 TWIDSTP BBIt-A13I- FGFps2-Q- ++ (SEQ ID L29P-F50T-V52A BBIt-FGF-5 NO: 671) de SEQ ID NO: 434 Proteína Nombre de Secuencia Núcleo Inhibidor Unión obj etivo péptido de péptido inhibidor de de Bowman BioVeris* variante* variante Bowman Birk Birk variante, modificado, resultante FGF-5 Control ALSYPAQ BBI sBBI negativo (SEQ ID SEQ ID NO: tipo NO: 675) 13 silvestre para unión FGF-5 TGFpl PEN3 PENINVLP BBIt-A40L-F50N PEN3-Q- ++ (SEQ ID BBIt-TGF- NO: 672) A40L-F50N (SEQ ID NO: 677) TGFpi PEN3 PENINVLP BBIt-A13I- PEN3-Q- ++ (SEQ ID L29P-F50T-V52A BBIt-TGF NO: 672) (SEQ ID NO: 443) TGF l MM021W KHNVDWL BBIt-A13I- M021W-Q- ++ (SEQ ID L29P-F50T-VS2A BBIt-TGF NO: 673) (SEQ ID NO: 445) TGFPl WTQ WTQHIHN BBIt-A13I- WTQ-BBIt-Q- ++ (SEQ ID L29P-F50T-V52A TGF (SEQ ID NO: 674) NO: 447) Proteína Nombre de Secuencia Núcleo Inhibidor Unión obj etivo péptido de péptido inhibidor de de Bowman BioVeris* variante* variante Bowman Birk Birk variante, modificado, resultante TGFpl Control TWIDSTP BBIt-A13I- FGFps2-Q- - negativo (SEQ ID L29P-F50T-V52A BBIt-FGF-5 NO: 671) de FGFps2 de SEQ ID NO: 434 para unión TNFa TI · RYWQDIP BBIt-A13I- BBIt-TNF-Tl ++ (SEQ ID S25R-M27A- SEQ ID NO: NO: 474) L29P-S31A- 637 F50K-V52T TNF T2 APEPILA BBIt-A13I- BBIt-TNF-T2 + (SEQ ID S25R-M27A- SEQ ID NO: NO: 475) L29P-S31A- 638 F50K-V52T TNFa T3 DMIMVSI BBIt-A13I- BBIt-TNF-T3 + (SEQ ID S25R- 27A- SEQ ID NO: NO: 476) L29P-S31A- 639 F50K-V52T TNFa Control S HSQIT BBIt-A13I- BBIt-AV de - negativo (SEQ ID S25R-M27A- SEQ ID NO: NO: 468) L29P-S31A- 491 para VI F50T-V52T para unión a TNFa •Péptido de unión usado para reemplazar la asa de quimiotripsina núcleo molecular de BBIt.

ASecuencia de aminoácidos del péptido de unión que reemplaza los aminoácidos 42-48 del BBIt de SEQ ID NO: 187. *(+++) indica un valor de IC50 de aproximadamente 2 - 10 µ?; (++) indica un valor de IC50 de aproximadamente 10 - 50 µ?; (+) indica un valor de IC50 de aproximadamente 50 - 250 µ?; y (-) indica un valor de IC50 mayor de aproximadamente 250 µ? Estos datos muestran que las BBPI vairiantes, modificadas en las cuales se reemplaza la asa de quimiotripsina por diferentes péptidos de unión a VEGF, y que comprende además al menos una sustitución de aminoácido en la estructura fundamental del núcleo molecular, se une de manera específica a su proteína objetivo, es decir VEGF. De manera similar, las BBPI, variantes, modificadas en las cuales se reemplaza la asa de quimiotripsina por otros péptidos variantes, por ejemplo, FGF-5, TGF y TNF , también se une de manera específica a sus correspondientes proteínas objetivo es decir FGF, TGF y TNF. Además, otros núcleos moleculares de BBPI es decir BBtc, BBsb3 y BBdb en las cuales se ha remplazado la asa de quimiotripsina por un péptido variante por ejemplo péptido variante de VEGF, también son capaces de unirse específicamente a la proteína objetivo de VEGF.

En conclusión, estos datos muestran que los núcleos moleculares de BBPI variantes, modificadas que comprenden al menos una sustitución de aminoácido y que tienen diferentes péptidos variantes en lugar de la asa de quimiotripsina retiene la capacidad para unirse a la proteína objetivo que se une por el péptido de unión libre (no injertado) . De esta manera, los datos indican que diferentes secuencias de péptido de unión que se mostraron anteriormente que se unen a su correspondiente proteína objetivo se pueden usar para reemplazar el asa inhibitoria de quimiotripsina de una proteína de BBI modificada y que se espera que se unan a la proteína objetivo cognada.

Ejemplo 16 Identificación de Epitopos de Células T de péptidos con wt BBI El ensayo i-muneMR se realizó para la identificación de epitopos · de células T de péptido en BBI tipo silvestre usando células T humanas sin tratamiento previo, como se describe en WO9953038A2 y Stickler et al, 2000 (J. Immunotherapy, 23(6), 654-660,

[2000]). Los péptidos para el uso del ensayo se prepararon en base a la secuencia de aminoácidos de BBI tipo silvestre DDESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCICALSYPAQCFCVDIT DFCYEPCKPSEDDKEN (SEQ ID NO: 13) . De la secuencia de aminoácidos de longitud complete de BBI, se prepararon de manera sintética péptidos 15mer por Mimotopes US West (San Diego, CA) . Cada secuencia de péptido 15mer se diseñó para traslaparse con los 15mer previos y subsiguientes, excepto por tres residuos. Los 20 péptidos usados para examinar los epítopos de células T, que corresponden a la secuencia de BBI tipo silvestre, fueron: Pl DDESSKPCCDQCACT (Pl; SEQ ID : NO: 649) P2 SSKPCCDQCACTKSN (P2; SEQ ID : NO: 650) P3 PCCDQCACTKSNPPQ (P3; SEQ ID NO: 651) P4 DQCACTKSNPPQCRC (P4; SEQ ID NO: 652) P5 ACTKSNPPQCRCSDM (P5; SEQ ID NO: 653) P6 KSNPPQCRCSDMRLN (P6; SEQ ID NO: 654) P7 PPQCRCSDMRLNSCH (P7; SEQ ID NO: 655) P8 CRCSD RLNSCHSAC (P8; SEQ ID NO: 656) P9 SD RLNSCHSACKSC (P9; SEQ ID NO: 657) PIO RLNSCHSACKSCICA (PIO; SEQ ID NO: 658) Pll SCHSACKSCICALSY (Pll; SEQ ID NO: 659) P12 SACKSCICALSYPAQ (P12; SEQ ID NO: 660) P13 KSCICALSYPAQCFC (P13; SEQ ID NO: : 661) P14 ICALSYPAQCFCVDI (P14; SEQ ID NO: : 662) P15 LSYPAQCFCVDITDF (P15; SEQ ID NO: ; 663) P16 PAQCFCVDITDFCYE (P16; SEQ ID NO: : 664) P17 CFCVDITDFCYEPCK (P17; SEQ ID NO: : 665) P18 VDITDFCYEPCKPSE (P18; SEQ ID NO: : 666) P19 TDFCYEPCKPSEDDK (P19; SEQ ID NO: : 667) P20 FCYEPCKPSEDDKEN (20; SEQ ID NO: 668) Brevemente, se co-cultivaron células T CD4+ humanas 557 con células dendríticas y el péptido para el conjunto intacto de péptidos, usando los péptidos mostrados enla Figura Y. Se promediaron las respuestas a citocinas dentro de cada experimento como se describe en Strickler et al, 2000 y se tabuló una respuesta a un péptido como postiva si el índice de estimulación (SI) fue mayor de 2.95 (Figura 18A) . Los valores de SI para cada donador se compilaron para cada cojunto de péptidos y en la Figura 18B se muestra el por ciento de donadores sensibles a cada péptido. El por ciento de respuesta de fondo, 2.89 %, se determinó como el por ciento promedio de respondedores sobre todos los péptidos en el conjunto. La desviación estándar para este conjunto de datos fue de 2.21 . Se definen epitopos principales como que tienen un porcetaje de respuesta que es 3 veces o más el del fondo. En base a los datos mostrados en las Figuras 18A y 18B, ninguna de las respuestas de péptidos se basó significativamente en el método estadístico para una población no expuesta de donadores con una baja proporción de respuesta de fondo.

Por lo tanto, estos datos indican que la moléculas de BBI tipo silvestre se pude considerar que tenga bajo potencial inmunogénico en humanos.

Ejemplo 17 Composiciones de Cuidado Personal En este ejemplo, se proporcionan a continuación varias composiciones de cuidado personal que comprenden cualquiera de los compuestos de BBPI variantes, modificadas de la presente invención. En estas formulaciones, las cantidades se dan como porcentajes de la composición total, a menos que se indique de otro modo. También, a menos que se indique de otro modo en las siguientes formulaciones, la concentración de BBI-AV (referido como "compuesto" más adelante) varía de aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 1.0 %. En algunas formulaciones, la concentración preferida es en el intervalo de aproximadamente 0.1 % a 0.2 %, en tanto que en otras formulaciones, la concentración preferida está en el intervalo de aproximadamente 0.05 % a aproximadamente 0.1 % (por ejemplo, para algunas modalidades de inhibición de crecimiento del pelo) ; de aproximadamente 0.02 a 0.1 % por ciento (por ejemplo, para algunas modalidades de aclaramiento de la piel) ; de aproximadamente 0.5 % a aproximadamente 1.0 % (por ejemplo, para algunas modalidades de aclaramiento de la piel) ; o a concentraciones mayores de aproximadamente 0.1 % (por ejemplo, para algunas modalidades el tratamiento de rosácea) . Los expertos en la técnica conocen como determinar la concentración adecuada (es decir, óptima), de BBI-AV para cada producto. En algunas de las composiciones proporcionadas más adelante, la cantidad del "Compuesto" que se indica como "SA" . Esto indica que el formulador debe usar la concentración apropiada de BBI-AV como se indica anteriormente en la presente, o como sea apropiado para formulación específica.

Lavado corporal humectante (pH 7) Lavado Corporal Materia Prima pH 8 pH S .5 pH 7 (Designación INCI) Cantidad Cantidad Cantidad Agua desionizada CS CS CS Laureth-sulfato de sodio 12 15 8 Cocamidopropi1-Betaína 8 10 15 Decil-glucósido 0 2 1 Policuaternio-10 0.25 0 0 Policuaternio-7 0 0 0.7 Conservador, fragancia, color CS CS CS Compuesto 250ppm 500ppm lOOOpm Loción Corporal pH 7 pH 7 pH 7.5 pH 7.5 Materia Prima Cantidad Cantidad Cantidad Cantidad (Designación INCI) Agua desionizada CS CS CS CS Glicerina 8 8 0 12 Isohexadecano 3 3 3 6 Niacinamida 0 3 5 6 Isoestearato de isopropilo 3 3 3 3 Poliacrilamida (y) 3 3 3 3 Isoparafina (y) Laureth-7 4 4 4 2 Petrolato Nylon 12 2 2 2.5 2.5 Dimeticona 2 2 2.5 2.5 Sacarosa-poliaceite de 1.5 1.5 1.5 1.5 algodón Alcohol estearílico 97 % 1 1 1 1 D. Pantenol 1 1 1 1 Acetato de DL-alfa tocoferol 1 1 1 1 Alcohol cetilico 95 % 0.5 0.5 0.5 1 Alcohol behenllico 1 1 1 0.5 Alcohol cetearilico (y) 0.4 0.4 0.5 0.5 Cetearil-glucósido Ácido 0.15 0.15 0.15 0.15 esteárico PEG- 100-estearato 0.15 0.15 0.15 0.15 Conservador, fragancia, CS CS CS CS color Compuestos 250ppm 500ppm 750ppm lOOOppm Emulsión Ultrahumectante pH7 pH7 Materia Prima Cantidad Cantidad (Designación INCI) Agua desionizada CS CS Glicerina 12 5 PEG 400 0 10 Niacinamida 5 7 Isohexadecano 5 5 Dimeticona 3 2 Poliacrilamida (y) Isoparadina 3 3 (y) Laureth-7 Isoestearato de isopropilo 2 2 Polime ilsilsesquioxano 2 2 Alcohol cetílico 95 % 1 1 Sacarosa-poliaceite de algodón 1 1 D-Pantenol 1 1 Alcohol estearílico 95 % 0.5 0.5 Cetearil-glucósido 0.5 0.5 Dióxido de titanio 0.3 0.3 Ácido esteárico 0.15 0.15 PEG-100-Estearato 0.15 0.15 Conservador, fragancia, color CS CS Compuesto 250ppm lOOppm Crema Humectante pH 7 pH 7 pH 7.5 Materia Prima Cantidad Cantidad Cantidad (Designación INCI) Agua desionizada CS CS CS Glicerina 3 5 10 Petrolato 3 3 0 Alcohol cetílico 95 % 1.5 1.5 1 Copoliol de dimeticona 2 2 2 Palmitato de isopropilo 1 1 0.5 Carbopol 954 (Noveon) 0.7 0.7 0.7 Dimeticona (350cs) 1 1 1 Alcohol estearílico 97 % 0.5 0.5 1 Ácido esteárico 0.1 0.1 0.1 Peg-100-estearato 0.1 0.1 0.1 Dióxido de titanio 0.3 0.3 0.3 Conservador, color, CS CS CS fragancia Compuesto 50ppm 250ppm lOOOppm Emulsión Limpiadora Facial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 69.05 EDTA disódico 0.1 Gliceril polimetacrilato (y) Propilenglicol 1.0 Glicerina 2.0 Goma de xantano 0.5 Hidroxietil celulosa 0.5 Emulsión Limpiadora Facial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Neopentanoato de tridecilo 4.0 Estearato de isocetilo 6.0 Palmitato de octilo 8.0 Dilaurato de glicerilo 4.0 Estearato de PEG-20 2.0 Gliceril estearato (y) Laureth-23 2.0 Lauril pirrolidona 0.5 Extracto de manzanilla 0.2 Aloe vera (200x) 0.05 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Limpiador Facial Basado en Agente Tensioactivo Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 62.55 Copolímero de acrilatos/metacrilato de 3.3 Steareth-20 EDTA de disodio 0.05 Glicerina 2.0 Copolímero de Gliceril polimetacrilato (y) 0.5 propilenglicol (y) PVM/MA Laureth-sulfato de sodio (30 %) 17.5 Limpiador Facial Basado en Agente Tensioactivo Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Alcohol cetearílico 1.0 Mantequilla de karité 1.0 Oleamido PEG-2 sulfosuccinato de disodio 5.0 Cocoamidopropil-Betaína 3.0 Lauroil-sarcosinato de sodio 1.0 Cocoato de gliceril PEG-7 1.0 Oleato de isodecilo 1.5 Extracto de hierbabuena 0.25 Extracto de Eucalipto 0.25 Fragancia, conservador, color, ajuste de pH CS Compuesto SA Gel Exfoliante Facial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 64.39 EDTA disódico 0.05 Aloe vera (200x) 0.01 Benzofenona-4 0.25 Pro ilenglicol 1.0 Polímero entrelazado de acrilatos/C10-C30 20.0 alquil-acrilato (2 %) Gliceril polimetacrilato (y) propilenglicol 10.0 Polimetracrilato de glicerilo (y) 1.0 propilenglicol (y) copolímero de PVM/MA Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Aceite de jojoba hidrogenado 1.5 Fragancia, conservador, color, ajuste de pH CS Compuesto SA Tonificador Facial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 93.99 EDTA disódico 0.1 Butilenglicol 2.0 Aloe vera (200x) 0.1 Alantoína 0.1 Benzofenona-4 0.5 Extracto de ungüento medicinal 0.3 Propilenglicol (y) extracto de Euphrasia (y) 0.01 extracto de raíz de sello dorado (y) extracto de té verde Aceite de ricino hidrogenado PEG-40 0.5 Quaternio- 22 0.5 Aceite de sándalo 0.02 Fragancia, conservador, color, ajuste de pH CS Compuesto SA Crema Exfoliante Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 68.80 EDTA disódico 0.1 Polímero entrelazado de PVM/MA decadieno 1.0 Butilenglicol 3.0 Estearato de PEG-20 1.0 Gliceril estearato (y) Laureth-23 2.0 Diisopropil-adipato 2.0 Oleato de isodecilo 2.0 Estearato de isocetil estearoilo 5.0 Miristato de miristilo 1.0 Dilaurato de glicerilo 2.0 Hidróxido de sodio, 10 % 2.6 Gliceril polimetacrilato (y) propilenglicol 5.0 Gliceril polimetacrilato (y) propilenglicol 0.5 (y) copolímero de PVM/MA Aceite de jojoba hidrogenado 3.0 Fragancia, conservador, color, ajuste de pH CS Compuesto SA Mascara Facial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 75.4 EDTA disódico 0.1 Bentonita 12.5 Mascara Facial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) C12-13 Alquil fosfato de potasio 5.0 Propilenglicol 4.0 Fosfato de cloruro de PG-dimonio de coco de 1.0 sodio Fragancia, conservador, color, ajuste de pH CS Compuesto SA Bálsamo Después de Afeitar Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 82.12 EDTA disódico 0.1 Copolímero de acrilato 2.0 Copolimero de acrilato/Stareth-20 metacrilato 1.0 Propilenglicol 3.0 Hidróxido de sodio (10 %) 1.28 Gliceril estearato (y) alcohol cetílico (y) 3.5 alcohol estearilico (y) alcohol behenílico (y) ácido palmítico (y) ácido esteárico (y) cloruro de hidroxietil cetearamidopropildimonio Estearato de isocetilo 1.0 C12-15 alquil lactato 1.5 Estearato de octildodecilo 3.0 Bálsamo Después de Afeitar Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Gliceril polimetacrilato (y) propilenglicol 1.0 (y) copolímero de PVM/MA Policuaternio-11 0.5 Fragancia, conservador, color, ajuste de pH CS Compuesto SA Gel para Ojos Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 89.14 Copolimero de VP/acrilatos/lauril metacrilato 0.5 Glicerina 5.0 Aminometil propanol 0.3 Aloe vera (200x) 0.05 Benzofenona-4 0.1 Gliceril polimetacrilato (y) propilenglicol 0.2 (y) copolimero de PVM/MA Butilenglicol (y) Agua (y) extracto de 0.5 Hamamelis Butilenglicol (y) agua (y) extracto de pepino 0.3 Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 0.01 Copolímero de acrilatos (metacrilato de 2.4 Beheneth-25 Fragancia, conservador, color, ajuste de pH CS Compuesto SA Lápiz Labial de Alto Punto de Fusión Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Cera de ozocerita 5.0 Cera de candelilla 11.0 Octil dodecanol 26.0 C30-45 alquil-meticona 5.0 Ciclometicona 4.8 Petrolato 3.0 Aceite de lanolina 9.0 Aceite de aguacate 2.0 Alcohol oleílico 8.0 Pigmento/ciclometicona 25.0 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Lápiz Labial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Cera de candelilla 9.1 Miristato de isopropilo 9.6 Lanolino 5.0 Cera de abejas 4.0 Parafina (130/135) 2.0 Cera de ozocerita 2.5 Aceite de ricino 53.7 Aceite de carnauba 1.5 Pigmentos .. 7.5 Lápiz Labial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Aceite mineral 4.0 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Brillo Labial Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Bis-digliceril poliaciladipato- 1 43.5 Bis-digliceril poliaciladipato-2 10 Ricinoleato de glicerol 10 Poliisobuteno 1000 13 Cera de lanolina 10 Cera de candelilla 2.5 Mica (y) dióxido de titanio 3 d-Pantenol 5 Fragancia, conservador, color CS Compuesto SA Brillo Labial con Bloqueador de Sol Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Citrato de triisostearilo 58.4 Cera de candelilla 8.0 Lactato de miristilo 7.5 Cera microcristalina 5.0 Brillo Labial con Bloqueador de Sol Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Cera de carnauba 2.0 Dilinoleato regulador de diisopropilo 10.0 Mica (y) oxicloruro de bismuto (y) carmina 6.0 Óxido de zinc (microfina) 2.0 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Bálsamo para Labios Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Petrolato 47.3 Lanolato de isopropilo 6.0 Cera de ozocerita 16.5 Cera de candelilla 4.5 Dilinoleato de diisopropilo 25.0 Palmitato de retinilo 0.5 Acetato de tocoferol 0.2 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Mascara a Prueba de Agua Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 49.45 Propilenglicol 3.0 Trietanolamina (99 %) 3.1 Copolímero de acrilatos/octilacrilamina 5.0 Silicato de siloxi de diisostearoil 5.0 trimetilolpropano Cera de candelilla 4.5 Cera de abejas 5.5 Cera de ozocerita 2.0 Cera de carnauba 1.0 Alcohol cetílico 3.0 Ácido esteárico 5.0 Óxidos de hierro 11.0 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Mascara Anhidra a Prueba de Agua Materia Prima Cantidad (Designación INCI) C9-11 Isoparafina 30.95 Polietileno 11.0 Cera de candelilla 4.5 Lanolina hidroxilada 0.25 Rosinato de pentaeritritilo 2: 0 Estearato de zinc 1.0 Mascara Anhidra a Prueba de Agua Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Sililato de sílice 1.0 Destilados de petróleo (y) hectorita de 35.0 Quaternio (y) carbonato de propileno Óxidos de hierro 12.0 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Mascara a Base de Agua Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 43.32 Polivinilpirrolidona (K30) 2.0 Hidroxietil celulosa 1.0 Trietanolamina (99 %) 2.0 EDTA disódico 0.1 Óxidos de hierro 10.0 Ácido esteárico 4.5 Monoestearato de glicerilo 2.0 Cera de abejas 7.0 Cera de carnauba 4.5 Lanolina hidroxilada 1.0 Copolímero de acrilatos 20.0 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Delineador de Ojos Líquido Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua 50-70 Gelante 0.5-1.5 Agentes humectantes 1-3 Poliol 4-8 Colorantes 10-20 Alcohol 5-10 Formador de película 3-8 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Barniz para Uñas Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Solventes 40-70 Resinas 10-20 Plastificante 3-12 Gelante 0-2 Colorantes 0-3 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Tratamiento de Cutícula Polvo Polvo Base Rubor Sombra suelto prensado para ojos Agentes de Relleno 70-95 40-90 40-80 40-80 40-80 (por ejemplo, talco, mica, seracita) Formulaciones de Polvo Prensado Polvo Polvo Base Rubo Sombra suelto prensado para oj os Auxiliares de 0-2.5 3-5 2-5 2-7 2-10 compresión (por ejemplo, jabones metálicos, ceras) Mej oradores de 10-40 5-40 10-40 10-40 0-30 textura Colorantes (por 2-10 2-10 5-20 2-10 1-40 ejemplo, óxidos de hierro, colores orgánicos) Perlas (por ejemplo, 0-20 0-10 0-5 0-20 0-50 mica titanada, oxicloruro de bismuto) Aglutinante húmedo (por 0-3 2-5 2-5 3-10 3-15 ejemplo, estearato de octildodecil estearoilo, adipato de di-PPG3 miristil-éter, estearato de isocetilo, cetil- dimeticona) Formulaciones de Polvo Prensado Base de Agua en Aceite Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Ciclometicona 12.0 Dimeticona 5.0 Ciclometicona (y) copoliol de dimeticona 20.0 Laureth- 7 0.5 Colorantes (hidrofóbicamente tratados) 2.2 Dióxido de titanio (y) meticona 8.5 Talco (y) meticona 3.3 Agua 37.2 Cloruro de sodio 2.0 Propilenglicol 8.0 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Barra Anhidra de Maquillaje Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Cera de ozocerita 5.6 Polietileno 5.3 Dilaurato de glicerilo 5.5 Neopentanoato de isostearilo 13.0 Estearato de octildodecil-estearoilo 12.0 Miristato de. miristilo 11.0 Metoxicinamato de etilhexilo 7.5 Copolímero de PVP/eicoseno 0.5 Acetato de tocoferol 0.1 Dimeticona (y) trimetilsiloxisilicato 8.0 Ciclopentasiloxano 9.0 Mica 10.0 Talco 1.7 Dióxido de titanio (y) triisoestearato de 8.86 isopropil titanio Óxidos de hierro (y) triisoestearato de 1.94 isopropil titanio Fragancia, conservador es Compuesto SA Base de Agua en Silicón Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Copoliol de cetil diraeticona 0.45 Isoestearato de poliglicerol-4 (y) copoliol de 1.75 cetil dimeticona (y) hexil laurato Copolímero de polialquileno polisiloxano 0.9 Cetil dimeticona 0.9 Cera de abejas 0.7 Cera de ricino (y) aceite de ricino 0.35 hidrogenado Palmitato de octilo 7.0 Ciclometicona 7.95 Fenil trimeticona 2.2 Dióxido de titanio (y) caprilil silano 7.5 Óxidos de hierro (y) caprilil silano 1.1 Talco (y) caprilil silano 3.8 Ciclometicona 7.95 Dimeticona 1.3 Agua 49.55 Cloruro de sodio 0.5 Propilenglicol 5.3 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Base de Aceite en Agua Materia Prima [01] Cantidad (Designación INCI) Polivinilpirrolidona 59.85 Silicato de magnesio-aluminio 2.0 Goma de xantano 0.4 EDTA de trisodio 0.05 Gliceril polimetacrilato (y) 1.0 propilenglicol (y) copolimero de PVM/MA Polisorbato 20 1.0 Caolín 0.8 Butilenglicol 4.0 Dióxido de titanio 6.05 Óxidos de hierro 1.15 Dimeticona 6.0 Palmitato de etilexilo 2.0 Dimeticona de PEG/PPG-25/25 1.0 Acetato de tocoferol 0.1 Palmitato de retinilo 0.1 Sílice 3.0 Ciclopentasiloxano 5.0 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Fórmulas de Bloqueador Solar Materia Prima Cantidad (Designación IMCI) SPF -25 SPF -15 Agua 52.65 71.10 Polímero entrelazado de PVM/MA decadieno 0.5 0.5 Butilenglicol 3.0 3.0 EDTA disódico 0.1 0.1 Estearato de PEG-20 1.5 1.5 Gliceril estearato (y) Laureth-23 2.0 2.0 Neopentanoato de isostearilo 1.0 1.0 Palmitato de etilhexilo 2.0 2.0 Dilaurato de glicerilo 0.5 0.5 Octinoxato 7.5 7.5 Oxibenzona 2.0 2.0 Salicilato de etilhexilo 3.0 3.0 Hidróxido de sodio (10 %) 1.3 1.3 Gliceril polimetacrilato (y) 3.0 3.0 propilenglicol Gliceril polimetacrilato (y) 0.5 0.5 propilenglicol (y) copolímero de PVM/MA Copolímero de Estireno/acrilatos 18.45 (sólidos al 27 %) Fragancia, conservador CS CS Compuesto SA SA Fórmulas de Bloqueadores de Sol Muy Cantidad Resistentes a Agua Materia Prima (Designación INCI) SPF-12 SPF-22 Agua 65.16 46.53 Copolímero de acrilato 3.0 3.0 EDTA disódico 0.1 0.1 Butilenglicol 2.0 2.0 Gliceril polimetacrilato (y) propilenglicol 1.0 1.0 (y) copolímero de PVM/MA PVP butilado 0.05 0.05 Gliceril estearato (y) alcohol behenílico 4.5 4.5 (y) ácido palmítico (y) ácido esteárico (y) Lecitina (y) alcohol laurílico PVP de tricontanilo 1.0 1.0 Palmitato de octilo 2.0 2.0 Octinoxato 7.5 7.5 Oxibenzona 2.0 2.0 Salicilato de etilhexilo 3.0 3.0 Neopentanoato de tridecilo 3.0 3.0 Dilaurato de glicerilo 0.5 0.5 Hidróxido de sodio (10 %) 1.89 1.89 Ciclopentasiloxano 2.0 2.0 Butilenglicol 1.0 1.0 Copolímero de estireno/acrilato (sólidos al 18.45 27 %) Fragancia, conservador CS CS Compuesto SA SA Bloqueador de Sol de Agua en Silicón Cantidad Materia Prima (Designación INCI) Dimeticona de éter butílico de PEG/PPG- 2.0 15/15 cetilo Aceite mineral 3.0 Palmitato de etilhexilo 1.0 Salicilato de etilhexilo 5.0 Aceite de ricino hidrogenado 0.5 Cera de abejas 0.5 Octinoxato 7.5 Polietileno 1.0 Dipolihodrixiestearato de PEG-30 2.0 Ciclopentasiloxano 5.0 Dimeticona 5.0 Cloruro de sodio 0.6 Copolímero de acrilato/C12-22 0.5 alquimetacrilato Agua 66.4 Fragancia, conservador CS Compuesto SA Acondicionador de Pelo de Dejar Puesto Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua desionizada CS Metosulfato de behentrimonio (y) alcohol cetílico 4.0 Aceite de germen de trigo 1.0 Alcohol cetílico 0.5 Acondicionador/Tratamiento de Pelo Nutritivo (pH 6) Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Propilenglicol 5.0 Lanolina de PEG-60 1.0 Pantenol 2.0 Aminoácidos de lupina 1.0 Proteína de trigo, hidrolizada de cocodimonio 1.0 hidroxipropilo Fragancia, conservador, color CS Compuesto lOOOppm Champú Acondicionador Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua desionizada CS Laureth sulfato de sodio 30 % 27.0 Betaína de cocamidopropilo 3.7 Coco-glucósido (y) oletato de glicerilo 5.0 Coco-glucósido (y) diestearato de glicol (y) 3.0 glicerina Cloruro de hidroxipropil trimonio guar 0.1 Laureth-2 1.55 Fragancia, conservador, color CS Compuesto lOOOppm Champú An i-Caspa Materia Prima Cantidad (Designación INCI) Agua desionizada CS Silicato de magnesio-aluminio l .0 Hidroxipropil metilcelulosa 0.8 Sulfato de olefina de sodio al 40 % 35.0 DEA de lauramida 4.0 DEA de soyamida 1.0 Colágeno hidrolizado de Quaternio-70 2.0 Piritiona de zinc al 40 % 4.0 Fragancia, conservador, color CS Compuesto lOOOppm Champú Limpiador Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Texapon N 70 13.00 15.00 10.50 12.50 10.00 Dehiton PK 45 7.50 7.00 5.00 5.50 10.00 Cetiol HE 2.00 2.50 3.50 5.00 2.30 Fragancia 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 Compuesto SA SA SA SA SA D-Pantenol USP 1.00 1.50 1.80 1.70 1.40 Conservador 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 Ácido cítrico 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 Ultra cuidado de Luviquat 1.50 1.00 1.50 1.20 1.10 Champú Limpiador Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Cloruro de sodio 1.50 1.40 1.40 1.30 1.50 Agua CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Champú Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Texapon NSO 35.00 40.00 30.00 45.00 27.00 Plantacare 2000 5.00 5.50 4.90 3.50 7.00 Betaína L7 de tego 10.00 5.00 12.50 7.50 15.00 Fragancia 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 Compuesto SA SA SA SA SA D-Pantenol USP 0.50 1.00 0.80 1.50 0.50 Conservador 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 Ácido cítrico 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 Re opal LA 3 0.50 2.00 0.50 0.50 2.00 Cloruro de sodio 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 Agua CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Champú Acondicionador Formulaciones Limpiador (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Amfotensid GB 2009 10.00 15.00 20.00 12.00 17.00 Plantacare 2000 5.00 6.00 7.00 8.00 4.00 Betaína L7 de tego 15.00 12.00 10.00 18.00 20.00 Luviquat FC 550 0.30 0.20 0.20 0.20 0.30 Fragancia 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 Compuesto SA SA SA SA SA Cremofor 20 5.00 1.00 1.00 7.00 5.00 Conservador 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 Rewopal LA 3 2.00 1.00 0.50 2.00 2.00 Ácido cítrico 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 PEG 600 DS de Stepan 3.00 2.00 2.00 3.00 2.50 Agua CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Emulsión O/ de Espuma Formul ciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 (Designación INCI) Ácido esteárico 5.00 1.00 Alcohol cetílico 5.50 Alcohol cetilestearílico 2.00 Estearato de PEG-40 8.50 Estearato de PEG-20 1.00 caprilato/caprinato-Triglicérido 4.00 2.00 Emulsión O/W de Espuma Formulaciones (Cantidades ) Materia Prima 1 2 (Designación INCI) Benzoato de alquilo de C12-15 10.00 15.00 Ciclometicona 4.00 Dimeticona 0.50 Compuesto SA SA Octilisoestearato 5.00 Miristato de miristilo 2.00 Ceresina 1.50 Glicerina 3.00 Filtro Fosfato de dist rke hidroxipropilo 1.00 3.50 BHT 0.02 EDTA disódico 0.50 0.10 Parfüm, onservierungsmittel CS CS Colorante CS CS Hidróxido de potasio CS CS Agua dem. CS (100) CS (100) pH pH ajustado ajustado a a 6.5-7.5 5.0-6.0 Emulsión 1 Emulsión 2 Gas (Stickstoff) Gas (Helio) Champú Acondicionador con Formulaciones Perlesencia (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 (Designación INCI) Policuaternio- 10 0.50 0.50 0.40 Lauretsulfato de sodio 9.00 8.50 8.90 Betaína de cocoamidopropilo 2.50 2.60 3.00 Benzofenona-4 1.50 0.50 1.00 Compuesto SA SA SA Compuesto perlesente 2.00 2.50 EDTA disódico 0.10 0.15 0.05 Conservador, perfume, espesante CS CS CS Agua dem. CS(IOO) CS (100) CS (100) pH ajustado de pH ajustado de Champú Acondicionador Limpiador Formulaciones con Efecto de Volumen (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 (Designación INCI) Lauretsulf to de sodio 10.00 10.50 11.00 Etilhexil metoxicinamato 2.00 1.50 2.30 Compuesto SA SA SA Betaína de cocoamidopropilo 2.50 2.60 2.20 EDTA disódico 0.01 0.10 0.01 Conservador, perfume, espesante CS CS CS Agua dem. CS (100) CS (100) CS (100) pH ajustado de pH ajustado de Champú Acondicionador Limpiador Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 Poliquarternium- 10 0.50 0.50 0.50 Lauretsulfato de sodio 9.00 8.50 9.50 Compuesto SA SA SA Benzofenona-3 1.00 1.50 0.50 Ácido imidosuccínico, Na 0.20 0.20 0.80 Conservador, perfume, espesante CS CS CS Agua dem. CS (100) CS (100) CS (100) pH ajustado de pH ajustado de Crema en Gel Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Polímero entrelazado de 0.40 0.35 0.40 0.35 acrilato/C10-C30 alquil acrilato Ácido poliacrílico 0.20 0.22 0.20 0.22 Goma de xantano 0.10 0.13 0.10 0.13 Alcohol cetearílico 3.00 2.50 3.00 2.50 Benzoato de alquilo de C12-15 4.00 4.50 4.00 4.50 Triglicérido caprílico/cáprico 3.00 3.50 3.00 3.50 Aminobenzofenona (por ejemplo, 2.00 1.50 0.75 1.00 UVINUL A PLUSMR) UVASorb K2A 3.00 Metoxicinamato de etilhexilo 3.00 1.00 Metoxifenil triazina de Bis- 1.50 2.00 etilhexiloxifenol Metoxidibenzoilmetano de butilo 2.00 Tetrasulfonato de fenil 2.50 0.50 2.00 dibencimidazol de disodio Triazon de etilhexilo 4.00 3.00 4.00 octocrileno 1.00 2.00 Sulfonato de fenilbencimidazol 0.50 3.00 Tetrametilbutilfenol de metilen 2.00 0.50 1.50 Bis-benzotriazolilo Salicilato de etilhexilo 3.00 Trisiloxano drometrizol 0.50 Sulfonato de teraftaliden 1.50 1.00 dicanfor Crema en Gel Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Dietilhexil-2 , 6-naftalato 3.50 4.00 7.00 9.00 Dióxido de titanio-raicrofino 1.00 3.00 Óxido de zinc-microfino 0.25 Compuesto SA SA SA SA Dimetilpolisiloxano de ciclisches 5.00 5.50 5.00 5.50 Polidimetilsiloxano de dimeticona 1.00 0.60 1.00 0.60 Glicerina 1.00 1.20 1.00 1.20 Hidróxido de sodio CS CS CS CS Conservador 0.30 0.23 0.30 0.23 Perfume 0.20 0.20 Agua CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) pH ajustado a 6.0 Formulación de Formulaciones Bloqueador de Sol O/W (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Monoestearato de 0.50 1.00 3.00 1.50 glicerina SE Citrato de estearato de 2.00 1.00 2.00 4.00 glicerilo Ácido esteárico 3.00 2.00 Estearato de PEG-40 0.50 2.00 Fosfato de cetilo 1.00 Formulación de Formulaciones Bloqueador de Sol O/W (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Sulfato de cetearilo 0.75 Alcohol estearílico 3.00 2.00 0.60 Alcohol cetílico 2.50 1.10 1.50 0.60 2.00 Compuesto SA SA SA SA SA SA SA Airdncfoejizofenona (por 2.00 1.50 0.75 1.00 2.10 4.50 5.00 ejemplo, UVINUL A PLUS11*) UVASorb K2A Metoxicinamato de 5.00 6.00 8.00 etilhexilo Metoxifenil triazin de 1.50 2.00 2.50 2.50 Bis-etilhexiloxifenol Metoxidibenzoilmetano de 2.00 2.00 1.50 butilo Fenil dibencimidazol 2.50 0.50 2.00 0.30 disodio Tetrasulfonato Triazona de etilhexilo 4.00 3.00 4.00 2.00 Octocrileno 4.00 7.50 Triazon de dietihexil 1.00 2.00 1.00 1.00 butamido Sulfonato de 0.50 3.00 fenilbencimidazol Formulación de Formulaciones Bloqueador de Sol O/W (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Tetrametilbutilfenol de 2.00 0.50 1.50 2.50 metilen Bis-benzotriazolilo Salicilato de etilhexilo 3.00 5.00 Drometrizol Trisiloxan 0.50 1.00 Ácido sulfónico de 1.50 1.00 1.00 0.50 tereftaliden dicanfor Dietilhexil-2 , 6- 3.50 7.00 6.00 9.00 naftalato Dióxido de titanio- 1.00 3.00 3.50 1.50 microfino Óxido de zinc-microfino 0.25 2.00 Benzoato de alquilo de 0.25 4.00 7.00 C12-15 Éter diceprílico 3.50 2.00 Dicaprilato/dicaprato de 5.00 6.00 butilenglicol Cocoglicérido 6.00 2.00 Dimeticona 0.50 1.00 2.00 Ciclometicona 2.00 0.50 1.00 Mantequilla de karité 2.00 Copolímero de hexadeceno 0.20 0.50 1.00 de PVP Glicerina 3.00 7.50 7.50 5.00 2.50 Formulación de Formulaciones Bloqueador de Sol O/W (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Goma de xantano 0.15 0.05 0.30 Carbómero sódico 0.20 0.15 0.25 Acetato de vitamina E 0.60 0.23 0.70 1.00 Fucogel 1000 3.00 10.00 Glicina de soja 0.50 1.50 1.00 Etilhexiloxiglicina 0.30 Hidantoína de DMDM 0.60 0.40 0.20 Gliacil-L 0.18 0.20 Metilparabeno 0.15 0.25 0.50 Fenoxietanol 1.00 0.40 0.40 0.50 0.40 EDTA trisódico 0.02 0.05 Ácido iminosuccínico 0.25 1.00 Etanol 2.00 1.50 3.00 1.20 5.00 Perfume 0.10 0.25 0.30 0.40 0.20 Agua CS CS CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) Hidrodispersión Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Ceteaereth-20 1.00 0.50 Alcohol cetílico 1.00 Carbómero sódico 0.20 0.30 Hidrodispersión Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Polímero entrelazado de 0.50 0.40 0.10 0.50 acrilato/C10-C30 alquil-acrilato Goma de xantano 0.30 0.15 Compuesto SA SA SA SA SA Aminobenzofenona (por ejemplo, 2.00 1.50 0.75 1.00 2.10 UVINUL A PLUSMR) UVASorb K2A 3.50 Metoxicinamato de etilhexilo 5.00 Metoxifenil triazin de Bis- 1.50 2.00 2.50 etilhexilfenol Metoxidibenzoilmetaño-butilo 2.00 2.00 TetrasulEonato de fenil 2.50 0.50 2.00 dibencimidazol de disodio Triazon de etilhexilo 4.00 3.00 4.00 Octocrileno 4.00 Triazon dietilhexil butamido 1.00 2.00 1.00 Sulfonilo de fenilbencimidazol 0.50 3.0 Metilen de Bis-benzotriazolilo 2.00 0.50 1.50 2.50 Tetrametilbutilfenol Salicilato de etilhexilo 3.00 Drometrizol trisiloxano 0.50 Sulfonato de tereftalidin 1.50 1.00 1.00 dicanfor Dietilhexil-2 , 6-naftalato 7.00 9.00 Dióxido de titanio-microfino 1.00 3.00 3.50 Hidrodispersión Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 ¦ 5 Óxido de zinc-microfino 0.25 C12-15 alquil benzoato 2.00 2.50 Éter dicaprílico 4.00 Dicaprilato/dicaprato de 4.00 2.00 6.00 butilenglicol Carbonato de dicaprilo 2.00 6.00 Dimeticona 0.50 1.00 Feniltrime icona 2.00 0.50 Mantequilla de karité 2.00 5.00 Copolímero de hexadeceno de PVP 0.50 0.50 1.00 PVP de tricontanilo 0.50 1.00 ¦ Glicerina de etilhexilo 1.00 0.80 Glicerina 3.00 7.50 7.50 8.50 Glicina de soja 1.50 1.00 Acetato de vitamina E 0.50 0.25 1.00 Alfa-glucosilrutina 0.60 0.25 Fucogel 10O0 2.50 0.50 2.00 Hidantoína de DMDM 0.60 0.45 0.25 Gliacil-S 0.20 Metilparabeno 0.50 0.25 0.15 Fenoxie anol 0.50 0.40 1.00 EDTA trisódico 0.01 0.05 0.10 Etanol 3.00 2.00 1.50 7.00 Perfume 0.20 0.05 0.40 Hidrodispersión Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Agua es es es es es (100) (100) (100) (100) (100) Emulsión de Bloqueador de Sol W/O Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Copoliol de cetildimeticona 2.50 4.00 Poligliceril-2 - 5.00 4.50 dipolihidroxiestearato PEG- 30 -dipolihidroxiestearato 5.00 Compuesto SA SA SA SA SA Aminobenzofenona (por ejemplo, 2.00 1.50 0.75 1.00 2.10 UVINUL A PLUSMR) UVASorb K2A 2.00 Metoxicinamato de etilhexilo 5.00 Triazin de Bis-etilhexiloxifenol 1.50 2.00 2.50 metoxifenilo Metoxidibenzoilmetano de butilo 2.00 2.00 Tetrasulfonato de fenil 2.50 0.50 2.00 dibencimidazol de disodio Triazon de etilhexilo 4.00 3.00 4.00 Octocrileno 4.00 Triazon de dietilhexil butamido 1.00 2.00 1.00 Sulfonato de fenilbencimidazol 0.50 3.00 Emulsión de Bloqueador de Sol W/O Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Tetrametilbutilfenol de metilen 2.00 0.50 1.50 2.50 Bis-benzotriazolilo Salicilato de etilhexilo 3.00 Trisiloxano drometrizol 0.50 Sulfonato de teraftaliden 1.50 1.00 1.00 dicanfor Dietilhexil-2 , 6-naf alato 7.00 4.00 Dióxido de titanio-microfino 1.00 3.00 3.50 Óxido de zinc-microfino 0.25 Aceite mineral 12.00 10.00 8.00 C12-15 alquil benzoato 9.00 Éter dicaprílico 10.00 7.00 Dicaprilato/dicaprato de 2.00 8.00 4.00 butilenglicol Carbonato de dicaprililo 5.00 6.00 Dimeticona 4.00 1.00 5.00 Ciclometicona 2.00 2.50 2.00 Mantequilla de karité 3.00 Línea de base 4.50 Copolímero de hexadeceno de PVP 0.50 0.50 1.00 Glicerina de etilhexilo 0.30 1.00 0.50 Glicerina 3.00 7.50 7.50 8.50 Glicina de soja 1.00 1.50 1.00 MgS04 1.00 0.50 0.50 MgCl2 1.00 0.70 Emulsión de Bloqueador de Sol W/0 Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Acetato de vitamina E 0.50 0.25 1.00 Palmitato de ascorbilo 0.50 2.00 Fucogel 1000 3.50 1.00 Hidantoina DMDM 0.60 0.40 0.20 Metilparabeno 0.50 0.25 0.15 Fenoxietanol 0.50 0.40 1.00 EDTA de trisodio 0.12 0.05 0.30 Etanol 3.00 1.50 5.00 Perfume 0.20 0.40 0.35 Agua CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Barras Formulaciones (Cantidades ) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Triglicérido caprílico/cáprico 12.00 10.00 6.00 Octildodecanol 7.00 14.00 8.00 3.00 Dicaprilato/dicaprato de 12.00 butilenglicol Tetraisoestearato de 10.00 6.00 8.00 7.00 pentaeritritilo Diisoestearato de poligliceril-3 2.50 Poliaciladipato-2 de Bis- 9.00 a . oo 10.00 8.00 diglicerilo Alcohol cetearílico 8.00 11.00 9.00 7.00 Barras Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Miristato de miristilo 3.50 3.00 4.00 3.00 Cera de abejas 5.00 5.00 6.00 6.00 Cera de carnauba 1.50 2.00 2.00 1.50 Cera de alba 0.50 0.50 0.50 0.40 Estearato de alquilo de C16-40 1.50 1.50 1.50 Compuesto SA SA SA SA Aminobenzofenona (por ejemplo, 2.00 1.50 0.75 9.00 UVINUL A PLUSMR) UVASorb K2A 2.00 4.00 Metoxicinamato de etilhexilo 3.00 Metoxifenil triazina de Bis- 1.50 2.00 etilhexiloxifenol Metoxidibenzoilmetano de butilo 2.00 TetrasulEonato de fenil 2.50 0.50 2.00 dibencimidazol de disodio Triazon de etilhexilo 4.00 3.00 4.00 Octocrileno 4.00 Triazon de dietilhexil butamido 1.00 2.00 Sulfonato de fenilbencimidazol 0.50 3.00 Tetrametilbutilfenol de metilen 2.00 0.50 1.50 Bis-benzotriazolilo Salicilato de etilhexilo 3.00 Trisiloxano drometrizol 0.50 Sulfonato de teraftaliden 1.50 1.00 dicanfor Barras Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Dietilhexil-2 , 6-naftalato 7.00 Dióxido de titanio-microfina 1.00 3.00 Óxido de zinc-microfino 0.25 Acetato de vitamina E 0.50 1.00 Palmitato de ascorbilo 0.05 0.05 Buxux Chinensis 2.00 1.00 1.00 Perfume, BHT 0.10 0.25 0.35 Ricinus Communis CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) PIT-Emulsión Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 8 (Designación INCI) Glicerinmono- 0.50 2.00 3.00 5.00 0.50 4.00 estearato SE Isoestearato de 3.50 4.00 2.00 glicerilo Isoceteth- 20 0.50 2.00 Ceteareth-12 5.00 1.0 3.50 5.00 Ceteareth-20 5.00 1.00 3.50 Estearato de PEG- 2.80 2.30 3.30 100 Alcohol cetílico 5.20 1.20 1.00 1.30 0.50 0.30 PIT-Emulsión Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 8 (Designación INCI) Palmitato de 2.50 1.20 1.50 0.50 1.50 cetilo Copoliol de cetil 0.50 1.00 dimeticona Poligliceril-2 0.75 0.30 Compues o SA SA SA SA SA SA SA SA Aminobenzofenona 2.00 1.50 0.75 1.00 2.10 4.50 5.00 2.10 (por ejemplo, UVINUL A PLUSMR) UVASorb K2A 4.00 1.50 Metoxicinamato de 5.00 6.00 8.00 5.00 etilhexilo Triazin de 1.50 2.00 2.50 2.50 2.50 metoxifenil de Bis-etilhexiloxifenol Metoxidibenzoilme 2.00 2.00 1.50 2.00 taño de butilo Tetrasulfonato de 2.50 0.50 2.00 0.30 fenil dibencimidazol disodio PIT-Emulsión Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 • 5 6 7 8 (Designación INCI) Triazon de 4.00 3.00 4.00 2.00 etilhexilo Octocrileno 4.00 7.50 Triazon de 1.00 2.00 1.00 1.00 1.00 dietilhexil butamido Sulfonato de 0.50 3.00 fenilbencimidazol Tetrametilbutilfe 2.00 0.50 1.50 2.50 2.50 nol de metilen Bis-benzotriazolilo Salicilato de 3.00 5.00 etilhexilo Trisiloxan 0.50 1.00 drimetrizol Sulfonato de 1.50 1.00 1.00 0.50 1.00 tereptaliden dicanfor Dietilhexil-2 , 6- 7.00 10.0 7.50 8.00 naftalato Dióxido de 1.00 3.00 3.50 1.50 3.'50 titanio-microfino PIT-Emulsión Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 a (Designación INCI) Óxido de zinc- 0.25 2.00 microfino Benzoato de 3.50 6.35 0.10 alquilo de C12-15 Cocoglicérilo 3.00 3.00 1.00 Éter dicaprílico 4.50 Carbonato de 4.30 3.00 7.00 dicaprililo Adipato de 0.50 0.30 dibutilo Fenilt imeticona 2.00 3.50 2.00 Ciclometicona 3.00 Galaktomano de 0.50 2.00 etilo Coco-glicérilo de 3.00 4.00 hidrierte Cera Abil 2440 1.50 2.00 Copolimero de 1.00 1.20 hexadeceno de PVP Glicerina 4.00 S .00 5.00 8.00 10.00 Acetato de 0.20 0.30 0.40 0.30 vitamina E PIT-Emulsión Formulaciones (Cantidades ) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 8 (Designación INCI) Mantequilla de 2.00 3.60 2.00 karité Butilcarbamato de 0.12 0.20 yodopropilo Fucogel 1000 0.10 Hidantoína de 0.10 0.12 0.13 DMDM Metilparabeno 0.50 0.30 0.35 Fenoxietanol 0.50 0.40 1.00 Octoxiglicerina 0.30 1.00 0.35 Etanol 2.00 2.00 5.00 EDTA trisódico 0.40 0.15 0.20 Perfume 0.20 0.20 0.24 0.16 0.10 0.10 Agua CS CS CS CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) Crema en Gel Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Polímero entrelazado de 0.40 0.35 0.40 0.35 acrilato/C10-C30 alquil-acrilato Acido poliacrílico 0.20 0.22 0.20 0.22 Luvigel Em 1.50 2.50 2.80 3.50 Crema en Gel Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Goma de xantano 0.10 0.13 0.10 0.13 Alcohol cetearílico 3.00 2.50 3.00 2.50 Benzoato de alquilo de C12-15 4.00 4.50 4.00 4.50 Triglicérido caprílico/cáprico 3.00 3.50 3.00 3.50 Dióxido de titanio-microfino 1.00 1.50 Óxido de zinc-microfino 2.00 0.25 Compuesto SA SA SA SA Dihidroxiacetona 3.00 5.00 Dimetilpolisiloxan ciclisches 5.00 5.50 5.00 5.50 Polidimetilsiloxano de dimeticona 1.00 0.60 1.00 0.60 Glicerina 1.00 1.20 1.00 1.20 Hidróxido de sodio es CS CS CS Conservadores 0.30 0.23 0.30 0.23 Perfume 0.20 0.20 Agua es CS CS CS (100) (100) (100) (100) pH ajustado a 6.0 Formulaciones Auto Formulaciones Bronceadoras O/W (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Monoestearato de 0.50 1.00 3.00 1.50 glicerina SE Formulaciones Auto Formulaciones Bronceadoras O/W (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Citrato de estearato 2.00 1.00 2.00 4.00 de glicerilo Ácido esteárico 3.00 2.00 Estearato de PEG-40 0.50 2.00 Fosfato de cetilo 1.00 Sulfato de cetearilo 0.75 Alcohol estearilo 3.00 2.00 0.60 Alcohol cetílico 2.50 1.10 1.50 0.60 2.00 Compuesto SA SA SA SA SA SA SA Dihidroxi acetona 3.00 5.00 4 Dióxido de titanio- 1.00 1.50 1.50 microfino Óxido de zinc- 0.25 2.00 microfino Benzoato de "alquilo 0.25 4.00 7.00 de C12-15 Éter dicaprílico 3.50 2.00 Dicaprilato/dicaprato 5.00 6.00 de butilenglicol Cocoglicérido 6.00 2.00 Dimeticona 0.50 1.00 2.00 Mantequilla de karité 2.00 Copolimero de 0.20 0.50 1.00 hexadeceno de PVP Formulaciones Auto Formulaciones Bronceadoras 0/W (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Glicerina 3.00 7.50 7.50 5.00 2.50 Goma de xantano 0.15 0.05 0.30 Carbómero sódico 0.20 0.15 0.25 Acetato de vitamina E 0.60 0.23 0.70 1.00 Fucogel 1000 3.00 10.00 Glicina de soja 0.50 1.50 1.00 Glicina de 0.30 etilhexiloxi Hidantoína de DMDM 0.60 0.40 0.20 Gliacil-L 0.18 0.20 Me ilparabeno 0.15 0.25 0.50 Fenoxietanol 1.00 0.40 0.40 0.50 0.40 EDTA trisódico 0.02 0.05 Iminobernsteinato 0.25 1.00 Etanol 2.00 1.50 3.00 1.20 5.00 Perfume 0.10 0.25 0.30 0.40 0.20 Agua CS CS CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) Maquillaje de O/W Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Monoestearato de 0.50 1.00 3.00 1.50 glicerina SE Citrato de estearato de 2.00 1.00 2.00 4.00 glicerilo Ácido esteárico 3.00 2.00 Estearato de PEG-40 0.50 2.00 Fosfato de cetilo 1.00 Sulfato de cetearilo 0.75 Alcohol estearílico 3.00 2.00 0.60 Alcohol cetílico 2.50 1.10 1.50 0.60 2.00 Compuesto SA SA SA SA SA SA SA Óxido de titanio 10.00 12.00 9.00 8.50 11.00 9.50 10.00 Óxido de hierro 2.00 4.00 3.00 5.00 3.40 6.00 4.40 Óxido de zinc 4.00 2.00 3.00 Benzoato de alquilo de 0.25 4.00 7.00 C12-15 Éter dicaprílico 3.50 2.00 Dicaprilato/dicaprato de 5.00 6.00 butilenglicol Cocoglicérido 6.00 2.00 Dimeticona 0.50 1.00 2.00 Ciclometicona 2.00 0.50 0.50 Mantequilla de karité 2.00 Maquillaje de 0/W Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 (Designación INCI) Copolímero de hexadeceno 0.20 0.50 1.00 de PVP Glicerina 3.00 7.50 7.50 5.00 2.50 Coma de xantano 0.15 0.05 0.30 Carbómero sódico 0.20 0.15 0.25 Acetato de vitamina E 0.60 0.23 0.70 1.00 Glicina de soja 0.50 1.50 1.00 Etilhexiloxiglicina 0.30 Hidantoína de DMDM 0.60 0.40 0.20 Gliacil-L 0.18 0.20 Metilparabeno 0.15 0.25 0.50 Fenoxietanol 1.00 0.40 0.40 0.50 0.40 EDTA de trisódico 0.02 0.05 Ácido iminosuccínico 0.25 1.00 Etanol 2.00 1.50 3.00 1.20 5.00 Perfume 0.10 0.25 0.30 0.40 0.20 Agua CS CS CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) Hidrospersión Auto Bronceadora Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Ceteaereth-20 1.00 0.50 Hidrospersión Auto Bronceadora Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Alcohol cetílico 1.00 Luvigel EM 2.00 2.50 2.00 Polímero entrelazado de 0.50 0.40 0.10 0.50 acrilato/C10-C30 alquil-acrilato Goma de xantano 0.30 0.15 Compuesto SA SA SA SA SA Dihidroxiacetona 3.00 5.00 Aminobenzofenona (por ejemplo, 2.00 1.50 0.75 1.00 2.10 UVINUL A PLUSMR) Dióxido de titanio-microfino 1.00 1.00 1.00 Óxido zinc-microfino 1.90 0.25 Benzoato de alquilo de C12-15 2.00 2.50 Éter dicaprílico 4.00 Dicaprilato/dicaprato de 4.00 2.00 6.00 butilenglicol .

Carbonato de dicaprilo 2.00 6.00 Dimeticona 0.50 1.00 Feniltrimeticona 2.00 0.50 Mantequilla de karité 2.00 5.00 Copolímero de hexadeceno de^PVP 0.50 0.50 1.00 PVP de tricontanilo 0.50 1.00 Etilhexilglicerina 1.00 0.80 Glicerina 3.00 7.50 7.50 8.50 Glicina de soja 1.50 . 1.00 Hidrospersión Auto Bronceadora Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Acetato de vitamina E 0.50 0.25 1.00 Alfa-glucosilrutina 0.60 0.25 Hidantoína de DMDM 0.60 0.45 0.25 Gliacil-S 0.20 Metilparabeno 0.50 0.25 0.15 Fenoxietanol 0.50 0.40 1.00 EDTA de trisódico 0.01 0.05 0.10 Etanol 3.00 2.00 1.50 7.00 Perfume 0.20 0.05 0.40 Agua es es CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Hidrodispersión para Después de Formulaciones Tomar el Sol (Cantidades) 1 2 3 4 5 Ceteaereth-20 1.00 0.50 Alcohol cetílico 1.00 Luvigel EM 2.00 2.50 2.00 Polímero entrelazado de 0.50 0.30 0.40 0.10 0.50 acrilato/C10-C30 alquil-acrilato Goma de xantano 0.30 0.15 Compuesto SA SA SA SA SA Benzoato de alquilo de C12-15 2.00 2.50 Éter dicaprílico 4.00 Hidrodispersión para Después de Formulaciones Tomar el Sol (Cantidades) 1 2 3 4 5 Dicaprilato/dicaprato de 4.00 2.00 6.00 butilenglicol Carbonato de dicaprilo 2.00 6.00 Dimeticona 0.50 1.00 Feniltrimeticóna 2.00 0.50 PVP de tricontanilo 0.50 1.00 Etilhexilglicerina 1.00 0.80 Glicerina 3.00 7.50 7.50 8.50 Glicina de soja 1.50 1.00 Acetato de vitamina E 0.50 0.25 1.00 Alf -glucosilrutina 0.60 0.25 EDTA de trisódico 0.01 0.05 0.10 Etanol 1.00 10.00 8.00 12.00 9.00 Perfume 0.20 0.05 0.40 Agua CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Emulsiones de WO Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Copoliol de cetildimeticona 2.50 4.00 Poligliceril-2- 5.00 4.50 dipolihidroxiestearato PEG- 30 - dipolihidroxiestearato 5.00 Emulsiones de WO Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Compuesto SA SA SA SA SA Aminobenzofenona (por ejemplo 2.00 1.50 0.75 1.00 2.10 UVINUL A PLUSMR) Dióxido de titanio-microfino 1.00 3.00 3.50 Óxido de zinc-microfino 0.90 0.25 Mineralol 12.00 10.00 8.00 Benzoato de alquilo de C12-15 9.00 Éter dicaprililo 10.00 7.00 Dicaprilato/dicaprato de 2.00 8.00 4.00 butilenglicol Carbonato de dicaprililo 5.00 6.00 Dimeticona 4.00 1.00 5.00 Ciclometicona 2.00 25.00 2.00 Mantequilla de karité 3.00 Línea de base 4.50 Copolímero de hexadeceno de PVP 0.50 0.50 1.00 glicerina de etilhexilo 0.30 1.00 0.50 Glicerina 3.00 7.50 7.50 8.50 Glicina de soja 1.00 1.50 1.00 MgS04 1.00 0.50 0.50 MgC12 1.00 0.70 Acetato de vitamina E 0.50 0.25 1.00 Palmitato de ascorbilo 0.50 2.00 Fucogel 1000 3.50 7.00 Emulsiones de WO Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Hidantoína de DMDM 0.60 0.40 0.20 Metilparabeno 0.50 0.25 0.15 Fenoxietanol 0.50 0.40 1.00 EDTA de trisódico 0.12 0.05 0.30 Etanol 3.00 1.50 5.00 Perfume 0.20 0.40 0.35 Agua es CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Emulsiones Estabilizadas de Formulaciones Sólidos (Emulsiones Recolectoras) (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Aceite mineral 16.00 16.00 Oc ildodecanol 9.00 9.00 5.00 Triglicérido caprílico/cáprico 9.00 9.00 6.00 Benzoato de alquilo de C12-15 5.00 8.00 Dicaprilato/dicaprato de 8.00 butilenglicol Éter dicaprililo 9.00 4.00 Carbonato de dicaprililo 9.00 Hidroxiestearato de 2.00 2.00 2.20 2.50· 1.50 hidroxioctacosanilo Hectorito de diesteardimonio 1.00 0.75 0.50 0.25 Emulsiones Estabilizadas de Formulaciones Sólidos (Emulsiones Recolectoras) (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 ¦ 2 3 4 5 Cera microcristalina + parafina 0.35 5.00 liquida Hidroxipropil metilcelulosa 0.10 0.05 Dimeticona 3.00 Compues o SA SA SA SA SA Dióxido de titanio + Alúmina + 3.00 Simeticona + Agua Dióxido de titanio + 2.00 4.00 2.00 4.00 trimetoxicaprililsilano Dimetil silicato de sílice 2.50 S .00 2.50 Bornitrid 1.00 Polímero de almidón/ -metafosfato 2.00 de sodio Almidón de tapioca 0.50 Cloruro sódico 5.00 7.00 8.50 3.00 4.50 Glicerina 1.00 EDTA trisódico 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Acetato de vitamina E 5.00 10.00 3.00 6.00 10.00 Palmitato de ascorbilo 1.00 1.00 1.00 Metilparabeno 0.60 0.20 Pro ilparaloeno 0.20 Fenoxietanol 0.20 Diisetionato de hexamidina 0.40 0.50 0.40 Diazolidinál Harnstoff 0.08 Etanol 0.23 0.20 Emulsiones Estabilizadas de Formulaciones Sólidos (Emulsiones Recolectoras) (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Perfume 5.00 3.00 4.00 Agua 0.20 0.30 0.10 CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Barras Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Triglicérido caprílico/cáprico 12.00 10.00 6.00 Octildodecanol 7.00 14.00 8.00 3.00 Dicaprilato/dicaprato de butilenglicol 12.00 Tetraisoestearato de pentaeritritilo 10.00 6.00 8.00 7.00 Diisoestearato de poligliceril- 3 2.50 Poliaciladipato-2 de Bis-diglicerilo 9.00 8.00 10.00 8.00 Alcohol cetearílico 8.00 11.00 9.00 7.00 Miristato de miristilo 3.50 3.00 4.00 3.00 Cera de abejas 5.00 5.00 6.00 6.00 Cera de carnauba 1.50 2.00 2.00 1.50 Cera de alba 0.50 0.50 0.50 0.40 Estearato de alquilo de C16-40 1.50 1.50 1.50 Compuesto SA SA SA SA Aminobenzofenona (por ejemplo, UVINUL A 2.00 1.50 0.75 9.00 PLUSMK) Dióxido de titanio-microfino 1.00 3.00 Óxido de zinc-microfino 1.00 0.25 Barras Formulaciones (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 Acetato de vitamina E 0.50 1.00 Palmitato de ascorbilo 0.05 0.05 Buxux Chinensis 2.00 1.00 1.00 Perfume, BHT 0.10 0.25 0.35 Ricinus Communis CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) PIT-Emulsión Auto Formulaciones Bronceadora (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 8 (Designación INCI) Monoestearato de 0.50 2.00 3.00 5.00 0.50 4.00 glicerina SE Isoestearato de 3.50 4.00 2.00 glicerilo Isoceteth-20 0.50 2.00 Ceteareth- 12 5.00 1.0 3.50 5.00 Ceteareth-20 5.00 1.00 3.50 Estearato de PEG- 2.80 2.30 3.30 100 Alcohol cetílico 5.20 1.20 1.00 1.30 0.50 0.30 Palmitato de 2.50 1.20 1.50 0.50 1.50 cetilo PIT-Emulsión Auto Formulaciones Bronceadora (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 8 (Designación INCI) Copoliol de cetil 0.50 1.00 dimeticona Poligliceril-2 0.75 0.30 Compuesto SA SA SA SA SA SA SA SA Dihidroxiacetona 3.00 5.00 4.00 Aminobenzofenona 2.00 1.50 0.75 1.00 2.10 4.50 5.00 2.10 (por ejemplo, UVINUL A PLUSR) Dióxido de 1.00 1.50 3.50 1.50 1.00 titanio-microfino Óxido de zinc- 1.00 0.25 2.00 1.50 microfino Benzoato de 3.50 6.35 0.10 alquilo de C12-15 Cocoglicérilo 3.00 3.00 1.00 Éter dicaprílico 4.50 Carbonato de 4.30 3.00 7.00 dicaprililo Adipato de 0.50 0.30 dibutilo Feniltrimeticona 2.00 3.50 2.00 Ciclometicona 3.00 PIT-Emulsión Auto Formulaciones Bronceadora (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 8 (Designación INCI) Galaktomano de 0.50 2.00 etilo Coco-glicérilo de 3.00 4.00 hidrogenados Cera Abil 2440 1.50 2.00 Copolímero de 1.00 1.20 hexadeceno de PVP Glicerina 4.00 6.00 5.00 8.00 10.0 Acetato de 0.20 0.30 0.40 0.30 vitamina E Mantequilla de 2.00 3.60 2.00 karité Butilcarbamato de 0.12 0.20 yodopropilo Hidantoína de 0.10 0.12 0.13 DMDM Metilparabeno 0.50 0.30 0.35 Fenoxietanol 0.50 0.40 1.00 Octoxiglicerina 0.30 1.00 0.35 Etanol 2.00 2.00 5.00 EDTA trisódico 0.40 0.15 0.20 Perfume 0.20 0.20 0.24 0.16 0.10 0.10 PIT-Emulsión Auto Formulaciones Bronceadora (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 7 8 (Designación INCI) Agua es es es es es es es es (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) (100) aún en modalidades adicionales, la presente invención comprende al menos un pigmento inorgánico. En algunas modalidades preferidas, estos pigmentos inorgánicos se basan en óxidos metálicos y/o otros compuesto metálicos ligeramente solubles en agua o insolubles en agua, que incluyen pero no se limitan a óxidos de zinc (ZnO) , de titanio (Ti02) , de hierro (por ejemplo, Fe203) , de zirconio (Zr02) , de sílice (Si02) , de manganeso (por ejemplo, MnO) , de aluminio (A1203) , de cerio (por ejemplo, Ce203) y óxidos mezclados de estos óxidos, así como mezclas de los mismos. En algunas modalidades, los óxidos metálicos son de grado microfino, en tanto que en otras modalidades, los óxidos metálicos son de grado pigmento. En otras modalidades adicionales, los óxidos metálicos son una mezcla de granos microfinos y de pigmento.

En modalidades adicionales, los pigmentos inorgánicos están revestidos (es decir, se tratan en la superficie) . En algunas modalidades particularmente preferidas, la superficie se reviste con una película hidrófoba, delgada. En algunas otras modalidades particularmente preferidas, la superficie se reviste con una película, hidrófila, delgada. En modalidades aún adicionales, la presente -ffñvención proporciona composiciones que comprenden varios maquillajes y constituyen de maquillaje. Por ejemplo, en algunas modalidades, la presente invención proporciona varios tintes y/o pigmentos. En algunas modalidades, los pigmentos útiles incluyen, pero no se limitan a dióxido de titanio, mica, óxidos de hierro (por ejemplo, Fe203, Fe304, FeO(OH), etc.) y/u óxido de estannoso. La presente invención proporciona además colorantes, que incluyen pero no se limitan a, carmina, azul, óxido de cromo, ultramarino y/o manganeso púrpura. Los colorantes y pigmentos de algunas de las modalidades más preferidas se conocen por los expertos en la técnica y se proporcionan anteriormente (Ver ejemplo, Colour Index Num ern (CIN) , Rowe Colour Index, 3^ ed., Society of Dyers and Colourists, Bradford, Inglaterra

[1971] ) .

En modalidades adicionales, encuentra uso como se describe anteriormente los pigmentos perlesentes basados en mica/óxido metálico. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a estos pigmentos particulares, puesto que pigmentos perlesentes adicionales encuentran uso en las varias modalidades de la presente invención.

Las siguientes formulaciones proporcionan ejemplos adicionales del uso de la presente invención.

Formulación (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Carbómero sódico 0.2 Polímero entrelazado de 0.3 0.2 0.6 acrilato/C10-C30 alquil-acrilato Formulación (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Hidroxipropil celulosa 1.0 1.50 Goma de xantano 0.6 0.2 1.0 1.0 Compuesto 0.5 0.1 0.01 0.01 1.0 Butamidotriazona de dioctilo 2.0 2.0 1.0 Triazon de etilhexilo 4.0 4.0 5.0 Aniso triazina 1.0 0.5 2.0 2.5 Bisoctiltriazol 6.0 Drometrizol trisiloxano Ácido fenilbencimidazolsul- 2.0 1.0 fónico Bisimidazilato 1.0 Ácido tereftaliliden decanfor 0.2 sulfónico Metoxicinamato de etilhexilo 7.5 10.0 5.0 Octocrileno 5.0 Dietilbenzalmalonato de 4.0 dimeticona Salicilato de etilhexilo Homosalato Metoxidibenzoilmetano de butilo 1.0 1.0 4.0 Dióxido de titanio 1.0 4.0 Óxido de zinc 4.0 Triglicérido caprílico/cáprico 2.0 Coco-glicérido hidrogenado 3.0 Benzoato de alquilo de C12-15 2.0 2.5 3.0 Formulación (Cantidades) Materia Prima (Designación INCI) 1 2 3 4 5 Éter dicaprililo 4.0 Dicaprilato/dicaprato de 4.0 2.0 6.0 butilenglicol Carbonato de dicaprililo 2.0 Dimeticona de cetilo 2.0 0.5 1.0 Mantequilla de karité 2.0 Copolímero de hexadeceno de 0.5 0.05 0.5 PVP Glicerina 3.0 7.5 7.5 2.5 Tocoferol 0.5 0.75 0.2 EDTA de trisodio 1.0 0.5 0.5 1.0 1.5 Citrato trisódico 0.2 Zitronenato 0.1 0.1 0.1 Hidantoína de DMDM 0.6 0.2 Me ilparabeno 0.5 0.3 0.15 Fenoxietanol 0.5 0.4 0.4 1.0 0.60 Etanol 3.0 2.0 3.0 1.0 Perfume 0.2 0.2 0.2 Agua es CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Carbómero sódico 0.5 1.5 Polímero entrelazado de 0.4 0.1 0.75 acrilato/C10-C30 alquil-acrilato Hidroxipropil celulosa 0.5 0.25 Goma de xantano 0.2 0.4 Compuesto 0.5 0.1 0.01 0.01 1.0 Butamidotrlazona de 1.0 2.0 dioctilo Triazon de etilhexilo 2.0 2.0 Triazina de aniso 1.0 0.2 3.0 1.0 Bisoctiltrlazol 8.0 Drometrizol trisiloxano 4.0 Ácido fen lbenzmidazol 1.5 sulfónico Bisimidazilato 1.5 Dicanfor de 0.5 tereftalilideno Ácido sulfónico Metoxicinamato de 7.5 5.0 10.0 etilhexilo Octocrileno 10.0 5.0 5.0 Dietilbenzalmalonato de 2 .5 dimeticona Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Salicilato de 3.5 5.0 etilhexilo Homosalato 4.0 Metoxidibenzoilmetano 0.5 de butilo Dióxido de titanio 1.5 2.0 1.0 2.5 Óxido de zinc 1.0 0.5 Triglicérido cap ílico/cáprico Coco-glicérido hidrogenado Benzoato de alquilo de 5.0 C12-15 Éter dicaprililo 7.5 Dicaprilato/dicaprato de butilenglicol Carbonato de 7.5 dicaprililo Dimeticona de cetilo Mantequilla de karité 3.0 Copolímero de 0.5 0.75 1.0 hexadeceno de PVP Glicerina 5.0 10.0 Tocoferol 0.3 1.5 1.0 EDTA de trisodio 0.5 0.1 0.5 Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 (Designación INCI) Citrato trisódico 0.3 Zitronenato 0.15 Hidantoína de DMDM 0.3 0.15 Metilparabeno 0.4 Fenoxietanol 1.0 Etanol 7.5 5.0 7.0 Perfume 0.25 0.2 Agua CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 (Designación INCI) Carbómero sódico 0.5 1.5 1.0 0.5 Polímero entrelazado de 1.0 0.75 1.0 acrilato/C10-C30 alquil-acrilato Hidroxipropil celulosa 0.4 1.0 1.0 Goma de xantano 0.6 0.2 1.0 1.0 BBI 4.0 0.5 3.0 2.0 4.0 1.5 Butamidotriazona de 2.0 2.0 2.0 1.0 dioctilo Triazon de etilhexilo 4.0 5.0 4.0 Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 (Designación INCI) Triazina de aniso 1.0 1.0 2.5 1.0 Bisoctiltriazol 4.0 Trisiloxano de drometrizol 3.0 Ácido fenilbenzmidazol 2.0 1.0 sulfónico Bisimidacilato 1.5 3.5 Dicanfor tereftalilídine 0.2 1.0 ácido sulfónico Metoxicinamato de 10.0 5.0 etilhexilo Octocrileno 1.0 5.0 Dietilbenzalmalonato de 4.0 dimeticona Salicilato de etilhexilo 5.0 Homosalato 5.0 Metoxi-dibenzoilmetano de 1.0 1.0 4.0 0.5 butilo Dióxido de titanio 1.0 4.0 1.5 Óxido de zinc 4.0 Triglicérido 2.0 caprílico/cáprico Aceite de parafina 1.0 Benzoato de alquilo de C12- 2.0 2.5 3.0 Cis Éter dicaprililo 4.0 Formulaciones (Cantidades) Materia Prima 1 2 3 4 5 6 (Designación INCI) Isohexadeceno 4.0 2.0 6.0 Carbonato de dicaprililo 2.0 Adipato de dibutilo 2.0 0.5 1.0 Cilometicona 3.0 Jojoba 2.0 Copolímero de hexadeceno de 0.5 0.05 0.5 0.5 PVP Butilenglicol 3.0 7.5 7.5 2.5 5.0 Palmitato de ascorbilo 0.5 0.75 0.2 0.3 Octoxiglicerina 1.0 0.5 1.0 Glicina de soja 2.0 1.5 EDTA de trisodio 1.0 0.5 0.5 1.5 0.5 Ácido caústico 1.0 0.2 0.25 Butilcarbamato de 0.6 0.2 yodopropilo Fenoxietanol 0.4 1.0 Etanol 5.0 2.0 7.0 Perfume 0.2 0.2 0.2 Agua CS CS CS CS CS CS (100) (100) (100) (100) (100) (100) La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto para después de afeitar que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Loción para Después de Afeitar Producción: Pesar los componentes de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar a la Fase A y homogenizar bien.

Valores de medida: Viscosidad: 18 500mP a de Brookfield RVD 11+ valor pH: 5.8 La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto para después de afeitar que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Para Antes de Afeitar Producción: Pesar los componentes de la Fase A y disolverlos claramente.

La fórmula para después de afeitar y para antes de afeitar, proporcionadas anteriormente contienen suficiente BBI-AV (Compuesto) para proporcionar los efectos deseados. En algunas modalidades, la concentración de BBI-AV está en el intervalo de aproximadamente 1,000 ppm a aproximadamente 10,000 ppm. En las siguientes formulaciones, las concentraciones típicas de BBI-AV usadas varían desde aproximadamente 100 ppm a aproximadamente 1,000 ppm o desde aproximadamente 1,000 ppm a aproximadamente 10,000 ppm. Sin embargo, no se propone que la presente invención se limite a este intervalo específico de concentraciones, puesto que otras concentraciones encuentran uso en las otras modalidades de la presente invención.

La siguiente formula proporciona un ejemplo de un producto para después de tomar el sol que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Loción para Después de Tomar el Sol Producción: Mezclar los componentes de la Fase A.

Disolver la Fase B y agitarla en la Fase A en tanto que se homogeniz . Neutralizar con Fase C y homogenizar nuevamente. Valores de medida: Viscosidad: 7 500mPa s Viscosímetro de Haake VT-02 valor pH : 6.0 La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto limpiador facial que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Limpiador Facial % Ingrediente INCI A 10.0 Luvitol EHO Cetearil-Etilhexanoato 10.0 Miglyol 812 Triglicérido caprílico/cáprico 1.5 Fluido Dow Corning Ciclopentasiloxano , 345 ciclohexasilosano 2.0 Cremphor CO 40 Aceite de ricino hidrogenado PEG-40 B 3.5 Luvigel EM Acrilatos de triglicérido caprílico/cáprico, Copolímero de sodio c 1.0 •Acetato de Acetato de tocoferilo vitamina E 0.2 Bisabolol rae. Bisabolol es Conservador es Perfume D 3.0 Luviquat Care Poliquaternium-44 0.5 Luviquat Mono LS Metosulfato de cocotrimonio 0.5 Cremophor A 25 Cetearth-25 0.2 D-pantenol 50 P Pantenol, propilenglicol % Ingrediente INCI 4.0 Cuidado de 1,2 Propilenglicol propilenglicol 0.1 Edeta BD EDTA disódico SA Compuesto SC Agua der. Agua dem .

Producción: Disolver Fase A, luego agitar en Fase B. Alforzar en Fase C. Disolver Fase D, agitarla en las Fases A + B + C combinadas, homogenizar y agitar nuevamente durante 15 minutos.

Valores de medida: Viscosidad: 7 200mPa s RTV de Brookfield valor de pH : 5.8 La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto de aspersión, corporal de cuidado diario con SPF 8 que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Aspersión Corporal de Cuidado Diario - SPF 8 % Ingrediente INCI A 3.0 Uvinul MC 80 Metoxicinamato de etilhexilo 2.0 Uvinul A PlusMR Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 1.0 Luvigueat Policuaternio-44 UltraCare 3.0 Cuidado de 1,2 Propilenglicol propilenglicol 2.0 D-pantenol 50 P Pantenol, Propilenglicol % Ingrediente INCI 1.0 Fluido Dow Corning Ciclopentasiloxano, 345 cic1ohexasi1oxano 1.0 Eutanol G Octildodecanol 0.5 Luviskol K 30 PVP 10.0 Miglyol 812 Triglicérido caprílico/cápr co 3.0 Finsolv TN C12-15 alquil benzoato 3.0 Glicerina 87 % Glicerina 1.0 Acetato de Acetato de tocoferilo vitamina E 0.3 Bisabolol rae. Bisabolol Compuesto se Etanol Alcohol Producción: Pesar los componentes de la Fase A y disolverlos claramente.

Valores de medida: SPF: 8 Colipa Task Forcé "Medición de Protección al Sol" La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto de loción de cuidado para el sol de cuidado diario con SPF 27 que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Loción de Cuidado para el Sol - SPF 27 % Ingrediente INCI A 4.5 Uvinul MC 80 Metoxicinamato de etilhexilo 2.0 Uvinul A PlusMR Benzoato de dietilamino hidroxibenxoil hexilo % Ingrediente INCI 3.0 Uvinul N 539 T Octocrileno 2.5 Cosmacol EMI DÍ-C12-13 alquil malato 0.5 Acetato de Acetato de tocoferol vitamina E 4.0 Regó Care 450 Diestearato de poligliceril-3 metil glucosa B 3.5 Cetiol SN Deo Isononanoato de cetearilo 1.0 Ganex V-220 Copolimero VP/Eicoseno 5.0 Isohexadecano Isohexadecano 2.5 Coscamcol EMI DÍ-C12-13 alquil malato 3.0 Uvinul Ti02 Dióxido de titanio, Trimetoxicaprililsilano C 5.0 Glicerina 87 % Glicerina 1.0 Lanette E Cetearil sulfato de sodio 0.5 Keltrol Goma de xantano 60.7 Agua dem . Agua dem .

D SA Compuesto 1.0 Phenonip Fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno, 0.3 Bisabolol rac. Bisabolol Producción: Calentar Fases A y B de manera separada a aproximadamente 80°C. Agita Fase B en Fase A, en tEinto que se homogeniza. Calentar de Fase C a aproximadamente 80°C y agitarlas en las Fases A+B combinadas, en tanto que se homogeniza. Enfriar a aproximadamente 40°C adicionar Fase D y homogenizar nuevamente.

Valores de medida: Viscosidad: 3 20OmPa s Brookfield RVD 11+ valor de pH : 6.0 SPF: 27 Colipa Task Forcé "Medición de Protección al Sol" Loción de Cuidado de Sol - SPF 24 % Ingrediente INCI A 2.0 Cremophor A 6 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 2.0 Cremophor A 25 Ceteareth-25 3.0 Syncrowax HRC Tribehenina 2.0 Lanette 0 Alcohol cetearílico 2.0 Luvitol EHO Cetearil etilhexanoato 5.0 Uvinul MC 80 Etilhexil metoxicinamato 1.0 Uvinul T 150 Etilhexil triazona 1.0 Ganex V-220 Copolímeto VP/Eicoseno 7.0 Miristato de Miristato de isopropilo isopropilo B 5.0 2-Cote HP-1 Óxido de zinc, Trietoxicaprililsilano C 0.2 Keltrol Acrilato de hidroxietilo/Acriloildimetil sódico Copolímero de taurato, Escualeno, Polysorbate 60 0.2 Edeta BD EDTA disódico 5.0 Cuidado de 1,2 Propilenglicol propilenglicol % Ingrediente INCI 0.5 D-pantenol USP Pantenol SI.9 Agua dem. Agua dem .

D SA Compuesto 0.5 Euxyl K 300 Fenoxietanol , metilparabeno , butilparabeno Etilparabeno, propilparabeno, - isobutilparabeno 1.0 Acetato de Acetato de tocoferilo vitamina E 0.2 Bisabolol rae. Bisabolol Producción: Calentar Fase A a 80°C, adicionar Fase B y homogenizarla durante 3 minutos. Calentar Fase C a aproximadamente 80°C, y agitarla en las Fases A+B combinadas en tanto que se homogeniza. Enfriar a aproximadamente 40°C, adicionar Fase D y homogenizar.

Valores de medida: Viscosidad: 5 OOmPa s Brookfield RVD 11+ valor de pH : 7.5 SPF: 24 Colipa Task Forcé "Medición de Protección al Sol" La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto de emulsión de bloqueador de sol con SPF 28 que comprende el BBI-AV de la presente invenc ión .

Emulsión de Bloqueador de Sol - SPF 28 % Ingrediente INCI A 3.5 Cremophor A 6 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 1.5 Cremophor A 25 Ceteareth-25 7.5 Uvinul MC 80 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Uvinul A PlusMR Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 2.0 Fluido Dow Corning Ciclopentasiloxano, 345 ciclohexasiloxano 0.5 Cera de abejas Cera de abejas 3044 PH 3.0 Lanette 0 Alcohol cetearílico 10.0 Miglyol 812 Triglicérido caprílico/cáprico B 5.0 L-Lite SF-S Dióxido de titanio, sílice, meticona, Alúmina C 3.0 Glicerina 87 % Glicerina 0.2 Edeta BD EDTA disódico 0.3 Keltrol T Goma de xantano 1.0 Plantacare 2000 Glucósido de decilo 2.0 D-pantenol 50 P Pantenol, propilenglicol 57.3 Agua dem. Agua dem.

D SA Compuesto 1.0 Acetato de Acetato de tocoferol vitamina E 0.2 Bisabolol rae. Bisabolol SC Perfume SC Conservador Producción: Calentar Fase A a 80°C, adicionar Fase B y homogenizarla durante 3 minutos. Calentar Fase C a aproximadamente 80°C, y agitarla en las Fases A+B combinadas en tanto que se homogeniza. Enfriar a aproximadamente 40°C, adicionar Fase D y homogenizar.

Valores de medida: Viscosidad: 7500mPas Brookfield RVD 11+ valor de pH : 6.6 SPF: 28 Colipa Task Forcé "Medición de Protección al Sol" La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto de bálsamo para pies comprende el BBI-AV de la presente invención.

Bálsamo para Pies % Ingrediente INCI A 2.0 Cremophor A 6 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 2.0 Cremophor A 25 Ceteareth-25 5.0 Luvitol EHO Cetearil etilhexanoato 4.0 Lanette 16 Alcohol cetílico 4.0 Cutina Gms Estearato de glicerilo 5.0 Aceite de parafina Aceite mineral 0.2 Mentol Mentol 0.5 alcanfor alcanfor B 70.3 Agua dem. Agua dem.

SC Conservador % Ingrediente INCI c SA Compuesto 1.0 Bisabolol rae. Bisabolol 1.0 Acetato de Acetato de tocoferilo vitamina E D 5.0 Extracto de Extracto de Hamamelis Hamamelis Producción: Calentar las Fases A y B a aproximadamente 80°C separadamente. Agitar la Fase B en la Fase A, en tanto que se homogeniza. Enfriar a aproximadamente 40 °C, adicionar las Fases C y D y homogenizar nuevamente. Enfriar a temperatura ambiente.

Valores de medida: Viscosidad: 20 500mPas Brookfield RVD 11+ valor de pH: 6.0 La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto de gel refrescante para pies que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Gel Refrescante para Pies % Ingrediente INCI A 0.6 Carbopol Ultrez 21 Polímero entrelazado de acrilatos/C10-C30 alquil- acrilato 45.9 Agua dem . Agua dem .

B 1.0 Bisabolol rae. Bisabolol 0.5 Farnesol Farnesol % Ingrediente INCI c . s . Perfume 4.5 Cremophor CO 40 Aceite de ricino hidrogenado PEG-40 1.0 Neutrol TE Tetrahidroxipropil etilendiamina 1.5 Mentol Mentol SA Compuesto 45.0 Etanol 96 % Alcohol CS FD&C Azul No. 1 C.I. 42 090, FD&C Azul No. 1 Producción: Fase A: Entremezclar el Carbopol y dejarlo asentar en el fondo del vaso. Disolver la Fase B y agitarla en la Fase A.

Valores de la medida: Viscosidad: 14 SOOMPas Brookfield RVD 11+ valor de pH: 7.5 La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto de gel acondicionador de la piel que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Gel Acondicionador de la Piel % Ingrediente INCI A 3.6 Cremophor co 40 Aceite de ricino hidrogenado PEG-40 15.0 Etanol Alcohol 0.1 Bisabolol rae. Bisabolol 0.5 Acetato de Acetato de tocoferol vitamina E % Ingrediente INCI cs Perfume B 3.0 D-pentenol USP Pantenol 0.6 Carbopol 940 Carbómero SA Compuesto 76.4 Agua dem . Agua dem .

C 0.8 Cuidado de Trietanolamina trietanolamina Producción: Disolver la Fase A claramente. Permitir la Fase B hincharse y neutralizar con la Fase C. Agita la Fase A en la Fase B neutralizada y homogenizar.

Valores de medida: Viscosidad: 57 600mPas Brookfield RVD 11+ valor de pH: 7.7 La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de una emulsión de W/O que comprende el BBI-AV de la presente invención .

Emulsión de W/O % Ingrediente INCI A 6.0 Cremophor O 7 Aceite de ricino hidrogenado PEG-7 8.0 Luvitol EHO Cetearil etilhexanoato 5.0 Miristato de Miristato de isopropilo isopropilo 15.0 Aceite de parafina Aceite mineral 0.3 Estearato de Estearato de magnesio magnesio % Ingrediente INCI 0.3 Estearato de Estearato de aluminio aluminio 2.0 Elfacos ST9 Copolímero de PEG-45/Dodecil glicol B 5.0 Glicerina 87 % Glicerina 0.7 Hidrato de sulfato Sulfato de magnesio de magnesio- 7 56.6 Agua dem. Agua dem .

C SA Compuesto 0.5 Acetato de Acetato de tocoferol vitamina E 0.6 Bisabolol rae. Bisabolol Producción: Calentar las Fases A y B separadamente a aproximadamente 85°C. Agitar la Fase B en la Fase A y homogenizar. Enfriar a aproximadamente 40°C en tanto que se agita, adicionar la Fase C y homogenizar nuevamente. Enfriar a temperatura ambiente.

Valores de medida: Viscosidad: 37 500mPas Brookfield RVD 11+ La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto de emulsión de 0/W que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Emulsión de 0/W % Ingrediente INCI A 1.7 Cremophor A 6 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 0.7 Cremophor A 25 Ceteareth-25 2.0 Uvinul A PlusMR Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 2.0 Abil B 8843 Dimeticona de PEG-14 3.6 Lanette 0 Alcohol cetearílico 6. q Uvinul MC 80 Etilhexil metoxicineimato 2.0 Cetiol B Adipato de dibutilo B 5.0 Glicerina 87 % Glicerina 0.2 Edeta BD EDTA disódico 1.0 D-pantenol 75W Pantenol c . s . Conservador 68.8 Agua dem . Agua dem.

C 4.0 Luvigel EM Triglicérido caprílico/cáprico , Copolímero de acrxlatos de sodio D 0.2 Fosfato de Fosfato de ascorbilo sódico ascorbilo sódico 1.0 Acetato de Acetato de tocoferilo vitamina E 0.2 Bisabolol rae. Bisabolol E c . s . Hidróxido de sodio Hidróxido de sodio 10 % a.c. p/p % Ingrediente INCI F 1.0 RetiSTAR Triglicérido caprílico/cáprico, ascorbato, tocoferol, retinol, sodio SA Compuesto Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 80°C. Agitar la Fase B en la Fase A y homogenizar. Agitar la Fase C en las Fases A+B combinadas y homogenizar. Enfriar a aproximadamente 40°C, adicionar la Fase . .

D, luego ajustar el valor de pH con la fase E a 6.5. Adicionar la fase F y homogenizar. Enfriar a temperatura ambiente.

Valores de medida: Viscosidad: 37 500mPas Brookfield RVD 11+ valor de pH: 6.3 La siguiente fórmula proporciona un ejemplo de un producto protector de crema diaria que comprende el BBI-AV de la presente invención.

Crema Protectora Diaria % Ingrediente INCI A 1.7 Cremophor A 6 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 0.7 Cremophor A 25 Ceteareth-25 2.0 Uvinul A Plus™ Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo % Ingrediente INCI 2.0 Abil B 8843 Dimeticona de PEG-14 3.6 Lanette 0 Alcohol cetearílico 6.0 Uvinul MC 80 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Cetiol B Adipato de dibutilo B 5.0 Glicerina 87 % Glicerina 0.2 Edeta BD EDTA disódico 1.0 D-pantenol 75W Pantenol CS Conservador 69.6 Agua dem. Agua dem.

C 4.0 Luvigel EM Triglicérido caprilico/cáprico, Copolímero de acrilatos de sodio D 1.0 Fosfato de Fosfato de ascorbilo sódico ascorbilo sódico 1.0 Acetato de Acetato de tocoferilo vitamina E SA Compuesto 0.2 Bisabolol rae. Bisabolol E cs Hidróxido de sodio Hidróxido de sodio 10 % ac. p/p Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 80°C. Agitar la Fase B en la Fase A y homogenizar. Agitar la Fase C en las Fases A+B combinadas y homogenizar. Enfriar a aproximadamente 40°C, adicionar la Fase D, luego ajustar el valor de pH con la fase E a 6.5 y homogenizar. Enfriar a temperatura ambiente.

Valores de medida: Viscosidad: 24 OOOmPas Brookfield RVD 11+ valor de pH : 6.4 Las siguientes fórmulas proporcionan ejemplos de productos de cuidado de pelo que comprende el BBI-A.V de la presente invención.

Acondicionadores de Pelo Producción: Adicionar todos los compuestos de la Fase A u agitar para homogenizar. Rellenar el contenedor apropiado y cambiar con la Fase B.

Acondicionadores de Espuma Producción: Adicionar todos los compuestos a la Fase A y agitar para homogenizar. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase B.

Espumas de Estilizado Ingredientes (INCI) A 0.5 Laureth-4 CS Perfume B 77.3 Agua dem.

% Ingredientes (INCI) 10.0 Policuaternio-28 Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA 0.2 Hidroxietilcelulosa c 10.0 HFC 152 A % Ingredientes (INCI) A 0.5 Laureth-4 CS Perfume B 73.3 Agua dem. 10.0 Policuaternio-28 SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA 0.2 Hidroxietilcelulosa C 10.0 HFC 152 A Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agita en la Fase A y homogenizar. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la fase C.

% Ingredientes (INCI) A 2.0 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 78.5 Agua dem. 6.7 Copolímero de acrilatos 0.6 AMP SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA 0.2 Hidroxietilcelulosa C 10.0 HFC 152 A % Ingredientes (INCI) A 2.0 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 74.5 Agua dem. 6.7 Copolímero de acrilatos 0.6 AMP SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA 0.2 Hidroxietilcelulosa C 10.0 HFC 152 A Producción: Pesar los compuestos de la Fase A u mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Llenar en el recipiente apropiado y cairgar con la fase C.

Espuma de Estilizado Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Espuma de Estilizado % Ingredientes (INCI) A 2.0 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 72.32 Agua dem. 2.00 Copolímero VP/Acrilatos/Lauril Metacrilato 0.53 AMP SA Compuesto 0.20 Ceteareth-25 0.50 Pantenol % Ingredientes (INCI) 0.05 Benzofenona-4 0.20 Amodimeticona, Cloruro de cetrimonio, Trideceth-12 15.00 Alcohol c 0.20 Hidroxietilcelulosa D 6.00 .Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A 2.00 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 68.32 Agua dem. 2.00 Copolímero VP/Acrilatos/Lauril Metacrilato 0.53 AMP SA Compuesto 0.20 Ceteareth- 25 0.50 Pantenol 0.05 Benzofenona- 0.20 Amodimeticona, Cloruro de cetrimonio, Trideceth- 12 15.00 Alcohol C 0.20 Hidroxietilcelulosa D 6.00 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Adicionar la Fase C y homogenizar nuevamente. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase D.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A 2.00 Cloruro de cetrimonio CS Perfume B 67.85 Agua dem. 7.00 Policuaternio-46 SA Compuesto 0.20 Ceteareth-25 0.50 Pantenol 0.05 Benzofenona-4 0.20 Amodimeticona, Cloruro de cetrimonio, Trideceth-12 15.00 Alcohol C 0.20 Hidroxietilcelulosa D 6.00 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A 2.00 Cloruro de cetrimonio CS Perfume B 63.85 Agua dem. 7.00 Policuaternio-46 SA Compuesto 0.20 Ceteareth-25 0.50 Pantenol 0.05 Benzofenona-4 0.20 Amodimeticona, Cloruro de cetrimonio, Trideceth-12 % Ingredientes (1NCI) 15.00 Alcohol c 0.20 Hidroxietilcelulosa D 6.00 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Adicionar la Fase C y homogenizar nuevamente. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase D.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A CS Aceite de ricino hidrogenado PEG-40 CS Perfume 81.5 Agua dem .

B 7.0 Sulfato de poliestireno sódico SA Compuesto % Ingredientes (INCI) 0.5 Bromuro de cetrimonio CS Conservador c 6.0 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar Ajustar el pH A 6-7. Llenar en el recipiente apropiado cargar con la fase C.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A CS Aceite de ricino hidrogenado PEG-40 CS Perfume 92.0 Agua dem.

B 0.5 Policuaternio- 10 1.0 Compuesto 0.5 Bromuro de cetrimonio CS Conservador C 6.0 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A CS Aceite de ricino hidrogenado PEG-40 CS Perfume 88.0 Agua dem.

B 0.5 Policuaternio- 10 5.0 Compuesto 0.5 Bromuro de cetrimonio % Ingredientes (INCI) es Conservador c 6.0 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la fase C.

Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Ajustar el H a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Espumas de Estilizado Producción: Pesar los compuestos de. la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la fase C.

Champús % Ingredientes (INCI) A 30.0 Laureth sulfato de sodio . 6.0 Cocoanfoacetato de sodio 6.0 Cocamidopropil betaína 3.0 Laureth sulfato de sodio/Diestearato de glicol, Cocamida MEA, Laureth- 10 SA Compuesto 7.7 Plicuaternio-44 2.0 Amodimeticona CS Perfume CS Conservador 1.0 Cloruro de sodio 73.3 Agua dem.

B CS Ácido cítrico % Ingredientes (INCI) A 30.0 Laureth sulfato de sodio 6.0 Cocoanfoacetato de sodio 6.0 Cocamidopropil betaína 3.0 Laureth sulfato de sodio/Diestearato de glicol, Cocamida MEA, Laureth- 10 Compuesto 7.7 Policuaternio-44 2.0 Amodimeticona CS . Perfume % Ingredientes (INCI) es Conservador 1.0 Cloruro de sodio 39.3 Agua dem.

B CS Ácido cítrico Producción: Pesar los compuestos de la Fase A mezclarlos. Ajustar el pH a 6-7 con ácido cítrico.

Geles de Ducha % Ingredientes (INCI) A 40.0 Laureth sulfato de sodio 5.0 Glucósido de decilo 5.0 Cocamidopropil betaína ' SA Compuesto 1.0 Pantenol CS Perfume CS Conservador 2.0 Cloruro de sodio 4S.0 Agua dem.

B CS Ácido cítrico % Ingredientes (INCI) A 40.0 Laureth sulfato de sodio 5.0 Glucósido de decilo 5.0 Cocamidopropil betaína SA Compuesto 1.0 Pantenol % Ingredientes (INCI) CS Perfume es Conservador 2.0 Cloruro de sodio 42.0 Agua dem.

B CS Ácido cítrico Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Ajustar el pH a 6-7 con ácido cítrico.

Champús .% Ingredientes (INCI) A 40.0 Laureth sulfato de sodio 5.0 C12-15 Pareth sulfonato de sodio 5.0 Glucósido de decilo CS Perfume 0.1 Fitantriol 44.6 Agua dem .

SA Compuesto 0.3 Policuaternio- 10 1.0 Pantenol CS Conservador 1.0 Laureth-3 2.0 Cloruro de sodio % Ingredientes (INCI) A 40.0 Laureth sulfato de sodio 5.0 C12-15 Pareth sulfonato de sodio 5.0 Glucósido de decilo CS Perfume % Ingredientes (INCI) 0.1 Filantriol 40.6 Agua dem.

SA Compuesto 0.3 Policuaternio-10 1.0 Pantenol es Conservador 1.0 Laureth-3 2.0 Cloruro de sodio Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Ajustar el pH a 6-7 con ácido cítrico.

Champús % Ingredientes (INCI) A 15.00 Cocamidopropil betaína 10.00 Cocoanfodiacetato de disodio 5.00 Polisorbate 20 5.00 Glucósido de decilo CS Perfume es Conservador SA Compuesto 0.15 Cloruro de hidroxipropiltrimonio de Guar 2.00 Lauteth-3 58.00 Agua dem .

CS Ácido cítrico B 3.00 Diestearato de PEG-150 % Ingredientes (INCI) A 15.00 Cocamidopropil betaína 10.00 Cocoanfodiacetato de disodio 5.00 Polisorbate 20 5.00 Glucósido de decilo CS Perfume CS Conservador Compuesto 0.15 Cloruro de hidroxipropiltrimonio de Guar 2.00 Lauteth-3 54.00 Agua dem .

CS Ácido cítrico B 3.00 Diestearato de PEG-150 Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Ajustar el pH a 6-7. Adicionar la Fase B y calentar al máximo a 40°C.

Lociones Corporales % Ingredientes (INCI) A 2 .0 Ceteareth-25 2 .0 Ceteareth-6, Alcohol Estearxlico 3 .0 Cetearil etilhexanoato 1 .0 Dimeticona 4 .0 Alcohol cetearílico 3 .0 Estearato de Glicerilo SE 5 .0 Aceite mineral 4 .0 Aceite de semilla de Simmondsia Chinensis (Joj oba) % Ingredientes (INCI) 3.0 Aceite mineral, Alcohol lanolínico B 5.0 Propilenglicol SA Compuesto 1.0 Pantenol 0.5 Silicato de Aluminio-Magnesio CS Conservador 65.5 Agua dem.

C cs Perfume D cs Ácido cítrico % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth-25 2.0 Ceteareth-6, Alcohol Estearilico 3.0 Cetearil etilhexanoato 1.0 Dimeticona 4.0 Alcohol cetearílico 3.0 Estearato de Glicerilo SE 5.0 Aceite mineral 4.0 Aceite de semilla de Simmondsia Chinensis (Jojoba) 3.0 Aceite mineral, Alcohol lanolínico B 5.0 Propilenglicol SA Compuesto 1.0 Pantenol 0.5 Silicato de Aluminio-Magnesio CS Conservador % Ingredientes (INCI) 61.5 Agua dem. c CS Perfume D CS Ácido cítrico Producción: Calentar las Fases A y B separadamente a aproximadamente 40°C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Adicionar la Fase C a la Fase A y B combinadas y homogenizar nuevamente. Ajustar el pH con la Fase D a 6-7. Homogenizar mediante agitación y enfriar a temperatura ambiente .

Lociones Corporales % Ingredientes (INCI) A 6.0 Aceite de ricino hidrogenado PEG-7 10.0 Cetearil etilhexanoato 5.0 Miristato de isopropilo 7.0 Aceite mineral 0.5 Mantequilla de karité (Butyrospermum Parkii) 0.5 Estearato de aluminio 0.5 Estearato de magnesio 0.2 Bisabolol 0.7 Cuaternio- 18 -Hectorite B 5.0 Dipropilenglicol 0.7 Sulfato de magnesio CS Conservador 62.9 Agua dem.

C es Perfume SA Compuesto % Ingredientes (INCI) A 6.0 Aceite de ricino hidrogenado PEG-7 10.0 Cetearil etilhexanoato 5.0 Miristato de isopropilo 7.0 Aceite mineral 0.5 Mantequilla de karité (Butyrospermum Parkii) 0.5 Estearato de aluminio 0.5 Estearato de magnesio 0.2 Bisabolol 0.7 Cuaternio-18-Hectorito B 5.0 Dipropilenglicol 0.7 Sulfato de magnesio CS Conservador 58.9 Agua dem.

C CS Perfume SA Compuesto Producción: Calentar las Fases A y B separeidamente a aproximadamente 80°C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Enfriar a 40 °C y adicionar la Fase C. Homogenizar nuevamente y enfriar a temperatura ambiente .

Acondicionadores de Pelo % Ingredientes (INCI) A 10.0 Copolímero de PVP/VA 0.2 Fosfato de hidroxietil cetildimonio 0.2 Ceteareth-25 0.5 Copoliol de dimeticona % Ingredientes (INCI) CS Perfume 10.0 Alcohol SA Compuesto 68.1 Agua dem .

B 10.0 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A 10.0 Copolímero de PVP/VA 0.2 Fosfato de hidroxietil cetildimonio 0.2 Ceteareth-25 0.2 Copoliol de dimeticona CS Perfume 10.0 Alcohol SA Compuesto 64.1 Agua dem.

B 10.0 Propano/Butano Producción: Adicionar todos los compuestos a la Fase A y agitar para homogenizar . Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase B .

Acondicionadores de Espuma % Ingredientes (INCI) A 1.0 Policuaternio- 4 0.5 Fosfato de hidroxietil cetildimonio SA Compuesto CS Perfume CS Conservador % Ingredientes (INCI) 91.5 Agua dem.

B 6.0 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A 1.0 Policuaternio-4 0.5 Fosfato de hidroxietil cetildimonio SA Compuesto CS Perfume CS Conservador 87.5 Agua dem .

B 6.0 Propano/Butano Producción: Adicionar todos los compuestos a la Fase A y agitar para homogenizar . Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase B .

Acondicionadores de Espuma % Ingredientes (INCI) A 1.0 Policuaternio-4 0.5 Fosfato de hidroxietil cetildimonio Compuesto CS Perfume CS Conservador 91.5 Agua dem.

B 6.0 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) ? 1.0 Policuaternio-11 0.5 Fosfato de hidroxietil cetildimonio Compuesto CS Perfume CS Conservador 87.5 Agua dem. ? 6.0 Propano/Butano Producción: Adicionar todos los compuestos a la Fase A y agitar para homogenizar. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase B .

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A 0.5 Laureth-4 CS Perfume B 77.3 Agua dem. 10.0 Policuaternio-28 SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA 0.2 Hidroxie ilcelulosa C 10.0 HFC 152 A % Ingredientes (INCI) A 0.5 Laureth-4 CS Perfume B 77.3 Agua dem. 10.0 Policuaternio-28 SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA 0.2 Hidroxietilcelulosa C 10.0 HFC 152 A Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A 0.2 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 78.5 Agua dem. 6.7 Copolímero de crilatos 6.0 AMP SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 % Ingredientes (INCI) 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA 0.2 Hidroxietilcelulosa c 10.0 HFC 152 A % Ingredientes (INCI) A 0.2 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 74.5 Agua dem . 6.7 Copolímero de acrilatos 0.6 AMP SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimetxcona 0.2 Ceteareth- 25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA 0.2 Hidroxietilcelulosa C 10.0 HFC 152 A Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A 0.2 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume % Ingredientes (INCI) B 7.70 Policuaternio-44 SA Compuesto CS Conservador 79.3 Agua dera .

C 10.0 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A 0.2 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 7.70 Policuaternio- 4 SA Compuesto CS Conservador 75.3 Agua dem .

C 10.0 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fcise A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A 2.00 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 72.32 Agua dem. 2.00 Copolímero de VP/Acrilatos/Metacrilato de laurilo 0.53 AMP % Ingredientes (INCI) SA Compuesto 0.20 Ceteareth-25 0.50 Pantenol 0.05 Benzofenona-4 0.20 Amodimeticona, cloruro de cetrimonio, Trideceth-12 15.00 Alcohol c 0.20 Hidroxietilcelulosa D 6.00 Propano/Butano Ingredientes (INCI) A 2.00 Metosulfato de cocotriraonio CS Perfume B 68.32 Agua dem . 2.00 Copolímero de VP/Acrilatos/Metacrilato de laurilo 0.53 AMP SA Compuesto 0.20 Ceteareth-25 0.50 Pantenol 0.05 Benzofenona- 4 0.20 Amodimeticona, cloruro de cetrimonio, Trideceth-12 15.00 Alcohol C 0.20 Hidroxietilcelulosa D 6.00 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B,, agitar en la Fase A y homogenizar . Adicionar la Fase C y homogenizar nuevamente. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase D.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A 2.00 Cloruro de cetrimonio CS Perfume B 67.85 Agua dera. 7.00 Policuaternio-46 SA Compuesto 0.20 Ceteareth-25 0.50 Pantenol 0.05 Benzofenona-4 0.20 Amodimeticona , cloruro de cetrimonio, Trideceth-12 15.00 Alcohol C 0.20 Hidroxietilcelulosa D 6.00 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A 2.00 Cloruro de cetrimonio CS Perfume B 63.85 Agua dem . 7.00 Policuaternio-46 SA Compuesto 0.20 Ceteareth-25 0.50 Pantenol 0.05 Benzofenona-4 0.20 Amodimeticona, cloruro de cetrimonio, Trideceth-12 15.00 Alcohol c 0.20 Hidroxieti1celulosa D 6.00 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Adicionar la Fase C y homogenizar nuevamente-. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase D.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A es Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 CS Perfume 85.5 Agua dem .

B 7.0 Sulfato de poliestireno sódico SA Compuesto 0.5 Bromuro de cetrimonio CS Conservador C 6.0 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A CS Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 CS Perfume 81.5 Agua dem.

B 7.0 Sulfato de poliestireno sódico SA Compuesto 0.5 Bromuro de cetrimonio CS Conservador C 6.0 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver, la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Espumado de Estilizado % Ingredientes (INCI) A CS Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 CS Perfume 92.0 Agua dem.

B 0.5 Policuaternio- 10 1.0 Compuesto 0.5 Bromuro de cetrimonio CS Conservador C 6.0 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A CS Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 CS Perfume 88.0 Agua dem.

B 0.5 Policuaternio-10 5.0 Compuesto 0.5 Bromuro de cetrimonio CS Conservador C 6.0 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A . y homogenizar. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Espumado de Estilizado % ' Ingredientes (INCI) A CS Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 CS Perfume 82.5 Agua dem .

B 10.0 Policuaternio- 16 SA Compuesto 0.5 Fosfato de hidroxietil cetildimonio CS Conservador C 6.0 Propano/Butano % Ingredientes (INCI) A CS Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 CS Perfume 87.5 Agua dem.

B 10.0 Policuaternio- 16 SA Compuesto 0.5 Fosfato de hidroxietil cetildimonio CS Conservador C 6.0 Propano/Butano Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar. Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Espumas de Estilizado % Ingredientes (INCI) A 2.0 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 84.0 Agua dem. 2.0 Citosan SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA C 10.0 HFC 152 A % Ingredientes (INCI) A 2.0 Metosulfato de cocotrimonio CS Perfume B 80.0 Agua dera. 2.0 Citosan SA Compuesto 0.5 Copoliol de dimeticona 0.2 Ceteareth-25 0.2 Pantenol 0.1 PEG-25 PABA C 10.0 HFC 152 A Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Disolver la Fase B, agitar en la Fase A y homogenizar . Ajustar el pH a 6-7. Llenar en el recipiente apropiado y cargar con la Fase C.

Champús % Ingredientes (INCI) A 30.0 Laureth sulfato de sodio 6.0 Cocoanfoacetato de sodio 6.0 Cocamidopropil betaína 3.0 Laureth sulfato de sodio, diestearato de glicol, cocamida MEA, laureth- 10 SA Compuesto 7.7 Policuaternio-44 ¡ 2.0 Amodimeticona CS Perfume % Ingredientes (INCI) CS Conservador 1.0 Cloruro de sodio 43.3 Agua dem.

B CS Ácido cítrico % Ingredientes (INCI) A 30.0 Laureth sulfato de sodio 6.0 Cocoanfoacetato de sodio 6.0 Cocamidopropil betaína 3.0 Laureth sulfato de sodio, diestearato de glicol, cocamida MEA, laureth- 10 SA Compuesto 7.7 Policuaternio-44 2.0 Amodimeticona CS Perfume CS Conservador 1.0 Cloruro de sodio 39.3 Agua dem .

Geles de Ducha % Ingredientes (INCI) A 40.0 Laureth sulfato de sodio 5.0 Glucósido de decilo 5.0 Cocamidopropil betaína SA Compuesto % Ingredientes (INCI) 1.0 Pantenol es Perfume es Conservador 2.0 Cloruro de sodio 46.0 Agua dem .

B es Ácido cítrico % Ingredientes (INCI) A 40.0 Laureth sulfato de sodio 5.0 Glucósido de decilo 5.0 Cocamidopropil betaína SA Compuesto 1.0 Pantenol es Perfume es Conservador 2.0 Cloruro de sodio 42.0 Agua dem .

B es Ácido cítrico Producción: Pesar los compuestos de la Faise A y mezclarlos. Ajustar el pH a 6-7 con ácido cítrico.

Champús % Ingredientes (INCI) A 40.0 Laureth sulfato de sodio 5.0 Sulfonato C12-15 Pareth-15 de sodio 5.0 Glucósido de decilo CS Perfume 0.1 Fintantriol % Ingredientes (INCI) 44.6 Agua dem.

SA Compuesto 0.3 POlicuaternio-10 1.0 Pantenol CS Conservador 1.0 Laureth- 3 2.0 Cloruro de sodio % Ingredientes (INCI) A 40..0 Laureth sulfato de sodio 5.0 Sulfonato C12-15 Pareth-15 de sodio 5.0 Glucósido de decilo CS Perfume 0.1 Fintantriol 40.6 Agua dem .

SA Compuesto 0.3 Policuaternio- 10 1.0 Pantenol CS Conservador 1.0 Laureth-3 2.0 Cloruro de sodio Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Ajustar el pHa 6-7 con ácido cítrico.

Champús % Ingredientes (INCI) A 15.00 Cocamidopropil betaína 10.00 Cocoanfodiacetato de disodio 5.0 Polisorbate-20 5.0 Glucósido de decilo CS Perfume CS Conservador SA Compuesto 0.15 Cloruro de hidroxipropiltrimonio de Guar 2.00 Laureth- 3 54.00 Agua dem .

CS Ácido cítrico B 3.00 Diestearato PEG-150 Producción: Pesar los compuestos de la Fase A y mezclarlos. Ajustar el pH a 6-7. Adicionar la Fase B y calentar al máximo a 40°C.

Lociones Corporales % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth-25 2.0 Ceteareth-6, Alcohol Estearílico 3.0 Cetearil etilhexanoato 1.0 Dimeticona 4.0 Alcohol cetearílico 3.0 Estearato de Glicerilo SE 5.0 Aceite mineral 4.0 Aceite de semilla de Simmondsia Chinensis (Jojoba) 3.0 Aceite mineral, Alcohol lanolínico B 5.0 Propilenglicol SA Compuesto 1.0 Pantenol 0.5 Silicato de Aluminio-Magnesio CS Conservador 65.5 Agua dem.

C CS Perfume D CS Ácido cítrico % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth-25 2.0 Ceteareth-6, Alcohol Estearílico 3.0 Cetearil etilhexanoato % Ingredientes (INCI) 1.0 Dimeticona 4.0 Alcohol cetearílico 3.0 Estearato de Glicerilo SE 5.0 Aceite mineral 4.0 Aceite de semilla de Simmondsia Chinensis (Jojoba) 3.0 Aceite mineral, Alcohol lanolínico B 5.0 Propilenglicol SA Compuesto 1.0 Pantenol 0.5 Silicato de Aluminio-Magnesio CS Conservador 61.5 Agua dem.

C CS Pe fume D CS Ácido cítrico Producción: Calentar las Fases A y B separadamente a aproximadamente 40°C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Adicionar la Fase C a la Fase A y B combinada y homogenizar nuevamente. Ajustar el pH con la Fase D a 6-7. Homogenizar mediante agitación y enfriar a temperatura ambiente .

Lociones Corporales % Ingredientes (INCI) A 6.0 Aceite de ricino hidrogenado PEG-7 10.0 Cetearil etilhexanoato 5.0 Miristato de isopropilo % Ingredientes (INCI) 7.0 Aceite mineral 0.5 Mantequilla de karité (Butyrospermum Parkii) 0.5 Estearato de aluminio 0.5 Estearato de magnesio 0.2 Bisabolol 0.7 Cuaternio-18-Hectorite B 5.0 Dipropilenglicol 0.7 Sulfato de magnesio CS Conservador 62.9 Agua dem .

C CS Perfume ?? Compuesto % Ingredientes (INCI) A 6.0 Aceite de ricino hidrogenado PEG-7 10.0 Cetearil etilhexanoato 5.0 Miristato de isopropilo 7.0 Aceite mineral 0.5 Mantequilla de karité (Butyrospermum Parkii) 0.5 Estearato de aluminio 0.5 Estearato de magnesio 0.2 Bisabolol 0.7 Cuaternio-18-Hectorito B 5.0 Dipropilenglicol 0.7 Sulfato de magnesio CS Conservador 58.9 Agua dem .

% Ingredientes (INCI) c es Perfume SA Compuesto Producción: Calentar las Fases A y B separadamente a aproximadamente 80 °C. Adicionar la Fase B a la FcLse A y homogenizar mediante agitación. Enfriar a 40°C y adicionar la Fase C. Homogenizar nuevamente y enfriar a temperatura ambiente .

Cuidado Diario de la Piel, O/ % Ingredientes (INCI) A 1.7 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 0.7 Ceteareth-25 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 2.0 Dimeticona de PEG-14 3.6 Alcohol cetearílico 6.0 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Adipato de dibutilo B 5.0 Glicerina 0.2 EDTA disódico 1.0 Pantenol CS Conservador 67.8 Agua dem.

C 4.0 Triglicérido caprílico/cáprico, Copolímero de acrilatos de sodio % Ingredientes (INCI) D 0.2 Fosfato de ascorbilo de sodio 1.0 Acetato de tocoferilo 0.2 Bisabolol 1.0 Triglicérido caprílico/cáprico, Ascorbato de sodio, Tocoferol, Retinol SA Compuesto E CS Hidróxido de sodio % Ingredientes (INCI) A 1.7 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 0.7 Ceteareth-25 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 2.0 Dimeticona de PEG-14 3.6 Alcohol cetearílico 6.0 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Adipato de dibutilo B 5.0 Glicerina 0.2 EDTA disódico 1.0 Pantenol cs Conservador 63.8 Agua dem .

C 4.0 Triglicérido caprílico/cáprico, Copolímero de acrilatos de sodio D 0.2 Fosfato de ascorbilo de sodio 1.0 Acetato de tocoferilo 0.2 Bisabolol 1.0 Triglicérido caprílico/cáprico, Ascorbato de % Ingredientes (INCI) sodio, Tocoferol, Retinol SA Compuesto E CS Hidróxido de sodio Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 80°C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Adicionar la Fase C a la Fase A y B combinada y homogenizar nuevamente. Enfriar a aproximadamente a 40°C y adicionar la Fase D. Ajustar el pH con la Fase E a aproximadamente 6.5. Homogenizar mediante agitación y enfriar a temperatura ambiente.

Crema Protectora de Dia para la Piel, O/W % Ingredientes (INCI) A 1.7 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 0.7 Ceteareth-25 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 2.0 Dimeticona de PEG-14 3.6 Alcohol cetearilico 6.0 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Adipato de dibutilo B 5.0 Glicerina 0.2 EDTA disódico 1.0 Pantenol CS Conservador 67.8 Agua dem .

C 4.0 Triglicérido caprílico/cáprico, Copolímero de % Ingredientes (INCI) acrilatos de sodio D 1.0 Fosfato de ascorbilo de sodio 1.0 Acetato de tocoferilo 0.2 Bisabolol SA Compuesto E CS Hidróxido de sodio % Ingredientes (INCI) A 1.7 Ceteareth-6, Alcohol estearílico 0.7 Ceteareth-25 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 2.0 Dimeticona de PEG-14 3.6 Alcohol cetearílico 6.0 Etilhexil metoxicinatnato 2.0 Adipato de dibutilo B 5.0 Glicerina 0.2 EDTA disódico 1.0 Pantenol CS Conservador 67.6 Agua dem .

C 4.0 Triglicérido caprílico/cáprico, Copolímero de acrilatos de sodio D 1.0 Fosfato de ascorbilo de sodio 1.0 Acetato de tocoferilo 0.2 Bisabolol Compuesto E CS Hidróxido de sodio Producción: Calentar la Fase A Y B separadamente a aproximadamente 80°C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Adicionar la Fase C a la Fase A y B combinada y homogenizar nuevamente . Enfriar a aproximadamente 40°C y adicionar la Fase D. Ajustar el pH con la Fase E a aproximadamente 6.5. Homogenizar mediante agitación y enfriar a temperatura ambiente.

Limpiador Facial, O/W % Ingredientes (INCI) A 10.0 Cetearil etilhexanoato 10.0 Triglicérido caprílico/cáprico 1.5 Ciclopentasiloxano, Ciclohexasilosano 2.0 Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 B 3.5 Triglicérido caprílico/cáprico, Copolímero de acrilatos de sodio C 1.0 Acetato de tocoferol 0.2 Bisabolol es Conservador CS Perfume D 3.0 Policuaternio- 44 0.5 Metosulfato de cocotrimonio 0.5 Ceteareth-25 2.0 Pantenol, propilenglicol 4.0 Propilenglicol 0.1 EDTA disódico SA Compuesto % Ingredientes (INCI) 60.7 Agua dem .

% Ingredientes (INCI) A 10.0 Cetearil etilhexanoato 10.0 Triglicérido caprílico/cáprico 1.5 Ciclopentasiloxano, Ciclohexasilosano 2.0 Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 B 3.5 Triglicérido caprilico/cáprico, Copolímero de acrilatos de sodio C 1.0 Acetato de tocoferol 0.2 Bisabolol CS Conservador CS Perfume D 3.0 Policuaternio-44 0.5 Metosulfato de cocotrimonio 0.5 Ceteareth-25 2.0 Pantenol, propilenglicol 4.0 Propilenglicol 0.1 EDTA disódico SA Compuesto 56.7 Agua dem .

Producción: Disolver la Fase A y adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Adicionar la Fase C a la A y B combinada y homogenizar nuevamente. Adicionar la Fase D a la Fase A, B y C combinada y homogenizar nuevamente. Disolver la Fase D y adicionar a la Fase A, B, y C y homogenizar nuevamente. Agita durante 15 minutos. Aspersión Corporal de Cuidado Diario Ingredientes (INCI) A 3.0 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 1.0 Policuaternio-44 3.0 Propilenglicol 2.0 Pantenol, propilenglicol 1.0 Ciclopentasiloxano , ciclohexasiloxano 10.0 Octildodecanol 0.5 PVP 10.0 Triglicérido caprílico/cáprico 3.0 C12-15 alquilo benzoato 3.0 Glicerina 1.0 Acetato de tocoferilo 0.3 Bisabolol SA Compuesto 59.2 Alcohol % Ingredientes (INCI) A 3.0 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 1.0 Policuaternio-44 3.0 Propilenglicol 2.0 Pantenol, propilenglicol 1.0 Ciclopentasiloxano, ciclohexasiloxano 10.0 Octildodecanol 0.5 PVP % Ingredientes (INCI) 10.0 Triglicérido caprílico/cáprico 3.0 C12-15 alquil benzoato 3.0 Glicerina 1.0 Acetato de tocoferilo 0.3 Bisabolol SA Compuesto 55.2 Alcohol Producción: Pesar todos los ingredientes de la Fase A y disolver completamente mediante agitación.

Gel de Cuidado para Piel % Ingredientes (INCI) A 3.6 Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 15.0 Alcohol 0.1 Bisabolol 0.5 Acetato de tocoferol CS Perfume B 3.0 Pantenol 0.6 Carbómero SA Compuesto 75.4 Agua dem .

C 0.8 Trietanolamina % Ingredientes (INCI) A 3.6 Aceite de ricino hidrogenado de PEG-40 15.0 Alcohol % Ingredientes (INCI) 0.1 Bisabolol 0.5 Acetato de tocoferol CS Perfume B 3.0 Pantenol 0.6 Carbómero SA Compuesto 71.4 Agua dem .

C 0.8 Trietanolamina Producción: Disolver la Fase A. Hinchar la Fase B y neutralizar con la Fase C. Adicionar la Fase A a la Fase B y C y homogenizar mediante agitación.

Lociones para Después de Afeitar % Ingredientes (INCI) A 10.0 Ceteraril etilhexanoato 5.0 Acetato de tocoferilo 1.0 Bisabolol 0.1 Perfume 0.3 Polímero entrelazado de acrilatos/C10-C30 alquil acrilato B 15.0 Alcohol 1.0 Pantenol 3.0 Glicerina SA Compuesto 1.0 Trietanolamina 63.5 Agua dem.

% Ingredientes (INCI) A 10.0 Ceteraril etilhexanoato 5.0 Acetato de tocoferilo 1.0 Bisabolol 0.1 Perfume 0.3 Polímero entrelazado de acrilatos/C10-C30 alquil acrilato B ' 15.0 Alcohol 1.0 Pantenol 3.0 Glicerina SA Compuesto 1.0 Trie anolamina 59.5 Agua dem .

Producción: Disolver la Fase A. Disolver la Fase B y adicionar a la Fase A. Homogenizar mediante agitación.

Lociones para Después del Sol % Ingredientes (INCI) A 0.4 Polímero entrelazado de acrilatos/C10-C30 alquil acrilato 15.0 Cetearil etilhexanoato 0.2 Bisabolol 0.1 Acetato de tocoferol es Perfume B 1.0 Pantenol 15.0 Alcohol 3.0 Glicerina SA Compuesto 63.2 Agua dem.

% Ingredientes (INCI) c 0.2 Trietanolamina % Ingredientes (INCI) A 0.4 Polímero entrelazado de acrilatos/C10-C30 alquil acrilato 15.0 Cetearil etilhexanoato 0.2 Bisabolol 0.1 Acetato de tocoferol CS Perfume B 1.0 Pantenol 15.0 Alcohol 3.0 Glicerina SA Compuesto 59.2 Agua dem.

C 0.2 Trietanolamina Producción: Disolver la Fase A. Disolver la Fase B y adicionar a la Fase A. Homogenizar mediante agitación. Neutralizar la Fase A y B mediante la adición de la Fase C y homogenizar nuevamente.

Lociones de Bloqueador de Sol % Ingredientes (INCI) A 4.5 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 3.0 Octocrileno 2.5 DÍ-C12-13 alquil malato 0.5 Acetato de tocoferilo % Ingredientes (INCI) 4.0 Diestearato de poligliceril-3-metil glucosa B 3.5 Cetearil isononanoato 1.0 Copolímero de VP/Eicoseno 5.0 Isohexadecano 2.5 DÍ-C12-13 alquil malato 3.0 Dióxido de titanio, Triraetoxicaprililsilano C 5.0 Glicerina 1.0 Cetearil sulfato de sodio 0.5 Goma de xantano 59.7 Agua dem .

D SA Compuesto 1.0 Fenoxietanol , Metiparabeno, Etilparabeno, Butilparabeno, Propilparabeno, 11sobutilparabeno 0.3 Bisabolol % Ingredientes (INCI) A 4.5 Etilhexil raetoxicinamato 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 3.0 Octocrileno 2.5 DÍ-C12-13 alquil malato 0.5 Acetato de tocoferilo 4.0 Diestearato de poligliceril-3-metil glucosa B 3.5 Cetearil isononanoato 1.0 Copolímero de VP/Eicoseno 5.0 Isohexadecano 2.5 DÍ-C12-13 alquil malato % Ingredientes (INCI) 3.0 Dióxido de titanio, Trimetoxicaprililsilano c 5.0 Glicerina 1.0 Cetearil sulfato de sodio 0.5 Goma de xantano 55.7 Agua dem .

D SA Compuesto 1.0 Fenoxietanol , Metiparabeno, Etilparabeno, Butilparabeno, Propilparabeno, Isobutilparabeno 0.3 Bisabolol Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 80 °C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Calentar la Fase C a 80°C y adicionar a la Fase A y B combinada y homogenizar nuevamente. Enfriar a aproximadamente 40°C y adicionar la fase D. Homogenizar nuevamente.

Lociones de Bloqueador de Sol, O/W % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth- 6 , alcohol estearílico 2.0 Ceteareth-25 3.0 Tribehenina 2.0 Alcohol cetearílico 2.0 Cetearil etilhexanoato 5.0 Etilhexil metoxicinamato % Ingredientes (INCI) 1.0 Etilhexil triazona 1.0 Copolimero de VP/Eicoseno 7.0 Miristato de isopropilo B 5.0 Óxido de zinc, trietroxicaprililsilano C 0.2 Goma de xantano 0.5 Acrilato de hidroxietilo/Copolímero de acriloildimetil traurato de sodio, Escualeno Polisorbato 60 0.2 EDTA disódico 5.0 Propilenglicol 0.5 Pantenol 60.9 Agua dem .

D SA Compuesto 0.5 Fenoxietanol, Metiparabeno, Etilparabeno, Butilparabeno , Propilparabeno, Ilsobutilparabeno 1.0 Acetato de tocoferilo 0.2 Bisabolol % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth-6, alcohol estearílico 2.0 Ceteareth-25 3.0 Tribehenina 2.0 Alcohol cetearílico 2.0 Cetearil etilhexanoato 5.0 Etilhexil metoxicinamato % Ingredientes (INCI) 1.0 Etilhexil triazona 1.0 Copolímero de VP/Eicoseno 7.0 Miristato de isopropilo B 5.0 Óxido de zinc, trietroxicaprililsilano C 0.2 Goma de xantano 0.5 Acrilato de hidroxietilo/Copolímero · de acriloildimetil taurato de sodio, Escualeno Polisorbate 60 0.2 EDTA disódico 5.0 Propilenglicol 0.5 Pantenol 59.9 Agua dem.

D SA Compuesto 0.5 Fenoxietanol , Metiparabeno, Etilparabeno, Butilparabeno , Propilparabeno, Ilsobutilparabeno 1.0 Acetato de tocoferilo 0.2 Bisabolol Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 80°C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Calentar la Fase C a 80°C y adicionar a la Fase A y B combinada y homogenizar nuevamente. Enfriar a aproximadamente 40°C y adicionar la fase D. Homogenizar nuevamente.

Lociones de Bloqueador de Sol, 0/W % Ingredientes (INCI) A 3.5 Ceteareth-6, alcohol estearílico 1.5 Ceteareth-25 7.5 Etilhexil metoxicinamato 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 2.0 Ciclopentasiloxano, ciclohexasi1oxano 0.5 Cera de abejas 3.0 Alcohol cetearílico 10.0 Triglicérido caprílico/cáprico B 5.0 Dióxido de titanio, Sílice, Meticona, Alúmina C 3.0 Glicerina 0.2 EDTA disódico 0.3 Goma de xantano 1.0 Glucósido de decilo 2.0 Pantenol, propilenglicol 56.3 Agua dem .

D SA Compuesto 1.0 Acetato de tocoferol 0.2 Bisabolol CS Perfume CS Conservador % Ingredientes (INCI) A 3.5 Ceteareth-6, alcohol estearílico 1.5 Ceteareth-25 7.5 Etilhexil metoxicinamato % Ingredientes (INCI) 2.0 Benzoato de dietilamino hidroxibenzoil hexilo 2.0 Ciclopentasiloxano, ciclohexasiloxano 0.5 Cera de abejas 3.0 Alcohol cetearílico 10.0 Triglicérido caprílico/cáprico B 5.0 Dióxido de titanio, Sílice, Meticona, Alúmina C 3.0 Glicerina 0.2 EDTA disódico 0.3 Goma de xantano 1.0 Glucósido de decilo 2.0 Pantenol, propilenglicol 52.3 Agua dem .

D SA Compuesto 1.0 Acetato de tocoferol 0.2 Bisabolol CS Perf me CS Conservador Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 80 °C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Calentar la Fase C a 80°C y adicionar a la A y B combinada y homogenizar nuevamente. Enfriar a aproximadamente 40°C y adicionar la Fase D. Homogenizar nuevamente.

Bálsamo para Pies % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth-6, alcohol estearílico 2.0 Ceteareth-25 5.0 Etilhexil metoxicinamato 4.0 Alcohol cetilico 4.0 Estearato de glicerilo 5.0 Aceite mineral 0.2 Mentol 0.5 alcanfor B 69.3 Agua dem .

CS Conservador C 1.0 Bisabolol 1.0 Acetato de tocoferol D SA Compuesto 5.0 Extracto de Hamamelis % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth-6, alcohol estearílico 2.0 Ceteareth-25 5.0 Cetearilo Etilhexanoato 4.0 Alcohol cetilico 4.0 Estearato de glicerilo 5.0 Aceite mineral 0.2 Mentol 0.5 alcanfor B 65.3 Agua dem.

CS Conservador % Ingredientes (INCI) c 1.0 Bisabolol 1.0 Acetato de tocoferol D SA Compuesto 5.0 Extracto de Hamamelis Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 80°C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Enfriar a aproximadamente 40°C y adicionar la Fase C y D. Homogenizar mediante agitación y enfriar a temperatura ambiente /O % Ingredientes (INCI) A 6.0 Aceite de ricino hidrogenado PEG-7 8.0 Cetearil etilhexanoato 5.0 Miristato de isopropilo 15.0 Aceite mineral 0.3 Estearato de magnesio 0.3 Estearato de aluminio 0.2 Copolímero de PEG-45/docecil glicol B 5.0 Glicerina 0.7 Sulfato de magnesio 55.6 Agua dem.

C 1.0 Compuesto 0.5 Acetato de tocoferol 0.6 Bisabolol % Ingredientes (INCI) A 6.0 Aceite de ricino hidrogenado PEG-7 8.0 Cetearil etilhexanoato 5.0 Miristato de isopropilo 15.0 Aceite mineral 0.3 Estearato de magnesio 0.3 Estearato de aluminio 0.2 Copolímero de PEG-45/docecil glicol B 5.0 Glicerina 0.7 Sulfato de magnesio 51.6 Agua dem.

C 5.0 Compuesto 0.5 Acetato de tocoferol Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 85 °C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Enfriar a aproximadamente 40°C y adicionar la Fase C. Homogenizar mediante agitación y enfriar a temperatura ambiente .

Maquillaje Líquido - Tipo 0/W % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth-6, alcohol estearílico 2.0 Ceteareth-25 6.0 Estearato de glicerilo 1.0 Alcohol cetílico 8.0 Aceite mineral 7.0 Cetearil etilhexanoato % Ingredientes (INCI) 0.2 Dimeticona B 3.0 Propilenglicol 1.0 Pantenol CS Conservador 61.9 Agua dem.

C 0.1 Bisabolol SA Compuesto CS Perfume D 5.7 C.I. 77 891, Dióxido de titanio 1.1 Óxidos de hierro % Ingredientes (INCI) A 2.0 Ceteareth-6, alcohol estearílico 2.0 Ceteareth-25 6.0 Estearato de glicerilo 1.0 Alcohol cetílico 8.0 Aceite mineral 7.0 Cetearil etilhexanoato 0.2 Dimeticona B 3.0 Propilenglicol 1.0 Pantenol CS Conservador 57.9 Agua dem.

C 0.1 Bisabolol SA Compuesto CS Perfume D 5.7 C.I. 77 891, Dióxido de titanio % Ingredientes (INCI) 1.1 Óxidos de hierro Producción: Calentar la Fase A y B separadamente a aproximadamente 80°C. Adicionar la Fase B a la Fase A y homogenizar mediante agitación. Enfriar a 40°C y adicionar la Fase C y D. Homogenizar nuevamente y enfriar a temperatura ambiente .

Base Ingrediente Nombre INCI % Fase de agua Dow Corning 9011 Ciclopentasiloxano, Copolímero de 15.00 Mezcla de elastómeros dimeticona de PEG-12 Fluido Dow Corning Ciclopentasiloxano 5.00 245 Silcare 31 M50 SV Caprilil trimeticona 6.35 Propilparabeno 0.05 AS 5811 Dióxido de titanio, 7.50 Trietoxicaprililsilano AS 5131 Óxidos de hierro, 0.70 Trietoxicaprililsilano AS 5146 Óxidos de hierro, 0.05 Trietoxicaprililsilano AS 5126 Óxidos de hierro, 0.35 Trietoxicaprililsilano AS 50230 Talco, Trietoxicaprililsilano 3.50 Fase de Aceite Los pigmentos (AS 5811, 5131, 5146, 5126 y 50230; Color Techniques) y propilparabeno se dispersan en Silcare SV 31 M50 (Clariant) , agitando hasta ser húmedos. La mezcla entonces se hace pasar sobre un molino de tres rodillos a ajuste estrecho hasta que el tamaño de partícula es <10µ??. Entonces, se combinan la mezcla de elastómeros DC 9011 (Dow Corning) y el fluido DC 245 en el recipiente de terminación, agitando hasta homogéneo. La molienda de color se adiciona con agitación lenta de homogenizador . El agua se pesa en un recipiente separado y gradualmente se adiciona el compuesto con agitación del propulsor, agitando hasta que se disuelva. Se adicionan metilparabeno y ácido benzoico a butilenglicol. La mezcla se calienta ligeramente, y se agita hasta que se disuelve. La mezcla se enfría a 30°C y se adiciona a la solución que contiene el compuesto. La fase de agua se adiciona lentamente a la fase de aceite con agitación rápida. Cuando se termina la agitación, la preparación se homogeniza durante cinco minutos. Esta preparación es útil como una base de maquillaje para aplicación a la piel.

Formulación de Máscara Los ingredientes tanto de una preparación control como de una máscara que contiene 2 % son como sigue Nombre Comercial Nombre INCI % de % de control compuesto Fase # Fase de agua 1 2 1 Agua desionizada 42.96 42.96 2 Butilenglicol 5.00 5.00 2 Metilparabeno 0.30 0.30 3 33-5198 (Negro) Óxidos de 10.00 10.00 hierro (Sol) 4 Natrosol 250 MR Hidroxietilcelulosa 0.20 0.20 (Escualo) 5 KOH al 10 % Hidróxido de 0.01 0.01 potasio 6 Arlacel 165 Estearato de 3.00 3.00 glicerilo , Estearato de PEG- 100 (Uniqema) 7 Ácido cítrico al 10 0.27 0.27 Fase # Fase de cera 8 Arlacel 165 1.00 1.00 8 Cesarint SD Estearato de 3.50 3.50 glicerilo (ISP) Fase # Fase de cera 8 Cera de abejas Blanco SP 242 Cera 7.50 7.50 de abejas (S&P) 8 Carnauba #1 Copermica 4.80 4.80 Cerífera (Carnauba) Cera (S&P) 8 Propilparabeno 0.10 0.10 9 Agua desionizada 20.00 20.00 9 Compuesto/Agua al 10 % 10 Agua desionizada 1.00 1.00 10 Glidant DMDM Hidantoina 0.36 0.36 (Lonza) 100.00 100.00 Para producir la formulación de máscara, se combina la fase de cera 8 y se calienta a 85-90°C con un mezclado con propulsor. La solución del compuesto al 10% se prepara al adicionar un compuesto al agua mientras mezclado con propulsor. Se adiciona el agua de la fase 1 a un recipiente de acero inoxidable tarado (se adicionan aproximadamente 50 g en exceso para compensar la pérdida) . Se adiciona el metilparabeno de la fase 2 a butilenglicol y se agita mientras el calentamiento sobre la parte superior de un baño de vapor hasta disolverse, luego se adiciona al agua con lenta agitación de homomezclador . Entonces, se adiciona el óxido de hierro negro de la fase 4, mientras que se mantiene la agitación. Entonces, se espolvorea Natrosol dentro, mientras se mantiene la agitación. Se adiciona el KOH al 10%, y se el calentamiento se inicia a 85°C, con el recipiente recubierto tan fuerte como sea posible. Cuando se disuelve Natrosol, se adiciona el ácido cítrico al 10% gota a gota, manteniendo la temperatura y la agitación. Entonces, se adiciona el Arlacel 165 lentamente y se mezcla durante al menos 5 minutos para asegurar la disolución. A 85-90°C, se adiciona lentamente la fase de cera a la fase de agua mientras el homomezclado . Se mantienen la temperatura y la agitación durante 10 minutos. El lote se remueve del baño de vapor y se deja enfriar mientras el homomezclado con el raspado a mano ocasional de las paredes del recipiente. A 55°C, el lote se pesa para verificar la pérdida de agua. El mezclado se reanuda y se adiciona agua nuevamente, si es necesario. A 45°C, se adicionan las fases 9 y 10. Se continúa el enfriamiento usando agua fría a 30°C. En este punto, el raspado a mano continuo de las paredes del recipiente es necesario.

En esta preparación, la cantidad pequeña de KOH (en la fase 5) se usa para elevar el pH para dispersar el Natrosol el cual se recubre con glioxal para retardar la humectación, y prevenir la aglomeración. En la fase 7 , se adiciona ácido cítrico lentamente para ajustar el pH a ~5.5 , por debajo del punto isoeléctrico de los óxidos de hierro. En las fases 7 y 8, el Arlacel 165 se divide entre las fases de aceite y agua, ya que el emulsionamiento es más fácil de realizar con el agente tensioactivo en ambas fases. En la fase 9, se adiciona agua desionizada en el lote de control en lugar del compuesto. La solución del compuesto se prepara mientras que la emulsión está siendo procesada, por lo que es absolutamente fresca. Esta preparación proporciona una formulación adecuada para el uso como una máscara.

Ejemplo 18.- Inhibición del Crecimiento de Pelo En este ejemplo, se describen los experimentos para determinar la habilidad de las composiciones de la presente invención para inhibir el crecimiento del pelo. En particular, estos experimentos se conducen para estimar la habilidad de las composiciones de la presente invención para disminuir el crecimiento del pelo después de la depilación mediante afeitado o uso de cremas o ceras depiladoras.

Una loción para inhibir el crecimiento de pelo y que contiene un BBPI variante, modificado en el cual la asa de quimiotripsina del BBPI de origen se reemplaza con un péptido de unión a VEGF preparado de acuerdo a la siguiente formulación (A) : Ingrediente (nombre INCI) % en peso Agua 88.97 Alcohol cetearílico 8.50 Ceteareth-20 2.70 Éter estearílico de PPG-15 0.60 Prunus Amydalus Dulcís Oil (1) 0.10 Líquido de parafina 0.10 Alantoína 0.20 Propilenglicol 0.13 Dióxido de titanio C177891 0.17 EDTA tetra sódico 0.10 VEGF-BBPI 0.10 Cloruro de sodio 0.091 Ácido cítrico 0.11 Hidróxido de sodio 0.034 Fenoxietanol 1.0 Robertet Artlande G10029876 (2) 0.10 La composición incluye al menos un tipo de VEGF-BBPI seleccionado de SEQ ID NOS: 601, 602, 627-631, 643, 491, 632-636. En algunas modalidades, la composición comprende al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco diferentes tipos de VEGF-BBPI seleccionados de SEQ ID NOS: 601, 602, 627-631, 643, 491, 632-636. La formulación comprende el VEGF-BBPI manufacturado como sigue: 1) Mezclar el emulsionante de alcohol graso y el agente gelificante de aceite conjuntamente en la fase fundida a una temperatura de 60, de manera preferente 70°C o más, 2) emulsionar la fase fundida en una fase acuosa, la temperatura de la fase acuosa antes del emulsionamiento que es 50°C, de manera preferente 60°C, más de manera preferente 70°C o más, mediante lo cual una emulsión se forma, 3) enfriar la emulsión a una temperatura de 35°C o menos , 4) dispersar el perfume, conservador, solución reguladora de ácido cítrico en la emulsión. 5) adicionar de la misma manera la solución de VEGF-BBPI, terminando con la solución reguladora durante un período de aproximadamente 5 minutos . 6) Agitar la mezcla durante uno 10 minutos adicionales .

Una formulación de control (B) se prepara de acuerdo con el método descrito para la preparación de la formulación A pero excluyendo el VEGF-BBPI .

Experimentos del vello facial En estos experimentos, un grupo (por ejemplo, 5) de varones se prueban con la Clasificación de Piel Fitzpatrick II. Se pide a los individuos utilizar tratamiento facial no tópico antes de comenzar los experimentos. En el día 1, el crecimiento del vello facial se evalúa visualmente y se fotografía. Después de esta evaluación y fotografía, las composiciones son probadas, así como se aplica un control de vehículo a las concentraciones deseadas . Comenzando en el día 2, los individuos aplican las composiciones inmediatamente después del afeitado. Ningún otro tratamiento se usa antes o después del afeitado para la duración de los experimentos. En la mayoría de los casos, el experimento continúa durante un período de tiempo de 30 a 45 días. El crecimiento vello facial se evalúa visualmente y se fotografía cada tres veces al día durante los experimentos. La cantidad de pelo, así como la longitud y el ancho del eje del cabello se miden usando en análisis de imagen computarizado . En modalidades preferidas, hay una disminución en la cantidad de pelo, grueso de pelo y/o longitud del pelo debido a la aplicación de los compuestos de prueba.

Experimentos de pelo o vello de la pierna En estos experimentos, un grupo (por ejemplo, 5) de mujeres se prueban con Clasificación de Piel de Fitzpatrick II· Se pide a los individuos utilizar el tratamiento de pierna no tópico antes de comenzar los experimentos. En el día 1, las áreas de ambas piernas de cada individuo se marcan y el crecimiento de pelo se evalúa visualmente y se fotografía. Después de esta evaluación y la fotografía, las composiciones que son probadas se aplican a las concentraciones deseadas. Después de esta evaluación y fotografía, las composiciones que son probadas (es decir, compuestos de prueba que contienen una concentración deseada de VEGF-BBP) , así como un control de vehículo, se aplican a las concentraciones deseadas. En algunos métodos, se proporciona a cada individuo con dos tubos, uno de los cuales contiene el VEGF-BBPI y el otro que contiene el control de vehículo. Estos tubos se marcan "izquierda" y "derecha" . Cada día durante los experimentos, el sujeto aplica las composiciones en los dos tubos de las piernas respectivas. Después de 7 días de aplicación, los individuos se evalúan visualmente y se toman las fotografías. Ambas piernas luego se afeitan o se exponen a un depilador y los individuos de prueba continúan aplicando las composiciones como antes. El crecimiento del pelo luego se evalúa visualmente y al fotografiar las áreas apropiadas en las piernas cada 2 días . Después de 10 días, las piernas se afeitan nuevamente y los sujetos de prueba continúan aplicando las composiciones como antes. En algunos métodos, los experimentos se llevan a cabo durante 3 ciclos y el crecimiento de pelo o vello se evalúa visualmente y se tomaron las fotografías. Los experimentos luego se continúan durante 8 días adicionales. En modalidades preferidas, hay una disminución en la cantidad de pelos, grueso del pelo y/o longitud del pelo debido a la aplicación de los compuestos de prueba en las áreas marcadas.

Comenzando el día 2, los individuos aplican las composiciones inmediatamente después del afeitado. Ningún otro tratamiento se usa antes o después del afeitado durante la duración de los experimentos. En la mayoría de los casos, el experimento continúa durante un período de tiempo de 30 a 45 días. El crecimiento del vello facial se evalúa visualmente y se fotografía cada tercer día durante los experimentos. El número de pelos, así como longitud y el ancho del eje del cabello se miden usando el análisis de imagen computerizado. En modalidades preferidas, hay una disminución en el número de pelos, grueso del pelo y/o longitud del pelo debido a la aplicación de los compuestos de prueba .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un inhibidor de proteasa de Bowman Birk (BBPI) variante, modificado, aislado, caracterizado porcpj.e la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular de BBPI es un péptido de unión, y en donde el BBPI variante, modificado comprende además un aminoácido sustituido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 y 65 de el BBPI variante de SEQ ID NO: 187. 2. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el núcleo molecular de BBPI se elige de (SEQ ID NO: 13) , BBIt (SEQ ID NO: 185), BBI-AV (SEQ ID NO: 186), BBIt-AV (SEQ ID NO: 187), BBIt-VEGK (SEQ ID NO: 640), BBIt-VEGT (SEQ ID NO: 641) , BBIt-VEGKD (SEQ ID NO: 642) , BBdb (SEQ ID NO: 449) , BBsb3 (SEQ ID NO: 450), BBtc (SEQ ID NO: 451, BBdb-AV (SEQ ID NO: 452), BBsb3-AV (SEQ ID NO: 453) y BBtC-AV (SEQ ID NO: 454) . 3. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de unión se elige de un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a FGF-5, un péptido de unión a TGFp y un péptido de unión TNF . 4. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de unión es un péptido de unión a VEGF elegido de ACYNLYGWTC (SEQ ID NO: 9), KYYLYWW (SEQ ID NO: 458), TLWKSY (SEQ ID NO: 459), DLYWW (SEQ ID NO: 460), SKHSQIT (SEQ ID NO: 468) KTNPSGS (SEQ ID NO: 469) RPTGHSL (SEQ ID NO: 470) , KHSAKAE (SEQ ID NO: 471) KPSSASS (SEQ ID NO: 472), PVTKRVH (SEQ ID NO: 473), TLHWWVT (SEQ ID NO: 492), PYKASFY (SEQ ID NO: 493), PLRTSHT (SEQ ID NO: 494), EATPROT (SEQ ID NO: 495), NPLHTLS (SEQ ID NO: 496), KHERIWS (SEQ ID NO: 497), ATNPPPM (SEQ ID NO: 498), STTSPNM (SEQ ID NO: 499), ADRSFRY (SEQ ID NO: 500), PKADS Q (SEQ ID NO:501), PNQSHLH (SEQ ID NO: 502), SGSETWM (SEQ ID NO: 503) , ALSAPYS (SEQ ID NO: 504) , K PTSKV (SEQ ID NO: 505), ITPKRPY (SEQ ID NO: 506), KWIVSET (SEQ ID NO: 507), PNANAPS (SEQ ID NO: 508), NVQSLPL (SEQ ID NO: 509), TLWPTFW (SEQ ID NO: 510) , NL PHFW (SEQ ID NO: 511) , SLWPAFW (SEQ ID NO: 512), SLWPHFW (SEQ ID NO: 513), APWNSHI (SEQ ID NO: 514), APWNLHI (SEQ ID NO: 515), LPSWHLR (SEQ ID NO: 516), PTILEWY (SEQ ID NO: 517), TLYPQFW (SEQ ID NO: 518), HLAPSAV (SEQ ID NO: 519), KYYLS W (SEQ ID NO: 520), WYTLYKW (SEQ ID NO: 521), TYRLY W (SEQ ID NO: 522), RYSLYYW (SEQ ID NO: 523), YYLYYWK (SEQ ID NO: 524) , NYQLYGW (SEQ ID NO: 525) , TK PSYW (SEQ ID NO: 226), TLWKSY (SEQ ID NO: 527), PLWPSY (SEQ ID NO: 528), RLWPSYW (SEQ ID NO: 529), TLWPKYW (SEQ ID NO: 530), KYDLYWW (SEQ ID NO: 531) , RYDLYWW (SEQ ID NO : 532) , DYRLYWW (SEQ ID NO: 533) , DYKLYWW (SEQ ID NO: 534) , EYLYWW (SEQ ID NO: 535) y RYPLYWW (SEQ ID NO: 536) . 5. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de unión es un péptido de unión a FGF-5 elegido de CACRTQPYPLCF (MM007; SEQ ID NO: 430), CICT IDSTPC (PS2; SEQ ID NO: 431) , CYGLPFTRC (SEQ ID NO: 537) , CEEI TMLC (SEQ ID NO: 538), CWALTVKTC (SEQ ID NO : 539), CLTVLWTTC (SEQ ID NO: 540) , CTL NRSPC (SEQ ID NO : 541) , CHYLLTNYC (SEQ ID NO : 542) , CRIHLAHKC (SEQ ID NO: 543), TNIDSTP (SEQ ID NO: 544), HLQTTET (SEQ ID NO: 545) SLNNLTV (SEQ ID NO: 546), TNIDSTP (SEQ ID NO: 547), TNIDSTP (SEQ ID NO: 548), LRILANK (SEQ ID NO: 549), LLTPTLN (SEQ ID NO : 550), ALPTHSN (SEQ ID NO: 551), TNIDSTP (SEQ ID NO: 552), LCRRFEN (SEQ ID NO: 553), TNIDSTP (SEQ ID NO: 554), TNIDSTP (SEQ ID NO: 555), HLQTTET (SEQ ID NO: 556), PLGLCPP (SEQ ID NO: 557), GYFIPSI (SEQ ID NO: 558), TKIDSTP (SEQ ID NO: 559), HLQTTET (SEQ ID NO: 560), WNIDSTP (SEQ ID NO: 561), TWIDWTP (SEQ ID NO: 562), RTQPYPL (SEQ ID NO: 670) y TWIDSTP (SEQ ID NO: 671) . 6. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de unión es un péptido de unión a TGF elegido de CLCPENINVLPCN (PEN3; SEQ ID NO: 436), CICKHNVDWLCF (MM021W; SEQ ID NO: 437), CICWTQHIHNCF (WTQ; SEQ ID NO: 438), CVTTDWIEC (SEQ ID NO: 563), CYYSQFHQC (SEQ ID NO: 564), CPTLWTHMC (SEQ ID NO: 565), QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ ID NO: 566) , QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID NO: 567) , QSACILYYVGTPKVECASSDD (SEQ ID NO: 568) , acetil-LCPENDNVSPCY-COhn2 (SEQ ID NO: 569), KHNVRLL (SEQ ID NO: 570), NDTPSYF (SEQ ID NO: 571), AKLYAGS (SEQ ID NO: 572), RGPAHSL (SEQ ID NO: 573), NSLAERR (SEQ ID NO: 574), HPLASPH (SEQ ID NO: 575), QPWNKLK (SEQ ID NO : 576), AWLr/Mipy (SEQ ID NO: 577), PTKPAQQ (SEQ ID NO: 578), PSLNRPQ (SEQ ID NO: 579), HHARQEW (SEQ ID NO: 580), RHHTPGP (SEQ ID NO: 581), ASAINPH (SEQ ID NO: 582), CHGYDRAPC (SEQ ID NO: 644), CFAPADQAC (SEQ ID NO: 645), CIPSRFITC (SEQ ID NO: 646), CHGHTKLAC (SEQ ID NO: 647), CNGKSKLAC (SEQ ID NO: 648) , PENINVLP (SEQ ID NO: 672) , KHNVDWL (SEQ ID NO: 673) y WTQHIHNC (SEQ ID NO: 674) . 7. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de unión es un péptido de unión a TNFa elegido de RYWPDIP (TI; SEQ ID NO: 474), APEPILA (T2; SEQ ID NO: 475), DMIMVSI (TD; SEQ ID NO: 476),· WTPKPTQ SEQ ID NO: 583), ATFPNQS (SEQ ID NO : 584) , ASTVGGL (SEQ ID NO: 585) , TMLPYRP (SEQ ID NO: 586), A HSPSV (SEQ ID NO: 587), TQSFSS (SEQ ID NO: 588), THKNTLR (SEQ ID NO: 589), GQTHFHV (SEQ ID NO: 590), LPILTQT (SEQ ID NO: 591) , SILPVSH (SEQ ID NO: 592) , SQPIPI (SEQ ID NO: 593), y QPLRKLP (SEQ ID NO: 594). 8. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aminoácido sustituido en la posición 1 se elige de A y C. 9. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 4 es V. 10. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en por lo menos una sustitución en la posición 5 se elige de P y A. 11. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 11 es 11G. 12. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 13 se elige de 13Y, 131, 13F, 13M, 13L, 13V, 13K y 13R. 13. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 18 se elige de 181 y 18V y 18L. 14. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 25 se elige de 25K, 25N, 25W, 251, 25A y 25R. 15. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 27 se elige de 27H, 27K, 27V, 27A, y 27Q. 16. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en por lo menos una sustitución en la posición 29 se elige de 29R, 29K y 29P. 17. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 31 se elige de 31Q, 31H, 31E, 31A, 31R, 31W, 31K y 31T. 18. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 38 se elige de 38N, 38K, y 38R. 19. El BBI modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 40 se elige de 40H, 40K, 40Q, 40R, y 40Y. 20. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 50 se elige de 50R, 50Q, 50K, 50T, 50V, 50M y 50S. 21. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en por lo menos una sustitución en la posición 52 se elige de 52K, 52T, 52R, 52Q, 52L, 52H, 52A, 52M, 52S y 52E. 22. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 55 es 55M. 23. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la por lo menos una sustitución en la posición 65 se elige de 65E, 61Q, y 65D. 24. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende una inserción de SEQ ID NO: 389. 25. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado se expresa como una proteína de fusión que comprende el dominio catalítico elegido de celulasa, cutinasa y disulfuro-isomerasa . 26. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante modificado se expresa como la proteína de fusión de SEQ ID NO: 195. 27. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de dos sustituciones de aminoácido en las posiciones de aminoácido equivalentes a las posiciones 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. 28. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el BBPI variante, modificado tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 595. 29. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de tres sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 25, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. 30. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la combinación de tres aminoácidos se elige de las combinaciones 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A. 31. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el BBPI variante, modificado tiene la secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS: 603, 607 y 609. 32. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de cuatro sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 13, 29, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. 33. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la combinación de cuatro aminoácidos se elige de las combinaciones 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 13I-A0K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, y 29P-40K-50T-52A. 34. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el BBPI variante, modificado tiene la secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS: 596, 600, 602, 604, 606, 608 y 643. 35. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de cinco sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de aminoácido en las posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 29, 40, 50 y 52 de SEQ ID NO: 187. 36. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la combinación de 5 aminoácidos se elige de las combinaciones 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, A13I-29P-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A, y 13I-29P-40K-50T-52T. 37. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el BBPI variante, modificado tiene la secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS : 432, 434, 443, 445, 446, 597, 599, 601, 605, 615, 620, 624 y 625. 38. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de seis sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 1, 4, 5, 11, 13, 25, 29, 40, 50, y 52 de SEQ ID NO: 187. 39. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque la combinación de seis aminoácidos se elige de las combinaciones 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, y 13I-29P-40K-50T-52A-65E. 40. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el BBPI variante, modificado tiene la secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NO: 598, 611, 612, 613, 614, 616, 619, 621, 622, 623 y 626. 41. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de siete sustituciones de aminoácido elegidas de las sustituciones de BBPI variante, modificado tiene la secuencia de aminoácidos elegida de SEQ ID NOS: 627-631. 47. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado se une a VEGF. 48. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de unión a VEGF se elige de SEQ ID NOS: 9, 458, 459, 460, 648, 469, 470, 471, 472 y 473. 49. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado es un VEGF-BBPI elegido de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 y 636. 50. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el inhibidor variante, modificado, aislado tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina que el correspondiente BBPI variante, precursor, no modificado. 51. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el BBPI variante, modificado, aislado, tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina y rendimiento de producción que el correspondiente BBPI variante, precursor, no modificado. 52. Un BBPI variante, modificado, aislado de SEQ ID NO: 187, caracterizado porque el BBPI comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las sustituciones de aminoácido en posiciones equivalentes a las posiciones 13, 25, 27, 29, 31, 40, 50 y 52 y en donde el péptido variante de VEGF del BBPI se reemplaza por un péptido variante para unirse a una proteína objetivo elegida de FGF-5, TGF y TNFa. 53. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el péptido variante es un péptido de unión a FGF5 elegido de SEQ ID NOS: 430, 431, 670 y 671. 54. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el péptido de unión es un péptido de unión a ???ß elegido de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673 y 674. 55. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el péptido de unión es un péptido de unión a TNFa elegido de SEQ ID NOS: 474, 476 y 476. 56. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el BBPI variante, modificado tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina y rendimiento de producción que el correspondiente BBPI precursor, no modificado. 57. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el inhibidor de Bowman-Birk variante se elige de SEQ ID NOS: 432, 434, 443, 445, 447, 637, 638 y 639. 58. Un polinucleótido aislado que codifica para una proteína de fusión de BBPI, caracterizado porque comprende una primera secuencia de polinucleótido que codifica para la unidad catalítica de una enzima, y una segunda secuencia de polinucleótido que codifica para un inhibidor de proteasa, variante, modificado elegido de un BBPI de unión a VEGF (VEGF-BBPI) , un BBPI de unión a FGF (FGF-BBPI) , un BBPI de unión a TGF (TGF-BBPI) y un BBPI de unión a TNF (TNF-BBPI) . 59. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la primera secuencia codifica para la unidad catalítica de una celulasa. 60. Un método para producir un BBPI variante, modificado en una célula bacteriana, el método está caracterizado porque comprende: a) mutar un polinucleótido que codifica para un BBPI variante para generar una construcción de polinucleótido que codifica para un BBPI variante, modificado que comprende una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 y 65 del BBPI variante de SEQ ID NO: 187; b) introducir la construcción de polinucleótido en una célula hospedadora bacteriana; c) cultivar la célula bacteriana bajo condiciones adecuadas de cultivo para permitir la expresión de la secuencia heteróloga de ADN; y d) producir el BBPI variante, modificado, en donde el BBPI variante, modificado tiene mayor actividad de tripsina que el correspondiente BBPI variante, precursor, no modificado . 61- El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el BBPI variante, modificado tiene una mayor actividad inhibitoria de tripsina y mayor rendimiento de producción que el .correspondiente BBPI variante, precursor, no modificado. 62. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el BBPI variante, precursor, no modificado se elige de BBI-AV (SEQ ID NO: 186) , BBIt-AV (SEQ ID NO: 187), BBdb-AV (SEQ ID NO: 452), BBsb3 (SEQ ID NO: 453), y BBtc-AV (SEQ ID NO: 454) . 63. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la segunda asa inhibitoria de proteasa del BBPI variante, modificado es un péptido de unión a proteína objetivo elegido de un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a FGF-5, un péptido de unión a ?T?ß y un péptido de unión a TNFa. 64. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque además comprende recuperar el BBPI variante, modificado. 65. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque además comprende activar el BBPI variante, modificado. 66. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de las combinaciones (3) 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A, (4) 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 13I-A0K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A y 29P-40K-50T-52A, (5) 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50K-52A y 13L-29P-40K-50T-52T, (6) 13I-25L-29P-40K-50T-52A, 1C-13I-29P-40K-50T-52A, 4V-13I-29P-40K-50T-52A, 5P-13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A-65E, (7) 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, y 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, (8) 13I-25R-27A-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L, 13I-25K- 27Q-29P-31E-4OH- 50R-52Q . 67. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para el BBPI variante, modificado de conformidad con la reivindicación 1. 68. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el BBPI variante, modificado se expresa como una proteina de fusión que tiene al menos 80 % de identidad al polipéptido de SEQ ID NO: 195. 69. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la segunda asa inhibitoria del BBPI modificado es un péptido de unión elegido de un péptido de unión a VEGF, un péptido de unión a FGF5, un péptido de unión a TGF y un péptido de unión a TNFa . 70. Una célula hospedadora, caracterizada porque se transforma con el vector de conformidad con la reivindicación 67. 71. La célula hospedadora de conformidad con la reivindicación 70, caracterizada porque la célula hospedadora es una célula hospedadora de la especie Bacillus . 72. Una composición de cuidado personóil que comprende un BBPI variante, modificado, caracterizada porque la segunda asa inhibitoria de proteasa del núcleo molecular del BBPI es un péptido de unión elegido de un péptido de unión al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , un péptido de unión al factor-5 de crecimiento de fibroblastos (FGF5) , un péptido de unión al factor ß de crecimiento transformante (TGF ß) y un péptido variante del factor de necrosis tumoral (TNFa) , y en donde el BBPI variante, modificado comprende además una sustitución de aminoácido en al menos una posición de aminoácido elegida de las posiciones equivalentes a 1, 4, 5, 11, 13, 18, 25, 27, 29, 31, 38, 40, 50, 52, 55 y 65 del BBPI variante de SEQ ID NO: 187. 73. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 72, caracterizada porque el núcleo molecular se elige de BBI (SEQ ID NO: 13) , BBIt (SEQ ID NO: 185), BBI-AV (SEQ ID NO: 186), BBIt-AV (SEQ ID NO: 187), BBIt-VEGK (SEQ ID NO:640), BBIt-VEGT (SEQ ID NO: 641), BBIt-VEGKD (SEQ ID NO: 642), BBdb (SEQ ID NO: 449), BBsb3 (SEQ ID NO: 450) , BBtC (SEQ ID NO: 451) , BBdb-AV (SEQ ID NO: 452), BBsb3-AV (SEQ ID NO: 453), y BBtc-AV (SEQ ID NO: 454). 74. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-73, caracterizada porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 50T-52A, 25L-50T-52A, 29P-50T-52A, 40K-50T-52A, 13I-25L-50T-52A, 13I-29P-50T-52A, 13I-40K-50T-52A, 25L-29P-50T-52A, 25L-40K-50T-52A, 29P-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-25L-29P-50T-52A, 13I-29P-40 -50T-52A, 13I-25L-40K-50T-52A, 25L-29P-40K-50T-52A, 13L-29P-40K-50T-52A, 13I-29K-40K-50T-52A, 131-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25L-29P-40K-50T-52A, D1C-13I-29P-40K-50T-52A, S4V-13I-29P-40K-50T-52A, S5P- 13I-29P-40K-50T-52A, 11G-13I-29P-40K-50T-52A, 13I-25R-29P-40K-50T-52A, 13I-27R-29P-40K-50T-52A, 13I-29P-31A-40K-50T-52A, 13I-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-29P-38N-40K-50T-52A, 131-29P-40K-50T-52A-65E, 13L-25R-29P-31A-40K-50T-52A, 13L-25R-29P-31R-40K-50T-52A, 13I-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27R-29E-31A-40H-50R-52K, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L, y 13I-25K-27Q-29P-31E-40H-50R-52Q. 75. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-74, caracterizada porque el BBPI variante, modificado se une a una proteína objetivo elegida de VEGF, FGF5, TGF y TNFa. 76. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizada porque el péptido de unión a VEGF se elige de ACYNLYG TC (SEQ ID NO : 9), KYYLYW (SEQ ID NO: 458), TLWKSYW (SEQ ID NO: 459), DLYWW (SEQ ID NO: 460), SKHSQIT (SEQ ID NO: 468) , KTNPSGS (SEQ ID NO: 469) RPTGHSL (SEQ ID NO: 470) , KHSAKAE (SEQ ID NO: 471) KPSSASS (SEQ ID NO: 472), PVTKRVH (SEQ ID NO: 473), TLHW VT (SEQ ID NO: 492), PYKASFY (SEQ ID NO: 493), PLRTSHT (SEQ ID NO: 494), AETPROT (SEQ ID NO: 495), NPLHTLS (SEQ ID NO: 496), KHERIWS (SEQ ID NO: 497), ATNPPPM (SEQ ID NO: 498), S.TTSPNM (SEQ ID NO: 499), ADRSFRY (SEQ ID NO: 500), PKADSKQ (SEQ ID NO: 501), PNQSHLH (SEQ ID NO: 502), SGSET M (SEQ ID NO: 503), ALSAPYS (SEQ ID NO: 504), KMPTSKV (SEQ ID NO: 505), ITPKRPY (SEQ ID NO: 506), KWIVSET (SEQ ID NO: 507), PNANAPS (SEQ ID NO: 508), NVQSLPL (SEQ ID NO: 509), TLWPTFW (SEQ ID NO: 510) , NLWPHFW (SEQ ID NO : 511) , SLWPAFW (SEQ ID NO: 512), SLWPHFW (SEQ ID NO: 513), APWNSHI (SEQ ID NO: 514), APWNLHI (SEQ ID NO: 515), LPSWHLR (SEQ ID NO: 516), PTILEWY (SEQ ID NO : 517) , TLYPQFW (SEQ ID NO : 518) , HLAPSAV (SEQ ID NO: 519) , KYYLS W (SEQ ID NO: 520) , WYTLYKW (SEQ ID NO: 521), TYRLYWW (SEQ ID NO: 522), RYSLYYW ('SEQ ID NO: 523), YYLYYWK (SEQ ID NO: 524) , NYQLYG (SEQ ID NO: 525) , T PSYW (SEQ ID NO: 226), TLWKSY (SEQ ID NO: 527), PLWPSYW (SEQ ID NO: 528) , RLWPSY (SEQ ID NO: 529) , TL PKY (SEQ ID NO: 530) , KYDLYWW (SEQ ID NO: 531) , RYDLYWW (SEQ ID NO : 532) , DYRLYWW (SEQ ID NO: 533) , DYKLYWW (SEQ ID NO: 534) , EYKLYWW (SEQ ID NO: 535) , y RYPLYWW (SEQ ID NO : 536) . 77. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizada porque el péptido de unión a FGF se elige de CACRTQPYPLCF (MM007; SEQ ID NO: 430), CICTWIDSTPC (PS2; SEQ ID NO: 431) , CYGLPFTRC (SEQ ID NO: 537) , CEEIWTMLC (SEQ ID NO: 538), CWALTVKTC (SEQ ID NO: 539), CLTVL TTC (SEQ ID NO: 540) , CTLWNRSPC (SEQ ID NO : 541) , CHYLLTNYC (SEQ ID NO: 542) , CRIHLAHKC (SEQ ID NO: 543), TNIDSTP (SEQ ID NO: 544), HLQTTET (SEQ ID NO: 545) , SLNNLTV (SEQ ID NO: 546) TNIDSTP (SEQ ID NO: 547), TNIDSTP (SEQ ID NO: 548), LRILANK (SEQ ID NO: 549), LLTPTLN (SEQ ID NO: 550), ALPTHSN (SEQ ID NO: 551), TNIDSTP (SEQ ID NO: 552), LCRRFEN (SEQ ID NO: 553), TNIDSTP (SEQ ID NO: 554), TNIDSTP (SEQ ID NO: 555), HLQTTET (SEQ ID NO: 556), PLGLCPP (SEQ ID NO: 557), GYFIPSI (SEQ ID NO: 558), TKIDSTP (SEQ ID NO: 559), HLQTTET (SEQ ID NO: 560), WNINDSTP (SEQ ID NO: 561), TWIDWTP (SEQ ID NO: 562), RTQPYPL (SEQ ID NO: 670) y T IDSTP (SEQ ID NO: 671) . 78. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizada porque el péptido de unión a TGF se elige de CLCPENINVLPCN (PEN3; SEQ ID NO: 436), CICKHNVDWLCF (MM021W; SEQ ID NO: 437), CIC TQHIHNCF (WTQ; SEQ ID NO: 438), CVTTD IEC (SEQ ID NO:563), CYYSQFHQC (SEQ ID NO: 564), CPTLWTHMC (SEQ ID NO: 565), QSACIVYYVGRKPKVECASSD (SEQ ID NO: 566) , QSACILYYIGKTPKIECASSD (SEQ ID NO: 567) , QSACILYYVGRTPKVECASSD (SEQ ID NO: 568), acetil-LCPENDNVSPCY-cohn2 (SEQ ID NO: 569), KHNVRLL (SEQ ID NO: 570), NDTPSYF (SEQ ID NO: 571), A LYAGS (SEQ ID NO: 572), RGPAHSL (SEQ ID NO: 573), NSLAERR (SEQ ID NO: 574), HPLASPH (SEQ ID NO: 575), QP NKLK (SEQ ID NO : 576) , AWLr/Mipy (SEQ ID NO : 577) , PTKPAQQ (SEQ ID NO: 578), PSLNRPQ (SEQ ID NO: 579), HHARQEW (SEQ ID NO: 580), RHHTPGP (SEQ ID NO: 581), ASAINPH (SEQ ID NO: 582), CHGYDRAPC (SEQ ID NO: 644), CFAPADDQAC (SEQ ID NO: 645), CIPSRFITC (SEQ ID NO: 646), CHGHTKLAC (SEQ ID NO: 647), CNGKSKLAC (SEQ ID NO: 648), PENINVLP (SEQ ID NO: 672), KHNVDWL (SEQ ID NO: 673) y WTQHIHNC (SEQ ID NO: 674) . 79. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizada porque el péptido de unión a TGF se elige de RYWQDIP (TI; SEQ ID NO: 474), APEPILA (T2; SEQ ID NO: 475), DMIMVSI (T3, SEQ ID NO: 476), WTPKPTQ (SEQ ID NO: 583), ATFPNQS (SEQ ID NO: 584), ASTVGGL (SEQ ID NO: 585), T LPYRP (SEQ ID NO: 586), AWHSPSV (SEQ ID NO: 587), TQSFSS (SEQ ID NO: 588), THKNTLR (SEQ ID NO: 589), GQTHFHV (SEQ ID NO: 590), LPILTQT (SEQ ID NO: 591), SILPVSH (SEQ ID NO: 592), SQPIPI (SEQ ID NO: 593), y QPLRKLP (SEQ ID NO: 594). 80. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizada porque el BBPI variante, modificado comprende desde aproximadamente 0.0001 por ciento en peso a aproximadamente 5 % en peso de la composición cuidado personal . 81. El BBPI variante, modificado, aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizado porque el inhibidor variante modificado, aislado tiene mayor actividad inhibitoria de tripsina y mayor rendimiento de producción que el correspondiente inhibidor variante, precursor, no modificado del BBPI. 82. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizada porque el péptido de unión es un péptido de unión a VEGF elegido de SEQ ID NOS: 9, 458, 459, 460, 468, 469, 470, 471, 472 y 473. 83. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada porque el núcleo molecular es la BBIt-AV de SEQ ID NO: 187. 84. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 82-83, caracterizada porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 131-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L. 85. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72 y 80-81, caracterizada porque el BBPI variante, modificado es un BBPI de unión a VEGF (VEGF-BBPI) y se elige de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 y 636. 86. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 75 y 80-85, caracterizada porque la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel seleccionada del grupo que consiste de cremas, lociones, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, espumas, aerosoles, líquidos, geles, sueros y sólidos para la piel. 87. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 75 y 80-85, caracterizada porque es una composición de cuidado de la piel seleccionada de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores anti-microbianos, cremas protectoras para la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos antiacné, tóneres fáciles, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, bloqueadores de sol, depiladores, inhibidores de crecimiento de pelo y radioprotectores . 88. La composición de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque la composición de cuidado de la piel comprende además composiciones de venta libre aplicadas tópicamente, tratamientos anti- fungoideos, tratamientos anti-acné, protectores para la piel, bloqueadores de sol, desodorantes y antitranspirtantes . 89. La composición de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque el radioprotector es un bloqueador de sol seleccionado de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores de sol de agua en silicón. 90. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque composición de cuidado personal es una composición cosmética elegida de las formulaciones de polvo prensado, y bases. 91. La composición de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque la composición cosmética comprende al menos un pigmento. 92. La composición de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque la composición cosmética es una formulación de polvo prensado seleccionada de polvos sueltos, rubores y polvos de broncear. 93. La composición de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada porque la composición cosmética es una base seleccionada de bases de agua en aceite, bases de agua en silicón, bases de aceite en agua, barras anhidras de maquillaje y bases de crema a polvo. 94. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel para tratar un trastorno angiogénico de la piel. 95. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel para mejorar la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de un trastorno de la piel elegido de psoriasis, escleroderma, úlceras venosas, acné, rosácea, verrugas, eccema, hemangiomas y linfangiogénesis . 96. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 75 y 80-85, caracterizada porque es una composición de cuidado del pelo . 97. La composición de cuidado de pelo de conformidad con la reivindicación 96, caracterizada se selecciona del grupo que consiste de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado de pelo, colorantes de pelo, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, expresiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. 98. La composición de cuidado de pelo de conformidad con la reivindicación 97, caracterizada porque comprende además un radioprotector . 99. La composición de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque el radioprotector es un bloqueador de sol elegido de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua y bloqueadores de agua en silicón. 100. La composición de conformidad con la reivindicación 96, caracterizada porque la composición de cuidado personal es capaz de impedir el crecimiento de pelo. 101. Un método para inhibir el crecimiento de pelo en un sujeto, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar la composición de cuidado personal de cualquiera - de conformidad con las reivindicaciones 75 y 80-85; b) proporcionar un sujeto que se va a tratar; y c) aplicar la composición al sujeto en un área a la cual se desea la inhibición de crecimiento de pelo o cabello . 102. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el crecimiento de pelo que se va a inhibir se elige de bello facial, vello de axila, bello de pierna, vello de torso, vello de brazo y cabello. 103. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque la composición de cuidado personal comprende un VEGF-BBPI elegido de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 y 636. 104. Un método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel en un sujeto que padece de un trastorno angiogénico de la piel, caracterizado porque comprende los pasos de : a) proporcionar la composición de cuidado personal de cualquiera de conformidad con las reivindicaciones 75 y 80-85, b) proporcionar el sujeto; y c) aplicar la composición a la piel del sujeto. 105. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque el trastorno angiogénico de la piel se elige de psoriasis, escleroderma, ulceras venosas, acné, rosáceas, verrugas, eccema, hemangiomas, y linfangiogénesis . 106. El método de conformidad con la reivindicación 104, caracterizado porque la composición de cuidado personal comprende un VEGF-BBI elegido de SEQ ID NOS: 601, 602, 627, 628, 630, 631, 643, 491, 632, 633, 634, 635 y 636. 107. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizada porque el péptido variante es un péptido variante de FGF elegido de SEQ ID NOS: 430 y 431. 108. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 107, caracterizada porque el núcleo molecular es el BBIt-AV de SEQ ID NO: 187. 109. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 107-108, caracterizada porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegida de 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 131-25R-27A-29P-31A, 50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L. 110. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 72 y 80-81, caracterizada porque el BBPI variante, modificado es un BBPI de unión a FGF (FGF-BBPI) y se elige de SEQ ID NOS: 432 y 434. 111. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 77 y 107-110, caracterizada porque la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de pelo. 112. La composición de cuidado de pelo de conformidad con la reivindicación 111, caracterizada porque la composición de cuidado de pelo se selecciona del grupo que consiste de champús, acondicionadores, composiciones de estilización de pelo, colorantes de pelo, formulación de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. 113. La composición de cuidado de pelo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 111-112, caracterizada porque comprende además un radioprotector . 114. La composición de conformidad con la reivindicación 113, caracterizada porque el radioprotector es un bloqueador de sol seleccionado de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua y bloqueadores de sol de agua en silicón. 115. La composición de conformidad con la reivindicación 111, caracterizada porque la composición de cuidado personal es capaz de promover el crecimiento de pelo. 116. Un método para promover el crecimiento de pelo de un sujeto, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar la composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 77 y 107-110; b) proporcionar un sujeto que se va a tratar; y c) aplicar la composición al sujeto en un área en la cual se desea la promoción de crecimiento de pelo. 117. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el crecimiento de pelo o cabello que se va a promover se elige de vello facial, vello de axila, vello de piernas, vello de torso, vello de brazo y cabello . 118. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el sujeto está padeciendo de una condición que comprende pérdida de pelo. 119. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque la condición se elige de alopecias inflamatorias, pseudoapelada, escleroderma, picaduras de garrapata, lichen planus, psoriasis, lupus, dermatitis seborreica, síndrome de pelo suelto, hemocromatosis , alopecia androgénica y alopecia areata. 120. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque la composición de cuidado personal comprende un BBPI de unión a FGF (FGF-BBPI) elegido de SEQ ID NOS: 432 y 434. 121. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-75, caracterizada porque el péptido variante es un péptido variante de TGF elegido de SEQ ID NOS: 436, 437, 438, 672, 673, y 674. 122. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 121, caracterizada porque el núcleo molecular es el BBIt-AV de SEQ ID NO: 187. 123. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-122, caracterizada porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 131-25R-27A-29P-31A-50 -52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L. 124. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72 y 80- 81, caracterizada porque el BBPI variante, modificado es un BBPI de unión a TGF (TGF-BBPI) que se elige de SEQ ID NOS: 443, 445 y 447. 125. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 78, 80, 81 y 121-124, caracterizada porque la composición de cuidado personal es una composición de cuidado del pelo o del cuidado de la piel. 126. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 125, caracterizada porque la composición de cuidado pelo o de cuidado de la piel se selecciona del grupo que consiste de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado de pelo, colorantes de pelo, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersores, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. 127. La composición de conformidad con la reivindicación 125, caracterizada porque la composición de cuidado personal es una composición de cuidado de la piel seleccionada de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores antimicrobianos, cremas protectoras para la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos antiacné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, bloqueadores de sol y radioprotectores . 128. La composición de conformidad con la reivindicación 127, caracterizada porque la composición de cuidado de la piel comprende además composiciones de venta libre aplicadas tópicamente, tratamientos anti- fungoideos, tratamientos anti -acné, protectores para la piel, bloqueadores de sol, desodorantes y anti-transpirantes . 129. La composición de conformidad con la reivindicación 127, caracterizada porque el radioprotector es un bloqueador de sol seleccionado de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua y bloqueadores de sol de agua en silicón. 130. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-124, caracterizada porque la composición de cuidado personal es una composición cosmética. 131. La composición de conformidad con la reivindicación 130, caracterizada porque la composición cosmética se selecciona de máscaras, delineadores de ojos, formulaciones de polvo prensado y bases . 132. La composición de cuidado de pelo de conformidad con la reivindicación 126, caracterizada porque la composición de cuidado de pelo comprende además un radioprotector . 133. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 132, caracterizada porque el radioprotector es un bloqueador de sol seleccionado de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua, y bloqueadores sol de agua en silicón. 134. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 125, caracterizada porque la composición de cuidado personal es capaz de promover el crecimiento de pelo. 135. Un método para promover el crecimiento de pelo de un sujeto, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar la composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 78, 80, 81 y 121-124; b) proporcionar un sujeto que se va a tratar; y c) aplicar la composición al sujeto en un área en la cual se desea la promoción de crecimiento de pelo. 136. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el crecimiento de pelo que se va a promover se elige de bello facial, vello de axila, bello de pierna, vello de torso, vello de brazo y cabello. 137. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el sujeto está padeciendo de una condición que comprende pérdida de pelo. 138. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque la condición se elige de alopecias inflamatorias, pseudopeladas , escleroderma, picaduras de garrapata, lichen planus, psoriasis, lupus, dermatitis seborreica, síndrome de pelo suelto, hemocromatosis , alopecia androgénica y alopecia areata. 139. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque la composición de cuidado personal comprende un TGF-BBPI variante, modificado, elegido de SEQ ID NOS: 443,445 y 447. 140. Un método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel del sujeto que padece de un trastorno de la piel, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar la composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 78, 80, 81 y 121-124; b) proporcionar al sujeto; y c) aplicar la composición a la piel del sujeto. 141. El método de conformidad con la reivindicación 140, caracterizado porque el trastorno de la piel se elige de psoriasis, escleroderma, y cáncer de la piel. 142. El método de conformidad con la reivindicación 140, caracterizado porque la composición de cuidado personal comprende un TFG-BBPI elegido del TGF-BBPI variante, modificado elegido de SEQ ID NOS: 443, 445 y 447. 143. La composición de cuidado personal de conformidad con las reivindicaciones 72-74, caracterizada porque el péptido variante es un péptido variante de TNF elegido de SEQ ID NOS: 474, 475 y 476. 144. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 143, caracterizada porque el núcleo molecular es el BBIt-AV de SEQ ID NO: 187. 145. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 143-144, caracterizada porque el BBPI variante, modificado comprende una combinación de sustituciones de aminoácido elegidas de 13I-40K-50T-52A, 13I-25K-29P-52K, 13I-29P-40K-50T-52A, 131-25R-27A-29P-31A-50K-52T, 13I-25R-27A-29P-31A-40H-50K.-52T, 13I-25K-27A-29R-31E-40K-50Q-52Q, 13I-25K-27A-29R-31A-40H-50R-52L. 146. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72 y 80-81, caracterizada porque el BBPI variante, modificado es un TNF-BBPI y se elige de SEQ ID NOS: 637, 638 y 639. 147. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79-81 y 142-146, caracterizada porque es una composición de cuidado de pelo. 148. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque la composición de cuidado pelo es capaz de promover el crecimiento de pelo en un sujeto que padece de psoriasis. 149. La composición de cuidado pelo de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste de champús, acondicionadores, composiciones de estilizado de pelo, colorantes de pelo, formulaciones de ondulación permanente, cremas, geles, mousses, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, líquidos, espumas y sólidos. 150. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 149, caracterizada porque la composición de cuidado de pelo comprende además un radioprotector . 151. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 150, caracterizada porque el radioprotector es un bloqueador de sol seleccionado de bloqueadores de sol no resistentes a agua, bloqueadores de sol muy resistentes a agua y bloqueadores de sol de agua en silicón . 152. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque es capaz de promover el crecimiento de pelo. 153. La composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79-81 y 142-146, caracterizada porque es una composición de cuidado de la piel. 154. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 153, caracterizada porque la composición de cuidado de la piel es capaz de mejorar la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de psoriasis o escleroderma . 155. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 153, caracterizada porque es una composición de cuidado de la piel seleccionada del grupo que consiste de cremas, lociones, aspersiones, emulsiones, suspensiones coloidales, espumas, aerosoles, líquidos, geles, sueros y sólidos para la piel. 156. La composición de cuidado personal de conformidad con la reivindicación 153, caracterizada porque es una composición de cuidado de la piel seleccionada de lavados corporales humectantes, lavados corporales, limpiadores anti-microbianos , cremas protectoras para la piel, lociones corporales, cremas faciales, cremas humectantes, emulsiones limpiadoras faciales, geles faciales, sueros faciales, limpiadores faciales basados en agentes tensioactivos , geles exfoliantes faciales, tratamientos antiacné, tonificadores faciales, cremas exfoliantes, máscaras faciales, bálsamos para después de afeitar, bálsamos para antes de afeitar, composiciones de bronceado, composiciones de aclaramiento de piel, composiciones de reducción de rojez de piel, bloqueadores de sol, depiladores y radioprotectores . 157. La composición de conformidad con la reivindicación 155, caracterizada porque la composición de cuidado personal comprende además composiciones de venta libre aplicadas tópicamente, tratamientos anti- fungoideos, tratamientos anti-acné, protectores de piel, bloqueadores de sol, desodorantes y antitranspirantes . 158. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79-81 y 142-146, caracterizada porque la composición de cuidado personal es una composición cosmétic . 159. La composición de conformidad con la reivindicación 158, caracterizada porque la composición cosmética se selecciona de máscaras, delineadores de ojos, formulaciones de polvo prensado y bases. 160. La composición de conformidad con la reivindicación 159, caracterizada porque la composición cosmética comprende al menos un pigmento. 161. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 158-159, caracterizada porque la composición cosmética que comprende al menos un pigmento es una máscara seleccionada de máscaras no a prueba de; agua, máscaras a prueba de agua, máscaras de volumen, máscaras de aclaramiento, máscaras de rizado, máscaras anhidras a prueba de agua, máscaras basadas en agua, y tratamientos para pestañas o cejas. 162. La composición de conformidad con la reivindicación 160, caracterizada porque la composición cosmética es una formulación de polvo prensado seleccionada de polvos sueltos, rubores, sombras para ojos, y polvos de bronceado . 163. La composición de conformidad con la reivindicación 160, caracterizada porque la composición cosmética es una base seleccionada de bases de agua en aceite, bases de agua en silicón, bases de aceites en agua, barras anhidras de maquillaje y bases de crema a polvo. 164. Un método para promover el crecimiento de pelo de un sujeto que padece de psoriasis, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar la composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79-81 y 142-146; b) proporcionar un sujeto que se va a tratar; y c) aplicar la composición al sujeto en un área en la cual se desea la promoción de crecimiento de pelo. 165. El método de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque el crecimiento de pelo que se va a promover se elige de vello facial, pelo de axila, vello de piernas, vello de torso, vello de brazo y cabello. 166. El método de conformidad con la reivindicación 164, caracterizado porque la composición de cuidado personal comprende un TNF-BBPI modificado, elegido de SEQ ID NOS: 637, 638 y 639. 167. Un método para mejorar la apariencia y/o condición de la piel de un sujeto que padece de psoriasis, caracterizado porque comprende los pasos de: a) proporcionar la composición de cuidado personal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 79-81 y 142-146. b) proporcionar al sujeto; y c) aplicar la composición a la piel del sujeto. 168. El método de conformidad con la reivindicación 167, caracterizado porque la composición de cuidado personal comprende un TNF-BBPI modificado, elegido de SEQ ID NOS: 637, 638 y 639.