MX2011002253A - Biomarcadores para el tratamiento anti-factor de necrosis tumoral en la colitis ulcerativa y trastornos relacionados. - Google Patents

Abstract

Métodos y kits para la evaluación de la adecuación y/o eficacia de una terapia de destino para un trastorno relacionado mediado por TNF, tal como la colitis ulcerativa, en un sujeto. Dichos métodos y kits evalúan la presencia, ausencia y/o magnitud de la expresión de dos o más genes sobrerregulados o subregulados, en asociación con sujetos que responden a anti-TNF en trastornos inflamatorios gastrointestinales tales como la colitis ulcerativa.

Description

BIOMARCADORES PARA EL TRATAMIENTO ANT1-F ACTOR DE NECROSIS TUMORAL EN LA COLITIS ULCERATIVA Y TRASTORNOS RELACIONADOS SOLICITUD ANTERIOR Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud de Estados Unidos serie núm. 61/091 ,641 presentada el 25 de agosto de 2008, incorporada en la presente descripción como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con la identificación de los perfiles de expresión y los ácidos nucleicos indicativos de trastornos mediados por TNF, tales como colitis ulcerativa, y el uso de dichos perfiles de expresión y ácidos nucleicos en el diagnóstico de la colitis ulcerativa y trastornos relacionados. La invención además se relaciona con métodos para identificar, usar y probar agentes y/o destinos candidato que modulan la colitis ulcerativa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El tratamiento de la colitis ulcerativa con agentes biológicos presenta ciertos desafios. Determinar la población de pacientes a estudiar, predecir qué sujetos responderán al tratamiento y qué sujetos perderán capacidad de respuesta después del tratamiento son cuestiones con un impacto significativo sobre el diseño del tratamiento y del estudio clínico. Los biomarcadores pueden ser útiles para responder estas preguntas.

Los biomarcadores se definen como una característica que se mide y se evalúa objetivamente como un indicador de procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica (Biomarkers Working Group, 2001 , más abajo). La definición de un biomarcador se amplió recientemente como proteínas en las que un cambio en la expresión se puede correlacionar con un riesgo aumentado de enfermedad o evolución, o puede predecir una respuesta de una enfermedad a un cierto tratamiento.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) es una citocina importante en la respuesta inmune innata, que proporciona una defensa inmediata del receptor contra los organismos invasores antes de la activación del sistema inmune adaptativo. El TNFa se expresa como el precursor transmembranoso que atraviesa un procesamiento proteolitico para formar un trímero soluble. La aglutinación de las formas membranosas y solubles de TNF a sus receptores, TNFRSF1A y TNFRSF1 B (también conocidos como TNFR1 y TNFR2, respectivamente), inicia la expresión de varias otras citocinas proinflamatorías y marcadores inflamatorios generales. El TNFa es un mediador conocido de varias enfermedades inflamatorias crónicas mediadas por el sistema inmune.

Hay muchos antagonistas biológicos TNFa tales como infliximab (Remicade®), golimumab (Simponi®), adalimumab (Humira®), y etanercept (Enbrel®), que han sido aprobados para el uso de los pacientes. El mecanismo primario es reducir los niveles de TNF en la circulación, lo que reduce así la inflamación general y mejora los signos clínicos de la enfermedad sin causar inmunodepresión sistémica en el paciente. Hasta ahora han demostrado ser eficaces para tratar la artritis reumatoide (RA), la artritis soriásica (PsA), la enfermedad de Crohn (CD), la colitis ulcerativa (CU), la soriasis y la espondilitis anquilosante.

La colitis ulcerativa (CU) es una inflamación intestinal del colon. La patogénesis de la CU depende de la interacción entre factores genéticos, la respuesta inmune, la infección microbiana y factores ambientales, que resultan en una respuesta anormal a las bacterias que se encuentran normalmente en el tracto gastrointestinal. La expresión genética no sólo controla el curso general de la enfermedad, sino que también refleja los procesos que subyacen a la expresión clínica de una enfermedad activa y una enfermedad en remisión.

Los tratamientos actuales de la CU incluyen agentes antiinflamatorios, inmunomoduladores y agentes anti-factor de necrosis tumoral (TNFa), incluso infliximab. El infliximab induce y mantiene la respuesta clínica y la remisión clínica en pacientes con CU, según lo demostrado en los ensayos ACT 1 y ACT 2.

Aunque se aprobó a algunos de estos agentes anti-TNFa para tratar la colitis ulcerativa, el TNFa ha sido implicado en muchos aspectos de los trastornos inflamatorios gastrointestinales. Sin embargo, hay diferencias individuales en respuesta a la terapia anti-TNF, y algunos pacientes pueden no recibir beneficios terapéuticos. Se ha hipotetizado que las variaciones genéticas múltiples pueden jugar un papel principal en la respuesta variada.

En consecuencia, existe la necesidad de identificar y caracterizar nuevos marcadores genéticos de suero o plasma que sean útiles para desarrollar métodos de diagnóstico y tratamiento de trastornos inflamatorios de origen inmune, tales como la colitis ulcerativa, así como otras enfermedades y afecciones, y un método para predecir cómo respondería un paciente a una intervención terapéutica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método o equipo para diagnosticar y/o tratar la colitis ulcerativa y/o enfermedades o trastornos relacionados, y/o predecir la adecuación de los agentes candidatos al tratamiento. La presente invención incluye el descubrimiento de genes de interés particulares que tienen niveles de expresión modificada en pacientes sujetos que responden al tratamiento de colitis ulcerativa (eficaz para reducir los síntomas de la colitis ulcerativa) frente a los pacientes que no responden al tratamiento o los pacientes tratados con un placebo. Los niveles de expresión modificada constituyen un perfil que puede servir como un perfil de biomarcador predictivo de la capacidad de respuesta de un paciente al tratamiento, y/o proporcionar rutas de dosificación preferidas. 1. La materia descrita en la presente descripción se relaciona con la asociación genética de un conjunto de genes (y la expresión de dichos genes) que se sobrerregulan o subrregulan con terapia anti-TNF en sujetos que tienen un trastorno inflamatorio gastrointestinal, tal como la colitis ulcerativa. Los genes que se sobrerregulan o subrregulan incluyen BCL6 (Genbank Acc. núm. AW264036; SEQ ID NO: 1 18) y un gen (Genbank Acc. núm. AI689210; SEQ ID NO: 123), que comprende, opcionalmente, C5AR1 (Genbank Acc. núm. NM001736; SEQ ID NO: 1 19), FOLR1 ((Genbank Acc. núm. U81501 ; SEQ ID NO: 142) y/o OSM (Genbank Acc. núm. A1079327; SEQ ID NO: 173) y, opcionalmente, comprenden también un gen presentado en el Cuadro A {por ejemplo, SEQ ID NO: 1 10 a 203). Los perfiles de expresión de estos genes se pueden medir por medio del uso de una o más sondas seleccionadas del grupo que consiste de la SEQ ID NO: 1 a 109.

El sujeto exhibe una respuesta terapéutica a al menos un agente anti-TNFa por ejemplo, infliximab, golimumab, Enbrel™, Humira ™, u otro fármaco anti-TNF biológico o de molécula pequeña, en donde se ha diagnosticado al sujeto una colitis ulcerativa u otro trastorno gastrointestinal, tal como, pero sin limitarse a, enfermedad de Crohn, trastorno inflamatorio intestinal y similares, incluso formas leves, moderadas, severas, pediátricas o adultas, así como otras formas tales como, pero sin limitarse a, formas resistentes a esteroides, metotrexato o NSAID de trastornos gastrointestinales.

En una modalidad la presente invención usa un panel genético en un método de evaluación de la eficacia de los agentes candidato para el tratamiento de la colitis ulcerativa o trastornos relacionados, por ejemplo, en momentos tempranos del tratamiento, en donde la eficacia de este puede no ser medible por los síntomas o características tradicionales de la enfermedad.

En una modalidad particular, la presente invención comprende un método para predecir la adecuación de un tratamiento para la colitis ulcerativa basado en el patrón de expresión genética de uno o más genes que constituyen el perfil anterior al tratamiento.

Además, la presente invención comprende un método para identificar sujetos con colitis ulcerativa y/o trastornos relacionados que son candidatos al tratamiento con un agente terapéutico particular, al evaluar su perfil de expresión de uno o más de estos SNP (polimorfismo de nucleótido simple) del panel que son receptores de TNF.

En otra modalidad el perfil del gen relacionado con la colitis ulcerativa se usa para crear un método basado en una matriz con fines prognósticos o diagnósticos; el método comprende: a) preparar una muestra de ácidos nucleicos a partir de una muestra obtenida del sujeto; y b) poner la muestra en contacto con un panel de segmentos de ácido nucleico, SEQ ID NO: 1-109) que comprende una porción de BCL6 (Genbank Acc. núm. AW264036; SEQ ID NO: 118) y tx82a04.x1 (Genbank Acc. núm. AI689210; SEQ ID NO: 123), opcionalmente comprende también C5AR1 ((Genbank Acc. núm. NM001736; SEQ ID NO: 1 19), FOLR1 ((Genbank Acc. núm. U81501 ; SEQ ID NO: 142) y OSM (Genbank Acc. núm. A1079327; SEQ ID NO: 173) comprende, opcionalmente, además, un gen enumerado en el Cuadro A o D (por ejemplo, SEQ ID NO: 110-203) con una respuesta terapéutica a un agente TNFa (por ejemplo, infliximab, golimumab, Enbrel™, Humira™, u otro fármaco de molécula pequeña o fármaco biológico anti-TNF), en sujetos con colitis ulcerativa u otro trastorno gastrointestinal tal como, pero sin limitarse a, enfermedad de Crohn, trastorno inflamatorio intestinal y similares, incluso formas leves, moderadas, severas, pediátricas o adultas, así como otras formas tales como, pero sin limitarse a, formas resistentes a esteroides, metotrexato o NSAID de trastornos gastrointestinales.

Opcionalmente, se hace un análisis estadístico de los cambios en los niveles de expresión de los miembros del panel correspondiente del gen SNP para evaluar la importancia de estos cambios e identificar a los miembros significativos del panel.

En una modalidad alternativa, la presente invención comprende un equipo para predecir la adecuación de los agentes candidato para tratar la colitis ulcerativa y/o los trastornos relacionados o los trastornos basados en la patrón de expresión genética.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1 . Análisis de distribución de ruta de referencia entre sujetos que responden y sujetos que no responden al infliximab. El análisis de distribución de la ruta de los genes expresados diferencialmente en los valores iniciales entre sujetos que responden y sujetos que no responden se muestra como porcentaje de genes (eje X) en una ruta dada entre el número total de genes incluido en la lista de entrada que tiene anotaciones de GeneOntology. Todas las mejoras son estadísticamente significativas (valor p del puntaje de la prueba exacta de Fisher < 0.05).

Figura 2. Agrupamiento jerárquico que usa el clasificador de referencia de 20 conjuntos de sondas. Agrupamiento jerárquico del clasificador de 20 conjuntos de sondas en 12 sujetos que responden frente a 1 1 muestras de sujetos que no responden antes del tratamiento con infliximab. La matriz de similitud se calculó mediante la correlación de Pearson alrededor del 0 (correlación estándar en GeneSpring).

Figura 3. Agrupamiento jerárquico que usa el clasificador de referencia de 5 conjuntos de sondas. Agrupamiento jerárquico del clasificador de 5 conjuntos de sondas en 12 sujetos que responden, frente a 1 muestras de sujetos que no responden del conjunto de entrenamiento (A) para 8 sujetos que responden y 16 que no responden del conjunto de prueba antes del tratamiento con infliximab. La matriz de similitud se calculó mediante la correlación de Pearson alrededor de 0 (correlación estándar en GeneSpring).

Figura 4. Perfil de expresión de sujetos que responden/que no responden al infliximab del clasificador de 5 conjuntos de sondas. Representación con línea de puntos que compara a las sujetos que responden a infliximab con los sujetos que no responden, del clasificador del conjunto de sondas 5. Se muestran las intensidades normalizadas de cada muestra (círculo negro). También se muestra la intensidad media, el percentil 75 y 25 y los valores mínimos y máximos para la población de cada sujeto que responde y sujeto que no responde para cada uno de los 5 genes.

Figura 5. Agrupamiento jerárquico de la cohorte de Leuven del clasificador de 20 conjuntos de 20 sondas entre los 8 sujetos que responden y los 16 que no responden demostró que los 4 que no responden mal clasificados y el sujeto que responde mal clasificado tienen perfiles de expresión muy similares a los sujetos que responden y que no responden, respectivamente.

Figura 6. Juegos de sondas comunes y únicas que comparan el ACT1 con la cohorte de validación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Una "actividad", una actividad biológica, y una actividad funcional de un polipéptido se refieren a una actividad ejercida por un gen, o proteina codificada por un gen, del panel genético relacionado con la colitis ulcerativa en respuesta a su interacción específica con otra proteína o molécula, tal como se determina in vivo, in situ, o in vitro, de conformidad con técnicas estándar. Dichas actividades pueden ser una actividad directa, tal como una asociación, o una actividad enzimática en una segunda proteína, o una actividad indirecta, tal como un proceso celular mediado por la interacción de la proteína con una segunda proteína, o una serie de interacciones como en la señalización intracelular o la cascada de coagulación.

Un "anticuerpo" incluye cualquier polipéptido o péptido que contiene una molécula que comprende al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como, pero sin limitarse a, al menos una región de determinación de complementariedad (CDR) de una cadena liviana o pesada o una porción de aglutinante de esta, una región variable de cadena pesada o liviana, una región constante de cadena pesada o liviana, una región de marco, o cualquier porción, fragmento o variante de estos. También se pretende que el término "anticuerpo" comprenda anticuerpos, fragmentos de la digestión, porciones y variantes de estos, que incluyen miméticos de anticuerpos o porciones de anticuerpos que repiten la estructura y/o la función de un anticuerpo o fragmento especificado o porción de ellos, incluso anticuerpos de cadena simple y fragmentos de ellos. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab (por ejemplo, por digestión de papaína Fab' {por ejemplo, por digestión y reducción parcial de pepsina F(ab')2 (por ejemplo, por digestión de pepsina), facb (por ejemplo, por digestión de plasmina), pFc' (por ejemplo, por digestión de pepsina o plasmina), Fd (por ejemplo, por digestión, reducción parcial y reagregado de pepsina), Fv o scFv (por ejemplo, por técnicas de biología molecular) fragmentos, y anticuerpos de dominio simple (por ejemplo, VH o VL) pertenecen a la invención (véase, por ejemplo, Colligan, y otros, eds, Current Protocols in inmunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan y otros, Current Protocols in polipéptido Science, John Wiley & Sons, NY (1997-2001)).

Los términos "matriz" o "micromatriz", y "biochip" o "chip", como se usan en la presente descripción, se refieren a artículos de fabricación o dispositivos que comprenden una pluralidad de elementos de destino inmovilizados, y cada elemento de destino comprende un "clon", "función", "sitio" o área definida que comprende una composición particular, tal como una molécula biológica, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico o polipéptido, inmovilizada a una superficie sólida, tal como se analiza más en detalle más abajo.

"Complemento de" o "complementario a" una secuencia de ácido nucleico de la invención se refiere a una molécula polinucleótida que tiene una secuencia de base complementaria y una orientación inversa, al compararla con un primer polinucleótido.

"Identidad", como se conoce en la materia, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según lo determine la comparación de secuencias. En la materia, "identidad" también significa el grado de relación de las secuencias entre secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según se determinan por la correspondencia entre series de dichas secuencias. "Identidad" y "similitud" se pueden calcular fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero no se limitan a, los que se describen Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics y Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., editores, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., editores, M Stockton Press, New York, 1991 ; y Carillo, H., y Lipman, D., Siam J. Applied Math., 48:1073 (1988). Además, los valores por identidad de porcentaje se pueden obtener a partir de alineaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos generadas mediante el uso de configuraciones por defecto para el componente AlignX del Vector NTI Suite 8.0 (Informax, Frederick, MD).

Específicamente los términos "hibridar a", "hibridar específicamente a", "hibridación específica" y "hibridar selectivamente a", como se usan en la presente descripción, se refieren a aglutinar, duplicar o hibridar una molécula de ácido nucleico, preferentemente, a una secuencia particular de nucleótidos bajo condiciones estrictas. El término "condiciones estrictas" se refiere a condiciones bajo las que una sonda hibridará, preferentemente, su secuencia de destino y, en menor grado o ninguno, a otras secuencias. Una "hibridación estricta" y unas "condiciones de limpieza de hibridación estricta" en el contexto de hibridación de ácido nucleico (por ejemplo, como en una matriz, hibridaciones de Southern o Northern) son dependientes de la secuencia y son diferentes bajo distintos parámetros ambientales. Más abajo se describen en detalle condiciones alternativas de hibridación que se pueden usar para practicar la invención. En aspectos alternativos las condiciones de hibridación y/o limpieza se cumplen bajo condiciones moderadas, condiciones estrictas o muy estrictas, tal como se describe más abajo en mayor detalle. También se usan condiciones alternativas de limpieza en diferentes aspectos, como se describe en la presente descripción en mayor detalle.

Las frases "molécula biológica marcada" o "marcada con una composición detectable" o "marcada con una porción detectable", como se usan en la presente descripción, se refieren a una molécula biológica, por ejemplo, un ácido nucleico que comprende una composición detectable, es decir, un marcador como se describe en detalle más abajo El marcador también puede ser otra molécula biológica, como un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico en la forma de una estructura de horquilla como una "baliza molecular", tal como se describe más abajo. Esto incluye la incorporación de bases marcadas (o de bases que se puedan ligar a un marcador detectable) en el ácido nucleico mediante, por ejemplo, traslación de muescas, extensión aleatoria del cebador, ampliación con cebadores redundantes, y similares. Se puede usar cualquier marcador, por ejemplo, marcadores quimiluminiscentes, radiomarcadores, marcadores enzimáticos y similares. El marcador puede ser detectable por cualquier medio, por ejemplo, detección visual, espectroscópica, fotoquímica, bioquímica, inmunoquímica, física, química y/o quimiluminescente. La invención puede usar matrices que comprenden ácidos nucleicos inmovilizados que contienen marcadores detectables.

El término "ácido nucleico" como se usa en la presente descripción, se refiere a desoxirribonucleótido (ADN) o bonucleótido (ARN) en forma de cadena simple o cadena doble. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales. El término ácido nucleico se usa intercambiablemente con gen, ADN, ARN, ADNc, ARNm, cebador oligonucleótido, sonda y producto de ampliación. El término también abarca análogos del esqueleto del ADN tales como fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato, alquil fosfotriéster, sulfamato, 3'-tioacetal, metileno (metilimino), 3'-N-carbamato, morfolino carbamato, y ácido nucleicos péptidos (PNA).

Los términos "muestra" o "muestra de ácidos nucleicos", como se usan en la presente descripción, se refieren a una muestra que comprende un ADN o ARN, o un ácido nucleico representativo de ADN o ARN aislado de una fuente natural. Una "muestra de ácidos nucleicos" es una forma adecuada de hibridación, por ejemplo, como en una solución acuosa soluble) a otro ácido nucleico (por ejemplo, sondas inmovilizadas). El ácido nucleico de muestra se puede aislar, clonar o extraer de ciertas células o tejidos. La muestra de células o tejidos con la que se preparó la muestra de ácido nucleico se toma, típicamente, de un paciente que tiene o se sospecha que tiene CU o una enfermedad o afección relacionada. Los métodos para aislar muestras de células y tejidos son del conocimiento de las personas con experiencia en la materia e incluyen, pero no se limitan a, aspiraciones, cortes de tejido, biopsias con aguja, y similares. Frecuentemente, la muestra es una "muestra clínica", que es una muestra derivada de un paciente, que incluye cortes de tejido tales como cortes congelados o cortes con parafina tomados con fines histológicos. La muestra también se puede derivar de sobrenadantes (de células) o de las células mismas tomadas de pacientes o de cultivos celulares, células de cultivos de tejido y otros medios con los que sea deseable detectar la respuesta de los candidatos a los fármacos. En algunos casos los ácidos nucleicos se pueden ampliar por medio del uso de técnicas estándar tales como PCR, antes de la hibridación. La sonda se puede producir y, colectivamente, ser representativa de una fuente de ácidos nucleicos extraída de una o más porciones particulares (preseleccionadas) de, por ejemplo, una recolección de productos de ampliación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), prácticamente un cromosoma entero o un fragmento de cromosoma o, prácticamente, un genoma entero, por ejemplo, como una recolección de clones, por ejemplo, BAC, PAC, YAC, y similares (ver más abajo.

Los "ácidos nucleicos" son polímeros de nucleótidos, en donde un nucleótido comprende una base enlazada a un azúcar, que a su vez está enlazado a otro mediante una molécula de intercesión al menos bivalente, tal como el ácido fosfórico. En ácidos nucleicos de origen natural, el azúcar es 2'-desoxiribosa (ADN) o ribosa (ARN). Los poli u oligonucleótidos no naturales contienen bases modificadas, azúcares o moléculas enlazantes pero se entiende, generalmente, que imitan a la naturaleza complementaria de los ácidos nucleicos de origen natural sobre los que están diseñados. Un ejemplo de un oligonucleótido no natural es una composición molecular no codificante que tiene una cadena principal de fosforotioatos. Un "oligonucleótido" se refiere, generalmente, a una molécula de ácido nucleico que tiene menos de 30 nucleótidos.

El término "perfil" significa un patrón y se relaciona con la magnitud y dirección de cambio de un cierto número de funciones. El perfil se puede interpretar estrictamente, es decir, en donde la variación en la magnitud y/o el número de funciones dentro del perfil muestra la característica que es sustancialmente similar al perfil de referencia, o se puede interpretar en forma menos estricta, por ejemplo, al requerir una tendencia en lugar de una correspondencia absoluta de todo el subconjunto de características de las funciones.

Los términos "proteína", "polipéptido", y "péptido" incluyen "análogos" o "variantes conservadoras" y "miméticos" o "peptidomiméticos" con estructuras y actividades que corresponden sustancialmente al polipéptido del que se derivó la variante, según se analiza en detalle más arriba.

Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por ligaduras péptidas, y un péptido se refiere, generalmente, a polímeros de aminoácidos de 12 residuos o menos. Las ligaduras péptidas se pueden producir naturalmente al ser dirigidas por la plantilla de ácido nucleico, o sintéticamente por métodos bien conocidos en la materia.

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína puede comprender, además, grupos sustituyentes unidos a los grupos secundarios de aminoácidos que no participan en la formación de los enlaces peptídicos. Típicamente, las proteínas formadas por la expresión de células eucarióticas también contienen carbohidratos. Las proteínas se definen en la presente descripción en términos de su secuencia de aminoácidos o cadena principal y los sustituyentes no se especifican, sean conocidos o no.

El término "receptor" denota una molécula que tiene la capacidad de afectar la actividad biológica en, por ejemplo, una célula, como resultado de la interacción con un par ligando o aglutinante específico. Los receptores unidos a la membrana celular se caracterizan por un dominio ligando-aglutinante extracelular, uno o más dominios que abarcan membranas o transmembranas, y un dominio efector intracelular que participa, típicamente, de la transducción de la señal. La unión de ligandos a receptores de membrana celular provoca cambios en el dominio extracelular que se comunican a través de la membrana celular, una interacción directa o indirecta con una o más proteínas ¡ntracelulares, y la alteración de las propiedades celulares, tales como la actividad enzimática, la forma celular o el perfil de expresión genética. Los receptores también se pueden desatar de la superficie celular y pueden ser citosólicos, nucleares, o totalmente liberados de la célula. Los receptores no asociados con las células se llaman receptores solubles o ligandos.

Todas las publicaciones o patentes citadas en la presente descripción se incorporan en su totalidad a la presente descripción como referencia, se designen o no específicamente en consecuencia, ya que demuestran lo más novedoso al momento de la presente invención y/o proporcionan una descripción y habilitación de la presente invención. Las publicaciones se refieren a cualquier publicación científica o de patentes o cualquier otra información disponible en cualquier formato de medios, incluso todos los formatos grabados, electrónicos o impresos. Las siguientes referencias se incorporan en su totalidad a la presente descripción como referencia: Ausubel, y otros, ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1987-2008); Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2o. edición, Coid Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lañe, antibodies, a Laboratory Manual, Coid Spring Harbor, NY (1989); Colligan, y otros, editores, Current Protocols in inmunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2008); Colligan y otros, Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY (1997-2008).

Identificación y validación del panel genético La presente invención proporciona nuevos métodos para examinar moléculas que modulan los síntomas de la colitis ulcerativa. Esta invención describe la asociación genética de un conjunto de genes sobrerregulados o subregulados con sujetos que responden al anti-TNF en el trastorno inflamatorio gastrointestinal, tal como la colitis ulcerativa, con BCL6 (Genbank Acc. núm. AW264036; SEQ ID NO: 1 8)y tx82a04.x1 (Genbank Acc. núm. AI689210; SEQ ID NO: 123), comprende, opcionalmente, además, C5AR1 ((Genbank Acc. núm. NM001736; SEQ ID NO: 119), FOLR1 ((Genbank Acc. núm. U8150 ; SEQ ID NO: 142) y OSM (Genbank Acc. núm. A1079327; SEQ ID NO: 173)), comprende, opcionalmente, además un gen presentado en el Cuadro A (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 10-203) con agentes de respuesta terapéutica anti-TNFa {por ejemplo, infliximab, golimumab, Enbrel™, Humira™, u otro fármaco biológico o de molécula pequeña anti-TNF), en sujetos con colitis ulcerativa u otro trastorno gastrointestinal, tales como, pero sin limitarse a, enfermedad de Crohn, trastorno inflamatorio intestinal y similares, incluso formas leves, moderadas, severas, pediátricas o adultas, así como otras formas tales como, pero sin limitarse a, esferoides, metotrexato o formas resistentes a NSAID en trastornos gastrointestinales.

La identificación de estas secuencias (genes o de aquí en adelante "secuencias de genes relacionados con la colitis ulcerativa") que se expresan diferencialmente en el tejido de la enfermedad o en respuesta a la terapia anti-TNF, permite el uso de esta información de distintas formas. Por ejemplo, la evaluación de un régimen de tratamiento en particular se puede hacer con información provista por el perfil de expresión de los genes biomarcadores asociados a la CU.

Esto se puede hacer al fabricar biochips que comprenden conjuntos complementarios de estas secuencias, que luego se pueden usar en estos exámenes (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-109). Estos métodos también se pueden aplicar sobre la base de proteínas, es decir, niveles de expresión de proteínas relacionados con la colitis ulcerativa, ya que estas proteínas producto de genes se pueden evaluar con fines diagnósticos para seleccionar sujetos que responden al tratamiento anti-TNF o para examinar la terapéutica en candidatos adicionales. Además, las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden el perfil genético relacionado con la colitis ulcerativa se pueden usar para medir si es probable que un paciente responda a una terapéutica antes del tratamiento.

Las secuencias genéticas relacionadas con la colitis ulcerativa pueden incluir secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos. En una modalidad preferida las secuencias genéticas relacionadas con la colitis ulcerativa son ácidos nucleicos recombinantes. El término "ácido nucleico recombinante" en la presente descripción significa ácido nucleico formado originalmente in vitro, generalmente, por la manipulación de ácido nucleico por polimerasas y endonucleasas, en una forma que no se encuentra normalmente en la naturaleza. Por lo tanto, un ácido nucleico aislado, en forma lineal, o un vector de expresión formado in vitro al ligar moléculas de ADN que normalmente no se juntan, se consideran recombinantes para los propósitos de esta invención. Se entiende que una vez que se fabrica un ácido nucleico recombinante, y se lo reintroduce en una célula u organismo anfitrión, se replica en forma no recombinante, es decir, se usa la maquinaria celular in vivo de la célula anfitriona, en lugar de manipulaciones in vitro; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, una vez producidos en forma recombinante, aunque se repliquen subsiguientemente en forma no recombinante, todavía se consideran recombinantes para los propósitos de la invención.

Método de práctica de la invención La invención proporciona in vitro, in situ, o in silicio, ácido nucleico, proteínas y/o métodos basados en matrices que se basan en la cantidad relativa de una molécula aglutinante (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico) en dos o más muestras. También se proporcionan métodos implementados por computadora para determinar la cantidad de una molécula aglutinante (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico) en dos o más muestras, con la cantidad aglutinante relativa determinada para predecir la capacidad de respuesta a una terapia en particular, y controlar y mejorar el tratamiento terapéutico.

Al practicar los métodos de la invención se aplican una o más muestras de moléculas biológicas marcadas (por ejemplo, ácido nucleico) a dos o más ensayos o matrices. Dichos ensayos o matrices tienen prácticamente el mismo complemento de molécula aglutinante inmovilizada (por ejemplo, ácido nucleico inmovilizado capaz de hibridar una muestra hibridada de ácido nucleico). Las dos o más matrices son, típicamente, copias múltiples de la misma matriz. Sin embargo, porque cada "sitio", "clon" o "función" de la matriz tiene moléculas biológicas similares (por ejemplo, ácido nucleicos de la misma secuencia) y las moléculas biológicas (por ejemplo, ácido nucleico) son conocidas en cada sitio, como es típico en el ácido nucleico y otras matrices, no es necesario que las matrices múltiples usadas en la invención sean idénticas en configuración; sólo es necesario que la posición de cada función en el sustrato sea conocida, es decir, tenga una dirección. Por ello, en un aspecto, las moléculas biológicas múltiples (por ejemplo, ácido nucleico) en las muestras están comparativamente unidas a la matriz (por ejemplo, hibridadas simultáneamente) y la información reunida se codifica para que los resultados se basen las propiedades inherentes a la función (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico) y no en la posición del sustrato.

Ampliación de ácido nucleicos Los métodos bien conocidos de ampliación del ácido nucleico con el uso de cebadores oligonucleótidos se pueden usar para generar ácidos nucleicos usados en las composiciones y métodos de la invención, para detectar o medir niveles de muestras de prueba o control hibridados a una matriz, y similares, por ejemplo, para detectar la presencia de polimorfismos TNFR SNP de la presente invención. El técnico con experiencia puede seleccionar y diseñar cebadores adecuados de ampliación de oligonucleótidos. Los métodos de ampliación también son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, PCR (PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS y APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y. (1990) y PCR STRATEGIES (1995), ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y., reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Wu (1989) Genomics 4:560; Landegren (1988) Science 241 :1077; Barringer (1990) Gene 89:1 17); ampliación de la transcripción (véase, por ejemplo, Kwoh (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 86:1 173); y, replicación de la secuencia autosustentada (véase por ejemplo, Guatelli (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 87:1874); amplificación de la replicasa Q Beta (véase, por ejemplo, Smith (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491), ensayo de amplificación automatizado de replicasa Q-beta (véase, por ejemplo, Burg (1996) Mol. Cell. Probes 10:257-271) y otras técnicas mediadas por polimerasa de ARN {por ejemplo, NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario); véase también Berger (1987) Methods Enzymol. 152:307-316; Sambrook; Ausubel; patentes de los EE. UU núms. 4,683,195 y 4,683,202; Sooknanan (1995) Biotechnology 13:563-564.

Hibridación de ácidos nucleicos Al practicar los métodos de la invención se hibridan muestras de prueba y control de ácido nucleico en sondas de ácido nucleico inmovilizado, por ejemplo, en matrices. En aspectos alternativos, la hibridación y/o condiciones de limpieza se hacen bajo condiciones moderadas, estrictas o muy estrictas. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en por ejemplo, Sambrook Ausubel, Tijssen. Generalmente, la hibridación y las condiciones de limpieza muy estrictas se seleccionan para ser aproximadamente 5 °C menores que la temperatura de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica bajo una resistencia iónica y pH definidos. Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica y pH definidos) a la que el 50 % de la secuencia de destino se híbrida con una sonda perfectamente ajustada. Se seleccionan condiciones muy estrictas para igualar la Tm para una sonda en particular. Un ejemplo de condiciones estrictas de hibridación para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en una matriz o un filtro en una membrana de Southern o Northern es 42 °C con soluciones de hibridación estándar (véase, por ejemplo, Sambrook), y la hibridación se hace durante toda la noche. Un ejemplo de condiciones de limpieza muy estrictas es 0.15 M NaCI a 72 °C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de limpieza estrictas es una limpieza de 0.2> SSC a 65 °C durante 15 minutos (véase, por ejemplo, Sambrook). Frecuentemente, una limpieza muy estricta está precedida por una limpieza medianamente o poco estricta para eliminar señales anteriores de la sonda. Un ejemplo de limpieza medianamente estricta para un híbrido de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1 *SSC a 45 °C durante 15 minutos. Un ejemplo de limpieza poco estricta para un híbrido de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4* a 6*SSC a 40 °C durante 15 minutos.

En aspectos alternativos de las composiciones y métodos de la invención, por ejemplo, al practicar la hibridación comparativa de ácido nucleico, tal como la hibridación genómica comparativa (CGH) con matrices, las tinturas fluorescentes Cy3® y Cy5® se usan para marcar diferencialmente fragmentos de ácido nucleico en dos muestras, por ejemplo, el ácido nucleico inmovilizado por la matriz frente a el ácido nucleico de muestra, o el ácido nucleico generado a partir de un control en comparación con una célula o tejido de prueba. Muchos instrumentos comerciales se diseñan para acomodar la detección de estas dos tinturas. Para aumentar la estabilidad de Cy5® o de los flúores de otros compuestos sensibles a la oxidación se pueden usar antioxidantes y depuradores de radicales libres en mezclas de hibridación en la hibridación y/o en las soluciones de limpieza. Por lo tanto, las señales de Cy5® aumentan dramáticamente y se pueden lograr tiempos de hibridación más largos. Véase la patente núm. WO 0194630 A2 y la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20020006622.

Para aumentar la sensibilidad a la hibridación, la hibridación se puede realizar en un ambiente con humedad controlada e insaturada; por lo tanto, la eficacia de la hibridación mejora significativamente si la humedad no es saturada. Véase la patente núm. WO 0194630 A2 y la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20020006622. La eficacia de la hibridación se puede mejorar si la humedad se controla dinámicamente, es decir, si la humedad cambia durante la hibridación. La transferencia de masa se facilita en un ambiente con humedad dinámicamente equilibrada. La humedad en el ambiente de hibridación se puede ajustar gradualmente o continuamente. Se pueden usar dispositivos de matriz que comprenden cajas protectoras y controles que permiten que el operador controle la humedad durante la prehibridación, hibridación, limpieza y/o etapas de detección. El dispositivo puede tener componentes de detección, control y memoria para permitir la reprogramación de los controles de humedad y temperatura (que son constantes y precisos y fluctúan) y otros parámetros durante todo el ciclo de procedimiento, incluso las etapas de prehibridación, hibridación, limpieza y detección. Véase la patente núm. WO 0194630 A2 y la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20020006622.

Los métodos de la invención pueden comprenden condiciones de hibridación que comprenden fluctuaciones osmóticas. La eficacia de la hibridación, (es decir, la relación entre tiempo y equilibrio) también se puede mejorar mediante un ambiente de hibridación que comprende el cambio de hiper/hipo-tonicidad, por ejemplo, un gradiente de soluto El gradiente de soluto se crea en el dispositivo. Por ejemplo, una solución de hibridación de poca sal se coloca a un lado de la cámara de hibridación de la matriz y se coloca un amortiguador al otro lado para generar un gradiente de soluto en la cámara. Véase la patente núm. WO 0194630 A2 y la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20020006622.

Bloqueo de la capacidad de hibridación de las secuencias repetitivas de ácidos nucleicos Los métodos de la invención pueden comprender una etapa de bloqueo de la capacidad de hibridación de las secuencias repetitivas de ácido nucleico (es decir, bloqueo de la "capacidad de hibridación") en los segmentos inmovilizados de ácido nucleico. La capacidad de hibridación de secuencias repetitivas de ácido nucleico en las secuencias de muestra de ácido nucleico se puede bloquear al mezclar secuencias de muestra de ácido nucleico con secuencias repetitivas de ácido nucleico no marcadas o marcadas alternativamente. Las secuencias de muestra de ácido nucleico se pueden mezclar con secuencias repetitivas de ácido nucleico antes de ponerlas en contacto con los segmentos inmovilizados de ácido nucleico. El bloqueo de secuencias es, por ejemplo, ADN de Cot-1 , ADN de esperma de salmón o secuencias genómicas repetitivas específicas. Las secuencias repetitivas de ácido nucleico se pueden desmarcar. Se conoce un cierto número de métodos para eliminar y/o inhabilitar la capacidad de hibridación de secuencias repetitivas con el uso de, por ejemplo, Cot-1 ; véase, por ejemplo, Craig (1997) Hum. Genet. 100:472-476; patente núm. WO 93/18186. Las secuencias repetitivas de ADN se pueden eliminar de las sondas de genoteca mediante purificación magnética y PCR de afinidad; véase, por ejemplo, Rauch (2000) J. Biochem. Biophys. Methods 44:59-72.

Las matrices son, genéricamente, una pluralidad de elementos de destino inmovilizados sobre la superficie de la placa, definidos como "sitios" o "grupos" o "funciones", cada uno de cuyos elementos de destino comprende una o más moléculas biológicas {por ejemplo, ácidos nucleicos o polipéptidos) inmovilizados a una superficie sólida para aglutinamiento específico (por ejemplo, hibridación) a una molécula en una muestra. Los ácidos nucleicos inmovilizados pueden contener secuencias de mensajes específicos (por ejemplo, como genotecas de ADNc) o genes (por ejemplo, genoteca genómicas), que incluyen un genoma humano. Otros elementos de destino pueden contener secuencias de referencia y similares. Las moléculas biológicas de las matrices se pueden disponer sobre la superficie sólida en diferentes tamaños y densidades. Las densidades de las moléculas biológicas en un grupo y el número de grupos en la matriz dependerá de un cierto número de factores, tales como la naturaleza del marcador, el apoyo sólido, el grado de hidrofobicidad de la superficie del sustrato, y similares. Cada función puede comprender, prácticamente, la misma molécula biológica (por ejemplo, ácido nucleico), o una mezcla de moléculas biológicas (por ejemplo, ácidos nucleicos de diferentes longitudes y/o secuencias). Por lo tanto, por ejemplo, una función puede contener más de una copia de una pieza clonada de ADN, y cada copia se pude descomponer en fragmentos de diferentes longitudes.

Las superficies de sustratos de matrices sobre las que se inmovilizan las moléculas biológicas (por ejemplo, ácidos nucleicos) pueden incluir nitrocelulosa, vidrio, cuarzo fundido, silicio, plásticos y similares se analizan a continuación, más abajo. Las composiciones y métodos de la invención pueden incorporar en su totalidad o en parte diseños de matrices y componentes y métodos asociados, según se describe, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos núms. 6,344,316; 6,197,503; 6,174,684; 6,159,685; 6,156,501 ; 6,093,370; 6,087,1 12; 6,087, 103; 6,087,102; 6,083,697; 6, 080,585; 6,054,270; 6,048,695; 6,045,996; 6,022,963; 6,013,440; 5,959,098; 5,856,174; 5,843,655; 5,837,832; 5,770,456; 5,723,320; 5,700,637; 5,695, 940; 5,556,752; 5,143,854; véase también, por ejemplo, patente núm. WO 99/51773; patente núm. WO 99/09217; patente núm. WO 97/46313; patente núm. WO 96/17958; patente núm. WO 89/10977; Véase también, por ejemplo, Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-174; Schummer (1997) Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; Solinas- Toldo (1997) Genes, Chromosomes & Cáncer 20:399-407; Bowtell (1999) Nature Genetics Supp. 21 :25-32; Epstein (2000) Current Opinión in Biotech. 11 :36-41 ; Mendoza (1999 Biotechniques 27: 778-788; Lueking (1999) Anal. Biochem. 270:103-111 ; Davies (1999) Biotechniques 27:1258-1261 .

Superficies de sustrato Las superficies de sustrato que se pueden usar en las composiciones y métodos de la invención incluyen, por ejemplo, vidrio (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,843,767), cerámica, y cuarzo. Las matrices pueden tener superficies de sustrato de un material rígido, semirrígido o flexible. La superficie del sustrato puede ser chata o aplanada, con huecos, áreas levantadas, hendiduras grabadas, porosa, globulada, con filamentos, y similares. Las superficies de sustrato pueden comprender, además, varios materiales tales como nitrocelulosa, papel, sustratos cristalinos (por ejemplo, arseniuro de galio), metales, metaloides, polacriloilmorfólidos, varios plásticos y copolímeros de plástico, Nylon®, Teflon®, polietileno, polipropileno, látex, polimetacrilato, poli (etileno tereftalato), rayón, nailon, poli-(butirato de vinilo), y acetato de celulosa. Los sustratos pueden estar revestidos y el sustrato y el revestimiento se pueden funcionalizar para, por ejemplo, permitir la conjugación de una amina.

Matrices que comprender las secuencias de calibración La invención contempla el uso de matrices que comprenden secuencias de calibración inmovilizada para normalizar los resultados de reacciones de hibridación basadas en matrices, y métodos para usar estas secuencias de calibración, por ejemplo, para determinar el número de copia de una secuencia de calibración para "normalizar" o "calibrar" perfiles de relación. Las secuencias de calibración pueden ser prácticamente las mismas que una secuencia única en una secuencia de ácido nucleico inmovilizado en una matriz. Por ejemplo, una secuencia "marcadora" de cada "sitio" o "biositio" en una matriz (que está presente sólo en ese sitio, haciéndolo un "marcador" para ese sitio) está representada por una secuencia correspondiente en uno o más sitios de "control" o "calibración".

Los "sitios de control" o "sitios de calibración" se usan para "normalización", para proporcionar información que sea confiable y repetible. Los sitios de control pueden proporcionar un resultado coherente, independientemente de la muestra marcada hibridada a la matriz (o molécula aglutinante marcada de una muestra). Los sitios de control se pueden usar para generar una curva de "normalización" o "calibración" para compensar los posibles errores de intensidad entre las dos (o más matrices usadas in silicio, métodos de la invención basados en matrices.

Un método para generar un control de la matriz sería usar una mezcla equimolar de todas las moléculas biológicas {por ejemplo, secuencias de ácido nucleico) marcadas en la matriz, y generar un sólo sitio. Este único sitio tendría iguales cantidades de las moléculas biológicas (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico) de todos los otros sitios de la matriz. Se pueden generar sitios de control múltiple al variar la concentración de la mezcla equimolar.

Muestras y especímenes El ácido nucleico de muestra se puede aislar, clonar, o extraer de células, tejidos u otros especímenes en particular. La muestra de células o tejidos a partir de la cual se preparó la muestra de ácido nucleico se toma, típicamente, de un paciente que tiene o tuvo colitis ulcerativa o una afección relacionada. Los métodos para aislar las muestras de células y tejidos son del conocimiento de aquellos con experiencia en la materia, e incluyen, pero no se limitan a, aspiraciones, cortes de tejido, biopsias con aguja y similares. Frecuentemente, la muestra es una "muestra clínica", que es una muestra derivada de un paciente, que incluye muestras enteras de sangre, suero, plasma, o cortes de tejidos, tales como cortes congelados o mantenidos en parafina tomados con fines histológicos. La muestra también se puede derivar de sobrenadantes (de células) o de las propias células tomadas de pacientes o de cultivos celulares, células de cultivo de tejidos y otros medios por los que se puede desear detectar la respuesta a los fármacos de los candidatos. En algunos casos los ácidos nucleicos se pueden ampliar por medio del uso de técnicas estándar tales como PCR, antes de la hibridación.

En una modalidad la presente invención es un método de pretratamiento para predecir la regresión o resolución de la enfermedad. El método incluye (1) tomar una biopsia de tejido adecuado u otro espécimen de un individuo diagnosticado con colitis ulcerativa o una enfermedad o afección relacionadas, (2) medir los niveles de expresión de los genes del perfil del panel, (3) comparar el nivel de expresión del pretratamiento de los genes con un perfil de referencia del pretratamiento tomado de sujetos que responden al tratamiento, y (4) predecir la respuesta al tratamiento al controlar los niveles de expresión del panel de genes.

Métodos para evaluar la utilidad de los biomarcadores La utilidad prognóstica del presente panel de genes marcadores para evaluar la respuesta de un paciente al tratamiento o para la prognosis de una enfermedad se puede validar mediante otros medios de evaluación para evaluar el estado de enfermedad de un paciente. Por ejemplo, la medición bruta de una enfermedad se puede evaluar y registrar mediante ciertos métodos de toma de imágenes, tales como, pero sin limitarse a, imágenes por tecnología fotográfica, radiométrica o magnética. Los índices generales de salud o enfermedad incluyen, además, la composición del suero o la sangre (proteínas, enzimas del hígado, pH, electrolitos, volumen de glóbulos rojos, hematocritos, hemoglobina, o proteínas específicas). Sin embargo, en algunas enfermedades, la etiología aún se entiende poco. La colitis ulcerativa es un ejemplo de dicha enfermedad.

Evaluación y control del paciente Los patrones de expresión de los genes durante el curso del tratamiento no se han estudiado en el tratamiento de la colitis ulcerativa u otros trastornos gastrointestinales, y no se ha identificado ninguno con valor predictivo. El panel de biomarcadores de expresión genética descrito en la presente descripción permite la generación de métodos de predicción rápida y confiable, herramientas diagnósticas que predicen el resultado clínico de un ensayo de colitis ulcerativa, o las herramientas prognósticas para rastrear la eficacia de la terapia para la colitis ulcerativa. Se proporcionan los métodos prognósticos basados en la detección de estos genes en una muestra. Estas composiciones se pueden usar, por ejemplo, en conexión con el diagnóstico, prevención y tratamiento de una variedad de enfermedades inflamatorias inmunes.

Agentes terapéuticos Antagonistas Como se usa en la presente descripción, el término "antagonista" se refiere a sustancias que inhiben o neutralizan la actividad biológica del producto genético del panel de genes de la invención relacionados con la colitis ulcerativa. Dichos antagonistas logran este efecto de distintas maneras. Una clase de antagonistas se liga a la proteína producto del gen con suficiente afinidad y especificad para neutralizar los efectos biológicos de la proteína. En esta clase de moléculas se incluyen los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, moléculas F(ab) o F(ab')2). Otra clase de antagonistas comprende fragmentos de proteína producto del gen, muteínas o pequeñas moléculas orgánicas, es decir, peptidomiméticos, que se ligarán a los pares aglutinantes cognados o ligandos del producto del gen para inhibir así la actividad biológica de la interacción específica del producto del gen con su ligando o receptor cognado. El antagonista del gen relacionado con la colitis ulcerativa puede ser de cualquiera de estas clases, siempre y cuando sea una sustancia que inhiba una actividad biológica del producto del gen.

Los antagonistas incluyen anticuerpos dirigidos a una o más regiones de la proteína producto del gen o de sus fragmentos, anticuerpos dirigidos al ligando o receptor cognado, y péptidos parciales del producto del gen o su ligando cognado que inhibe una actividad biológica del producto del gen. Otra clase de antagonistas incluye ARNip, ARNhc, moléculas no codificante y ADNzimas orientadas a la secuencia genética tal como se conoce en la materia que se describen la presente descripción.

Los anticuerpos adecuados incluyen los que compiten por ligarse a los productos del gen relacionado con la colitis ulcerativa con anticuerpos monoclonales que bloquean la activación del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa o impiden la ligadura del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa a su ligando cognado, o impiden la señalización del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa.

Una terapéutica orientada al inductor del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa puede proporcionar mayores oportunidades de éxito. La expresión genética se puede modular de varias formas diferentes, incluso el uso de ARNip, ARNhc, moléculas no codificantes y ADNzimas. Se puede diseñar ARNip, ARNhc, y ADNzimas sintéticas para orientar específicamente uno o más genes, y se pueden enviar fácilmente a las células in vitro o in vivo.

La presente invención abarca moléculas de ácido nucleico no codificante, es decir, moléculas que son complementarias a un ácido nucleico codificante que codifica un polipéptido producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa, por ejemplo, complementario a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenario, o complementario a una secuencia de ARNm. En consecuencia, un ácido nucleico no codificante puede hacer un enlace de hidrógeno a un ácido nucleico codificante. El ácido nucleico no codificante puede ser complementario a toda una cadena codificante, o solamente a una porción de esta, por ejemplo, la totalidad o parte de la región codificante de la proteína (o marco de lectura abierto). Una molécula de ácido nucleico no codificante puede ser no codificante para todos o parte de una región no codificante de la cadena codificante de una secuencia nucleótida que codifica un polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa. Las regiones no codificantes ("regiones no traducidas 5' y 3'") son las secuencias de 5' y 3' que flanquean la región codificante y no se traducen a aminoácidos.

La invención también proporciona proteínas quiméricas o de fusión. Como se usa en la presente descripción, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" comprende la totalidad o una parte (preferentemente, biológicamente activa) de un polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa ligado operativamente a un polipéptido heterólogo (es decir, un polipéptido que no sea el mismo polipéptido de producto del gen relacionado con la CU). Dentro de la proteína de fusión, el término "unido operativamente" busca indicar que el polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa y el polipéptido heterólogo se fusionan entre sí en el marco de lectura. El polipéptido heterólogo se puede fusionar con los amino-terminales o el carboxil-terminal del polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa. En otra modalidad un polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa o un dominio o fragmento activo de este se puede fusionar con una secuencia de proteínas heteróloga o un fragmento de esta para formar una proteina quimérica, en donde los polipéptidos, dominios o fragmentos no se unen extremo a extremo pero se interponen dentro del marco de proteínas heterólogo.

En otra modalidad la proteína de fusión es una proteína de fusión de inmunoglobulina en la que la totalidad o parte de un polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa se fusiona con secuencias derivadas de un miembro de la familia de las proteínas de inmunoglobulina. Las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto para inhibir una interacción entre un ligando (soluble o unido a una membrana) y una proteina sobre la superficie de una célula (receptora), para suprimir así la transducción in vivo. La proteína de fusión de inmunoglobulina se puede usar para afectar la biodisponibilidad de un ligando cognado de un polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa. La inhibición de la interacción ligando/receptor puede ser útil, terapéuticamente, para tratar trastornos proliferativos y diferenciados y para modular (por ejemplo, promover o inhibir) la supervivencia de la célula. Además, las proteínas de fusión de inmunoglobulina de la invención se pueden usar como inmunogenes para producir anticuerpos dirigidos contra un polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa en un sujeto, para purificar ligandos y para ensayos de detección para identificar moléculas que inhiben la interacción de receptores con ligandos.

Composiciones y sus usos De acuerdo con la invención, los antagonistas neutralizantes del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa, tales como los anticuerpos monoclonales, que se describen en la presente descripción, se pueden usar para inhibir la actividad del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa. Además, dichos antagonistas se pueden usar para inhibir la patogénesis de la colitis ulcerativa y los trastornos inflamatorios relacionados sensibles a dicho tratamiento, que pueden incluir, pero no se limitan a, enfermedades reumáticas. El individuo a tratar puede ser cualquier mamífero y, preferentemente, un primate, un animal de compañía que sea un mamífero y, con la máxima preferencia, un paciente humano. La cantidad de antagonistas administrados varía de acuerdo con el fin para el que se lo use y el método de administración.

Los antagonistas de genes relacionados con la colitis ulcerativa se pueden administrar mediante cualquier número de métodos que resultan en un efecto en el tejido, en el que se desea que la actividad patológica se impida o se detenga. Además, los antagonistas del gen relacionado con la colitis ulcerativa no necesitan estar presentes localmente para producir un efecto en la actividad del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa; por lo tanto, se pueden administrar donde sea que se logre acceder a los compartimientos o fluidos del cuerpo que contienen el producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa. En el caso de tejidos inflamados, malignos o comprometidos de cualquier otra forma, estos métodos pueden incluir la aplicación directa de una formulación que contiene los antagonistas. Dichos métodos incluyen la administración intravenosa de una composición líquida, la administración transdérmica de una formulación líquida o sólida, la administración oral, tópica, intersticial o interoperativa. La administración se puede afectar por la implantación de un dispositivo cuya función primaria puede no ser la de un vehículo de suministro de un fármaco.

Para los anticuerpos la dosis preferida es de aproximadamente 0.1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal (generalmente, aproximadamente 10 mg/kg a 20 mg/kg). Si el anticuerpo va a actuar en el cerebro, una dosis de aproximadamente 50 mg/kg a 100 mg/kg es, usualmente, adecuada. Generalmente, los anticuerpos parcialmente humanos y los anticuerpos totalmente humanos tienen una vida media más larga dentro del cuerpo humano que otros anticuerpos. En consecuencia, el uso de dosis menores y una administración menos frecuente a menudo es posible. Las modificaciones, tales como la lipidación, se pueden usar para estabilizar anticuerpos y mejorar la captación y la penetración en los tejidos, por ejemplo, en el cerebro). Un método para la lipidación de anticuerpos se describe en Cruikshank y otros ((1997) J. Acquired Immune Defíciency Syndromes y Human Retrovirology 14:193).

Las moléculas de ácido nucleico del antagonista del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa se pueden insertar en vectores y usarse como vectores de terapia genética. Los vectores de terapia genética se pueden suministrar a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local, (patente de los Estados Unidos núm. 5,328,470), o inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen y otros (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :3054- 3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia genética puede incluir el vector de terapia genética en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se inserta el vehículo de suministro genético. O bien, cuando el vector de suministro genético completo se puede producir intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro genético.

Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un envase, paquete o dispensador junto con las instrucciones de administración.

Farmacogenómica Los agentes o moduladores que tienen un efecto estimulante o inhibidor sobre la actividad o expresión de un polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa, según lo identifica un ensayo de detección descrito en la presente descripción, se pueden administrar a individuos para tratar (profilácticamente o terapéuticamente) trastornos asociados con actividad anómala del polipéptido. En conjunto con dicho tratamiento, se puede considerar la farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta de ese individuo a un compuesto o fármaco extraño) del individuo. Las diferencias en el metabolismo de la terapéutica pueden llevar a toxicidad severa o fracaso terapéutico al alterar la relación entre la dosis y la concentración en la sangre del fármaco farmacológicamente activo. Por ello, la farmacogenómica del individuo permite la selección de agentes eficaces (por ejemplo, fármacos) para tratamientos profiláctico o terapéuticos basados en un análisis del genotipo del individuo. Dicha farmacogenómica se puede usar, además, para determinar las dosificaciones adecuadas y los regímenes terapéuticos. En consecuencia, la actividad de un polipéptido producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa, expresión de un ácido nucleico producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa, o el contenido de una mutación de un gen de un producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa en un individuo se puede determinar para seleccionar así uno o más agentes adecuados para el tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo.

La farmacogenómica trata con variaciones hereditarias clínicamente significativas en respuesta a fármacos, debido a una disposición alterada a los fármacos y una acción anormal en las personas afectadas. Véase, por ejemplo, Linder (1997) Clin. Chem. 43(2): 254-266. Generalmente, se pueden diferenciar dos tipos de condiciones farmacogenéticas. Las condiciones genéticas transmitidas como factor simple que altera la forma en que actúan los fármacos en el cuerpo se conocen como "acción alterada de los fármacos". Las condiciones genéticas transmitidas como factores simples que alteran la forma en que actúa el cuerpo sobre los fármacos se conocen como "metabolismo alterado de los fármacos". Estas condiciones farmacogenéticas pueden ocurrir como defectos raros o como polimorfismos. Por ejemplo, la deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es una enzimopatía común hereditaria en la que la complicación clínica principal es la hemolisis después de la ingestión de fármacos oxidantes (antimalaria, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos) y el consumo de habas verdes.

Como una modalidad ilustrativa, la actividad del fármaco en la metabolización de enzimas es un gran determinante de la intensidad y duración de la acción del fármaco. El descubrimiento de polimorfismos genéticos de enzimas metabolizantes de fármacos {por ejemplo, N-acetiltransferasa 2 (NAT 2) y citocromo P450 (enzimas CYP2D6 y CYP2C19) ha dado una aplicación sobre por qué algunos pacientes no obtienen los efectos esperados de los fármacos o muestran una respuesta exagerada y toxicidad severa después de tomar la dosis estándar y segura de un fármaco. Estos polimorfismos se expresan en dos fenotipos en la población, el metabolizador (EM) amplio y el metabolizador (PM) reducido. (PM). Esta prevalencia de PM es diferente entre distintas poblaciones. Por ejemplo, el gen que codifica la CYP2D6 es altamente polimórfico, y se han identificado varias mutaciones en PM, que llevan a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los metabolizadores reducidos de CYP2D6 y CYP2C19 con bastante frecuencia sufren una respuesta exagerada al fármaco y efectos colaterales cuando reciben dosis estándar. Si un metabolito es la entidad terapéutica activa, un PM no mostrará respuesta terapéutica, según lo demuestra el efecto analgésico de la codeína mediada por su morfina de metabolito formado por CYP2D6. El otro extremo son los asi llamados metabolizadores ultrarrápidos, que no responden a dosis estándar. Recientemente, se identificó que la base molecular del metabolismo ultrarrápido se debía a una ampliación del gen CYP2D6.

Por lo tanto, la actividad de una colitis ulcerativa u otro polipéptido de producto del gen relacionado con un trastorno gastrointestinal, expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido, o contenido de la mutación de un gen que codifica el polipéptido en un individuo, se puede determinar para así seleccionar el o los agentes adecuados para un tratamiento terapéutico o profiláctico del individuo. Además, los estudios farmacogenéticos se pueden usar para aplicar el genotipado de alelos polimórficos que codifican enzimas metabolizadoras de fármacos a la identificación del fenotipo de la capacidad de respuesta a un fármaco de un individuo. Este conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o a la selección de fármacos, puede evitar las reacciones adversas o el fracaso terapéutico y así mejorar la eficacia terapéutica o profiláctica al tratar a un sujeto con un modulador de actividad o expresión del polipéptido, tal como un modulador identificado por uno de los ensayos de detección ilustrativos descritos en la presente descripción.

Métodos de tratamiento La presente invención proporciona métodos profilácticos y terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible de) un trastorno o de tener un trastorno asociado con una expresión anómala o actividad de un polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa y/o en el cual participe el polipéptido del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa La presente invención proporciona un método para modular o tratar una enfermedad o afección relacionada con el producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, tal como se conoce en la materia o tal como se describe en la presente descripción, por medio del uso de un antagonista del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa. Las composiciones del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa pueden encontrar un uso terapéutico en el tratamiento de la colitis ulcerativa o afecciones relacionadas, tales como la colitis ulcerativa u otros trastornos mediados por TNF.

La presente invención también proporciona un método para modular o tratar un enfermedad inmune relacionada, mediada por TNF, en una célula, tejido, órgano, animal o paciente, incluso, pero sin limitarse a, úlcera gástrica, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerativa, patología de Crohn, y similares. Véase, por ejemplo, the Merck Manual, Ediciones 12°. a 17°., Merck & Company, Rahway, NJ (1972, 1977, 1982, 1987, 1992, 1999), Pharmacotherapy Handbook, Wells y otros, eds., segunda edición, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (1998, 2000), cada una incorporada en su totalidad como referencia.

Los trastornos caracterizados por la expresión anómala o actividad de los polipéptidos del producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa se explican con más detalle en otras partes de esta descripción.

Métodos profilácticos En un aspecto la invención proporciona un método para prevenir sustancialmente en un sujeto una enfermedad o afección asociada con una expresión o actividad anómala de un polipéptido de un producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa, por medio de administrar al sujeto un agente que modula la expresión o una actividad del polipéptido. Los sujetos en riesgo por una enfermedad causada o fomentada por una expresión o actividad anómala de un producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa se pueden identificar mediante, por ejemplo, cualquier combinación de ensayos diagnósticos o prognósticos, tal como se escribe en la presente descripción. La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de síntomas característicos de la anomalía, de manera tal que una enfermedad o trastorno se previene, o bien se retrasa en su evolución. Según el tipo de anomalía, por ejemplo, se puede usar un agonista o un agente antagonista para tratar al sujeto. Se puede determinar el agente adecuado sobre la base de ensayos de detección descritos en la presente.

Métodos terapéuticos Otro aspecto de la invención se relaciona con los métodos para modular una expresión o actividad de un producto de un gen o gen relacionado con la colitis ulcerativa con fines terapéuticos. El método modulador de la invención supone poner en contacto una célula con un agente que module una o más de las actividades del polipéptido. Un agente que modula actividad puede ser un agente tal como se describe en la presente descripción, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando cognado de origen natural y el polipéptido, un péptido, un peptidomimético, u otra molécula pequeña. En una modalidad el agente estimula una o más de las actividades biológicas del polipéptido. En otra modalidad el agente inhibe una o más de las actividades biológicas del polipéptido del producto del gen o del gen relacionado con la colitis ulcerativa. Como ejemplos de dichos agentes inhibidores se incluyen moléculas de ácido nucleico no codificante y anticuerpos, y otros métodos descritos en la presente descripción. Estos métodos moduladores se pueden realizar ¡n vitro (por ejemplo, al cultivar la célula con el agente) o bien, in vivo (por ejemplo, al administrar el agente a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona métodos para tratar a un individuo que sufre una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión o actividad anómala de un polipéptido producto del gen relacionado con la colitis ulcerativa En una modalidad, el método supone la administración de un agente (por ejemplo, un agente identificado por un ensayo de detección que se describe en la presente descripción), o una combinación de agentes que modulan (por ejemplo, sobrerregulan o subrregulan) una expresión o actividad. La inhibición de la actividad es deseable en situaciones cuya actividad o expresión es anormalmente alta o sobrerregulada, y/o en la que la menor actividad tenga, probablemente, un efecto beneficioso.

Si bien la invención se ha descrito en términos generales, las modalidades de la invención se describen más detalle en los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes en cuanto alcance de las reivindicaciones.

Abreviaturas: ACT 1 Ensayo 1 - Colitis ulcerativa activa ANOVA Análisis de varianza C5a Complemento 5a DC Célula dendrítica FDR Indice de descubrimiento falso IEC Célula epitelial intestinal IL Interieucina ARNm ARN mensajero PMN Leucocitos polimorfonucleares TLR Receptor tipo toll TNFa Factor alfa de necrosis tumoral Th Células T ayudantes TREM-1 Receptor disparador expresado en células mieloides cu Colitis ulcerativa Ejemplo 1 Se usaron biopsias de mucosa colónica obtenidas de un subgrupo de pacientes en un estudio clínico, y se hizo un análisis retrospectivo de la expresión del ARN (ARNm) mensajero. Se identificaron patrones de expresión del ARNm que proporcionan un perfil molecular anterior al tratamiento con infliximab, que distingue a los sujetos que responden de los que no responden al tratamiento. Las moléculas identificadas se usaron para definir las firmas de la respuesta molecular del gen 20- y 5-, que clasificó con precisión a los pacientes como sujetos que responden o que no responden.

Se aplicaron conjuntos de sondas con firmas de respuesta a una segunda cohorte independiente de pacientes. Los resultados confirmaron la capacidad de los conjuntos de sondas para clasificar con precisión a los sujetos antes del tratamiento con infliximab.

Infliximab, un anticuerpo monoclonal anti-TNFa, es un tratamieno eficaz para la colitis ulcerativa (CU), e induce a más del 60 % de los pacientes a sujetos que responden al tratamiento. En consecuencia, aproximadamente el 40 % de los pacientes no responde. Este experimento analizó la expresión genética de la mucosa de pacientes participantes en un ensayo clínico ("ACT1") para proporcionar una firma de respuesta predictiva al tratamiento con infliximab.

Veintidós pacientes fueron sometidos a colonoscopías con biopsia antes del tratamiento con infliximab. La respuesta al infliximab se definió como una cura endoscópica e histológica en la semana 8. El ARN mensajero se aisló de biopsias anteriores al infliximab, se marcó y se híbrido a una matriz Affymetrix HGU133Plus_2.0. La firma de la respuesta predictiva se verificó mediante un conjunto de datos independiente.

Cuando se comparó el perfil de expresión de la mucosa de 12 sujetos que responden al infliximab y de 10 que no responden, se identificaron 109 conjuntos de sondas expresadas diferencialmente. Los genes ligados a funciones de células neutrófilas, función de barrera epitelial mucosa y respuestas inmunes innatas se enriquecieron. A partir de estos 109 genes, se definió una firma de respuesta predictiva de 20 conjuntos de sondas, que mostraba una precisión general de 95.4 % (21/22), una sensibilidad de 91.7 % (11/12 sujetos que responden) y una especificidad de 100 % (10/10 que no responden). Una reducción a cinco conjuntos de sondas mantuvo la precisión total en 90.9 % (20/22), la sensibilidad de 91.7 % (11/12 sujetos que responden) y la especificidad en 90.0 % (9/10 que no responden). Ambas firmas de conjuntos de sondas se validaron en una cohorte independiente que produjo precisiones generales de 75 % (18/24), sensibilidades de 87.5 % (7/8 sujetos que responden), y especificidades de 68.8 % (11/16 que no responden). Los datos de la micromatriz data se depositaron en el Gene Expression Omnibus bajo el número de serie de acceso GSE12251 (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov /geo /query/ acc. cgi? token=rdatvkmqcaiqizk&acc=GSE12251).

Materiales y métodos Las biopsias de los pacientes se recogieron en los tiempos especificados en el protocolo a partir de un subconjunto de pacientes ACT1 elegidos aleatoriamente. Se analizaron 23 biopsias obtenidas en la semana 0 a partir de un subgrupo de 22 pacientes que recibieron infliximab 5 o 10 mg/kg (1 1 biopsias de 10 que no responden y 12 biopsias de 12 sujetos que responden; dos de las biopsias de los que no responden se obtuvieron dentro de las dos semanas, de un mismo sujeto). La respuesta se determinó en la semana 8. La respuesta al infliximab se definió como cura completa de la mucosa (es decir, subpuntaje endoscópico Mayo de 0 o 1 ) y un nivel de 0 o 1 en el puntaje histológico para la CU. Los pacientes que no lograron la cura de la mucosa se consideraron que no responden, aunque algunos pacientes mostraron una mejora histológica. Las características de referencia de esta cohorte se presentan en la Tabla 1. o Tabla 1. Características de referencia de las cohortes de estudio Se recogieron biopsias intestinales de 15 a 20 centímetros distales del. borde anal durante las endoscopías realizadas en la semana 0. Las biopsias se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido, y se almacenaron a menos 80 °C hasta el momento de procesarlas. Se aisló el ARN total con un minikit de RNeasy, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen Inc., Valencia, CA). La calidad y cantidad del ARN se analizaron con un Bioanalyzer 3100 (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA).

Se obtuvo una cohorte de validación independiente de los datos de expresión de ARN de la biopsia tomada de 24 pacientes con CU tratados con IFX en University Hospital Gasthuisberg, Leuven, Bélgica. Las biopsias se obtuvieron dentro de una semana, antes de la infusión intravenosa de 5 mg/kg IFX. Las biopsias se congelaron a -80 °C antes de procesar para la expresión ARNm. La respuesta a IFX se determinó 4 a 6 semanas después de la infusión, con una respuesta definida como se explicó anteriormente. Los especímenes de la cohorte de Leuven se procesaron para aislar y hibridar el ARNm con los mismos métodos que se usaron para los especímenes ACT1.

La hibridación de la micromatriz se hizo con matrices GeneChip del genoma humano U133 Plus 2.0, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). El chip permite el análisis de la expresión de más de 47,000 transcritos y variantes, que incluyen 38,500 genes humanos bien caracterizados. Los chips se escanearon con un GeneChip Scanner 3000, y se obtuvo intensidad de fluorescencia para cada función de la matriz con GeneChip Operating Software versión 1.4 (Affymetrix, Santa Clara, CA). Los datos se depositaron en Gene Expression Omnibus bajo el número de serie de acceso GSE12251 (http:// www. ncbi. nlm. nih. Gov /geo/query/acc.cgi?token=rdatvkmqcaiqizk&acc=GSE12251. Los datos de la cohorte de validación también se depositaron en Gene Expression Omnibus bajo el número de serie de acceso GSE10892 (http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/geo/query/acc.cgi?token=dlyphyokcomkmto&acc=GSE10892).

La calidad de los datos se evaluó por la distribución de intensidad de hibridación y la correlación de Pearson con Partek Genomic Suite 6.3 (Partek Inc., St. Charles, MO). Los coeficientes de correlación de Pearson van de 0.80 a 1.0. La intensidad de los conjuntos de sondas se normalizó a través de todas las muestras que usaron GeneSpringGX 7.3 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

Se identificaron diferencias significativas entre muestras de que no responden y sujetos que responden al infliximab con el análisis de varianza (ANOVA) en intensidades normalizadas transformadas log-2. Un índice de 5 % de descubrimientos falsos (FDR) se aplicó para correcciones de prueba múltiples. Los transcritos con expresiones diferenciales más que duplicadas se seleccionaron para la comparación a analizar. Para excluir conjuntos de sondas que pasaron ANOVA y duplicaron el filtrado de cambios pero que no se detectaron en ambas condiciones de una comparación emparejada, sólo se seleccionaron las muestras designadas como "presentes" (detectadas) o "marginales" (de detección limitada) entre las muestras que representan la afección.

La clasificación de la capacidad de respuesta al infliximab por cada muestra de pacientes se generó con el algoritmo 'Vecinos k más cercanos", con GeneSpring GX 7.3. Un clasificador que contiene transcritos que muestran una expresión diferencial significativa entre que no responden (n=11 muestras) y sujetos que responden (n=12 muestras) antes del tratamiento con infliximab se evaluó mediante el método de validación cruzada dejando uno afuera. Se calculó un valor p para medir la probabilidad de una muestra de prueba que se clasificara de casualidad. Se usó la Prueba exacta de Fisher para seleccionar los transcritos más predictivos.

Se aplicó el análisis de grupos jerárquicos a los datos obtenidos del análisis de datos de la micromatriz. El agrupamiento se hizo con la correlación de Pearson entre los perfiles de expresión de dos genes o pacientes para calcular la matriz de similitud en GeneSpringGX 7.3. Los resultados se visualizaron como un mapa de calor bidimensional con dos dendrogramos, uno que indica la similitud entre pacientes y el otro que indica la similitud entre genes.

El análisis de enriquecimiento por anotación de genes se hizo con el sistema National Institutes of Health DAVID online (http:// david. abcc.ncifcrf.gov/). La significatividad estadística se determinó mediante la prueba exacta de Fisher. Las categorías funcionales con un valor p 0.05 se consideraron significativas.

Resumen de los resultados Se hizo un perfil de expresión de las biopsias mucosas en la semana 0 antes del tratamiento con infliximab sobre 22 pacientes (11 biopsias de 10 que no responden y 12 biopsias de 12 sujetos que responden; dos de las biopsias de los que no responden se obtuvieron dentro de las dos semanas del mismo sujeto), basado en la respuesta al infliximab en la semana 8. Un total de 109 conjuntos de sondas, 12 subregulados y 7 sobrerregulados, pasaron un FDR de 5 % y un límite diferencial doble que representaba a 86 genes (Cuadro D). Al clasificarlo en procesos biológicos, hubo predominancia de procesos inmunes innatos. Los cinco procesos inmunes innatos más predominantes fueron la respuesta de defensa, la respuesta inmune, la transducción de señal, la respuesta a otros organismos y la respuesta a las plagas, patógenos o parásitos (Figura 1). Diez conjuntos de sondas fueron receptores de citocinas/quimocinas o citocinas/quimocinas. En el conjunto se sondas se incluyó CXCL8/interleucina (IL)-8, una quimocina quimotáctica para leucocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN). Los receptores para CXCL8/IL-8, CXCR1/IL-8RA y CXCR2/IL-8RB también estuvieron presentes. También existió CXCL11/I-TAC, un factor quimotáctico que activa las células T y las células asesinas naturales. Finalmente, IL-?ß, IL-1 RN, y IL-11 se redujeron más de cuatro veces al comparar a sujetos que responden con que no responden (Cuadro D).

Análisis de predicción de clase de sujetos que responden y que no responden La prueba exacta de Fisher se usó para seleccionar los conjuntos de sondas más predictivos que distinguían a sujetos que responden de que no responden dentro de los 109 conjuntos de sondas expresados diferencialmente en la semana (Cuadro D). Un subconjunto de 20 conjuntos de sondas clasificó a sujetos que responden y que no responden en la semana 0 (Cuadro A) con una precisión general de 95.4 % (21/22), una sensibilidad of 91.7 % (1 1/12 sujetos que responden) y una especificidad de 100 % (10/10 que no responden) (Cuadro A). Se representaron genes que participaron en respuestas inmunes {por ejemplo IL-?ß, TLR2, TREM1 o LILRA2), transducción de señal {por ejemplo PDE4B, NAMPT o FCN1) o rutas de señalización de proteínas receptoras acopladas a proteínas G {por ejemplo GPR109B, C5AR1 o FPRL1). Ocho de estos 20 genes se expresaron por PMN, que están presentes en grandes cantidades en la mucosa colónica de pacientes con CU activa. El agolpamiento jerárquico del clasificador de 20 conjuntos de sondas mostró una separación clara entre sujetos que responden y que no responden (Figura 3). A continuación se determinó el número mínimo de transcritos que permiten una clasificación equivalente. Un clasificador que contiene sólo 5 conjuntos de sondas seleccionadas de los 20 antes mencionados pudo obtener una precisión general de 90.9 % (20/22), una sensibilidad de 91.7 % (11/12 sujetos que responden) y una especificidad de 90.0 % (9/10 que no responden) (Figuras 3 y Cuadro A). Los 5 genes obtenidos eran BCL6, C5AR1 , FPRL1 , OSM y tx82a04.x1 , un gen similar a CREB5. BCL6 y tx82a04.x1 tenían una resistencia predictiva ligeramente superior, mientras que los otros 3 genes tenían una resistencia predictiva equivalente. Se debe observar que cualquiera de los otros 15 genes podría reemplazar a C5AR1 , FPRL1 y OSM sin pérdida alguna de la calidad predictiva del clasificador de los 5 conjuntos de sondas (no se muestran los datos). El agrupamiento jerárquico del clasificador de 5 conjuntos de sondas en los 10 que no responden y los 12 sujetos que responden mostró una separación notoria (Figura 3) con un perfil de expresión muy contrastado en los 5 conjuntos de sondas, al comparar sujetos que responden con que no responden. Los únicos sujetos que responden mal clasificados tenían un perfil de expresión muy similar a los que no responden, con excepción de tx82a04.x1 , que es similar a CREB5 (Figuras 2 y 3). Finalmente, la Figura 4 muestra una representación en gráfico de puntos del clasificador de 5 genes por medio del uso de las intensidades normalizadas en bruto, en donde se ve una diferencia marcada por cada uno de los cinco genes de referencia, al comparar a sujetos que responden con los que no responden.

Validación de la predicción de clase A continuación validamos los clasificadores de los 20 y 5 conjuntos de sondas con el uso de la cohorte de Leuven como conjunto de prueba de validación independiente compuesto de 8 sujetos que responden y 16 que no responden. Se obtuvieron precisiones del 75 % (18/24), sensibilidades del 87.5 % (7/8 sujetos que responden) y especificidades generales del 68.8 % (11/16 que no responden) para ambos clasificadores. El agrupamiento jerárquico del clasificador de 20 conjuntos de sondas entre los 8 sujetos que responden y los 16 que no responden mostró que los 4 que no responden mal clasificados y el sujeto que responde mal clasificado tienen perfiles de expresión muy similares a sujetos que responden y que no responden, respectivamente. (Figura 5).

Dos criterios estrictos que definen la respuesta al infliximab (cura endoscópica e histológica) produjeron 109 conjuntos de sondas expresados diferencialmente en la semana 0, que representaban 86 genes. Estos conjuntos de sondas pasaron el 5 % del FDR y un límite de expresión diferencial duplicado. Se crearon y verificaron dos firmas de respuesta predictiva, una del grupo de 20 sondas y una del subgrupo de 5 de las 20 con el uso de una cohorte independiente. Cuatro que no responden se clasificaron mal pero tenían patrones de expresión que parecían los de los sujetos que responden para la totalidad de los 109 genes expresados diferencialmente en la semana 0. Esto sugiere que estos pacientes son lentos para manifestar un beneficio clínico del tratamiento con infliximab, o tienen factores que influyen su respuesta clínica que no son evidentes mediante el perfilado de expresión de mucosa en la semana 0. Un sujeto que responde de la cohorte ACT1 fue mal clasificado por los clasificadores de los conjuntos de sondas 20 y 5, mientras que un sujeto que responde en la cohorte de validación independiente se clasificó mal. (Figuras 2, 3, y 5).

Un número de genes expresados antes del tratamiento con infliximab participa de la regulación de la función de PMN. Los PMN presentan un componente central de la respuesta inmune innata que actúan como sujetos primarios que responden al desafío microbiano. Los PMN migran rápidamente a tejidos inflamados por medio de hagocitosis, la producción de especies de oxígeno reactivo y liberación de mediadores inflamatorios y sustancias antimicrobianas como potentes mecanismos efectores. La entrada de PMN es común en la CU, tal como se muestra en el examen histológico de las biopsias de mucosa colónica obtenidas de pacientes con CU activa, y va en paralelo con la lesión transmural extensa y/o de las mucosas que incluye edema, pérdida de células copa, reducción en la producción de moco, hiperplasia de células crípticas, erosiones y ulceraciones. Por lo tanto, los PMN representan un importante tipo celular que orienta e influye a la patogénesis de la CU. La normalización de la entrada y actividad de los PMN es una parte integral de la respuesta al tratamiento con infliximab. Trece genes expresados diferencialmente en la semana 0 codifican las proteínas en la membrana de las vesícula secretoras o en la membrana plasmática de los fPMN (Cuadro B). Siete (CSF3R, FCN1 , FGR, FPRL1 , OSM, NAMPT, TLR2) se incluyen en el panel del gen de respuesta de los 20 conjuntos de sondas predictivas, y dos (FPRL y OSM) se incluyen el panel del gen de respuesta de los 5 conjuntos de sondas predictivas (Cuadro A). Además, todos están subregulados entre los sujetos que responden al comparar con los que no responden en la semana 0, lo que sugiere un estado de activación diferencial de PMN.

El complemento 5a (C5a) que se liga al receptor complemento del componente 5a (C5aR1) juega un papel esencial en la inmunidad innata de PMN. Las interacciones C5a-C5aR1 preservan las funciones inmunes innatas de PMN (quimiotaxis, fagocitosis, estallido respiratorio), atenúan la reacción inflamatoria, mejoran la coagulopatía, alteran la expresión de la molécula de adhesión, y modulan la apoptosis. Sin embargo, se explicó que la interacción excesiva de C5a-C5aR1 resulta en la parálisis de las funciones de PMN, que a su vez pueden llevar a comprometer las defensas del receptor. Como C5aR1 estaba subregulada al comparar los sujetos que responden al infliximab con los que no responden en la semana 0 (Cuadro B), se podría hipotetizar que las funciones de PMN se pueden paralizar total o parcialmente en los que no responden al infliximab, lo que resulta en un compromiso a las defensas del receptor.

El receptor tipo toll (TLR) 2 y el TLR4 son dos receptores que participan en la defensa del receptor, que reconocen patrones molecular específicos asociados con patógenos. Ambos están subregulados en la semana 0 al comparar los sujetos que responden al infliximab con los que no responden (Cuadro A y Cuadro D). TLR2 y TLR4 se expresan en leucocitos que incluyen PMN, y están sobreexpresados en la CU al compararlos con controles normales. Las células dendríticas /CD) reconocen y responden a las estructuras microbianas a través de TLR. En el intestino, las CD son fundamentales para la inducción a la tolerancia, y dirigen la diferenciación de las células T. En individuos sanos, unas pocas CD intestinales expresan TLR2 o TLR4; sin embargo, ambas mejoran significativamente en la CU. Debido a la importancia de las señales de TLR en el mantenimiento de la homeostasis de las células epiteliales (CE) intestinales, y como las bacterias comensales tienen un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de IEC, la señalización desregulada de TLR podría ser un factor contribuyente en la CU.

El receptor disparador que se expresa en las células mieloides (TREM-1) es un receptor expresado en la superficie de PMN y monocitos en presencia de componentes microbianos. TREM-1 se subreguló al comparar los sujetos que responden con los que no responden en la semana 0 (Cuadro A). CXCL8/IL-8, CXCR1/IL-8RA y CXCR2/IL-8RB (Cuadro A y Cuadro D) también se subregularon, una conclusión destacada por la mayor expresión de estas moléculas en los especímenes de mucosa intestinal de pacientes con CU. Además, los mayores niveles de CXCL8/IL-8 en la mucosa rectal se asociaron significativamente con una recaída en la CU. Finalmente, CXCL8/IL-8 puede iniciar la migración transepitelial de PMN. Estos genes también apuntan a una diferencia en la actividad de PMN en que no responden al infliximab.

BCL6 y el gen similar a CREB5 eran los dos genes expresados en la semana 0 en el panel predictivo de 20 ó 5 con el mayor valor predictivo. BCL6 es un protooncógeno, que codifica un represor transcripcional nuclear, con un papel fundamental en la formación del centro germinal y la regulación de la función, diferenciación y supervivencia de los linfocitos. Los ratones con BCL6 exhiben un fenotipo caracterizado por un defecto en la formación del centro germinal y una respuesta inflamatoria multiorgánica masiva, especialmente en el corazón y los pulmones, que corresponde a una respuesta superinmune Th2 típica. Además, BCL6 regula la expresión de las citocinas Th2 múltiples al controlar la expresión del factor de transcripción GATA-3, lo que sugiere que una respuesta Th2 más activa contribuye a la situación de los que no responden frente al infliximab. IL-13Ralfa2 era la sonda de gen más significativa, al distinguir entre sujetos que responden y que no responden en la CU e IBD en general en la cohorte de validación. IL-13 es un regulador de la respuesta Th2 y se ha hipotetizado recientemente que el receptor IL-13Ralfa2 puede participar en la fibrogénesis.

La expresión alterada de IL-11 puede participar en la patogénesis de la CU. La interleucina-1 1 tiene propiedades antiinflamatorios, y la subregulación de este gen en los pacientes con CU que responden al infliximab puede tener efectos positivos en el curso de la enfermedad. Mientras que los polimorfismos del gen de la interleucina-1 1 y la interleucina-1 RN se han asociado con la CU, IL-11 se ha asociado con la permeabilidad o intestinal mediada por una mayor actividad y expresión de la proteína MLCK.

Cuando se comparan los resultados de ambas cohortes surge una superposición muy importante entre las dos firmas genéticas, lo que destaca la inmunidad innata y el sesgo de Th2 como esenciales para la resolución de la CU (Figura 6). Estos resultados también demuestran que se puede usar múltiples firmas de expresión genética en rutas comunes para predecir la respuesta a IFX.

Hemos usado el análisis de expresión de ARNm para crear un indicador de respuesta predictiva al tratamiento con infliximab en la CU. Este indicador permite conocer la acción del infliximab a nivel molecular. La expresión de los genes que afectan las funciones de las células PMN y Th2 era la más influyente para predecir la respuesta al infliximab, como fue el caso con los resultados descritos para la cohorte de validación. Proponemos que, en los pacientes con CU, el gen de la mucosa de estos genes representa una parte importante de la falta de respuesta al tratamiento con infliximab observada en algunos pacientes después de 8 semanas de tratamiento.

CUADRO A Clasificador del conjunto de sondas IFX de referencia Núm. de ident. índice CN en del conjunto comparación Nombre GenBank de sondas con R 205220_en -1 1 .1 GPR 109B NM 00601 8 219434_en -9.3 TREM1 NM 01 8643 230170_en -8.6 OSM AI079327 213524_s_en -7.7 G0S2 NM_015 14 210773_s_en -7.1 FPRL1 U81501 236439 en -6.5 AI733564 21 5671 en -6.3 PDE4B AU 144792 243296_en -5.1 NAMPT AA873350 228758_en -5.0 BCL6 AW264036 232555_en -4.6 AI689210 39402 en -4.3 IL1 B M 1 5330 1 553297_a_en -4.3 CSF3R NM_17231 3 204924_en -4.0 TLR2 N M_003264 220088_en -3.7 C5AR1 N _001 36 205237_en -3.5 FCN 1 NM_002003 1 555643_s_en -3.5 LI LRA5 (LIR9) AF49991 8 21 1806_s_en -3.3 KCNJ 1 5 D87291 208438_s_en -2.6 FGR NM_005248 21 1 1 00_x_en -2.5 LILRA2 U82278 21 5966_x_en -2.4 GK3P (GK) AA292874 El clasificador del conjuntos de sondas 5 IFX de referencia está resaltado en negrita 205220 (SEQ ID NO:5); 219434 (SEQ ID NO:10); 230170 (SEQ ID NO:1 1); 213524 (SEQ ID NO:13); 210773 (SEQ ID NO:14); 236439 (SEQ ID NO: 17); 215671 (SEQ ID NO:19); 243296 (SEQ ID NO:33); 228758 (SEQ ID NO:36); 232555 (SEQ ID NO:41); 39402 (SEQ ID NO:47); 1553297 (SEQ ID NO:48); 204924 (SEQ ID NO:51); 220088 (SEQ ID NO:57); 205237 (SEQ ID NO:58)¡ 1555643 (SEQ ID NO:59); 21 1806 (SEQ ID NO:71); 208438 (SEQ ID NO:80); 21 1100 (SEQ ID NO:89); 215966 (SEQ ID NO:91).

CUADRO B Características de las firmas predictivas IFX de referencia Firma del conjunto Firma del conjunto de sondas 20 de sondas 5 conjunto de conjunto de conjunto de conjunto de Parámetros prueba validación prueba validación R 12 8 12 8 Predicciones correctas 11 7 11 7 CN 11 16 11 16 Predicciones correctas 11 11 10 11 Sensibilidad 91.7 % 87.5 % 91.7 % 87.5 % Especificidad 100.0 % 68.8 % 90.9 % 68.8 % Precisión general 95.7 % 75.0 % 91.3 % 75.0 % CUADRO C Las proteínas se expresan en la membrana de las vesículas secretoras del plasma de neutrófilo polimorfonuclear Núm. de ident. índice CN en del conjunto comparación de sondas con R Nombre Gen Bank 215078 _ SOD AL05038 230170 -8.6 illMilllll AI07932 207008 -6.1 I L8R NM 0015 203591 s -5.9 CSF3 NM 0007 206522 -5.8 MGA NM 0046 205119 s -5.5 FPR NM 0020 204007" -5.3 FCGR3 ? 416 243296 -5.1 NAMP AA87335 204006 S -4.6 FCGR3 NM 0005 204959 -4.5 MND NM 0024 1553297 a -4.3 CSF3 NM 1723 204924 -4.0 TLR NM 0032 205237 -3.5 FCN NM 0020 208438"s -2.6 FG NM"0052 211546 x -2.2 SNC L3667 En negrita: genes incluidos en la firma de respuesta predictiva del gen 20 En negrita y gris; genes incluidos en la firma de respuesta predictiva del gen 5 230170 (SEQ ID NO: 1 1 ); 243296 (SEQ ID NO:33); 1553297 (SEQ ID NO:48); 204924 (SEQ ID NO:51 ); 205237 (SEQ ID NO:58); 1555643 (SEQ ID NO:59); 208438 (SEQ ID NO:80); 215078 (SEQ ID NO:2); 207008 (SEQ ID NO:20); 203591 (SEQ ID NO:21); 206522 (SEQ ID NO:25); 2051 19 (SEQ ID NO:28); 204007 (SEQ ID NO:32); 204006 (SEQ ID NO:42); 204959 (SEQ ID NO: 44).

CUADRO D Genes regulados diferencialmente de referencia que comparan IFX R con CN SEQ ID NO: Núm. ident. del Indice de CN en conjunlo de sondas comparación con R Descripción Gen BANK núm. 1 206924 en 15.58 1L1 1 NM 000641 2 215078 en 14.68 SOD2 AL050388 3 229947 en 13.68 P115 A1088609 4 207094 en 13.49 1L8RA NM 000634 5 205220 en ° 1 1 .08 GPR109B NM 006018 6 232629 en 9.86 PROK2 AF182069 7 21 1506 s en 9.82 1L8 AF043337 8 2101 19 en 9.51 K.CNJ15 U73191 9 1554997 a en 9.38 PTGS2 AY 151286 10 219434 en 9.29 TREMI NM 018643 1 1 230170 en 8.64 OSM A1079327 12 204748 en 8.06 PTGS2 NM 000963 13 213524 s en 7.74 G0S2 NM 015714 14 210773 s en_ 7.08 FPRL1 U81501 15 214637 en 7 OSM BG437034 16 205568 en 6.71 AQP9 NM 020980 1 7 236439 en 6.46 A1733564 18 206025 s en 6.34 TNFAJP6 AW188198 19 215671 en 6.25 PDE4B AU 144792 20 207008 en 6.06 1L8RB NM 001557 21 203591 S en 5.89 CSF3R NM 000760 22 234644 x en 5.85 TNFRSF10C AK026079 23 206881 s en 5.82 L1LRA3 NM 006865 24 229967 en 5.82 C LFSF2 AA778552 25 206522 en 5.78 MGAM NM 004668 26 236495 en 5.67 AI681868 27 206026 s en 5.57 TNFAIP6 NM 0071 1 5 28 2053 19 s en 5.54 FPR1 NM 002029 29 210873 x en 5.47 APOBEC3A U03891 30 203470 s en 5.4 PLEK. AI433595 31 1554676 en 5.35 PRG 1 BC022313 32 204007 en 5.31 FCGR3A J04162 33 243296 en 5.1 PBEF1 AA873350 Genes regulados diferencialmente de referencia que comparan IFX R con CN Indice de CN en SEQ ID NO: Núm. ident. del conjunto de sondas comparación con R Descripción Gen BANK núm. 34 205681 en 5.09 BCL2A1 NM 004049 35 210772 en 5.07 FPRL1 M88107 36 228758 en 4.96 BCL6 AW264036 37 212657 s en 4.95 IL1 RN U65590 38 230746 s en 4.85 STC1 AW003173 39 207275 s en 4.84 ACSL1 NM 001995 40 205067 en 4.67 1L1 B NM 000576 41 232555 en 4.63 CREB5 AJ689210 42 204006 s en 4.58 FCGR3A NM 000570 43 212942 s en 4.56 KJAA 1 199 AB033025 44 204959 en 4.55 MNDA NM 002432 45 210004 en 4.55 OLR1 AF035776 46 216243 s en 4.55 IL1 RN BE563442 47 39402 en 4.28 IL1 B M 1 5330 48 1553297 a en 4.26 CSF3R NM 172313 49 201963 en 4.25 ACSL1 NM 021 122 50 212659 s en 4.05 IL1 RN AW083357 51 204924 en 4.03 . TLR2 NM 003264 52 21 1 163 s en 3.97 TNFRSF10C AF012536 53 204596 s en 3.95 STC1 U46768 54 229723 en 3.94 TAGAP BF591040 55 1553723 en 3.87 GPR97 NM 170776 56 204932 en 3.79 TNFRSF1 I B BF433902 57 220088 en 3.7 C5R1 NM 001736 58 205237 en 3.49 FC 1 NM 002003 59 1555643 s en 3.48 LIR9 AF499918 60 229770 en 3.44 FLJ31978 A1041543 61 21451 1 x en 3.41 FCGR1A L03419 62 210163 en 3.4 CXCL1 1 AF030514 63 206222 en 3.39 TNFRSF10C NM 003841 64 213425 en 3.38 WNT5A AJ968085 65 216950 s en 3.38 FCGR1A X14355 66 224941 en 3.36 PAPPA BF107618 67 220404 en 3.34 GPR97 NM 014076 Genes regulados diferencialmente de referencia que comparan IFX R con CN Núm. ident. del índice de CN en SEQ ID NO: conjunto de sondas comparación con R Descripción Gen BANK núm. 68 206515 en 3.32 CYP4F3 NM 000896 69 204933 s en 3.3 TNFRSF1 1 B NM 002546 70 2051 1 8 en 3.29 FPR1 M60626 71 21 1806 s en 3.28 CNJ15 D87291 72 21 1 322 s en 3.25 CXCL1 1 AF002985 73 226064 s en 3.13 DGAT2 AW469523 74 204597 x en 3.08 STC1 NM 003155 75 203140 en 3.07 BCL6 NM 001706 76 204595 s en 3.05 STC1 A1300520 77 204422 s en 2.85 FGF2 NM 002006 78 225987 en 2.8 FLJ23153 AA650281 79 205990 s en 2.68 WNT5A NM 003392 80 208438 s en 2.64 FGR NM 005248 .81 201858 s en 2.61 PRG1 J03223 82 210484 s en 2.59 TNFRSF10C BC005043 83 232224 en 2.58 ASP1 A1274095 84 205100 en 2.55 GFPT2 NM 0051 10 85 208594 x en 2.55 ILT8 NM 02431 8 86 240862 en 2.54 RASGRP4 AA923524 87 202388 en 2.5 RGS2 NM 002923 88 219788 en 2.49 PILRA NM 013439 . 89 21 1 100 x en 2.48 LILRA1 U82278 90 224341 x en 2.41 TLR4 U93091 91 215966 x en 2.4 GK AA292874 92 201041 s en 2.39 DUSP1 NM 00441 7 93 215977 x en 2.37 GK X68285 94 205896 en 2.35 SLC22A4 NM 003059 95 228501 en 2.32 GALNTL2 BF055343 96 21 1 133 x en 2.31 L1LRB3 AF009643 97 217167 x en 2.2 GK AJ252550 98 21 1546 x en 2.19 SNCA L36674 99 210664 s en 2.1 TFP1 AF021834 100 209960 en 2.08 HGF X I 6323 101 219859 en 2.04 CLECSF9 NM 014358 Genes regulados diferencialmente de referencia que comparan IFX R con CN e CN en SEO ID NO: Núm. ident del índice d conjunto de sondas comparación con R Descripción GenBANK núm. 102 201315 x en 2.01 1FITM3 NM 006435 103 212281 s en -2.02 MAC30 BF038366 104 211541 s en -2.39 DYRK1A U52373 105 227491 en -2.4 ELOVL6 AA777752 106 235109 en -2.78 ZBED3 AJ887983 107 205523 en -2.8 HAPLN1 U43328 108 232054 en -5.26 PCDH20 AA040057 109 229831 en -5.81 CNTN3 BE221817 CUADRO E Citocinas y quimocinas expresadas diferencialmente en la comparación de referencia entre IFX R y CN.

Núm. de ident. índice CN en del conjunto comparación Nombre GenBank de sondas con R 206924_en -15.6 IL11 NM_000641 207094_en -13.5 IL8RA NM_000634 211506_s_en -9.8 IL8 AF043337 230 l70_en -8.6 OSM AI079327 21 637_en -7.0 OSM BG437034 206025_s_en -6.3 TNFAIP6 AW 188198 207008_en -6.1 IL8RB NM_001557 212657_s_en -4.9 IL1RN U65590 205067_en -4.7 IL1B NM_000576 2l6243_s_en -4.5 IL1RN BE563442 39402_en -4.3 IL1B M15330 212659_s_en -4.0 IL1RN AW083357 204932_en -3.8 TNFRSF11 B BF433902 210163_en -3.4 CXCL11 AF030514 204933_s_en -3.3 TNFRSF11 B N _002546 2l1122_s_en -3.2 CXCL11 AF002985 230170 (SEQ ID NO:11); 207008 (SEQ ID NO:20); 206924 (SEQ ID NO:1); 207094 (SEQ ID NO:4); 211506 (SEQ ID NO:7); 214637 (SEQ ID NO:15); 206025 (SEQ ID NO:18); 212657 (SEQ ID NO:37); 205067 (SEQ ID NO:40); 216243 (SEQ ID NO:46)¡ 39402 (SEQ ID NO:47); 212659 (SEQ ID NO:50); 204932 (SEQ ID N0.56); 210163 (SEQ ID NO:62), 204933 (SEQ ID NO: 69); 211122 (SEQ ID NO:72).

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir la adecuación del tratamiento con terapia anti-TNF para un trastorno relacionado mediado por TNF en un sujeto, el método comprende: a) preparar una muestra de ácidos nucleicos a partir de un espécimen obtenido del sujeto; y b) hacer un ensayo con la muestra con un panel de segmentos marcados de ácido nucleico que se hibridan con BCL6 (Genbank Acc. núm. AW264036; SEQ ID NO:118) y tx82a04.x1 (Genbank Acc. núm. AI689210; SEQ ID NO:123), caracterizado porque la subregulación de dichos genes se correlaciona con la eficacia terapéutica para el tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el ensayo comprende, además, el ensayo de la hibridación de un ácido nucleico con un miembro seleccionado del grupo que consiste de C5AR1 (Genbank Acc. núm. NM001736; SEQ ID NO: 119), FOLR1 ((Genbank Acc. núm. U81501 ; SEQ ID NO: 142) y OSM (Genbank Acc. núm. A1079327; SEQ ID NO: 173).

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el ensayo comprende, además, el ensayo de hibridación de un ácido nucleico con un gen seleccionado de las SEQ ID NO: 110 a 203.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la terapia anti-TNF se selecciona del grupo que consiste de infliximab, golimumab, Enbrel™, y Humira™.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el trastorno inflamatorio gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste de enfermedad de Crohn, inflamación intestinal y la colitis ulcerativa.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque trastorno inflamatorio gastrointestinal se selecciona del grupo que consiste de formas leves, moderadas, severas, pediátricas o adultas.

7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque el anticuerpo anti-TNF es golimumab o infliximab y el trastorno mediado por TNF es la colitis ulcerativa.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la recolección es una matriz de segmentos de ácido nucleico seleccionados de las SEQ ID NO: 1 a 109.

9. Un método de prueba basado en una matriz para predecir la adecuación del tratamiento con una terapia anti-TNF para un trastorno relacionado mediado por TNF en un paciente, el método comprende: a) preparar una mezcla de ácidos nucleicos a partir de un espécimen obtenido del paciente; b) hacer un ensayo con la muestra y un panel de sondas marcadas de ácido nucleico que se hibridan con BCL6 (Genbank Acc. núm. AW264036; SEQ ID NO: 118) y tx82a04.x1 (Genbank Acc. núm. AI689210; SEQ ID NO:123), en donde las sondas comprenden la SEQ ID NO: 37, y SEQ ID NO: 41 , en donde la subregulación de los genes se correlaciona con la eficacia terapéutica para el tratamiento de un trastorno inflamatorio gastrointestinal.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el ensayo comprende, además, hacer un ensayo con C5AR1 ((Genbank Acc. núm. NM001736; SEQ ID NO: 119), FOLR1 ((Genbank Acc. núm. U81501 ; SEQ ID NO: 142) o OSM (Genbank Acc. núm. A1079327; SEQ ID NO: 173).

1 1 . El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el ensayo comprende, además, hacer un ensayo con uno de los genes de SEQ ID NO: 1 10 - 203

12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la terapia anti-TNF se selecciona del grupo que consiste de infliximab, golimumab, Enbrel™, y Humira™, u otro fármaco anti-TNF biológico o de molécula pequeña.

13. Un kit para uso prognóstico o diagnóstico, que comprende oligonucleótidos u oligonucleótidos complementarios a un polinucleótido que codifica un gen marcador o la cadena complementaria de este que expresa los genes marcadores, en donde los genes marcadores se seleccionan del grupo que consiste de secuencias de nucleótidos que codifican una porción de BCL6 (Genbank Acc. núm. AW264036; SEQ ID NO:118) y tx82a04.x1 (Genbank Acc. núm. AI689210; SEQ ID NO: 123).

14. El kit de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque los genes marcadores comprenden, además, C5AR1 ((Genbank Acc. núm. NM001736; SEQ ID NO: 1 19), FOLR1 ((Genbank Acc. núm. U81501 ; SEQ ID NO: 142) o OSM (Genbank Acc. núm. A1079327; SEQ ID NO: 173).

15. El kit de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque los genes marcadores comprenden, además, un gen incluido en las SEQ ID NO: 1 10-203, y los oligonucleótidos comprenden una sonda de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-109.